KR102242785B1 - 개변 피브로인 - Google Patents

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Abstract

식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하는 개변 피브로인으로서, 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, 적어도 REP 중의 1 또는 복수의 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것에 상당하는, 글라이신 잔기의 함유량이 저감된 아미노산 서열을 갖는, 개변 피브로인.
[식 1 중, (A)n 모티프는 4∼20 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타내고, 또한 (A)n 모티프 중의 전체 아미노산 잔기수에 대한 알라닌 잔기수가 83% 이상이다. REP는 10∼200 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타낸다. m은 8∼300의 정수를 나타낸다. 복수 존재하는 (A)n 모티프 등은 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 된다.]

Description

개변 피브로인
본 발명은 개변 피브로인에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 글라이신 잔기의 함유량이 저감된 개변 피브로인에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 개변 피브로인을 코딩하는 핵산, 당해 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 당해 발현 벡터로 형질전환된 숙주, 및 개변 피브로인으로부터 제조된 제품에도 관한 것이다.
피브로인은 섬유상의 단백질의 일종이고, β 플리티드 시트의 형성으로 이어지는 글라이신 잔기, 알라닌 잔기 및 세린 잔기를 최대 90% 함유한다(비특허문헌 1). 피브로인으로서, 곤충 및 거미류가 산생하는 사(絲)를 구성하는 단백질(견(絹) 단백질, 호넷 실크 단백질, 스파이더 실크 단백질) 등이 알려져 있다.
견 단백질은 우수한 기계적 특성, 흡습 특성 및 소취 특성을 가져, 의복 원료로서 널리 이용되고 있는 소재이다. 또한 견사는 면역 관용적인 천연 섬유이고, 생체 친화성이 높기 때문에 수술용 봉합사 등의 용도에도 이용되고 있다.
거미에는 최대 7종류의 견사선이 존재하고, 각각 성질이 상이한 피브로인(스파이더 실크 단백질)을 산생한다. 스파이더 실크 단백질은, 그 원천인 기관에 따라, 높은 인성을 갖는 메이저 앰풀레이트 스파이더 단백질(major ampullate spider protein, MaSp), 고도한 신장력을 갖는 마이너 앰풀레이트 스파이더 단백질(minor ampullate spider protein, MiSp), 및 편상(flagelliform(Flag)), 관상(tubuliform), 집합(aggregate), 포도상(aciniform) 및 배상(pyriform)의 각 스파이더 실크 단백질이라고 명명되고 있다. 특히, 우수한 강도(응력 및 터프니스)와 신도를 갖는 것에 의해 높은 인성을 갖는 메이저 앰풀레이트 스파이더 단백질에 있어서 구조적 연구가 집중적으로 행해지고 있다(특허문헌 1 및 특허문헌 2).
피브로인에 특이적인 구조의 하나로서, GPGXX, 알라닌 잔기가 풍부한 신장 영역((A)n 또는 (GA)n), GGX, 및 스페이서로 분류되는 아미노산 모티프가 반복된 구조가 알려져 있다(비특허문헌 2). 또한, (GA)n 모티프를 (A)n 모티프로 치환하는 것에 의해 신도는 감소하지만 인장 강도가 증가하는 것, GPGXX 모티프의 수를 증가시키는 것에 의해 신도가 증가하는 것, GPGXX 모티프 중 몇 개를 (A)n 모티프로 치환하는 것에 의해 인장 강도가 증가하는 것이 보고되어 있다(특허문헌 2). 또한, GGX 및 GPGXX 모티프는 사에 탄성을 주는 가요성의 나선 구조를 취한다고 생각되고 있다(특허문헌 3).
재조합 스파이더 실크 단백질 및 재조합 견 단백질은 몇 가지의 이종(異種) 단백질 생산계에서 산생되고 있다. 예를 들면, 트랜스제닉 염소, 트랜스제닉 누에, 또는 재조합 식물 혹은 포유류 세포가 이용되고 있다(비특허문헌 3). 그러나, 이들 생산계에서는, 생산 속도가 느려, 상업 레벨에 알맞은 대량 생산에는 부적합하다(특허문헌 4 및 5). 대량 생산이 가능한 생산계로서 효모, 곰팡이, 그램 음성 세균, 그램 양성 세균 등의 생물에 의한 재조합 피브로인 생산도 다수 보고되어 있고 일정한 성과가 얻어져 있지만, 신도 및 인장 강도가 우수한 재조합 피브로인을 공업적으로 대량 생산할 수 있음에는 도달해 있지 않다(특허문헌 5).
일본 특허공개 2012-55269호 공보 일본 특허공표 2005-502347호 공보 일본 특허공표 2009-505668호 공보 일본 특허공표 2014-502140호 공보 국제 공개 제2015/042164호
Asakura 등, Encyclopedia of Agricultural Science, AcademicPress: New York, NY, 1994년, Vol. 4, pp. 1-11 Microbial Cell Factories, 2004년, 3:14 Science, 2002년, 295권, pp. 472-476
피브로인은, 그의 우수한 특성에 의해, 의료(醫療), 항공, 의료(衣料) 등의 다양한 산업 분야에 있어서의 신소재로서 주목받고 있다. 그러나, 상업 레벨에 알맞은 생산량을 달성하기 위해서는, 피브로인의 생산성을 보다 향상시키는 것이 필요하다.
본 발명은, 피브로인의 강도와 신도를 유지하면서, 생산성이 향상된 개변 피브로인의 제공을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 공업적으로 대량 생산 가능한 방법을 여러 가지 검토한 결과, 피브로인의 신장에 관여하고 있다고 생각되고 있는 GGX 모티프 또는 GPGXX 모티프를 개변해서 글라이신 잔기의 함유량을 저감하는 것에 의해, 의외롭게도 강도(응력 및 터프니스)와 신도를 유지한 채, 생산성을 향상시킬 수 있는 것을 발견했다. 본 발명은 이 신규한 지견에 기초한다.
즉, 본 발명은, 예를 들면, 이하의 각 발명에 관한 것이다.
[1]
식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하는 개변 피브로인으로서,
상기 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, 적어도 REP 중의 1 또는 복수의 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것에 상당하는, 글라이신 잔기의 함유량이 저감된 아미노산 서열을 갖는, 개변 피브로인.
[식 1 중, (A)n 모티프는 4∼20 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타내고, 또한 (A)n 모티프 중의 전체 아미노산 잔기수에 대한 알라닌 잔기수가 83% 이상이다. REP는 10∼200 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타낸다. m은 8∼300의 정수를 나타낸다. 복수 존재하는 (A)n 모티프는 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 된다. 복수 존재하는 REP는 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 된다.]
[2]
상기 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, REP 중의 GGX 및 GPGXX(단, X는 글라이신 이외의 아미노산 잔기를 나타낸다)로부터 선택되는 적어도 하나의 모티프 서열에 있어서, 적어도 1 또는 복수의 당해 모티프 서열 중의 1개의 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는, [1]에 기재된 개변 피브로인.
[3]
글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 모티프 서열의 비율이, 전체 모티프 서열에 대해서, 10% 이상인, [2]에 기재된 개변 피브로인.
[4]
식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하는 개변 피브로인으로서,
상기 도메인 서열로부터, 가장 C 말단측에 위치하는 (A)n 모티프부터 상기 도메인 서열의 C 말단까지의 서열을 제외한 서열 중의 전체 REP에 포함되는 XGX(단, X는 글라이신 이외의 아미노산 잔기를 나타낸다)로 이루어지는 아미노산 서열의 총 아미노산 잔기수를 z로 하고, 상기 도메인 서열로부터, 가장 C 말단측에 위치하는 (A)n 모티프부터 상기 도메인 서열의 C 말단까지의 서열을 제외한 서열 중의 총 아미노산 잔기수를 w로 했을 때에, z/w가 50.9% 이상인, 개변 피브로인.
[식 1 중, (A)n 모티프는 4∼20 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타내고, 또한 (A)n 모티프 중의 전체 아미노산 잔기수에 대한 알라닌 잔기수가 83% 이상이다. REP는 10∼200 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타낸다. m은 8∼300의 정수를 나타낸다. 복수 존재하는 (A)n 모티프는 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 된다. 복수 존재하는 REP는 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 된다.]
[5]
천연 유래의 피브로인과 비교해서, REP 중의 1 또는 복수의 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것에 상당하는 데 더하여, 추가로 1 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는, [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 개변 피브로인.
[6]
상기 천연 유래의 피브로인이 곤충 또는 거미류 유래의 피브로인인, [5]에 기재된 개변 피브로인.
[7]
상기 천연 유래의 피브로인이 거미류의 메이저 앰풀레이트 스파이더 단백질(MaSp) 또는 마이너 앰풀레이트 스파이더 단백질(MiSp)인, [5]에 기재된 개변 피브로인.
[8]
상기 도메인 서열이, 상기 천연 유래의 피브로인과 비교해서, REP 중의 GGX 및 GPGXX(단, X는 글라이신 이외의 아미노산 잔기를 나타낸다)로부터 선택되는 적어도 하나의 모티프 서열에 있어서, 적어도 1 또는 복수의 당해 모티프 서열 중의 1개의 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖고, 또한 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 모티프 서열의 비율이, 전체 모티프 서열에 대해서, 10% 이상인, [5]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 개변 피브로인.
[9]
상기 다른 아미노산 잔기가 글루타민(Q) 잔기, 발린(V) 잔기, 류신(L) 잔기, 아이소류신(I) 잔기, 메티오닌(M) 잔기, 프롤린(P) 잔기, 페닐알라닌(F) 잔기, 트립토판(W) 잔기, 아스파라긴(N) 잔기, 세린(S) 잔기, 라이신(K) 잔기 및 글루탐산(E) 잔기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인, [8]에 기재된 개변 피브로인.
[10]
상기 다른 아미노산 잔기가 글루타민(Q) 잔기인, [8]에 기재된 개변 피브로인.
[11]
상기 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, 추가로 적어도 1 또는 복수의 (A)n 모티프가 결실한 것에 상당하는, (A)n 모티프의 함유량이 저감된 아미노산 서열을 갖는, [1]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 개변 피브로인.
[12]
상기 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, 적어도 N 말단측으로부터 C 말단측을 향해서 1∼3개의 (A)n 모티프마다 1개의 (A)n 모티프가 결실한 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는, [11]에 기재된 개변 피브로인.
[13]
상기 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, 적어도 N 말단측으로부터 C 말단측을 향해서 2개 연속한 (A)n 모티프의 결실, 및 1개의 (A)n 모티프의 결실이 이 순서로 반복된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는, [11]에 기재된 개변 피브로인.
[14]
N 말단측으로부터 C 말단측을 향해서, 서로 이웃하는 2개의 [(A)n 모티프-REP] 유닛의 REP의 아미노산 잔기수를 순차적으로 비교해서, 아미노산 잔기수가 적은 REP의 아미노산 잔기수를 1로 했을 때, 다른 쪽의 REP의 아미노산 잔기수의 비가 1.8∼11.3이 되는 상기 서로 이웃하는 2개의 [(A)n 모티프-REP] 유닛의 아미노산 잔기수를 서로 합한 합계값을 x로 하고, 상기 도메인 서열의 총 아미노산 잔기수를 y로 했을 때에, x/y의 최대값이 20% 이상인, [11]∼[13] 중 어느 하나에 기재된 개변 피브로인.
[15]
서열번호 3, 서열번호 4 혹은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 3, 서열번호 4 혹은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 개변 피브로인.
[16]
추가로, N 말단 및 C 말단 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 태그 서열을 포함하는, [1]∼[15] 중 어느 하나에 기재된 개변 피브로인.
[17]
상기 태그 서열이 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, [16]에 기재된 개변 피브로인.
[18]
서열번호 8, 서열번호 9 혹은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8, 서열번호 9 혹은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 개변 피브로인.
[19]
[1]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 개변 피브로인을 코딩하는 핵산.
[20]
[19]에 기재된 핵산의 상보쇄와 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이징하고, 또한 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하는 개변 피브로인을 코딩하는 핵산.
[식 1 중, (A)n 모티프는 4∼20 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타내고, 또한 (A)n 모티프 중의 전체 아미노산 잔기수에 대한 알라닌 잔기수가 83% 이상이다. REP는 10∼200 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타낸다. m은 8∼300의 정수를 나타낸다. 복수 존재하는 (A)n 모티프는 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 된다. 복수 존재하는 REP는 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 된다.]
[21]
[19]에 기재된 핵산과 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하는 개변 피브로인을 코딩하는 핵산.
[식 1 중, (A)n 모티프는 4∼20 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타내고, 또한 (A)n 모티프 중의 전체 아미노산 잔기수에 대한 알라닌 잔기수가 83% 이상이다. REP는 10∼200 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타낸다. m은 8∼300의 정수를 나타낸다. 복수 존재하는 (A)n 모티프는 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 된다. 복수 존재하는 REP는 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 된다.]
[22]
[19]∼[21] 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열과, 당해 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 1 또는 복수의 조절 서열을 갖는 발현 벡터.
[23]
플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인, [22]에 기재된 발현 벡터.
[24]
[22] 또는 [23]에 기재된 발현 벡터로 형질전환된 숙주.
[25]
원핵생물인, [24]에 기재된 숙주.
[26]
상기 원핵생물이 에셔리키아속, 브레비바실러스속, 세라티아속, 바실러스속, 마이크로박테리움속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속 및 슈도모나스속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 속에 속하는 미생물인, [25]에 기재된 숙주.
[27]
진핵생물인, [24]에 기재된 숙주.
[28]
상기 진핵생물이 효모, 사상 진균 또는 곤충 세포인, [27]에 기재된 숙주.
[29]
상기 효모가 사카로마이세스속, 스키조사카로마이세스속, 클루이베로마이세스속, 트리코스포론속, 쉬완니오마이세스속, 피키아속, 칸디다속, 야로위아속 및 한세눌라속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 속에 속하는 효모인, [28]에 기재된 숙주.
[30]
상기 사카로마이세스속에 속하는 효모가 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)이고, 상기 스키조사카로마이세스속에 속하는 효모가 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)이고, 상기 클루이베로마이세스속에 속하는 효모가 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)이고, 상기 트리코스포론속에 속하는 효모가 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans)이고, 상기 쉬완니오마이세스속에 속하는 효모가 쉬완니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius)이고, 상기 피키아속에 속하는 효모가 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)이고, 상기 칸디다속에 속하는 효모가 칸디다 알비칸스(Candida albicans)이고, 상기 야로위아속에 속하는 효모가 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)이고, 상기 한세눌라속에 속하는 효모가 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)인, [29]에 기재된 숙주.
[31]
상기 사상 진균이 아스퍼질러스속, 페니실륨속 및 무코르속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 속에 속하는 사상 진균인, [28]에 기재된 숙주.
[32]
상기 아스퍼질러스속에 속하는 사상 진균이 아스퍼질러스 오라이재이고, 상기 페니실륨속에 속하는 사상 진균이 페니실륨 크라이소제넘이며, 상기 무코르속에 속하는 사상 진균이 무코르 프라질리스인, [31]에 기재된 숙주.
[33]
상기 곤충 세포가 인시류의 곤충 세포인, [28]에 기재된 숙주.
[34]
상기 곤충 세포가 스포돕테라 프루지퍼다(Spodoptera frugiperda) 유래의 곤충 세포, 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 유래의 곤충 세포인, [28]에 기재된 숙주.
[35]
[1]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 개변 피브로인을 포함하고,
섬유, 사, 필라멘트, 필름, 발포체, 구체, 나노피브릴, 하이드로겔, 수지 및 그의 등가물로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 제품.
본 발명에 의하면, 피브로인의 강도와 신도를 유지하면서, 생산성이 향상된 개변 피브로인의 제공이 가능해진다. 피브로인의 GGX 모티프 및 GPGXX 모티프는, 피브로인 섬유의 신도에 관여하고 있다고 생각되고 있었기 때문에, 이들 모티프의 글라이신 잔기(G)를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것은, 이 피브로인 섬유의 신도에 크게 영향을 준다고 생각되고 있었다. 그러나, 본 발명자들은, GGX 모티프 및 GPGXX 모티프 중 1개의 G를 다른 아미노산으로 치환시키더라도, 다른 쪽의 G를 잔존시켜 두는 것에 의해, 피브로인 섬유의 신도에 영향을 주는 일은 없고, 또한 재조합 단백질 생산계에서의 생산량을 현저하게 향상시킬 수 있는 것을 발견했다. 본 발명에 의하면, 이와 같은 예상외의 효과가 나타난다.
도 1은 천연 유래의 피브로인의 z/w(%)의 값의 분포를 나타내는 도면이다.
도 2는 개변 피브로인의 도메인 서열을 나타내는 모식도이다.
도 3은 천연 유래의 피브로인의 x/y(%)의 값의 분포를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대하여 상세히 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
〔개변 피브로인〕
본 발명에 따른 개변 피브로인은, 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하는 단백질이다. 개변 피브로인은, 도메인 서열의 N 말단측 및 C 말단측 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 추가로 아미노산 서열(N 말단 서열 및 C 말단 서열)이 부가되어 있어도 된다. N 말단 서열 및 C 말단 서열은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 전형적으로는, 피브로인에 특징적인 아미노산 모티프의 반복을 갖지 않는 영역이고, 100 잔기 정도의 아미노산으로 이루어진다.
본 명세서에 있어서 「개변 피브로인」이란, 그 도메인 서열이 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열과는 상이한 피브로인을 의미한다. 본 명세서에서 말하는 「천연 유래의 피브로인」도 또한, 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하는 단백질이다.
「개변 피브로인」은, 본 발명에서 특정되는 아미노산 서열을 갖는 것이면, 천연 유래의 피브로인에 의거해서 그 아미노산 서열을 개변한 것(예를 들면, 클로닝된 천연 유래의 피브로인의 유전자 서열을 개변하는 것에 의해 아미노산 서열을 개변한 것)이어도 되고, 또한 천연 유래의 피브로인에 상관없이 인공적으로 설계 및 합성한 것(예를 들면, 설계한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 화학 합성하는 것에 의해 원하는 아미노산 서열을 갖는 것)이어도 된다.
본 명세서에 있어서 「도메인 서열」이란, 피브로인 특유의 결정 영역(전형적으로는, 아미노산 서열의 (A)n 모티프에 상당한다)과 비결정 영역(전형적으로는, 아미노산 서열의 REP에 상당한다)을 생기게 하는 아미노산 서열이고, 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 아미노산 서열을 의미한다. 여기에서, (A)n 모티프는 4∼20 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타내고, 또한 (A)n 모티프 중의 전체 아미노산 잔기수에 대한 알라닌 잔기수가 83% 이상이다. REP는 10∼200 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타낸다. m은 8∼300의 정수를 나타낸다. 복수 존재하는 (A)n 모티프는 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 된다. 복수 존재하는 REP는 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 된다.
(A)n 모티프는, (A)n 모티프 중의 전체 아미노산 잔기수에 대한 알라닌 잔기수가 83% 이상이면 되지만, 86% 이상인 것이 바람직하고, 90% 이상인 것이 보다 바람직하고, 95% 이상인 것이 더 바람직하며, 100%인 것(알라닌 잔기만으로 구성되는 것을 의미함)이 더 바람직하다. 도메인 서열 중에 복수 존재하는 (A)n 모티프는 적어도 7개가 알라닌 잔기만으로 구성되는 것이 바람직하다. 알라닌 잔기만으로 구성된다는 것은, (A)n 모티프가 (A)n(A는 알라닌 잔기를 나타내고, n은 4∼20의 정수, 바람직하게는 4∼16의 정수를 나타낸다)으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 의미한다.
일 실시형태에 따른 개변 피브로인은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, 글라이신 잔기의 함유량이 저감된 아미노산 서열을 갖는다. 당해 개변 피브로인은, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, 적어도 REP 중의 1 또는 복수의 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이라고 할 수 있다.
본 실시형태에 따른 개변 피브로인은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, REP 중의 GGX 및 GPGXX(단, X는 글라이신 이외의 아미노산 잔기를 나타낸다)로부터 선택되는 적어도 하나의 모티프 서열에 있어서, 적어도 1 또는 복수의 당해 모티프 서열 중의 1개의 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것인 것이 바람직하다. 이에 의해, 본 발명에 의한 효과가 한층 더 현저히 나타난다.
본 실시형태에 따른 개변 피브로인은, 전술의 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 모티프 서열의 비율이, 전체 모티프 서열에 대해서, 10% 이상인 것이 보다 바람직하다. 이에 의해, 신도를 감소시킴이 없이, 재조합 단백질 생산계에서의 생산량을 현저하게 향상시킬 수 있다는 본 발명에 의한 효과를 보다 안정되게 발휘할 수 있다.
본 실시형태에 따른 개변 피브로인은, 전술한 REP 중의 글라이신 잔기에 관한 개변에 더하여, 추가로, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 것에 상당하는 아미노산 서열의 개변이 있어도 된다.
본 실시형태에 따른 개변 피브로인은, 예를 들면, 클로닝된 천연 유래의 피브로인의 유전자 서열로부터 REP 중의 1 또는 복수의 글라이신 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환시키는 것에 의해 얻을 수 있다. 또한, 예를 들면, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터 REP 중의 1 또는 복수의 글라이신 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 것에 상당하는 아미노산 서열을 설계하고, 설계한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 화학 합성하는 것에 의해 얻을 수도 있다. 어느 경우에 있어서도, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터 REP 중의 1 또는 복수의 글라이신 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 것에 상당하는 개변에 더하여, 추가로 1 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 것에 상당하는 아미노산 서열의 개변을 행해도 된다. 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가는 부분특이적 돌연변이 유발법 등의 당업자에게 주지된 방법에 의해 행할 수 있다. 구체적으로는, Nucleic Acid Res. 10, 6487(1982), Methods in Enzymology, 100, 448(1983) 등의 문헌에 기재되어 있는 방법에 준하여 행할 수 있다.
천연 유래의 피브로인은, 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하는 단백질이고, 구체적으로는, 예를 들면, 곤충 또는 거미류가 산생하는 피브로인을 들 수 있다.
곤충이 산생하는 피브로인으로서는, 예를 들면, 봄빅스 모리(Bombyx mori), 봄빅스 만다리나(Bombyx mandarina), 천잠(Antheraea yamamai), 작잠(Anteraea pernyi), 풍잠(Eriogyna pyretorum), 비잠(Pilosamia Cynthia ricini), 저잠(Samia cynthia), 율충(Caligura japonica), 안테래아 밀리타(Antheraea mylitta), 안테래아 아싸마(Antheraea assama) 등의 누에가 산생하는 견 단백질, 황말벌(Vespa simillima xanthoptera)의 유충이 토출하는 호넷 실크 단백질을 들 수 있다.
곤충이 산생하는 피브로인의 보다 구체적인 예로서는, 예를 들면, 누에 피브로인 L쇄(GenBank 수탁번호 M76430(염기 서열), AAA27840.1(아미노산 서열))을 들 수 있다.
거미류가 산생하는 피브로인으로서는, 예를 들면, Araneus ventricosus, Araneus diadematus, Araneus pinguis, Araneus pentagrammicus 및 Araneus nojimai 등의 Araneus속에 속하는 거미, Neoscona scylla, Neoscona nautica, Neoscona adianta 및 Neoscona scylloides 등의 Neoscona속에 속하는 거미, Pronoides brunneus 등의 Pronus속에 속하는 거미, Cyrtarachne bufo 및 Cyrtarachne inaequalis 등의 Cyrtarachne속에 속하는 거미, Gasteracantha kuhli 및 Gasteracantha mammosa 등의 Gasteracantha속에 속하는 거미, Ordgarius hobsoni 및 Ordgarius sexspinosus 등의 Ordgarius속에 속하는 거미, Argiope amoena, Argiope minuta 및 Argiope bruennichi 등의 Argiope속에 속하는 거미, Arachnura logio 등의 Arachnura속에 속하는 거미, Acusilas coccineus 등의 Acusilas속에 속하는 거미, Cyrtophora moluccensis, Cyrtophora exanthematica 및 Cyrtophora unicolor 등의 Cytophora속에 속하는 거미, Poltys illepidus 등의 Poltys속에 속하는 거미, Cyclosa octotuberculata, Cyclosa sedeculata, Cyclosa vallata 및 Cyclosa atrata 등의 Cyclosa속에 속하는 거미, 및 Chorizopes nipponicus 등의 Chorizopes속에 속하는 거미가 산생하는 스파이더 실크 단백질, 및 Tetragnatha praedonia, Tetragnatha maxillosa, Tetragnatha extensa 및 Tetragnatha squamata 등의 Tetragnatha속에 속하는 거미, Leucauge celebesiana, Leucauge blanda 및 Leucauge subblanda 등의 Leucauge속에 속하는 거미, Nephila clavata 및 Nephila pilipes 등의 Nephila속에 속하는 거미, Menosira ornata 등의 Menosira속에 속하는 거미, Dyschiriognatha tenera 등의 Dyschiriognatha속에 속하는 거미, Latrodectus mactans, Latrodectus hasselti, Latrodectus geometricus 및 Latrodectus tredecimguttatus 등의 Latrodectus속에 속하는 거미, 및 Euprosthenops속에 속하는 거미 등의 Tetragnathidae과에 속하는 거미가 산생하는 스파이더 실크 단백질을 들 수 있다. 스파이더 실크 단백질로서는, 예를 들면, MaSp(MaSp1 및 MaSp2), ADF(ADF3 및 ADF4) 등의 견인사 단백질, MiSp(MiSp1 및 MiSp2) 등을 들 수 있다.
거미류가 산생하는 피브로인의 보다 구체적인 예로서는, 예를 들면, fibroin-3(adf-3)[Araneus diadematus 유래](GenBank 수탁번호 AAC47010(아미노산 서열), U47855(염기 서열)), fibroin-4(adf-4)[Araneus diadematus 유래](GenBank 수탁번호 AAC47011(아미노산 서열), U47856(염기 서열)), dragline silk protein spidroin 1[Nephila clavipes 유래](GenBank 수탁번호 AAC04504(아미노산 서열), U37520(염기 서열)), major angu11ate spidroin 1[Latrodectus hesperus 유래](GenBank 수탁번호 ABR68856(아미노산 서열), EF595246(염기 서열)), dragline silk protein spidroin 2[Nephila clavata 유래](GenBank 수탁번호 AAL32472(아미노산 서열), AF441245(염기 서열)), major anpullate spidroin 1[Euprosthenops australis 유래](GenBank 수탁번호 CAJ00428(아미노산 서열), AJ973155(염기 서열)), 및 major ampullate spidroin 2[Euprosthenops australis](GenBank 수탁번호 CAM32249.1(아미노산 서열), AM490169(염기 서열)), minor ampullate silk protein 1[Nephila clavipes](GenBank 수탁번호 AAC14589.1(아미노산 서열)), minor ampullate silk protein 2[Nephila clavipes](GenBank 수탁번호 AAC14591.1(아미노산 서열)), minor ampullate spidroin-like protein[Nephilengys cruentata](GenBank 수탁번호 ABR37278.1(아미노산 서열) 등을 들 수 있다.
천연 유래의 피브로인의 보다 구체적인 예로서는, 또, NCBI GenBank에 서열 정보가 등록되어 있는 피브로인을 들 수 있다. 예를 들면, NCBI GenBank에 등록되어 있는 서열 정보 중 DIVISION으로서 INV를 포함하는 서열 중에서, DEFINITION에 spidroin, ampullate, fibroin, 「silk 및 polypeptide」, 또는 「silk 및 protein」이 키워드로서 기재되어 있는 서열, CDS로부터 특정 product의 문자열, SOURCE로부터 TISSUE TYPE에 특정 문자열이 기재된 서열을 추출하는 것에 의해 확인할 수 있다.
다른 실시형태에 따른 개변 피브로인은, 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하고, 상기 도메인 서열로부터, 가장 C 말단측에 위치하는 (A)n 모티프부터 상기 도메인 서열의 C 말단까지의 서열을 제외한 서열 중의 전체 REP에 포함되는 XGX(단, X는 글라이신 이외의 아미노산 잔기를 나타낸다)로 이루어지는 아미노산 서열의 총 아미노산 잔기수를 z로 하고, 상기 도메인 서열로부터, 가장 C 말단측에 위치하는 (A)n 모티프부터 상기 도메인 서열의 C 말단까지의 서열을 제외한 서열 중의 총 아미노산 잔기수를 w로 했을 때에, z/w가 50.9% 이상인 아미노산 서열을 갖는다. 본 실시형태에 따른 개변 피브로인은, 글라이신 잔기의 함유량이 저감되어 있기 때문에, XGX로 이루어지는 아미노산 서열의 함유 비율에 상당하는 z/w의 값이 상기 범위에 들어가는 비율이 높아져 있다.
본 실시형태에 따른 개변 피브로인은, GGX 모티프 중 1개의 글라이신 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것에 의해, XGX로 이루어지는 아미노산 서열의 함유 비율을 높이는 것이 바람직하다. 본 실시형태에 따른 개변 피브로인은, 도메인 서열 중의 GGX로 이루어지는 아미노산 서열의 함유 비율이 6% 이하인 것이 바람직하고, 4% 이하인 것이 보다 바람직하며, 2% 이하인 것이 더 바람직하다. 도메인 서열 중의 GGX로 이루어지는 아미노산 서열의 함유 비율은, 하기 XGX로 이루어지는 아미노산 서열의 함유 비율(z/w)의 산출 방법과 마찬가지의 방법으로 산출할 수 있다.
z/w의 산출 방법을 더 상세히 설명한다. 우선, 도메인 서열로부터, 가장 C 말단측에 위치하는 (A)n 모티프부터 도메인 서열의 C 말단까지의 서열을 제외한 서열에 포함되는 모든 REP로부터, XGX로 이루어지는 아미노산 서열을 추출한다. XGX를 구성하는 아미노산 잔기의 총수가 z이다. 예를 들면, XGX로 이루어지는 아미노산 서열이 50개 추출된 경우(중복은 없음), z는 50×3=150이다. 또한, 예를 들면, XGXGX로 이루어지는 아미노산 서열의 경우와 같이 2개의 XGX에 포함되는 X(중앙의 X)가 존재하는 경우는, 중복분을 공제해서 계산한다(XGXGX의 경우는 5 아미노산 잔기이다). w는, 도메인 서열로부터, 가장 C 말단측에 위치하는 (A)n 모티프부터 도메인 서열의 C 말단까지의 서열을 제외한 서열에 포함되는 총 아미노산 잔기수이다. 예를 들면, 도 2에 나타낸 도메인 서열의 경우, w는 4+50+4+100+4+10+4+20+4+30=230이다(가장 C 말단측에 위치하는 (A)n 모티프는 제외하고 있다). 다음으로, z를 w로 나누는 것에 의해, z/w(%)를 산출할 수 있다.
여기에서, 천연 유래의 피브로인에 있어서의 z/w에 대하여 설명한다. 우선, 전술과 같이, NCBI GenBank에 아미노산 서열 정보가 등록되어 있는 피브로인을 예시한 방법에 의해 확인한 바, 663종류의 피브로인(이 중, 거미류 유래의 피브로인은 415종류)이 추출되었다. 추출된 모든 피브로인 중, 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하고, 피브로인 중의 GGX로 이루어지는 아미노산 서열의 함유 비율이 6% 이하인 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터, 전술의 산출 방법에 의해, z/w를 산출했다. 그 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1의 가로축은 z/w(%)를 나타내고, 세로축은 빈도를 나타낸다. 도 1로부터 분명한 대로, 천연 유래의 피브로인에 있어서의 z/w는 모두 50.9% 미만이다(가장 높은 것에서 50.86%).
본 실시형태에 따른 개변 피브로인에 있어서, z/w는 50.9% 이상인 것이 바람직하고, 56.1% 이상인 것이 보다 바람직하고, 58.7% 이상인 것이 더 바람직하고, 70% 이상인 것이 더 바람직하며, 80% 이상인 것이 보다 더 바람직하다. z/w의 상한에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면, 95% 이하여도 된다.
본 실시형태에 따른 개변 피브로인은, 예를 들면, 클로닝된 천연 유래의 피브로인의 유전자 서열로부터, 글라이신 잔기를 코딩하는 염기 서열의 적어도 일부를 치환해서 다른 아미노산 잔기를 코딩하도록 개변하는 것에 의해 얻을 수 있다. 이때, 개변하는 글라이신 잔기로서, GGX 모티프 및 GPGXX 모티프에 있어서의 1개의 글라이신 잔기를 선택해도 되고, 또한 z/w가 50.9% 이상이 되도록 치환해도 된다. 또한, 예를 들면, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터 상기 각 실시형태를 만족시키는 아미노산 서열을 설계하고, 설계한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 화학 합성하는 것에 의해 얻을 수도 있다. 어느 경우에 있어서도, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터 REP 중의 글라이신 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 것에 상당하는 개변에 더하여, 추가로 1 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 것에 상당하는 아미노산 서열의 개변을 행해도 된다.
상기의 다른 아미노산 잔기로서는, 글라이신 잔기 이외의 아미노산 잔기이면 특별히 제한은 없지만, 발린(V) 잔기, 류신(L) 잔기, 아이소류신(I) 잔기, 메티오닌(M) 잔기, 프롤린(P) 잔기, 페닐알라닌(F) 잔기 및 트립토판(W) 잔기 등의 소수성 아미노산 잔기, 글루타민(Q) 잔기, 아스파라긴(N) 잔기, 세린(S) 잔기, 라이신(K) 잔기 및 글루탐산(E) 잔기 등의 친수성 아미노산 잔기가 바람직하고, 발린(V) 잔기, 류신(L), 잔기 아이소류신(I) 잔기 및 글루타민(Q) 잔기가 보다 바람직하며, 글루타민(Q) 잔기가 더 바람직하다.
본 발명의 개변 피브로인은, 그 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, 글라이신 잔기의 함유량이 저감된 것에 더하여, (A)n 모티프의 함유량이 저감된 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 이에 의해, 본 발명에 의한 효과가 한층 더 현저히 나타난다. 당해 개변 피브로인의 도메인 서열은, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, 적어도 REP 중의 1 또는 복수의 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것에 더하여, 추가로 적어도 1 또는 복수의 (A)n 모티프가 결실한 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이라고 할 수 있다.
다음으로, (A)n 모티프의 함유량이 저감된 도메인 서열의 구체적인 실시형태를 설명한다. 한편, 글라이신 잔기의 함유량의 저감에 대해서는 기재를 생략하지만, 전술한 글라이신 잔기의 함유량의 저감에 관한 각 실시형태와 이하의 (A)n 모티프의 함유량의 저감에 관한 각 실시형태는 임의로 조합할 수 있다.
일 실시형태에 있어서의 개변 피브로인은, 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, 적어도 N 말단측으로부터 C 말단측을 향해서 1∼3개의 (A)n 모티프마다 1개의 (A)n 모티프가 결실한 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시형태에 있어서의 개변 피브로인은, 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인과 비교해서, 적어도 N 말단측으로부터 C 말단측을 향해서 2개 연속한 (A)n 모티프의 결실, 및 1개의 (A)n 모티프의 결실이 이 순서로 반복된 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 실시형태에 있어서의 개변 피브로인은, 도메인 서열이, 적어도 N 말단측으로부터 C 말단측을 향해서 2개 간격으로 (A)n 모티프가 결실한 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는다.
피브로인의 (A)n 모티프는, 피브로인의 강도(응력 및 터프니스)에 밀접하게 관계하고 있다고 생각되고 있었기 때문에, 지금까지 (A)n 모티프의 함유량을 증가시키는 방향으로 연구 개발이 진행되고 있고, (A)n 모티프의 함유량을 감소시키는 것에 의해 현저하게 강도가 감소한다고 생각되고 있었다. 그러나, 본 발명자들은, (A)n 모티프의 함유량을 감소시키더라도 현저하게 응력이 감소하는 일은 없고, 또한 재조합 단백질 생산계에서의 생산량을 현저하게 향상시킬 수 있고, 나아가서는 터프니스 및 신도도 향상되는 것을 발견했다. 본 실시형태에 따른 개변 피브로인에 의하면, 이와 같은 예상외의 효과도 나타난다.
본 실시형태에서는, 개변 피브로인의 도메인 서열이, 천연 유래의 피브로인으로부터 (A)n 모티프를 10∼40% 결실시킨 것에 상당하는 아미노산 서열을 갖는 것이어도 된다. (A)n 모티프의 함유량의 감소가 이 범위 내이면, 현저하게 응력을 감소시킴이 없이, 재조합 단백질 생산계에서의 생산량을 현저하게 향상시킬 수 있고, 또한 터프니스 및 신도를 향상시킬 수 있다는 효과를 안정되게 발휘할 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서의 개변 피브로인은, N 말단측으로부터 C 말단측을 향해서, 서로 이웃하는 2개의 [(A)n 모티프-REP] 유닛의 REP의 아미노산 잔기수를 순차적으로 비교해서, 아미노산 잔기수가 적은 REP의 아미노산 잔기수를 1로 했을 때, 다른 쪽의 REP의 아미노산 잔기수의 비가 2∼3.5가 되는 상기 서로 이웃하는 2개의 [(A)n 모티프-REP] 유닛의 아미노산 잔기수를 서로 합한 합계값을 x로 하고, 상기 도메인 서열의 총 아미노산 잔기수를 y로 했을 때에, x/y의 최대값이 20% 이상인 아미노산 서열을 갖는다.
x/y의 산출 방법을 도 2를 참조하면서 더 상세히 설명한다. 도 2에는, 개변 피브로인으로부터 N 말단 서열 및 C 말단 서열을 제외한 도메인 서열을 나타낸다. 당해 도메인 서열은, N 말단측(좌측)으로부터 (A)n 모티프-제 1 REP(50 아미노산 잔기)-(A)n 모티프-제 2 REP(100 아미노산 잔기)-(A)n 모티프-제 3 REP(10 아미노산 잔기)-(A)n 모티프-제 4 REP(20 아미노산 잔기)-(A)n 모티프-제 5 REP(30 아미노산 잔기)-(A)n 모티프라는 서열을 갖는다.
서로 이웃하는 2개의 [(A)n 모티프-REP] 유닛은, 중복이 없도록, N 말단측으로부터 C 말단측을 향해서, 순차적으로 선택한다. 이때, 선택되지 않는 [(A)n 모티프-REP] 유닛이 존재해도 된다. 도 2에는, 패턴 1(제 1 REP와 제 2 REP의 비교, 및 제 3 REP와 제 4 REP의 비교), 패턴 2(제 1 REP와 제 2 REP의 비교, 및 제 4 REP와 제 5 REP의 비교), 패턴 3(제 2 REP와 제 3 REP의 비교, 및 제 4 REP와 제 5 REP의 비교), 패턴 4(제 1 REP와 제 2 REP의 비교)를 나타냈다. 한편, 이것 이외에도 선택 방법은 존재한다.
다음으로 각 패턴에 대하여, 선택한 서로 이웃하는 2개의 [(A)n 모티프-REP] 유닛 중의 각 REP의 아미노산 잔기수를 비교한다. 비교는, 보다 아미노산 잔기수가 적은 쪽을 1로 했을 때의, 다른 쪽의 아미노산 잔기수의 비를 구하는 것에 의해 행한다. 예를 들면, 제 1 REP(50 아미노산 잔기)와 제 2 REP(100 아미노산 잔기)의 비교의 경우, 보다 아미노산 잔기수가 적은 제 1 REP를 1로 했을 때, 제 2 REP의 아미노산 잔기수의 비는 100/50=2이다. 마찬가지로, 제 4 REP(20 아미노산 잔기)와 제 5 REP(30 아미노산 잔기)의 비교의 경우, 보다 아미노산 잔기수가 적은 제 4 REP를 1로 했을 때, 제 5 REP의 아미노산 잔기수의 비는 30/20=1.5이다.
도 2 중, 보다 아미노산 잔기수가 적은 쪽을 1로 했을 때에, 다른 쪽의 아미노산 잔기수의 비가 1.8∼11.3이 되는 [(A)n 모티프-REP] 유닛의 조를 실선으로 나타냈다. 이하 이와 같은 비를 기자 비율이라고 부른다. 보다 아미노산 잔기수가 적은 쪽을 1로 했을 때에, 다른 쪽의 아미노산 잔기수의 비가 1.8 미만 또는 11.3초과가 되는 [(A)n 모티프-REP] 유닛의 조는 파선으로 나타냈다.
각 패턴에 있어서, 실선으로 나타낸 서로 이웃하는 2개의 [(A)n 모티프-REP] 유닛의 모든 아미노산 잔기수를 서로 합한다(REP만은 아니고, (A)n 모티프의 아미노산 잔기수도이다). 그리고, 서로 합한 합계값을 비교해서, 당해 합계값이 최대가 되는 패턴의 합계값(합계값의 최대값)을 x로 한다. 도 2에 나타낸 예에서는, 패턴 1의 합계값이 최대이다.
다음으로, x를 도메인 서열의 총 아미노산 잔기수 y로 나누는 것에 의해, x/y(%)를 산출할 수 있다.
여기에서, 천연 유래의 피브로인에 있어서의 x/y에 대하여 설명한다. 우선, 전술과 같이, NCBI GenBank에 아미노산 서열 정보가 등록되어 있는 피브로인을 예시한 방법에 의해 확인한 바, 663종류의 피브로인(이 중, 거미류 유래의 피브로인은 415종류)이 추출되었다. 추출된 모든 피브로인 중, 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하고, 또한 도메인 서열 중에 복수 존재하는 (A)n 모티프 중 적어도 7개가 알라닌 잔기만으로 구성되는 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터, 전술의 산출 방법에 의해, x/y를 산출했다. 기자 비율이 1:1.9∼4.1인 경우의 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3의 가로축은 x/y(%)를 나타내고, 세로축은 빈도를 나타낸다. 천연 유래의 피브로인에 있어서의 x/y는 64.2% 미만이었다(가장 높은 것에서 64.14%). 한편, 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하고, 또한 도메인 서열 중에 복수 존재하는 (A)n 모티프 중 적어도 7개가 알라닌 잔기만으로 구성되는 천연 유래의 피브로인(전술대로, 천연 유래의 피브로인에 있어서의 z/w는 모두 46.4% 미만)에 있어서는, x/y가 20% 이상이면 효과가 확인된다.
본 실시형태에 따른 개변 피브로인에 있어서, x/y는 20% 이상이면 되고, 40% 이상인 것이 바람직하고, 50% 이상인 것이 보다 바람직하고, 60% 이상인 것이 더 바람직하고, 64.2% 이상인 것이 더 바람직하고, 70% 이상인 것이 보다 더 바람직하고, 75% 이상인 것이 특히 바람직하며, 80% 이상인 것이 가장 바람직하다. x/y의 상한에 특별히 제한은 없고, 100% 이하이면 된다.
(A)n 모티프 함유량이 저감된 도메인 서열을 포함하는 개변 피브로인은, 예를 들면, 클로닝된 천연 유래의 피브로인의 유전자 서열로부터, x/y가 20% 이상이 되도록 (A)n 모티프를 코딩하는 서열의 1 또는 복수를 결실시키는 것에 의해 얻을 수 있다. 또한, 예를 들면, 천연 유래의 피브로인의 아미노산 서열로부터, x/y가 20% 이상이 되도록 1 또는 복수의 (A)n 모티프가 결실한 것에 상당하는 아미노산 서열을 설계하고, 설계한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 화학 합성하는 것에 의해 얻을 수도 있다.
본 발명에 따른 개변 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (i) 서열번호 3, 서열번호 4 혹은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열번호 3, 서열번호 4 혹은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 개변 피브로인을 들 수 있다.
(i)의 개변 피브로인에 대하여 설명한다. 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열은, 천연 유래의 피브로인에 상당하는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 REP 중의 모든 GGX를 GQX로 치환한 것이다. 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열은, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로부터, N 말단측으로부터 C 말단측을 향해서 2개 간격으로 (A)n 모티프를 결실시키고, 추가로 C 말단 서열의 앞에 [(A)n 모티프-REP]를 1개 삽입한 것이다. 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열은, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 각 (A)n 모티프의 C 말단측에 2개의 알라닌 잔기를 삽입하고, 추가로 일부의 글루타민(Q) 잔기를 세린(S) 잔기로 치환하고, 서열번호 4의 분자량과 거의 동일해지도록 N 말단측의 일부의 아미노산을 결실시킨 것이다. 한편, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열은, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로부터, N 말단측으로부터 C 말단측을 향해서 2개 간격으로 (A)n 모티프를 결실시킨 것이다.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열(천연 유래의 피브로인에 상당)에 있어서의 z/w의 값은 46.8%이다(표 1 참조). 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열, 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 z/w의 값은 각각 58.7%, 70.1% 및 66.1%이다(표 1 참조). 또한, 서열번호 1, 3, 4 및 10으로 표시되는 아미노산 서열의 기자 비율 1:1.8∼11.3에 있어서의 x/y의 값은 각각 15.0%, 15.0%, 93.4% 및 92.7%이다(표 2∼5 참조).
Figure 112018115169365-pct00001
Figure 112018115169365-pct00002
Figure 112018115169365-pct00003
Figure 112018115169365-pct00004
Figure 112018115169365-pct00005
(i)의 개변 피브로인은, 서열번호 3, 서열번호 4 혹은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것이어도 된다.
(ii)의 개변 피브로인은, 서열번호 3, 서열번호 4 혹은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. (ii)의 개변 피브로인도 또한, 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하는 단백질이다. 상기 서열 동일성은 95% 이상인 것이 바람직하다.
(ii)의 개변 피브로인은, 서열번호 3, 서열번호 4 혹은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 REP 중에 포함되는 XGX(단, X는 글라이신 이외의 아미노산 잔기를 나타낸다)로 이루어지는 아미노산 서열의 총 아미노산 잔기수를 z로 하고, 상기 도메인 서열 중의 REP의 총 아미노산 잔기수를 w로 했을 때에, z/w가 50.9% 이상인 것이 바람직하다.
전술의 개변 피브로인은 N 말단 및 C 말단 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 태그 서열을 포함하고 있어도 된다. 이에 의해, 개변 피브로인의 단리, 고정화, 검출 및 가시화 등이 가능해진다.
태그 서열로서, 예를 들면, 다른 분자와의 특이적 친화성(결합성, 어피니티)을 이용한 어피니티 태그를 들 수 있다. 어피니티 태그의 구체예로서, 히스티딘 태그(His 태그)를 들 수 있다. His 태그는 히스티딘 잔기가 4 내지 10개 정도 나열된 짧은 펩타이드로, 니켈 등의 금속 이온과 특이적으로 결합하는 성질이 있기 때문에, 금속 킬레이트 크로마토그래피(chelating metal chromatography)에 의한 개변 피브로인의 단리에 이용할 수 있다. 태그 서열의 구체예로서, 예를 들면, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열(His 태그를 포함하는 아미노산 서열)을 들 수 있다.
또한, 글루타싸이온에 특이적으로 결합하는 글루타싸이온-S-트랜스퍼라제(GST), 말토스에 특이적으로 결합하는 말토스 결합 단백질(MBP) 등의 태그 서열을 이용할 수도 있다.
또, 항원 항체 반응을 이용한 「에피토프 태그」를 이용할 수도 있다. 항원성을 나타내는 펩타이드(에피토프)를 태그 서열로서 부가하는 것에 의해, 당해 에피토프에 대한 항체를 결합시킬 수 있다. 에피토프 태그로서, HA(인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 펩타이드 서열) 태그, myc 태그, FLAG 태그 등을 들 수 있다. 에피토프 태그를 이용하는 것에 의해, 높은 특이성으로 용이하게 개변 피브로인을 정제할 수 있다.
또 태그 서열을 특정 프로테아제로 잘라버릴 수 있도록 한 것도 사용할 수 있다. 당해 태그 서열을 개재해서 흡착한 단백질을 프로테아제 처리하는 것에 의해, 태그 서열을 잘라버린 개변 피브로인을 회수할 수도 있다.
태그 서열을 포함하는 개변 피브로인의 보다 구체적인 예로서, (iii) 서열번호 8, 서열번호 9 혹은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열, 또는 (iv) 서열번호 8, 서열번호 9 혹은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 개변 피브로인을 들 수 있다.
서열번호 6, 7, 8, 9 및 11로 표시되는 아미노산 서열은, 각각 서열번호 1, 2, 3, 4 및 10으로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열(His 태그를 포함함)을 부가한 것이다.
(iii)의 개변 피브로인은, 서열번호 8, 서열번호 9 혹은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것이어도 된다.
(iv)의 개변 피브로인은, 서열번호 8, 서열번호 9 혹은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. (iv)의 개변 피브로인도 또한, 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하는 단백질이다. 상기 서열 동일성은 95% 이상인 것이 바람직하다.
(iv)의 개변 피브로인은, 서열번호 8, 서열번호 9 혹은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 REP 중에 포함되는 XGX(단, X는 글라이신 이외의 아미노산 잔기를 나타낸다)로 이루어지는 아미노산 서열의 총 아미노산 잔기수를 z로 하고, 상기 도메인 서열 중의 REP의 총 아미노산 잔기수를 w로 했을 때에, z/w가 50.9% 이상인 것이 바람직하다.
전술의 개변 피브로인은 재조합 단백질 생산계에 있어서 생산된 단백질을 숙주의 외부로 방출하기 위한 분비 시그널을 포함하고 있어도 된다. 분비 시그널의 서열은 숙주의 종류에 따라서 적절히 설정할 수 있다.
[핵산]
본 발명에 따른 핵산은 본 발명에 따른 개변 피브로인을 코딩한다. 핵산의 구체예로서, 서열번호 3, 서열번호 4 혹은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 개변 피브로인, 또는 이들 아미노산 서열의 N 말단 및 C 말단 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열(태그 서열)을 결합시킨 단백질 등을 코딩하는 핵산 등을 들 수 있다.
일 실시형태에 따른 핵산은, 본 발명에 따른 개변 피브로인을 코딩하는 핵산의 상보쇄와 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이징하고, 또한 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하며, REP 중에 포함되는 XGX(단, X는 글라이신 이외의 아미노산 잔기를 나타낸다)로 이루어지는 아미노산 서열의 총 아미노산 잔기수를 z로 하고, 상기 도메인 서열 중의 REP의 총 아미노산 잔기수를 w로 했을 때에, z/w가 50.9% 이상인, 개변 피브로인을 코딩하는 핵산이다.
「스트린전트한 조건」이란, 이른바 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 「스트린전트한 조건」은 저 스트린전트한 조건, 중 스트린전트한 조건 및 고 스트린전트한 조건 중 어느 것이어도 된다. 저 스트린전트한 조건이란, 적어도 85% 이상의 동일성이 서열간에 존재할 때만 하이브리다이제이션이 일어나는 것을 의미하고, 예를 들면, 0.5% SDS를 포함하는 5×SSC를 이용하여, 42℃에서 하이브리다이징하는 조건을 들 수 있다. 중 스트린전트한 조건이란, 적어도 90% 이상의 동일성이 서열간에 존재할 때만 하이브리다이제이션이 일어나는 것을 의미하고, 예를 들면, 0.5% SDS를 포함하는 5×SSC를 이용하여, 50℃에서 하이브리다이징하는 조건을 들 수 있다. 고 스트린전트한 조건이란, 적어도 95% 이상의 동일성이 서열간에 존재할 때만 하이브리다이제이션이 일어나는 것을 의미하고, 예를 들면, 0.5% SDS를 포함하는 5×SSC를 이용하여, 60℃에서 하이브리다이징하는 조건을 들 수 있다.
일 실시형태에 따른 핵산은, 본 발명에 따른 개변 피브로인을 코딩하는 핵산과 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하며, REP 중에 포함되는 XGX(단, X는 글라이신 이외의 아미노산 잔기를 나타낸다)로 이루어지는 아미노산 서열의 총 아미노산 잔기수를 z로 하고, 상기 도메인 서열 중의 REP의 총 아미노산 잔기수를 w로 했을 때에, z/w가 50.9% 이상인, 개변 피브로인을 코딩하는 핵산이다. 서열 동일성은 95% 이상인 것이 바람직하다.
[숙주 및 발현 벡터]
본 발명에 따른 발현 벡터는, 본 발명에 따른 핵산 서열과, 당해 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 1 또는 복수의 조절 서열을 갖는다. 조절 서열은, 숙주에 있어서의 재조합 단백질의 발현을 제어하는 서열(예를 들면, 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 서열, 전사 종결 서열 등)이고, 숙주의 종류에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 발현 벡터의 종류는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 포스미드 벡터, 인공 염색체 벡터 등, 숙주의 종류에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 숙주는 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 것이다. 숙주로서, 원핵생물, 및 효모, 사상 진균, 곤충 세포, 동물 세포 및 식물 세포 등의 진핵생물 모두 적합하게 이용할 수 있다.
발현 벡터로서는, 숙주 세포에 있어서 자립 복제가 가능하거나, 또는 숙주의 염색체 중으로의 조립이 가능하고, 본 발명에 따른 핵산을 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 적합하게 이용된다.
세균 등의 원핵생물을 숙주로서 이용하는 경우는, 본 발명에 따른 발현 벡터는, 원핵생물 중에서 자립 복제가 가능함과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 서열, 본 발명에 따른 핵산 및 전사 종결 서열을 포함하는 벡터인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있어도 된다.
원핵생물로서는, 에셔리키아속, 브레비바실러스속, 세라티아속, 바실러스속, 마이크로박테리움속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속 및 슈도모나스속 등에 속하는 미생물을 들 수 있다.
에셔리키아속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 에셔리키아 콜라이 BL21(노바젠사), 에셔리키아 콜라이 BL21(DE3)(라이프테크놀로지스사), 에셔리키아 콜라이 BLR(DE3)(머크밀리포어사), 에셔리키아 콜라이 DH1, 에셔리키아 콜라이 GI698, 에셔리키아 콜라이 HB101, 에셔리키아 콜라이 JM109, 에셔리키아 콜라이 K5(ATCC 23506), 에셔리키아 콜라이 KY3276, 에셔리키아 콜라이 MC1000, 에셔리키아 콜라이 MG1655(ATCC 47076), 에셔리키아 콜라이 No. 49, 에셔리키아 콜라이 Rosetta(DE3)(노바젠사), 에셔리키아 콜라이 TB1, 에셔리키아 콜라이 Tuner(노바젠사), 에셔리키아 콜라이 Tuner(DE3)(노바젠사), 에셔리키아 콜라이 W1485, 에셔리키아 콜라이 W3110(ATCC 27325), 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli) XL1-Blue, 에셔리키아 콜라이 XL2-Blue 등을 들 수 있다.
브레비바실러스속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 브레비바실러스 아그리, 브레비바실러스 보스테렌시스, 브레비바실러스 센트로포러스, 브레비바실러스 포모서스, 브레비바실러스 인보카터스, 브레비바실러스 래터로스포러스, 브레비바실러스 림노필러스, 브레비바실러스 파라브레비스, 브레비바실러스 레우스제리, 브레비바실러스 서모루버, 브레비바실러스 브레비스 47(FERM BP-1223), 브레비바실러스 브레비스 47K(FERM BP-2308), 브레비바실러스 브레비스 47-5(FERM BP-1664), 브레비바실러스 브레비스 47-5Q(JCM8975), 브레비바실러스 초시넨시스 HPD31(FERM BP-1087), 브레비바실러스 초시넨시스 HPD31-S(FERM BP-6623), 브레비바실러스 초시넨시스 HPD31-OK(FERM BP-4573), 브레비바실러스 초시넨시스 SP3주(Takara사제) 등을 들 수 있다.
세라티아속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 세라티아 리퀘파시엔스(Serratia liquefacience) ATCC14460, 세라티아 엔토모필라(Serratia entomophila), 세라티아 피카리아(Serratia ficaria), 세라티아 폰티콜라(Serratia fonticola), 세라티아 그리메시(Serratia grimesii), 세라티아 프로테아마큘란스(Serratia proteamaculans), 세라티아 오도리페라(Serratia odorifera), 세라티아 플라이무티카(Serratia plymuthica), 세라티아 루비대아(Serratia rubidaea) 등을 들 수 있다.
바실러스속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 등을 들 수 있다.
마이크로박테리움속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 마이크로박테리움 암모니아필룸 ATCC15354 등을 들 수 있다.
브레비박테리움속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 브레비박테리움 디바리카툼(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC14020, 브레비박테리움 플라붐(코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067) ATCC13826, ATCC14067, 브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869) ATCC13665, ATCC13869, 브레비박테리움 로제움 ATCC13825, 브레비박테리움 사카로리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 브레비박테리움 싸이오제니탈리스 ATCC19240, 브레비박테리움 알붐 ATCC15111, 브레비박테리움 세리눔 ATCC15112 등을 들 수 있다.
코리네박테리움속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 코리네박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6871, ATCC6872, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067, 코리네박테리움 아세토애시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움 알카놀리티쿰 ATCC21511, 코리네박테리움 칼루나에 ATCC15991, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060, 코리네박테리움 릴리움 ATCC15990, 코리네박테리움 메라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움 서모아미노게네스 AJ12340(FERM BP-1539), 코리네박테리움 허큘리스 ATCC13868 등을 들 수 있다.
슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 미생물로서, 예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 브래시카세아룸(Pseudomonas brassicacearum), 슈도모나스 풀바(Pseudomonas fulva) 및 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) D-0110 등을 들 수 있다.
상기 숙주 세포에의 발현 벡터의 도입 방법으로서는, 상기 숙주 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 이용할 수 있다. 예를 들면, 칼슘 이온을 이용하는 방법〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕, 프로토플라스트법(일본 특허공개 소63-248394), 또는 Gene, 17, 107(1982)나 Molecular & General Genetics, 168, 111(1979)에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
브레비바실러스속에 속하는 미생물의 형질전환은, 예를 들면, Takahashi 등의 방법(J. Bacteriol., 1983, 156:1130-1134)이나, Takagi 등의 방법(Agric. Biol. Chem., 1989, 53:3099-3100), 또는 Okamoto 등의 방법(Biosci. Biotechnol. Biochem., 1997, 61:202-203)에 의해 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산을 도입하는 벡터(이하, 간단히 「벡터」라고 한다)로서는, 예를 들면, pBTrp2, pBTac1, pBTac2(모두 베링거만하임사로부터 시판), pKK233-2(Pharmacia사제), pSE280(Invitrogen사제), pGEMEX-1(Promega사제), pQE-8(QIAGEN사제), pKYP10(일본 특허공개 소58-110600), pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)〕, pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)〕, pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)〕, pBluescript II SK(-)(Stratagene사제), pTrs30〔Escherichia coli JM109/pTrS30(FERM BP-5407)으로부터 조제〕, pTrs32〔Escherichia coli JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로부터 조제〕, pGHA2〔Escherichia coli IGHA2(FERM B-400)로부터 조제, 일본 특허공개 소60-221091〕, pGKA2〔Escherichia coli IGKA2(FERM BP-6798)로부터 조제, 일본 특허공개 소60-221091〕, pTerm2(US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392(1990)〕, pGEX(Pharmacia사제), pET 시스템(Novagen사제) 등을 들 수 있다.
숙주로서 Escherichia coli를 이용하는 경우는, pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold 등을 적합한 벡터로서 들 수 있다.
브레비바실러스속에 속하는 미생물에 적합한 벡터의 구체예로서, 고초균 벡터로서 공지인 pUB110, 또는 pHY500(일본 특허공개 평2-31682호 공보), pNY700(일본 특허공개 평4-278091호 공보), pHY4831(J. Bacteriol., 1987, 1239-1245), pNU200(우다카 시게조, 일본 농예화학회 잡지 1987, 61:669-676), pNU100(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 30:75-80), pNU211(J. Biochem., 1992, 112:488-491), pNU211R2L5(일본 특허공개 평7-170984호 공보), pNH301(Appl. Environ. Microbiol., 1992, 58:525-531), pNH326, pNH400(J. Bacteriol., 1995, 177:745-749), pHT210(일본 특허공개 평6-133782호 공보), pHT110R2L5(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42:358-363), 또는 대장균과 브레비바실러스속에 속하는 미생물의 셔틀 벡터인 pNCO2(일본 특허공개 2002-238569호 공보) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 숙주 세포 중에서 기능하는 것이면 제한되지 않는다. 예를 들면, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터, T7 프로모터 등의 대장균 또는 파지 등에서 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또한 Ptrp를 2개 직렬시킨 프로모터(Ptrp×2), tac 프로모터, lacT7 프로모터, let I 프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 이용할 수 있다.
리보솜 결합 서열인 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈 사이를 적당한 거리(예를 들면 6∼18 염기)로 조절한 플라스미드를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 발현 벡터에 있어서, 본 발명에 따른 핵산의 발현에는 전사 종결 서열은 반드시 필요하지는 않지만, 구조 유전자의 직하에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다.
진핵생물의 숙주로서는, 예를 들면, 효모, 사상 진균(곰팡이 등) 및 곤충 세포를 들 수 있다.
효모로서는, 예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)속, 트리코스포론(Trichosporon)속, 쉬완니오마이세스(Schwanniomyces)속, 피키아(Pichia)속, 칸디다(Candida)속, 야로위아속 및 한세눌라속 등에 속하는 효모를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 쉬완니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius), 쉬완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 칸디다 유틸리스(Candida utilis), 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 피키아 앙구스타(Pichia angusta), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 폴리모파(Pichia polymorpha), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha) 등을 들 수 있다.
효모를 숙주 세포로서 이용하는 경우의 발현 벡터는 통상, 복제 기점(숙주에 있어서의 증폭이 필요한 경우) 및 대장균 중에서의 벡터의 증식을 위한 선발 마커, 효모에 있어서의 재조합 단백질 발현을 위한 프로모터 및 터미네이터, 및 효모를 위한 선발 마커를 포함하는 것이 바람직하다.
발현 벡터가 비조립 벡터인 경우, 추가로 자기 복제 서열(ARS)을 포함하는 것이 바람직하다. 이에 의해 세포내에 있어서의 발현 벡터의 안정성을 향상시킬 수 있다(Myers, A. M., etal. (1986) Gene 45:299-310).
효모를 숙주로서 이용하는 경우의 벡터로서는, 예를 들면, YEP13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), YCp50(ATCC37419), YIp, pHS19, pHS15, pA0804, pHIL3Ol, pHIL-S1, pPIC9K, pPICZα, pGAPZα, pPICZB 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 효모 중에서 발현할 수 있는 것이면 제한되지 않는다. 예를 들면, 헥소스키나제 등의 해당계의 유전자의 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트 쇼크 폴리펩타이드 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터, pGAP 프로모터, pGCW14 프로모터, AOX1 프로모터, MOX 프로모터 등을 들 수 있다.
효모에의 발현 벡터의 도입 방법으로서는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 이용할 수 있고, 예를 들면, 일렉트로포레이션법(Methods Enzymol., 194, 182(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889(1984)), 아세트산 리튬법(J. Bacteriol., 153, 163(1983)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978)에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
사상 진균으로서는, 예를 들면, 아크레모니움(Acremonium)속, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 우스틸라고(Ustilago)속, 트리코더마(Trichoderma)속, 뉴로스포라(Neurospora)속, 푸사리움(Fusarium)속, 휴미콜라(Humicola)속, 페니실륨(Penicillium)속, 마이셀리옵토라(Myceliophtora)속, 보트리티스(Botryts)속, 마그나포테(Magnaporthe)속, 무코르(Mucor)속, 메타리지움(Metarhizium)속, 모나스커스(Monascus)속, 리조퍼스(Rhizopus)속, 및 리조무코르속에 속하는 균 등을 들 수 있다.
사상 진균의 구체예로서, 아크레모니움 알라바멘세(Acremonium alabamense), 아크레모니움 셀룰로리티커스(Acremonium cellulolyticus), 아스퍼질러스 아쿨레아터스(아큘레이터스)(Aspergillus aculeatus), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 오라이재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 세이크(Aspergillus sake), 아스퍼질러스 소재(소야)(Aspergillus sojae), 아스퍼질러스 터비젠시스(Aspergillus tubigensis), 아스퍼질러스 니제르(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 파라시티커스(Aspergillus parasiticus), 아스퍼질러스 피쿰(피큐움)(Aspergillus ficuum), 아스퍼질러스 포에이커스(Aspergillus phoeicus), 아스퍼질러스 포에티더스(페티더스)(Aspergillus foetidus), 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 후미가터스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 야포니쿠스(쟈포니커스)(Aspergillus japonicus), 트리코더마 비리데(Trichoderma viride), 트리코더마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코더마 리세에이(Trichoderma reseei), 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 서모아스쿠스(Thermoascus), 스포로트리쿰(Sporotrichum), 스포로트리쿰 셀룰로필룸(Sporotrichum cellulophilum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 티엘라비아(Thielavia), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 푸사리움 옥시스포러스(Fusarium oxysporus), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 페니실륨 크라이소제넘(Penicillium chrysogenum), 페니실륨 카멤버티(Penicillium camemberti), 페니실륨 카네스센스(Penicillium canescens), 페니실륨 에머소니(Penicillium emersonii), 페니실륨 푸니큘로섬(Penicillium funiculosum), 페니실륨 그라이세오로세움(Penicillium griseoroseum), 페니실륨 푸르퓨로제넘(Penicillium purpurogenum), 페니실륨 로퀘포티(Penicillium roqueforti), 마이셀리옵토라 서모필룸(Myceliophtaora thermophilum), 무코르 암비구우스(Mucor ambiguus), 무코르 서시넬로이드스(Mucor circinelloides), 무코르 프라질리스(Mucor fragilis), 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis), 무코르 이나에퀴스포러스(Mucor inaequisporus), 무코르 오블론지엘립티커스(Mucor oblongiellipticus), 무코르 라세모서스(Mucor racemosus), 무코르 레커버스(Mucor recurvus), 무코르 새터니누스(Mocor saturninus), 무코르 섭틸리스스무스(Mocor subtilissmus), 오가태아 폴리모파(Ogataea polymorpha), 파네로카에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 리조무코르 미헤이(Rhizomucor miehei), 리조무코르 푸실러스(Rhizomucor pusillus), 리조퍼스 아르히저스(Rhizopus arrhizus) 등을 들 수 있다.
숙주가 사상 진균인 경우의 프로모터로서는, 해당계에 관한 유전자, 구성적 발현에 관한 유전자, 가수분해에 관한 효소 유전자 등 어느 것이어도 되고, 구체적으로는 amyB, glaA, agdA, glaB, TEF1, xynF1tannasegene, No. 8AN, gpdA, pgkA, enoA, melO, sodM, catA, catB 등을 들 수 있다.
사상 진균에의 발현 벡터의 도입은 종래 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면, Cohen 등의 방법(염화 칼슘법)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110(1972)], 프로토플라스트법[Mol. Gen. Genet., 168:111(1979)], 컴피턴트법[J. Mol. Biol., 56:209(1971)], 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있다.
곤충 세포로서, 예를 들면, 인시류의 곤충 세포를 들 수 있고, 보다 구체적으로는, Sf9 및 Sf21 등의 스포돕테라 프루지퍼다(Spodoptera frugiperda) 유래의 곤충 세포, 및 High 5 등의 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 유래의 곤충 세포 등을 들 수 있다.
곤충 세포를 숙주로서 이용하는 경우의 벡터로서는, 예를 들면, 밤나방과 곤충에 감염하는 바이러스인 오토그래파 캘리포니카 누클리어 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등의 바큘로바이러스(Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992))를 들 수 있다.
곤충 세포를 숙주로서 이용하는 경우에는, 예를 들면 커런트 프로토콜스 인 몰레큘러 바이올로지, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992), Bio/Technology, 6, 47(1988) 등에 기재된 방법에 의해서, 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큘로바이러스를 곤충 세포에 공(共)도입해서 곤충 세포 배양 상청 중에 재조합 바이러스(발현 벡터)를 얻은 후, 추가로 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜, 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 해당 방법에 있어서 이용되는 유전자 도입 벡터로서는, 예를 들면, pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII(모두 Invitorogen사제) 등을 들 수 있다.
재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충 세포에의 재조합 유전자 도입 벡터와 바큘로바이러스의 공도입 방법으로서는, 예를 들면, 인산 칼슘법(일본 특허공개 평2-227075), 리포펙션법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)) 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는, 형질전환체 선택을 위한 선택 마커 유전자를 추가로 함유하고 있는 것이 바람직하다. 예를 들면, 대장균에 있어서는, 선택 마커 유전자로서는, 테트라사이클린, 암피실린, 카나마이신 등의 각종 약제에 대한 내성 유전자를 이용할 수 있다. 영양 요구성에 관여하는 유전자 변이를 상보할 수 있는 열성의 선택 마커도 사용할 수 있다. 효모에 있어서는, 선택 마커 유전자로서, 제네티신에 대한 내성 유전자를 이용할 수 있고, 영양 요구성에 관여하는 유전자 변이를 상보하는 유전자, LEU2, URA3, TRP1, HIS3 등의 선택 마커도 사용할 수 있다. 사상 진균에 있어서는, 선택 마커 유전자로서, niaD(Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 1795-1797(1995)), argB(Enzyme Microbiol Technol, 6, 386-389, (1984)), sC(Gene, 84, 329-334, (1989)), ptrA(BiosciBiotechnol Biochem, 64, 1416-1421, (2000)), pyrG(BiochemBiophys Res Commun, 112, 284-289, (1983)), amdS(Gene, 26, 205-221, (1983)), 오레오바시딘 내성 유전자(Mol Gen Genet, 261, 290-296, (1999)), 베노밀 내성 유전자(Proc Natl Acad Sci USA, 83, 4869-4873, (1986)) 및 하이그로마이신 내성 유전자(Gene, 57, 21-26, (1987))로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마커 유전자, 류신 요구성 상보 유전자 등을 들 수 있다. 또한, 숙주가 영양 요구성 변이주인 경우에는, 선택 마커 유전자로서 당해 영양 요구성을 상보하는 야생형 유전자를 이용할 수도 있다.
본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주의 선택은, 본 발명에 따른 핵산에 선택적으로 결합하는 프로브를 이용한 플라크 하이브리다이제이션 및 콜로니 하이브리다이제이션 등으로 행할 수 있다. 당해 프로브로서는, 본 발명에 따른 핵산의 서열 정보에 기초하여, PCR법에 의해서 증폭된 부분 DNA 단편을 라디오아이소토프 또는 다이곡시제닌으로 수식한 것을 이용할 수 있다.
(개변 피브로인의 생산)
본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주에 있어서, 본 발명에 따른 핵산을 발현시키는 것에 의해, 본 발명에 따른 개변 피브로인을 생산할 수 있다. 발현 방법으로서는, 직접 발현 외, 몰레큘러 클로닝 제2판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여, 분비 생산, 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다. 효모, 동물 세포, 곤충 세포에 의해 발현시킨 경우에는, 당 또는 당쇄가 부가된 폴리펩타이드로서 개변 피브로인을 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 개변 피브로인은, 예를 들면, 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주를 배양 배지 중에서 배양하고, 배양 배지 중에 본 발명에 따른 개변 피브로인을 생성 축적시키고, 해당 배양 배지로부터 채취하는 것에 의해 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 숙주를 배양 배지 중에서 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 통상 이용되는 방법에 따라서 행할 수 있다.
본 발명에 따른 숙주가 대장균 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물인 경우, 본 발명에 따른 숙주의 배양 배지로서, 해당 숙주가 자화(資化)될 수 있는 탄소원, 질소원 및 무기염류 등을 함유하고, 해당 숙주의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면 천연 배지, 합성 배지 중 어느 것을 이용해도 된다.
탄소원으로서는, 해당 숙주가 자화될 수 있는 것이면 되고, 예를 들면, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 및 이들을 함유하는 당밀, 전분 및 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산 및 프로피온산 등의 유기산, 및 에탄올 및 프로판올 등의 알코올류를 이용할 수 있다.
질소원으로서는, 예를 들면, 암모니아, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 아세트산 암모늄 및 인산 암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 밖의 함질소 화합물, 및 펩톤, 고기 진액, 효모 진액, 콘 스티프 리쿼, 카제인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효균체 및 그의 소화물을 이용할 수 있다.
무기염으로서는, 예를 들면, 인산 제일칼륨, 인산 제이칼륨, 인산 마그네슘, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 황산 제일철, 황산 망가니즈, 황산 구리 및 탄산 칼슘을 이용할 수 있다.
대장균 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물의 배양은, 예를 들면, 진탕 배양 또는 심부 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에서 행할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들면, 15∼40℃이다. 배양 시간은 통상 16시간∼7일간이다. 배양 중의 배양 배지의 pH는 3.0∼9.0으로 유지하는 것이 바람직하다. 배양 배지의 pH의 조정은 무기산, 유기산, 알칼리 용액, 요소, 탄산 칼슘 및 암모니아 등을 이용하여 행할 수 있다.
또한, 배양 중 필요에 따라서, 암피실린 및 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배양 배지에 첨가해도 된다. 프로모터로서 유도성의 프로모터를 이용한 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라서 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들면, lac 프로모터를 이용한 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 아이소프로필-β-D-싸이오갈락토피라노사이드 등을, trp 프로모터를 이용한 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 인돌 아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.
곤충 세포의 배양 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지(Pharmingen사제), Sf-900 II SFM 배지(LifeTechnologies사제), ExCell400, ExCell405(모두 JRH Biosciences사제), Grace's Insect Medium(Nature, 195, 788(1962)) 등을 이용할 수 있다.
곤충 세포의 배양은, 예를 들면, 배양 배지의 pH 6∼7, 배양 온도 25∼30℃ 등의 조건하에서, 배양 시간 1∼5일간으로 할 수 있다. 또한, 배양 중 필요에 따라서, 겐타마이신 등의 항생 물질을 배양 배지에 첨가해도 된다.
숙주가 식물 세포인 경우, 형질전환된 식물 세포를 그대로 배양해도 되고, 또한 식물의 기관에 분화시켜 배양할 수 있다. 해당 식물 세포를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 무라시게 앤드 스쿠그(MS) 배지, 화이트(White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 사이토키닌 등, 식물 호르몬을 첨가한 배지 등을 이용할 수 있다.
동물 세포의 배양은, 예를 들면, 배양 배지의 pH 5∼9, 배양 온도 20∼40℃ 등의 조건하에서, 배양 시간 3∼60일간으로 할 수 있다. 또한, 배양 중 필요에 따라서, 카나마이신, 하이그로마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주를 이용하여 개변 피브로인을 생산하는 방법으로서는, 해당 개변 피브로인을 숙주 세포내에 생산시키는 방법, 숙주 세포외로 분비시키는 방법, 및 숙주 세포외막 상에 생산시키는 방법이 있다. 사용하는 숙주 세포, 및 생산시키는 개변 피브로인의 구조를 바꾸는 것에 의해, 이들 각 방법을 선택할 수 있다.
예를 들면, 개변 피브로인이 숙주 세포내 또는 숙주 세포외막 상에 생산되는 경우, 폴 손 등의 방법(J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)), 로우 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227(1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)), 또는 일본 특허공개 평5-336963호 공보, 국제 공개 제94/23021호 등에 기재된 방법을 준용하는 것에 의해, 개변 피브로인을 숙주 세포외로 적극적으로 분비시키도록 변경시킬 수 있다. 즉, 유전자 재조합의 수법을 이용하여, 개변 피브로인의 활성 부위를 포함하는 폴리펩타이드에 시그널 펩타이드를 부가한 형태로 발현시키는 것에 의해, 개변 피브로인을 숙주 세포외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주에 의해 생산된 개변 피브로인은, 단백질의 단리 정제에 통상 이용되고 있는 방법으로 단리 및 정제할 수 있다. 예를 들면, 개변 피브로인이 세포내에 용해 상태로 발현한 경우에는, 배양 종료 후, 숙주 세포를 원심분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤가우린 호모지나이저 및 다이노밀 등에 의해 숙주 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다. 해당 무세포 추출액을 원심분리하는 것에 의해 얻어지는 상청으로부터, 단백질의 단리 정제에 통상 이용되고 있는 방법, 즉 용매 추출법, 황산 암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 다이에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75(미쓰비시화성사제) 등의 레진을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(Pharmacia사제) 등의 레진을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 뷰틸 세파로스, 페닐 세파로스 등의 레진을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 이용한 겔 여과법, 어피니티 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 방법을 단독으로 또는 조합해서 사용하여, 정제 표품을 얻을 수 있다.
상기 크로마토그래피로서는, 페닐-도요펄(도소), DEAE-도요펄(도소), 세파덱스 G-150(파마시아바이오테크)을 이용한 컬럼 크로마토그래피가 바람직하게 이용된다.
또한, 개변 피브로인이 세포내에 불용체를 형성하여 발현한 경우는, 마찬가지로 숙주 세포를 회수 후, 파쇄하고, 원심분리를 행하는 것에 의해, 침전 획분으로서 개변 피브로인의 불용체를 회수한다. 회수한 개변 피브로인의 불용체는 단백질 변성제로 가용화할 수 있다. 해당 조작 후, 상기와 마찬가지의 단리 정제법에 의해 개변 피브로인의 정제 표품을 얻을 수 있다.
개변 피브로인, 또는 개변 피브로인에 당쇄가 부가된 유도체가 세포외로 분비된 경우에는, 배양 상청으로부터 개변 피브로인 또는 그의 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 배양물을 원심분리 등의 수법에 의해 처리하는 것에 의해 배양 상청을 취득하고, 해당 배양 상청으로부터, 상기와 마찬가지의 단리 정제법을 이용하는 것에 의해, 정제 표품을 얻을 수 있다.
(방사)
본 발명에 따른 개변 피브로인은, 전술과 같이 생산 및 정제한 후, 추가로 방사해도 된다. 본 발명에 따른 개변 피브로인은, 피브로인의 방사에 통상 사용되고 있는 방법으로 방사할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 개변 피브로인을 용매에 용해시킨 방사액(도프액)을 방사하는 것에 의해, 본 발명에 따른 개변 피브로인으로 형성된 섬유를 얻을 수 있다.
방사액은 개변 피브로인에 용매를 가하고, 방사할 수 있는 점도로 조정해서 제작한다. 용매는 개변 피브로인을 용해시킬 수 있는 것이면 된다. 용매로서, 예를 들면, 헥사플루오로아이소프로판올(HFIP), 헥사플루오로아세톤(HFA), 다이메틸설폭사이드(DMSO), N,N-다이메틸폼아마이드(DMF), 폼산, 요소, 구아니딘, 도데실 황산 나트륨(SDS), 브로민화 리튬, 염화 칼슘, 싸이오사이안산 리튬 등을 포함하는 수용액 등을 들 수 있다.
방사액에는, 필요에 따라서 무기염을 첨가해도 된다. 무기염으로서는, 예를 들면, 이하에 나타내는 루이스산과 루이스 염기로 이루어지는 무기염을 들 수 있다. 루이스 염기로서는, 예를 들면, 옥소산 이온(질산 이온, 과염소산 이온 등), 금속 옥소산 이온(과망가니즈산 이온 등), 할로젠화물 이온, 싸이오사이안산 이온, 사이안산 이온 등을 들 수 있다. 루이스산으로서는, 예를 들면, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토류 금속 이온 등의 금속 이온, 암모늄 이온 등의 다원자 이온, 착이온 등을 들 수 있다. 루이스산과 루이스 염기로 이루어지는 무기염의 구체예로서는, 염화 리튬, 브로민화 리튬, 아이오딘화 리튬, 질산 리튬, 과염소산 리튬 및 싸이오사이안산 리튬 등의 리튬염, 염화 칼슘, 브로민화 칼슘, 아이오딘화 칼슘, 질산 칼슘, 과염소산 칼슘 및 싸이오사이안산 칼슘 등의 칼슘염, 염화 철, 브로민화 철, 아이오딘화 철, 질산 철, 과염소산 철 및 싸이오사이안산 철 등의 철염, 염화 알루미늄, 브로민화 알루미늄, 아이오딘화 알루미늄, 질산 알루미늄, 과염소산 알루미늄 및 싸이오사이안산 알루미늄 등의 알루미늄염, 염화 칼륨, 브로민화 칼륨, 아이오딘화 칼륨, 질산 칼륨, 과염소산 칼륨 및 싸이오사이안산 칼륨 등의 칼륨염, 염화 나트륨, 브로민화 나트륨, 아이오딘화 나트륨, 질산 나트륨, 과염소산 나트륨 및 싸이오사이안산 나트륨 등의 나트륨염, 염화 아연, 브로민화 아연, 아이오딘화 아연, 질산 아연, 과염소산 아연 및 싸이오사이안산 아연 등의 아연염, 염화 마그네슘, 브로민화 마그네슘, 아이오딘화 마그네슘, 질산 마그네슘, 과염소산 마그네슘 및 싸이오사이안산 마그네슘 등의 마그네슘염, 염화 바륨, 브로민화 바륨, 아이오딘화 바륨, 질산 바륨, 과염소산 바륨 및 싸이오사이안산 바륨 등의 바륨염, 및 염화 스트론튬, 브로민화 스트론튬, 아이오딘화 스트론튬, 질산 스트론튬, 과염소산 스트론튬 및 싸이오사이안산 스트론튬 등의 스트론튬염을 들 수 있다.
방사액의 점도는 방사 방법에 따라서 적절히 설정하면 되고, 예를 들면, 35℃에서 100∼15,000cP(센티포이즈)로 할 수 있다. 방사액의 점도는, 예를 들면 교토전자공업사제의 상품명 "EMS 점도계"를 사용하여 측정할 수 있다.
방사 방법으로서는, 본 발명에 따른 개변 피브로인을 방사할 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 건식 방사, 용융 방사, 습식 방사 등을 들 수 있다. 바람직한 방사 방법으로서는, 습식 방사를 들 수 있다.
습식 방사에서는, 개변 피브로인을 용해시킨 용매를 방사 구금(노즐)으로부터 응고액(응고액 조(槽)) 중으로 압출하고, 응고액 중에서 개변 피브로인을 굳히는 것에 의해 사의 형상의 미연신사를 얻을 수 있다. 응고액으로서는, 탈용매할 수 있는 용액이면 되고, 예를 들면, 메탄올, 에탄올 및 2-프로판올 등의 탄소수 1∼5의 저급 알코올, 및 아세톤 등을 들 수 있다. 응고액에는, 적절히 물을 가해도 된다. 응고액의 온도는 0∼30℃인 것이 바람직하다. 방사 구금으로서, 직경 0.1∼0.6mm의 노즐을 갖는 시린지 펌프를 사용하는 경우, 압출 속도는 1홀당 0.2∼6.0ml/시간이 바람직하고, 1.4∼4.0ml/시간인 것이 보다 바람직하다. 응고액 조의 길이는 탈용매를 효율적으로 행할 수 있는 길이가 있으면 되고, 예를 들면, 200∼500mm이다. 미연신사의 인취 속도는, 예를 들면, 1∼20m/분이면 되고, 1∼3m/분인 것이 바람직하다. 체류 시간은, 예를 들면, 0.01∼3분이면 되고, 0.05∼0.15분인 것이 바람직하다. 또한, 응고액 중에서 연신(전(前)연신)을 해도 된다. 저급 알코올의 증발을 억제하기 위해 응고액을 저온으로 유지하고, 미연신사의 상태에서 인취해도 된다. 응고액 조는 다단 설치해도 되고, 또한 연신은 필요에 따라서, 각 단 또는 특정 단에서 행해도 된다.
상기의 방법으로 얻어진 미연신사(또는 전연신사)는 연신 공정을 거쳐 연신사(피브로인 섬유)로 할 수 있다. 연신 방법으로서는, 습열 연신, 건열 연신 등을 들 수 있다.
습열 연신은 온수 중, 온수에 유기 용제 등을 가한 용액 중, 스팀 가열 중에서 행할 수 있다. 온도로서는, 예를 들면, 50∼90℃이면 되고, 75∼85℃가 바람직하다. 습열 연신에서는, 미연신사(또는 전연신사)를, 예를 들면, 1∼10배 연신할 수 있고, 2∼8배 연신하는 것이 바람직하다.
건열 연신은 전기 관상로, 건열판 등을 사용해서 행할 수 있다. 온도로서는, 예를 들면, 140℃∼270℃이면 되고, 160℃∼230℃가 바람직하다. 건열 연신에서는, 미연신사(또는 전연신사)를, 예를 들면, 0.5∼8배 연신할 수 있고, 1∼4배 연신하는 것이 바람직하다.
습열 연신 및 건열 연신은 각각 단독으로 행해도 되고, 또한 이들을 다단으로, 또는 조합하여 행해도 된다. 즉, 1단째 연신을 습열 연신으로 행하고, 2단째 연신을 건열 연신으로 행하거나, 또는 1단째 연신을 습열 연신으로 행하고, 2단째 연신을 습열 연신으로 행하고, 추가로 3단째 연신을 건열 연신으로 행하는 등, 습열 연신 및 건열 연신을 적절히 조합하여 행할 수 있다.
연신 공정에 있어서의 최종적인 연신 배율은, 미연신사(또는 전연신사)에 대해서, 예를 들면, 5∼20배이고, 6∼11배인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 개변 피브로인은, 연신해서 피브로인 섬유로 한 후, 피브로인 섬유 내의 폴리펩타이드 분자간에 화학적으로 가교시켜도 된다. 가교시킬 수 있는 작용기는, 예를 들면, 아미노기, 카복실기, 싸이올기 및 하이드록시기 등을 들 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드에 포함되는 라이신 측쇄의 아미노기는 글루탐산 또는 아스파라긴산 측쇄의 카복실기와 탈수 축합에 의해 아마이드 결합으로 가교할 수 있다. 진공 가열하에서 탈수 축합 반응을 행하는 것에 의해 가교해도 되고, 카보다이이미드 등의 탈수 축합제에 의해 가교시켜도 된다.
폴리펩타이드 분자간의 가교는 카보다이이미드, 글루탈알데하이드 등의 가교제를 이용하여 행해도 되고, 트랜스글루타미나제 등의 효소를 이용하여 행해도 된다. 카보다이이미드는 화학식 R1N=C=NR2(단, R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 1∼6의 알킬기, 사이클로알킬기를 포함하는 유기기를 나타낸다)로 표시되는 화합물이다. 카보다이이미드의 구체예로서, 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염(EDC), N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), 1-사이클로헥실-3-(2-모폴리노에틸)카보다이이미드, 다이아이소프로필카보다이이미드(DIC) 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, EDC 및 DIC는 폴리펩타이드 분자간의 아마이드 결합 형성능이 높아, 가교 반응하기 쉽기 때문에 바람직하다.
가교 처리는 피브로인 섬유에 가교제를 부여해서 진공 가열 건조로 가교하는 것이 바람직하다. 가교제는 순품을 피브로인 섬유에 부여해도 되고, 탄소수 1∼5의 저급 알코올 및 완충액 등으로 0.005∼10질량%의 농도로 희석한 것을 피브로인 섬유에 부여해도 된다. 가교 처리는 온도 20∼45℃에서 3∼42시간 행하는 것이 바람직하다. 가교 처리에 의해, 피브로인 섬유에 더욱 높은 응력(강도)을 부여할 수 있다.
[제품]
본 발명에 따른 개변 피브로인으로 형성된 피브로인 섬유는, 섬유 또는 사로서, 직물, 편물, 조(組)물, 부직포 등에 응용할 수 있다. 또한, 로프, 수술용 봉합사, 전기 부품용의 가요성 고정구, 나아가서는 이식용 생리 활성 재료(예를 들면, 인공 인대 및 대동맥 밴드) 등의 고강도 용도에도 응용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 개변 피브로인은, 필라멘트, 필름, 발포체, 구체, 나노피브릴, 하이드로겔, 수지 및 그의 등가물에도 응용할 수 있고, 이들은 일본 특허공개 2009-505668호 공보, 일본 특허공개 2009-505668호 공보, 일본 특허 제5678283호 공보, 일본 특허 제4638735호 공보 등에 기재된 방법에 준하여 제조할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
〔(1) 개변 피브로인을 코딩하는 핵산의 합성, 및 발현 벡터의 구축〕
천연 유래의 피브로인인 Nephila clavipes(GenBank 수탁번호: P46804.1, GI: 1174415)의 염기 서열 및 아미노산 서열에 기초하여, 서열번호 1∼4 및 6∼11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 피브로인 및 개변 피브로인을 설계했다. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열(Met-PRT313)은, 상기 천연 유래의 피브로인의 (A)n 모티프 중의 알라닌 잔기가 연속하는 아미노산 서열을 알라닌 잔기가 연속하는 수를 5개가 되도록 결실한 것이고, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열(PRT313)은, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열(태그 서열 및 힌지 서열)을 부가한 것이다(비교예 1, 비교예 2). 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열(Met-PRT399)은, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로부터, N 말단측으로부터 C 말단측을 향해서 2개 간격으로 (A)n 모티프((A)5)를 결실시키고, 추가로 C 말단 서열의 앞에 [(A)n 모티프-REP]를 1개 삽입한 것이며, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열(PRT399)은 이 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열(태그 서열 및 힌지 서열)을 부가한 것이다(참고예 1, 참고예 2). 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열(Met-PRT380)은, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 REP 중의 모든 GGX를 GQX로 치환한 것이고, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열(PRT380)은 이 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열(태그 서열 및 힌지 서열)을 부가한 것이다(실시예 1, 실시예 4). 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열(Met-PRT410)은, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 REP 중의 모든 GGX를 GQX로 치환한 것이고, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열(PRT410)은 이 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열(태그 서열 및 힌지 서열)을 부가한 것이다(실시예 2, 실시예 5). 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열(Met-PRT468)은, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 각 (A)n 모티프의 C 말단측에 2개의 알라닌 잔기를 삽입하고, 추가로 일부의 글루타민(Q) 잔기를 세린(S) 잔기로 치환하고, 서열번호 4의 분자량과 거의 동일해지도록 N 말단측의 일부의 아미노산을 결실시킨 것이며, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열(PRT468)은, 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열(태그 서열 및 힌지 서열)을 부가한 것이다(실시예 3).
설계한 서열번호 1∼4 및 10으로 표시되는 아미노산 서열 각각의 N 말단에 His 태그 서열 및 힌지 서열(서열번호 5)을 부가한 서열번호 6∼9 및 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산을 각각 합성했다. 당해 핵산에는, 5' 말단에 NdeI 사이트, 종지 코돈 하류에 EcoRI 사이트를 부가했다. 이들 4종류의 핵산을 클로닝 벡터(pUC118)에 클로닝했다. 그 후, 동 핵산을 NdeI 및 EcoRI로 제한 효소 처리해서 잘라낸 후, 단백질 발현 벡터 pET-22b(+)에 재조합하여 발현 벡터를 얻었다.
〔(2) 단백질의 발현〕
서열번호 6∼9 및 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 pET22b(+) 발현 벡터로, 대장균 BLR(DE3)을 형질전환했다. 당해 형질전환 대장균을, 암피실린을 포함하는 2mL의 LB 배지에서 15시간 배양했다. 당해 배양액을, 암피실린을 포함하는 100mL의 시드 배양용 배지(표 6)에 OD600이 0.005가 되도록 첨가했다. 배양액 온도를 30℃로 유지하고, OD600이 5가 될 때까지 플라스크 배양을 행하여(약 15시간), 시드 배양액을 얻었다.
Figure 112018115169365-pct00006
당해 시드 배양액을 500ml의 생산 배지(표 7)를 첨가한 자 퍼멘터(jar fermenter)에 OD600이 0.05가 되도록 첨가했다. 배양액 온도를 37℃로 유지하고, pH 6.9로 일정하게 제어해서 배양했다. 또한, 배양액 중의 용존 산소 농도를 용존 산소 포화 농도의 20%로 유지하도록 했다.
Figure 112018115169365-pct00007
생산 배지 중의 글루코스가 완전히 소비된 직후에, 피드액(글루코스 455g/1L, Yeast Extract 120g/1L)을 1ml/분의 속도로 첨가했다. 배양액 온도를 37℃로 유지하고, pH 6.9로 일정하게 제어해서 배양했다. 또한, 배양액 중의 용존 산소 농도를 용존 산소 포화 농도의 20%로 유지하도록 하여, 20시간 배양을 행했다. 그 후, 1M의 아이소프로필-β-싸이오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양액에 대해서 종농도 1mM가 되도록 첨가하여, 목적하는 단백질을 발현 유도시켰다. IPTG 첨가 후 20시간 경과한 시점에서, 배양액을 원심분리하고, 균체를 회수했다. IPTG 첨가 전과 IPTG 첨가 후의 배양액으로부터 조제한 균체를 이용하여 SDS-PAGE를 행하고, IPTG 첨가에 의존한 목적으로 하는 단백질 사이즈의 밴드의 출현에 의해, 목적으로 하는 단백질의 발현을 확인했다.
〔(3) 단백질의 정제〕
IPTG를 첨가하고 나서 2시간 후에 회수한 균체를 20mM Tris-HCl buffer(pH 7.4)로 세정했다. 세정 후의 균체를 약 1mM의 PMSF를 포함하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)에 현탁시키고, 고압 호모지나이저(GEA Niro Soavi사)로 세포를 파쇄했다. 파쇄한 세포를 원심분리하여, 침전물을 얻었다. 얻어진 침전물을 고순도가 될 때까지 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)으로 세정했다. 세정 후의 침전물을 100mg/mL의 농도가 되도록 8M 구아니딘 완충액(8M 구아니딘 염산염, 10mM 인산 이수소나트륨, 20mM NaCl, 1mM Tris-HCl, pH 7.0)으로 현탁하고, 60℃에서 30분간, 스터러로 교반하여, 용해시켰다. 용해 후, 투석 튜브(산코준야쿠주식회사제의 셀룰로스 튜브 36/32)를 이용하여 물로 투석을 행했다. 투석 후에 얻어진 백색의 응집 단백질을 원심분리에 의해 회수하고, 동결 건조기로 수분을 제거하여, 동결 건조 분말을 회수했다.
얻어진 동결 건조 분말에 있어서의 목적 단백질의 정제도는, 분말의 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동의 결과를 Totallab(nonlinear dynamics ltd.)을 이용하여 화상 해석하는 것에 의해 확인했다. 그 결과, 어느 단백질도 정제도는 약 85%였다.
〔(4) 방사액(도프액)의 조제〕
미리 첨가물로서 염화 리튬을 4질량% 용해시킨 DMSO를 주용매로서 이용하여, 상기에서 조제한 PRT313(서열번호 6: 비교예 1), PRT399(서열번호 7: 참고예 1), PRT380(서열번호 8: 실시예 1), PRT410(서열번호 9: 실시예 2) 및 PRT468(서열번호 11: 실시예 3) 단백질의 동결 건조 분말을 농도가 24질량%가 되도록 주용매에 가했다. 90도의 로테이터로 1시간 및 80도에서 15시간 용해한 후, 소결 금속 필터로 여과하여, 찌꺼기를 제거했다. 이어서, 1시간 정치해서 폼을 제거하여, 방사액(도프액)으로 했다. 단백질의 종류 및 온도에 따라 방사액의 점도는 다소 상이하지만, PRT410의 경우, 35℃에서 5,000cP(센티포이즈)였다.
〔(5) 방사〕
방사액을 리저브 탱크에 충전하고, 0.1 또는 0.2mm 지름의 멀티 홀 노즐로부터 기어 펌프를 이용하여 100질량% 메탄올 응고 욕조 중에 토출시켰다. 토출량은 3∼6ml/분으로 조정했다. 응고 후, 100질량% 메탄올 세정 욕조에서 세정 및 연신을 행했다. 세정 및 연신 후, 건열판을 이용하여 건조시키고, 얻어진 원사(섬유)를 권취했다.
〔물성 측정〕
이하와 같이 해서 얻어진 원사의 물성을 측정했다.
(a) 광학 현미경을 이용하여 섬유의 직경을 구했다.
(b) 온도 20℃, 상대습도 65%의 조건에서 인장 시험기(INSTRON3342)를 이용하여 섬유의 응력, 초기 탄성률, 신도(파단점 변위, 변위)를 측정하고, 하기 식에 의해 터프니스를 산출했다. 인장 시험에서는 10m 초 간격으로 측정했다. 각 샘플은 후지(厚紙)로 제작한 형틀에 첩부하고, 그립퍼간 거리는 20mm, 인장 속도는 10mm/분으로 했다. 로드 셀 용량 10N, 그립 지그는 클립식으로 했다. 측정값은 샘플수 n=5의 평균값으로 했다.
터프니스는 다음의 산출식으로 구했다.
터프니스=[E/(r2×π×L)×1000](단위: MJ/m3)
여기에서,
E: 파괴 에너지(단위: J)
r: 섬유의 반경(단위: mm)
π: 원주율
L: 인장 시험 측정 시의 그립퍼간 거리: 20mm
각 단백질의 동결 분말의 생산량, 각 원사의 응력, 터프니스 및 신도를 측정한 결과를, PRT313(서열번호 6: 비교예 1)의 값을 100으로 했을 때의 상대값으로 표 8에 나타냈다.
Figure 112018115169365-pct00008
REP 중의 글라이신 잔기의 함유량을 저감시킨 개변 피브로인은 생산성이 현저하게 향상되었다(실시예 1). 또한, REP 중의 글라이신 잔기의 함유량의 저감에 더하여, (A)n 모티프의 함유량을 저감시킨 개변 피브로인은 한층 더 현저히 생산성이 향상되고, 또한 터프니스 및 신도의 향상이 확인되었다(실시예 2 및 3).
다음으로, 방사 조건을 이하에 나타내는 대로 변경하고, 상기에서 조제한 정제 단백질, PRT313(서열번호 6: 비교예 2), PRT399(서열번호 7: 참고예 2), PRT380(서열번호 8: 실시예 4) 및 PRT410(서열번호 9: 실시예 5)에 대하여 방사를 행하여, 상기와 마찬가지의 방법으로 물성을 측정하고, 비교를 행했다.
방사액은 상기 (4) 방사액(도프액)의 조제와 마찬가지의 방법으로 조제했다. 조제한 방사액을 리저브 탱크에 충전하고, 0.2mm 지름의 노즐로부터 기어 펌프를 이용하여 100질량% 메탄올 응고 욕조 중에 토출시켰다. 토출량은 0.050∼0.052ml/분으로 조정했다. 응고 후, 100질량% 메탄올 세정 욕조에서 세정, 50도의 탕욕 중에서 3배 연신을 행했다. 세정 및 연신 후, 60도의 핫 롤러를 이용하여 건조시키고, 얻어진 원사(섬유)를 권취했다.
각 원사의 응력, 터프니스 및 신도를 측정한 결과를, PRT313(서열번호 6: 비교예 2)의 값을 100으로 했을 때의 상대값으로 표 9에 나타냈다.
Figure 112018115169365-pct00009
REP 중의 글라이신 잔기의 함유량을 저감시킨 개변 피브로인은 강도(응력 및 터프니스)와 신도를 유지하고 있었다(실시예 4). 또한, REP 중의 글라이신 잔기의 함유량의 저감에 더하여, (A)n 모티프의 함유량을 저감시킨 개변 피브로인은 응력을 유지한 채, 터프니스 및 신도의 향상이 확인되었다(실시예 5).
SEQUENCE LISTING <110> Spiber Inc. KOJIMA INDUSTRIES CORPORATION <120> Altered Fibroin <130> FP17-0267-00 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 597 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Met-PRT313 <400> 1 Met Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Gly Gly Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Gln Gly 35 40 45 Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro 50 55 60 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala 85 90 95 Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Gly Gln Gln 100 105 110 Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Ser Gly 115 120 125 Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala 145 150 155 160 Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Gln 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Ala Gly Gly Tyr 180 185 190 Gly Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala 210 215 220 Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser 225 230 235 240 Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Gln Gly 245 250 255 Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gly Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gly 260 265 270 Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala 275 280 285 Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala 290 295 300 Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly 305 310 315 320 Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser 325 330 335 Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro 340 345 350 Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gln Gln 355 360 365 Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly 370 375 380 Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly 385 390 395 400 Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala 405 410 415 Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Tyr 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro 435 440 445 Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro 450 455 460 Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala 465 470 475 480 Gly Pro Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gly Asn Gly 485 490 495 Pro Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Ser 500 505 510 Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly 515 520 525 Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly 530 535 540 Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Ser 545 550 555 560 Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala 565 570 575 Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser 580 585 590 <210> 3 <211> 597 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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415 Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala 420 425 430 Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala 435 440 445 Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Tyr 450 455 460 Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly 465 470 475 480 Ser Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala 485 490 495 Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro 500 505 510 Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly 515 520 525 Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser 530 535 540 Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala 545 550 555 560 Ala Ala Gly Gln Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly 565 570 575 Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln 580 585 590 Gly Pro Gly Ala Ser 595 <210> 4 <211> 590 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Met-PRT410 <400> 4 Met Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly 20 25 30 Gln Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly 35 40 45 Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro 50 55 60 Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly 65 70 75 80 Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln 85 90 95 Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala 100 105 110 Gly Gln Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Ser Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Pro Tyr 130 135 140 Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly 145 150 155 160 Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro 165 170 175 Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr 180 185 190 Gly Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala 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Ala Gly Gly 420 425 430 Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Ser 435 440 445 Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala 450 455 460 Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro 465 470 475 480 Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly 485 490 495 Gly Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gly Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gly 500 505 510 Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala 515 520 525 Gly Gly Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly 530 535 540 Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln 545 550 555 560 Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro 565 570 575 Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly 580 585 590 Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser 595 600 <210> 8 <211> 608 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRT380 <400> 8 Met His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln 1 5 10 15 Gln Gly 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Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser 225 230 235 240 Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala 245 250 255 Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro 275 280 285 Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Asn Gly Pro 290 295 300 Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Ala 305 310 315 320 Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala 325 330 335 Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro 340 345 350 Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly 355 360 365 Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly 370 375 380 Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Ala 385 390 395 400 Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro 405 410 415 Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln 420 425 430 Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly 435 440 445 Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala 450 455 460 Ala Gly Gln Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro 465 470 475 480 Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly 485 490 495 Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln 500 505 510 Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala 515 520 525 Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala 530 535 540 Ala Ala Ala Ala Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro 545 550 555 560 Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr 565 570 575 Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala 580 585 590 Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser 595 600 605 <210> 9 <211> 601 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRT410 <400> 9 Met His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln 1 5 10 15 Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln 20 25 30 Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Gly Gln Tyr 35 40 45 Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro 65 70 75 80 Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly 85 90 95 Pro Gly Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln 100 105 110 Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ser 115 120 125 Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly 130 135 140 Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser 145 150 155 160 Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala 165 170 175 Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro 180 185 190 Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ser Gly Pro Gly 195 200 205 Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser Gly Gln Gln Gly 210 215 220 Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro 225 230 235 240 Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala 245 250 255 Gly Gln Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly 260 265 270 Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln 275 280 285 Gln Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln 290 295 300 Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr 305 310 315 320 Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Gly 325 330 335 Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala 340 345 350 Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln 355 360 365 Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln 370 375 380 Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr 385 390 395 400 Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly 405 410 415 Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln 420 425 430 Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Gly 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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gln 260 265 270 Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser 275 280 285 Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala 290 295 300 Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala 305 310 315 320 Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln 325 330 335 Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly 340 345 350 Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser 355 360 365 Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala 370 375 380 Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly 385 390 395 400 Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly 405 410 415 Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr 420 425 430 Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala 435 440 445 Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro 450 455 460 Gly Gln Ser Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro Tyr Gly 465 470 475 480 Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Pro 485 490 495 Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala 500 505 510 Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln 515 520 525 Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly 530 535 540 Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln 545 550 555 560 Gly Pro Gly Ala Ser 565 <210> 11 <211> 576 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRT468 <400> 11 Met His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln 1 5 10 15 Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Gly Ser Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Gly 35 40 45 Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser 50 55 60 Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly 65 70 75 80 Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro 85 90 95 Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly 100 105 110 Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr 130 135 140 Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr 145 150 155 160 Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly 165 170 175 Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 180 185 190 Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Ala Ser Ala 195 200 205 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Gln 210 215 220 Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly 225 230 235 240 Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro 245 250 255 Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala 260 265 270 Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly 275 280 285 Pro Gly 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Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro 500 505 510 Tyr Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly 515 520 525 Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser 530 535 540 Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala 545 550 555 560 Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser 565 570 575

Claims (35)

  1. 삭제
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  3. 식 1: [(A)n 모티프-REP]m으로 표시되는 도메인 서열을 포함하는 개변 피브로인으로서,
    식 1 중, (A)n 모티프는 4∼20 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타내고, 또한 (A)n 모티프 중의 전체 아미노산 잔기수에 대한 알라닌 잔기수가 83% 이상이며, REP는 10∼200 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 나타내고, m은 8∼300의 정수를 나타내며, 복수 존재하는 (A)n 모티프는 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 되며, 복수 존재하는 REP는 서로 동일한 아미노산 서열이어도 되고, 상이한 아미노산 서열이어도 되며,
    글라이신 이외의 아미노산 잔기를 X라고 할 때, 상기 도메인 서열로부터, 가장 C 말단측에 위치하는 (A)n 모티프부터 상기 도메인 서열의 C 말단까지의 서열을 제외한 서열 중의 전체 REP에 포함되는 XGX로 이루어지는 아미노산 서열의 총 아미노산 잔기수를 z로 하고, 상기 도메인 서열로부터, 가장 C 말단측에 위치하는 (A)n 모티프부터 상기 도메인 서열의 C 말단까지의 서열을 제외한 서열 중의 총 아미노산 잔기수를 w로 했을 때에, z/w가 50.9% 이상인, 개변 피브로인.
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  13. 제 3 항에 있어서,
    N 말단측으로부터 C 말단측을 향해서, 서로 이웃하는 2개의 [(A)n 모티프-REP] 유닛의 REP의 아미노산 잔기수를 순차적으로 비교해서, 아미노산 잔기수가 적은 REP의 아미노산 잔기수를 1로 했을 때, 다른 쪽의 REP의 아미노산 잔기수의 비가 2∼3.5가 되는 상기 서로 이웃하는 2개의 [(A)n 모티프-REP] 유닛의 아미노산 잔기수를 서로 합한 합계값을 x로 하고, 상기 도메인 서열의 총 아미노산 잔기수를 y로 했을 때에, x/y의 최대값이 20% 이상인, 개변 피브로인.
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  15. 제 3 항에 있어서,
    추가로, N 말단 및 C 말단 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 태그 서열을 포함하는, 개변 피브로인.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 태그 서열이 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 개변 피브로인.
  17. 삭제
  18. 제 3 항, 제 13 항, 제 15 항 및 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 개변 피브로인을 코딩하는 핵산.
  19. 제 18 항에 기재된 핵산 서열과, 당해 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 1 또는 복수의 조절 서열을 갖는 발현 벡터.
  20. 제 19 항에 있어서,
    플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인, 발현 벡터.
  21. 제 19 항에 기재된 발현 벡터로 형질전환된 숙주.
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  32. 제 3 항, 제 13 항, 제 15 항 및 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 개변 피브로인을 포함하고,
    섬유, 사, 필라멘트, 필름, 발포체, 구체, 나노피브릴, 하이드로겔, 수지 및 그의 등가물로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 제품.
  33. 삭제
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