DE3686646T2 - Herstellung eines igg-bindenden proteins zum erleichtern der weiterverarbeitung mittels "protein-engineering". - Google Patents
Herstellung eines igg-bindenden proteins zum erleichtern der weiterverarbeitung mittels "protein-engineering".Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Fragment, das für eine Immunglobulin G (im folgenden IgG genannt) Bindungsdomäne codiert, die mit Staphylokokkenprotein A in Beziehung steht, DNA-Sequenzen, welche solche Fragmente enthalten sowie ein Verfahren zur Abspaltung eines Fusionsproteins, das durch Verwendung eines solchen Fragments oder einer solchen Sequenz exprimiert ist. Die Erfindung betrifft auch Plasmidvektoren und Bakterienzellen, welche solche rekombinanten DNA-Fragmente oder Sequenzen enthalten. Grundsätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes System zur Erzeugung und Reinigung von Fremdproteinen, die in Bakterien exprimiert werden.
- Die Genfusionstechniken wurden in der DNA-Rekombinationstechnologie zur Überwachung der Transientenexpression von einem Gen oder zur Erleichterung der downstream- Verarbeitung verwendet. Indem man eine Genfusion an Staphylokokkusprotein A durchführt, kann jedes Genprodukt als ein Fusionsprodukt mit Protein A gereinigt und somit in einer einzigen Stufe gereinigt werden, wobei man die IgG-Affinitätschromatographie anwendet. Wir haben früher das Protein A Gen mit einem synthetischen Gen fusioniert, das den humanen insulinähnlichen Wachstumsfaktor I codiert (IGF-I). Das exprimierte Hybridprotein konnte in hoher Ausbeute aus dem Wachstumsmedium von Staphylokokkus aureus gewonnen werden. Wir haben ebenfalls gezeigt, daß ein Genprodukt, das aus zweiwertigem Protein A, fusioniert mit IGF-I (EE-IGF-I) besteht, von einer E.coli Zelle nach einem Verfahren sekretiert wurde, das in unserer gleichzeitig angemeldeten Schwedischen Patentanmeldung (SE 8505921.0) beschrieben ist.
- Diese zwei erwähnten Expressionssysteme stellen recht wirksame Werkzeuge zur Expression und Sekretion von Fremdproteinen dar. Die Verwendung von Protein A-Fusionen hängt jedoch von der Verarbeitung nach der Reinigung ab, um ein biologisch aktives Peptid oder Protein freizusetzen. In einem industriellen Verfahren werden chemische Spaltungsmethoden aus wirtschaftlichen Gründen bevorzugt im Vergleich zu proteolytischen Spaltungen. Wenn man Protein A als Trägerprotein verwendet, wäre es von großer Wichtigkeit, wenn die Aminosäure-Erkennungssequenz nur in dem Linker vorhanden wäre, der verarbeitet werden soll, um das daran gebundene Genprodukt freizusetzen, so daß der Protein A-Teil intakt gelassen werden könnte. Auf diese Weise würde ein zweiter Durchgang durch eine IgG-Säule das Protein A-Molekül binden, jedoch das durch die chemische Spaltung freigesetzte Produkt würde durchlaufen.
- Für IGF-I ist die von uns zur Verwendung vorgeschlagene Methode die Hydroxylaminspaltung in Asn-Gly- Dipeptidsequenzen. Die hauptsächlich benutzte Methode ist sonst die CNBr-Spaltung, die für Met spezifisch ist. Die Wahl der Methode hängt davon ab, ob eine oder mehrere für die Chemikalie empfindliche Aminosäure im Produkt vorhanden sind oder nicht. IGF-I hat ein internes Methionin und IFG-II hat dies nicht. Protein A hat jedoch 3 interne Methionine in dem IgG-Bindungsbereich und 5 Asn-Gly im IgG-Bindungsbereich von Protein A. Dies macht den zweiten Durchgang durch die Säule bedeutungslos, da die bei der Spaltung freigesetzten Protein A Stücke nicht an das IgG binden.
- Hauptziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung einer Lösung dieser Probleme durch Anpassung einer IgG-Bindungsdomäne derart, daß kein Met und kein Gly in der Sequenz vorliegen. Gleichzeitig werden vorzugsweise zwei nicht-palindromische AccI-Stellen in das Fragment eingeführt, um imstande zu sein, die IgG-Bindungsdomäne an jede Anzahl von IgG-Bindungsdomänen zu polymerisieren.
- Demgemäß liefert zur Erreichung dieses Ziels und anderer Ziele, die aus der folgenden Offenbarung deutlich werden, die Erfindung ein rekombinantes DNA-Fragment (in dieser Beschreibung abgekürzt Z), das für eine Immunglobulin G-Bindungsdomäne codiert und durch irgendeine der E D A B C Domänen des Proteins A von Staphylokokkus oder durch funktionale Äquivalente davon gebildet ist, wobei dieses Fragment dadurch ausgezeichnet ist, daß das Methionin-Codon des Fragments durch ein Codon eines anderen, die Expression eines methioninfreien Proteins ermöglichenden Aminosäurerests ersetzt worden ist, wobei vorzugsweise das Codon dieses anderen Aminosäurerestes das von Leucin ist und wobei das Glycincodon durch ein Alanincodon ersetzt worden ist.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Fragments der Erfindung sind die Asparagin-Methionincodons durch Histidin-Leucincodons ersetzt. Das Codon des Aminosäurerestes Nr. 1, definiert durch die Trypsinverdauung von nativem Protein A wird vorzugsweise durch ein Valincodon ersetzt, um auf der Nucleotidebene die Sequenz GTAGAC zu ergeben, welche eine nicht-palindrome AccI Stelle liefert.
- Die Asp-Pro-Codone sind zweckmäßig modifiziert, um die Säurebeständigkeit der Peptidbindung des exprimierten Proteins zu erhöhen, wie durch Ersatz des Asparaginsäurecodons durch ein Glutaminsäurecodon.
- Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine rekombinante DNA-Sequenz bereitgestellt, die mindestens zwei Z-Fragmente, wie oben definiert, umfaßt. Die Anzahl solcher verschmolzener Z-Fragmente liegt vorzugsweise im Bereich von 2-15 und insbesondere im Bereich von 2-10.
- Gemäß einem noch anderen Aspekt der Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Fragment bereitgestellt, das für jede der E D A B C Domänen von Staphylokokkenprotein A codiert, worin das oder die Glycincodon(s) in der Asn-Gly Codierungskonstellation durch ein Alanincodon ersetzt sind.
- Die Erfindung liefert auch eine rekombinante DNA-Sequenz, umfassend das Z-Fragment, wie oben definiert, mit einer voranstehenden Signalsequenz und einer für die Aminosäuresequenz Ala Gln His Asp Glu Ala codierenden nachfolgenden Nucleotidsequenz.
- Die Erfindung deckt auch ein rekombinantes DNA-Molekül, umfassend die rekombinante DNA-Sequenz, wie oben beschrieben, und fusioniert hieran am 3'-Ende auf der DNA-Ebene ein Produktionsgen. Durch die Anordnung erhält ein solches Molekül die Fähigkeit, ein Fusionsprotein in einem geeigneten Wirt zu exprimieren. Ein solches Produktionsgen kann das eines Somatomedins sein, von denen Beispiele die folgenden sind: Wachstumshormone oder -faktoren, wie hGH (menschliches Wachstumshormon), IGF-I, IGF-II, NGF (Nervenwachstumsfaktor), EGF (Epidermaler Wachstumsfaktor) und PDGF (Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor). Das Produktionsgen kann auch ein solches sein, das für ein Interferon, Interleukin-2, Insulin, Neuropeptid, Gastrointestinalpeptid und dergleichen codiert. Insbesondere ist das Produktionsgen das von IGF-I oder IGF-II. Das Produktionsgen kann auch für ein Strukturgen für ein Enzym oder Teile davon codieren.
- Es wird bevorzugt, daß in einem solchen rekombinanten DNA-Molekül das N-endständige Glycincodon ein voranstehendes Asparagincodon hat, um die Hydroxylaminspaltung der Peptidbindung zu ermöglichen, um das native Protein, wie IGF-I, freizusetzen. Bei einer anderen Ausführungsform geht dem N-endständigen Codon ein Methionincodon voraus, um eine Cyanogenbromidspaltung der Peptidbindung zur Freisetzung des nativen Proteins, wie IGF-II, zu ermöglichen.
- Gemäß einem noch anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Freisetzung eines Produktionsproteins aus einem Fusionsprotein bereitgestellt, das in einem biologischen System durch das rekombinante DNA-Molekül, wie oben definiert, exprimiert ist und sich dadurch auszeichnet, daß das Fusionsprotein gespalten wird. Eine solche Behandlung wird zweckmäßig durch Hydroxylaminbehandlung durchgeführt, wenn dem N-endständigen Glycincodon ein Asparagincodon vorsteht. Wenn ein Methionincodon vorsteht, wird die Spaltung vorzugsweise durch Cynogenbromidbehandlung durchgeführt.
- Schließlich deckt die Erfindung einen Plasmidvektor, welcher das oben beschriebene, rekombinante DNA-Molekül umfaßt. Die Erfindung erstreckt sich auch auf Bakterienzellen, welche das oben definierte, rekombinante DNA-Molekül enthalten. Das Molekül kann im Chromosom der Bakterienzelle, jedoch auch in einem Plasmidvektor enthalten sein.
- Die Wirtszelle ist z. B. Gram negativ und besteht insbesondere aus einem E.coli.
- Die Erfindung wird im folgenden näher durch nicht beschränkende Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert. Es bedeuten:
- Fig. 1 zeigt die Organisation des Codierungsbereiches des Protein A Gens. S ist die Signalsequenz, A-E sind die IgG-Bindungsdomänen und X ist der C-endständige Bereich ohne IgG-Bindungsaktivität des codierenden Polypeptids;
- Fig. 2 zeigt einen Vergleich der verschiedenen IgG-Bindungsbereiche. Die erste Zeile zeigt eine vorgeschlagene Consensus-Aminosäuresequenz der IgG-Bindungsbereiche. Die Kästen zeigen die Ausmaße an Aminosäuren, die in zwei verschiedenen Alphahelices beteiligt sind. Die bei der Bindung an IgG beteiligten Aminosäuren sind unterstrichen. Die Aminosäuren in den verschiedenen Bereichen sind durch - für keine Änderung im Vergleich zu dem Consensuscodon und mit + für keine Aminosäureänderung, jedoch eine stille Mutation und dem Buchstaben für eine andere Aminosäure für Aminosäureänderungen ausgedrückt. Die Aminosäuren sind in einem Ein-Buchstaben-Code angegeben;
- Fig. 3 zeigt die Nucleotidsequenz des Sinnstrangs des synthetisierten Z-Fragments. Der Spaltungsbereich ist das Ausmaß an Aminosäuren, die zur Verarbeitung der Signalsequenz erforderlich sind. Der Z-Bereich ist der Teil des Z-Fragmentes, der für die IgG-Bindungsdomäne codiert. Die Aminosäureänderungen sind unterstrichen. Die Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen der in den Bespielen benutzten Stellen sind gezeigt;
- Fig. 4 zeigt die Nucleotidsequenz der durch den pZZ-IGF-I Plasmidvektor codierten Nucleotidsequenz des ZZ-IGF-I. Die Bereiche, welche das Signalpeptid codieren, der Spaltungsbereich, die zwei Z-Bereiche und IGF-I sind gezeigt, ebenso wie die Restriktionsstellen, die für die Konstruktionsstrategie relevant sind;
- Fig. 5 zeigt die in den Beispielen, Abschnitt V beschriebene Strategie. Die sythetischen Oligomeren wurden in M13 mp 18 (in der Figur nicht gezeigt) kloniert, bevor das Z-Fragment (von Hind III nach Eco RI) in pUCS kloniert wurde. Durch Verdauen von pUC8-Z mit AccI wird der Z-Bereich herausgespalten und durch Religieren, gefolgt von Transformation konnte der pUC8-ZZ Plasmidvektor isoliert werden. AMP ist die Gencodierung für das β-Lactamasegen, ori ist der Replikationsursprung für E.coli, lac Z' ist das Gen, welches für das β-Galactosidase-alpha-fragment codiert und Z ist das synthetische Fragment;
- Fig. 6 zeigt die in den Beispielen, Abschnitt IV beschriebene Klonungsstrategie. AMP ist das Gen, welches für β-Lactamase codiert, S ist die Signalsequenz, A-E sind die IgG-Bindungsdomänen von Protein A, ori ist der Replikationsursprung, Z ist das synthetische Fragment, IGF-I ist das Gen für IGF-I, F1 ist der Replikationsursprung vom f1-Phagen und lacZ ist das Gen für β-Galactosidase;
- Fig. 7 zeigt die Konstruktion von pASZ1 und pASZ2 wie in den Beispielen, Abschnitte III und IV beschrieben. AMP ist das Gen, welches die β-Lactamase codiert, F1 ist der Replikationsursprung für den f1-Phagen, S ist die Signalsequenz, A-E sind die IgG-Bindungsbereiche, ori ist Replikationsursprung für E.coli und Z ist das synthetische Fragment;
- Fig. 9 zeigt die Strategie des Verfahrens zur Reinigung von IGF-I unter Verwendung der Methode der einmaligen Asn-Gly Spaltung, wie in den Beispielen, Abschnitt VII beschrieben; und
- Fig. 8 zeigt die SDS Gelelektrophorese des Proteins, welche den verschiedenen Stufen in dem in den Beispielen, Abschnitt VII beschriebenen Verfahren entspricht. Die Spur 1 zeigt Größenmarker in Kilo-Dalton, die Spur 2 zeigt das Hybridprotein nach der IgG-Affinitätsreinigung, Die Spur 3 zeigt das Ergebnis der Hydroxylaminspaltung, die Spur 4 zeigt den Fluß durch ein IgG-Sepharose®-Gel eines hydroxylamin-verdauten Hybridproteins und die Spur 5 ist reines IGF-I (Marker). Die Banden, welche ZZ-IGF-I, ZZ und IGF-I entsprechen, sind durch Pfeile angezeigt.
- Durch Spaltung des klonierten synthetischen Fragments unter Verwendung des Restriktionsenzyms AccI, gefolgt von Religation des isolierten Fragmentes, ligiert das Fragment Kopf and Schwanz und erzeugt eine Tandemwiederholung von Fragmenten und theoretisch kann jede Anzahl von Bereichen erhalten werden. Das zur Erläuterung der Erfindung verwendete Fragment wurde in der folgenden Weise konstruiert:
- Protein A besteht aus zwei unterschiedlichen Bereichen: Dem IgG-Bindungsbereich (A-E Domänen) und dem Bereich X ohne IgG-Bindungsaktivität (Fig. 1). Der IgG-Bindungsbereich besteht aus fünf homologen IgG-Bindungsdomänen, die durch Trypsinbehandlung auf der Proteinebene gespalten werden kann. Die B-Domäne wurde zusammen mit IgG kristallisiert und die Struktur wurde durch Röntgenkristallographie bestimmt (Deisenhofer, J., Biochemistry , 2361 (1981)).
- Die fünf IgG-Bindungsdomänen bestehen aus etwa 58 Aminosäuren (E ist kürzer und D ist länger) und die Aminosäuresequenzen der Bereiche sind in Fig. 2 gezeigt.
- Das Fragment, das synthetisiert wurde, hatte die folgenden Merkmale
- 1) Fehlen von jedem Met;
- 2) Fehlen der Asn-Gly Dipeptidsequenz;
- 3) Das Fragment ist optimiert, um auf der Nucleotidebene synthetisiert zu werden, um das Clonen zu erleichtern und um die Expression zu erhalten;
- 4) Das Fragment kann auf der Nucleotidebene polymerisiert werden, um jede Anzahl von IgG-Bindungsbereichen zu erhalten;
- 5) Das Fragment kann in einem genetischen System exprimiert werden, das zur Expression und Sekretion angepaßt ist.
- 1) Es gibt insgesamt 3 Met im IgG-Bindungsbereich von Protein A. In dem synthetischen Fragment wurde das Consensus Met (die Protein A Consensus Aminosäuresequenz ist in Fig. 2 gezeigt) in dem synthetischen Fragment geändert, indem das Asn-Met zu Codonen für eine His-Leu Sequenz geändert wurde.
- 2) Die Asn-Gly Dipeptidsequenz ist empfindlich gegen Hydroxylamin. Da diese Sequenz in allen fünf IgG-Bindungsdomänen von Protein A intakt gehalten wird und da diese Aminosäuresequenz in der Mitte einer Alphahelix vorliegt, die bei der Bindung an IgG beteiligt ist (Fig. 2), gibt es sehr wenig Chancen, bei irgendeiner Aminosäureveränderung erfolgreich zu sein. Die offensichtliche Wahl, das Asn zu einem, Gln zu verändern, wurde durch Computergraphiken analysiert (FRODO Software, Alwin Jones, Biomedical Centre, Uppsala, Schweden) unter Verwendung der Koordinaten, die von der Brookhaven Protein Data Bank verfügbar waren (Bernstein, F.C. et al., J.Mol.
- Bio., , 553-542 (1972)), berechnet aus der röntgenkristallographischen Struktur von Protein A.
- Da das Asn Wasserstoffbindungen an zwei andere Reste liefert, war zu erwarten, daß die Veränderung des Codes für das Asn zu Gln beides, sowohl die tertiäre Struktur von Protein A als auch die Bindung an IgG zerstört. Statt dessen zeigte jedoch die Computeranalyse erstaunlicherweise, daß das Gly in der Asn-Gly Dipeptidsequenz zu einem Ala verändert werden konnte. Diese Veränderung war nicht naheliegend, da Glycine aufgrund ihrer speziellen Merkmale unter den meisten konservierten Aminosäuren zwischen homologen Proteinsequenzen sind. Zu diesen Merkmalen gehören die Flexibilität um die Peptidbindung, die übliche Funktion, alpha- und beta-Strukturen zu beginnen und abzubrechen und das Merkmal als eine Aminosäure ohne Nettoladung in der Polypeptidkette. Jedoch durch Simulieren der Aminosäureänderung von Gly zu Ala im Computer wurde geschlossen, daß diese Veränderung die Faltung zu Protein A oder die Bindung an IgG nicht stören würde.
- 3) Das Fragment wurde auf der DNA-Ebene in 10 getrennten Oligomeren synthetisiert. Um die Klonierung des Fragments zu erleichtern, wurde eine HindIII Stelle im 5'-Ende und eine EcoRI Stelle im 3'-Ende angebracht. (Die Nucleotidsequenz des Fragments ist in Fig. 3 gezeigt).
- 4) Um das Fragment auf der Nucleotidebene polymerisieren zu können, wurde eine nicht-palindromische AccI Stelle eingeführt, indem die Nucleotidsequenz zu GTAGAC im Code für das N-endständige Ende der IgG-Bindungsregion geändert wurde. Auf diese Weise wird ein Ala-Codon, das in allen Regionen vorhanden ist, zu einem Val geändert. Durch diese Nucleotidkonstellation kann das Fragment zu jeder Multiplizität polymerisiert werden, was somit die Bindungskapazität des translatierten Produkts verändert. Es ist nicht vorhersehbar, ob diese Aminosäuresubstitution die Protein A Funktion stört oder nicht.
- 5) Durch Einführung einer FspI Stelle, wo die Signalsequenz an das Fragment gebunden werden soll und durch den Beginn des codierten Fragments mit den sechs Aminosäuren, die einmalig für die E-Region des Proteins A sind, kann das Fragment an die Protein A Signalsequenz durch molekulares Klonieren gebunden werden und diese sechs N-endständigen Aminosäuren wurden eingeführt, um die Sekretion des Fragments zu gewährleisten.
- Spezielle Ausführungsformen der Erfindung werden nun im einzelnen beschrieben.
- Bakterienwirte. Drei verschiedene Stämme von E.coli K12 wurden in den Beispielen benutzt:
- HB101 (Boyer, H.W. et al J.Mol.Biol., , 459-572 (1969)), JM 83 (Yanisch-Perron, C. et al Gene, , 103-119 (1985)) und JM103 (Messing, J. et al Methods Enzymol., , 20-79 (1983)). (Die Stämme sind beim Dept of Biochemistry and Biotechnoloy, Royal Institute of Technology, Stockholm, Schweden erhältlich).
- Klonierungsträger: Die in den Beispielen verwendeten Klonierungsträger waren M13mp18 (Yanisch-Perron, C. et al Gene, , 103-119 (1985)) und pUC8 (Vieva, J. et al Gene , 259 (1982)). Der Vektor pHL33 ist ein Vektor, der von pEMBL19 (-) (Dente et al, Nucl.Acids Res., , 1645 (1983)) und pRIT4 (Nilsson, B. et al, EMBO J. 1075 (1985)) stammt und in folgender Weise konstruiert wurde:
- Das Plasmid pRIT4 wurde mit Taq I gespalten und nach Auffüllreaktion mit Klenow-Polymerase wurden Not-I Linker zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit EcoRI Not I gespalten und das Fragment, welches sich über das Protein A Gen erstreckt, wurde isoliert. Dieses Fragment wurde in pEMBL19 (-) kloniert, wo die CIaI Stelle vorher mit einer NotI Stelle verbunden worden war, indem dieses Plasmid mit NotI und EcoRI gespalten wurde. Dies gibt einen Vektor, der einen Teil des Protein A Gens enthält, gefolgt von dem mp19 Multirestriktionsenzymlinker.
- Der Vektor pEX4-IGF-I ist pEX (Stanley, K. et al EMBO J. , 1429 (1984)) mit dem synthetischen, von EcoRI bis BamHI' klonierten IGF-I.
- Das synthetische Gen, welches IGF-I codiert, wurde von Elmblad, A. et al in Third European Congress on Biotechnology III, 287-296, Verlag Chemie, Weinheim (1984) beschrieben. Der Plasmidvektor pASZ2 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, unter Nr. 3594 DSM (und dem angegebenen Namen pE*2 im Hinterlegungsdokument) hinterlegt.
- Beschichtungspuffer: 1,59 g Na&sub2;CO&sub3;, 2,93 g NaHCO&sub3; und 0,2 g NaN&sub3;, aufgefüllt auf 1 Liter mit destilliertem H&sub2;O.
- PBST: 8,0 g NaCl, 0,2 g KH&sub2; PO&sub4;, 2,9 g Na&sub2;HPO&sub4; x 12H&sub2;O, 0,2 g KCl, 0,2 ml Tween® 20 und 0,2 g NaN&sub3;, aufgefüllt auf 1 Liter mit destilliertem H&sub2;O (pH 7,4).
- TSB: 30 g tryptische Sojabrühe, aufgefüllt auf 1 Liter und autoklaviert.
- LB: 10 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl, aufgefüllt auf 1 Liter und autoklaviert.
- LA: Platten, enthaltend LB und 15 g Bacto Agar pro Liter.
- TBAB: 30 g tryptische Brühe auf Blut-Agar Basis, aufgefüllt auf 1 Liter und autoklaviert.
- ONPG-Puffer: 2 mM o-Nitrophenyl-β-D-galactosid (ONPG, Sigma Produkt Nr. N-1127) in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,3, enthaltend 15 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM MgCl&sub2;.
- Gewisse Arbeitsweisen wurden wiederholt in den Beispielen durchgeführt. Wenn nichts Anderes angegeben ist, wurden sie jedesmal bei ihrer Durchführung genau wie folgt durchgeführt:
- Verfahren, die routinemäßig in der Molekularbiologie angewandt werden, werden nicht beschrieben (wie die Verwendung von handelsüblichen Restriktionsenzymen, DNA-Ligationen, Bal 31 Exonuclease, Sl Nuclease und Klenow-Polymerase).
- Transformationen: Die Transformation von E.coli K12 mit Plasmid DNA wurde genau wie beschrieben durchgeführt (Morrison, D.A., Methods in Enzymology, Academic Press , 326-331 (1979)). Die Transformanten wurden in herkömmlicher Weise auf Platten (TBAB) selektiert, welche 70 mg/l Ampicillin enthielten.
- Isolation von Plasmid DNA: Plasmid DNA wurde, wie von Birnboim, H.C. et al., Nucl.Acids Res. , 1513 (1979) beschrieben, isoliert. Präparate in kleiner Menge, um eine große Anzahl von Transformanten zu screenen, wurden genau wie von Kieser, T. Plasmid , 19-36 (1984) beschrieben, durchgeführt.
- Senharose® 6B Chromatographie: Die zur Bal 31 oder 51 Behandlung zuverwendenden Plasmid DNAs wurden auf einer Sepharose® 6B Gelfiltration in einem 10 mM Tris, 1 mM EDTA und 500 mM NaCl-Puffer durchlaufen gelassen. Auf diese Weise wird DNA von RNA getrennt.
- Elution von DNA-Fragmenten: Die Elution der DNA-Fragmente von entweder Agarose oder Polyacrylamidgelstücken wurde genau wie von Maxam et al., P.N.A.S. (USA), , 560-564 (1977) beschrieben, durchgeführt.
- Ligation von DNA in Agarosegel von niedriger Geltemperatur: Die Ligation direkt in Agarosegel wurde durchgeführt, indem die Elektrophorese in einem Agarosegel mit niederer ,Geltemperatur laufen gelassen wurde und nach dem Heraus schneiden der Bande wurde das Gelstück durch Erwärmen auf 65ºC geschmolzen. Nach 10-facher Verdünnung unter Verwendung von Tris-Puffer (10 mM, pH 7,4) konnte die Ligation durchgeführt werden.
- Nachweis und Quantifizierung von Protein A: Ein ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) wurde angewandt, um Protein A zu quantifizieren. Der Test benutzt eine spezielle Mikrotiterplatte (Titertek, Amstelstad, Niederlande) ohne Nettoladung. Die Löcher werden mit human-IgG (Kabi AB, Schweden) in einem Beschichtungspuffer beschichtet. Testproben werden zugesetzt und Protein A wird an die Fc-Teile des IgG gebunden, das im Loch absorbiert ist. Protein A wird dann durch ein Antiprotein A (aus Kaninchen) bestimmt, das an β-Galactosidase (von Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) konjugiert ist.
- Assay: Die Löcher einer Mikrotiterplatte werden mit 75 ul einer Lösung von human-IgG mit 16 ng/ml in Beschichtungspuffer gefüllt und die Platte wird bei Zimmertemperatur wenigstens 1 Stunde inkubiert. Die Löcher werden dreimal mit 100 ul PBST gewaschen und 50 ul der Probe werden in jedes Loch gegeben. Zur quantitativen Bestimmung werden 2-fach Verdünnungen gemacht. Nach 1-stündiger Inkubierung werden die Löcher dreimal mit 100 ul PBST gewaschen, gefolgt von Zugabe von 50 ul Antiprotein A-β-Galactosidase (die Menge an Protein A Bindungskapazität, die in jedes Loch gegeben wird, entspricht der molaren Menge von IgG, die in jedes Loch gegeben wurde, nachgewiesen durch Titration mit Protein A im Überschuß). Nach 45-minütigem Inkubieren werden die Löcher dreimal mit 100 ul PBST gewaschen, gefolgt von Zugabe von 125 ul ONPG-Puffer. Nach 20-30-minütiger Inkubation werden 150 ul 0,1 M NaOH zugesetzt, um die Reaktion abzubrechen. Die Quantifizierung wird durchgeführt, indem man eine 2-fach Verdünnung einer Protein A Standardlösung bekannter Konzentration parallel mit den 2-fachen Verdünnungen der Prüfproben durchlaufen läßt. Die Absorption bei 405 nm wird für jedes Loch mit einem Photometer gemessen.
- SDS-PAGE: Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde, genau wie von Laemmli, O.K. Nature (London), , 680-685 (1970) beschrieben, durchgeführt, wobei ein 10-20% Stufengradientengel verwendet wurde.
- Die abgeleitete DNA-Sequenz wurde durch ein Computerprogramm analysiert und in 10 Oligonucleotide unterteilt, die in ihrer Länge von 41 bis 45 Nucleotiden schwankten und mit einer Überlappung von 6 bp.
- Die Synthese wurde auf einer vollautomatischen Maschine durchgeführt und die von Schutzgruppen befreiten Oligomere wurden durch Polyacrylamid-Elektrophorese gereinigt (20% Polyacrylamid, 7 M Harnstoff, 50 mM Tris-Borat pH 8,3), gefolgt von Extraktion in Wasser und Gefriertrocknen.
- 100 pMol an Oligonucleotiden A1-A5 und B1-B5 wurden getrennt in 20 ul Kinasepuffer phosphoryliert (50 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCI&sub2;, 1 mM ATP, 10 mM DTT), 5 Einheiten Polynucleotidkinase wurden zugesetzt und die Gemische wurden 45 min bei 37ºC inkubiert.
- 5 ug des Vektors M13mp18, Replikativform, wurden mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII verdaut. Das große Fragment aus der Verdauung wurde aus einem Agarosegel von niederer Temperatur isoliert.
- Die Agarose, die verdaute M13 mp18 enthielt, wurde bei 65ºC geschmolzen und 5 ul (0,5 ul, 0,1 p Mol) wurden mit 0,5 p Mol jeweils der phosphorylierten Oligomeren A1-A5 und B1-B5 in 50 ul Ligationspuffer gemischt (66 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM MgCl&sub2;, 50 mM DTT, 1 mM ATP), auf 90ºC erhitzt und langsam während 1 h auf Zimmertemperatur abgekühlt. 10 Einheiten T4 DNA Ligase wurden zugesetzt und das Gemisch wurde über Nacht bei 15ºC inkubiert.
- E.coli JM 103 wurde mit der so erhaltenen DNA transfiziert und über Nacht auf 2·YT-Platten, die x-gal und IPTG enthielten, gezüchtet. 78 weiße Plaques wurden auf eine neue 2·YT-Platte überführt und als Kolonien gezüchtet. Die Koloniehybridisierung mit ³²P markiertem Oligonucleotid B5 als Sonde gab eine positive Kolonie, die ausgewählt und in 15 ml 2·YT mit E.coli JM 103 gezüchtet wurde. Die Zellen wurden abzentrifugiert und die Phagen wurden aus dem Überstand gewonnen. Die einzelsträngige Phasen-DNA wurde extrahiert und gereinigt und als Template für die Sequenzierungsreaktion nach der Dideoxy-Methode benutzt. Die M13mP18, welche das Z-Fragment enthielt, wurde als M13-Z bezeichnet.
- Der Plasmidvektor PHL33 wurde mit HindIII und EcoRI gespalten. Das große Fragment wurde aus einem 1% Agarosegel nach Elektrophorese isoliert. Das Fragment wurde an ein isoliertes Z-Fragment (HindIII/EcoRI) ligiert. Nach der Ligation wurde E.coli HB101 mit dem Gemisch transformiert und der isolierte Vektor pASZ1 (Fig. 7) hat das synthetische Z-Fragment downstream von der Signalsequenz kloniert. Um das synthetische Fragment direkt nach der Signalsequenz anzuordnen, wurde der pASZ1-Vektor mit FspI gespalten. Nach Religieren wurde das Gemisch in E.coli HB101 überführt und pHSZ2 konnte isoliert werden.
- Der Vektor hatte das synthetische Z-Fragment (Fig. 3) direkt nach der Signalsequenz des Proteins A.
- Die Konstruktion wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
- Expression von pASZ2 in E.coli HB101. Der Stamm wurde in 15 ml TSB geimpft und nach Inkubation in einer Schüttelf lasche für 12 h wurde die Zellsuspension zentrifugiert.
- Die Zellen wurden einmal in TE (5 ml) gewaschen und wurden weiter in 5 ml TSB resuspendiert, gefolgt von beschallen für 3·30 sec (MSE Sonicator, Microtip, Stärke 6). Nach dem Beschallen wurde das Gemisch bei 10 000 xg 10 min zentrifugiert.
- Die Wachstumsmedien und der Extrakt aus der Zellbeschallung wurden auf Protein A geprüft, wobei die in Routinemethoden angegebene Methode benutzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt: Plasmid filamentöses Wachstum Expressionsebene % extracellulär
- Diese Ergebnisse zeigen, daß das Fragment IgG bindend ist.
- Die einzelsträngige DNA von M13-Z wurde einer Annealing-Reaktion mit dem Sequenzierungsprimer unterzogen, gefolgt von Behandlung mit Klenow und dNTPs.
- Auf diese Weise wurde doppelsträngige DNA erhalten. Das Reaktionsgemisch wurde mit HindIII und EcoRI verdaut und das Z-Fragment wurde von einer Agarose-Gelelektrophorese mit niedriger Geltemperatur isoliert. Getrennt wurde das Plasmid pUC 8 mit EcoRI und HindIII verdaut und das große Fragment wurde von einer Agarose-Gelelektrophorese mit niederer Geltemperatur isoliert. Die zwei isolierten Gelfragmente wurden auf 65ºC erhitzt und 2 ul von jedem geschmolzenem Fragment wurden in 50 ul Ligationspuffer und 2,5 Einheiten DNA-Ligase bei 15ºC über Nacht ligiert. Die 50 erhaltene DNA wurde benutzt, um E.coli-Stamm JM83 wie oben zu transformieren und Plasmid DNA von zwei Transformanten wurde isoliert, und es zeigte sich, daß es das Z-Fragment enthielt. Das pUC 8-Z wurde mit Restriktionsenzym AccI verdaut. Nach Religieren des Verdauungsgemisches wurde eine neue Transformation von JM83 gemacht, gefolgt von Plasmidisolation aus 12 Transformanten. Die Verdauung mit HindIII und EcoRI und die Analyse auf Agarosegel bestätigten, daß 2 Transformanten das pUC 8 mit einem Insert von 2 Z-Fragmenten (pUC 8-ZZ) trugen.
- Die Konstruktion von pZZ-IGF-I wurde in folgender Weise durchgeführt (Fig. 6):
- A. pUC 8-22 wurde mit FspI und EcoRI verdaut und das kleinste Fragment wurde auf LGT-Agarose isoliert.
- B. Der Plasmidvektor pHL33 wurde mit FspI verdaut. Das größte Fragment (2273 bp) wurde auf LGT-Agarose isoliert.
- C. Das Plasmid pEX4-IGF-I wurde mit FspI und EcoRI verdaut. Das kleine Fragment, das sich über das IGF-I-Gen in das AMP-Gen erstreckt, wurde isoliert.
- Die drei Fragmente aus A, B und C wurden miteinander, wie in Routine-Methoden beschrieben, ligiert und das Ligationsgemisch wurde in E.coli JM83 transformiert.
- Die Wahl des Transformanten wurden durchgeführt, indem ein LB Agar Medium benutzt wurde, das 70 ug/ml an Ampicillin enthielt. Die Isolierung der Plasmid-DNA und die Analyse mit Restriktionsenzymen bestätigten, daß die Transformanten das Plasmid pZZ-IGF-I trugen.
- 4 l Wachstumsmedium LB, ergänzt durch 0,2% Glucose, 0,01 M MgSO&sub4; und Ampicillin (100 ug/ml) wurden mit E.coli JM83/pZZ-IGF-I geimpft. Die Zellen wurden in Schüttelflaschen 20 h bei 37ºC in 2 l Flaschen mit 500 ml Brühe in jeder Flasche gezüchtet. Die Zellen wurden abzentrifugiert und 3 Tage bei -20ºC gehalten. Zu dem gefrorenen Pellet (32 g Nettogewicht) wurden 128 ml 10 mM Tris HCl pH 8,0 Lösung gegeben und die Zellsuspension wurde 2 h bei +4ºC gelinde gemischt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren ausgefällt und der Überstand wurde für die Affinitätschromatographie gewonnen. Der Überstand wurde vor Aufbringen auf eine IgG-Sepharose®-Säule mit 150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7,5 (im folgenden TS) rezentrifugiert.
- Der Überstand wurde durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 12 ml/h geleitet und die Menge an IgGbindendem Material wurde vor und nach jedem Durchlauf durch die Säule analysiert. Das gebundene Material wurde mit TS, ergänzt mit 0,05% Triton®X-100 und dann TS und schließlich mit 0,05 M Ammoniumacetat gewaschen, bevor mit 1 M Essigsäure, deren pH auf 2,8 mit Ammoniumacetat eingestellt war, eluiert wurde. Die 2 ml Fraktionen wurden auf Protein A Gehalt untersucht und die Fraktionen wurden gepoolt und gefriergetrocknet. Das Hybridprotein wurde mit Hydroxylamin gespalten, wie von Bornstein, et al, Methods Enzymol., , 132 (1977) beschrieben. Das trockene Material wurde in 2 M Hydroxylamin gelöst, das mit Lithiumchlorid und 0,2 M Trisbase auf pH 9 eingestellt war. Die Spaltung wurde bei 45ºC für 4 h durchgeführt. Die Spaltungsreaktion wurde abgebrochen, indem das pH auf 7,0 mit Essigsäure erniedrigt wurde und das Material wurde auf einer PD-10®-Säule entsalzt, die mit TS gesättigt war. Die entsalzte Fraktion von 3,5 ml wurde durch eine 1 ml IgG-Sepharose®-Säule geleitet, um IGF-I vom ZZ-Polypeptid abzutrennen. Dieses Material wurde dann auf einer PD-10®-Säule entsalzt, die mit 0,2 M Essigsäure gesättigt war und dann gefriergetrocknet. Das Material wurde dann durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektro-phorese analysiert. Dieses Verfahren ist in Fig. 9 gezeigt und das SDS-Polyacrylamidgel ist in Fig. 8 gezeigt. Die Nucleotidsequenz des exprimierten Fusionsproteins ist in Fig. 4 gezeigt.
- Diese Ergebnisse zeigen, daß das ZZ-Fragment funktional in einem Verfahren zur Reinigung von IGF-I bezüglich der Bindung von IgG ist, um die Reinigung zu erleichtern sowie eine einzigartige Asn-Gly-Spaltungsstelle aufweist, um natives IGF-I freizusetzen und es dem ZZ-Teil zu ermöglichen, an das IgG-Gel nach der zweiten Passage durch das Gel zu binden.
- Obwohl die Erfindung bezüglich der Reinigung von IGF-I gezeigt ist, sei darauf hingewiesen, daß die Erfindung auf die Reinigung von jedem Gen anwendbar ist, das für ein brauchbares Protein codiert. Somit ist die IGF-I-Reinigung lediglich ein Beispiel der Brauchbarkeit der Erfindung und nicht als Beschränkung des Umfanges der Erfindung anzusehen, außer wie sie in den beigefügten Patentansprüchen definiert ist.
- Die Asp-Pro-Dipeptidkonstellation, die in allen Protein A-Domänen vorhanden ist und von der bekannt ist, daß sie humanes IgG bindet (Fig. 2), wurde aufgebaut, um zu einem Glu-Pro verändert zu werden. Dies macht die normalerweise gegen Säure labile Asp-Pro-Peptidbindung beständig gegen Säurebehandlung (wie 70% Ameisensäure bei 42º für 12 h), was jeden anderen eingefügten Asp-Pro-Codierungslinker einzigartig macht. Diese entwickelte Veränderung der Aminosäure (Asp zu Glu) ist in den Beispielen nicht gezeigt.
Claims (26)
1. Rekombinantes DNA-Fragment (Z), das für eine
Immunglobulin G-Bindungsdomäne codiert und durch
irgendeine der E D A B C Domänen des Proteins A von
Staphylokokkos oder durch funktionelle Äquivalente davon
gebildet ist, gekennzeichnet dadurch, daß das
Methionin-Codon des Fragments durch ein Codon eines
anderen, die Expression eines methioninfreien Proteins
ermöglichenden Aminosäurerests ersetzt worden ist, und in
ihm das Glycin-Codon durch ein Alanin-Codon ersetzt
worden ist.
2. Fragment nach Anspruch 1, bei dem das Codon des nach
Trypsinspaltung des nativen Proteins A mit Nummer eins
bezeichneten Aminosäurerests durch ein Valin-Codon so
ersetzt worden ist, daß auf der Nucleotidebene die eine
nicht-palindrome AccI-Stelle liefernde Sequenz GTAGAC
erhalten worden ist.
3. Fragment nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Codon des
anderen Aminosäurerests jenes von Leucin ist.
4. Fragment nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem die
Asparagin-Methionin-Codons durch Histidin-Leucin-Codons
ersetzt worden sind.
5. Fragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem
die Asp-Pro-Codons zur Verbesserung der Säurestabilität
der Peptidbindung des exprimierten Proteins modifiziert
worden sind.
6. Fragment nach Anspruch 5, bei dem das
Asparaginsäure-Codon durch ein Glutaminsäure-Codon
ersetzt worden ist.
7. Rekombinante DNA-Sequenz, umfassend mindestens zwei der
in einem der vorhergehenden Ansprüche angegebenen
Z-Fragmente.
8. Sequenz nach Anspruch 7, bei der die Zahl der
Z-Fragmente im Bereich von 2 bis 15 liegt.
9. Fragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
dem das (die) Glycin-Codon(s) in der Codon-Anordnung
Asn-Gly durch ein Alanin-Codon ersetzt worden ist (sind).
10. Rekombinante DNA-Sequenz, umfassend das Z-Fragment nach
einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einer voranstehenden
Signalsequenz und einer für die Aminosäuresequenz
Ala Gln His Asp Glu Ala
codierenden Nucleotidsequenz.
11. Rekombinante DNA-Sequenz, umfassend die Sequenz nach
Anspruch 7 oder 8 mit einer voranstehenden
Signalsequenz, gefolgt von einer für die Aminosäuren
Ala Gln His Asp Glu Ala
codierenden Nucleotidsequenz.
12. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend die rekombinante
DNA-Sequenz nach Anspruch 10 oder 11 und fusioniert
hieran am 3'-Ende auf der DNA-Ebene ein Produktionsgen,
wobei das Molekül die Fähigkeit zur Expression eines
Fusionsproteins aufweist.
13. Molekül nach Anspruch 12, bei dem das Produktionsgen
jenes von Somatomedin ist.
114. Molekül nach Anspruch 13, bei dem das Produktionsgen
jenes von IGF-1 ist.
15. Molekül nach Anspruch 14, bei dem dem N-terminalen
Glycin-Codon ein Asparagin-Codon vorsteht, um eine
Hydroxylamin-Spaltung der Peptidbindung zur Freisetzung
von nativem IGF-1 zu ermöglichen.
16. Molekül nach Anspruch 13, bei dem das Produktionsgen
jenes von IGF-2 ist.
17. Molekül nach Anspruch 16, bei dem dem N-terminalen
Glycin-Codon ein Methionin-Codon vorsteht, um eine
Cyanogenbromid-Spaltung der Peptidbindung zur
Freisetzung von nativem IGF-2 zu ermöglichen.
18. Verfahren zur Freisetzung eines Produktionsproteins aus
einem, in einem biologischen System durch das
rekombinante DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 15 bis
17 exprimierten Fusionsprotein, dadurch gekennzeichnet,
daß das Fusionsprotein gespalten wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18 in Verbindung mit Anspruch 17
oder 18, worin die Spaltung durch eine CNBr-Behandlung
erfolgt.
20. Verfahren nach Anspruch 18 in Verbindung mit Anspruch 14
oder 15, worin die Spaltung durch eine
Hydroxylamin-Behandlung erfolgt.
21. Plasmidvektor, umfassend das rekombinante DNA-Molekül
nach einem der Ansprüche 12 bis 17.
22. Bakterienzelle, enthaltend das rekombinante DNA-Molekül
nach einem der Ansprüche 12 bis 17.
23. Bakterienzelle nach Anspruch 22, enthaltend das Molekül
in ihrem Chromosom.
24. Bakterienzelle nach Anspruch 22, enthaltend den
Plasmidvektor nach Anspruch 21.
25. Gram(-) Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 22 bis
24.
26. Bakterienzelle nach Anspruch 25, nämlich E.coli.
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