WO2019022163A1 - 改変フィブロイン - Google Patents

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WO2019022163A1
WO2019022163A1 PCT/JP2018/027974 JP2018027974W WO2019022163A1 WO 2019022163 A1 WO2019022163 A1 WO 2019022163A1 JP 2018027974 W JP2018027974 W JP 2018027974W WO 2019022163 A1 WO2019022163 A1 WO 2019022163A1
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amino acid
seq
modified fibroin
fiber
acid sequence
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PCT/JP2018/027974
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Inventor
森田　啓介
佑之介 安部
健久 前川
浩一 小鷹
潤一 菅原
圭司 沼田
Original Assignee
Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
国立研究開発法人理化学研究所
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    • D—TEXTILES; PAPER
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    • D01D5/12—Stretch-spinning methods
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F4/00—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof
    • D01F4/02—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof from fibroin

Definitions

  • the present invention relates to modified fibroin. More specifically, the present invention relates to a modified fibroin having a reduced content of glutamine residues.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding the modified fibroin, an expression vector comprising the nucleic acid sequence, a host transformed with the expression vector, and a product produced from the modified fibroin.
  • Fibroin is a type of fibrillar protein, and contains up to 90% of glycine residues, alanine residues and serine residues that lead to the formation of a ⁇ -pleated sheet (Non-patent Document 1).
  • proteins as fibroin, proteins (silk protein, hornet silk protein, spider silk protein) and the like that constitute threads produced by insects and arachnids are known.
  • Silk protein is a material widely used as a raw material for clothes, having excellent mechanical properties, moisture absorption properties and deodorizing properties.
  • silk thread is a natural fiber that is immune tolerance, and is also used for applications such as surgical sutures because it has high biocompatibility.
  • Spider silk proteins are, according to their source organs, large tenacious spider proteins (major ampullate spider protein (MaSp), high elongating fissure-like spider proteins (minor ampullate spider protein (MiSp), It has been designated as a flagelliform (Flag), a tubular (tubuliform), an aggregate, a grapevine (aciniform) and a pearlike spider silk protein.
  • Major ampullate spider protein Major ampullate spider protein
  • MiSp high elongating fissure-like spider proteins
  • It has been designated as a flagelliform (Flag), a tubular (tubuliform), an aggregate, a grapevine (aciniform) and a pearlike spider silk protein.
  • flagelliform flagelliform
  • tubular tubuliform
  • an aggregate a grapevine (aciniform)
  • pearlike spider silk protein a pearlike spider silk protein
  • GPGXX As one of the fibroin-specific structures, GPGXX, an extension region ((A) n or (GA) n ) rich in alanine residues, GGX, and a structure in which amino acid motifs classified into spacers are repeated are known.
  • Non-Patent Document 2 In addition, by replacing the (GA) n motif with the (A) n motif, the elongation decreases but the tensile strength increases, the elongation increases by increasing the number of GPGXX motifs, how many of the GPGXX motifs It has been reported that tensile strength is increased by substituting K with (A) n motif (Patent Document 2). In addition, GGX and GPGXX motifs are considered to have a flexible helical structure that imparts elasticity to yarns (Patent Document 3).
  • Fibroin fibers obtained by spinning fibroin have the property of shrinking due to immersion in water or hot water, exposure to a high humidity environment, and the like. This property causes various problems in the manufacturing process and production and affects the product made of the fiber.
  • a shrinkage-preventing method for preventing the shrinkage of the product for example, a silk fabric using a high twist yarn which has been completely scoured is immersed in water, other solvents, or a mixture thereof in a tensioned state and heated for a predetermined time
  • the non-shrinkage processing method of a silk fabric (Patent Document 6) characterized in that an animal fiber product in a state of being formed into a required shape is subjected to a treatment of contacting high pressure saturated steam at 120 to 200 ° C.
  • a method for fixing the shape of an animal fiber product Patent Document 7 and the like characterized in that the shape at the time of steam treatment is fixed.
  • JP 2012-55269 A Japanese Patent Application Publication No. 2005-502347 Japanese Patent Publication No. 2009-505668 Japanese Patent Application Publication No. 2014-502140 International Publication No. 2015/042164 Tokuhei 2-6869 Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-294068
  • An object of the present invention is to provide a modified fibroin capable of spinning fibroin fibers with reduced shrinkage.
  • the inventors have found that reducing the content of glutamine residues present in fibroin results in fibroin fibers with reduced contraction. Furthermore, the film which shape
  • a modified fibroin comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n Motif-REP] m , or Formula 2: [(A) n Motif -REP] m- (A) n Motif, Content of glutamine residue corresponding to the above-mentioned domain sequence having deleted one or more glutamine residues in REP as compared with naturally occurring fibroin, or substituting for another amino acid residue A modified fibroin, having a reduced amino acid sequence.
  • (A) n motif indicates an amino acid sequence composed of 4 to 27 amino acid residues, and (A) the number of alanine residues is 80% of the total number of amino acid residues in the n motif It is above.
  • REP represents an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 10 to 300.
  • the plurality of (A) n motifs may be identical to each other or different from each other.
  • the plurality of REPs may be identical amino acid sequences to each other or different amino acid sequences.
  • [4] The above other amino acid residues are isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) alanine (A), glycine (G), threonine (T) And any one of [1] to [3] which is an amino acid residue selected from the group consisting of serine (S), tryptophan (W), tyrosine (Y), proline (P) and histidine (H) Modified fibroin as described. [5] The modified fibroin according to any one of [1] to [4], wherein the hydrophobicity of REP is -0.8 or more.
  • [11] [10] The modified fibroin according to [10], wherein the tag sequence comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • [14] It hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the nucleic acid described in [13], and formula 1: [(A) n motif-REP] m , or formula 2: [(A) n motif-REP] m -(A) A nucleic acid encoding a modified fibroin comprising a domain sequence represented by the n motif.
  • (A) n motif indicates an amino acid sequence composed of 4 to 27 amino acid residues, and (A) the number of alanine residues is 80% of the total number of amino acid residues in the n motif It is above.
  • REP represents an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 10 to 300.
  • the plurality of (A) n motifs may be identical to each other or different from each other.
  • the plurality of REPs may be identical amino acid sequences to each other or different amino acid sequences.
  • [15] It has 90% or more sequence identity with the nucleic acid described in [13], and Formula 1: [(A) n Motif -REP] m , or Formula 2: [(A) n Motif -REP] m-
  • (A) n motif indicates an amino acid sequence composed of 4 to 27 amino acid residues, and (A) the number of alanine residues is 80% of the total number of amino acid residues in the n motif It is above.
  • REP represents an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 10 to 300.
  • the plurality of (A) n motifs may be identical to each other or different from each other.
  • the plurality of REPs may be identical amino acid sequences to each other or different amino acid sequences.
  • An expression vector comprising the nucleic acid sequence of any of [13]-[15] and one or more regulatory sequences operably linked to said nucleic acid sequence.
  • the above-mentioned prokaryote is a microorganism belonging to a genus selected from the group consisting of Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium and Pseudomonas. 19].
  • yeast a yeast belonging to a genus selected from the group consisting of Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Clyberomyces, Trichosporon, Ciwaniomyces, Pichia, Candida, Yarowia and Hansenula [22], The host as described in.
  • the yeast belonging to the genus Saccharomyces is Saccharomyces cerevisiae, and the yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces is Schizosaccharomyces pombe, and the yeast belonging to the genus Chriberomyces is Klyberomyces.
  • a yeast belonging to the genus Trichosporon which is the yeast belonging to the genus Trichosporon; a yeast belonging to the genus Trichosporon pullulans; and a yeast belonging to the genus Ciwaniomyces is the species Ciwaniomyces alvius (Schwanniomyces alluvius), which belongs to the genus Pichia; But Pichia Pastoris (Pichi) and the yeast belonging to the genus Candida are Candida albicans, and the yeast belonging to the genus Yarowia is Yarrowia lipolytica, and the yeast belonging to the genus Hansenula is The host according to [23], which is Hansenula polymorpha.
  • the filamentous fungus is a filamentous fungus belonging to a genus selected from the group consisting of Aspergillus, Penicillium and Mucor.
  • the filamentous fungus belonging to the genus Aspergillus is Aspergillus oryzae
  • the filamentous fungus belonging to the genus Penicillium is Penicillium crizogenum
  • the filamentous fungus belonging to the genus Mucoa is Mucocoflagylus
  • the present invention also relates to, for example, the following inventions.
  • An artificially modified fibroin fiber comprising an altered fibroin, which elongates when moistened and shrinks when dried from moistening.
  • the artificially modified fibroin fiber as described in [30] whose recovery ratio defined by following formula (1) is 95% or more.
  • the artificially modified fibroin fiber is a fiber having a shrinkage history irreversibly shrunk by contact with water after spinning, The artificially modified fibroin fiber as described in [30] or [31] whose shrinkage rate A defined by following formula (2) is 2% or more.
  • Shrinkage factor A ⁇ 1- (length of fiber irreversibly shrunk by contact with water after spinning / length of fiber before spinning and after contact with water) ⁇ ⁇ 100 (%) (2)
  • the artificially modified fibroin fiber is a fiber having a contraction history further contracted by drying after being irreversibly contracted by contact with water after spinning.
  • the artificially modified fibroin fiber according to any one of [30] to [32], wherein the shrinkage factor B defined by the following formula (3) is more than 7%.
  • Shrinkage factor B ⁇ 1-length of fiber shrunk irreversibly by contact with water after spinning, length of fiber further shrunk by drying / length of fiber before spinning and contact with water) ⁇ ⁇ 100 (%) ...
  • Shrinkage factor C ⁇ 1 ⁇ (length of artificially modified fibroin fiber when dried from wet state / length of artificially modified fibroin fiber when wet state) ⁇ ⁇ 100 (%) (5)
  • Shrinkage factor A ⁇ 1- (length of fiber irreversibly shrunk by contact with water after spinning / length of fiber before spinning and after contact with water) ⁇ ⁇ 100 (%) (2) [39] The production method according to [37] or [38], wherein the raw material fiber is a fiber having a shrinkage ratio B defined by the following formula (3) of more than 7%.
  • Shrinkage factor B ⁇ 1- (Length of fiber shrunk irreversibly by contact with water after spinning, length of fiber further shrunk by drying / length of fiber before contacting with water after spinning) ⁇ ⁇ 100 (%) ... (3)
  • the present invention it is possible to provide a modified fibroin capable of spinning fibroin fibers with reduced shrinkage. Moreover, water absorption is reduced and it becomes possible to provide a modified fibroin capable of producing a fibroin film having water resistance.
  • the degree of the elongation and contraction is comparable (the recovery rate is close to 100%), and the original length It is possible to provide a man-made modified fibroin fiber having the property of being able to return to the other, and a method for producing the same.
  • the modified fibroin comprises a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif It is a protein.
  • the modified fibroin may further have an amino acid sequence (N-terminal sequence and C-terminal sequence) added to either or both of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence.
  • An N-terminal sequence and a C-terminal sequence are typically, but not limited to, regions having no repeat of the amino acid motif characteristic of fibroin, and consist of about 100 amino acids.
  • modified fibroin refers to fibroin whose domain sequence differs from that of naturally occurring fibroin.
  • naturally-derived fibroin is also represented by Formula 1: [(A) n Motif-REP] m , or Formula 2: [(A) n Motif-REP] m- (A) n Motif A protein comprising the domain sequence
  • modified fibroin As long as it has the amino acid sequence specified in the present invention, the one derived from naturally occurring fibroin and modified in its amino acid sequence (eg, modified gene sequence of cloned naturally occurring fibroin) Amino acid sequence may be modified by artificially), or artificially designed and synthesized independently of naturally occurring fibroin (eg, desired by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence).
  • modified gene sequence of cloned naturally occurring fibroin eg, modified gene sequence of cloned naturally occurring fibroin
  • Amino acid sequence may be modified by artificially), or artificially designed and synthesized independently of naturally occurring fibroin (eg, desired by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence).
  • domain sequence refers to a crystal region specific to fibroin (typically corresponding to the (A) n motif of the amino acid sequence) and an amorphous region (typically the REP of the amino acid sequence).
  • Amino acid sequence which corresponds to the following formula 1: [(A) n motif -REP] m , or formula 2: [(A) n motif -REP] m- (A) n motif Means sequence.
  • (A) n motif indicates an amino acid sequence composed of 4 to 27 amino acid residues, and (A) the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in n motif is 80% or more.
  • REP represents an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 10 to 300.
  • the plurality of (A) n motifs may be identical to each other or different from each other.
  • the plurality of REPs may be identical amino acid sequences to each other or different amino acid sequences.
  • (A) n motif be alanine residues to total amino acid residues in (A) n motifs may be at least 80% but preferably 85% or more, 90% or more More preferably, it is more preferably 95% or more, and it is even more preferable that it is 100% (meaning it is composed of only alanine residues). It is preferable that at least seven (A) n motifs in the domain sequence are composed of only alanine residues. When it consists only of an alanine residue, (A) n motif is (A) n (A represents an alanine residue, n is an integer of 4 to 27, preferably an integer of 4 to 20, more preferably It means having an amino acid sequence represented by 4) to 16).
  • the modified fibroin according to the present embodiment may have an amino acid sequence in which the content of glutamine residues is reduced as compared to naturally occurring fibroin. Since the modified fibroin according to the present embodiment has a reduced content of glutamine residue, the fibroin fiber obtained by spinning the modified fibroin has a reduced shrinkage. In addition, a film obtained by molding the fibroin has water resistance.
  • the modified fibroin according to this embodiment is selected from the GGX motif and the GPGXX motif (G is a glycine residue, P is a phenylalanine residue, and X is an amino acid residue other than a glycine residue) in the amino acid sequence of REP.
  • G is a glycine residue
  • P is a phenylalanine residue
  • X is an amino acid residue other than a glycine residue
  • at least one motif is included. The inclusion of these motifs in the REP can improve the elongation of the modified fibroin.
  • the GPGXX motif content is usually 1% or more, may be 5% or more, and preferably 10% or more. Thereby, the elongation of the modified fibroin can be further improved.
  • the upper limit of the GPGXX motif content is not particularly limited, and may be 50% or less, or 30% or less.
  • GPGXX motif content is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n Motif -REP] m
  • Formula 2 [(A) n Motif -REP] m- (A) n in the fibroin containing the domain sequence represented by the n motif, most C-terminally
  • A) The number obtained by three times the total number of GPGXX motifs contained in the region in all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the domain motif to the C-terminus of the domain sequence from the (A) n motif (ie, Let the total number of G and P in the GPGXX motif be x), and the sequence from the (A) n motif located closest to the C terminal to the C terminus of the domain sequence is removed from the domain sequence, and (A) n motif GPGXX motif content is calculated as x / y, where y is the total number of amino acid residues of all REPs removed.
  • GPGXX motif content “the sequence obtained by removing the sequence from the (A) n motif located at the most C terminal side to the C terminus of the domain sequence from the domain sequence” is “most C terminal side (A)
  • a sequence from the n motif to the C terminus of the domain sequence (sequence corresponding to REP) may contain a sequence with low correlation with the sequence characteristic of fibroin, and m is small If this is the case (that is, if the domain sequence is short), this affects the result of calculation of the GPGXX motif content, so this effect is eliminated.
  • GPGXX motif is located at the C-terminal of REP, even if “XX” is, for example, “AA”, it is treated as “GPGXX motif”.
  • FIG. 1 is a schematic view showing the domain sequence of modified fibroin.
  • all the REPs are "the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal end to the C-terminal end of the domain sequence removed from the domain sequence" (the sequence shown in "region A” in FIG.
  • the modified fibroin according to this embodiment preferably has a glutamine residue content of 9% or less, more preferably 7% or less, still more preferably 4% or less, and 0%. Particularly preferred. Thereby, the effects of the present invention can be more significantly exhibited.
  • glucose residue content is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n Motif -REP] m
  • Formula 2 [(A) n Motif -REP] m- (A) n in the fibroin containing the domain sequence represented by the n motif, most C-terminally (A) All the REP included in the sequence (a sequence corresponding to “region A” in FIG.
  • the total number of glutamine residues is w, and the sequence from the (A) n motif located closest to the C terminal to the C terminus of the domain sequence is removed from the domain sequence, and (A) the amino acid residues of all REP excluding the n motif
  • the glutamine residue content is calculated as w / y, where y is the total number of groups. In the calculation of glutamine residue content, the reason why “a sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence is excluded from the domain sequence” is the reason described above It is similar.
  • the domain sequence has deleted one or more glutamine residues in REP as compared to naturally occurring fibroin, or replaced with another amino acid residue. It may have the corresponding amino acid sequence.
  • the “other amino acid residue” may be an amino acid residue other than a glutamine residue, but is preferably an amino acid residue having a larger hydrophobicity index than a glutamine residue.
  • known indices Hydropathy index: Kyte J, & Doolittle R (1982) “A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”, J. Mol. Biol., 157, pp. Use 105-132).
  • the hydrophobicity index (hydropathy index, hereinafter also referred to as "HI" of each amino acid is as shown in Table 1 below.
  • amino acid residues having a larger hydrophobicity index than glutamine residues isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) )
  • amino acid residues selected from alanine (A), glycine (G), threonine (T), serine (S), tryptophan (W), tyrosine (Y), proline (P) and histidine (H) it can.
  • the amino acid residue is selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A). More preferably, it is an amino acid residue selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L) and phenylalanine (F).
  • the hydrophobicity of REP is preferably ⁇ 0.8 or more, more preferably ⁇ 0.7 or more, still more preferably 0 or more, and 0. It is further more preferable that it is 3 or more, and it is especially preferable that it is 0.4 or more.
  • the upper limit of the hydrophobicity of REP is not particularly limited, and may be 1.0 or less, or 0.7 or less.
  • the hydrophobicity of REP is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n Motif -REP] m
  • Formula 2 [(A) n Motif -REP] m- (A) n in the fibroin containing the domain sequence represented by the n motif, most C-terminally (A)
  • Each amino acid of the region of all REPs contained in the sequence (a sequence corresponding to “region A” in FIG.
  • Naturally occurring fibroin is a protein comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n Motif-REP] m , or Formula 2: [(A) n Motif -REP] m- (A) n Motif Specifically, for example, fibroin produced by insects or spiders can be mentioned.
  • fibroin produced by insects include Bombyx mori (Bombyx mori), Quwaco (Bombyx mandarina), pemphigus (Antheraea yamamai), moth (Anteraea pernyi), moth (Eriogyna pyretorum), moth (Pilosamia Cynthia ricini) ), Silkworms produced by silkworms such as silkworms (Samia cynthia), cricketworms (Caligura japonica), tusser moths (Antheraea mylitta), and muga moths (Antheraea assama), hornets ejected by the larvae of the hornets (Vespa simillima xanthoptera) Silk protein is mentioned.
  • insect-produced fibroin include, for example, silkworm fibroin L chain (GenBank accession No. M76430 (base sequence), AAA27840.1 (amino acid sequence)).
  • the fibroins produced by the spiders include, for example, spiders belonging to the genus Araneus such as spider spiders, spider spiders, spider spiders, blue spider spiders, and spider spiders, spider spiders (genus Neoscona) such as spider spiders, spider spiders, spider spiders and spiders , Spiders belonging to the genus Pronus (Pronus), such as Torino Fundamas, spiders belonging to the genus Torino Fundama (Cyrtarachne) such as Torino Fundamas, and Otorino Fundames, such as spiders such as Togegumo and Tibusegumo Spiders belonging to the genus Gasteracantha, spiders belonging to the genus Ordgarius, such as the spiders belonging to the genus Gasteracantha and those belonging to the genus Ordgarius A spider belonging to the genus Angiope (Argiope), a spider belonging to the genus Angiope, a spider
  • fibroin produced by spiders include, for example, fibroin-3 (adf-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (base sequence)), fibroin- 4 (adf-4) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (base sequence)), dragline silk protein spidroin 1 (derived from Nephila clavipes) (genbank accession number AAC 04504 (amino acid sequence), U37520 (base sequence)), major angu11ate spidroin 1 [La rodectus hesperus] (GenBank Accession No.
  • ABR68856 amino acid sequence
  • EF 595246 base sequence
  • dragline silk protein spidroin 2 [from Nephila clavata] (GenBank Accession No. AAL 32472 (amino acid sequence), AF 44 1 245 (base sequence)), major anpullate spidroin 1 [from Euprosthenops australis] (GenBank accession numbers CAJ00428 (amino acid sequence), AJ 973 155 (base sequence)), and major ampullate spidroin 2 [Euprosthenops australis] (GenB nk accession number CAM 32249.1 (amino acid sequence), AM 490169 (base sequence)), minor ampullate silk protein 1 [Nephila clavipes] (GenBank accession number AAC 14589.
  • Naturally derived fibroin further include fibroin whose sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • spidroin, ampullate, fibroin, “silk and polypeptide”, or “silk and protein” are described as keywords among sequences including INV as DIVISION among sequence information registered in NCBI GenBank.
  • the sequence can be confirmed by extracting a specified product string from CDS, and a described sequence of a specific string from SOURCE to TISSUE TYPE.
  • the domain sequence thereof lacks one or more glutamine residues in the REP as compared to naturally occurring fibroin, and / or one or more glutamine in the REP.
  • the modification corresponding to substitution of the residue by another amino acid residue there is further modification of the amino acid sequence corresponding to substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues. It is also good.
  • Substitutions, deletions, insertions and / or additions of amino acid residues can be carried out by methods known to those skilled in the art such as partial directed mutagenesis. Specifically, Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982), Methods in Enzymology, 100, 448 (1983) and the like.
  • the modified fibroin according to the present embodiment is, for example, deleting one or more glutamine residues in the REP from the cloned naturally-occurring fibroin gene sequence, and / or one or more glutamine residues in the REP. Can be obtained by substitution of other amino acid residues. Also, for example, one or more glutamine residues in REP are deleted from the amino acid sequence of naturally-derived fibroin, and / or one or more glutamine residues in REP are replaced with another amino acid residue. Particularly, it can be obtained by designing a corresponding amino acid sequence and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • modified fibroin examples include (i) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 or Modified fibroin, or (ii) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22, comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 22
  • a modified fibroin can be mentioned, which comprises an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence shown by the number 22.
  • the amino acid sequence (M_PRT410) shown in SEQ ID NO: 1 is based on the nucleotide sequence and amino acid sequence of naturally occurring fibroin Nephila clavipes (GenBank accession number: P46804.1, GI: 1174415), and in (A) n motif
  • the amino acid is modified to improve the productivity, such as setting the number of alanine residues to 5 in succession.
  • M_PRT410 does not modify the glutamine residue (Q), so the glutamine residue content is similar to that of naturally occurring fibroin.
  • the amino acid sequence (M_PRT888) shown by SEQ ID NO: 2 is one in which all QQs in M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) are replaced with VL.
  • the amino acid sequence (M_PRT965) shown in SEQ ID NO: 3 is obtained by replacing all QQs in M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) with TS and replacing the remaining Q with A.
  • the amino acid sequence (M_PRT889) shown by SEQ ID NO: 4 is one in which all QQs in M_PRT 410 (SEQ ID NO: 1) are replaced with VL, and the remaining Q is replaced with I.
  • the amino acid sequence (M_PRT916) shown by SEQ ID NO: 5 is obtained by replacing all QQs in M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) with VI and replacing the remaining Q with L.
  • the amino acid sequence (M_PRT 918) shown in SEQ ID NO: 6 is obtained by replacing all QQs in M_PRT 410 (SEQ ID NO: 1) with VF and replacing the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence (M_PRT525) shown by SEQ ID NO: 15 inserts two alanine residues in the region (A5) in which alanine residues are continuous to M_PRT410 (SEQ ID NO: 1), and the molecular weight of M_PRT410 becomes almost the same.
  • two C-terminal domain sequences were deleted, and thirteen glutamine residues (Q) were substituted with serine residues (S) or proline residues (P).
  • the amino acid sequence (M_PRT699) shown by SEQ ID NO: 16 is one in which all QQs in M_PRT 525 (SEQ ID NO: 15) are replaced with VL.
  • the amino acid sequence (M_PRT698) shown by SEQ ID NO: 17 is one in which all QQs in M_PRT 525 (SEQ ID NO: 15) are replaced with VL, and the remaining Q is replaced with I.
  • the amino acid sequence (M_PRT 917) shown by SEQ ID NO: 21 is one in which all QQs in M_PRT 410 (SEQ ID NO: 1) are replaced with LI, and the remaining Q is replaced with V.
  • the amino acid sequence (M_PRT1028) shown by SEQ ID NO: 22 is obtained by replacing all QQs in M_PRT 410 (SEQ ID NO: 1) with IF and replacing the remaining Q with T.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 all have glutamine residue content It is 9% or less (Table 3).
  • the modified fibroin of (i) consists of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22 It may be one.
  • the modified fibroin of (ii) has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: % Or more of the amino acid sequence which has sequence identity.
  • the modified fibroin of (ii) also has a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n Motif -REP] m , or Formula 2: [(A) n Motif -REP] m- (A) n Motif It is a protein that contains.
  • the above sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (ii) preferably has a glutamine residue content of 9% or less.
  • the modified fibroin of (ii) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • modified fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus. This makes it possible to isolate, immobilize, detect, visualize, etc., the modified fibroin.
  • an affinity tag utilizing specific affinity (binding, affinity) with another molecule can be mentioned.
  • a histidine tag (His tag) can be mentioned as a specific example of an affinity tag.
  • the His tag is a short peptide consisting of 4 to 10 histidine residues, and has the property of binding specifically to metal ions such as nickel, so isolation of the modified fibroin by metalating metal chromatography It can be used to A specific example of the tag sequence is, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (amino acid sequence containing His tag).
  • tag sequences such as glutathione-S-transferase (GST) that specifically binds to glutathione and maltose binding protein (MBP) that specifically binds to maltose can also be used.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose binding protein
  • epitope tags utilizing antigen-antibody reactions can also be used.
  • a peptide (epitope) showing antigenicity as a tag sequence an antibody against the epitope can be bound.
  • the epitope tag include HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, FLAG tag and the like.
  • tag sequence can be separated by a specific protease
  • modified fibroin from which the tag sequence has been separated can also be recovered by subjecting the protein adsorbed via the tag sequence to a protease treatment.
  • modified fibroin containing a tag sequence More specific examples of the modified fibroin containing a tag sequence are (iii) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID A modified fibroin can be mentioned, which comprises an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence shown by No. 24.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 have SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (including His tag) ) Is added.
  • SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 each have a glutamine residue content of 9% or less (Table 4).
  • the modified fibroin of (iii) consists of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24 It may be one.
  • the modified fibroin of (iv) has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: % Or more of the amino acid sequence which has sequence identity.
  • the modified fibroin of (iv) also has a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif It is a protein that contains.
  • the above sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (iv) preferably has a glutamine residue content of 9% or less. Also, the modified fibroin of (iv) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • the above-described modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of host.
  • nucleic acid encodes the modified fibroin according to the present invention.
  • specific examples of the nucleic acid include modified fibroin comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22 Or a nucleic acid encoding a protein etc. in which the amino acid sequence (tag sequence) shown in SEQ ID NO: 7 is bound to either one or both of the N-terminus and C-terminus of these amino acid sequences.
  • the nucleic acid hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the nucleic acid encoding the modified fibroin according to the present invention, and under the conditions of Formula 1: [(A) n Motif-REP] m , or [(A) n Motif -REP] m- (A) A nucleic acid encoding a modified fibroin comprising a domain sequence represented by an n motif.
  • the modified fibroin encoded by the nucleic acid preferably has a glutamine residue content of 9% or less.
  • the modified fibroin encoded by the nucleic acid preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • “Stringent conditions” refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. “Stringent conditions” may be any of low stringency conditions, moderately stringent conditions and high stringency conditions. Low-stringent conditions mean that hybridization occurs only when at least 85% or more identity exists between the sequences, for example, at 5 ° C using 0.5xSDS at 42 ° C. Conditions for hybridization can be mentioned. Moderately stringent conditions mean that hybridization occurs only when at least 90% or more identity exists between the sequences, eg, at 50 ° C. using 5 ⁇ SSC containing 0.5% SDS. Conditions for hybridization can be mentioned. Highly stringent conditions mean that hybridization occurs only when at least 95% or more identity exists between the sequences, for example, at 60 ° C. using 5 ⁇ SSC containing 0.5% SDS. Conditions for hybridization can be mentioned.
  • the nucleic acid according to another embodiment has a sequence identity of 90% or more with the nucleic acid encoding the modified fibroin according to the present invention, and the formula 1: [(A) n motif-REP] m , or the formula 2: [(A) n Motif-REP]
  • This is a nucleic acid encoding a modified fibroin containing a domain sequence represented by m- (A) n motif.
  • the modified fibroin encoded by the nucleic acid preferably has a glutamine residue content of 9% or less.
  • the modified fibroin encoded by the nucleic acid preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • An expression vector according to the invention comprises a nucleic acid sequence according to the invention and one or more regulatory sequences operably linked to said nucleic acid sequence.
  • the regulatory sequence is a sequence that controls the expression of a recombinant protein in a host (for example, a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a transcription termination sequence, etc.), and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • the type of expression vector can be appropriately selected according to the type of host, such as a plasmid vector, a virus vector, a cosmid vector, a fosmid vector, an artificial chromosome vector and the like.
  • the host of the present invention is one transformed with the expression vector of the present invention.
  • any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells and plant cells can be suitably used.
  • a vector capable of autonomous replication in a host cell or capable of being integrated into the host chromosome and containing a promoter at a position at which the nucleic acid of the present invention can be transcribed is suitably used.
  • the expression vector of the present invention is capable of autonomous replication in prokaryote, and at the same time contains a promoter, a ribosome binding sequence, a nucleic acid of the present invention and a transcription termination sequence.
  • a promoter preferably a promoter, a ribosome binding sequence, a nucleic acid of the present invention and a transcription termination sequence.
  • it is a vector.
  • a gene that controls a promoter may be included.
  • prokaryote examples include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium and Pseudomonas.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli BL21 (Novagen), Escherichia coli BL21 (DE3) (Life Technologies), Escherichia coli BLR (DE3) (Merck Millipore), Escherichia coli DH1, Escherichia coli E. coli GI698, E. coli HB101, E. coli JM109, E. coli K5 (ATCC 23506), E. coli KY3276, E. coli MC 1000, E. coli MG1655 (ATCC 47076), E. coli No. 49, Escherichia coli Rosetta (DE3) (Novagen), E.
  • E. coli TB1 E. coli Tuner (Novagen), E. coli Tuner (DE3) (Novagen), E. coli W1485, E. coli W3110 (E. coli) ATCC 27325), Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, and the like.
  • Brevibacillus agri As microorganisms belonging to the genus Brevibacillus, for example, Brevibacillus agri, Brevibacillus bollsterensis, Brevibacillus centropolis Brevibacillus formosas, Brevibacillus imbocatus, Brevibacillus latyrosporus, Brevibacillus limnophilus, Brevibacillus parabrevis Brevibacillus reusseri, Brevibacillus samorvar, Brevibacillus brevis 47 (FERM BP-1223), Brevibacillus brevis 47K (FERM BP-2308), Brevibacillus brevis 47-5 (FERM BP-1664), Brevi Bacillus brevis 47-5Q (JCM8975), Brevibacillus choshinensis HPD 31 (FERM BP-1087), Brevibacil Choshinensis HPD31-S (FERM BP-6623), Brevibac
  • Serratia As a microorganism belonging to the genus Serratia, for example, Serratia liquefacience (ATC 14460), Serratia entomophila (Serratia entomophila), Serratia ficaria (Serratia ficaria), Serratia fonticola (Serratia fonticola), Serratia grimesi (Serratia grimesii), Serratia proteamaculans (Serratia proteamaculans), Serratia odorifera (Serratia odorifera), Serratia plymuthica, Serratia rubidaea etc. It is possible.
  • microorganism belonging to the genus Bacillus examples include, for example, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, and the like.
  • microorganism belonging to the genus Microbacterium examples include Microbacterium ammoniafilum ATCC 15354 and the like.
  • Brevibacterium divivalatam (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020, Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum ATCC 14067) ATCC 13826, ATCC 14067, Brevibacterium inmariofilum (Brevibacterium immariophilum) ATCC 14068, Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum ATCC 13869) ATCC 13665, ATCC 13869, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Brevibacterium saccharolyticum TCC14066, Brevibacterium Chiogenitarisu ATCC19240, Brevibacterium album ATCC15111, mention may be made of Brevibacterium Serinumu ATCC15112 and the like.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Corynebacterium include Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067, Corynebacterium acetoacidophilus Lam (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium alkanolitica cam ATCC 21511, Corynebacterium carnae ATCC 15991, Corynebacterium glutamicum Arm ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060, can be named Corynebacterium Lilium ATCC15990, Corynebacterium Merasekora ATCC 17965, Corynebacterium thermo amino monocytogenes AJ12340 (FERMBP-1539), Corynebacterium Hakyurisu ATCC13868 and the
  • microorganisms belonging to the genus Pseudomonas include, for example, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas brassicaerum, Pseudomonas fulva (Pseudomonas sp.) D-0110 etc. can be mentioned.
  • any method of introducing DNA into the host cell can be used.
  • a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-248394), or Gene, 17, 107 (1982) or Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979). It can be mentioned.
  • Transformation of a microorganism belonging to the genus Brevibacillus may be carried out, for example, by the method of Takahashi et al. (J. Bacteriol., 1983, 156: 1130-1134) or the method of Takagi et al. (Agric. Biol. Chem., 1989, 53: 3099 Or by the method of Okamoto et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem., 1997, 61: 202-203).
  • vectors into which the nucleic acid according to the present invention is introduced include pBTrp2, pBTac1 and pBTac2 (all commercially available from Boehringer Mannheim), pKK233-2 (manufactured by Pharmacia), pSE280 (pSE280). Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (QIAGEN), pKYP10 (JP-A-58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem. , 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem.
  • pGEL1 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)]
  • pBluescript II SK (-) manufactured by Stratagene
  • pTrs30 prepared from Escherichia coli JM109 / pTrS30 (FERM BP-5407)
  • pTrs 32 Escherichia coli JM109 / pTrS32 (FERM BP-5408)] Prepared from pGHA2 (prepared from Escherichia coli IGHA2 (FERM B-400), JP-A-60-221091), pGKA2 (prepared from Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-6798), JP-A-60-221091) [Publication], pTerm 2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSup x, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [
  • pUC18 When Escherichia coli is used as a host, pUC18, pBluescript II, pSupex, pET22b, pCold and the like can be mentioned as suitable vectors.
  • vectors suitable for microorganisms belonging to the genus Brevibacillus include pUB110, which is known as a Bacillus subtilis vector, or pHY500 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-31682), pNY700 (Japanese Patent Laid-open No. 4-278091), pHY4831 (J Bacteriol., 1987, 1239-1245), pNU200 (Akira Takashige, Journal of Japan Society for Agricultural Chemistry, 1987, 61: 669-676), pNU100 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 30: 75-80), pNU211 (J.
  • the promoter is not limited as long as it functions in the host cell.
  • promoters derived from E. coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter and the like can be mentioned.
  • a promoter (Ptrp ⁇ 2) in which two Ptrps are connected in series, a tac promoter, a lacT7 promoter, a promoter artificially designed and modified like a let I promoter, and the like can be used.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the nucleic acid according to the present invention, but it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Eukaryotic hosts can include, for example, yeast, filamentous fungi (such as mold) and insect cells.
  • yeast examples include, for example, the genus Saccharomyces, the genus Schizosaccharomyces, the genus Kluyveromyces, the genus Trichosporon, the genus Schwanniomyces, the genus Pichia and the genus Candida. And yeast belonging to the genus Jalowia and Hansenula.
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Schizosaccharomyces pombe Schizosaccharomyces pombe
  • Kleberomyces lactis Kleberomyces marxinium cerum Albius (Schwanniomyces alluvius)
  • Ciwaniomyces occidentalis Candida utilis (Candida utilis)
  • Pichia pastoris ichia pastoris
  • Pichia angusta Pichia
  • Pichia methanolica Pichia polymorpha
  • Pichia stipitis Yarrowia lipolytica (Yarrowia lipolytica), Etc.
  • Expression vectors for when yeast is used as a host cell are usually an origin of replication (if amplification in the host is required) and a selectable marker for propagation of the vector in E. coli, a promoter for recombinant protein expression in yeast and It is preferred to include a terminator as well as a selectable marker for the yeast.
  • the expression vector When the expression vector is a non-integrating vector, it preferably further contains an autonomously replicating sequence (ARS). This can improve the stability of the expression vector in cells (Myers, AM, et al. (1986) Gene 45: 299-310).
  • ARS autonomously replicating sequence
  • yeast When yeast is used as a host, for example, YEP13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419), YIp, pHS19, pHS15, pA0804, pHIL3Ol, pHIL-S1, pPIC9K, pPICZ ⁇ , pGAPZ ⁇ , pPICZ B Etc. can be mentioned.
  • the promoter is not limited as long as it can be expressed in yeast.
  • promoters of glycolytic genes such as hexose kinase, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, CUP 1 promoter, pGAP promoter, pGCW14 promoter, AOX1 promoter, MOX promoter and the like can be mentioned.
  • any method for introducing an expression vector into yeast any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast, for example, electroporation (Methods Enzymol., 194, 182 (1990)), spheroplast Method (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)), lithium acetate method (J. Bacteriol., 153, 163 (1983)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978), etc. may be mentioned.
  • filamentous fungi examples include, for example, Acremonium, Aspergillus, Ustilago, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Fusarium, Humicola, Penicillium (Penicillium), Myceliophtora, Myceliophtora, Botryts (Botryts), Magnaporthe (Magnaporthe), Mucor (Mucor), Metalithium (Metarhizium), Monascus (Monascus), Rhizopus And bacteria belonging to the genus Rhizome core.
  • filamentous fungi include Acremonium alabamense, Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus apulus, Aspergillus oryzae, Aspergillus sake, Aspergillus sojae (Aspergillus sojae), Aspergillus tubigensis, Aspergillus niger (Aspergil niger) us niger), Aspergillus nidulans, Aspergillus parasiticus, Aspergillus ficuum, Aspergillus ficuum, Aspergillus phenicus (Aspergillus phoeicus), Aspergillus , Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus (Aspergillus japonicus), Trichoderma vibe De (Trichoderma viride), Trichoderma harzianum, Trichoderma
  • penicillium chrysogenum P. n. (Penicillium canescens), Penicillium emersonii, Penicillium funiculosum, Penicillium gliceolozeum (Penillium canescens) illium griseoroseum), Penicillium perpurogenum, Penicillium roqueforti, Myceliophtraa thermofilm, Myceliophtaora thermophilum, Mucor ambiguus, Mucor ambiguus Mucor fragilis, Mucor hiemalis, Mucor inaequisporus, Mucor oblongiellipticus (Mucor oblongiellipti) us), Mucor racemosus, Mucor recurvus, Mucor saturninus, Mucor subtilissmus, Ogataea polymorpha, Funero cioce chrispo Lilium (Phanerochaete chrysosporium), Rhizomucor
  • the promoter in the case where the host is a filamentous fungus may be any of a gene for glycolysis, a gene for constitutive expression, an enzyme gene for hydrolysis, etc. Specifically, amyB, glaA, agdA, glaB, TEF1 , Xyn F1 tannase gene, no. 8AN, gpdA, pgkA, enoA, melO, sodM, catA, catB and the like.
  • the introduction of the expression vector into filamentous fungi can be carried out using a conventionally known method.
  • a conventionally known method for example, the method of Cohen et al. (Calcium chloride method) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972)], protoplast method [Mol. Gen. Genet. Chem., 168: 111 (1979)], the competent method [J. Mol. Biol. , 56: 209 (1971)], electroporation and the like.
  • the insect cells include, for example, lepidopteran insect cells, and more specifically, insect cells derived from Spodoptera frugiperda such as Sf9 and Sf21, and Trichoplusia ni such as High 5 And the like).
  • baculovirus Baculovirus Expression Vectors
  • Autographa californica nucleare polyhedrosis virus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus
  • Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus
  • the polypeptide can be expressed by the method described in Freeman and Company, New York (1992), Bio / Technology, 6, 47 (1988), etc. That is, after a recombinant gene transfer vector and a baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain a recombinant virus (expression vector) in insect cell culture supernatant, the insect virus is further infected with the recombinant virus, and the polypeptide Can be expressed.
  • gene transfer vectors used in the method include pVL1392, pVL1393 and pBlueBacIII (both manufactured by Invitrogen).
  • a method of co-introducing a recombinant gene transfer vector and a baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus for example, calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), lipofection method (Proc. Natl. Acad) Sci. USA, 84, 7413 (1987)) and the like.
  • the recombinant vector according to the present invention preferably further contains a selectable marker gene for transformant selection.
  • a selectable marker gene for transformant selection For example, in E. coli, resistance genes against various drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin and the like can be used as a selection marker gene. Recessive selection markers that can complement gene mutations involved in auxotrophy can also be used.
  • yeast a resistance gene for geneticin can be used as a selection marker gene, and genes that complement gene mutations involved in auxotrophy, selection markers such as LEU2, URA3, TRP1, HIS3, etc. can also be used.
  • filamentous fungi In filamentous fungi, niaD (Biosci. Biotechnol.
  • the host transformed with the expression vector of the present invention can be selected by plaque hybridization, colony hybridization and the like using a probe that selectively binds to the nucleic acid of the present invention.
  • a probe one obtained by modifying a partial DNA fragment amplified by the PCR method with radioisotope or digoxigenin based on the sequence information of the nucleic acid according to the present invention can be used.
  • modified fibroin can be produced by expressing the nucleic acid according to the present invention in a host transformed with the expression vector according to the present invention.
  • expression method in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression and the like can be performed according to the method described in Molecular and Cloning 2nd Edition.
  • modified fibroin when it is expressed by yeast, animal cells or insect cells, modified fibroin can be obtained as a sugar or glycosylated polypeptide.
  • a host transformed with the expression vector according to the present invention is cultured in a culture medium
  • the modified fibroin according to the present invention is produced and accumulated in the culture medium, and collected from the culture medium It can be manufactured by carrying out.
  • the method of culturing the host according to the present invention in a culture medium can be carried out according to a method usually used for culturing the host.
  • the host according to the present invention is a prokaryote such as E. coli or a eukaryote such as yeast, it contains, as a culture medium for the host according to the present invention, carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and the like that can be used by the host.
  • a culture medium for the host according to the present invention carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and the like that can be used by the host.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • Any carbon source may be used as long as the host can assimilate, for example, glucose, fructose, sucrose and molasses containing them, carbohydrates such as starch and starch hydrolysate, and organic acids such as acetic acid and propionic acid And alcohols such as ethanol and propanol.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonium, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate
  • other nitrogen-containing compounds such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • potassium phosphate, potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate and calcium carbonate can be used.
  • the culture of a prokaryote such as E. coli or a eukaryote such as yeast can be performed under aerobic conditions such as shake culture or submerged aeration culture, for example.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 40 ° C.
  • the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH of the culture medium during culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0. Adjustment of the pH of the culture medium can be carried out using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia and the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as needed during culture.
  • an inducer may be added to the medium as needed.
  • indole acrylic An acid or the like may be added to the medium.
  • TNM-FH medium manufactured by Pharmingen
  • Sf-900 II SFM medium manufactured by Life Technologies
  • ExCell 400 ExCell 405
  • ExCell 405 all manufactured by JRH Biosciences
  • Grace ' s Insect Medium Nature, 195, 788 (1962)
  • the culture of the insect cells can be carried out, for example, for 1 to 5 days under the conditions of pH 6 to 7 of culture medium, culture temperature of 25 to 30 ° C. and the like.
  • antibiotics such as gentamicin may be added to the culture medium as needed during culture.
  • the transformed plant cell When the host is a plant cell, the transformed plant cell may be cultured as it is, or may be differentiated into a plant organ and cultured.
  • a culture medium for culturing the plant cells generally used Murashige & Skoog (MS) culture medium, White (White) culture medium, or a culture medium etc. in which plant hormones such as auxin, cytokinin, etc. are added to these culture media is used. be able to.
  • Culturing of animal cells can be carried out, for example, for 3 to 60 days under the conditions of pH 5 to 9 of culture medium, culture temperature of 20 to 40.degree.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture, if necessary.
  • a method of producing modified fibroin using a host transformed with the expression vector according to the present invention there is provided a method of producing said modified fibroin in a host cell, a method of secreting outside of host cell, and host extracellular membrane. There is a way to make it Each of these methods can be selected by changing the structure of the host cell used and the modified fibroin to be produced.
  • the modified fibroin when the modified fibroin is produced in the host cell or on the host extracellular membrane, the method of Paulson et al. (J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)), the method of Rowe et al. (Proc. Natl. Acad.). Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)), or JP-A-5-33663, WO 94/23021 etc.
  • the modified fibroin can be altered to be actively secreted out of the host cell. That is, the modified fibroin can be actively secreted out of the host cell by expressing the polypeptide containing the active site of the modified fibroin in a form in which the signal peptide is added using a genetic recombination technique.
  • the modified fibroin produced by the host transformed with the expression vector according to the present invention can be isolated and purified by methods commonly used for isolation and purification of proteins. For example, when the modified fibroin is expressed in a dissolved state in cells, after completion of culture, host cells are recovered by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then sonicator, French press, Manton Gaulin The host cells are disrupted by a homogenizer, dynomill or the like to obtain a cell-free extract.
  • resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -s
  • the host cell when the modified fibroin forms an insoluble form in cells and is expressed, the host cell is similarly recovered and then disrupted and centrifuged to recover the insoluble form of the modified fibroin as a precipitate fraction.
  • the insoluble form of the modified fibroin recovered can be solubilized with a protein denaturant.
  • a purified preparation of the modified fibroin can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the modified fibroin or the derivative in which the sugar chain is added to the modified fibroin is secreted extracellularly
  • the modified fibroin or a derivative thereof can be recovered from the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation, and a purified preparation can be obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
  • the modified fibroin according to the present invention can be produced and purified as described above and then spun by methods commonly used for fibroin spinning. For example, by spinning a spinning solution (doping solution) in which the modified fibroin according to the present invention is dissolved in a solvent, a fiber formed of the modified fibroin according to the present invention can be obtained.
  • a spinning solution doping solution
  • a fiber formed of the modified fibroin according to the present invention can be obtained.
  • the spinning solution is prepared by adding a solvent to the modified fibroin and adjusting the viscosity to be spinnable.
  • the solvent may be one that can dissolve the modified fibroin.
  • a solvent for example, hexafluoroisopropanol (HFIP), hexafluoroacetone (HFA), dimethylsulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide (DMF), formic acid, urea, guanidine, sodium dodecyl sulfate (SDS), bromide
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • HFA hexafluoroacetone
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • bromide An aqueous solution containing lithium, calcium chloride, lithium thiocyanate and the like can be mentioned.
  • Inorganic salts may be added to the spinning solution as required.
  • the inorganic salt which consists of a Lewis acid and a Lewis base shown below, for example is mentioned.
  • the Lewis base for example, oxo acid ion (nitrate ion, perchlorate ion etc.), metal oxo acid ion (permanganate ion etc.), halide ion, thiocyanate ion, cyanate ion etc.
  • the Lewis acid include metal ions such as alkali metal ions and alkaline earth metal ions, polyatomic ions such as ammonium ions, and complex ions.
  • inorganic salts composed of Lewis acids and Lewis bases include lithium salts such as lithium chloride, lithium bromide, lithium iodide, lithium nitrate, lithium perchlorate, and lithium thiocyanate, calcium chloride, calcium bromide Calcium salts such as calcium iodide, calcium nitrate, calcium perchlorate, and calcium thiocyanate, iron salts such as iron chloride, iron bromide, iron iodide, iron nitrate, iron perchlorate, iron thiocyanate, etc.
  • lithium salts such as lithium chloride, lithium bromide, lithium iodide, lithium nitrate, lithium perchlorate, and lithium thiocyanate
  • calcium chloride calcium bromide
  • Calcium salts such as calcium iodide, calcium nitrate, calcium perchlorate, and calcium thiocyanate
  • iron salts such as iron chloride, iron bromide, iron iodide, iron nitrate, iron perchlorate
  • Aluminum salts such as aluminum chloride, aluminum bromide, aluminum iodide, aluminum nitrate, aluminum perchlorate, and aluminum thiocyanate, potassium chloride, potassium bromide, potassium iodide, potassium nitrate, potassium perchlorate, and potassium thiocyanate
  • potassium chloride, potassium bromide, potassium iodide, potassium nitrate, potassium perchlorate, and potassium thiocyanate Sodium chloride, sodium bromide, etc.
  • Sodium salts such as sodium boride, sodium nitrate, sodium perchlorate and sodium thiocyanate, zinc chlorides such as zinc chloride, zinc bromide, zinc iodide, zinc nitrate, zinc perchlorate and zinc thiocyanate, chloride
  • Magnesium salts such as magnesium bromide, magnesium iodide, magnesium iodide, magnesium nitrate, magnesium perchlorate and magnesium thiocyanate, barium chloride, barium bromide, barium iodide, barium nitrate, barium perchlorate, and barium thiocyanate
  • strontium salts such as strontium chloride, strontium bromide, strontium iodide, strontium nitrate, strontium perchlorate, and strontium thiocyanate.
  • the viscosity of the spinning solution may be appropriately set according to the spinning method, and can be, for example, 100 to 15,000 cP (centipoise) at 35 ° C.
  • the viscosity of the spinning solution can be measured, for example, using a trade name "EMS viscometer” manufactured by Kyoto Electronics Industry Co., Ltd.
  • the spinning method is not particularly limited as long as it can spin the modified fibroin according to the present invention, and examples thereof include dry spinning, melt spinning, wet spinning and the like. As a preferred spinning method, wet spinning can be mentioned.
  • a solvent in which the modified fibroin is dissolved is extruded from a spinneret (nozzle) into a coagulating liquid (coagulated liquid tank), and the modified fibroin is solidified in the coagulating liquid to obtain an undrawn yarn in the form of a yarn.
  • the coagulating solution may be any solution which can remove the solvent, and examples thereof include lower alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol and 2-propanol, and acetone. Water may be added to the coagulating solution as appropriate.
  • the temperature of the coagulating solution is preferably 0 to 30 ° C.
  • the extrusion speed is preferably 0.2 to 6.0 ml / hour, preferably 1.4 to 4.0 ml / hole. More preferably it is time.
  • the length of the coagulation bath may be, for example, 200 to 500 mm as long as desolvation can be efficiently performed.
  • the drawing speed of the undrawn yarn may be, for example, 1 to 20 m / min, preferably 1 to 3 m / min.
  • the residence time may be, for example, 0.01 to 3 minutes, preferably 0.05 to 0.15 minutes.
  • stretching pre-stretching
  • the coagulation liquid may be maintained at a low temperature to suppress the evaporation of lower alcohol and may be withdrawn in the form of undrawn yarn.
  • the coagulation liquid tank may be provided in multiple stages, and the stretching may be performed in each stage or a specific stage, as needed.
  • the undrawn yarn (or pre-drawn yarn) obtained by the above method can be made into a drawn yarn (fibroin fiber) through a drawing process.
  • a stretching method wet heat stretching, dry heat stretching and the like can be mentioned.
  • the wet heat drawing can be performed in steam heating in warm water, in a solution obtained by adding an organic solvent or the like to warm water.
  • the temperature may be, for example, 50 to 90 ° C., preferably 75 to 85 ° C.
  • the undrawn yarn (or pre-drawn yarn) can be drawn, for example, 1 to 10 times, preferably 2 to 8 times.
  • Dry heat drawing can be performed using an electric tube furnace, a dry heat plate or the like.
  • the temperature may be, for example, 140 ° C. to 270 ° C., preferably 160 ° C. to 230 ° C.
  • the undrawn yarn (or pre-drawn yarn) can be drawn, for example, 0.5 to 8 times, preferably 1 to 4 times.
  • the wet heat drawing and the dry heat drawing may be performed alone, or may be performed in multiple stages or in combination. That is, the first step drawing is performed by wet heat drawing, the second step drawing is performed by dry heat drawing, or the first step drawing is performed by wet heat drawing, the second step drawing is performed by wet heat drawing, and the third step drawing is further by dry heat drawing
  • the wet heat drawing and the dry heat drawing can be performed in combination as appropriate.
  • the final draw ratio in the drawing step is, for example, 5 to 20 times and preferably 6 to 11 times that of the undrawn yarn (or pre-drawn yarn).
  • the modified fibroin according to the present invention may be drawn into fibroin fibers and then chemically cross-linked between polypeptide molecules in fibroin fibers.
  • functional groups that can be crosslinked include amino groups, carboxyl groups, thiol groups and hydroxy groups.
  • the amino group of the lysine side chain contained in the polypeptide can be cross-linked at the amide bond by dehydration condensation with the carboxyl group of the glutamic acid or aspartic acid side chain.
  • the crosslinking may be carried out by performing a dehydration condensation reaction under vacuum heating, or may be carried out by a dehydration condensation agent such as carbodiimide.
  • Crosslinking between polypeptide molecules may be performed using a crosslinking agent such as carbodiimide or glutaraldehyde, or may be performed using an enzyme such as transglutaminase.
  • carbodiimides include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide And diisopropyl carbodiimide (DIC).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • DCC N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
  • DIC diisopropyl carbodiimide
  • EDC and DIC are preferable because they have high ability to form an amide bond between polypeptide molecules and are easily crosslinked.
  • crosslinking treatment it is preferable to apply a crosslinking agent to fibroin fibers and to crosslink by vacuum heating and drying.
  • the crosslinking agent may be applied to fibroin fibers by adding pure products to fibroin fibers or diluted to a concentration of 0.005 to 10% by mass with a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms and a buffer solution. Good.
  • the crosslinking treatment is preferably performed at a temperature of 20 to 45 ° C. for 3 to 42 hours.
  • the crosslinking treatment can impart higher stress (strength) to the fibroin fibers.
  • FIG. 2 is a view showing an example of a change in length of fibroin fiber due to contact with water or the like.
  • Fibroin fibers have the property of contracting (primary shrinkage) upon contact (wet) with water below the boiling point. After primary contraction, it contracts further upon drying (secondary contraction). After secondary contraction, when it comes in contact with water below the boiling point again, it expands to a length before secondary contraction, and when drying and wetting are repeated thereafter, the width is about the same as secondary contraction ("stretching ratio" in FIG. Repeat contraction and expansion ( Figure 2).
  • shrinkage be as low as possible, but particularly in products such as woven fabrics composed of fibroin fibers, it is preferable that this secondary shrinkage be small.
  • the secondary contraction can be evaluated using the secondary contraction rate determined by the following method as an index.
  • ⁇ Secondary contraction rate> A plurality of fibroin fibers having a length of about 30 cm are bundled to form a fiber bundle having a denier of 150 denier.
  • a 0.8 g lead weight is attached to this fiber bundle, and in this state, the fiber bundle is immersed in water at 40 ° C. for 10 minutes to be primarily shrunk, and the length of the fiber bundle is measured in water.
  • the primarily shrunk fiber bundle is removed from the water and dried at room temperature for 2 hours with 0.8 g lead weight attached. After drying, measure the length of the fiber bundle.
  • fibroin fibers from which fibroin of natural origin is spun generally have a secondary shrinkage of 11 to 20%
  • fibroin fibers from which the modified fibroin according to the present invention is spun reduce the secondary shrinkage to 8% or less be able to.
  • the film according to the present invention can be obtained by preparing a dope solution in which the modified fibroin according to the present invention is dissolved in a solvent, casting the dope on the substrate surface, and drying and / or removing the solvent. .
  • a solvent As a solvent, the same kind as the solvent exemplified for the spinning solution (doping solution) can be mentioned.
  • polar solvents such as formic acid, hexafluoro-2-propanol (HFIP), and dimethyl sulfoxide are preferable.
  • Inorganic salts may be added to the dope solution as required.
  • the inorganic salt the same kind as the inorganic salt exemplified in the spinning solution (doping solution) can be mentioned.
  • the viscosity of the dope solution is preferably 15 to 80 cP (centipoise), and more preferably 20 to 70 cP.
  • the concentration of the modified fibroin according to the present invention is preferably 3 to 50% by mass, more preferably 3.5 to 35% by mass, and 4.2 to 15. More preferably, it is 8% by mass.
  • It may be carried out by heating to 30 to 60 ° C. at the time of preparation of the dope solution. Shaking may be performed to promote dissolution.
  • the substrate may be a resin substrate, a glass substrate, a metal substrate or the like.
  • the base material is preferably a resin substrate from the viewpoint of easily peeling the film after cast molding.
  • the resin substrate may be, for example, a polyethylene terephthalate (PET) film, a fluorine resin film such as polytetrafluoroethylene, a polypropylene (PP) film, or a release film in which a silicone compound is immobilized on the surface of these films.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PP polypropylene
  • the base material is stable to HFIP, DMSO solvent, etc., the dope solution can be stably cast-formed, and the silicone compound is immobilized on the surface of the PET film or PET film from the viewpoint that the formed film can be easily peeled off. It is more preferable that it is a release film.
  • the dope solution is cast on the substrate surface, and a film thickness control means such as an applicator, a knife coater, a bar coater etc. is used to obtain a predetermined thickness (for example, drying and / or The wet film of 1 to 1000 ⁇ m in thickness after solvent is prepared.
  • a film thickness control means such as an applicator, a knife coater, a bar coater etc. is used to obtain a predetermined thickness (for example, drying and / or The wet film of 1 to 1000 ⁇ m in thickness after solvent is prepared.
  • Drying and / or desolvation can be carried out dry or wet.
  • Examples of the dry method include vacuum drying, hot air drying, air drying and the like.
  • Examples of the wet method include a method of immersing the cast film in a desolvated liquid (also referred to as a coagulating liquid) to release the solvent.
  • Examples of the solvent removal solution include water, alcohol solutions such as lower alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol and 2-propanol, and mixed solutions of water and alcohol.
  • the temperature of the desolvation liquid (coagulation liquid) is preferably 0 to 90.degree.
  • the unstretched film after drying and / or desolvation can be uniaxially stretched or biaxially stretched in water.
  • the biaxial stretching may be sequential stretching or simultaneous biaxial stretching. Two or more multistage stretching may be performed.
  • the stretching ratio is preferably 1.01 to 6 times, more preferably 1.05 to 4 times in both longitudinal and transverse directions. Within this range, stress-strain balance can be easily achieved.
  • the in-water stretching is preferably performed at a water temperature of 20 to 90.degree.
  • the stretched film is preferably heat-set at a dry heat of 50 to 200 ° C. for 5 to 600 seconds. This heat setting provides dimensional stability at normal temperature.
  • the uniaxially stretched film is a uniaxially oriented film
  • the biaxially stretched film is a biaxially oriented film.
  • the water resistance of the film can be evaluated by measuring the degree of moisture absorption under high humidity using the saturated salt method using a saturated aqueous solution of salts.
  • potassium sulfate potassium chloride, sodium chloride, sodium bromide, potassium carbonate, magnesium chloride and the like can be mentioned.
  • the water resistance of the film is set, for example, in a closed container such as a Falcon tube containing a saturated aqueous solution of potassium sulfate so that the film cut to an appropriate size is not dipped in the aqueous solution, for example, relative humidity 98% It can be evaluated by standing for 20 to 48 hours in air in equilibrium with high humidity such as, measuring the weight and moisture content of the film, and calculating the moisture content from the moisture content per weight .
  • the fibroin fiber formed from the modified fibroin according to the present invention is a fiber (long fiber, short fiber, multifilament, or product filament etc.) or yarn (spun yarn, twisted yarn, false twist yarn, processed yarn, mixed yarn, mixed yarn, etc. Etc.) can be applied to woven fabric, knitted fabric, braided fabric, non-woven fabric and the like. Also, it can be applied to high strength applications such as ropes, surgical sutures, flexible fasteners for electrical parts, and physiologically active materials for implantation (for example, artificial ligaments and aortic bands).
  • the modified fibroin according to the present invention can be applied to foams, granules (spheres or non-spheres, etc.), nanofibrils, gels (hydrogels, etc.), resins and their equivalents. It can manufacture according to the method as described in Unexamined-Japanese-Patent No. 2009-505668, the patent 5678283, the patent 4638735 grade
  • the artificially modified fibroin fiber according to the present embodiment contains the modified fibroin, which elongates when wet and shrinks when it is dried from the wet state ("secondary contraction" in FIG. 2). It corresponds to the following expansion and contraction.).
  • the modified fibroin in the artificially modified fibroin fiber according to the present embodiment is not limited to the modified fibroin having an amino acid sequence in which the content of glutamine residue is reduced, as long as it falls under the definition of the modified fibroin described above.
  • the modified fibroin may be modified silk (fibronectin) fibroin (modified from the amino acid sequence of a silk protein produced by silkworm), or modified amino acid sequence of a spider silk fibroin (produced by spiders). It may be modified).
  • modified spider silk fibroin is preferred.
  • a modified fibroin derived from the large nasogastric silkworm silk protein produced in the large vein of the spider, a domain sequence with a reduced content of glycine residues (A) a modified fibroin (a third modified fibroin) having a domain sequence with a reduced content of n motif, a content of a glycine residue, and (A) n Modified fibroin (fourth modified fibroin) having a domain sequence with reduced motif content, modified fibroin having a domain sequence including a region locally having a large hydrophobicity index (fifth modified fibroin), and glutamine residue A modified fibroin (a sixth modified fibroin) having a domain sequence with a reduced content of groups And the like.
  • the first modified fibroin includes a protein comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n Motif-REP] m .
  • the amino acid residue number of the (A) n motif is preferably an integer of 3 to 20, more preferably an integer of 4 to 20, still more preferably an integer of 8 to 20, and an integer of 10 to 20 Is still more preferred, the integer of 4 to 16 is even more preferred, the integer of 8 to 16 is particularly preferred, and the integer of 10 to 16 is most preferred.
  • the number of amino acid residues constituting the REP is preferably 10 to 200 residues, more preferably 10 to 150 residues, and 20 to 100 residues More preferably, it is 20 to 75 residues.
  • the total number of residues of glycine, serine and alanine residues contained in the amino acid sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m is an amino acid residue
  • the total number is preferably 40% or more, more preferably 60% or more, and still more preferably 70% or more.
  • the first modified fibroin comprises a unit of the amino acid sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and the amino acid sequence whose C-terminal sequence is represented by any one of SEQ ID NOs: 25 to 27 or It may be a polypeptide which is an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 25-27.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 is identical to the amino acid sequence consisting of 50 C-terminal amino acids of the amino acid sequence of ADF3 (GI: 1263287, NCBI), and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 is a sequence It is identical to the amino acid sequence obtained by removing 20 residues from the C-terminus of the amino acid sequence shown in No. 25 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 has 29 residues removed from the C terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. It is identical to the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence represented by (1-i) SEQ ID NO: 28 (recombinant spider silk protein ADF3 KaiLargeNRSH1) or (1-ii) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 Mention may be made of modified fibroins which comprise amino acid sequences with% or more sequence identity.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 28 is an amino acid sequence of ADF 1 obtained by adding an amino acid sequence (SEQ ID NO: 29) consisting of an initiation codon, His10 tag and HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site to the N terminus.
  • the 13th repeat region is about doubled and the translation is mutated to terminate at amino acid residue 1154.
  • the amino acid sequence at the C-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 is identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27.
  • the modified fibroin of (1-i) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 28.
  • the second modified fibroin has an amino acid sequence whose domain sequence has a reduced content of glycine residues as compared to naturally occurring fibroin.
  • the second modified fibroin can be said to have an amino acid sequence corresponding to the replacement of at least one glycine residue in REP with another amino acid residue as compared to naturally occurring fibroin .
  • GGX and GPGXX in REP (wherein G is a glycine residue, P is a proline residue, and X is an amino acid residue other than glycine) in the second modified fibroin in comparison with the naturally derived fibroin in its domain sequence In which at least one glycine residue in at least one or more motif sequences is substituted with another amino acid residue.
  • the percentage of the motif sequence in which the above-mentioned glycine residue is replaced with another amino acid residue may be 10% or more with respect to the entire motif sequence.
  • the second modified fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and from the above domain sequence to the most C-terminally located (A) n motif from the above domain sequence
  • the alanine residue number relative to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more It is more preferred that there be 100%, meaning that it consists only of alanine residues.
  • the second modified fibroin is preferably one in which the content of the amino acid sequence consisting of XGX is increased by replacing one glycine residue of the GGX motif with another amino acid residue.
  • the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence is preferably 30% or less, more preferably 20% or less, still more preferably 10% or less, and 6 % Or less is even more preferable, 4% or less is even more preferable, and 2% or less is particularly preferable.
  • the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence can be calculated by the same method as the calculation method of the content ratio (z / w) of the amino acid sequence consisting of XGX.
  • z / w is preferably 50.9% or more, more preferably 56.1% or more, still more preferably 58.7% or more, and 70% or more It is further more preferred that the ratio is 80% or more.
  • the upper limit of z / w is not particularly limited, and may be, for example, 95% or less.
  • the second modified fibroin can be obtained, for example, by replacing at least a part of the nucleotide sequence encoding a glycine residue from the cloned gene sequence of naturally occurring fibroin to encode another amino acid residue You can get it.
  • a glycine residue to be modified one glycine residue in the GGX motif and the GPGXX motif may be selected, or z / w may be substituted so as to be 50.9% or more.
  • it can be obtained by designing an amino acid sequence satisfying the above embodiment from the amino acid sequence of naturally derived fibroin, and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • one or more amino acid residues are further substituted or deleted.
  • the amino acid sequence may be modified corresponding to the insertion and / or addition.
  • the above other amino acid residue is not particularly limited as long as it is an amino acid residue other than glycine residue, but valine (V) residue, leucine (L) residue, isoleucine (I) residue, methionine ( M) Hydrophobic amino acid residues such as residue, proline (P) residue, phenylalanine (F) residue and tryptophan (W) residue, glutamine (Q) residue, asparagine (N) residue, serine (S ), Hydrophilic amino acid residues such as lysine (K) residue and glutamic acid (E) residue are preferable, and valine (V) residue, leucine (L) residue, isoleucine (I) residue, phenylalanine ( F) The residue and glutamine (Q) residue are more preferred, and glutamine (Q) residue is even more preferred.
  • SEQ ID NO: 30 (Met-PRT380), SEQ ID NO: 31 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 32 (Met-PRT525) or SEQ ID NO: 33 (Met) -PRT 799), or (2-ii) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33, Modified fibroin can be mentioned.
  • the modified fibroin of (2-i) will be described.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 30 is one in which all GGX in the REP of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 34 (Met-PRT313) corresponding to naturally occurring fibroin are replaced with GQX.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 31 is such that every two (A) n motifs are deleted from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 30 from the N terminal side toward the C terminal side, and further before the C terminal sequence. [(A) n Motif-REP] is inserted into.
  • amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 32 two alanine residues are inserted at the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 31, and a part of glutamine (Q) residues It is substituted with a serine (S) residue and a partial amino acid at the C-terminal side is deleted so as to be approximately the same as the molecular weight of SEQ ID NO: 31.
  • amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 33 a region of 20 domain sequences present in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 31 (provided that several amino acid residues at the C-terminal side of the region are substituted).
  • a predetermined hinge sequence and a His tag sequence are added to the C terminus of the sequence repeated four times.
  • the value of z / w in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 (corresponding to naturally occurring fibroin) is 46.8%.
  • the value of z / w in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 is 58.7%, respectively 70.1%, 66.1% and 70.0%.
  • the value of x / y in the Giza ratio (described later) 1: 1.8 to 11.3 of the amino acid sequences shown by SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33 is 15.0%, 15.0%, 93.4%, 92.7% and 89.8%, respectively.
  • the modified fibroin of (2-i) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33.
  • the modified fibroin of (2-ii) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33.
  • the modified fibroin of (2-ii) is also a protein comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n Motif-REP] m .
  • the above sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (2-ii) has a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33 and However, when X represents the total number of amino acid residues of the amino acid sequence consisting of amino acid residues other than glycine) as z, and the total number of amino acid residues of REP in the above domain sequence as w, z / w Is preferably 50.9% or more.
  • the second modified fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus. This makes it possible to isolate, immobilize, detect, visualize, etc., the modified fibroin.
  • an affinity tag utilizing specific affinity (binding, affinity) with another molecule can be mentioned.
  • a histidine tag (His tag) can be mentioned as a specific example of an affinity tag.
  • the His tag is a short peptide consisting of 4 to 10 histidine residues, and has the property of binding specifically to metal ions such as nickel, so isolation of the modified fibroin by metalating metal chromatography It can be used to Specific examples of the tag sequence include, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 (His tag sequence and amino acid sequence including hinge sequence).
  • tag sequences such as glutathione-S-transferase (GST) that specifically binds to glutathione and maltose binding protein (MBP) that specifically binds to maltose can also be used.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose binding protein
  • epitope tags utilizing antigen-antibody reactions can also be used.
  • a peptide (epitope) showing antigenicity as a tag sequence an antibody against the epitope can be bound.
  • the epitope tag include HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, FLAG tag and the like.
  • tag sequence can be separated by a specific protease
  • modified fibroin from which the tag sequence has been separated can also be recovered by subjecting the protein adsorbed via the tag sequence to a protease treatment.
  • modified fibroin containing the tag sequence (2-iii) SEQ ID NO: 36 (PRT 380), SEQ ID NO: 37 (PRT 410), SEQ ID NO: 38 (PRT 525) or SEQ ID NO: 39 (PRT 799)
  • modified fibroin comprising a sequence or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39 .
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 40 (PRT313), SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39 are respectively SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO 30, 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 (including His tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminus of the amino acid sequence shown.
  • the modified fibroin of (2-iii) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39.
  • the modified fibroin of (2-iv) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39.
  • the modified fibroin of (2-iv) is also a protein comprising a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the above sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (2-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39, and However, when X represents the total number of amino acid residues of the amino acid sequence consisting of amino acid residues other than glycine) as z, and the total number of amino acid residues of REP in the above domain sequence as w, z / w Is preferably 50.9% or more.
  • the second modified fibroin may comprise a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system outside the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the third modified fibroin has an amino acid sequence in which the content of the (A) n motif is reduced as compared to naturally occurring fibroin.
  • the domain sequence of the third modified fibroin can be said to have an amino acid sequence corresponding to deletion of at least one or more (A) n motifs as compared to naturally occurring fibroin.
  • the third modified fibroin may have an amino acid sequence corresponding to 10-40% of the (A) n motif deleted from naturally occurring fibroin.
  • the third modification fibroin its domain sequence, compared to the naturally occurring fibroin, at least from the N-terminal side toward the C-terminal one to three (A) n motif every one (A) n motif It may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of
  • the third modified fibroin has a deletion of two consecutive (A) n motifs whose domain sequences are at least N-terminal to C-terminal as compared to naturally occurring fibroin, and one (A The amino acid sequence may correspond to the fact that the deletion of the n motif is repeated in this order.
  • the third modified fibroin may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of (A) n motif every other two domain sequences from at least the N terminal side to the C terminal side .
  • the third modified fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and two adjacent [(A) n motifs from the N terminal side toward the C terminal side
  • the ratio (giza ratio) of the number of amino acid residues of the other REP is 1
  • the maximum value of the sum of the amino acid residue numbers of two adjacent [(A) n motif-REP] units, which are 1.8 to 11.3, is defined as x
  • the total amino acid residue number of the domain sequence is When y, it may have an amino acid sequence in which x / y is 20% or more, 30% or more, 40% or more, or 50% or more.
  • the alanine residue number relative to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more It is more preferred that there be 100%, meaning that it consists only of alanine residues.
  • x / y is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 65% or more, still more preferably 70% or more It is more preferably 75% or more, still more preferably 80% or more.
  • x / y is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 65% or more, still more preferably 70% or more It is more preferably 75% or more, still more preferably 80% or more.
  • the upper limit of x / y may be, for example, 100% or less.
  • x / y is preferably 89.6% or more, and in the case of a Giza ratio of 1: 1.8 to 3.4, x It is preferable that / y is 77.1% or more, and when the Giza ratio is 1: 1.9 to 8.4, x / y is preferably 75.9% or more, and the Giza ratio is 1 In the case of 1.9 to 4.1, x / y is preferably 64.2% or more.
  • x / y is 46.4% or more Is preferably 50% or more, more preferably 55% or more, still more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, and 80% or more. Being particularly preferred.
  • the upper limit of x / y is not particularly limited, and may be 100% or less.
  • the third modified fibroin deletes one or more of the sequences encoding the (A) n motif so that x / y is 64.2% or more from the cloned naturally-occurring fibroin gene sequence It can be obtained by Also, for example, from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, an amino acid sequence corresponding to deletion of one or more (A) n motifs so that x / y is 64.2% or more is designed and designed It can also be obtained by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the above amino acid sequence.
  • one or more amino acid residues are further substituted, deleted, inserted and / or added.
  • the amino acid sequence corresponding to the above may be modified.
  • SEQ ID NO: 41 (Met-PRT399), SEQ ID NO: 31 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 32 (Met-PRT525) or SEQ ID NO: 33 (Met)
  • the modified fibroin of (3-i) will be described.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41 is an alternate sequence from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 (Met-PRT313) corresponding to naturally occurring fibroin, from the N terminal side toward the C terminal side (A) n
  • the motif is deleted, and one [(A) n motif-REP] is inserted in front of the C-terminal sequence.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33 is as described in the second modified fibroin.
  • the value of x / y in the Giza ratio 1: 1.8 to 11.3 of the amino acid sequence (corresponding to naturally occurring fibroin) represented by SEQ ID NO: 34 is 15.0%.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 41 and the value of x / y in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 31 are both 93.4%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 32 is 92.7%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 33 is 89.8%.
  • the modified fibroin of (3-i) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33.
  • the modified fibroin of (3-ii) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33.
  • the modified fibroin of (3-ii) is also a protein comprising a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the above sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (3-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33, and N-terminal to C-terminal Sequentially comparing the number of amino acid residues of REP of two [(A) n motif-REP] units adjacent to each other, and assuming that the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is 1, Amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units in which the ratio of the number of amino acid residues of REP is 1.8 to 11.3 (the Giza ratio is 1: 1.8 to 11.3) It is preferable that x / y be 64.2% or more, where x is the maximum value of the sum total of the number of bases and x is the total number of amino acid residues in the domain sequence.
  • the third modified fibroin may contain the above-described tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus.
  • modified fibroin containing a tag sequence As a more specific example of the modified fibroin containing a tag sequence, (3-iii) SEQ ID NO: 42 (PRT 399), SEQ ID NO: 37 (PRT 410), SEQ ID NO: 38 (PRT 525) or SEQ ID NO: 39 (PRT 799)
  • modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the sequence or (3-iv) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39 .
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39 have SEQ ID NO: 35 at the N terminus of the amino acid sequences shown by SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33 respectively.
  • the amino acid sequence (including His tag sequence and hinge sequence) is added.
  • the modified fibroin of (3-iii) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39.
  • the modified fibroin of (3-iv) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39.
  • the modified fibroin of (3-iv) is also a protein comprising a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the above sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (3-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39, and N-terminal to C-terminal Sequentially comparing the number of amino acid residues of REP of two [(A) n motif-REP] units adjacent to each other, and assuming that the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is 1, The maximum value of the sum of the amino acid residue numbers of two adjacent [(A) n motif-REP] units in which the ratio of the amino acid residue number of REP is 1.8 to 11.3 is x.
  • x / y is 64.2% or more, where y is the total number of amino acid residues in the domain sequence.
  • the third modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the fourth modified fibroin has an amino acid sequence in which the content of the glycine residue is reduced in addition to the content of the (A) n motif being reduced as compared to the naturally derived fibroin of the domain sequence. It is possessed.
  • the domain sequence of the fourth modified fibroin has at least one or more glycine residues in the REP in addition to the deletion of at least one or more (A) n motifs as compared to naturally occurring fibroin It can be said to have an amino acid sequence corresponding to substitution with another amino acid residue. That is, the fourth modified fibroin is a modified fibroin having the characteristics of the second modified fibroin described above and the third modified fibroin. Specific embodiments and the like are as described in the second modified fibroin and the third modified fibroin.
  • modified fibroin As a more specific example of the fourth modified fibroin, (4-i) SEQ ID NO: 31 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 32 (Met-PRT525), SEQ ID NO: 33 (Met-PRT799), SEQ ID NO: 37 (PRT410) Or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 (PRT 525) or SEQ ID NO: 39 (PRT 799), or (4-ii) SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39
  • modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in Specific embodiments of the modified fibroin comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39 are as described above.
  • the fifth modified fibroin is that its domain sequence has one or more amino acid residues in REP replaced with an amino acid residue having a large hydrophobicity index, as compared to naturally occurring fibroin, and / or REP It may have an amino acid sequence including a region having a locally large hydrophobicity index corresponding to insertion of one or more hydrophobicity index large amino acid residues therein.
  • the region locally having a large hydrophobicity index is preferably composed of 2 to 4 consecutive amino acid residues.
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index mentioned above is an amino acid selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A) It is more preferable that it is a residue.
  • one or more amino acid residues in the REP are replaced with an amino acid residue having a large hydrophobicity index, as compared with naturally occurring fibroin, and / or one or more in the REP.
  • substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues as compared with naturally occurring fibroin There may be amino acid sequence modifications corresponding to those described above.
  • the fifth modified fibroin is, for example, a hydrophobic amino acid residue remaining in one or more hydrophilic amino acid residues (for example, an amino acid residue having a negative hydrophobicity index) in REP from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence. It can be obtained by substituting a group (for example, an amino acid residue whose hydrophobicity index is plus) and / or inserting one or more hydrophobic amino acid residues into the REP. Also, for example, from the amino acid sequence of naturally-derived fibroin, one or more hydrophilic amino acid residues in REP are substituted with hydrophobic amino acid residues, and / or one or more hydrophobic amino acid residues in REP.
  • an amino acid sequence corresponding to the insertion of X can also be obtained by designing an amino acid sequence corresponding to the insertion of X, and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • one or more hydrophilic amino acid residues in the REP are substituted with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally derived fibroin, and / or one or more hydrophobic amino acids in the REP
  • the amino acid sequence corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be further modified.
  • the fifth modified fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and from the (A) n motif located most at the C-terminal end to the C-terminus of the domain sequence
  • Let p be the total number of amino acid residues contained in a region in which the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more in all REPs contained in the sequence excluding the above sequence from the above domain sequence,
  • p / q is 6
  • hydrophobicity index of amino acid residues
  • known indices Hydropathy index: Kyte J, & Doolittle R (1982) “A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”, J. Mol. Biol., 157, pp. Use 105-132).
  • the hydrophobicity index (hydropathy index, hereinafter also referred to as "HI" of each amino acid is as shown in Table 1 above.
  • sequence A [(A) n motif-REP] m to the sequence from the (A) n motif located closest to the C terminal to the C terminus of the domain sequence (Hereinafter, referred to as "sequence A") is used.
  • sequence A the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is calculated. The average value of the hydrophobicity index is determined by dividing the sum of HI of each amino acid residue contained in 4 consecutive amino acid residues by 4 (the number of amino acid residues).
  • the average value of the hydrophobicity index is determined for all four consecutive amino acid residues (each amino acid residue is used to calculate an average of 1 to 4 times). Next, a region in which the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more is identified. Even if a certain amino acid residue corresponds to "a series of 4 amino acid residues in which the average value of the hydrophobicity index is 2.6 or more", the region is included as one amino acid residue become. And, the total number of amino acid residues contained in the region is p. In addition, the total number of amino acid residues contained in the sequence A is q.
  • the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2
  • p / q is preferably 6.2% or more, more preferably 7% or more, still more preferably 10% or more, and preferably 20% or more. Still more preferably, it is 30% or more.
  • the upper limit of p / q is not particularly limited, and may be, for example, 45% or less.
  • the fifth modified fibroin is, for example, one or more hydrophilic amino acid residues (for example, a hydrophobicity index) in the REP such that the amino acid sequence of the cloned naturally-derived fibroin satisfies the above p / q condition.
  • a hydrophobic amino acid residue eg, an amino acid residue with a positive hydrophobicity index
  • insertion of one or more hydrophobic amino acid residues into the REP By doing this, it can be obtained by locally modifying the amino acid sequence including the region having a large hydrophobicity index.
  • one or more amino acid residues in the REP are replaced with an amino acid residue having a large hydrophobicity index, and / or one or more amino acids in the REP as compared to naturally occurring fibroin, and / or
  • modification corresponding to substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be performed. .
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index is not particularly limited, and isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A) are preferred, and valine (V), leucine (L) and isoleucine (I) are more preferred.
  • the fifth modified fibroin (5-i) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43 (Met-PRT720), SEQ ID NO: 44 (Met-PRT665) or SEQ ID NO: 45 (Met-PRT666), Or (5-ii) a modified fibroin comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45.
  • the modified fibroin of (5-i) will be described.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 43 consists of three amino acid residues for every REP, except for the domain sequence at the C-terminal end of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 31 (Met-PRT410)
  • the amino acid sequence (VLI) is inserted in two places, and a part of glutamine (Q) residues is replaced with a serine (S) residue and a part of amino acids at the C-terminal side is deleted.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 44 is one obtained by inserting an amino acid sequence (VLI) consisting of three amino acid residues each in place of REP with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 42 (Met-PRT525). is there.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 45 is obtained by inserting two amino acid sequences (VLI) consisting of three amino acid residues each in place of REP with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 32.
  • the modified fibroin of (5-i) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45.
  • the modified fibroin of (5-ii) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45.
  • the modified fibroin of (5-ii) is also a protein comprising a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the above sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (5-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45, and is most C-terminally located (A) n Amino acids included in a region in which the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more in all REPs included in the sequence excluding the sequence from the motif to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence Assuming that the total number of residues is p, and the total number of amino acid residues contained in the sequence obtained by removing the sequence from the (A) n motif located closest to the C terminal to the C terminus of the domain sequence from the domain sequence is q. And p / q is preferably 6.2% or more.
  • the fifth modified fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus.
  • modified fibroin containing the tag sequence are (5-iii) SEQ ID NO: 46 (PRT720), SEQ ID NO: 47 (PRT665) or SEQ ID NO: 48 (PRT666), or (5-iv) A modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 or SEQ ID NO: 48).
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48 are the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 35 (His tag) at the N terminus of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45, respectively. (Including sequence and hinge sequence).
  • the modified fibroin of (5-iii) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 or SEQ ID NO: 48.
  • the modified fibroin of (5-iv) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 or SEQ ID NO: 48.
  • the modified fibroin of (5-iv) is also a protein comprising a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the above sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (5-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 or SEQ ID NO: 48, and is most C-terminally located (A) n Amino acids included in a region in which the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more in all REPs included in the sequence excluding the sequence from the motif to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence Assuming that the total number of residues is p, and the total number of amino acid residues contained in the sequence obtained by removing the sequence from the (A) n motif located closest to the C terminal to the C terminus of the domain sequence from the domain sequence is q. And p / q is preferably 6.2% or more.
  • the fifth modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the sixth modified fibroin has an amino acid sequence with a reduced content of glutamine residues as compared to naturally occurring fibroin.
  • Preferred embodiments of the sixth modified fibroin are as described above.
  • the degree of elongation and contraction is the same (the recovery rate is 100%) at the time of dimensional change (elongation and contraction) due to contact with water and subsequent drying.
  • the artificially modified fibroin fiber according to the present embodiment can be obtained by a manufacturing method including a shrinking step of shrinking the raw fiber into which the modified fibroin is spun with water.
  • the shrinking step may include, for example, a step (contacting step) of causing the raw material fiber (the raw material fiber after spinning and before being in contact with water) to be brought into contact with water and irreversibly shrink.
  • the shrinking step may comprise a step of drying and further shrinking the fiber (drying step) after the contacting step.
  • the raw material fiber can be manufactured using a known spinning method. Specifically, for example, it can be manufactured according to the above-described spinning method of fibroin fiber.
  • FIG. 3 is an explanatory view schematically showing an example of a spinning device for producing a raw material fiber.
  • the spinning device 10 shown in FIG. 3 is an example of a spinning device for dry-wet spinning, and includes an extrusion device 1, an undrawn yarn production device 2, a wet heat drawing device 3, and a drying device 4.
  • the dope solution 6 stored in the storage tank 7 is pushed out of the base 9 by the gear pump 8.
  • the dope solution may be filled into a cylinder and pushed out of the nozzle using a syringe pump.
  • the extruded dope solution 6 is supplied through the air gap 19 into the coagulating solution 11 of the coagulating solution tank 20 to remove the solvent and coagulate the modified fibroin to form a fibrous coagulated body.
  • the fibrous coagulated body is supplied into the warm water 12 in the draw bath 21 and drawn.
  • the draw ratio is determined by the speed ratio between the feed nip roller 13 and the take-up nip roller 14.
  • the stretched fibrous coagulated body is supplied to the drying device 4 and dried in the yarn path 22 to obtain a raw fiber as the wound body 5.
  • 18a-18g are yarn guides.
  • the coagulating solution 11 may be any solvent that can remove the solvent, and examples thereof include lower alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol and 2-propanol, and acetone.
  • the coagulation liquid 11 may contain water as appropriate.
  • the temperature of the coagulating solution 11 is preferably 0 to 30 ° C.
  • the extrusion speed is preferably 0.2 to 6.0 ml / hour, preferably 1.4 to 4.0 ml / hole. More preferably it is time.
  • the distance the coagulated protein passes in the coagulation liquid 11 may be any length that enables efficient solvent removal, for example, 200 to 500 mm It is.
  • the drawing speed of the undrawn yarn may be, for example, 1 to 20 m / min, preferably 1 to 3 m / min.
  • the residence time in the coagulating liquid 11 may be, for example, 0.01 to 3 minutes, preferably 0.05 to 0.15 minutes.
  • stretching pre-stretching
  • the coagulating liquid tank 20 may be provided in multiple stages, and the stretching may be performed in each stage or a specific stage as needed.
  • dry heat stretching is also employed in addition to the above-described pre-stretching performed in the coagulating liquid tank 20 and the wet heat stretching performed in the stretching bath 21.
  • Wet heat stretching can be performed in warm water, in a solution obtained by adding an organic solvent or the like to warm water, or in steam heating.
  • the temperature may be, for example, 50 to 90 ° C., preferably 75 to 85 ° C.
  • the undrawn yarn (or pre-drawn yarn) can be drawn, for example, 1 to 10 times, preferably 2 to 8 times.
  • Dry heat drawing can be performed using an electric tube furnace, a dry heat plate or the like.
  • the temperature may be, for example, 140 ° C. to 270 ° C., preferably 160 ° C. to 230 ° C.
  • the undrawn yarn (or pre-drawn yarn) can be drawn, for example, 0.5 to 8 times, preferably 1 to 4 times.
  • the wet heat drawing and the dry heat drawing may be performed alone, or may be performed in multiple stages or in combination. That is, the first step drawing is performed by wet heat drawing, the second step drawing is performed by dry heat drawing, or the first step drawing is performed by wet heat drawing, the second step drawing is performed by wet heat drawing, and the third step drawing is further by dry heat drawing
  • the wet heat drawing and the dry heat drawing can be performed in combination as appropriate.
  • the lower limit of the final draw ratio is preferably more than 1 time, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times that of the undrawn yarn (or pre-drawn yarn).
  • the upper limit is preferably 40 times or less, 30 times or less, 20 times or less, 15 times or less, 14 times or less, 13 times or less, and is at least 7 times, at least 8 times, at least 9 times. , 12 times or less, 11 times or less, 10 times or less.
  • the raw material fiber (fiber containing modified fibroin) has the property of shrinking upon contact (wet) with water (length change indicated by “primary shrinkage” in FIG. 2). After primary contraction, it contracts further when dried (the length change indicated by “secondary contraction” in FIG. 2). After secondary contraction, when it is brought into contact with water again, it extends to the same length as or similar to that before secondary contraction, and when drying and wetting are repeated thereafter, the same width as secondary contraction (in FIG. Repeat contraction and expansion at the width shown in “stretching ratio”. Therefore, the artificial modified fibroin fiber according to the present embodiment can be obtained by the manufacturing method including the contraction step including at least the contact step.
  • Irreversible contraction ("primary contraction" in FIG. 2) of the raw material fiber (fiber containing modified fibroin) in the contacting step is considered to occur, for example, for the following reasons. That is, one reason is considered to be due to the secondary structure or tertiary structure of the raw material fiber (fiber containing modified fibroin), and another reason is that it has residual stress due to, for example, stretching in the manufacturing process In the raw material fiber (fiber containing modified fibroin), it is considered that the infiltration of water into or between fibers results in the relaxation of the residual stress.
  • the shrinkage rate of the raw material fiber (fiber containing modified fibroin) in the shrinking step is optionally controlled, for example, according to the size of the draw ratio in the manufacturing process of the raw material fiber (fiber containing modified fibroin) described above. It is considered possible to
  • the raw fiber before contacting with water is brought into contact with water to make the raw fiber wet.
  • the wet state means that at least a part of the raw fiber is wet with water.
  • the temperature of the water brought into contact with the raw fibers in the contacting step may be below the boiling point.
  • the lower limit value of the temperature of water is preferably 10 ° C. or more, more preferably 40 ° C. or more, and still more preferably 70 ° C. or more .
  • the upper limit of the temperature of water is preferably 90 ° C. or less.
  • the method of contacting water with the raw fiber is not particularly limited.
  • a method of immersing the raw material fiber in water for example, a method of immersing the raw material fiber in water, a method of spraying water on the raw material fiber at normal temperature or in a heated steam state, and a high humidity environment where the raw material fiber is full of water vapor Methods of exposure etc. may be mentioned.
  • a method of immersing the raw material fiber in water is preferable since shortening of the contraction time can be effectively achieved and simplification of processing equipment can be realized.
  • the contacting step when the raw fiber is brought into contact with water in a relaxed state, the raw fiber may be not only shrunk but also crimped in a wavelike manner.
  • the contact step may be performed in a state where the raw material fiber is not loosened, such as contacting the raw material fiber with water while stretching (stretching) in the fiber axial direction.
  • the method for producing artificially modified fibroin fiber according to the present embodiment may further include a drying step.
  • the drying step is a step of drying and further shrinking the raw material fiber (or the artificially modified fibroin fiber obtained through the contacting step) which has been subjected to the contacting step (corresponding to "secondary shrinkage" in FIG. 2). Drying may be, for example, natural drying or forced drying using a drying facility.
  • the drying equipment any known drying equipment of contact type or non-contact type can be used.
  • the drying temperature is not particularly limited as long as it is a temperature lower than the temperature at which the protein contained in the raw material fiber is decomposed or the raw material fiber is thermally damaged, for example.
  • the temperature is in the range of 150 ° C., and the temperature is in the range of 50 ° C. to 100 ° C.
  • the drying time is appropriately set according to the drying temperature and the like, and for example, a time in which the influence of the overdrying on the quality and physical properties of the artificially modified fibroin fiber can be eliminated as much as possible.
  • the artificially modified fibroin fiber according to the present embodiment is obtained by, for example, the above-described manufacturing method, and thus is substantially free of the residual stress generated by stretching in the spinning process.
  • the artificially modified fibroin fiber according to the present embodiment may have a restitution rate of 95% or more as defined by the following formula (1).
  • Recovery rate (length of artificially modified fibroin fiber when dried from wet state / length of artificially modified fibroin fiber before being moistened) ⁇ 100 (%)
  • the artificially modified fibroin fiber according to this embodiment preferably has a restitution ratio of 96% or more, more preferably 97% or more, and still more preferably 98% or more, as defined by the formula (1). And 99% or more.
  • the man-made modified fibroin fiber according to the present embodiment may have an elongation rate of 17% or less as defined by the following formula (4).
  • the elongation rate defined by the equation (4) is an indicator of the elongation characteristics when the artificial modified fibroin fiber is in a wet state.
  • Formula (4): Elongation rate ⁇ (length of artificially modified fibroin fiber in wet state / length of artificially modified fibroin fiber before wet state) -1 ⁇ ⁇ 100 (%)
  • the upper limit of the elongation rate defined by the formula (4) is, for example, 15% or less, 13% or less, 10% or less or 5% or less, and the lower limit is more than 0%, 1% or more, 2% or more 5% or more, 10% or more, or 13% or more is exemplified.
  • the elongation rate defined by the formula (4) may be, for example, more than 0% and 17% or less, may be more than 0% and 15% or less, and may be 2% or more and 15% or less. , 5% and 15% or less, 5% and 13% or less, 5% and 10% or less, and more than 0% and 10% or less Also, it may be more than 0% and 5% or less.
  • the shrinkage factor C defined by the following formula (5) may be 17% or less.
  • the shrinkage factor C defined by the equation (5) is an index of the shrinkage characteristics when the engineered modified fibroin fiber is dried from the wet state.
  • Formula (5): Shrinkage factor C ⁇ 1- (length of artificially modified fibroin fiber when dried from wet state / length of artificially modified fibroin fiber when wet state) ⁇ ⁇ 100 (%)
  • the upper limit of the contraction rate C defined by the formula (5) is, for example, 15% or less, 13% or less, 10% or less or 5% or less, and the lower limit is more than 0%, 1% or more, 2% or more 5% or more, 10% or more, or 13% or more.
  • the shrinkage factor C defined by the equation (5) may be, for example, more than 0% and 17% or less, may be more than 0% and 15% or less, and may be 2% or more and 15% or less It may be 5% or more and 15% or less, may be 5% or more and 13% or less, may be 5% or more and 10% or less, or more than 0% and 10% or less It may be more than 0% and 5% or less.
  • the artificially modified fibroin fiber according to the present embodiment is a fiber having a contraction history irreversibly contracted by contact with water after spinning, and the contraction ratio A defined by the following formula (2) is 2% or more Is preferred.
  • the shrinkage factor A defined by the equation (2) is an index indicating the characteristics of the primary shrinkage (see FIG. 2) of the raw material fiber. When the contraction rate A defined by the equation (2) is 2% or more, the recovery rate defined by the equation (1) becomes higher.
  • Shrinkage factor A ⁇ 1- (length of fiber irreversibly shrunk by contact with water after spinning / length of fiber before spinning and contact with water) ⁇ ⁇ 100 %)
  • the shrinkage ratio A defined by the equation (2) is 2.5% or more, 3% or more, 3.5% or more, 4% or more, 4.5% or more, 5% or more, 5.5% or more, 6 %, 10% or more, 15% or more, 20% or more, or 25% or more.
  • the upper limit of the contraction rate A defined by the formula (2) is not particularly limited, but 80% or less, 60% or less, 40% or less, 20% or less, 10% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less , 4% or less, or 3% or less.
  • the artificially modified fibroin fiber according to the present embodiment is a fiber having a contraction history further contracted by drying after being irreversibly contracted by contact with water after spinning, and is defined by the following formula (3)
  • the shrinkage factor B is preferably more than 7%.
  • the shrinkage factor B defined by the equation (3) is an index indicating the characteristics of the primary shrinkage and the secondary shrinkage (see FIG. 2) of the raw material fiber.
  • the contraction rate B defined by the equation (3) is more than 7%, the recovery rate defined by the equation (1) becomes higher.
  • Shrinkage factor B ⁇ 1- (the length of the fiber shrunk irreversibly by contact with water after spinning, and then the length of the fiber further shrunk by drying / the fiber before contacting with water after spinning Length) ⁇ ⁇ 100 (%)
  • the shrinkage factor B defined by the equation (3) is 10% or more, 15% or more, 25% or more, 32% or more, 40% or more, 48% or more, 56% or more, 64% or more, or 72% or more You may Although the upper limit of the contraction rate B defined by Formula (3) is not specifically limited, Usually, it is 80% or less.
  • Test Example 1 [(1) Synthesis of nucleic acid encoding modified fibroin, and construction of expression vector] A fibroin having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 to 14 and SEQ ID NO: 18 to 20 based on the nucleotide sequence and amino acid sequence of Nephila clavipes (GenBank accession number: P46804.1, GI: 1174415) which is a naturally derived fibroin And modified fibroin.
  • the amino acid sequence (PRT410: Test Example 1-1) shown in SEQ ID NO: 8 has the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 7 at the N-terminus of the amino acid sequence (M_PRT410) shown in SEQ ID NO: 1 It is added.
  • M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) is based on the base sequence and amino acid sequence of naturally occurring fibroin Nephila clavipes (GenBank accession number: P46804.1, GI: 1174415), and the alanine residue in the (A) n motif is The amino acid is modified to improve productivity, such as setting the number of consecutive alanine residues to 5 in the continuous amino acid sequence.
  • M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) has not been modified with glutamine residue (Q), the glutamine residue content is about the same as that of naturally occurring fibroin.
  • the amino acid sequence (PRT 888: Test Example 1-2) shown in SEQ ID NO: 9 has the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 7 at the N-terminus of the amino acid sequence (M_PRT 888) shown in SEQ ID NO. It is added.
  • M_PRT 888 (SEQ ID NO: 2) is one in which all QQs in M_PRT 410 (SEQ ID NO: 1) are replaced with VL.
  • the amino acid sequence (PRT 965: Test Example 1-3) shown in SEQ ID NO: 10 has the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 7 at the N terminus of the amino acid sequence (M_PRT 965) shown in SEQ ID NO. It is added.
  • M_PRT 965 (SEQ ID NO: 3) is one in which all QQs in M_PRT 410 (SEQ ID NO: 1) are replaced with TS, and the remaining Q is replaced by A.
  • the amino acid sequence (PRT 889: Test Example 1-4) shown in SEQ ID NO: 11 has the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 7 at the N terminus of the amino acid sequence (M_PRT 889) shown in SEQ ID NO. It is added.
  • M_PRT 889 (SEQ ID NO: 4) is obtained by replacing all QQs in M_PRT 410 (SEQ ID NO: 1) with VL and replacing the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence (PRT916: Test Example 1-5) shown in SEQ ID NO: 12 has the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 7 at the N-terminus of the amino acid sequence (M_PRT916) shown in SEQ ID NO: 5 It is added.
  • M_PRT 916 (SEQ ID NO: 5) is obtained by replacing all QQs in M_PRT 410 (SEQ ID NO: 1) with VI and replacing the remaining Q with L.
  • the amino acid sequence (PRT 918: Test Example 1-6) shown in SEQ ID NO: 13 has the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 7 at the N terminus of the amino acid sequence (M_PRT 918) shown in SEQ ID NO. It is added.
  • M_PRT 918 (SEQ ID NO: 6) is obtained by replacing all QQs in M_PRT 410 (SEQ ID NO: 1) with VF and replacing the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence (PRT720: Test Example 1-7) shown in SEQ ID NO: 14 has two amino acid sequences (VLI) consisting of three amino acid residues inserted in every other REP with PRT 410 (SEQ ID NO: 8). And a portion of the amino acid at the N-terminal side is deleted so as to have approximately the same molecular weight as PRT410 (SEQ ID NO: 8).
  • the amino acid sequence (PRT525: Test Example 1-8) shown in SEQ ID NO: 18 has the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 7 at the N-terminus of the amino acid sequence (M_PRT525) shown in SEQ ID NO: 15 It is added.
  • M_PRT 525 (SEQ ID NO: 15) has a C-terminal such that two alanine residues are inserted in a region (A 5 ) in which alanine residues are continuous with respect to M_PRT 410 (SEQ ID NO: 1). Two of the side domain sequences were deleted, and 13 glutamine residues (Q) were substituted with serine residues (S) or proline residues (P).
  • the amino acid sequence (PRT699: Test Example 1-9) shown by SEQ ID NO: 19 is the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown by SEQ ID NO: 7 at the N-terminus of the amino acid sequence (M_PRT699) shown by SEQ ID NO. It is added.
  • M_PRT699 (SEQ ID NO: 16) is one in which all QQs in M_PRT 525 (SEQ ID NO: 15) are replaced with VL.
  • the amino acid sequence (PRT698: Test Example 1-10) shown in SEQ ID NO: 20 is the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 7 at the N-terminus of the amino acid sequence (M_PRT698) shown in SEQ ID NO: 17 It is added.
  • M_PRT698 (SEQ ID NO: 17) is one in which all QQs in M_PRT 525 (SEQ ID NO: 15) are replaced with VL and the remaining Q is replaced with I.
  • Nucleic acids encoding proteins having the designed amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 14 and SEQ ID NOs: 18 to 20 were synthesized respectively.
  • the NdeI site at the 5 'end and the EcoRI site downstream of the stop codon were added to the nucleic acid.
  • These five nucleic acids were cloned into a cloning vector (pUC118). Thereafter, the same nucleic acid was digested with NdeI and EcoRI, cut out, and then recombined into a protein expression vector pET-22b (+) to obtain an expression vector.
  • E. coli BLR (DE3) was transformed with pET22b (+) expression vector containing a nucleic acid encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8-14 and SEQ ID NO: 18-20.
  • the transformed E. coli was cultured in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours.
  • the culture solution was added to 100 mL of a seed culture medium (Table 5) containing ampicillin so that the OD 600 was 0.005.
  • the culture solution temperature was maintained at 30 ° C., and flask culture was performed until the OD 600 reached 5 (about 15 hours) to obtain a seed culture solution.
  • the seed culture solution was added to a jar fermenter to which 500 mL of production medium (Table 6) was added so that the OD 600 was 0.05 to inoculate transformed E. coli.
  • the temperature of the culture solution was maintained at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9. Also, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • the feed solution (glucose 455 g / 1 L, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 mL / min.
  • the temperature of the culture solution was maintained at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9. Further, the culture was carried out for 20 hours while maintaining the dissolved oxygen concentration in the culture solution at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration. Thereafter, 1 M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce expression of the target protein. Twenty hours after the addition of IPTG, the culture solution was centrifuged to recover the cells. SDS-PAGE was performed using cells prepared from the culture solution before IPTG addition and after IPTG addition, and expression of a target protein was confirmed by appearance of a band of the target protein size depending on IPTG addition.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the precipitate after washing is suspended in 8 M guanidine buffer (8 M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100 mg / mL, 60 ° C. The solution was stirred for 30 minutes and dissolved. After dissolution, dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Pure Chemical Industries, Ltd.). The white aggregated protein obtained after dialysis was recovered by centrifugation, the water was removed by a lyophilizer, and the lyophilized powder was recovered.
  • 8 M guanidine buffer 8 M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0
  • PRT720 SEQ ID NO: 14: Test Example 1-7) A lyophilized powder of protein was added to the solvent to a concentration of 24% by mass, respectively. After dissolving with an aluminum block heater at 90 ° C. for 1 hour, insolubles and bubbles were removed to obtain a spinning solution (doping solution).
  • the spinning solution was filled into a reserve tank and discharged from a 0.1 or 0.2 mm diameter monohole nozzle into a 100% by mass methanol coagulation bath using a gear pump. The discharge rate was adjusted to 0.01 to 0.08 mL / min. After coagulating, washing and stretching were performed in a 100% by mass methanol washing bath. After washing and drawing, it was dried using a dry heat plate, and the obtained raw yarn (fibroin fiber) was wound up.
  • PRT 720 (Test Example 1-7) has an amino acid sequence obtained by inserting a hydrophobic amino acid residue into PRT 410 (Test Example 1-1).
  • the insertion of the hydrophobic amino acid residue slightly lowers the glutamine residue content of PRT 720 (Test Example 1-7) compared to PRT 410 (Test Example 1-1), and the hydrophobicity of REP is remarkable. It's getting higher.
  • the fibers spun with PRT 720 (Test Example 1-7) protein and the fibers spun with PRT 410 (Test Example 1-1) protein had no difference in secondary shrinkage (Test Example 1-1 in Table 7). And Test Example 1-7). From this result, it was found that reduction of the secondary contraction rate can not be expected even if the degree of hydrophobicity is simply increased.
  • PRT 410 (SEQ ID NO: 8: Test Example 1-1), PRT 525 (SEQ ID NO: 18: Test Example 1-8), PRT 699 (SEQ ID NO: 19: Test Example 1-9) and PRT 698 (SEQ ID NO: 20: Test Example 1-10)
  • the freeze-dried powder of protein was added to 99% hexafluoro-2-propanol (HFIP) to a concentration of 10% by mass, shaken at 55 ° C. and 400 rpm for 20 minutes, and dissolved to obtain a dope solution.
  • HFIP hexafluoro-2-propanol
  • a release film (made by Mitsui Chemicals Tosoh Co., Ltd., product number “SP-PET-01-75-BU”) in which a silicone compound was immobilized on the surface of a 75 ⁇ m-thick polyethylene terephthalate (PET) film was used as a substrate.
  • the batch coater (made by Imoto Machinery Co., Ltd.)
  • the dope solution prepared above was cast on the substrate to make a wet film under the conditions of a feed speed of 20 mm / sec and a slit width of 0.18 mm. .
  • a modified fibroin was prepared by the same procedure as in Test Example 1 except that a modified fibroin (PRT 917) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 and a modified fibroin (PRT 1028) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 were designed.
  • the dope solution was filled in a reserve tank, and discharged from a 0.3 mm diameter monohole nozzle into a 100% by mass methanol coagulation bath (coagulation bath temperature 12 ° C.) using a gear pump. After coagulating, washing and stretching were performed in a 100% by mass methanol washing bath. After washing and drawing, it was dried using a dry heat plate (drying temperature 80 ° C.), and the obtained raw yarn (raw material fiber) was wound up. The draw ratio was 6 times.
  • each artificially modified fibroin fiber in water was carried out with 0.8 g lead weight attached to each artificially modified fibroin fiber in order to eliminate the crimp of each artificially modified fibroin fiber. Then, each artificially modified fibroin fiber removed from water was dried at room temperature for 2 hours with 0.8 g of lead weight attached. After drying, the length of each artificially modified fibroin fiber (the length of artificially modified fibroin fiber when dried from the wet state) was measured. From the obtained measured values, the restitution ratio, elongation ratio and shrinkage ratio C of each artificially modified fibroin fiber were calculated according to the following formulas (1), (4) and (5). The results are shown in Table 9.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a freeze-dried powder of modified fibroin is added to a concentration of 18% by mass or 24% by mass (table 10), dissolved for 3 hours using a shaker. Thereafter, insolubles and bubbles were removed to obtain a modified fibroin solution.
  • the obtained modified fibroin solution was used as a dope solution (spinning stock solution) to produce a raw material fiber spun and drawn by dry-wet spinning using a spinning device according to the spinning device 10 shown in FIG.
  • the spinning device used is a second non-stretched yarn production device (between the unstretched yarn production device 2 (first bath) and the wet heat drawing device 3 (third bath) A second bath).
  • the conditions for dry and wet spinning are as follows. Extrusion nozzle diameter: 0.2 mm Liquid in first to third baths and temperature: See Table 10 Total stretch ratio: See Table 10 Drying temperature: 60 ° C.
  • a plurality of raw material fibers each having a length of 30 cm were cut out from the wound product material fibers obtained in Production Examples 1 to 19.
  • the plurality of raw material fibers were bundled to obtain a raw material fiber bundle having a fineness of 150 denier.
  • Each raw material fiber bundle was attached with 0.8 g of lead weight, and in this state, each raw material fiber bundle was immersed in water at a temperature shown in Tables 11 to 14 for 10 minutes (contact step). Thereafter, the length of each raw fiber bundle was measured in water.
  • the length measurement of the raw material fiber bundle in water was carried out with 0.8 g of lead weight attached to the raw material fiber bundle in order to eliminate the crimp of the raw material fiber bundle.
  • the shrinkage factor A (%) was calculated according to the following formula (2).
  • L0 shows the length of the fiber before contacting with water after spinning, and is 30 cm here.
  • Lw shows the length of the fiber irreversibly shrunk by contacting with water after spinning, and here is the length of each raw fiber bundle measured in water.
  • Shrinkage rate A ⁇ 1- (Lw / L0) ⁇ ⁇ 100 (%)

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Abstract

本発明は、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインであって、ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当する、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する、改変フィブロインに関する。［式１及び式２中、（Ａ）ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフ等は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］

Description

改変フィブロイン
　本発明は、改変フィブロインに関する。より具体的には、本発明は、グルタミン残基の含有量が低減された改変フィブロインに関する。本発明はまた、改変フィブロインをコードする核酸、当該核酸配列を含む発現ベクター、当該発現ベクターで形質転換された宿主、及び改変フィブロインから製造された製品にも関する。
　フィブロインは、繊維状のタンパク質の一種であり、βプリーツシートの形成につながるグリシン残基、アラニン残基及びセリン残基を最大９０％含有する（非特許文献１）。フィブロインとして、昆虫及びクモ類が産生する糸を構成するタンパク質（絹タンパク質、ホーネットシルクタンパク質、スパイダーシルクタンパク質）等が知られている。
　絹タンパク質は、優れた機械的特性、吸湿特性及び消臭特性を有し、衣服原料として広く用いられている素材である。また絹糸は免疫寛容な天然繊維であり、生体親和性が高いため手術用縫合糸等の用途にも用いられている。
　クモには最大７種類の絹糸腺が存在し、それぞれ性質の異なるフィブロイン（スパイダーシルクタンパク質）を産生する。スパイダーシルクタンパク質は、その源泉の器官にしたがって、高い靭性を有する大瓶状スパイダータンパク質（ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭａＳｐ）、高度な伸長力を有する小瓶状スパイダータンパク質（ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭｉＳｐ）、並びに鞭状（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ（Ｆｌａｇ））、管状（ｔｕｂｕｌｉｆｏｒｍ）、集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、ブドウ状（ａｃｉｎｉｆｏｒｍ）及びナシ状（ｐｙｒｉｆｏｒｍ）の各スパイダーシルクタンパク質と命名されている。特に、優れた強度と伸度を有することにより高い靭性を有する大瓶状スパイダータンパク質において構造的研究が集中して行われている（特許文献１及び特許文献２）。
　フィブロインに特異的な構造の一つとして、ＧＰＧＸＸ、アラニン残基に富んだ伸長領域（（Ａ）ｎ又は（ＧＡ）ｎ）、ＧＧＸ、及びスペーサーに分類されるアミノ酸モチーフが反復した構造が知られている（非特許文献２）。また、（ＧＡ）ｎモチーフを（Ａ）ｎモチーフで置換することにより伸度は減少するが引張り強度が増すこと、ＧＰＧＸＸモチーフの数を増加させることにより伸度が増加すること、ＧＰＧＸＸモチーフのいくつかを（Ａ）ｎモチーフで置換することにより引張り強度が増加することが報告されている（特許文献２）。また、ＧＧＸ及びＧＰＧＸＸモチーフは、糸に弾性を与える可撓性のらせん構造をとると考えられている（特許文献３）。
　組換えスパイダーシルクタンパク質、及び組換え絹タンパク質は、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されている。例えば、ヤギ、カイコ、植物、哺乳類細胞、酵母、カビ、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌等を宿主とした組換えタンパク質生産系による組換えフィブロイン生産が多数報告されており一定の成果が得られている（非特許文献３、特許文献４及び５）。
　フィブロインを紡糸して得られるフィブロイン繊維は、水又は湯への浸漬、高湿度環境への暴露等により収縮する特性を有する。この特性は、製造工程及び製品化において様々な問題を発生させ、当該繊維よりなる製品にも影響が及ぶ。
　当該製品の収縮を防止するための防縮方法として、例えば、精練を完了した強撚糸使用の絹織物を、緊張した状態で水、その他の溶媒、又はその混合系に浸漬して所定時間加温することを特徴とする絹織物の防縮加工法（特許文献６）、所要形状に成形された状態にある動物繊維製品に、１２０～２００℃の高圧飽和水蒸気を接触させる処理を施して、当該繊維製品に水蒸気処理時の形状を固定することを特徴とする動物繊維製品の形状固定化方法（特許文献７）等が開示されている。
特開２０１２－５５２６９号公報 特表２００５－５０２３４７号公報 特表２００９－５０５６６８号公報 特表２０１４－５０２１４０号公報 国際公開第２０１５／０４２１６４号 特公平２－６８６９号公報 特開平６－２９４０６８号公報
Ａｓａｋｕｒａら，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９４年，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．１－１１ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，２００４年，３：１４ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，２９５巻，ｐｐ．４７２－４７６
　特許文献６及び７に開示されるような防縮方法は、操作が煩雑であり、また工程が増えるため、工業的に不利である。一方、フィブロイン繊維自体の収縮を抑制又は低減させることができれば、極めて工業的に有用である。しかしながら、これまでに収縮が抑制又は低減されたフィブロイン繊維、又はそれを構成する改変されたフィブロインは知られていない。
　本発明は、収縮が低減されたフィブロイン繊維を紡糸することができる改変フィブロインの提供を目的とする。
　本発明者らは、フィブロイン中に存在するグルタミン残基の含有量を減少させることにより、収縮が低減されたフィブロイン繊維が得られることを見出した。更に当該フィブロインを成形したフィルムは耐水性を有することを見出した。本発明はこの新規な知見に基づく。
　すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインであって、
　上記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当する、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する、改変フィブロイン。
［式１及び式２中、（Ａ）ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
［２］
　ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸ（但し、Ｘはグリシン残基以外のアミノ酸残基を示す。）モチーフを含み、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上である、［１］に記載の改変フィブロイン。
［３］
　グルタミン残基含有率が９％以下である、［１］又は［２］に記載の改変フィブロイン。
［４］
　上記他のアミノ酸残基が、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択されるアミノ酸残基である、［１］～［３］のいずれかに記載の改変フィブロイン。
［５］
　ＲＥＰの疎水性度が、－０．８以上である、［１］～［４］のいずれかに記載の改変フィブロイン。
［６］
　天然由来のフィブロインと比較して、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列を有する、［１］～［５］のいずれかに記載の改変フィブロイン。
［７］
　上記天然由来のフィブロインが、昆虫又はクモ類由来のフィブロインである、［６］に記載の改変フィブロイン。
［８］
　上記天然由来のフィブロインが、クモ類の大瓶状スパイダータンパク質（ＭａＳｐ）又は小瓶状スパイダータンパク質（ＭｉＳｐ）である、［７］に記載の改変フィブロイン。
［９］
　配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６若しくは配列番号１７で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６若しくは配列番号１７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン。
［１０］
　更に、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含む、［１］～［９］のいずれかに記載の改変フィブロイン。
［１１］
　上記タグ配列が、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含む、［１０］に記載の改変フィブロイン。
［１２］
　配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９若しくは配列番号２０で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９若しくは配列番号２０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン。
［１３］
　［１］～［１２］のいずれかに記載の改変フィブロインをコードする核酸。
［１４］
　［１３］に記載の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインをコードする核酸。
［式１及び式２中、（Ａ）ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
［１５］
　［１３］に記載の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、かつ式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインをコードする核酸。
［式１及び式２中、（Ａ）ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
［１６］
　［１３］～［１５］のいずれかに記載の核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクター。
［１７］
　プラスミドベクター又はウイルスベクターである、［１６］に記載の発現ベクター。
［１８］
　［１６］又は［１７］に記載の発現ベクターで形質転換された宿主。
［１９］
　原核生物である、［１８］に記載の宿主。
［２０］
　上記原核生物が、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属からなる群より選択される属に属する微生物である、［１９］に記載の宿主。
［２１］
　真核生物である、［１８］に記載の宿主。
［２２］
　上記真核生物が、酵母、糸状真菌又は昆虫細胞である、［２１］に記載の宿主。
［２３］
　上記酵母が、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クリベロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピキア属、キャンディダ属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属からなる群より選択される属に属する酵母である、［２２］に記載の宿主。
［２４］
　上記サッカロマイセス属に属する酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、上記シゾサッカロマイセス属に属する酵母が、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）であり、上記クリベロマイセス属に属する酵母が、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）であり、上記トリコスポロン属に属する酵母が、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）であり、上記シワニオミセス属に属する酵母が、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ）であり、上記ピキア属に属する酵母が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、上記キャンディダ属に属する酵母が、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）であり、上記ヤロウィア属に属する酵母が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、上記ハンゼヌラ属に属する酵母が、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である、［２３］に記載の宿主。
［２５］
　上記糸状真菌が、アスペルギルス属、ペニシリウム属及びムコア属からなる群より選択される属に属する糸状真菌である、［２２］に記載の宿主。
［２６］
　上記アスペルギルス属に属する糸状真菌が、アスペルギルス・オリゼであり、上記ペニシリウム属に属する糸状真菌が、ペニシリウム・クリゾゲナムであり、上記ムコア属に属する糸状真菌が、ムコア・フラギリスである、［２５］に記載の宿主。
［２７］
　上記昆虫細胞が、鱗翅類の昆虫細胞である、［２２］に記載の宿主。
［２８］
　上記昆虫細胞が、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来の昆虫細胞、又はイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）由来の昆虫細胞である、［２７］に記載の宿主。
［２９］
　［１］～［１２］のいずれかに記載の改変フィブロインを含み、
　繊維、糸、フィルム、発泡体、粒体、ナノフィブリル、ゲル及び樹脂からなる群から選択される、製品。
　本発明はまた、例えば、以下の各発明にも関する。
［３０］
　改変フィブロインを含む人造改変フィブロイン繊維であって、湿潤状態にした際に伸長し、かつ湿潤状態から乾燥した際に収縮する、人造改変フィブロイン繊維。
［３１］
　下記式（１）で定義される復元率が９５％以上である、［３０］に記載の人造改変フィブロイン繊維。
　復元率＝（湿潤状態から乾燥した際の人造改変フィブロイン繊維の長さ／湿潤状態にする前の人造改変フィブロイン繊維の長さ）×１００（％）　・・・（１）
［３２］
　上記人造改変フィブロイン繊維は、紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された収縮履歴を有する繊維であり、
　下記式（２）で定義される収縮率Ａが２％以上である、［３０］又は［３１］に記載の人造改変フィブロイン繊維。
　収縮率Ａ＝｛１－（紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された繊維の長さ／紡糸後、水と接触する前の繊維の長さ）｝×１００（％）　・・・（２）
［３３］
　上記人造改変フィブロイン繊維は、紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された後、乾燥により更に収縮された収縮履歴を有する繊維であり、
　下記式（３）で定義される収縮率Ｂが７％超である、［３０］～［３２］のいずれかに記載の人造改変フィブロイン繊維。
　収縮率Ｂ＝｛１－紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された後、乾燥により更に収縮された繊維の長さ／紡糸後、水と接触する前の繊維の長さ）｝×１００（％）　・・・（３）
［３４］
　上記改変フィブロインが、［１］～［１２］のいずれかに記載の改変フィブロインである、［３０］～［３３］のいずれかに記載の人造改変フィブロイン繊維。
［３５］
　下記式（４）で定義される伸長率が１７％以下である、［３０］～［３４］のいずれかに記載の人造改変フィブロイン繊維。
　伸長率＝｛（湿潤状態にした際の人造改変フィブロイン繊維の長さ／湿潤状態にする前の人造改変フィブロイン繊維の長さ）－１｝×１００（％）　・・・（４）
［３６］
　下記式（５）で定義される収縮率Ｃが１５％以下である、［３０］～［３５］のいずれかに記載の人造改変フィブロイン繊維。
　収縮率Ｃ＝｛１－（湿潤状態から乾燥した際の人造改変フィブロイン繊維の長さ／湿潤状態にした際の人造改変フィブロイン繊維の長さ）｝×１００（％）　・・・（５）
［３７］
　紡糸後、水と接触する前の原料繊維を、水と接触させて不可逆的に収縮させた後、乾燥させて更に収縮させる収縮工程を備え、
　上記原料繊維が、改変フィブロインを含む、人造改変フィブロイン繊維の製造方法。
［３８］
　上記原料繊維は、下記式（２）で定義される収縮率Ａが２％以上の繊維である、［３７］に記載の製造方法。
　収縮率Ａ＝｛１－（紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された繊維の長さ／紡糸後、水と接触する前の繊維の長さ）｝×１００（％）　・・・（２）
［３９］
　上記原料繊維は、下記式（３）で定義される収縮率Ｂが７％超の繊維である、［３７］又は［３８］に記載の製造方法。
　収縮率Ｂ＝｛１－（紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された後、乾燥により更に収縮された繊維の長さ／紡糸後、水と接触する前の繊維の長さ）｝×１００（％）　・・・（３）
［４０］
　上記改変フィブロインが、［１］～［１２］のいずれかに記載の改変フィブロインである、［３７］～［３９］のいずれかに記載の製造方法。
　本発明によれば、収縮が低減されたフィブロイン繊維を紡糸することができる改変フィブロインの提供が可能となる。また、吸水性が低減され、耐水性を有するフィブロインフィルムを作製できる改変フィブロインの提供が可能となる。
　本発明によればまた、水との接触及びその後の乾燥による寸法変化（伸長及び収縮）の際、当該伸長と収縮の程度が同程度（復元率が１００％に近い）であり、元の長さに戻ることができるという特性を有する人造改変フィブロイン繊維、及びその製造方法の提供が可能となる。
改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。 水等との接触によるフィブロイン繊維の長さ変化の例を示す図である。 原料繊維を製造するための紡糸装置の一例を概略的に示す説明図である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
〔改変フィブロイン〕
　本発明に係る改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
　本明細書において「改変フィブロイン」とは、そのドメイン配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインを意味する。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン」もまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。
　「改変フィブロイン」は、本発明で特定されるアミノ酸配列を有するものであれば、天然由来のフィブロインに依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。
　本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
　（Ａ）ｎモチーフは、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上であればよいが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されることが好ましい。アラニン残基のみで構成されるとは、（Ａ）ｎモチーフが、（Ａ）ｎ（Ａはアラニン残基を示し、ｎは４～２７の整数、好ましくは４～２０の整数、より好ましくは４～１６の整数を示す。）で表されるアミノ酸配列を有することを意味する。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものであってよい。本実施形態に係る改変フィブロインは、グルタミン残基の含有量が低減されているため、当該改変フィブロインを紡糸して得られるフィブロイン繊維は、収縮が低減されたものとなる。また、当該フィブロインを成形して得られるフィルムは、耐水性を有するものとなる。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフ（Ｇはグリシン残基、Ｐはフェニルアラニン残基、Ｘはグリシン残基以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。ＲＥＰ中にこれらのモチーフが含まれることにより、改変フィブロインの伸度を向上させることができる。
　本実施形態に係る改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。これにより、改変フィブロインの伸度をより向上させることができる。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
　本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｘとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｙとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｘ／ｙとして算出される。
　ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
　図１は、改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図１を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図１に示した改変フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図１中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｘを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｘは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図１中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｙは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｘをｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができ、図１の改変フィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。これにより、本発明による効果をより一層顕著に奏することができる。
　本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図１の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｗとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｙとしたときに、グルタミン残基含有率はｗ／ｙとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。
　「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ　Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ（１９８２）“Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度が、－０．８以上であることが好ましく、－０．７以上であることがより好ましく、０以上であることが更に好ましく、０．３以上であることが更により好ましく、０．４以上であることが特に好ましい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。
　本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図１の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｚとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｙとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｚ／ｙとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　天然由来のフィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であり、具体的には、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｇｕ１１ａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
　ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む天然由来のフィブロインは１２９種類存在した。このうち、更に上述の方法により算出されるＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上である天然由来のフィブロインは下記表２に示す６種類であった。表２に示した６種類の天然由来のフィブロインのグルタミン残基含有率は、いずれも９．２％以上であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本実施形態に係る改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
　本発明に係る改変フィブロインのより具体的な例として、（ｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１若しくは配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（ｉｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１若しくは配列番号２２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（ｉ）の改変フィブロインについて説明する。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ４１０）は、天然由来のフィブロインであるＮｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、（Ａ）ｎモチーフ中のアラニン残基が連続するアミノ酸配列をアラニン残基が連続する数を５つにする等の生産性を向上させるためのアミノ酸の改変を行ったものである。一方、Ｍ＿ＰＲＴ４１０は、グルタミン残基（Ｑ）の改変は行っていないため、グルタミン残基含有率は、天然由来のフィブロインのグルタミン残基含有率と同程度である。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ８８８）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。
　配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９６５）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。
　配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ８８９）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１６）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。
　配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１８）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号１５で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ５２５）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）に対し、アラニン残基が連続する領域（Ａ５）に２つのアラニン残基を挿入し、Ｍ＿ＰＲＴ４１０の分子量とほぼ同じになるよう、Ｃ末端側のドメイン配列２つを欠失させ、かつグルタミン残基（Ｑ）１３箇所をセリン残基（Ｓ）又はプロリン残基（Ｐ）に置換したものである。
　配列番号１６で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ６９９）は、Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号１５）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。
　配列番号１７で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ６９８）は、Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号１５）中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号２１で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１７）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）中のＱＱを全てＬＩに置換し、かつ残りのＱをＶに置換したものである。
　配列番号２２で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ１０２８）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）中のＱＱを全てＩＦに置換し、かつ残りのＱをＴに置換したものである。
　配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１及び配列番号２２で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（ｉｉ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（ｉｉ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
　さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（ｉｉｉ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３若しくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（ｉｖ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３若しくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１及び配列番号２２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（ｉｖ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（ｉｖ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
〔核酸〕
　本発明に係る核酸は、本発明に係る改変フィブロインをコードする。核酸の具体例として、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１若しくは配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又はこれらのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか一方若しくは両方に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列）を結合させたタンパク質等をコードする核酸等が挙げられる。
　一実施形態に係る核酸は、本発明に係る改変フィブロインをコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインをコードする核酸である。当該核酸によりコードされる改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、当該核酸によりコードされる改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。低ストリンジェントな条件とは、少なくとも８５％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、４２℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。中ストリンジェントな条件とは、少なくとも９０％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、５０℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、少なくとも９５％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、６０℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。
　他の実施形態に係る核酸は、本発明に係る改変フィブロインをコードする核酸と９０％以上の配列同一性を有し、かつ式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインをコードする核酸である。当該核酸によりコードされる改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、当該核酸によりコードされる改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
〔宿主及び発現ベクター〕
　本発明に係る発現ベクターは、本発明に係る核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する。調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
　本発明に係る宿主は、本発明に係る発現ベクターで形質転換されたものである。宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
　発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、本発明に係る核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
　細菌等の原核生物を宿主として用いる場合は、本発明に係る発現ベクターは、原核生物中で自立複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明に係る核酸及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　原核生物としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。
　エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ　ＢＬ２１（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、エシェリヒア・コリ　ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、エシェリヒア・コリ　ＤＨ１、エシェリヒア・コリ　ＧＩ６９８、エシェリヒア・コリ　ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ　Ｋ５（ＡＴＣＣ　２３５０６）、エシェリヒア・コリ　ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ　ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ　４７０７６）、エシェリヒア・コリ　Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ　Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　ＴＢ１、エシェリヒア・コリ　Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）　（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ　２７３２５）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。
　ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ、ブレビバチルス・ボルステレンシス、ブレビバチルス・セントロポラスブレビバチルス・フォルモサス、ブレビバチルス・インボカツス、ブレビバチルス・ラチロスポラス、ブレビバチルス・リムノフィルス、ブレビバチルス・パラブレビス、ブレビバチルス・レウスゼリ、ブレビバチルス・サーモルバー、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１２２３）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７－５（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１６６４）、ブレビバチルス・ブレビス４７－５Ｑ（ＪＣＭ８９７５）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－Ｓ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６２３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－ＯＫ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４５７３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（Ｔａｋａｒａ社製）等を挙げることができる。
　セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ）ＡＴＣＣ１４４６０、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンティコーラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・グリメシ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、セラチア・ルビダエ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｒｕｂｉｄａｅａ）等を挙げることができる。
　バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等を挙げることができる。
　ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム　ＡＴＣＣ１５３５４等を挙げることができる。
　ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７）ＡＴＣＣ１３８２６，ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９）ＡＴＣＣ１３６６５，ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２４０、ブレビバクテリウム・アルバムＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテリウム・セリヌムＡＴＣＣ１５１１２等を挙げることができる。
　コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１，ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカムＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０３２，ＡＴＣＣ１３０６０、コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭＢＰ－１５３９）、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８等を挙げることができる。
　シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ブラシカセラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）、シュードモナス・フルバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｕｌｖａ）、及びシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）Ｄ－０１１０等を挙げることができる。
　上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９，２１１０　（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３－２４８３９４号公報）、又はＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
　ブレビバチルス属に属する微生物の形質転換は、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８３，１５６：１１３０－１１３４）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５３：３０９９－３１００）、又はＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：２０２－２０３）により実施することができる。
　本発明に係る核酸を導入するベクター（以下、単に「ベクター」という。）としては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３－２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ－８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　Ｂ－４００）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６７９８）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
　宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉを用いる場合は、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ等を好適なベクターとして挙げることができる。
　ブレビバチルス属に属する微生物に好適なベクターの具体例として、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、又はｐＨＹ５００（特開平２－３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４－２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１２３９－１２４５）、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌１９８７，６１：６６９－６７６）、ｐＮＵ１００（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，３０：７５－８０）、ｐＮＵ２１１（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，１１２：４８８－４９１）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７－１７０９８４号公報）、ｐＮＨ３０１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，５８：５２５－５３１）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：７４５－７４９）、ｐＨＴ２１０（特開平６－１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４２：３５８－３６３）、又は大腸菌とブレビバチルス属に属する微生物とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
　プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであれば制限されない。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の大腸菌又はファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ　Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明に係る発現ベクターにおいて、本発明に係る核酸の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　真核生物の宿主としては、例えば、酵母、糸状真菌（カビ等）及び昆虫細胞を挙げることができる。
　酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属等に属する酵母を挙げることができる。より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ）、シワニオマイセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ　ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ポリモルファ（Ｐｉｃｈｉａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等を挙げることができる。
　酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターは通常、複製起点（宿主における増幅が必要である場合）及び大腸菌中でのベクターの増殖のための選抜マーカー、酵母における組換えタンパク質発現のためのプロモーター及びターミネーター、並びに酵母のための選抜マーカーを含むことが好ましい。
　発現ベクターが非組込みベクターの場合、さらに自己複製配列（ＡＲＳ）を含むことが好ましい。これにより細胞内における発現ベクターの安定性を向上させることができる（Ｍｙｅｒｓ、Ａ．Ｍ．、ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ　４５：２９９－３１０）。
　酵母を宿主として用いる場合のベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ＹＩｐ、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＡ０８０４、ｐＨＩＬ３Ｏｌ、ｐＨＩＬ－Ｓ１、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣＺ　Ｂ等を挙げることができる。
　プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば制限されない。例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ　１プロモーター、ｇａｌ　１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１　プロモーター、ＣＵＰ　１プロモーター、ｐＧＡＰプロモーター、ｐＧＣＷ１４プロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＭＯＸプロモーター等を挙げることができる。
　酵母への発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。
　糸状真菌としては、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ウスチラーゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）属、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｓ）属、マグナポルサ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ムコア（Ｍｕｃｏｒ）属、メタリチウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、及びリゾムコア属に属する菌等を挙げることができる。
　糸状真菌の具体例として、アクレモニウム・アラバメンゼ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ａｌａｂａｍｅｎｓｅ）、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアツス（アキュレータス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・サケ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓａｋｅ）、アスペルギルス・ゾジエ（ソーヤ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・テュビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・フィクム（フィキュウム）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス・フェニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐｈｏｅｉｃｕｓ）、アスペルギルス・フォエチズス（フェチダス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ヤポニクス（ジャポニカス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｓｅｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、スポロトリクム・セルロフィルム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、チラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、ノイロスポラ・クラザ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）、フザリウム・オキシスポーラス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｓ）、フザリウム・グラミネルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カネセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・エメルソニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・グリゼオロゼウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｇｒｉｓｅｏｒｏｓｅｕｍ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・ロケフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィルム（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔａｏｒａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ムコア・アンビグス（Ｍｕｃｏｒ　ａｍｂｉｇｕｕｓ）、ムコア・シイルシネロイデェス（Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ムコア・フラギリス（Ｍｕｃｏｒ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ムコア・ヘマリス（Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ムコア・イナエクイスポラス（Ｍｕｃｏｒ　ｉｎａｅｑｕｉｓｐｏｒｕｓ）、ムコア・オブロンジエリプティカス（Ｍｕｃｏｒ　ｏｂｌｏｎｇｉｅｌｌｉｐｔｉｃｕｓ）、ムコア・ラセモサス（Ｍｕｃｏｒ　ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、ムコア・レクルバス（Ｍｕｃｏｒ　ｒｅｃｕｒｖｕｓ）、ムコア・サトゥルニナス（Ｍｏｃｏｒ　ｓａｔｕｒｎｉｎｕｓ）、ムコア・サブティリススミウス（Ｍｏｃｏｒ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｍｕｓ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、リゾムコア・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ）、リゾムコア・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、リゾプス・アルヒザス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ａｒｒｈｉｚｕｓ）等を挙げることができる。
　宿主が糸状真菌である場合のプロモーターとしては、解糖系に関する遺伝子、構成的発現に関する遺伝子、加水分解に関する酵素遺伝子等いずれであってもよく、具体的にはａｍｙＢ、ｇｌａＡ、ａｇｄＡ、ｇｌａＢ、ＴＥＦ１、ｘｙｎＦ１ｔａｎｎａｓｅｇｅｎｅ、Ｎｏ．８ＡＮ、ｇｐｄＡ、ｐｇｋＡ、ｅｎｏＡ、ｍｅｌＯ、ｓｏｄＭ、ｃａｔＡ、ｃａｔＢ等を挙げることができる。
　糸状真菌への発現ベクターの導入は、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９）］、コンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６：２０９（１９７１）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
　昆虫細胞として、例えば、鱗翅類の昆虫細胞が挙げられ、より具体的には、Ｓｆ９、及びＳｆ２１等のスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来の昆虫細胞、並びに、Ｈｉｇｈ　５等のイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）由来の昆虫細胞等が挙げられる。
　昆虫細胞を宿主として用いる場合のベクターとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）等のバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２））を挙げることができる。
　昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。すなわち、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス（発現ベクター）を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
　組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターとバキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２－２２７０７５号公報）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））等を挙げることができる。
　本発明に係る組換えベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。例えば、大腸菌においては、選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。栄養要求性に関与する遺伝子変異を相補できる劣性の選択マーカーも使用できる。酵母においては、選択マーカー遺伝子として、ジェネティシンに対する耐性遺伝子を用いることができ、栄養要求性に関与する遺伝子変異を相補する遺伝子、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３等の選択マーカーも使用できる。糸状真菌においては、選択マーカー遺伝子として、ｎｉａＤ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１７９５－１７９７（１９９５））、ａｒｇＢ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌ，６，３８６－３８９，（１９８４）），ｓＣ（Ｇｅｎｅ，８４，３２９－３３４，（１９８９））、ｐｔｒＡ（ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，６４，１４１６－１４２１，（２０００））、ｐｙｒＧ（ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，１１２，２８４－２８９，（１９８３）），ａｍｄＳ（Ｇｅｎｅ，２６，２０５－２２１，（１９８３））、オーレオバシジン耐性遺伝子（Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ，２６１，２９０－２９６，（１９９９））、ベノミル耐性遺伝子（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，８３，４８６９－４８７３，（１９８６））及びハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｇｅｎｅ，５７，２１－２６，（１９８７））からなる群より選ばれるマーカー遺伝子、ロイシン要求性相補遺伝子等が挙げられる。また、宿主が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
　本発明に係る発現ベクターで形質転換された宿主の選択は、本発明に係る核酸に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション及びコロニーハイブリダイゼーション等で行うことができる。当該プローブとしては、本発明に係る核酸の配列情報に基づき、ＰＣＲ法によって増幅した部分ＤＮＡ断片をラジオアイソトープ又はジゴキシゲニンで修飾したものを用いることができる。
〔改変フィブロインの生産〕
　本発明に係る発現ベクターで形質転換された宿主において、本発明に係る核酸を発現させることにより、本発明に係る改変フィブロインを生産することができる。発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。酵母、動物細胞、昆虫細胞により発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたポリペプチドとして改変フィブロインを得ることができる。
　本発明に係る改変フィブロインは、例えば、本発明に係る発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に本発明に係る改変フィブロインを生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。本発明に係る宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
　本発明に係る宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、本発明に係る宿主の培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、該宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
　また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　昆虫細胞の培養培地としては、一般に使用されているＴＮＭ－ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ－９００　ＩＩ　ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））等を用いることができる。
　昆虫細胞の培養は、例えば、培養培地のｐＨ６～７、培養温度２５～３０℃等の条件下で、培養時間１～５日間とすることができる。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。
　宿主が植物細胞の場合、形質転換された植物細胞をそのまま培養してもよく、また植物の器官に分化させて培養することができる。該植物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、又はこれらの培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
　動物細胞の培養は、例えば、培養培地のｐＨ５～９、培養温度２０～４０℃等の条件下で、培養時間３～６０日間とすることができる。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
　本発明に係る発現ベクターで形質転換された宿主を用いて改変フィブロインを生産する方法としては、該改変フィブロインを宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法がある。使用する宿主細胞、及び生産させる改変フィブロインの構造を変えることにより、これらの各方法を選択することができる。
　例えば、改変フィブロインが宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９））、ロウらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０））、又は特開平５－３３６９６３号公報、国際公開第９４／２３０２１号等に記載の方法を準用することにより、改変フィブロインを宿主細胞外に積極的に分泌させるように変更させることができる。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、改変フィブロインの活性部位を含むポリペプチドにシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、改変フィブロインを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
　本発明に係る発現ベクターで形質転換された宿主により生産された改変フィブロインは、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法で単離及び精製することができる。例えば、改変フィブロインが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
　上記クロマトグラフィーとしては、フェニル－トヨパール（東ソー）、ＤＥＡＥ－トヨパール（東ソー）、セファデックスＧ－１５０（ファルマシアバイオテク）を用いたカラムクロマトグラフィーが好ましく用いられる。
　また、改変フィブロインが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として改変フィブロインの不溶体を回収する。回収した改変フィブロインの不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により改変フィブロインの精製標品を得ることができる。
　改変フィブロイン、又は改変フィブロインに糖鎖の付加された誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清から改変フィブロイン又はその誘導体を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
〔紡糸〕
　本発明に係る改変フィブロインは、上述のように生産及び精製した後、フィブロインの紡糸に通常使用されている方法で紡糸することができる。例えば、本発明に係る改変フィブロインを溶媒に溶解させた紡糸液（ドープ液）を、紡糸することにより、本発明に係る改変フィブロインで形成された繊維を得ることができる。
　紡糸液は、改変フィブロインに溶媒を加え、紡糸できる粘度に調整して作製する。溶媒は、改変フィブロインを溶解することができるものであればよい。溶媒として、例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、蟻酸、尿素、グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化リチウム、塩化カルシウム、チオシアン酸リチウム等を含む水溶液等を挙げることができる。
　紡糸液には、必要に応じて無機塩を添加してもよい。無機塩としては、例えば、以下に示すルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩が挙げられる。ルイス塩基としては、例えば、オキソ酸イオン（硝酸イオン、過塩素酸イオン等）、金属オキソ酸イオン（過マンガン酸イオン等）、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオン等が挙げられる。ルイス酸としては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオン等が挙げられる。ルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩の具体例としては、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウム等のリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウム等のカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄等の鉄塩、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウム等のカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛等の亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウム等のバリウム塩、並びに塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、過塩素酸ストロンチウム、及びチオシアン酸ストロンチウム等のストロンチウム塩が挙げられる。
　紡糸液の粘度は、紡糸方法に応じて適宜設定すればよく、例えば、３５℃において１００～１５，０００ｃＰ（センチポイズ）とすることができる。紡糸液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定することができる。
　紡糸方法としては、本発明に係る改変フィブロインを紡糸できる方法であれば特に制限されず、例えば、乾式紡糸、溶融紡糸、湿式紡糸等を挙げることができる。好ましい紡糸方法としては、湿式紡糸を挙げることができる。
　湿式紡糸では、改変フィブロインを溶解させた溶媒を紡糸口金（ノズル）から凝固液（凝固液槽）の中に押出して、凝固液中で改変フィブロインを固めることにより糸の形状の未延伸糸を得ることができる。凝固液としては、脱溶媒できる溶液であればよく、例えば、メタノール、エタノール及び２－プロパノール等の炭素数１～５の低級アルコール、並びにアセトン等を挙げることができる。凝固液には、適宜水を加えてもよい。凝固液の温度は、０～３０℃であることが好ましい。紡糸口金として、直径０．１～０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプを使用する場合、押し出し速度は１ホール当たり、０．２～６．０ｍｌ／時間が好ましく、１．４～４．０ｍｌ／時間であることがより好ましい。凝固液槽の長さは、脱溶媒が効率的に行える長さがあればよく、例えば、２００～５００ｍｍである。未延伸糸の引き取り速度は、例えば、１～２０ｍ／分であってよく、１～３ｍ／分であることが好ましい。滞留時間は、例えば、０．０１～３分であってよく、０．０５～０．１５分であることが好ましい。また、凝固液中で延伸（前延伸）をしてもよい。低級アルコールの蒸発を抑えるため凝固液を低温に維持し、未延伸糸の状態で引き取ってもよい。凝固液槽は多段設けてもよく、また延伸は必要に応じて、各段、又は特定の段で行ってもよい。
　上記の方法で得られた未延伸糸（又は前延伸糸）は、延伸工程を経て延伸糸（フィブロイン繊維）とすることができる。延伸方法としては、湿熱延伸、乾熱延伸等をあげることができる。
　湿熱延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中、スチーム加熱中で行うことができる。温度としては、例えば、５０～９０℃であってよく、７５～８５℃が好ましい。湿熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、１～１０倍延伸することができ、２～８倍延伸することが好ましい。
　乾熱延伸は、電気管状炉、乾熱板等を使用して行うことができる。温度としては、例えば、１４０℃～２７０℃であってよく、１６０℃～２３０℃が好ましい。乾熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、０．５～８倍延伸することができ、１～４倍延伸することが好ましい。
　湿熱延伸及び乾熱延伸はそれぞれ単独で行ってもよく、またこれらを多段で、又は組み合わせて行ってもよい。すなわち、一段目延伸を湿熱延伸で行い、二段目延伸を乾熱延伸で行う、又は一段目延伸を湿熱延伸行い、二段目延伸を湿熱延伸行い、更に三段目延伸を乾熱延伸で行う等、湿熱延伸及び乾熱延伸を適宜組み合わせて行うことができる。
　延伸工程における最終的な延伸倍率は、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、例えば、５～２０倍であり、６～１１倍であることが好ましい。
　本発明に係る改変フィブロインは、延伸してフィブロイン繊維とした後、フィブロイン繊維内のポリペプチド分子間で化学的に架橋させてもよい。架橋させることができる官能基は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基及びヒドロキシ基等が挙げられる。例えば、ポリペプチドに含まれるリジン側鎖のアミノ基は、グルタミン酸又はアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基と脱水縮合によりアミド結合で架橋できる。真空加熱下で脱水縮合反応を行なうことにより架橋してもよいし、カルボジイミド等の脱水縮合剤により架橋させてもよい。
　ポリペプチド分子間の架橋は、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて行ってもよく、トランスグルタミナーゼ等の酵素を用いて行ってもよい。カルボジイミドは、一般式Ｒ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ２（但し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、炭素数１～６のアルキル基、シクロアルキル基を含む有機基を示す。）で示される化合物である。カルボジイミドの具体例として、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリノエチル）カルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等が挙げられる。これらの中でも、ＥＤＣ及びＤＩＣはポリペプチド分子間のアミド結合形成能が高く、架橋反応し易いことから好ましい。
　架橋処理は、フィブロイン繊維に架橋剤を付与して真空加熱乾燥で架橋するのが好ましい。架橋剤は純品をフィブロイン繊維に付与してもよいし、炭素数１～５の低級アルコール及び緩衝液等で０．００５～１０質量％の濃度に希釈したものをフィブロイン繊維に付与してもよい。架橋処理は、温度２０～４５℃で３～４２時間行うのが好ましい。架橋処理により、フィブロイン繊維に更に高い応力（強度）を付与することができる。
〔フィブロイン繊維の収縮性評価〕
　図２は、水等との接触によるフィブロイン繊維の長さ変化の例を示す図である。フィブロイン繊維は、沸点未満の水に接触（湿潤）させることにより収縮する（一次収縮）特性を有する。一次収縮後、乾燥させると更に収縮する（二次収縮）。二次収縮後、再度沸点未満の水に接触させると二次収縮前の長さにまで膨張し、以後乾燥と湿潤を繰り返すと、二次収縮と同程度の幅（図２の「伸縮率」）で、収縮と膨張を繰り返す（図２）。フィブロイン繊維において、このような収縮が少ない程好ましいが、特にフィブロイン繊維からなる織物等の製品においては、この二次収縮が少ないことが好ましい。
　二次収縮は、以下の方法で求められる二次収縮率を指標として評価することができる。
＜二次収縮率＞
　長さ約３０ｃｍの複数本のフィブロイン繊維を束ね、繊度１５０デニールの繊維束とする。この繊維束に０．８ｇの鉛錘を取り付け、その状態で繊維束を４０℃の水に１０分間浸漬し一次収縮させ、水中で繊維束の長さを測定する。
　一次収縮した繊維束を水中から取り出し、０．８ｇの鉛錘を取り付けたまま室温で２時間おいて乾燥させる。乾燥後、繊維束の長さを測定する。再度、湿潤、乾燥を少なくとも３回繰り返し、湿潤時の平均の長さ（Ｌｗｅｔ）、乾燥時の平均の長さ（Ｌｄｒｙ）を求める。二次収縮率は下記式に従って算出される。
　式：二次収縮率（％）＝（１－（Ｌｄｒｙ／Ｌｗｅｔ））＊１００
　天然由来のフィブロインを紡糸したフィブロイン繊維は、通常、二次収縮率は１１～２０％であるが、本発明に係る改変フィブロインを紡糸したフィブロイン繊維は、二次収縮率を８％以下に低減することができる。
〔フィルム〕
　本発明に係るフィルムは、本発明に係る改変フィブロインを溶媒に溶解させたドープ溶液を調製し、当該ドープ液を基材表面にキャスト成形し、乾燥及び／又は脱溶媒することにより得ることができる。
　溶媒としては、紡糸液（ドープ液）で例示した溶媒と同種のものを挙げることができる。また、溶媒としては、ギ酸、ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）、又はジメチルスルホキシド等の極性溶媒が好ましい。ドープ液には、必要に応じて無機塩を添加してもよい。無機塩としては、紡糸液（ドープ液）で例示した無機塩と同種のものを挙げることができる。
　ドープ溶液の粘度は１５～８０ｃＰ（センチポアズ）であることが好ましく、２０～７０ｃＰであることがより好ましい。
　ドープ溶液を１００質量％としたとき、本発明に係る改変フィブロインの濃度は３～５０質量％であることが好ましく、３．５～３５質量％であることがより好ましく、４．２～１５．８質量％であることがさらに好ましい。
　ドープ溶液調製時に、３０～６０℃に加温して行ってもよい。溶解を促進するために振盪、撹拌してもよい。
　基材は、樹脂基板、ガラス基板、金属基板等であってよい。基材は、キャスト成形後のフィルムを容易に剥離できる観点から、好ましくは樹脂基板である。樹脂基板としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂フィルム、ポリプロピレン（ＰＰ）フィルム、又はこれらのフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムであってよい。基材は、ＨＦＩＰ、ＤＭＳＯ溶媒等に対して安定であり、ドープ溶液を安定してキャスト成形でき、成形後のフィルムを容易に剥離できる観点から、ＰＥＴフィルム又はＰＥＴフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムであることがより好ましい。
　具体的な手順を説明すると、まずドープ液を基材表面に流延し、アプリケーター、ナイフコーター、バーコーター等の膜厚制御手段を使用して、所定の厚さ（例えば、乾燥及び／又は脱溶媒後の厚さで１～１０００μｍ）の濡れ膜を作製する。
　乾燥及び／又は脱溶媒は、乾式又は湿式で行うことができる。乾式で行う方法としては、真空乾燥、熱風乾燥、風乾等を挙げることができる。湿式で行う方法としては、キャストフィルムを脱溶媒液（凝固液とも言う）に浸漬して溶媒を脱離する方法等を挙げることができる。脱溶媒液として、水、メタノール、エタノール、２－プロパノール等の炭素数１～５の低級アルコール等のアルコール液、水とアルコールとの混合液等を挙げることができる。脱溶媒液（凝固液）の温度は０～９０℃であることが好ましい。
　乾燥及び／又は脱溶媒後の未延伸フィルムは、水中で１軸延伸又は２軸延伸することができる。２軸延伸は、逐次延伸でも同時２軸延伸でもよい。２段以上の多段延伸をしてもよい。延伸倍率は、縦、横ともに、好ましくは１．０１～６倍、より好ましくは１．０５～４倍である。この範囲であると応力－歪のバランスがとりやすい。水中延伸は、２０～９０℃の水温で行われることが好ましい。延伸後のフィルムは、５０～２００℃の乾熱で５～６００秒間熱固定することが好ましい。この熱固定により、常温における寸法安定性が得られる。なお、１軸延伸したフィルムは１軸配向フィルムとなり、２軸延伸したフィルムは２軸配向フィルムとなる。
〔フィルムの耐水性評価〕
　フィルムの耐水性は、塩類の飽和水溶液を用いた飽和塩法を利用し、高湿度下での吸湿の度合いを測定することにより評価することができる。
　塩類としては、硫酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、炭酸カリウム、塩化マグネシウム等を挙げることができる。
　フィルムの耐水性は、例えば、硫酸カリウムの飽和水溶液を入れたファルコンチューブ等の密閉容器に、適当な大きさに切断したフィルムを、水溶液に浸からないように設置し、例えば、相対湿度９８％のような高湿度で平衡状態にある空気中で、２０～４８時間静置し、フィルムの重量及び水分含量を測定し、重量あたりの水分含量より水分率をもとめることにより、評価することができる。
〔製品〕
　本発明に係る改変フィブロインから形成されたフィブロイン繊維は、繊維（長繊維、短繊維、マルチフィラメント、又は物フィラメント等）又は糸（紡績糸、撚糸、仮撚糸、加工糸、混繊糸、混紡糸等）として、織物、編物、組み物、不織布等に応用できる。また、ロープ、手術用縫合糸、電気部品用の可撓性止め具、さらには移植用生理活性材料（例えば、人工靭帯及び大動脈バンド）等の高強度用途にも応用できる。
　また、本発明に係る改変フィブロインは、フィルム以外にも、発泡体、粒体（球体又は非球体等）、ナノフィブリル、ゲル（ヒドロゲル等）、樹脂及びその等価物にも応用でき、これらは、特開２００９－５０５６６８号公報、特許第５６７８２８３号公報、特許第４６３８７３５号公報等に記載の方法に準じて製造することができる。
〔人造改変フィブロイン繊維〕
　本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維は、改変フィブロインを含むものであり、湿潤状態にした際に伸長し、かつ湿潤状態から乾燥した際に収縮するものである（図２の「二次収縮」以降の伸縮に相当する。）。
　本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維における改変フィブロインは、上述した改変フィブロインの定義に該当するものであればよく、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する改変フィブロインに限られない。当該改変フィブロインとしては、改変絹（シルク）フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、改変クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよい。改変フィブロインとしては、改変クモ糸フィブロインが好ましい。改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（第１の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第４の改変フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（第５の改変フィブロイン）、並びにグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第６の改変フィブロイン）が挙げられる。
　第１の改変フィブロインとしては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の改変フィブロインにおいて、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、３～２０の整数が好ましく、４～２０の整数がより好ましく、８～２０の整数が更に好ましく、１０～２０の整数が更により好ましく、４～１６の整数が更によりまた好ましく、８～１６の整数が特に好ましく、１０～１６の整数が最も好ましい。第１の改変フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０～２００残基であることが好ましく、１０～１５０残基であることがより好ましく、２０～１００残基であることが更に好ましく、２０～７５残基であることが更により好ましい。第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。
　第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号２５～２７のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号２５～２７のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。
　配列番号２５に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２６に示されるアミノ酸配列は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号２７に示されるアミノ酸配列は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
　第１の改変フィブロインのより具体的な例として、（１－ｉ）配列番号２８（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｐｉｄｅｒ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡＤＦ３ＫａｉＬａｒｇｅＮＲＳＨ１）で示されるアミノ酸配列、又は（１－ｉｉ）配列番号２８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　配列番号２８で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号２９）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号２８で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号２７で示されるアミノ酸配列と同一である。
　（１－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２８で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第２の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
　第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第２の改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。
　第２の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
　第２の改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。
　第２の改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。
　第２の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。
　第２の改変フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉ）配列番号３０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３８０）、配列番号３１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号３２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号３３（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｉ）配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２若しくは配列番号３３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（２－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号３４（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号３１で示されるアミノ酸配列は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、配列番号３１で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号３１の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号３３で示されるアミノ酸配列は、配列番号３１で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端に所定のヒンジ配列とＨｉｓタグ配列が付加されたものである。
　配列番号３４で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号３０で示されるアミノ酸配列、配列番号３１で示されるアミノ酸配列、配列番号３２で示されるアミノ酸配列、及び配列番号３３で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号３４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．８％である。
　（２－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（２－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（２－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
　第２の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号３５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
　さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉｉｉ）配列番号３６（ＰＲＴ３８０）、配列番号３７（ＰＲＴ４１０）、配列番号３８（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号３９（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｖ）配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８若しくは配列番号３９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号４０（ＰＲＴ３１３）、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４０、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号３５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（２－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号３９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（２－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号３９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（２－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号３９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
　第２の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第３の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
　第３の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０～４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１～３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比（ギザ比率）が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
　第３の改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９～１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８～３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。
　第３の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　第３の改変フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉ）配列番号４１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３９９）、配列番号３１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号３２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号３３（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｉ）配列番号４１、配列番号３１、配列番号３２若しくは配列番号３３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（３－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号４１で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号３４（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３で示されるアミノ酸配列は、第２の改変フィブロインで説明したとおりである。
　配列番号３４で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号４１で示されるアミノ酸配列、及び配列番号３１で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号３２で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号３３で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．８％である。配列番号３４、配列番号４１、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。
　（３－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号４１、配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（３－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号４１、配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（３－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号４１、配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３（ギザ比率が１：１．８～１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉｉｉ）配列番号４２（ＰＲＴ３９９）、配列番号３７（ＰＲＴ４１０）、配列番号３８（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号３９（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｖ）配列番号４２、配列番号３７、配列番号３８若しくは配列番号３９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号４２、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４１、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号３５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（３－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号４２、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号３９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（３－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号４２、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号３９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（３－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号４２、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号３９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第４の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第４の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第４の改変フィブロインは、上述した第２の改変フィブロインと、第３の改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第２の改変フィブロイン、及び第３の改変フィブロインで説明したとおりである。
　第４の改変フィブロインのより具体的な例として、（４－ｉ）配列番号３１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号３２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）、配列番号３３（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）、配列番号３７（ＰＲＴ４１０）、配列番号３８（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号３９（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（４－ｉｉ）配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３７、配列番号３８若しくは配列番号３９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
　第５の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。
　局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２～４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。
　上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。
　第５の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
　第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　第５の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
　アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ　Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ（１９８２）“Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、上記表１に示すとおりである。
　ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１～４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。また、配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。
　例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。また、例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４－１＝７。「－１」は重複分の控除である。）。
　第５の改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。
　第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
　疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。
　第５の改変フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉ）配列番号４３（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７２０）、配列番号４４（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号４５（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｉ）配列番号４３、配列番号４４若しくは配列番号４５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（５－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号４３で示されるアミノ酸配列は、配列番号３１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）で示されるアミノ酸配列に対し、Ｃ末端側の端末のドメイン配列を除いて、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、配列番号４２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号４５で示されるアミノ酸配列は、配列番号３２で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。
　（５－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号４３、配列番号４４又は配列番号４５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（５－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号４３、配列番号４４又は配列番号４５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（５－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号４３、配列番号４４又は配列番号４５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
　第５の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉｉｉ）配列番号４６（ＰＲＴ７２０）、配列番号４７（ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号４８（ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｖ）配列番号４６、配列番号４７若しくは配列番号４８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号３５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（５－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号４６、配列番号４７又は配列番号４８で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（５－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号４６、配列番号４７又は配列番号４８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（５－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号４６、配列番号４７又は配列番号４８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
　第５の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第６の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第６の改変フィブロインの好ましい態様等は、上述のとおりである。
　本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維における改変フィブロインとしては、水との接触及びその後の乾燥による寸法変化（伸長及び収縮）の際、当該伸長と収縮の程度が同程度（復元率が１００％に近い）であり、元の長さに戻ることができるという特性を有することに加え、水との接触及びその後の乾燥による寸法変化が低減されていることから、第６の改変フィブロインであることが好ましい。
　本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維は、改変フィブロインを紡糸した原料繊維を水により収縮させる収縮工程を備える製造方法により得ることができる。収縮工程は、例えば、原料繊維（紡糸後、水と接触する前の原料繊維）を、水と接触させて不可逆的に収縮させるステップ（接触ステップ）を備えるものであってよい。収縮工程は、接触ステップの後、繊維を乾燥させて更に収縮させるステップ（乾燥ステップ）を備えるものであってもよい。
　原料繊維は、公知の紡糸方法を利用して製造することができる。具体的には例えば、上述したフィブロイン繊維の紡糸方法に従って、製造することができる。
　図３は、原料繊維を製造するための紡糸装置の一例を概略的に示す説明図である。図３に示す紡糸装置１０は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、未延伸糸製造装置２と、湿熱延伸装置３と、乾燥装置４とを有している。
　紡糸装置１０を使用した紡糸方法を説明する。まず、貯槽７に貯蔵されたドープ液６が、ギアポンプ８により口金９から押し出される。ラボスケールにおいては、ドープ液をシリンダーに充填し、シリンジポンプを用いてノズルから押し出してもよい。次いで、押し出されたドープ液６は、エアギャップ１９を経て、凝固液槽２０の凝固液１１内に供給され、溶媒が除去されて、改変フィブロインが凝固し、繊維状凝固体が形成される。次いで、繊維状凝固体が、延伸浴槽２１内の温水１２中に供給されて、延伸される。延伸倍率は供給ニップローラ１３と引き取りニップローラ１４との速度比によって決まる。その後、延伸された繊維状凝固体が、乾燥装置４に供給され、糸道２２内で乾燥されて、原料繊維が、巻糸体５として得られる。１８ａ～１８ｇは糸ガイドである。
　凝固液１１としては、脱溶媒できる溶媒であればよく、例えば、メタノール、エタノール及び２－プロパノール等の炭素数１～５の低級アルコール、並びにアセトン等を挙げることができる。凝固液１１は、適宜水を含んでいてもよい。凝固液１１の温度は、０～３０℃であることが好ましい。口金９として、直径０．１～０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプを使用する場合、押出し速度は１ホール当たり、０．２～６．０ｍｌ／時間が好ましく、１．４～４．０ｍｌ／時間であることがより好ましい。凝固したタンパク質が凝固液１１中を通過する距離（実質的には、糸ガイド１８ａから糸ガイド１８ｂまでの距離）は、脱溶媒が効率的に行える長さがあればよく、例えば、２００～５００ｍｍである。未延伸糸の引き取り速度は、例えば、１～２０ｍ／分であってよく、１～３ｍ／分であることが好ましい。凝固液１１中での滞留時間は、例えば、０．０１～３分であってよく、０．０５～０．１５分であることが好ましい。また、凝固液１１中で延伸（前延伸）をしてもよい。凝固液槽２０は多段設けてもよく、また延伸は必要に応じて、各段、又は特定の段で行ってもよい。
　なお、原料繊維を得る際に実施される延伸は、例えば、上記した凝固液槽２０内で行う前延伸、及び延伸浴槽２１内で行う湿熱延伸の他、乾熱延伸も採用される。
　湿熱延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中、又はスチーム加熱中で行うことができる。温度としては、例えば、５０～９０℃であってよく、７５～８５℃が好ましい。湿熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、１～１０倍延伸することができ、２～８倍延伸することが好ましい。
　乾熱延伸は、電気管状炉、乾熱板等を使用して行うことができる。温度としては、例えば、１４０℃～２７０℃であってよく、１６０℃～２３０℃が好ましい。乾熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、０．５～８倍延伸することができ、１～４倍延伸することが好ましい。
　湿熱延伸及び乾熱延伸はそれぞれ単独で行ってもよく、またこれらを多段で、又は組み合わせて行ってもよい。すなわち、一段目延伸を湿熱延伸で行い、二段目延伸を乾熱延伸で行う、又は一段目延伸を湿熱延伸行い、二段目延伸を湿熱延伸行い、更に三段目延伸を乾熱延伸で行う等、湿熱延伸及び乾熱延伸を適宜組み合わせて行うことができる。
　最終的な延伸倍率は、その下限値が、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、好ましくは、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上のうちのいずれかであり、上限値が、好ましくは４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、１０倍以下である。原料繊維が２倍以上の延伸倍率で紡糸された繊維であると、原料繊維を水に接触させて湿潤状態にした際の収縮率は、より高くなる。
　図２に示すとおり、原料繊維（改変フィブロインを含む繊維）は、水に接触（湿潤）させることにより収縮する（図２中、「一次収縮」で示した長さ変化）特性を有する。一次収縮後、乾燥させると更に収縮する（図２中、「二次収縮」で示した長さ変化）。二次収縮後、再度水に接触させると二次収縮前と同一又はそれに近似した長さにまで伸長し、以後乾燥と湿潤を繰り返すと、二次収縮と同程度の幅（図２中、「伸縮率」で示した幅）で、収縮と伸長を繰り返す。したがって、少なくとも接触ステップを含む収縮工程を備える製造方法により、本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維を得ることができる。
　接触ステップでの原料繊維（改変フィブロインを含む繊維）の不可逆的な収縮（図２中の「一次収縮」）は、例えば、以下の理由により生ずると考えられる。すなわち、一つの理由は、原料繊維（改変フィブロインを含む繊維）の二次構造や三次構造に起因すると考えられ、また別の一つの理由は、例えば、製造工程での延伸等によって残留応力を有する原料繊維（改変フィブロインを含む繊維）において、水が繊維間又は繊維内へ浸入することにより、残留応力が緩和されることで生ずると考えられる。したがって、収縮工程での原料繊維（改変フィブロインを含む繊維）の収縮率は、例えば、上記した原料繊維（改変フィブロインを含む繊維）の製造過程での延伸倍率の大きさに応じて任意にコントロールすることもできると考えられる。
　接触ステップでは、紡糸後、水と接触する前の原料繊維を水と接触させて、原料繊維を湿潤状態にする。湿潤状態とは、原料繊維の少なくとも一部が水で濡れた状態を意味する。これにより、外力によらずに原料繊維を収縮させることができる。この収縮は不可逆的なものである（図２の「一次収縮」に相当する）。
　接触ステップで原料繊維に接触させる水の温度は、沸点未満であってよい。これにより、取扱い性及び収縮工程の作業性等が向上する。また、収縮時間を充分に短縮するという観点からは、水の温度の下限値が、１０℃以上であることが好ましく、４０℃以上であることがより好ましく、７０℃以上であることが更に好ましい。水の温度の上限値は９０℃以下であることが好ましい。
　接触ステップにおいて、水を原料繊維に接触させる方法は、特に限定されない。当該方法として、例えば、原料繊維を水中に浸漬する方法、原料繊維に対して水を常温で又は加温したスチーム等の状態で噴霧する方法、及び原料繊維を水蒸気が充満した高湿度環境下に暴露する方法等が挙げられる。これらの方法の中でも、接触ステップにおいては、収縮時間の短縮化が効果的に図れるとともに、加工設備の簡素化等が実現できることから、原料繊維を水中に浸漬する方法が好ましい。
　接触ステップにおいて、原料繊維を弛緩させた状態で水に接触させると、原料繊維が、単に収縮するだけでなく、波打つように縮れてしまうことがある。このような縮れの発生を防止するために、例えば、原料繊維を繊維軸方向に緊張させ（引っ張り）ながら水と接触させるなど、原料繊維を弛緩させない状態で接触ステップを実施してもよい。
　本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維の製造方法は、乾燥ステップを更に備えるものであってもよい。乾燥ステップは、接触ステップを経た原料繊維（又は接触ステップを経て得られた人造改変フィブロイン繊維）を乾燥させて更に収縮させる工程である（図２の「二次収縮」に相当する）。乾燥は、例えば、自然乾燥でもよく、乾燥設備を使用して強制的に乾燥させてもよい。乾燥設備としては、接触型又は非接触型の公知の乾燥設備がいずれも使用可能である。また、乾燥温度も、例えば、原料繊維に含まれるタンパク質が分解したり、原料繊維が熱的損傷を受けたりする温度よりも低い温度であれば何ら限定されるものではないが、一般には、２０～１５０℃の範囲内の温度であり、５０～１００℃の範囲内の温度であることが好ましい。温度がこの範囲にあることにより、繊維の熱的損傷、又は繊維に含まれるタンパク質の分解が生ずることなく、繊維が、より迅速且つ効率的に乾燥される。乾燥時間は、乾燥温度等に応じて適宜に設定され、例えば、過乾燥による人造改変フィブロイン繊維の品質及び物性等への影響が可及的に排除され得る時間等が採用される。
　本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維は、例えば、上述の製造方法により得られるものであるため、紡糸過程での延伸により生じる残留応力を実質的に含まないものである。
　本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維は、下記式（１）で定義される復元率が９５％以上であってよい。
　式（１）：復元率＝（湿潤状態から乾燥した際の人造改変フィブロイン繊維の長さ／湿潤状態にする前の人造改変フィブロイン繊維の長さ）×１００（％）
　式（１）で定義される復元率が高い程、湿潤／乾燥時において、より元の長さに戻ることができるといえる。本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維は、式（１）で定義される復元率が９６％以上であることが好ましく、９７％以上であることがより好ましく、９８％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが更により好ましい。
　本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維は、下記式（４）で定義される伸長率が１７％以下であってもよい。式（４）で定義される伸長率は、人造改変フィブロイン繊維を湿潤状態にした際の伸長特性の指標となる。
　式（４）：伸長率＝｛（湿潤状態にした際の人造改変フィブロイン繊維の長さ／湿潤状態にする前の人造改変フィブロイン繊維の長さ）－１｝×１００（％）
　式（４）で定義される伸長率の上限としては、１５％以下、１３％以下、１０％以下又は５％以下が例示され、下限としては、０％超、１％以上、２％以上、５％以上、１０％以上又は１３％以上が例示される。式（４）で定義される伸長率は、例えば、０％超かつ１７％以下であってよく、０％超かつ１５％以下であってよく、２％以上かつ１５％以下であってもよく、５％以上かつ１５％以下であってもよく、５％以上かつ１３％以下であってもよく、５％以上かつ１０％以下であってもよく、０％超かつ１０％以下であってもよく、０％超かつ５％以下であってもよい。
　本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維は、下記式（５）で定義される収縮率Ｃが１７％以下であってもよい。式（５）で定義される収縮率Ｃは、人造改変フィブロイン繊維を湿潤状態から乾燥した際の収縮特性の指標となる。
　式（５）：収縮率Ｃ＝｛１－（湿潤状態から乾燥した際の人造改変フィブロイン繊維の長さ／湿潤状態にした際の人造改変フィブロイン繊維の長さ）｝×１００（％）
　式（５）で定義される収縮率Ｃの上限としては、１５％以下、１３％以下、１０％以下又は５％以下が例示され、下限としては、０％超、１％以上、２％以上、５％以上、１０％以上又は１３％以上が例示される。式（５）で定義される収縮率Ｃは、例えば、０％超かつ１７％以下であってよく、０％超かつ１５％以下であってよく、２％以上かつ１５％以下であってもよく、５％以上かつ１５％以下であってもよく、５％以上かつ１３％以下であってもよく、５％以上かつ１０％以下であってもよく、０％超かつ１０％以下であってもよく、０％超かつ５％以下であってもよい。
　本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維は、紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された収縮履歴を有する繊維であって、下記式（２）で定義される収縮率Ａが２％以上であることが好ましい。式（２）で定義される収縮率Ａは、原料繊維の一次収縮（図２参照）に関する特性を示す指標となる。式（２）で定義される収縮率Ａが２％以上であることにより、式（１）で定義される復元率がより高いものとなる。
　式（２）：収縮率Ａ＝｛１－（紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された繊維の長さ／紡糸後、水と接触する前の繊維の長さ）｝×１００（％）
　式（２）で定義される収縮率Ａは、２．５％以上、３％以上、３．５％以上、４％以上、４．５％以上、５％以上、５．５％以上、６％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上又は２５％以上であってよい。式（２）で定義される収縮率Ａの上限は特に限定されないが、８０％以下、６０％以下、４０％以下、２０％以下、１０％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、又は３％以下であってよい。
　本実施形態に係る人造改変フィブロイン繊維は、紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された後、乾燥により更に収縮された収縮履歴を有する繊維であって、下記式（３）で定義される収縮率Ｂが７％超であることが好ましい。式（３）で定義される収縮率Ｂは、原料繊維の一次収縮及び二次収縮（図２参照。）に関する特性を示す指標となる。式（３）で定義される収縮率Ｂが７％超であることにより、式（１）で定義される復元率がより高いものとなる。
　式（３）：収縮率Ｂ＝｛１－（紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された後、乾燥により更に収縮された繊維の長さ／紡糸後、水と接触する前の繊維の長さ）｝×１００（％）
　式（３）で定義される収縮率Ｂは、１０％以上、１５％以上、２５％超、３２％以上、４０％以上、４８％以上、５６％以上、６４％以上又は７２％以上であってよい。式（３）で定義される収縮率Ｂの上限は特に限定されないが、通常、８０％以下である。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［試験例１］
〔（１）改変フィブロインをコードする核酸の合成、及び発現ベクターの構築〕
　天然由来のフィブロインであるＮｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号８～１４及び配列番号１８～２０で示されるアミノ酸配列を有するフィブロイン及び改変フィブロインを設計した。
　配列番号８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ４１０：試験例１－１）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ４１０）のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）は、天然由来のフィブロインであるＮｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、（Ａ）ｎモチーフ中のアラニン残基が連続するアミノ酸配列をアラニン残基が連続する数を５つにする等の生産性を向上させるためのアミノ酸の改変を行ったものである。一方、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）は、グルタミン残基（Ｑ）の改変は行っていないため、グルタミン残基含有率は、天然由来のフィブロインのグルタミン残基含有率と同程度である。
　配列番号９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ８８８：試験例１－２）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ８８８）のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。Ｍ＿ＰＲＴ８８８（配列番号２）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。
　配列番号１０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９６５：試験例１－３）は、配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９６５）のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。Ｍ＿ＰＲＴ９６５（配列番号３）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。
　配列番号１１で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ８８９：試験例１－４）は、配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ８８９）のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。Ｍ＿ＰＲＴ８８９（配列番号４）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号１２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９１６：試験例１－５）は、配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１６）のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。Ｍ＿ＰＲＴ９１６（配列番号５）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。
　配列番号１３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９１８：試験例１－６）は、配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１８）のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。Ｍ＿ＰＲＴ９１８（配列番号６）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号１４で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ７２０：試験例１－７）は、ＰＲＴ４１０（配列番号８）に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、かつＰＲＴ４１０（配列番号８）の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。
　配列番号１８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ５２５：試験例１－８）は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ５２５）のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号１５）は、Ｍ＿ＰＲＴ４１０（配列番号１）に対し、アラニン残基が連続する領域（Ａ５）に２つのアラニン残基を挿入し、Ｍ＿ＰＲＴ４１０の分子量とほぼ同じになるよう、Ｃ末端側のドメイン配列２つを欠失させ、かつグルタミン残基（Ｑ）１３箇所をセリン残基（Ｓ）又はプロリン残基（Ｐ）に置換したものである。
　配列番号１９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ６９９：試験例１－９）は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ６９９）のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。Ｍ＿ＰＲＴ６９９（配列番号１６）は、Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号１５）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。
　配列番号２０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ６９８：試験例１－１０）は、配列番号１７で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ６９８）のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。Ｍ＿ＰＲＴ６９８（配列番号１７）は、Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号１５）中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　設計した配列番号８～１４及び配列番号１８～２０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸をそれぞれ合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。これら５種類の核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
〔（２）タンパク質の発現〕
　配列番号８～１４及び配列番号１８～２０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液をアンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表５）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表６）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加して形質転換大腸菌を植菌した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするタンパク質の発現を確認した。
〔（３）タンパク質の精製〕
　ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ　グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。
〔（４）紡糸液（ドープ液）の調製〕
　４質量％になるように塩化リチウムを溶解したＤＭＳＯを溶媒として用い、上記で調製したＰＲＴ４１０（配列番号８：試験例１－１）、ＰＲＴ８８８（配列番号９：試験例１－２）、ＰＲＴ９６５（配列番号１０：試験例１－３）、ＰＲＴ８８９（配列番号１１：試験例１－４）、ＰＲＴ９１６（配列番号１２：試験例１－５）、ＰＲＴ９１８（配列番号１３：試験例１－６）及びＰＲＴ７２０（配列番号１４：試験例１－７）タンパク質の凍結乾燥粉末を、それぞれ濃度２４質量％となるように、溶媒に添加した。９０℃のアルミブロックヒーターで１時間溶解させた後、不溶物と泡を取り除き、紡糸液（ドープ液）とした。
〔（５）紡糸〕
　紡糸液をリザーブタンクに充填し、０．１又は０．２ｍｍ径のモノホールノズルからギアポンプを用い１００質量％メタノール凝固浴槽中へ吐出させた。吐出量は０．０１～０．０８ｍＬ／分に調整した。凝固後、１００質量％メタノール洗浄浴槽で洗浄及び延伸を行った。洗浄及び延伸後、乾熱板を用いて乾燥させ、得られた原糸（フィブロイン繊維）を巻き取った。
〔（６）フィブロイン繊維の収縮性評価〕
　得られた原糸を長さ約３０ｃｍに揃えて、束ね、繊度１５０デニールのフィブロイン繊維束とした。各フィブロイン繊維束に０．８ｇの鉛錘を取り付け、その状態でフィブロイン繊維束を４０℃の水に１０分間浸漬して一次収縮させ、水中でフィブロイン繊維束の長さを測定した。一次収縮したフィブロイン繊維束を水中から取り出し、０．８ｇの鉛錘を取り付けたまま、室温で２時間おいて乾燥させた。乾燥後、各フィブロイン繊維束の長さを測定した。この湿潤及び乾燥の操作を３回繰り返し、湿潤時の平均の長さ（Ｌｗｅｔ：単位ｃｍ）、乾燥時の平均の長さ（Ｌｄｒｙ：単位ｃｍ）を求め、下記式に従って二次収縮率を算出した。結果を表７に示す。
　二次収縮率（％）＝｛１－（Ｌｄｒｙ／Ｌｗｅｔ）｝×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　ＰＲＴ７２０（試験例１－７）は、ＰＲＴ４１０（試験例１－１）に疎水性アミノ酸残基を挿入したアミノ酸配列を有する。疎水性アミノ酸残基の挿入により、ＰＲＴ４１０（試験例１－１）と比較して、ＰＲＴ７２０（試験例１－７）のグルタミン残基含有率は若干低下し、かつＲＥＰの疎水性度が顕著に高くなっている。しかし、ＰＲＴ７２０（試験例１－７）タンパク質で紡糸した繊維、及びＰＲＴ４１０（試験例１－１）タンパク質で紡糸した繊維は、二次収縮率に差はなかった（表７の試験例１－１及び試験例１－７）。この結果から、単に疎水性度を高くしても二次収縮率の低減は期待できないことが分かった。
　一方、ドメイン内のグルタミン残基（Ｑ）を別のアミノ酸残基に置換することにより、グルタミン残基含有率を低減させ（６．３％）、ＰＲＴ７２０（試験例１－７）とほぼ同じＲＥＰの疎水性度となるように設計したＰＲＴ８８８（配列番号９）では、顕著な二次収縮率の低減効果が認められた（表７の試験例１－２）。この二次収縮率の低減効果は、グルタミン残基含有率を更に低下（０％）させることにより、ＲＥＰの疎水性度をＰＲＴ８８８のように高めなくても認められた（表７の試験例１－３）。また、グルタミン残基含有率を更に低下（０％）させると共に、さらに疎水性度の高いアミノ酸残基に置換することにより、二次収縮率の低減効果がより顕著に認められた（表７の試験例１－４～試験例１－６）。
〔（７）フィルム作製用ドープ液の調製〕
　ＰＲＴ４１０（配列番号８：試験例１－１）、ＰＲＴ５２５（配列番号１８：試験例１－８）、ＰＲＴ６９９（配列番号１９：試験例１－９）及びＰＲＴ６９８（配列番号２０：試験例１－１０）タンパク質の凍結乾燥粉末を９９％ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）に濃度１０質量％となるように添加し、５５℃、４００ｒｐｍの条件で２０分間振盪し、溶解させ、ドープ液とした。
〔（８）フィルムキャスト成形〕
　厚さ７５μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた離形フィルム（三井化学東セロ株式会社製、商品番号“ＳＰ－ＰＥＴ－０１－７５－ＢＵ”）を基板として使用した。バッチ式塗工機（井元製作所製）を使用して、送り速度２０ｍｍ／秒、スリット幅０．１８ｍｍの条件で、上記で調製したドープ液を基板の表明にキャスト成形し、濡れ膜を作製した。
〔（９）乾燥及び脱溶媒〕
　成形した濡れ膜を、５５℃の恒温槽（ｅｓｐｅｃ社製）中で１２時間静置し、乾燥した。その後、乾燥フィルムを基板から剥離し、メタノールに１２時間浸漬した。浸漬後、再度６０℃の恒温槽（ｅｓｐｅｃ社製）中で１２時間静置し、乾燥した。得られたフィルムを３０ｍｍ角に切断し、以下の耐水性評価を行った。
〔（１０）フィルムの耐水性評価〕
　硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４・Ｈ２Ｏ）の飽和水溶液を入れたファルコンチューブに、３０ｍｍ角に切断したフィルムを、水溶液に浸からないように設置し、９８％の高湿度下で４８時間静置した。静置後のフィルムの水分含量を、カールフィッシャー（京都電子工業株式会社製）で吸湿の程度を測定することで水分率（％）として求めた。結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　グルタミン残基含有率の低下に伴い、フィルムの吸水性が低下することが確認され、耐水性が向上することが分かった。
［試験例２］
〔（１）改変フィブロインの製造〕
　配列番号２３で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ９１７）、及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ１０２８）を設計したこと以外は、試験例１と同様の手順で、改変フィブロインの凍結乾燥粉末を得た。
〔（２）原料繊維の製造〕
　４質量％になるように塩化リチウムを溶解させたＤＭＳＯを溶媒として用い、そこに改変フィブロインの凍結乾燥粉末を、濃度２４質量％となるように添加した。９０℃のアルミブロックヒーターで１時間溶解させた後、不溶物と泡を取り除き、ドープ液（紡糸原液）とした。
　ドープ液をリザーブタンクに充填し、０．３ｍｍ径のモノホールノズルからギアポンプを用い１００質量％メタノール凝固浴槽中（凝固浴温度１２℃）へ吐出させた。凝固後、１００質量％メタノール洗浄浴槽で洗浄及び延伸を行った。洗浄及び延伸後、乾熱板を用いて乾燥させ（乾燥温度８０℃）、得られた原糸（原料繊維）を巻き取った。延伸倍率は６倍であった。
〔（３）人造改変フィブロイン繊維の製造〕
　各原料繊維を、それぞれ長さ約３０ｃｍに揃えて束ね、繊度１５０デニールの原料繊維束とした。各原料繊維束に０．８ｇの鉛錘を取り付け、その状態で原料繊維束を４０℃の水に１０分間浸漬して収縮させた後（接触ステップ）、水中から取り出し、０．８ｇの鉛錘を取り付けたまま、室温で２時間おいて乾燥させて（乾燥ステップ）、互いにタンパク質の種類が異なる、試験例２－１～試験例２－２の人造改変フィブロイン繊維を得た。
〔（４）人造改変フィブロイン繊維の評価（水伸縮性）〕
　（３）で得られた試験例２－１～試験例２－２の人造改変フィブロイン繊維の乾燥状態での長さ（湿潤状態にする前の人造改変フィブロイン繊維の長さ）をそれぞれ測定した。次いで、各人造改変フィブロイン繊維に０．８ｇの鉛錘を取り付け、その状態で原料繊維束を４０℃の水に１０分間浸漬した。その後、水中で各人造改変フィブロイン繊維の長さ（湿潤状態にした際の人造改変フィブロイン繊維の長さ）を測定した。水中での各人造改変フィブロイン繊維の長さ測定は、各人造改変フィブロイン繊維の縮れを無くすために、各人造改変フィブロイン繊維に０．８ｇの鉛錘を取り付けたまま実施した。次いで、水中から取り出した各人造改変フィブロイン繊維を、０．８ｇの鉛錘を取り付けたまま、室温で２時間おいて乾燥させた。乾燥後、各人造改変フィブロイン繊維の長さ（湿潤状態から乾燥した際の人造改変フィブロイン繊維の長さ）を測定した。得られた測定値から、下記式（１）、式（４）及び式（５）に従って、各人造改変フィブロイン繊維の復元率、伸長率及び収縮率Ｃを算出した。結果を表９に示す。
　式（１）：復元率＝（湿潤状態から乾燥した際の人造改変フィブロイン繊維の長さ／湿潤状態にする前の人造改変フィブロイン繊維の長さ）×１００（％）
　式（４）：伸長率＝｛（湿潤状態にした際の人造改変フィブロイン繊維の長さ／湿潤状態にする前の人造改変フィブロイン繊維の長さ）－１｝×１００（％）
　式（５）：収縮率Ｃ＝｛１－（湿潤状態から乾燥した際の人造改変フィブロイン繊維の長さ／湿潤状態にした際の人造改変フィブロイン繊維の長さ）｝×１００（％）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示すとおり、グルタミン残基含有率を低減させた改変フィブロインを含む人造改変フィブロイン繊維（試験例２－１～試験例２－２）は、湿潤状態で伸長し、その後乾燥すると元の長さに戻る（復元率９８．２～９９％）という特性を有している。また、人造改変フィブロイン繊維（試験例２－１～試験例２－２）は、伸長率及び収縮率Ｃ共に低く抑えられており、水との接触（及びその後の乾燥）における寸法変化が抑制されている。
［試験例３］
〔（１）改変フィブロインの製造〕
　配列番号４２で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ３９９）、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ３８０）、配列番号３７で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ４１０）、配列番号３９で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ７９９）を設計したこと以外は、試験例１と同様の手順で、改変フィブロインの凍結乾燥粉末を得た。
〔（２）原料繊維の製造〕
　４．０質量％になるように塩化リチウムを溶解させたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を溶媒として用い、そこに改変フィブロインの凍結乾燥粉末を、濃度１８質量％又は２４質量％となるよう添加し（表１０参照）、シェーカーを使用して３時間溶解させた。その後、不溶物と泡を取り除き、改変フィブロイン溶液を得た。
　得られた改変フィブロイン溶液をドープ液（紡糸原液）とし、図３に示す紡糸装置１０に準じた紡糸装置を用いた乾湿式紡糸によって、紡糸及び延伸された原料繊維を製造した。用いた紡糸装置は、図３に示す紡糸装置１０において、未延伸糸製造装置２（第１浴）及び湿熱延伸装置３（第３浴）の間に、更に第２の未延伸糸製造装置（第２浴）を備えるものである。乾湿式紡糸の条件は以下のとおりである。
　押出しノズル直径：０．２ｍｍ
　第１浴～第３浴中の液体及び温度：表１０参照
　総延伸倍率：表１０参照
　乾燥温度：６０℃
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
〔（３）人造改変フィブロイン繊維の製造、並びに収縮率Ａ及び収縮率Ｂの評価〕
　製造例１～１９で得た各原料繊維に対し、水に接触させる接触ステップを施すこと、又は当該接触ステップを施した後、室温で乾燥させる乾燥ステップを施すことにより、人造改変フィブロイン繊維を製造した。
＜接触ステップにおける収縮率Ａの評価＞
　製造例１～１９で得た原料繊維の巻回物から、それぞれ、長さ３０ｃｍの複数本の原料繊維を切り出した。それら複数本の原料繊維を束ねて、繊度１５０デニールの原料繊維束を得た。各原料繊維束に０．８ｇの鉛錘を取り付け、その状態で各原料繊維束を表１１～１４に示す温度の水に１０分間浸漬した（接触ステップ）。その後、水中で各原料繊維束の長さを測定した。水中での原料繊維束の長さ測定は、原料繊維束の縮れを無くすために、原料繊維束に０．８ｇの鉛錘を取り付けたまま実施した。次いで、各原料繊維に対して、収縮率Ａ（％）を、下記式（２）に従って算出した。式（２）中、Ｌ０は、紡糸後、水と接触する前の繊維の長さを示し、ここでは３０ｃｍである。同様に、式（２）中、Ｌｗは、紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された繊維の長さを示し、ここでは水中で測定した各原料繊維束の長さである。
　式（２）：収縮率Ａ＝｛１－（Ｌｗ／Ｌ０）｝×１００（％）
＜乾燥ステップにおける収縮率Ｂの評価＞
　接触ステップの後、原料繊維束を水中から取り出した。取り出した原料繊維束を、０．８ｇの鉛錘を取り付けたまま、室温で２時間おいて乾燥させて（乾燥ステップ）、人造改変フィブロイン繊維を得た。乾燥後、各人造改変フィブロイン繊維束の長さを測定した。次いで、各人造改変フィブロイン繊維に対して、収縮率Ｂ（％）を、下記式（３）に従って算出した。式（３）中、Ｌ０は、紡糸後、水と接触する前の繊維の長さを示し、ここでは３０ｃｍである。同様に、式（３）中、Ｌｗｄは、紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された後、乾燥により更に収縮された繊維の長さを示し、ここでは乾燥後に測定した各人造改変フィブロイン繊維束の長さである。
　式（３）：収縮率Ｂ＝｛１－（Ｌｗｄ／Ｌ０）｝×１００（％）
　結果を表１１～１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　１…押出し装置、２…未延伸糸製造装置、３…湿熱延伸装置、４…乾燥装置、６…ドープ液、１０…紡糸装置、２０…凝固液槽、２１…延伸浴槽、３６…原料繊維。

Claims (40)

  1. 　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインであって、
    　前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当する、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する、改変フィブロイン。
    ［式１及び式２中、（Ａ）ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
  2. 　ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸ（但し、Ｘはグリシン残基以外のアミノ酸残基を示す。）モチーフを含み、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上である、請求項１に記載の改変フィブロイン。
  3. 　グルタミン残基含有率が９％以下である、請求項１又は２に記載の改変フィブロイン。
  4. 　前記他のアミノ酸残基が、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択されるアミノ酸残基である、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変フィブロイン。
  5. 　ＲＥＰの疎水性度が、－０．８以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載の改変フィブロイン。
  6. 　天然由来のフィブロインと比較して、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変フィブロイン。
  7. 　前記天然由来のフィブロインが、昆虫又はクモ類由来のフィブロインである、請求項６に記載の改変フィブロイン。
  8. 　前記天然由来のフィブロインが、クモ類の大瓶状スパイダータンパク質（ＭａＳｐ）又は小瓶状スパイダータンパク質（ＭｉＳｐ）である、請求項７に記載の改変フィブロイン。
  9. 　配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６若しくは配列番号１７で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６若しくは配列番号１７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン。
  10. 　更に、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の改変フィブロイン。
  11. 　前記タグ配列が、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の改変フィブロイン。
  12. 　配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９若しくは配列番号２０で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９若しくは配列番号２０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン。
  13. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変フィブロインをコードする核酸。
  14. 　請求項１３に記載の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインをコードする核酸。
    ［式１及び式２中、（Ａ）ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
  15. 　請求項１３に記載の核酸と９０％以上の配列同一性を有し、かつ式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインをコードする核酸。
    ［式１及び式２中、（Ａ）ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
  16. 　請求項１３～１５のいずれか一項に記載の核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクター。
  17. 　プラスミドベクター又はウイルスベクターである、請求項１６に記載の発現ベクター。
  18. 　請求項１６又は１７に記載の発現ベクターで形質転換された宿主。
  19. 　原核生物である、請求項１８に記載の宿主。
  20. 　前記原核生物が、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属からなる群より選択される属に属する微生物である、請求項１９に記載の宿主。
  21. 　真核生物である、請求項１８に記載の宿主。
  22. 　前記真核生物が、酵母、糸状真菌又は昆虫細胞である、請求項２１に記載の宿主。
  23. 　前記酵母が、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クリベロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピキア属、キャンディダ属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属からなる群より選択される属に属する酵母である、請求項２２に記載の宿主。
  24. 　前記サッカロマイセス属に属する酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、前記シゾサッカロマイセス属に属する酵母が、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）であり、前記クリベロマイセス属に属する酵母が、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）であり、前記トリコスポロン属に属する酵母が、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）であり、前記シワニオミセス属に属する酵母が、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ）であり、前記ピキア属に属する酵母が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、前記キャンディダ属に属する酵母が、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）であり、前記ヤロウィア属に属する酵母が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、前記ハンゼヌラ属に属する酵母が、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である、請求項２３に記載の宿主。
  25. 　前記糸状真菌が、アスペルギルス属、ペニシリウム属及びムコア属からなる群より選択される属に属する糸状真菌である、請求項２２に記載の宿主。
  26. 　前記アスペルギルス属に属する糸状真菌が、アスペルギルス・オリゼであり、前記ペニシリウム属に属する糸状真菌が、ペニシリウム・クリゾゲナムであり、前記ムコア属に属する糸状真菌が、ムコア・フラギリスである、請求項２５に記載の宿主。
  27. 　前記昆虫細胞が、鱗翅類の昆虫細胞である、請求項２２に記載の宿主。
  28. 　前記昆虫細胞が、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来の昆虫細胞、又はイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）由来の昆虫細胞である、請求項２７に記載の宿主。
  29. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変フィブロインを含み、
    　繊維、糸、フィルム、発泡体、粒体、ナノフィブリル、ゲル及び樹脂からなる群から選択される、製品。
  30. 　改変フィブロインを含む人造改変フィブロイン繊維であって、湿潤状態にした際に伸長し、かつ湿潤状態から乾燥した際に収縮する、人造改変フィブロイン繊維。
  31. 　下記式（１）で定義される復元率が９５％以上である、請求項３０に記載の人造改変フィブロイン繊維。
    　復元率＝（湿潤状態から乾燥した際の人造改変フィブロイン繊維の長さ／湿潤状態にする前の人造改変フィブロイン繊維の長さ）×１００（％）　・・・（１）
  32. 　前記人造改変フィブロイン繊維は、紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された収縮履歴を有する繊維であり、
    　下記式（２）で定義される収縮率Ａが２％以上である、請求項３０又は３１に記載の人造改変フィブロイン繊維。
    　収縮率Ａ＝｛１－（紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された繊維の長さ／紡糸後、水と接触する前の繊維の長さ）｝×１００（％）　・・・（２）
  33. 　前記人造改変フィブロイン繊維は、紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された後、乾燥により更に収縮された収縮履歴を有する繊維であり、
    　下記式（３）で定義される収縮率Ｂが７％超である、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の人造改変フィブロイン繊維。
    　収縮率Ｂ＝｛１－紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された後、乾燥により更に収縮された繊維の長さ／紡糸後、水と接触する前の繊維の長さ）｝×１００（％）　・・・（３）
  34. 　前記改変フィブロインが、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変フィブロインである、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の人造改変フィブロイン繊維。
  35. 　下記式（４）で定義される伸長率が１７％以下である、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の人造改変フィブロイン繊維。
    　伸長率＝｛（湿潤状態にした際の人造改変フィブロイン繊維の長さ／湿潤状態にする前の人造改変フィブロイン繊維の長さ）－１｝×１００（％）　・・・（４）
  36. 　下記式（５）で定義される収縮率Ｃが１７％以下である、請求項３０～３５のいずれか一項に記載の人造改変フィブロイン繊維。
    　収縮率Ｃ＝｛１－（湿潤状態から乾燥した際の人造改変フィブロイン繊維の長さ／湿潤状態にした際の人造改変フィブロイン繊維の長さ）｝×１００（％）　・・・（５）
  37. 　紡糸後、水と接触する前の原料繊維を、水と接触させて不可逆的に収縮させた後、乾燥させて更に収縮させる収縮工程を備え、
    　前記原料繊維が、改変フィブロインを含む、人造改変フィブロイン繊維の製造方法。
  38. 　前記原料繊維は、下記式（２）で定義される収縮率Ａが２％以上の繊維である、請求項３７に記載の製造方法。
    　収縮率Ａ＝｛１－（紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された繊維の長さ／紡糸後、水と接触する前の繊維の長さ）｝×１００（％）　・・・（２）
  39. 　前記原料繊維は、下記式（３）で定義される収縮率Ｂが７％超の繊維である、請求項３７又は３８に記載の製造方法。
    　収縮率Ｂ＝｛１－（紡糸後に水と接触することで不可逆的に収縮された後、乾燥により更に収縮された繊維の長さ／紡糸後、水と接触する前の繊維の長さ）｝×１００（％）　・・・（３）
  40. 　前記改変フィブロインが、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変フィブロインである、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の製造方法。
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