JPS63502560A - ストレプトアビジンをコ−ドするdna、該dnaから産生されるストレプトアビジン、ストレプトアビジン中に存在するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、並びにその使用 - Google Patents
ストレプトアビジンをコ−ドするdna、該dnaから産生されるストレプトアビジン、ストレプトアビジン中に存在するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、並びにその使用Info
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- JPS63502560A JPS63502560A JP62501917A JP50191787A JPS63502560A JP S63502560 A JPS63502560 A JP S63502560A JP 62501917 A JP62501917 A JP 62501917A JP 50191787 A JP50191787 A JP 50191787A JP S63502560 A JPS63502560 A JP S63502560A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
36、NIH3T3宿主細胞である請求の範囲第35項に記載の哺乳動物宿主細
胞。
37、適当な宿主細胞に導入された際に請求の範囲第31項に記載の融合遺伝子
を発現し得る発現ベクターであって、適当なキャリアDNA及び請求の範囲第3
1項に記載の融合DNA断片を有する前記発現ベクター。
38、哺乳動物発現ベクターである請求の範囲第37項に記載の発現ベクター。
39、請求の範囲第38項に記載の発現ベクターを有する哺乳動物宿主細胞。
40、NIH3T3宿主細胞である請求の範囲第39項に記載の哺乳動物宿主細
胞。
41、請求の範囲第25項に記載の融合遺伝子にコードされる融合タンパク質で
あって、対象標的タンパク質がストレプトアビジンに融合しており、ストレプト
アビジンがビオチン又はどオチン誘導体に対する多数の結合部位を有している前
記融合タンパク質。
42、標的タンパク質がモノクローナル抗体である請求の範囲第41項に記載の
融合タンパク質。
43、標的タンパク質がヒトLDL受容体タンパク質である請求の範囲第41項
に記載の融合タンパク質。
44、ビオチン誘導体が蛍光ビオチンである請求の範囲第41項に記載の融合タ
ンパク質。
45、a)対象タンパク質をコードするDNA?請求の範囲第1項に記載のスト
レブトアごジンをコードするDNAに連結して融合遺伝子を生成し、
b)該融合遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、C)該融合遺伝子を発現し融
合タンパク質を産生し得る適当な条件下で、該発現ベクターを適当な宿主細胞に
導入し、d)該融合タンパク質を単離し、
e)イン・ヴイトロで該融合タンパク質をビオチン又はビオチン誘導体とインキ
ュベートし、これによって、該融合タンパク質のストレプトアビジン部分にビオ
チン又はどオチン誘導体が結合した融合タンパク質−ビオチン複合体を生成し、
「)ビオチン又はどオチン誘導体が該宿主細胞によって産生された非標識融合タ
ンパク質に結合し得るような適当な条件下で、該融合タンパク質−ビオチン複合
体を前記C)段階の宿主細胞に導入し、これによって、イン・ヴイボで標識又は
化学修飾された対象タンパク質を産生ずる
ことから成る、イン・ヴイボに於ける標識対象タンパク質の産生方法。
46、 c)段階のビオチン誘導体が蛍光性である請求の範囲第45項に記載の
方法。
47、a)対象タンパク質をコードするDNAを請求の範囲第1項に記載のスト
レプトアビジンをコードするDNAに連結して融合遺伝子を生成し、
b)該融合遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、C)該融合遺伝子を発現し融
合タンパク質を産生し得る適当な条件下で、該発現ベクターを適当な宿主細胞に
導入し、d)該融合タンパク質のストレプトアビジン部分にビオチン又はビオチ
ン誘導体が結合するような条件下で、該融合タンパク質をビオチン又はピオチン
誘導体と接触させ、これによって、融合タンパク質−ストレブトアごジン−ビオ
チン複合体を産生じ、
e)該複合体を単離し、これによって、対象タンパク質を単離する
ことから成る、対象タンパク質の単離方法。
明細書
ストレプトアビジンをコードするDNA、該DN^から産生されるストレプトア
ビジン、ストレプトアビジン中に存在するアミノ を む ムボリペブ ド 並
びに の1肚Δ11
本明細書中に記載する発明の所定の具体例は、米国厚生省の国立衛生研究所(N
ational In5titutes of Health。
U、S、 Department of Health and Hu+man
5ervices)の認可番号に814825−19下の研究の過程で実施さ
れた。米国政府は本発明の所定の権利を有する。
本明細書を通して各種の刊行物が括弧内のアラビア数字で引用しである。これら
の引用文献の完全な名称は明細書末尾の請求の範囲の直前に記載されている。こ
れらの刊行物の開示内容は、明細書及び請求の範囲に記載された発明の時点にお
いて当業者に周知であった技術状態をより十分に説明するために、その全体を本
明細書の一部に組み入れる。
ストレプトマイセス・アビジニイ(Stre tom ces avidi−L
LL)により産生されるタンパク質であるストレプトアビジンは、水溶性ビタミ
ンであるビオチンと非常に強く且つ特異的な非共有結合複合体を形成する。スト
レプトアビジンは、数種の江阻吐姐り旺の培養P液中の抗生物質系の一部として
1963年に発見された(1)、その後、Chaiet及び−olf(2)はそ
の化学的性質を確立し、そのアミノ酸組成を決定した。ストレプトアビジンはほ
ぼ中性の60000ドルトンのタンパク質である。ストレプトアビジンは、夫々
約15000ドルトンの分子量を有する4個の同一のサブユニットから構成され
る。ストレプトアビジンはタンパク質1分子当たりビオチン4分子と結合し、炭
水化物を含まない、アビジンは通常ニワトリの卵白から単離される塩基性糖タン
パク質であり、分子量、サブユニット組成及びビオチンと結合して非常に高い親
和性(K、= 10−”)を有するビオチンとの複合体を形成する能力等におい
て、ストレプトアビジンと共通の特徴を有している(3−4) 、ストレプトア
ビジン及びアビジンは異なるアミノ酸組成を有しているが、いずれも−iにスレ
オニン及びトリプトファンの含有量が非常に高い、ストレプトアビジン及びアビ
ジン(卵白から誘導)は同様に高い親和性でビオチンと結合するが、ストレプト
アビジンは生理学的pHでアビジンに生じ得る望ましくない非特異的結合を大幅
に回避できるという利点がある。この理由として、1)ストレプトアビジンの等
電点は中性に近く、アビジンの等電点は10である(従ってアビジンはpH7,
0で正に荷電される)こと、及び2)ストレプトアビジンは炭水化物を含まない
が、アビジンは約7%の炭水化物を含むことが挙げられる。
現状では、S、avidiniiの増殖により製造された市販のストレプトアビ
ジン製剤にはいくつかの欠点がある。即ち、製造費用が高く、しばしばビオチン
で汚染され、その結果としてビオチンとの結合に充てられる4価全てをもたない
。
更に、S、 avidiniiからストレプトアビジンを産生させると、制限さ
れた!のストレプトアビジンしか得られない。
本発明は、本質的にビオチン汚染がなく且つビオチン結合に充てられる4価全て
を有する廉価なストレプトアビジンソースを提供することにより、市販のストレ
プトアビジン製剤の欠点を克服するものである。本発明は、ストレプトアビジン
を大量に産生ずることの可能なベクターを意図している。更に、特定部位の突然
変異誘発により、改良型ストレプトアビジンも産生され得る。
従来、生体細胞内の少量の興味あるタンパク質を標識及び検出する方法を考案す
るべく種々の試みが為されている。
従来方法では、興味あるタンパク質をコードする遺伝子に例えばβ−ガラクトシ
ダーゼのような原核遺伝子を融合していた。形成された融合遺伝子の発現により
融合ポリペプチド、例えば該当タンパク質の安定化及び単離に使用可能なβ−ガ
ラクトシダーゼからのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドが得られる。しかし
ながら、このような方法は標識タンパク質をin vivoで産生させるために
は使用することができなかった。
本発明は、鑞ハイ!で共有結合化学修飾を必要とせずに標識タンパク質をin
vivoで生成する方法を提供する0本発明の方法は、タンパク質に残存するタ
ッグと非共有結合し得るマーカータンパク質を利用する。本発明の方法は、タン
パク質をコードする遺伝子の構造しかわからない場合に、標識タンパク質をin
vivoで産生させるため、又は標的タンパク質を単離するために使用され得
る。
ビオチンは、ア4ビジン又はストレプトアビジンの強く且つ特異的なビオチン結
合能力により、各種の生物学的分子と結合し得る。従って、本発明の融合遺伝子
は、タンパク質、炭水化物及び核酸の検出、局在化又は精製を可能にする。
几朋!す1叛
ポリペプチドストレプトアビジンをコードするDNAは、5tre tomce
s avidiniiの染色体DNAの制限エンドヌクレアーゼ消化から誘導さ
れた長さ2kbのフラグメントとして単離した。このDNAは第3図に示すよう
な核酸配列を有している。 2kbのフラグメントはストレプトアビジンポリペ
プチドをコードする全領域、シグナルペプチドをコードする領域及びコーディン
グ領域の3′及び5゛末端に天然に生起するフランキング(flinkins)
領域DNAを含んでいる。 DNAフラグメントをクローニングベヒクルに導入
し、該ベヒクルを細菌宿主細胞のゲノムDN^に挿入した。
本発明は更に、ビオチン又はビオチン誘導体との多数の結合部位を有するストレ
プトアビジンをコードするDNAフラグメントに融合した対象標的タンパク質を
コードする第1のDNAフラグメントを含む融合遺伝子を提供するものであり、
該融合遺伝子は、適当な発現ベクターに挿入され適当な宿主細胞に導入されると
、江バカ1で融合タンパク質を発現することが可能である。この融合遺伝子は、
タンパク質をコードする遺伝子の配、列しかわかっていない場合に、標識され化
学修飾されたタンパク質をin y力1で産生させ、該タンパク質を単離するた
めに使用され得る。
本発明によると、該当標識化タンパク質をin vivoで産生させるための方
法は、
a) 対象タンパク質をコードするDNAを本発明のストレプトアビジンをコー
ドするDNAに連結し、融合遺伝子を生成し、
b) id合遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、C)融合遺伝子の発現及び
融合タンパク質の産生を可能にする適当な条件下で発現ベクターを適当な宿主細
胞に導入し、
d) U合タンパク質を単離し、
e)融合タンパク質をビオチン又はビオチン誘導体と共にil vitroでイ
ンキュベートし、ビオチン又はビオチン誘導体が融合タンパク質のストレプトア
ビジン部分に結合しているような融合タンパク質−ビオチン複合体を生成し、
f) ビオチン又はビオチン誘導体を宿主細胞により産生された非標識融合タン
パク質と結合させることの可能な条件下で、融合タンパク質−ビオチン複合体を
段tll(e)の宿主細胞に導入し、これによって、■畦!で標識又は化学修飾
された対象タンパク質を産生させる段階を含んでいる。
対象タンパク質を単離する方法は、
a) 対象タンパク質をコードするDNAを本発明のストレプトアビジンをコー
ドするDNAに連結し、融合遺伝子を生成し、
b)融合遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、c)融合遺伝子の発現及び融合
タンパク質の産生を可能にする適当な条件下で発現ベクターを適当な宿主細胞に
導入し、
d) ビオチン又はビオチン誘導体を融合タンパク質のストレプトアビジン部分
と結合させることの可能な条件下で融合タンパク質をビオチン又はビオチン誘導
体と接触させ、これによって、融合タンパク質−ストレプトアビジン−ビオチン
複合体を産生させ、e)複合体を単離し、これによって、対象タンパク質を単離
する
段階を含んでいる。
・ の、t=B
第1図は、ストレプトアビジンのアミノ末端アミノ酸配列、及びストレプトアビ
ジン遺伝子の単離に使用される2つのオリゴヌクレオチド10−ブのヌクレオチ
ド配列を示す、(N:^、G、C及びU又はT)。
第2図は、クローン化した2kbフラグメントの部分制限地図(^)、及びDN
A配列分析に使用されるストラテジ−(B)を示す。矢印は配列したフラグメン
トの方向及び範囲を示す、太線の領域はコーディング配列に対応する。
(B:石H1,R:馳工1.S:鋒り^I、 M:Ms工1.A:ム!。
Sm: SmaI 、 K: 巨1 、 El: Haelff、 T: Ta
el)。
第3図は、ストレプトアビジンの遺伝子のヌクレオチド配列及び5′及び3″領
域の修飾に使用される制限部位を示す。
ヌクレオチド配列の上に示したのがストレプトアビジンタンパク質のアミノ酸配
列である。シグナルペプチドのアミノ酸は負の数で示した。
第4図は、ストレプトアビジン及びアビジンのアミノ酸配列比較を示す、同一の
残基は実線で囲み、化学的に類似の残基は破線で囲んだ0両方の配列は、最大の
相同性を与えるように整合させた。(アビジンの残基番号34のへテロ性は(2
5)に報告されている。この位置にはIle又はThrが存在している。)
第5図は、ストレプトアビジン及びアビジンの予想される二次構造の比較を示す
、配列は第4図と同様に整合させた。α:α−へリックス、B: β−ストラン
ド、T: ターン。
(ストレプトアビジンの最後の20個のC末端アミノ酸は分析しなかった。)
第6図は、プラスミドpUc3−S2の制限地図を示す。
第7図は、ストレプトアビジン遺伝子の5′領域の修飾に実施した段階及び反応
を示す。
第8区は、ストレプトアビジン遺伝子及びヒトLDLレセプター遺伝子の融合で
実施した反応及び段階を示す。
日の=t;H
本発明はストレプトアビジンをコードする単離DN^を提供する。このDNAは
、長さ2kbのフラグメントとして単離したものであり、江阻ル視匹旺avid
iniiの染色体DNAの制限エンドヌクレアーゼ消化から誘導され、第3図の
核酸配列を有する。前記2kbフラグメントはストレプトアビジンポリペプチド
をコードする全領域、シグナルペプチドをコードする領域、該コーディング領域
の3°及び5°末端に天然に生起するフランキング(f Ianking)領域
DNAとを含む。
本発明はまた、クローニングベヒクルDN^及びポリペプチドストレプトアビジ
ンをコードするDNAの2kbセグメントを含む組換えクローニングベヒクルも
提供する。この場合前記2kbセグメントは5tre toem ces av
idiniiの染色体DNAから誘導される。前記クローニングベヒクルDNA
は第1及び第2制限酵素部位を有することを特徴とし、2kbセグメントがこれ
らの部位に挿入される。この2kbセグメントはポリペプチドストレプトアビジ
ンをコードする全領域、シグナルペプチドをコードする領域と、該コーディング
領域の3′及び5゛末端に天然に生起するフランキング領域DNAとを含む。
本発明のクローニングベヒクルは、バクテリア又はウィルスに由来する。適切な
プラスミドクローニングベヒクルはpUcプラスミドである。適切なファージク
ローニングベヒクルはファージ813である。
本発明の組換えクローニングベヒクルをバクテリア宿主細胞に挿入した。適切な
バクテリア宿主細胞は大腸菌である0本発明の組換えクローニングベヒクルを含
む遺伝子工学的に操作した大腸菌宿主細胞を形成した。これをJM83と称する
(^TCCAccession No、53307)、ストレプトアビジンの製
造方法の1つは、本発明の遺伝子工学的に操作した宿主細胞を、ストレプトアビ
ジン遺伝子の発現に適した条件下で培養し、このようにして産生されたストレプ
トアビジンを回収することからなる。
組換えDNA技術によって産生される実質的に純粋な、ビオチンを含まないスト
レプトアビジンは4つの同じポリペプチドサブユニットを含む、各サブユニット
は分子量が約16.500ダルトンであり、多数の遊離ビオチン結合部位を有す
る。各ストレプトアビジンサブユニットは第3図のアミノ酸配列を有する1本発
明のストレプトアビジンのアミノ酸の大部分はβ−構造をとる。
遊離ビオチン結合部位の好ましい個数は4である。これらの遊離ビオチン結合部
位は位置80及び121にあるリジン残基に隣接する。これらの遊離ビオチン結
合部位は非常に重要な(critical) )リプトファン結合残基を含み、
これらのトリプトファン結合残基は位置21.79又は120に位置し且つリジ
ン残基に隣接する。
前記ポリペプチドストレプトアビジンはタンパク質分解による開裂(Prote
olytic cleavage)が可能なアミノ末端標識を用いて製造し得る
。このアミノ末端標識は放射性標識又は蛍光標識であってよい。別の方法として
、ポリペプチドストレプトアビジンはタンパク質分解による開裂が可能なカルボ
キシ末端標識を用いて製造することもできる。カルボキシ末端標識は放射性標識
又は蛍光標識である。このカルボキシ末端標識は同定可能なシスティンであって
もよい。
本発明はまた、ストレプトアビジンをコードする第2DNAフラグメントに融合
した対象ターゲットタンパク質をコードする第1DN^フラグメントを含む融合
遺伝子も提供する。前記ストレプトアビジンはビオチン又はビオチン誘導体の結
合部位を多数有する。この融合遺伝子は、該遺伝子を適当な発現ベクター内に挿
入し且つ適当な宿主細胞内に導入するとin vivoで融合タンパク質を発現
することができる。この融遺伝子は5′末端にターゲットタンパク質をコードす
る第1DN^フラグメントか、又はストレプトアビジンをコードする第2 [I
NAフラグメントを有し得る。該融合遺伝子のストレプトアビジンをコードする
DNAフラグメントは長さが2kbであり、ジlヱ且しLヱ幻=s avidi
nii)染色体DNAの制限エンドヌクレアーゼ消化から誘導され、第3図の核
酸配列を有する。この2kbフラグメントはポリペプチドストレプトアビジンを
コードする全領域、シグナルペプチドをコードする領域と、該コーディング領域
の3゛及び5′末端に天然に生起するフランキング領域DNAとを含む。
本発明の一具体例では、第1 DNAフラグメントはヒト低密度リポタンパク質
(LDL)レセプターをコードする遺伝子である。このような融合遺伝子は、該
融合遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し且つ適当な宿主細胞内に導入すると、
ストレプトアビジンからなるタンパク質を該融合タンパク質のN末端領域に発現
し、且つLDLレセプタータンパク質を該融合タンパク質のC末端領域に有する
タンパク質を発現する。この融合遺伝子は哺乳動物発現ベクター内にクロ胞と該
融合遺伝子とのトランスフェクションに使用できるようになる。好ましい哺乳動
物宿主細胞はNI[l 3T3紺胞である。
適当な宿主細胞内に導入した時に本発明の融合遺伝子を発現できる発現ベクター
は、適当なキャリヤーDNAと本発明の融合DNAフラグメントとを含む、適当
なキャリヤーDNAはプラスミド又はファージDNAであり得る。前記発現ベク
ターはバクテリア又は真核細胞発現ベクターであり得る。
適切なバクテリア発現ベクターは二重鎖DNA分子を含み、この分子は5′から
3′に向けて下記のものを順次含む:プロモーターを含むか又はプロモーターと
オペレーターを含むDNA配列;
所望の遺伝子のmRN^が宿主細胞内でリポソームに結合できるようにするリポ
ソーム結合部位を含むDNA配列;ATG開始コドン;
所望の遺伝子を^TG開始コドンに合わせてベクター内に挿入するための制限酵
素部位;
宿主細胞内で自律的複製(autono+*ous replication)
を生じ得るバクテリアプラスミドからの複製の起源(origin)含むDNA
配列;
選択可能な又は同定可能な表現型特性(phenotypictrait)に関
連する遺伝子を含み且つベクターが宿主細胞中に存在する時に表現されるDNA
配列。
本発明は更に、本発明の融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質も提供
する。この融合タンパク質では対象ターゲットタンパク質がストレプトアビジン
に融合され、このストレプトアビジンがビオチン又はビオチン誘導体の結合部位
を多数有する。−具体例では、ターゲットタンパク質はヒトLDLレセプターで
ある。別の具体例では、夕一ゲットタンパク質はモノクローナル抗体である。更
に別の具体例では、ビオチン誘導体が蛍光ビオチンである。
標識対象タンパク質をin vivoで産生する方法の1つは下記のステップか
らなる:
a)対象タンパク質をコードするDNAを本発明のストレプトアビジンをコード
するDNAに連結して融合遺伝子を生成し;
b)前記融合遺伝子を適当な発現ベクター内に挿入し;C)前記発現ベクターを
、前記融合遺伝子の発現及び融合タンパク質の産生に適した条件で、適当な宿主
細胞内に導入し;
d)融合タンパク質を単離し;
e)前記融合タンパク質をビオチン又はビオチン誘導体と共にin vitro
でインキュベートして、ビオチン又はビオチン誘導体が融合タンパク質のストレ
プトアビジン部分に結合した融合タンパク質−ビオチン複合体を生成し;f)前
記融合タンパク質−ビオチン複合体を、ビオチン又はビオチン誘導体が宿主細胞
によって産生されたひ非標識融合タンパク質と結合できるような適当な条件下で
、ステップC)の宿主細胞内に導入し、それによって標識された又は化学修飾さ
れた対象タンパク質をin vivoで産生ずる。
対象タンパク質を単離する方法の1つは下記のステップを含む:
a)対象タンパク質をコードするDNAを本発明のストレプトアビジンをコード
するDNAに連結して融合遺伝子を生成し;
b)前記融合遺伝子を適当な発現ベクター内に挿入し;C)前記発現ベクターを
、前記融合遺伝子の発現及び融合タンパク質の産生に適した条件で、適当な宿主
細胞内に導入し;
d)融合タンパク質を、ビオチン又はビオチン誘導体が該融合タンパク質のスト
レプトアビジン部分に結合できるような条件下で、ビオチン又はビオチン誘導体
と接触させ、それによって融合タンパク質−ストレプトアビジン−ビオチン複合
体を生成し;
e)前記複合体を単離することによって対象タンパク質を単離する。
本発明は標識タンパク質をin vivoで産生ずる方法と、ターゲットタンパ
ク質をその遺伝子のヌクレオチド配列のみを知ることによって単離する方法とを
提供する。基本的概念は、対象タンパク質(ターゲット)をコードする遺伝子を
特定リガンドに対する親和力の大きい結合部位をもつ別のタンパク質(マーカー
)をコードする遺伝子と融合させることにある。この場合融合タンパク質は、遺
伝子がin viv。
発現された時に生じる。この方法では、リガンド結合部位を用いて、適切な修飾
リガンドの付加により、化学的に標識したタンパク質をin vivoで産生す
ることができる。ターゲットタンパク質は任意の対象タンパク質であってよい。
例えば、対象タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド構造がわかっていれ
ば、バクテリア又はウィルスに由来する任意のタンパク質がターゲットタンパク
質になり得る。
本発明ではマーカータンパク質はストレプトアビジンである。但し、エクオリン
(aequorin)又は他の高親和性リガンド結合部位をもつタンパク質も適
切なマーカータンパク質として使用できる。
ストレプトアビジンはビオチンと結合し、化学的に修飾した多くのビオチン、例
えば蛍光ビオチンもストレプトアビジンと結合する0例えば、ストレプトアビジ
ン遺伝子との遺伝子融合は、所望であればin vivo又はin vitro
で蛍光団により特異的に標識し得る融合タンパク質のin viv。
産生を可能にする。
本発明は標識モノクローナル抗体の製造にも係わる。このようなモノクローナル
抗体は蛍光染料に関する唯一の結合部位を有する。 in vitro共有結合
修飾は必要ない、生成物にはバッチ毎の相違(batch to batch
variation)はない・本発明はまた、既存のビオチン−ストレプトアビ
ジン親和力分離法を用いて希な又は不安定なタンパク質を単離する操作を容易に
し得る融合標識タンパク質についても考察する。
生体細胞内で、少量の対象タンパク質を標識し且つ検出できることは望ましいこ
とである0本発明の方法では、当該タンパク質をコードするDNA配列さえわか
れば、そのタンパク質を単離することができる。これが有する内容及びその応用
は多くある0例えば、標識腫瘍遺伝子生成物を産生ずる細胞では、その腫瘍遺伝
子生成物の細胞内位置を本発明の方法で分析することができる。少数の細胞内の
みに生じる特定遺伝子に関しては、これらの細胞をFACSによって単離し且つ
同定することができる。
多数の小(small)タンパク質は、的確な補因子を付加すると化学発光する
という理由、又は大きな特異性及び親和力をもって小(s−a l l )分子
に結合するという理由から、1nvivoで容易に検出できる。これらのタンパ
ク質の遺伝子は、哺乳動物細胞内での強い発現を促進するベクター内にクローニ
ング処理して配置することができる。このシステムは補因子又は標識小分子の付
加によってタンパク質を検出できることを確認するのに使用し得る。前記ベクタ
ーはタンパク質融合の楕築を容易にすべく変化させてよい0m胞タンパク質に関
する遺伝子をベクター内に挿入すると遺伝子融合が生じる。融合遺伝子を含むベ
クターは細胞に再挿入し得、その結果in vivo合成した融合タンパク質の
性質、位置、程度及びコントロールの特徴を調べることができる。
適切な突然変異体が存在すれば、そのタンパク質融合が正常な機能を保持してい
るが否かを評価することができる。
必要であれば、短いコラーゲンブリッジを細胞タンパク質と標識タンパク質との
間に形成してもよい。
大」E伝」−
ストレプト ビジンをコード る゛ツムDNAクローンの及で、lL汲淀−
杜!!tJJL友払−
1び の1のパ
使用したすべての酵素及び化学物質は、BethesdaResearch L
aboratories+New England Biolabs、 Boe
hringMannhem Bioehemieals又はPharmacia
P−L Biochemicalsから入手した。放射性化学物質は、New
England Nuclearから入手した。ストレプトアビジン、pUC
8及び813はBethesda Re5e’arch Laboratorj
esから入手した。
アミノ びアミノ
使用したストレプトアビジン調製物を5OS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分析すると、主タンパク質バンド以外におそらくはタンパク質の分解産物と推
定される低分子量の物質がある程度検出された。アミノ酸配列分析用の純粋成分
を得るために、ストレプトアビジン調製物を分離用の15%スラブ5OS−ポリ
アクリルアミドゲル(9)の電気泳動にかけ、ゲルから高分子量の主タンパク質
バンドを精製した。実質的にHaller & Burgessの方法(10)
で、タンパク質バンドを可視化し、溶出し、SOS除去した。Beekman
890B自動シーケンサを使用してタンパク質のアミノ末端配列分析を行なった
。HPLC(11)を使用してアミノ酸の同定を行なった。アミノ酸分析のため
に、ゲル精製タンパク質をβ−メルカプトエタノール(1:1000)の存在下
に6N HClで真空下に110℃で24時間加水分解し、加水分解液をBee
kman 121MBアミノ酸アナライザーで分析した。
リボ フレ ドのム び :
^pplied Biologicals DN^/RN^シンセサイザー(1
2)を使用し、固相ホスファイトトリエステル法でオリゴヌクレオチド混合物を
合成した。
15x配列決定ゲル上の分離用ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってオリゴ
ヌクレオチドを精製した。ストレプトアビジン遺伝子の単離に使用したオリゴヌ
クレオチドプローブを第1図に示す。
精製したオリゴヌクレオチドの5′末端をγ−[32p]^TP(4,00(1
−6,0OOCi/mmo1)とポリヌクレオチドキナーゼとによって標識した
1組み込まれながった^TPをDEAE−セルロースクロマトグラフィーによっ
て除去した(13) 。
5tre tom ces avidiniiからのゲノムライプーリーのSt
reptomyces avidiniiから精製した染色体DNAをMbo
lで部分消化し、6〜19kbのDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動
によって精製した。 Charon 30 DNA(14)をBamHIで完全
消化し、アームをアガロースゲル電気泳動によって単離し、T4 DNAリガー
ゼを使用してStreptomycesavidiniiのDNAフラグメント
と結合した0Maniatis等の方法(15)を用い、組換DN^を生きたバ
クテリオファージ粒子にin vitroでパッケージした。
DNAクローンのス 1−ニン
大腸菌LE 392株に組換ファージを感染させ、NZYCM寒天プレート上の
NZYCH軟質アガロースにプレートし、37℃で増殖させた。各々が約8xl
O’のファージを含むZつのプレートをスクリーニングに使用した。 Bent
on & Davisの方法(16)でハイブリダイゼーションを行なうために
、3つのレプリカプレートを調製した。 75+M Tris−HC1pH8と
loomMリン酸ナトリウムp[16,5と750mM NaC1と5n+M
EDT^と1%SDSと10x Denhardtと100127zj!の変性
サケ精子DNAとの中でフィルターを25℃で3時間プレハイブリダイズした。
オリゴヌクレオチドl111F当たり比活性108〜10肯cpmの4ng/x
iの標識10−ブ(Stv14、第4図参照)の存在下に同じ溶液中でハイブリ
ダイゼーションを行なった。フィルターを25℃、28℃及び31℃(各温度−
に各1つのレプリカ)で30〜36時間ハイブリダイズし、次にプレハイブリダ
イゼーション溶液からDenhardtとDNAとを除いた同じ組成の溶液25
0zI!を3回交換して25℃で45分間洗浄した。乾いたフィルターをプロッ
トし、増感スクリーンと共にKodax XR5X線フィルムに露光した。
胆IULL附
遺伝子の制限フラグメントを、813. mp18及びmp19(17)内でサ
ブクローニングし、ジデオキシチェーンターミネータ−法で配列決定した(18
> 。
更に、ストレプトアビジン遺伝子(2kbフラグメント)を1ラスミドpUC8
にサブクローニングし、新しいプラスミドを形成してpUc8−S2と命名した
。プラスミドpUc8−S2の制限地図を第6図に示す。
プラスミドpUc8−S2を使用して大腸菌に一12株をトランスフオームし、
新しい菌株JH83を得た。プラスミドpUc8−S2を内包する大腸菌JM8
3株は、^merican Type Cu1tureCollection、
Rockville、 Md、に受託番号ATCCNo、53307で寄託され
た。この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約に基づいてなされたものである。
二゛告の ・ ゛
タンパク質のアミノ酸配列を既知の三次構造のタンパク質中の二次i遣要素に特
徴的であることがわかっている一連の配列パターンに比較するコンピュータプロ
グラムを開発した(19〜21)、ヘリックスとβ鎖とを分けるターンを同定す
る上でこれらのパターンは約90%正確であることが知見されている(20)
、α/βタンパク質の研究(19)と全てヘリカルで全てβのタンパク質のその
他の特性(20)とに基づいて選んだパターンを使用してヘリカル及びβの傾向
(propensities)を推゛定した。これらのパターンは、ターン検出
手順よりも信頼性が高いことは明らかである(即ち70%正確度)、類縁である
ことがわかっている配列グループ(例えばミオグロビン及び免疫グロブリン)に
この方法を応用したときも方法の信頼度は低下しなかった(19)。
丸」えm
ストレプトアビジンのアミノ
市販のストレプトアビジン調製物のアミノ末端のアミノ酸分析によれば、エドマ
ンのタンパク質分解法の第一サイクルでアラニンとアスパラギン酸との双方が存
在することが判明した。この異質性はこの調製物を5OS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で検査したときに分子量が夫々的17.5kd及び15.5kdの
2つの主タンパク質バンドが1i!察されることによって説明できる。高いほう
の分子量をもつバンドは、ゲル中に存在する全部の染色タンパク質材料のの60
〜70%にのぼる。アミノ酸配列を決定するために、17.5kdのポリペプチ
ド鎖を、前記の材料及び方法の項で記載したごとくゲル精製した。第1図は、タ
ンパク質の40個のアミノ末端残基に関して得られたアミノ酸配列を示す。
ストレプトアビジン遺「 を るクローンの゛ストレプトアビジン遺伝子を内包
するクローンを単離するために、ストレプトアビジンのアミノ酸配列の小部分を
コードするコドンの可能な組み合わせ全部を示す16種のオリゴヌクレオチドの
混合物でストレプトアビジンのゲノムライブラリーをスクリーニングした(第1
図)。14個のヌクレオチドの長さをもつ1つの特定プローブを5tv14と命
名した。
使用した3種類のハイブリダイゼーション温度(材料及び方法の項参照)で陽性
を維持したいくつがのクローンを単離した。所望クローンの存在を確認するため
に、推定された各陽性クローンの精製DNAをBa+il(Iで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動でDNAフラグメントを分離し、サチンプロット法で分析した
(22)、 5tvL4以外の別のプローブ、即ちアミノ酸配列の異なる部分に
由来するプローブ5tvll(第1図)を使用した。プローブ5tv14及び5
tvllの双方は約2kbの単一フラグメントに特異的にハイブリダイズした。
ストレプトアビジンのクローンDNAのサザンプロット分析を完了するために、
陽性クローンのDNAをBamHIで消化した。 DNAフラグメントを0.9
%アガロースゲル電気泳動にかけ、臭化エチジウムで染色して可視化し、標準サ
ザンブロッティング法(22)でニトロセルロース濾紙に移した0重複プロット
をZOng/mlの32P−標識5tv14又は5tvllと共に27℃で20
時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション溶液及び洗浄条件はライブラ
リーのスクリーニングに使用したものと同じであった。
ヌクレオ ド びアミノ
プローブの相補的配列を含む領域を同定するために、2kbのフラグメントを5
au3八Iで切断し、BamHIで切断した813にサブクローニングし、組換
え体を12p標識S t v 1410−ブでスクリーニングした。単離した陽
性クローンから得られた[lN八へ列は、遺伝子のコード領域の一部と両方のプ
ローブに相補的な配列との存在を示した。この配列を2kbフラグメントの範囲
内に限定するために、S+aith & Birns−tielの方法(23)
を使用して2kbフラグメントの部分制限地図を作成した。遺伝子の完全ヌクレ
オチド配列を得るために、適当なオーバーラツプフラグメントをM13にサブク
ローニングして配列決定した。第2図は2kbフラグメントの部分制限地図とス
トレプトアビジン遺伝子の配列決定に使用された戦略とを示す。
ストレプトアビジン遺伝子の完全ヌクレオチド配列をアミノ酸配列と共に第3図
に示す。残基1〜40のアミノ酸配列は第1図に示したタンパク質配列から得ら
れたアミノ酸配列と完全に一致する。 in vitro単離されたタンパク質
のアミノ末端のアミノ酸配列は、アスパラギン酸であり、従って、残基−24−
1はこの成熟タンパク質を生成するために除去される必要がある。24個のエキ
ストラアミノ酸は、殆どの分泌タンパク質の遺伝子中に存在するシグナルペプチ
ドと共通の特性を示す(24)。この知見はストレプトアビジンが分泌タンパク
質である(1)というこれまでの知見と一致する。アミノ末端プロセッシング後
の成熟タンパク質は、159個のアミノ酸を含み、計算分子量は16,500ダ
ルトンであり、これは5OS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって各スト
レプトアビジンサブユニットについて知見された約17,500ダルトンに極め
て近い値である。
異なる3種類の方法で決定されたストレプトアビジンのアミノ酸組成、即ちスト
レプトアビジン遺伝子のヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸組成、ゲル精
製タンパク質の分析に由来するアミノ酸組成及びこれまでに報告されたアミノ酸
組成(4)の比較を表Iに示す。
宍」ニ
ストレプトアビジンのアミノ 4
ブユニッドた の 基
アミノ酸 (a) (b) (c)
Lys 8 8.7 4
His 2 2.6 2
^rg 4 3.0 4
^sp 8 ts、o* 12*
Δsn 10 18.0* 12*
Thr 19 18.3 19
Ser 14 13.0 10
Glu 5 11.3本 9木
GIn 6 11.3本 9*
Pro 4 3.7 2
Gly 18 20.6 17
^la 25 25.0 17
Cys OOO
Va l 10 10 、1 7
Met O’ O0
11e 4 4.0 3
Leu 8 B、5 8
Tyr 、 8 6.1 8
Phe 2 2 、1 2
Trp 6 4.01本 8
(a)ヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸組成、N−末端プロセッシング
後の成熟タンパク質の組成を示す。
(b)本発明によるアミノ酸分析、この値はゲル精製タンパク質のアミノ酸分析
から算出したもの。
(c)従来技術によるアミノ酸分析、この値は参考文献(4)によるもの。
(車)タンパク質の酸加水分解でアスパラギン及びグルタミンの脱アミンが生じ
るのでこれらのアミノ酸はアスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩と識別できない
。
(木本)I(Cf加水分解を使用したのでトリプトファン回収率は低い(β−メ
ルカプトエタノールの添加によってトリプトファンをある程度回収できた)。
(以下余白)
ヌクレオチド配列決定から得られる値はゲル精製タンパク質のアミノ酸分析から
得られる値と、アミノ酸分析の誤差の範囲内で良好に一致する。先に報告したス
トレプトアビジンサブユニット1個当たりの残基数は、タンパク質に関する残基
の合計を130個と仮定して計算した(4)、それらの値をヌクレオチド配列か
ら得られる値と比較すると、幾つかのアミノ酸において相違が認められる。この
不一致は、相違のうちの幾つかは初めから存在し、またその他の相違は先に報告
した値をアミノ酸総数159個として修正した後に現れるので、残基総数を小さ
く見積もり過ぎたということでは説明され得ない、プロセッシング後のストレプ
トアビジンのNあるいはC末端領域に全くあるいは僅かにしか存在しないアミノ
酸については同じかあるいは類似の値が見いだされるという点が、興味深く指摘
される。この観察に加え、ストレプトアビジンの異なる一市販調製品は、アミノ
酸配列の決定に用いたポリペプチドより低くかつ可変の分子量を示した。このこ
とは、このタンパク質のN及び/またはC末端領域が特にタンパク質分解を起こ
し易いものであり得るということを示唆する。N末端残基10〜12個にC末端
残基19〜21個を加えたものが、表■に示したアミノ酸含量に見いだされる不
一致にほぼ相当することが、計算によって示される。従って、先に報告したアミ
ノ酸分析は恐らく部分的に分解したストレプトアビジンから得られたと考えられ
る。
ストレプトアビジン びアビジンの一゛ び二゛ロ第4図は、ストレプトアビジ
ンのアミノ酸配列を、鶏卵の卵白から得たビオチン結合タンパク質であるアビジ
ン(25)のアミノ酸配列と比較して示す、アビジンが128個のアミノ酸を有
するのに比べ、ストレプトアビジンは159個のアミノ酸を有する。上記両タン
パク質問には幾つかの広範相同領域が見いだされた。特に興味深いのは、ストレ
プトアビジンのトリプトファン21.79及び120を含む、これらのトリプト
ファンの周囲の相同性である。アビジンにおいて、対応するトリプトファン10
.70及び110はビオチンによって酸化剤から保護されており、このことはこ
れらの残基が該タンパク質のビオチン結合部位に関連付けられることを示唆する
(4)。そのうえ、恐らく、トリプトファンに隣接する3個のりジン残基(9,
71及び111)のうちの1個である単一のNl2基がアビジンのビオチン結合
活性のために重要であることが判明した(4)、ストレプトアビジンにおいては
、上記のような3個のリジンのうちの2個が、やはりトリプトファンに隣接する
りジン残基(80及び121)として保存されている。
上記両タンパク質について、二次構造を、アミノ酸配列(19〜21)からのコ
ンホーメーションを予想するアルゴリズムを用いて計算した。第5図は、α−ヘ
リカル構造部、β−鎖鎖構造郡部るいはβ−ターン構造部の中心位置にある残基
を示す0両タンパク質は、β構造がきわめて優勢な構造上の明らかな相同を示す
、示唆されたβ−鎖のほとんどにおける疎水−親水の繰り返しパターンは、折り
畳まれたβ−シートもしくはβ−バレル構造(26)に一致する0両配列の全体
の組成パターンは、両タンパク質が“全β0タンパク質(27)の範晴に属する
ことを示唆する。第5図に示したターンのリストは不完全であるが、示されたタ
ーンが適正である可能性は高い(19)、β構造の規模並びに正確な場所を予想
することは比較的困難である。他方、両タンパク質中のα−へソックスが、たと
え存在するにしても僅かであることは明らかである。α−へソックスが見いださ
れるうえでの最良の変化は、ストレプトアビジンのN末端領域並びに両タンパク
質のC末端領域で起こる。
上記予想に違わず、アビジンはRa+*an分光法での決定によれば55%のβ
構造並びに5%のα−へソックスを含有することが判明した(28)。
九は眞ム
でのストレプトアビジン−ヒトLDLレセプ −゛ −ムの
ストレプトアビジン遺伝子をヒトの低密度リポタンパク質(LDL>レセプター
遺伝子に、これらの遺伝子の読み取り枠が共に存続するように融合する遺伝子構
成を、ストレプトアビジン遺伝子を遺伝子融合の5′末端に、またヒトしDLレ
セプター遺伝子を3′末端に配置することによって実施した0発現されたタンパ
ク質は、ハイブリッドタンパク質のN末端領域に位置するストレプトアビジンと
、C末端領域に位置するLDLレセプターとから成る。
上記両遺伝子を融合するために、ストレプトアビジン遺伝子の3′領域のコドン
11個をin vitroで除去した。LDLレセプター遺伝子の、融合に用い
た領域は、タンパク質のC末端領域の159個のアミノ酸についてコードする領
域であった。融合前のレセプターにおいてこの領域は、短い細胞外尾部(アミノ
酸88個)と、膜伸張領域(アミノ酸22個)と、細胞内ドメイン(アミノ酸4
9個)とから成る。
ストレプトアビジン の5′ び3′ の亦第3図に、ストレプトアビジン(S
TV)遺伝子のヌクレオチド配列並びに5′及び3′領域の変更に用いた制限部
位を示す。
第7図は、STV遺伝子の5′領域の変更のために実現した反応を示す、STV
遺伝子を含む2kbフラグメント(第7図、ステップA)をN5tl及び粒Iで
処理し、得られたST■遺伝子含有フラグメントを精製した(第7図、ステップ
B)、このフラグメントを、MstI処理並びに開始コドンの上流側に隣接する
酵素1リーIのための制限部位で除去したSTV遺伝子配列を含む合成オリゴヌ
クレオチドの付加によって変更した。上記変更の部位のヌクレオチド配列を下記
に5’−−−−TCTCACATGCGC^^G−−−−3’ (STV)3’
−−−−^(1;AにTにTACGCGTTC−−−−5’GC^^G−−−−
(STV)
CGTTC−−−−
5’ CCATGGTACC八TGC3’ ÷へ (オリゴヌクレオチド)3’
CGTACCATGGTACG 5’CATGCG^ΔC−−−−
CAT(:CTACCCGTTC−−−一配列決定ゲルのオートラジオグラフィ
ーによって、変更領域の配列を確認した。
変更したフラグメント(第7図、ステップC)をpUC19中でサブクローニン
グしく第7図、ステップD)、Sa+aIで処理し、STV遺伝子含有フラグメ
ントを精製したく第7図、ステップE)。両末端をEeoRIリンカ−で変更し
た後、フラグメントをHincllで処理しく第7図、ステップF)、再びSd
Iリンカ−の連結反応によって変更した(第7図、ステップG)、第7図のステ
ップGでの変更の部位におけるヌクレオチド配列は、次のようである。
GlyValAsnAsnGIy
5”−−−−GGCにTC^八C^へCGCC−−−−3’ (STV)3’−
−−−CCGCAGTTGTTGCGG−−−−5’−−−−CCGCAG
5’G四が’GCC3’ (鏑−■リンカー)3’ CCGTACGG 5’
一−−−C:GCにTC−GGCATGCC−−−−(、にCGTCGにCAT
に
−−−−CCGCAGCC
3TV −のLDLレセプター −との ムヒトLDLレセプター遺伝子の制限
マツプ及びヌクレオチド配列は、既に決定されている(29)。融合に用いた制
限部位は、およそ0.7kbに位置するEcoR1部位、およそ2.1kbに位
置するII部位、並びにおよそ2゜8kbに位置するSma1部位であった。
第8図は、両遺伝子を融合するべく実現した反応を示す。
LDLレセプター遺伝子を含むプラスミド(第8図、ステップA)を、EcoR
I及びSdlで処理した。第8図のステップBに示したフラグメントを精製して
、STV遺伝子の挿入に用いた(第8図、ステップC)0両遺伝子の融合部位の
ヌクレオチド配列は、次のようである。
GIyMetLeuLeu
5’−−−−GGCATCCTGCTG−−−−3′(L D Lレセプター)
3’−−−−CCGTACGACGAC−−−−5’CTCCTG−−− (L
D Lレセプター)GTACGACGAC−−−
−−−−にGCGTCG(:CATG (STV)−−−−CCGCM:CC
Gly Val Gly Met Leu Leu−−−GGCCTCGGCA
Tに CTに CTG−−−(STV−LDLI/セフタ−)−−−CCG C
Aに CCG TACGACにAC−−−このヌクレオチド配列を、オートラジ
オグラフィーで確認した。
EeoRI及びSma Iでの処理により5TV−LDLレセプターを回収した
(第8図、ステップD)後、フラグメントをEcoRIリンカ−の付加によって
変更した(第8図、ステップ現ベクターであるpMV7中でサブクローニングし
、得られたプラスミドを、リン酸カルシウム沈澱法(31)でNi1(3T3細
胞をトランスフェクトするのに用いた。抗生物質G418に耐性の細胞コロニー
を、ビオチニル化したウシ血清アルブミンと結合した赤血球に結合させることに
よって、STVの発現に関して試験した。過剰な赤血球を洗浄によって除去した
後、幾つかのコロニーが赤血球と結合したが、このことはストレプトアビジン融
合が発現され、かつ細胞膜へと運搬されたことを証明している。
(以下余白)
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国際調査報告
Claims (47)
- 1.ストレプトアビジンをコードする単離DNA。
- 2.約2kbの長さを有し、ストレプトマイセス・アビジニイの染色体DNAの 制限エンドヌクレアーゼ消化から誘導される、請求の範囲第1項に記載のDNA 。
- 3.第3図に示される核酸配列を有する請求の範囲第1項に記載のDNA。
- 4.ストレプトアビジンポリペプチドをコードする全領域,シグナルペプチドを コードする領域及び該コード領域の3′及び5′末端に天然に生起するフランキ ング領域DNAを有する請求の範囲第2項に記載のDNA。
- 5.請求の範囲第2項に記載のDNA及びクローニングベヒクルDNAを有する 組換えクローニングベヒクルであって、該クローニングベヒクルDNAに第1及 び第2の制限酵素部位が存在し、請求の範囲第2項に記載のDNAが該部位に挿 入されていることを特徴とする前記組換えクローニングベヒクル。
- 6.挿入DNAがストレプトアビジンポリペプチドをコードする全領域,シグナ ルペプチドを:コードする領域及び該コード領域の3′及び5′末端に天然に生 起するフランキング領域DNAを有する請求の範囲第5項に記載のクローニング ベヒクル。
- 7.ブラスミドクローニングベヒクルである請求の範囲第5項に記載のクローニ ングベヒクル。
- 8.ファージクローニングベヒクルである請求の範囲第5項に記載のクローニン グベヒクル。
- 9.ファージがM13である請求の範囲第8項に記載のクローニングベヒクル。
- 10.ブラスミドがpUCである請求の範囲第7項に記載のクローニングベヒク ル。
- 11.請求の範囲第5項に記載のクローニングベヒクルを有する遺伝子工学的に 得られた細菌宿主細胞。
- 12.大腸菌である請求の範囲第11項に記載の細菌宿主細胞。
- 13.JM83と指称されATCC受託番号53307を有する請求の範囲第1 2項に記載の大腸菌宿主細胞。
- 14.請求の範囲第5項に記載のクローニングベヒクルを有する哺乳動物宿主細 胞。
- 15.哺乳動物細胞がNIH3T3細胞である請求の範囲第14項に記載の哺乳 動物宿主細胞。
- 16.夫々が分子量約16,500ドルトンで多数の遊離ビオチン結合部位を有 する4つ等しいポリペプチドサブユニットから成る、実質的に純粋なビオチンフ リーストレプトアビジン。
- 17.各サブユニットが第3図のアミノ酸配列を有する請求の範囲第16項に記 載のストレプトアビジン。
- 18.タンパク質分解による開裂可能なアミノ末端標識を有する請求の範囲第1 6項に記載のストレプトアビジン。
- 19.アミノ末端標識が放射性標識又は蛍光標識である請求の範囲第18項に記 載のストレプトアビジン。
- 20.タンパク質分解による開裂可能なカルボキシ末端標識を有する請求の範囲 第16項に記載のストレプトアビジン。
- 21.カルボキシ末端標識が放射性標識又は蛍光標識である請求の範囲第20項 に記載のストレプトアビジン。
- 22.カルボキシ末端標識が同定可能なシステインである請求の範囲第20項に 記載のストレプトアビジン。
- 23.アミノ酸の大部分がベータ構造にある請求の範囲第16項に記載のストレ プトアビジン。
- 24.請求の範囲第11項に記載の宿主細胞を、ストレプトアビジンをコードす る遺伝子が発現されるような適当な条件下で培養し、産生されたストレプトアビ ジンを回収することから成る、ストレプトアビジン調製方法。
- 25.ストレプトアビジンをコードする第2DNA断片に融合した対象標的タン パク質をコードする第1DNA断片を有する融合遺伝子であって、該ストレプト アビジンがビオチン又はビオチン誘導体に対する多数の結合部位を有し、該融合 遺伝子が適当な発現ベクターに挿入され適当な宿主細胞に導入された際にイン・ ヴィボで融合タンパク質を発現し得る、前記融合遺伝子。
- 26.第1DNA断片が融合遺伝子の5′末端にある請求の範囲第25項に記載 の融合遺伝子。
- 27.ストレプトアビジンをコードするDNA断片が融合遺伝子の5′末端にあ る請求の範囲第25項に記載の融合遺伝子。
- 28.ストレプトアビジンをコードするDNA断片が2kbの長さであり、スト レプトマイセス・アビジニイの染色体DNAの制限エンドヌクレアーゼ消化から 誘導される請求の範囲第25項に記載の融合遺伝子。
- 29.ストレプトアヒジンDNA断片が第3図の核酸配列を有する請求の範囲第 25項に記載の融合遺伝子。
- 30.2kbの断片がストレプトアビジンポリペプチドをコードする全領域,シ グナルペプチドをコードする領域及び該コード領域の3′及び5′末端に天然に 生起するフランキング領域DNAを有する請求の範囲第28項に記載の融合遺伝 子。
- 31.第1DNA断片がヒトLDL受容体タンパク質をコードする遺伝子である 請求の範囲第25項に記載の融合遺伝子。
- 32.融合遺伝子が適当な発現ベクターに挿入され適当な宿主細胞に導入された 際に、融合タンパク質のN末端領域にあるストレプトアビジン及び融合タンパク 質のC末端領域にあるLDL受容体タンパク質から構成されるタンパク質を発現 し得る請求の範囲第31項に記載の融合遺伝子。
- 33.適当な宿主細胞に導入された際に請求の範囲第25項に記載の融合遺伝子 を発現し得る発現ベクターであって、適当なキャリアDNA及び請求の範囲第2 5項に記載の融合DNA断片を有する前記発現ベクター。
- 34.哺乳動物発現ベクターである請求の範囲第33項に記載の発現ベクター。
- 35.請求の範囲第34項に記載の発現ベクターを有する哺乳動物宿主細胞。
- 36.NIH3T3宿主細胞である請求の範囲第35項に記載の哺乳動物宿主細 胞。
- 37.適当な宿主細胞に導入された際に請求の範囲第31項に記載の融合遺伝子 を発現し得る発現ベクターであって、適当なキャリアDNA及び請求の範囲第3 1項に記載の融合DNA断片を有する前記発現ベクター。
- 38.哺乳動物発現ベクターである請求の範囲第37項に記載の発現ベクター。
- 39.請求の範囲第38項に記載の発現ベクターを有する哺乳動物宿主細胞。
- 40.NIH3T3宿主細胞である請求の範囲第39項に記載の哺乳動物宿主細 胞。
- 41.請求の範囲第25項に記載の融合遺伝子にコードされる融合タンパク質で あって、対象標的タンパク質がストレプトアビジンに融合しており、ストレプト アビジンがビオチン又はビオチン誘導体に対する多数の結合部位を有している前 記融合タンパク質。
- 42.標的タンパク質がモノクローナル抗体である請求の範囲第41項に記載の 融合タンパク質。
- 43.標的タンパク質がヒトLDL受容体タンパク質である請求の範囲第41項 に記載の融合タンパク質。
- 44.ビオチン誘導体が蛍光ビオチンである請求の範囲第41項に記載の融合タ ンパク質。
- 45.a)対象タンパク質をコードするDNAを請求の範囲第1項に記載のスト レプトアビジンをコードするDNAに連結して融合遺伝子を生成し、 b)該融合遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、c)核融合遺伝子を発現し融 合タンパク質を産生し得る適当な条件下で、該発現ベクターを適当な宿主細胞に 導入し、d)該触合タンパク質を単離し、 e)イン・ヴィトロで該融合タンパク質をビオチン又はビオチン誘導体とインキ ュベートし、これによって、該融合タンパク質のストレプトアビジン部分にビオ チン又はビオチン誘導体が結合した融合タンパク質−ビオチン複合体を生成し、 f)ビオチン又はビオチン誘導体が該宿主細胞によって産生された非標識融合タ ンパク質に結合し得るような適当な条件下で、該融合タンパク質−ビオチン複合 体を前記c)段階の宿主細胞に導入し、これによって、イン・ヴィボで標識又は 化学修飾された対象タンパク質を産生する ことから成る、イン・ヴィボに於ける標識対象タンパク質の産生方法。
- 46.c)段階のビオチン誘導体が蛍光性である請求の範囲第45項に記載の方 法。
- 47.a)対象タンパク質をコードするDNAを請求の範囲第1項に記載のスト レプトアビジンをコードするDNAに連結して融合遺伝子を生成し、 b)該融合遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、c)該融合遺伝子を発現し融 合タンパク質を産生し得る適当な条件下で、該発現ベクターを適当な宿主細胞に 導入し、d)該融合タンパク質のストレプトアビジン部分にビオチン又はビオチ ン誘導体が結合するような条件下で、該融合タンパク質をビオチン又はビオチン 誘導体と接触させ、これによって、融合タンパク質−ストレプトアビジン−ビオ チン複合体を産生し、 e)該複合体を単離し、これによって、対象タンパク質を単離する ことから成る、対象タンパク質の単離方法。
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