JPS60500480A

JPS60500480A - 蛋白質とポリペプチドを製造及び分離する方法

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Publication number: JPS60500480A
Application number: JP59500885A
Authority: JP
Inventors: レフダール、スヴエン; ウーレン、マチアス; リンドベルグ、マーチン; スジエクイスト、ジヨーン
Original assignee: フア−マシア、エイ．ビイ−．
Priority date: 1983-02-09
Filing date: 1984-02-09
Publication date: 1985-04-11
Anticipated expiration: 2009-05-11
Also published as: JPH0634742B2; SE8300693L; DE3473298D1; EP0135532B1; US5100788A; JPH07265078A; SE8300693D0; WO1984003103A1; EP0135532A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】蛋白質とポリペプチドを製造及び分離する方法並びにそのための組換えベクタ一本発明は組換えＬ）　Ｎ　Ａ技術を用いて高純度の蛋白質とポリペプチド生成物を製造する方法に関し、さらに詳しくは組換えＤＮＡ技術を応用して目的とする蛋白質やポリペプチドを含んだ新規なジーン（遺伝子）生成物を得ること、そしてこの新規な遺伝子生成物は精製が容易で、所望の蛋白質やポリペプチドに変換することを内容とするものである。本発明はこのような遺伝子生成物をも目的とするものである。

最近の組換えＤＮＡ技術、あるいは、いわゆる遺伝子工学の技術によると、各種の生物起源から得られたＤＮＡ断片から新らしい構造をもった新規な組換えＤＮＡを組み立て、これを原始根または成熟（真）核の宿主細胞に導入してそれぞれ対応する蛋白質、ポリペプチドを生産できるようになっているが、これらの技術のお蔭でこれまでは天然からかなり高いコストでしか得られなかった数多くの蛋白質が生産できるようになった。これらの例としてよく知られているのはインシュリンや生長ホルモンのソマトスタチンである。このようにして宿主（ホスト）細胞から産生される蛋白質はその細胞内にとどまったままであるか、あるいは周囲の生育媒体中へと分泌されてくる。前者の場合には目的とする蛋白質の抽出のために細胞を破壊しなくてはならないが、後者の場合は生育媒体から分離することが可能である。しかし、後者のように蛋白質が分泌されてくる場合でも、その分離源には色色な物質が含まれておりかなり複雑な構成となっているため、効率のよい分離技術を用いても、目的とする蛋白質の純度も収率も低くならざるをえない。

本発明は、上述のような問題の解決を目的として、組換えＤＮＡ技術を基礎とする方法を用い、所望の蛋白質、ポリペプチドを極めて高純度に製造するものである。本発明ではスタフィロコッカスから得たプロティンＡが独特な結合能をもつことを利用し、これに後述の遺伝子融合技術をうまく結びつけて、目的を達成している。

このプロティンＡはバクテリアの黄色ブドウ状球菌（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃＬＬｓ　ａｔｙｇｗｓ　；以後５．　ａｕ、ｒｅｕｓと略記する）の細胞壁の成分として知られ、唾乳類の免疫グロブリンと特異的な血清反応を示すという特徴を有する。しかし、この蛋白質は普通の抗原−抗体反応とは対照的に、ヒト免疫グロブリンのＧ型またはＩ、Ｇ型（ただしＩ、Ｇ３は除く）のすべてのサブクラスのＦｃ一部と結合しなからＦａ　ｂ一部は遊離させて抗原やハプテンとカップリング（結合）させるという性質をもっている。

このような性質をもっているためにプロティンＡは定量的−１定性的な免疫化学技術に広く用いられている。

担体と共有結合したプロティンＡは、従ってＩ、Ｇ分離のためのすぐれた免疫吸収体である。プロティンＡの正確な構造はその由来によって変動する。その分子量は約４２０００で、よく伸長した形状を呈している。分子のＮ末端には極めて相同性（均質性）の高いＩ、Ｇ−結合単位が４ケないし５ケ存在するが、Ｃ末端にはＦｃ結合能が欠けている。以下の説明ならびに請求の範囲において用いられる１プロテインＡ”なる用語は上記のスタフィロコッカス蛋白質に限定されるものではなく、スタフィロコッカス、例えば天然のＳ、αｕｒεｕｓ　ｈよびそのミュータントによって産生させるプロティンＡに類似した免疫学的、生物学的活性をもつ巨大分子はすべて包含するものである。同様にして、“プロティンＡの活性フラグメント”丁たしま“プロティンＡの活性誘導体″なる用語は、プロティンＡの他、免疫反応性の巨大分子オリゴマーまたはその活性フラグメント、または少くとも１ケの免疫グロブリンの特定領域と結合できる巨大分子のそれぞれのポリペプチドフラグメントまたは誘導体を包含するものである。

その開示内容を本願の参照例として挙げた本出願人の国際出願ＰＣＴｌＳＥ　８３１００２９７　（スウェーデン特許出願４８２０４８１０−９　）には、スタフィロコッカスプロティンＡをコードする遺伝子の抽出とその特性、ならびにでのその発現についての説明がある。このスタフィロコッカスプロティンＡの遺伝子を有するプラスミドで形質転換（トランスホーム）されたム’、ｃｏ！、Ｌ　株はドイツ微生物収集所（Ｄｅｕｔ３ｃｈｅ　Ｓａｍｍｌａｎｇυｏｎ、　Ｍｉｋｒｏｏｒｌａｎｉｙｍａｒｂ（Ｄ　Ｓ　Ｍ　）　、　Ｇ６ｔｔｉｒＬｇｅｒＬ、西ドイツ）に１９８２年７月１２日付、寄託番号Ｄ　Ｓ　Ｍ　２４３４で寄託された。例えばこのプロティンＡ遣云子含有プラスミドを用いることにより本発明の目的に使用する遺伝（子）材料を取得する。

以下の説明と請求の範囲で用いられる遺伝子工学に関する特殊用語は、当業者にはよく知られそのまま受け入れられるものである。しかし、その選定用語の定義については、例えば上記の国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ　８３１００２９７を参照することができる。

遺伝子慶合の手法は２ケまたはそれ以上の遺伝子のコード・シーケンス（配列）を互いに接合させて、適当な宿主（微生物）体中で発現させるときに融合生成物（それぞれの遺伝子によってコードされるそれぞれ別個の蛋白質ヤボリペプチドが単一の分子に融合された形のもの）を産生ずるような１ケの結合遺伝子を形成させる方法である。このような遺伝子融合技術は重要度をまし１色々な生物学的課題例えば蛋白質トランスボート機構、プラスミド・レプリヶーション、遺伝子発現の研究に用いられている。

この種の用法は、酵素β−ガラクトシダーゼをコードするＥ、　ｃｏｌｉ　Ｌα ＣＺ遺伝子について特によく研究されてきている。

本発明では、プロティンＡまたはその活性ポリペプチドフラグメントをコードする第１　ＤＮＡ配列と、目的とする蛋白質またはポリペプチドをコードする第２ＤＮＡ配列とを結合させて、該蛋白質またはポリペプチドおよびプロティンＡ成分とからなる融合生成物を発現することのできる機能的遺伝子を形成させるために、遺伝子融合の手法が用いられる。プロティンＡの部分がＩ、Ｇとの結合力をもっているために、得られる蛋白質またはポリペプチドは、適当なキャリアーで固定化されたＩ、Ｇ型の免疫グロブリンを用いたアフィニティー（親和）クロマトグラフィー法によって容易にかつ効率よく抽出単離することができる。このキャリアーに結合した融合生成物は例えば目的とする蛋白質が酵素のときはそのままで使用することができるし、またプロティンＡの部分を包含した総合体としてキャリアーから分離させることも、あるいは後述するような適当な反応剤を用いて所望の蛋白質あるいはそのホ゛リペプチド部のみを解裂（分断）して分離させることも可能である。

すなわち本発明の重要な目的の一つは、目的とする蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖（ＤＮＡ−配列）がプロティンＡまたはその活性ポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡ鎖（ＤＮＡ−配列）に有機的に連結し、その結果、これらのＤＮＡ鎖が一緒になって該蛋白質またはポリペプチドと該プロティンＡまたはその活性ポリペプチドフラグメントからなりＩ、Ｇ結合性の融合生成物をコードするような組換えＤＮＡ−クローニング−ビークルまたはベクターを提供することにある。

宿主（ホスト）となる微生物を形質転換（トランスホーム）（ベクターがバクテリオファージである場合も含める）させて該融合生成物を産生できるようにするために、このベクターには常法に従って結合融合生成物をコードするＤＮＡ配列に対するレプリコンやプロモーターを包含させる。後述する目的のために、該結合ＤＮＡ配列は、目的とする蛋白質とプロティンＡをそれぞれコードするＤＮＡ配列の間にある適当な分断部位をコードする配列を含めることにより、融合分子からプロティンＡ部分を上記のように切り去ることのできるようにすることができる。本発明に係る組換えベクターとその構築については後で詳細に説明する。

適合性の宿主微生物を該ベクターで形質転換して上記のような結合ＤＮＡ配列が発現できるようにし、この宿主微生物を栄養培地で培養すると、対応するＩ、Ｇ −結合性の融合蛋白質またはポリペプチドが得られる。不発明の目的からすると、バクテリア宿主としてエシェリキア（Ｅｓｃｈｔｒｉｃｈｉａ　）、バチ＃　、ｒ、　（Ｂａｃｉｌｌｗｓ　）、スタフィロ宿主、例えば酵母、かび、植物細胞培養物などもその範囲のものとして使用する。これらの宿主はよく知られた方法で形質転換させることができる。

宿主微生物の培養で生産される融合分子のプロティンＡ部がＩ、Ｇ−結合力をもっているために、該融合分子は適当なキャリアーで固定されたＩｐによって細胞培養物から極めて効率よく抽出される。融合生成物が周囲の媒体に分泌されてくるときは、キャリアーへの結合は培地から直接性なうことができる。これに対して融合生成物が細胞内部にとどまる場合には先ず細胞を破壊してから免疫吸着を行なうようにすればよい。細胞壁の破壊は通常の方法、例えば高圧処理、超音波処理、ホモジ坏−ション（均質化）、ガラス・ビードを用いた攪拌処理などで行なう。グラム陰性のバクテリアで見られるように生成物が２つの細胞膜の間にあるペリプラスト（外質）域にとり込まれる場合には、滲透圧ショックを用いて該生成物を＠温媒体中に遊離させることができる。Ｉ、Ｇを用いて融合生成物を抽出するに先立って培養細胞や生育培地を適宜処理することがあっても、それはもちろん本発明の範囲のこととして実施するものである。

固定化工程は、通常の方法として、Ｉ、Ｇ−カップリングキャリアーを適当な媒体中にスラリー化してバッチ法で行なうか、あるいは活性化したキャリアーの刀ラムを用いて行なうことができる。クロマトグラフィー用のＩ、Ｇ−カップリングキャリアー、例えばＩ、Ｇ−セファロース■（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　Ａ　Ｂ　、　ｘ　ウェーデン）が市販されているので、本発明の目的にはこれらが有利に使用できる。しかし、Ｉ、Ｇが充分にカップリングできるキャリアー材質ならば、いずれも本目的に使用可能である。この種の材質へのＩＧのカップリングと固定化はよく知られた方法であるから、詳細な説明は不要と考える。

１、Ｇ−キャリアーに結合した融合蛋白質またはポリペプチドを遊離または脱着（放出）させるには、従来法により、例えばグリシン緩衝液（ＰＨ３，０）を用いてｐＨを低下させる方法、高濃度の塩類（溶液）またはカオトロピック・イオンによる処理、あるいは可溶性のプロティンＡまたはＩＧまたはそれらの７ラグメントを過剰に使用？した競合俗離法でＩＧ−千ヤリアー吸着体から融合蛋白質またはポリペプチドを置換脱離させる方法などにより行なう。これらの脱着方法の選定は、目的とする蛋白質またはポリペプチドの特性にもとついて行ない、その必要とされる活性が失われたり、著しく減少することのないようにする。得られる溶離液から融合蛋白質またはポリペプチドは容易に抽出されるが、所望により、ざらに精製工程例えばグル濾過、イオン交換などに付することができる。

ここに得られる融合蛋白質またはポリペプチドの精製物は、後記のごとく価値ある生成物である。従って、本発明の別の目的は、適合性の宿主を上記ベクターにより形質転換し、栄養培地で培養してから、融合蛋白質またはポリペプチドをＩ、Ｇ−支持キャリアーに選択的に結合させることにより宿主培養物から抽出し、所望により該キャリヤーから該融合蛋白質またはポリペプチドを遊離させることを内容とする、高純度の融合蛋白質またはポリペプチド生成物の製造方法、ならびにそのような融合生成物の提供にある。

この種の融合生成物の用達として価値のあるのは、プロティンＡ部に融合した蛋白質が酵素の場合である。この場合、融合生成物のＩ、Ｇ−結合活性を利用してＩ、Ｇの結合を介してキャリアー材質に該酵素を固定化させる。

このような酵素系には色々と利点がある。プロティンＡ−１、Ｇカップリングを介して酵素がキャリアーに結合するので、すべての酵素分子がまったく同じようにしてキャリアーに結合し、最も高い活性が得られる。酵素活性が許容範囲以下のレベルまで低下したならば、例えばグリシン緩衝液による処理でｐＥを変化させてキャリアーから常法により酵素を脱離させてから、活性酵素を有する融合生成物をそれに結合させることにより酵素系の再生を容易に行なうことができる。

Ｉ、Ｇ−カップリング・キャリアーへの融合酵素の結合または吸着は適当に処理を受けた細胞または細胞培地から直接に行なうか、または別のＩ、Ｇ−カップリング吸着剤に吸着、脱着して精製された状態にしてから行ってもよい。

以上のような酵素の固定化はその酵素をコードするＤＮＡフラグメントが入手できるなら、すでに工業的に用いられている酵素系のみでなく、未だ市販されていない酵素系にも適用できる。このような酵素系の例としてはアミノ酸アシラーゼ、グルコースイソメラーゼ、ペニシリン−アミダーゼ、アスパルターゼ、フマラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。

融合蛋白質またはポリペプチドのＩ、Ｇ−結合能が好ましいものである場合には、ＥＬＩＳＡ　（酵素リンク・イミュノソルベント・アッセイ）としてよく知られている免疫−化学分析変法に用いられるプロティンＡ共役体（コンジュゲート）となる。このような共役体としてよく使用され、市販されているものの例としてはβ−ガラクトシダーゼとアルカリホスファターゼが挙げられる。この種の共役体を、例えばプロティンＡをそれぞれの酵素に化学的に結合させるという従来法に従って調製すると、これら二つの成分の一部のみしか相互に正しく結合しないので、得られる共役体温合物にはかなりの高い比率で不活性共役体もしくは低活性の共役体が含まれることになる。これに対して本発明で融合遣云子生成物の形で得られる共役体では、プロティンＡと酵素との間に正し℃・カンプリング関係があるので、常に最高の活性が保持される。

融合蛋白質またはホ゛リペプチドが利用できる別の場合としては、プロティンＡがプロティンＡ部に融合した目的の蛋白質またはポリペプチドを不活性にしたり、あるいはその使用において阻害的に作用しないことなどが考えられる。この場合には、それぞれの純粋な蛋白質またはポリペプチドに代ってこの融合生成物が使用でき、また以下に本発明のもう一つの目的として説明する通り、プロティンＡの切断は必ｇｈいのである。

融合蛋白質のある蛋白部分またはポリペプチドは条件によって切断されて、目的とする純粋な蛋白質またはポリペプチドが得られる。従って、適合性の宿主を上述のベクターで形質転換し、該宿主を栄養培地で培養し、この細胞培養物から該融合蛋白質またはポリペプチド全Ｉ、Ｇ−支持キ−１−ＩＪプアー選択的に結合させることにより抽出し、該キャリアー結合融合生成物から直接に、またはキャリアーから脱着させた後に、該融合蛋白質のプロティンＡ部から目的とする蛋白質またはポリペプチドを切断することにより高純度の目的蛋白質またはポリペプチドを製造する方法が本発明の一つの目的である。

融合蛋白質またはポリペプチドがこのように切断されるために必要な条件は、それらが適当な手段によって認識され切断され得る特有の分断部位を保有しているということである。このような分断部位は化学的方法または酵素的方法で認識される特異的アミノ酸配列であって、生産される融合生成物の所望の蛋白質またはポリペプチドとプロティンＡセクションの間に存在すればよい。この特異的アミノ酸配列は、融合生成物の目的とする蛋白質またはポリペプチドの内部に存在してはならないし、またプロティンＡ部内にもない方がよい。酵素剤の例としてはプロテアーゼ、例えばボラゲナーゼ〔アミノ酸鎖ＮＨ２−Ｐｒｏ　−Ｘ−Ｇｌｙ −Ｐｒｏ　−Ｃｏｏｎ　（Ｘは任意のアミノ酸残基、例えばロイシン残基を表わす）を認識できる〕、キモシン（レンニン）　（Ｎｅｔ　−Ｐｈｔ結合を切断する〕、力ＵフレインＢＣＸ−Ｐｈｅ−Ａｒｙ−ＹにおけるＡｒ？のカルボキシル側で切断する〕、エンテロキナーゼ（Ｘ　−ＣＡ’Ｐ）ｎ−Ｌ’／’−ＹＣｒＬ＝２〜４　）鎖を認識し、リジンのカルボキシル側で切断する〕、トロンビン〔特定のアルギニル結合を切断する〕が挙げられる。化学薬剤の例としては、臭化シアン（ＣＮＢｒ）（Ｎｅｔの後方を切断する〕、ヒドロキシルアミン（ＡｓｒＬ−’Ｚ　結合（Ｚはグリシン、ロイシンまたはアラニンである）を切断する〕、蟻酸〔高濃度（〜７０％）下でＡｓｐ　−Ｐｒｏ鎖を切断する〕が挙けられる。例えばホルモンのソマトスタチンのように目的とする蛋白質またはポリペプチドがメチオニン鎖をまったく含有しないときには、臭化シアンで選択的に切断できるメチオニン基が分断部位となる。プロテアーゼの認識スるセクションは融合蛋白質で立体的障害を受けるので、化学的分割薬剤を用いる方が好ましい場合がある。このような分断に感受性をもったペプチド・ユニットまたは残基をコードするＤＮＡ配列を融合蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡｇ中に導入する技術はよく知られているので、詳細な説明は省略する。目的とする蛋白質ではみられない特異的な切断配列がプロティンＡ分子で生ずるときには、このアミノ酸鎖は、プロティンＡ部の活性を変えることなく、既知の方法による特定の切断手段では認識も切断もされない配列に変換される。

既に述べた通り、切断はＩ、Ｇ−カップリングキャリアーに結合した融合生成物そのもの、またはそれから脱離したものについて行なうことができる。バッチ法は次のようにして行なわれる。融合蛋白質またはポリペプチドを結合したヤイリアー、例えば％Ｇ　−１フアロース■〔ファーマシア（ｐｈατｍａｃｉα）ＡＢ、スウエーテン〕を適当な媒質で洗ってから分割剤、例えばグロテアーゼまたは臭化シアンと一緒にインキュベイトする。

プロティンＡ残基を結合保持したキャリアーから分離すると、目的とする蛋白質またはポリペプチドおよび分解剤を含んだ溶液が得られるので、その溶液から目的とする蛋白質またはポリペプチドを抽出し、さらに所望によって常法、例えばゲル濾過、イオン交換などを利用して精製する。

キャリアーがカラム形式をとり、融合蛋白質またはポリペプチドがプロテアーゼ認識部位を有する場合には、次のようにして切断を行なう。融合蛋白質またはホ゛リヘブチドを結合保持したキャリアーのカラムを適当な媒質で洗滌してから、目的とする蛋白質またはポリペプチドに対しておだやかな試剤で溶離する。この種の試剤としては、蛋白質やポリペプチドの種類によって決められるものであるが、グリシン緩衝液のようなｐＨ低下剤やプロティンＡ溶液（＠合溶離）が挙げられる。純粋な融合蛋白質またはｇ　ＩＪペプチドと分割剤とを含有した溶離液は、固定化プロテアーゼ、例えば切断部位がコラゲナーゼ感受性配列のときはコラゲナーゼを含有した第２カラムに通す。カラム通過中に、融合蛋白質またはポリペプチドは切断されて目的とする蛋白質またはポリペプチドとプロティンＡ残基に分れる。得られる溶液は上記と同じかあるいは違ったＩ、Ｇカップリングカラムに通じて溶液中のプロティンＡ成分を吸着させると、通過液は目的とする蛋白質またはポリペプチドの純粋な溶液となる。脱着剤がプロティンＡ浴液の場合には、最終段階で吸着したプロティンＡは切断溶液中に溶出し、リサイクルされるので、このときの系はプロティンＡに対して再生糸となる。

このような本発明の手段を用いることにより、ごくわずかな工程で目的とする蛋白質またはポリペプチドが極めて高い純度かつ高収率で容易に得られる。このように高い純度で得られる。このように高い純度で得られる蛋白質やポリペプチドは、兎のような動物の免疫法により抗体を製造するのに非常に適したものである。いわゆるハイブリドーマ技術と結びつけてモノクローナル抗体を製造するのも一つの応用として考えられる。

本発明によって高純度に製造される蛋白質、ポリペプチドには、例えば、酵素として各種のオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ；ホルモンとしてバラサイロイドホルモン、生長ホルモン、ゴナドトロピン（ＦＳＨ。

黄体形成ホルモン、コリオノゴナドトロビン、グリコプロティン）、インシュリン、ＡＣＴＨ，ソマトスタチン、グロラクチン、ブラセンタルラクトジエン、メラノサイト刺戟ホルモン、チロトロピン（南中状１１９１　性ホ／ｌ／　モン）、上皮小体ホルモン、カル７トニン、エンケファリン、アンギオテンシン、その他の蛋白質として血清蛋白質、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、プロトロンビン、トロンボプラスチン、グロブリン例えばγ−グロブリン。

抗体、ヘパリン、凝固因子、コンブレメント・ファクター、プラズマ（血漿）蛋白質、万キシドシン、アルブミン、アクチン、ミオシン、ヘモグロビン、フェリチン（鉄量白質）、チトクローム、ミオグロビン、ラクトグロビン、ヒストン、アビジン、千ロクロプリン、インターフェロン、トランスコルチカル（皮質連結性）キニンなどが挙げられ、さらにワクチノ製造に用いら７するペプチド抗原がある。

以上の説明から判る通り、本発明の主要部は目的とする融合蛋白質またはホ゛リペプチドをコードする結合遺伝子を含み、宿主細胞を形質転換してそれを発現させ目的とする融合生成物を生国させることのできる組換えＤＮＡ（構造）またはベクターを提供することにある。

本発明はベクターがいかなる方法で得られたものであろうとも、すなわち使用する制限酵素による切断、連結（リゲート）、形質転換、よく知られたスクリーニング法、さらには適当なベクター材料、宿主微生物について、色々つくり方を変えて得られるすべてのベクターを包含するものである。目的とする蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ５を適当なベクターに挿入してから、次いでプロティンＡをコードするＤＮＡ＠を挿入してもよいし、それを逆ニしてもよい。

さらにこれらの二つのＤＮＡ鎖を同時にベクターに導入してもよい。それぞれのＤＮＡ鎖を１部分づつベクターに挿入することも可能である。この二つのＤＮＡ鎖は、結合遺伝子の５′−末端か先端（スタート）にプロティンＡをコードする鎖または目的とする蛋白質またはポリペプチドをコードする鎖を配列するようにして調製する。正しいリーディング・フレームを維持（そのための適当か制限部位を保持しつつ）しながら上記のような挿入、連結操作を行なう技術それ自体はよく知られた技術である。

プロティンＡもしくはその活性ポリペプチドをコードするためのＤＮＡ＠のオリジンの構造はどのようなものでも、それから対応する遺伝子あるいはＤＮＡセグメントが（例えばプロティンＡ遺伝子含有プラスミドのように）得られるものならばよい。適当なオリジンとしては、例えば本出願人の国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ　８３１００２９７（スウェーデン特許願Ａ３２０４８１０−９　）に記載されているプロティンＡ遺伝子含有プラスミドｐ　ＳＰＡ　ｌ　、　ｐｓＰＡ３゜ＰＳＰＡ５のいずれかを使用すればよい。遺伝子に近接した適当な制限部位をそれに対応した適当な制限酵素で切断することにより、これらのベクターからプロティンＡ遺伝子の全体もしくはその適当部分を切りとることができる。融合生成物をコードする結合遺伝子に包含させなければならないプロティンＡ遺伝子の範囲については、融合生成物にＩ、Ｇ−結合能を付与できる範囲でなければならない。すなわちプロティンＡ分子の中のＩ、Ｇ−結合部分をコードする遺伝子セグメントの少くとも主要部が必要であることを示している。しかし、以下に述べる実験の部からみても明らかなごとく、場合によってはこの分子の非１．Ｇ−結合部分をコードする遺伝子セグメントの少くとも一部分を包含させる方が好ましいことがある。

分子のこの部分は融合生成物のＩ、Ｇ−活性部分と目的とする蛋白質部分の間のスペーサーとしての役目をするも目的とする蛋白質あるいはポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖のオリジンは原始核細胞、成熟核細胞のいずれでもよく、やはり対応する遺伝子または遺伝子セグメントが得られる構造のものならどのようなものでもよい。

そのような遺伝子や遺伝子セグメントを含むプラスミドがオリジンとして適している。このようなプラスミドについて、目的とする活性をもった蛋白質またはポリペプチドの対応部分を充分にコードできる遺伝子部分を切りとるには、その遺伝子に近接した位置にうまく存在する制限部位に対応した制限酵素を用いて切断するようにする。

本発明の組換えベクターのベクタ一部分のオリジンとしてはプラスミドが用いられるがビールスやファージなどでもよい。このベクターの選定は形質転換される宿主微生物によって適宜性なわれる。既に述べた通り、後者の宿主微生物としてはバクテリア、かび、植物、藻類が挙げられる。しかし最も好ましいのはバクテリアで、形質転換に感受性の高いのはＥ、　ｃｏｌｔ　、サルモネラ（５ａｔｍｏｎｔ伍紐）のようなＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｔｒｉａｃｔａｅ　（腸内細菌）　、１３ａｃｉｌｔａｓｓｗｂｔｉｌｉｓ　のようなりａｃｉｌＬａｃｅａｅ、　（バチルス科細菌）、などである。

本発明の組換えＤＮＡベクターの構築にあたっては、先ず、グロティ／Ａまたはその活性ポリペプチドフラグメントをコードする機能的ＤＮＡ配列と、このプロティンＡをコードする遺伝子の末端もしくはその近傍に少くとも一ケの特異的制限部位を有する表現体（ｇｘｐｒｇｓｓｉｏル）もしくは融合ベクターをつくるようにする。このような融合ベクターの構築には、前述の通りプロティンＡをコードする遺伝子の全部もしくは必要充分なる部分を含む適当なベクター、例えばプラスミドベクターの調製が必要である。次に特異的制限部位（サイト）、好ましくはいくつかの制限部位（サイト）をもったプルチリ／カーをプロティンＡ遺伝子のＩ、Ｇ−結合領域の後方でストップコドンの前方の位置に挿入する。この挿入操作は後に述べる実験の部から明らかな通り、枚数のステップ、プラスミドによって行なわれる。このようにして得られた融合ベクターは次に、目的とする蛋白質もしくはポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖への挿入に使用される。この融合ベクターも本発明の対象の一つである。

目的とする蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖を融合ベクターに挿入するには、プラスミドの一部分として供給するのがよい。融合ベクターを一つの特異的制限部位で切ったとき得られる切断部に相補末端を付与できるような適当な制限部位が遺伝子に存在しないときは、常法によってそのような部位を挿入する。これらは、中間にストップ・コド／がないときはできるだけ上流の離れたところに、すなわち遺伝子の５′−末端に近いところまたはスタート・コド／の前に挿入するようにする。

融合ベクターと、所望の遺伝子を含むプラスミドを適当な制限部位で解裂切断し、混合物をリゲートすれば結合遺伝子を含んだ組換えベクターが得られる。目的とする蛋白質をコードする遺伝子を切りとり、それをプラスミドに挿入するのが好ましいが、プラスミドを遺伝子のスタート部分だけで切断し、二つのプラスミドを結合してもよい。これらの方法はあくまで一つの例にすぎず、これには多くの変法が可能である。

融合蛋白質またはポリペプチド（それらからプロティンＡ部分を切りとることができる）全コードする組換えベクターをつくるために、プロテアーゼまたはペプチド切断化学薬剤によって認識されるオリゴペプチドをコードする合成銀を二つの融合遺伝子または′Ｍ伝子セグメントの間に挿入してもよい。この挿入も常法によって行なうことができる。その場合、融合蛋白質またはポリペプチドは（しかし少くとも目的とする蛋白質はのぞく）プロテアーゼや化学薬剤で切断されるような別のペプチド鎖を含まないことが条件であることはもちろんである。

バチ／ｌ／／１．−サブチリ／＜　（Ｊ３ｃＬｃｉｌｌｔＬｓ　ｒａｈｔｉｌｉｓ　）やスタフィロコッカス種のようなグラム陽性バクテリアを組換エヘクターで形質転換する場合には、プロティンＡ遺伝子の対照（ｃｏｒＬｔｒｏｌ　）領域（ブロモ−ターとりボゾームようなオリジンから得た対照領域を挿入するのがよい。

プロティンＡ遺伝子の対照領域がグラム陰性バクテリア中でよく作用することの他に、単一膜を有するこれらの宿主は、別の観点、すなわちプロティンＡ遺伝子のシグナル配列によってコードされるシグナル・ペプチドが融合蛋白質やポリペプチドを周囲媒体中に分泌させるようにするということからみても有効である。

ｌ：、　ｃｏＬｉのようなグラム陰性バクテリアでは、融合生成物が二つの細胞膜の間にとり込まれる。生成物が分泌してくることは、生成物の回収のために細胞を破壊する必要がなく、生成物が分離しやすく、媒体から融合蛋白質またはポリペプチドが直接吸着できることになり有利である。

遺伝子１）ＮＡ技術でＥ、　ｃｏＬｉ中で産生された外来蛋白質は酵素的に蛋白分解作用を受けやすいことが知られている。この種の分解作用は温度感受性のレプレッサー（高温で非活性になる）を使用することで最小に抑えることができる。これによって、培養中でこの遺伝子がスイッチオンされており、細胞回収の直前でスイッチオ／されるようにすることができる。このような温度感受性のレプレッサーをコードするＤＮＡ鎖は常法によって本発明の組換えベクターに挿入する。

次に、本発明を添付図面を参照しつつ、さらに詳細にしかし非限定的に説明する。これから示す特許およびその他の文献における開示は本願の引例としてここに使用する。

添付図面において、第１図はプロティンＡをコードするプラスミドＤＮＡＣｐＳＰＡｌ）の環状制限地図を示す図である。地図の大きさは１２分角のＥｃｏＲＩ　制限部位（ベクターｐＢＲ３２２内の制限位置）をスタートとしてキロベースで表現されされたＤＮＡとの接合点は矢印で示した。

第２Ａ図は各種の領域をもつプロティンＡコード遺伝子を示す図である。太線はベクターｐＢＲ３２２のＤＮＡを示す。Ｓはシグナル配列を、Ａ−Ｄは予め同定されたＩ、Ｇ−結合領域を、ＥはＡ−Ｄに殆んど相同の領域を、Ｘは１、Ｇ結合能を欠いたプロティンＡのＣ゛−末端部を示している。

第２Ｂ図は、第２Ａ図に対応したＤＮＡ−鎖の詳細なロベースで表現されている。ベクターｐＢＲ３２２と挿入されたＤＮＡフラグメ／トとの間の接合点は矢印をもって示した。ベクター鎖にあるＴａｑ　［（２ケ）と５（ＬＬ３ＡＣ１ケ）の制限部位は省略した。

第３Ａ図は５Ｂｗ　３　Ａ制限部位（第２Ｂ図、１．８ｋｈの位置）と１仔制限部位（図２Ｂ、２．１ｋｂの位置）の附近における塩基配列を示す。この塩基配列から推論されたアミノ酸配列も同時に示しである（アミノ酸の略号はＩＵＰＡＣアミノ酸略号によった：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｔｍ、２４゜５２７および２４９＋　（＋９６６　）　）。

第４図はプロティンＡ遺伝子の全部または一部を含んだプラスミドの構築を示す図であり、制限部位のいくつかを表示した。囲いは構造遺伝子を矢印はオリエンテーション（配向）（スタート・コドンからストップ・コドンに向って）を示している。レプリグーショ／・オリジンをＯｒｉで示した。Ａ　ＭＰとＴＥＴはそれぞれアンピシリン耐性、テトフサイクリ／耐性をコードする遺伝子である。ＰＲＯＴ　ＡはプロティンＡをコードする遺伝子・Ｌａｃ　Ｚ’はβ−ガラクトシダーゼのＮ−末端（ＲＬＩｔｈｅｒ　ｔｔａｌ　。

Ｎａｃｌ、　Ａｃ１ｄ、ｓ　Ｒｔｓ、　９．４０８７−４０９８　（１９８１）　ｋコ）’する遺伝子である。

第５Ａ及び５Ｂ図は、２つの融合ベクタープラスミドの地図を示す。略号は第４図と同じ意味を表わしている。

Ｍ１３マルチリ／カーは２つのプラスミドでそれぞれ違った位置で、プロティンＡコード遺伝子に挿入されている。それぞれのプラスミド地図の上方にはヌクレオチット鎖とこの領域における誘導アミノ酸配列を示した。第５Ａ図は、プラスミドｐｓＰＡ１（を、第５Ｂ図はプラスミドｐｓＰＡＩ２を示す。

第６Ａ及び６Ｂ図は、相互に融合したプロティンＡをコードする遺伝子とβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子とを含有する２つのプラスミドを示す。第４図と同じ略号を使用。ＬＡＣＺはβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子全体（５′−末端の数ケのヌクレオチットは除いて）を示す。第６Ａ図はプラスミドｐｓＰＡ　ｌ　３を、第６Ｂ図はプラスミドｐｓＰＡ１４を示す。

第７図（ＣとＤ）ｋま、第６Ａ及び６Ｂ図におけるプラスミドの融合したプロティンＡ遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子全示す。図ＡとＢはそれぞれ第２Ａ図及びＭ２Ｒ図の制限地図に対応したプロティンＡ遺伝子とその配列を示す。大きさはｌ’ａｑ　１部位をスタートとしてベース対で表現。（ヌクレオチット３５５と１５７２　における２つのＢｃ１部位は５ａｕ　３−４部位でもある）第８図は、プラスミドｐＳＰＡ　ｌ　３の融合点（第６Ａ図）附近のヌクレオチット鎖を示す。制限部位とそれに対応した誘導アミノ酸配列を表示した。鎖の各部分のオリジンも示した。第８Ｂ図は、プラスばトｐｓＰＡＩ４の融合点（第６Ｂ図）附近におけるヌクレオチット鎖を示す。

第９図は、合成オリゴヌクレオチットのヌクレオチット鎖と突然変異（ムタゲネシス）発生点での対応のファージ”Ｐ　９／ｌ　ＧＦ−１の配列を示している。

−げ印は非相補性の塩基対を示す。突然変異後の推論アミノ酸配列も同時に示した。

第１０図は、ＩＦＧ−ｌとプロティンＡ遺伝子を含むシャトル・ベクターの構築を示す図であり、制限部位のいくつかを示した。囲いは構造遺伝子を、矢印はオリエ／テーショ／（スタート・コド／からストップ・コドンに向っての）を示す。レプリケーション・オリジンは０ＲＩ−Ｅ（Ｅ、ｃｏム）とＯＲＩ　−Ｓ　（Ｓ、　αＩＬｒｔｗ　）で表わした。ＡＭＰ　、ＴＥＴ　、ＣＭＬはそれぞれアンビシリン耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性を表わす。

ＰＲＯＴ　ＡはプロティンＡをコードする遺伝子を、ＩＧＦ−（は修正ヒトイ／シュリ／様生長ファクター（１型）をコードする遺伝子を表わす。

第１１図は、プラスミドｐＵＮ２０１において融合したプロティンＡ遺伝子とＩＧＦ−１との遺伝子融合のヌクレオチットとそれより誘導されたアミノ酸配列を示す。

成熟プロティンＡをコードするＤＮＡ−鎖（シグナルペプチドをコードする領域を欠如）のみを示した。蟻酸処理で起ると考えられるアミノ酸の切断点（Ａｓｐ　−Ｐｒｏ　）に下線を付した。ＥｃｏＲ■とＢｉｎｄ、Ｈの切断部位を示したが、この部位は合成ＩＦＧ−ｌ　（修正）遺伝子終点を表わす。

第１２図は、プラスミドｐ　Ｕ　Ｎ　２０２のプロティンＡ遺伝子の３′−末端附近のヌクレオチット鎖とそれに対応じて推論したアミノ酸配列を示す。

第１３，４図は、２つのＤＮＡストランドで複数のオリゴマーに分けられたＩＧＦ−１とフランキング配列を示している。この配列はスタート・コドン（ブロックＡ２のＡＴＧ）、ストップ・コドン（ブロック、４１７のＴＡＧ）、Ｅｃｏ　ＲＩ　の認識配列（ブロックＡＩ）とＨｉミルＬｉ（ブロックＡ１７）をもつ。

第１３Ｂ図は、ＩＧＦ−１遺伝子のリゲーションパターンを示す。

以下の実施例における出発材料、緩衝液、細胞培地、方法手順は、以下のとおりである。

Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、人し４５９−４７２　Ｃ１９６９）に記載〕；Ｘ　Ａ　ＣＬａｃ　（Ｍｉｌｌｅｒら、　／、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、　１０９．２７５〜３０１　（１’？７７　））　：ＲＲＩ　ｔｅｌ　Ｍ　１５　（Ｌａｎｇｇｙら、　ｐｒｏｃ。

Ｊ、　ＧｅｒＬ、Ｍｉｃｒｏｈｉｏｔ、　９’６．２７７−２８１　（１９７６）　）　も使用。

これらの菌株はスウェーデン国つプサラの生体医学センター、微生物学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＭｉｃｒｏｂｉｏＬｏｇｙ　（Ａ’　）。

Ｂｉｏｍｅｄ、１ｃａＬ　Ｃｅｎｔｒｅ　、　Ｕｐｐｚａｌａ　、　Ｓｗｇｄ、ｅｎ　）　で入手できる。

クローニング・ビークル実施例で使用したクローニング・ビークルは次の通り＋１３　（＋９７７　）　）　。

（２）　ＰＵＲ２２２（Ｒｕｔｈｅｒがつくり報告、　）ｈｂｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｔｓ、。

９　、４０８７−４０９８　（＋９８１　））　。

（３）　ＰＴＲ２６２〔Ｒｏｂｅｒｔｓ　、　Ｔ、Ｍ、らがつくり報告、　Ｇｇｎｇｌ　２　、１２３−１２７　（１９８０））　。

（４）　ＰＵＣ８（Ｖｉ　ｅｒａおよびｉｅｚｙｉｇがつくり報告、　ＧａｒＬｇｌ　ＣＩ　、　２５９−２６８　（１９８２））　。

（５）　ＰＨＶ　ｌ　４ＣＥｈｒｌｉｃｈ　、　Ｓ、Ｄ、がっくり報告、　ｐｒｏｃ。

Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７０　、３２４０−３２４４　（１９７８）　）。

（６）　ｐｓＫｓ　１０４とＰＳＫＳ　１０６　（Ｃａ５ＬＬｃｔａｂａｎ　、　Ｍ、Ｊ、、Ｍａｒｔｉｙｓ−Ａｒ１ｏＬｓ　、　Ａ、、　５ｈａｐｉｒｏ　、　Ｆ、、およびＣｈｏｗ　、　Ｊ、がっくり報告、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｔｏｇｙ　、１００　＋　Ｐ、　２９３−３０８　（１９８３）　）　。

（７）　スタフィロコッカスのプロティンＡをコードする遺伝子を含んだプラスミドｐｓＰＡ　ｌ　、　ｐｓＰＡ　３　、　ｐｓＰＡ　５　。

ｐｓＰＡ　＋　６　（国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ　８３１００２’？７　（スウエーデン特許出願４８２０４Ｂ１０−９）を参照〕プラスばドｐｓＰＡＩを含むＥ、　ｃｏｌｊ　２５９株、プラスミドｐｓＰＡ１６を含むＳ、ｘｙｔｏｓｔｂｚＫＬ　１１７株の培養体はドイツ微生物収集所（Ｄｅｕ、ｔｓｃｈ　ＳｃＬｍｍＬｗｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＥＮ）、ゲッチンゲン、西ドイツ）に寄託（前者は１９ｇ２年７月１２日に寄託番号ＤＳＭ２４３４、後者は１９８３年８月１５日に寄託番号Ｄ　Ｓ　Ｍ　２７０６をモッテ）された。

（８）　ファージ・ベクターＭ　Ｉ　３　ｍｐ　８およびｒｎｐ　ｑ　ＲＦ　ＩＤ　Ａ’　Ａ　（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｒＬｃＬ　Ｂｉｏｌａｂｚ　、　Ｂｇｖｇｒｌｙ　、　ＭＡ　、　ＵＳＡより供給（カタログ４４０８　、４０９　）　）。

緩衝液と培地トリス−ＥＤＴＡ緩衝液　：　０．００１　＃　ｐ：ｎｒ、＜　２　ヨヒｏ、ｏ１ｙｘｃｔ、ｏ、２ｍｔ　ｒｖＥＥａ　２０．　ｈ　ヨｒｙ：０．２　？　ｋＮ３；蒸溜水ｘでｌ　ｌニーｊる（　ｐＨ−７，４）ジェタノールアミン緩衝液１０％　：９７ｍ１ジエタノールアミン、　ｇｏ。

−蒸溜水、０．２ｆＮＬＬＮ、および１１００ｔｒｑ？ｃ１２・６Ｈ，０；　＋ＭＨｃｔにてｐＨを９，８に調整、蒸溜水にて１１Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物、０．５　？ＮαＣノ、２　ｆｎｔｌ　Ｍ　ＮａＯＨ；　ｌ　Ｍ　ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整、オートクレーブにかけてから２０％グルコース１〇 −を添加。

アガーを追加Ｍホウ酸および０．００２ＭＥＤＴＡ。

２ｍＭの０−ニトロフェニル− β−Ｄ−ガラクトジッド（ＯＮＰＧ。

５ｍｇｍａ製品屋Ｎ　−１１２７＞、ＰＨ−７−３０，１Ｍ２−メルカプトエタノ− ルと１ｍ　Ｍ　Ｍ？Ｃ１ｘを含有。

ロモー４−クロロー３−インドリルーβ−Ｄ−ガラクトジッド（Ｘｒ＋αりを追加。

ＡＸＩ：　ＬＡ−培地に５０１１のエンドシリ／、４０１１の５−ブロモー４−クロロ−３−インドリル一β−Ｄ−ガラクトジッド（Ｘｇαｌ）と０．１ｒｎＭのイソプロピル−β −Ｄ−チオガラクトジッド（ＩＰＴＧ）を追加。

方　法　手　順手法によっては実施例の中でくり返して行なわれるものもある。特にことわらないかぎり、これらの手法は毎回次に述べる通りに行なわれる。

トランスフォーメーション（形質転換）プラスミドＤＮＡを用いてのＥ、　ｃｏｌｉＫ　ｌ　２の形質転換はモリソｙ　、　Ｄ、Ａ、、によって報告（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ７Ｌｚｙ−ｍｏＬｏｌｙ　、　Ａｃａｄ、ｔｍｉｃ　Ｐτａｓｓ旦、　３２６〜３３１　（＋９７９　＞　）された方法に従って正確に行った。形質転換された細胞は適当な抗生物質を含有した（すなわち３５μＳ’／ｍのアンピシリンまたは２５μ？鷹のクロラムフェニコール）ＬＡプレートに単一コロニーを植菌し、常法に従って選スケールの大きいプラスミドの調製法としては、Ｔα−α。

３５４〜３６２　（＋９７５　）　）の方法に正確に単投した。多数のプラスミドのコロニーはＢ＊ｒｒＬｂｏｉｒｎ　、　Ｈ，ＣとＤｏｌｙ、Ｊ、、の報告（ＨＬＬＣｔ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｔｚ、　７　、１５１３−１５２３（１９７９）　）　シた通りに゛ミニ・アルカリ法”によって数えた。

ゲル溶離ＤＮＡ７ラグメ７）はＭｔｚｘａｍ他の報告〔Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ。

７４　、５６０−５６４　（＋９７７　）　）に従ってポリアクリルアミドまたはアガロース・ゲル・ピースから溶離した。

ＤＮＡ鎖の決定ＤＮＡフラグメントの５′−末端をラベルし、そのＤＮＡ鎖配列はＭａｘａｍ他の報告（上記）に従って決定した。エンドヌクレアーゼによるＤＮＡフラグメントの５′−末端はＴ４ポリヌクレ万チット・キナーゼ（Ｂｏｔｈｒ器ｒＬｇｅｒ　。

Ｍａｒ、ｒＬｈｔｉｍ　、西ドイツ）を用いて（７−Ｐ）ＡＴ　Ｐ　（ＮｅｖｕＥｎｌｌａｎｔＬ　＃ｂｃＬｅａｒ　、　ＵＳＡ　：　２７００　ＣＬ／ｍｍ０１　）　でラベルした。

制限酵素によるＤＮＡの消化（ダイジエスチオン）−Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ、　Ｂｔｏｌ、ａｂｓ　−−Ｂｔｖｅｒｌｙ　ＭＡ　、　ＵＳＡの販売する通常の制限酵素を用いてＤＮＡを切断した。制限酵素は通常の濃度、温度でＤＮＡに加え、緩衝液はＮｅｗ　Ｅｎｇ−ＬａｒＬｄ　ＢｉｏＬａｒの推しようするものに従った。

ＤＮＡフラグメントの連結（リゲイション）ＤＮＡフラグメントの連結はすべて −Ｎｅｗ　ＥｒｂｇｔａｎｄＢｉｏＬａｂｓ　’　、　Ｂｔｖｇｒｌｙ　ＨＡ　、ＵＳＡの販売するＴ４ＤＮＡリガーゼを用い、同販売者のすすめる緩衝液中で１４℃、−夜かけて行なった。

に従かい０．７％アガロースゲル電気泳動でプラスミド切断フラグメント、スーパーコイル（超らせん）プラスミド、長さ１０００〜＋００００　ヌクレオチットのＤＮＡフラグメントの分離を行なった。

に従って８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で長さ１００〜４０００　ヌクレオチットのＤＮＡフラグメントの分離を行なった。

プロティンＡの検出用の細胞溶解物の調製３５μｍ鷹のアンピシリンを加えたルリアーブイヨン（ＬＢ）５０ｄ中、３７℃でＥ、　ｃｏｔｉクローンを一夜増殖すセタ。遠心分離後、細胞をＴｒＬｓ　−ＥＤＴＡ（０，０５Ｍ−ｐＥ　８．５　、０．０５　Ｍ　）　５−に再懸濁し、遠心分離した。この細胞を同じ緩衝液５ｍｌに再懸濁しこれにリゾチームを加え、その濃度を２４譬とした。３７℃で１時間経過後、溶解物を５ｏｒｖａｌｌ　５５−３４　０−ターを用い１５０００　ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄液を集めてプロティンＡの検定を行なった。

生成したプロティンＡの検定と定量にはＥＬＩＳＡテスト（酵素−リンク　イミュノソルペント　アッセイ）を用いた。ネット・チャージ（中性）がなく、その壁部がヒトＩｙＧ　（Ｋａｈｔ　、スウェーデン）で被覆された特殊なミクロタイター・プレート（Ｔｉｔｔｒｔｔｋ　、　Ａｍ５ｔｅｌｓｔｔｔｄ　、　７１ −ランダ）を用いた。試料を加えてプロティンＡをＩ、Ｇ−分子のＦｃ一部分に結合させる。プロティンＡに連結したアルカリホスファターゼを加えることにより残存する遊離Ｆｃ一部位を滴定する。壁部を洗滌してから、アルカリホスファターゼ用の基質としてＰ−ニトロフェニル−ホスフェートを加える。

検　定コーティング緩衝液に５００μ７肩の濃度に調製したヒトＩｔＧ　（ＫｃＬＡＬ　、スワエーデン）の溶液５０μノをミクロタイタープレートのウェルに充填し、そのプレートを室温下で一時間インキユベートした。そのウェルをＰＢＳ＋０．０５％７ｗｅｅｒＬ■２０　（本アッセイの洗滌はすべてこれを用いた）で３回洗滌してから、被検溶解物５０μノを添加した。定量分析の場合は溶解物のＰ　Ｂ　５　＋　０．０５％Ｔｗｔｔｎ’Ｆ’２０による（２倍）段階稀釈法を採用した。Ｐ　Ｂ　Ｓ　十０．１％Ｔ・・・・■２０の１０μノを加えて室温下で一時間イ・キュベートした。ウェルを再び３回洗滌してからプロティｙＡ−アルカリホスファターゼ共役体（ｌｒｒｒｒａｔａｏｃｈｔｍｉｓｔｒｙ　。

Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　１９６９　、　Ｕｏｌ、　６　ｐｐ−４３−５２に従って調製）５０μｌを加えた。室温下で一時間インキユベートシタラウエルヲ再び３回洗滌してからアルカリホスファターゼ基質（Ｓｔｙｍα１０４−Ｐ −ニトロ−フェニルホスフェート、１号Ｑ）１００μノ　を添加。この酵素反応は３０分後に３ＭＮα０ＥＩＯμｔ　を加えて中断させた。肉眼で結果を判定した。（＋）の結果すなわちプロティンＡが存在するときは反応混合物は無色となる。その理由は遊離したＩ、ＧのＦｃ部位が共役体（コンジュゲート）と結合しないからである。（−）の結果すなわちプロティンＡが存在しないときは黄色となる（結合共役体のアルカリホスファターゼの活性による）。プロティンＡの定量分析では、試料と平行して濃度既知の標準プロティンＡ液を用い（２倍）段階稀釈法を採用して行なった。

β−ガフクトシダーゼ　アッセイ機能的ｔαＣＺ遺伝子を含有した組換え体をｘｇαＬ　培地に植菌して数えた。

細胞から遊離したβ−ガラクトシダーゼ活性は、Ｍｉｌｌｅｒ　、　Ｊ、　Ｈノ報告（Ｅｘ、ＩＩ）ｅｒｉｍｅｒＬｔ　ｉｎＭｏｌｅｃｕ、ｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、Ｃｏ１ｄ、Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈｃｔｒｈｔｒ　、Ｎｅｗ　Ｙｏｒん；Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｔｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　１９７２　）　Ｋ従ッテ基質としてＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトジッド（０ＮＰＧ、Ｓｉｇｍａ　Ｐｒｏｃｔｗｃｔ　ＡＮ　−１１２７）　ｋ用イ比色法テ検定した（しかし次の通りの修正を加えた。）。検定は＋８℃で行ない、その活性は４ｏ５ｒＬｍで測定した。活性の一単位は４０５ｒＬｍの吸収値の変化（１分当り）を示す。Ｉ、Ｇ−セファロース■にカップリングした融合蛋白質のβ−ガラクトシダーゼ活性は８℃で測定（沈降を防ぐためにチューブを回転させながら）した。

ファージＭ１３クローニングおよび配列決定Ｍ１３のクローニング、精製、配列決定はすべて提供者（Ｎｇｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　、　Ｂｇｖｔｒｌｙ　、　ＨＡ、、　ＵＳＡ　、カタＩ：ＩりＡ４０８　、４０’？　）から得た指示書／プロトコルの記載に従って行なった。

遺伝子もしくは遺伝子の部分間で融合をさせるために、先ず、融合させる２つの遺伝子または遺伝子の一部分の融合点の近傍におけるＤ　ｉＶ　Ａ配列、それより誘導されるアミノ酸配列を知ることが望ましい。これに関する知見が得られればリンケージをどのようにデザインして２つの遺伝子間または遺伝子部分間での正確なリーディングフレームをつくるべきか、かつまた機能的ハイブリッド蛋白質の表現形質を示すかを予測することが可能となる。

出願人のスウエーデ／％許出願４８２０４８１０−９　（その開示内容を引例として挿入する）にはスタフィロコッカスのプロティンＡをコードする構造遺伝子全体を含む３つのプラスミド、すなわちプラスミドｐｓＰＡ　ｌ　、　ｐｓＰＡ３、ｐｓＰＡ５　について記載している。しかし、プロティンＡ涜云子０５′− 末端のＤＮＡ配列（添付図面の第２Ａ図の領域Ｓ、Ｅ、Ｄ、ｌ！：Ａの一部）しか開示されていない。

従って、遺伝子の３′−末端のＤＮＡ配列についてもっと詳細な情報を得るためにプロティンＡ遺伝子全体の配列を先に決定した。前記実施手順で述べた通りにして配列決定操作を行なったが、その際ＤＮＡ源としては精製したプラスミドｐｓＰＡ３ｃ３種のプロティンＡ遺伝子含有プラスミドのうちで最も小さいので、配列決定には一番やさしい）を使用した。第３図に示したＤＮＡ鎖（配列）は第２Ｂ図のプロティンＡ遺伝子の制限地図において１．Ｂｈｈの位置にあたるＳａｕ、　３　Ａ制限部位と２．１　ｈｂの位置にあたるｌｉｔ　ｌ制限部位の近傍から得たＤＮＡ配列とそれから推測したアミノ酸配列である。この２つの制限部位に特に関心がもたれる理由を次に説明する。

ここで得られたＤＮＡ配列にもとすいて、この二種の遺伝子融合ベクターをつくるためＭ１３マルチリンカ−（いくつかの制限酵素に対して制限部位を有するオリゴヌクレオチット）を、第３Ａ図に示したヌクレオチット１０９６の５Ｂｗ　３　Ａ部位と第３Ｂ図に示したヌクレオチット１５４ＩのＰｅｔ　１部位に挿入することにした。これらの部位はプロティンＡがＳ、ｅｔＬ１”ｅｔＬ、９の細胞壁にあるペプチドグルカンに結合するとき、それに関与して包含されると考えられているプロティンＡ遺伝子のＸ領域（第２Ａ図）の反復配列部の前後に位置する。この融合ベクターを用いる手段により、融合遺伝子を発現させて得られる融合蛋白質にこれらがどのように影響するかを知ることができた。これら２ケの遺伝子融合ベクターの構築につき以下説明する。

■融合ベクタープラスミドｐｓＰ、４１１の構築（第５Ａ図）次の工程Ａ−ＥはＸ領域をもたないプロティンＡ遺伝子と１０９８に位置する５ａｔｂ　３　Ａ部位（図７）に特異的ＥｃｏＲ１部位を挿入保有するプラスミドの構築に関するものである。

プラスミドｐｓＰＡ１（第１図参照）の１μりとグラＨＢＩＯ１を形質転換した。分断、連結（リゲーション）、形質転換の方法は前記“実施例での手法”の項で述べた通りに行なった。

プラスミドｐ　Ｔ　Ｒ２６２はラムダ・レプレッサー遺伝子をもち、これが発現するとテトラサイクリン耐性の遺伝子を非活性にする。このラムダ・レプレッサー遺伝子はＢｉｎｄｌ　部位を有しており、ここにＤＮＡ鎖が挿入されるとラムダ・レプレッサーが非活性となり、その結果、テトラサイクリン耐性遺伝子が活性化される。このようにＰ　Ｔ　Ｒ２６２プラスミドはテトラサイクリン耐性組換え体を積極的に選別する。

このようにして組換え体を含むコロニーはテトラサイクリン耐性として選別した。これらの組換え体２０ケのうち１ケは、先に述べた実施例の手法の項でのＥＬＩＳＡ法を用いてプロティンＡ陽性であることを見出した。制限分析の結果、それは第１図と第２Ｂ図で示したｐＳＰＡ１制限地図の０．０〜’）−，１ｋｂに相応したフラグメントから得た２、１んｂプロティンＡ遺伝子を挿入保持したベクタープラスミドｐ　Ｔ　Ｒ２６２を含有していることが判った。このプラスミドをＰＳＰＡ２と命名し、第４図にその略図を示した。それはプロティンＡ遺伝子フラグメントの３′−末端に特異的Ｐｅｔ　ｌ制限部位を有しており、次の工程Ｌ′で使用される。

１００μ７のプラスミドｐ’５ＰＡ５（プロティンＡ遺伝子をもったプラスミドベクターＰＨＶ　ｌ　４　；前記“出発材料”の項参照）を制限酵素ＥＣａ　ＲＶを用い３７℃。

１時間処理して切断した。このようにして産生された２ケのＤＮＡフラグメントは、すなわち第２Ｂ図の０．２ｈｂと２．３　ｋｂの間に位置するプロティンＡ遺伝子（２，１ｋＡ）を有する挿入されたＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＨＶ　ｌ　４　（７，２ｋｂ　）である。この消化物（ｄＬｙｇ、ｒｔ）を加熱して非活性化し、エタノールで沈でんさせ、１００μｌのＴＥにとかし、１０・〜３０％蔗糖グラディエンド／ＴＥ緩衝液を用いて沈降させた。ペックマン５Ｆ４０ローター（５℃、　３５０００　ｒｐｍ　、　２０時間）を使用した。

グラディエンドは帆５−づつのフラクションに分け、各フラクションはアガロースゲル電気泳動で分析した。

２．１ん６　フラグメントを含むフラクションをプールし、２倍容積のエタノールで沈でんさせ、ＴＥ緩衝液に溶かした。

第２Ａ及びＢ図から明らかな通り、このフラクションはプロティンＡ遺伝子全体に加えて、プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２から得たＥ、　ｃｏｌｉ配列とスタフィロコッカス遺伝子残留物を含有している。

前記工程Ｂから得た２、Ｉｋｂ　フラグメント（精製）５μタ　を制限酵素５ａＩＬ３　Ａを３７℃で１時間作用させて切断した。この消化物を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＴＥＢ緩衝液）にかけ、約６００ベース対のＤＮＡフラグメントを切り出した。このフラグメントはｆＡ２Ｂ図の１．＋５＆ｈと１４　ｈｈ　の位置の間にある遺伝子部分に相当するものである。このＤＮＡをＴＥ十０．３　Ｍ　＃αＣ１の５記中３７℃で一夜溶離した。３００ｐｔ　（７）沈降Ｄ　Ｅ　−５２（Ｗｈａｔｍａｎ　、英国）　（５ｔｎｌＴＥで平衡化）をつめたカラムに溶離物を通した。ＴＥ十０　、３３ｆ　ＮａＣｔ　の０．５記で洗ってから０．５　ｉ　Ｔ　Ｅ　＋　０．６ＭＮｃＬｃｌ　で２回溶曝してＤ　ＮＡを溶出した。Ｄ　Ｎ　Ａフラグメント含有溶離液をＴＥ（容積量で稀釈し、エタノールで沈でんさせ次いでＴＥ緩衝液に溶かした。ここに得られるプロティンＡ遺伝子フラグメント（精製）には５Ｂｗ　３　Ａ制限部位と中間１１ｉｎｄ１部位に対応した粘着末端が存在する。

Ｄ、ベクタープラスミドｐ　Ｕ　Ｒ２２２の調製プラスミドｐ　Ｕ　Ｒ２２２は市販されているベクターで、それには酵素β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（Ｌａｃ　Ｚ　）が含まれている。この遺伝子にはいくつかの制限部位例えばムｔｔ　Ｉ　、　ＢａｍＨｌ、μヱＲＩをもったマルチリフカーが含まれている。＃素アッセイによってβ−ガラクトシダーゼは容易に検出できるので、これらの制限部位の一つにＤＮＡフフグメント全挿入保持する組換え体は適当な宿主菌株を用いて簡単に数えることができる。よく使われるのはＸｇαｔプレートＣＸｙαｔは呈色基質、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトジッドで、β−ガラクトシダーゼで分断されると青色のインドリル誘導体を遊離する）で、その際、β−ガラクト／ダーゼ陰性組換え体は白色のコロニーとなり、これに対して押入のないプラスミドを含むコロニーは青−緑となる。

β−ガラクトシダーゼコード遺伝子中のプラスミドｐ　Ｕ　Ｒ２２２を分断して、工程ＣのプロティンＡフラグメントの粘着末端に相補性の粘着末端をつくり、それをプラスミドに挿入するために、ＢａｒＩＬａｒ制限部位を使用した。’　ＢｏｓｈｒｉｒＬｇｔｒ　−Ｍａｎｎｈｔｉｒｎ　、西ドイツ’から供給されたｐＵＲ２２２１μ２　を制限酵素Ｂａｍ　ＨＩで３７℃、１時間処理して消化し、次いで６５℃、１０分間かけて酵素を非活性にした。次の工程ＥでプロティンＡフラグメントと連結（リゲート）するためにこの分断調製品を使用した。

工程りで説明したＢａｍ　ＨＩで消化したＰＵ　Ｒ２２２の２００ｎ？、工程Ｂで説明した溶出プロティンＡフラグメント２００μＶ　を混合し、全量２０μｌ　として１４℃で一夜連結した。６５℃で１０分間かけて酵素を失活させ、エタノールで沈でんさせてからＴＥ緩衝液に浴かした。β−ガラクトシダーゼ遺伝子にプロティンＡを挿入保持する組換えプラスミドを含有するＤＮＡ混合の操作で組換えプラスミドはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（Ｐｓｔ　ｌ　）とプロティンＡ遺伝子（Ｉｌｉルｄｌ）のところで分断し、２つのフラグメント、すなわち第２Ｂ図の１．１５ｋｂ位のＳａｗ　３　Ａ部位からｐυピリ−部位に至るプロティンＡ遺伝子フラグメントに結合した小さなβ−ガラクトシダーゼＤＮＡ配列からなる小フラグメントと、第２Ｂ図の−Ｂｉｎｄ　１　部位から１．８ｋｂ　位の５ｅｔｗ３Ａ部位に至るプロティンＡ遺伝子フラグメントに結合した大部分の β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む残りの組換えプラスミドからなる大フラグメ／トを生成する。第４図から判る通り、このβ−ガラクトシダーゼ・フラグメントはプロティンＡフラグメントとの融前記工程Ａから得たプラスミド２００　ｔＬｇ　を上記と同様にして制限酵素１１ｉｎｄＨとＰｓｔ　１で切断して（第４図参照）、このプラスミドを３つのフラグメントに分ける。すなわち、７ｅｔ− 遺伝子とプロティンＡ遺伝子メント、および残りのプラスミドからなるｐ　Ｔ　Ｒ２６２オリジンの大きなフラグメントである。

このようにして得られた２つの消化物を６５℃、１０分間で非活性にし、混合し、エタノールで沈でんさせた。このＤＮＡを連結緩衝液にとかしてＴ４−リガーゼで処理した。目的とする組換えプラスミドはｐＵＲ２２２組撓え体の分断で得られ、プロティンＡ遺伝子内のｌｆｉルｔＬ１　部位とｐｓｔ　１部位の間のｐｓＰＡ２に挿入された上記の大フラグメ／トを含み、またプロティンＡ遺伝子の５′−末端を含有しておりへその一部はｐｓＰＡ２から誘導され他の部分はｐ　Ｕ　Ｒ２２２組換え体に由来しているものである。また、このプラスミドはアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性でｘ１αｔプレート上では次に述べる通り青色を呈する。

次にこのリゲート（連結）したＤＮＡ混合物を使用してＥ、　ｃｏハＲＲＴ　ｄ、ｇＺ　Ｍ　ｌ　５　を形質転換した。上述の方法で分断（クリーベイジ）、連結（リゲーショ／）および形質転換を行なった。組換え体をアンピシリン、テトラサイクリ／を含有するＸｇαＬプレート上にまいた。ここに出現するコロニーの一つは明るい青色を呈する。そのプラスミドについて制限分析を行゛なった。

このプラスミドはｐｓＰＡＩＯｃ第４図）と命名され、それはプラスミドＰ　Ｕ　Ｒ２２２、プラスミドｐ　Ｔ　Ｒ２６２の一部、ならびにプラスミドｐｓＰＡＩに由来するプロティンＡ遺伝子の一部からなり立っている。プラスミドｐｓＰＡＩｏで、このフ゛ロチイン８１ｆｉｘ子フラグメントは第７図で示した１０９６位にある５Ｂｗ　３　Ａを介してｂａｒ　Ｚ″ＩＪ！ＩＪ！伝子ている。

プラスミドＰＳＰＡＩＯにはβ−ガラクトシダーゼをコードする１ＬＬｃ　Ｚ遺伝子の全部は含まれておらず、そのうちのα−フラグメントをコードする遺伝子（ｔαＣＺ′）のみが含まれ、Ｘ、！７αＬ基質を分割する活性全もち、前述の条件下で青色を生ずる。

これは、このプラスミドによってコードされるα−フラグメントと、β−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端フラグメントを含む染色体遺伝子生成物との間の相補によって活性酵素が生ずるからである。Ｅ、　ｃｏｌｉＲＲＩ　ｃｔｇｌ　Ｍ　ｌ　５宿主菌株にはこのような染色体遺伝子物質があるために、ｐｓＰＡ　ｌ　Ｑプラスミドのつくるα−フラグメントを相補して活性なβ−ガラクトシダーゼ分子を生ずる。

以上の工程Ａ−Ｅによって目的のプロティンＡフラグメントを含むプラスミドベクターｐ５ＰＡ＋Ｏｃ下流末Ｐｓｔ　ｌの部位の間にある不要フフグメン１．（Ｚαｃｚ”ａ伝子とアンピシリン耐性の遺伝子を含む）をとり除くと同時にその部位にＤ　＃　Ａ　ＩＪンカーを導入し、有利な融合ベクターを構築した。

工程ＥからのプラスミドｐｓＰＡｌＯｌμ７とファージベクターＡ／　ｌ　３　ｍｐ　８　（Ｎｅｗ　ＥｎｇＬａｎｔｉ　Ｂｉｏｌａｌｒｓ　。

ＨＢＩＯｌを形質転換した。前述の方法手順に従って分断、連結、形質転換を行なった。目的とする組換え体をテトラサイクリン耐性、かつアンピシリン感受性として選別した。テトラサイクリン耐性コロニー５２ケをアンピシリン含有プレート上に採取した。これらのコロニーのうち３ケはアンピシリン感受性であった力入そのうちの一つについて制限分析をしたところ、そのプラスミドは第５Ａ図の略図で表わされることが判った。このプラスミドはプロティンＡ１１ｆ云子の領域Ｃ（第２Ｂ図〕１．Ｂｈｂ　の位置）の末端部にＭ１３マルチ−リンカ−を挿入保持したもので、ｐｓＰＡｌｌと命名した。遺伝子融合後の正確な解読フレームを得る指針とするため推測アばノ酸配列も示した。プラスミドｐｓＰＡｌｌは次の工程３で示す通り、プロティンＡフラグメントとの遺伝子融合に適したベクターである。

プラスミドｐｓＫｓＩ０４ｃ特異的Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｒ１部位をもつ）１μ７　を制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩで消化した。このプラスミドは以下で用いるｐｓＫｓ１０６プラスミドと共に、Ｅ、　ｃｏハ１ｃＬｃ　Ｚ遺伝子とその他の遺伝子との遺伝子融合を助成するための１セツトのプラスミドとなる。この融合でできるハイブリッド蛋白質はカルボキシ末端に酵素活性のあるβ−ガラクトシダーゼ（Ｎ −末端のアミノ酸のいくつかを欠如）を含み、その酵素活性によってアッセイすることができる。別に工程２ＦからのプラスミドｐＳＰＡｌ　ｌ　（やはり特異的ＥｃｏＲ１部位を有する）１μタ　を制限酵素Ｅｃｏ　Ｒｌで消化した。

この２つのＤＮＡ消化生成物を加熱して失活させ、混合し、連結し、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｘ　Ａ　Ｃｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子を欠く）の形質転換に用いた。組換え体をテトラサイクリ／とアンピシリンの両者を含むＸｇαｔプレート上でカウ／トシた。

これらのコロニーの約半分は明るい青色を呈しく分割ｐｓＫｓＩ’０４の挿入は正しい方向のものと逆の方向のものカ半々の確率で生ずる）、それらの一つについて行なった制限分析の結果、このプラスミドは第６Ａ図で表わされることが判った。

このグラ、スミドはｐｓＰＡＩ３と命名され、第２Ｂ図の１４　ｈｂ　のヌクレオチットにあるプロティンＡ遺伝子にｌ、ｏＬｃ　Ｚ遺伝子を挿入保持している。これは第７図で表わされるが、この融合点附近における推測アミノ酸配列を第８図に示した。このクローン培養物はドイツ微生物収集所（Ｄｅｕ、ｔｚｃｈ　Ｓａｍｍｌｔｂｎｇ　ｖｏｒｂ　Ｍｉｋｒｏｏτｔｌｃｔ−ｎｉｓｍｇｎ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ　）　、ゲッチンゲン、西ドイツ）に１９８３年２月４日付（寄託番号ＡＤＳＭ２５９＋＞で寄託され工程＋１，４で構築され、第４図で示されるプラスミドｐｓＰＡ２は、プロティンＡ遺伝子の１５４１の位置（第７図参照）に特異的Ｐｓｔ　１部位を有している。従ってこのプラスミドはプラスミドｐＳＫＳ１０６のｌａｃ　Ｚ遺伝子に対応するプロティンＡ遺伝子フラグメントを遺伝子融合するのに用いられる。

工程■ＣからのプラスミドｐｓＰＡ９　ｌμ７とプラスミドｐｓＫｓ１ａｂＩμ ２　をそれぞれ別々に制限酵素Ｐｓｔ　ｌで切断した。得られるＤＮＡフフグメントを混合し、連結し、前述の方法手順の項で述べたところに従ってＥ、　ｃｏｌｉ　Ｘ　Ａ　Ｃｔａｃの形質転換に用いた。テトラサイクリンとアンピシリンを含むＸｇαＬプレート上で組換え体をカウントした。セクション■と同じく、これらのコロニーの約半数は明るい青色を呈し、これらの一つについて制限分析をした結果、第６Ｂ図で表わされることが判った。ｐ　ＳＰＡ　＋　４と命名されたこのプラスミドは第２Ｂ図の２．１１ｃｈ　位にあるプロティンＡ遺伝子にＬａｃ　Ｚ遺伝子を融合保持している。概略は第７図に示す通りである。融合点附近の推測アミノ酸配列はｍ　８　Ｂ図に示される。このクローン培養物はＤ　Ｓ　Ｍ　、　Ｇｄｔｔｉｎ、ｇｅｒｂ　、西ドイツに１９８３年２月４日付（寄託番号４ＤＳＭ２５９２　’）で寄託されている。

プラスばドｐｓＰＡ９のプロティンＡ遺伝子フラグメントの融合体をもつとつくりやすくするために、プラスミドｐ　ＳＰＡ　ｌ　４からｌａｃＺＭ伝子を切断し、この遺伝子の５′−末端の前方にマルチ−リンカ−を保持させることにより対応の融合ベクター、ｐｓＰＡ（１を構築した。

セクション■のプラスばドｐｓＰＡ１４　ｌμ）を制限酵素Ｅｃｏ　Ｒ■で切断し、連結し、方法手順の項で述べたところに従ってＥ、ｃｏｌｉ　Ｘ　Ａ　Ｃｌａｃ形質転換し、テトラサイクリン耐性でβ−カフクトシダーゼ活性を欠くものをカウントした。コロニーをテトフサイクリン含有Ｘｇａｌフレートにまいた。

これらのコロニーの約８０％は白色を呈した。これらの一つについて制限分析を行なったところ第５Ｂ図に示すプラスばドであることが判ったっこのｐｓＰＡＩ２と命名されたプラスミドは第２Ｂ図の２．１ｋｂ　位にＭ１３マルチ−リンカ −を含有する。融合点での解読フレームを第５Ｂ図に示した。

■プロテ遺伝子コード遣云子の全部をプラスミドｐＢＲ上記の融合ベクターｐＳＰ、４１１とｐ　ＳＰＡ　＋　２、およびそれに対応した融合遺伝子（プラスミドｐ　５ＰＡ１３とｐＳＰＡ＋４を含有）はすべて、原料プラスミドｐＳＰＡ１から派生したプロティンＡ遺伝子の上流比較のために、プロティンＡの構造遺伝子の全体とプロティンＡのプロモーターを含むが、上流のＥ、　ｃｏｌｉプロモーターは欠如しているプラスミドをつくる目的で工程１１７３からの２．１　ｋｈ　プロティンＡフラグメントを次のようにしてプラスミドベクターｐ　Ｂ　Ｒ３２２にクローンした。

工程■Ｂからの２．１　ｋＡ　プロティンＡフラグメント（精製）１μタ　を制限酵素Ｔｇ　ｌを用いて６０℃、１時間かけて切断（スタフィロコッカス由来のＤＮＡ内で）した。等容量のフェノールで抽出して酵素を失活させ、エーテル抽出全くり返してから、エタノールでＤＮＡを沈でんさせ、ＴＥ緩衝液に溶かした。プラスミドｐＢＲ３２２１μ７　を制限酵素色Ｉとに混ＲＶ　（これらは同じようにして切断し、相補性の付着端をつくから６５℃、１０分間加熱して失活させた。このＤＮＡ試料を混合し、連結し、上述の”方法手順”の項で述べたところに従ってＥ、　ｃｏｌｉ　Ｅ’　Ｂ　１０１を形質転換した。

組換え体をアンピシリン（３５μ２鷹）上にストリークした。コロニーをそれぞれテトラサイクリン１０μ７鷹、アンピシリン３５μ？鷹を含むプレートに採取した。

アンピシリン上では生育するが、テトラサイクリン上では生育しないものを組換え体とした。これらの組換え体１２ケのコロニーのうちの４ケはＥＬＩＳＡ法によりプロティンＡ（＋）であることが判った。これらのコロニーの一つについて制限分析（純粋なプラスミドを１ケ、２ケまたは３ケの制限酵素で切断）を行なった。このｐＳＰＡ８と命名されたプラスミドの制限地図を第４図に示した。これらのプラスミドはプロティンＡ遺伝子の上流にｐ：、　ｃｏｔｉプロモーターを欠いている。プロティンＡ遺伝子フラグメントの前方にはそれ自身のスタフィロコッカスプロモーターのみが存在する。

■Ｅ、　ｃｏｌｉクローンからのプロティンＡの検出と定量プラスミドｐｓＰＡ１３とｐｓＰＡＩ４のフ゛ロチインＡ活性を検定するために、セクション■で得たプラスミドｐｓＰＡｇ（プロティンＡの構造遺伝子の全体を含む）とプラスミドｐｓＫｓ１０６ｃβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む）を用いてプロティンＡ全含有量とＩ、Ｇ−セファロース■カラムへの結合能の比較を行なった。

グルコースは不添加、アンピシリン３５μｇ／ｍｌ含ＯＬＢ培地にそれぞれプラスミドρ５ＫＳＩ０５　、　ｐ　Ｓ　ＰＩ３、ｐｓＰＡＩ３およびｐｓＰＡｊ４を含む細胞懸濁物３００Ｍ１を培養して０Ｄ５５０−１．０にする。細胞培養物を５ｏｒｖａｌｌ　Ｇ　Ｓ　Ａ　−ｏ−ター＜　６００Ｏｒｐｍ　、　Ｉ　０分間）で遠心分離してＴ　Ｅ　（０，ｏｓＭトリス、ｐＨＬ５　、０．０５Ｍ　ＥＤＴＡ）で細胞ベレットを洗い、再び遠心分離した。

最後に細胞ペレットを蛋白質インヒビツタ−緩衝液（０，０２Ｍ　りン酸カリウム、ＰＨ７，５、Ｏ，ｌ　Ｍ　Ｎａｃｌ。

０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％トリトンＸ−１００，０，１％ランデウムドデシルサルフエート（ＳＤＳ　）、ＩｎＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド（Ｐ、’、ｆ　Ｓ　Ｆ　）　）の１５ｍ１中に再懸濁させた。−″ −１ＳＥソ二ケーターで細胞を超音波処理（水浴上、３０秒、３回）して、＋　５０００τｐｍで１０分間達６分離（５ｏｒυα１１５５−３４０−ター〉した。

Ｅ）’ｅ１ｍらの報告（Ｆ　ＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　、　２８　（１９７２））に従ってＩＧ−セファロース■４Ｂカラム（ＰＢＳＴ？緩衝液にて平衡にしたもの）に、上記で得られた上澄部を通過させた。カラムをＰＢＳＴで洗滌してから吸着した蛋白質を３１Ｒ１のグリシン緩衝液（０，１Ｍグリシン、２％Ｈａｃｌ、　ｐＨ−３）　テ溶離した。溶離液をＰＢＳＴで一夜凸析してＥ’Ｌ　Ｉ　ＳＡ法でプロティンＡの儂度を測定した。

得られる培養物がプロティンＡ−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質を含有しているかどうかをみるためへ修飾テストを行なった。プロティンＡ−アルカリホスファターゼコンジュゲート（抱合体）を加える前に０ＮＰＧ緩衝液１００μノ　をミクロタイタープレートのウェルに加え、β−ガラクトシダーゼ活性を示す色の変化（無色から黄色）を肉眼でチェックした。Ｐ　ＢＳＴで３回洗滌後、プロティンＡ−アルカリホスファターゼコンジュゲート５０μノ　を加え、前記の方法手順で述べたところに従ってテストを行なった。結果を表１表　１この表で１全体量”とは細胞溶解物についての値で、“溶離液”とはＩ、Ｇ−セファロース■に結合させ溶離したものについての値である。β−ガラクトシダーゼ活！（−）とは室温下で３０分間インキュベートした後にまったく色の変化のないことを示しており、同（＋）とは同じ条件下で５分後に肉眼にはっきり判る色の変化のあることを示している。

テストの結果から判る通り、対照ＣＰ　ＳＫＳ　１０６　）からのβ−ガラクトシダーゼはＩ、Ｇ被覆ウェルに認識できる程度の結合を生じない。これに対して、プラスミドｐｓＰＡ＋　３とｐ　ＳＰＡ　ｌ　４とを含も培養物からの融合蛋白質はウェルに結合し、酵素活性が明らかである。Ｉ、Ｇ−セファロース■カラムからのグリシン−緩衝液で溶離してもβ−ガラクトシダーゼ活性は回収できなかった（表１参照）。これはｐＨ４のグリシン緩衝液中で酵素が失活するためである。

ＥＬＩＳＡテストによると同じプロモーターをもった同じプロティンＡ遺伝子配列を用いても３つのプロティンＡ含有クローンＣｐ　５ＰＡＲ、ｐ　ＳＰＡ　ｌ　３　。

ｐ　Ｓ　Ｐ　Ａ　ｌ　４　）間でプロティンＡ濃度が異っている。

プロティンＡ遺伝子（ｐｓＰＡ１３とｐ　ＳＰＡ　ｌ　４　）と融合したｌ、ａｃ　Ｚ遺伝子をもつ２つのクローンではプロティンＡの含有ｔがｐ　５ＰＡ８クローンのそれよりも少ない。しかしプロティンＡ含有クローン（ｐｓＰＡＦ３．ｐＳＰＡＩ３．ｐｓＰＡ１４）のプロティンＡは％Ｇ　−セファ０−ス■に結合し、グリシン緩衝液（ｐＨ−３）で効率よく溶離できる（表１）。しかしｐ　ＳＰＡ　ｌ　３とｐｓＰＡ１４のβ−ガラクトシダーゼは非可逆的に失活する。

以上の結果によると目的酵素は粗細胞溶解物からＩ、Ｇ−アフイニテイカラムに直接固定化される。このようにＩ、ＧとプロティンＡの間に特異的なアフイニテイが有るために一段階の工程で純粋な固定化酵素が得られる。

１、Ｇ−セファロース■に固定した後の）の検出と定量セクション■で述べたと同様にしてプラスミドｐｓｘｓ＋０６　、ＰＳＰＡ８　、ＰＳＰＡ　ｌ　３　、ＰＳＰＡ　ｌ　４をもつ細胞を培養し、分解（リゼート）シた。上澄液１０−を沈降１．Ｇ−セファロース■４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ　。

ｖｐｐ９α２α、スウェーデン）（ＰＢＳＴ緩衝液で洗滌）ｌｆＴＬｔと混和した。混合物を８℃で、１時間処理して転化し、上澄液を集めた。＋２ｆｎｌのＰＢＳＴで４回洗滌後、最終洗滌の上澄部を集めた。セファロース■を１０−のＰＢＳＴに懸濁させてその一部を小型チューブに移した。前述の手法に従ってβ− ガラクトシダーゼ活性を測定した。結果は次の表に示す。

表　２骨細胞溶解物１−当りに換算した値。

１単位の意味は方法手順の項で述べた通り。

Ｎ、Ｄ、は検出できないことを示す。

プラスミド’ｐ　Ｓ　ｆ　Ｓ　１０６を含む細胞からのβ−ガラクトシダーゼ（対照）はＩ、Ｇ被覆ウェルへの結合能をもたない（工程■）ためにＩ、Ｇ−セファロース■には結合しない。これに対してプラスミドｐｓＰＡ１３とｐ　ＳＰＡ　＋　４を含む細胞からのβ−ガラクトシダーゼ（プロティンＡ融合蛋白質）は効率よく結合し、実際に７０％以上の固定化が起る。

プラスミドｐｓＰＡＩ３を介してつくられた蛋白質分子の非１．Ｇ−結合域（図２のＸ）を欠く融合蛋白質はプラスミドｐｓＰＡ＋４を介してつくられたプロティンＡの実質全部を含む融合生成物よりも３〜４倍も生成物が多い。この場合“ スペーサー“域Ｘばあまり工程■で得られたＩＧ−セファロース■懸濁物（融合量白質に結合）の一定量をカラムに移した。５０μｌの沈降ゲルに種々の濃度の純プロティンＡ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｕｐｐｓαｌα、スウェーデン）を含む緩衝液０．５−を加え（室温）て融合蛋白質を溶離した。溶離後、溶離液と１、Ｇ−セファ０−ス■ゲルのβ−ガラクトシダーゼ活性を前手法で述べた通りにして測定した。結果を表３に示す。各値はセファロース■に結合したβ−ガラクトシダーゼ活性の％で表現した。

表　３この結果から、β−ガラクトシダーゼ活性の少くとも半分はこの操作で溶離される。

実　施　例　■ 次の工程Ａ−ＤはＸ領域をもたずプロティンＡ遺伝子を含みかつ修飾ＩＧＦ−１（ヒトのインシュリン様生長因子Ｉ型）とそれが融合した形のプラスミドＰＵＮ２０１の構築に関するものである。

反応試薬としてＮ−保護ヌクレオチットクロロフオスファイト（ＥｌｒｎｂＬａｔＬら、Ｎｕ、ｃＬｇｉｃ　Ａｃ１ｄ、ｚ　Ｒｔｚ、Ｉ　Ｑ。

３２９１−３３０１　）を用い、ＫｃＬｌｒｉＧｇｎ　Ａ　Ｂ　、　Ｘ　ｆｙ　ｘ−ｆ　ｙ（Ｃｈｏｗ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ、ｓ　ＲｅＳ、　９　、２８０１−２８１７　＞の開発した自動式ＤＮＡ合成装置により第１３Ａ図に示すオリゴマーを合成した。

このオリゴマーは精製、リン酸化後第１３Ｂ１ｋに示す７つのブロックに集められ、それらは第１３Ｂ図に示すように連結された。

最終工程でブロックＡとブロックＢが連結されＩＧＦ−１遺伝子となる。この配列鎖はμ叉ＲＩと、μす差音の制限酵素で消化され、精製後プラスミドｐＵＣ８に挿入されｐ：、　ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　８３に形質転換された。この組換え体は／１１５をプローブとしてコロニー・）・イブリゼーションによりスクリーニングされ、陽性コロニーの一つＣ１Ｍ８３／ｐＫＧ３と命名）の配列がＩＧＦ−１遺伝子とマツチすることが判った。

ＩＧＦ−１遺伝子の合成についてはスウェーデン特許願Ａ３３０３６２６−９に記載されているが、その開示内容を本願の引用文献として挙げる。このＩＧＦ− １遺伝子のＤＮＡ配列と対応するアミノ酸配列はグリシン残基ＣＧｔ’／）がアスパラギン酸残基（Ａ、ｓ′Ｐ）に変っている（次の工程り参照）ことを除いては第１１図に示す通りである。

Ｂ　修飾ヒト−ＩＧＦ−＋をコードする合成遺伝子のＬルｖｉｔｒｏ　突然変異誘発成熟蛋白質のＮ−末端アミノ酸残基をコードする部分を変えるために、クローン合成ＩＧＦ−（遺伝子についてオリゴヌクレオチット仲介１ｒＬｖｉｔｒｏ　突然変異誘発を行なった。このアミノ酸残基をグリシンからアスパラギン酸に変えることによりアスバフキン酸−プロリンジペプチツドが形成される。これによって、精製の前後で蟻酸処理（アスパラギン酸とプロリンの間を切断する）　（ＬａｒＬｄｏｎ　、　ｇｅｔんｏｃｔｚ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｌｙ４７　＋１３２−１４５　、１９７７　）により分断することのできるハイブリッド蛋白質をコードする遺伝子融合が可能となる。かくてＮ−末端グリシ／を欠如した成熟ＩＧＦ−１が生成する。プラスミドｐＫＧ　Ｉ　０μｍ　を工ＥｃｏＲ１゜ＨｉｎｔＬ　ｌ　で分断し、０．２２　ｋｂフラクショ／を５％ポリアクリルアミド（電気泳動後の）より切り出した。国際出願ＰＣＴ／５Ｅ８３１００２９’ｌ　（その開示内容は本願の引例とする）に記載の方法に従ってこのフラグメントを溶離し、精製した。精製後のフラグメント５ｏｒＬ２を形質転換し細胞をＡＸＩ −プレートにまいた。前述の手法に従って分断、連結、形質転換を行なった。白色のプラークからのファージ精製も前述の手法に従って行なった。ユニバーサル・プライマー（Ｂｉｏ　−Ｌａｂｚ。

Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　、　Ｕ　Ｓ　Ａ　）を用いてファージ挿入が２２０ｈｐ　合成ＩＧＦ−１遺伝子であることを確認した。このファージ（ｍｐ　ｑ／Ｉ　Ｇ　Ｆ　−ｌと命名）を用いて、次の突然変異誘発を行なった。

スウエーテ／特許願４８３０３６２６−９に従って２つのオリゴヌクレオチットを合成し精製した。すなわち２４ケの塩基（５’−ＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧＡＣＣＣＣＧ−ＡＡＡＣＴ　−３’）からなり突然変異誘発に用いられるプライマーオリゴヌクレオチットと、１４ケの塩基（５′−ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧＡＣＣＣ−３’）からなり突然変異化ファージクローンをうまく同定するのに用いられるプローブ（Ｐ）オリゴヌクレオチットである。合成ＩＦＧ−１遺伝子とプライマーとの間の不適性は第９図に示す通りである。

ｍｐ　９／Ｉ　Ｆ　Ｇ　−１（７）　ｌ　６　ｐ　モにとプライマ−８０ｐモルとを混合（全容８０　ｐｌ　、　ｔｏｏ　ｍ−Ｍ　Ｎ（ＬＣｌ　、　２０　ｍＭＭ！Ｉ’１２．４０７ｎ　Ｍ　トリス−Ｈｃｔ　、　ｐＨ７，５）　シた。この混合物を６５℃で３分間加熱してから、２３℃に冷却（３０分間）した。水浴に移しＨ２Ｏ１９０μノと、１００ｍＭＭｇｃｌ、　、５　０　ｍＭＤＴＴ　、２　０　ｍＭ　ト　リ　ス−Ｈｃｌ。

ｐｉｆ　７　、５　の溶液３０μｌ　を加えた。フレノウフラグメント（Ｂｏｔｈｒｉｎｇｈｇｒ　−Ｍａｎｎｈｇｉｍ　、西ドイツ）５０単位を加えて氷浴上で１０分間放置してから試料を２３℃とした（３０分）。さらにフレノウフラグメント５０単位を追加し２３℃で６０分間保持してからポリメラーゼを６５℃、１０分間で失活きせた。エタノールで沈でんさせＥｃｏ　Ｒ■とＨｉｎｔｌ　を用いて前述の方法で分断した。０．２２　ｈｂフラグメントを５％ポリアクリルアミドゲル（電気泳動後）から切り出し、このフラグメントをＰＣＴ／ＳＥ８．３１０Ｏ２９７に記載の方法に従って溶出し精製した。この精製フラグメント５０　ｒＬｆ　をｐｃｏ　Ｒ１、Ｂ鼎革璽　で分割したファージＭ１３ｍｐ９２００　ｎｔ　と混合（全容２０μ２）した。連結（リゲーション）後前述の方法でＥ、　ｃｏｌｉ　／　Ｍ　８３を形質転換し、青色プラークの背景の下、白色プラークを検出した。

白色のプラーク４８ケはさらに２つの合成プローブを用いて、Ｗｉｎｔｅｒら（Ｎａｔｗｒｅ　２９９　、１９８２年ＩＯ月２１日）の方法でハイブリット形成による分析を行なつち濾液を３２Ｐ−ラベルオリゴヌクレオチットを用いて室温下ハイブリッド化し、温度を色々に変えて洗滌した。

Ａ２グローブ；　５’−ＡＴＧＧＧＴＣＣＣＧＡＡＡＣ−３’（スウェーデン特許願屋８３０３６２６−’？　”）を用いると、４ケを除いてクローンはすべて４４℃の洗滌後強いハイブリゼーションを示し、これらのクローンがオリジナルのＩＧＦ−１遺伝子を含むことを証明した。プローブＰ　、５’−ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧＡＣＣＣ−３′　を用いると先の４ケの陰性コロニーは顕著なハイプリゼーションを示した。この４ケのうち１ケ（ｍｐ　ｑ　／Ｉ　Ｇ　Ｆ　−Ｉ　− Ｍ３と命名）についてユニバーサル・プライマーを用い前述の方法を甲いてその配列を調べた。これは第９図の通り、突然変異誘発がうまく起っていることを証明した。

７７一ジｍｐｑ／　Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１、Ｍ　３　２００　ｎ？　とプラスミドＰＵｃ　８２００　ｎｙをＥｃｏ　ＲｌとＨｉｎぞＩで別々に分割した。Ｔ４−リガーゼで処理（全容２０μりし、このＤＮＡを用いてＥ、ｃｏハＪＭ８３を形質転換し、細胞をＡＸＩ−プレートにまいた。前述の方法で白色コロニーの制限分析を行なったところ予期した通り、０．２２　ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ　／　ＨｉｎｔＬ　Ｈ（挿入）を含んだｐＵＣＦ３プラスミドであることが判った。このプラスミドをｐＫＧｌｌと命名し、次の工程で使用した。

ＣｐＫＧ（１を含むシャトルプラスミドＰ　Ｕ　Ｎ　２００化）を混合しく全容１００μり、＋１４℃で一夜連結した。Ｅｃｏ　Ｒｙで消化してから、このＤＮＡ混合物をＬｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１　に形質転換し、５ｏμ２アンピシリン／ｎｌを含むＬＡプレートに採取した。５２ケのコロニーをクロラムフェニコール１０μｒ／ｉ、！：アンピシリン５０μり鷹を含有するＬＡプレートに採取した。２８℃で２日後、一つのクローンが現れたので、そのプラスミドを制限分析にかけた。第１０図に示すプラスミドｐ　Ｕ　Ｎ　２００である。ＩＧＦ−１遺伝子を含むこのプラスミドはＥ、　ｃｏｌｉとＳ、　ａＴＬｒｅｗｓの両者で複製できる。

ＰＵＮ２００１　μ７とプラスミドＰＳＰＡＩμ？（いずれもＥｃｏ　Ｒｌで消化）を混合（全容量ｔｏｏμりし、連結した（１４℃、−夜）。このリガーゼを６５℃、１０分−間加熱して失活させた。Ｅｃｏ　Ｒｙで消化してバックグランドクローン（ｐｓＰＡ１６含有）の数を減らしてからこのＤＮＡ混合物をＥ、　ｃｏハＨＢＩＯ１に形質転換し、５０μりのアンピシリンを含むＬＡプレートにまいた。４８ケのクローンのプラスミドを制限地図により解析し、そのうちの３つが１．１　ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒｌ　挿入ＣｐＳＰＡ１６より）をもつＰＵＮ２００（プロティンＡ遺伝子の５′−末端に対応）を含むことが判った。これらの３つのプラスミドの挿入配向性をＨｉｎｄ　Ｈで分断して分析し、このうちの２つかプロティンＡをコードする遺伝子とＩＧＦ−１の間に予測通り融合を有することが判った。このプラスミドはｐＵＮ２０１と命名された（第１０図）。このヌクレオチット配列とこの遺伝子融合の推測アミノ酸配列を第１１図に示した。

この成熟ハイブリッド蛋白質の分子量は３８７０１と推測される。

これら３つのクローンのうち一つは（ＰＵＮ２０２と命名）ＩＧＦ−１遺伝子に対して反対の方向にプロティンＡ遺伝子をもっている（第１０図ン。このプラスミドは分子ｉ　３０９６３で、トランク−ドブロチインＡをコードする（第１２図）。

工程（ＤからのプラスミドｐＵＮ２０＋とｐ　Ｕ　Ｎ　２０２の１０μりを用いＧ６ｔｚ　、　Ｆらの方法（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４５゜７４−８１（ｌｉ＋））と６国際特許出願ＰＣＴ／５Ｅ８３１００２９７　’の方法に従ってＳ、　ａｔＬｒｔｕｓ　Ｓ　Ａ　ｌ　１３を形質転換した。（工程１，４）　３７℃、３日後にクロラムフェニコール耐性クローンを検出し、これらの組換え体をクロラムフェニコール（１０μｙ／ｍｔ　）を含％ＴＳＡ−プレート（ＴｒｙｐｔｉｃｃＬ、ｒｔ　Ｓａｙ　Ａｇａｒ　）に画線した。それぞれのプラスミド（ｐ　ＵＮ　２０１　、　ｐ　ＵＮ　２０２　）について−ケの組換え体を選んで、さらに分析を行なった。純粋なプラスミドの制限地図によりＳ、ａｕｒ化Ｓ　ＳＡ　１１３宿主にインタクトプラスミドが導入きれたことが判った。

それぞれＰＵＡ’２００　、　ｐＵ＃２０１　、　ＰＵＡ’２０２　（工程ＨＣ，Ｄからのもの）を含むＥ、　ｃｏム細胞とｐＵＮ２０１ニコール（ｌ　Ｏａｔ／ｍｌ　）　を含むＴ　Ｓ　Ｂ　（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　５ｏｙＢｒＯｔん）で培養した。Ｓｏｒｗａｔｌ　Ｇ　Ｓ　Ａ−ローターで６０００τｐｍ、１０分間遠心分離して細胞をペレットとし、上澄培地は保存した。細胞ペレットをＰＢＳ＋ＴＷＥＥＮ１０ｄで洗滌しもう一度遠心分離した。次に、細胞ペレットをプロテアーゼインヒビツタ−緩衝液（０，０２Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７，５、０，１Ｍｈａｃｌ　、　０．５％デオキシコール酸ナトリウム、　１％トリ　トンＸ　−ｔｏｏ　、　０．１　％ドテシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））ｌｏｉにＦ［ｆｆｉさせた。

この細胞を水浴上でＭＳＥソニケーターで超音波処理（４０秒、４回）し、１５０００　ｒｐｍで１ｏ分間（ＳｏτυαｔＩ　ＳＳ−３４０−ター）遠心分離した。上澄の細胞抽出物を集めＥＬＩＳＡ−テストで前述の手法に従って試料のプロティンＡの量を測定した。結果は表４に示す通りである。

表　４超音波処理した細胞培養物１４当りのプロティンＡの量（ＥＬＩＳＡテスト）。

０値は０．１μ２鷹未満であるこＥ、　ｃｏｌｉＨＢ　１０１　（Ｐ（７Ｎ２００　）　ＯＯＥ、　ｃｏｌｉＨＢ　１０１　（ＰＵＡ’２０１　）　２　０Ｅ、　ｃｏハＨＢ　１０１　（ＰＵＮ２０２　）　２　０Ｓ、　ａａｒｅＬＬｓ　ＳＡ　ｌ　１３　（ＰＵＡ’２０１　）　０．２　５Ｓ：　ａｕｒｔｕｓＳＡＩＩ３ＣｐＵＮ２０２）　０　５Ｅ、　ｃｏＬｉＨＢ　１０１　０　０Ｓ、　ａｕｒｔｕｓ３ＡＩＩ３　０　０ラレるプロティンＡの量はプロティンＡ遺伝子含有フラグメント（プラスミドｐＵＮ２０＋対ｐＵＮ２０２＞の配向によって影響されないことを示している。すなわち、ｐ　Ｕ　Ｎ　２０１でコードされるプロティンＡＩＧＦ−１）・イブリッド蛋白質はｐＵＮ２０２でコードされるトフンケートプロテインＡとほぼ同じレベルでつくられる。測方の蛋白質は期待通りＥ、　ｃｏｌｉの細胞抽出物とＳ、αＬＬｒｇＷ、？の培地で見出された。

工程厘から得られた、それぞれｐ　Ｕ　Ｎ　２０１とＰＵＮ２０２を含むＳ、α ｔｂｒｔｗｓ　Ｓ　Ａ　ｌ　１３の培地をそれぞれ、予め酢酸ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ酢酸ナトリウム、２％ＮαＣ／。

ｐＨ−５−５）で平衡にしたＩ、Ｇ−セファロース■４Ｂカラム（Ｐんａｒｍａｃｉａ　Ａ　Ｂ　、　ＵｐｐｓａＬａ　、スウェーデン）　〔Ｈｊａｌｍら、ＦＥＢＳ　Ｌｇｔｔ、２Ｂ＋’１３−’１６ＣＩ９”７２）〕Ｋ通した。カラムを同じ緩衝液で洗滌してからグリシン緩衝液（０，ｌｌ＋Ｖｉグリシン、２％Ｒａｃｅ　、　ｐＨ−３，０）で吸着プロティンＡを溶離した。溶出フラクションを蒸溜水で透析してから２つに分けて凍結乾燥した。そのうちの一つについて１３％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析（１０（１’、１２時間）した。アミドブラック（０，１％、″″４５％メタ／−ルー１０％酢酸中）で発色した。ｐＵＮ２１０　Ｋ　ツイテハ分子ｉ　３８７０１　ノ蛋白質が、ＰＵＮ２ｏ２については分子量３０９６３の蛋白質が主要部であることが判った。これはＤＮＡ配列から推測される大きさと一致するＣＩＤ工程参照）。

もう一つの試料については７０％蟻酸０．５４に懸濁し、３７℃で２日間インキュベートした。この処理でアスパラギ／酸−プロリンの間のジペプチド鎖が分断される。

ｐＵＮ２引でコードされた蛋白質から得られた分解生成物は、Ｎ−末端グリシンを欠くＩＧＦ−Ｊ部とは別に、５つのオリゴペプチド（分子量６８００　、６６００　、６６００　。

６６００　および６００）からなる。５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動は、前述の通り主要蛋白質バンドが約３８０００から７０００　附近の数ケのバンドへとシフトすることを示している。

蟻酸で処理した蛋白質を凍結乾燥し、蒸溜水に再懸濁した。ｐ　Ｕ　Ｎ　２０１からの試料は前述の通りＩ、Ｇ−セファロース■４Ｂカラムに−ｍ−した。通過液と溶出物（グリシン緩衝液と共に）は次の分析にとっておいた。

ヒト胎盤膜の粒フラクションをマトリックスとしてＢａ１ｌら（Ｊ、　ｃｌｉｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｔｒｂｏｌ、　ＭｅｔａＡ、　４８．２７１−２７８　（＋９７４）　）　の方法に従ってラジオレセプターアッセイ（ＲＲＡ　）を行なった。標準試料として力価が一単位（Ｕ）　Ｉ　Ｇ　Ｆ　／ｆｎｌ（１）正常ヒト血清音用いた。ラベルに用いたペプチドはＣｏ　ｈ７＋、フラクション１■から精製（５００μ層蛋白質（ＲＲＡによる））で）した。ペプチドのラベル化ハＴｈｏｒｅｌｌら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　、４ｃｔα２５１　、３６３−３６９（＋９７１））の方法で行なった。トレーサーはカルボキシメチルセルロースカラムを用いグラブイエｙ　ト（０，１Ｍ　ＮＨ４０ＡｃでｐＨ４，０から６．８に）法で溶離し、精製した。

トレーサーの活性はほぼ２０μｃｉ／μ２の値であった。次の方法でアッセイを行なった。

標準試料または未知（被検）試料（１００μｌ）を胎盤膜１００　ｐｌ　、ラヘｋ　Ｉ　Ｇ　Ｆ　−ｌ　１００　ｔｔｌと一緒に４℃で一夜インキュベートした。遠心分離後ベレットを一回洗滌し、α−カウンターで測定した。１インハウス ”コンピュータープログラムで力価の計算をした。

工程■の試料の蟻酸処理前後のものについて、ＲＲＡテストでの分析を行ない、表５に示す結果を得た。

表　５Ｓ、　ａＬＬｒｅｌＬ、９Ｓ　Ａ　ｆｉ３　（ｐ　Ｕ　Ｎ　２０１　）とＳ、α ｕ、ｒｅｗｓｙ　５　Ａ１１３　（ｐＵＮ　２０＋　）の生育培地のＩＧＦ−１活性についてのラジオレスブタ−分析（ＲＲＡ）（Ｉ、Ｇ−アフィニティクロマトグラフイーで抽出精製後）０の値はＩＵ／１培地未満に相当する。

蟻酸処理後　０ＰＵＡ’２０１　蟻酸処理前　０蟻酸処理後　１４３通過液“　１０６溶離液１１９簀蟻酸処理試料をＩ、Ｇ−セファロース■カラムに通し結合した（溶離液）ＩＧＦ−１と結合しない（通過液）表５から判る通り、ｐ　Ｕ　Ｎ　２０＋でコードしたハイブリッド蛋白質にはＩＧＦ−１活性がみられなかった。蟻酸処理でＩＧＦ−１活性が生じ、この活性の大部分はＩ、Ｇアフイニテイカラムに結合せず、プロティンＡとＩＧＦ−１部との間にうまく分断の起ることを示した。

以上実施例によって本発明を説明したが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではなく、請求の範囲から逸脱しない範囲内で多くの変更、修飾の可能であることは勿論である。

国際出願番号：　ｐＣＴ／微　生　物明細書第１４頁第２〜６行に１照された微生物に関する随時シートＡ　寄託の同定寄託機関の名称ドイツ微生物収集所（ＤＳＭ）寄託機関の住所ドイツ連邦共和国、ディー３４００　ゲンチンケン。

クリーゼバンハシュトラーセ　８寄　託　日　受託番号１９８２年７月１２日　ＤＳＭ　２４３４Ｉ特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約国際様式 ■、微生物の同定寄託者により示された同定表示　国際寄託機関によシ付与さ…、　科学的性質及び／又は生物分類学上の指示上記■に同定された微生物には以下のものが添附された：科学的性質提案された生物分類学上の指示 ■、受領及び受託この国際寄託機関は上記■に同定された微生物を受託し、これは１９８２年７月１２日（原寄託日）に受領した。

■３国際幣託機関名称ニドイン微生物収集所　国際寄託機関を代表する帷（署名）１９８２年７月１３日特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約国際様式％式％ ■、微生物の同定国際寄託機関により付与された受託番号　ＤＳＭ　２４３４寄託又は移転の日　１９８２年７月１２日■、生存能力声明薔上記Ｈに同定された微生物の生存能力は臥験芒れた。その期日に上記微生物は生存していた。

■１国際寄託機関名称：ドイツ微生物収集所　国際寄託機関を代表する権（署名）１９６２年７月１３日７３島際出願査号：ｐＣＴ／明細薔第１４頁第２〜６行に引照された微生物に関する随時シートＡ　寄託の同定寄託機関の名称ドイツ微生物収集所（ＤＳＭ）寄託機関の住所ドイツ連邦共和国、ディー３４００　ケンチンケン。

クリーゼバソハシュ）７−セ　８寄　託　日　受託を号１９８３年８月１５日　ＤＳＡｉ　２７０６７４　特表昭ＧＯ−５００４ｇＯ（２１）特許手続上の微生物の寄託の国・際的承認に関するブタ−ペスト条約国際様式 ■、微生物の同定 ■、　科学的性質及び／又は生物分類学上の指示上記ｌに同定された微生物には以下のものが添附された：科学的性質提案された生物分類学上の指示 ■、受領及び受託この国際寄託機関は上記Ｉに同定された微生物を受託し、これは１９８３年８月１５日（原寄託日）に受領した。

Ｎ９国際寄託機関名称：ドイツ微生物収集所　国際寄託機関を代表する権１９８３年８月２３日特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約国際様式 ■、微生物の同定国際寄託機関により付与された受託番号　１）ＳＭ　２７０６寄託又は移転の日　１９８３年８月１５日■、生存能力声明書上記■に同定された微生物の生存能力は１９８３年８月２２日に試験された。その期日に上記微生物は生存していた。

■、国際寄託機関名称：ドイツ微生物収集所　１際寄託機関を代表する権□ヶエディー３４００ヶッｆ：７ヶ７．　限を肩する者又は事務官のグリーゼバンハシュトラーセ８　署名（署名）１９８３年８月２３日す際出願番号：ＰＣＴ／微　生　物明細書第２２頁第３７行〜第２３頁、第１行に引照された微生物に関する随時シートＡ　寄託の同定寄託機関の名称ドイツ微生物収集所（ＤＳＭ）寄託機関の住所ドイツ連邦共和国、ディー３４００ゲンチンケン、グリーゼバンハシュトラーセ　８寄　託　日　受託番号１９８３年２月４日　ＤＳＭ　２５９１特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタ−ペスト条約国際様式 ■、微生物の同定 ■、　科学的性質及び／又は生物分類学上の指示上記■に同定された微生物には以下のものが添附された：科学的性質提案された生物分類学上の指示 ■、受領及び受託この国際寄託機関は上記Ｉに同定された微生物を受託し、これは１９８３年２月４日（原を託日）に受領した。

■１国際寄託機関名称ニドイン微生物収集所　国際寄託機関を代表する権１９８３年２月１７臼特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタ−ペスト条約国際様式 ■、破生物の同定国際寄託機関により付与された受託番号　Ｄｓｉ、ｔ　２５９＋寄託又は移転の日　１９８３年２月４日■、生存能力声明書上記■に同定された微生物の生存能力は１９８３年２月８日に試験された。その期日に上記微生物は生存していた０■０国際寄託機関名称二ドイツ微生物収集所　国際寄託機関を代表する権１９８３年２月１７日９国際出願番号：ＰＣＴ／微　生　物明細書第２３頁第１６〜１８行に１照された微生物に関する随時シート Δ　寄託の同定寄託機関の名称ドイツ微生物収集所（ＤＳＭ）寄託機関の住所ドイツ連邦共和国、ディー３４００　ケンチンケン。

グリーゼバツハシュトラーセ　８寄　託　日　受託番号１９８３年２月４日　ＤＳＭ　２５９２特許手続上の微生物の弁孔の国際的承認に関するフダペスト条約国際様式 ■、微生物の同定 ■、　科学的性質及び／又は生物分類学上の指示上記Ｉに同定された微生物には以下のものが添附された：科学的性質提案された生物分類学上の指示 ■、受頒及び受託この国際寄託機関は上記Ｉに同定された微生物を受託し、これは１９８３年２月４日（原寄託日）に受領した。

■０国際寄託機関名称二ドイツ微生物収集Ｆ５ＪＴ　１際寄託機関を代表する罹グリーセバソハシュトラーセ８　著名（著名）１９８３年２月１７日特許手続上の微生物の畜託の国際的承認に関するブタペスト鍮約国際様式 ■、微生物の同定国際寄託機関によｐ付与された受託番号　ＤＳＭ　２５９２寄託又は移転の日　１９８３年２月６日■、生存能力声明書上記Ｈに同定された微生物の生存能力は１９８３年２月８日に試験された。その期日に上記微生物は生存していた。

■１国際寄託機関名称ニドイン微生物収集ＰｙＴ　国際寄託機関を代表する侑（署名）１９８３年２月１７日ＦＩＧ、２ＦＩＧ、３Ｘｙ＋Ａｃｃ１＾ｃｃｌＹＭＩＦＩＧ、５ＦＩＧ、６Ｄ、　７　。ケイ　、　−ヵ、、、／、−ヤ　ｐＳＰ人、４ＦＩＧ、７ＦＩＧ、８ＶａＩＡｓｎＳｅｒｋｔＡｓｐＰｒｃＧｌｕＴｈｒＦＩＧ、９ＡＡＡ　ＧＡＣＧＡＴ　ＣＣＧ　ＧＧＧ　ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＴＡＡＦＩＧ、１２ＦＩＧ、１１ＦＩＧ、１３ＡＩＣＦ−１遺伝子ｌＧ１３Ｂ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）昭和５９年１０月９日特許庁長官　志　賀　学　殿１、％許出願の表示ＰＣＴ／５ＥＢ４１０００４６２発明の名称蛋白質とポリペプチドを製造及び分離する方法並びにそのための組換えベクター３、特許出願人名称　ファーマシア、エイ、ビイー７国籍　スウェーデン国５、補正書の提出年月日１９８４年７月９日詩才の範囲１、　プロティンＡもしくはその活性ポリペプチド％または免疫グロブリンの一定領域と結合しうる他の巨大分子をコードするＤ’ＮＡ配列に、これらのＤＮＡ配列が一緒になって目的とする蛋白質もしくはポリペプチドと上記プロティンＡ、活性ポリペプチドフラグメントもしくは巨大分子との間のＩＩＧ−結合融合生成物をコードするように機能的に連結された。目的とする蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターをつくシ；この組換えベクターを用いて、上記融合蛋白質またはポリペプチドをコードする結合ＤＮＡ配列が宿主によシ発現されるように適合性宿主を形質転換し、そして適当な生長培地中で形質転換された宿主を培養して上記融合蛋白質またはポリペプチドを生産させ；キャリアー物質上に不溶化されたそれらの１９０またはＦｃ一部に吸着させることにより上記融合蛋白質またはポリペプチドを選択的に単離し；所望により、上記１ｆ／Ｇ＝支持キヤリアーから融合蛋白質またはポリペプチドを脱着さぜる；工程からなることを特徴とする。目的の蛋白質またはポリペプチドまたはそれらの誘導体を製造し選択的に分離する方法。

２　培養宿主の細胞溶解物または生長培地を用いて融合蛋白質またはポリペプチドを単離することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。

３゜　結合ＤＮＡ配列でコードされる融合蛋白質またはポリペプチドか、前記プロティンＡ部分と前記目的蛋白質重たはポリペプチド部分との間に目的蛋白質ならひに。

好ましくはプロティンＡ部分には存在しない特異的切断部位を有しており、融合蛋白質またはポリペプチドの残部がキャリアーに吸着されるときまたはそれをキャリアーから脱着した後のいずれかにおいて、前記目的蛋白質またはポリペプチド部を融合蛋白質重たはポリペプチドの残部から分断することを特徴とする請求の範囲第１項せたは第２項記載の方法。

歳　前記特異的分断部位がグロテアーゼ、ヒドロキシルアミン、臭化シアンまたは蟻酸からなる群から選ばれた分割剤に対して感受性のアミノ酸またはアミノ酸配列であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。

５、　蛋白質、その活性ポリペプチドフラグメントまたは免疫グロブリンの一定領域と結合できるその他の巨大分子をコードする機能的ＤＮＡ配列、およびプロティンｌをコードする配列のいずれかのストンプコドンの前方に位置するマルチリンカ−を含有した発現ベクターをつくり；前記目的蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を上記マルチリンカ−配列の適当な制限部位に挿入し；所望によりプロティンＡをコードするＤＮＡ配列と目的蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列との間に前記特異的分断部位をコードするＤＮＡ配列を挿入し、かつ好ましくは前記分断部位コード配列を発現ベクター挿入前に該発現ベクターまたは目的蛋白質またはポリペプチドコードベクターの接合末端として調製することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の方法。

＆　キャリアーを低ρＢ条件＆藁い塩類濃度条件、カオトロピツクイオンでの処理、捷たは過剰の可溶性プロティンＡ　、　１９Ｇまたはそれらの７ラグメントの競合溶離に付することによって、該融合蛋白質またはポリペプチドをキャリアーから脱着することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第５頓のいずれかに記載の方法。

７　目的の蛋白質またはポリペプチドをコートするＤＮＡ配列に、結合された配列が一緒になってプロティンＡ。

その活性ポリペプチドフラグメントまたは巨大分子と上記目的蛋白質またはポリペプチドとの間のＩ／ｉＧ−結合能力を有する融合生成物をコードするように機能的に連結された。プロティンＡもしくはその活性ポリペプチドフラグメントまたは免疫グロブリンの一定領域と結合しうる他の巨大分子をコードするＤＮＡ配列を含有することを特徴とする組換えベクター。

８、　前記プロティンｌコードＤＮＡ配列か、前記融合蛋白質またはポリペプチドをコードする結合１）ＮＡ配列の５′−末端をスタートとしてのひ、該プロティンバコード配列が好ましくは構造プロティンＡコード遺伝子のプロモーターとシグナル配列を含むことを特徴とする請求の範囲第７項記載の組換えベクター。

立　前記目的蛋白質またはポリペプチド、および好ましくはプロティンＡ部には存在しないでかつ分割剤で分断できる特異的切断部位をコードするＤＮＡ配列を前記結合ＤＮＡ配列の間の接合点に有することを特徴とする請求の範囲第７項または第８項記載の組換えベクター。

１０、前記特異的分断部位がグロテアーゼ、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、蟻酸からなる群から選ばれた分割剤による分断作用に感受性をもつアミノ酸またはアミノ酸配列であることを特徴とする１釆の範囲第９項記載の組換えベクター。

１１、それかフラスミトである請求の範囲第７項乃至第１０項のいずれかに記載の組換えベクター０１２、プロティンｌ、その活性ホリペフチドフラグメントせたけ免疫グロフリンの一定領域に結合する能力のあるその他の巨大分子をコードする機能的ＤＩＶΔ配列と、フロティンＡコード配列のいずれかのストンプコトンの前方に位置するマルチリンカ−配列を含む発現ベクターをつくり、前記目的蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を該マルチリンカ−配列の適当な制限部位に挿入し、所望により該目的蛋白質またはポリペプチド及び好ましくはプロティン４部に存在しない特異的分断部位をコードするＤＮＡ配列を該プロティンｌをコードするＤＮＡ配列と目的蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の間に挿入し、かつ好ましくは分断部位コード配列か１発現ベクター挿入前に１発現ベクター。

または目的蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の接合末端として調製されることを特徴とする請求の範囲第７項乃至第１１項のいずれかに記載の組換えベクターの調製方法。

１３、プロティンＡ、その活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンの一定領域に結合する能力のあるその他の巨大分子をコードする機能的ＤＮＡ配列と、グロテインΔコード配列のいずれかのストンプコドンの前にあるマルチリンカ−配列とを含むことを特徴とする発現ベクター。

１４　好ましくはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）　、バチルス（Ｂ αｃｉｌｌｔｔｓ）−ｊたはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ゛）株である請求の範囲第７項乃至第１２項のいずれかに記載の組換えベクターによって形負転候された宿主微生物。

１５、請求の範囲第１．２．５および６項のいずれかによって生産されることを特徴とする融合蛋白質またはポリペプチド。

１６　それかそれらのＩＩＩＧまたはｐｃ一部を支持するキャリアー物質に結合していることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の融合蛋白質またはポリペプチド。

１７　プロティン４またはその活性ポリペプチドフラグメントまたは免疫グロブリンの一定領域に結合する能力をもつその他の巨大分子をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結した。目的蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有し、このＤＮ／１配列か一緒になって前記目的蛋白質またはポリペプチドと、前記プロティンΔ、その活性ポリペプチドフラグメントまたは巨大分子との間のＩｇＧ−結合融合生成物をコードする組換えベクターをつくり；この結合１）ＮＡ配列を適合性宿主に形質転換して該融合蛋白質またはポリペプチドがその宿主の中で発現するようにし、適当な生産培地でその形質転換宿主を培養して該融合蛋白質またはポリペプチドを製造する工程からなることを％徴とする目的蛋白％またはポリペプチドまたはその誘導体グレパレートをつくり、容易に単離する方法。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１、　プロティンＡもしくはその活性ポリペプチド、または免疫グロブリンの一定領域と結合しうる他の巨大分子をコードするＩ）ＮＡ配列に、これらのＤＮＡ配列が一緒になって目的とする蛋白質もしくはポリペプチドと上記プロティンＡ、活性ポリペプチドフラグメントもしくは巨大分子との間のＩｇＧ−結合融合生成物をコードするように機能的に連結された、目的とする蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターをつくり；この組換えベクターを用いて、上記融合蛋白質またはポリペプチドをコードする結合ＤＮＡ配列が宿主により発現されるように適合性宿主を形質転換し、そして適当な生長培地中で形質転された宿主を培養して上記融合蛋白質またはポリペプチドを生産させ；１９Ｇ−支持キャリアー物質に吸着させることにより上記融合蛋白質またはポリペプチドを選択的に単離し；所望により、上記１９Ｇ−支持キャリアーから融合蛋白質またはポリペプチドを脱着させる；工程からなることを特徴とする、目的の蛋白質またはポリペプチドまたはそれらの誘導体を製造し選択的に分離する方法。２　培養宿主の細胞溶解物または生長培地を用いて融合慕由暑嘘介はボ１１ペプチドを車離することを特徴とする１　結合１）ＨＡ配列でコードされる融合蛋白質またはポリペプチドが、前記プロティンＡ部分と前記目的蛋白質またはポリペプチド部分との間に目的蛋白質ならびに、好１しくけプロティンＡ部分には存在しない特異的切断部位を有しておシ、融合蛋白質またはポリペプチドの残部がＩＩＧ−支持キャリアーに吸着されるときまたはそれをキャリアーから脱着した後のいずれかにおいて、前記目的蛋白Ｊｉまたはポリペプチド部を融合蛋白質またはポリペプチドの残部から分断することを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の方法。４　前記特異的分断部位がプロテアーゼ、ヒドロキシルアミン、臭化シアンまたは蟻酸からなる群から選ばれた分割剤に対して感受性のアミノ酸またにアミノ酸配列であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。５、　蛋白質、その活性ボリベブチドフラダメントまたは免疫グロブリンの一定領域と結合できるその他の巨大分子をコードする機能的ＤＮＡ配列、およびプロティンＡをコードする配列のいずれかのストップコドンの前方に位置するマルチリンカ−を含有した発現ベクターをつくシ；前記目的蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を上記マルチリンカ−配列の適当な制限部位に挿入し；所望によりプロティンＡをコードするＤＮＡ配列と目的蛋白質またはポリペプチドをコードするＩ）ＮＡ配列との間に前記特異的分断部位をコードするＤＮＡ配列を挿入し、かつ好ましくは前記分断部位コード配列を発現ベクター挿入前に該発現ベクター″！たは目的蛋白質またはポリペプチドコードベクターの接合末端として調製することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の方法。１：ＬＩｇＧ−支持キャリアーを低ｐＨ条件、高い塩類濃度条件、カオトロピツクイオンでの処理、または過剰の可溶性プロティンＡ、ＩｉＧまたはそれらの７ラグメントの競合溶離に付することによって、該融合蛋白質またはポリペプチドをＩＩＧ−支持キャリアーから脱着することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の方法。７　目的の蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、結合された配列が一緒になってプロティンＡ、その活性ポリペプチドフラグメントまたは巨大分子と上記目的蛋白質またはポリペプチドとの間のＩｙＧ−結合能力を有する融合生成物をコードするように機能的に連結された、プロティンＡもしくはその活性ポリペプチドアラグメントまたは免疫グロブリンの一定領域と結合しうる他の巨大分子をコードするＤＮＡ配列を含有することを特徴とする組換えベクター。８、　前記プロティンＡコードＤＮＡ配列が、前記融合蛋白質またはポリペプチドをコードする結合１）ＮＡ配列の５′−末端をスタートとしてのび、該プロティンＡコード配列が好ましくは構造プロティンＡコード遺伝子のプロモーターとシグナル配列を含むことを特徴とする請求の範囲第７項記載の組換えベクター。９、　前記目的蛋白質またはポリペプチド、および好１しくけプロティンＡ部には存在しないでかつ分割剤で分断できる特異的切断部位をコードするＤＮＡ配列を前記結合ＤＮＡ配列の間の接合点に有することを特徴とする請求の範囲第７項または第８項記載の組換えベクター。１０、前記特異的分断部位がプロテアーゼ、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、蟻酸からなる群から選ばれた分割剤による分断作用に感受性をもつアミノ酸またはアミノ酸配列であることを特徴とする請求の範囲第９項記載の組換えベクター。１１、それがプラスミドである請求の範囲第７項乃至第１０項のいずれかに記載の組換えベクター。１ｚ　プロティンＡ、その活性ポリペプチドアラグメントまたは免疫グロブリンの一定領域に結合する能力のあるその他の巨大分子をコードする機能的ＤＮＡ配列と、プロティンＡコード配列のいずれかのストップコドンの前方に位置するマルチリンカ−配列を含む発現ベクターをつくり、前記目的蛋白質またはポリベグテド全コードするＤＮＡ配列を該マルチリンカ−配列の適当な制限部位に挿入し５、所望により該目的蛋白質またはポリペプチド及び好ましくはプロティンＡ部に存在しない特異的分断部位をコードするＤＮＡ配列を該プロティンＡをコードするＤＮＡ配列と目的蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の間に挿入し、かつ好ましくは分断部位コード配列が、発現ベクター挿入前に、発現ベクター、または目的蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＭＡ配列の接合末端として調製されることを特徴とする請求の範囲第７項乃至第１１項のいずれかに記載の組換えベクターの調製方法。１３、プロティンＡ、その活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンの一定領域に結合する能力のあるその他の巨大分子をコードする機能的ＤＮＡ配列と、プロティンＡコード配列のいずれかのストップコドンの前にあるマルチリンカ−配列とを含むことを特徴とする発現ベクター。１４、好ましくはエシェリキア（Ｅ３Ｃｈｅｒｉｃれα）、ノくチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ、ｓ）　またはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈ　ｌｏｃｏｃｃｗｓ）株である請求の範囲第７項乃至第１２項のいずれかに記載の組換えベクターによって形質転換された宿主微生物。１５、請求の範囲第１．２．５および６項のいずれかによって生産されることを特徴とする融合蛋白質またはポリペプチド。１Ｇ　それがＩＩＧ−支持キャリアー物質に結合していることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の融合蛋白質またはポリペプチド。１７、プロティンＡまたはその活性ポリペプチドフラグメントまたは免疫グロブリンの一定領域に結合する能力をもつその他の巨大分子をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結した、目的蛋白質またはポリペプチドをコードする１）ＨＡ配列を含有し、このＩ）ＮＡ配列が一緒になって前記目的蛋白質または、ポリペプチドと、前記プロティンＡ、その活性ポリペプチドフラグメントまたは巨大分子との間のＩｇＧ−結合融合生成物をコードする組換えベクターをつくり；この結合ＤＮＡ配列を適合性宿主に形質転換して該融合蛋白質またはポリペプチドがその宿主の中で発現するようにし、適当な生産培地でその形質転換宿主を培養して該融合蛋白質またはポリペプチドを製造する工程からなることを特徴とする目的蛋白質またはポリペプチドまたはその誘導体プレバレートをつくり、容易に単離する方法。