DE69220336T2

DE69220336T2 - Kalzium-geregelter Promotor

Info

Publication number: DE69220336T2
Application number: DE69220336T
Authority: DE
Inventors: Tomas Vigal Garcia; Jose Antonio Gil; Juan Francisco Martin; Antonio Daza Ortega
Original assignee: Laboratorios Serono SA
Current assignee: Merck SL
Priority date: 1991-12-12
Filing date: 1992-12-10
Publication date: 1997-09-25
Anticipated expiration: 2012-12-11
Also published as: JPH05336972A; EP0546833B1; DK0546833T3; US5385841A; DE69220336D1; GR3024625T3; IL103975A; CA2084351C; LV10728A; ZA929284B; CA2084351A1; LT3133B; IL103975A0; ATE154392T1; AU661073B2; RU2112802C1; US5660999A; LTIP237A; AU2979192A; LV10728B

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf einen Calcium-regulierten Promotor ("Po438"), insbesondere auf einen neuen, für die steigende Produktion extrazellulärer Enzyme oder heterologer Polypeptide verwendbaren Calcium-regulierten Promotor, einen rekombinanten Vektor, der die DNA-Sequenz des Promotors, der mit einer für das Enzym oder Polypeptid kodierenden DNA funktionell verbunden ist, enthält und einen Wirtsorganismus, transformiert mit dem rekombinanten Vektor, der den Promotor enthält, der mit der für das Enzym oder Polypeptid kodierenden DNA fünktionell verbunden ist. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf Expressionssysteme von Streptomyces und Methoden für die Expression von Fremd-DNA-Sequenzen in Streptomyces und für die Sekretion von Polypeptiden und Proteinen, die von den Fremd- DNA-Sequenzen kodiert werden, in das umgebende Medium.
Die Streptomyceten sind als Produzenten einer Vielfalt extrazellulärer Enzyme, einschließlich Proteasen, Phosphatasen, Xylanasen, Cellulasen, Amylasen, Lipasen und Nukleasen, gut bekannt.
Zusätzlich bilden Angehörige der Gattung Streptomyces eine große Anzahl an Antibiotika, Pigmenten und anderen Sekundärmetaboliten und weisen ein komplexes Differenzierungsmuster, woraus die Bildung von Sporen resultiert, auf. In Batch- Kulturen von Streptomyces stimmt gewöhnlich die Produktion extrazellulärer Enzyme mit dem Einsetzen der Antibiotikabildung, der Pigmentbiosynthese und der Sporulation überein. All diese Prozesse werden durch Nährbedingungen, die eine hohe Wachstumsrate fördern, reprimiert und durch Mangel an P-, C- oder N-Quellen dereprimiert. Es ist unwahrscheinlich, daß Enzymsekretion, Bildung sekundärer Metabolite und Differenzierung vollständig unabhängig voneinander sind, sondern auf ähnliche Auslösemechanismen reagieren.
Es wurden verschieden Gene von Streptomyces, die für extrazelluläre Enzyme kodieren, kloniert. Diese umfassen Agarase von Streptomyces coelicolor, Endoglykosidase H von Streptomyces plicatus, Xylanase von Streptomyces lividans, alpha-Amylase von Streptomyces hygroscopicus, Cellulase von Strep. spA2, beta-Galaktosidase von Strep. lividans und beta-Lactamase von Strep. cacaoi, badius und fradiae.
Die Regulationsmechanismen, die die Expression dieser Gene kontrollieren, sind im Grunde genommen jedoch unbekannt. Zusätzlich zu spezifischen Regulationsmechanismen, wie Induktion der Amylase durch Dextrine oder Maltotriose und Kohlenstoffmetabolitregulation von Amylase oder Agarase, treten wahrscheinlich allgemeine Derepressionsmechanismen für verschiedene extrazelluläre Enzyme ein, da nach einer Nährstoffabnahme in Streptomyces eine gleichzeitige Bildung verschiedener, polymere Substrate abbauende Enzyme beobachtet wurden. Derartige transagierende Regulationsgene wurden in Bacillus subtilis (J. Bacteriol. 169: 324-333, 1987), Bacillus natto (J. Bacteriol. 166: 20-28, 1986) und Bacillus licheniformis gefünden.
Positive Regulationsgene, die die Enzymsynthese und/oder -sekretion betreffen, können kloniert werden, indem bei einem sekretionsarmen Stamm, wie S. lividans, nach erhöhter Sekretion extrazellulärer Enzyme gesucht wird.
Expressionssysteme für Fremd-DNA-Sequenzen in Streptomyces sind bereits in beispielsweise EP 148,552 und WO 88/07079 beschrieben. Diese Systeme nutzen den endogenen Promotor für extrazelluläre Enzyme, die von Streptomyces gebildet werden.
Der Ersatz der endogenen Promotoren durch Fremdpromotoren ist in WO 90/14426 offenbart, worin die Klonierung und Charakterisierung eines neu isolierten Gens, des saf- Gens, das für ein neues Polypeptid kodiert, bezeichnet als saf-Polypeptid, das direkt oder indirekt die Genexpression für extrazelluläre Enzyme in Streptomyces durch Wechselwirkung mit der Kontroliregion der Strukturgene für die extrazellulären Enzyme reguliert, beschrieben ist.
Der Promotor des saf-Gens erwies sich als wirksamer als der natürliche Promotor extrazellulärer Enzyme Bespielsweise exprimiert das Amylasegen höhere Amylasemengen, wenn der saf-Promotor den natürlichen Amylasepromotor ersetzt. Somit kann der saf-Promotor zwecks einer erhöhten Expression eines jeglichen endogenen Polypeptids oder Proteins anstelle des natürlichen Promotors des Proteins verwendet werden.
Für die Klonierung und Charakterisierung des saf-Gens wurde Plasmid PIJ702 (Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129: 2703-2714, 1983) als Klonierungsvektor verwendet. Dieses Plasmid enthalt das Tyrosinasegen, dessen Enzym lür die Bildung von Melanin aus Tyrosin in verschiedenen Streptomycesaaten verantwortlich ist. Der mel-Genort in PIJ702 wurde sequenziert und zwei offene Leseraster (ORFs) identifiziert: das erste ist der dem mel-Gen, das für die Polypeptidkette der Tyrosinase kodiert, entsprechende ORF; das zweite ORF, stromaufwärts vom mel-Gen lokalisiert, wurde ORF438 genannt (Bernan et al., Gene 37:101-110, 1985), dessen Rolle bis jetzt aber unbekannt ist.
Während der zur genauen Lokalisierung des saf-Gens durchgetührten Untersuchungen wurde das Fragment SstI-Kpnl (432 Nukleostide - saf-Gen ohne Promotor) in die BglII- Schnittstelle von pJI702 eingefügt. Ein überraschender Aspekt der Untersuchungen war die mangelnde Expression dieses Fragments bei Insertion in rechter Orientierung und seine Expression nach Einbau in umgekehrter Richtung (im Uhrzeigersinn) zu ORF438. Dieser Befünd beinhaltete das Vorliegen eines Fragments vor dem mel-Gen und an der BglII-Klonierungsstelle, lokalisiert innerhalb des ORF438 in umgekehrter Orientierung, mit Promotoraktivitat.
Eine Hauptaufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Promotors, der in einem DNA-Fragment, enthalten innerhalb des ORF438 des pIJ702-Plasmids, identifiziert wurde. Die Promotoraktivität wurd durch Calciumionen positiv reguliert; die Expression der für die extrazellulären Enzyme in Streptomyces zuständigen, funktionell mit dem Promotor verbundenen Gene steigt in Gegenwart von CaCl&sub2;- Lösungen signifikant an.
Es ist ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung, Klonierungsvehikel (Vektoren), die den Promotor, fünktionell mit einer endogenen oder Fremd-DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid oder Protein kodiert, verbunden, enthalten, wie auch mit solchen Klonierungsvehikeln transformierte Wirtsorganismen oder Zellen bereitzustellen, woraus die Expression und Sekretion der durch die DNA-Sequenz kodierten Polypeptide resultiert.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Integration eines solchen, eine Fremd-DNA enthaltenden Klonierungsvehikeis in die chromosomale DNA von Streptomyces.
Es ist weiterhin ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Enzyms, eines gewunschten Polypeptids oder Proteins durch Kultivierung eines transformierten Wirtsorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung und Gewinnung des Produkts aus der Kulturbrühe bereitzustellen.
Der neue, im ORF438 enthaltende Promotor zeigt in umgekehrter Orientierung zu der des ORF438 Promotoraktivität und wird im folgenden als Po438 (Promotor opposite to the ORF438) bezeichnet. Die Kenntnis über seine Promotoraktivität in pIJ702 bei Orientierung im Uhrzeigersinn ist zur Vermeidung von Irrtümern bei der Interpretation von Genexpressionsuntersuchungen von in diesen Vektor klonierten DNA-Fragmenten sehr wichtig.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform einen Calciumregulierten Promotor bereit, der dadurch gekennzeichnet ist, dafl er die folgende DNA- Sequenz
oder ein Fragment dieser Sequenz mit dieser Aktivität enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso eine DNA-Sequenz bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mit einer, wie oben definierten Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert, einzeisträngig ist und eine Calcium-regulierte Promotoraktivität aufeist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Klonierungsvehikel bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine DNA-Sequenz umfaßt, die vorzugsweise für Streptomyces endogen ist, welche für ein Polypeptid oder Protein kodiert und fünktionell mit einem wie oben definierten Promotor verbunden ist. Vorzugsweise umfaßt die DNA-Sequenz die gesamte oder einen Teil einer Sequenz, die für ein Polypeptid oder Protein kodiert, das für Streptomyces endogen ist, an die im gleichen Leserahmen eine DNA-Sequenz angebunden wurde, die für ein Nicht- Streptomyces-Polypeptid oder -Protein kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Streptomyces-Wirtszelle zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mit einem solchen Klonierungsvehikel transformiert wurde.
Ebenso stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Expression einer Fremd-DNA- Sequenz in Streptomyces zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es das fünktionelle Verbinden der Fremd-DNA-Sequenz mit einer Streptomyces-Expressionskontrollsequenz, die einen wie oben angegebenen Promotor enthält, umfaßt. In einem solchen Verfahren werden die Fremd-DNA-Sequenz und die Streptomyces-Expressionskontrollsequenz vorzugsweise in die chromosomale DNA von Streptomyces eingefügt. Allgemein ist die Fremd-DNA-Sequenz mit der Streptomyces-Expressionskontrollsequenz über eine DNA-Sequenz fünktionell verbunden, die mindestens einen Teil der Signalsequenz des Proteins oder Polypeptids, das von Streptomyces sekretiert wird, kodiert, wobei die die Signalsequenz kodierende DNA-Sequenz zusammen mit der Fremd-DNA-Sequenz unter der Kontrolle der Streptomyces-Expressionskontrollsequenz exprimiert wird, um die Sekretion des durch die Fremd-DNA-Sequenz kodierten Proteins oder Polypeptids zu ermöglichen.
Der Po438-Promotor ist der erste bekannte Calcium-regulierte Promotor, der in Streptomyces etabliert wurde und der für die gesteigerte Expression ausgewählter heterologer Proteine in Streptomyces verwendbar ist, durch Insertion des DNA- Fragments, das den Po438-Promotor in einer geeigneten Schnittstelle stromaulwärts des für das gewunschte Protein kodierenden Gens enthält, in ein geeignetes Klonierungsvehikel, Transformation eines Streptomyces-Wirtes mit einem solchen Kionierungsvehikel und Kultivierung der transformierten Bakterien in Gegenwart einer Ca²&spplus;-Lösung zur Exkretion des ausgewählten Proteins oder Teile davon.
Die Promotoraktivität von Po438 wurde unter Verwendung zweier verschiedener mit Promotorsonden ausgestatteter Vektoren gefünden Das den P0438-Promotor enthaltende DNA-Fragment wurde in zwei verschiedene Plasmide, die das promotorlose Aminoglykosidase-Phosphotransferasegen (neo) bzw. das promotorlose Catecholdioxygenasegen (XylE) trugen, subkloniert (Fig. 1). Beide Gene exprimieren große Mengen jedes Enzyms in Gegenwart steigender Calciumionenkonzentrationen, was somit auf die Calcium-regulierende Promotoraktivität von Po438 hinweist.
Der Transkriptionsstartpunkt in Po438 wurde durch ein S1-Nuklease-Kartierungsexperiment bestimmt, das den Startpunkt in der Nähe des C bei 24 nt von der SstI- Schnittstelle festlegte (Fig. 4).
Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen:
Fig. 1 Plasmidkonstrukte pULAD50 und pULAD51, die das 242-bp-SstI-BglII- Fragment von pIJ702 (enthaltend Po438), kloniert in die Promotorsonde aulweisende Vektoren PIJ487 (Ward et al., Mol. Gen. Genet., 203: 468478, 1965) und pIJ4038, tragen.
Fig. 2 Promotoraktivität des 242-bp-SstI-BglII-Fragments von pIJ702. Ein Kanamycingradient (0-180 ug/ml) wurde auffestem MM-Medium (Hopwood, Bacterial Rev., 31: 373-403, 1967) eingesetzt und S. lividans, das das Plasmid pULAD50 (A) oder pIJ487 (B) enthielt, darauf ausgestrichen.
Fig. 3 Schematische Darstellung einer pULAD50-Region, die das 242-bp-SstI- BglII-Fragment von pI3702 trägt und die für die S1-Kartierung gefolgte Strategie. In dem Diagramm stellt der mit Sternchen markierte Balken das markierte Fragment dar und der Balken mit S1 das erhaltene geschützte Fragment. Die Bahnen A-C-G-T zeigen die vier Sequenzreaktionen tür die M13mp18-Einzelstrang-DNA (rechts) und für das 242-bp-SstI-BGlII-Fragment von pIJ702 (links).
1 - Geschütztes Fragment in der Hybridisation zwischen dem 270-nt- HindIII-SstI-Fragment von pULAD50 und mRNA von S. lividans (pULAD50).
2 - 270-nt-HindIII-SstI-Sonde.
3 - 242-nt-BglII-SstI-Sonde
4 - Geschütztes Fragment in der Hybridisation zwischen dem 242-nt-BglII- SstI-Fragment von pIJ702 und mRNA von S. lividans (pIJ702).
Die Pfeilspitzen verweisen auf die den geschützten Fragmenten entsprechenden Hybridisationsbanden.
Fig. 4 Nukleotidsequenz der DNA-Region im mel-Cluster, das den ORF438 enthält, dessen Aminosauresequenz angedeutet ist. Die BglII- und SstI-Restriktionsschnittstellen, die das in pIJ487 zur Konstruktion von pULAD50 klonierte DNA- Fragment flankieren, sind angezeigt. Die ersten beiden Aminosäuren der Tyrosinase sind ebenfalls gezeigt.
TInitiation der mel-Transkription gemäß Geistlich et al., Molecular Microbiology 3:1061, 1069 (1989) und Leu et al., Gene 84: 267-277 (1989).
TTranskriptionsinitiation von Po438 gemäß S1-Nuklease-Kartierungsexperiment (Fig. 3).
rbs Ribosomenbindestelle.
Fig. 5 Phosphatrepression der Expression vom Po438-Promotor. Ein Neomycin- Gradient (0-180 µg/ml) wurde auffestem MM+TES-Puffer (825 mM, pH 7.2), obere Platte, und auf demselben Medium mit zugesetztem 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7.2, untere Platte, hergestellt. Beide Platten wurden mit einem ähnlichen Anteil an S. lividans-(pULAD50)-Sporen ausgestrichen.
Fig. 6 Calciuminduktion des promotorlosen XylE-Gens von Pseudomonas putida in Streptomyces bei Plazierung stromabwärts des Po438-Promotors. S. lividans(PULADS 51) wurde in Calcium-freiem R2YE-Flüssigmedium ( ) und R2YE-Medium mit zusätzlich zugesetztem CaCl&sub2; bis zu 60 mM (Δ) wachsen gelassen. Catecholdioxygenase-Aktivität (CatO&sub2;ase) von mit pIJ4083 transformiertem S. lividans (o) änderte sich nicht bei Wachstum in R2YE-Medium mit oder ohne CaCl&sub2;.
Die hierin beschriebene Arbeit wurde unter Verwendung der folgenden Materialien und Methoden durchgeführt.
Bakterienstämme und Plasmide. Die in diesen Untersuchungen verwendeten Streptomyces-Stämme und -Plasmide sind unten in der Tabelle 1 aufgeführt.
Medien und Kultivierungsbedingungen. Transformation von Protoplasten. Streptomyces- Stämme wurden in R2YE, Minimalmedium (MM) oder YEME unter Zusatz von 34% Sucrose und 5 mM MgCl&sub2; (Hopwood et al., Genetic manipulation pf Streptomyces. A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985) wachsen gelassen. Flüssigkulturen von Streptomyces wurden in Kolben mit Dreifach-Schikanen bei 28ºC in einem Rotationsschüttler bei einer Umdrehung von 220 rpm wachsen gelassen.
Die Herstellung und Transformation von S. lividans-Protoplasten erfolgte wie beschrieben (Thompson et al., J. Bacteriol. 151: 668-677 1982).
DNA-Isolierung, -Manipulation und -Sequenzierung. Plasmid-DNA wurde nach der Kiesermethode isoliert (Kieser et al., Plasmid 12:19-36, 1984). Verdaus und Ligationen wurden durch Agarosegelelektrophorese kontrolliert. Die Bedingungen für den Verdau mit einer Restriktionsendonuklease und die Ligationsreaktionen waren die durch den Hersteller empfohlenen. Subklonierung von DNA-Fragmenten wurde durch Verdau von 1-2 µg Plasmid-DNA mit entsprechendem/n Restriktionsenzym(en) durchgelührt und die Reaktionsprodukte durch Gelelektrophorese in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMPA) getrennt.
Die Nukleotidsequenz wurde durch die Kettenabschlußmethode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977) unter Verwendung von M13- Klonen (Messing et al., Nucl. Acids Res. 9: 309-321, 1981) bestimmt.
RNA-Isolierung und S1-Nuklease-Kartierung. RNA wurde gemäß Kirby (Kirby et al., Biochem. J. 104: 258-262, 1967) aus 50-Stunden-Kulturen in MM-Medium isoliert. Für die S1-Kartierung wurden die DNA-Sonden endmarkiert (Maxam und Gilbert, Methods Enzymol. 65: 499-560, 1980). RNA (40 µg) wurde mit 10&sup5; c.p.m. eines (³²P)- endmarkierten DNA-Fragments gemischt und bei 85ºC für 15 Min. denaturiert (Favalora et al., Methods Enzymol. 65: 718-749, 1980). Hybridisierung wurde bei 60ºC für 3 h durchgeführt, mit 60 Units S1-Nuklease behandelt, und das S1-Verdau-Produkt auf einem 7% (w/v) -Polyacrylamidgel mit 7 M Harnstoff aufgetragen und parallel mit dem M13-mp18-Phagen- und dem 242-bp-BglII-SstI-Fragment von pIJ702, sequenziert durch die Sangermethode, laufen gelassen.
Nachweis von Catecholdioxygenase-Aktivität. Für Bestimmungen auf Platten wurden transformierte Kolonien von Streptomyces bei 28ºC über 3 Tage wachsen gelassen und die Platten mit einer wässrigen Lösung an 0.5 M Catechol besprüht. Für Bestimmungen in Flüssigkultur wurden Streptomycesstämme bei 28ºC in 50 ml 2RYE Flüssigmedium ohne oder unter Zusatz von CaCl&sub2; (60 mM) wachsen gelassen. Zu unterschiedlichen Zeiten wurden Proben genommen und Catecholdioxygenase-Aktivitäten wie beschrieben (Ingram et al., J. Bacteriol. 171: 6617-6624, 1989) bestimmt. Proteinkonzentrationen wurden nach der Bradford-Methode unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt (Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976).
Die folgende, mehr detaillierte Beschreibung wird die Erfindung weiter verdeutlichen:

Promotoraktivität von Po438

Die Promotoraktivität von Po438 wurde durch die Expression des Aminoglykosid- Phosphotransferasegens und des Catecholdioxygenasegens, die in zwei verschiedenen, eine Promotorsonde enthaltenden Vektoren enthalten waren.
Expression des Aminoglykosid-Phosphotransferasegens. Ein 242-bp-BglII-SstI- Fragment vom pIJ702-Plasmid wurde in pIJ487 (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468478, 1986), der ein promotorloses Aminoglykosid-Phosphotransferasegen (neo) trug, subkioniert. Die Expression dieses Gens verleiht Streptomyces lividans Kanamycin(km) und Neomycinresistenz. Plasmid pULAD50 wurde somit geschaffen (Fig. 1). Mit pULAD50 transformierter S. lividans war in der Lage, auf MM, das mehr als 150 µg/ml Km enthielt, zu wachsen, während mit pIJ487 (Vektor mit Promotorsonde ohne eingeffigten Promotor) transformierter S. lividans auf MM mit 10 µg/ml Km nicht wuchs, wie in Fig. 2 gezeigt. Dieses Ergebnis weist deutlich daraufhin, daß das BglII-SstI- Fragment von pIJ702 in Streptomyces Promotoraktivität aufweist, mit Orientierung von der SstI- zur BglII-Schnittstelle.
Expression des Catecholdioxygenasegens. Das 242-bp-BglII-SstI-Fragment wie in dem Beispiel oben wurde in einen unterschiedlichen Vektor mit Promotorosonde, Plasmid pIJ4083, der das XylE-Gen von Pseudomonas putida trug, das für das Enzym Catecholdioxygenase kodiert, subkloniert. Das Hybridplasmid wurde pULAD51 (Fig. 1) genannt. Mit pULAD51 transformierter Streptomyces lividans wurde in R2YE-Medium unter Zusatz von CaCl2 bis zu 60 mM wachsen gelassen. Quantifizierung der Catecholdioxygenaseaktivität wies darauf hin, daß Po438 auch nach Einbau stromaufwärts des XylE- Gens Promotoraktivität aufwies (Fig. 6).

Regulation der Expression von Po438 durch Calciumionen

Die Wirkung unterschiedlicher Ionen auf die Promotoraktivität von Po438 wurde analysiert. Da der Level an Kanamycinresistenz vom Salzanteil im Wachstumsmedium abhängig ist (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, U.K. 1985), wurde Neomycin (Neo) in MM für diese Untersuchungen benutzt. In allen Fällen war dem MM TES-Puffer (25 mM, pH 7.2) zur Verhinderung von pH-Anderungen zugesetzt. Mg²&spplus;-, Fe²&spplus;-, Zn²&spplus;-, Cu²&spplus;-Kationen hatten keine Wirkung auf die Stärke von Po438 (Resistenz gegenüber 170 ug/ml Neo auf MM-Platten), während verschiedene monovalente Kationen (Na&spplus;, K&spplus;, Li&spplus;, Cs&spplus;, 10 mM) zu einer schwachen Reduktion der Promotoraktivität führten; ein Wachstum auf MM mit mehr als 100 ug/ml Neo unterblieb. Eine Reduktion der Promotoraktivität wurde ebenso beobachtet, wenn dem MM Natriumphosphatpuffer (20 mM, pH 7.2) zugesetzt war, wie in Fig. 5 gezeigt.
Calciumionen regulieren die Promotoraktivität von Po438 positiv. Ca²&spplus; erhtht die Neo- Resistenz von mit pULAD50-Plasmid transformiertem S. lividans signifikant, und es wurde eine strenge Korrelation zwischen CaCl&sub2;-Konzentration und Level der Neo- Resistenz nachgewiesen (unten Tabelle 2).
Plasmid pULAD60 stellt ein Beispiel für ein ähnliches Plasmid mit demselben Neo-Gen dar, das aber mit einem unterschiedlichen Promotor, dem saf-Promotor, wie in WO 90/14426 beschrieben, verbunden ist. Die Neo-Resistenz von S. lividans, transformiert mit PULAD6O, war jedoch bei Wachstum auf MM mit verschiedenen CaCl&sub2;- Konzentrationen (0, 10, 20, 30, 40 mM) unverändert, was vermuten läßt, daß weder eine post-translationale Stimulierung des Neo-Genproduktes erfolgt, noch eine Calcium- Inaktivierung von Neomycin. Wenn die Wirkung von Ca²&spplus; nicht spezifisch wäre, müßte die stimulierende Wirkung mit allen Konstrukten zu beobachten sein. Dies zeigt, daß die Po438-Promotoraktivität durch Calciumionen spezifisch reguliert wird.
Calciuminduktion wurde auch bei der Expression von Xyle in S. lividans, mit Plasmid pULAD51 transformiert, beobachtet, wie in Fig. 6 gezeigt. Catecholdioxygenaseaktivität (CatO&sub2;ase) stieg signifikant an, wenn das R2YE-Kulturmedium mit CaCl&sub2; bis zu einer Konzentration von 60 mM versetzt wurde. Im Gegensatz dazu wurde die Catecholdioxygenaseaktivität von S. lividans, mit pIJ4038 transformiert (der Vektor mit Promotorsonde ohne den Po438-Promotor), bei Wachstum in R2YE-Medium mit oder ohne Calciumchlorid nicht verändert.

Bestimmung des Transkriptionsstartpunktes in Po438

S1-Nuldease-Kartierungsexperimente wurden zur Bestimmung des Transktiptionsstartpunktes und der Sequenz des Po438-Promotors durchgeführt. Ein von pULAD50 isoliertes 270-bp-HindIII-SstI-Fragment wurde am HindIII-5'-Ende markiert und mit mRNA, aus S. lividans mit pULAD50 isoliert, hybridisiert. Das geschützte Fragment zeigte in einer um 24 nt kürzere Größe als die Kontrollsonde (Fig. 3), was den Transkriptionsstartpunkt um das C bei 24 nt von der SstI-Schnittstelle entfernt lokalisiert (Fig. 4). Ein zweites S1-Nuklease-Kartierungsexperiment wurde mit dem Originalplasmid pIJ702, der auch die Po438-DNA-Region enthält, durchgeführt. Das 242-bp-BglII-SstI- Fragment von pIJ702 wurde als eine Sonde verwendet. Das Fragment wurde am BglII-5'-Ende markiert und mit mRNA, isoliert aus S. lividans, transformiert mit pIJ702, hybridisiert. Fig. 3 zeigt, daß das geschützte Fragment immer noch 24 nt kürzer als die Sonde war, was darauf hinweist, daß die Initiation der Transkription in pIJ702 an einem ähnlichen Nukleotid wie in pULAD50 erfolgt.
Fig. 4 zeigt die Promotorregion des mel-Gens in ORF 438, lokalisiert etwa 30 nt stromaufwärts vom Startcodon des ORF 438 (Geistlich et al., Molecular Microbiology 3: 1061-1069, 1989; Leu et al., Gene 84: 267-277, 1989), wie auch den Po438-Promotor, in umgekehrter Richtung zu der von ORF 438 lokalisiert, und seinen Transkriptionsstartpunkt gemäß des S1-Nuklease-Kartierungsexperimentes der vorliegenden Arbeit.
Während das Aminoglykosid-Phosphotransferasegen und das Catecholdioxygenasegen spezifisch als Beispiele herangezogen wurden, sollte dies dahingehend zu verstehen sein, daß zur Expressionserhöhung unter Verwendung des Po438-Promotors das Gen jeglichen, von den verwendeten Streptomyces-Arten hergestellten Polypeptids oder Proteins durch Entfernen des nativen Promotors und Ersetzen durch den Po438- Promotor modifiziert werden kann. Ahnlich kann für ein Polypeptid oder Protein kodierende Fremd-DNA in jedes endogene Gen eingefügt werden. Vorzugsweise wird das Gen jedoch aus solchen ausgewählt sein, die Protein ausprägen, die durch die Zellwand in das Kulturmedium ausgeschieden werden, wobei in diesem Fall wichtig ist, daß die Sekretion der Signalsequenz erhalten bleibt. Die Fremd-DNA wird daher vorzugsweise auf einem Weg eingefügt, bei dem die Sekretionssignale vom extrazellulären Enzymgen so weit wie möglich erhalten bleibt. Wänrend sich diese Signale vorwiegend auf der Leadersequenz befinden, gibt es hinsichtlich endogener Gene für extrazelluläre Enzyme Hinweise, daß das terminale Carboxylende ebenfalls für die Sekretion wichtig ist. Daher mag es besser sein, ein Fusionsprotein durch Einfügen der Fremd-DNA in die endogene DNA zu schaffen, als den transkriptionalen Teil der endogenen DNA zu entfernen und durch Fremd-DNA zu ersetzen.
Es sollte sich ebenfalls von selbst verstehen, daß die Fremd-DNA-Sequenz jegliche, nicht von Streptomyces stammende DNA-Sequenz, die ein Protein oder Polypeptid kodiert, insbesondere eines mit eukaryotischem oder viralem Ursprung, sein kann. Beispiele solcher eukaryotischer oder viraler DNA-Sequenzen sind Sequenzen, die für menschliche und tierische Leukocytinterferone (IFN-alpha), Fibroblastinterferone (IFN-beta) und Immuninterferone (IFN-gamma), menschliches Insulin, menschliche und tierische Wachstums- und andere Hormone, wie Corticotropin-Releasingfaktor (CRF), menschliches Serumalbumin und verschiedene menschliche Blutfaktoren und Plasminogenaktivatoren, sowohl Gewebe als auch Urokinase, virale Hepatitis-B-Hülle und Obertlächenantigene, virale FMD-Antigene und andere menschliche, tierische und virale Polypeptide und Proteine kodieren. Tabelle 1 Stämme und Plasmide
JI, Sammlung von Mikroorganismen des John Innes Institute, Colney Lane, Norwich; NR4UH, UK; ATTC, American Type Culture Collection Tabelle 2: Level der Neomycin-Resistenz von S. lividans (pULAD50), gewachsen auf festem MM mit zugesetztem CaCl&sub2;

Claims

1. Calcium-regulierter Promotor, dadurch gekennzeichnet, daß er die nachfolgende DNA-Sequenz aufweist:

oder einem Fragment dieser Sequenz mit dieser Aktivität.

2. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert, die Sequenz einzelsträngig ist und eine Calcium-regulierte Promotoraktivität aufweist.

3. Klonierungsvehikel, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz umfaßt, die für ein Polypeptid oder ein Protein kodiert, das mit einem Promotor nach Anspruch 1 in funktioneller Weise verbunden ist.

4. Klonierungsvehikel nach Anspruch 3, wobei die DNA-Sequenz für Streptomyces endogen ist.

5. Klonierungsvehikel nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, wobei die DNA-Sequenz die gesamte Sequenz oder einen Teil einer Sequenz umfaßt, die für ein Polypeptid oder ein Protein kodiert, das für Streptomyces endogen ist, an die, im gleichen Leserahmen, eine DNA-Sequenz angebunden wurde, die für ein Nicht-Streptomyces-Polypeptid oder -Protein kodiert.

6. Streptomyces-Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Klonierungsvehikel nach einem der Ansprüche 3 bis 5 transformiert wurde.

7. Verfahren zur Expression von fremder DNA-Sequenz in Streptomyces, dadurch gekennzeichnet, daß es das funktionelle Verbinden der Fremd-DNA-Sequenz an eine Streptomyces-Expressionskontrollsequenz einschließlich eines Promotors nach Anspruch 1 umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Fremd-DNA-Sequenz und die Streptomyces-Expressionskontrollsequenz in die chromosomale DNA von Streptomyces insertiert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei die Fremd-DNA-Sequenz an die Streptomyces-Expres sionskontrollsequenz funktionell über eine DNA-Sequenz verbunden wird, die zumindest für einen Teil der Signalsequenz eines Proteins oder eines Polypeptids, das von Streptomyces sezerniert wird, kodiert, wobei die die Signalsequenz kodierende DNA-Sequenz zusammen mit der Fremd-DNA-Sequenz unter der Kontrolle der Streptomyces- Expressionskontrollsequenz exprimiert wird, um die Ausscheidung des durch die Fremd-DNA-Sequenz kodierten Proteins oder Polypeptids zu ermöglichen.

Sequenz-Protokoll

(1) Allgemeine Informationen:

(i) Anmelder:

(A) Name: Laboratorios Serono, S.A.

(B) Straße: C/Genova 17

(C) Stadt: Madrid

(E) Land: Spanien

(F) Postfach: 28004

(ii) Titel der Erfindung: Calcium-regulierter Promotor

(ili) Anzahl der Sequenzen: 4

(iv) Computer-lesbar von

(A) Datenträger: Diskette

(B) Computer: IBM-PC-kompatibel

(C) Operationssystem: PC-DOS/MS-DOS

(D) Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPA)

(v) Aktuelle Anmeldedaten:

Anmeldenummer: EP 92 311 292.4

(vi) Frühere Anmeldedaten:

(A) Anmeldenummer: ES P9 102765

(B) Einreichungsdatum: 12. Dezember 1992

(2) Informationen zur Seq. ID Nr.: 1:

(i) Sequenzcharakteristika:

(A) Länge: 219 Basenpaare

(B) Typ: Nukleinsaure

(C) Strangart: Einzeistrangig

(D) Topologie: linear

(ii) Molekulart: DNA (genomisch)

(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID Nr.: 1:

(2) Information zur Seq. ID Nr.: 2:

(i) Sequenzcharakteristika:

(A) Länge: 572 Basenpaare

(B) Typ: Nukleinsäure

(C) Strangart: Doppeisträngig

(D) Topologie: linear

(ii) Molekülart: DNA (genomisch)

(ix) Merkmal:

(A) Name / Schlüssel: RBS

(B) Standort: 82..87

(D) Weitere Information: /Anm.= "rbs"

(ix) Merkmal:

(A) Name / Schlüssel: CDS

(B) Standort: 94.535

(ix) Merkmal:

(A) Name / Schlüssel: misc_Merkmal

(B) Standort: Ergänzung (257..262)

(D) Weitere Information: /Anm.= "BglII"

(ix) Merkmal:

(A) Name / Schlüssel: RBS

(B) Standort: 554..557

(ix) Merkmal:

(A) Name / Schlüssel: CDS

(B) Standort: 567..572

(ix) Merkmal:

(A) Name / Schlüssel: misc_Merkmal

(B) Standort: Ergänzung (493..498)

(D) Weitere Information: Ianm.= "SstI"

(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID Nr.: 2:

(2) Information zur Seq. ID Nr.: 3:

(i) Sequenzcharakteristika:

(A) Länge: 147 Aminosäuren

(B) Typ: Aminosäure

(D) Topologie: linear

(ii) Molekülart: Protein

(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. ID Nr.: 3:

(2) Information zur Seq. ID Nr.: 4:

(i) Sequenzcharakteristika:

(A) Länge: 2 Aminosäuren

(B) Typ: Aminosäure

(D)Topologie: linear

(ii) Molekülart: Protein

(xi) Sequenzbeschreibung: Seq. D Nr.: 4: