DE3485883T2 - Rekombinante materialien und verfahren zur herstellung von menschliche konnektive gewebe aktivierende peptide iii und deren analoge. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet des genetischen Engineering. Im spezielleren betrifft sie synthetische Gene für menschliches, Binde- bzw. Zellgewebe aktivierendes Peptid-III und neue Analoge davon, Plasmidvektoren zum Klonen und Exprimieren derartiger Gene und die mikrobielle Erzeugung von Bindegewebe aktivierendem Peptid-III und Analogen davon.
• Menschliches Bindegewebe aktivierende Peptide (CTAPs) sind eine Gruppe von natürlich vorkommenden Polypeptiden, die fähig sind, Bindegewebezellen zu aktivieren. Diese Peptide sind in Blutplättchen und Leukozyten vorhanden und regen Mitogenese, Glykosaminoglykan und Hyaluronsäure-Synthese, Prostaglandin E&sub2;- und zyklische AMP-Bildung, Plasminogenaktivatorsekretion, Fibroblastchemotaxe, Glukosetransport und Glykolyse an. CTAPs werden als pharmazeutische Wirkstoffe zum Regenerieren von Bindegewebe (z. B. Wundheilung) untersucht. Castor, C.W., et al., PNAS (USA) (1983) 80: 765-769 berichtet die Aminosäuresequenz eines CTAPs, bekannt als CTAP-III, und die biologischen Eigenschaften von CTAP-III. Das in diesen Untersuchungen berichtete CTAP wurde aus Blutplättchen erhalten. Während die Extraktion aus Blutplättchen ein nützlicher Weg ist, geringe Mengen von CTAP-III zu Forschungszwecken zu erhalten, wäre sie ein unpraktischer Weg zur Erzeugung großer Mengen des Peptids. In dieser Hinsicht ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Mittel zum Erzeugen von CTAP-III und CTAP-III-Analogen mit Hilfe bakterieller Expression zu schaffen. Diese Mittel umfassen neue für CTAP-III und CTAP-III-Analoge kodierende synthetische Gene, die zur wirksamen Expression von CTAP-III in Bakterien und Expressionsplasmiden bestimmt sind, die diese Gene in Assoziation mit dem Colicin-E1-Expressionssteuerungsbereich enthalten.
• Ein rekombinantes Plasmid, das ein exogenes Gen unter der Steuerung des Colicin-E1-Steuerungsbereichs enthält, wird von Selker, E. et al., J.Bacteriol. (1977) 129 : 388-394 beschrieben.
• Die US-PS-4,356,270 betrifft allgemein die Expression von Genen, die für Säugetierpolypeptide kodieren und aus einer Vielzahl von Kodonen bestehen, die zur bakteriellen Expression bevorzugt werden. Gouz, M. und Gautier, C., Nucl. Acids Res. (1983) 10 : 7055-7074, berichten Kodongebrauchsdaten für Genexpression in E.coli.
• Die US-PS-4,366,247 beschreibt allgemein rekombinante Materialien und Verfahren zur mikrobiellen Erzeugung von Verschmelzungsproteinen eines exogenen Polypeptids, das über eine Aminosäure, die eine spezifische Spaltungsstelle definiert, mit einer endogenen Aminosäuresequenz verbunden ist.
• Ein Aspekt der Erfindung ist ein synthetisches Gen, das für CTAP-III oder ein Analog (Mutein) von CTAP-III kodiert, worin das Methionin an Position 21 durch Leucin ersetzt ist (in der Folge als CTAP-III-Leu2 bezeichnet) und eine DNA-Sequenz umfaßt, deren Kodierungsstrang die folgende Sequenz aufweist:
• worin:
• A = Adenin
• G = Guanin
• C = Cytosin
• T= Thymin
• H = entweder T, C oder G J = entweder C oder A L = entweder T oder A M = entweder C oder G P = entweder A oder G Q = entweder C oder T
• Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Gens umfaßt die DNA-Sequenz:
• worin A, G, C, T und J die zuvor angeführte Bedeutung haben und K abhängig von J entweder G oder T ist. Wenn J A ist und K T ist, kodiert das Gen für CTAP-III. Wenn J C ist und K G ist, kodiert das Gen für CTAP-III-Leu21.
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein DNA-Fragment zur Verwendung bei der mikrobiellen Erzeugung von menschlichem CTAP-III oder einem Mutein davon, worin das Methionin an Position 21 durch Leucin ersetzt ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment aus dem oben beschriebenen strukturellen Gen besteht, dem das Basenpaar
• vorangeht und das durch ein Adaptorfragment mit der Sequenz
• TAATGACTGCAG ATTACTGACGTCTTAA.
• abgeschlossen wird.
• Ein weiterer Aspekt ist ein rekombinanter Plasmidexpressionsvektor, umfassend eine bakterielle Expressionssteuerungssequenz, ein heterologes strukturelles Gen stromabwärts von und in Phase mit der Expressionssteuerungssequenz und von dieser gesteuert, und ein Translationsstartkodon, das dem strukturellen Gen vorangeht und ein Translationsstopkodon, welches das strukturelle Gen abschließt, dadurch gekennzeichnet, daß das strukturelle Gen das oben beschriebene Gen für CTAP-III oder CTAP-III-Leu21 ist.
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist mit den oben beschriebenen rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren transformiertes E.coli.
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung von CTAP-III oder CTAP-III-Leu21, umfassend das Züchten des oben beschriebenen transformierten E.coli in einem Kulturmedium und das Herbeiführen von Expression von CTAP-III oder CTAP-III-Leu21 dadurch, indem eine Expression-induzierende Menge eines Agens hinzugefügt wird, die das SOS-System von E.coli im Kulturmedium induziert.
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Protein mit CTAP-III-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Mutein von CTAP-III ist, worin das Methionin an Position 21 von CTAP-III durch eine andere Aminosäure ersetzt worden ist.
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Protein mit der biologischen Aktivität von CTAP-III, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Mutein von CTAP-III ist und weniger anfällig für in vivo Umwandlung in β-Thromboglobulin (β-TG) ist, als CTAP-III. Bei einer Ausführungsform dieses Aspekts umfaßt das Mutein CTAP-III mit einem unpolaren Polypeptidfragment, das mit seinem aminoterminalen Ende verschmolzen ist und die alpha-Helixstruktur des genannten Endes bei behält. Bei einer anderen Ausführungsform ist das Mutein CTAP-III, bei dem eine oder mehrere der Aminosäuren, welche die trypsinempfindliche Stelle in der Nähe des aminoterminalen Endes von CTAP-III definiert bzw. definieren, gelöscht oder durch eine andere Aminosäure ersetzt ist bzw. sind.
• In den Zeichnungen:
• ist Fig. 1 die Aminosäuresequenz von CTAP-III, wobei das hinzugefügte Pentapeptid eines N-terminalen modifizierten Analogs (CTAP-III-NMOD genannt) in geschwungenen und die Met → Leu Ersetzung von CTAP-III-Leu21 in eckigen Klammern gezeigt ist;
• ist Fig. 2 die unbestimmte Nukleotidsequenz, die für die CTAP-III-Aminosäuresequenz von Fig. 1 kodiert. Die in Fig. 2 und anderswo hierin verwendeten Nukleotidabkürzungen sind die oben angegebenen;
• ist Fig. 3 die Nukleotidsequenz des Kodierungsstranges der bevorzugten Ausführungsform des synthetischen Gens für CTAP-III-Leu21 einschließlich der 3'- und 5'-Adaptorsequenzen zur Verwendung beim Klonen und Exprimieren des Gens. Die entsprechende Aminosäuresequenz wird unterhalb der Nukleotidsequenz gezeigt;
• ist Fig. 4 ein Restriktionsendonukleasespaltungsplan der Nukleotidsequenz von Fig. 3;
• ist Fig. 5 die vollständige doppelstrangige Sequenz des bevorzugten synthetischen Gens für CTAP-III-Leu21 einschließlich der 3'- und 5'-Adaptorsequenzen;
• ist Fig. 6 ein Schema, das die Ligierungsstrategie zum Konstruieren des in Fig. 5 gezeigten synthetischen Gens zeigt;
• ist Fig. 7 ein Schema des Plasmidvektors pUC8/CTAP-III, der zum Herstellen eines das synthetische Gen von Fig. 5 enthaltenden Expressionsvektors verwendet wird;
• ist Fig. 8 ein Schema des Plasmidklonungsvektors pNP6, der zum Herstellen eines das synthetische Gen von Fig. 5 enthaltenden Expressionsvektors verwendet wird;
• ist Fig. 9 ein schematisches Fließschema zum Herstellen eines linearisierten Derivates von pNP6, pNP6-LBR, das mit einem DNA-Fragment ligiert ist, das das oder die synthischen CTAP-III-Gen(e) enthält, das/die für CTAP-III-Analoge kodiert/-en;
• ist Fig. 10 ein schematisches Fließschema zum Herstellen der CTAP- III-Leu21-Geneinfügung zur Ligierung mit pNP6-LBR, um den induzierbaren Plasmidexpressionsvektor der Erfindung herzustellen.
• Fig. 11 ist ein schematisches Fließschema des Verfahrens, das angewandt wird, um das Expressionsplasmid pNP6/CTAP-III-NMOD zu erzeugen und ist
• Fig. 12 ein schematisches Fließschema des Verfahrens, das angewandt wird, um das Expressionsplasmid pNP6ΔRI/Col:CTAP-III-Leu21 zu erzeugen.
• Die Erfindung umfaßt mehrere Abänderungen von nativem menschlichem CTAP-III. Eine beinhaltet das Ersetzen des Methionins an Position 21 der CTAP-III-Aminosäuresequenz. Das Methionin kann durch eine Aminosäure ersetzt sein, welche die biologische Aktivität oder Stabilität des Moleküls nicht nachteilig beeinflußt. Aminosäuren mit ähnlichen hydrophoben Eigenschaften und azyklischen Seitenketten wie Leucin, Isoleucin und Valin werden bevorzugt. Leucin ist ein besonders bevorzugter Ersatz. Das Ersetzen des inneren Methionins macht das modifizierte Protein (modifizierte Moleküle werden hierin üblicherweise als Analoge oder Muteine bezeichnet) für Agenzien wie Zyanogenbromid unempfindlich, die Polypeptidketten spezifisch bei Methioninresten spalten. Eine derartige Unempfindlichkeit macht es möglich, das Mutein durch Digerieren der Materialien oder Extrakte mit derartigen Agenzien von zellularen Materialien oder Extrakten zu reinigen oder von Partnerverschmelzungssequenzen zu trennen, wenn das Mutein als ein Verschmelzungsprotein erzeugt wird, in dem es durch ein Methionin an den Partner gebunden ist.
• Es ist klar, daß dieser Aspekt der Erfindung auf andere nützliche Polypeptide als CTAP-III und CTAP-III-Analoge angewandt werden kann, die ein oder mehrere Methionine enthalten, die für die Nützlichkeit des Polypeptids nicht unabdingbar sind. Löschung oder Ersetzen des/der Methionins/-e in derartigen Polypeptiden kann durch Synthetisieren des für das methioninabgereicherte Polypeptid kodierenden Gens aus Nukleotiden oder durch stellenspezifische Mutagenese von nativen oder rekombinanten Gensequenzen erreicht werden.
• Eine weitere Abänderung des nativen CTAP-III beinhaltet das Ändern der Aminosäuresequenz auf eine Art, die bewirkt, daß das resultierende Mutein für in vivo Umwandlung in β-TG weniger anfällig ist als natives CTAP-III, ohne daß die biologischen Eigenschaften nachteilig beeinflußt werden. Eine derartige Abänderung kann das Hinzufügen eines allgemein unpolaren Polypeptidfragments zum Aminoterminus des nativen CTAP-III umfassen, welches Fragment selbst dazu neigt, eine alpha-Helixkonfiguration zu bilden und somit die Konfiguration des Terminus erhält und/oder eine oder mehrere der Aminosäuren löscht oder ersetzt, welche die trypsinempfindliche Stelle nahe dem Aminoterminus des nativen CTAP-III definieren. Hinzufügungen von nonpolaren Fragmenten zum Aminoterminus können durch Synthetisieren des Gens erreicht werden, so daß es Kodone für das Fragment einschließt, oder durch Synthetisieren des Polypeptids in der Form eines Verschmelzungsproteins, in der die Leadersequenz oder der endogene Abschnitt des Proteins ein derartiges Fragment kennzeichnet. Das Fragment besteht überwiegend aus hydrophoben oder ambivalenten azyklischen Aminosäureresten wie Leucin, Methionin und Isoleucin. Es kann nicht-hydrophobe Reste wie Threonin und Glutamin enthalten, vorausgesetzt, das Fragment als Ganzes ist unpolar. Das Fragment muß nicht groß sein und enthält zweckmäßigerweise normalerweise 4 bis 10 Reste. Derartige Modifikationen verlängern die in vivo Halbwertszeit des Proteins und in Korrelation dazu seine biologische Aktivität und therapeutische Wirksamkeit. Löschung oder Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren an der trypsinempfindlichen Stelle kann mittels de novo Synthese des Gens oder durch stellenspezifische Mutagenese von nativen oder rekombinanten CTAP-III-Genen erreicht werden.
• Wieder eine andere Modifikation stellt die Erzeugung von CTAP-III oder CTAP-III-Muteinen in Form von Verschmelzungsproteinen dar, in denen der endogene Abschnitt des Proteins ein biologisch inaktives Colicin-E1-Fragment ist, das die Ladungseigenschaften des Colicins besitzt, und die Verschmelzungsstelle leicht spaltbar ist. Derartige Proteine können unter Verwendung von Expressionsvektoren erzeugt werden, bei denen das CTAP-III- oder CTAP-III-Mutein-Gen mit geeigneten Terminatoren in einen Vektor eingefügt wird, der die Colicin-Expressionssteuerungssequenz und das strukturelle Gen an einer zweckmäßigen Restriktionsstelle nahe dem Ende des strukturellen Colicingens enthält, das für den Carboxy-Terminus von Colicin kodiert. Das Verschmelzungsprotein behält die Ladungseigenschaften von Colicin bei (Colicin E1 hat im Vergleich zu den meisten anderen bakteriellen Proteinen einen hohen isoelektrischen Punkt, > 9,5, und bindet sich somit bei hohen pH-Werten an Kationenaustauschmedien, während andere bakterielle Proteine das nicht tun), wodurch es leicht durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines Kationenaustauschmediums bei einem pH-Wert von etwa 9 bis 10,5, vorzugsweise etwa 9,5 isoliert werden kann. Herkömmliche Kationenaustauschharze wie CM-Zellulose, P-Zellulose oder SE-Zellulose oder vernetzte Dextran- oder Polyacrylamidbasis-Ionenaustauschgels wie CM-Sephadex oder SP-Sephadex können eingesetzt werden. Die angewendete Ionenstärke hängt vom speziellen verwendeten Medium ab. Herkömmliche Ionenaustauschtrennungsausrüstung (z. B. Säulen) und Gleichgewichts- und Eluierungsverfahren werden bei der Trennung eingesetzt.
• Nachdem das Verschmelzungsprotein durch Ionenaustauschchromatographie abgetrennt ist, wird das CTAP-III oder CTAP-III-Mutein durch Behandlung des Verschmelzungsproteins mit einem Spaltungsagens abgetrennt, das das Protein an der Verschmelzungsstelle spaltet. Wenn zum Beispiel zwei Segmente des Proteins über einen Methioninrest verschmolzen sind und ein methioninfreies Mutein beteiligt ist, kann das Protein mit Zyanogenbromid behandelt werden.
• Fachleuten wird auch klar sein, daß Verschmelzungsproteine von anderen nützlichen Polypeptiden und Colicinfragmenten hergestellt, durch Ionenaustauschchromatographie abgetrennt und gespalten werden können, um das nützliche Polypeptid auf ähnliche Weise zu schaffen.
• Nach dem Stand der Technik ist auch bekannt, daß das CTAP-III und die CTAP-III-Analoge, die mittels Expression von rekombinanter DNA in Bakterien erzeugt wird/werden, zu Beginn einen Methioninrest an ihrem Aminoterminus aufweisen können.
• Die gemäß der Erfindung hergestellten CTAP-III und CTAP-III-Muteine (mit Ausnahme der für Trypsin unempfindlich gemachten), können durch Behandlung mit Trypsin oder Plasmin in β-TG und β-TG-Muteine umgewandelt werden. β-TG ist ein chemotaktisches Agens.
• Nun folgt eine detaillierte Beschreibung spezifischer Ausführungsformen der Erfindung, die CTAP III, CTAP III-Mutein und Verschmelzungsproteine eines Colicin-Fragments und eines CTAP III-Muteins umfassen.
Konstruktion von synthetischem Gen für CTAP-III/CTAP-III-Leu21
• Die Aminosäuresequenz von CTAP-III (Fig. 1) wurde unter Verwendung des genetischen Codes in die in Fig. 2 gezeigte unbestimmte Kodierungssequenz umkehrtranslatiert. Die in Fig. 3 gezeigte bestimmte endgültige Nukleotidsequenz für das strukturelle Gen, das für CTAP- III-Leu21 kodierte, wurde folgendermaßen bestimmt:
• Die unbestimmte Nukleotidsequenz wurde durch die Auswahl von Kodonen, die aufgrund hoher Expressionswerte in Bakterien bevorzugt werden, zu einer einzigen unbestimmten Sequenz reduziert. Veränderungen wurden durchgeführt, um zwei einzigartige Restriktionsstellen in diese Sequenz für die Endonukleasen BamHI und XbaI einzufügen. Diese Veränderungen umfassen die Verwendung nichtoptimaler Kodone für das Gly an Position 28 (GGG) und das Leu an Position 63 (CTA). Diese Stellen wurden hinzugefügt, um alternative Strategien zum Synthetisieren des Gens, Sub-klonen des Gens, Bestätigen der Sequenz des synthetisierten Gens und Modifizieren des Gens, um für Muteine (Analoge) zu kodieren, zu ermöglichen. Die resultierende Sequenz wurde mit einem Computerprogramm analysiert, das dazu bestimmt war, sowohl komplementäre als auch wiederholte Sequenzen festzustellen. Diese Information wurde verwendet, um Bereiche mit Intrasequenzhomologie zu identifizieren, welche die korrekte Ligierung von Oligonukleotiden beeinträchtigen könnte, die zum Synthetisieren des Gens und zum entsprechenden Modifizieren des Gens verwendet wurden.
• Adaptorsequenzen waren für die Termini des strukturellen Gens bestimmt, um geeignete Start- und Stopsignale, Restriktionsstellen und klebrige EcoRI-Enden- zum Klonen des Gens wie folgt zu schaffen.
• Die Adaptorsequenz, die zum carboxy-terminalen Kodierungsende des Gens hinzugefügt wurde, war dazu bestimmt, zwei Tandemtranslationsterminationskodone (TAA, TGA), eine Pst I-Erkennungssequenz (CTGCAG) und Teil einer EcoRI-Erkennungssequenz (AATT) zu enthalten. Die Adaptersequenz, die dem aminoterminalen Ende des Gens hinzugefügt war, war dazu bestimmt, ein Translationsstartkodon (ATG), eine PvuII-Erkennungssequenz (CAGCTG), und Teil einer EcoRI-Erkennungssequenz (AATT) zu enthalten.
• Die Endsequenz wurde mit dem Computer analysiert, um zu überprüfen, daß die Sequenz translatiert werden konnte, um die richtige Aminosäuresequenz für das CTAP-III-Leu21-Protein zu ergeben. Ein Restriktionsendonukleaseplan des strukturellen Gens plus Adaptersequenzen für alle bekannten Enzyme wird in Fig. 4 gezeigt. Die Pfeile markieren die 5'-Seite der Spaltungsstelle, es sei denn, der Stellenname ist in Klammern angegeben. Klammern zeigen an, daß nur die Erkennungsstelle bekannt ist.
Gensynthese Strategie und Oligonukleotidherstellung
• Fig. 5 zeigt die vollständige DNA-Sequenz für das synthetische strukturelle CTAP-III-Leu21-Gen plus Adaptersequenzen. Wie in Fig. 6 gezeigt, wurde das Gen in drei Fragmente geteilt: Fragment I EcoRI bis BamHI, Fragment II BamHI bis XbaI und Fragment III XbaI bis EcoRI. Jedes Fragment wurde weiter wie angegeben in kleine Oligonukleotide geteilt. Insgesamt gab es 38 Oligonukleotide. Die Sternchen in Fig. 6 bezeichnen die Oligonukleotidgrenzen. Die Oligonukleotide wurden nach dem Phosphotriesterverfahren (Ohtsuka, E., et al, Nucleic Acid Res (1982) 10: 6553-6570) synthetisiert. Die rohen Oligonukleotide wurden durch Ionen-Austausch-HPLC mit einem 30-45 min Gradienten von 0,1 M - 0,4 M KH&sub2;PO&sub4;-Puffer gereinigt, der 20% Acetonitril enthielt.
• Die Produktpeaks wurden gesammelt, entsalzt, getrocknet und in destilliertem H&sub2;O rekonstituiert. Die Größe und Homogenität der gereinigten Oligonukleotide wurde durch Gelelektrophorese unter Verwendung von 20% Acrylamidgels mit 3-3,5% Vernetzungsmittel bestätigt. Oligonukleotide mit weniger als 95% Reinheit wurden entweder durch Umkehrphasen-HPLC oder durch präparative Gelelektrophorese weiter bis zum gewünschten Reinheitsgrad gereinigt.
Ligierungen Fragment I
• Die Oligonukleotide 1-14 (Fig. 6) wurden in einer Reaktion mit ³²P-ATP und Polynukleotidkinase unter Verwendung der folgenden Vorschrift einzeln radiomarkiert:
• Oligonukleotide 0,04 OD
• ³²P-ATP (10 &sub1;uCi/mmol) 10 ul
• Kinase/Ligase-Puffer 15 ul
• (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol)
• Polynukleotidkinase 1 ul
• Die Oligonukleotide und ATP wurden getrocknet und in Kinasepuffer gelöst. Das Enzym wurde hinzugefügt und bei 37ºC 1 Stunde lang inkubiert. Die kinasierten Oligonukleotide wurden in eine einzelne Phiole kombiniert und 10 min in ein 95ºC Wasserbad gegeben, und dann ließ man das Bad langsam auf Raumtemperatur abkühlen. 10 X Lösung aus 100 mM DTT/10 mM ATP wurde hinzugefügt, gefolgt von 5 Einheiten T4-DNA-Ligase. Die Reaktionsmischung wurde bei 12ºC über Nacht ( 16 h) inkubiert.
• Die gesamte Reaktionsmischung wurde über Nacht auf einem 15% 1,5 mm nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel gereinigt, das bei 250 Volt laufen gelassen wurde. Das Produkt wurde durch Autoradiographie im Vergleich mit HaeIII-Digest von pBR322-DNA lokalisiert. Der entsprechende Bereich auf dem Gel wurde durch Elektrophorese auf DE-81- Papier übertragen (Transblot). Das entsprechende Band wurde dann unter Verwendung von 1 M NaCl in TE-Puffer eluiert. Die DNA wurde mit Äthanol ausgefällt und in Wasser gelöst.
• Ein Aliquot des Produkts wurde auf einem analytischen denaturierenden 15% Polyacrylamidgel auf Homogenität überprüft. Ein weiteres Aliquot wurde mit DNA-Ligase behandelt, um Selbstligierung des Produkts zu fördern (5-6 h bei 4ºC). Dann wurde die Reaktionsmischung mit EcoRI und BamHI behandelt, und die Reaktionsmischung wurde durch analytische Gelelektrophorese analysiert. Das Produktband wurde dann geklont und sequenziert.
Fragment II
• Die Oligonukleotide 15-28 wurden unter Verwendung des obigen Verfahrens kinasiert und ligiert. Die Ausbeute bei dieser Reaktion war gering. Daher wurde diese Gruppe in zwei Untergruppen (IIA, 15-21, und IIB, 22-28) geteilt und diese wurden getrennt ligiert. Produkte von diesen beiden Untergruppen wurden dann ligiert. Das Endprodukt (103 bp) wurde der Selbstligierung und Behandlung mit geeigneten Restriktionsenzymen unterworfen. Das Material wurde geklont und sequenziert.
Fragment III
• Die Oligonukleotide 29-39 wurden kinasiert und ligiert. Bei Analyse auf analytischem Gel zeigte das Produkt 3 Bänder (nahe beieinander). Selbstligierung und Behandlung mit XbaI und EcoRI zeigte, daß nur eines der 3 Bänder sich wie erwartet verhielt. Dieses Band wurde geklont und sequenziert.
M13 Klonen/Sequenzieren
• Das synthetische Fragment I (EcoRI, BamHI) wurde in M13 mp8 geklont und sequenziert. Drei von 16 unabhängigen Klonen wiesen die korrekte Sequenz auf. Die anderen wiesen zumindest eine Basensubstitution auf.
• Das synthetische Fragment II (BamHI, XbaI) wurde in M13 mp11 geklont und sequenziert. Die korrekte Sequenz wurde an 14 von 16 unabhängigen Klonen überprüft. Die anderen beiden wiesen eine einzelne Basensubstitution auf.
• Das synthetische Fragment III (XbaI, EcoRI) wurde in M13 mp11 geklont und sequenziert. Acht von acht Klonen wiesen die korrekte Sequenz auf.
Zusammenstellung von vollständigem Gen
• Einstrangiges M13 für die geklonten Fragmente I oder II wurde mit dem universellen Primer und Klenow-Polymerase doppelstrangig gemacht, dann mit EcoRI und BamHI für Fragment I oder BamHI und XbaI für Fragment II digeriert. Die Einfügungen wurden von einem 6% Acrylamidminiplattengel elektroeluiert und mit EcoRI XbaI geschnittenem mp8 ligiert. Es wurden mehrere Transformanten identifiziert, die die korrekte Einfügung (I + II) aufwiesen.
• Einstrangiges M13 für geklontes Fragment (I + II) und III wurde wie oben doppelstrangig gemacht und mit EcoRI und XbaI digeriert. Die gereinigten Einfügungen wurden Gel-gereinigt, elektroeluiert und kombiniert und in EcoRI geschnittenem mp8 ligiert. Sieben Klone mit der korrekten (I + II + III) Einfügung wurden identifiziert. Beide Ausrichtungen waren vorhanden.
• Einstrangiges M13 mit der I + II + III Einfügung wurde wie beschrieben doppelstrangig gemacht und mit EcoRI digeriert. Eine 284 bp-Einfügung wurde durch Gelelektrophorese vom Digest gereinigt.
Klonen des synthetischen CTAP-III-Leu21-Genfragments in pUC8
• Etwa 5 ug Plasmid pUC8 (P-L Biochemicals, Milwaukee, WI) wurden 60 min lang bei 37ºC mit EcoRI in einer 50 ul Lösung digeriert, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 1 mM DTT enthielt. Die Reaktionen wurden durch Hinzufügen von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 20 mM beendet, dann mit Phenol/Chloroform (3/1) extrahiert und mit Äthanol ausgefällt.
• Zehn pmol des synthetischen Genfragments und 1 pmol (2,5 ug) EcoRI- digerierte pUC8-Plasmid-DNA wurden in einem Volumen von 100 ul aus 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 5 mM ATP und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase bei 10ºC 16 h lang ligiert. Aliquote (5 ul) der Reaktionsmischung wurden direkt zur Transformation wie unten beschrieben verwendet.
• Der Wirt für die Transformationsversuche war E.coli K-12 Stamm JM83, der das lac ZΔM15 auf einem Φ80 in das Chromosom integriert trägt (ara, Δlac-pro str A, thi, Φ80 lac ZΔM15) (U.Messing, "a multipurpose cloning system based on a single-stranded DNA bacteriophage M13" Recombinant DNA Technical Bulletin, NIH Publication No. 79-99, 2, (1979), No 2 : 43-48).
• Eine in L-Brühe (pro Liter: 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, 2 ml 1,0 N NaOH und 10 ml 20% Glukose nach dem Autoklavieren hinzugefügt) über Nacht gezogene Kultur wurde 1 : 100 in frisches L-Brühe Medium verdünnt und wurde unter Rütteln bei 37ºC inkubiert, bis das OD&sub6;&sub0;&sub0; 0,6 war. Zu diesem Zeitpunkt wurden 35 ml Kultur mit 6000 UpM 10 min lang bei 4ºC zentrifugiert, und das Pellet in 10 ml 0,05 M CaCl&sub2; resuspendiert. Die Zellen wurde 15 min lang auf Eis inkubiert, bevor sie durch Zentrifugieren mit 4000 UpM 10 min lang gesammelt wurden. Die Zellen wurden dann in 4 ml 0,05 M CaCl&sub2; resuspendiert und mit 200 ul einer DNA-Lösung gemischt, die durch Hinzufügen von 5 ul der Ligierungsmischung (siehe oben) und 150 ul 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) hergestellt wurde, das 10 mM MgClo2 und 10 mM CaCl&sub2; enthielt. Diese Mischung wurde 25 min lang bei 0ºC inkubiert, gefolgt von Inkubation bei 50ºC für 10 sek und bei Raumtemperatur für 10 min. An diesem Punkt wurden 14 ml L-Brühe hinzugefügt, und die Kulturmischung wurde 30 min lang bei 37ºC gerüttelt. Dann wurden 480 ul Ampicillinlösung, 1,25 mg/ml, zur Kultur hinzugefügt, und die Inkubation wurde weitere 30 min lang fortgesetzt. Aliquote mit 100 ul wurden auf frisch vorbereitete Agarplatten plattiert, die 2YT (pro Liter: 16 g Bacto-trypton, 10 g Bacto-Hefeextrakt und 5 g NaCl) enthielten, mit 50 ul 50 mg/ml Ampicillin, und 50 ul 2% Xgal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid) knapp vor der Verwendung zu jeder Platte hinzugefügt.
• Die Platten wurden bei 37ºC inkubiert, bis die Kolonien einen Durchmesser zwischen 0,5 und 2 mm aufwiesen. Bakterien, die Plasmide ohne Einfügungen enthalten, erzeugen auf diesen Indikatorplatten (die Xgal enthalten) blaue Kolonien, während diejenigen, die rekombinante Plasmide enthielten, weiße Kolonien erzeugen. Mehrere weiße Kolonien wurden direkt auf das Vorhandensein von rekombinantem Plasmid gescreent, indem eine kleine Menge von geklärtem Lysat durch Agarosegelelektrophorese analysiert wurde. Einzelne Kolonien wurden in 1 ml L-Brühe-Medium über Nacht bei 37ºC gezogen. Jede Kultur wurde 5 min lang in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert, und das Pellet wurde in 325 ul 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, resuspendiert, der 1,0 mM EDTA und 10 mM NaCl enthielt (TEN-Puffer). 80 ul 0,25 M EDTA und 40 ul 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde weitere 5 min lang bei 65ºC inkubiert, gefolgt von Inkubation auf Eis für 3 h. Nach diesem Zeitraum wurde die Mischung in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge 15 min lang zentrifugiert. Der Oberstand wurde mit Phenol extrahiert, und die Nukleinsäure wurde mit Äthanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde in 50 ul TEN-Puffer wieder gelöst. 5 ul dieser Lösung wurden wie zuvor beschrieben mit EcoRI digeriert und unter Verwendung von 5% Polyacrylamidplattengel-Elektrophorese analysiert. Die Größe der Einfügung, wie durch Messen ihrer elektrophoretischen Migration gegenüber einem Satz von DNA-Fragmenten mit bekannter Größe bestimmt, war etwa 285 Basenpaare. Das rekombinante Plasmid, das diese Einfügung enthielt, wurde pUC8/C TAP-III-Leu21 benannt. Fig. 7 ist ein Schema des Plasmids das die Position der CTAP-III-Leu21-Einfügung zeigt. Eine Probe des transformierten E.coli, das dieses Plasmid enthielt, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20852 am 9. August 1984 hinterlegt. Diese Probe erhielt die ATCC-Eingangsnummer 39793. Die Hinterlegung erfolgte gemäß dem Budapester Vertrag und wird gemäß dessen Bestimmungen aufbewahrt und für andere zugänglich gemacht.
• Die gesamte Nukleotidsequenz der Einfügung wurde unter Anwendung der Sanger'schen enzymatischen Sequenzierungstechnik (Sanger, F. PNAS (USA) (1977) 74 : 5463-5467) bestätigt.
Herstellung der Plasmidvektoren pNP6, pNP6ΔRI und pNP6-LBR
• Die Konstruktion von pNP6 und seinen Derivaten, pNP6 RI und pNP6-LBR, erfolgte nach dem folgenden allgemeinen Schema. Offene zirkulare ColE1- K30-DNA-Moleküle wurden einer Scherkraft unterworfen um eine normale Verteilung von DNA-Fragmenten mit einer durchschnittlichen Größe von 2000 Basenpaaren zu ergeben. Diese Fragmente wurden in die einzelne PstI-Stelle des Ampicillinlocus von pBR322 geklont, wobei Terminaltransferase und das Poly(G):poly(c)-Schwänzungsverfahren (Bolivar, F. et al, Gene (1977), 2 : 95-113) eingesetzt wurde. Die resultierenden rekombinanten Plasmide wurden dann verwendet, um einen E.coli K-12-Stamm Wildtyp für die induzierbaren DNA-Reparatur (SOS)-Systeme zu transformieren. Tetracyclinresistente (Tcr) ampicillinempfindliche (Aps) Transformantkolonien, die Colicin (Col+) erzeugten, wurden ausgewählt und ihre Plasmid-DNAs analysiert. pNP6 und seine Derivate haben gegenüber dem ColE1-Elternplasmid mehrere Vorteile, wenn sie als Expressionsvektoren zur Erzeugung exogener Polypeptide verwendet werden. Das Elternplasmid enthält das Colicin E1-Immunitätsgen und ein Lysegen. Die Induktion von Zellen, die Vektoren auf der Basis des Elternplasmids enthalten, kann aufgrund der Aktivierung des Lysegens zu Zell-Lyse führen. In pNP6 fehlt sowohl das Lysegen als auch ein Immunitätsgen. Somit verursacht die Induktion keine Zell-Lyse. Auch mit rekombinanten Vektoren, in denen ein strukturelles Gen wie das CTAP-III-Gen in das ColE1-Gen eingefügt ist, transformierte Zellen, erzeugen kein Colicin E1. Das ermöglicht es, daß derartige Transformanten von Zellen unterschieden werden können, die mit Vektoren transformiert sind, die keine Einfügung enthalten, da letztere Colicin erzeugen, das die Zellen abtötet.
• Plasmid pNP 6 (Fig. 8), ein Tcr Aps Col&spplus; rekombinantes Plasmid, das ein Molekulargewicht von 5,0 · 10&sup6; Dalton aufweist und eine Einfügung mit etwa 3300 bp trägt, wurde zur Verwendung als ein Expressionsvektor ausgewählt. Das Plasmid trägt den regulierenden Bereich (Promotor, Operator und Ribosombindungsstelle) und das strukturelle Gen für Colicin E1. Die Nukleotidsequenz für diesen Bereich und dieses Gen werden von Yamada, M. et al, PNAS (USA) (1982) 79 : 2827-2831, beschrieben. Plasmid pNP6 kann mit SacII in ein lineares Molekül gespalten werden. Die einzige SacII-Stelle von Plasmid pNP6 befindet sich 8 bp vom Beginn des Colicin E1-Gens entfernt. Exogene (fremde)Gene, die in diese Stehle geklont und, werden von der regulierenden Colicin E1-Sequenz gesteuert. Genexpression kann durch Behandlung von Transformanten mit Mitomycin C oder anderen SOS-System aktivierenden Agenzien wie Alkylierungsmitteln und ähnlichem selektiv herbei geführt werden.
• Plasmid pNP6ΔRI ist ein Derivat von pNP6, bei dem die EcoRI-Stelle im pBR322-Abschnitt des Plasmids eliminiert worden ist, wodurch das Plasmid mit einer einzelnen EcoRI-Stelle verbleibt, die 19 Kodone stromaufwärts vom Carboxyterminus des strukturellen Colicingens liegt. Dieses Plasmid ist nützlich zur Herstellung von Expressionsvektoren zum Erzeugen von Verschmelzungsproteinen des Colicinfragments (dem die 19 Carboxy-terminus-Aminosäuren fehlen) und CTAP-III oder Analogen von CTAP-III. pNP6ΔRI wurde konstruiert durch: teilweises Digerieren von pNP6 mit EcoRI; Einfüllen der einstrangigen EcoRI-Enden des linearisierten Plasmids unter Verwendung einer DNA-Polymerasereaktion; Stumpfenden-Ligieren des resultierenden Fragments; und Identifizierung von Konstrukten, die das Colicingen enthalten, unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens.
• Die Konstruktion des Plasmids pNP6-LBR, das verwendet werden kann, um einen Expressionsvektor zu erzeugen, der das synthetische CTAP- III-Gen oder CTAP-III-Analoggene enthält, umfaßt die folgenden Schritte: pNP6 wurde zuerst durch SacII-Endonuklease in ein lineares Molekül (pNP6-L) gespalten. pNP6-L wird dann mit T&sub4;-Polymerase in Gegenwart von dTTP behandelt, gefolgt von Behandlung mit S1-Nuklease, um ein lineares Molekül mit stumpfen Enden (pNP6-LB) zu bilden. pNP6-LB wurde dann mit EcoRI-Endonuklease gespalten, um das Segment von DNA vom Rest des fünften Codons des Colicin-E1-Gens zur EcoRI-Stelle im pBR322-Abschnitt von pNP6 zu entfernen (pNP6-LBR).
• Details der Konstruktion dieser Plasmide folgen.
Isolierung von ColE1-Plasmid
• Stamm JC411 (Col EL-D30) wurde in 60 Liter M9 Medium (pro Liter: 1g NH&sub4;Cl, 6 g Na&sub2;HPO&sub4; · H&sub2;O, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 5 g NaCl, 3 g Casaminosäuren, 1 ml 10% MgSO&sub4;, ergänzt mit 10 ml 20% Glukose und 0,5 ml 1 M CaCl&sub2;, nach dem Autoklavieren hinzugefügt) in einem Fermentor bei 37ºC bis zu einer Zelldichte von etwa 5 · 10&sup8; CFU/ml gezogen. Chloramphenicol wurde bis zu einer Endkonzentration von 100 ug/ml hinzugefügt, und die Inkubation bei 37ºC wurde weitere 6 h fortgesetzt. Zellen wurden unter Verwendung einer Sharpels Durchfluß-Zentrifuge gewonnen. 10 g(Naßgewicht) des Pellets wurden in 180 ml 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 8,0) suspendiert, der 50 mM EDTA und 15% Saccharose enthielt. Dann wurden 0,14 g Lysozym hinzugefügt, und die Mischung wurde 10 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurden 16 ml 10% SDS und 20 ml 5 M Kaliumazetat hinzugefügt. Die Mischung wurde auf Eis 30 min lang inkubiert und dann 30 min lang unter Verwendung des SS-34 Rotors und einer Sorvall-Zentrifuge mit 12.000 UpM zentrifugiert. 4 mg Bauchspeicheldrüsenribonuklease-A wurde dem Oberstand hinzugefügt und die Mischung wurde 1 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Probe wurde zweimal mit einem gleichen Volumen an mit 0,1 M Tris, pH 8,0, gesättigtem Phenol extrahiert, und die DNA wurde durch Hinzufügen von 1/10 Probevolumen 3,0 M Natriumacetat und 2,5 Volumina kaltem Äthanol ausgefällt, gefolgt von Inkubation bei -20ºC über Nacht. Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugierung mit 7.000 UpM 50 min lang in einer gekühlten Sorvall-Zentrifuge unter Verwendung eines HB4-Rotors gewonnen. Das Pellet wurde in 50 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 0,3 M NaCl und 5 mM EDTA enthielt (NE-Puffer) gelöst. Diese Probe wurde dann auf eine Bio-Gel A.5-Säule (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California), 5 · 100 cm, äquilibriert mit NE-Puffer, aufgebracht. Die DNA wurde mit NE-Puffer eluiert. 20-ml- Fraktionen wurden mit einer Fließrate von 60 ml/h gesammelt. Die Eluierung von DNA wurde durch Messen der dekadische Extinktion jeder Fraktion bei 260 nm unter Verwendung eines Gilford 2600 UV-VIS-Spektrophotometers überwacht. Die Wirts-DNA und die Plasmid-DNA wurden gemeinsam im leeren Volumen wiedergewonnen. Die Fraktionen, die die DNA enthielten, wurden vereinigt und mit Äthanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugierung mit 8.000 UpM für 40 min in einer gekühlten Sorvall-Zentrifuge unter Verwendung eines HB-4-Rotors gesammelt und in 5 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8), der 0,2 M NaCl enthielt, erneut gelöst. Die DNA-Probe wurde dann auf eine RPC-5-Säule, 0,9 · 90 cm, aufgebracht, und unter Druck bei 30ºC gepackt. Die DNA wurde mit einem linearen Gradienten (Gesamtvolumen 1 Liter) aus 0,6-0,7 M NaCl in 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,8, eluiert. Fraktionen von 2,5 ml wurden mit einer Fließrate von 0,8 ml/min gesammelt. Die Eluierung der DNA wurde durch Messen der Leitfähigkeit einer jeden gesammelten Probe unter Verwendung eines Leitfähigkeitsmeßgerätes (Radiometer, Kopenhagen) und durch Agarosegelelektrophorese unter Verwendung von vertikalen Agaroseplattengels (0,25 · 14 · 15,5 cm) überwacht. Die Proben wurden auf 1% Agarosegels aufgebracht, die in 40 mM Tris-Basenpuffer, pH 8,2, hergestellt worden waren, der 1 mM EDTA und 5 mM Natriumacetat (TAE-Puffer) enthielt, und 3 h lang bei einer konstanten angelegten Spannung von 5 V/cm elektrophoresiert. Fraktionen, die die supergecoilte und eingekerbte zirkulare DNA enthielten, wurden getrennt gesammelt und mit kaltem Äthanol ausgefällt. Die resultierenden Niederschläge von ColE1-DNA-Molekülen wurden in 1,0 bzw. 0,6 ml TEN-Puffer gelöst.
Isolierung von Plasmid pBR322
• Plasmid pBR322 wurde von E.coli Stamm 294 (pBR322) durch das zum Isolieren von ColE1-Plasmid wie oben beschrieben eingesetzte Verfahren isoliert.
Herstellung von scherkraftunterworfenen Fragmenten von ColE1 DNA
• 200 ul gekerbte zirkulare ColE1-DNA (0,7 ug/ul) und 2,8 ml 0,3 M Natriumazetat wurden gemischt. Die DNA-Lösung wurde in eine Mikrohomogenisatorzelle eines Omnimixers (Dupont Instruments, Newton, Connecticut) gegeben, und die DNA wurde bei 38.500 UpM 20 min lang der Scherkraft unterworfen. Die Temperatur wurde während des gesamten Scherprozesses bei 0ºC gehalten. Die scherkraftunterworfene DNA wurde mit Äthanol ausgefällt, in 100 ul TEN-Puffer erneut gelöst und mit Kalbs-Intestinalphosphatase (CIT) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) behandelt. Die Behandlung mit CIT wurde in zwei 500 ul Reaktionsmischungen durchgeführt. Jede Reaktionsmischung enthielt 380 ul destilliertes Wasser, 50 ul 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 5 ul 10 mM Zinksulfat, 5 ul CIT (10 E/ul). Nach 30 minütiger Inkubation bei 37ºC wurden zusätzliche 5 ul CIT hinzugefügt und die Inkubation bei 37ºC weitere 30 min fortgesetzt. Die Reaktionsmischungen wurden zweimal mit einem gleichen Volumen an puffergesättigtem Phenol extrahiert, und die DNA wurde mit Äthanol ausgefällt. Die heterogene Population an DNA-Fragmenten wurde weiter gereinigt, und durch Saccharosegradient-Geschwindigkeitszentrifugation entsprechend der Größe aufgetrennt. Ein diskontinuierlicher Saccharosegradient wurde in Zentrifugenröhren für den SW40-Rotor (Beckman) durch sequentielles Schichten von 3,4 ml 20%, 15%, 10% und 5% Saccharose in 0,3 M Natriumazetatpuffer (pH 7,0) hergestellt, der 1 mM EDTA enthielt. Die DNA-Probe in 100 ul (0,25 ug/ul) wurde auf den Saccharosegradienten geschichtet und 20 h lang bei 10ºC unter Verwendung einer L8-70-Beckman-Ultrazentrifuge bei 35.000 UpM zentrifugiert. Fraktionen von jeweils 0,5 ml wurden gesammelt und mit Äthanol ausgefällt. Die Niederschläge wurden in 50 ul TEN-Puffer erneut gelöst und durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Durch Behandlung von Bakteriophage DNA mit HindIII-Endonuklease erzeugte DNA-Fragmente wurden als Molekulargewichts-Standards verwendet. Die λ/HindIII-Reaktionsmischung enthielt 27 ul destilliertes Wasser, 10 ul 5X HindIII-Puffer 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2,5 mM Na&sub2; EDTA, 200 mM NaCl, 5 mM DTT), 1 ul 1λDNA (0,7 ug/ul), und 2 ul HindIII-Lösung (2E/ul).
• Saccharosegradientfraktionen, die einer Scherkraft unterworfene ColE1-DNA-Fragmente mit durchschnittlich 2.000 bp enthielten, wurden vereinigt, mit Äthanol ausgefällt und in TEN-Puffer erneut gelöst.
Klonen von scherkraftunterworfenen ColE1-Fragmenten in pBR322
• Plasmid pBR322 wurde mit PstI in ein lineares Molekül gespalten. Die Reaktionsmischung enthielt 520 ul destilliertes Wasser, 200 ul 5X PstI-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 mM Na&sub2; EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT, 50% Glycerin, 0,15% Triton X100), 200 ul pBR322 DNA-Lösung (0,25 ug/ul), und 80 ul PstI (12 E/ul), und wurde 4 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von EDTA bis zu 20 mM abgebrochen und mit einem gleichen Volumen an Phenol extrahiert. Die DNA wurde mit Äthanol ausgefällt und in TEN-Puffer erneut gelöst.
• Poly(dG)-Homopolymer-Verlängerungen wurden zu linearen pBR322 Molekülen in einer Reaktionsmischung hinzugefügt, die 6 ul destilliertes Wasser, 20 ul 500 mM Kaliumcacodylat, 10 ul 10 mM Kobaltchlorid, 10 ul 1 mM DTT, 2 ul 10 mM dGTP, 20 ul ³H-dGTP (New England Nuclear Corporation), 25 ul DNA (0,04 ug/ul) und 5 ul (12 E/ul) terminale Desoxynukleotidyltransferase (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland) enthielt.
• Poly(dC)-Homopolymer-Verlängerungen wurden zu ColE1-gescherten Fragmenten in einer ähnlichen Reaktionsmischung hinzugefügt, mit der Ausnahme, daß die Gesamt-DNA 2,0 ug betrug und das Nukleotidtriphosphat dCTP war. Die obigen Reaktionen wurden bei 37ºC 2 bzw. 3 min lang durchgeführt und wurden durch Hinzufügen von EDTA bis zu 20 mM und Extrahieren mit Phenol abgebrochen. ColE1- poly(dC) -Fragmente wurden in 115 ul destilliertem Wasser erneut gelöst und wurden zu linearen pBR322-[poly(dG)]-Molekülen zusammengefügt, indem 40 ul 0,5 M NaCl, 40 ul 50 mM EDTA (pH 7,25) und 3 ul lineare pBR322-[poly(dG)]-DNA-Lösung (0,1 ug/ul) hinzugefügt wurde. Die Zusammenfügungsmischung wurde 15 min lang bei 70ºC inkubiert und dann über einen Zeitraum von 5 h auf 40ºC abgekühlt. Die Mischung wurde über Nacht bei 45ºC gehalten und dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
• Zur Transformation in E.coli 294 wurde eine über Nacht in L-Brühe gezogene Kultur 1 : 100 in frisches L-Brühe-Medium verdünnt und unter Rütteln bei 37ºC inkubiert, bis das OD&sub6;&sub0;&sub0; 0,6 betrug. Zu diesem Zeitpunkt wurden 35 ml der Kultur 10 min lang bei 4ºC mit 6.000 UpM zentrifugiert, und das Pellet wurde in 20 ml 0,05 M CaCl&sub2; resuspendiert. Die Zellen wurden auf Eis 15 min lang inkubiert, bevor sie durch Zentrifugierung mit 4.000 UpM 10 min lang gesammelt wurden. Die Zellen wurden in 4 ml 0,05 M CaCl&sub2; resuspendiert und mit 200 ul einer DNA-Lösung gemischt, die durch Hinzufügen von 50 ul der Zusammenfügungsmischung und 150 ul 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), das 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM CaCl&sub2; enthielt, hergestellt worden war. Diese Mischung wurde 25 min lang bei 0ºC inkubiert, gefolgt von Inkubation bei 50ºC für 10 sec und bei Raumtemperatur für 10 min. An diesem Punkt wurden 14 ml L-Brühe hinzugefügt und die Kultur 30 min lang bei 37ºC gerüttelt. Dann wurden 480 ul Tetracyclinlösung, 1,25 mg/ml, zu der Kultur hinzugefügt, und die Inkubation wurde weitere 30 min fortgesetzt. Aliquote von 100 ul wurden auf frisch hergestellte Agarplatten, die 25 ml L-Brühe, 1,5% Agar und 25 ug/ml Tetracyclin enthielten, plattiert. Die Tcr-Transformanten wurden weiter auf Empfindlichkeit für Ampicillin getestet, indem sie auf Agar plattiert wurden, das 25 ug/ml Ampicillin enthielt.
• Die Tcr-Aps-Transformantkolonien wurden dann auf die spontane Erzeugung von Colicin gescreent. Einzelne Kolonien wurden auf L-Agarplatten ausfindig gemacht und wurden bei 37ºC über Nacht inkubiert. Die Kolonien wurden abgetötet, indem man sie Chloroformdampf aussetzte, dann mit 5 ml L-Brühe überschichtet, die 0,7% Agar und 0,1 ml einer über Nacht gezogenen Kultur von E.coli K-12 CL142, enthielt. Nachdem der Agar hart geworden war, wurden die Platten bei 37ºC über Nacht inkubiert. Kolonien mit einer Inhibitionszone um sie herum wurden als Colicinproduzenten gewertet.
• Die Tcr Aps Col&spplus; Transformantkolonien wurden durch Analysieren einer kleinen Menge von geklärtem Lysat durch Agarosegelelektrophorese wie bezüglich pUC8/C TAP-III oben beschrieben auf die Gegenwart von rekombinanten Plasmiden gescreent. Die Größe der Plasmide wurde durch Messen der elektrophoretischen Migration von DNA durch ein Agarosegel unter Verwendung von 8 Plasmidstandards im Größenbereich von 1,36 · 10&sup6; bis 35,8 · 10&sup6; Dalton bestimmt (F.L. Marcina, D. J. Kopecko, K.R. Jones, D.J. Ayers und S.M. McCowen. "A multiple plasmid-containing Escherichia coli strain: Convenient source of size reference plasmid molecules" Plasmid (1978) 1 : 417-420).
Restriktionsendonuklease-Fragmentgrößenanalyse von rekombinanten Plasmiden
• Transformierte Klone wurden in 2-Liter-Kulturen gezogen. Geklärte Lysate wurden wie oben beschrieben hergestellt. Die Oberstände wurden mit Bauchspeicheldrüsen-RNase A (100 ug/ml bei 37ºC 30 min lang) behandelt und wurden dann mit Phenol extrahiert. Die DNA wurde mit Äthanol ausgefällt und in TEN-Puffer erneut gelöst.
• Restriktionsenzyme wurden als Handelserzeugnisse von Bethesda Research Laboratories, Inc. (BRL) erhalten. Die DNA wurde mit PstI, EcoRI, SmaI und SacII unter den von BRL angegebenen Bedingungen digeriert. Proben wurden auf 1%-Agarosegels aufgebracht und 4 h bei einer Konstanten angelegten Spannung von 5 V/cm elektrophoresiert. Die Molekulargewichte von Restriktionsfragmenten wurden bezüglich der Standardmigrationsmuster von mit HindIII und HaeIII digerierter Bakteriophag-λ-DNA bestimmt.
• Restriktionsanalyse unter Einsatz von PstI wurde verwendet, um die Größe des (der) Fragment-Einfügung in der PstI-Stelle des pBR322-Abschnitts der rekombinanten Plasmide zu bestimmen. Fig. 8 ist ein Restriktionsplan des als pNP6 bezeichneten rekombinanten Plasmids eines der transformierten Klone. Eine Probe dieses als NP6-294 bezeichneten transformierten Klons wurde am 24. August 1983 bei ATCC hinterlegt. Diese Probe erhielt die ATCC Eingangsnummer 39418. Diese Hinterlegung erfolgte gemäß dem Budapester Vertrag und wird gemäß dessen Bestimmungen aufbewahrt und anderen zugänglich gemacht.
• E.coli Stamm NP6-294 (pNP6) wurde gezogen und Plasmid DNA isoliert, wie oben für ColE1 beschrieben. Die supergecoilte DNA wurde durch Einstellen von 500 ug DNA auf 3,9 ml TEN-Puffer und Hinzufügen von 3,45 g CsCl und 0,1 ml Ethidiumbromidstammlösung (5 mg/ml) weiter gereinigt. Diese Mischung wurde in ein Zellulosenitratrohr für einen SW50.1 Rotor (Beckman) übertragen und mit 36.000 UpM bei 10ºC 40 h lang zentrifugiert. Das Plasmid-DNA-Band wurde unter einen Langwellen- UV-Licht geortet und mit einer Spritze durch Punktieren des Rohrs von der Seite her entfernt. Die DNA-Probe wurde 5mal mit Butanol extrahiert und gegen 100 Volumina (·3) TEN-Puffer 24 h bei 4ºC dialysiert. Die DNA wurde dann mit 2,5 Volumina Äthanol und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat ausgefällt.
Herstellung von Derivat pNP6ΔRI
• Plasmid pNP6 enthält zwei EcoRI-Restriktionsstellen, von denen sich eine im carboxyterminalen Bereich des Colicin E1-Gens und die andere in der Nähe des Tetrazyklinresistenzgens des ursprünglichen pBR322- Vektors befindet. Ein Derivat von pNP6, dem die zweite Stelle fehlte, wurde folgendermaßen konstruiert. pNP6 wurde mit EcoRI unter eingeschränkten Reaktionsbedingungen digeriert, so daß lineare Moleküle (nur an einer der beiden Stellen gespalten) erzeugt wurden. Lineare Moleküle von pNP6 wurden durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und in der Folge mit DNA-Polymerase I und Desoxyribonukleotidtriphosphaten umgesetzt, um die einstrangigen Enden aufzufüllen. Die resultierenden Moleküle wurden in einer Stumpfend-Ligierungsreaktion unter Verwendung von T&sub4;-Ligase zirkularisiert und verwendet, um E.coli 294 wie zuvor beschrieben zu transformieren.
• Colicin-erzeugende Transformanten wurden wie zuvor beschrieben ausgewählt. DNA wurde von einzelnen Klonen isoliert und mit EcoRI digeriert, um diejenigen zu identifizieren, die eine einzelne, intakte EcoRI-Stelle innerhalb des Colicingens enthielten. Die Position der einzelnen EcoRI-Stelle wurde durch zusätzliches Restriktions-Endonulease-Mapping bestätigt.
Herstellung des pNP6-LBR Derivats
• Fig. 9 gibt einen Oberblick über die verwendeten Schritte um pNP6-LBR aus PnP6 herzustellen. pNp6 wurde durch Mischen von 40 ul DNA (90,61 ug/ul), 10 ul destilliertem Wasser, 50 ul 2 · SacII-Puffer (15 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM β-Mercaptoäthanol, 200 ug/ml BSA und 3 ul SacII (10 E/ul) mit SacII digeriert. Die Reaktionsmischung wurde bei 37ºC 8 h lang inkubiert und mit Phenol/Chloroform (3 : 1) extrahiert.
• Die DNA wurde dann mit Aethanol ausgefällt und in 100 ul einer Lösung erneut gelöst, die 50 mM Tris-HCl (pH 8,5), 7 mM MgCl&sub2;, 10 mM β-Mercaptoäthanol, 15 mM Ammoniumsulfat, 7 mM Na&sub2; EDTA, 20 ug BSA und 0,1 mM dTTP enthielt. Eine Einheit T4-DNA-Polymerase (BRL) wurde hinzugefügt, und die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 10 min lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 25 ul 0,2 M Na&sub2; EDTA abgebrochen. Die Lösung wurde von dTTP gereinigt, indem die DNA in 0,12 M Natriumphosphat (PB), 15% Fromamid, an 0,5 g Hydroxyapatit bei 65ºC gebunden, mit 30 ml 0,12 M PB gewaschen, die DNA mit 0,5 M PB eluiert, gegen Wasser dialysiert und mit Äthanol ausgefällt wurde.
• DNA wurde in einer 50 ul Lösung gelöst, die 30 mM Natriumacetat (pH 4,6), 50 mM NaCl, 1 mM ZnSO&sub4; und 5% Glycerin enthielt. Zwei Einheiten Sl-Nuklease wurden hinzugefügt und die Mischung bei Raumtemperatur 5 min lang inkubiert. EDTA wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 mM hinzugefügt und die Lösung mit Phenol/Chloroform (3 : 1) extrahiert und mit Äthanol ausgefällt. Die DNA wurde in 50 ul Lösung erneut gelöst, die 100 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgCl&sub2;, 2 mM β-Mercaptoäthanol und 50 mM NaCl enthielt. 5 Einheiten EcoRI wurden hinzugefügt, und die Mischung bei 37ºC 6 h lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 15 ul 0,1 M EDTA und 5 ul 10% SDS abgebrochen. Das große Plasmidfragment, pNP6-LBR, wurde durch Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel 4 h lang bei 5 V/cm gereinigt. Die DNA-Fragmente wurden unter Langwellen-UV-Licht sichtbar gemacht, nachdem das Gel 15 min lang mit 1 ug/ml Ethidiumbromid gefärbt worden war. Das DNA-Band (pNP6-LBR) wurde aus dem Plattengel herausgeschnitten, und die DNA in einen Dialysebeutel hinein elektroeluiert. Die DNA wurde durch Binden an einer 1-cm-Säule aus Diäthylaminoäthyl (DEAE)-Zellulose, Waschen mit 0,15 M NaCl, eluieren mit 1 M NaCl und Ausfällen mit Äthanol weiter gereinigt. Die DNA wurde schließlich in TEN-Puffer gelöst und bis zur Verwendung bei -85ºC gelagert.
Herstellung von CTAP-III-Leu21-Geneinfügung zur Ligierung mit pNP6-LBR
• Fig. 10 gibt einen Überblick über die Schritte zur Herstellung der Einfügungs-DNA aus pUC8/CTAP-III-Leu21.
• Plasmid pUC8/CTAP-III-Leu21-DNA wurde nach dem gleichen Verfahren gereinigt, das zur Reinigung von pNP6 verwendet wurde. Nach der Ausfällung mit Äthanol wurden 10 ug der DNA in einer Lösung gelöst, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM β-Mercaptoäthanol, 50 mM NaCl und 100 ug/ml BSA enthielt. Fünf Einheiten PvuII wurden hinzugefügt und die Mischung wurde 3 h lang bei 37ºC inkubiert. Die DNA wurde mit Phenol/Chloroform (3 : 1) extrahiert und mit Äthanol ausgefällt.
• Enzymreaktionen unter Verwendung von T&sub4;-Polymerase (mit dTTP und dCTP einzeln), S1-Nuklease und Endonuklease EcoRI wurden wie oben für pNP6-Vektor-DNA beschrieben durchgeführt. Das resultierende Fragment hat ein stumpfes Ende und ein klebriges EcoRI-Ende. Ligierung des stumpfen Endes dieses Fragments an das stumpfe Ende von pNP6-LBR bildet ein Startkodon, ATG, in Phase mit dem strukturellen Gen für CTAP- III-Leu21.
Herstellung von Expressionsplasmid pNP6-LBR/CTAP-III-Leu21
• Jeweils etwa 1 pmol Vektor-pNP6-LBR und CTAP-III-Leu21-Geneinfügung wurden in einer 100 ul Reaktion ligiert, in E.coli 294 transformiert und mit Tetracyclin ausgewählt, wobei die oben unter "Klonen des synthetischen CTAP III-Fragments in pUC8" beschriebenen allgemeinen Verfahren verwendet wurden. Kolonien, die rekombinantes Plasmid enthalten, wurden durch Feststellung des Verlustes der Fähigkeit, Colicin E1 zu produzieren, gescreent.
• Einzelne Kolonien wurden auf L-Agarplatten ausfindig gemacht und bei 37ºC über Nacht inkubiert. Die Kolonien wurden dadurch abgetötet, daß man sie Chloroformdampf aussetzte, und wurden dann mit 5 ml L-Brühe überschichtet, die 0,7% Agar und 0,1 ml einer über Nacht gezogenen Kultur von E.coli K-12, CL142, enthielt. Nach dem Aushärten des Agars wurden die Platten bei 37ºC über Nacht inkubiert. Kolonien mit einer Inhibitionszone um sie herum wurden als Colicinproduzenten gewertet. Kolonien, die keine Zone erzeugten, enthalten das rekombinante Plasmid, wie durch Analysieren eines geklärten Lysats durch Agarosegelelektrophorese wie oben beschrieben gezeigt. Rekombinante DNA wurde isoliert und einzeln mit den Restriktionsendonukleasen BamHI, XbaI und PstI digeriert. Die Fragmentmuster bestätigten die Identität der CTAP-III-Leu21-Geneinfügung. Einer der Transformanten, die die CTAP-III-Leu21-Geneinfügung enthielten, wurde pNP6-LBR/CTAP-III-Leu21 benannt.
Herstellung von Expressionsplasmid pUC8-Col/CTAP-III-Leu21
• Gereinigtes Plasmid pNP6-LBR/CTAP-III-Leu21 wurde mit Endonuklease PstI digeriert, um zwei Fragmente zu erzeugen, von denen das kleinere ( 2100 bp) den Colicinregulationsbereich und das strukturelle CTAP- III-Leu21-Gen enthält. Dieses Fragment wurde gereinigt und in die einzelne PstI-Stelle von Plasmid pUC8 geklont, und Transformanten wurden mit Ampicillin ausgewählt. Das pUC8-Col/CTAP-III-Leu21 benannte resultierende rekombinante Plasmid weist eine mehr als zehnfache Zunahme der Kopienanzahl als pBR322 auf und schafft somit bei der Induktion aufgrund eines Gendosierungseffekts wesentlich größere Mengen an CTAP-III-Leu21.
Induzierte Synthese von CTAP-III oder CTAP-III-Analogen
• Die Stämme pNP6-LBR/CTAP-III-Leu21 oder UC8-Col/CTAP-III-Leu21 wurden in 10 ml L-Brühe-Medium über Nacht bei 37ºC ohne Belüftung gezogen. Die Kulturen wurden dann 1 : 100 in frisches L-Brühe-Medium verdünnt und bei 37ºC unter Belüftung inkubiert, bis die Zelldichte etwa 5 · 10&sup8; Zellen/ml (OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,6) erreichte. Zu diesem Zeitpunkt wurde Mitomycin C bis zu einer Endkonzentration von 2 ug/ml hinzugefügt, und die Inkubation wurde weitere 3,5 h lang fortgesetzt. Die Kultur wurde auf 0ºC abgekühlt und Zellen wurden durch Zentrifugierung mit 6.000 UpM für 15 min unter Verwendung des GSA-Rotors und einer Sorvall-Zentrifuge gesammelt. Das Zellpellet wurde bei -85ºC gefroren gelagert.
• Diese Wachstumsbedingungen schaffen mehr als 10 mg CTAP-III-Leu21 pro Liter Kultur im Fall von UC8-Col/CTAP-III-Leu21.
• Nachdem die Zellen dazu gebracht worden waren, CTAP-III/CTAP-III-Analog zu erzeugen, wird das CTAP-III/CTAP- III-Analog aus den Zellen aufgearbeitet. Die Zellen werden zuerst wahlweise durch Erwärmen oder Hinzufügen eines leicht entfernbaren zytotoxischen Agens zum Kulturmedium abgetötet und dann, wenn notwendig, durch Filtration oder Zentrifugation eingeengt. Die Zellwand wird dann gemäß herkömmlicher Verfahren wie Beschallung, Homogenisierung, Lyse oder Druckzyklen zertrümmert. Feststoffe können vom zertrümmerten Material durch Filtration oder Zentrifugation entfernt werden. Nukleinsäuren werden von der Flüssigphase des zertrümmerten Materials mittels herkömmlicher Verfahren wie Ausfällung oder Chromatographie entfernt. Das CTAP-III oder Analog wird dann mit den gleichen Techniken gewonnen, die eingesetzt werden, um es von menschlichen Blutplättchen zu reinigen.
Herstellung von Expressionsplasmid pNP6/CTAP-III-NMOD
• Fig. 11 gibt einen Überblick über die Schritte zur Herstellung von pNP6/CTAP-III-NMOD aus pUC8/CTAP-III-Leu21 und pNP6.
• Gereinigte pUC8/CTAP-III-Leu21-Plasmid-DNA wurde bis zur Vollständigkeit mit Endonuklease PvuII digeriert, gefolgt von Endonuklease EcoRI. Die Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, und das 273 bp Fragment, das das CTAP-Gen enthielt, wurde elektroeluiert, mit Phenol extrahiert und mit Äthanol ausgefällt (Teil (A) von Fig. 11). Gereinigte pNP6-Plasmid-DNA wurde bis zur Vollständigkeit mit Endonuklease SacII digeriert, gefolgt von Behandlung mit T&sub4;-Polymerase und Desoxycytidintriphosphat, um die 3' einstrangigen Enden zu entfernen. Das Produkt dieser Reaktion wurde mit Endonuklease EcoRI digeriert, und das erzeugte große DNA-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese gereinigt (Teil (B) von Fig. 11).
• Die Endprodukte der Teile (A) und (B) wurden in einem äquimolaren Verhältnis gemischt und mit T&sub4;-Ligase ligiert (Teil (C) von Fig. 11). Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E.coli 294 zu transformieren, und mehrere tetracyclinresistente Transformanten wurden ausgewählt. Plasmid-DNA von diesen Klonen wurde durch Restriktionsendonukleasedigestion und DNA-Sequenzanalyse analysiert, um Rekombinanten mit der korrekten Struktur zu identifizieren.
Herstellung von Expressionsplasmid pNP6ΔRI/Col:CTAP-III-Leu21
• Fig. 12 gibt einen Überblick über die an der Herstellung von pNP6ΔRI/CTAP-III-Leu21 aus PUC8/CTAP-III-Leu21 und pNP6ΔRI beteiligten Schritte.
• Gereinigte pUC8/CTAP-III-Leu21-Plasmid-DNA wurde bis zur Vollständigkeit mit Endonuklease EcoRI digeriert, um das 284 bp-Fragment zu erzeugen, das das CTAP III-Gen enthielt. Dieses Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese gereinigt (Teil (A) von Fig. 12). Gereinigtes Plasmid pNP6ΔRI (oder pNP6) wurde bis zur Vollständigkeit mit Endonuklease EcoRI digeriert, und das Vektorfragment wurde durch Agarosegelelektrophorese gereinigt (Teil (B) von Fig. 12).
• Die Endprodukte der Teile (A) und (B) wurden in äquimolaren Mengen gemischt, ligiert, und in E.coli 294 transformiert. DNAs von tetrazyklinresistenten Transformanten wurden durch Endonuklease-BamHI- Digestion analysiert, um die beiden möglichen Ausrichtungen des CTAP- III-Fragments innerhalb der Vektor-DNA zu unterscheiden. Die korrekte Ausrichtung erzeugt ein Verschmelzungsprodukt des CTAP-III-Proteins mit Aminosäureresten 1-502 von Colicin E1 (Teil (C) von Fig. 12).
Synthese von CTAP-III NMOD
• Die Induktion von CTAP-III-NMOD-Synthese und seine Reinigung werden wie zuvor für CTAP-III-Leu21 beschrieben erreicht, wobei Zellen verwendet wurden, die das Expressionsplasmid pNP6/CTAP-III-Leu21-NMOD enthielten. Die Aminosäuresequenz von CTAP-III-NMOD ist in Fig. 1 dargestellt, wobei die Pentapeptidhinzufügung am Aminoterminus in geschwungenen Klammern dargestellt ist. Das terminale Methionin des dargestellten Pentapeptids ist als Ergebnis der bakteriellen Produktion des Proteins vorhanden. Es ist klar, daß dieses Methionin aufgrund von Verarbeitung nach der Expression abwesend sein kann.
Synthese von Verschmelzungsprotein von Colicin-CTAP-III-Leu21
• Induktion von Col:CTAP-III-Leu21-Synthese wird wie zuvor für CTAP- III-Leu21 beschrieben erreicht, wobei Zellen eingesetzt werden, die das Expressionsplasmid pNP6/Col:CTAP-III-Leu21 enthalten.
Reinigung und Spaltung von Verschmelzungsprotein
• Zellextrakte, die CTAP-III-Leu21 verschmolzen mit ColE1(1-502) (Col:CTAP-III-Leu21) enthielten, wurden durch Lysieren von Zellen in 50 mM Natriumborat, pH 9,5, bei einer Konzentration von 1-5 · 10¹&sup0; Zellen/ml hergestellt. Zellreste wurden durch Zentrifugierung entfernt. Col:CTAP-III-Leu21 wurde unter Anwendung von Kationenaustauschchromatographie nach einem von zwei Verfahren gereinigt:
• (1) 1 Gramm CM-Sephadex C-50 (mit 50 mM Natriumborat, pH 9,5, äquilibriert) wurde zu 100 ml Zellextrakt hinzugefügt und über Nacht leicht bei 4ºC gerührt. Das Harz wurde durch Filtration gesammelt und ausgiebig mit Puffer gewaschen, bis durch Messung der dekadischen Extinktion bei 280 nm keine weitere Freisetzung von Protein festgestellt wurde. Das Col:CTAP-III-Leu21 wurde mit Puffer eluiert, der 0,4 M NaCl enthielt.
• (2) Col:CTAP-III-Leu21 wurde unter Verwendung des Pharmacia Schnellproteeinflüssigchromatographie(FPLC)-Systems von Zellextrakten gereinigt. 10 bis 100 ml Extrakt wurde auf eine Mono-S-Säule in 50 mM Natriumborat, pH 9,5, aufgebracht, und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl eluiert. Das Verschmelzungsprotein eluierte bei etwa 0,25 M NaCl.
• Die Reinheit von nach einem der beiden Verfahren hergestelltem Col:CTAP-III-Leu21 lag im allgemeinen über 90%, wie durch eine Analyse bewertet, bei der Polyacrylamidgelelektrophorese unter Denaturierungsbedingungen eingesetzt wurde.
• Gereinigtes Verschmelzungsprotein wurde ausgiebig gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das Protein wurde in 70%iger Ameisensäure gelöst; Cyanogenbromid wurde in einem Verhältnis von 300 Mol Cyanogenbromid pro Mol Methionin (etwa 2 mg Cyanogenbromid pro mg Verschmelzungsprotein) hinzugefügt.
• Proben wurden bei Raumtemperatur 22 h lang inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde dann mit zwei Volumina destilliertem Wasser verdünnt und lyophilisiert. Dieser Zyklus wurde ein- bis zweimal wiederholt, um die Säure und das Cyanogenbromid zu entfernen. Schließlich wurde das Protein in 50 mM Natriumphosphat, pH 6,2, gelöst und durch FPLC unter Verwendung der Mono-S-Säule gereinigt. Protein wurde durch Gradienteluierung mit Phosphatpuffer, pH 6,2, von 0 bis 0,5 M NaCl abgetrennt. Gereinigtes CTAP-III-Leu21 eluierte zwischen 0,2 und 0,3 M NaCl.
Umwandlung von CTAP-III-Leu21 in β-Thromboglobulin-Leu17 (β-TG-Leu17)
• CTAP-III-Leu21 kann durch proteolytische Spaltung des aminoterminalen Tetrapeptids bei Lys4-Gly5 unter Verwendung entweder von Plasmin oder Trypsin und der folgenden Vorschrift in β-TG-Leu17 umgewandelt werden.
• Etwa 0,5 mg/ml CTAP-III-Leu21 in 0,15 M NaCl/0,01 M Tris-HCl, pH 7,5, wird bei 37ºC 1 h lang mit 1,5 I.E./ml Plasmin oder 10 min lang mit 0,5 Gew-% Trypsin inkubiert. β-TG-Leu17 wird durch FPLC unter Verwendung einer Mono-S-Säule wie oben beschrieben gereinigt.
• Die gereinigten CTAP-III oder CTAP-III-Analoge werden typischerweise mit herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen Trägern zur Verabreichung an Menschen formuliert, um Bindegewebe zu regenerieren (z. B. um Wunden zu heilen). Es wird gewöhnlich örtlich unter Verwendung herkömmlicher lokaler Formulierungen wie Cremes, Pasten, Gels, Sprays, Salben und Heilpflaster verabreicht. Für derartige Formulierungen verwendete Träger sind wohlbekannt und umfassen, ohne Einschränkung, Petrolatum, Polyäthylenglykol, Gelatine, Isopropylmyristat, Polyvinylalkohol und ähnliche. Alternativ dazu kann das gereinigte CTAP-III oder Analog unter Verwendung gesteuerter Dosisfreisetzungsformen verabreicht werden, die typischerweise aus Verbänden oder Hautpflaster bestehen, die CTAP-III oder ein Analog in einer Art enthalten, in der es in einer gesteuerten Rate an die Haut abgegeben wird. Der Steuerungsmechanismus kann Diffusion, Osmose, Auflösung, Erosion oder Iontophorese sein. Die lokal verabreichte Formulierung von CTAP-III oder einem Analog kann geringe Mengen an Additiven wie Weichmacher, Stabilisatoren, oberflächenaktive Mittel, Mittel zum Ändern der Hautdurchdringung und Pigmente enthalten. Die Konzentration von CTAP-III oder dem Analog in der Formulierung ist in Korrelation zur vorgeschriebenen Dosis und der zu behandelnden Oberfläche zu bringen. Die Konzentration liegt normalerweise im Bereich von 0,0001 bis 1 Gew-% der Dosierungsform. In jedem Fall ist die verabreichte Menge ausreichend, um die gewünschte pharmakologische Wirkung zu erzielen, z. B. die Mitogenese anzuregen etc., um die Wundheilung zu erleichtern.
• Modifikationen der oben beschriebenen Durchführungsarten der Erfindung, die für den Fachmann auf dem Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht, offensichtlich sind, sollen im Schutzbereich der folgenden Patentansprüche liegen. Zum Beispiel liegt es auch im Schutzbereich der Erfindung, zu Colicin E1 regulierende und strukturelle Gensequenzen in andere Plasmide als pBR322 einzubringen, die geeignete Replikations- und Markierungsfunktionen und geeignete Restriktionsstellen aufweisen. Es ist auch möglich, das CTAP-III- oder Analoggen in andere Expressionsplasmide einzufügen, die andere bakterielle Expressionssteuerungssysteme verwenden als das ColE1-System, um die Expression der Einfügung zu steuern. Zum Beispiel können Vektoren eingesetzt werden, bei denen das trp-Expressionssteuerungssystem oder das lac-System verwendet wird.

Claims (17)

1. Synthetisches strukturelles Gen, das für menschliches Bindegewebe aktivierendes Peptid-III oder ein Mutein davon kodiert, worin das Methionin an Position 21 durch Leucin ersetzt ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Kodierungsstrang des Gens die Nukleotidsequenz

aufweist,

worin

A = Adenin

G = Guanin

C = Cytosin

T = Thymin

P = entweder A oder G

Q = entweder C oder T

H = entweder T, C oder G

J = entweder C oder A

L = entweder T oder A

M = entweder C oder G.

2. Synthetisches strukturelles Gen nach Anspruch 1, worin das Gen die DNA-Sequenz

aufweist, worin K abhängig von J entweder G oder T ist.

3. DNA-Fragment zur Verwendung bei mikrobieller Erzeugung von menschliches Bindegewebe aktivierendem Peptid-III oder einem Mutein davon, worin das Methionin an Position 21 mit Leucin ersetzt ist, wobei das Fragment aus dem strukturellen Gen nach Anspruch 2 besteht, dem das Basenpaar

vorangeht und das durch ein Adaptorfragment abgeschlossen ist, das die Sequenz

TAATGACTGCAG ATTACTGACGTCTTAA

aufweist.

4. Rekombinanter Plasmidexpressionsvektor, umfassend eine bakterielle Expressionssteuerungssequenz, ein heterologes strukturelles Gen stromabwärts von und in Phase mit der Expressionssteuerungssequenz und von dieser gesteuert, und ein Translationsstartkodon, das dem strukturellen Gen vorangeht und ein Translationsstopkodon, das das strukturelle Gen abschließt, dadurch gekennzeichnet, daß das strukturelle Gen das strukturelle Gen nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 ist.

5. Plasmidexpressionsvektor nach Anspruch 4, worin die Expressionssteuerungssequenz die Colicin E1-Expressionssteuerungssequenz ist.

6. Induzierbarer Plasmidexpressionsvektor, der das Ligierungsprodukt von

(a) dem strukturellen Gen nach Anspruch 2; und

(b) dem linearen rekombinanten Plasmid nach Anspruch 4 ist.

7. Mit dem Plasmidexpressionsvektor nach einem der Ansprüche 4 bis 6 transformiertes E.coli und Abkömmlinge davon.

8. Verfahren zur Erzeugung von Bindegewebe aktivierendem Peptid III oder eines Muteins davon, worin das Methionin an Position 21 durch Leucin ersetzt wird, umfassend das Ziehen, in einem Kulturmedium, von E.coli und Abkömmlinge davon, die mit dem Plasmidexpressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert sind, und das Induzieren der Expression des Peptids dadurch, indem dem Kulturmedium ein SOS-System aktivierendes Agens hinzugefügt wird.

9. Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von menschlichem CTAP-III ist, worin das Methionin an Position 21 von CTAP-III durch eine andere Aminosäure ersetzt worden ist, die ähnliche hydrophobe Eigenschaften aufweist, und dadurch, daß es CTAP-III-Aktivität bei behält.

10. Protein nach Anspruch 9, worin das Methionin an Position 21 durch Leucin ersetzt worden ist.

11. Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von menschlichem β-TG ist, worin das Methionin an Position 17 des β-TG durch eine andere Aminosäure ersetzt worden ist, die ähnliche hydrophobe Eigenschaften besitzt, und dadurch, daß es β-TG-Aktivität bei behält.

12. Protein nach Anspruch 11, worin das Methionin an Position 17 durch Leucin ersetzt worden ist.

13. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein nach Anspruch 9 mit Trypsin oder Plasmin behandelt wird.

14. Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von CTAP-III ist, das CTAP-III-Aktivität bei behält und ein unpolares Polypeptidfragment aufweist, das mit seinem aminoterminalen Ende verschmolzen ist und das die alpha-Helixstruktur des genannten Endes beibehält und dazu führt, daß das Mutein für in vivo Umwandlung in β-Thromboglobulin weniger anfällig ist als CTAP-III.

15. Protein nach Anspruch 14, worin das Fragment das Polypeptid (met)n-glu-thr-leu-met- ist, worin n 0 oder 1 ist.

16. Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von CTAP-III ist, das CTAP-III-Aktivität beibehält und eine oder mehrere Aminosäuren aufweist, welche die trypsinempfindliche Stelle in der Nähe des aminoterminalen Endes von CTAP-III definiert bzw. definieren, gelöscht oder durch eine andere Aminosäure ersetzt ist bzw. sind.

17. Zusammensetzung zum Regenerieren von Bindegewebe, umfassend das Protein nach den Ansprüchen 9, 10, 14, 15, 16, in Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.