JP3340164B2 - 新規なカルシウム調節プロモータｐｏ４３８ - Google Patents
新規なカルシウム調節プロモータｐｏ４３８Info
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- C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
- C12Y113/11001—Catechol 1,2-dioxygenase (1.13.11.1)
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はバイオテクノロジーの分
野のものである。さらに詳細には、それは細胞外酵素ま
たは異種ポリペプチドの増産に用いるための新規なカル
シウム調節プロモータ、上記の酵素またはポリペプチド
を暗号化しているＤＮＡと効果的に結合されているプロ
モータのＤＮＡ配列を包含する組換えベクターおよび上
記の酵素またはポリペプチドを暗号化しているＤＮＡと
効果的に結合されているプロモータを包含する組換えベ
クターで形質転換された宿主微生物に関するものであ
る。本発明は、ストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）
発現系およびストレプトマイセス中で外来ＤＮＡ配列を
発現するため、これらの外来ＤＮＡ配列によりコード化
されるポリペプチドおよび蛋白質を周辺の媒体に分泌す
るための方法に関するものである。
野のものである。さらに詳細には、それは細胞外酵素ま
たは異種ポリペプチドの増産に用いるための新規なカル
シウム調節プロモータ、上記の酵素またはポリペプチド
を暗号化しているＤＮＡと効果的に結合されているプロ
モータのＤＮＡ配列を包含する組換えベクターおよび上
記の酵素またはポリペプチドを暗号化しているＤＮＡと
効果的に結合されているプロモータを包含する組換えベ
クターで形質転換された宿主微生物に関するものであ
る。本発明は、ストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）
発現系およびストレプトマイセス中で外来ＤＮＡ配列を
発現するため、これらの外来ＤＮＡ配列によりコード化
されるポリペプチドおよび蛋白質を周辺の媒体に分泌す
るための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】スト
レプトマイセスはプロテアーゼ、ホスファターゼ、キシ
ラナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびヌ
クレアーゼを包含するいろいろな細胞外酵素の周知の生
産者である。その上に、多くのストレプトマイセス属は
多くの抗生物質、色素および他の二次代謝産物を生産
し、胞子形成に帰着する複雑なパターンの分化を有す
る。ストレプトマイセスの回分培養において、細胞外酵
素の生産および抗生物質生産および色素生合成の開始期
および胞子形成に同時性がある。全てのこれらの過程は
高成長率に好適な栄養状態により抑制され、Ｐ、Ｃまた
はＮ源の不足により制御解除される。酵素分泌、二次代
謝産物の生成および分化が全く影響を受けないが同一の
引金機作に反応するということではないようである。
レプトマイセスはプロテアーゼ、ホスファターゼ、キシ
ラナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびヌ
クレアーゼを包含するいろいろな細胞外酵素の周知の生
産者である。その上に、多くのストレプトマイセス属は
多くの抗生物質、色素および他の二次代謝産物を生産
し、胞子形成に帰着する複雑なパターンの分化を有す
る。ストレプトマイセスの回分培養において、細胞外酵
素の生産および抗生物質生産および色素生合成の開始期
および胞子形成に同時性がある。全てのこれらの過程は
高成長率に好適な栄養状態により抑制され、Ｐ、Ｃまた
はＮ源の不足により制御解除される。酵素分泌、二次代
謝産物の生成および分化が全く影響を受けないが同一の
引金機作に反応するということではないようである。
【０００３】細胞外酵素を暗号化しているストレプトマ
イセス（Ｓtreptomyces）のいくつかの遺伝子はクロー
ン化されている。これらはストレプトマイセス・コエリ
コロル（Ｓtreptomyces coelicolor）からのアガラー
ゼ、ストレプトマイセス・プリカタス（Ｓtreptomyces
plicatus）からのエンドグリコシダーゼ、ストレプト
マイセス・リビダンス（Ｓtreptomyces lividans）か
らのキシラナーゼ、ストレプトマイセス・ハイグロスコ
ピカス（Ｓtreptomyces hygroscopicus）からのアルフ
ァーアミラーゼ、ストレプトマイセス・エスピーＡ２
（Ｓtrep．spas）からのセルラーゼ、ストレプトマイセ
ス・リビダンス（Ｓtrep．lividans）からのベーターガ
ラクトシダーゼおよびストレプトマイセス・カカオイ
(Ｓtrep．cacaoi）、バデアス（badius）およびフラジ
アェ（fradiae）からのベーターラクタマーゼを包含す
る。
イセス（Ｓtreptomyces）のいくつかの遺伝子はクロー
ン化されている。これらはストレプトマイセス・コエリ
コロル（Ｓtreptomyces coelicolor）からのアガラー
ゼ、ストレプトマイセス・プリカタス（Ｓtreptomyces
plicatus）からのエンドグリコシダーゼ、ストレプト
マイセス・リビダンス（Ｓtreptomyces lividans）か
らのキシラナーゼ、ストレプトマイセス・ハイグロスコ
ピカス（Ｓtreptomyces hygroscopicus）からのアルフ
ァーアミラーゼ、ストレプトマイセス・エスピーＡ２
（Ｓtrep．spas）からのセルラーゼ、ストレプトマイセ
ス・リビダンス（Ｓtrep．lividans）からのベーターガ
ラクトシダーゼおよびストレプトマイセス・カカオイ
(Ｓtrep．cacaoi）、バデアス（badius）およびフラジ
アェ（fradiae）からのベーターラクタマーゼを包含す
る。
【０００４】しかし、これらの遺伝子の発現を制御する
調節機作はほとんど未知である。デキストリンまたはマ
ルトトリオーズによるアミラーゼの誘導およびアミラー
ゼまたはアガラーゼの炭素代謝物調節のような特定の調
節機作以外にいくつかの細胞外酵素の制御解除の一般の
機作が存在するらしいが、それはいくつかの重合体基質
を分解する酵素の同時生産が栄養のダウン−シフト後に
ストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）で観察されてい
るためである。上記のトランス作用性調節遺伝子はバチ
ルス・ズブテリス（Ｂacillus subtilis）〔ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯ
Ｌ）第１６９巻：３２４−３３３頁、１９８７年〕、バ
チルス・ナトリー（Ｂacillus）〔ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ）、および
バチルス・ライケニフォルミス（Ｂacillus lichenifo
rmis）に見い出される。
調節機作はほとんど未知である。デキストリンまたはマ
ルトトリオーズによるアミラーゼの誘導およびアミラー
ゼまたはアガラーゼの炭素代謝物調節のような特定の調
節機作以外にいくつかの細胞外酵素の制御解除の一般の
機作が存在するらしいが、それはいくつかの重合体基質
を分解する酵素の同時生産が栄養のダウン−シフト後に
ストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）で観察されてい
るためである。上記のトランス作用性調節遺伝子はバチ
ルス・ズブテリス（Ｂacillus subtilis）〔ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯ
Ｌ）第１６９巻：３２４−３３３頁、１９８７年〕、バ
チルス・ナトリー（Ｂacillus）〔ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ）、および
バチルス・ライケニフォルミス（Ｂacillus lichenifo
rmis）に見い出される。
【０００５】酵素合成および／または分泌に影響する正
の調節遺伝子は、ストレプトマイセス・リビダンス
（Ｓ．lividans）のような弱い分泌性株で細胞外酵素の
増加した分泌を探索することによりクローン化され得
る。ストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）に外来ＤＮ
Ａ配列を発現する系は、たとえばヨーロッパ特許第１４
８５５２号および国際出願公開第８８／０７０７９号に
既に報告されている。これらの系はストレプトマイセス
（Ｓtreptomyces）により生産される細胞外酵素の内因
性プロモータを用いる。外来プロモータによる内因性プ
ロモータの置換は、細胞外酵素に対する構造遺伝子の制
御領域との相互作用によりストレプトマイセス（Ｓtrep
tomyces）中で細胞外酵素に対する遺伝子の発現を直接
または間接に調節するＳafポリペプチドと称する新規な
ポリペプチドを暗号化している新たに分離した遺伝子Ｓ
af遺伝子のクローニングおよび特性を記載する国際出願
公開第９０／１４４２６号に開示されている。
の調節遺伝子は、ストレプトマイセス・リビダンス
（Ｓ．lividans）のような弱い分泌性株で細胞外酵素の
増加した分泌を探索することによりクローン化され得
る。ストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）に外来ＤＮ
Ａ配列を発現する系は、たとえばヨーロッパ特許第１４
８５５２号および国際出願公開第８８／０７０７９号に
既に報告されている。これらの系はストレプトマイセス
（Ｓtreptomyces）により生産される細胞外酵素の内因
性プロモータを用いる。外来プロモータによる内因性プ
ロモータの置換は、細胞外酵素に対する構造遺伝子の制
御領域との相互作用によりストレプトマイセス（Ｓtrep
tomyces）中で細胞外酵素に対する遺伝子の発現を直接
または間接に調節するＳafポリペプチドと称する新規な
ポリペプチドを暗号化している新たに分離した遺伝子Ｓ
af遺伝子のクローニングおよび特性を記載する国際出願
公開第９０／１４４２６号に開示されている。
【０００６】Ｓaf遺伝子のプロモータは細胞外酵素の天
然のプロモータよりもさらに強力であることが見い出さ
れている。たとえば、アミラーゼ遺伝子はＳafプロモー
タが天然のアミラーゼプロモータで置換される場合非常
に大量のアミラーゼを発現する。すなわち、Ｓafプロモ
ータはその蛋白質の天然プロモータの代わりに全ての内
因性ポリペプチドまたは蛋白質の発現を増幅するのに用
いられる。Ｓaf遺伝子のクローニングおよび確認には、
プラスミドｐＩＪ７０２〔カツら、ジャーナル・オブ・
マイクロバイオロジー（Ｊ．ＧＥＮ・ＭＩＣＲＯＢＩＯ
Ｌ）第１２９巻：２７０３−２７１４頁、１９８３年〕
がクローニングベクターとして用いられた。このプラス
ミドはストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）のいくつ
かの種でチロジンからメラニンの生成の原因である酵
素、チロジナーゼの遺伝子を含む。ｐＩＪ７０２のｍｅ
ｌ遺伝子座は配列決定され、二つの転写解読枠（ＯＲＦ
ｓ）が同定されている：一番目はチロジナーゼのポリペ
プチド鎖をコード化するｍｅｌ遺伝子に対応するＯＲＦ
であり、ｍｅｌ遺伝子の下流に位置している第二番目の
ＯＲＦはＯＲＦ４３８と命名され〔バーナンら、ジーン
（ＧＥＮＥ）第３７巻：１０１−１１０頁、１９８５
年〕、その役割はなお不明である。
然のプロモータよりもさらに強力であることが見い出さ
れている。たとえば、アミラーゼ遺伝子はＳafプロモー
タが天然のアミラーゼプロモータで置換される場合非常
に大量のアミラーゼを発現する。すなわち、Ｓafプロモ
ータはその蛋白質の天然プロモータの代わりに全ての内
因性ポリペプチドまたは蛋白質の発現を増幅するのに用
いられる。Ｓaf遺伝子のクローニングおよび確認には、
プラスミドｐＩＪ７０２〔カツら、ジャーナル・オブ・
マイクロバイオロジー（Ｊ．ＧＥＮ・ＭＩＣＲＯＢＩＯ
Ｌ）第１２９巻：２７０３−２７１４頁、１９８３年〕
がクローニングベクターとして用いられた。このプラス
ミドはストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）のいくつ
かの種でチロジンからメラニンの生成の原因である酵
素、チロジナーゼの遺伝子を含む。ｐＩＪ７０２のｍｅ
ｌ遺伝子座は配列決定され、二つの転写解読枠（ＯＲＦ
ｓ）が同定されている：一番目はチロジナーゼのポリペ
プチド鎖をコード化するｍｅｌ遺伝子に対応するＯＲＦ
であり、ｍｅｌ遺伝子の下流に位置している第二番目の
ＯＲＦはＯＲＦ４３８と命名され〔バーナンら、ジーン
（ＧＥＮＥ）第３７巻：１０１−１１０頁、１９８５
年〕、その役割はなお不明である。
【０００７】Ｓaf遺伝子の位置を詳細に示す研究が行わ
れている間に、Ｓaf遺伝子断片Ｓstr−ＫpnＩ（４３２
ヌクレオチド−プロモータをもたないＳaf遺伝子）がｐ
ＩＪ７０２のＢｇｌII部位に挿入された。研究の予期し
ない特徴は、正配位で挿入される場合のこの断片の発現
の欠失および逆配向（時計回り配向）で挿入される場合
その発現であった。この事実は、逆配位でＯＲＦ４３８
内に位置した、遺伝子ｍｅｌの前でＢｇｌII部位にある
プロモータ活性をもつ断片の存在を暗示する。
れている間に、Ｓaf遺伝子断片Ｓstr−ＫpnＩ（４３２
ヌクレオチド−プロモータをもたないＳaf遺伝子）がｐ
ＩＪ７０２のＢｇｌII部位に挿入された。研究の予期し
ない特徴は、正配位で挿入される場合のこの断片の発現
の欠失および逆配向（時計回り配向）で挿入される場合
その発現であった。この事実は、逆配位でＯＲＦ４３８
内に位置した、遺伝子ｍｅｌの前でＢｇｌII部位にある
プロモータ活性をもつ断片の存在を暗示する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の主なる目的は、
ｐＩＪ７０２プラスミドのＯＲＦ４３８内に含まれるＤ
ＮＡ断片中に同定される新規なプロモータを提供するも
のである。プロモータ活性はカルシウムイオンによって
正に調節され、作動可能に上記プロモータに結合される
ストレプトマイセスの細胞外酵素に対する遺伝子の発現
はＣａＣｌ２溶液の存在で大いに増大される。ポリペプ
チドまたは蛋白質を暗号化している内因性または外来Ｄ
ＮＡ配列に作動可能に結合された上記のプロモータを含
むクローニングビークル（ベクター）および上記のクロ
ーニングビークルにより形質転換された宿主微生物また
は細胞を提供し、それにより上記のＤＮＡ配列により暗
号化されているポリペプチドの発現および分泌をもたら
すことは本発明の他の特徴である。本発明の他の特徴は
ストレプトマイセスの染色体ＤＮＡに外来ＤＮＡ配列を
保有する上記のクローニングビークルを挿入することで
ある。なお本発明の形質転換された宿主微生物を培養す
ることおよび培養ブロスから生成物を回収することによ
り細胞外酵素、目的とするポリペプチドまたは蛋白質を
製造する方法は本発明の他の特徴である。
ｐＩＪ７０２プラスミドのＯＲＦ４３８内に含まれるＤ
ＮＡ断片中に同定される新規なプロモータを提供するも
のである。プロモータ活性はカルシウムイオンによって
正に調節され、作動可能に上記プロモータに結合される
ストレプトマイセスの細胞外酵素に対する遺伝子の発現
はＣａＣｌ２溶液の存在で大いに増大される。ポリペプ
チドまたは蛋白質を暗号化している内因性または外来Ｄ
ＮＡ配列に作動可能に結合された上記のプロモータを含
むクローニングビークル（ベクター）および上記のクロ
ーニングビークルにより形質転換された宿主微生物また
は細胞を提供し、それにより上記のＤＮＡ配列により暗
号化されているポリペプチドの発現および分泌をもたら
すことは本発明の他の特徴である。本発明の他の特徴は
ストレプトマイセスの染色体ＤＮＡに外来ＤＮＡ配列を
保有する上記のクローニングビークルを挿入することで
ある。なお本発明の形質転換された宿主微生物を培養す
ることおよび培養ブロスから生成物を回収することによ
り細胞外酵素、目的とするポリペプチドまたは蛋白質を
製造する方法は本発明の他の特徴である。
【０００９】ＯＲＦ４３８に含まれる新規なプロモータ
は、ＯＲＦ４３８のそれと逆配位にプロモータ活性を示
し、以下Ｐｏ４３８（ＯＲＦ４３８と逆のプロモータ）
と称する。ｐＩＪ７０２のその時計回りプロモータ活性
に関する知識はこのベクター中にクローンされるＤＮＡ
断片の遺伝子発現研究におけるまちがった解釈を避ける
ためにも非常に重要である。Ｐｏ４３８プロモータはス
トレプトマイセス（Ｓtreptomyces）に特徴づけられて
いる最初に知られたカルシウム−調節プロモータであっ
て、適当なクローニングビークル中へ目的の蛋白質に対
する遺伝子の上流の適当な切断部位にＰｏ４３８プロモ
ータを含んでいるＤＮＡ断片を挿入すること、上記のク
ローニングビークルでストレプトマイセス（Ｓtreptomy
ces）宿主を形質転換することおよびＣａ2+溶液の存在
下で形質転換された細菌を培養して選択した蛋白質また
はその一部を外分泌させることにより、選択した異種蛋
白質のストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）中での発
現を増大するのに用いられ得る。Ｐｏ４３８のプロモー
タ活性は２つの異なるプロモータ−プローブベクターを
用いて測定されている。Ｐｏ４３８プロモータを含むＤ
ＮＡ断片は、プロモータを欠くアミノグリコシド ホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）およびプロモー
タを欠くカラコール ジオキシゲナーゼ遺伝子（Ｘｇｌ
Ｅ）をそれぞれ保有する２つの異なるプラスミドにサブ
クローンされた（図１）。両遺伝子はカルシウムイオン
の増大する濃度の存在下で多量の各酵素を発現し、かく
して、Ｐｏ４３８のカルシウム−調節プロモータ活性を
示す。Ｐｏ４３８の転写の出発点は、Ｓ１ヌクレアーゼ
マッピング試験で測定された結果ＳｓｔＩ部位から２４
ｎｔのＣａ周辺に出発点に位置する（図４）。
は、ＯＲＦ４３８のそれと逆配位にプロモータ活性を示
し、以下Ｐｏ４３８（ＯＲＦ４３８と逆のプロモータ）
と称する。ｐＩＪ７０２のその時計回りプロモータ活性
に関する知識はこのベクター中にクローンされるＤＮＡ
断片の遺伝子発現研究におけるまちがった解釈を避ける
ためにも非常に重要である。Ｐｏ４３８プロモータはス
トレプトマイセス（Ｓtreptomyces）に特徴づけられて
いる最初に知られたカルシウム−調節プロモータであっ
て、適当なクローニングビークル中へ目的の蛋白質に対
する遺伝子の上流の適当な切断部位にＰｏ４３８プロモ
ータを含んでいるＤＮＡ断片を挿入すること、上記のク
ローニングビークルでストレプトマイセス（Ｓtreptomy
ces）宿主を形質転換することおよびＣａ2+溶液の存在
下で形質転換された細菌を培養して選択した蛋白質また
はその一部を外分泌させることにより、選択した異種蛋
白質のストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）中での発
現を増大するのに用いられ得る。Ｐｏ４３８のプロモー
タ活性は２つの異なるプロモータ−プローブベクターを
用いて測定されている。Ｐｏ４３８プロモータを含むＤ
ＮＡ断片は、プロモータを欠くアミノグリコシド ホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）およびプロモー
タを欠くカラコール ジオキシゲナーゼ遺伝子（Ｘｇｌ
Ｅ）をそれぞれ保有する２つの異なるプラスミドにサブ
クローンされた（図１）。両遺伝子はカルシウムイオン
の増大する濃度の存在下で多量の各酵素を発現し、かく
して、Ｐｏ４３８のカルシウム−調節プロモータ活性を
示す。Ｐｏ４３８の転写の出発点は、Ｓ１ヌクレアーゼ
マッピング試験で測定された結果ＳｓｔＩ部位から２４
ｎｔのＣａ周辺に出発点に位置する（図４）。
【００１０】添付図において：図１は、プロモータ−プ
ローブベクターｐＩＪ４８７（ワードら、１９８６年）
およびｐＩＪ４０８３中にクローンされたｐＩＪ７０２
の２４２ｂｐ ＳｓｔＩ−ＢｇｌII断片（Ｐｏ４３８を
含有）を保有するプラスミドｐＵＬＡＤ５０およびｐＵ
ＬＡＤ５１の構築を示す図である。図２は、ｐＩＪ７０
２の２４２ｂｐ ＳｓｔＩ−ＢｇｌII断片のプロモータ
活性を示す図である。カナマイシン グレディエント
（０−１８０μg／ml）を固体最小（ＭＭ）培地に設定
し（ポプウド、１９６７年）、プラスミドｐＵＬＡＤ５
０（Ａ）またはｐＩＪ４８７（Ｂ）を保有するストレプ
トマイセス・リビダンス（Ｓ．lividans）を線状接種し
た。図３は、pＩＪ７０２の２４２ ｂｐ ＳｓｔＩ−
ＢｇｌII断片を保有するpＵＬＡＤ５０の領域およびＳ
１マッピングによるストラテジーの図解である。星印に
よりマークされたバーは標識断片を示し、Ｓ１をもつバ
ーは得られた保護断片を示す。レーンＡ−Ｃ−Ｇ−Ｔは
Ｍ１３mp１８一本鎖ＤＮＡ(右)による、およびpＩＪ７
０２からの２４２ bp ＳstＩ−ＢglII断片(左)によ
る、４つの配列反応を示す。
ローブベクターｐＩＪ４８７（ワードら、１９８６年）
およびｐＩＪ４０８３中にクローンされたｐＩＪ７０２
の２４２ｂｐ ＳｓｔＩ−ＢｇｌII断片（Ｐｏ４３８を
含有）を保有するプラスミドｐＵＬＡＤ５０およびｐＵ
ＬＡＤ５１の構築を示す図である。図２は、ｐＩＪ７０
２の２４２ｂｐ ＳｓｔＩ−ＢｇｌII断片のプロモータ
活性を示す図である。カナマイシン グレディエント
（０−１８０μg／ml）を固体最小（ＭＭ）培地に設定
し（ポプウド、１９６７年）、プラスミドｐＵＬＡＤ５
０（Ａ）またはｐＩＪ４８７（Ｂ）を保有するストレプ
トマイセス・リビダンス（Ｓ．lividans）を線状接種し
た。図３は、pＩＪ７０２の２４２ ｂｐ ＳｓｔＩ−
ＢｇｌII断片を保有するpＵＬＡＤ５０の領域およびＳ
１マッピングによるストラテジーの図解である。星印に
よりマークされたバーは標識断片を示し、Ｓ１をもつバ
ーは得られた保護断片を示す。レーンＡ−Ｃ−Ｇ−Ｔは
Ｍ１３mp１８一本鎖ＤＮＡ(右)による、およびpＩＪ７
０２からの２４２ bp ＳstＩ−ＢglII断片(左)によ
る、４つの配列反応を示す。
【００１１】１−pＵＬＡＤ５０の２７０nt ＨindＩＩ
Ｉ−ＳstＩ断片およストレプトマイセス・リビダンス
(Ｓ．lividans)からのmＲＮＡの間のハイブリダイゼー
ションでの保護断片[pＵＬＡＤ５０]。 ２−２７０nt ＨindＩＩＩ−ＳstＩ−プローブ。 ３−２４２nt ＢglＩＩ−ＳstＩプローブ。 ４−pＩＪ７０２の２４２nt ＢglＩＩ−ＳstＩ断片お
よびストレプトマイセス・リビダンス(Ｓ．lividans)か
らのmＲＮＡの間のハイブリダイゼーションでの保護断
片。 やじり状印は保護断片に対応するハイブリダイゼーショ
ン バンドを示す。図４は、そのアミノ酸配列を示して
いるＯＲＦ４３８を含むmelクラスターのＤＮＡ領域の
ヌクレオチド配列である。pＵＬＡＤ５０を構築するた
めにpＩＪ４８７にクローンされたＤＮＡ断片の側面に
あるＢglIIおよびＳstＩ制限部位が示される。チロシナ
ーゼの二つの最初のアミノ酸もまた示される。 ●●→黒丸(２個)つき矢印：ゲィストリヒら(１９８９
年)およびロィら(１９８９年)によるmel転写の開始。 ○○→白丸(２個)つき矢印：Ｓ１ヌクレアーゼマッピン
グ試験によるＰo４３８からの転写開始(図３)。 rbs．リボゾーム結合部位。
Ｉ−ＳstＩ断片およストレプトマイセス・リビダンス
(Ｓ．lividans)からのmＲＮＡの間のハイブリダイゼー
ションでの保護断片[pＵＬＡＤ５０]。 ２−２７０nt ＨindＩＩＩ−ＳstＩ−プローブ。 ３−２４２nt ＢglＩＩ−ＳstＩプローブ。 ４−pＩＪ７０２の２４２nt ＢglＩＩ−ＳstＩ断片お
よびストレプトマイセス・リビダンス(Ｓ．lividans)か
らのmＲＮＡの間のハイブリダイゼーションでの保護断
片。 やじり状印は保護断片に対応するハイブリダイゼーショ
ン バンドを示す。図４は、そのアミノ酸配列を示して
いるＯＲＦ４３８を含むmelクラスターのＤＮＡ領域の
ヌクレオチド配列である。pＵＬＡＤ５０を構築するた
めにpＩＪ４８７にクローンされたＤＮＡ断片の側面に
あるＢglIIおよびＳstＩ制限部位が示される。チロシナ
ーゼの二つの最初のアミノ酸もまた示される。 ●●→黒丸(２個)つき矢印：ゲィストリヒら(１９８９
年)およびロィら(１９８９年)によるmel転写の開始。 ○○→白丸(２個)つき矢印：Ｓ１ヌクレアーゼマッピン
グ試験によるＰo４３８からの転写開始(図３)。 rbs．リボゾーム結合部位。
【００１２】図５は、Ｐo４３８プロモータからの発現
のリン酸抑制を示す図である。ネオマイシン勾配(０−
１８０ug／ml)は固体ＭＭ＋ＴＥＳ緩衝液８２５mＭ、p
Ｈ７.２(上面プレート)および２０ＭＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pＨ７.２で補足した同じ培地(下面プレート)
上でつくられた。両プレートは同量のストレプトマイセ
ス・リビダンス(Ｓ．lividans)〔ＰＵＬＡＤ５０〕胞子
を線状接種した。図６は、Ｐo４３８プロモータの下流
に位置した場合のプソイドモナス・プチダ(Ｐsendomona
s putida)のプロモータを欠くＸylＥ遺伝子のストレプ
トマイセス(Ｓtreptomyces)中でのカルシウム誘導を示
すグラフである。ストレプトマイセス・リビダンス
(Ｓ．lividans)〔pＵＬＡＤ５１〕はカルシウム除去の
Ｒ２ＹＥ液体培地（黒丸●）および６０mＭまで別のＣa
Ｃl2で補足したＲ２ＹＥ培地（白三角△）中に増殖され
た。pＩＪ４０８３により形質転換したストレプトマイ
セス・リビダンス(Ｓ．lividans)のカテコール ジオキ
シゲナーゼ活性（ＣａtＯ2 ase)（白丸○）はＣaＣl2
共存または不在のＲ２ＹＥ培地に増殖した場合変らなか
った。
のリン酸抑制を示す図である。ネオマイシン勾配(０−
１８０ug／ml)は固体ＭＭ＋ＴＥＳ緩衝液８２５mＭ、p
Ｈ７.２(上面プレート)および２０ＭＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pＨ７.２で補足した同じ培地(下面プレート)
上でつくられた。両プレートは同量のストレプトマイセ
ス・リビダンス(Ｓ．lividans)〔ＰＵＬＡＤ５０〕胞子
を線状接種した。図６は、Ｐo４３８プロモータの下流
に位置した場合のプソイドモナス・プチダ(Ｐsendomona
s putida)のプロモータを欠くＸylＥ遺伝子のストレプ
トマイセス(Ｓtreptomyces)中でのカルシウム誘導を示
すグラフである。ストレプトマイセス・リビダンス
(Ｓ．lividans)〔pＵＬＡＤ５１〕はカルシウム除去の
Ｒ２ＹＥ液体培地（黒丸●）および６０mＭまで別のＣa
Ｃl2で補足したＲ２ＹＥ培地（白三角△）中に増殖され
た。pＩＪ４０８３により形質転換したストレプトマイ
セス・リビダンス(Ｓ．lividans)のカテコール ジオキ
シゲナーゼ活性（ＣａtＯ2 ase)（白丸○）はＣaＣl2
共存または不在のＲ２ＹＥ培地に増殖した場合変らなか
った。
【００１３】明細書に記載した研究を下記の物質および
方法を用いて行った。細菌株およびプラスミド。本研究
に用いたストレプトマイセス(Ｓtreptomyces)株および
プラスミドを第１表に示す。培地および培養条件、プロ
トプラストの形質転換。ストレプトマイセス(Ｓtreptom
yces)株をＲ２ＹＥ、最小培地(ＭＭ)または３４％スク
ロースおよびＭgＣl2で補足したＹＥＭＥに増殖させ
た。[ホプウドら、ジェネテック・マニプレション・オ
ブ・ストレプトマイセス(Ｓtreptomyces)。ア・ラボラ
トリィ・マニュアル(Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡ
ＮＵＡＬ)。ザ・ジョン・イネス・ファウンデイショ
ン、ノリッヂ、ユー・ケイ、１９８５年)。ストレプト
マイセス(Ｓtreptomyces)の液体培養を２２０rpmで振と
うしつつロータリーシェカー中で２８℃で三角振とうフ
ラスコ中に増殖させた。ストレプトマイセス・リビダン
ス(Ｓ．lividans)プロトプラストの製造および形質転換
は〔トムプソンら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー(Ｊ.ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ)。第１５１巻:６６８−６７
７頁、１９８２年〕記載通りで行った。
方法を用いて行った。細菌株およびプラスミド。本研究
に用いたストレプトマイセス(Ｓtreptomyces)株および
プラスミドを第１表に示す。培地および培養条件、プロ
トプラストの形質転換。ストレプトマイセス(Ｓtreptom
yces)株をＲ２ＹＥ、最小培地(ＭＭ)または３４％スク
ロースおよびＭgＣl2で補足したＹＥＭＥに増殖させ
た。[ホプウドら、ジェネテック・マニプレション・オ
ブ・ストレプトマイセス(Ｓtreptomyces)。ア・ラボラ
トリィ・マニュアル(Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡ
ＮＵＡＬ)。ザ・ジョン・イネス・ファウンデイショ
ン、ノリッヂ、ユー・ケイ、１９８５年)。ストレプト
マイセス(Ｓtreptomyces)の液体培養を２２０rpmで振と
うしつつロータリーシェカー中で２８℃で三角振とうフ
ラスコ中に増殖させた。ストレプトマイセス・リビダン
ス(Ｓ．lividans)プロトプラストの製造および形質転換
は〔トムプソンら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー(Ｊ.ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ)。第１５１巻:６６８−６７
７頁、１９８２年〕記載通りで行った。
【００１４】ＤＮＡ分離、操作およびＤＮＡ配列。プラ
スミドＤＮＡをキエセルの方法〔キエセルら、プラスミ
ド(ＰＬＡＳＭＩＤ)第１２巻:１９−３６頁、１９８４
年〕により分離した。消化および結さつをアガロース
ゲル電気泳動によりモニターした。制限エンドヌクレア
ーゼおよび結さつ反応による消化のための条件は製造者
によりすすめられたものであった。ＤＮＡ断片のサブク
ローニングを充分な制限酵素により１−２ugのプラスミ
ドＤＮＡを消化することにより行って、反応生成物を低
融点アガロース(ＬＭＰＡ)でゲル電気泳動により分離し
た。ヌクレオチド配列をＭ１３クローン〔メーシング
ら、ヌクレイク・アシズ・リサーチ(ＮＵＣＬＥＩＣ
ＡＣＩＤ(Ｓ) ＲＥＳＥＡＣＨ)第９巻:３０９−３２１
頁、１９８１年〕を用いて、サンガーの鎖終止法〔サン
ガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ
(ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ・Ｓ・Ａ)
第７４巻：５４６３−５４６７頁、１９７７年〕により
決定した。
スミドＤＮＡをキエセルの方法〔キエセルら、プラスミ
ド(ＰＬＡＳＭＩＤ)第１２巻:１９−３６頁、１９８４
年〕により分離した。消化および結さつをアガロース
ゲル電気泳動によりモニターした。制限エンドヌクレア
ーゼおよび結さつ反応による消化のための条件は製造者
によりすすめられたものであった。ＤＮＡ断片のサブク
ローニングを充分な制限酵素により１−２ugのプラスミ
ドＤＮＡを消化することにより行って、反応生成物を低
融点アガロース(ＬＭＰＡ)でゲル電気泳動により分離し
た。ヌクレオチド配列をＭ１３クローン〔メーシング
ら、ヌクレイク・アシズ・リサーチ(ＮＵＣＬＥＩＣ
ＡＣＩＤ(Ｓ) ＲＥＳＥＡＣＨ)第９巻:３０９−３２１
頁、１９８１年〕を用いて、サンガーの鎖終止法〔サン
ガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ
(ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ・Ｓ・Ａ)
第７４巻：５４６３−５４６７頁、１９７７年〕により
決定した。
【００１５】ＲＮＡ分離およびＳ１ヌクレアーゼマッピ
ング。ＲＮＡをＭＭ培地での５０時間培養からキルビー
[キルビーら、バイオケミカル・ジャーナル(ＢＩＯＣＨ
ＥＭ．Ｊ)第１０４巻:２５８−２６２頁、１９６７年]
により分離した。Ｓ１マッピングのためにＤＮＡプロー
ブは末端を標識した。[アサムおよびギルバート、メソ
ズ・イン・エンザイモロジー(ＭＥＴＨＯＤＳ．ＥＮＺ
ＹＭＯＬ)第６５巻:４９９−５６０頁、１９８０年)。
ＲＮＡ(４０ug)を[32Ｐ]で末端標識したＤＮＡ断片の１
０5Ｃ・Ｐ・Ｍと混合して、１５分間８５℃で変性させ
た。[ファバロラら、メソズ・イン・エンザイモロジー
(ＭＥＴＨＯＤＳ．ＥＮＺＹＭＯＬ)第６５巻:７１８−
７４９頁、１９８０年]。ハイブリダイゼーションを３
時間６０℃で行って、６０単位のＳ１ヌクレアーゼで処
理し、Ｓ１消化生成物を７Ｍ尿素を含む７％(Ｗ／Ｖ)ポ
リアクリルアミド ゲルに負荷して、Ｍ１３ mp１８フ
ァージおよびサンガー法により配列決定した２４２ bp
ＢglII−ＳstＩ断片と平行して移動させた。
ング。ＲＮＡをＭＭ培地での５０時間培養からキルビー
[キルビーら、バイオケミカル・ジャーナル(ＢＩＯＣＨ
ＥＭ．Ｊ)第１０４巻:２５８−２６２頁、１９６７年]
により分離した。Ｓ１マッピングのためにＤＮＡプロー
ブは末端を標識した。[アサムおよびギルバート、メソ
ズ・イン・エンザイモロジー(ＭＥＴＨＯＤＳ．ＥＮＺ
ＹＭＯＬ)第６５巻:４９９−５６０頁、１９８０年)。
ＲＮＡ(４０ug)を[32Ｐ]で末端標識したＤＮＡ断片の１
０5Ｃ・Ｐ・Ｍと混合して、１５分間８５℃で変性させ
た。[ファバロラら、メソズ・イン・エンザイモロジー
(ＭＥＴＨＯＤＳ．ＥＮＺＹＭＯＬ)第６５巻:７１８−
７４９頁、１９８０年]。ハイブリダイゼーションを３
時間６０℃で行って、６０単位のＳ１ヌクレアーゼで処
理し、Ｓ１消化生成物を７Ｍ尿素を含む７％(Ｗ／Ｖ)ポ
リアクリルアミド ゲルに負荷して、Ｍ１３ mp１８フ
ァージおよびサンガー法により配列決定した２４２ bp
ＢglII−ＳstＩ断片と平行して移動させた。
【００１６】カテコールジデキシゲナーゼ活性の測定。
プレート検定として、ストレプトマイセス(Ｓtreptomyc
es)形質転換体コロニーを３日間２８℃で増殖させ、プ
レートに０.５Ｍカテコールの水溶液を噴霧した。液体
検定として、ストレプトマイセス(Ｓtreptomyces)株を
ＣaＣl2を欠くまたはＣaＣl2(６０mＭ)で補足したＲ２
ＹＥ液体培地５０ml、２８℃で増殖させた。異なる時間
にサンプルを取り、カテコールジオキシゲナーゼ活性を
[イングラムら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
(Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ)第１７１巻:６６１７−６６
２４頁、１９８９年]に記載の通り測定した。蛋白質濃
度を牛血清アルブミンを標準として用いるプラスミドフ
ォード法により測定した[ブラドフォード、アナリテカ
ル・バイオケミストリー(ＡＮＡＬ・ＢＩＯＣＨＥＭ)第
７２巻:２４８−２５４頁、１９７６年]。
プレート検定として、ストレプトマイセス(Ｓtreptomyc
es)形質転換体コロニーを３日間２８℃で増殖させ、プ
レートに０.５Ｍカテコールの水溶液を噴霧した。液体
検定として、ストレプトマイセス(Ｓtreptomyces)株を
ＣaＣl2を欠くまたはＣaＣl2(６０mＭ)で補足したＲ２
ＹＥ液体培地５０ml、２８℃で増殖させた。異なる時間
にサンプルを取り、カテコールジオキシゲナーゼ活性を
[イングラムら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
(Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ)第１７１巻:６６１７−６６
２４頁、１９８９年]に記載の通り測定した。蛋白質濃
度を牛血清アルブミンを標準として用いるプラスミドフ
ォード法により測定した[ブラドフォード、アナリテカ
ル・バイオケミストリー(ＡＮＡＬ・ＢＩＯＣＨＥＭ)第
７２巻:２４８−２５４頁、１９７６年]。
【００１７】下記の詳細な記述は本発明を説明するもの
である: Ｐo４３８のプロモータ活性 Ｐo４３８のプロモータ活性を２つの異なるプロモータ
プローブに含まれたアミノグリコシド ホスホトランス
フェラーゼ遺伝子およびカテコールジオキシゲナーゼ遺
伝子の発現により測定した。アミノグリコシド ホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子の発現。pＩＪ７０２プラス
ミドからの２４２ bp ＢglＩＩ−ＳstＩ断片をプロモ
ータを欠くアミノグリコシド ホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子(neo)を保有したpＩＪ４８７[ワードら、モレ
キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(ＭＯ
Ｌ．ＧＥＮ．ＧＥＮＥＴ)第２０３巻:４６８−４７８
頁、１９８６年]にサブクローンした。この遺伝子の発
現はストレプトマイセス・リビダンス(Ｓtreptomyces
lividans)にカナマイシン(Ｋm)およびネオマイシン耐性
を付与する。プラスミドpＵＬＡＤ５０をこうして造っ
た（図１）。pＵＬＡＤ５０により形質転換したストレ
プトマイセス・リビダンス(Ｓ．lividans)を１５０ug／
ml以上のＫmを含むＭＭに増殖させ得るが、それに反し
て、pＩＪ４８７(挿入したプロモータを欠くプロモータ
プローブ)により形質転換したストレプトマイセス・リ
ビダンス(Ｓ．lividans)は図２に示したように１０ug／
ml ＫmをもつＭＭに増殖しない。この結果は明らか
に、pＩＪ７０２のＢglＩＩ−ＳstＩ断片がＳstＩ部位
からＢglＩＩ部位への配位によりストレプトマイセス
(Ｓtreptomyces)のプロモータ活性を有することを示
す。
である: Ｐo４３８のプロモータ活性 Ｐo４３８のプロモータ活性を２つの異なるプロモータ
プローブに含まれたアミノグリコシド ホスホトランス
フェラーゼ遺伝子およびカテコールジオキシゲナーゼ遺
伝子の発現により測定した。アミノグリコシド ホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子の発現。pＩＪ７０２プラス
ミドからの２４２ bp ＢglＩＩ−ＳstＩ断片をプロモ
ータを欠くアミノグリコシド ホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子(neo)を保有したpＩＪ４８７[ワードら、モレ
キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(ＭＯ
Ｌ．ＧＥＮ．ＧＥＮＥＴ)第２０３巻:４６８−４７８
頁、１９８６年]にサブクローンした。この遺伝子の発
現はストレプトマイセス・リビダンス(Ｓtreptomyces
lividans)にカナマイシン(Ｋm)およびネオマイシン耐性
を付与する。プラスミドpＵＬＡＤ５０をこうして造っ
た（図１）。pＵＬＡＤ５０により形質転換したストレ
プトマイセス・リビダンス(Ｓ．lividans)を１５０ug／
ml以上のＫmを含むＭＭに増殖させ得るが、それに反し
て、pＩＪ４８７(挿入したプロモータを欠くプロモータ
プローブ)により形質転換したストレプトマイセス・リ
ビダンス(Ｓ．lividans)は図２に示したように１０ug／
ml ＫmをもつＭＭに増殖しない。この結果は明らか
に、pＩＪ７０２のＢglＩＩ−ＳstＩ断片がＳstＩ部位
からＢglＩＩ部位への配位によりストレプトマイセス
(Ｓtreptomyces)のプロモータ活性を有することを示
す。
【００１８】カテコール ジオキシゲナーゼ遺伝子の発
現。上記の実施例におけるように２４２ bp ＢglＩＩ
−ＳstＩ断片を異なるプロモータプローブベクター、酵
素カテコール ジオキシゲナーゼに対してコード化する
プソイドモナスプチダ(Ｐsendomonas putida)からのＸ
ylＥを保有するプラスミドにサブクローンした。ハイブ
ライドプラスミドをpＵＬＡＤ５１と命名した(図１)。p
ＵＬＡＤ５１により形質転換したストレプトマイセス・
リビダンス(Ｓtreptomyces lividans)を６０mＭまでの
ＣaＣl2で補足したＲ２ＹＥ培地に増殖させた。カテコ
ール ジオキシゲナーゼ活性の定量はＸylＥ遺伝子の下
流に挿入した場合、またＰo４３８がプロモータ活性を
発現することを示す(図６)。
現。上記の実施例におけるように２４２ bp ＢglＩＩ
−ＳstＩ断片を異なるプロモータプローブベクター、酵
素カテコール ジオキシゲナーゼに対してコード化する
プソイドモナスプチダ(Ｐsendomonas putida)からのＸ
ylＥを保有するプラスミドにサブクローンした。ハイブ
ライドプラスミドをpＵＬＡＤ５１と命名した(図１)。p
ＵＬＡＤ５１により形質転換したストレプトマイセス・
リビダンス(Ｓtreptomyces lividans)を６０mＭまでの
ＣaＣl2で補足したＲ２ＹＥ培地に増殖させた。カテコ
ール ジオキシゲナーゼ活性の定量はＸylＥ遺伝子の下
流に挿入した場合、またＰo４３８がプロモータ活性を
発現することを示す(図６)。
【００１９】カルシウムイオンによるＰo４３８からの
発現の調節。Ｐo４３８のプロモータ活性に及ぼす異な
るイオンの作用を分析した。カナマイシン耐性のレベル
は増殖培地中の塩の量によって異なるから〔ホプムウド
ら、ジェネティク・マニプレション・オブ・ストレプト
マイセス(Ｓtreptomyces)。ア・ラボラトリイ・マニュ
アル(Ａ．ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ．ＭＡＮＵＡＬ)ザ．ジ
ョン・イネス・ファウンデーション、ノリッヂ、ユー・
ケイ．１９８５年〕、ネオマイシン(ＮeＯ)をこれらの
研究のためにＭＭに用いた。全ての場合に、ＭＭをpＨ
の変化を避けるためにＴＥＳ緩衝液(２５mＭ、pＨ７.
２)で補足した。Ｍg2+、Ｆe2+、Ｚn2+、Ｃu2+陽イオン
はＰo４３８の力価に及ぼす作用はなかったが(ＭＭプレ
ート上での１７０ug／ml ＮeＯに対する耐性)、それに
反して、いくつかの一価陽イオン(Ｎa+、Ｋ+、Ｌi+、Ｃ
s+、１０mＭ)はプロモータ活性の僅かな減少を招き、１
００ug／ml以上のＮeＯを含むＭＭでの増殖はなかっ
た。プロモータ活性の減少は、ＭＭをリン酸緩衝液(２
０mＭ、pＨ７.２)で補足した場合にまた図５で示したよ
うに観察した。カルシウムイオンはＰo４３８のプロモ
ータ活性を正に調節する。Ｃa2+はpＵＬＡＤ５０プラス
ミドで形質転換したストレプトマイセス・リビダンス
(Ｓ．lividans)のＮeＯ耐性を増大し、ＣaＣl2濃度およ
びＮeＯレベル耐性の間の厳密な相互関係を示している
(第２表)。
発現の調節。Ｐo４３８のプロモータ活性に及ぼす異な
るイオンの作用を分析した。カナマイシン耐性のレベル
は増殖培地中の塩の量によって異なるから〔ホプムウド
ら、ジェネティク・マニプレション・オブ・ストレプト
マイセス(Ｓtreptomyces)。ア・ラボラトリイ・マニュ
アル(Ａ．ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ．ＭＡＮＵＡＬ)ザ．ジ
ョン・イネス・ファウンデーション、ノリッヂ、ユー・
ケイ．１９８５年〕、ネオマイシン(ＮeＯ)をこれらの
研究のためにＭＭに用いた。全ての場合に、ＭＭをpＨ
の変化を避けるためにＴＥＳ緩衝液(２５mＭ、pＨ７.
２)で補足した。Ｍg2+、Ｆe2+、Ｚn2+、Ｃu2+陽イオン
はＰo４３８の力価に及ぼす作用はなかったが(ＭＭプレ
ート上での１７０ug／ml ＮeＯに対する耐性)、それに
反して、いくつかの一価陽イオン(Ｎa+、Ｋ+、Ｌi+、Ｃ
s+、１０mＭ)はプロモータ活性の僅かな減少を招き、１
００ug／ml以上のＮeＯを含むＭＭでの増殖はなかっ
た。プロモータ活性の減少は、ＭＭをリン酸緩衝液(２
０mＭ、pＨ７.２)で補足した場合にまた図５で示したよ
うに観察した。カルシウムイオンはＰo４３８のプロモ
ータ活性を正に調節する。Ｃa2+はpＵＬＡＤ５０プラス
ミドで形質転換したストレプトマイセス・リビダンス
(Ｓ．lividans)のＮeＯ耐性を増大し、ＣaＣl2濃度およ
びＮeＯレベル耐性の間の厳密な相互関係を示している
(第２表)。
【００２０】プラスミドpＵＬＡＤ６０は、国際出願公
開第９０／１４４２６号に記載されているように、異な
るプロモータ、safプロモータと結合したneo遺伝子をも
つ同様なプラスミドの例を示す。しかし、pＵＬＡＤ６
０で形質転換したストレプトマイセス・リビダンス(Ｓt
reptomyces lividans)のＮeＯ耐性は、異なる濃度のＣ
aＣl2(０、１０、２０、３０、４０mＭ)を含むＭＭに増
殖する場合修飾されず、neo遺伝子生成物の翻訳後の刺
激またはネオマイシンのカルシウム不活性化がないこと
を示唆した。Ｃa2+の作用が特異的でなかった場合刺激
性作用が全構築物で観察される筈である。これは、Ｐo
４３８プロモータ活性を特異的にカルシウムイオンによ
り調節することを示す。カルシウム誘導体はまた図６に
記録したようにプラスミドpＵＬＡＤ５１で形質転換し
たストレプトマイセス・リビダンス(Ｓtreptomyces li
vidans)のＸylＥの発現で観察された。カテコール ジ
オキシゲナーゼ活性(Ｃat Ｏ2 ase)は、Ｒ２ＹＥ培地
を６０mＭまでのＣaＣl2で補足した場合非常に増大し
た。逆に、pＩＪ４０３８(Ｐo４３８プロモータを欠く
プロモータプローブベクター)で形質転換したストレプ
トマイセス・リビダンス(Ｓtreptomyces)のカテコール
ジオキシゲナーゼ活性は塩化カルシウム共存または不
在のＲ２ＹＥ培地に増殖した場合変わらない。
開第９０／１４４２６号に記載されているように、異な
るプロモータ、safプロモータと結合したneo遺伝子をも
つ同様なプラスミドの例を示す。しかし、pＵＬＡＤ６
０で形質転換したストレプトマイセス・リビダンス(Ｓt
reptomyces lividans)のＮeＯ耐性は、異なる濃度のＣ
aＣl2(０、１０、２０、３０、４０mＭ)を含むＭＭに増
殖する場合修飾されず、neo遺伝子生成物の翻訳後の刺
激またはネオマイシンのカルシウム不活性化がないこと
を示唆した。Ｃa2+の作用が特異的でなかった場合刺激
性作用が全構築物で観察される筈である。これは、Ｐo
４３８プロモータ活性を特異的にカルシウムイオンによ
り調節することを示す。カルシウム誘導体はまた図６に
記録したようにプラスミドpＵＬＡＤ５１で形質転換し
たストレプトマイセス・リビダンス(Ｓtreptomyces li
vidans)のＸylＥの発現で観察された。カテコール ジ
オキシゲナーゼ活性(Ｃat Ｏ2 ase)は、Ｒ２ＹＥ培地
を６０mＭまでのＣaＣl2で補足した場合非常に増大し
た。逆に、pＩＪ４０３８(Ｐo４３８プロモータを欠く
プロモータプローブベクター)で形質転換したストレプ
トマイセス・リビダンス(Ｓtreptomyces)のカテコール
ジオキシゲナーゼ活性は塩化カルシウム共存または不
在のＲ２ＹＥ培地に増殖した場合変わらない。
【００２１】Ｐo４３８での転写出発点の決定 Ｓ１ヌクレアーゼマッピング試験を、Ｐo４３８の転写
出発点および配列を測定するため行った。pＵＬＡＤ５
０から分離した２７０ bp ＨindＩＩＩ−ＳstＩ断片
をＨindＩＩＩ５'末端に標識し、pＵＬＡＤ５０を保有
するストレプトマイセス・リビダンス(Ｓtreptomyces
lividans)から分離したmＲＮＡとハイブリダイズした。
保護断片は、ＳstＩ部位から２４ntのＣ周辺に転写出発
点を位置させた(図４)調節プローブより約２４nt短いサ
イズを示した(図３)。２番目のＳ１ヌクレアーゼマッピ
ング試験を、Ｐo４３８ＤＮＡ領域を含む元のプラスミ
ドpＩＪ７０２で行った。pＩＪ７０２の２４２ bp Ｂ
glＩＩ−ＳstＩ断片をプローブとして用いた。断片をＢ
glＩＩ５'末端に標識し、pＩＪ７０２で形質転換したス
トレプトマイセス・リビダンス(Ｓtreptomyces livida
ns)から分離したmＲＮＡとハイブリダイズした。図３は
保護断片がつねにプローブより２４nt短かったことを示
し、転写開始がpＵＬＡＤ５０と同様なヌクレオチドでp
ＩＪ７０２に起こることを示す。
出発点および配列を測定するため行った。pＵＬＡＤ５
０から分離した２７０ bp ＨindＩＩＩ−ＳstＩ断片
をＨindＩＩＩ５'末端に標識し、pＵＬＡＤ５０を保有
するストレプトマイセス・リビダンス(Ｓtreptomyces
lividans)から分離したmＲＮＡとハイブリダイズした。
保護断片は、ＳstＩ部位から２４ntのＣ周辺に転写出発
点を位置させた(図４)調節プローブより約２４nt短いサ
イズを示した(図３)。２番目のＳ１ヌクレアーゼマッピ
ング試験を、Ｐo４３８ＤＮＡ領域を含む元のプラスミ
ドpＩＪ７０２で行った。pＩＪ７０２の２４２ bp Ｂ
glＩＩ−ＳstＩ断片をプローブとして用いた。断片をＢ
glＩＩ５'末端に標識し、pＩＪ７０２で形質転換したス
トレプトマイセス・リビダンス(Ｓtreptomyces livida
ns)から分離したmＲＮＡとハイブリダイズした。図３は
保護断片がつねにプローブより２４nt短かったことを示
し、転写開始がpＵＬＡＤ５０と同様なヌクレオチドでp
ＩＪ７０２に起こることを示す。
【００２２】図４は、ＯＲＦ４３８の出発コドンから約
３０nt下流に位置したＯＲＦ４３８のmel遺伝子のプロ
モータ領域[ゲイストリヒら、モレキュラー・マイクロ
バイオロジー(Ｍolecular．Ｍicrobiology)第３巻:１０
６１−１０６９頁、１９８９年ロィら、ジーン(ＧＥＮ
Ｅ)第８４巻:２６７−２７７頁、１９８９年]およびＯ
ＲＦ４３８のそれと逆配位に位置したＰo４３８プロモ
ータおよび本研究のＳ１ヌクレアーゼマッピング試験に
よるその転写出発点を示す。アミノグリコシド ホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子およびカテコール ジオキシ
ゲナーゼ遺伝子を特に例に挙げたが、Ｐo４３８プロモ
ータの使用により発現を増進するために、用いるストレ
プトマイセス・リビダンス(Ｓtreptmyces)種により生産
した全てのポリペプチドまたは蛋白質に対する遺伝子を
天然のプロモータを除去することおよびＰo４３８プロ
モータで置換することにより修飾し得ることがわかる。
同様に、ポリペプチドまたは蛋白質をコード化する異種
ＤＮＡを全ての上記の内因性遺伝子に挿入し得る。しか
し好ましくは、選択した内因性遺伝子は細胞壁を通し
て、培地中に発現するものであり、その場合、それは分
泌シグナル配列を保つことが重要である。それ故外来Ｄ
ＮＡを細胞外酵素遺伝子からできるだけ多く分泌シグナ
ルを保つように上記の方法により挿入することが好まし
い。これらのシグナルは優勢にリーダー配列上にある
が、細胞外酵素に対する内因性遺伝子に関してターミナ
ル カルボキシル末端がまた分泌に重要であることの証
拠がある。それ故、内因性ＤＮＡに外来ＤＮＡを挿入す
ることではなく内因性ＤＮＡの転写部分を除去すること
および外来ＤＮＡを置換することにより融合蛋白質を造
ることが最良である。
３０nt下流に位置したＯＲＦ４３８のmel遺伝子のプロ
モータ領域[ゲイストリヒら、モレキュラー・マイクロ
バイオロジー(Ｍolecular．Ｍicrobiology)第３巻:１０
６１−１０６９頁、１９８９年ロィら、ジーン(ＧＥＮ
Ｅ)第８４巻:２６７−２７７頁、１９８９年]およびＯ
ＲＦ４３８のそれと逆配位に位置したＰo４３８プロモ
ータおよび本研究のＳ１ヌクレアーゼマッピング試験に
よるその転写出発点を示す。アミノグリコシド ホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子およびカテコール ジオキシ
ゲナーゼ遺伝子を特に例に挙げたが、Ｐo４３８プロモ
ータの使用により発現を増進するために、用いるストレ
プトマイセス・リビダンス(Ｓtreptmyces)種により生産
した全てのポリペプチドまたは蛋白質に対する遺伝子を
天然のプロモータを除去することおよびＰo４３８プロ
モータで置換することにより修飾し得ることがわかる。
同様に、ポリペプチドまたは蛋白質をコード化する異種
ＤＮＡを全ての上記の内因性遺伝子に挿入し得る。しか
し好ましくは、選択した内因性遺伝子は細胞壁を通し
て、培地中に発現するものであり、その場合、それは分
泌シグナル配列を保つことが重要である。それ故外来Ｄ
ＮＡを細胞外酵素遺伝子からできるだけ多く分泌シグナ
ルを保つように上記の方法により挿入することが好まし
い。これらのシグナルは優勢にリーダー配列上にある
が、細胞外酵素に対する内因性遺伝子に関してターミナ
ル カルボキシル末端がまた分泌に重要であることの証
拠がある。それ故、内因性ＤＮＡに外来ＤＮＡを挿入す
ることではなく内因性ＤＮＡの転写部分を除去すること
および外来ＤＮＡを置換することにより融合蛋白質を造
ることが最良である。
【００２３】外来ＤＮＡ配列は、蛋白質またはポリペプ
チドを暗号化している全ての非ストレプトマイセス(Ｓt
reptmyces)由来のＤＮＡ配列、特に真核生物またはウイ
ルス起源のものであり得ることをまた理解すべきであ
る。上記の真核生物およびウイルスＤＮＡ配列の例は、
ヒトおよび動物真核生物インタフェロン(ＩＦＮ−アル
ファ)線維芽細胞インタフェロン(ＩＦＮ−ベーター)お
よび免疫性インタフェロン(ＩＦＮ−ガンマー)、ヒトイ
ンシュリン、コルチコトロビン放出因子(ＣＲＦ)のよう
なヒトおよび動物成長および他のホルモン、ヒト血清ア
ルブミンおよびいろいろなヒト血液因子およびプラスミ
ノゲン活性化因子、両組織およびウロキナーゼ、Ｂ型肝
炎ウイルスコアおよび表面抗原、ＦＭＤウイルス抗原お
よび他のヒト、動物およびウイルスポリペプチドおよび
蛋白質を暗号化している配列である。
チドを暗号化している全ての非ストレプトマイセス(Ｓt
reptmyces)由来のＤＮＡ配列、特に真核生物またはウイ
ルス起源のものであり得ることをまた理解すべきであ
る。上記の真核生物およびウイルスＤＮＡ配列の例は、
ヒトおよび動物真核生物インタフェロン(ＩＦＮ−アル
ファ)線維芽細胞インタフェロン(ＩＦＮ−ベーター)お
よび免疫性インタフェロン(ＩＦＮ−ガンマー)、ヒトイ
ンシュリン、コルチコトロビン放出因子(ＣＲＦ)のよう
なヒトおよび動物成長および他のホルモン、ヒト血清ア
ルブミンおよびいろいろなヒト血液因子およびプラスミ
ノゲン活性化因子、両組織およびウロキナーゼ、Ｂ型肝
炎ウイルスコアおよび表面抗原、ＦＭＤウイルス抗原お
よび他のヒト、動物およびウイルスポリペプチドおよび
蛋白質を暗号化している配列である。
【００２４】
【表１】
【表２】
【００２５】図および表１に引用した参考文献 ゲイストリヒ．エム、イル＝ゲル．エスおよびフテル．
アル:ストレプトマイセス・グラウセスセンス(Ｓtreptm
yces glaucescens)melオペロンからの調節したプロモ
ータの局在および基本的分布。モレキェラー・マイクロ
バイオロジー(Ｍolecular．Ｍicrobiology)第３巻(１９
８９年)１０６１−１０６９頁)。ホプウド．デ．エ:ス
トレプトマイセス・コエリコロル(Ｓtreptmyces coeli
color)の遺伝学的分析およびゲノム構造。バクテリアル
・レビュー(Ｂacterial．Ｒeview)第３１巻(１９６７
年)３７３−４０３頁。カツ・エ、トムプソン．シ．ジ
ェおよびホプウド．ディ．エ:ストレプトマイセス・リ
ビダンス(Ｓtreptmyces lividans)中へのストレプトマ
イセス・アンテバイオテカス(Ｓtreptomyces antibiot
icus)からのチロシナーゼ遺伝子のクローニングおよび
発現。ジャーナル・オブ・シェネナル・マイクロバイオ
ロジー(Ｊ．Ｇen．Ｍicrobiol)第１２９巻(１９８３年)
２７０３−２７１４頁。ロイ、ダブリュ．−エム、ム、
エス．−ワイ、リン、ジェ、−ジェ、ロ、エス．ジェお
よびムゥ リー、ワイ．−エッチ:ストレプトマイセス
アンテバイオテカス(Ｓtreptomyces antibioticus)か
らのメラニン遺伝子座のプロモータ領域の分析。ジーン
(Ｇene)第８４巻(１９８９年)２６７−２７７頁。ワー
ド、ジェ．エム．、ジャンセン、ジ・アル、キエセル、
ティ、ビブ、エム．ジェ、ブトネル、エム．ジェおよび
ビブ、エム．ジェ:インデケーターとしてＴn５からのア
ミノグリコシド ホスホトランスフェラーゼを用いたス
トレプトマイセス(Ｓtreptomyces)に対する一連の多重
コピーのプロモータプローブプラスミド ベクターの構
築および特性。モレキュラル・アンド・ジェネラル・ジ
ェネティク(Ｍol．Ｇen．Ｇenet)第２０３巻(１９８６
年)４６８−４７８頁。
アル:ストレプトマイセス・グラウセスセンス(Ｓtreptm
yces glaucescens)melオペロンからの調節したプロモ
ータの局在および基本的分布。モレキェラー・マイクロ
バイオロジー(Ｍolecular．Ｍicrobiology)第３巻(１９
８９年)１０６１−１０６９頁)。ホプウド．デ．エ:ス
トレプトマイセス・コエリコロル(Ｓtreptmyces coeli
color)の遺伝学的分析およびゲノム構造。バクテリアル
・レビュー(Ｂacterial．Ｒeview)第３１巻(１９６７
年)３７３−４０３頁。カツ・エ、トムプソン．シ．ジ
ェおよびホプウド．ディ．エ:ストレプトマイセス・リ
ビダンス(Ｓtreptmyces lividans)中へのストレプトマ
イセス・アンテバイオテカス(Ｓtreptomyces antibiot
icus)からのチロシナーゼ遺伝子のクローニングおよび
発現。ジャーナル・オブ・シェネナル・マイクロバイオ
ロジー(Ｊ．Ｇen．Ｍicrobiol)第１２９巻(１９８３年)
２７０３−２７１４頁。ロイ、ダブリュ．−エム、ム、
エス．−ワイ、リン、ジェ、−ジェ、ロ、エス．ジェお
よびムゥ リー、ワイ．−エッチ:ストレプトマイセス
アンテバイオテカス(Ｓtreptomyces antibioticus)か
らのメラニン遺伝子座のプロモータ領域の分析。ジーン
(Ｇene)第８４巻(１９８９年)２６７−２７７頁。ワー
ド、ジェ．エム．、ジャンセン、ジ・アル、キエセル、
ティ、ビブ、エム．ジェ、ブトネル、エム．ジェおよび
ビブ、エム．ジェ:インデケーターとしてＴn５からのア
ミノグリコシド ホスホトランスフェラーゼを用いたス
トレプトマイセス(Ｓtreptomyces)に対する一連の多重
コピーのプロモータプローブプラスミド ベクターの構
築および特性。モレキュラル・アンド・ジェネラル・ジ
ェネティク(Ｍol．Ｇen．Ｇenet)第２０３巻(１９８６
年)４６８−４７８頁。
【図１】プロモータ−プローブベクターｐＩＪ４８７
（ワードら、１９８６年）およびｐＩＪ４０８３中にク
ローンされたｐＩＪ７０２の２４２ｂｐ ＳｓｔＩ−Ｂ
ｇｌII断片（Ｐｏ４３８を含有）を保有するプラスミド
ｐＵＬＡＤ５０およびｐＵＬＡＤ５１の構築を示す図で
ある。
（ワードら、１９８６年）およびｐＩＪ４０８３中にク
ローンされたｐＩＪ７０２の２４２ｂｐ ＳｓｔＩ−Ｂ
ｇｌII断片（Ｐｏ４３８を含有）を保有するプラスミド
ｐＵＬＡＤ５０およびｐＵＬＡＤ５１の構築を示す図で
ある。
【図２】ｐＩＪ７０２の２４２ｂｐ ＳｓｔＩ−Ｂｇｌ
II断片のプロモータ活性を示す図である。
II断片のプロモータ活性を示す図である。
【図３】pＩＪ７０２の２４２ ｂｐ ＳｓｔＩ−Ｂｇ
ｌII断片を保有するpＵＬＡＤ５０の領域およびＳ１マ
ッピングによるストラテジーの図解である。
ｌII断片を保有するpＵＬＡＤ５０の領域およびＳ１マ
ッピングによるストラテジーの図解である。
【図４】そのアミノ酸配列を示しているＯＲＦ４３８を
含むmelクラスターのＤＮＡ領域のヌクレオチド配列で
ある。
含むmelクラスターのＤＮＡ領域のヌクレオチド配列で
ある。
【図５】Ｐo４３８プロモータからの発現のリン酸抑制
を示す図である。
を示す図である。
【図６】Ｐo４３８プロモータの下流に位置した場合の
プソイドモナス・プチダ(Ｐsendomonas putida)のプロ
モータを欠くＸylＥ遺伝子のストレプトマイセス(Ｓtre
ptomyces)中でのカルシウム誘導を示すグラフである。
プソイドモナス・プチダ(Ｐsendomonas putida)のプロ
モータを欠くＸylＥ遺伝子のストレプトマイセス(Ｓtre
ptomyces)中でのカルシウム誘導を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 ホセ・アントニオ・ヒル スペイン24008レオン、アベニーダ・マ リアーノ・アンドレス18−３デ番 (72)発明者 トーマス・ビガル・ガルシア スペイン24002レオン、カジェ／アルバ ロ・ロペス・ヌネス10−４デ番 (72)発明者 フアン・フランシスコ・マルティン スペイン2400レオン、アベニーダ・ファ クルタッド・デ・ベテリナリア13−４ア ー番 (56)参考文献 特表 平４−501855（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．37（1985）ｐ. 101−110 Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．25（1983）ｐ. 119−132 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ
Claims (11)
- 【請求項１】 下記のヌクレオチド配列を有するDNAま
たはその断片であって、当該DNAまたは断片がカルシウ
ム調節プロモータ活性を有するもの： 【化１】 - 【請求項２】 DNAまたは断片が、それに作動可能に結
合したストレプトマイセス（Streptomyces)の細胞外酵
素遺伝子の発現に対し、カルシウム調節プロモータ活性
を発揮するものである、請求項１記載のDNAまたは断
片。 - 【請求項３】 請求項１記載のヌクレオチド配列を有す
るDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するDNAであって、カルシウム調節プロモータ活性を有
するもの。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか記載のDNAまた
は断片を含む、プロモータ。 - 【請求項５】 請求項１記載のDNAまたは断片と、これ
に作動可能に結合したポリペプチドまたは蛋白質をコー
ドする遺伝子を含む、クローニングビークル。 - 【請求項６】 遺伝子が、ストレプトマイセスに内因性
のものである、請求項５記載のクローニングビークル。 - 【請求項７】 遺伝子が、同じ解読枠中で非ストレプト
マイセスのポリペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝
子に融合されたストレプトマイセスに内因性のポリペプ
チドまたは蛋白質をコードする遺伝子の全部または一部
を含む、請求項５記載のクローニングビークル。 - 【請求項８】 請求項５〜７のいずれか記載のクローニ
ングビークルにより形質転換された、ストレプトマイセ
ス宿主細胞。 - 【請求項９】 請求項４記載のプロモータを含んでいる
ストレプトマイセス発現制御配列に作動可能に外来DNA
を結合させることを特徴とする、ストレプトマイセス中
で外来DNAを発現させる方法。 - 【請求項１０】 外来DNAおよびストレプトマイセス発
現制御配列がストレプトマイセスの染色体DNAに挿入さ
れる、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 外来DNAが、ストレプトマイセスから
分泌される蛋白質またはポリペプチドのシグナル配列の
少なくとも一部をコードしているDNAを介してストレプ
トマイセス発現制御配列に作動可能に連結され、上記シ
グナル配列をコードするDNAが上記ストレプトマイセス
発現制御配列の制御の下に上記外来DNAと共に発現され
て、当該外来DNAによりコードされている蛋白質または
ポリペプチドを分泌するものである、請求項９記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES9102765 | 1991-12-12 | ||
| ES9102765 | 1991-12-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33150692A Expired - Fee Related JP3340164B2 (ja) | 1991-12-12 | 1992-12-11 | 新規なカルシウム調節プロモータｐｏ４３８ |
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|---|---|
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| JP (1) | JP3340164B2 (ja) |
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| US4745056A (en) * | 1984-10-23 | 1988-05-17 | Biotechnica International, Inc. | Streptomyces secretion vector |
| DE3536182A1 (de) * | 1985-10-10 | 1987-04-16 | Hoechst Ag | Promotor-anordnung fuer streptomyceten-vektoren |
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| US5118617A (en) * | 1989-05-19 | 1992-06-02 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Saf polypeptide, gene coding therefor, saf promoter and expression methods for expressing foreign dna sequences in streptomyces |
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