JPH04104794A - 形質転換体および融合蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、遺伝子組換え技術により、バソアクティブ・
インテスティナル・ポリペプチド（以下、ＶＩＰと略称
する）の前駆体を得る上で有用な融合蛋白質分泌発現プ
ラスミド、それで形質転換された微生物、及び融合蛋白
質の製造方法に関与る。

［従来の技術と発明が解決しようとする課題］分子量が
比較的小さな生理活性ペプチドとして、ＶＩＰが知られ
ている。このＶＩＰは２８個のアミノ酸残基からなり、
サッド（ＳａＩｄ）とムット（Ｍｕｔｔ）により、ブタ
十二指腸粘膜から血管拡張作用などの薬理作用を持つペ
プチドとして単離され、かつその構造が決定されている
［５ｃｉｅｎｃｅ　１６９．１２１７　（１９７０）］
。このＶＩＰは腸管や脳のニューロンで合成され、消化
管や血管を弛緩させ小腸分泌を促進する。

現在、ＶＩＰの持つ気管拡張作用や血流増加作用を利用
して、医薬品の開発検討が行われているが、ＶＩＰの産
生、分泌量は極めて微量であり、生体から大量に得るこ
とは困難である。

一方、ＶＩＰはペプチドであるので、遺伝子組換え法に
より微生物に生産させることも考えられる。しかし、微
生物により比較的分子量の小さいペプチドを直接発現さ
せる場合、生産されるペプチドが宿主由来のプロテアー
ゼにより分解されるため、効率よく多量のＶＩＰを得る
ことが困難である。

ヒトＶＩＰと同箸の薬理作用を何するペプチドに関し、
特開平１−２９６９９６号公報およびＩＥｕｒ、　Ｊ、
　ｒｌｏｃｈｅＬ、　１７８．．３４３−３５０　（１
９８８）には、ＶＩＰ前駆体又はＶＩＰアナログを、大
腸菌由来のβ−ガラクトシダーセとの融合蛋白質として
、大腸菌を宿主として産生させることが提案されている
。この方法においては、産生された融合蛋白質は分泌発
現せず、菌体内に蓄積する。

従って、本発明の目的は、キャリアー蛋白質とＶＩＰ前
駆体とかスペーサー配列を介して連結した融合蛋白質を
菌体外に効率よく多量に産生ずる上で有用な融合蛋白分
泌発現プラスミド、および該プラスミドで形質転換され
た微生物を提供することにある。

本発明の他の目的は、ＶＩＰ前駆体を効率よく多量に得
ることかできる製造方法を提供することにある。

［発明の構成コ 本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討の結果、
ＶＩＰ前駆体を、スペーサ配列を介してキャリアー蛋白
質と連結した融合蛋白質として分泌発現させる場合には
、宿主由来のプロテアーゼによるＶＩＰ前駆体の分解を
抑制でき、融合蛋白質が菌体外に多量に産生ずることを
見いたし、本発明を完成した。すなわち、本発明は、遺
伝子の発現に関与するプロモーター　、リボソーム結合
部位、分泌シグナル及びキャリアー蛋白質をコードする
領域と、ＶＩＰ前駆体をコードする遺伝子とが、化学的
又は酵素的に切断可能なスペーサ配列を介して連結して
いるＤＮＡ断片が、ヘクターＤＮＡに結合している融合
蛋白質分泌発現プラスミドを提供する。

また、本発明は、上記の融合蛋白質分泌発現プラスミド
により形質転換されている微生物を提供する。

さらに、本発明は、前記融合蛋白質分泌発現プラスミド
により形質転換された微生物を培養し、キャリアー蛋白
質とＶＩＰ前駆体とがスペーサー配列を介して連結した
融合蛋白質を分泌させ、回収する融合蛋白質の製造方法
を提供する。

本発明のプラスミドに含まれるキャリアー蛋白質は、特
に制限されないが、発現量が多く安定なものが好ましく
、さらには発現された融合蛋白質を簡単に分離精製でき
るものか好ましい。このようなキャリアー蛋白質として
は、例えば、大腸菌由来のβ−ラクタマーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、枯草菌由来のα−アミラーゼ、黄色
ブドウ状球菌（ＳＬａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ
ｅｕｓ）由来のプロテインＡなどが例示できる。黄色ブ
ドウ状球菌由来のプロティンＡは、大腸菌や枯草閑にお
いて安定に発現することか報告されている［Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔ、＾Ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０．６
９７〜７０１．　（１９８３）：　Ｊ、　ＢａｃＬｅｒ
ｉｏｌ、、　１６５．、７９６〜８０４．　（１９８６
）　］。特に、プロティンＡは、免疫グロブリンＧ（Ｉ
ｇＧ）のＦｃ領域と特異的に結合する５つの繰返し領域
と、細胞壁と結合する領域とを有している。このことを
利用して、Ｆｃ領域と特異的に結合する領域の後に、目
的とするＶＩＰ前駆体を連結し、融合蛋白質として発現
させた後、アフィニティークロマトグラフィーで簡単に
精製することができる。従って、キャリアー蛋白質は、
黄色ブドウ状球菌のプロティンＡ中のＩｇＧ結合能をＨ
する領域であるのが好ましい。

以下、プロティンＡの塩基配列とそれに対応するアミノ
酸配列を下記式［ｎ］に示すと共に、プロティンＡにつ
いてより詳細に説明する。

（以下、余白） ＧＡＴＡＧＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣＴＴＣ；
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を占める蛋白質であり、ヒト、マウス、ウサギなとの唾
乳類のＩｇＧのＦｃ部分と特異的に結合するが、ヒトＩ
ｇＧ３とは結合しない。またプロティンＡは、遺伝子の
発現に関り、するプロモーター領域と、リボソーム結合
部位とを有している。プロモーター領域は、例えば、黄
色ブドウ状球菌８３２５−４株［ウーレンら、Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５９．１６９５　（１９８
４）コに由来し、−１，３１〜１２０番目のヘアピン構
造と−１５１〜−１３８番目のパリンドローム配列とを
Ｈするプロモータであってもよいが、好ましいプロモー
ター領域は、本出願人が特開昭６３−２４５６７７号公
報において提案した塩基配列で表される領域である。こ
のプロモーター領域は、前記式［Ｉ１］中、−３００〜
１番目の配列に対応し、その特徴は、前記黄色ブドウ状
球菌８３２５−４１に由来するブロモター領域と異なり
、前記ヘアピン構造及びパリンドローム配列が存在しな
い点にある。

プロモーター領域の丁流（１〜１０８番目の塩基配列）
には、分泌に関与するＳ領域をコードする遺伝子が存在
し、この分泌シグナル領域の下流（１０９〜１５２４番
目の塩基配列）には構造遺伝子が存在する。

プロティンＡの構造遺伝子は、Ｅ　（１０９〜２７６番
目の塩基配列）、Ｄ　（２７７〜４５９番目の塩基配列
）、Ａ（４６０〜６３３番［Ｉの塩基配列）　、Ｂ　（
６３４〜８０７番目の塩基配列）、Ｃ（８０８〜９８１
一番目の塩基配列）、およびＸ（９８２〜１５２４番目
の塩基配列）からなる６つのユニットで構成され、Ｎ末
端から、上記の順序に結合している。なお、１５２５〜
１５５２５２５〜１５５２番目コーディング部分てあり
、１５２５〜１５２７５２５〜１５２７番目ドンである
。上記６つのユニットは、トリプシンによる分解で得ら
れ、ＥＳＤ、Ａ、Ｂ、Ｃのユニットのアミノ酸配列には
高い類似性がみられる。Ｅ領域は、プロティンＡのＮ末
端に存在するユニットであり、ＩｇＧとの結合能力か比
較的小さい。Ｄ、Ａ、Ｂ、及びＣ領域は、それぞれＩｇ
ＧのＦｃ部分との強い結合能力を有し、Ｘ領域は、プロ
ティンＡ分子を黄色ブドウ状球菌の細胞壁に結合させる
機能を有するユニットである。従って、キャリアー蛋白
質は、ＩｇＧのＦｃ部分に対して結合能を有する領域、
特に、プロティンＡの成熟蛋白質中の４４０番目のアミ
ノ酸まで、すなわち、プロティンＡの構造遺伝子中の４
４０番目のアミノ酸（シグナルペプチドを除いて）であ
るＡｓｐまての領域であるのが好ましい。また、キャリ
アー蛋白質は、プロティンＡの成熟蛋白質中の１８７番
目のアミノ酸まで、すなわち、プロティンＡの構造遺伝
子中の１８７番目のアミノ酸（シグナルペプチドを除い
て）であるＬｅｕまでの領域であるのか好ましい。

以上のように、黄色ブドウ状球菌のプロティンＡには、
遺伝子の発現に関与するプロモーター、リボソーム結合
部位、分泌シグナル及びキャリアー蛋白質をコードする
領域か含まれている。従って、プロティンＡを導入した
プラスミドは、分泌発現能を有し、キャリアー蛋白質を
コードする領域の後に、ＶＩＰ前駆体をコードする遺伝
子を、スペーサー配列を介して連結すると、キャリアー
蛋白質とスペーサー配列とＶＩＰ前駆体とからなる融合
蛋白質を分泌定規する。

キャリアー蛋白質をコードする領域とＶＩＰ前駆体をコ
ードする遺伝子は、化学的又は酵素的に切断可能なスペ
ーサー配列（アミノ酸配列）を介して連結されている。

キャリアー蛋白質をコードする領域とＶＩＰ前駆体をコ
ードする遺伝子とを前記スペーサー配列で連結すると、
産生じた融合蛋白質からＶＩＰ前駆体を容易に切断して
分離することができる。

化学的に切断可能なスペーサー配列としては、例えば、
シアノゲンブロミトにより切断されるＭｅｔ［Ｍｅｔの
後方か切断される。Ｊ、　ｒ３ｉｏｐｈｙｓＣｈｅｍ、
、　２３７．１８５６　（１９Ｂ２）コ　ギ酸により切
断されるＡｓｐ−Ｐｒｏ鎖［Ｉ３ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅ５ＣｏＩｌｓｕｎ、、　４０．１１
７３　（１９７０）　］などが挙げられる。

また、酵素的方法には、例えば、ファクターＸａが認識
する配列Ｉ　ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ［Ａｒｇの
後方か切断される。Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、。

２４９、７７８２　（１９７４）］　　　）ロロンジが
認識する配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　［Ａｒｇの後方
が切断される。Ｎａｔｕｒｅ、　２１１’ｔ、　３１４
　（１９Ｈ）　］　　　カリクレインか認識する配列Ｐ
ｈｅ−Ａｒｇ　［Ａｒｇの後方か切断される。ｌｌｅｍ
ｏｓｔａｓｉｓ、　７．１６（１９７８）］　　Ｖ８ブ
ロテアーセか認識するＧｌｕ［Ｇｌｕの後方が切断され
る。Ｐｒｏ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪ
ｓ＾、６９゜３５０６　（１９７２）　］　　プロリル
エンドペプチダーゼが認識するＰｒｏ［Ｐｒｏの後方が
切断される。旧ｏｃｈｅ＋＋１ｓｔｒｙ、　１６．２９
４２　（１９７７）　］などが含まれる。

なお、融合蛋白質を産生させる方法として、特公表昭６
０−５００４８０号公報には、プロティンＡをキャリア
ー蛋白質として用いることが開示されている。

しかしながら、ＶＩＰ前駆体を融合蛋白質として分／ヒ
・発現させることについては何ら開示されていない。

ＶＩＰ前駆体としては、ＶＩＰのＣ末端にグリシン（Ｇ
ｌｙ）か付加したアミノ酸配列を有するＶＩＰ前駆体が
好ましく使用される。このＶＩＰ前駆体は下記式［Ｉ］
で表される。

Ｈ−Ｈｌｓ−８ｅｒ−＾ｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ
−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−
１，ｅｕ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｍｅｔ−＾１
　ａ−Ｖａ　ｌ　−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−
＾５ｎ−３ｅｒ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇ！ｙ−Ｘ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　［Ｉコ（
式中、Ｘは、ＯＨ，Ｌｙｓ−ＯＨ，Ａｒｇ−０１１、Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇ−０１１゜または＾ｒｇ−Ｌｙｓ−ＯＨを
示す。）このアミノ酸配列で表されるＶＩＰ前駆体は、
１７番目のアミノ酸がＬｅｕではなく　Ｍ　ｅ　ｔであ
る点て、前記先行技術［特開平１−２９６９９６号公報
およびＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｃｍ、　１７８．３
４３−３５０　（１９８８）］に記載のＶＩＰ前駆体と
異なる。

融合蛋白質は、前記スペーサー配列を介して、キャリア
ー蛋白質をコードする領域とＶＩＰ前駆体をコードする
遺伝子とを連結したＤＮＡに、発現のための制御部位で
あるプロモーター　、リボソーム結合部位及び分泌シグ
ナルを結合し、得られたＤＮＡ断片を、ベクターＤＮＡ
に結合することにより、融合蛋白質分泌発現プラスミド
を得ることかできる。なお、プロモーター　、リボソー
ム結合部位、分泌シグナル及びキャリアー蛋白質を含む
前記プロティンＡなどを用いる場合には、プロモーター
　、リボソーム結合部位、分泌シグナル及びキャリアー
蛋白質を、ベクターに導入する必要はない。

ベクターは、宿主に応して、慣用のベクタ例えば、ｐＵ
Ｂｌｌｏ、Ｃｏ１Ｅ１、ｐ　Ｓ　Ｃ１ｒ−）１、Ｒ３Ｆ
２１２４、ｐＢＲ３２２、Ｔｉプラスミ　ド、　　ｐ　
　Ｔ　　Ｕ　　Ｂ　　４　　　［Ｔａｋｅｉｃｈ、　　
Ｙ、　　ｅｔ　　ａｌ　　　　＾ｇｒｉｃＢｉｏ１．　
Ｃｈｅｗ、、　４７．１５９　（１９８３）；　ＹａＩ
Ｉｌａｚａｋｉ、　Ｉｔ、　ｅｔａｔ、　Ｊ、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ、　１５６（［）、　３２７　（１９！１
３）　］なとのプラスミド、バクテリオファ−ンスなと
のファージ、ＳＶ４０ウィルスなどから選択できる。

ＤＮＡ断片のベクターＤＮＡへの組込みによるＤＮＡ組
換え体は、従来慣用の方法、例えば、制限酵素を用いて
切断したＤＮＡとベクターＤＮＡとをリガーゼを用いて
連結する制限酵素法、リンカ−法などにより作製できる
。

上記融合蛋白質分泌発現プラスミドを宿主微生物に移入
し形質転換することにより、本発明の微生物が得られる
。

宿主としては、例えば、酵母、カビなとてあってもよい
が、バチルス（Ｂａｃｉ　ｌ　Ｉｕｓ）　Ｒ、スタフイ
ハチルス属の微生物、特にバチルス・ズブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）は、安全性が高く
、菌体外に蛋白質を多量に分泌する。さらに、バチルス
・ズブチリスの中で、菌体外へのプロテアーゼ生産性を
突然変異などの手法により低下させた菌株が好ましい。

このような菌株を前記プラスミドにより形質転換する場
合には、宿主に由来するプロテアーゼによる融合蛋白質
の分解を著しく抑制でき、ＶＩＰ前駆体を効率よく多量
に得ることができる。

プロテアーゼ生産性の低い枯窄菌としては、例えば、（
１）バチルス・サブチリス　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５
ｕｂｔｉｌｉｓ）　Ｄ　Ｂ　１０４株［Ｊ、　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、、　１６０４４２−４４４．　（１９８４
）　］及びバチルス・サブチリス１０４ＨＬ株［Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｓｍｕ
ｎ、、　１２８；　６０１−６０８．　（１９ｇ５）］
　　；　（２）本出願人か特開昭６４−３７２８４号公
報において提案したバチルス・サブチリスＤ　Ｙ　−１
６株（微工研閑寄第９４８８号）；（３）アルカリプロ
テアーゼ及び中性プロテアーゼの生産能を欠き、かつプ
ロテアーゼ活性が野生株の３％以下である枯草菌に、５
ｐｏｏ＾△６７７変異遺伝ｒを導入した菌株などが挙げ
られる。特に好ましい菌株は上記（３）に属する菌株で
あり、このような菌株には、例えば、特願平１−２８１
４４０号において、本発明者らか提案したように、バチ
ルス・サブチリス１０４ＨＬ株にｓｐｏ　ＯＡ△６７７
変異逍伝子を導入したバチルス・サブチリス５ＰＯ１］
株（微王研菌寄第１０９８７号）、バチルス・サブチリ
スＤＹ１６株に５ｐｏＯ＾△６７７変異遺伝了を導入し
たバチルス・サブチリス５ＰＬ１４株（微−１，研菌寄
第１０９８８号）などが含まれる。

ＤＮＡ組換え体の宿主への移入は、従来慣用の方法、例
えば、プロトプラスト化技術や細胞融合技術などを利用
して行なうことができる。

本発明の融合蛋白質の製造方法では、融合蛋白質分泌発
現プラスミドにより形質転換された微生物を培養する。

本発明の製造方法の特徴は、融合蛋白質分泌発現プラス
ミドが保持する分泌シグナル領域に起因して、前記培養
により融合蛋白質を分泌発現させることにある。微生物
の培養は、慣用の成分、例えば、無機塩、炭素源、窒素
源、増殖因子成分なとを含む培地で行なうことができる
。

好ましい培地は、液体培地である。液体培地による培養
は、通常、振盪培養又は通気撹拌培養法か採用できる。

培地のｐＨは、通常７〜８程度である。培養は、微生物
の培養に採用される通常の条件、例えば、温度１５〜４
５℃、好ましくは２５〜４０℃、培養時・間６〜６０時
間程度の条件で行なうことができる。

融合蛋白質、すなわちキャリアー蛋白質とＶＩＰ前駆体
とかスペーサー配列を介して連結した融合蛋白質を、化
学的又は酵素的に切断することにより、ＶＩＰ前駆体を
動子よく多量に得ることができる。化学的又は酵素的切
断は、融合蛋白質に、前記スペーサー配列を切断する化
学薬剤や酵素を作用させることにより行なうことができ
る。

なお、下記の２８個のアミノ酸残基からなる生理活性ペ
プチドとしてのＶＩＰ： Ｈ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ
−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−＾５ｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈ　ｒ−＾ｒｇ
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−
Ｖａｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−＾５ｎ−Ｓ
ｅｒ−Ｉ　Ｉｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＮＩＩ２を遺伝子組
換え技術を利用して生産させる場合には、Ｃ末端がアミ
ノ基のアミド体は得られない。

ＶＩＰは、ＶＩＰ前駆体と、アミド化酵素、又はカルボ
キシペプチダーゼＢ及びアミド化酵素とを反応させ、Ｃ
末端をアミノ化することにより得られる。より具体的に
は、前記式［Ｉ］で表されるＶＩＰ前駆体に、前記アミ
ド化酵素などを作用させ、アミノ酸配列のＣ末端のＡｓ
ｎ−Ｇｌｙ−Ｘ（Ｘは前記に同し）をＡ　ｓ　ｎ　−Ｎ
　Ｈ２に変換することにより、ＶＩＰを得ることができ
る。

［発明の効果コ 本発明の融合蛋白質分泌発現プラスミド、および該プラ
スミドで形質転換された微生物は、ＶＩＰ前駆体を含む
融合蛋白質を菌体外に効率よく多量に産生ずる。

また、本発明の融合蛋白質の製造方法は、ＶＩＰ前駆体
のプロテアー七による分解を抑制しなから、融合蛋白質
を分泌発現させることかでき、ＶＩＰ前駆体を効率よく
多量に産生てきる。

［実施例コ 以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない
。なお、実施例で用いた酵素は、いずれも盲酒造■製の
酵素であり、それらの使用条件で反応を行った。

実施例］ （１）プラスミドｐ　Ｍ　Ｄ　２００の作製プロティン
Ａ遺伝子を含むプラスミドｐＤＣＰ２４１１（特開昭６
３−２４５６７７号公報参照）（１０μｇ）を制限酵素
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ　（各々２０　ｕｎｉｔｓ　）
で消化し、プロティンＡ遺伝子を含む２．２５ｋｂのＥ
　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ断片を（ワた。

次いて、この２２５ｋｂのＥｃｏＲ１／Ｂ　ａｍＩ（Ｔ
断１”ｉ（１ｕ　ｇ　）と、プラスミドｐｔＪＢ１１０
のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ長鎖断片（０５μｇ）とを、
Ｔｔ　ＤＮＡリガーセ（］００ｕｎｉｔＳ）を用いて連
結し、枯堅菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓＰ
ＳＬ１Ｋ　（オハイオ州立大学のバチルスジエネテイン
クストソクセンターより人手可能）をプロトプラスト法
で形質転換しｆ：　［Ｍｏｌ　、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅ
ｔ。

１６８、１ｉｔ−１１５，（１９７９）　］。

得られたカナマインン耐性（Ｋｍ　　）株をＬＢ培地（
１，０％）リブトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎ
ａＣｇ、ｐＨ７，２）１　（１ｍＮ　　（カナマイシン
Ｋｍを１０μに／ｍｇ含有）で３７℃、１６時間培養し
た。その培養土清液について、ＥＬ　Ｉ　Ｓ　Ａ　［Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　　＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
、　８０．６９７〜７０１．　（１９８３）　］によっ
てプロティンＡの生産性を検討し、その結果、プラスミ
ドｐ　ＭＤ　２００を含む枯苧菌Ｂ　、　５ｕｂｔｉｌ
ｉｓＰ　Ｓ　Ｌ　１株を得た。

プラスミドｐＭＤ２００の構築図を第１図に示す。

（２）ＶＩＰ−Ｇｕｙ遺伝子ノ化学合成２つアミノ酸残
基からなるＶＩＰ−Ｇ１ｙをコードするＤＮＡ配列と、
そのＮ末端に、制限酵素ＰｓｔＩの切断部位と、カリク
レインの認識配列であるＰｈｅ−Ａｒｇを含むスベーサ
ー領域のＤＮＡ配列、さらにＣ末端側に、終始コドンＴ
ＡＡＴＡＧと、制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位を付加し
た１２２ｂｐのＶＩＰ−Ｇｌｙ（以下、ＶＩＰ−Ｇｌと
いう）遺伝子をＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシ
ステムス社　モデル３８１Ａ）て化学合成した。

得られたＶＩＰ−Ｇｌの塩基配列および対応するアミノ
酸配列を以下に示す。

Ｔｈｒｌ　ｌｅＰｈｅＴｈｒＰｂｅＡｒｇｔｌｉｓＳｅ
ｒＡｓｐ＾ｌａＶａｌＧＡＴＡＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ
ＴＴＣＣＧＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴＧＣＧＧＴＣＡＣＧＴ
ＣＴＡＴＧＣＴＡＧＡＡＧＴＧＣ＾＾ＧＧＣＧＧＴＡＴ
ＣＧＣＴＡＣＧＣＣＡＧＰｓｔｌ ＰｈｅＴｈｒＡｓｐＡｓｎＴｙｒＴｈｒ＾ｒｇＬｅｕＡ
ｒｇＬｙｓＧｌｎＭｅｔ＾ｌａＶａＴＴＴＡＣＡＧＡＴ
＾＾ＣＴＡＴＡＣＧＣＧＴＣＴＧＣＧＣ＾＾＾ＣＡＧＡ
ＴＧＧＣＧＧＴＣ＾ＡＧＴＧＣＣＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧ
ＣＧＣＡＧＡＣＧＣＧＴＴＴＧＴＣＴＡＣＣＧＣＣＡＧ
ＬｙｓＬｙｓＴｙｒＬｅｕＡｓｎＳｅｒＪ　Ｉ　ｅＬｅ
ｕＡｓｎＧ　Ｉ　ｙ＊’ｉｌ＊ｉＦ＊＊＾＾ＡＡＡＡＴ
ＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＡＴＣＣＴＴ＾＾ＣＧＧＡＴ＾
＾ＴＡＧＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧＡＣＴＴＡＡＧＡＴＡＧ
ＧＡＡＴＴＧＣＣＧＡＣＴＡＴＣＣＴＡＧＢａｓｌｌｌ （３）プロテアーゼ生産性の低い宿主ハチルス・ズブチ
リスＳＰＬ１４株の作製 ｓｐｏｏ＾△６７７遺伝子及びリンコマイシン耐性遺伝
子（以下、Ｌｉｎ’と表す）を有する枯苧菌てあるバチ
ルス・サブチリスＡ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　３　９　（１　９　
６株を、表１に示すＬＢ培地を用いて、温度３７℃で対
数増殖期まで振盪培養した。

表１ １．０重量％　　　　　トリプトン ０．５重量％　　　　酵母エキス ０．５重量％　　　　ＮａＣＪ ｐＨ　　　　　　　　７．　　５ 培養？＃Ｃ５　０　ｍｌ中に含まれる菌体を集め、斎藤
・三浦の方法（Ｈ．Ｓａｉｔｏ．　Ｋ．Ｍｉｕｒａ．　
ｌｌｉｏｃｈｉｍ．　ｎｉｏｐｈｉｓ．　Ａｃｔａ，　
７２，　８１９　（１９８３））により染色体ＤＮＡを
抽出精製した。

得られた染色体ＤＮＡを用いて、コンビテントセルトラ
ンスフォーメーション法により、バチルス・サブチリス
ＤＹ−　１　６株を彰質転換した。次に、得られた形質
転換株を、５μｇ　／　ｍｌのリンコマインンを含むＬ
Ｂ寒天平板培地を用いて培養し、Ｌｌｎ　の導入された
株を選択した。

その結果、約８００株のリンコマインン耐性形質転換株
を得た。次いて、以下のようにして、これらのリンコマ
イシン耐性形質転換株から胞子形成能欠損株を５１株分
離した。

ヒスチジンを５０ｍｇ／ノ含む最小寒天培地に形質転換
した枯苧菌をまき、温度３７℃で４８時間培養した。以
下の指標１〜３に合致する閑株を、胞子形成能欠損株と
して選別した。

１。胞子形成培地に形質転換株を埴菌しそのコロニーか
メラニノ色素生産能を失ったこと、２．温度８０℃で１
０分間の熱処理に耐性を示さないこと、及び ３．顕微鏡検査により胞子形成を認めないこと。

ｉｒｌられた胞了形成能欠損株１７３株の中でプロテア
ーゼ活性が最も低い株を、下記のようにして選別し、プ
ロテアーセ活性を測定した。

１重量９６のカセインを含むＬＢ寒天平板培地に、胞ｒ
形成能欠Ｊｉ形質転換株と、親株であるハチルス・サブ
チリスＤＹ−　１　６株とを別々に植閑し、温度３７℃
で２４時間培養した。閑体か分泌するプロテアーゼによ
りカゼインが分解されるので、カゼインの分解により形
成される菌体の回りの・１ローの大きさを指標として、
バチルス・サブチリスＤＹ−１６株よりもプロテアーゼ
牛ｎ能か低ドした菌株を４０株分離した。

ハチルス・サブチリスＤＹ−　１　６株と、プロテアー
セ活性か低下した形質転換株４０株とを、それそれ、Ｌ
Ｂ培地１０ｍ１を用いて一晩培養した後、培養液１　ｍ
ｌを遠心分離し、その上清に存在するプロテアーゼの活
性を測定した。すなわち、０．２％ＦＩＴＣ−カゼイン
（冫グマ冫土製）、１００ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）　、２ｍＭ塩化カルシウムを含む基質溶液１
００μノに、ブロテアーゼを含む上清試験溶液１００μ
Ｊを添加し、３７℃で３時間反応させた。反応終了後、
反応液に２００μノの７．５％トリクロロ酢酸を添加し
て反応を停止し、遠心分離により上清を得、５０Ｑ　ｍ
　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）で中和した後
、励起波長４９０　ｎ　ｍ、発光波長５２５０ｍの螢光
を測定した。

なお、カゼインから、１分間に１μＭのＴｙｒ相当のト
リクロロ酢酸可溶性ペプチドを遊離する酵素活性をＩＵ
とし、プロナーゼ（科研製薬製）を基準として換算した
。

その結果、プロテアーゼ活性が親株バチルス・サブチリ
スＤＹ−１６株に比べて、極端に低下した４株を得、こ
れらの菌株を、それぞれ、バチルス・ヅブチリス５ＰＬ
Ｑ株、５ＰＬＩ１株、５ｐＬ１４株、ＳＰＬ’３９株と
した。

そして、バチルス・サブチリスＤＹ−１６株及びこれら
のプロテアーゼ活性か低下した形質転換株を１０ｍ１の
ＬＢ培地で１８時間培養した後、５０　ｍｌのＭｅｄｉ
ｕｍ　Ａ培ｔｔ！！　（Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　１６５．７９６ＪＯ４，１９８
６）に菌体を移し、培養２４時間及び４８時間培養した
後、培養上清中のプロテアーゼの活性を上記と同様にし
て測定した。

その結果を表２に示す。

表　　２ （表中、ＯＤ　Ｂｏｏは、波長６００　ｎｗ＋Ｉこおけ
る培養液上清の吸光度を示す。また割合は、親株バチル
ス・サブチリスＤＹ−１６株のプロテアーゼ活性を１０
０としたときの相′ｉＩ値を示す。）表２より、形質転
換株４株は、親株よりもプロテアーゼ活性か１／２０以
下と低いことが確認された。特にＳＰＬ　１４株は、プ
ロテアーゼ活性が、親株であるＤＹ−１６株の３％程度
に抑制されていることか確認された。この５ＰＬ１４株
は、前記の遺伝子マーカーを有している。またこれらの
菌株は、いずれも、ヒスチジンとロイシンに対する要求
性を有しており、遺伝子組換え実験において宿主に要求
される複数の栄養要求性を確認した。

なお、形質転換に供したバチルス・サブチリスＤＹ−１
６株のプロテアーゼ活性を、プロテアーゼの野生株であ
るバチルス・サブチリス２０７−２５株と比較したとこ
ろ、表３に示す結果か得られた。なお、プロテアーゼ活
性は、前記と同様にして、菌株を２４時間培養し、測定
した。

表３ 表３より、バチルス・サブチリスＤＹ−１６株は野生株
２０７−２５株の約１％しかプロテアーゼを生産しない
。

上５己のよう１こして得られたバチルス・サブチリス５
ＰＬ１４株を下記の融合蛋白質発現プラスミドｐＭＤ２
３５の宿主として用いた。

（４）プロティンＡ−ＶＩＰ−Ｇｌｙ融合蛋白質発現プ
ラスミドｐ　Ｍ　Ｄ　２３５の作製化学合成したＶＩＰ
’−Ｇｌ遺伝了（５μＦＣ）の５′末端をリン酸化し、
次いて、Ｔ４ＤＮＡリカーゼ（２００ｕｎ！ｔｓ　）を
用いて、前記式［■コて表されるプロティンＡ（成熟型
う中の４４０番目のＡｓｐをコードする部分まで含んだ
プラスミドｐＭＤ２００のＰｓｔｌ／ＢａｍＨＩ長鎖断
片（１μｇ）と連結し、枯堅菌バチルス・ズブチリス５
ＰＬ１４株をプロトプラスト法で形質転換した。得られ
たＫｍ　　株よりプラスミドｐＭＤ２３５を得た。ｐＭ
Ｄ２３５中に挿入された部分について、Ｍ１３タ゛イデ
オキン法でＤＮＡシーケンシングを行ったところ、目的
通りにＶＩＰ−Ｇｌ遺伝子が挿入されていた。

プラスミドｐ　Ｍ　Ｄ　２３５の構築図を第２図に示す
。

（５）ＶＩＰ−Ｇｌｙの酵素免疫測定法による定量 ＶＩＰ−Ｇｌｙの酵素免疫測定法による定量は、「酵素
免疫測定法」　（石川栄治他編集、医学書院）記載の方
法により行った。

先ず、ＶＩＰを用いてウサギを免疫し、抗ＶＩＰ血消を
得た。この抗ＶＩＰ血清より「酵素免疫測定法」の第８
３−９２頁記載のマレイミド−ヒンジ法により抗ＶＩＰ
−１ｇＧ、抗Ｖ　Ｉ　Ｐ−Ｆ（ａｂ’）ｚ、抗ＶＩＰ−
ペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ“を調製した。

酵素免疫測定法によるＶＩＰ−Ｇｌｙの測定は、以下の
手順で行った。

ＥＬＩＳＡプレート（９６穴うに抗ＶＩＰ−Ｆ（ａｂ’
）２を吸着させ、１９６牛血清アルブミンでブロッキン
グした。このプレートに被試験液を添加したｖｔｐ−ｃ
ｒｙを、固Ｆ目に吸着した抗ＶＩＰ−Ｆ　（ａｂ’　）
２に結合さけた後、洗浄し、更に抗ＶＩＰ−ペルオキシ
ダーゼ標識−Ｆａｂ２を添加し、同相に結合したＶＩＰ
−Ｇｌｙをサンドイッチした。遊離の標識抗体を除去し
た後、ＩＱｍＭオルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）
、０．０２５％過酸化水素、５０　ｍ　Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ５，０）を含む反応液を添加し、ペルオ
キシダーゼの反応により生成する色素を波長４９０ｎｍ
の吸収で測定した。

標準物質として、アプライド・バイオシステムズ（ＡＢ
Ｉ）社製のペプチド合成装置により同相合成し、逆相高
速液体クロマトグラフィーにより精製し、アミノ酸組成
を確認したＶＩＰ−Ｇｌｙを用いた。

（６）プロティンＡ−ＶＩＰ−Ｇｌｙ融合蛋白質の分泌
発現 プラスミドｐＭＤ２３５で形質転換された枯草菌バチル
ス・スブチリスＳ　Ｐ　Ｌ　１４　／　ｐ　Ｎｉ　Ｄ　
２３５株を５００ｒｒｌのヒダ付き三角フラスコを用い
て、３．３％のトリプトン、２．０％の酵母エキス、２
，０％のカザミノ酸、１０？６のグルコース、０．７４
％のＮ　ａ　Ｃｌ３　、０．　８？。のＮａ２ＨＰＯ４
０，４％のＫＨ２ＰＯ２３６ｍＭのＮａ　ＯＨ、０、０
６ｍ　ＭのＭｎＣ，１７２からなる培地１００ｍＮ　　
（カナマイシンＫｍｌＯμｇ／ｒ＋ｄ）ａ有）で３７℃
、１２時間培養した。培ｆ終了後、プロテアーセ阻害剤
であるフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳ
　Ｆ）　、ＥＤＴＡを各々１、　Ｑ　ｍ　Ｍになるよう
に添加して、遠心分離し、培養上清液をｉ等だ。次いて
、得られた培養土清液を用いて、分泌発現された融合蛋
白質を酵素免疫測定法により定量したところ、培養液１
ｇ当り４９゜９μどのＶＩＰ−Ｇｌｙを分泌発現してい
た。

実施例２ （１）ＶＩＰ−Ｇｌｙ遺伝子のｆヒ学合成２９アミノ酸
残基からなるＶＩＰ−ＧｌｙをコドするＤＮＡ配列と、
そのＮ木端に制限酵素Ｈｉｎｄｍの切断部位と、カリク
レインの認識配列であるＰｈｅ−Ａｒｇを含むスペーサ
ー領域のＤＮＡ配列、さらにＣ末端側に、終始コドンＴ
ＡＡＴＡＧと、制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位を付加し
た１２２ｂｐのＶＩＰ−Ｇｌｙ　（以下、ＶＩＰ−Ｇ２
という）遺伝子をＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオ
システムス社　モデル３８１Ａ）で化学合成した。

得られたＶ　Ｉ　Ｐ−Ｇ２の塩基配列および対応するア
ミノ酸配列を以下に示す。

Ｔｈｒｌ　ｌｃＰｈｃＴｈｒＰｈｅＡｒｇＩＩｉｓＳｅ
ｒＡｓｐ＾＋　ａｈａＡＧＣＴＴ＾＾ＣＧＡＴＣＴＴＣ
ＡＣＧＴＴＣＣＧＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴＧＣＧＧＴＣ＾
ＴＴＧＣＴＡＧＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＣＧＧＴＡＴＣＧ
ＣＴＡＣＧＣＣＡＧ１ｉｎｄｍ ＰｈｅＴｈｒＡｓｐＡｓｎＴｙｒＴｈｒ＾ｒｇＬｅｕ＾
ｒｇＬｙｓＧｌｎｅａｔ＾１ａＶａ＋ＴＴＴＡＣＡＧＡ
ＴＡＡＣＴＡＴＡＣＧＣＧＴＣＴＧＣＧＣＡＡＡＣＡＧ
ＡＴＧＧＣＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＡＴＴＧＡＴＡＴ
ＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＧＴＴＴＧＴＣＴＡＣＣＧＣＣＡ
ＧｙｓＬｙｓＴｙｒＬｃｕＡｓｎＳｅｒ　ｌ　ｌ　ｅＬ
ｅｕＡｓｎＧ　ｌ　ｙＨＨ４本＾Ａ＾＾ＡＡＴＡＴＣＴ
Ｇ＾＾ＴＴＣＴＡＴＣＣＴＴ＾＾ＣＧＧＡＴＡＡＴＡＧ
ＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧＡＣＴＴＡＡＧＡＴＡＧＧＡＡＴ
ＴＧＣＣＧＡＣＴＡＴＣＣＴＡＧａｍｌｌｌ （２）プロティンＡ−Ｖ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　Ｉ　ｙ融合蛋白
質発現プラスミドｐＭＤ２４５の作製 化学合成したＶ　Ｉ　Ｐ−Ｇ２遺伝子（５μｇ）の５′
末端をリン酸化し、次いで、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（２
００ｕｎｉｔｓ　）を用いて、前記式［■コで表される
プロティンＡ（成熟型）中の１８７番目のＬｅｕをコー
ドする部分まで含んだプラスミドｐＭＤ２００のＨｉｎ
ｄｍ／ＢａｍＨＩ長鎖断片（１μｇ）と連結し、枯草菌
バチルス・ズブチリス５ＰＬ１４株をプロトプラスト法
で形質転換した。得られたＫｍ　　株よりプラスミドｐ
　Ｍ　Ｄ　２４５を得た。ｐＭＤ２４５中に挿入された
部分について、Ｍ１３ダイデオキシ法でＤＮＡシーケン
ンングを行ったところ、目的通りにＶ　Ｉ　Ｐ−０２遺
伝子が挿入されていた。　プラスミドｐＭＤ２４５の構
築図を第２図に示す。

（３）プロティンＡ−ＶＩＰ−Ｇｌｙ融合蛋白質の分泌
発現 プラスミドｐＭＤ２４５で形質転換された枯草菌バチル
ス・スブチリスＳ　Ｐ　Ｌ　１４　／　ｐ　Ｍ　Ｄ　２
４５株を５００ｍＪ７のヒダ付き三角フラスコを用いて
、３．３％のトリプトン、２．０％の酵母エキス、２，
０％のカサミノ酸、１．０９６のグルコス、０．７４％
のＮａＣ９，０，８％のＮａ２ＨＰＯ４０，４％のＫＨ
２ＰＯ４，３６ｍＭのＮａＯＨ１０，０６ｍＭのＭｎＣ
Ｉｚからなる培地１００ｒｒｌ　　（カナマイシンＫｍ
　１０　ｕ　ｒ／ｍｆＩ含有）で３７℃、１２時間培養
した。培養終了後、プロテアーゼ阻害剤であるフェニル
メチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）　、ＥＤＴ
Ａを各々１０ｍＭになるように添加して、遠心分離し、
培養土清液を得た。次いて、得られた培養土清液を用い
て、分泌発現された融合蛋白質を酵素免疫測定法により
定量したところ、培養液１ｇ当り４゜５μｇのＶＩＰ−
Ｇｌｙを分泌発現していた。

実施例３ （１）プロティンＡ−Ｖ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　ｌ　ｙ融合蛋白
質発現プラスミドｐＭＤ１３５の作製 大腸菌によるプロティンＡ−ＶＩＰ−Ｇｌｙ融合蛋白質
の分泌発現を検討するため、プラスミドｐＭＤ２３５　
（５μｇ）を制限酵素ＳｐｈＩ（１Ｏｕｍｉｔｓ）で完
全消化した後、ＥｃｏＲＩ（５ｕｎｔｓ）で部分消化し
て、２．２６ｋｂの５ｐｈｌ／ＥｃｏＲＩ断片を得た。

得られたＤＮＡ断片（１μｇ）と、ｓｐｈ　Ｉ及びＥｃ
ｏＲＩて消化したプラスミドｐＵｃ１１９（盲酒造■製
）の長鎖断片（０，１μｇ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（
１００ｕｎｉｔｓ　）を用いて連結し、大腸菌Ｅ、ｃｏ
ｌｉＭＶ１１８４株（寅酒造■製）を形質転換した。得
られたアンピンリン耐性（Ａｍｐ　　）株より、プラス
ミドを調製し、目的とする融合遺伝子か挿入されたプラ
スミドｐＭＤ１３５をｉすた。

プラスミ）”ｐＭＤ１３５の構築図を第３図に示す。

（２）プロティンＡ−ＶＩＰ−Ｇｌｙ融合蛋白質の分泌
発現 プラスミドｐＭＤ１３５て形質転換された大腸菌Ｅ、ｃ
ｏ　１　ｉＭＶｌ　１８４／ｐＭＤ１３５株を、５００
ｍ１ｌのヒダ付き三角フラスコを用いて、２ＸＬＢ培地
（アンピンリンＡｍｐを５　（１８ｇ　／　ｍｇ金含有
１．００ｍＪ７で３７℃、１２時間培養し、遠心分離し
て菌体を集め、オスモティック・ショック法［Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　ＣＩ＋ｅｍ、、　２４０．３５８５　（１９
６５）コによりペリプラズム画分を得た。このペリプラ
ズム画分を用いて、分泌発現された融合蛋白質を酵素免
疫ＪＰ１定法により定量したところ、培芥液１ｇ当り７
．８μｇのＶＩＰ−Ｇｌｙを分泌発現していた。

実施例４ （１）プロティンＡ−Ｖ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　Ｉ　Ｙ融合蛋白
質発現プラスミドル　Ｍ　Ｄ　１４５の作製大腸菌によ
るプロティンＡ−ＶＩＰ−Ｇｌｙ融合蛋白質の分泌発現
を検討するため、プラスミドｐＭＤ２４５　（５μｇ）
を制限酵素５ｐｈｌ　（１０ｕ１Ｌｓ）で完全消化した
後、ＥｃｏＲＩ（５ｕｎｉｔｓ）で部分消化して、１．
５ｋｂの５ｐｈｌ／ＥｃｏＲＩ断片を得た。得られたＤ
ＮＡ断片（１μｇ）と、５ｐｈｌ及びＥｃｏＲＩて消化
したプラスミドｐＵｃ１１９の長鎖断片（０，１μｇ）
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１００ｕｎｌｔｓ　）を用い
て連結し、大腸菌エッシェリキア・コリＭＶ１１８４株
を形質転換した。得られたアンピシリン耐性（Ａｍｐ　
　）株より、プラスミドを調製し、目的とする融合遺伝
子が挿入されたプラスミドｐ　Ｍ　Ｄ１４５を得た。

プラスミドｐＭＤ１４５の構築図を第３図に示す。

（２）プロティンＡ−ＶＩＰ−Ｇｌｙ融合蛋白質の分泌
発現 プラスミドｐＭＤ　１４５で形質転換された大腸菌Ｅ、
ｃｏ１ｉＭＶ１１８４／ｐＭＤ１４５株を、５００ｍＮ
のヒダ付き三角フラスコを用いて、２ＸＬＢ培地（アン
ピシリンＡｍｐを５０　ｔｔ　ｇ　／　ｍｇ金含有１０
０ｍｊ７て３７℃、１２時間培養し、遠心分離して菌体
を集め、前記オスモティック・ショック法によりペリブ
ラスム画分を得た。このベリプラスム画分を用いて、分
泌発現された融合蛋白質を酵素免疫測定法により定量し
たところ、培養液１ｇ当り１．０μｇのｖＩｐ−ｃｔｙ
を分泌発現していた。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＭＤ２００の構築図、第２図はプ
ラスミドｐ　Ｍ　Ｄ　２３５及びプラスミドｐＭＤ２４
５の構築図、 第２図はプラスミドｐＭＤ１３５及びプラスミドｐＭＤ
１４５の構築図である。 特許出願人　　エム・デイ・リサーチ株式会月代　　理
　　人　　　弁理士　　鍬　　　１）　　充　　　土弟 図 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、遺伝子の発現に関与するプロモーター、リボソーム
   結合部位、分泌シグナル及びキャリアー蛋白質をコード
   する領域と、バソアクティブ・インテスティナル・ポリ
   ペプチド前駆体をコードする遺伝子とが、化学的又は酵
   素的に切断可能なスペーサ配列を介して連結しているＤ
   ＮＡ断片が、ベクターＤＮＡに結合していることを特徴
   とする融合蛋白質分泌発現プラスミド。 ２、キャリアー蛋白質が、黄色ブドウ球菌のプロテイン
   Ａ中のＩｇＧ結合能を有する領域である請求項１記載の
   融合蛋白質分泌発現プラスミド。 ３、遺伝子の発現に関与するプロモーター、リボソーム
   結合部位、分泌シグナル及びキャリアー蛋白質をコード
   する領域が、黄色ブドウ状球菌のプロテインＡ遺伝子に
   由来する請求項１記載の融合蛋白質分泌発現プラスミド
   。 ４、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド
   前駆体が下記式［ I ］で表されるアミノ酸配列からな
   る請求項１記載の融合蛋白質分泌発現プラスミド。 【アミノ酸配列があります】［ I ］ （式中、Ｘは、ＯＨ、Ｌｙｓ−ＯＨ、Ａｒｇ−ＯＨ、Ｌ
   ｙｓ−Ａｒｇ−ＯＨ、またはＡｒｇ−Ｌｙｓ−ＯＨを示
   す。）５、請求項１記載の融合蛋白質分泌発現プラスミ
   ドにより形質転換されている微生物。 ６、形質転換された微生物がバチルス（￥Ｂａｃｉｌｌ
   ｕｓ￥）属、スタフィロコッカス（￥Ｓｔａｐｈｙｌｏ
   ｃｏｃｃｕｓ￥）属、またはエシリヒア（￥Ｅｓｃｈｅ
   ｒｉｃｈｉａ￥）属である請求項５記載の微生物。 ７、請求項５記載の微生物を培養し、キャリアー蛋白質
   とバソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド前
   駆体とがスペーサー配列を介して連結した融合蛋白質を
   分泌させ、回収する融合蛋白質の製造方法。