BR112019018454A2 - fibra de fibroína artificial altamente contraída, e, métodos para produzir e para contrair uma fibra de fibroína artificial - Google Patents
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Abstract
a presente invenção se refere a uma fibra de fibroína sintética contraída compreendendo fibroína modificada, em que a porcentagem de contração definida pela equação seguinte excede 7%. porcentagem de contração = {1- (comprimento da fibra de fibroína sintética contraída/comprimento da fibra de fibroína sintética após fiação e antes de contato com água)} × 100 (%).
Description
FIBRA DE FIBROÍNA ARTIFICIAL ALTAMENTE CONTRAÍDA, E,
MÉTODOS PARA PRODUZIR E PARA CONTRAIR UMA FIBRA DE
FIBROÍNA ARTIFICIAL
CAMPO TÉCNICO [001] A presente invenção se refere a uma fibra de fibroína artificial altamente contraída, um método de produção da mesma, e um método para contrair uma fibra de fibroína artificial.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] Geralmente, exige-se que fibras usadas para roupa, roupa de cama e similares tenham um alto nível de propriedades tácteis. Como uma fibra que satisfaz suficientemente propriedades tácteis e tendo altas propriedades finais, é conhecida uma seda que é um tipo de fibra de fibroína natural.
[003] Além disso, maciez, propriedades de retenção de calor e similares são também exigidas para fibras usadas para roupa, roupa de cama e similares. Dessa maneira, por exemplo, seda usada para roupa, roupa de cama e similares pode ser seda que foi submetida a um processo de contração para aumentar o volume, por meio do que flexibilidade e propriedades de retenção de calor são conferidas.
[004] Entretanto, fibras sintéticas tais como fibras de poliéster, fibras de poliamida e fibras acrílicas são geralmente usadas para roupa, roupa de cama e similares, e essas fibras sintéticas têm uma porcentagem de contração de 40% ou mais quando são colocadas em contato com água fervente (Literatura de Patente 1).
LISTA DE CITAÇÃO
Literatura de Patente [005] [Literatura de Patente 1] Relatório Descritivo de Patente não
Examinado Japonês No. 2009-121003
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
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PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO [006] Entretanto, seda tem apenas pouca porcentagem de contração quando é colocada em contato apenas com água.
[007] Além disso, um método para contração descrito na Literatura de Patente 1 envolve um grande risco em virtude do manuseio de água fervente a alta temperatura.
[008] Um objetivo da presente invenção é prover uma fibra de fibroína artificial altamente contraída que tem uma porcentagem de contração suficientemente alta, tem propriedades tácteis e flexibilidade excelentes, e pode ser produzida com segurança; e um método de produção da mesma. Um outro objetivo da presente invenção é prover um método para contrair uma fibra de fibroína artificial, que é capaz de obter com segurança a uma porcentagem de contração suficientemente alta.
MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS [009] A presente invenção se refere, por exemplo, a cada das seguintes invenções.
[1] [0010] Uma fibra de fibroína artificial contraída incluindo:
uma fibroína modificada, em que uma porcentagem de contração definida pela equação seguinte excede 7%.
Porcentagem de contração = {1- (comprimento da fibra de fibroína artificial contraída/comprimento da fibra de fibroína artificial antes de ser posta em contato com água após fiação)} x 100 (%) [2] [0011] A fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com [1], em que a fibroína modificada é uma fibroína de seda de aranha modificada.
[3]
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3/59 [0012] A fibra de fibroina artificial altamente contraída de acordo com [1] ou [2], que é contraída ao ser colocada em contato com água abaixo de um ponto de ebulição.
[4] [0013] A fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com [3], em que uma temperatura da água é 10°C a 90°C.
[5] [0014] A fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com [3] ou [4], que é contraída adicionalmente secando após ser colocada em contato com a água.
[6] [0015] Um método para produzir uma fibra de fibroína artificial altamente contraída, incluindo:
uma etapa de contrair uma fibra de fibroína artificial contendo uma fibroína modificada colocando a fibra de fibroína artificial em contato com água abaixo de um ponto de ebulição, em que uma porcentagem de contração definida pela equação seguinte excede 7%.
Porcentagem de contração = {1- (comprimento da fibra de fibroína artificial contraída/comprimento da fibra de fibroína artificial antes de ser posta em contato com água após fiação)} x 100 (%) [7] [0016] O método para produzir uma fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com [6], em que a fibroína modificada é uma fibroína de seda de aranha modificada.
[8] [0017] O método para produzir uma fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com [6] ou [7], em que uma temperatura da água é 10°C a 90°C.
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4/59 [9] [0018] O método para produzir uma fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com qualquer um de [6] a [8], em que a etapa de contrair a fibra de fibroína artificial inclui adicionalmente secar a fibra de fibroína artificial após ser colocada em contato com a água.
[10] [0019] Um método para contrair uma fibra de fibroína artificial, incluindo:
uma etapa de contrair uma fibra de fibroína artificial contendo uma fibroína modificada colocando a fibra de fibroína artificial em contato com água abaixo de um ponto de ebulição, em que uma porcentagem de contração definida pela equação seguinte excede 7%.
Porcentagem de contração = {1- (comprimento da fibra de fibroína artificial contraída/comprimento da fibra de fibroína artificial antes de ser posta em contato com água após fiação)} x 100 (%) [11] [0020] O método para contrair uma fibra de fibroína artificial de acordo com [10], em que a fibroína modificada é uma fibroína de seda de aranha modificada.
[12] [0021] O método para contrair uma fibra de fibroína artificial de acordo com [10] ou [11], em que uma temperatura da água é 10°C a 90°C.
[13] [0022] O método para contrair uma fibra de fibroína artificial de acordo com qualquer um de [10] a [12], em que a etapa de contrair a fibra de fibroína artificial inclui adicionalmente secar a fibra de fibroína artificial após ser colocada em contato com a água.
EFEITOS DA INVENÇÃO
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5/59 [0023] De acordo com a presente invenção, é possível prover uma fibra de fibroína artificial altamente contraída que tem uma porcentagem de contração suficientemente alta, tem propriedades tácteis e flexibilidade excelentes, e pode ser produzida com segurança; e um método de produção da mesma. De acordo com a presente invenção, é também possível prover um método para contrair uma fibra de fibroína artificial, que é capaz de obter com segurança a uma porcentagem de contração suficientemente alta.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0024] A FIG. 1 é um diagrama esquemático mostrando uma sequência de domínio de uma fibroína modificada.
[0025] A FIG. 2 é um gráfico mostrando uma distribuição de valores de z/w (%) de fibroína de ocorrência natural.
[0026] A FIG. 3 é um gráfico mostrando uma distribuição de valores de x/y (%) de fibroína de ocorrência natural.
[0027] A FIG. 4 é uma vista explicativa mostrando esquematicamente um exemplo de um aparelho de fiação para produzir fibras de fibroína artificial.
[0028] A FIG. 5 é uma vista explicativa mostrando esquematicamente um exemplo de um aparelho de produção para produzir fibras de fibroína artificial altamente contraídas.
[0029] A FIG. 6 é uma vista explicativa mostrando esquematicamente um exemplo de um aparelho de produção para produzir fibras de fibroína artificial altamente contraídas.
MODALIDADES PARA REALIZAR A INVENÇÃO [0030] A seguir, modalidades para realizar a presente invenção serão descritas em detalhes. Entretanto, a presente invenção não é limitada às modalidades seguintes.
[Fibra de fibroína artificial altamente contraída] [0031] Uma fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo
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6/59 com a presente invenção é uma fibra de fibroína artificial contraída incluindo uma fibroína modificada. Na fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com a presente modalidade, uma porcentagem de contração definida pela equação seguinte excede 7%.
Porcentagem de contração = {1- (comprimento da fibra de fibroína artificial contraída/comprimento da fibra de fibroína artificial antes de ser posta em contato com água após fiação)} x 100 (%) <Fibroína modificada>
[0032] A fibroína modificada de acordo com a presente modalidade é uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m. A fibroína modificada pode ter adicionalmente uma sequência de aminoácidos (sequência N-terminal e sequência C-terminal) adicionada a qualquer ou ambos do lado N-terminal e o lado C-terminal da sequência de domínio. A sequência N-terminal e a sequência C-terminal, embora não limitadas a isso, são tipicamente regiões que não têm repetições de motivos de aminoácido características de fibroína e consistem de aminoácidos de cerca de 100 resíduos.
[0033] A expressão “fibroína modificada” como usada na presente especificação significa uma fibroína produzida sinteticamente (uma fibroína artificial). A fibroína modificada pode ser uma fibroína cuja sequência de domínio é diferente da sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural, ou pode ser uma fibroína cuja sequência de aminoácidos é a mesma daquela de fibroína de ocorrência natural. A expressão “fibroína de ocorrência natural” como usada aqui é também uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m.
[0034] A “fibroína modificada” pode ser uma fibroína na qual a sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural é usada como ela é; pode ser uma fibroína; uma fibroína cuja sequência de aminoácidos foi modificada com base na sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência
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7/59 natural (por exemplo, uma fibroína cuja sequência de aminoácidos foi modificada alterando uma sequência genética de fibroína de ocorrência natural clonada); ou uma fibroína artificialmente projetada e sintetizada independentemente de fibroína de ocorrência natural (por exemplo, uma fibroína tendo uma sequência de aminoácidos desejada sintetizando quimicamente um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos projetada), desde que ela tem a sequência de aminoácidos especificada na presente invenção.
[0035] A expressão “sequência de domínio” como usada aqui se refere a uma sequência de aminoácidos que produz uma região cristalina (que tipicamente corresponde ao motivo (A)n de uma sequência de aminoácidos) e uma região amorfa (que tipicamente corresponde a REP de uma sequência de aminoácidos) peculiar a fibroína e significa uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m. Motivo (A)n indica uma sequência de aminoácidos principalmente incluindo um resíduo de alanina, em que n é um número inteiro de 2 a 20, é preferivelmente 4 a 20, é mais preferivelmente 8 a 20, é ainda mais preferivelmente 10 a 20, é também ainda mais preferivelmente 4 a 16, é também ainda mais preferivelmente 8 a 16, e é de forma particular preferivelmente 10 a 16. Além disso, é suficiente desde que uma porcentagem de resíduos de alanina seja 40% ou mais com relação ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n, mas é preferivelmente 60% ou mais, mais preferivelmente 70% ou mais, ainda mais preferivelmente 80% ou mais, ainda também mais preferivelmente 90%, e pode ser 100% (que significa que o motivo (A)n consiste apenas de resíduos de alanina). REP representa uma sequência de aminoácidos consistindo de 2 a 200 resíduos de aminoácido. m representa um número inteiro de 2 a 300. Uma pluralidade de motivos (A)n pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos. Uma pluralidade de REPs pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos.
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Exemplos específicos de proteínas derivadas do grande bicho da seda nasogástrico incluem uma proteína contendo a sequência de aminoácidos (PRT410) mostrada na SEQ ID NO: 9.
[0036] A fibroína modificada de acordo com a presente modalidade pode ser obtida, exemplo, realizando modificações de uma sequência de aminoácidos correspondendo à substituição, deleção, inserção e/ou adição de uma ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos com relação à sequência genética de uma fibroína de ocorrência natural clonada. Substituição, deleção, inserção e/ou adição de resíduos de aminoácidos podem ser realizadas por métodos bem conhecidos pelos versados na técnica, tal como mutagênese direcionada ao sítio. Especificamente, elas podem ser realizadas de acordo com um método descrito nas literaturas tais como Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982), e Methods in Enzymology, 100, 448 (1983).
[0037] Fibroma de ocorrência natural é uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m, especificamente, por exemplo, uma fibroína produzida por insetos ou aranhas. [0038] Exemplos da fibroína produzida por insetos incluem proteínas de seda produzidas por bichos da seda tais como Bombyx mori, Bombyx mandarina, Antheraea yamamai, Anteraea pemyi, Eriogyna pyretorum, Pilosamia Cynthia ricini, Samia cynthia, Caligura japonica, Antheraea mylitta, e Antheraea assama; e proteínas de seda Hornet descarregadas por larvas de Vespa simillima xanthoptera.
[0039] Um exemplo mais específico da fibroína produzida por insetos pode ser uma cadeia L de fibroína de bicho da seda (Acesso no GenBank No. M76430 (sequência de base), AAA27840.1 (sequência de aminoácidos)).
[0040] Exemplos da fibroína produzida por aranhas incluem proteínas de seda de aranha produzidas por aranhas que pertencem ao gênero Araneus tais como Araneus ventricosus, Araneus diadematus, Araneus pinguis, Araneus pentagrammicus e Araneus nojimai, aranhas que pertencem ao
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9/59 gênero Neoscona tais como Neoscona scylla, Neoscona nautica, Neoscona adianta e Neoscona scylloides, aranhas que pertencem ao gênero Promts tais como Pronous minutes, aranhas que pertencem ao gênero Cyrtarachne tais como Cyrtarachne bufo e Cyrtarachne inaequalis, aranhas que pertencem ao gênero Gasteracantha tais como Gasteracantha kuhli e Gasteracantha mammosa, aranhas que pertencem ao gênero Ordgarius tais como Ordgarius hobsoni e Ordgarius sexspinosus, aranhas que pertencem ao gênero Argiope tais como Argiope amoena, Argiope minuta e Argiope bruennich, aranhas que pertencem ao gênero Arachnura tal como Arachnura logio, aranhas que pertencem ao gênero Acusilas tal como Acusilas coccineus, aranhas que pertencem ao gênero Cytophora tais como Cyrtophora moluccensis, Cyrtophora exanthematica e Cyrtophora unicolor, aranhas que pertencem ao gênero Poltys tal como Poltys illepidus, aranhas que pertencem ao gênero Cyclosa tais como Cyclosa octotuberculata, Cyclosa sedeculata, Cyclosa vallata e Cyclosa atrata, e aranhas que pertencem ao gênero Chorizopes tal como Chorizopes nipponicus; e proteínas de seda de aranha produzidas por aranhas que pertencem ao gênero Tetragnatha tais como Tetragnatha praedonia, Tetragnatha maxillosa, Tetragnatha extensa e Tetragnatha squamata, aranhas que pertencem ao gênero Leucauge tais como Leucauge magnífica, Leucauge blanda e Leucauge subblanda, aranhas que pertencem ao gênero Nephila tais como Nephila clavata e Nephila pilipes, aranhas que pertencem ao gênero Menosira tais como Menosira ornata, aranhas que pertencem ao gênero Dyschiriognatha tais como Dyschiriognatha tenera, aranhas que pertencem ao gênero Latrodectus tais como Latrodectus mactans, Latrodectus hasseltii, Latrodectus geometricus e Latrodectus tredecimguttatus, e aranhas que pertencem à família Tetragnathidae tais como aranhas que pertencem ao gênero Euprosthenops. Exemplos de proteínas de seda de aranha incluem proteínas de fibra de tração tais como MaSp (MaSpl e MaSp2) e ADF (ADF3 e ADF4), e MiSp (MiSpl e MiSp2).
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10/59 [0041] Exemplos mais específicos da fibroína produzida por aranhas incluem fibroína-3 (adf-3) [derivada de Araneus diadematus] (Número de Acesso no GenBank AAC47010 (sequência de aminoácidos), U47855 (sequência de base)), fibroína-4 (adf-4) [derivada de Araneus diadematus] (Número de Acesso no GenBank AAC47011 (sequência de aminoácidos), U47856 (sequência de base)), espidroína 1 de proteína de seda dragline [derivada de Nephila clavipes] (Número de Acesso no GenBank AAC04504 (sequência de aminoácidos), U37520 (sequência de base)), espidroína 1 da ampola principal [derivada de Latrodectus hesperus] (Número de Acesso no GenBank ABR68856 (sequência de aminoácidos)), EF595246 (sequência de base)), espidroína 2 da proteína de seda dragline [derivada de Nephila clavata] (Número de Acesso no GenBank AAL32472 (sequência de aminoácidos), AF441245 (sequência de base)), espidroína 1 da ampola principal [derivada de Euprosthenops australis] (Número de Acesso no GenBank CAJ00428 (sequência de aminoácidos), AJ973155 (sequência de base)) e espidroína 2 da ampola principal [Euprosthenops australis] (Número de Acesso no GenBank CAM32249.1 (sequência de aminoácidos), AM490169 (sequência de base)), proteína 1 de seda da ampola secundária [Nephila clavipes] (Número de Acesso no GenBank AAC14589.1 (sequência de aminoácidos)), proteína de seda 2 da ampola secundária [Nephila clavipes] (Número de Acesso no GenBank AAC14591.1 (sequência de aminoácidos)), e proteína tipo espidroína da ampola secundária [Nephilengys cruentata] (Número de Acesso no GenBank ABR37278.1 (sequência de aminoácidos)).
[0042] Como um exemplo mais específico de fibroína de ocorrência natural, fibroína em que informação da sequência é registrada no GenBank NCBI pode ser mencionada adicionalmente. Por exemplo, ela pode ser confirmada extraindo sequências em que espidroína, ampola, fibroína, “seda e polipeptídeo”, ou “seda e proteína” são descritos como uma palavra chave em DEFINIÇÃO dentre as sequências contendo INV como DIVISÃO entre
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11/59 informação de sequência registrada em GenBank NCBI, sequências em que uma sequência caractere específico de produtos é descrito pela CDS, ou sequências em que uma sequência de caractere específica é descrita pela
FONTE no TIPO de TECIDO.
[0043] A fibroína modificada de acordo com a presente modalidade pode ser fibroína de seda modificada (em que a sequência de aminoácidos da proteína de seda produzida por bicho da seda é modificada), ou pode ser uma fibroína de seda de aranha modificada (em que a sequência de aminoácidos de uma proteína de seda de aranha produzida por aranhas é modificada).
[0044] Exemplo específico da fibroína modificada de acordo com a presente modalidade inclui uma fibroína modificada derivada da proteína dragline nasogasus grande produzida em uma linhagem principal de aranha (a fibroína modificada de acordo com a primeira modalidade), uma fibroína modificada tendo um teor reduzido de resíduo de glicina (uma fibroína modificada de acordo com a segunda modalidade), uma fibroína modificada na qual o teor de motivo (A)n é reduzido (uma fibroína modificada de acordo com a terceira modalidade), e uma fibroína modificada na qual o teor de resíduo de glicina e o teor de motivo (A)n são reduzidos (uma fibroína modificada de acordo com a quarta modalidade).
[0045] Exemplos da fibroína modificada de acordo com a primeira modalidade incluem uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m. Na fibroína modificada de acordo com a primeira modalidade, na Fórmula 1, n é preferivelmente um número inteiro de 3 a 20, mais preferivelmente um número inteiro de 4 a 20, ainda mais preferivelmente um número inteiro de 8 a 20, e também ainda mais preferivelmente um número inteiro de 10 a 20, também ainda mais preferivelmente um número inteiro de 4 a 16, de forma particular preferivelmente um número inteiro de 8 a 16, e acima de tudo preferivelmente um número inteiro de 10 a 16. Na fibroína modificada de acordo com a
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12/59 primeira modalidade, na Fórmula 1, o número de resíduos de aminoácidos que constituem a REP é preferivelmente 10 a 200 resíduos, mais preferivelmente 10 a 150 resíduos, ainda mais preferivelmente 20 a 100 resíduos, e também ainda mais preferivelmente 20 a 75 resíduos. Na fibroína modificada de acordo com a primeira modalidade, um número total de resíduos de resíduos de glicina, resíduos de serina, e resíduos de alanina contidos na sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m é preferivelmente 40% ou mais, mais preferivelmente 60% ou mais, e ainda mais preferivelmente 70% ou mais, com relação ao número total de resíduos de aminoácido.
[0046] A fibroína modificada de acordo com a primeira modalidade inclui uma unidade da sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m, e pode ser um polipeptideo que é uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de 90% ou mais com a sequência de aminoácidos cuja sequência C-terminal é mostrada em qualquer das SEQ ID NOs: 12 a 14, ou a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer das SEQ ID NOs: 12 a 14.
[0047] A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12 é idêntica à sequência de aminoácidos consistindo de 50 resíduos de aminoácidos na terminação-C da sequência de aminoácidos de ADF3 (GI: 1263287, NCBI); a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13 é idêntica à sequência de aminoácidos obtida removendo 20 resíduos da terminação-C da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12; e a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14 é idêntica à sequência de aminoácidos obtida removendo 29 resíduos da terminação-C da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12.
[0048] Um exemplo mais específico da fibroína modificada de acordo com a primeira modalidade pode ser uma fibroína modificada incluindo (1-i), uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15 ou (1-ii), uma
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13/59 sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais sequência identidade com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15. A sequência identidade é preferivelmente 95% ou mais.
[0049] A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15 é uma sequência de aminoácidos na qual a primeira até a décima terceira regiões de repetição são aumentadas até aproximadamente o dobro, e que é multada de maneira tal que a tradução seja terminada no 1. 154- resíduo de aminoácido, na sequência de aminoácidos de ADF3 na qual a sequência de aminoácidos consistindo de códon de iniciação, marca HislO, e sítio de reconhecimento de protease HRV3C (3C protease de rinovírus de Humano) (SEQ ID NO: 16) são adicionados à terminação-N. A sequência de aminoácidos na terminação-C da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15 é idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3 [0050] A fibroína modificada de (1-i) pode consistir da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15.
[0051] A fibroína modificada de acordo com a segunda modalidade tem uma sequência de aminoácidos cuja sequência de domínio tem um teor reduzido de resíduos de glicina comparado com fibroína de ocorrência natural. Pode-se dizer que a fibroína modificada pode tem pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondendo à substituição de um ou de uma pluralidade de resíduos de glicina em REP com um outro resíduo de aminoácido, comparado com fibroína de ocorrência natural.
[0052] A fibroína modificada de acordo com a segunda modalidade pode ser uma fibroína modificada na qual a sequência de domínio tem, pelo menos uma sequência de motivo selecionada de GGX e GPGXX (onde X representa um resíduo de aminoácido sem ser glicina) em REP, pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondendo à substituição de um resíduo de glicina em uma ou uma pluralidade das sequências de motivo com um
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14/59 outro resíduo de aminoácido, comparado com a fibroína de ocorrência natural.
[0053] A fibroína modificada de acordo com a segunda modalidade pode ser uma fibroína modificada na qual a razão da sequência de motivo na qual o resíduo de glicina é substituído com um outro resíduo de aminoácido é
10% ou mais com relação à sequência de motivo total.
[0054] A fibroína modificada de acordo com a segunda modalidade pode ser uma fibroína modificada que inclui uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m, e tem uma sequência de aminoácidos na qual z/w é 30% ou mais, ou tem uma sequência de aminoácidos na qual z/w é 50,9% ou mais, no caso onde o número total de resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos consistindo de XGX (onde X representa um resíduo de aminoácido sem ser glicina) contidos em todas as REPs na sequência, excluindo a sequência do motivo (A)n localizado no lado mais C-terminal até a terminação-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio é definido como z, e o número total de resíduos de aminoácidos na sequência excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais C-terminal até a terminação-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio é definido como w. Isso é suficiente desde que o número de resíduos de alanina seja 83% ou mais com relação ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n, mas é preferivelmente 86% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, também mais preferivelmente 95% ou mais, e ainda também mais preferivelmente 100% (que significa que o motivo (A)n consiste apenas de resíduos de alanina).
[0055] A fibroína modificada de acordo com a segunda modalidade é preferivelmente uma fibroína modificada na qual a razão do teor da sequência de aminoácidos consistindo de XGX é aumentada substituindo um resíduo de glicina do motivo de GGX com um outro resíduo de aminoácido. Na fibroína modificada de acordo com a segunda modalidade, a razão do teor da sequência de aminoácidos consistindo de GGX na sequência de domínio é
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15/59 preferivelmente 30% ou menos, mais preferivelmente 20% ou menos, também mais preferivelmente 10% ou menos, ainda também mais preferivelmente 6% ou menos, também adicionalmente preferivelmente 4% ou menos, e de forma particular preferivelmente 2% ou menos. A razão do teor da sequência de aminoácidos consistindo de GGX na sequência de domínio pode ser calculada pelo pelo método como o método de cálculo da razão do teor (z/w) da sequência de aminoácidos consistindo de XGX descrito a seguir.
[0056] O método de cálculo de z/w será descrito com mais detalhes. Primeiramente, da sequência de domínio, uma sequência de aminoácidos consistindo de XGX é extraída de todas as REPs contidas na sequência excluindo a sequência do motivo (A)n localizado no lado mais C-terminal até a terminação-C da sequência de domínio. O número total de resíduos de aminoácidos que constituem XGX é z. Por exemplo, no caso onde 50 sequências de aminoácidos consistindo de XGX são extraídas (não existe sobreposição), z é 50x3 = 150. Também, por exemplo, no caso onde X (X central) contido em dois XGXs existe como no caso da sequência de aminoácidos consistindo de XGXGX, ele é calculado subtraindo a porção de sobreposição (no caso de XGXGX, ele tem 5 resíduos de aminoácido). w é o número total de resíduos de aminoácidos contidos na sequência excluindo a sequência do motivo (A)n localizado no lado mais C-terminal até a terminação-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio. Por exemplo, no caso da sequência de domínio mostrada na FIG. 1, w é 4+50+4+100+4+10+4+20+4+30=230 (excluindo o motivo (A)n localizado no lado mais C-terminal). Em seguida, z/w (%) pode ser calculado dividindo z por w.
[0057] Aqui, z/w em fibroína de ocorrência natural será descrito.
Primeiramente, como descrito anteriormente, 663 tipos de fibroínas (415 tipos de fibroínas derivadas de aranhas entre elas) foram extraídas confirmando
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16/59 fibroínas com informação de sequência de aminoácidos registrada no GenBank NCBI por um método exemplificado, z/w foi calculado pelo método de cálculo mencionado anteriormente das sequências de aminoácidos de fibroínas de ocorrência natural que incluem uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m e em que a razão do teor da sequência de aminoácidos consistindo de GGX na fibroína é 6% ou menos, entre todas as fibroínas extraídas. Os resultados são mostrados na FIG. 2. Na FIG. 2, o eixo geométrico horizontal representa z/w (%) e o eixo geométrico vertical representa frequência. Como fica aparente a partir da FIG. 2, z/w em fibroína de ocorrência natural é menos que 50,9% (mais alto, 5,086%).
[0058] Na fibroína modificada de acordo com a segunda modalidade, z/w é preferivelmente 50,9% ou mais, mais preferivelmente 56,1% ou mais, também mais preferivelmente 58,7% ou mais, ainda também mais preferivelmente 70% ou mais, e também adicionalmente preferivelmente 80% ou mais. O limite superior de z/w não é particularmente limitado, mas ele pode ser 95% ou menos, por exemplo.
[0059] A fibroína modificada de acordo com a segunda modalidade pode ser obtida, por exemplo, substituindo e modificando pelo menos uma parte de uma sequência de base que codifica um resíduo de glicina da sequência genética de fibroína de ocorrência natural clonada, de maneira a codificar um outro resíduo de aminoácido. Neste momento, um resíduo de glicina no motivo de GGX e motivo de GPGXX pode ser selecionado como o resíduo de glicina a ser modificado, e substituição pode ser realizada de maneira tal que z/w seja 50,9% ou mais. Altemativamente, a fibroína modificada de acordo com a modalidade pode também ser obtida, por exemplo, projetando uma sequência de aminoácidos que satisfaça cada qual das modalidades anteriores da sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural, e sintetizando quimicamente um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos projetada. Em qualquer caso, além da
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17/59 modificação correspondendo à substituição de um resíduo de glicina em REP com um outro resíduo de aminoácido da sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural, modificação da sequência de aminoácidos correspondendo à substituição, deleção, inserção e/ou adição de uma ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos pode ser realizada.
[0060] O outro resíduo de aminoácido mencionado anteriormente não é particularmente limitado, desde que ele seja um resíduo de aminoácido sem ser um resíduo de glicina, mas ele é preferivelmente um resíduo de aminoácido hidrofóbico tais como um resíduo de valina (V), um resíduo de leucina (L), um resíduo de isoleucina (I), um resíduo de metionina (M), um resíduo de prolina (P), um resíduo de fenilalanina (F), ou um resíduo de triptofano (W), ou um resíduo de aminoácido hidrofílico tais como um resíduo de glutamina (Q), um resíduo de asparagina (N), um resíduo de serina (S), um resíduo de lisina (K), ou um resíduo de ácido glutâmico (E), entre o quais os mais preferidos são um resíduo de valina (V), um resíduo de leucina (L), um resíduo de isoleucina (I) ou um resíduo de glutamina (Q), e também mais preferido é um resíduo de glutamina (Q).
[0061] Um exemplo mais específico da fibroína modificada de acordo com a segunda modalidade pode ser uma fibroína modificada incluindo (2-i) uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17; ou (2-ii) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais sequência identidade com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17.
[0062] A fibroína modificada de (2-i) será descrita. A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3 é obtida substituindo GQX para todos os GGX em REP da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 correspondendo à fibroína de ocorrência natural. A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 é obtida deletando o motivo (A)n
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18/59 a cada outras duas posições do lado N-terminal até o lado C-terminal da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3 e inserindo adicionalmente um [(A)n motif-REP] antes da sequência C-terminal. A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 é obtida inserindo dois resíduos de alanina no lado C-terminal de cada motivo (A)n da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 e substituindo adicionalmente uma parte de resíduos de glutamina (Q) com um resíduo de serina (S) para deletar uma parte de aminoácidos no lado N-terminal de maneira a ter quase o mesmo peso molecular da SEQ ID NO: 4. A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17 é uma sequência de aminoácidos na qual uma marca His foi adicionada ao C-terminal de uma sequência obtida repetindo, 4 vezes, a região das 20 sequências de domínio presentes na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 (entretanto, diversos resíduos de aminoácidos no lado C-terminal da região são substituídos).
[0063] O valor de z/w na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 (correspondendo à fibroína de ocorrência natural) é 46,8%. Os valores de z/w na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4, na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10, e na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17 são respectivamente 58,7%, 70,1%, 66,1%, e 70,0%. Além disso, os valores de x/y na razão Giza (a ser descrita posteriormente) 1:1,8 a 1:11,3 das sequências de aminoácidos apresentada na SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 10, e 17 são respectivamente 15,0%, 15,0%, 93,4%, 92,7%, e 89,3%.
[0064] A fibroína modificada de (2-i) pode consistir de uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17.
[0065] A fibroína modificada de (2-ii) inclui uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de
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19/59 aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17. A fibroína modificada de (2-ii) é também uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais. [0066] Prefere-se que a fibroína modificada de (2-ii) tem 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17, e z/w seja 50,9% ou mais no caso onde o número total de resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos consistindo de XGX (onde X representa um resíduo de aminoácido sem ser glicina) contidos em REP é definida como z, e o número total de resíduos de aminoácidos de REP na sequência de domínio é definido como w.
[0067] A fibroína modificada mencionada anteriormente pode incluir uma sequência de marca em qualquer ou ambas de terminação-N e terminação-C. Isso toma possível isolar, imobilizar, detectar e visualizar a fibroína modificada.
[0068] A sequência de marca pode ser, por exemplo, uma marca de afinidade utilizando afinidade específica (propriedade de ligação, afinidade) com uma outra molécula. Como um exemplo específico da marca de afinidade, uma marca de histidina (marca His) pode ser mencionada. A marca His é um peptideo curto em que cerca de 4 a 10 resíduos de histidina são arranjados, e tem uma propriedade de ligar especificamente a um íon de metal tais como níquel, assim ele pode ser usado para isolamento de fibroína modificada por cromatografia de metal quelante. Um exemplo específico da sequência de marca pode ser uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 (sequência de aminoácidos incluindo marca His).
[0069] Além disso, uma sequência de marca tais como glutationa-Stransferase (GST) que liga especificamente a glutationa ou uma proteína de ligação de maltose (MBP) que liga especificamente a maltose pode também
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20/59 ser usada.
[0070] Adicionalmente, uma “marca de epítopo” utilizando uma reação antígeno-anticorpo pode também ser usada. Adicionando um peptídeo (epítopo) mostrando antigenicidade como uma sequência de marca, um anticorpo contra o epítopo pode ser ligado. Exemplos da marca de epítopo incluem uma marca HA (sequência de peptídeo de hemaglutinina do vírus influenza), uma marca myc, e uma marca FLAG. A fibroína modificada pode facilmente ser purificada com alta especificidade utilizando uma marca de epítopo.
[0071] E também possível usar uma sequência de marca que pode ser clivada com uma protease específica. Tratando uma proteína adsorvida através da sequência de marca com protease, é também possível recuperar a fibroína modificada clivada da sequência de marca.
[0072] Um exemplo mais específico da fibroína modificada incluindo a sequência de marca pode ser uma fibroína modificada incluindo (2-iii) uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 18; ou (2-iv) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 18.
[0073] As sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9, 11, e 18 são sequências de aminoácidos em que uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 (incluindo uma marca His) é adicionada à terminação-N das sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 10, e 17, respectivamente.
[0074] A fibroína modificada de (2-iii) pode consistir de uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9,
SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 18.
[0075] A fibroína modificada de (2-iv) inclui uma sequência de
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21/59 aminoácidos tendo 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 18. A fibroína modificada de (2-iv) é também uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais. [0076] Prefere-se que a fibroína modificada de (2-iv) tem 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 18, e z/w seja 50,9% ou mais no caso onde o número total de resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos consistindo de XGX (onde X representa um resíduo de aminoácido sem ser glicina) contidos em REP é definida como z, e o número total de resíduos de aminoácidos de REP na sequência de domínio é definido como w.
[0077] A fibroína modificada mencionada anteriormente pode incluir um sinal secretório para liberar a proteína produzida no sistema de produção de proteína recombinante para fora de um hospedeiro. A sequência do sinal secretório pode ser estabelecida adequadamente dependendo do tipo do hospedeiro.
[0078] A fibroína modificada de acordo com a terceira modalidade tem uma sequência de aminoácidos cuja sequência de domínio tem um teor reduzido de motivo (A)n comparado com fibroína de ocorrência natural. Podese dizer que que sequência de domínio da fibroína modificada tem pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondendo à deleção de um ou de uma pluralidade de motivos (A)n, comparado com fibroína de ocorrência natural. [0079] A fibroína modificada de acordo com a terceira modalidade pode ter uma sequência de aminoácidos correspondendo a 10 a 40% de deleção do motivo (A)n da fibroína de ocorrência natural.
[0080] A fibroína modificada de acordo com a terceira modalidade pode ser uma fibroína modificada cuja sequência de domínio tem pelo menos
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22/59 uma sequência de aminoácidos correspondendo à deleção de um motivo (A)n por um a três motivos (A)n do lado N-terminal até o lado C-terminal, comparado com fibroína de ocorrência natural.
[0081] A fibroína modificada de acordo com a terceira modalidade pode ser uma fibroína modificada cuja sequência de domínio tem pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondendo à repetição de duas deleções motivo (A)n consecutivas e uma deleção de motivo (A)n nessa ordem do lado N-terminal até o lado C-terminal, comparado com a fibroína de ocorrência natural.
[0082] A fibroína modificada de acordo com a terceira modalidade pode ser uma fibroína modificada cuja sequência de domínio tem pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondendo à deleção do motivo (A)n a cada outras duas posições do lado N-terminal até o lado C-terminal.
[0083] A fibroína modificada de acordo com a terceira modalidade pode ser uma fibroína modificada que tem uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m, e tem uma sequência de aminoácidos na qual x/y é 20% ou mais, ou tem uma sequência de aminoácidos na qual x/y é 50% ou mais, no caso onde o número de resíduos de aminoácidos em REPs de duas unidades de [(A)n motif-REP] adjacentes é sequencialmente comparado do lado N-terminal até o lado C-terminal, e o número de resíduos de aminoácidos em REP tendo um número menor de resíduos de aminoácidos é definido como 1, o valor máximo do valor total do número de resíduos de aminoácidos nas duas unidades de [(A)n motif-REP] adjacentes onde a razão do número de resíduos de aminoácidos na outra REP é 1,8 a 11,3 é definido como x, e o número total de resíduos de aminoácidos da sequência de domínio é y. Isso é suficiente desde que o número de resíduos de alanina seja 83% ou mais com relação ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n, mas ele é preferivelmente 86% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, também mais preferivelmente 95% ou mais, e
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23/59 ainda também mais preferivelmente 100% (que significa que o motivo (A)n consiste apenas de resíduos de alanina).
[0084] Um método para calcular x/y será descrito com mais detalhes com referência à FIG. 1. A FIG. 1 mostra uma sequência de domínio excluindo a sequência N-terminal e sequência C-terminal de fibroína modificada. Essa sequência de domínio tem uma sequência de primeira REP do motivo (A)n (50 resíduos de aminoácido) segunda REP do motivo (A)n (100 resíduos de aminoácido) terceira REP do motivo (A)n- (10 resíduos de aminoácido) quarta REP do motivo (A)n- (20 resíduos de aminoácido) quinta REP do motivo (A)n (30 resíduos de aminoácido)-motivo (A)n do lado Nterminal (lado esquerdo).
[0085] As duas unidades de [(A)n motif-REP] adjacentes são sequencialmente selecionadas do lado N-terminal até o lado C-terminal de maneira a não sobreporem. Neste momento, uma unidade de [(A)n motifREP] não selecionada pode existir. A FIG. 1 mostra um padrão 1 (uma comparação entre primeira REP e segunda REP e uma comparação entre terceira REP e quarta REP), um padrão 2 (uma comparação entre primeira REP e segunda REP e uma comparação quarto entre REP e quinta REP), um padrão 3 (uma comparação entre segunda REP e terceira REP e uma comparação entre quarta REP e quinta REP), e um padrão 4 (uma comparação entre primeira REP e segunda REP). Existem outros métodos de seleção além destes [0086] Em seguida, para cada padrão, o número de resíduos de aminoácidos de cada REP nas duas unidades de [(A)n motif-REP] adjacentes selecionadas é comparado. A comparação é realizada obtendo a razão do número de resíduos de aminoácidos da outra REP no caso onde uma REP tendo um número menor de resíduos de aminoácidos é 1. Por exemplo, no caso de comparar a primeira REP (50 resíduos de aminoácido) e a segunda REP (100 resíduos de aminoácido), a razão do número de resíduos de
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24/59 aminoácidos da segunda REP é 100/50 = 2 no caso onde a primeira REP tendo um número menor de resíduos de aminoácidos é 1. Similarmente, no caso de comparar a quarta REP (20 resíduos de aminoácido) e a quinta REP (30 resíduos de aminoácido), a razão do número de resíduos de aminoácidos da quinta REP é 30/20 = 1,5 no caso onde a quarta REP tendo um número menor de resíduos de aminoácidos é 1.
[0087] Na FIG. 1, um conjunto de unidades de [(A)n motif-REP] em que a razão do número de resíduos de aminoácidos da outra REP é 1,8 a 11,3 no caso onde uma REP tendo um número menor de resíduos de aminoácidos é 1 é indicado por uma linha cheia. Na presente especificação, uma razão como essa é referida como uma razão Giza. Um conjunto de unidades de [(A)n motif-REP] em que a razão do número de resíduos de aminoácidos da outra REP é menos que 1,8 ou mais que 11,3 no caso onde uma REP tendo um número menor de resíduos de aminoácidos é 1, é indicado por um linha tracejada.
[0088] Em cada padrão, o número de todos os resíduos de aminoácidos de duas unidades de [(A)n motif-REP] adjacentes indicadas por linha cheias (incluindo não apenas o número de resíduos de aminoácidos de REP, mas também o número de resíduos de aminoácidos de motivo (A)n) é combinado. Então, os valores totais assim combinados são comparados e o valor total do padrão cujo valor total é o máximo (o valor máximo do valor total) são definidos como x. No exemplo mostrado na FIG. 1, o valor total do padrão 1 é o máximo.
[0089] Em seguida, x/y (%) pode ser calculado dividindo x pelo número de resíduo de aminoácido total y da sequência de domínio.
[0090] Na fibroína modificada de acordo com a terceira modalidade, x/y é preferivelmente 50% ou mais, mais preferivelmente 60% ou mais, também mais preferivelmente 65% ou mais, ainda também mais preferivelmente 70% ou mais, também de forma adicional preferivelmente
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75% ou mais, e de forma particular preferivelmente 80% ou mais. O limite superior de x/y não é particularmente limitado, e ele pode ser 100% ou menos, por exemplo. Em um caso onde uma razão Giza é 1:1,9 a 1:11,3, x/y é preferivelmente 89,6% ou mais; em um caso onde uma razão Giza é 1:1,8 a 1:3,4, x/y é preferivelmente 77,1% ou mais; em um caso onde uma razão Giza é 1:1,9 a 1:8,4, x/y é preferivelmente 75,9% ou mais; e em um caso onde uma razão Giza é 1:1,9 a 1:4,1, x/y é preferivelmente 64,2% ou mais.
[0091] Em um caso onde a fibroína modificada de acordo com a terceira modalidade é uma fibroína modificada na qual pelo menos sete dos motivos (A)n que estão presentes em plural na sequência de domínio são compostos de apenas resíduos de alanina, x/y é preferivelmente 46,4% ou mais, é mais preferivelmente 50% ou mais, é ainda mais preferivelmente 55% ou mais, é também ainda mais preferivelmente 60% ou mais, é também ainda mais preferivelmente 70% ou mais, e é particularmente preferível 80% ou mais. O limite superior de x/y não é particularmente limitado, e pode ser 100% ou menos.
[0092] Aqui, x/y em fibroína de ocorrência natural será descrito. Primeiramente, como descrito anteriormente, 663 tipos de fibroínas (415 tipos de fibroínas derivadas de aranhas entre elas) foram extraídas confirmando fibroínas com informação de sequência de aminoácidos registrada no GenBank NCBI por um método exemplificado, x/y foi calculado pelo método de cálculo mencionado anteriormente das sequências de aminoácidos de fibroínas de ocorrência natural que incluem uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m, entre todas as fibroínas extraídas. A FIG. 3 mostra os resultados no caso onde a razão Giza é 1:1,9 a 1:4,1.
[0093] Na FIG. 3, o eixo geométrico horizontal representa x/y (%) e o eixo geométrico vertical representa a frequência. Como fica aparente a partir da FIG. 3, x/y em fibroína de ocorrência natural é menos que 64,2% (mais
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26/59 alto, 64,14%).
[0094] A fibroína modificada de acordo com a terceira modalidade pode ser obtida, por exemplo, de uma sequência genética de fibroína de ocorrência natural clonada, deletando uma ou uma pluralidade das sequências que codifica o motivo (A)n de maneira tal que x/y seja 64,2% ou mais. Adicionalmente, a fibroína modificada incluindo uma sequência de domínio com um teor de motivo (A)n reduzido pode também ser obtida, por exemplo, projetando uma sequência de aminoácidos correspondendo à deleção de um ou de uma pluralidade de motivos (A)n de maneira tal que x/y seja 64,2% ou mais, da sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural, e quimicamente sintetizando um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos projetada. Em qualquer caso, além da modificação correspondendo à deleção de motivo (A)n da sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural, modificação da sequência de aminoácidos correspondendo à substituição, deleção, inserção e/ou adição de uma ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos pode ser realizada.
[0095] Um exemplo mais específico da fibroína modificada de acordo com a terceira modalidade pode ser uma fibroína modificada incluindo (3-i) uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17; ou (3-ii) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17.
[0096] A fibroína modificada de (3-i) será descrita. A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 é obtida deletando o motivo (A)n a cada outras duas posições do lado N-terminal até o lado C-terminal da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 correspondendo à fibroína de ocorrência natural e inserindo adicionalmente um [(A)n motifREP] antes da sequência C-terminal. A sequência de aminoácidos apresentada
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27/59 na SEQ ID NO: 4 é obtida substituindo GQX para todos os GGX em REP da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 é obtida inserindo dois resíduos de alanina no lado C-terminal de cada motivo (A)n da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 e substituindo adicionalmente uma parte de resíduos de glutamina (Q) com um resíduo de serina (S) para deletar uma parte de aminoácidos no lado N-terminal de maneira a ter quase o mesmo peso molecular da SEQ ID NO: 4. A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17 é uma sequência de aminoácidos na qual uma marca His foi adicionada à terminação-C de uma sequência obtida repetindo, 4 vezes, a região das 20 sequências de domínio presentes na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 (entretanto, diversos resíduos de aminoácidos no lado C-terminal da região são substituídos).
[0097] O valor de x/y na razão Giza 1:1,8 a 1:11,3 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 (correspondendo à fibroína de ocorrência natural) é 15,0%. Valores de x/y na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 são ambas 93,4%. O valor de x/y na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 é 92,7%. O valor de x/y na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17 é 89,3%. Valores de z/w nas sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 10, e 17 são 46,8%, 56.2%, 70,1%, 66,1%, e 70,0%, respectivamente.
[0098] A fibroína modificada de (3-i) pode consistir de uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17.
[0099] A fibroína modificada de (3-ii) inclui uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17. A fibroína modificada de (3-ii) é também uma proteína
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28/59 incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais.
[00100] A fibroína modificada de (3-ii) preferivelmente tem 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17, e tem uma sequência de aminoácidos na qual x/y é 64,2% ou mais, no caso onde o número de resíduos de aminoácidos em REPs de duas unidades de [(A)n motif-REP] adjacentes é sequencialmente comparado do lado N-terminal até o lado C-terminal, e o número de resíduos de aminoácidos em REP tendo um número menor de resíduos de aminoácidos é definido como 1, o valor máximo do valor total do número de resíduos de aminoácidos nas duas unidades de [(A)n motif-REP] adjacentes onde a razão do número de resíduos de aminoácidos na outra REP é 1,8 a 11,3 (aa razão Giza de 1:1,8 a 1:11,3) é definido como x, e o número total de resíduos de aminoácidos da sequência de domínio é y.
[00101] A fibroína modificada mencionada anteriormente pode incluir a sequência de marca mencionada anteriormente em qualquer ou ambos os terminação-N e terminação-C.
[00102] Um exemplo mais específico da fibroína modificada incluindo a sequência de marca pode ser uma fibroína modificada incluindo (3-iii) uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 18; ou (3-iv) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 18.
[00103] As sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NOs:
6, 7, 8, 9, 11, e 18 são sequências de aminoácidos em que uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 (incluindo uma marca His) é adicionada à terminação-N das sequências de aminoácidos apresentadas na
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SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 10, e 17, respectivamente.
[00104] A fibroma modificada de (3-iii) pode consistir de uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9,
SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 18.
[00105] A fibroma modificada de (3-iv) inclui uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 18. A fibroma modificada de (3-iv) é também uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [(A)n motif-REP]m. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais.
[00106] A fibroína modificada de (3-iv) preferivelmente tem 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 18, e tem uma sequência de aminoácidos na qual x/y é 64,2% ou mais, no caso onde o número de resíduos de aminoácidos em REPs de duas unidades de [(A)n motif-REP] adjacentes é sequencialmente comparado do lado N-terminal até o lado C-terminal, e o número de resíduos de aminoácidos em REP tendo um número menor de resíduos de aminoácidos é definido como 1, o valor máximo do valor total do número de resíduos de aminoácidos nas duas unidades de [(A)n motif-REP] adjacentes onde a razão do número de resíduos de aminoácidos na outra REP é 1,8 a 11,3 é definido como x, e o número total de resíduos de aminoácidos da sequência de domínio é y.
[00107] A fibroína modificada mencionada anteriormente pode incluir um sinal secretório para liberar a proteína produzida no sistema de produção de proteína recombinante para fora de um hospedeiro. A sequência do sinal secretório pode ser estabelecida adequadamente dependendo do tipo do hospedeiro.
[00108] A fibroína modificada da quarta modalidade é uma fibroína modificada na qual a sequência de domínio tem uma sequência de
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30/59 aminoácidos na qual o teor de resíduos de glicina é reduzido além de ter um teor reduzido de motivos (A)n comparado com fibroína de ocorrência natural. Pode-se dizer que a sequência de domínio da fibroína modificada tem adicionalmente uma sequência de aminoácidos correspondendo pelo menos à substituição de um ou de uma pluralidade de resíduos de glicina em REP com um outro resíduo de aminoácido, além da deleção de um ou de uma pluralidade de motivos (A)n, comparado com fibroína de ocorrência natural. Ou seja, a fibroína modificada é uma fibroína modificada qual tendo os recursos da fibroína modificada descrita anteriormente de acordo com a segunda modalidade e da fibroína modificada descrita anteriormente de acordo com a terceira modalidade. Aspectos específicos e similares são como descrito na fibroína modificada de acordo com a segunda e terceira modalidades.
[00109] Um exemplo mais específico da fibroína modificada de acordo com a quarta modalidade pode ser uma fibroína modificada incluindo (4-i) uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17; ou (4-ii) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17. Aspectos específicos da fibroína modificada incluindo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 17 são como descritos anteriormente.
<Método para produzir fibroína modificada>
[00110] A fibroína modificada de acordo com a presente modalidade pode ser produzida, por exemplo, expressando o ácido nucleico por uma sequência de ácido nucleico que codifica a fibroína modificada, e um hospedeiro transformado com um vetor de expressão tendo uma ou uma pluralidade de sequências regulatórias ligadas operacionalmente à sequência de ácido nucleico.
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31/59 [00111] Um método para produzir um ácido nucleico que codifica a fibroína modificada não é particularmente limitado. Um ácido nucleico pode ser produzido, por exemplo, por um método em que um gene que codifica fibroína natural é amplificado e clonado por reação em cadeia de polimerase (PCR) ou similares, e modificado por método de engenharia genética; ou um método de sintetizar quimicamente um ácido nucleico. Um método para sintetizar quimicamente um ácido nucleico não é particularmente limitado e, por exemplo, genes podem ser quimicamente sintetizados por um método de ligação no qual, por PCR ou similares, oligonucleotídeos que são automaticamente sintetizados por AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare Japan Ltd.) ou similares, com base na informação de sequência de aminoácidos de fibroína obtida da base de dados da web NCBI e similares. Neste momento, a fim de facilitar a purificação e/ou confirmação da fibroína modificada, um ácido nucleico que codifica uma fibroína modificada consistindo de uma sequência de aminoácidos obtida adicionando uma sequência de aminoácidos consistindo de um códon de partida e uma marca HislO à terminação-N da sequência de aminoácidos anterior, pode ser sintetizado.
[00112] A sequência regulatória é uma sequência (por exemplo, uma sequência promotora, uma intensificadora, uma de ligação de ribossomo, ou uma sequência de terminação de transcrição) que controla a expressão de uma fibroína modificada em um hospedeiro, e pode ser adequadamente selecionada dependendo do tipo do hospedeiro. Como um promotor, um promotor indutível que funciona em células hospedeiras e é capaz de expressão indutível de fibroína modificada pode ser usado. Um promotor indutível é um promotor que pode controlar a transcrição devido à presença de um indutor (indutor de expressão), a ausência de uma molécula repressora, ou fatores físicos tais como um aumento ou diminuição na temperatura, pressão osmótica, ou valor de pH.
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32/59 [00113] O tipo do vetor de expressão tais como um vetor de plasmídio, um vetor viral, um vetor de cosmídio, um vetor de fosmídio, ou um vetor de cromossomo artificial pode ser adequadamente selecionado dependendo do tipo do hospedeiro. Como o vetor de expressão, um vetor de expressão que pode replicar autonomamente em uma célula hospedeira ou pode ser incorporado em um cromossomo de um hospedeiro e que contém um promotor em uma posição capaz de transcrever o ácido nucleico que codifica a fibroína modificada é adequadamente usado.
[00114] Tanto procariotos quanto eucariotos tais como levedura, fungos filamentosos, células de inseto, células de animal, e células de planta podem ser adequadamente usados como hospedeiros.
[00115] Exemplos de hospedeiros do procarioto incluem bactérias que pertencem ao gênero Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium e Pseudomonas. Exemplos de micro-organismos que pertencem ao gênero Escherichia incluem Escherichia coli e similares. Exemplos de micro-organismos que pertencem ao gênero Brevibacillus incluem Brevibacillus agri e similares. Exemplos de micro-organismos que pertencem ao gênero Serratia incluem Serratia liquefaciens e similares. Exemplos de micro-organismos que pertencem ao gênero Bacillus incluem Bacillus subtilis e similares. Exemplos de micro-organismos que pertencem ao gênero Microbacterium incluem Microbacterium ammoniaphilum. Exemplos de micro-organismos que pertencem ao gênero Brevibacterium incluem Brevibacterium divaricatum e similares. Exemplos de micro-organismos que pertencem ao gênero Corynebacterium incluem Corynebacterium ammoniagenes e similares. Exemplos de micro-organismos que pertencem ao gênero Pseudomonas incluem Pseudomonas putida e similares.
[00116] Em um caso onde um procarioto é usado como um hospedeiro, exemplos de vetores nos quais um ácido nucleico que codifica a fibroína
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33/59 modificada é introduzido incluem pBTrp2 (fabricado por Boehringer
Mannheim), pGEX (fabricado por Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, pUBUO, e pNCO2 (Relatório Descritivo de Patente não
Examinado Japonês No. 2002-238569) e similares.
[00117] Exemplos de hospedeiros eucarióticos incluem levedura e fungos filamentosos (mofo e similares). Exemplos de leveduras incluem uma levedura que pertence ao gênero Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces e similares. Exemplos de fungos filamentosos incluem fungos filamentosos que pertencem ao gênero Aspergillus, Penicillium, Trichoderma e similares.
[00118] Em um caso onde um eucarioto é usado como um hospedeiro, exemplos de vetores nos quais um ácido nucleico que codifica a fibroína modificada é introduzido incluem YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051) e similares. Como um método para introduzir um vetor de expressão na célula hospedeira anterior, qualquer método pode ser usado desde que ele introduza DNA na célula hospedeira. Exemplos do mesmo incluem um método usando íons de cálcio [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)], um método de eletroporação, um método de esferoplasto, um método de protoplasto, um método de acetato de lítio, um método competente e similares.
[00119] Como um método para expressar um ácido nucleico por um hospedeiro transformado com um vetor de expressão, produção secretória, expressão de proteína de fusão, ou similares, além de expressão direta, podem ser realizadas de acordo com o método descrito em Molecular Cloning, 2nd edition.
[00120] A fibroína modificada pode ser produzida, por exemplo, cultivando um hospedeiro transformado com o vetor de expressão em um meio de cultura, produzindo e acumulando a fibroína modificada no meio de cultura, e então coletando a fibroína modificada do meio de cultura. O método
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34/59 para cultivar o hospedeiro em um meio de cultura pode ser realizado de acordo com um método comumente usado para cultivar um hospedeiro.
[00121] No caso onde o hospedeiro é um procarioto tal como Escherichia coli ou um eucarioto tal como levedura, qualquer de um meio natural e um meio sintético pode ser usado como um meio de cultura desde que ele contenha uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, sais inorgânicos e similares que podem ser assimilados pelo hospedeiro e ele seja capaz de cultivar eficientemente o hospedeiro.
[00122] Como a fonte de carbono, qualquer fonte de carbono que pode ser assimilada pelo micro-organismo transformado pode ser usada. Exemplos da fonte de carbono que pode ser usada incluem carboidratos tais como glicose, frutose, sacarose, e melaço, amido e amido hidrolisado contendo-os, ácidos orgânicos tais como ácido acético e ácido propiônico, e álcoois tais como etanol e propanol. Exemplos da fonte de nitrogênio que pode ser usada incluem sais de amônio de ácidos inorgânico ou orgânicos tais como amônia, cloreto de amônio, sulfato de amônio, acetato de amônio e fosfato de amônio, outros compostos contendo nitrogênio, peptona, extrato de carne, extrato de levedura, licor de maceração de milho, hidrolisado de caseína, torta de soja e hidrolisado de torta de soja, várias células microbianas fermentadas e produtos digeridos dos mesmos. Como sais inorgânicos, é possível usar dihidrogeno fosfato de potássio, fosfato de dipotássio, fosfato de magnésio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, sulfato de cobre, e carbonato de cálcio.
[00123] Cultura de um procarioto tal como Escherichia coli ou um eucarioto tal como levedura pode ser realizada em condições aeróbicas tais como cultura com agitação ou cultura com agitação com aeração profunda. A temperatura da cultura é, por exemplo, 15°C a 40°C. O tempo de cultura é normalmente 16 horas a 7 dias. E preferível manter o pH do meio de cultura durante a cultura a 3,0 a 9,0. O pH do meio de cultura pode ser ajustado
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35/59 usando um ácido inorgânico, um ácido orgânico, uma solução alcalina, ureia, carbonato de cálcio, amônia, ou similares.
[00124] Além disso, antibióticos tais como ampicilina e tetraciclina podem ser adicionados ao meio de cultura como necessário durante a cultura. No caso de cultivar um micro-organismo transformado com um vetor de expressão usando um promotor indutível como um promotor, um indutor pode ser adicionado ao meio como necessário. Por exemplo, no caso de cultivar um micro-organismo transformado com um vetor de expressão usando um promotor lac, isopropil-P-D-tiogalactopiranosídeo ou similares é usado, e no caso de cultivar um micro-organismo transformado com um vetor de expressão usando um promotor trp, ácido acrílico indol ou similares pode ser adicionado ao meio.
[00125] Isolamento e purificação da fibroína modificada expressa podem ser realizados por um método comumente usado. Por exemplo, no caso onde a fibroína modificada é expressa em um estado dissolvido em células, as células hospedeiras são recuperadas por centrifugação após conclusão da cultura, suspensas em uma solução aquosa tampão, e então rompidas usando um ultrassonizador, uma prensa Francesa, um homogeneizador Manton-Gaulin, um Dyno-Mill, ou similares para obter um extrato sem célula. A partir do sobrenadante obtido por fiação o extrato sem célula, uma preparação purificada pode ser obtida por um método comumente usado para isolamento e purificação de uma fibroína modificada, ou seja, um método de extração de solvente, um método de precipitação “por salinização” usando sulfato de amônio ou similares, um método de dessalgação, um método de precipitação usando um solvente orgânico, um método de cromatografia por troca iônica usando uma resina tal como dietilaminoetil (DEAE)-Sefarose ou DIAION HPA-75 (fabricado por Mitsubishi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha), um método de cromatografia por troca catiônica usando uma resina tal como S-Sefarose FF (Pharmacia Corporation), um
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36/59 método de cromatografia hidrofóbica usando uma resina tal como butil sefarose ou fenil sefarose, um método de filtração de gel usando uma peneira molecular, um método de cromatografia por afinidade, um método de cromatofocagem, um método de eletroforese tal como focagem isoelétrica ou similares, sozinhos ou em combinação dos mesmos.
[00126] Além disso, no caso onde a fibroína modificada é expressa pela formação de uma substância insolúvel na célula, similarmente, as células hospedeiras são recuperadas, rompidas e centrifugadas para recuperar a substância insolúvel da fibroína modificada como uma fração precipitada. A substância insolúvel recuperada da fibroína modificada pode ser solubilizada com um agente desnaturante de proteína. Após esta operação, uma preparação purificada de fibroína modificada pode ser obtida pelo mesmo método de isolamento e purificação como descrito anteriormente. No caso onde a fibroína modificada é secretada extracelularmente, a fibroína modificada pode ser recuperada do sobrenadante da cultura. Ou seja, um sobrenadante da cultura é obtido tratando a cultura por uma técnica tal como fiação, e uma preparação purificada pode ser obtida do sobrenadante da cultura usando o mesmo método de isolamento e purificação como descrito anteriormente.
<Fibra de fibroína artificial [00127] A fibra de fibroína artificial de acordo com a presente modalidade é uma fibra que obtida por fiação da fibroína modificada descrita anteriormente, e que contém a fibroína modificada descrita anteriormente como um principal componente.
<Método para produzir fibra de fibroína artificial [00128] A fibra de fibroína artificial de acordo com a presente modalidade pode ser produzida por um método de fiação conhecido. Ou seja, por exemplo, em um caso de produção de fibras de fibroína artificial contendo a fibroína modificada como um principal componente, primeiramente, uma solução dope é preparada adicionando e dissolvendo a fibroína modificada
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37/59 produzida de acordo com o método descrito anteriormente em um solvente tais como sulfóxido de dimetila (DMSO), Ν,Ν-dimetilformamida (DMF), ou hexafluorisopronol (HFIP), junto com sal inorgânico como um promotor de dissolução. Em seguida, usando essa solução dope, a fiação é realizada por um método de fiação conhecido tais como fiação por via úmida, fiação por via seca, fiação por via úmida-via seca, ou fiação tipo fusão, e por meio disso fibras de fibroína artificial alvos podem ser obtidas. Métodos de fiação preferidos incluem fiação por via úmida ou fiação por via úmida-via seca.
[00129] A FIG. 4 é uma vista explicativa mostrando esquematicamente um exemplo de um aparelho de fiação para produzir fibras de fibroína artificial. Um aparelho de fiação 10 mostrado na FIG. 4 é um exemplo de um aparelho de fiação para fiação por via úmida-via seca, e inclui um aparelho de extrusão 1, um aparelho de produção de fio não estirado 2, um aparelho de estiramento a quente via úmida 3, e um aparelho de secagem 4.
[00130] Um método de fiação usando o aparelho de fiação 10 será descrito. Primeiramente, uma solução dope 6 armazenada em um tanque de armazenamento 7 é forçada através de uma fiandeira 9 por uma bomba de engrenagem 8. Na escala de laboratório, a solução dope pode ser preenchida em um cilindro e forçada através do bocal usando uma bomba de seringa. Em seguida, a solução dope extrudada 6 é suprida através de uma lacuna de ar 19 em um líquido de coagulação 11 de um tanque de líquido de coagulação 20, o solvente é removido, a fibroína modificada é coagulada, e um corpo coagulado fibroso é formado. Em seguida, o corpo coagulado fibroso é suprido em água quente 12 em um banho de estiramento 21 e estirado. Uma razão de estiramento é determinada por uma razão de velocidade entre um rolo com abertura de passagem de alimentação 13 e um rolo com abertura de passagem de transferência 14. Depois disso, o corpo coagulado fibroso estirado é suprido ao aparelho de secagem 4 e seco em uma guia de linha 22, e por meio disso a fibra de fibroína artificial como um corpo bobinado 5 é
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38/59 obtida. 18a a 18g são guias de fio.
[00131] O líquido de coagulação 11 pode ser uma solução capaz de dessolvatação, e exemplos do mesmo incluem álcoois inferiores tendo 1 a 5 átomos de carbono tais como metanol, etanol e 2-propanol, e acetona. O líquido de coagulação 11 pode adequadamente conter água. A temperatura do líquido de coagulação 11 é preferivelmente 0°C a 30°C. No caso onde uma bomba de seringa tendo um bocal com um diâmetro de 0,1 a 0,6 mm é usada como a fiandeira 9, a taxa de extrusão é preferivelmente 0,2 a 6,0 mL/h e mais preferivelmente 1,4 a 4,0 mL/h por furo. A distância que a proteína coagulada passa no líquido de coagulação 11 (substancialmente, a distância da guia de fio 18a até a guia de fio 18b) pode ser qualquer comprimento que permita dessolvatação eficiente e é, por exemplo, 200 a 500 mm. A velocidade de extração do fio não estirado pode ser, por exemplo, 1 a 20 m/min e preferivelmente 1 a 3 m/min. O tempo de permanência no líquido de coagulação 11 pode ser, por exemplo, 0,01 a 3 minutos e preferivelmente 0,05 a 0,15 minutos. Adicionalmente, o estiramento (pré-estiramento) pode ser realizado no líquido de coagulação 11.0 tanque de líquido de coagulação 20 pode ser provido com múltiplos estágios, e o estiramento pode ser realizado em cada estágio ou um estágio específico, como necessário.
[00132] Para o estiramento realizado em um caso de obter a fibra de fibroína artificial, por exemplo, estiramento a quente por via seca é também empregado, além do pré-estiramento descrito anteriormente realizado no tanque de líquido de coagulação 20, e estiramento a quente por via úmida realizado no banho de estiramento 21.
[00133] O estiramento a quente por via úmida pode ser realizado em água quente, em uma solução obtida adicionando um solvente orgânico ou similares à água quente, ou durante aquecimento por vapor. A temperatura pode ser, por exemplo, 50°C a 90°C e preferivelmente 75°C a 85°C. Em estiramento a quente por via úmida, fio não estirado (ou fio pré-estirado) pode
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39/59 ser estirado, por exemplo, 1 a 10 vezes, preferivelmente 2 a 8 vezes.
[00134] Estiramento a quente por via seca pode ser realizado usando um forno de tubo elétrico, uma placa térmica seca, ou similares. A temperatura pode ser, por exemplo, 140°C a 270°C e preferivelmente 160°C a 230°C. Em estiramento a quente por via seca, fio não estirado (ou fio préestirado) pode ser estirado, por exemplo, 0,5 a 8 vezes, preferivelmente 1 a 4 vezes.
[00135] O estiramento a quente por via úmida e o estiramento a quente por via seca podem ser realizados individualmente, ou eles podem ser realizados em múltiplos estágios, ou em combinação. Ou seja, estiramento a quente por via úmida e estiramento a quente por via seca podem ser realizados em uma combinação apropriada de uma maneira tal que o primeiro estiramento do estágio é realizado por estiramento a quente por via úmida e o segundo estiramento do estágio é realizado por estiramento a quente por via seca, ou o primeiro estiramento do estágio é realizado por estiramento a quente por via úmida e o segundo estiramento do estágio é realizado por estiramento a quente por via úmida, e o terceiro estiramento do estágio é realizado adicionalmente por estiramento a quente por via seca.
[00136] O limite inferior da razão de estiramento final é preferivelmente mais que 1 vez, 2 vezes ou mais, 3 vezes ou mais, 4 vezes ou mais, 5 vezes ou mais, 6 vezes ou mais, 7 vezes ou mais, 8 vezes ou mais, ou 9 vezes ou mais de uma razão de estiramento do fio não estirado (ou fio préestirado). O limite superior é preferivelmente 40 vezes ou menos, 30 vezes ou menos, 20 vezes ou menos, 15 vezes ou menos, 14 vezes ou menos, 13 vezes ou menos, 12 vezes ou menos, 11 vezes ou menos, ou 10 vezes ou menos. <Fibra de fibroína artificial altamente contraída>
[00137] A fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com a presente modalidade é formada por contração das fibras de fibroína artificial mencionadas anteriormente. As fibras de fibroína artificial
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40/59 mencionadas anteriormente podem ser contraídas a uma maior porcentagem de contração comparadas com fibras de proteína conhecidas da técnica relacionada, e podem ser contraídas a uma maior porcentagem de contração em condições mais brandas que aquelas de fibras sintéticas conhecida da técnica relacionada.
[00138] Dessa maneira, na fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com a presente modalidade, uma porcentagem de contração definida pela equação seguinte excede 7%.
Porcentagem de contração = {1- (comprimento da fibra de fibroína artificial contraída/comprimento da fibra de fibroína artificial antes de ser posta em contato com água após fiação)} x 100 (%) [00139] A porcentagem de contração da fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com a presente modalidade é preferivelmente 15% ou mais, é mais preferivelmente mais que 25%, é ainda mais preferivelmente 32% ou mais, é também ainda mais preferivelmente 40% ou mais, é também ainda mais preferivelmente 48% ou mais, é de forma particular preferivelmente 56% ou mais, é ainda mais de forma particular preferivelmente 64% ou mais, e é acima de tudo preferivelmente 72% ou mais. O limite superior da porcentagem de contração é geralmente 80% ou menos.
<Método para produzir fibra de fibroína artificial altamente contraída>
[00140] Um método para produzir uma fibra de fibroína artificial altamente contraída inclui uma etapa de contrair uma fibra de fibroína artificial contendo uma fibroína modificada colocando a fibra de fibroína artificial em contato com água abaixo de um ponto de ebulição (em seguida será referida como “etapa de contração”).
[00141] Na etapa de contração, as fibras de fibroína artificial são colocadas em contato com água abaixo de um ponto de ebulição (em seguida também referida como como uma “etapa de contato”). Por meio disso, a fibra
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41/59 de fibroína artificial pode ser contraída indiferentemente da força externa. Considera-se que a contração sem nenhuma força externa das fibras de fibroína artificial na etapa de contato ocorra em virtude dos motivos seguintes, por exemplo. Em outras palavras, considera-se que, como um motivo, ela ocorra devido a uma estrutura secundária e uma estrutura terciária de fibroína artificial. Por exemplo, como um outro exemplo, considera-se que, em fibras de fibroína artificial tendo tensão residual devido ao estiramento ou similares no processo de produção, tensão residual é aliviada por infiltração de água entre as fibras ou nas fibras. Dessa maneira, considera-se que uma porcentagem de contração da fibra de fibroína artificial na etapa de contração pode ser opcionalmente controlada, por exemplo, de acordo com a magnitude da razão de estiramento no processo de produção da fibra de fibroína artificial descrito anteriormente.
[00142] Uma temperatura da água com a qual as fibras de fibroína artificial são colocadas em contato em a etapa de contato pode ser menor que um ponto de ebulição. Dessa maneira, a manuseabilidade e funcionalidade do processo de contração são melhoradas. Além disso, do ponto de vista de encurtar suficientemente um tempo de contração, o valor do limite inferior da temperatura de água é preferivelmente 10°C ou mais, é mais preferivelmente 40°C ou mais, e é ainda mais preferivelmente 70°C ou mais. O limite superior da temperatura de água é preferivelmente 90°C ou menos.
[00143] Um método de colocar as fibras de fibroína artificial em contato com água na etapa de contato não é particularmente limitado. Exemplos de métodos incluem um método de mergulhar fibras de fibroína artificial em água; um método de pulverizar água nas fibras de fibroína artificial a temperatura normal ou em um estado de vapor aquecido e similares; um método de expor fibras de fibroína artificial a um ambiente de alta umidade cheio com vapor de água; e similares. Dentre esses métodos, na etapa de contato, o método de mergulhar fibras de fibroína artificial em água é
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42/59 preferível em virtude de a redução do tempo de contração poder ser efetivamente atingida, e simplificação de equipamento de processamento poder ser realizada.
[00144] Na etapa de contato, quando as fibras de fibroína artificial são colocadas em contato com água em um estado solto, as fibras de fibroína artificial podem não apenas ser contraídas, mas também frisadas de uma maneira ondulada. A fim de impedir a ocorrência de tal frisado, por exemplo, a etapa de contato é realizada em um estado onde as fibras de fibroína artificial não são soltas, colocando as fibras de fibroína artificial em contato com água abaixo de um ponto de ebulição, alongando-as ao mesmo tempo (alongamento) em uma fibra direção axial.
[00145] A etapa de contração pode incluir adicionalmente, além da etapa de contato, secagem das fibras de fibroína artificial após serem colocadas em contato com água (em seguida, será referida como a “etapa de secagem”).
[00146] A etapa de secagem é uma etapa de secagem as fibras de fibroína artificial que foram submetidas à etapa de contato. A secagem pode ser, por exemplo, secagem natural ou secagem forçada usando uma instalação de secagem. Como o equipamento de secagem, qualquer equipamento de secagem conhecido de tipo contato ou tipo não contato pode ser usado. Além disso, uma temperatura de secagem não é particularmente limitada, desde que ela seja menor que a temperatura na qual, por exemplo, proteínas contidas na fibra de fibroína artificial são decompostas, ou a fibra de fibroína artificial é termicamente danificada. Em geral, a temperatura é em uma faixa de 20°C a 150°C, e a temperatura é preferivelmente em uma faixa de 50°C a 100°C. Quando a temperatura é nessa faixa, as fibras de fibroína artificial são secas mais rapidamente e de forma eficiente sem dano térmico para as fibras de fibroína artificial, ou decomposição de proteínas contidas nas fibras de fibroína artificial. Um tempo de secagem é estabelecido adequadamente de
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43/59 acordo com a temperatura de secagem e similares e, por exemplo, um tempo no qual a influência de supersecagem na qualidade e propriedades físicas da fibra de fibroína artificial pode ser eliminada tanto quanto possível.
[00147] No método para produzir uma fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com a presente modalidade, uma fibra de fibroína artificial altamente contraída tendo uma porcentagem de contração excedendo 7% pode ser obtida através da etapa de contração (a etapa de contato e, se necessário, a etapa de secagem). A porcentagem de contração da fibra de fibroína artificial altamente contraída obtida de acordo com a presente modalidade, é preferivelmente 15% ou mais, é mais preferivelmente mais que 25%, é ainda mais preferivelmente 32% ou mais, é também ainda mais preferivelmente 40% ou mais, é também ainda mais preferivelmente 48% ou mais, é de forma particular preferivelmente 56% ou mais, é ainda mais de forma particular preferivelmente 64% ou mais, e é acima de tudo preferivelmente 72% ou mais. O limite superior da porcentagem de contração é geralmente 80% ou menos.
[00148] A FIG. 5 é uma vista explicativa mostrando esquematicamente um exemplo de um aparelho de produção para produzir fibras de fibroína artificial altamente contraídas. Um aparelho de produção 40 mostrado na FIG. 5 é configurado para incluir um rolo de alimentação 42 para distribuir fibras de fibroína artificial, uma bobinadeira 44 para bobinar fibras de fibroína artificial altamente contraídas 38, um banho de água 46 para realizar a etapa de contato, e um secador 48 para realizar a etapa de secagem.
[00149] Mais especificamente, o rolo de alimentação 42 pode ser carregado com um produto bobinado de fibras de fibroína artificial 36, e as fibras de fibroína artificial 36 são continuamente distribuídas automaticamente do produto bobinado das fibras de fibroína artificial 36 por rotação de um motor elétrico ou similares (não mostrado). A bobinadeira 44 pode continuamente e automaticamente bobinar as fibras de fibroína artificial
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44/59 altamente contraídas 38 produzidas através da etapa de contato e da etapa de secagem após serem alimentadas fora do rolo de alimentação 42 pela rotação de um motor elétrico (não mostrado). Uma velocidade de alimentação das fibras de fibroína artificial 36 pelo rolo de alimentação 42 e a velocidade de bobinamento das fibras de fibroína artificial altamente contraídas 38 pela bobinadeira 44 podem ser controladas independentemente uma da outra. [00150] O banho de água 46 e o secador 48 são dispostos entre o rolo de alimentação 42 e a bobinadeira 44, respectivamente, no lado à montante e no lado à jusante em uma direção de alimentação das fibras de fibroína artificial 36. O aparelho de produção 40 mostrado na FIG. 5 tem rolos de transferência 50 e 52 que transferem as fibras de fibroína artificial 36 que deslocam do rolo de alimentação 42 em direção aa bobinadeira 44.
[00151] O banho de água 46 tem um aquecedor 54, e água quente 47 aquecida pelo aquecedor 54 é acomodada no banho de água 46. Além disso, no banho de água 46, um rolo tensor 56 é instalado em um estado de ficar imerso na água quente 47. Dessa maneira, as fibras de fibroína artificial 36 distribuídas do rolo de alimentação 42 que deslocam em direção à bobinadeira 44 ficando ao mesmo tempo mergulhadas na água quente 47 em um estado em que são bobinadas em torno do rolo tensor 56 no banho de água 46. Um tempo de imersão das fibras de fibroína artificial 36 na água quente 47 é adequadamente controlado de acordo com a velocidade de deslocamento das fibras de fibroína artificial 36.
[00152] O secador 48 tem um par de rolos quentes 58. O par de rolos quentes 58 pode ser bobinado com fibras de fibroína artificial 36 que são separadas do banho de água 46 e deslocam em direção ao lado da bobinadeira 44. Dessa maneira, as fibras de fibroína artificial 36 imersas na água quente no banho de água 46 são aquecidas pelo par de rolos quentes 58 no secador e secas, e então é alimentadas adicionalmente em direção à bobinadeira 44. [00153] Durante a produção das fibras de fibroína artificial altamente
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45/59 contraídas 38 usando o aparelho de produção 40 tendo uma estrutura como essa, primeiramente, por exemplo, o produto bobinado das fibras de fibroína artificial 36 fiadas usando o aparelho de fiação 10 mostrado na FIG. 4, é montado no rolo de alimentação 42. Em seguida, as fibras de fibroína artificial 36 são continuamente extraídas do rolo de alimentação 42 e mergulhadas na água quente 47 no banho de água 46. Neste momento, por exemplo, a velocidade de bobinamento da bobinadeira 44 toma-se menor que a velocidade de alimentação do rolo de alimentação 42. Dessa maneira, a geração de frisagem pode ser impedida, uma vez que as fibras de fibroína artificial 36 são contraídas ao serem colocadas em contato com a água quente 47 em um estado tensionado de maneira a não ficarem soltas entre o rolo de alimentação 42 e a bobinadeira 44.
[00154] Em seguida, as fibras de fibroína artificial 36 contraídas na água quente 47 no banho de água 46 são aquecidas pelo par de rolos quentes 58 do secador 48. Por meio disso, as fibras de fibroína artificial contraídas 36 são secas para formar as fibras de fibroína artificial altamente contraídas 38. Neste momento, controlando uma razão da velocidade de alimentação do rolo de alimentação 42 e da velocidade de bobinamento da bobinadeira 44, é possível contrair adicionalmente as fibras de fibroína artificial 36, ou fazer com que seu comprimento não seja mudado. Em seguida, as fibras de fibroína artificial altamente contraídas obtidas 38 são bobinadas na bobinadeira 44, e por meio disso o produto bobinado das fibras de fibroína artificial altamente contraídas 38 é obtido.
[00155] Em vez do par de rolos quentes 58, as fibras de fibroína artificial 36 podem ser secas usando uma instalação de secagem tal como uma placa térmica seca 64 como mostrado na FIG. 6. Também nesse caso, ajustando uma velocidade relativa entre a velocidade de alimentação do rolo da alimentação 42 e a velocidade de bobinamento da bobinadeira 44 da mesma maneira que no caso de usar o par de rolos quentes 58 como uma
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46/59 instalação de secagem, é possível contrair adicionalmente as fibras de fibroína artificial 36, ou fazer com que seu comprimento não seja mudado. O meio de secagem é constituído pela placa térmica seca 64.
[00156] Como descrito anteriormente, usando o aparelho de produção 40, as fibras de fibroína artificial altamente contraídas alvos 38 podem ser produzidas automaticamente, continuamente, e muito facilmente.
[00157] A FIG. 6 é uma vista explicativa mostrando esquematicamente um outro exemplo de um aparelho de produção para produzir fibras de fibroína artificial altamente contraídas. A FIG. 6(a) mostra um aparelho de processamento que é incluído no aparelho de produção e que implementa a etapa de contato. A FIG. 6(b) mostra um aparelho de secagem que é incluído no aparelho de produção e que implementa a etapa de secagem. O aparelho de produção mostrado na FIG. 6 tem um aparelho de processamento 60 para realizar a etapa de contato com as fibras de fibroína artificial 36, e um aparelho de secagem 62 para secagem as fibras de fibroína artificial 36 no qual a etapa de contato foi realizada pelo aparelho de processamento 60; e tem uma estrutura em que esses aparelhos são independentemente instalados um com o outro.
[00158] Mais especificamente, o aparelho de processamento 60 mostrado na FIG. 6(a) tem uma estrutura em que o secador 48 é omitido do aparelho de produção 40 mostrado na FIG. 5, e o rolo de alimentação 42, o banho de água 46, e a bobinadeira 44 são arranjados na ordem do lado à montante para o lado à jusante em uma direção de deslocamento das fibras de fibroína artificial 36. Tal aparelho de processamento 60 é projetado para fazer com que as fibras de fibroína artificial 36 distribuídas pelo rolo de alimentação 42 sejam mergulhadas em água quente 47 no banho de água 46 e contraídas antes de serem bobinadas pela bobinadeira 44. Além disso, a estrutura é configurada de maneira tal que as fibras de fibroína artificial 36 contraída na água quente 47 sejam bobinadas pela bobinadeira 44.
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47/59 [00159] O aparelho de secagem 62 mostrado na FIG. 6(b) tem o rolo de alimentação 42, a bobinadeira 44, e a placa térmica seca 64. A placa térmica seca 64 é disposta entre o rolo de alimentação 42 e a bobinadeira 44 de maneira tal que uma superfície de aquecimento seca 66 fique em contato com as fibras de fibroína artificial 36 e se estenda ao longo da direção de deslocamento dos mesmos. Neste aparelho de secagem 62, como descrito anteriormente, controlando uma razão da velocidade de alimentação do rolo de alimentação 42 e da velocidade de bobinamento da bobinadeira 44, é possível contrair adicionalmente as fibras de fibroína artificial 36, ou fazer com que seu comprimento não seja mudado.
[00160] Em um caso de usar o aparelho de produção tendo uma estrutura como essa, por exemplo, as fibras de fibroína artificial altamente contraídas alvos 38 podem ser produzidas primeiramente contraindo as fibras de fibroína artificial 36 pelo aparelho de processamento 60, e então secando as fibras de fibroína artificial 36 pelo aparelho de secagem 62.
[00161] O rolo de alimentação 42 e a bobinadeira 44 podem ser omitidos do aparelho de processamento 60 mostrado na FIG. 6(a), e o aparelho de processamento pode ser configurado apenas com o banho de água 46. Em um caso de usar o aparelho de produção tendo um aparelho de processamento como esse, por exemplo, fibras de fibroína artificial altamente contraídas são produzidas em um assim chamado sistema em batelada. <Aplicações de uso de fibra de fibroína artificial altamente contraída> [00162] A fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com a presente invenção tem propriedades tácteis e flexibilidade excelentes em virtude de ela ser contraída a uma alta porcentagem de contração. Portanto, ela é adequada como fibras usadas, por exemplo, para roupa e roupa de cama.
[Método para contrair fibra de fibroína artificial] [00163] O método para produzir uma fibra de fibroína artificial
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48/59 altamente contraída da presente invenção descrito anteriormente pode ser percebido como um método para contrair uma fibra de fibroína artificial, incluindo uma etapa de contrair uma fibra de fibroína artificial contendo uma fibroína modificada colocando a fibra de fibroína artificial em contato com água abaixo de um ponto de ebulição, em que uma porcentagem de contração definida pela equação seguinte excede 7%.
Porcentagem de contração = {1- (comprimento da fibra de fibroína artificial contraída/comprimento da fibra de fibroína artificial antes de ser posta em contato com água após fiação)} x 100 (%).
Exemplos [00164] A seguir, a presente invenção será descrita mais especificamente com base nos exemplos e similares. Entretanto, a presente invenção não é limitada aos Exemplos a seguir.
[(1) Produção de fibroína modificada (fibroína artificial)] (Síntese de ácido nucleico que codifica fibroína modificada e construção de vetor de expressão) [00165] Uma fibroína modificada (PRT399) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7, uma fibroína modificada (PRT380) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, uma fibroína modificada (PRT410) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO 9, e uma fibroína modificada (PRT799) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 foram projetadas.
[00166] A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 é obtida adicionando uma sequência de aminoácidos (incluindo uma marca His) apresentada na SEQ ID NO: 5 na terminação-N de uma sequência de aminoácidos na qual o motivo (A)n é deletado a cada outras duas posições do lado N-terminal até o lado C-terminal da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 correspondendo à fibroína de ocorrência natural e um [(A)n motif-REP] é inserido antes da sequência C-terminal.
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49/59 [00167] A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 é obtida adicionando uma sequência de aminoácidos (incluindo uma marca His) apresentada na SEQ ID NO: 5 na terminação-N de uma sequência de aminoácidos na qual todos os GGX em REP da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 correspondendo à fibroína de ocorrência natural são substituídos por GQX.
[00168] A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 é obtida adicionando uma sequência de aminoácidos (incluindo uma marca His) apresentada na SEQ ID NO: 5 na terminação-N de uma sequência de aminoácidos na qual todos os GGX em REP da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 são substituídos por GQX.
[00169] A sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 é obtida adicionando uma sequência de aminoácidos (incluindo uma marca His) apresentada na SEQ ID NO: 5 na terminação-N de uma sequência de aminoácidos na qual uma marca His foi adicionada à terminação-C de uma sequência obtida repetindo, 4 vezes, a região das 20 sequências de domínio presentes na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 (entretanto, diversos resíduos de aminoácidos no lado C-terminal da região são substituídos).
[00170] Ácidos nucleicos que codificam os tipos tipos de fibroína modificada projetada foram sintetizada respectivamente. No ácido nucleico, um sítio Ndel foi adicionado à extremidade 5’ e um sítio EcoRI foi adicionado à jusante do códon de parada. Esses tipos de ácido nucleicos foram clonados em um vetor de clonagem (pUC118). Depois disso, o mesmo ácido nucleico foi clivado por tratamento de enzima de restrição com Nde\ e EcoRI, e então recombinado em um vetor de expressão pET-22b(+) de proteína para obter um vetor de expressão.
(Expressão de fibroína modificada) [00171] Escherichia coli BLR (DE3) foi transformada com o vetor de
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50/59 expressão pET-22b (+) obtido. O Escherichia coli transformado foi cultivado em 2 mL de um meio LB contendo ampicilina por 15 horas. A solução de cultura foi adicionada a 100 mL de um meio de cultura de semente (Tabela 1) contendo ampicilina de maneira tal que o ODôoo foi 0,005. A temperatura da solução de cultura foi mantida a 30°C e a cultura do frasco foi realizada (por cerca de 15 horas) até o ODôoo atingir 5, por meio disso obtendo uma solução de cultura de semente.
[Tabela 1]
Meio de cultura de semente
| Reagentes Concentração (g/L) | |
| Glicose | 5,0 |
| KH2PO4 | 4,0 |
| K2HPO4 | 9,3 |
| Extrato de levedura | 6,0 |
| Ampicilina | 0,1 |
[00172] A solução de cultura de semente foi adicionada a um jarro fermentador ao qual 500 mL de um meio de produção (Tabela 2) foram adicionados de maneira tal que o OD600 fosse 0,05. A cultura foi realizada mantendo ao mesmo tempo a temperatura da solução de cultura a 37°C e mantendo o pH constante a 6,9. Adicionalmente, a concentração de oxigênio dissolvido na solução de cultura foi mantida a 20% da concentração de saturação do oxigênio dissolvido.
[Tabela 2]
Meio de produção
| Reagentes | Concentração (g/L) |
| Glicose | 12,0 |
| KH2PO4 | 9,0 |
| MgSO4-7H2O | 2,4 |
| Extrato de levedura | 15 |
| FeSO4-7H2O | 0,04 |
| MnSO4-5H2O | 0,04 |
| CaC12-2H2O | 0,04 |
| ADEKANOL (LG-295S, Adeka Corporation) | 0,l(mL/L) |
[00173] Imediatamente após glicose no meio de produção ter sido completamente consumida, uma solução de alimentação (455 g/lL de glicose e 120 g/lL de Extrato de levedura) foi adicionada a um taxa de 1 mL/min. A cultura foi realizada mantendo ao mesmo tempo a temperatura da solução de
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51/59 cultura a 37°C e mantendo o pH constante a 6,9. A cultura foi realizada por 20 horas mantendo ao mesmo tempo a concentração de oxigênio dissolvido na solução de cultura a 20% da concentração de saturação de oxigênio dissolvido. Depois disso, isopropil-P-tiogalactopiranosídeo 1 M (IPTG) foi adicionado à solução de cultura a uma concentração final de 1 mM para introduzir a expressão da fibroína modificada alvo. Vinte horas após adição de IPTG, a solução de cultura foi centrifugada para recuperar as células bacterianas. SDS-PAGE foi realizado usando as células bacterianas preparadas a partir da solução de cultura antes da adição de IPTG e após a adição de IPTG, e a expressão da fibroína modificada alvo foi confirmada pelo aparecimento de uma fita de um tamanho da fibroína modificada alvo dependendo da adição de IPTG.
(Purificação de fibroína modificada) [00174] As células bacterianas recuperadas 2 horas após a adição de IPTG foram lavadas com solução tampão Tris-HCI 20 mM (pH 7,4). As células bacterianas após lavagem foram suspensas em solução tampão TrisHCI 20 mM (pH 7,4) contendo cerca de 1 mM PMSF, e as células foram rompidas com um homogeneizador de alta pressão (disponível da GEA Niro Soavi SpA). As células rompidas foram centrifugadas para obter um precipitado. O precipitado obtido foi lavado com solução tampão Tris-HCI 20 mM (pH 7,4) até alta pureza. O precipitado após lavagem foi suspenso em solução tampão guanidina 8 M (cloridrato de guanidina 8 M, di-hidrogeno fosfato de sódiolO mM, NaCl 20 mM, Tris-HCll mM, pH 7,0) de maneira a ter uma concentração de 100 mg/mL, e dissolvido agitando com um agitador a 60°C por 30 minutos. Após dissolução, diálise foi realizada com água usando um tubo de diálise (tubo de celulose 36/32 fabricado pela Sanko Junyaku Co., Ltd.). A proteína agregada branca obtida após diálise foi recuperada por fiação. Agua foi removida da proteína agregada recuperada com um liofilizador, e o pó de liofilização da fibroína modificada foi obtido.
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52/59 [00175] O grau de purificação da fibroína modificada alvo no pó de liofilização assim obtido foi confirmado por resultados de análise de imagem de eletroforese de gel de poliacrilamida do pó usando TotalLab (Nonlinear
Dynamics Ltd.). Em decorrência disso, a pureza de cada fibroína modificada foi cerca de 85%.
[(2) Produção de fibra de fibroína artificial] (Preparação de solução dope) [00176] Sulfóxido de dimetila (DMSO) em que LiCl foi dissolvido de maneira tal que uma concentração ficasse 4,0% em massa foi preparado como um solvente, o pó de liofilização da fibroína modificada foi adicionado a isso de maneira tal que uma concentração ficasse 18% em massa ou 24% em massa (referir-se à Tabela 3), e a mistura foi dissolvida por 3 horas usando uma batedeira. Depois disso, insolúveis e bolhas foram removidos, e uma solução de fibroína modificada foi obtida.
(Fiação) [00177] A solução de fibroína modificada obtida foi usada como uma solução dope (solução não diluída de fiação), e uma fibra de fibroína artificial fiada e estirada foi produzida por fiação por via úmida - por via seca usando um aparelho de fiação que pode ser considerado o aparelho de fiação 10 mostrado na FIG. 4. O aparelho de fiação usado é um aparelho em que um segundo aparelho de produção de fio não estirado (o segundo banho) é adicionalmente provido entre um aparelho de produção de fio não estirado 2 (o primeiro banho) e um aparelho de estiramento a quente por via úmida 3 (o terceiro banho) no aparelho de fiação 10 mostrado na FIG. 1. Condições para fiação por via úmida - por via seca são como a seguir.
[00178] Diâmetro do bocal de extrusão: 0,2 mm
Velocidade de extrusão (quantidade de descarga): referir-se à Tabela 3
Líquido e temperatura no primeiro banho ao terceiro banho:
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53/59 referir-se à Tabela 3
Velocidade de bobinamento: referir-se à Tabela 3
Razão de estiramento total: referir-se à Tabela 3
Temperatura de secagem: 60°C
Comprimento da lacuna de ar: referir-se à Tabela 3
Petição 870190087335, de 05/09/2019, pág. 64/76 [Tabela 3]
| Solução dope | Descarga | Primeiro banho | Segundo banho | Terceiro banho | Velocidade de bobinamento (m/min) | Razão de estiramento total (vezes) | ||||||
| Fibroína modificad a | Concentraçã 0 (% em massa) | Quantidade de descarga (mg/min) | Comprimento de lacuna de ar (mm) | Líquido | Temperatur a (°C) | Líquido | Temperatura (°C) | Líquido | Temperatura (°C) | |||
| Exemplo de produção 1 | PRT799 | 24 | 53,8 | 1 a2 | 100% de metanol | -5 | 100% de metanol | 16 | Agua | 17 | 1,45 | 1 |
| Exemplo de produção 2 | 2,9 | 2 | ||||||||||
| Exemplo de produção 3 | 4,35 | 3 | ||||||||||
| Exemplo de produção 4 | 5,8 | 4 | ||||||||||
| Exemplo de produção 5 | 18 | 55,1 | 1,49 | 1 | ||||||||
| Exemplo de produção 6 | 2,98 | 2 | ||||||||||
| Exemplo de produção 7 | 4,47 | 3 | ||||||||||
| Exemplo de produção 8 | 5,96 | 4 | ||||||||||
| Exemplo de produção 9 | PRT410 | 24 | 51,9 | 0 | -11 | 14 | 1,4 | 1 | ||||
| Exemplo de produção 10 | 2,8 | 2 | ||||||||||
| Exemplo de produção 11 | 4,2 | 3 | ||||||||||
| Exemplo de produção 12 | 5,6 | 4 | ||||||||||
| Exemplo de produção 13 | PRT399 | 51,1 | 1,38 | 1 | ||||||||
| Exemplo de produção 14 | 2,76 | 2 | ||||||||||
| Exemplo de produção 15 | 4,14 | 3 | ||||||||||
| Exemplo de produção 16 | PRT380 | 47,2 | 11 | 1,27 | 1 |
54/59
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| Exemplo de produção 17 | 2,54 | 2 | ||||||||||
| Exemplo de produção 18 | 3,81 | 3 | ||||||||||
| Exemplo de produção 19 | 5,08 | 4 |
55/59
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56/59 [(3) Produção e avaliação de fibra de fibroína artificial altamente contraída] (Processo de contração) [00179] Fibras de fibroína artificial altamente contraídas foram produzidas realizando, em cada fibra de fibroína artificial obtida nos Exemplos de produção 1 a 19, uma etapa de contato de colocar fibras em contato com água abaixo de um ponto de ebulição (em seguida referida como “contração primária”), ou uma etapa de secagem de secar à temperatura ambiente após realizar a etapa de contato (em seguida referida como “contração secundária”).
<Contração primária>
[00180] Uma pluralidade de fibras de fibroína artificial cada qual tendo um comprimento de 30 cm foram cortadas fora do produto bobinado das fibras de fibroína artificial obtidas nos Exemplos de produção 1 a 19. A pluralidade de fibras de fibroína artificial foi agrupada em feixe para obter um feixe de fibra de fibroína artificial tendo uma finura de 150 denier. Cada feixe de fibra de fibroína artificial foi afixado com 0,08 g de um peso de chumbo e, nesse estado, cada feixe de fibra de fibroína artificial foi imerso em água tendo uma temperatura mostrada nas Tabelas 4 a 7 por 10 minutos (a etapa de contato). Depois disso, o comprimento de cada feixe de fibra de fibroína artificial foi medido em água. A medição do comprimento do feixe de fibra de fibroína artificial em água foi realizada com o feixe de fibra de fibroína artificial afixado com um peso de chumbo de 0,08 g a fim de eliminar o frisado do feixe de fibra de fibroína artificial. Em seguida, uma porcentagem de contração (%) de cada fibra de fibroína artificial foi calculada de acordo com a Equação I. Na Equação I, L0 indica o comprimento do feixe de fibra de fibroína artificial (aqui, 30 cm) antes de ser colocado em contato com água após fiação, e Lw indica o comprimento do feixe de fibra de fibroína artificial que passou por contração primária.
Equação I: porcentagem de contração (porcentagem de contração primária) =
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57/59 {1-(Lw/LO)} x 100 (%) <Contração secundária>
[00181] Após imersão em água na contração primária (a etapa de contato), os feixes de fibra de fibroína artificial foram removidos da água. Os feixes de fibra de fibroína artificial extraídos foram secos à temperatura ambiente por 2 horas com um peso de chumbo de 0,08 g afixado a isso (a etapa de secagem). Após secagem, o comprimento de cada feixe de fibra de fibroína artificial foi medido. Em seguida, uma porcentagem de contração (%) de cada fibra de fibroína artificial foi calculada de acordo com a Equação II. Na Equação II, L0 indica o comprimento do feixe de fibra de fibroína artificial (aqui, 30 cm) antes de ser colocado em contato com água após fiação, e Lwd indica o comprimento do feixe de fibra de fibroína artificial que passou por contração primária.
Equação II: porcentagem de contração (porcentagem de contração secundária) = {I-(Lwd/L0)} x 100 (%) [00182] Os resultados são mostrados nas Tabelas 4 a 7.
[Tabela 4]_______________________________________________________________
| Fibra de fibroína artificial | Temperatura de água abaixo do ponto de ebulição (°C) | Contração primária (%) | Contração secundária (%) | |
| Exemplo de produção 1 | 24% em peso PRT799 Xl | 20 | 0,0 | 7,8 |
| Exemplo de produção 2 | 24% em peso PRT799 X2 | -1,2 | 10,3 | |
| Exemplo de produção 3 | 24% em peso PRT799 X3 | 7,2 | 21,2 | |
| Exemplo de produção 4 | 24% em peso PRT799 X4 | 13,5 | 26,3 | |
| Exemplo de produção 6 | 18% em peso PRT799 X2 | -2,3 | 9,5 | |
| Exemplo de produção 7 | 18% em peso PRT799 X3 | 6,0 | 19,7 | |
| Exemplo de produção 8 | 18% em peso PRT799 X4 | 14,3 | 27,5 | |
| Exemplo de produção 2 | 24% em peso PRT799 X2 | 40 | -5,3 | 7,2 |
| Exemplo de produção 3 | 24% em peso PRT799 X3 | 8,7 | 21,3 | |
| Exemplo de produção 4 | 24% em peso PRT799 X4 | 14,5 | 26,0 | |
| Exemplo de produção 6 | 18% em peso PRT799 X2 | -4,3 | 7,3 |
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58/59
| Exemplo de produção 7 | 18% em peso PRT799 x3 | 6,2 | 18,3 | |
| Exemplo de produção 8 | 18% em peso PRT799 X4 | 16,0 | 28,7 | |
| Exemplo de produção 3 | 24% em peso PRT799 x3 | 60 | 6,8 | 21,0 |
| Exemplo de produção 4 | 24% em peso PRT799 X4 | 15,0 | 27,5 | |
| Exemplo de produção 6 | 18% em peso PRT799 X2 | -1,5 | 10,7 | |
| Exemplo de produção 7 | 18% em peso PRT799 x3 | 3,3 | 18,2 | |
| Exemplo de produção 8 | 18% em peso PRT799 X4 | 16,2 | 29,0 |
[Tabela 5]
| Fibra de fibroína artificial | Temperatura de água abaixo do ponto de ebulição (°C) | Contração primária (%) | Contração secundária (%) | |
| Exemplo de produção 10 | 24% em peso PRT410 X2 | 20 | -2,3 | 8,7 |
| Exemplo de produção 11 | 24% em peso PRT410 X3 | 4,7 | 16,7 | |
| Exemplo de produção 12 | 24% em peso PRT410 X4 | 10,3 | 22,3 | |
| Exemplo de produção 11 | 24% em peso PRT410 X3 | 40 | 4,7 | 17,5 |
| Exemplo de produção 12 | 24% em peso PRT410 X4 | 11,5 | 24,0 | |
| Exemplo de produção 11 | 24% em peso PRT410 X3 | 60 | 2,0 | 16,5 |
| Exemplo de produção 12 | 24% em peso PRT410 X4 | 1,08 | 25,0 |
[Tabela 6]
| Fibra de fibroína artificial | Temperatura de água abaixo do ponto de ebulição (°C) | Contração primária (%) | Contração secundária (%) | |
| Exemplo de produção 13 | 24% em peso PRT399 xl | 20 | -3,5 | 7,6 |
| Exemplo de produção 14 | 24% em peso PRT399 X2 | 3,7 | 12,5 | |
| Exemplo de produção 15 | 24% em peso PRT399 x3 | 7,0 | 16,8 | |
| Exemplo de produção 14 | 24% em peso PRT399 X2 | 40 | 3,0 | 12,7 |
| Exemplo de produção 15 | 24% em peso PRT399 x3 | 7,3 | 16,7 | |
| Exemplo de produção 14 | 24% em peso PRT399 X2 | 60 | 3,3 | 9,3 |
| Exemplo de produção 15 | 24% em peso PRT399 x3 | 6,8 | 14,2 |
[Tabela 7]
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59/59
| Fibra de fibroína artificial | Temperatura de água abaixo do ponto de ebulição (°C) | Contração primária (%) | Contração secundária (%) | |
| Exemplo de produção 16 | 24% em peso PRT380 Xl | 20 | -1,1 | 9,4 |
| Exemplo de produção 17 | 24% em peso PRT380 X2 | 2,7 | 13,3 | |
| Exemplo de produção 18 | 24% em peso PRT380 x3 | 7,0 | 17,7 | |
| Exemplo de produção 19 | 24% em peso PRT380 X4 | 10,0 | 20,2 | |
| Exemplo de produção 17 | 24% em peso PRT380 X2 | 40 | 3,3 | 14,2 |
| Exemplo de produção 18 | 24% em peso PRT380 x3 | 7,7 | 19,0 | |
| Exemplo de produção 19 | 24% em peso PRT380 X4 | 12,0 | 22,0 | |
| Exemplo de produção 17 | 24% em peso PRT380 X2 | 60 | 2,7 | 14,3 |
| Exemplo de produção 18 | 24% em peso PRT380 x3 | 8,2 | 20,3 | |
| Exemplo de produção 19 | 24% em peso PRT380 X4 | 12,0 | 23,2 |
[00183] A fibra de fibroína artificial altamente contraída da presente invenção teve uma porcentagem de contração suficientemente alta e foi excelente em propriedades tácteis e flexibilidade. Além disso, a fibra de fibroína artificial altamente contraída pode ser produzida com segurança em virtude de ela poder ser fabricada pela etapa de contato de ser colocada em contato com água abaixo de um ponto de ebulição, e a etapa de secagem de secar a fibra de fibroína artificial após a etapa de contato, se necessário.
Lista de Sinais de Referência
1: aparelho de extrusão, 2: aparelho de produção de fio não estirado, 3: aparelho de estiramento a quente por via úmida, 4: aparelho de secagem, 6: solução dope, 10: aparelho de fiação, 20: tanque de líquido de coagulação, 21: banho de estiramento, 36: fibra de fibroína artificial, 38: fibra de fibroína artificial altamente contraída, 40: aparelho de produção, 42: rolo de alimentação, 44: bobinadeira, 46: banho de água, 48: secador, 54: aquecedor, 56: rolo tensor, 58: rolo quente, 60: aparelho de processamento, 62: aparelho de secagem, 64: placa térmica seca.
Claims (13)
- REIVINDICAÇÕES1. Fibra de fibroína artificial altamente contraída, caracterizada pelo fato de que compreende:uma fibroína modificada, em que uma porcentagem de contração definida pela equação seguinte excede 7%.porcentagem de contração = {1- (comprimento da fibra de fibroína artificial contraída/comprimento da fibra de fibroína artificial antes de ser posta em contato com água após fiação)} x 100 (%)
- 2. Fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fibroína modificada é uma fibroína de seda de aranha modificada.
- 3. Fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que é contraída ao ser colocada em contato com água abaixo de um ponto de ebulição.
- 4. Fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que uma temperatura da água é 10°C a 90°C.
- 5. Fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que é contraída adicionalmente secando após ser colocada em contato com a água.
- 6. Método para produzir uma fibra de fibroína artificial altamente contraída, caracterizado pelo fato de que compreende:uma etapa de contrair uma fibra de fibroína artificial contendo uma fibroína modificada colocando a fibra de fibroína artificial em contato com água abaixo de um ponto de ebulição, em que uma porcentagem de contração definida pela equação seguinte excede 7%.porcentagem de contração = {1- (comprimento da fibra dePetição 870190087335, de 05/09/2019, pág. 71/762/3 fibroína artificial contraída/comprimento da fibra de fibroína artificial antes de ser posta em contato com água após fiação)} x 100 (%)
- 7. Método para produzir uma fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a fibroína modificada é uma fibroína de seda de aranha modificada.
- 8. Método para produzir uma fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que uma temperatura da água é 10°C a 90°C.
- 9. Método para produzir uma fibra de fibroína artificial altamente contraída de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a etapa de contrair a fibra de fibroína artificial inclui adicionalmente secar a fibra de fibroína artificial após ser colocada em contato com a água.
- 10. Método para contrair uma fibra de fibroína artificial, caracterizado pelo fato de que compreende:uma etapa de contrair uma fibra de fibroína artificial contendo uma fibroína modificada colocando a fibra de fibroína artificial em contato com água abaixo de um ponto de ebulição, em que uma porcentagem de contração definida pela equação seguinte excede 7%.porcentagem de contração = {1- (comprimento da fibra de fibroína artificial contraída/comprimento da fibra de fibroína artificial antes de ser posta em contato com água após fiação)} x 100 (%)
- 11. Método para contrair uma fibra de fibroína artificial de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a fibroína modificada é uma fibroína de seda de aranha modificada.
- 12. Método para contrair uma fibra de fibroína artificial de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que uma temperatura da água é 10°C a 90°C.Petição 870190087335, de 05/09/2019, pág. 72/763/3
- 13. Método para contrair uma fibra de fibroína artificial de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a etapa de contrair a fibra de fibroína artificial inclui adicionalmente secar a fibra de fibroína artificial após ser colocada em contato com a água.
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