JPH0811069B2 - 蛋白質工学を用いるダウンストリ−ムプロセツシングを促進するためのＩｇＧ結合性蛋白質の構成 - Google Patents

蛋白質工学を用いるダウンストリ−ムプロセツシングを促進するためのＩｇＧ結合性蛋白質の構成

Info

Publication number
JPH0811069B2
JPH0811069B2 JP61296509A JP29650986A JPH0811069B2 JP H0811069 B2 JPH0811069 B2 JP H0811069B2 JP 61296509 A JP61296509 A JP 61296509A JP 29650986 A JP29650986 A JP 29650986A JP H0811069 B2 JPH0811069 B2 JP H0811069B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
fragment
protein
recombinant dna
amino acid
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP61296509A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS62190087A (ja
Inventor
ラース・アブラハムゼン
トーマス・モックス
ベルン・ニルソン
マジアス・ウーレン
Original Assignee
カビ ファルマシア アクチェボラーグ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by カビ ファルマシア アクチェボラーグ filed Critical カビ ファルマシア アクチェボラーグ
Publication of JPS62190087A publication Critical patent/JPS62190087A/ja
Publication of JPH0811069B2 publication Critical patent/JPH0811069B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/705—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a protein-A fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 産業上の利用分野 本発明はブドウ球菌性蛋白質Ａに関連した免疫グロブ
リンＧ（以下IgGと称す）結合領域をコード化する組換
体DNAフラグメントに、このようなフラグメントを含むD
NA配列に、及びこのようなフラグメントまたは配列を用
いることにより発現された融合された蛋白質の開裂方法
に関する。本発明はまたこのような組換体DNAフラグメ
ントまたは配列を保持するプラスミド媒介体及び細菌細
胞に関する。基本的には、本発明は細菌中に発現された
外来蛋白質を製造かつ精製する改善方法に関する。
従来の技術 遺伝子融合技術が遺伝子からの一時発現を監視しかつ
ダウンストリームプロセツシングを促進するための組換
体DNA技術において使用されてきた。ブドウ球菌性蛋白
質Ａに遺伝子融合を作ることにより、いかなる遺伝子生
成物も蛋白質Ａへの融合蛋白質として精製でき、かくし
てIgGアフイニテイクロマトグラフイーを用いる単一工
程にて精製できる。本発明者らは以前ヒトインシユリン
様発育因子（IGF-I）をコード化する合成遺伝子に蛋白
質Ａ遺伝子を融合させた。発現されたハイブリツド蛋白
質は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の増殖
培地から高収率で得ることができた。本発明者らはまた
IGF-Iに融合した２価の蛋白質Ａからなる遺伝子生成物
（EE-IGF-I）が本発明者らによるスウエーデン特許出願
中に記載した方法により大腸菌（E.coli）から分泌され
ることを示した。
これら二つの言及された発現方法は外来蛋白質を発現
させかつ分泌させるための非常に強力な手段をなす。し
かしながら、蛋白質Ａ融合の使用は生物学的に活性なペ
プチドまたは蛋白質を放出するための精製後の処理に依
存する。工業的プロセスにおいては、化学開裂方法が経
済的理由で蛋白質分解開裂に比べて好まれる。蛋白質Ａ
を担体蛋白質として用いる場合、蛋白質Ａが無傷で残る
ように結合した遺伝子生成分を放出するため処理すべき
リンカー中にのみ認識アミノ酸配列が存在するのかどう
かが非常に重要なことであろう。その方法では、IgGカ
ラム中の２度目の通過は蛋白質Ａ分子を結合させるが、
化学開裂により放出された生成物は通過してしまう。
発明が解決しようとする問題点 IGF-Iの場合、本発明者らが使用するよう提案した方
法はAsn-Glyジペプチド配列におけるヒドロキシルアミ
ン開裂である。さもなければ主に用いられている方法は
Metに特異的なCNBr開裂である。方法の選択は生成物中
にその薬剤に敏感なアミノ酸が存在するか否か、IGF-I
が内部メチオニンを有し、そしてIGF-IIが有さないのに
依存する。しかしながら、蛋白質ＡはIgG結合領域中に
３個の内部メチオニン及び蛋白質ＡのIgG結合領域中に
５個のAsn-Glyを有する。このことは、開裂から放出さ
れた蛋白質Ａ片がIgGに結合しないので、カラム中の２
度目の通過を無関係なものにする。
本発明の主な目的は配列中にMetや存在任意のAsn-Gly
が存在しないようにIgG結合領域を適合することにより
これらの問題に対する解答を提供することである。同時
に、２個の非再起帰性（非パリンドローム）Acc I部位
は好ましくはフラグメント中に導入されIgG結合領域を
任意の数のIgG結合領域へと重合可能にする。
〔発明の構成〕
問題を解決するための手段 従つて、該目的及び以下の記載から明らかになろう他
の目的を達成するため、本発明はブドウ球菌性蛋白質Ａ
に関連した免疫グロブリンＧ結合領域をコード化する組
換体DNAフラグメント（本開示においてＺと略す）であ
って、該フラグメントは該フラグメントのメチオニンコ
ドンがメチオニン不含有蛋白質の発現を可能にする、メ
チオニン以外のアミノ酸残基のコドンにより置換されて
おり、先天蛋白質Ａのトリプシン消化により定義された
ようなアミノ酸残基第１番のコドンはバリンコドンによ
り置換され、そして前記フラグメントを任意の多重度で
重合させて翻訳生成物の結合能を高めることを可能とし
ていることを特徴とするものを提供する。該他のアミノ
酸残基のコドンがロイシンのものであることが好まし
い。
本発明のフラグメントの一つの好ましい実施態様にお
いて、アスパラギン−メチオニンコドンはヒスチジン−
ロイシンコドンにより置換されている。先天（天然）蛋
白質Ａのトリプシン消化により定義されるアミノ酸残基
の第１番のコドンは好ましくはヌクレオチド水準で非再
起帰性（非パリンドローム）Acc I部位を与える配列GTA
GACを与えるようにバリンコドンにより置換される。
他の好ましい実施態様において、Asn-Gly群中のグリ
シンコドンはアラニンコドンにより置換されている。As
p-Proコドンは、例えばアスパラギン酸コドンをグルタ
ミン酸コドンで置換することにより、発現された蛋白質
のペプチド結合の酸安定性を高めるため適当に変性され
ている。
本発明の他の観点において、上記と同一の意義を有す
る少なくとも２個のＺ−フラグメントを含む組換体DNA
配列が提供される。このような融合されたＺ−フラグメ
ントの数は２〜15個の範囲、特に２〜10の範囲である。
本発明の更に別の観点によれば、Asn-Glyコード化群
中のグリシンコドンがアラニンコドンにより置換されて
いるブドウ球菌性蛋白質ＡのEDABC領域のいずれかをコ
ード化する組換体DNAフラグメントが提供される。
本発明はまた上記と同一の意義を有するＺフラグメン
ト及びそれに先立つてシグナル配列次いでアミノ酸配
列:AlaGlnHisAspGluAlaをコード化するヌクレオチドペ
プチド配列を含む組換体DNA配列も提供する。
本発明はまた上記と同一の意義を有する組換体DNA配
列を含みかつその３′でDNA水準で生産遺伝子を融合し
ている組換体DNA分子も包含する。この配置により、こ
のような分子は融合された蛋白質を適当な宿主中に発現
させる能力を得る。このような生産遺伝子はソマトメジ
ンのものでよく、その例は成長ホルモンまたは因子、例
えばhGH（ヒト成長ホルモン）、IGF-I,IGF-II,NGF（神
経発育因子）,EGF（皮膚発育因子）及びPDGF（血小板誘
導発育因子）である。生産遺伝子はまたインターフエロ
ン，インターロイキン−２インシユリン）イロペプチ
ド、胃腸ペプチド等である。詳しくは、生産遺伝子はIG
F-IまたはIGF-IIのものである。生産遺伝子はまた酵素
またはその一部のための構造遺伝子もコード化できる。
このような組換体DNA分子において、先天蛋白質、例
えばIGF-Iを放出するためペプチド結合のヒドロキシル
アミノ開裂を可能にするためアスパラギンコドンをＮ末
端グリシンコドンの前におくのが好ましい。他の実施態
様において、先天蛋白質、例えばIGF-IIを放出するため
ペプチド結合の臭化シアン開裂を可能にするためメチオ
ニンコドンをＮ末端グリシンコドンの前におくのが好ま
しい。
本発明の更に別の観点によれば、上記と同一の意義を
有する組換体DNA分子により生物学的系中に発現された
融合蛋白質を開裂する方法が提供される。このような処
理はＮ末端グリシンコドンの前にアスパラギンコドンが
おかれる場合ヒドロキシルアミン処理により好適に行な
われる。メチオニンコドンが前におかれる場合は、開裂
は好ましくは臭化シアン処理により行なわれる。
最後に、本発明は上記したような組換体DNA分子を含
むプラスミド媒介体を包含する。本発明はまた上記と同
一の意義を有する組換体DNA分子を保持する細菌細胞に
も及ぶ。分子は細菌細胞の染色体中に保持されることが
できるが、またプラスミド媒介体中にも含有されうる。
作用効果 宿主細胞は例えばグラム陰性であり、特に大腸菌（E.
coli）により構成されている。
以下、本発明を添付図面を参照した非限定的実施例に
より更に例示する。
第１図は蛋白質Ａ遺伝子のコード化領域の組織を示し
ている。Ｓはシグナル配列であり、Ａ〜ＥはIgG結合領
域であり、そしてＸはコード化ポリペプチドのIgG結合
活性を有さないＣ末端領域である。
第２図は異なるIgG結合領域の比較を示している。第
一の線は提案された意見一致したIgG結合領域のアミノ
酸配列を示している。二つの囲みは２種の異なるアルフ
アヘリツクスに関係したアミノ酸の範囲を示す。IgGへ
の結合に関係したアミノ酸に下線が引かれている。異な
る領域中のアミノ酸が意見一致のコドンに比較して変化
のない場合は一により、何らアミノ酸の変化はないが無
症状突然変異がある場合は＋によりそしてアミノ酸変化
のある場合は他のアミノ酸の文字により示されている。
アミノ酸は１文字のアルフアベツトコードで示した。
第３図は合成されたＺフラグメントの感覚鎖（sense
strand）のヌクレオチド配列を示す。開裂領域はシグ
ナル配列のプロセツシングに必要なアミノ酸の範囲を示
す。Ｚ領域はIgG結合領域をコード化するＺ−フラグメ
ントの部分である。アミノ酸変化に下線が引かれてい
る。実施例にて用いた部位のための制限酵素認識配列を
示した。
第４図はpZZ-IGF-Iプラスミド媒介体によりコード化
されたZZ-IGF-Iのヌクレオチド配列を示す。シグナルペ
プチド、開裂領域、２種Ｚ領域及びIGF-Iをコード化す
る領域が構成手順に関連した制限部位と共に示されてい
る。
第５図は実施例第Ｖ部中に記載した手順を示してい
る。合成オリゴマーはＺ−フラグメント（HindIIIからE
coRIまで）のpUC8へのクローン化の前にM13mp8（図示さ
れていない）中にクローン化される。pUC8-ZをAccIで消
化させることにより、Ｚ領域が開裂され、そして結紮次
いで転換により、pUC8-Zプラスミド媒介体が単離でき
た。AMPはβ−ラクタマーゼ遺伝子をコード化する遺伝
子であり、oriは大腸菌を複製する原型であり、lacZ′
はβ−ガラクトシダーゼアルフアフラグメントをコード
化する遺伝子であり、そしてＺは合成フラグメントであ
る。
第６図は実施例第VI部中に記載したクローン化手順を
示している。AMPはβ−ラクタマーゼをコード化する遺
伝子であり、Ｓはシグナル配列であり、Ａ〜Ｅは蛋白質
ＡのIgG結合領域であり、oriは複製の原型であり、Ｚは
合成フラグメントであり、IGF-IはIGF-Iのための遺伝子
であり、F1はフアージf1を複製する原型であり、そして
lacZはβ−ガラクトシダーゼのための遺伝子である。
第７図は、実施例第III及びIV部に記載したようにpAS
Z1及びpASZ2の構成を示している。AMPはβ−ラクタマー
ゼをコード化する遺伝子であり、F1はフアージf1を複製
する原型であり、S1はシグナル配列であり、Ａ〜ＥはIg
G結合領域であり、oriは大腸菌を複製する原型であり、
そしてＺは合成フラグメントである。
第８図は実施例第VII部中に記載したように独特のAsn
-Gly領域開裂方法を用いてIGF-Iを精製する方法手順を
示している。そして、 第９図は実施例第VII部中に記載した方法における異
なる工程に対応する蛋白質のSDSゲル電気泳動を示して
いる。レーン１はキロダルトンで表わしたサイズマーカ
ーを示し、レーン２はIgGアフイニテイ精製後のハイブ
リツド蛋白質を示し、レーン３はヒドロキシルアミン開
裂の結果を示し、レーン４はヒドロキシアミンで消化さ
れたハイブリツド蛋白質のIgGセフアロースゲルのフロ
ースルーを示しており、そしてレーン５は純粋なIGF-1
（マーカー）である。ZZ-IGF-I、ZZ及びIGF-1に対応す
る帯が矢印により示されている。
制限酵素AccIを用いてクローン化合成フラグメントを
開裂し次いで単離されたフラグメントを結紮することに
より、フラグメントは頭−尾型に結紮しフラグメントの
直列型反復を生成し、かつ理論上は任意の数の領域を得
ることができる。本発明を例示するのに用いたフラグメ
ントは以下の方法により構成した。
蛋白質Ａは２個の別個の領域からなる： IgG結合領域（Ａ〜Ｅ領域）及びIgG結合活性を有さない
領域Ａ（第１図）、IgG結合領域は蛋白質水準にてのト
リプシン処理により開裂分離されうる５種の同類のIgG
結合領域からなる。Ｂ領域はIgGと共に結晶化されてお
り、構造はＸ線結晶学により決定した（Deisenhofer,J,
Biochemistry.20,2361（1981）。
５種のIgG結合領域は約58個のアミノ酸（Ｅはより短
かく、Ｄはより長い）からなり、領域のアミノ酸配列は
第２図に示されている。
合成されたフラグメントは下記の特徴を有していた。
１）いかなるMetも欠除、 ２）Asn-Glyジペプチド配列の欠除、 ３）フラグメントが発現を得るためのクローン化を促進
するためにヌクレオチド水準で合成されるように最適化
される。
４）フラグメントは任意の数のIgG結合領域を得るため
ヌクレオチド水準で重合されうる。
５）フラグメントは発現及び分泌に適した遺伝子系中に
発現される能力を有する。
１）蛋白質ＡのIgG結合領域中には３個のMetがある。合
成フラグメントにおいて、意見一致したMet（蛋白質Ａ
意見一致アミノ酸配列は第２図に示されている）はAsn-
MetをHis-Leu配列のためのコドンに代えることにより合
成フラグメント中で変化された。
２）Asn-Glyジペプチド配列はヒドロキシルアミンに敏
感である。この配列は蛋白質Ａの５種のIgG結合領域全
てにおいて無傷である故かつこのアミノ酸配列はIgGへ
の結合に関係するアルフアヘリツクスの中央に存在する
故（第２図）、いかなるアミノ酸変化も成功するチヤン
スがほとんどない。AsnからGlnへの変化の明白な選択を
コンピユーターグラフイツクス（FRODOソフトウエア、A
lwin Jones Biological Centre,スウエーデン、ウプサ
ラ）によりBrookhaven Protein Data Bank（Bernstein,
F.C.etal,J.Mol.Biol.,112,553-542（1972））から入手
できる座標を用いて分析し、蛋白質ＡのＸ線結晶学的構
造から計算した。
Asnは２種の他の残基への水素結合を提供するので、A
snからGlnへのコードの変化は蛋白質Ａの三次構造及びI
gGへの結合いずれも破壊すると予想された。しかしなが
ら、それに反し、コンピユーター分析は驚くべきことに
Asn-Glyジペプチド配列中のGlnがAlaに変化されうるこ
とを示した。この変化は明白ではない。何故ならばグリ
シン類はそれらの特別な特徴により同類の蛋白質配列間
で最も保存されるアミノ酸類の中にあるからである。特
徴にはペプチド結合周囲の柔軟性、アルフア及びベータ
構造を開始させ破壊する通常の機能、及びポリペプチド
鎖中では何ら正味電荷を有さないアミノ酸としての特徴
が含まれる。しかしながら、コンピユーターにてGlyか
らAlaアミノ酸への変化をシミユレートすることによ
り、本発明者らはこの変化は蛋白質Ａの折重（foldin
g）またはIgGへの結合を干渉しないとの結論に達した。
３）フラグメントはDNA水準において10個の別個のオリ
ゴマー中で合成された。フラグメントのクローン化を促
進するため、１個のHindIII部位が５′末端に指定さ
れ、EcoRI部位が３′末端に指定された（フラグメント
のヌクレオチド配列は第３図に示されている）。
４）ヌクレオチド水準でフラグメントを重合することが
できるようにするため、IgG結合領域のＮ末端のコード
においてヌクレオチド配列をGTAGACに変化させることに
より非再帰性AccI部位を導入した。この方法により、全
領域中に存在するAlaコドンがValに変化される。このヌ
クレオチド群により、フラグメントは任意の多数性まで
重合させることができ、かくして翻訳された生成物の結
合能力を変化させる。このアミノ酸置換が蛋白質Ａの機
能を干渉するか否かは明白ではない。
５）シグナル配列がフラグメントに結合されるはずのFs
pI部位を導入することによりかつ蛋白質ＡのＥ領域に独
特な６個のアミノ酸を有するコード化されたフラグメン
トを開始することにより、フラグメントは分子クローン
化により蛋白質Ａシグナル配列に結合される能力を有
し、６個のＮ末端アミノ酸を導入することによりフラグ
メントの分泌を確実にした。
実施例 本発明の特定な実施態様を以下詳細に記載する。
出発物質 細菌宿主：大腸菌K12の３種の異なる菌株を実施例中で
使用した。
HB101（Boyer,H.W.etal.,J.Mol.Biol,41,459-572（196
9））， JM83（Yanisch-Perron,C.etal,Gene,33,103-119（198
5）及びJM103（Messing,J.etal,Methods Enzymol.,101
20-79（1983））。（菌株はスウエーデン、ストツクホ
ルムのDepartment of Biochemistry and Biotechnolog
y,Royal Institute of Techrologyから入手できる） クローン化媒体： 実施例にて使用したクローン化媒体
はM13mp18（Yanisch-Perron,C.etal.,Gene,33,103-109
（1985））及びpUC8（Vieva,J.etal.,Gene19,259（198
2））であつた。媒介体pHL33は以下の方法で構成された
pEMBL19（−）（Dente etal.,Nucl.Acids Res.,11,1645
（1983））及びpR1T4（Nilsson,B.etal.,EMBO J.4,1075
（1985）から誘導した媒介体である。
プラスミドpR1T4をTaqIで開裂し、そしてKlenowポリ
メラーゼによる充填反応の後、Not-Iリンカーを添加し
た。反応混合物をEcoRI NotIで開裂させ、蛋白質Ａ遺伝
子上に広がつているフラグメントを単離した。このフラ
グメントをNot-I及びEcoRIによりそのプラスミドを開裂
させることによりpEMBL19（−）ヘクローン化させた。
後者はClaI部位が既にNotI部位に結合されてしまつたと
ころである。これにより蛋白質Ａ遺伝子の一部次いでmp
19多重制限酵素リンカーを含有する媒介体を与える。
媒介体pEX4-IGF-IはEcoRI中でBamHI′にクローン化さ
れた合成IGF-Iを有するpEX（Stanley′K.etal.,EMBO J.
3,1429（1984）である。
IGF-Iをコード化する合成遺伝子はElmblad,A.らによ
りThird European Congress on Biotechnology III,287
-296,Verlag Chemie,Weinheim（1984）により記載され
ている。プラスミド媒介体pASZ2は西独、ゲツテインゲ
ンのDeutsches Sammlung von Microorganismen（DSM）
に第3594DSM号として寄託されており、かつ（寄託書類
にては命名した名称pE＊２とされている）。
緩衝液及び培地 コーチング緩衝液:1.59gのNa2CO3,2.93gのNaHCO3及び0.
2gのNaN3を蒸留水で１に調製。
PBST:8.0gのNaCl.0.2gのKH2PO4,2.9gのNa2HPO4×12H2O,
0.2gのKCl,0.2mlのTween 20及び0.2gのNaN3を蒸留水
で１に調製（pH7.4）。
TSB:30gのトリプシン系大豆汁を１に調製し、オート
クレープにかけた。
LB:10gのバクトトリプトン、5gの酵素抽出物及び10gのN
aClを１に調製し、オートクレーブにかけた。
LA:LB含び１当り15gのバクト寒天を含有するプレー
ト。
TBAB:30gのトリプシン系寒天基質を１に調製し、オー
トクレーブにかけた。
OPNG緩衝液:15mM2−メルカプトエタノール及び1mM MgCl
2を含有する0.1M燐酸カリウム緩衝液、pH7.3中の2mMO−
ニトロフエノール−β−ガラクトシド（ONPG、シグマ製
品No.N-1127）。
通常方法 操作方法のうちあるものは実施例中で繰返し行なつ
た。他に特記しない限り、それらはそれらを行なう毎に
全く下記と同じように行なつた。
分子生物学において通常用いられる方法は記載されて
いない（例えば、市販の制限酵素、DNA結紮、Bal31エキ
ソヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ及びK1enowポリメラー
ゼの使用）。
転換：プラスミドDNAによる大腸菌K12の転換は記載され
たように行なつた（Morrison,D.A.,Methods in Enzymol
ogy,Academic Press 68,326-331（1971））。転換体は7
0mg/lアンピシリンを含有するグレート（TBAB）上で常
法により選択した。
プラスミドDNAの単離：プラスミドDNAをBirnboim,H.C.e
tal,Nucl.Acids Res.7,1513（1973）に記載されたよう
に単離した。多数の転換体をスクリーニングするため小
規模製剤をKieser,T.,Plasmid12,19-36（1984）により
記載されたのと全く同じように作成した。
セフアロース（Sepharose）6Bクロマトグラフイー:Bal3
1またはS1処理のため使用すべきプラスミドDNAを10mM T
ris,1mM EDTA及び500mM NaCl緩衝液中のセフアロース6B
ゲル過にかけた。この方法によりDNAはRNAから分離さ
れる。
DNAフラグメントの溶離:DNAフラグメントのアガロース
またはポリアクリルアミドゲル片からの溶離をMaxam et
al,P.N.A.S.（USA），74,560-564（1977）により記載さ
れたものと全く同じように行なつた。
低ゲル温度アガロースゲル中のDNAの結紮： 直接アガロースゲル中における結紮を低ゲル温度アガ
ロースゲル中の電気泳動を行なうことにより行ない、帯
を切出した後、ゲル片を65℃に加熱することにより融解
させた。Tris緩衝液（10mMpH7.4）を用いる10回希釈の
後、結紮が実施できた。
蛋白質Ａの検出及び定量：蛋白質Ａを定量するためELIS
A試験（すなわち酵素結合免疫吸着剤分析）を用いた。
この試験は正味電荷（net charge）を有さない特別ミク
ロ滴定プレート（Titertek,オランダ、アムステルスタ
ツド）を使用する。溜めをコーチング緩衝液中のヒトIg
G（Kabi AB,スウエーデン）でコーチングする。試料を
添加し、蛋白質Ａを溜め中に吸着されたIgGのFc部分に
結合させる。次いで、蛋白質Ａをβ−ガラクトシダーゼ
（Pharmacia AB,スウエーデン、ウプサラから）に接合
された抗蛋白質Ａ（ラビツトから）により分析する。
分析：ミクロ滴定プレートの溜めをコーチング緩衝液中
16ng/mlのヒトIgG溶液75μｌで満たし、プレートを室温
で少なくとも１時間培養する。溜めを100μｌのPBSTで
３回洗浄し、50μｌの試料を各溜めに添加する。定量の
ため、２倍希釈液を調製する。１時間温置後、溜めを10
0μｌのPBSTで３回洗浄し、次いで50μｌの抗蛋白質Ａ
−β−ガラクトシダーゼを添加する（各溜めに添加され
た蛋白質Ａ結合能力の量は過剰の蛋白質Ａによる滴定に
より検出された各溜めに添加されたIgGのモル量に対応
する）。45分間温置した後、溜めを100μｌのPBSTで３
回洗浄し、次いで125μｌのONPG緩衝液を添加する。20
〜30分間温置した後、150μｌの0.1MNaOHを添加して反
応を停止させる。定量は既知濃度の蛋白質Ａ標準溶液の
２倍希釈液を試料の２倍希釈液と平行して流すことによ
り行なう。405nmにおける吸収を光度計により各溜めに
ついて測定する。
SDS-PAGE:SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をLaem
mli,O,K,Nature（London），227,680-685（1970）によ
り記載されたのと全く同じように10-20％段階勾配ゲル
を用いて行なつた。
実施例 I.合成蛋白質Ａフラグメント（Ｚ）の構成 誘導されたDNA配列をコンピユータープログラムによ
り分析し、41個から45個までのヌクレオチドと長さが変
化しかつ6bpのオーバーラツプを有する10個のオリゴヌ
クレオチドに分割した。
合成を完全自動機械により行ない、脱蛋白オリゴマー
をポリアクリルアミド電気泳動（20％ポリアクリルアミ
ド、7M尿素、50mM Trisホウ酸塩、pH8.3）にかけ、次い
で水で抽出し、親液化することにより精製した。
II.Z−フラグメントの結紮及びクローン化 100pmoleずつのオリゴヌクレオチドA1〜A5及びB1〜B5
を20μｌのキナーゼ緩衝液（50mM Tris-HCl,pH7.6,10mM
MgCl2,1mM ATP,10mMDTT）中で別個にホスホリル化し、
５単位のポリヌクレオチドキナーゼを添加し、混合物を
37℃で45分間温置した。
５μｇの媒介体M13mp18の複製的形態を制限酵素EcoRI
及びHindIIIで消化させた。消化からの大きなフラグメ
ントを低温アガロースゲルから単離した。
消化させたM13mp18を含有するアガロースを65℃で融
解し、５μｌ（0.5μｌ、0.1pmole）を50μｌ結紮緩衝
液（66mM Tris-HCl、pH7.6 50mM MgCl2,50mM DTT,1mM A
TP）中の0.5pmoleずつのホスホリル化オリゴマーA1〜A5
及びB1〜B5と混合し、90℃に加熱し、１時間かけてゆつ
くり室温まで冷却した。10単位のT4DNAリガーゼを添加
し、混合物を15℃で１晩温置した。
大腸菌JM103をかくして得られたDNAでトランスフエク
シヨンし、x-gal及びIPTGを含有する2xYTプレート上で
１晩増殖させた。78個の白色プラークを新しい2xYTプレ
ートに移し、コロニーとして増殖させた。プローブとし
ての32P標識オリゴヌクレオチドによるコロニーハイブ
リツド形成により一つの陽性コロニーが得られ、これを
取り出し15mlの2xYT中で大腸菌JM103で増殖させた。細
胞を旋回沈降させ、フアージを上澄液から回収した。一
本鎖フアージDNAを抽出し、精製し、ジデオキシ法によ
る配列反応のための鋳型として用いた。Ｚ−フラグメン
トを含有するM13mp18をM13-Zと命名した。
III.プラスミド媒介体pASZ2の構成 プラスミド媒介体pHL33をHindIII及びEcoRIで開裂し
た。大きなフラグメントは電気泳動後１％アガロースゲ
ルから単離した。フラグメントは単離したＺ−フラグメ
ント（HindIII/EcoRI）に結紮した。結紮後、混合物を
大腸菌HB101に転換し、単離された媒介体pASZ1（第７
図）はシグナル配列から下流にクローン化された合成Ｚ
−フラグメントを有する。シグナル配列の直後に合成フ
ラグメントを置くために、pASZ1媒介体をFspIで開裂さ
せた。再結紮後、混合物を大腸菌HB101に転換し、pASZ2
が単離できた。
媒介体は蛋白質Ａのシグナル配列の直後にＺ−フラグ
メント（第３図）を有している。
構成はDNA配列化により確認した。
IV.pASZ2の発現 pASZ2の大腸菌HB101中の発現 菌株を15mlのTSBに接種し、振盪フラスコ中で12時間
温置した後、細胞懸濁液を遠心分離した。
細胞をTE（5ml）中で１回洗浄し、更に5mlのTBS中に
再懸濁し、次いで３×30s（MSE超音波処理器、ミクロテ
イツプ、出力６）で超音波処理した。超音波処理後、混
合物を10分間10000xgで遠心分離した。
増殖培地及び細胞超音波処理からの抽出物を通常方法
に記載した方法を用いて蛋白質Ａについて分析した。結
果を第１表に示す。
これらの結果はフラグメントがIgG結合性であること
を示している。
V.二量体Ｚフラグメントの構成 M13-Zからの一本鎖DNAを配列化プライマーへと焼なま
し、次いでKlenow及びdNTPによる処理を行なつた。
ここにおいて二本鎖DNAが得られた。反応混合物をHin
dIII及びEcoRIで消化させ、Ｚフラグメントを低ゲル温
度アガロースゲル電気泳動から単離した。別個にプラス
ミドpUC8をEcoRI及びHindIIIで消化させ、大きなフラグ
メントを低ゲル温度アガロースゲル電気泳動から単離し
た。２種の単離したゲルフラグメントを65℃に加熱し、
２μｌの各融解フラグメントを50μｌの結紮緩衝液及び
2.5単位のDNAリガーゼで15℃で１晩結紮させた。かくし
て得られたDNAを上記のように大腸菌株JM83を転換させ
るため使用し、２種の被転換体からのプラスミドDNAを
単離し、Ｚフラグメントを含有していることが分つた。
pUC8-Zを制限酵素AccIで消化させた。消化混合物の結
紮後、JM83の新しい転換を作成し、次いで12種の被転換
体からプラスミドを単離した。HindIII及びEcoRIで消化
させ、アガロースゲル分析することにより２種の被転換
体が２種のＺフラグメントの挿入体を有するpUC8を保持
している（pUC8-ZZ）ことを確認した。
VI 発現媒介体pZZ-IGF-Iの構成 pZZ-IGF-Iの構成を以下の方法により行なつた（第６
図）。
A.pUC18-ZZをFspI及びEcoRIで消化させ、最も小さなフ
ラグメントをLGTアガロース上で単離した。
B.プラスミド媒介体pHL33をFspIで消化させた。最も大
きなフラグメント（2273bp）をLGTアガロース上で単離
した。
C.プラスミドpEX4-IGF-IをFspI及びEcoRIで消化させ
た。AMP遺伝子中へのIGF-I遺伝子上に亘つている小さな
フラグメントを単離した。
A,B及びＣからの３種のフラグメントを通常方法に記
載したように一緒に結紮させ、結紮混合物を大腸菌JM83
に転換した。
被転換体選択は70μg/mlのアンピシリンを含有するLB
寒天培地を用いて行なつた。プラスミドDNAの単離及び
制限酵素による分析により被転換体がプラスミドpZZ-IG
F-Iを保持していることを見出した。
VII pZZ-IGF-Iを含有する大腸菌JM83の増殖及びIGF-I
の精製 0.2％グルコース、0.01M MgSO4及びアンピシリン（10
0μg/ml）を補充した4lの増殖培地を大腸菌JM83/pZZ-IG
F-Iで接種した。細胞を振盪フラスコ中で2lのフラスコ
中各フラスコ当り500mlのブロスを用いて37℃で20時間
増殖した。細胞を旋回沈降させ、−20℃に３日間保持し
た。この凍結ペレツト（32g正味重量）に、128mlの10mM
Tris HCl pH8.0溶液を添加し、細胞懸濁液を＋４℃で
２時間緩かに混合した。細胞を遠心分離により旋回沈降
させ、上澄液をアフイニテイクロマトグラフイーのため
回収した。上澄液を再遠心分離し、次いでIgGセフアロ
ースカラムに150mMNaCl、50mM Tris HCl.pH7.5（以下T
s）と共に付した。
上澄液を12ml/時の速度でカラムに通し、IgG結合性物
質の量をカラムに流す前後で分析した。結合した物質を
0.05％TritonX-100を補充したTSで、次いでTSそして最
後に0.05M酢酸アンモニウムで洗浄し、次いでpHを酢酸
アンモニウムで2.8に合せた1M酢酸で溶離した。2mlずつ
の画分を蛋白質Ａ含量について分析し、画分をプール
し、凍結乾燥させた。ハイブリツド蛋白質はBornstein
etal,Methods Enzymol.,47,132（1977）に記載したよう
にヒドロキシルアミンで開裂させた。乾燥物質を塩化リ
チウムでpH9に調整した2Mヒドロキシルアミン及び0.2M
Tris塩基中に溶解した。この開裂を45℃で４時間行なつ
た。開裂反応をpHを酢酸で7.0に低下させることにより
停止させ、TSで飽和させたPD-10カラム上で脱塩した。
脱塩した3.5mlの画分を1mlのIgG−セフアロースカラム
に通すことによりIGF-IをZZポリペプチドから分離し
た。次いで、この物質を0.2M酢酸で飽和させたPD-10カ
ラム上で脱塩し、次いで凍結乾燥させた。次いで、物質
をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分析した。この方法は第８図に示されており、SD
S−ポリアクリルアミドゲルは第９図に示されている。
発現された融合蛋白質のヌクレオチド配列を第４図に示
した。
これらの結果はZZフラグメントが精製を促進するため
IgGを結合すること並びに先天IGF-Iを放出するためかつ
ゲル中第二の通過の後ZZ部分をIgGゲルに結合できるよ
うにするため独得なAsn-Gly開裂部位を保持することに
関してIGF-Iを精製する方法において機能することを示
している。
以上本発明をIGF-Iの精製に関して説明してきたが、
本発明は有用な蛋白質をコード化する任意の遺伝子の精
製に適用できることに留意ありたい。かくして、IGF-I
精製は本発明の有用性の一つの例にすぎず、本特許請求
の範囲に規定した以外に本発明の範囲を限定するものと
解してはならない。
ヒトIgGを結合すると知られた全ての蛋白質Ａ領域中
に存在するAsp-Proジペプチド群はGlu-Proに変化するよ
う設計された。これは通常酸に不安定なAsp-Proペプチ
ドを酸処理（例えば70％蟻酸で42℃にて12時間）に耐え
られるようにし、任意の他の導入されたAsp-Proコード
化リンカーを独特なものにしている。この設計されたア
ミノ酸変化（AspからGlu）は実施例中に示されていな
い。
【図面の簡単な説明】
第１図は蛋白質Ａ遺伝子のコード化領域の組織を示して
いる。 第２図は異なるIgG結合領域の比較を示している。 第３図は合成されたＺ−フラグメントの感覚鎖のヌクレ
オチド配列を示している。 第４図はpZZ-IGF-Iプラスミド媒介体によりコード化さ
れたZZ-IGF-Iのヌクレオチド配列を示す。 第５図は実施例第Ｖ部中に記載した手順を示している。 第６図は実施例第VI部中に記載した手順を示している。 第７図は実施例第III及びIV部中に記載したようにpASZ1
及びpASZ2の構成を示している。 第８図は実施例第VII部中に記載したように独特のAsn-G
ly領域開裂方法を用いてIGF-Iを精製する方法を示して
いる。 第９図は実施例第VII部中に記載した方法における異な
る工程に対応する蛋白質のSDSゲル電気泳動を示してい
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 マジアス・ウーレン スエーデン国，ウプサラ，エスー752 35, エーブルス ロッツガータン ８アー (56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ，Ｖｏｌ．13，Ｎｏ．４（1985) ｐ．1151−62 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖ ｏｌ．259，Ｎｏ．３（1984）ｐ．1695− 1702

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ブドウ球菌性蛋白質Ａに関連した免疫グロ
    ブリンＧ結合領域をコードする組換体DNAフラグメント
    であり、下記に示すアミノ酸配列（Ｚ−領域）をコード
    するヌクレオチド配列を含む組換体DNAフラグメント。
  2. 【請求項２】シグナル配列及びアミノ酸配列： Ala Gln His Asp Glu Ala をコードするヌクレオチド配列がＺ−領域をコードする
    ヌクレオチド配列の上流に存在する特許請求の範囲第
    （１）項記載の組換体DNAフラグメント。
  3. 【請求項３】Ｚ−領域をコードするヌクレオチド配列の
    直前にアミノ酸配列： Ala Gln His Asp Glu Ala をコードするヌクレオチド配列が、更にその前にシグナ
    ル配列をコードするヌクレオチド配列が存在する特許請
    求の範囲第（１）項記載の組換体DNAフラグメント。
  4. 【請求項４】ブドウ球菌性蛋白質Ａに関連した免疫グロ
    ブリンＧ結合領域をコードする組換体DNAフラグメント
    であり、下記に示すアミノ酸配列（Ｚ−領域）をコード
    するヌクレオチド配列を少なくとも２個含む組換体DNA
    フラグメント。
  5. 【請求項５】シグナル配列次いでアミノ酸配列： Ala Gln His Asp Glu Ala をコードするヌクレオチド配列がＺ−領域をコードする
    ヌクレオチド配列の上流に存在する特許請求の範囲第
    （４）項記載の組換体DNAフラグメント。
JP61296509A 1985-12-13 1986-12-12 蛋白質工学を用いるダウンストリ−ムプロセツシングを促進するためのＩｇＧ結合性蛋白質の構成 Expired - Lifetime JPH0811069B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8505922A SE8505922D0 (sv) 1985-12-13 1985-12-13 Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering
SE8505922-8 1985-12-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS62190087A JPS62190087A (ja) 1987-08-20
JPH0811069B2 true JPH0811069B2 (ja) 1996-02-07

Family

ID=20362468

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61296509A Expired - Lifetime JPH0811069B2 (ja) 1985-12-13 1986-12-12 蛋白質工学を用いるダウンストリ−ムプロセツシングを促進するためのＩｇＧ結合性蛋白質の構成

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5143844A (ja)
EP (1) EP0230869B1 (ja)
JP (1) JPH0811069B2 (ja)
AT (1) ATE80180T1 (ja)
AU (1) AU600244B2 (ja)
CA (1) CA1311430C (ja)
DE (1) DE3686646T2 (ja)
DK (1) DK600486A (ja)
ES (1) ES2046177T3 (ja)
GR (1) GR3006178T3 (ja)
SE (1) SE8505922D0 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015046473A1 (ja) 2013-09-27 2015-04-02 株式会社カネカ アルカリ水溶液を用いた多孔質セルロースビーズの製造方法、リガンド固定化用担体および吸着体

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK528285D0 (da) * 1985-11-15 1985-11-15 Novo Industri As Peptider samt praeparater indeholdende disse
SE8505921D0 (sv) * 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab A method to export gene products to the growth medium of gram negative bacteria
SE8601940D0 (sv) * 1986-04-25 1986-04-25 Kabigen Ab Preparation of fused proteins, antibodies and processes therefor
US5985599A (en) * 1986-05-29 1999-11-16 The Austin Research Institute FC receptor for immunoglobulin
EP0623679B1 (en) * 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5095096A (en) * 1987-05-29 1992-03-10 Sagami Chemical Research Center Fused protein comprising lymphotoxin
WO1989004675A1 (en) * 1987-11-20 1989-06-01 Creative Biomolecules, Inc. Selective removal of immune complexes
US5084398A (en) * 1987-11-20 1992-01-28 Creative Biomolecules Selective removal of immune complexes
US5243040A (en) * 1987-11-20 1993-09-07 Creative Biomolecules DNA encoding a protein which enables selective removal of immune complexes
SE8800981A (sv) * 1988-03-17 1988-10-14 Lars Abrahamsen A recombinant fusion protein, its use and a recombinant vector
SE509359C2 (sv) * 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
GB8927008D0 (en) * 1989-11-29 1990-01-17 Ciba Geigy Novel process for the production of unfused protein in e.coli
US5681814A (en) * 1990-06-07 1997-10-28 Genentech, Inc. Formulated IGF-I Composition
US5595887A (en) * 1990-07-16 1997-01-21 Bionebraska, Inc. Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment
US6077694A (en) * 1990-09-21 2000-06-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for over-expression and rapid purification of biosynthetic proteins
US5863783A (en) * 1991-03-27 1999-01-26 Gist-Brocades, N.V. Cloning and expression of DNA molecules encoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin
US5736363A (en) * 1991-07-29 1998-04-07 British Bio-Technology Limited IGF-II analogues
US5989887A (en) * 1992-11-25 1999-11-23 Dsm N.V. Cloning and expression of DNA molecules incoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin
SE9504019D0 (sv) * 1995-11-13 1995-11-13 Pharmacia Ab Method for production of proteins
US5917026A (en) * 1996-02-05 1999-06-29 Loewenadler; Bjoern Fusion proteins of immunopotentiating activity
US5962270A (en) * 1996-02-06 1999-10-05 Bionebraska, Inc. Recombinant preparation of calcitonin fragments and use thereof in the preparation of calcitonin and related analogs
AU4196697A (en) * 1996-09-16 1998-04-14 Dalhousie University Use of igf-i for the treatment of polycystic kidney disease and related indications
US6156728A (en) 1996-11-01 2000-12-05 Genentech, Inc. Treatment of inner ear hair cells
US6593290B1 (en) 1996-11-01 2003-07-15 Genentech, Inc. Treatment of inner ear hair cells
US6420518B1 (en) 1997-04-04 2002-07-16 Genetech, Inc. Insulin-like growth factor agonist molecules
US6121416A (en) 1997-04-04 2000-09-19 Genentech, Inc. Insulin-like growth factor agonist molecules
DK1141014T3 (da) 1999-01-06 2005-04-11 Genentech Inc Insulinlignende vækstfaktor (IGF) i mutantvariant
AU762047B2 (en) 1999-01-06 2003-06-19 Genentech Inc. Insulin-like growth factor (IGF) I mutant variants
ES2208305T3 (es) 1999-04-08 2004-06-16 Genentech, Inc. Composicion basada en polipeptidos de carga opuesta..
ATE389416T1 (de) 2000-05-16 2008-04-15 Genentech Inc Behandlung von knorpelerkrankungen
US20030157561A1 (en) * 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
SE0200943D0 (sv) 2002-03-25 2002-03-25 Amersham Biosciences Ab Mutant protein
US20050003548A1 (en) * 2002-07-22 2005-01-06 Nikolay Korokhov Targeted adenoviral vector displaying immunoglobulin-binding domain and uses thereof
ATE536186T1 (de) 2003-09-12 2011-12-15 Tercica Inc Verfahren zur behandlung von igf-1 (insulin-like growth factor 1)-mangel
WO2005033132A2 (en) 2003-10-03 2005-04-14 Genentech, Inc. Igf binding proteins
EP1732613A2 (en) 2004-04-06 2006-12-20 Affibody AB Use of serum albumin binding peptides conjugates for the preparation of a medicament
EP2465870A1 (en) 2005-11-07 2012-06-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
KR101434682B1 (ko) 2005-12-02 2014-08-27 제넨테크, 인크. 결합 폴리펩티드 및 이들의 용도
JP2008048607A (ja) 2006-08-22 2008-03-06 Chisso Corp Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途
GB2442118B (en) 2006-09-19 2011-08-17 Chisso Corp Process for production of recombinant proteins as a soluble form
EP2099932A4 (en) 2006-12-06 2009-11-18 Repligen Corp NUCLEIC ACIDS ENCODING THE RECOMBINANT PROTEIN A
US8198043B2 (en) 2006-12-08 2012-06-12 General Electric Company Two helix binders
US8592555B2 (en) 2008-08-11 2013-11-26 Emd Millipore Corporation Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
SG195555A1 (en) 2008-12-24 2013-12-30 Emd Millipore Corp Caustic stable chromatography ligands
EP2412809B1 (en) 2009-03-24 2017-08-09 Kaneka Corporation Protein having affinity for immunoglobulin, and immunoglobulin-binding affinity ligand
MX2011010159A (es) 2009-04-02 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla.
WO2011034605A2 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
CN107686513A (zh) * 2010-03-08 2018-02-13 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 免疫球蛋白G Fc区结合多肽
US10273270B2 (en) 2010-03-24 2019-04-30 Kaneka Corporation Protein capable of binding specifically to immunoglobulin, and immunoglobulin-binding affinity ligand
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
WO2011133886A2 (en) 2010-04-23 2011-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins
CA2808185A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Genentech, Inc. Antibodies to il-1.beta. and il-18, for treatment of disease
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
JP5974343B2 (ja) 2010-12-20 2016-08-23 ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
EP2654915B1 (en) 2010-12-20 2018-10-24 GE Healthcare BioProcess R&D AB Affinity chromatography matrix
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
US10689447B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
BR112013019499B1 (pt) 2011-02-04 2023-01-10 Genentech, Inc. Proteína heteromultimérica variante ou anticorpo igg modificado, método para produzir uma proteína heteromultimérica variante ou anticorpo igg modificado, composição, método para preparar uma proteína heteromultimérica e proteína heteromultimérica variante
KR20140007394A (ko) 2011-03-25 2014-01-17 가부시키가이샤 가네카 면역 글로불린 결합성 신규 폴리펩티드
SG10201604559TA (en) 2011-06-08 2016-07-28 Emd Millipore Corp Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands
KR102106002B1 (ko) 2011-10-11 2020-05-07 제넨테크, 인크. 이중특이적 항체의 개선된 어셈블리
RU2644341C2 (ru) 2012-02-10 2018-02-08 Дженентек, Инк. Одноцепочечные антитела и другие гетеромультимеры
JP6420756B2 (ja) * 2012-03-28 2018-11-07 ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
EP2867253B1 (en) 2012-06-27 2016-09-14 F. Hoffmann-La Roche AG Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
CA2871882A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
JP6544808B2 (ja) 2013-07-10 2019-07-17 ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 突然変異免疫グロブリン結合ポリペプチド
ES2955736T3 (es) 2014-05-06 2023-12-05 Hoffmann La Roche Producción de proteínas heteromultiméricas usando células de mamífero
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
CN107001482B (zh) 2014-12-03 2021-06-15 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体
WO2016121701A1 (ja) 2015-01-26 2016-08-04 株式会社カネカ 免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質精製用アフィニティー分離マトリックス
JP6663360B2 (ja) 2015-01-26 2020-03-11 株式会社カネカ 変異型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド
JP6424101B2 (ja) * 2015-01-30 2018-11-14 Jnc株式会社 Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途
EP3255058B1 (en) 2015-02-05 2021-03-24 Mitsubishi Chemical Corporation Protein having affinity to immunoglobulin, and affinity separation medium and column for liquid chromatography using same
WO2017195638A1 (ja) 2016-05-09 2017-11-16 株式会社カネカ 抗体またはκ鎖可変領域含有抗体断片の精製方法
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
CN109311949B (zh) 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 储存分离基质的方法
US11753438B2 (en) 2016-05-11 2023-09-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix
ES2874974T3 (es) 2016-05-11 2021-11-05 Cytiva Bioprocess R & D Ab Matriz de separación
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
AU2018314651B2 (en) 2017-08-07 2022-12-15 Repligen Corporation Fc binding proteins with Cysteine in the C-terminal helical region
GB202018588D0 (en) 2020-11-26 2021-01-13 Cytiva Bioprocess R & D Ab Separation matrix
GB202113626D0 (en) 2021-09-24 2021-11-10 Cytiva Bioprocess R & D Ab FC binding polypeptides

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769326A (en) * 1980-02-29 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Expression linkers
SE8300693L (sv) * 1983-02-09 1984-08-10 Sven Lofdahl Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．４（１９８５）ｐ．１１５１−６２
ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２５９，Ｎｏ．３（１９８４）ｐ．１６９５−１７０２

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015046473A1 (ja) 2013-09-27 2015-04-02 株式会社カネカ アルカリ水溶液を用いた多孔質セルロースビーズの製造方法、リガンド固定化用担体および吸着体
EP3459631A1 (en) 2013-09-27 2019-03-27 Kaneka Corporation Process for producing porous cellulose beads using alkali aqueous solution and porous cellulose beads produced by this process

Also Published As

Publication number Publication date
DE3686646T2 (de) 1993-04-08
AU600244B2 (en) 1990-08-09
GR3006178T3 (ja) 1993-06-21
AU6633186A (en) 1987-06-18
JPS62190087A (ja) 1987-08-20
EP0230869A3 (en) 1988-08-03
DK600486A (da) 1987-06-14
DE3686646D1 (de) 1992-10-08
US5143844A (en) 1992-09-01
CA1311430C (en) 1992-12-15
ATE80180T1 (de) 1992-09-15
DK600486D0 (da) 1986-12-12
ES2046177T3 (es) 1994-02-01
EP0230869A2 (en) 1987-08-05
SE8505922D0 (sv) 1985-12-13
EP0230869B1 (en) 1992-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0811069B2 (ja) 蛋白質工学を用いるダウンストリ−ムプロセツシングを促進するためのＩｇＧ結合性蛋白質の構成
JP2694840B2 (ja) ポリペプチドを微生物により発現させる方法
JP3369168B2 (ja) 精製が向上される組換えポリペプチドの発現
KR100316347B1 (ko) 대장균엔테로톡신ⅱ신호펩티드의변형체와인체성장호르몬의융합단백질을발현하는재조합미생물및그를이용한인체성장호르몬의제조방법
JPH0657154B2 (ja) 所望のポリペプチドを発現させるためのクローニングビーイクル
JPH0612996B2 (ja) 部分的合成遺伝子の微生物学的発現法
JPS60500480A (ja) 蛋白質とポリペプチドを製造及び分離する方法
AU626521B2 (en) Production and purification of a protein fused to a binding protein
JPS62500700A (ja) ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造
Gallizia et al. Production of a Soluble and Functional Recombinant Streptavidin inEscherichia coli
GB2031434A (en) Synthesis of a eucaryotic protein by amicroorganism
JPS63502560A (ja) ストレプトアビジンをコ−ドするｄｎａ、該ｄｎａから産生されるストレプトアビジン、ストレプトアビジン中に存在するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、並びにその使用
Baty et al. Extracellular release of colicin A is non‐specific.
JPS62501538A (ja) ａｒａＢプロモーターを含有する複製可能な発現ビヒクル
JP2970811B2 (ja) 原核生物細胞中にポリペプチドを調製するための発現システム
DK175020B1 (da) Fremgangsåde til udtrykkelse og ekstracellulær udskillelse af proteiner i G(-)bakterie, rekombinant DNA-konstruktion og plasmidvektor kodende herfor, samt G(-)bakterie indeholdende disse
King et al. Isolation, expression, and characterization of fully functional nontoxic BiP/GRP78 mutants
Jansson et al. A dual-affinity gene fusion system to express small recombinant proteins in a soluble form: expression and characterization of protein A deletion mutants
WO1986003779A1 (en) Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms
JP2007501622A (ja) 組換えポリペプチドを精製するための方法
Koyama et al. A novel procedure for the preparation of biologically active recombinant peptides using a cyanylation reaction
CN112689674B (zh) 葡聚糖亲和性标签及其应用
KR840002107B1 (ko) 재조합 미생물 클로닝 베히클로부터 폴리펩티드를 제조하는 방법
KR840002091B1 (ko) 폴리펩티드의 미생물 발현을 위해 암호화된 구조 유전자의 제조방법
KR840002106B1 (ko) 세균숙주의 형질전환에 적합한 재조합 클로닝 베히클의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term