JPH04278091A - 高発現ベクター及び該高発現ベクター を保有する微生物並びに該微生物を 用いる有用物質の製造法 - Google Patents
高発現ベクター及び該高発現ベクター を保有する微生物並びに該微生物を 用いる有用物質の製造法Info
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、バイオテクノロジーに
関するものであリ、更に詳細には、本発明は、新規高発
現ベクター及び高発現ベクターに外来遺伝子を結合して
なるベクターをバチルス・ブレビスに保有せしめてなる
微生物、並びに該微生物を培養し、培養物中に外来遺伝
子産物を生成蓄積せしめこれを採取することを特徴とす
る該産物の製造法に関する。
関するものであリ、更に詳細には、本発明は、新規高発
現ベクター及び高発現ベクターに外来遺伝子を結合して
なるベクターをバチルス・ブレビスに保有せしめてなる
微生物、並びに該微生物を培養し、培養物中に外来遺伝
子産物を生成蓄積せしめこれを採取することを特徴とす
る該産物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】鵜高らはバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）にはプロテアーゼを生産し
ない菌株が多いことを見いだし、その１菌株バチルス・
ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４：特開昭６０
−５８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８９号公報
参照）の主要菌体外タンパク質（Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａ
ら、Ｊ・Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９（１
９８７）；塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１，６８（
１９８７）および特開昭６２−２０１５８３号公報にそ
れぞれ“ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｎｄ ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ”、“菌体外蛋白主要タンパク質”として記載され
ている。）遺伝子のプロモーターおよび該主要菌体外タ
ンパク質の１種であるＭＷタンパク質（ｍｉｄｄｌｅ
ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナルペプチドを
コードする領域を用いて分泌ベクターを作製し、本菌株
を宿主としてα−アミラーゼ（特開昭６２−２０１５８
３号公報、Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１６９，１２３９（１９８７）やブタペプシ
ノーゲン（鵜高重三、日本農芸化学会昭和６２年度大会
講演要旨集、ｐ８３７−８３８；塚越規弘、日本農芸化
学会誌、６１，６８（１９８７））の分泌生産に成功し
ている。
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）にはプロテアーゼを生産し
ない菌株が多いことを見いだし、その１菌株バチルス・
ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４：特開昭６０
−５８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８９号公報
参照）の主要菌体外タンパク質（Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａ
ら、Ｊ・Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９（１
９８７）；塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１，６８（
１９８７）および特開昭６２−２０１５８３号公報にそ
れぞれ“ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｎｄ ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ”、“菌体外蛋白主要タンパク質”として記載され
ている。）遺伝子のプロモーターおよび該主要菌体外タ
ンパク質の１種であるＭＷタンパク質（ｍｉｄｄｌｅ
ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナルペプチドを
コードする領域を用いて分泌ベクターを作製し、本菌株
を宿主としてα−アミラーゼ（特開昭６２−２０１５８
３号公報、Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１６９，１２３９（１９８７）やブタペプシ
ノーゲン（鵜高重三、日本農芸化学会昭和６２年度大会
講演要旨集、ｐ８３７−８３８；塚越規弘、日本農芸化
学会誌、６１，６８（１９８７））の分泌生産に成功し
ている。
【０００３】また、高木らはバチルス・ブレビスの中で
プロテアーゼを菌体外に生産しない菌株バチルス・ブレ
ビスＨＰＤ３１（なお、この菌株は本明細書におけるバ
チルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８
７）と同一菌株である）を分離し、これを宿主として耐
熱性α−アミラーゼの高分泌生産（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５８，２７７９−２３８０（１９８９
））や、山形らによるヒトＥＧＦの高分泌生産（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３５
８９−３５９３（１９８９））に成功している。
プロテアーゼを菌体外に生産しない菌株バチルス・ブレ
ビスＨＰＤ３１（なお、この菌株は本明細書におけるバ
チルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８
７）と同一菌株である）を分離し、これを宿主として耐
熱性α−アミラーゼの高分泌生産（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５８，２７７９−２３８０（１９８９
））や、山形らによるヒトＥＧＦの高分泌生産（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３５
８９−３５９３（１９８９））に成功している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】バチルス・ブレビスを
宿主菌とする外来遺伝子産物の生産性については、遺伝
子組換え技術を適用する以前の生産量及び大腸菌を宿主
菌とする系に比べ飛躍的に向上しているが、産業上必要
な量を安価に供給するにはもう一段の技術開発が必要と
されている。従来、バチルス・ブレビスを宿主菌とする
系で使用しているベクターは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のｐＵＢ１１０をベースと
するもので、バチルス・ブレビス内に安定に保持するた
めには抗生物質等の薬剤の存在が必須であること、また
高コピープラスミドであり、短期間に多量の遺伝子発現
が起こるために、宿主菌であるバチルス・ブレビスに重
大なダメージを与え、結果として、遺伝子産物の生産が
少ないと言うことが頻繁に認められ、より安定でかつ宿
主菌と適合性、調和性のよいベクターの開発が望まれて
いた。
宿主菌とする外来遺伝子産物の生産性については、遺伝
子組換え技術を適用する以前の生産量及び大腸菌を宿主
菌とする系に比べ飛躍的に向上しているが、産業上必要
な量を安価に供給するにはもう一段の技術開発が必要と
されている。従来、バチルス・ブレビスを宿主菌とする
系で使用しているベクターは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のｐＵＢ１１０をベースと
するもので、バチルス・ブレビス内に安定に保持するた
めには抗生物質等の薬剤の存在が必須であること、また
高コピープラスミドであり、短期間に多量の遺伝子発現
が起こるために、宿主菌であるバチルス・ブレビスに重
大なダメージを与え、結果として、遺伝子産物の生産が
少ないと言うことが頻繁に認められ、より安定でかつ宿
主菌と適合性、調和性のよいベクターの開発が望まれて
いた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記した業界のニーズに
加え、更に、バチルス・ブレビスが汎用性の高い宿主と
して利用可能であること、また同菌がコンピテントな菌
を冷凍保存できること、そしてまた電気パルス法等によ
り形質転換が容易であること等に鑑み、バチルス・ブレ
ビスの工業的有用性に着目して、バチルス・ブレビスで
安定でかつ高発現のベクターを開発すべく鋭意検討した
結果、バチルス・ブレビス由来のプラスミドを利用し、
且つ、バチルス・ブレビス由来の強力なプロモータを用
いて非常に有効なベクターを構築することに成功し本発
明を完成した。
加え、更に、バチルス・ブレビスが汎用性の高い宿主と
して利用可能であること、また同菌がコンピテントな菌
を冷凍保存できること、そしてまた電気パルス法等によ
り形質転換が容易であること等に鑑み、バチルス・ブレ
ビスの工業的有用性に着目して、バチルス・ブレビスで
安定でかつ高発現のベクターを開発すべく鋭意検討した
結果、バチルス・ブレビス由来のプラスミドを利用し、
且つ、バチルス・ブレビス由来の強力なプロモータを用
いて非常に有効なベクターを構築することに成功し本発
明を完成した。
【０００６】すなわち本発明は、バチルス・ブレビスで
高発現するベクターに関するものである。また更に、本
発明はこのベクターに目的とする外来遺伝子を連結して
なる高発現ベクター、それを保有する形質転換体、及び
この形質転換体を培養することによる外来遺伝子産物の
大量分泌生産方法にも関するものである。以下、本発明
について詳しく説明する。
高発現するベクターに関するものである。また更に、本
発明はこのベクターに目的とする外来遺伝子を連結して
なる高発現ベクター、それを保有する形質転換体、及び
この形質転換体を培養することによる外来遺伝子産物の
大量分泌生産方法にも関するものである。以下、本発明
について詳しく説明する。
【０００７】本発明の高発現ベクターの構築に使用する
プラスミドはバチルス・ブレビス由来のプラスミドであ
れば何れでも良いが、例えば、バチルス・ブレビス４８
１（ＦＥＲＭ Ｐ−７５３１）より調製されるプラス
ミドｐＷＴ４８１が有効に使用される。プラスミドの調
製は既知の方法例えば田中らの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１２９，１４８７−１４９４（１９７７））
が挙げられる。
プラスミドはバチルス・ブレビス由来のプラスミドであ
れば何れでも良いが、例えば、バチルス・ブレビス４８
１（ＦＥＲＭ Ｐ−７５３１）より調製されるプラス
ミドｐＷＴ４８１が有効に使用される。プラスミドの調
製は既知の方法例えば田中らの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１２９，１４８７−１４９４（１９７７））
が挙げられる。
【０００８】プロモーターとしてはバチルス・ブレビス
で機能するものであれば何れでも良いが、バチルス・ブ
レビス由来のプロモーターが好ましく、例えばバチルス
・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）
の主要菌体外タンパク質遺伝子（ＨＷＰ遺伝子）のプロ
モーターなどが挙げられる。プロモーター領域を含有す
るＤＮＡは上記プロモーター以外にＳＤ配列、翻訳開始
コドンなどを有していることが必要である。
で機能するものであれば何れでも良いが、バチルス・ブ
レビス由来のプロモーターが好ましく、例えばバチルス
・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）
の主要菌体外タンパク質遺伝子（ＨＷＰ遺伝子）のプロ
モーターなどが挙げられる。プロモーター領域を含有す
るＤＮＡは上記プロモーター以外にＳＤ配列、翻訳開始
コドンなどを有していることが必要である。
【０００９】上記のように、バチルス・ブレビスＨＰＤ
３１のＨＷＰプロモーター領域を含有するＤＮＡは既知
であるので（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，１３
１２−１３２０（１９９０））、必要部分を制限酵素で
切断しておき、これをサブクローニング用ベクター（形
質転換体としてＥ．ｃｏｌｉを用いる場合には．ｐＵＣ
１１８、ｐＵＣ１１９等のｐＵＣ系プラスミド又はｐＢ
Ｒ３２２系のプラスミドが好適である）に挿入し、その
ＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉを形質転換しておけば、目的とす
るプロモーター領域を含有するＤＮＡが保存される。し
たがって必要ある場合に、形質転換体からプラスミドを
取り出し、必要あれば更に制限酵素処理、リンカー処理
等を行ってプラスミドを調製しておけば、目的とするプ
ロモーターを含むＤＮＡ断片を自由に取り出すことがで
きる。
３１のＨＷＰプロモーター領域を含有するＤＮＡは既知
であるので（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，１３
１２−１３２０（１９９０））、必要部分を制限酵素で
切断しておき、これをサブクローニング用ベクター（形
質転換体としてＥ．ｃｏｌｉを用いる場合には．ｐＵＣ
１１８、ｐＵＣ１１９等のｐＵＣ系プラスミド又はｐＢ
Ｒ３２２系のプラスミドが好適である）に挿入し、その
ＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉを形質転換しておけば、目的とす
るプロモーター領域を含有するＤＮＡが保存される。し
たがって必要ある場合に、形質転換体からプラスミドを
取り出し、必要あれば更に制限酵素処理、リンカー処理
等を行ってプラスミドを調製しておけば、目的とするプ
ロモーターを含むＤＮＡ断片を自由に取り出すことがで
きる。
【００１０】また、本発明の高発現ベクターに連結する
外来遺伝子はバチルス・ブレビスで発現可能な遺伝子で
あれば何れでも良く、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子、ヒトＥ
ＧＦ遺伝子等が挙げられる。
外来遺伝子はバチルス・ブレビスで発現可能な遺伝子で
あれば何れでも良く、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子、ヒトＥ
ＧＦ遺伝子等が挙げられる。
【００１１】プラスミドを構築する方法としては、常法
が適宜用いられ、例えばモレキュラー・クローニング，
ア・ラボラトリー・マニュアル，コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）に記載の方法などが例
示される。
が適宜用いられ、例えばモレキュラー・クローニング，
ア・ラボラトリー・マニュアル，コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）に記載の方法などが例
示される。
【００１２】バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ
−７２２４）のＭＷＰプロモーター領域の下流にバチル
ス・リケニフォルミスのα−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝
子を連結したＤＮＡフラグメントを保有するプラスミド
は既知であるので（Ｊ・Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９
，１２３９−１２４５（１９８７））、これに制限酵素
処理した後、上記によって調製したプラスミドから取り
出したＨＷＰプロモーター領域断片をつないでバチルス
・ブレビスを形質転換して、ＭＷＰプロモーターがＨＷ
Ｐプロモーターにかわったプラスミドを得る。このプラ
スミドを制限酵素処理、リガーゼ処理、リンカー処理す
ることによつてＢＬＡ遺伝子領域を除去した本発明の目
的とする高発現ベクターｐＨＹ７００が得られる。
−７２２４）のＭＷＰプロモーター領域の下流にバチル
ス・リケニフォルミスのα−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝
子を連結したＤＮＡフラグメントを保有するプラスミド
は既知であるので（Ｊ・Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９
，１２３９−１２４５（１９８７））、これに制限酵素
処理した後、上記によって調製したプラスミドから取り
出したＨＷＰプロモーター領域断片をつないでバチルス
・ブレビスを形質転換して、ＭＷＰプロモーターがＨＷ
Ｐプロモーターにかわったプラスミドを得る。このプラ
スミドを制限酵素処理、リガーゼ処理、リンカー処理す
ることによつてＢＬＡ遺伝子領域を除去した本発明の目
的とする高発現ベクターｐＨＹ７００が得られる。
【００１３】このようにして調製した高発現ベクターｐ
ＨＹ７００のＨＷＰプロモーター、シグナルペプチドの
下流側に、目的とする外来遺伝子を常法にしたがってｉ
ｎｆｒａｍｅ挿入し、微生物を形質転換すれば、外来遺
伝子を多量に分泌生産しうる形質転換体を得ることがで
きる。
ＨＹ７００のＨＷＰプロモーター、シグナルペプチドの
下流側に、目的とする外来遺伝子を常法にしたがってｉ
ｎｆｒａｍｅ挿入し、微生物を形質転換すれば、外来遺
伝子を多量に分泌生産しうる形質転換体を得ることがで
きる。
【００１４】外来遺伝子を組み込んだベクターで形質転
換する微生物としては、バチルス・ブレビスに属する微
生物であれば何れでも良く、例えば、バチルス・ブレビ
ス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）、バチルス・ブレ
ビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）が挙げ
られるが、好適にはバチルス・ブレビスＨＰＤ３１が用
いられる。バチルス・ブレビスを形質転換する方法は、
公知の方法で良く、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方
法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１３０（１
９８３））またはＴａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９−３１００（１
９８９））等が例示される。
換する微生物としては、バチルス・ブレビスに属する微
生物であれば何れでも良く、例えば、バチルス・ブレビ
ス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）、バチルス・ブレ
ビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）が挙げ
られるが、好適にはバチルス・ブレビスＨＰＤ３１が用
いられる。バチルス・ブレビスを形質転換する方法は、
公知の方法で良く、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方
法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１３０（１
９８３））またはＴａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９−３１００（１
９８９））等が例示される。
【００１５】得られた形質転換体の培養に用いる培地は
、形質転換体が生育して目的とする外来遺伝子産物を産
生しうるものであれば如何なるものでも良い。
、形質転換体が生育して目的とする外来遺伝子産物を産
生しうるものであれば如何なるものでも良い。
【００１６】該培地に含有される炭素源としては、例え
ばグルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、
デキストリン、糖蜜、尿素、有機酸などが考えられる。 該培地に含有される窒素源としては、カゼイン、ポリペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、グリシン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられ
る。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸
二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの
無機塩が必要に応じて培地に加えられる。また、糖と無
機窒素源を主とする合成培地を用いて培養しても良い。 栄養要求性を示す菌は、その生育に必要な栄養物質を培
地に添加すればよい。該栄養物質としては、アミノ酸類
、ビタミン類、核酸、塩類などが挙げられる。
ばグルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、
デキストリン、糖蜜、尿素、有機酸などが考えられる。 該培地に含有される窒素源としては、カゼイン、ポリペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、グリシン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられ
る。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸
二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの
無機塩が必要に応じて培地に加えられる。また、糖と無
機窒素源を主とする合成培地を用いて培養しても良い。 栄養要求性を示す菌は、その生育に必要な栄養物質を培
地に添加すればよい。該栄養物質としては、アミノ酸類
、ビタミン類、核酸、塩類などが挙げられる。
【００１７】また、培養に際して必要があれば、培地に
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリンなどが加えられる。更に必要により、消泡
剤例えば大豆油、ラード油、各種界面活性剤などを培地
に加えてもよい。
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリンなどが加えられる。更に必要により、消泡
剤例えば大豆油、ラード油、各種界面活性剤などを培地
に加えてもよい。
【００１８】培地の初発ｐＨは５．０〜９．０であり、
さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通
常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃で
あり、培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好まし
くは２４〜９６時間である。
さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通
常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃で
あり、培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好まし
くは２４〜９６時間である。
【００１９】培養終了後、それ自体公知の方法、例えば
遠心分離、ろ過などで菌体と上清とを分離する。
遠心分離、ろ過などで菌体と上清とを分離する。
【００２０】形質転換する微生物として、例えばバチル
ス・ブレビスＨＰＤ３１等を使用すれば、電気パルス法
等によって容易に形質転換することができるのみでなく
、目的とする産物を菌体外に生産するというすぐれた性
質を有しているので、上記のようにして得られた培養上
清に含まれる外来遺伝子産物は、例えば塩析、等電点沈
澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ハイドロ
オキシアパタイト、高速液体クロマトグラフィーなどに
従って精製すればよく、このようにして目的とする外来
遺伝子産物を容易に得ることが出来る。
ス・ブレビスＨＰＤ３１等を使用すれば、電気パルス法
等によって容易に形質転換することができるのみでなく
、目的とする産物を菌体外に生産するというすぐれた性
質を有しているので、上記のようにして得られた培養上
清に含まれる外来遺伝子産物は、例えば塩析、等電点沈
澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ハイドロ
オキシアパタイト、高速液体クロマトグラフィーなどに
従って精製すればよく、このようにして目的とする外来
遺伝子産物を容易に得ることが出来る。
【００２１】以下、本発明を実施例により更に詳しく説
明する。
明する。
【００２２】
【実施例１】
【００２３】［（１）ＨＷＰプロモーターの調製（図１
）］Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓＨＰＤ３１の細
胞壁構成タンパク質（ＨＷＰ）遺伝子の５’上流域（全
プロモーター領域）と構造遺伝子の約半分を含むＤＮＡ
断片を有するファージφ−ＳＫ１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１７２，１３１２−１３２０（１９９０））
よりＤＮＡを調製し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ（１９８２））、そのＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩ
とＨｐａＩで消化し、ＨＷＰ全プロモーターとそのシグ
ナルペプチドの一部を含む６４０ｂｐ断片を得た。予め
ｐＵＣ１１９をＳｍａＩで消化後、ＨｐａＩリンカーを
挿入しｐＵＣ１１９−ＨｐａＩを作製した。ｐＵＣ１１
９−ＨｐａＩをＡｃｃＩとＨｐａＩで消化し、その３．
１ｋｂ断片と先に得た６４０ｂｐ ＣｌａＩ−Ｈｐａ
Ｉ断片をＴ４リガーゼを用いて連結し、そのＤＮＡを大
腸菌ＪＭ１０９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ（１９８２））の形質転換に用い、その形質転換体か
らｐＳＫ３１Ｐを得た。ｐＳＫ３１ＰはｐＵＣ１１９−
ＨｐａＩのＡｃｏＩ−ＨｐａＩサイトに６４０ｂｐ
ＣｌａＩ−ＨｐａＩ断片が正しく挿入されていることを
ＤＮＡの塩基配列を決定して確認した。次にｐＳＫ３１
ＰをＰｖｕＩＩで消化後ＢａｍＨＩリンカーを付加し、
ｐＳＫ３１ＰＢｍを得た。ｐＳＫ３１ＰＢｍからはＨＷ
Ｐプロモーター及びシグナルペプチドの一部を８２０ｂ
ｐ ＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ断片として取り出せる。
）］Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓＨＰＤ３１の細
胞壁構成タンパク質（ＨＷＰ）遺伝子の５’上流域（全
プロモーター領域）と構造遺伝子の約半分を含むＤＮＡ
断片を有するファージφ−ＳＫ１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１７２，１３１２−１３２０（１９９０））
よりＤＮＡを調製し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ（１９８２））、そのＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩ
とＨｐａＩで消化し、ＨＷＰ全プロモーターとそのシグ
ナルペプチドの一部を含む６４０ｂｐ断片を得た。予め
ｐＵＣ１１９をＳｍａＩで消化後、ＨｐａＩリンカーを
挿入しｐＵＣ１１９−ＨｐａＩを作製した。ｐＵＣ１１
９−ＨｐａＩをＡｃｃＩとＨｐａＩで消化し、その３．
１ｋｂ断片と先に得た６４０ｂｐ ＣｌａＩ−Ｈｐａ
Ｉ断片をＴ４リガーゼを用いて連結し、そのＤＮＡを大
腸菌ＪＭ１０９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ（１９８２））の形質転換に用い、その形質転換体か
らｐＳＫ３１Ｐを得た。ｐＳＫ３１ＰはｐＵＣ１１９−
ＨｐａＩのＡｃｏＩ−ＨｐａＩサイトに６４０ｂｐ
ＣｌａＩ−ＨｐａＩ断片が正しく挿入されていることを
ＤＮＡの塩基配列を決定して確認した。次にｐＳＫ３１
ＰをＰｖｕＩＩで消化後ＢａｍＨＩリンカーを付加し、
ｐＳＫ３１ＰＢｍを得た。ｐＳＫ３１ＰＢｍからはＨＷ
Ｐプロモーター及びシグナルペプチドの一部を８２０ｂ
ｐ ＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ断片として取り出せる。
【００２４】［（２）ｐＨＹ７００の構築（図２）］Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ４７（ＦＥＲＭ Ｐ
−７２２４）のＭＷＰプロモーター及びシグナルペプチ
ド（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９−１
２４５（１９８７））の下流にＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉｓのα−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝子（Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，９６，１１４７−１１５６（１９８５）
）を直結し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓで安定に保持されるプラ
スミドｐＨＹ４８１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．，４９，１０７６−１０７９（１９８５））に
挿入したプラスミドｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１６９，１２３９−１２４５（１９８７））
をＢａｍＨＩで完全消化後、ＨＰａＩで部分消化し、（
ＭＷＰプロモーター及びシグナルの一部が除かれた）５
．５ｋｂＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ断片を得た。（１）で得
たｐＳＫ３１ＰＢｍをＢａｍＨＩとＨｐａＩで処理し、
ＨＷＰプロモーター及びシグナルの一部を含む８２０ｂ
ｐＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ断片を得、先に得た５．５ｋｂ
断片とＴ４リガーゼを用いて連結し、そのＤＮＡをＢ．
ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１の形質転換に用いた。得ら
れた形質転換株からｐＨＹ４８３１Ｈを得た。ｐＨＹ４
８３１ＨはＭＷＰプロモーターがＨＷＰプロモーターに
変わったプラスミドである。次いでｐＨＹ４８３１Ｈを
ＢａｍＨＩで消化後、ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末
端化した後Ｔ４リガーゼにてその平滑末端部分を連結し
ＢａｍＨＩ切断点を無くし、次いでそのプラスミドをＳ
ａｌＩで消化後、ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化
した後ＢａｍＨＩリンカーを付加しｐＨＹ７００を得た
（図５）。ｐＨＹ７００のＸ部分に外来（目的）遺伝子
をアミノ酸の読み取りが合う様に（ｉｎｆｒａｍｅ）挿
入し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を形質転換する
ことにより、プラスミドｐＨＹ７００Ｘ（図５）を保有
し目的遺伝子産物を多量に分泌生産する組換え体を得た
。
ａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ４７（ＦＥＲＭ Ｐ
−７２２４）のＭＷＰプロモーター及びシグナルペプチ
ド（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９−１
２４５（１９８７））の下流にＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉｓのα−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝子（Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，９６，１１４７−１１５６（１９８５）
）を直結し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓで安定に保持されるプラ
スミドｐＨＹ４８１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．，４９，１０７６−１０７９（１９８５））に
挿入したプラスミドｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１６９，１２３９−１２４５（１９８７））
をＢａｍＨＩで完全消化後、ＨＰａＩで部分消化し、（
ＭＷＰプロモーター及びシグナルの一部が除かれた）５
．５ｋｂＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ断片を得た。（１）で得
たｐＳＫ３１ＰＢｍをＢａｍＨＩとＨｐａＩで処理し、
ＨＷＰプロモーター及びシグナルの一部を含む８２０ｂ
ｐＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ断片を得、先に得た５．５ｋｂ
断片とＴ４リガーゼを用いて連結し、そのＤＮＡをＢ．
ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１の形質転換に用いた。得ら
れた形質転換株からｐＨＹ４８３１Ｈを得た。ｐＨＹ４
８３１ＨはＭＷＰプロモーターがＨＷＰプロモーターに
変わったプラスミドである。次いでｐＨＹ４８３１Ｈを
ＢａｍＨＩで消化後、ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末
端化した後Ｔ４リガーゼにてその平滑末端部分を連結し
ＢａｍＨＩ切断点を無くし、次いでそのプラスミドをＳ
ａｌＩで消化後、ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化
した後ＢａｍＨＩリンカーを付加しｐＨＹ７００を得た
（図５）。ｐＨＹ７００のＸ部分に外来（目的）遺伝子
をアミノ酸の読み取りが合う様に（ｉｎｆｒａｍｅ）挿
入し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を形質転換する
ことにより、プラスミドｐＨＹ７００Ｘ（図５）を保有
し目的遺伝子産物を多量に分泌生産する組換え体を得た
。
【００２５】［実施例２．ｐＨＹ７００ＢＬＡの構築（
図３）］ｐＨＹ４８３１をＡｐａＬＩとＢｃｌＩで消化
し、ＭＷＰのシグナルペプチドの一部とＢ．ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子を含む１．７
ｋｂ ＡｐａＬＩ−ＢｃｌＩフラグメントを得た。ｐ
ＨＹ７００をＡＰａＬＩとＢａｍＨＩで消化し、５．４
ｋｂ ＡｐａＬＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを得、こ
れと先に得た１．７ｋｂフラグメントをＴ４リガーゼに
て連結し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を形質転換
した。組換え体よりプラスミドｐＨＹ７００ＢＬＡを得
た。
図３）］ｐＨＹ４８３１をＡｐａＬＩとＢｃｌＩで消化
し、ＭＷＰのシグナルペプチドの一部とＢ．ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子を含む１．７
ｋｂ ＡｐａＬＩ−ＢｃｌＩフラグメントを得た。ｐ
ＨＹ７００をＡＰａＬＩとＢａｍＨＩで消化し、５．４
ｋｂ ＡｐａＬＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを得、こ
れと先に得た１．７ｋｂフラグメントをＴ４リガーゼに
て連結し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を形質転換
した。組換え体よりプラスミドｐＨＹ７００ＢＬＡを得
た。
【００２６】［実施例３．ｐＨＹ７００ＢＬＡを用いて
のＢＬＡの分泌生産］ｐＨＹ７００ＢＬＡを保持するＢ
．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を５’ＰＹ培地（Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２２７９−２２８
０（１９８９））に植え、３０℃で８日間振とう培養し
た。上記の培養液を遠心分離し、その上清のアミラーゼ
活性を可溶性デンプンを基質として斎藤の方法（Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｓｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９
０−２９８（１９７３））を用いて測定し、下記の表１
の結果を得た。
のＢＬＡの分泌生産］ｐＨＹ７００ＢＬＡを保持するＢ
．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を５’ＰＹ培地（Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２２７９−２２８
０（１９８９））に植え、３０℃で８日間振とう培養し
た。上記の培養液を遠心分離し、その上清のアミラーゼ
活性を可溶性デンプンを基質として斎藤の方法（Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｓｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９
０−２９８（１９７３））を用いて測定し、下記の表１
の結果を得た。
【００２７】
【表１】
【００２８】培養上清からα−アミラーゼを山形らの方
法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９−１
２４５（１９８７））に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥ上一本の
シングルバンドになるまで精製を行った。本アミラーゼ
精製品の比活性は１×１０６Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉ
ｎであり、上記培養液（ｐＨＹ４８３１Ｈ−８日）には
３．７ｇ／Ｌのアミラーゼが分泌されていることになる
。
法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９−１
２４５（１９８７））に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥ上一本の
シングルバンドになるまで精製を行った。本アミラーゼ
精製品の比活性は１×１０６Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉ
ｎであり、上記培養液（ｐＨＹ４８３１Ｈ−８日）には
３．７ｇ／Ｌのアミラーゼが分泌されていることになる
。
【００２９】［実施例４．ｐＨＹ７００ＥＧＦの構築（
図４）］ｐＮＵ２００ＥＧＦを保持するＢ．ｂｒｅｖｉ
ｓ４７−５（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ ４７−
５（ｐＮＵ２００−ＥＧＦ），ＦＥＲＭ ＢＰ−１７
７１）からＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ中の
アルカリ抽出法により単離したプラスミドｐＮＵ２００
ＥＧＦをＡＰａＬＩとＢａｍＨＩで消化し、ＭＷＰシグ
ナルペプチド（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１
２３９−１２４５（１９８７）の一部及びＥＧＦを含む
２００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ｐＨＹ７００をＡＰａ
ＬＩとＢａｍＨＩで消化し５．２ｋｂの断片を得、これ
と先の２００ｂｐの断片をＴ４リガーゼを用いて連結後
、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ４７を形質転換した。形質転換
体よりｐＨＹ７００にＥＧＦ遺伝子が正しく挿入された
ｐＨＹ７００ＥＧＦを得た。ｐＨＹ７００ＥＧＦを保持
するＢ．ｂｒｅｖｉｓ ４７よりアルカリ抽出法によ
りｐＨＹ７００ＥＧＦを得、これを用いて、Ｔａｋａｇ
ｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３
，３０９９−３１００（１９８９））によりＢ．ｂｒｅ
ｖｉｓ ＨＰＤ３１を形質転換し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ
ＨＰＤ３１（ｐＨＹ７００ＥＧＦ）が得られた。
図４）］ｐＮＵ２００ＥＧＦを保持するＢ．ｂｒｅｖｉ
ｓ４７−５（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ ４７−
５（ｐＮＵ２００−ＥＧＦ），ＦＥＲＭ ＢＰ−１７
７１）からＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ中の
アルカリ抽出法により単離したプラスミドｐＮＵ２００
ＥＧＦをＡＰａＬＩとＢａｍＨＩで消化し、ＭＷＰシグ
ナルペプチド（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１
２３９−１２４５（１９８７）の一部及びＥＧＦを含む
２００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ｐＨＹ７００をＡＰａ
ＬＩとＢａｍＨＩで消化し５．２ｋｂの断片を得、これ
と先の２００ｂｐの断片をＴ４リガーゼを用いて連結後
、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ４７を形質転換した。形質転換
体よりｐＨＹ７００にＥＧＦ遺伝子が正しく挿入された
ｐＨＹ７００ＥＧＦを得た。ｐＨＹ７００ＥＧＦを保持
するＢ．ｂｒｅｖｉｓ ４７よりアルカリ抽出法によ
りｐＨＹ７００ＥＧＦを得、これを用いて、Ｔａｋａｇ
ｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３
，３０９９−３１００（１９８９））によりＢ．ｂｒｅ
ｖｉｓ ＨＰＤ３１を形質転換し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ
ＨＰＤ３１（ｐＨＹ７００ＥＧＦ）が得られた。
【００３０】［実施例５．ｈ−ＥＧＦの生産］上記で得
られた形質転換体Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１（ｐ
ＨＹ７００ＥＧＦ）及び対照となるＢ．ｂｒｅｖｉｓ
ＨＰＤ３１を５’ＰＹ培地を用いて３０℃で６日間振
とう培養を行った。その培養液を遠心分離し、上清のヒ
トＥＧＦ濃度を抗ヒトＥＧＦ血清を用いたＥＬＩＳＡ法
により求めた。その結果を下記の表２に示す。
られた形質転換体Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１（ｐ
ＨＹ７００ＥＧＦ）及び対照となるＢ．ｂｒｅｖｉｓ
ＨＰＤ３１を５’ＰＹ培地を用いて３０℃で６日間振
とう培養を行った。その培養液を遠心分離し、上清のヒ
トＥＧＦ濃度を抗ヒトＥＧＦ血清を用いたＥＬＩＳＡ法
により求めた。その結果を下記の表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【発明の効果】本発明により、バチルス・ブレビス由来
の高発現ベクターを開発した。この高発現ベクターは目
的とする外来遺伝子を挿入することが可能であるので、
このベクターにより形質転換した微生物を培養すること
により、目的とする各種の外来遺伝子産物を菌体外に著
量分泌生産することができる。
の高発現ベクターを開発した。この高発現ベクターは目
的とする外来遺伝子を挿入することが可能であるので、
このベクターにより形質転換した微生物を培養すること
により、目的とする各種の外来遺伝子産物を菌体外に著
量分泌生産することができる。
【図１】ＨＷＰプロモーターの調製図である。
【図２】ｐＨＹ７００の構築図である。
【図３】ｐＨＹ７００ＢＬＡの構築図である。
【図４】ｐＨＹ７００ＥＧＦの構築図である。
【図５】高発現ベクターｐＨＹ７００（Ｘ）の制限酵素
切断地図である。
切断地図である。
Claims (6)
- 【請求項１】 図５の制限酵素地図で示される高発現
ベクターｐＨＹ７００。 - 【請求項２】 図５の制限酵素地図で示される高発現
ベクターｐＨＹ７００に外来遺伝子を結合してなる高発
現ベクターｐＨＹ７００Ｘ。 - 【請求項３】 高発現ベクターｐＨＹ７００Ｘを保有
する微生物。 - 【請求項４】 高発現ベクターｐＨＹ７００Ｘを保有
するバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅ
ｖｉｓ）。 - 【請求項５】 高発現ベクターｐＨＹ７００Ｘを保有
するバチルス・ブレビス ＨＰＤ３１（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１）（ＦＥＲＭＢＰ
−１０８７）。 - 【請求項６】 高発現ベクターｐＨＹ７００Ｘを保有
する微生物を培養することにより外来遺伝子産物を培養
物中に生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する該産物の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3123183A JP3012026B2 (ja) | 1991-03-05 | 1991-03-05 | 高発現ベクター及び該高発現ベクター を保有する微生物並びに該微生物を 用いる有用物質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3123183A JP3012026B2 (ja) | 1991-03-05 | 1991-03-05 | 高発現ベクター及び該高発現ベクター を保有する微生物並びに該微生物を 用いる有用物質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04278091A true JPH04278091A (ja) | 1992-10-02 |
| JP3012026B2 JP3012026B2 (ja) | 2000-02-21 |
Family
ID=14854247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3123183A Expired - Fee Related JP3012026B2 (ja) | 1991-03-05 | 1991-03-05 | 高発現ベクター及び該高発現ベクター を保有する微生物並びに該微生物を 用いる有用物質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3012026B2 (ja) |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000053778A1 (fr) * | 1999-03-08 | 2000-09-14 | Showa Sangyo Co., Ltd. | Promoteurs |
| WO2004029254A1 (ja) * | 2002-09-30 | 2004-04-08 | Ajinomoto Co.,Inc. | 安定同位体標識タンパク質の製造方法 |
| WO2006004067A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2006-01-12 | Kaneka Corporation | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| US7332331B2 (en) | 2001-02-14 | 2008-02-19 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | Plasmid shuttle vector between Escherichia coli and Brevibacillus |
| WO2010110288A1 (ja) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド |
| WO2011118699A1 (ja) | 2010-03-24 | 2011-09-29 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド |
| WO2012133349A1 (ja) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | 株式会社カネカ | アフィニティー分離マトリックス用タンパク質 |
| WO2014046278A1 (ja) | 2012-09-21 | 2014-03-27 | 株式会社カネカ | アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド |
| WO2015034056A1 (ja) | 2013-09-06 | 2015-03-12 | 株式会社カネカ | アフィニティー分離マトリックス用分離能強化リガンド |
| WO2018030499A1 (ja) | 2016-08-10 | 2018-02-15 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 不溶性組換えタンパク質凝集体の製造方法 |
| WO2018066558A1 (ja) | 2016-10-03 | 2018-04-12 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 組換えタンパク質の精製方法 |
| WO2019022163A1 (ja) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 改変フィブロイン |
| WO2020145363A1 (ja) | 2019-01-09 | 2020-07-16 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 改変フィブロイン |
| WO2020158877A1 (ja) | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 組換えタンパク質の製造方法 |
| WO2021187502A1 (ja) | 2020-03-16 | 2021-09-23 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 合成高分子及びその製造方法、成形材料、並びに、成形体 |
-
1991
- 1991-03-05 JP JP3123183A patent/JP3012026B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| EP2251425A1 (en) | 2004-07-06 | 2010-11-17 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
| JPWO2006004067A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2008-04-24 | 株式会社カネカ | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| WO2006004067A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2006-01-12 | Kaneka Corporation | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| US8597908B2 (en) | 2004-07-06 | 2013-12-03 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
| US8889389B2 (en) | 2004-07-06 | 2014-11-18 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
| WO2010110288A1 (ja) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド |
| WO2011118699A1 (ja) | 2010-03-24 | 2011-09-29 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド |
| WO2012133349A1 (ja) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | 株式会社カネカ | アフィニティー分離マトリックス用タンパク質 |
| WO2014046278A1 (ja) | 2012-09-21 | 2014-03-27 | 株式会社カネカ | アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド |
| WO2015034056A1 (ja) | 2013-09-06 | 2015-03-12 | 株式会社カネカ | アフィニティー分離マトリックス用分離能強化リガンド |
| WO2018030499A1 (ja) | 2016-08-10 | 2018-02-15 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 不溶性組換えタンパク質凝集体の製造方法 |
| WO2018066558A1 (ja) | 2016-10-03 | 2018-04-12 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 組換えタンパク質の精製方法 |
| WO2019022163A1 (ja) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 改変フィブロイン |
| WO2020145363A1 (ja) | 2019-01-09 | 2020-07-16 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 改変フィブロイン |
| WO2020158877A1 (ja) | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 組換えタンパク質の製造方法 |
| WO2021187502A1 (ja) | 2020-03-16 | 2021-09-23 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 合成高分子及びその製造方法、成形材料、並びに、成形体 |
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|---|---|
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