ES2327398T3

ES2327398T3 - Biomateriales interfaciales.

Info

Publication number: ES2327398T3
Application number: ES02806542T
Authority: ES
Inventors: Mark W. Grinstaff; Daniel J. Kenan; Elisabeth B. Walsh; Crystan Middleton
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 2001-11-20
Filing date: 2002-11-20
Publication date: 2009-10-29
Anticipated expiration: 2022-11-20
Also published as: US20060263830A1; WO2003072542A2; EP1527341B1; EP1527341A2; JP2005518442A; ATE434184T1; CA2467836A1; DE60232688D1; WO2003072542A3; US20060216772A1; US20030185870A1; US20060263831A1; EP1527341A4; AU2002367566B2; AU2002367566A1

Abstract

Biomaterial interfacial que comprende de una pluralidad de agentes de unión, donde cada agente de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana no biológico, y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana biológico, donde cada agente de unión comprende de dos o más especificidades de unión, donde la pluralidad de agentes de unión son capaces de definir una interfaz entre el sustrato diana no biológico y el sustrato diana biológico, y donde la primera parte de unión comprende de un péptido y la segunda parte de unión comprende de un péptido.

Description

Biomateriales interfaciales.

Campo de la invención

La presente Invención se refiere en general a biomateriales Interfaciales que actúan de mediadores en la interacción entre un sustrato no biológico y un sustrato biológico, y a procedimientos para preparar y utilizar los mismos. Más concretamente, la presente invención se refiere a agentes de unión que crean una interfaz de unión entre sustratos mediante la unión específica de cada sustrato.

También se describen en la presente memoria agentes de unión que crean una interfaz de no unión entre sustratos mediante la unión específica a un sustrato no biológico y básicamente la no unión a un sustrato biológico.

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1001

1002

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Abreviaturas de los aminoácidos y sus codones de ARNm correspondientes

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1

2

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Antecedentes de la invención

La notable especificidad de unión y función que presentan las moléculas orgánicas ha motivado esfuerzos para utilizar estas actividades de unión y funcionales de nuevas maneras. Las tecnologías de despliegue molecular han facilitado estos esfuerzos permitiendo la rápida identificación de agentes de unión específicos para casi cualquier molécula diana. En concreto, la tecnología de despliegue en fagos de péptidos y proteínas (incluyendo los anticuerpos) han llevado al descubrimiento de sitios de unión naturales y de diseño.

Los sistemas de despliegue en fagos utilizan bibliotecas muy diversas construidas fusionando secuencias degeneradas de ADN a un gen que codifica una proteína de la cubierta del fago, de manera que la secuencia variable de la proteína codificada se despliegue en la cubierta del fago. Se aíslan fagos individuales con las especificidades de unión deseadas mediante la unión a una molécula inmovilizadora ó molécula diana que se puede seleccionar. Se identifican los péptidos o proteínas que confieren la unión mediante secuenciación del ADN dentro del fago seleccio-
nado.

Los péptidos y proteínas que tienen propiedades funcionales y de unión únicas se puede utilizar como agentes terapéuticos (Raum et al., 2001), como plantillas para el diseño de moléculas, incluyendo el diseño de fármacos (Ballinger et al., 1999; Bolin et al., 2000; Wolfe et al., 2000; Mourez et al., 2001; Rudgers & Palzkill, 2001), como moléculas autodireccionales para métodos de administración de fármacos (Arap et al., 1998; Nilsson et al., 2000; Ruoslahti, 2000), y como composiciones para estimular la fijación celular en casos de cicatrización o regeneración de tejidos (por ejemplo, las Patentes estadounidenses nº 5.856.308; nº 5.635.482; y nº 5.292.362).

El despliegue en fagos se ha utilizado también para seleccionar péptidos que se unen a superficies inorgánicas con una especificidad alta. Los péptidos de unión a superficies semiconductoras que también se unen a una segunda molécula se han propuesto para el ensamblaje de estructuras electrónicas. Véase Whaley et al., 2000.

Se ha desarrollado un interés reciente en composiciones que imitan las capacidades funcionales y de reconocimiento de las moléculas biológicas para actuar de mediadores en interacciones que implican a materiales no biológicos. Por ejemplo, pueden utilizarse péptidos para recubrir dispositivos prostéticos para por consiguiente estimular la fijación de las células endoteliales tras la implantación. Véanse las Patentes estadounidenses nº 6.280.760; nº 6.140.127; nº 4.960.423; y nº 4.378.224.

Antes de describir la presente invención, se ha llevado a cabo la preparación de superficies y dispositivos recubiertos de péptidos mediante adsorción no específica, mediante el acoplamiento del péptido a una superficie derivatizada, o mediante el acoplamiento del péptido a una molécula conectora unida covalentemente a la superficie. Estos procedimientos son relativamente tediosos y requieren mucho tiempo, y generalmente requieren múltiples etapas para la asociación efectiva del péptido y el sustrato. Sin embargo, los beneficios potenciales de las superficies y dispositivos no biológicos que incluyen un recubrimiento biológico son evidentes.

Por lo tanto, existe una largamente sentida necesidad en la técnica de desarrollar un procedimiento eficiente y ampliamente aplicable para estimular interacciones específicas entre sustratos no biológicos y sustratos biológicos. Además, existe una continua necesidad de desarrollar procedimientos para dirigir interacciones entre moléculas y/o células, especialmente en el contexto del diagnóstico y de los tratamientos terapéuticos.

Para satisfacer esta necesidad, la presente invención se refiere a biomateriales interfaciales que pueden actuar de mediadores en interacciones selectivas entre sustratos biológicos y no biológicos, agentes de unión novedosos que pueden unirse específicamente a un sustrato diana no biológico y/o a un sustrato diana biológico, y a procedimientos para realizar y utilizar los mismos.

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Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un biomaterial interfacial que comprende de una pluralidad de agentes de unión donde cada agente de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente a un sustrato no biológico y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un sustrato biológico, y donde la pluralidad de agentes de unión comprenden de una interfaz entre el sustrato no biológico y el sustrato biológico.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un biomaterial interfacial que comprende de una pluralidad de agentes de unión, donde cada agente de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana no biológico, y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana biológico, donde cada agente de unión comprende de dos o más especificidades de unión, donde la pluralidad de agentes de unión son capaces de definir una interfaz entre el sustrato diana no biológico y el sustrato diana biológico, y donde la primera parte de unión comprende de un péptido y la segunda parte de unión comprende de un péptido.

También se describe en la presente memoria un biomaterial interfacial que comprende de una pluralidad de agentes de unión donde cada agente de unión comprende de una primera y una segunda parte de unión que se unen específicamente a un sustrato biológico, y donde la pluralidad de agentes de unión comprenden de una interfaz entre los sustratos biológicos. En una forma de realización, la primera y segunda parte de unión se unen al mismo sustrato biológico. En otra forma de realización, la primera y segunda parte de unión se unen a sustratos biológicos diferentes.

También se describe en la presente memoria un biomaterial interfacial que comprende de una pluralidad de agentes de unión, donde cada agente de unión comprende de una parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana no biológico y a un dominio de no unión que básicamente carece de unión a un sustrato diana biológico.

El biomaterial interfacial puede comprender de una pluralidad de agentes de unión idénticos o no idénticos. Cuando el biomaterial interfacial comprende de una pluralidad de agentes de unión no idénticos, cada uno la pluralidad de agentes de unión no idénticos comprende de una forma de realización en una parte de unión idéntico que se une específicamente a un sustrato no biológico.

La presente invención proporciona adicionalmente un biomaterial interfacial estructurado, donde los agentes de unión están restringidos espacialmente dentro de la interfaz.

Sustratos no biológicos representativos incluyen pero no se limitan a un sustrato no biológico que comprende de un polímero sintético, plástico, metal, un óxido metálico, un óxido no metálico, silicona, un material cerámico, un fármaco, o un portador de fármaco. En una forma de realización, un polímero sintético comprende de ácido de poliglicol. En otra forma de realización, un polímero sintético comprende de una sutura de nailon. En una forma de realización, un plástico comprende de policarbonato, en otra forma de realización en poliestireno, y en otra forma de realización más en poliuretano. En una forma de realización, un metal comprende de titanio. En otra forma de realización, un metal comprende de acero inoxidable.

Sustratos biológicos representativos incluyen pero no se limitan a un tejido, una célula, o una macromolécula. En una forma de realización, un sustrato diana biológico diana comprende de colágeno. En otra forma de realización, un sustrato diana biológico comprende de un receptor Tie2.

También se proporcionan procedimientos para preparar un biomaterial interfacial según se define en las reivindicaciones adjuntas. De esta manera, en una forma de realización de la invención, el procedimiento comprende de: (a) aplicar a un sustrato no biológico una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al sustrato no biológico y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana biológico, y donde la aplicación está libre de acoplamiento; (b) poner en contacto el sustrato no biológico, donde la pluralidad de agentes de unión están unidos al sustrato no biológico, con una muestra que comprende de el sustrato diana biológico; y (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que el sustrato diana biológico se una a la pluralidad de agentes de unión, donde se prepara un biomaterial interafacial. Según la invención descrita, la puesta en contacto puede comprender de una puesta en contacto in vitro, ex vivo, ó in vivo.

En otra forma de realización de la invención, un biomaterial interfacial comprende de una matriz biológica. En una forma de realización, un procedimiento para preparar un biomaterial interfacial comprende de: (a) proporcionar un sustrato no biológico con una pluralidad de posiciones; (b) aplicar a cada una de la pluralidad de posiciones un agente de unión que comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al sustrato no biológico y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana biológico, donde la aplicación está libre de acoplamiento; (c) poner en contacto el sustrato no biológico, donde una pluralidad de agentes de unión están unidos al sustrato no biológico, con una muestra que comprende de el sustrato diana biológico; y (d) dejar pasar un tiempo suficiente para que el sustrato diana biológico se una a la pluralidad de agentes de unión, con lo que se prepara una matriz biológica. En una forma de realización, un procedimiento para aplicar la pluralidad de agentes de unión comprende de la impresión por "dip-pen".

También se describe en la presente memoria un procedimiento para preparar un biomaterial interfacial que comprende de: (a) aplicar a un sustrato no biológico una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una parte de unión que se une específicamente al sustrato no biológico y de un dominio de no unión que básicamente no se une a un sustrato diana biológico, y donde la aplicación está libre de acoplamiento; y (b) poner en contacto el sustrato no biológico, donde la pluralidad de agentes de unión están unidos al sustrato no biológico, con una muestra que comprende de el sustrato diana biológico, con lo que se prepara un biomaterial interfacial.

También se describen en la presente memoria procedimientos para preparar agentes de unión. En un caso, el procedimiento comprende de: (a) "lavado en batea" de una biblioteca de moléculas diversas sobre un sustrato diana no biológico, con lo que se identifica una primera parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana no biológico; y (b) unir la primera parte de unión a una segunda parte de unión, donde la segunda parte de unión se une específicamente a un sustrato diana biológico, con lo que se prepara un agente de unión. El procedimiento puede comprender adicionalmente del "lavado en batea" de una parte de unión sobre un sustrato diana biológico, con lo que se identifica una parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana biológico.

En otro caso, un procedimiento para preparar un agente de unión comprende de: (a) "lavado en batea" de una biblioteca de moléculas diversas sobre un sustrato diana no biológico, con lo que se identifica una parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana no biológico; y (b) unir la parte de unión a un dominio de no unión, donde el dominio de no unión que básicamente no se une a un sustrato diana biológico, con lo que se prepara un agente de unión. El procedimiento puede comprender adicionalmente del "lavado en batea" de una parte de unión sobre un sustrato diana biológico, con lo que se identifica un dominio de no unión que básicamente no se une a un sustrato diana biológico.

También se describen agentes de unión producidos mediante el procedimiento. En una forma de realización de la invención, un agente de unión comprende adicionalmente de un conector que se une a la primera parte de unión y a la segunda parte de unión. También se describe en la presente memoria un conector que se une a la primera parte de unión y al dominio de no unión.

En la invención, la primera parte de unión comprende de un péptido. También se describen en la presente memoria anticuerpos monocatenarios que se unen específicamente a un sustrato no biológico.

Se presentan partes de unión representativos que se unen a plásticos como los números de identidad en la SEQ: 1 a 23 y números: 66 a 71, y se presentan partes de unión representativos que se unen a metales como los números de identidad en la SEQ: 24 a 36 y números 51 a 65. La segunda parte de unión o región de no unión comprende de un péptido.

También se describen en la presente memoria, por ejemplo para su uso en la invención, péptidos sintéticos que comprenden de partes de unión que se unen al poliestireno, al poliuretano, al plicarbonato, al ácido de poliglicol, al titanio, al acero inoxidable. En una forma de realización, las partes de unión sintéticos utilizados en la invención comprenden de menos de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos. Se presentan partes de unión péptidos representativos que se unen al poliestireno como los números de identidad en la SEQ: 1 a 22, se presenta una parte de unión representativa que se unen al poliuretano como la SEQ ID nº: 23, se presentan partes de unión representativos que se unen al policarbonato como los números de identidad en la SEQ: 68 a 71, se presentan partes de unión péptidos representativos que se unen al titanio como los números de identidad en la SEQ: 24 a 36, y se presentan partes de unión representativos que se unen al acero inoxidable como los números de identidad en la SEQ: 51
a 65.

La descripción proporciona adicionalmente procedimientos representativos para utilizar un biomaterial interfacial, que incluyen, pero no se limitan a un procedimiento para cultivar células, un procedimiento para implantar un dispositivo en un sujeto, un procedimiento para modular una actividad de un sustrato biológico, un procedimiento para preparar un recubrimiento no ensuciante, un procedimiento para administrar fármacos, y un procedimiento para seleccionar una sustancia de ensayo para la interacción con un sustrato biológico.

Un procedimiento para cultivar células, según la presente invención, puede comprender de: (a) aplicar a un sustrato no biológico una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente a un sustrato no biológico y de una segunda parte de unión que se une específicamente a células, macromoléculas o a una combinación de las mismas, donde la aplicación está libre de acoplamiento; (b) poner en contacto el sustrato no biológico, donde la pluralidad de agentes de unión están unidos al sustrato no biológico, con células; (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que las células se unan a la pluralidad de agentes de unión; y (d) cultivar las células.

La presente invención también proporciona biomateriales interfaciales para su uso en procedimientos de implantación de un dispositivo en un sujeto. Un procedimiento como éste puede comprender de: (a) aplicar a un implante una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al implante y de una segunda parte de unión que se une específicamente a las células en el sitio del implante, donde la aplicación está libre de acoplamiento; y (b) colocar el implante en un sujeto en el sitio del implante. Cuando ha sido implantado en un sujeto, un dispositivo preparado de ésta manera puede estimular la fijación celular al dispositivo.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para crear una interfaz lubricante que comprende de: aplicar a un primer sustrato una pluralidad de agentes de unión, donde la aplicación está libre de acoplamiento, y donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de: (a) una parte de unión que se une específicamente al primer sustrato; y (b) un dominio de no unión que básicamente no se une a un segundo sustrato. El primer sustrato puede comprender de un sustrato no biológico o en un sustrato biológico.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para implantar un dispositivo en un sujeto que puede comprender de: (a) aplicar al implante una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una parte de unión que se une específicamente al implante y de un dominio de no unión que básicamente no se une a las células en el sitio del implante, donde la aplicación está libre de acoplamiento; y (b) colocar el implante en un sujeto en el sitio del implante. Cuando ha sido implantado en un sujeto, un dispositivo preparado de ésta manera puede proporcionar una acción lubricante en el sitio del implante.

También se describe en la presente memoria, un procedimiento para preparar un biomaterial interfacial que comprende de un lubricante de la demarcación puede también comprender de:

\quad: (a) Administrar a un sujeto una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una parte de unión que se une específicamente a un primer sustrato biológico y de un dominio de no unión que básicamente no se une a un segundo sustrato biológico; y (b) dejar pasar un tiempo suficiente para que la pluralidad de agentes de unión se unan al primer sustrato biológico, con lo que se crea una interfaz lubricante.

La invención se refiere a un procedimiento para modular una actividad de un sustrato biológico, procedimiento que consiste en:

(a) recubrir un sustrato no biológico biodegradable con una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al sustrato no biológico biodegradable y de una segunda parte de unión que se une específicamente al sustrato biológico, donde el recubrimiento está libre de acoplamiento; (b) colocar el sustrato no biológico biodegradable recubierto en un sitio diana, donde el sustrato biológico está presente en el sitio diana; y (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que el sustrato biológico se una en el sitio diana a los agentes de unión, donde la unión modula la actividad del sustrato biológico. En una forma de realización, un sustrato biológico es una célula endotelial vascular. En otra forma de realización, un sustrato biológico es una célula endotelial vascular tumoral. En otra forma de realización más, un sustrato biológico es un receptor Tie2. En una forma de realización, un sitio diana es el sitio de una herida, y la modulación promueve la cicatrización de la herida. En otra forma de realización, un sitio diana es un sitio angiogénico y la modulación inhibe la angiogénesis, incluyendo, pero sin limitarse a la angiogénesis
tumoral.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para preparar un sustrato no biológico con un recubrimiento no ensuciante. El recubrimiento comprende de una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de: (a) una parte de unión que se un específicamente al sustrato no biológico; y (b) un dominio de no unión que básicamente no se une al agente ensuciante.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para la administración de fármacos que implica un biomaterial interfacial. El procedimiento comprende de: (a) aplicar a un fármaco no biológico, o a un portador no biológico del fármaco, una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al fármaco o al portador del fármaco y de una segunda parte de unión que se une específicamente a una célula diana; (b) administrar el fármaco a un sujeto; y (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que la pluralidad de agentes de unión se unan a la célula diana.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para seleccionar una sustancia de ensayo para la interacción con un sustrato biológico. En una forma de realización, el procedimiento comprende de: (a) preparar una matriz biológica que comprende de una pluralidad de sustratos biológicos, donde cada uno de la pluralidad de sustratos biológicos está específicamente unido a una de la pluralidad de posiciones en un sustrato no biológico; (b) poner en contacto la matriz biológica con una sustancia candidata; (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que la sustancia candidata se una a la matriz biológica; y (d) someter a ensayo una interacción entre uno o más de los sustratos biológicos y la sustancia candidata, con lo que se identifica una molécula interactuante.

Por consiguiente, es un objeto de la presente descripción proporcionar biomateriales interfaciales que puedan actuar de mediadores en interacciones de unión directa y de no unión entre sustratos. Este objetivo se alcanza por completo o en parte mediante la presente descripción.

Un objeto de la invención que se ha indicado anteriormente, otros objetivos y ventajas de la presente descripción se pondrán de manifiesto a los expertos en la materia tras un estudio de la siguiente descripción y Ejemplos no limitativos.

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Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Aunque se supone que los siguientes términos serán bien comprendidos por la persona capacitada en la técnica, se exponen las siguientes definiciones para facilitar la explicación de la invención.

El término "parte de unión" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula u otra entidad química con la capacidad de unirse a un sustrato. Una parte de unión puede comprender de un péptido, un oligómero, un ácido nucleico (por ejemplo, un aptámero), una molécula pequeña (por ejemplo, un compuesto químico), un anticuerpo o fragmento del mismo, una fusión ácido nucleico-proteína, un polímero, un polisacárido, y/o cualquier otro agente con afinidad.

El término "dominio de no unión" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula, macromolécula, u otra entidad química que básicamente no se une a un sustrato diana. Un dominio de no unión puede comprender de un péptido, un oligómero, un ácido nucleico (por ejemplo, un aptámero), una molécula pequeña (por ejemplo, un compuesto químico), un anticuerpo o fragmento del mismo, una fusión ácido nucleico-proteína, un polímero, un polisacárido, y/o cualquier otro agente que básicamente no se una a un sustrato diana.

El término "sustrato" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una composición biológica o no biológica que se utiliza para preparar un biomaterial interfacial. De esta manera, el término "sustrato" abarca composiciones con una capacidad para unirse a una parte de unión de la invención. También se describen composiciones que básicamente no se unen a un dominio de no unión de la descripción.

El término "diana" se utiliza generalmente para calificar una descripción de un sustrato como uno de los múltiples sustratos con diferentes especificidades de unión. De esta manera, el término "diana" se refiere en general a un sustrato que está unido específicamente mediante una parte de unión de la presente invención, o a un sustrato que básicamente no se une a un dominio de no unión de la presente descripción.

El término "unión" se refiere a una afinidad entre dos moléculas, por ejemplo, entre un péptido y un sustrato. Tal como se utiliza en la presente memoria, "unión" se refiere a una unión preferencial de un péptido a un sustrato en una mezcla de moléculas. La unión de un péptido a un sustrato se puede considerar específico si la afinidad de unión es desde aproximadamente 1 x 10^{4} M^{-1} hasta aproximadamente 1 x 10^{6} M^{-1} ó mayor.

La frase "se une específicamente (o selectivamente)", cuando se refiere a la capacidad de unión de una parte de unión, se refiere a una reacción de unión que determina la presencia del sustrato en una población heterogénea de otros sustratos. La unión específica excluye la adsorción no específica, unión covalente mediante una reacción química, un acoplamiento mediante una fracción de fijación.

El término "tiempo suficiente para que se unan" se refiere en general a una duración temporal suficiente para la unión específica de una parte de unión y un sustrato.

Las frases "que básicamente carece de unión" ó "básicamente no se une", tal como se utilizan en la presente memoria para describir la unión de una parte de unión o dominio de no unión a un sustrato, se refieren a un nivel de unión que abarca la unión no específica o de fondo, pero que no incluye la unión específica.

El término "sujeto" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier especie de invertebrado o vertebrado. Los procedimientos de la presente invención son particularmente útiles en el tratamiento y diagnóstico de vertebrados de sangre caliente. De esta manera, la invención tiene que ver con mamíferos y aves. Más concretamente, se contempla el tratamiento y/o diagnóstico de mamíferos tales como los seres humanos, así como de aquellos mamíferos de importancia para el ser humano debido a que se encuentran en peligro (como por ejemplo los tigres siberianos), de importancia económica (animales criados en granjas para el consumo humano) y/o de importancia social (animales de compañía o en zoológicos), por ejemplo, otros carnívoros diferentes del ser humano (como por ejemplo gatos y perros), ganado porcino (cerdos, puercos, y jabalíes), rumiantes (como por ejemplo reses, bueyes, ovejas, jirafas, ciervos, cabras, bisontes, y camellos), y caballos. También se contempla el tratamiento de aves, incluyendo el tratamiento de aquellos tipos de aves que están en peligro, que viven en zoológicos, así como aves, y más concretamente aves de corral domesticadas, por ejemplo aves de corral, como por ejemplo pavos, gallinas, patos, gansos, gallinas de Guinea, y similares, ya que también tienen importancia económica para el ser humano. De esta manera, se contempla el tratamiento del ganado, incluyendo, pero sin limitarse a, ganado porcino domesticado (cerdos y puercos), rumiantes, caballos, aves de corral, y similares.

El término "aproximadamente", tal como se utiliza en la presente memoria cuando se refiere a un valor medible como por ejemplo un número de aminoácidos, etc. abarca, en una forma de realización, variaciones del \pm20% ó \pm10%, en otra forma de realización del \pm5%, en otra forma de realización del \pm1%, y en otra forma de realización más del \pm0,1% de la cantidad especificada, ya que tales variaciones son apropiadas para llevar a cabo los procedimiento descritos.

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II. Biomateriales Interfaciales

La presente invención proporciona un biomaterial interfacial que comprende de una pluralidad de agentes de unión, tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas. Cada agente de unión se une específicamente a un sustrato no biológico y a un sustrato biológico, para de esa manera crear una interfaz entre el sustrato no biológico y el sustrato biológico. También se describen agentes de unión y procedimientos para fabricarlos, según describe adicionalmente a continuación en la presente memoria.

El término "biomaterial interfacial" se utiliza en la presente memoria para referirse en líneas generales a una composición que comprende de una pluralidad de agentes de unión, donde la pluralidad de agentes de unión crea una interfaz funcional entre dos o más sustratos. Cada uno de los agentes de unión comprende de dos o más especificidades de unión deseadas, o de una combinación deseada de especificidades de unión, que incluyen: (a) la unión específica de por lo menos un sustrato no biológico; (b) y la unión específica de por lo menos un sustrato diana
biológico.

Varios estudios previos han descrito partea de unión con dos o más especificidades de unión. Por ejemplo, la Patente estadounidense nº 5.948.635 de Kay et al., describe reactivos con afinidad totalmente sintéticos (TSARs) que comprenden de péptidos de fusión bivalentes. Tal como se define en la presente memoria, un péptido bivalente comprende de dos regiones funcionales; un dominio de unión y un dominio efector útil para potenciar la expresión y/o la detección del TSAR expresado. A diferencia de los péptidos bivalentes descritos en la Patente estadounidense nº 5.948.635 de Kay et al., un biomaterial interfacial de la presente invención comprende de dos o más dominios de unión y no requiere un elemento para potenciar la expresión y/o la detección del biomaterial interfacial. Además, la Patente estadounidense nº 5.948.635 de Kay et al. no describe la creación de un biomaterial interfacial que comprende de una pluralidad de agentes de unión, donde la pluralidad de agentes de unión crea una interfaz funcional entre dos o más sustratos.

El término "interfaz funcional" se refiere a una interfaz, donde la funcionalidad de la interfaz requiere una pluralidad de agentes de unión. Más concretamente, una interfaz funcional no se crea mediante una reacción de unión entre un único agente de unión y un sustrato. Por ejemplo, una interacción de unión entre un soporte sólido, como por ejemplo una columna de purificación, y una molécula de interés no comprende de una interfaz funcional en el sentido de que la funcionalidad de la interacción (purificación) puede comprender de un único reactivo y de una única molécula de interés.

Interfaces funcionales representativas incluyen recubrimientos, donde la pluralidad de agentes de unión comprenden de una interfaz de unión, una interfaz de no unión, o una combinación de las mismas. El término "interfaz de unión" se refiere a una interfaz creada utilizando agentes de unión que comprenden de una primera parte de unión que se une específicamente a un primer sustrato (por ejemplo, un sustrato no biológico) y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un segundo sustrato (por ejemplo, un sustrato biológico). De esta manera, una interfaz de unión actúa de mediador en la interacción entre dos o más sustratos proporcionando una afinidad para cada uno de los dos o más sustratos. En un caso, los dos o más sustratos son todos iguales. En otro caso, los dos o más sustratos no son todos iguales.

El término "interfaz de no unión" se refiere a una interfaz creada utilizando agentes de unión que comprenden de una primera parte de unión que se une específicamente a un primer sustrato (por ejemplo, un sustrato no biológico) y de una segunda parte de unión que básicamente no se une a un segundo sustrato (por ejemplo, un sustrato diana biológico). Adicionalmente, se puede crear una interfaz de no unión utilizando agentes de unión que consten de una primera parte de unión que básicamente no se una a un sustrato diana no biológico y de un segundo agente de unión que se una específicamente a un sustrato biológico. Una interfaz de no unión asegura así una falta de interacción entre dos o más sustratos.

Una interfaz funcional puede también comprender de una matriz biológica, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión se adhiere a un sustrato en una posición prescrita, y la suma de cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de un patrón. En una forma de realización de un biomaterial interfacial estructurado según la presente invención, se aplican los agentes de unión de la presente invención a una interfaz no biológica de una manera restringida espacialmente, como se describe adicionalmente a continuación en la presente memoria.

Un biomaterial interfacial de la presente invención puede comprender de un biomaterial interfacial homogéneo, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión es idéntico. De manera alternativa, un biomaterial interfacial puede ser heterogéneo construyendo el biomaterial interfacial utilizando una pluralidad de agentes de unión no idénticos. En un forma de realización, cada uno de la pluralidad de agentes de unión no idénticos comprenden de: (a) una parte de unión idéntico que se une específicamente a un primer sustrato (preferentemente un sustrato no biológico), y (b) un dominio variable. Se puede seleccionar el dominio variable de entre cualquiera de una variedad de partes de unión para sustratos (en una forma de realización, un sustrato biológico), de manera que una pluralidad de sustratos (en una forma de realización, un sustrato biológico) puedan estar unidos o no unidos.

Por ejemplo, un biomaterial interfacial heterogéneo puede comprende de una pluralidad de agentes de unión no idénticos, donde cada uno de la pluralidad de agentes que no unen comprenden de: (a) una primera parte de unión que se une específicamente al poliestireno; y (b) una segunda parte de unión que se une específicamente a una de una variedad de tipos de células. La pluralidad de agentes de unión se pueden adherir a un sustrato de poliestireno. Se puede proporcionar al sustrato de poliestireno una muestra que comprende de una población de células mezcladas, donde cada uno de los diferentes tipos de células de la población de células mezcladas se une específicamente a uno de la pluralidad de partes de unión secundarias. Tras dejar pasar un tiempo suficiente para que la población de células mezcladas se una a la pluralidad de agentes de unión, se forma un biomaterial interfacial entre el sustrato de poliestireno y las poblaciones de células mixtas.

En una forma de realización de la invención, la preparación de un biomaterial interfacial heterogéneo puede comprender de: (a) adherir en posiciones al azar en un sustrato no biológico cada uno de la pluralidad de agentes de unión no biológicos; ó (b) adherir en posiciones conocidas en un sustrato no biológico cada uno de una pluralidad de agentes de unión no idénticos. De esta manera, un biomaterial interfacial heterogéneo puede comprender de un biomaterial interfacial heterogéneo al azar o heterogéneo estructurado.

Se puede preparar un biomaterial interfacial estructurado en una forma de realización enviando cada uno de una pluralidad de agentes de unión a una posición discreta en un sustrato no biológico utilizando cualquier técnica adecuada para dispensar un agente de unión, que incluye pero no se limita al rociado, pintado, inyección de tinta, escritura por "dip-pen" (Ejemplo 15), impresión de microcontacto (Patentes estadounidenses nº. 6.180.239 y nº. 6.048.623), estampación (Patentes estadounidenses nº. 5.512.131 y nº. 5.776.748), o litografía (Bhatia et al., 1993, Publicación Internacional PCT nº WO 00/56375).

La presente invención proporciona adicionalmente procedimientos para preparar un biomaterial interfacial según se define en las reivindicaciones adjuntas. En una forma de realización de la invención, un procedimiento para preparar un biomaterial interfacial de unión comprende de:

\quad: (a) aplicar a un sustrato no biológico una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera segundos que se une específicamente al sustrato no biológico y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana biológico, y donde la aplicación está libre de acoplamiento; (b) poner en contacto el sustrato no biológico, donde la pluralidad de agentes de unión están unidos al sustrato no biológico, con una muestra que comprende de el sustrato diana biológico; y (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que el sustrato diana biológico se una a la pluralidad de agentes de unión, con lo que se prepara un biomaterial interfacial.

De manera alternativa, la unión de la pluralidad de agentes de unión a un sustrato no biológico y a un sustrato biológico se puede llevar a cabo simultáneamente o en el orden inverso, dependiendo de la aplicación concreta. De esta manera, un procedimiento para preparar un biomaterial interfacial de unión puede también comprender de: (a) poner en contacto una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de los agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al sustrato no biológico y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana biológico, y donde la aplicación está libre de acoplamiento; (b) aplicar a un sustrato no biológico una pluralidad de agentes de unión; y (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que el sustrato no biológico se una a la pluralidad de agentes de unión con lo que se prepara un biomaterial
interfacial.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para preparar un biomaterial interfacial de no unión que comprende de: (a) aplicar a un sustrato no biológico una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una parte de unión que se une específicamente al sustrato no biológico y de un dominio de no unión básicamente no se une a un sustrato diana biológico, y donde la aplicación está libre de acoplamiento y libre de unión covalente; y (b) poner en contacto el sustrato no biológico, donde la pluralidad de agentes de unión están unidos al sustrato no biológico, con una muestra que comprende de el sustrato diana biológico, con lo que se prepara un biomaterial interfacial.

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II.A. Sustratos No Biológicos

El término "sustrato no biológico" se utiliza en la presente memoria para describir un sustrato que no es una cualidad o un componente de un sistema vivo. Sustratos no biológicos representativos incluyen pero no se limitan a plásticos comunes (por ejemplo, poliestireno, poliuretano, policarbonato), silicona, polímeros sintéticos, metales (que incluyen aleaciones metálicas mezcladas), óxidos metálicos (por ejemplo, vidrio), óxidos no metálicos, cerámica, fármacos, portadores de fármacos, y combinaciones de los mismos.

Un sustrato no biológico puede comprender de cualquier forma adecuada para el uso que se pretende incluyendo pero sin limitarse a una superficie plana (por ejemplo, una placa de cultivo), una superficie no plana (por ejemplo, un pocillo, un implante, o un tubo), o un sustrato en solución. En una forma de realización, un sustrato no biológico tiene una dimensión mínima de por lo menos aproximadamente 20 nm. Por ejemplo, un sustrato no biológico puede tener una dimensión mínima de aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 200 nm, aproximadamente 500 nm, aproximadamente 1 \mum, aproximadamente 50 \mum, aproximadamente 100 \mum, aproximadamente 200 \mum, aproximadamente 500 \mum o aproximadamente 1 mm.

Polímeros sintéticos representativos incluyen pero no se limitan a politetrafluoroetileno, politetrafluoroetileno expandido, GORE-TEX® (Gore & Associates, Inc. de Newark, Delaware), propileno etileno fluorinado, hexafluoropropileno, polimetilmetacrilato (PMMA), pelletano (un poliuretano comercial, PELL), metacrilato de 2-hidroxietilo (PHEMA), tereftalato de polietileno (PEPT), polietileno, polipropileno, nailon, poliuretano, goma de silicona, poliestireno, polisulfona, poliéster, polihidroxiácidos, policarbonato, polimida, poliamida, ácidos de poliamino, y combinaciones de los mismos. En una forma de realización, un polímero sintético comprende de un polímero expandido o poroso. En otra forma de realización, un polímero sintético comprende de una sutura de nailon.

Metales representativos que se pueden utilizar según los procedimientos de la presente invención incluyen pero no se limitan a titanio, acero inoxidable, oro, plata, rodio, zinc, platino, rubidio, y cobre. Materiales cerámicos adecuados incluyen pero no se limitan a óxidos de silicona, óxidos de aluminio, alúmina, sílice, hidroxiapapititas, vidrios, cuarzo, óxidos de calcio, fosfatos de calcio, óxido de indio-estaño (ITO), polisilanoles, óxido de fósforo, y combinaciones de los mismos.

Otros sustratos no biológicos incluyen materiales basados en el carbono como el grafito, nanotubos de carbono, "buckyballs" de carbono, y composites carbono-metálicos.

La preparación de un biomaterial interfacial para la administración de fármacos puede utilizar un sustrato no biológico que comprende de un fármaco o un portador de fármaco. El término "fármaco" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier sustancia con actividad biológica o detectable. De esta manera, el término "fármaco" incluye un agente farmacéutico, un marcador detectable, o una combinación de los mismos. El término "fármaco" también incluye cualquier sustancia que se desea enviar a una célula diana.

El término "portador de fármaco", tal como se utiliza en la presente memoria para describir un sustrato no biológico, se refiere a una composición que facilita la preparación y/o administración del fármaco. Se puede utilizar cualquier vehículo o portador adecuado para administrar el fármaco, incluyendo pero sin limitarse a un vector de terapia génica (por ejemplo, un vector viral o un plásmido), una microcápsula (por ejemplo, una microesfera o una nanoesfera, Manome et al., 1994; Saltzman & Fung, 1997), una emulsión grasa (Patente estadounidense nº 5.651.991), una nanosuspensión (Patente estadounidense nº 5.858.410), una micela polimérica o conjugado polimérico (Goldman et al.,1997; Patentes estadounidenses nº 4.551.482, nº 5.714.166, nº 5.510.103, nº 5.490.840, y nº 5.855.900), un liposoma (Patente estadounidense nº 6.214.375; nº 6.200.598; nº 6.197.333); y un polisoma (Patente estadounidense nº 5.922.545).

El término "marcador detectable" se refiere a cualquier sustrato que se puede detectar, incluyendo, pero sin limitarse a un agente que pude ser detectado utilizando procedimientos no invasivos como por ejemplo procedimientos de escintigrafía, resonancia magnética, ultrasonido, espectroscopia, enzimáticos, electroquímicos, y/o de fluorescencia. A continuación se describen en la presente memoria sustratos representativos útiles para la toma de imágenes no invasiva.

Se selecciona un sustrato no biológico para una aplicación deseada en base a un número de factores que incluyen pero no se limitan a la biocompatibilidad, degradabilidad, relación entre superficie y volumen, e integridad mecánica. Para aplicaciones clínicas, un sustrato no biológico puede comprender de un sustrato no biológico biocompatible como por ejemplo titanio, polímeros sintéticos (por ejemplo, silicona), y cualquier otro sustrato no biológico biocompatible. Un sustrato no biológico también se puede hacer biocompatible aplicando una pluralidad de agentes de unión como los descritos en la presente memoria. La selección de un sustrato no biológico adecuado está dentro del dominio del experto en la materia.

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II.B. Sustratos Biológicos

El término "sustrato biológico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una cualidad o componente que pertenece a los sistemas vivos. Como tal, un "sustrato biológico" puede comprender de un órgano, un tejido, una célula, o componentes de los mismos. Por lo tanto, un sustrato biológico puede comprender de una macromolécula incluyendo, pero sin limitarse a una proteína (por ejemplo, un anticuerpo, colágeno, un receptor), un péptido, un ácido nucleico (por ejemplo, un aptámero), un oligómero, una molécula pequeña (por ejemplo, un compuesto químico), una fusión ácido nucleico-proteína, y/o cualquier otro agente con afinidad biológica. El término "sustrato biológico" también abarca sustratos aislados a partir de un sistema vivo y sustratos producidos sintéticamente o por
recombinación.

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III. Agentes de unión

El término "agente de unión" se refiere a una composición que actúa de mediador en una interacción de unión o de no unión entre dos sustratos. En la invención un agente de unión actúa de mediador en una interacción entre un sustrato no biológico y un sustrato biológico. De esta manera, en la presente invención, un agente ligante comprende de: (a) una parte de unión que se une específicamente a un sustrato no biológico; y (b) una parte de unión que se une específicamente a un sustrato biológico. También se describe en la presente memoria, un agente de unión que comprende de:

\quad: (a) Una parte de unión que se une específicamente a un sustrato no biológico; y (b) un dominio de no unión que básicamente no se une a un sustrato diana biológico.

Una parte de unión que se une específicamente a un sustrato no biológico muestra unión específica sin unión covalente o acoplamiento, mediante una fracción de fijación. Por ejemplo, la unión entre la parte de unión y el sustrato no biológico está libre de cualquier forma de unión descrita a continuación en la presente memoria ya que se refiere a, por ejemplo, unir un primer y una segunda parte de unión de un agente de unión.

Una parte de unión que se une específicamente a un sustrato biológico puede tener bioactividad adicional como resultado de la unión específica. Por ejemplo, una parte de unión puede mostrar adicionalmente actividad kinasa, actividad fosfatasa, actividad de reparación del ADN, actividad oncogénica, actividad supresora de tumores, actividad de estimulación de la angiogénesis, actividad inhibidora de la angiogénesis, actividad mitogénica, actividad de señalización, actividad transportadora, actividad enzimática, actividad anti-ensuciamiento, actividad antibacteriana, actividad antiviral, actividad antigénica, actividad inmunogénica, actividad inductora de apoptosis, actividad inductora anti-aptótica, actividad citotóxica, actividad lubricante, y combinaciones de las mismas.

Se puede construir un agente de unión uniendo un primer y una segunda parte de unión, o una parte de unión y un dominio de no unión, para formar una única molécula o complejo. La unión puede comprender de fusionar dos o más partea de unión péptidos durante la síntesis, como se describe en los Ejemplos 12 y 13. Opcionalmente, también se puede incorporar una región conectora del péptido entre los dos dominios durante la síntesis. De manera alternativa, se pueden combinar un primer y una segunda parte de unión mediante un conector mediante unión covalente o acoplamiento químico, como se describe adicionalmente a continuación en la presente memoria.

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III.A. Péptidos

En la invención, una parte de unión comprende de un péptido de unión que se une específicamente a un sustrato no biológico y/o a un sustrato biológico. También se describe en la presente memoria un dominio de no unión que comprende de un péptido que básicamente no se une a un sustrato diana biológico.

El término "péptido" se refiere en líneas generales a una cadena de aminoácidos que incluye aminoácidos naturales, aminoácidos sintéticos, aminoácidos codificados genéticamente, aminoácidos codificados no genéticamente, y combinaciones de los mismos. Los péptidos pueden incluir tanto L-aminoácidos como D-aminoácidos. Un péptido de la presente invención puede ser sometido a diversos cambios, sustituciones, inserciones, y deleciones donde tales cambios proporcionan ciertas ventajas en su uso. De esta manera, el término "péptido" abarca cualquiera de una variedad de formas de derivados de péptidos que incluyen las amidas, conjugados con proteínas, péptidos ciclados, péptidos polimerizados, variantes sustituidas conservativamente, análogos, fragmentos, péptidos modificados químicamente, y miméticos de péptidos.

En una forma de realización de la invención, el péptido comprende de una secuencia de aminoácidos que comprende de por lo menos aproximadamente 3 residuos, en otra forma de realización desde aproximadamente de 3 hasta aproximadamente 50 residuos, y en otra forma de realización más desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 25 residuos. Se puede utilizar cualquier péptido de unión que muestre características de unión específica en la práctica de la presente invención. En una forma de realización, se utilizan fragmentos de péptidos que contienen menos de aproximadamente 25 residuos de aminoácidos. En otra forma de realización, se utilizan fragmentos de péptidos de menos de aproximadamente 20 aminoácidos.

Aminoácidos representativos codificados no genéticamente incluyen pero no se limitan al ácido 2 aminoadíptico; ácido 3 aminoadíptico; ácido \beta aminopropiónico; ácido 2 aminobutírico; ácido 4 aminobutírico (ácido piperidínico); ácido 6 aminocaproico; ácido 2 aminoheptanoico; ácido 2 aminoisobutírico; ácido 3 aminoisobutírico; ácido 2 aminopimélico; ácido 2,4 diaminobutírico; desmosina; ácido 2,2' diaminopimélico; ácido 2,3 diaminopropiónico; N etilglicina; N etilasparagina; hidroxilisina; alo hidroxilisina; 3 hidroxiprolina; 4 hidroxiprolina; isodesmosina; alo isoleucina; N metilglicina (sacarosina); N metilisoleucina; N melilvalina; norvalina; norleucina; y ornitina.

Aminoácidos derivatizados representativos incluyen por ejemplo, aquellas moléculas en las que los grupos amino libres han sido derivatizados para formar hidrocloridos amino, grupos p tolueno sulfonil, grupos carbobenzoxi, grupos t butiloxicarbonil, grupos cloro acetil o grupos formil. Se pueden derivatizar los grupos carboxilo libres para formar sales, ésteres metil y etil u otros tipos de ésteres o hidrácidos. Se pueden derivatizar los grupos hidroxilo libres para formar derivados O acil u O alkil. Se puede derivatizar el nitrógeno imidazol de la histidina para formar N im benzilhistidina.

El término "variante sustituida consevativamente" se refiere a un péptido con una secuencia de residuos de aminoácidos básicamente idéntica a una secuencia de un péptido de referencia en el que uno o más residuos han sido sustituidos conservativamente con un residuo funcionalmente similar. En una forma de realización, una variante sustituida conservativamente presenta una especificidad de unión específica similar cuando se compara con el péptido de referencia. La frase "variante sustituida conservativamente" también incluye péptidos en los que se sustituye un residuo por un residuo derivatizado químicamente, siempre que el péptido resultante tenga una especificidad de unión tal como se describe en la presente memoria.

Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrofóbico) como por ejemplo la isoleucina, valina, leucina o metionina por otro; la sustitución de un residuo polar (hidrofílico) por otro tal como por ejemplo entre la arginina y la lisina, entre la glutamina y la asparagina, entre la glicina y la serina; la sustitución de un residuo básico como por ejemplo la lisina, arginina o histidina por otro; o la sustitución de un residuo acídico, como por ejemplo el ácido aspártico o el ácido glutámico por otro.

Los péptidos de la presente invención también incluyen péptidos con una o más adiciones y/o deleciones o residuos correspondientes a la secuencia de un péptido cuya secuencia se describe en la presente memoria, mientras se mantenga el requisito de especificidad de unión del péptido. El término "fragmento" se refiere a un péptido con una secuencia de residuos de aminoácidos más corta que la de un péptido descrito en la presente memoria.

Se puede modificar un péptido mediante acilación del extremo NH_{2} terminal (por ejemplo, acetilación, o amidación del ácido tioglicólico) o mediante amidación del extremo carboxilo (por ejemplo con amoniaco o metilamina). Las modificaciones de los extremos terminales son útiles para reducir la susceptibilidad por digestión de proteinasa, y para por consiguiente alargar la vida media de los péptidos en soluciones, concretamente en los fluidos biológicos donde pueden estar presentes las proteasas.

La ciclación de péptidos es también una modificación útil debido a las estructuras estables que se forman por ciclación y en vista de las actividades biológicas observadas para dichos péptidos cíclicos. Procedimientos representativos para la ciclación de péptidos son descritos por Schnider & Eberle (1993) Peptides, 1992: Proceedings of the Twenty-Second European Peptide Symposium, 13-19 de Septiembre, 1992. Interlaken, Suiza, Escom., Leiden, Países Bajos. Por lo general, el metil ester del péptido protegido con tertbutoxicarbonil se disuelve en metanol, se añade solución de hidróxido de sodio, y se hace reaccionar la mezcla a 20ºC para eliminar por hidrólisis el grupo metil ester protector. Tras la evaporación del disolvente, se extrae el péptido protegido con tertbutoxicarbonil con etil acetato del disolvente acuoso acidificado. A continuación se retira el grupo tertbutoxicarbonil protector en condiciones ligeramente ácidas en el co disolvente dioxano. El péptido lineal desprotegido con los extremos terminales amino y carboxilo libres obtenido de esta manera se convierte en su péptido cíclico correspondiente haciendo reaccionar una solución diluida del péptido lineal, en una mezcla de diclorometano y dimetilformamida, con diciclohexilcarbodiimida en presencia de 1 hidroxibenzotriazol y N metilmorfolina. A continuación se purifica el péptido cíclico resultante mediante
cromatografía.

Opcionalmente, una parte de unión de la presente invención puede comprender de uno o más aminoácidos que han sido modificados para contener uno o más halógenos, como por ejemplo flúor, bromo, o yodo, para facilitar la unión a una molécula conectora como se describe adicionalmente a continuación en la presente memoria.

El término "peptoide" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un péptido en el que uno o más de los enlaces peptídicos se sustituyen por enlaces pseudopeptídicos que incluyen pero no se limitan a un enlace carba (CH_{2}-CH_{2}), un enlace depsi (CO-O), un enlace hidroxietileno (CHOH-CH_{2}), un enlace quetometileno (CO-CH_{2}), un enlace oxi metileno (CH_{2}-O), un enlace reducido (CH_{2}-NH), un enlace tiometileno (CH_{2}-S), un enlace N modificado (-NRCO-), y un enlace tiopéptido (CS-NH). Véase por ejemplo, Barbay-Jaureguiberry et al., 1992; Tung et al., 1992; Urge et al., 1992; Corringer et al., 1993; Pavone et al., 1993.

Se presentan péptidos representativos que se unen específicamente a un sustrato no biológico como los números de identidades en la SEQ: 1 a 71. Véanse los Ejemplos 2 a 8.

Partes de unión péptidos que se unen específicamente a un sustrato biológico incluyen péptidos con especificidades de unión conocidas, que incluyen pero no se limitan a: (a) péptidos que se unen a células listados en la Tabla 1 (números de identidad en la SEQ: 74 a 98); (b) otros péptidos que como se sabe se unen específicamente a un sustrato diana; ó (c) péptidos descubiertos mediante la tecnología de despliegue como se describe a continuación en la presente memoria.

TABLA 1

3

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Los péptidos de la presente invención, incluyendo los peptoides, se pueden sintetizar mediante cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en la materia de la síntesis de péptidos. Las técnicas de química sintética, como por ejemplo una síntesis tipo Merrifield en fase sólida, se emplean por razones de pureza, especificidad antigénica, estar libres de subproductos no deseados, facilidad de producción, y similares. Se puede encontrar un resumen de las técnicas representativas en Stewart & Young (1969) Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco, California, Estados Unidos de América; Merrifield (1969) Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 32:221-296; Fields & Noble (1990) Int J Pept Protein Res 35:161-241; y Bodanszky (1993) Principles of Peptide synthesis, 2ª Rev. Ed. Springer-Verlag, Berlin, Nueva York, entre otros lugares. Se pueden encontrar técnicas representativas de síntesis en fase sólida en Andersson et al., (2000) Biopolymers 55:227-250, referencias citadas en la presente memoria, y en las Patentes estadounidenses nº 6.015.561; nº 6.015.881; nº 6.031.071; y nº 4.244.946. La síntesis de péptidos en solución se describe en Schröeder & Lübke (1965) The Peptides, Academic Press, Nueva York, Nueva York, Estados Unidos de América. Se describen grupos protectores apropiados útiles para la síntesis de péptidos en los textos anteriores y en McOmie (1973) Protective Groups in Organic Chemestry, Plenum Press, Londres, Nueva York. En una forma de realización de la invención, se produce un péptido utilizando un sintetizador de péptidos automatizado como se describe en los Ejemplos 11 a 13.

También se pueden sintetizar péptidos mediante ligación química nativa como se describe en la Patente estadounidense nº 6.184.344. En resumen, el paso de ligación utiliza una reacción quimioselectiva de dos segmentos peptídicos desprotegidos para producir un intermediario unido al tioéster transitorio. El intermediario se reorganiza espontáneamente para generar el producto de ligadura de longitud completa.

Los péptidos, incluyendo los péptidos que comprenden de aminoácidos codificados no genéticamente, también se pueden producir en un sistema de traducción libre de células, como por ejemplo el sistema descrito por Shimizu et al., (2001) Nat Biotechnol 19:751-755. Además, los péptidos con una secuencia de aminoácidos especificada se pueden adquirir a partir de fuentes comerciales (por ejemplo, Biopeptide Co., LLC de San Diego, California, Estados Unidos de América, y PeptidoGenics de Livermore, California, Estados Unidos de América).

Los péptidos que tienen uno o más residuos de tirosina en una posición interna o en el extremo carboxilo del péptido se pueden marcar convenientemente, por ejemplo, mediante yodinación o radio yodinación.

El término "mimético de péptido" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una parte de unión que imita la actividad biológica de un péptido de referencia, duplicando básicamente la antigenicidad del péptido de referencia, pero no es un péptido o un peptoide. En una forma de realización, un mimético de péptido tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 700 daltons. Se puede diseñar o seleccionar un mimético de péptido utilizando procedimientos conocidos por el experto en la materia. Véanse por ejemplo, las Patentes estadounidenses nº 5.811.392; nº 5.811.512; nº 5.578.629; nº 5.817.879; nº 5.817.757; y nº 5.811.515.

Se puede utilizar cualquier péptido o mimético de péptido de la presente invención en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Ácidos adecuados que se pueden utilizar con los péptidos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a ácidos inorgánicos como por ejemplo el ácido trifluoroacético (TFA), ácido hidroclórico (HCI), ácido hidrobrómico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico, ácido acético fosfórico, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido cinámico, ácido sulfónico naftaleno, ácido sulfanílico o similares. En una forma de realización, una sal farmacéuticamente aceptable es el HCI. En otra forma de realización, una sal farmacéuticamente aceptable es el TFA.

Bases adecuadas capaces de formar sales con los péptidos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a bases inorgánicas como por ejemplo el hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio y similares; y bases orgánicas como por ejemplo mono, di y tri alquil y aril aminas (por ejemplo, trietilamina, diisopropilamina, metilamina, dimetilamina y similares), y opcionalmente etanolaminas sustituidas (por ejemplo, etanolamina, dietanolamina y similares).

Un péptido de unión de la invención puede adicionalmente comprender de una o más fracciones de reticulación, como por ejemplo una fracción fotorreticulable, una fracción reticulable iónicamente, o una fracción reticulable terminalmente. Se pueden utilizar las fracciones de reticulación para crear un biomaterial interfacial de dos dimensiones o de tres dimensiones.

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III.B. Anticuerpos

En otro caso de la descripción, una parte de unión o dominio de no unión, puede comprender de un anticuerpo monocatenario. El término "anticuerpo monocatenario" se refiere a un anticuerpo que comprende de una cadena variable pesada y de una cadena variable ligera que están unidas, bien directamente o mediante un péptido conector, para formar un polipéptido continuo. De esta manera, el término "anticuerpo monocatenario" abarca una proteína inmunoglobulina o una parte funcional de la misma, incluyendo, pero sin limitarse a un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo híbrido, un anticuerpo mutagenizado, un anticuerpo humanizado, y fragmentos de anticuerpos que comprenden de un sitio de unión al antígeno (por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos Fab y Fv).

Se pueden identificar los anticuerpos de unión mediante los procedimientos de "lavado en batea" descritos a continuación de la presente memoria. De manera alternativa, se pueden utilizar anticuerpos monocatenarios conocidos con una especificidad de unión deseada o una cualidad de no unión deseada. Por ejemplo en la Patente estadounidense nº 5.874.542 de Rockwell et al., describe anticuerpos monocatenarios que se unen específicamente al receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El VEGF se expresa en macrófagos y keratinocitos epidérmicos en proliferación y por lo tanto se pueden utilizar para estimular la cicatrización de heridas (Brown et al., 1992). Se han identificado un número de anticuerpos monocatenarios que se unen específicamente a las células cancerosas (por ejemplo, las Patentes estadounidenses nº 5.977.322 y nº 5.837.243), al virus de la inmunodeficiencia humana (Patente estadounidense nº 5.840.300), y a moléculas de señalización secretadas (por ejemplo, el factor de necrosis tumoral (TNF); Patente estadounidense nº 5.952.087). Estos anticuerpos de unión pueden resultar útiles, por ejemplo en la administración de fármacos y en los procedimientos de detección descritos a continuación en la presente
memoria.

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III.C. Otras partes de unión s y dominios de no unión

Un agente de unión de la presente descripción puede también comprender de una parte de unión que muestra una unión específica diferente de un péptido de unión o un anticuerpo de unión. De manera similar, se puede utilizar para preparar un agente de unión cualquier dominio de no unión adecuado que básicamente no se una a un sustrato diana. De esta manera, una parte de unión o un dominio de no unión de la descripción también puede comprender de una proteína, un polímero sintético, un polímero natural, un polisacárido, un ácido nucleico (por ejemplo, un aptámero), una molécula pequeña (por ejemplo, un compuesto químico), una fusión ácido nucleico-proteína, y/o cualquier otro agente con afinidad o agente de no unión.

Como también se describe en la presente memoria un dominio de no unión puede comprender de un polímero aniónico o en un carbohidrato aniónico. Estas moléculas básicamente no se unen a las células y de esta manera resultan útiles para inhibir la fibrosis, la formación de escaras, y las adhesiones quirúrgicas. Véase la Patente estadounidense nº 5.705.177. Polímeros aniónicos representativos incluyen pero no se limitan a proteoglicanos naturales, fracciones glicosaminoglicano de proteoglicanos, sulfato de dextrano, pentosán polisulfato, sulfato de dextrano, ó derivados de celulosa. Los polímeros aniónicos pueden obtenerse a partir de fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma Chemical Company de St. Louis, Missouri, Estados Unidos de América), purificarse a partir de una fuente natural, o prepararse sintéticamente. Se pueden encontrar procedimientos para la purificación y la síntesis de polímeros en Budavari (1996) The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, 12ª ed. Merck, Whitehouse Station, Nueva Jersey, Estados Unidos de América, entre otros lugares.

Un dominio de no unión descrito en la presente memoria puede también consistir en un polisacárido que básicamente no se una a las plaquetas, puede utilizarse como inhibidor de la calcificación como se describe en la Patente estadounidense nº 4.378.224. Inhibidores de la calcificación adecuados incluyen proteína-polisacáridos naturales (por ejemplo, condroitín sulfatos y hialuronato), polisacáridos sulfatados, bifosfonatos, fosfoproteínas, y otros
polianiones.

Una parte de unión o dominio de no unión como se describe en la presente memoria también puede comprender de una molécula pequeña. El término "molécula pequeña" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un compuesto, por ejemplo un compuesto orgánico, con un peso molecular en una forma de realización de menos de aproximadamente 1.000 daltons, en otra forma de realización de menos de aproximadamente 750 daltons, en otra forma de realización de menos de aproximadamente 600 daltons, y en otra forma de realización más de menos de aproximadamente 500 daltons. En una forma de realización, una molécula pequeña tiene un logaritmo del coeficiente de partición octanol-agua calculado en el rango comprendido entre aproximadamente -4 y aproximadamente +14, y en otra forma de realización, en el rango comprendido entre aproximadamente -2 y aproximadamente
+7,5.

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III.D. Conectores

Los agentes de unión útiles para la preparación de un biomaterial interfacial comprenden adicionalmente de manera opcional de un conector entre un primer y una segunda parte de unión, o entre una parte de unión y una región de no unión. El conector puede facilitar la combinación de dos o más partes de unión. Además, el conector puede comprender de una función espaciadora para minimizar el impedimento estérico potencial entre los dos o más
dominios.

En una forma de realización, el conector no anula o altera la fuerza de unión de la parte de unión, la especificidad de unión de la parte de unión. En una forma de realización, el conector es básicamente biológicamente inerte excepto por sus actividades espaciadora y/o de enlace.

Los conectores adecuados comprenden de una o más cadena o cadenas ramificadas o lineales de 2 átomos de carbono hasta aproximadamente 50 átomos de carbono, donde la cadena es completamente saturada, completamente insaturada, o una combinación de ambas. Por lo general, un conector comprende de entre 2 y aproximadamente cien sitios para la unión de la parte de unión. Los procedimientos utilizados para la unión variarán según la naturaleza química de cada uno de una parte de unión, dominio de no unión, y conector seleccionados.

Grupos reactivos adecuados de un conector incluyen, pero no se limitan a aminas, ácidos carboxílicos, alcoholes, aldehídos, y tioles. Un grupo amina en un conector puede formar un enlace covalente con un grupo ácido carboxílico de una parte de unión, como por ejemplo un extremo carboxilo terminal de un péptido de unión. Un grupo ácido carboxílico o un aldehído en un conector puede formar un enlace covalente con el extremo amino terminal de un péptido de unión u otro grupo amina de unión. Un grupo alcohol en un conector puede formar un enlace covalente con el extremo carboxilo terminal de un péptido de unión u otro grupo ácido carboxílico de unión. Un grupo tiol en un conector puede formar un enlace bisulfuro con una cisteína en un péptido de unión o un grupo tiol de unión.

Grupos reactivos adicionales que pueden utilizarse para reacciones de unión incluyen, pero no se limitan a un fosfato, un sulfato, un hidróxido, -SeH, un éster, un silano, urea, uretano, un tiol uretano, un carbonato, un tioéter, un tioéster, un sulfato, un éter, o una combinación de los mismos.

En una forma de realización de la invención, un conector comprende de un péptido. En una forma de realización, un péptido conector comprende de uno (1) hasta aproximadamente 40 aminoácidos. Los sitios para la unión de la parte de unión a un péptido de unión incluyen grupos funcionales de las cadenas laterales de los aminoácido y los grupos amino y carboxilo terminales. Conectores péptidos representativos con sitios reactivos múltiples incluyen polilisinas, poliornitinas, policisteínas, ácido poliglutámico y ácido poliaspártico. De manera alternativa, péptidos conectores básicamente inertes incluyen poliglicina, poliserina, poliprolina, polialanina, y otros oligopéptidos que incluyen residuos de aminoácidos alanil, serinil, prolinil ó glicinil.

Los péptidos conectores pueden ser de insignia o de cascada. El término "polipéptido de insignia" se refiere a un péptido lineal. Al igual que con los polipéptidos que suelen encontrarse en la naturaleza, los enlaces amida de un polipéptido de insignia están formados entre el extremo amino terminal de un residuo de aminoácido y el ácido carboxílico terminal del siguiente residuo de aminoácido. El término "polipéptido de cascada" se refiere a un polipéptido ramificado, donde por lo menos algunos de los enlaces amida se forman entre el grupo funcional de la cadena lateral de un residuo de aminoácido y el grupo amino terminal o el grupo carboxilo terminal del siguiente residuo de
aminoácido.

En otra forma de realización de la invención, un conector puede comprender de un polímero, incluyendo un polímero sintético o un polímero natural. Polímeros sintéticos representativos incluyen, pero no se limitan a poliéteres (por ejemplo, polietilenglicol; PEG), poliésteres (por ejemplo, ácido poliláctico (PLA) y ácido poliglicólico (PGA)), poliamidas (por ejemplo, nailon), poliaminas (por ejemplo, polimetilmetacrilato; PMMA), ácidos poliacrílicos, poliuretanos, poliestirenos, y otros polímeros sintéticos con un peso molecular de aproximadamente 200 daltons hasta aproximadamente 1.000 kilodaltons. Polímeros naturales representativos incluyen, pero no se limitan al ácido hialurónico, alginato, condroitín sulfato, fibrinógeno, fibronectina, albúmina, colágeno, y otros polímeros naturales con un peso molecular de aproximadamente 200 daltons hasta aproximadamente 20.000 kilodaltons. Los conectores poliméricos pueden comprender de un polímero dibloque, un copolímero multibloque, un polímero en forma de peine, un polímero estrella, un polímero dendrítico, un polímero híbrido linear-dendrítico, o un copolímero
aleatorio.

Un conector también puede comprender de un ácido mercapto(amida)carboxílico, un ácido acrilamidacarboxílico, un ácido acrilamido-amido trietilenoglicol, y derivados de los mismos.

Los procedimientos para unir una molécula conectora a una parte de unión o a un dominio de no unión variarán según los grupos reactivos presentes en cada molécula. Los protocolos para la unión utilizando las moléculas y grupos reactivos mencionados anteriormente son conocidos para el experto en la materia. Véanse Goldman et al., 1997; Cheng 1996; Neri et al., 1997; Nabel 1997; Park et al., 1997; Pasqualini et al., 1997; Bauminger & Wilchek 1980; las Patentes estadounidenses nº 6.280.760 y nº 6.071.890; y las Patentes europeas nº 0 439 095 y nº 0 712 621.

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IV. Identificación de Partes de Unión Utilizando la Tecnología de Despliegue en Fagos

La tecnología de despliegue es un método efectivo para la identificación de partes de unión que se unen específicamente a un sustrato, por ejemplo los procedimientos de despliegue en fagos. Según este método, se presenta una biblioteca de diversas partes de unión a un sustrato diana, y se seleccionan las partes de unión que se unen específicamente al sustrato. A la inversa, también se pueden recuperar las partes de unión que básicamente no se unen a un sustrato diana. Se pueden seleccionar las partes de unión y dominios de no unión tras rondas seriadas múltiples de selección que se denomina "lavado en batea".

Se pueden utilizar cualquiera de una variedad de bibliotecas y procedimientos de "lavado en batea" para identificar un péptido que resulte útil en los procedimientos de la invención, como se describe adicionalmente a continuación en la presente memoria.

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V.A. Bibliotecas

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "biblioteca" significa una colección de moléculas. Una biblioteca puede contener unas pocas o un gran número de moléculas diferentes, que varían desde aproximadamente diez moléculas hasta varios billones de moléculas o más. Una molécula puede comprender de una molécula natural, o en una molécula sintética, que no se encuentra en la naturaleza. De manera opcional, se pueden utilizar simultáneamente una pluralidad de bibliotecas diferentes para un "lavado en batea" in vivo.

Bibliotecas representativas incluyen pero no se limitan a una biblioteca de péptidos (Ejemplo 1 y Patentes estadounidenses nº 6.156.511, nº 6.107.059, nº 5.922.545, y nº 5.223.409), una biblioteca de oligómeros (Patentes estadounidenses nº 5.650.489 y nº 5.858.670), y una biblioteca de aptámeros (Patentes estadounidenses nº 6.180.348 y nº 5.756.291), una biblioteca de moléculas pequeñas (Patentes estadounidenses nº 6.168.912 y nº 5.738.996), una biblioteca de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos (Patentes estadounidenses nº 6.174.708, nº 6.057.098, nº 5.922.254, nº 5.840.479, nº 5.780.225, nº 5.702.892, y nº 5.667.988), una biblioteca de fusiones ácido nucléico-proteína (Patente estadounidense nº 6.214.553), y una biblioteca de cualquier otro agente con afinidad que pueda potencialmente unirse a un sustrato diana (por ejemplo, las Patentes estadounidenses nº 5.948.635, nº 5.747.334, y
nº 5.498.538).

Las moléculas de una biblioteca se pueden producir in vitro, o se pueden sintetizar in vivo, por ejemplo mediante la expresión de una molécula in vivo. También, las moléculas de una biblioteca se pueden desplegar en cualquier soporte pertinente, por ejemplo, en los pili bacterianos (Lu et al., 1995) o en un fago (Smith, 1985).

Una biblioteca puede comprender de una colección aleatoria de moléculas. De manera alternativa, una biblioteca puede comprender de una colección de moléculas con una tendencia a una secuencia, estructura o conformación concretas. Véanse por ejemplo, las Patentes estadounidenses nº 5.264.563 y nº 5.824.483. Son conocidos en la técnica procedimientos para preparar bibliotecas que contengan poblaciones variadas de diversos tipos de moléculas, como se describen por ejemplo en las Patentes estadounidenses citadas anteriormente en la presente memoria. También hay numerosas bibliotecas comercialmente disponibles.

Una biblioteca para utilizar en los procedimientos de "lavado en batea" descritos puede tener una complejidad de por lo menos aproximadamente 1 x 10^{8} hasta aproximadamente 1 x 10^{9} moléculas diferentes por biblioteca. Por lo tanto, un experimento de "lavado en batea" típico con una entrada de 1 x 10^{11} fagos muestrea de media de 100 a 1.000 copias de cada molécula de la biblioteca.

El procedimiento de "lavado en batea" puede llevarse a cabo utilizando una biblioteca de fagos. Los fagos de utilizan como estructura de soporte para desplegar bibliotecas recombinantes y también para proporcionar la recuperación y la amplificación de las partes de unión con una especificidad de unión deseada.

El fago T7 tiene una cápside icosaédrica hecha de 415 proteínas codificadas por el gen 10 durante su fase lítica. El sistema de despliegue del fago T7 tiene la capacidad de desplegar péptidos de hasta 15 aminoácidos de tamaño a un alto número de copias (415 por fago). A diferencia de los sistemas de despliege en fagos filamentosos, los péptidos desplegados en la superficie del fago T7 no son capaces de secretar péptidos. Los fagos T7 también se replican más rápidamente y son extremadamente robustos en comparación con los demás fagos.

Una biblioteca de fagos para ser utilizada con procedimientos de "lavado en batea" también se puede construir en un fago filamentoso, por ejemplo el fago M13 o fagos derivados del M13. Las partes de unión se pueden desplegar en la superficie exterior del fago, por ejemplo mediante la fusión a la proteína vital 8 del M13. Se pueden encontrar procedimientos para preparar bibliotecas M13 en Sambrook & Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, Estados Unidos de América, entre otros lugares. En el Ejemplo 1 se describen bibliotecas de péptidos representativas preparadas en el fago M13 y que son útiles con relación a la presente invención.

Otros fagos vectores adecuados incluyen los vectores mAEK y mACK, que son derivados de un esqueleto
M13mp18. Estos vectores versátiles son compatibles con una amplia variedad de formatos de selección, que incluyen los "lavado en batea" basados en células, en fase de solución, y en fase sólida. El vector mAEK proporciona un péptido epítopo independiente que resulta útil en la cuantificación del péptido para la unión y los ensayos funcionales además del "lavado en batea". El vector mAEK también incluye un sitio de clivaje de la trombina para una elución altamente selectiva y eficiente del fago unido específicamente. El clivaje de la trombina también permite los ensayos "fuera del fago", en los que el módulo del péptido se corta del fago antes de llevar a cabo el ensayo. Este procedimiento de "lavado en batea" se puede utilizar para experimentos que producen una unión de fondo inaceptablemente alta cuando está presente la partícula completa del fago.

Los fagos vectores incluyen por lo general un único alelo del gen pIII del recubrimiento del fago, y por consiguiente se producen de tres a cinco copias de proteínas de fusión la parte de unión-PIII idénticas en la superficie de cada fago recombinante. Esta valencia múltiple resulta en un aumento de la avidez de las partes de unión seleccionados por los sustratos diana. De esta manera, los fagos vectores se pueden utilizar para selecciones primarios donde el objetivo es por lo general identificar uno o varios motivos de unión específicos de diana para una caracterización posterior y donde las partes de unión de alta afinidad no son esenciales.

Una biblioteca utilizada para el "lavado en batea" puede comprender de un vector fagémido. Un fagémido es un plásmido que incluye un origen de replicación del fago f1, que también actúa como una señal de empaquetamiento, y una única copia del gen que codifica la PIII que contiene los casetes de expresión descritos anteriormente. Los vectores fagémidos útiles incluyen los plásmidos pAEK y pACK, que se derivan del vector pGEM-3z-f(+)(Promega Corporation, Madison, Wisconsin, Estados Unidos de América).

Las bibliotecas de fagémidos se mantienen como plásmidos, y se rescatan mediante superinfección con un fago helper deficiente para el empaquetamiento. Los virus progenie empaquetan preferentemente el ADN del fagémido, que no tiene más genes fágicos que el gen de fusión pIII. El virus helper proporciona copias de pIII tipo salvaje, mientras que el fagémido expresa una menor cantidad de proteína de fusión de la parte de unión -PIII recombinante. De esta manera, la mayoría de los virus recombinantes que expresan las proteínas de fusión de la parte de unión -PIII sólo expresan una única copia. Estas bibliotecas monovalentes tienden a resultar en partes de unión de mayor afinidad porque la unión de baja afinidad no pude ser compensada por un aumento de la avidez. De esta manera, los vectores fagémidos se pueden utilizar para selecciones secundarias para optimizar los motivos de unión y para producir partes de unión de alta afinidad.

Los sistemas de expresión de plásmidos se pueden utilizar para generar cantidades suficientes de partes de unión y de dominios de no unión para su posterior caracterización en ensayos de unión estándares. De manera alternativa, las parte de unión y dominios de no unión seleccionados mediante "lavado en batea" se pueden sintetizar en cantidades apropiadas.

Como precursor de la síntesis química, suele ser útil determinar las actividades de las parte de unión péptidos expresados como proteínas de fusión en casetes de expresión estándares como por ejemplo la glutatión S Transferasa (GST), la proteína verde fluorescente (GFP), y la fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) (Yamabhai & Kay, 2001). Estos módulos de expresión facilitan la expresión, estabilización y purificación de las parte de unión péptidos y también pueden servir como indicadores de la unión del péptido.

Bibliotecas de péptidos. Se puede utilizar una biblioteca de péptidos para llevar a cabo los procedimientos de "lavado en batea" descritos. Una biblioteca de péptidos comprende de un caso en péptidos que comprenden de tres o más aminoácidos. En otro caso de por lo menos cinco, seis, siete u ocho aminoácidos. En otro caso de hasta 50 aminoácidos, en otro caso de hasta 100 aminoácidos, en otro caso de hasta 200 aminoácidos y en otro caso más de hasta aproximadamente 300 aminoácidos. En un caso una biblioteca de péptidos comprende de péptidos con un peso molecular de aproximadamente 500 daltons hasta aproximadamente 3.500 daltons.

Los péptidos pueden ser lineales, ramificados, o cíclicos, y pueden incluir fracciones no peptídicas. Los péptidos pueden comprender de aminoácidos naturales, aminoácidos sintéticos, aminoácidos codificados genéticamente, aminoácidos codificados no genéticamente, y combinaciones de los mismos.

También se puede utilizar una biblioteca de péptidos sesgada, una biblioteca sesgada que comprende de péptidos donde uno o más residuos (pero no todos) de los péptidos son constantes. Por ejemplo, un residuo interno puede ser constante, de manera que la secuencia del péptido se representa como:

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donde Xaa_{1} y Xaa_{2} son cualquier aminoácido, o cualquier aminoácido excepto cisteína, donde Xaa_{1} y Xaa_{2} son el mismo o diferentes aminoácidos, m y n indican un número de residuos Xaa, donde en un caso m y n se eligen de manera independiente del intervalo comprendido entre los 2 residuos y los 20 residuos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y/o 20 residuos), en otro caso m y n se eligen del intervalo comprendido entre los 4 residuos y los 9 residuos (por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8, y/o 9), y AA es el mismo aminoácido para todos los péptidos de la biblioteca. En un caso AA se sitúa en o cerca del centro del péptido. En otro caso m y n no son diferentes en más de 2 residuos; en otro caso m y n son iguales.

En un caso las bibliotecas son aquellas en las que AA es triptófano, prolina, o tirosina. En otro caso las bibliotecas son aquellas en las que AA es fenilalanina, histidina, arginina, aspartato, leucina, ó isoleucina. En otro caso las bibliotecas son aquellas en las que AA es asparagina, serina, alanina, o metionina. En otro caso más las bibliotecas son aquellas en las que AA es cisteína o glicina.

Se puede preparar una biblioteca representativa utilizando codones degenerados codificados como NNK, donde N = A, C, G ó T y K = G ó T. La restricción de la posición de tambaleo del codón reduce, pero no elimina, el sesgo de codones intrínseco al código genético (por ejemplo, 6 codones para la serina, 6 para la arginina y 6 para la leucina, pero sólo uno para la metionina y uno para el triptófano) y también elimina dos de los tres codones de terminación. Adicionalmente los formatos de bibliotecas incluyen, pero no se limitan a los presentados en la Tabla 2. En un caso, se utiliza una biblioteca X_{6}PX_{5}. En otro caso, se utiliza una biblioteca SCX_{16}S. En otro caso más se utiliza una biblioteca X_{6}YX_{6}. También se describen métodos representativos para la síntesis de bibliotecas en los Ejemplos (véase por ejemplo, el Ejemplo 1).

TABLA 2

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Bibliotecas de Anticuerpos

Los procedimientos de "lavado en batea" pueden utilizar una biblioteca de anticuerpos. Los vectores para la construcción de bibliotecas de anticuerpos incluyen los vectores pCANTAB-5E ó pCANTAB-6 (Amersham Biosciences, Piscataway, Nueva Jersey, Estados Unidos de América). Estos vectores contienen una estructura de soporte fragmento Fv monocatenario (scFV) de región constante, y se clonan secuencias variables dentro de las secuencias del vector que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo. Los anticuerpos con parte de unión se pueden desplegar utilizando, por ejemplo, un vector fágico M13 como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. Se pueden encontrar procedimientos para construir una biblioteca de anticuerpos en el fago M13 o en los fagos derivados de M13 en las Patentes estadounidenses nº 6.225.447, nº 5.580.717 y 5.702.892, entre otros
lugares.

Una biblioteca de anticuepos utilizada para los procedimientos de "lavado en batea" descritos puede comprender de una biblioteca naif o una biblioteca inmune. Se pueden construir bibliotecas naif de anticuerpos utilizando las regiones hipervariables de la IgG derivadas de los linfocitos de la sangre periférica obtenidos a partir de varios sujetos normales y/o inmunológicamente deficientes. Las bibliotecas naif son particularmente útiles en la selección de dianas que comprenden de un epítopo pobremente inmunogénico. De manera alternativa, se puede preparar una biblioteca inmune, en la que las regiones hipervariables de la IgG se obtienen a partir de esplenocitos de ratones previamente inmunizados con el sustrato diana.

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IV.B. Procedimientos de "lavado en batea"

Las técnicas de "lavado en batea" utilizadas con relación a la presente invención pueden comprender de una selección en fase sólida, selección en fase de solución, selección de proximidad dirigido a anticuerpos, selección basado en células, selección basado en tejidos, o una combinación de los mismos. Los formatos de selección se describen adicionalmente a continuación en la presente memoria. Véanse también los Ejemplos 2 a 8.

Los procedimientos para recuperar partes de unión que se unen a un sustrato se seleccionan en base a una o más características comunes a las moléculas presentes en la biblioteca. Por ejemplo, se pueden utilizar la espectrometría de masas y/o la cromatografía de gases para identificar las moléculas que compartan una estructura nuclear común. De esta manera, en el caso de que una biblioteca conste de diversas moléculas basadas generalmente en la estructura de una molécula orgánica, determinar la presencia de un pico base para la molécula en concreto puede identificar una parte de unión.

De manera alternativa, cada una de las diversas moléculas de una biblioteca puede comprender de un marcador que facilita la recuperación y la identificación. Por ejemplo, un marcador representativo es un oligonucleótido o una molécula pequeña como por ejemplo la biotina. Véanse por ejemplo, Brenner & Lerner, 1992; Norris et al., 1999; Paige et al., 1999; la Patente estadounidense nº 6.068.829.

Un marcador también puede ser un soporte o una superficie a la que puede fijar una molécula. Por ejemplo, un soporte puede ser un marcador biológico como por ejemplo un virus o una partícula similar a un virus como por ejemplo un bacteriófago ("fago"); una bacteria; o una célula eucariota como por ejemplo una levadura, la célula de un insecto, o la célula de mamífero (por ejemplo, una célula progenitora endotelial o un leucocito); o puede ser un marcador físico como por ejemplo un liposoma o una microperla. Cuando una molécula se une a un soporte, se puede situar la parte de la molécula de la que se sospecha que es capaz de interactuar con un sustrato de tal manera que pueda participar en la interacción.

Selección en Fase Sólida. Los procedimientos de selección en fase sólida se utilizan cuando el sustrato de unión comprende de una superficie no biológica. Véanse los Ejemplos 2 a 8. La selección en fase sólida abarca procedimientos de "lavado en batea" en los que se recubre una diana biológica en un soporte sólido (por ejemplo, en pocillos de una placa micrititer), como se describe en el Ejemplo 9. Este método requiere que un sustrato diana biológico conserve por lo menos una aproximación de la estructura y función nativas al ser inmovilizado en un
soporte.

Selección en Fase de Solución. Este método se puede utilizar para identifica una parte de unión que se une específicamente a un sustrato biológico en solución. En concreto, el procedimiento es adecuado para identificar una parte de unión que se une específicamente a un sustrato biológico, donde el sustrato biológico está unido a otros componentes biológicos como parte de un complejo. La selección en fase de solución es también apropiada en casos en los que la capacidad de unión de un sustrato biológico se ve disminuida por la inmovilización en un sustrato. Según este método, el sustrato biológico, un componente que forma un complejo con éste, o la parte de unión se modifican para incluir un marcador que facilita la recuperación del sustrato, como se describe a continuación en la presente
memoria.

Selecciones de Proximidad Dirigidos a Anticuerpos. Si no se puede obtener la diana purificada, se puede utilizar un anticuerpo que se une específicamente a la diana para recuperar las parte de unión que también se unen a la diana. El procedimiento se basa en la observación de que por lo general una parte de unión se une a un sustrato diana, donde el sustrato diana forma un complejo con un anticuerpo u otra proteína, en sitios en el sustrato diana que son adyacentes a las regiones unidas por el anticuerpo u otra proteína asociada. Una parte de unión se detecta por la activación de la biotina-tiramina por la peroxidasa de rábano picante (HRP) en presencia de peróxido de hidrógeno. A continuación la biotina-tiramina activada biotiniza cualquier molécula con la que entra en contacto. Sin embargo, la biotina-tiramina activada se enfría con agua, de manera que tiene un radio de difusión extremadamente limitado. De esta manera, sólo se biotinizan las moléculas muy cercanas a la HRP, incluyendo el fago unido en los sitios cercanos. Los fagos bioninizados se separan de la población por afinidad a perlas magnéticas de estreptavidina. Los fagos recuperados se amplifican mediante infección y a continuación pueden caracterizarse o someterse a rondas adicionales de "lavado en batea". Véanse Osbourn et al., 1998a; Osbourn et al., 1998b.

Selección basado en células. Los sustratos diana que comprenden de receptores u otras moléculas presentes en una superficie celular se pueden utilizar en la selección basada en células. Este método implica el "lavado en batea" de una biblioteca de fagos sobre una población de células. Para seleccionar los fagos que se unen a una molécula de la superficie celular, el procedimiento incluye las etapas de minimizar la detección de la unión de los fagos a otras moléculas presentes en la membrana celular. Véase el Ejemplo 9.

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Un método para minimizar la detección de una unión no diana implica la selección diferencial utilizando una población mixta de células "marcadas" que expresan el receptor y una cantidad muy superior de células "no marcadas" que no tienen el receptor. Según el procedimiento, cualquier fago que se une a moléculas comunes a ambas poblaciones celulares está unido preferentemente a la cantidad muy superior de células no marcadas y se depleciona durante múltiples rondas de selección. Los fagos que se unen al receptor diana son por consiguiente enriquecidos durante las múltiples rondas de selección.

Otro método combina procedimientos de selección dirigida a antígenos y basado en células. Si un anticuerpo está disponible para una molécula de la superficie celular, o para una versión del epítopo marcado de la misma, el anticuerpo está unido a la molécula diana en la superficie celular. En este caso, el gran número de fagos que se unen a moléculas diferentes del receptor diana no son detectadas porque están biotinizadas.

Selección de tejidos. También se puede identificar un péptido que se une específicamente a un sustrato biológico mediante un "lavado en batea" in vivo como se describe en la Patente estadounidense nº 6.086.829. Según este procedimiento, se administra una biblioteca de péptidos diversos a un sujeto, o a un tejido diana aislado o a un órgano obtenido de un paciente, o una fracción del mismo, y se recuperan los fagos que se unen específicamente a un tejido o un órgano diana.

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V. Aplicaciones

Se puede utilizar un biomaterial interfacial de la presente invención en cualquier aplicación donde se desee controlar una interacción entre dos sustratos, es decir un sustrato no biológico y un sustrato biológico. Se describen brevemente usos representativos de un biomaterial interfacial de la presente invención a continuación en la presente memoria. En la presente memoria se describen interacciones que comprender de una interacción de unión, una interacción de no unión, o una combinación de las mismas. La naturaleza y calidad de la interacción dependen de la especificidad de unión, fuerza de unión, o cualidad de no unión de la pluralidad de agentes de unión utilizados para crear un biomaterial interfacial.

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V.A. Cultivo Celular

En una forma de realización de la invención, un biomaterial interfacial comprende de un recubrimiento que actúa de mediador en la adhesión de las células a una superficie para el cultivo celular. El Ejemplo 14 describe un biomaterial interfacial que comprende de agentes de unión que se unen específicamente a las células y al poliestireno. El biomaterial interfacial se crea adhiriendo una pluralidad de agentes de unión a una placa de cultivo de poliestireno, y a continuación adhiriendo las células a la pluralidad de agentes de unión.

Se puede utilizar un biomaterial interfacial para el cultivo celular para facilitar el cultivo de cualquier tipo de célula incluyendo, pero sin limitarse a fibroblastos, células endoteliales aórticas, células madre, células embrionarias y de tejidos de recién nacido, células endoteliales de vertebrados, condorcitos, osteoblastos, adipositos, y mioblastos. Las células se pueden obtener de cualquier especie incluyendo, pero sin limitarse a células humanas, de primates, porcinas, murinas, y de insectos.

Para crear una interfaz de unión entre un sustrato no biológico y un sustrato biológico que comprende de células, cada uno de una pluralidad de agentes de unión puede comprender de un péptido de unión obtenido de una molécula de adhesión celular, como por ejemplo cualquiera de las listadas en la Tabla 1 (números de identidad en la SEQ: 74 a 98). El término "molécula de adhesión celular" se refiere a cualquiera de una familia de proteínas y péptidos que facilitan la adhesión o la fijación celular a una superficie. De manera alternativa, los agentes de unión pueden comprender de un péptido de unión que se une específicamente a proteínas de la matriz extracelular. En el Ejemplo 16 se describen procedimientos representativos para preparar una interfaz de unión.

Un biomaterial interfacial para la adhesión de las células a un superficie de cultivo puede comprender de una interfaz heterogénea que comprende de una pluralidad de péptidos no idénticos que se unen a células. Cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de: (a) una parte de unión que se une específicamente a un sustrato de la superficie de cultivo; y (b) una parte de unión variable que se une a las células.

Se puede mantener un cultivo celular en contacto con el biomaterial interfacial en condiciones y durante un período de tiempo efectivos para generar una estructura tipo tejido bidimensional o tridimensional, como por ejemplo un tejido tipo hueso o un tejido vascularizado.

La presente invención también abarca el cultivo de células in vitro y ex vivo para se posteriormente trasplantadas a un sujeto. Las células cultivadas pueden separarse del biomaterial interfacial y proporcionarse a un sujeto. Otro método implica transplantar a un sujeto una composición que comprende de un sustrato no biológico, un biomaterial interfacial y un sustrato celular.

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V.B. Matrices Biológicas

La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento para preparar una matriz biológica. El término "matriz" se refiere en general a un patrón de "spots" adherentes y a un patrón de sustratos biológicos específicamente unidos a ellos. El término "spot" se utiliza en la presente memoria para describir una región que comprende de un agente de unión de la presente invención específicamente unido a un sustrato no biológico.

En una forma de realización de la invención, un procedimiento para preparar una matriz biológica comprende de: (a) proporcionar un sustrato no biológico con una pluralidad de posiciones; (b) aplicar a cada una de la pluralidad de posiciones un agente de unión que comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al sustrato no biológico y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana biológico, donde la aplicación está libre de acoplamiento; (c) poner en contacto el sustrato no biológico, donde una pluralidad de agentes de unión están unidos al sustrato no biológico, con una muestra que comprende de el sustrato diana biológico; y (d) dejar pasar un tiempo suficiente para que el sustrato diana biológico se una a la pluralidad de agentes de unión, con lo que se prepara una matriz biológica. Un procedimiento representativo para aplicar una pluralidad de agentes de unión a una pluralidad de posiciones comprende de la impresión por "dip-pen" como se describe en el Ejemplo
15.

La cantidad de agente de unión dispensado, el tamaño de los puntos, y la forma de los puntos pueden variar modificando la concentración y el volumen de la parte de unión dispensado, la temperatura a la que se dispensa, y/o la técnica de aplicación. Por lo general, la dimensión de un punto es una dimensión mínima de entre aproximadamente 0,2 \mum y aproximadamente 1,0 \mum, pero puede tener una dimensión mínima mayor según se desee para una aplicación concreta. Está dentro del dominio del experto en la materia optimizar el tamaño de los puntos, la forma y la cantidad de agente de unión para una aplicación concreta, tras una revisión de la descripción presentada en la presente
memoria.

Un punto puede ser de cualquier tamaño y forma apropiados para unirse a un sustrato diana biológico. Por ejemplo, un punto preparado dispensando un agente de unión que comprende de una parte de unión que se une a las células puede tener una dimensión máxima menor que o aproximadamente igual al tamaño de una célula adherida. Por ejemplo, un glóbulo blanco tiene un diámetro de aproximadamente 20 \mum, y los oocitos de Xenopus laevis son de hasta 1 mm de diámetro. Al colocarse en una superficie, estas células prácticamente no se aplastan al adherirse a una superficie. Las células endoteliales por lo general se aplastan al adherirse a una superficie y pueden tener un área de entre aproximadamente 250 \mum^{2} y 4.000 \mum^{2}. De manera similar, los hepatocitos pueden tener un área de entre aproximadamente 500 \mum^{2} y 10.000 \mum^{2}.

El término "dimensión entre puntos" se refiere a la distancia entre los puntos de una matriz. En una forma de realización de la invención, una dimensión entre puntos resulta suficiente para distinguir puntos adyacentes y sustratos biológicos específicamente unidos a ellos. Por ejemplo, donde el biomaterial interfacial estructurado se utiliza para preparar una matriz celular, la dimensión entre puntos es suficiente para evitar el contacto entre las células en puntos adyacentes. También se puede determinar la dimensión entre puntos para distinguir puntos adyacentes mientras se permite la interacción de los sustratos unidos a ellos.

De esta manera, se puede dimensionar un punto para que se una a una única célula. Adicionalmente, se puede utilizar un punto que sea sustancialmente menor que la dimensión de una célula aplastada para hacer que una célula adherida mantenga una forma redondeada. Cuando se desea un contacto célula a célula para influir en las características celulares (por ejemplo, viabilidad, crecimiento, proliferación, diferenciación, procesamiento de proteínas, orientación, diseminación), se pueden utilizar puntos capaces de adherirse a más de una célula.

El término "región de borde" se utiliza en la presente memoria para describir una región exclusiva de uno o más puntos. Las regiones de borde del sustrato no biológico pueden comprender adicionalmente de un sustrato biológico adsorbido o acoplado a los bordes, o cualquier otro tratamiento deseado. Por ejemplo, se pueden adherir las células a una región de borde utilizando suero para facilitar la unión de las células.

Un biomaterial interfacial estructurado y heterogéneo es útil para las manipulaciones celulares como por ejemplo la citometría. Por ejemplo, se puede determinar un número o ratio de diferentes tipos de células en una muestra: (a) aplicando un agente de unión a cada una de la pluralidad de posiciones en un sustrato no biológico; (b) poniendo en contacto una suspensión celular con el sustrato no biológico; y (c) determinando el número de células unidas al sustrato no biológico. Una muestra puede comprender de cualquier muestra celular, como por ejemplo sangre, orina, fluido cerebroespinal, extensión de Pap, biopsia, suelo, agua y cualquier otra aplicación donde se desee determinar la presencia, número o frecuencia relativa de uno o más tipos de células. Se puede utilizar un equipo detector automatizado para determinar el número de células unidas utilizando un programa diseñado para detectar células en las posiciones de los puntos. Se puede detectar la presencia o ausencia de una célula mediante espectrofotometría, la detección de un marcador celular (por ejemplo, un marcador fluorescente), o análisis
microscópico.

Las matrices biológicas preparadas tal como se describe en la presente memoria también resultan útiles para inmovilizar células para experimentos de microinyección.

Más generalmente, una matriz biológica de la presente invención resulta útil para la selección de una pluralidad de sustratos biológicos en presencia de una sustancia de ensayo. Un procedimiento para identificar una molécula interactuante puede comprender de: (a) preparar una matriz biológica que comprende de una pluralidad de sustratos biológicos, donde cada uno de la pluralidad de sustratos biológicos está unido específicamente a una de una pluralidad de posiciones en un sustrato no biológico; (b) poner en contacto la matriz biológica con una sustancia candidata; (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que la sustancia candidata se una a la matriz biológica; y (d) someter a ensayo una interacción entre uno o más de los sustratos biológicos y la sustancia candidata, con lo que se identifica una molécula interactuante.

Por ejemplo, una matriz biológica utilizada para seleccionar una sustancia de ensayo puede comprender de una matriz celular. Se puede identificar una molécula interactuante observando un resultado biológico, como por ejemplo un cambio en la morfología celular, en presencia de la sustancia de ensayo.

Un procedimiento para seleccionar una matriz celular puede adicionalmente comprender de poner en contacto la matriz celular con un agente de detección. Agentes de detección representativos incluyen, pero no se limitan a partes de unión marcados y ácidos nucleicos marcados. Por ejemplo, se puede estudiar una población de células transfectadas utilizando la tecnología del ADN recombinante para determinar un subconjunto de células que expresen con éxito el ADN transfectado.

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V.C. Potenciación de una interacción entre Materiales Biológicos

La presente descripción proporciona un biomaterial interfacial para potenciar la interacción entre dos o más materiales. Los materiales descritos en la presente memoria pueden ser los mismos o diferentes, y pueden ser biológicos o no biológicos. También se describe en la presente memoria un biomaterial interfacial que comprende de una pluralidad de agentes de unión donde cada agente de unión comprende de una primera y una segunda parte de unión que se unen específicamente a un sustrato biológico, y donde la pluralidad de agentes de unión son una interfaz entre los sustratos biológicos. En un caso la primera y segunda parte de unión se unen al mismo sustrato biológico. En otro caso la primera y la segunda parte de unión se unen a sustratos biológicos diferentes.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para preparar un biomaterial interfacial para potenciar una interacción entre materiales biológicos. Un procedimiento para preparar un biomaterial interfacial para estimular una interacción entre materiales biológicos puede comprender de: (a) adherir a un primer material biológico una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al primer material biológico y de un segundo agente de unión que se une específicamente a un segundo material biológico; (b) poner en contacto el segundo material biológico con el primer material biológico con los agentes de unión adheridos; y (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que el segundo material biológico se una a la pluralidad de agentes de unión.

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V.C.1. Dispositivos de Implante Recubiertos

La presente invención proporciona adicionalmente un biomaterial interfacial para recubrir implantes para mejorar su uso in vivo. El biomaterial interfacial se puede formar antes de (in vitro o ex vivo) o después de (in vivo) la implantación de un dispositivo de implante. El término "recubrimiento", tal como se utiliza en la presente memoria para describir la aplicación de un recubrimiento a un sustrato, se refiere a poner en contacto una parte de unión o un agente de unión que comprende de una parte de unión, con el sustrato y dejar pasar un tiempo suficiente para que la parte de unión o el agente de unión se unan al sustrato. En el Ejemplo 14 se describen procedimientos representativos para recubrir un sustrato no biológico.

El término "implante" se refiere en general a un material no biológico que se puede introducir dentro del cuerpo de un ser humano o de un animal para restaurar una función o un tejido dañado. Se puede crear un dispositivo de implante utilizando cualquier sustrato biocompatible al que los agentes de unión se pueden unir específicamente como se describe en la presente memoria. Implantes representativos incluyen, pero no se limitan a endoprótesis de cadera, articulaciones artificiales, implantes maxilares o faciales, sustituciones de tendones y ligamentos, sustituciones de piel, sustituciones de hueso y tornillos artificiales para hueso, prótesis vasculares, marcapasos para el corazón, válvulas artificiales para el corazón, implantes mamarios, implantes peneanos, stents, catéteres, derivaciones, guías para el crecimiento de los nervios, lentes intraoculares, apósitos para heridas, y selladores de tejidos.

En una forma de realización, un sustrato de implante no biológico es biocompatible. En otra forma de realización es biodegradable, y tiene una elevada relación superficie-volumen para permitir el crecimiento y transporte celulares. Por ejemplo, sustratos no biológicos adecuados incluyen polímeros sintéticos y/o copolímeros de ácido poliláctico y ácido poliglicólico, que se pueden procesar para convertirlos en estructuras de soporte muy porosas y degradables. Véanse por ejemplo Mikos et al., 1994; Harris et al., 1998.

En una forma de realización de la invención, un biomaterial interfacial puede crear una interfaz de unión que actúa de mediador en la fijación de las células a un implante no biológico. Los dispositivos de implante preparados según los procedimientos de la presente invención controlan la cantidad y porcentaje de fijación de las células, y de esta manera la tasa de integración del tejido del dispositivo in vivo. La adhesión celular y la integración del tejido potenciados actúan para minimizar la infección sellando el sitio del implante con una capa protectora de células. Esta capa protectora de células puede también reducir la formación de cicatrices.

De esta manera, la invención se refiere a un procedimiento para implantar un dispositivo en un sujeto, donde el implante recubierto promueve la fijación celular, que puede comprender de: (a) aplicar a un implante una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al implante y de una segunda parte de unión que se une específicamente a las células en el sitio del implante, donde la aplicación está libre de acoplamiento; (b) colocar el implante en un sujeto en el sitio del implante; y (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que las células se unan a la pluralidad de agentes de unión. El término "tiempo suficiente para que se unan" se refiere a un período de tiempo en el que las células huésped pueden migrar a las cercanías del implante y unirse al implante mediante el agente de unión.

Por ejemplo, se puede preparar un biomaterial interfacial para estimular la incorporación de un implante mamario de silicona utilizando una pluralidad de agentes de unión, donde cada agente de unión comprende de: (a) una parte de unión que se une específicamente a un implante de silicona; y (b) una parte de unión que se une específicamente a las células grasas. Se recubre el implante mamario de silicona con la pluralidad de agentes de unión, y a continuación se transplanta al huésped. La parte de unión que se une específicamente a las células grasas promueve la fijación celular al implante y la satisfactoria incorporación del mismo.

Como otro ejemplo, un agente de unión puede comprender de una parte de unión que se une específicamente a un implante de titanio y de una parte de unión que se une específicamente a las células cercanas al sitio del implante. Véase el Ejemplo 13. Se presentan péptidos de unión representativos adecuados para unirse al titanio como los números de identidad en la SEQ: 24 a 36. En la Tabla 1 y en los números de identidad en la SEQ: 74 a 98 se listan péptidos representativos que se unen a las células.

En otra forma de realización de la invención, los materiales de sutura se recubren con agentes de unión que se unen específicamente al material de sutura. Una sutura recubierta puede estimular la regeneración o reparación de tejido fijando las proteínas o las células, dependiendo de la especificidad de unión del agente de unión, en el sitio de la herida. De esta manera una sutura recubierta pude proporcionar resistencia mecánica y cerrar la herida.

Para los sitios de heridas que no son fácilmente accesibles o cuando se desea una intervención sin sutura, se puede utilizar un biomaterial interfacial que comprenda de un sellador de tejido. Tales "colas" terapéuticas ofrecen ventajas que incluyen la simplicidad, rapidez de administración y recuperación celular, y la seguridad. En una forma de realización, un biomaterial interfacial para el sellado de tejidos comprende adicionalmente de una fuerza de adhesión suficiente para estimular la regeneración del tejido, incluyendo la regeneración de tejidos que comprenden de células necróticas y/o de una cantidad anormal de humedad. En una forma de realización, un biomaterial interfacial básicamente no afecta a la función de tejido o a la integridad estructural en el sitio de la herida.

Un procedimiento para preparar un biomaterial interfacial para estimular la cicatrización de heridas comprende de: (a) adherir a un polímero biodegradable una pluralidad de agentes de unión, donde la pluralidad de agentes de unión comprenden de una primera parte de unión que se une específicamente al polímero biodegradable y de una segunda parte de unión que se une específicamente a las células; (b) implantar el polímero en el sitio de la herida; y (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que las células se unan a la pluralidad de agentes de unión.

Un biomaterial interfacial que comprende de un sellador de tejido resulta útil para estimular la cicatrización de cualquier herida con necesidad de sellado que incluye pero no se limita a ampollas que se filtran hacia dentro; tejido cortado por intervención quirúrgica, incluyendo la cirugía plástica o reconstructiva; fístula broncopleural; úlcera péptica; perforación de membrana timpánica; perforación de córnea; transplante de córnea; orificios retinianos; tendones lacerados o rotos; y tejidos sometidos a reparación plástica y reconstructiva.

Una forma de representación adicional de esta invención se refiere al uso de biomateriales interfaciales como una plantilla implantable para estructuras celulares altamente ordenadas, como por ejemplo los órganos, la piel o los músculos. Se crea un biomaterial interfacial utilizando agentes de unión que se unen específicamente al material de la plantilla y a las células o proteínas. Las células o proteínas diana se ensamblan en la plantilla mediante el biomaterial interfacial y a continuación reclutan células o matrices adicionales, proliferar, o se diferencian para crear un órgano o tejido multicelular. El biomaterial interfacial puede formarse in vitro o ex vivo como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. De manera alternativa, el biomaterial interfacial se pude formar in vivo por implantación de un sustrato no biológico recubierto con una pluralidad de agentes de unión.

Como se describe también en la presente memoria, se puede utilizar un recubrimiento para implantes para crear una interfaz de no unión. Un procedimiento para preparar un recubrimiento para implantes de no unión comprende de: (a) aplicar al implante una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una parte de unión que se une específicamente al implante y de un dominio de no unión que básicamente no se une a las células en el sitio del implante, donde la aplicación está libre de acoplamiento; y (b) colocar el implante en un sujeto en el sitio del implante.

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Una interfaz de no unión como la que se describe en la presente memoria resulta útil para evitar o minimizar las adhesiones quirúrgicas. En aproximadamente entre un 5% y aproximadamente un 10% de los procedimientos quirúrgicos se dan adhesiones clínicamente significativas, y hasta casi el 100% en algunos procedimientos. Las adhesiones quirúrgicas pueden resultar en complicaciones que incluyen la obstrucción, infertilidad, dolor y la necesidad de un segundo procedimiento funcional. Véase di Zerega 1993; Stangel et al., 1984.

Se puede utilizar una interfaz de no unión para evitar la formación de adhesiones entre los tejidos dañados colocando el biomaterial interfacial entre los tejidos dañados. Por ejemplo, un sustrato barrera que comprende de dos superficies puede actuar de mediador de manera diferencial en la fijación de células sanas y en la no fijación de células dañadas. Una primera superficie de la barrera está recubierta con una pluralidad de agentes de unión, comprendiendo cada agente de unión de una parte de unión que se une específicamente a un sustrato barrera no biológico y de un dominio de no unión que básicamente no se une a las células. Una segunda superficie del sustrato barrera está opcionalmente recubierta con una pluralidad de agentes de unión, comprendiendo cada agente de unión de una parte de unión que se une específicamente a un sustrato barrera no biológico y de una parte de unión que se une específicamente a las células en el sitio de la lesión. La barrera recubierta se coloca en un sujeto en el sitio de la lesión. En un caso, el sustrato barrera no biológico comprende de un sustrato biodegradable, por ejemplo un polímero biodegradable, de manera que se de la cicatrización con la mínima formación de cicatrices o adhesiones.

Los métodos para la prevención de adhesiones post quirúrgicas han incluido la administración de polímeros lineales sintéticos y naturales (Patente estadounidense nº 6.060.582; Diamond & Dechemey, 1987; Unsky et al., 1987; Leach & Henry, 1990; Steinleitner et al., 1991). A diferencia de los procedimientos para evitar o minimizar las adhesiones post quirúrgicas descritas en la presente memoria, estos métodos no utilizan un biomaterial interfacial que comprende de una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una parte de unión que se une específicamente a un sustrato no biológico y de un dominio de no unión que básicamente no se une a un sustrato biológico.

Un biomaterial interfacial también puede funcionar como un lubricante biológico. Un lubricante de la demarcación es importante en muchos casos de implantes donde se da un excesivo desgaste entre un implante sintético y un huésped. De esta manera, se puede preparar un biomaterial interfacial para la lubricación utilizando una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de: (a) una parte de unión que se une específicamente a un implante; y (b) un dominio de no unión que básicamente no se une a las células huésped en el sitio del implante.

En otro caso de la descripción se puede preparar un biomaterial interfacial que comprende de un lubricante de la demarcación utilizando una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de: (a) una parte de unión que se une específicamente a un primer sustrato biológico; y (b) un dominio de no unión que básicamente no se une a un segundo sustrato biológico. Por ejemplo, cada uno de la pluralidad de agentes de unión utilizados para crear un lubricante de la demarcación puede comprender de: (a) una parte de unión que se une específicamente al cartílago articular; y (b) un dominio de no unión que básicamente no se une a los sustratos biológicos presentes en el fluido sinovial. Un biomaterial interfacial así preparado se puede utilizar, por ejemplo, para tratar la enfermedad articular degenerativa protegiendo el cartílago articular y restaurando las propiedades viscoelásticas del líquido sinovial.

En otra forma de realización más de la invención, un biomaterial interfacial que comprende de un recubrimiento para implantes puede comprender de una interfaz heterogénea, en la que las regiones de la interfaz muestran diferentes especificidades de unión y actúan de mediadores en diferentes procesos in vivo. Por ejemplo, un recubrimiento para implantes puede comprender tanto de una interfaz de unión como de una interfaz de no unión como se describe a continuación en la presente memoria para un sustrato barrera. En una forma de realización, se estructura una interfaz heterogénea adhiriendo agentes de unión a un sustrato no biológico de una manera espacialmente
restringida.

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V.D. Composición Recubierta para Transplantes

La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento para recubrir las células o tejidos para transplante del donante para conseguir una viabilidad mejorada del transplante. Se pueden utilizar membranas de polímeros sintéticos para encapsular las células para su transplante. Para el tratamiento de la diabetes, las células de los islotes de Langerhans se pueden transplantar en una microcápsula sintética para minimizar una respuesta inmune post transplante en el huésped (Marik et al., 1999). Los inconvenientes de este método incluyen la limitada viabilidad de las células de los islotes encapsuladas, posiblemente como resultado de la pobre incorporación ó la falta de
revascularización.

Para estimular con éxito el transplante de las células o tejidos encapsulados, se puede preparar un biomaterial interfacial que comprende de una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de:

(a): una primera parte de unión que se une específicamente a una microcápsula no biológica; y

(b): una segunda parte de unión que se une específicamente a las células huésped en el sitio del transplante. Tras el transplante, la segunda parte de unión actúa de mediador en la integración de las células donantes encapsuladas y las células huésped en el sitio del transplante.

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V.E. Diagnóstico y Administración de Fármacos

La presente invención se refiere adicionalmente a un procedimiento para preparar un biomaterial interfacial que comprende de una interfaz terapéutica o de diagnostico, comprendiendo el procedimiento de: (a) adherir una pluralidad de agentes de unión a un sustrato no biológico, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al fármaco, a un marcador detectable o a un portador del fármaco, y de una segunda parte de unión que se un específicamente a una célula diana; (b) administrar el sustrato no biológico a un sujeto; y (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que la célula diana se una a la pluralidad de agentes de unión, con lo que se forma un biomaterial interfacial.

Partes de unión representativos que se unen específicamente a una célula diana y que se pueden utilizar para preparar un agente de unión como se describe en la presente memoria se describen en las Patentes norteamericanas nº 6.068.829 y nº 6.180.084; Publicación Internacional PCT nº WO 98/10795 y nº WO 01/09611; Arap et al. (1998) Science 279:377-380; Staba et al. (2000) Cancer Gene Ther 7:13-19; Wickham et al. (1995) Gene Ther 2:750-
756.

Se han descrito fármacos y portadores de fármacos representativos anteriormente en la presente memoria. En una forma de realización de la invención, un fármaco comprende de un marcador detectable. En otra forma de realización, el marcador se puede detectar in vivo. A continuación se describen en la presente memoria sustratos no biológicos adicionales que comprenden de agentes para la formación de imágenes, que incluyen agentes para la escintigrafía, imagen por resonancia magnética, ultrasonido, y fluorescencia.

Los procedimientos por escintigrafía incluyen el SPECT (Tomografía computerizada por emisión de un único fotón), PET (Tomografía por emisión de positrones), gammacámara, y escáner rectilíneo. Un sustrato no biológico que comprende de un marcador para escintigrafía comprende en una forma de realización de un marcador radionúclido, y en otra forma de realización un marcador radionúclido seleccionado de entre el grupo que consiste de ^{18}flúor, ^{64}cobre, ^{65}cobre, ^{67}galio, ^{68}galio, ^{77}bromo, ^{80m}bromo, ^{95}rutenio, ^{97}rutenio, ^{103}rutenio, ^{105}rutenio, ^{99m}tecnecio, ^{107}mercurio, ^{203}mercurio, ^{123}yodo, ^{124}yodo, ^{125}yodo, ^{126}yodo, ^{131}yodo, ^{133}yodo, ^{111}indio, ^{113m}indio, ^{99m}renio, ^{105}renio, ^{101}renio, ^{188}renio, ^{121m}telurio, ^{122m}telurio, ^{125m}telurio, ^{165}tulio, ^{167}tulio, ^{168}tulio y formas nitruro u óxido derivadas de ellos.

Las técnicas basadas en imágenes de resonancia magnética crean imágenes basadas en las tasas de relajación relativas de los protones del agua en medios químicos únicos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "imagen por resonancia magnética" se refiere a técnicas de fuentes magnéticas que incluyen la imagen por resonancia magnética convencional, transferencia de magnetización de imágenes (MTI), espectroscopia de resonancia magnética protónica (MRS), obtención de imágenes por difusión del peso (DWI) y resonancia magnética funcional (fMRI). Véase Rovaris et al., 2001; Pomper & Port 2000; y las referencias citadas en la presente memoria.

Sustratos no biológicos que comprenden de agentes de contraste para las imágenes de fuente magnética incluyen pero no se limitan a iones paramagnéticos o superparamagnéticos, partículas de óxido de hierro (Weissleder et al., 1992; Shen et al., 1993), y agentes de contraste solubles en agua. Se pueden seleccionar los iones paramagnéticos y superparamagnéticos de entre el grupo de los metales que incluye hierro, cobre, manganeso, cromo, erbio, europio, disprosio, holmio y gadolinio. En una forma de realización, el metal es hierro, en otra forma de realización es manganeso, y en otra forma de realización más es gadolinio.

Se pueden utilizar las imágenes por ultrasonido para obtener información cuantitativa y estructural de un tejido diana. Sustratos no biológicos representativos que comprenden de una sustancia para proporcionar microburbujas in vivo incluyen pero no se limitan a burbujas lipofílicas llenas de gas o burbujas basadas en lípidos (por ejemplo, las Patentes estadounidenses nº 6.245.318; nº 6.231.834; nº 6.221.018; y nº 5.088.499). Además, se puede encerrar el gas o líquido en partículas inorgánicas porosas que facilitan la liberación de las microburbujas tras su administración a un sujeto (Patentes estadounidenses nº 6.254.852 y nº 5.147.631).

Los procedimientos de toma de imágenes no invasivos también pueden comprender de la detección de un marcador fluorescente. Sustratos no biológicos que comprenden de marcadores fluorescentes incluyen, pero no se limitan a tinciones con carbocianina y amino estiril, dialquil carbocianinas de cadena especialmente larga (por ejemplo, DiI, DiO, y DiD disponibles en Molecular Probes Inc. de Eugene, Oregon, Estados Unidos de América) y tinciones con dialquilamino estéril. Un marcador fluorescente también puede comprender de tinciones con cianina sulfonada, que incluyen Cy5.5 y Cy5 (disponibles en Amersham de Arlington Heights, Illinois, Estados Unidos de América), IRD41 y IRD700 (disponibles en Li-Cor, Inc. de Lincoln, Nebraska, Estados Unidos de América), NIR-1 (disponible en Dejindo de Kumamoto, Japón), y LaJoila Blue (disponible en Diatron de Miami, Florida, Estados Unidos de América). Además, un marcador fluorescente puede comprender de un quelato orgánico derivado de iones lantánidos, por ejemplo quelatos fluorescentes de terbio y europio (Patente estadounidense nº 5.928.627).

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V.F Aplicaciones Diagnósticas, para la Cromatografía y para la Filtración

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para utilizar biomateriales interfaciales para la detección y determinación de un parte de unión o partes de unión así como el aislamiento de una parte de unión o partes de unión. El biomaterial interfacial actúa como mediador de la interacción o interacciones entre un sustrato no biológico y un sustrato biológico. Más concretamente, la presente invención se refiere a agentes de unión que crean una interfaz de unión entre sustratos mediante una unión específica de cada sustrato. La presente invención describe procedimientos utilizados en aplicaciones diagnósticas mediante las que se determina una parte de unión en un medio líquido. La presente invención también incluye procedimientos para aislar una parte de unión de un medio
líquido.

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V.F.1. Consideraciones Generales para las Aplicaciones Diagnósticas

La presente descripción proporciona procedimientos de ensayo y reactivos utilizados en ensayos de tipo uniones específicas homogéneas y heterogéneas para determinar cualitativamente o cuantitativamente una parte de unión en un medio líquido. Se pueden determinar las cantidades de una parte de unión en un medio líquido utilizando un proceso de unión no competitiva (por ejemplo, la técnica tipo "Sándwich"). Generalmente este ensayo requiere por lo menos dos sitios reactivos para unirse tanto a la fase sustrato/insoluble que contiene una sustancia de unión específica como a una sustancia que se une específicamente a la biotina marcada. Lo anteriormente indicado no resulta necesario cuando se utiliza un proceso de unión competitiva.

La mayoría de los ensayos anteriores dependen de las interacciones de la estreptavidina o la avidina con la biotina (Hiller et al., 1987). La estreptavidina, una proteína tetramérica producida por Streptomyces avidinii, forma un complejo no covalente específico y muy fuerte con la vitamina biotina soluble en agua. La afinidad de unión se encuentra entre las más altas presentadas para interacciones no covalentes entre una parte de unión y una proteína, con una constante de asociación (Ka) que se estima está en el rango comprendido entre los 10^{13} M^{-1} y los 10^{15} M^{-1}. Esta afinidad de unión es tal que la unión de la estreptavidina y la biotina resulta esencialmente irreversible en la mayoría de condiciones fisiológicas y proporciona la base para la utilidad de estos compuestos en una amplia variedad de aplicaciones clínicas e industriales (Green, 1975).

Tanto la estreptavidina como la proteína homóloga avidina, que comparte su alta afinidad por la biotina, han sido investigadas puesto que muestran fuertes interacciones parte de unión-proteína. Se han descrito las estructuras de los cristales por rayos X de la estreptavidina y la avidina, ambas en sus formas apo y holo. También se han descrito las secuencias de ambas, así como la construcción de varias proteínas de fusión de estreptavidina. Véanse por ejemplo, Sano y Cantor, 1991; Patente estadounidense nº 4.839.293.

Hoy en día, la estreptavidina/avidina juega un papel clave en cuatro áreas tecnológicas de interés comercial: 1) bioseparaciones/clasificación de células; 2) toma de imágenes; 3) administración de fármacos; y 4) diagnosis (Wilchek y Bayer, 1990). En el área de separaciones, se han utilizado mucho estas proteínas en aplicaciones de clasificación de células, donde, por ejemplo, se pueden utilizar para eliminar las células contaminantes de las células madre hematopoyéticas antes de un transplante de médula (Berenson et al., 1992). La estreptavidina también se ha utilizado mucho tanto en la investigación como en el ámbito clínico para someter a ensayo la presencia de diversos biomarcadores específicos de tumores.

Antes de que se pueda utilizar el sistema avidina/biotina en un ensayo, tanto la biotina como la avidina necesitan ser modificadas químicamente para incorporar las funcionalidades apropiadas. Se puede llevar a cabo la preparación del reactivo marcado con biotina (por ejemplo, una sustancia marcada que se une específicamente a la biotina o una parte de unión marcado con biotina) mezclando la entidad que se va a marcar con el éster de la biotina N-hidroxi-succinimida (BNHS) en un disolvente adecuado como por ejemplo dimetilformamida. Aunque el BNHS se utiliza comúnmente, se pueden utilizar otros reactivos y/o procedimientos adecuados.

Se puede llevar a cabo la preparación de un sustrato o una fase insoluble que contiene una sustancia de unión específica para determinar la parte de unión mediante procedimientos conocidos. Por ejemplo, la sustancia de unión específica se puede fijar a un portador sólido mediante reticulación, mediante unión covalente, o mediante acoplamiento físico. Portadores sólidos incluyen, pero no se limitan a tubos de polipropileno, placas microtiter de poliestireno, y perlas de nailon. Cuando la parte de unión que se va a detectar es un antígeno, se puede llevar a cabo la preparación de la fase insoluble recubriendo los tubos o placas con el anticuerpo apropiado. Esta unión es no específica, y por consiguiente el anticuerpo juega dos papeles: la unión al sustrato y la unión a la biotina. Cuando se utilizan perlas de nailon, en anticuerpo apropiado puede estar acoplado covalentemente a las perlas por el procedimiento de Faulstich (Faulstich et al., 1974).

Se pueden utilizar diversas enzimas para producir un reactivo de avidina o estreptavidina marcado con una enzima. Las enzimas que se van a conjugar a la avidina o la estreptavidina se eligen basándose en la disponibilidad de sistemas de ensayo que se puedan utilizar para detectar la enzima bien cualitativamente o cuantitativamente. Por ejemplo, en la determinación cualitativa de una parte de unión, hay reactivos comercialmente disponibles que permiten detectar la enzima utilizando un ensayo que produce un producto coloreado.

Enzimas adecuadas para su uso en la invención incluyen, pero no se limitan a aquellas clasificadas por la Sindicato Internacional de Bioquímicos (I.U.B.) como oxidorreductasas, hidrolasas, y liasas. Oxidorreductasas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a aquellas que actúan sobre el grupo CHOH, el grupo aldehído o ceto, el grupo CHNH_{2}, y aquellas que actúan sobre el peróxido de hidrógeno como aceptor. En una forma de realización, una oxidorreductasa es la glucosa oxidasa. En otra forma de realización, una oxidorreductasa es la peroxidasa de rábano. Hidrolasas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a aquellas que actúan sobre los enlaces éster (tanto ésteres orgánicos como inorgánicos) y aquellas que actúan sobre compuestos glicosílicos, por ejemplo, glucósido hidrolasas. En una forma de realización, una hidrolasa es la fosfatasa alcalina. En otra forma de realización, una hidrolasa es la \beta-galactosidasa.

Otras técnicas para monitorizar la unión de las IFBMs a los materiales biológicos o no biológicos incluyen, pero no se limitan a la resonancia de plasmones en la superficie (SPR), espectroscopía infrarrojo por transformación de Fourier (FTIR), espectroscopia RAMAN y espectrometría de masas. Véanse las Patentes estadounidenses nº 6.429.015 y nº 6.428.955.

En el Ejemplo 20 se describe un procedimiento general para la determinación de un antígeno de unión utilizando la técnica tipo "Sándwich" y se basa en la Patente estadounidense nº 4.298.685 de Parikh et al. En resumen, se añade un estándar de un antígeno diluido apropiadamente o una muestra desconocida a tubos de polipropileno recubiertos con un antígeno, que a continuación se incuban a temperatura ambiente para permitir que se unan los antígenos presentes en el estándar o muestra. Se aspiran y se lavan los tubos, y se añade el anticuerpo marcado con biotina y se permite que se unan durante toda la noche a 4ºC. A continuación se aspiran y lavan los tubos otra vez, y se añade una dilución apropiada de avidina marcada con HRP. Se incuban los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos a 60 minutos, se aspiran y a continuación se lavan. La actividad enzimática en la fase insoluble se determina a intervalos programados. Cuando la intensidad del color del producto de la reacción se considera adecuada, se interrumpe la reacción enzimática y se mide la absorbancia a una longitud de onda apropiada. También se puede marcar la avidina con fosfatasa alcalina en lugar de HRP.

Cuando se utiliza avidina marcada con fosfatasa alcalina en lugar de avidina marcada con HRP, la actividad enzimática en la fase insoluble se determina añadiendo 1 ml de solución tampón de carbonato de sodio 0,05 M, a pH 9,8 que contiene 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato y 1 mM de MgCl_{2}. Tras un período de incubación apropiado, se interrumpe la reacción con 100 \mul de NaOH 1 N y se determina la absorbancia a 400 nm.

Los inmunoensayos enzimáticos llevados a cabo en placas microtiter se realizan básicamente de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Los ensayos enzimáticos se llevan a cabo utilizando sólo 250 \mul de la solución sustrato y se interrumpen con 50 \mul de NaOH 1 N. La intensidad del color se estima cualitativamente, o se determina cuantitativamente transfiriendo la solución a una microcubeta de 250 \mul y haciendo una lectura espectrofoto-
métrica.

Otros sistemas de inmunoensayos que se pueden utilizar con la presente invención incluyen aquellos descritos en las Patentes estadounidenses nº 4.282.287; nº 4.298.685; nº 4.279.992; nº 4.253.995; nº 4.230.797; nº 4.228.237; y nº 4.208.479.

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V.F.2. Consideración General para las Aplicaciones de Cromatografía de Afinidad

El principio de la técnica de separación por cromatografía de afinidad es bien conocido. La presente invención describe el uso de un biomaterial interfacial adherido a un soporte para unirse selectivamente a una especie o parte de unión. Convencionalmente, la interacción entre el soporte y la parte de unión es no específica. Sin embargo, la presente invención utiliza interacciones específicas, cuya fuerza se puede ajustar optimizando la interacción específica. Por consiguiente, las demás especies serán llevadas por el flujo de la mezcla de reacción lejos de la parte de inicio de la columna donde está la especie inmovilizada, efectuando por consiguiente la separación inherente de las especies unidas y libres. Esta técnica se describe en la Patente estadounidense nº 4.205.058 de Wagner et al.

Antes de la descripción de la presente invención, se ha llevado a cabo la preparación de superficies y dispositivos recubiertos de péptidos mediante adsorción no específica, mediante acoplamiento de los péptidos a una superficie derivatizada, o mediante acoplamiento del péptido a una molécula conectora covalentemente unida a la superficie. Estos procedimientos son relativamente tediosos y requieren mucho tiempo, en general requieren múltiples etapas para una asociación efectiva del péptido y del sustrato, a menudo requieren reacciones químicas para la inmovilización, y pueden caracterizarse por la dificultad en conseguir un recubrimiento de superficie reproducible y la pérdida de la actividad máxima. La presente invención representa un procedimiento fácil para recubrir un sustrato con un biomaterial interfacial multifuncional novedoso que se puede utilizar en una aplicación diagnóstica o de cromatografía de afinidad donde se den interacciones de fuerza específicas hechas a medida.

Por lo tanto existe una largamente sentida necesidad en la técnica de desarrollar un procedimiento eficiente y ampliamente aplicable para estimular interacciones específicas entre sustratos no biológicos y sustratos biológicos. Además, existe una continua necesidad de desarrollar procedimientos para dirigir las interacciones entre moléculas y/o células, concretamente en el contexto de la diagnosis y la cromatografía de afinidad.

Para satisfacer esta necesidad, la presente invención se refiere a biomateriales interfaciales que pueden actuar como mediadores en interacciones selectivas entre sustratos biológicos y no biológicos, agentes de unión novedosos que pueden unirse específicamente a un sustrato diana no biológico y a un sustrato diana biológico, y procedimientos para crear y utilizar los mismos en aplicaciones diagnósticas y de cromatografía de afinidad.

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V.G. Recubrimientos No-Ensuciantes

También se describe en la presente memoria, un biomaterial interfacial que comprende de una interfaz no ensuciante, que es un tipo de interfaz de no unión. Los recubrimientos no ensuciantes resultan útiles como tratamiento protector para cualquier sustrato no biológico susceptible de ensuciamiento, incluyendo, pero sin limitarse a equipamiento médico, dispositivos médicos, ropa, y máquinas marinas y artículos de confección.

También se describen en la presente memoria biomateriales interfaciales que crean una interfaz no adhesiva para por consiguiente evitar el ensuciamiento y la corrosión. El término "ensuciamiento" se refiere a un proceso de volverse sucio, contaminado, corroído u obstruido. A la inversa, el término "no ensuciante" se refiere a una cualidad de evitar o minimizar el ensuciamiento. De esta manera, se puede utilizar un biomaterial interfacial no ensuciante para reducir la fijación de patógenos y otros organismos a una superficie, y para reducir las consecuencias estéticas y funcionales del ensuciamiento.

Los recubrimientos anti-ensuciamiento actuales comprenden de químicos tóxicos consumibles y que contaminan el medio ambiente. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de procedimientos para tratar una diversidad de sustratos con un recubrimiento protector no tóxico y de larga duración.

El ensuciamiento incluye las etapas de: (1) fijación a y colonización de una superficie por patógenos, (2) secreción de una matriz extracelular y formación de una biopelícula, y (3) fijación de otros patógenos y/u organismos multicelulares a la biopelícula. De esta manera, un biomaterial interfacial que comprende de una superficie que básicamente no se une a patógenos diana podría reducir el ensuciamiento de manera efectiva.

Un biomaterial interfacial no ensuciante se prepara utilizando una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente a un sustrato no biológico susceptible de ensuciamiento y de una segunda parte de unión que básicamente no se une a un organismo diana que actúa de mediador en el ensuciamiento (por ejemplo, bacterias, hongos o cualquier otro patógeno).

Sustratos que son susceptibles de ensuciamiento y que se pueden proteger utilizando un biomaterial interfacial incluyen, pero no se limitan a dispositivos médicos, textiles, y superficies sometidas a un ambiente acuoso. En cada caso, se puede identificar una primera parte de unión que se una específicamente al sustrato no biológico susceptible de ensuciamiento utilizando los procedimientos de "lavado en batea" descritos en la presente memoria. De manera similar, también se puede identificar mediante "lavado en batea" una segunda parte de unión que se una específicamente a un patógeno sospechoso o a una combinación de patógenos.

Un biomaterial interfacial descrito en la presente memoria también puede comprender de un recubrimiento no ensuciante para dispositivos implantables. Un recubrimiento así podría resultar útil, por ejemplo, para recubrir catéteres venosos centrales utilizados en quimioterapia, soporte ionotrópico y para antibióticos, nutrición intravenosa, monitorización del estado hemodinámica, acceso venoso para exámenes sanguíneos para el diagnóstico, etc. La incidencia de las infecciones adquiridas en el hospital es siete veces mayor en pacientes con dispositivos invasivos como por ejemplo catéteres venosos centrales (Dobbins et al., 1999), y la infección relacionada con catéteres tiene una tasa de mortalidad del 35% (Collin, 1999). Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento confiable para inhibir el ensuciamiento de los catéteres y otros dispositivos implantables.

Las infecciones relacionadas con catéteres pueden implicar al S. epidermis, S. aureus, especies de Bacillus, especies de Corynebacterium, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter, organismos fúngicos (por ejemplo, Candida), y otros agentes infecciosos. Las proteínas huésped (por ejemplo, fibronectina, fibrinógeno, laminina) y las cualidades de la superficie del catéter (por ejemplo, carga, hidrofobicidad) pueden contribuir a la adherencia de agentes infecciosos a la superficie del catéter. De esta manera, un biomaterial interfacial descrito en la presente memoria puede comprender de una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente a un catéter sustrato y de una segunda parte de unión que básicamente no se une a uno o más agentes infecciosos. De esta manera, un biomaterial interfacial así preparado podría evitar la colonización bacteriana y/o fúngica del catéter y reducir por consiguiente la infección relacionada con el
catéter.

También se puede utilizar un biomaterial interfacial no ensuciante para recubrir tela, ropa, y fibras para ropa de origen natural o sintético. Por ejemplo, la ropa destinada a llevase durante mucho tiempo o para su uso en condiciones que son permisivas para el crecimiento bacteriano podrían utilizarse durante más tiempo si estuviesen protegidas por un biomaterial interfacial con propiedades no ensuciantes.

Los biomateriales interfacial no ensuciantes también son útiles para recubrir superficies sometidas a un ambiente acuoso. Tales recubrimientos no ensuciantes pueden minimizar la velocidad de corrosión y otros efectos perjudiciales del funcionamiento. Superficies representativas que pueden ser tratadas incluyen, pero no se limitan a cascos de barco, plataformas de perforación, apilamientos, torres de enfriamiento, dispositivos de retención de balsas, bombas, válvulas, oleoductos, tuberías de conducción de agua, vidrio y otras ventanas de observación transparentes, bóvedas de sónar y elementos de filtración. Por ejemplo, se puede utilizar un recubrimiento no ensuciante para evitar la adherencia de percebes a las superficies requeridas en un ambiente marino.

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V.H. Modulación de una Actividad de un Sustrato Biológico

\quad: En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para modular una actividad de un sustrato biológico, procedimiento que comprende de: (a) recubrir un sustrato no biológico biodegradable con una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al sustrato no biológico biodegradable y de una segunda parte de unión que se une específicamente al sustrato biológico, donde el recubrimiento está libre de acoplamiento; (b) colocar el sustrato no biológico biodegradable recubierto en un sitio diana, donde el sustrato biológico está presente en el sitio diana; y (c) dejar pasar un tiempo suficiente para que el sustrato biológico en el sitio diana se una a los agentes de unión, donde la unión modula la actividad del sustrato biológico.

\quad: Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "modular", "modulación" y "modulado" se refieren todos a un aumento, descenso u otra alteración de cualquiera o todas las actividades químicas y biológicas o propiedades de un sustrato biológico. En una forma de realización, se selecciona un sustrato biológico del grupo que consiste de un tejido, una célula, una macromolécula, y combinaciones de los mismos. En una forma de realización, una célula es una célula endotelial vascular. En otra forma de realización, una célula es una célula endotelial vascular tumoral. En una forma de realización, una macromolécula es un receptor Tie2.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "modulador" se refiere a una segunda parte de unión del procedimiento que se une específicamente al sustrato biológico. En una forma de realización de la invención, un modulador es un agonista de un sustrato biológico. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "agonista" significa una sustancia que sinergiza o potencia la actividad biológica de un sustrato biológico. En otra forma de realización de la invención, un modulador es un antagonista de un sustrato biológico. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "antagonista" o "inhibidor" se refiere a una sustancia que bloquea o mitiga la actividad biológica de un sustrato biológico. En una forma de realización, un modulador se une específicamente al receptor
Tie2.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "sitio diana" se refiere a cualquier célula o grupo de células, in vivo, in vitro o ex vivo. Este término incluye células solas y poblaciones de células. El término incluye pero no se limita a poblaciones de células que comprenden de glándulas y órganos como la piel, hígado, corazón, riñón, cerebro, páncreas, pulmón, estómago y órganos reproductores. También incluye pero no se limita a poblaciones de células mixtas como por ejemplo médula ósea. Adicionalmente, incluye pero no se limita a células anormales como células neoplásicas o tumorales, sea individualmente o como parte de tumores sólidos o metastásicos.

El término "sitio diana" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un sitio destinado a la acumulación de una parte de unión tras su administración a un sujeto. En una forma de realización, un sitio diana es el sitio de una herida y la modulación potencia la cicatrización de la herida. En otra forma de realización, un sitio diana es un sitio angiogénico, incluyendo, pero sin limitarse a un sitio de angiogénesis tumoral, y la modulación inhibe la angiogénesis.

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Ejemplo

Se podrá entender que no todos los Ejemplos a continuación entran dentro del alcance de la invención, en relación a lo cual se hace referencia a las reivindicaciones adjuntas.

Se han incluido los siguientes Ejemplos. Ciertos aspectos de los siguientes Ejemplos se describen en términos de técnicas y procedimientos descubiertos o contemplados por los presentes co inventores para trabajar bien en la práctica de la invención. Los Ejemplos ilustran las prácticas de laboratorio estándares de los presentes co inventores. En vista de la presente descripción y del nivel general de experiencia en la técnica, aquellos expertos entenderán que los siguientes los ejemplos están destinados a ser sólo ejemplares y que se pueden utilizar numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin alejarse del alcance de la técnica de la invención.

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Ejemplo 1

Biblioteca de Péptidos

Se utilizaron tres bibliotecas de péptidos de fagos: (a) una biblioteca que codificaba péptidos del formato X_{6}YX_{6}; (b) una biblioteca que codificaba péptidos del formato X_{6}PX_{6}; y (c) una biblioteca que codificaba péptidos del formato SCX_{16}S.

La biblioteca X_{6}YX_{6} se construyó utilizando secuencias variables que comprendían de 39 nucleótidos ligados al extremo 5' del gen pIII del fago filamentoso M13. Los péptidos producidos por la biblioteca eran secuencias de péptidos 13-mer con un residuo central de tirosina fijo flanqueado por seis aminoácidos aleatorios en cada lado.

Lo que sigue a continuación se proporciona como un esquema de construcción de una biblioteca a modo de ejemplo para la biblioteca X_{6}YX_{6}. Se puede utilizar una estrategia similar para las demás bibliotecas, que también se pueden producir utilizando técnicas bien conocidas en la técnica.

Para producir la biblioteca X_{6}YX_{6}, se construyó un oligonucleótido de secuencia AGTGTGTGCCTCGAGCNNK
NNKNNKNNKNNKNNKTATNNKNNKNNKNN KNNKNNKTCTAGACTGTGCAGT (nº de identidad en la SEQ: 99) en el que el módulo NNKNNKNNKNNKNNKNNKTATNNKNNKNNKNNKNNKNNK (nº de identidad en la SEQ: 100) representa la biblioteca. Las secuencias subrayadas CTCGAG y TCTAGA representan los sitios de endonucleasas de restricción XhoI y XbaI utilizados para clonar la biblioteca dentro del vector fágico. La secuencia TAT en negrita representa un codón de tirosina. N representa mezclas equimolares de A, C, G y T. K representa G y T equimolares.

La biblioteca X_{6}PX_{6} se construyó utilizando el fago filamentoso M13. Los péptidos producidos por la biblioteca fueron secuencias de péptidos 13-mer con un residuo central de prolina fijo flanqueado por seis aminoácidos aleatorios en cada lado.

La biblioteca SCX_{16}S codificaba péptidos 19-mer, donde cada péptido incluía 16 aminoácidos centrales aleatorios, una serina en cada extremo terminal y un único residuo de cisteína. Los péptidos se desplegaron en el extremo amino terminal de la proteína del recubrimiento PIII del fago M13.

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Ejemplo 2

Aislamiento de Péptidos que se Unen Específicamente al Poliestireno

Las bibliotecas X_{6}PX_{6}, X_{6}YX_{6} y SCX_{16}S (descritas en el Ejemplo 1) se seleccionaron para unirse a poliestireno utilizando una placa microtiter de 96 pocillos de afinidad de unión alta (placas de poliestireno COSTAR® disponibles en VWR Scientific de West Chester, Pennsylvania, Estados Unidos de América). Se bloquearon los sitios de unión a proteínas no específicos utilizando 100 \mul de leche en polvo al 5% en tampón fosfato salino más TWEEN® (PBS-T). Se selló la placa y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación a 50 rpm. A continuación se lavaron los pocillos 5 veces con 300 \mul de PBS-T, asegurando que los pocillos no se secaran. Se diluyó la biblioteca en PBS-T y se añadió a una concentración de 10^{10} pfu/ml en un volumen total de 100 \mul. Después de otra hora de incubación a una temperatura ambiente y en agitación a 50 rpm, se retiraron los fagos no unidos mediante 5 lavados de 300 \mul de PBS-T. Los fagos unidos se eluyeron durante 30 minutos a 150 rpm con 3 \mug/\mul de trombina. Tras la elución, se añadieron 1,5 \mul mM de D-fenilalanilo-L-prolilo-L-arginina clorometilcetona (PPACK) y se hicieron diluciones seriadas para determinar las titulaciones.

Para asegurar la producción de soluciones madre de fagos de titulación más alta, los fagos eluídos se añadieron a 5 ml de cultivos de TG1 en fase exponencial sin diluir en medio 2X YT. Se incubó la mezcla durante aproximadamente tres horas en un agitador a 37ºC a 210 rpm. A continuación se recogió el sobrenadante con fagos para determinar la titulación tras centrifugación a 8.500 x g durante 10 minutos. La segunda y tercera rondas de selección se llevaron a cabo de una manera similar a la de la primera ronda, utilizando como entrada el fago amplificado de la ronda
anterior.

Para detectar el fago que se unía específicamente al titanio, se llevaron a cabo ELISAs convencionales utilizando un anticuerpo anti-fago M-13 conjugado con HRP, seguido de la adición del agente cromogénico o-fenilenediamina en peróxido de hidrógeno al 10%. Se determinaron las fuerzas relativas de unión del fago mediante mediciones de absorbancia a 490 nm utilizando un lector de placas microtiter.

Se secuenció el ADN que codificaba los péptidos que se unían específicamente al poliestireno mediante el procedimiento de terminador de cadena utilizando un cebador inverso diseñado según la secuencia pIII. Se colocó la secuencia que codificaba el péptido inserto en el genoma del fago y se tradujo para proporcionar la secuencia de aminoácidos correspondiente desplegada en la superficie del fago.

En la Tabla 3 se listan péptidos representativos que se unen específicamente al poliestireno y se presentan como números de identidad en la SEQ: 1 a 22.

TABLA 3

7

Ejemplo 3

Aislamiento de Péptidos que se Unen Específicamente al Poliuretano

La biblioteca SCX_{16}S (descrita en el Ejemplo 1) se cribó para unirse al poliuretano. Los fagos se detectaron, aislaron, amplificaron y secuenciaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.

Un péptido representativo que se une específicamente al poliuretano es SCYVNGHNSVWVVVFWGVS (nº de identidad en la SEQ: 23).

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Ejemplo 4

Aislamiento de Péptidos que se Unen Específicamente al Ácido Poliglicólico (PGA)

La biblioteca SCX_{16}S (descrita en el Ejemplo 1) se cribó para unirse al ácido poliglicólico. Se lavó repetidamente la malla de ácido poliglicólico (PGA) antes del "lavado en batea" en un exceso de agua.

Antes de añadir los fagos a la estructura de soporte de PGA, se transfirieron los fagos secuencialmente entre las dianas de los pocillos de poliestireno para extraer los fagos que se unían al poliestireno y los fagos de unión no específica de la población. Esta etapa se llevó a cabo en cada ronda de "lavado en batea". También se bloquearon los sitios de unión no específica con BSA al 1% en PBS durante rondas de "lavado en batea" de numeración impar y con leche en polvo al 5% en PBS-T durante rondas de "lavado en batea" de numeración par. La alternancia del BSA y las proteínas bloqueantes de la leche en polvo evitó la supervivencia de los péptidos que se unían específicamente al BSA y a la leche en polvo entre las rondas. Los fagos se detectaron, aislaron, amplificaron y secuenciaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.

En la Tabla 4 se listan péptidos representativos que se unen específicamente al ácido poliglicólico y se presentan como los números de identidad en la SEQ: 37 a 50.

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TABLA 4

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8

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Ejemplo 5

Aislamiento de Péptidos que se Unen al Policarbonato

Las bibliotecas X_{6}YX_{6,} SCX_{16}S, y X_{6}PX_{6} (descritas en el Ejemplo 1) se seleccionaron para unirse al policarbonato. Las hojas de policarbonato se lavaron repetidamente con etanol y agua antes de su uso.

Antes de añadir los fagos a las hojas de policarbonato, se transfirieron los fagos secuencialmente entre las dianas de los pocillos de poliestireno para extraer los fagos que se unían al poliestireno y los fagos de unión no específica de la población. Esta etapa se llevó a cabo en cada ronda de "lavado en batea". También se bloquearon los sitios de unión no específica con BSA al 1% en PBS durante rondas de "lavado en batea" de numeración impar y con leche en polvo al 5% en PBS-T durante rondas de "lavado en batea" de numeración par. La alternancia del BSA y las proteínas bloqueantes de la leche en polvo evitó la supervivencia de los péptidos que se unían específicamente al BSA y a la leche en polvo entre las rondas. Los fagos se detectaron, aislaron, amplificaron y secuenciaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.

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En la Tabla 5 se listan péptidos representativos que se unen específicamente al policarbonato y se presentan como los números de identidad en la SEQ: 66 a 71.

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TABLA 5

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Ejemplo 6

Aislamiento de Péptidos que se Unen a las Suturas de Nailon

La biblioteca X_{6}YX_{6} (descrita en el Ejemplo 1) se cribó para unirse a suturas de nailon. Las suturas de nailon se lavaron repetidamente con etanol y agua antes de su uso.

Antes de añadir los fagos a las suturas de nailon, se transfirieron los fagos secuencialmente entre las dianas de los pocillos de poliestireno para extraer los fagos que se unían al poliestireno y los fagos de unión no específica de la población. Esta etapa se llevó a cabo en cada ronda de "lavado en batea". También se bloquearon los sitios de unión no específica con BSA al 1% en PBS durante rondas de "lavado en batea" de numeración impar y con leche en polvo al 5% en PBS-T durante rondas de "lavado en batea" de numeración par. La alternancia del BSA y las proteínas bloqueantes de la leche en polvo evitó la supervivencia de los péptidos que se unían específicamente al BSA y a la leche en polvo entre las rondas. Los fagos se detectaron, aislaron, amplificaron y secuenciaron como se ha descrito en el Ejemplo 2. Las secuencias representativas son como sigue:

(números de identidad en la SEQ: 105 a 116):

ssMASMTGGQYMGHsr

ssMASMTGGQWMGHsr

ssSCFYQNVISSSFAGNPWECsr

ssSCNMLLNSLPLPSEDWSACsr

ssSCPFTHSLALNTDRASPGCsr

ssSCFESDFPNVRHHVLKQSCsr

ssSCVFDSKHFSPTHSPHDVCsr

ssSCGDHMTDKNMPNSGISGCsr

ssMASMTGGQWMGHsr

ssSCDFFNRHGYNSGCEHSVCsr

ssSCGDHMTDKNMPNSGISGCsr

ssSCYYNGLVVHHSNSGHKDCsr.

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Ejemplo 7

Aislamiento de Péptidos que se Unen Específicamente al Titanio

La biblioteca SCX_{16}S (descrita en el Ejemplo 1) se cribó para unirse a perlas de titanio. Se lavaron repetidamente perlas de titanio comercialmente puras de aproximadamente 25 \mum de diámetro antes del "lavado en batea" en un exceso de hexanos y etanol para eliminar cualquier sustancia orgánica de la superficie. Se colocaron veinticinco perlas de titanio en placas de poliestireno de 96 pocillos.

Antes de añadir los fagos a las perlas de titanio, se transfirieron los fagos secuencialmente entre las dianas de los pocillos de poliestireno para extraer los fagos que se unían al plástico y los fagos de unión no específica de la población. Esta etapa se llevó a cabo en cada ronda de "lavado en batea". También se bloquearon los sitios de unión no específica con seroálbúmina bovina (BSA) al 1% en tampón fosfato salino (PBS) durante rondas de "lavado en batea" de numeración impar y con leche en polvo al 5% en PBS-T durante rondas de "lavado en batea" de numeración par. La alternancia del BSA y las proteínas bloqueantes de la leche en polvo evitó la supervivencia de los péptidos que se unían específicamente al BSA y a la leche en polvo entre las rondas. Los fagos se detectaron, aislaron, amplificaron y secuenciaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.

En la Tabla 6 se listan péptidos representativos que se unen específicamente al titanio y se presentan como los números de identidad en la SEQ: 24 a 36.

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TABLA 6

1000

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Ejemplo 8

Aislamiento de Péptidos que se Unen al Acero Inoxidable

Las bibliotecas X_{6}HX_{6,} SCX_{16}S, X_{6}YX_{6,} X_{7} y X_{6}NX_{6} (descritas en el Ejemplo 1 y en la Tabla 1) se seleccionaron para unirse al acero inoxidable. Las perlas de acero inoxidable se lavaron repetidamente con etanol y agua antes de su uso.

Antes de añadir los fagos a las perlas de acero inoxidable, se transfirieron los fagos secuencialmente entre las dianas de los pocillos de poliestireno para extraer los fagos que se unían al plástico y los fagos de unión no específica de la población. Esta etapa se llevó a cabo en cada ronda de "lavado en batea". También se bloquearon los sitios de unión no específica con BSA al 1% en PBS durante rondas de "lavado en batea" de numeración impar y con leche en polvo al 5% en PBS-T durante rondas de "lavado en batea" de numeración par. La alternancia del BSA y las proteínas bloqueantes de la leche en polvo evitó la supervivencia de los péptidos que se unían específicamente al BSA y a la leche en polvo entre las rondas. Los fagos se detectaron, aislaron, amplificaron y secuenciaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.

En la Tabla 7 se listan péptidos representativos que se unen específicamente al acero inoxidable y se presentan como los números de identidad en la SEQ: 51 a 65.

TABLA 7

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Ejemplo 9

Aislamiento de Péptidos que se Unen Específicamente a los Condrocitos

La biblioteca SCX_{16}S (descrita en el Ejemplo 1) se cribó para unirse a los condrocitos. Los péptidos de la biblioteca eran del formato SCX_{16}S, que incluyen 16 aminoácidos centrales aleatorios, serinas terminales fijas y un único residuo de cisteína. Los péptidos se despliegan en el extremo amino terminal de la proteína PIII del recubrimiento del fago M13.

Los condrocitos humanos se obtuvieron de Clonetics, Inc. (San Diego, California, Estados Unidos de América) y se hicieron crecer en un pocillo de una placa de poliestireno de 6 pocillos en medio F-12 suplementado (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Missouri, Estados Unidos de América). Todo el procedimiento de "lavado en batea" celular estuvo libre de detergente. La biblioteca se preaclaró de fagos que se unían específicamente o no específicamente al poliestireno incubando los fagos en pocillos de poliestireno durante dos horas antes de añadirlos a la diana celular. En cada ronda, se bloquearon los sitios de unión no específica utilizando leche en polvo al 5% en PBS. Los fagos se detectaron, aislaron, amplificaron y secuenciaron como se ha descrito en el Ejemplo 2. Un péptido representativo tiene la secuencia SCSVYDHKIGRDSFYSGCS (nº de identidad en la SEQ: 101). Un péptido representativo también tiene una preferencia por los condrocitos más de 10 veces mayor que las células endoteliales.

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Ejemplo 10

Aislamiento de Péptidos que se Unen al Colágeno

Se seleccionaron perlas de colágeno (colágeno bovino tipo I y tipo III de BD Biosciences, Bedford, Massachusetts, Estados Unidos de América) de la manera que se ha hecho anteriormente. Se utilizó una biblioteca mixta (X_{7}, X_{6}GX_{6}, X_{6}PX_{6}, X_{6}HX_{6}, X_{6}YX_{6}, X_{6}NX_{6}, SCX_{16}S, SSX_{16}S, y X_{6}CX_{4}CX_{9}) para determinar si hay un motivo estructural del péptido que posea una unión preferencial al colágeno. Al igual que antes, la muestra de colágeno se bloquea con leche o BSA en cada ronda antes de añadir los fagos. Se lavan (5X) las perlas de colágeno con fagos unidos y a continuación se añaden células de E. coli para la posterior infección y amplificación. Se aíslan los fagos de las células y se añaden a una nueva muestra de colágeno y se repite el procedimiento.

Los fagos se detectaron, aislaron, amplificaron y secuenciaron como se ha descrito en el Ejemplo 2.

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Ejemplo 11

Síntesis de un Péptido Marcado que se Une al Poliestireno

Se sintetizó el péptido fluoresceína- FLSFVFPASAWGG (nº de identidad en la SEQ: 1) utilizando un sintetizador de péptidos automatizado según las indicaciones dadas por el fabricante. Tras el clivaje a partir de la resina, los péptidos se lavaron, se purificaron mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), y se caracterizaron mediante espectroscopía de masas. Este péptido posee un dominio de unión al plástico (FLSFVFPASAWGG; nº de identidad en la SEQ: 1) y una sonda fluorescente (fluoresceína).

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Ejemplo 12

Síntesis de un Agente de Unión que Comprende de un Péptido que se une al Poliestireno y de un Péptido que se une a las Células

Se sintetizó el péptido FLSFVFPASAWGGSSGRGD (nº de identidad en la SEQ: 72) utilizando un sintetizador de péptidos automatizado según las indicaciones dadas por el fabricante. Tras el clivaje a partir de la resina, los péptidos se lavaron, se purificaron mediante HPLC, y se caracterizaron mediante espectroscopía de masas. Este péptido posee un dominio de unión a las células (RGD; nº de identidad en la SEQ: 75) y un domino de unión al plástico (FLSFVFPASAWGG; nº de identidad en la SEQ: 1).

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Ejemplo 13

Síntesis de un Agente de Unión que Comprende de un Péptido que se une al Titanio y de un Péptido que se une a las Células

Se sintetizó el péptido SCSDCLKSVDFIPSSLASSRGD (nº de identidad en la SEQ: 103) utilizando un sintetizador de péptidos automatizado según las indicaciones dadas por el fabricante. Tras el clivaje a partir de la resina, los péptidos se lavaron, se purificaron mediante HPLC, y se caracterizaron mediante espectroscopía de masas. Este péptido posee un dominio de unión a las células (RGD; nº de identidad en la SEQ: 75) y un domino de unión al titanio (SCSDCLKSVDFIPSSLASS; nº de identidad en la SEQ: 27).

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Ejemplo 14

Recubrimiento de Poliestireno con un Péptido de unión

Se bañó un trozo de poliestireno en una solución acuosa de un agente de unión que comprende de un péptido que se une específicamente al poliestireno (por ejemplo, cualquiera de los números de identidad en la SEQ: 1 a 22). A continuación se lavó el poliestireno con grandes cantidades de PBS a pH 7,4 y a continuación se secó. Se observó una disminución el ángulo de contacto desde 70º a 28º, lo que indicaba que el péptido de unión estaba recubriendo la superficie del poliestireno.

Procedimientos adicionales para aplicar un péptido de unión o un agente de unión en un sustrato no biológico incluyen el cepillado y el rociado de una solución que comprende de una parte de unión o agente de unión. También se puede recubrir un sustrato no biológico con un material de sacrificio soluble, a continuación se recubre con la parte de unión o agente de unión, seguido de la retirada del material de sacrificio para proporcionar un patrón. Se pueden encontrar procedimientos representativos para utilizar un material de sacrificio en Clark et al. (2001) J Am Chem Soc 123:7677-7682, entre otros lugares.

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Ejemplo 15

Aplicación de un Agente de Unión a un Poliestireno Utilizando la Tecnología de "Dip-Pen"

Se diluyeron péptidos que se unen específicamente al poliestireno, o a agentes de unión que comprenden de un péptido que se une específicamente al poliestireno, a una concentración de 25 mg/ml en una solución de 90 partes de PBS a pH 7,4 y 10 partes de dimetil sulfóxido (DMSO). A continuación se estructuraron las soluciones por duplicado sobre distintos pocillos de una placa de poliestireno para cultivo de tejidos de 12 pocillos utilizando un formador de matrices con un "pin" (Cartesian Technologies, Inc. de Irvine, California, Estados Unidos de América). Se preparó una matriz de 10 x 10 de islas aplicando cien puntos, cada uno de aproximadamente 40 \mum de diámetro, con un espaciado vertical y horizontal de 500 \mum. Se aplicó un patrón lineal con una matriz de 400 puntos de espaciado horizontal de 70 \mum y espaciado vertical de 750 \mum.

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Ejemplo 16

Preparación de un Biomaterial Interfacial para el Cultivo de Células

Se preparó una solución de 25 mg/ml utilizando un agente de unión que comprende de la secuencia peptídica RGDFLSFVFPASAWGG (nº de identidad en la SEQ: 72) en una mezcla de 90 partes de PBS a pH 7,4 y 10 partes de DMSO. Se añadieron cincuenta (50) \mul de solución de agente de unión a cada una de las tres placas microtiter de poliestireno de 96 pocillos durante 1 hora. En otros 3 pocillos, se añadieron 50 \mul de un péptido control FLSFVFPA
SAWGG (nº de identidad en la SEQ: 1) marcado con 25 mg/ml de fluoresceína. Los pocillos se lavaron tres veces con PBS y se bloquearon los sitios de unión no específica de la proteína con BSA estéril filtrada (3% en PBS) durante 30 minutos en agitación a 25 rpm. Como control negativo, se bloquearon 3 pocillos adicionales con la solución de BSA y no contenían un péptido de unión al poliestireno o un agente de unión que comprende de un péptido que se une al poliestireno. Tras 4 lavados con PBS, se sembraron en cada pocillo células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs) en medio EBM suplementado. Se monitorizó la adhesión y diseminación de las células mediante microscopía ligera tras cultivarlas durante 1 hora, 2 horas, ó toda la noche. Los pocillos recubiertos con el agente de unión que comprendía de la nº de identidad en la SEQ: 72 mostró una adhesión celular y una diseminación celular aumentadas en comparación con los pocillos recubiertos con un péptido que se unía específicamente al poliestireno pero que carecía de dominio de unión a las células, o con células sin recubrimiento.

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Ejemplo 17

Aislamiento de un Anticuerpo Monocatenario para el Receptor Tie2

Se preparó ARNm de esplenocitos de ratón inmunizados con el dominio extracelular de Tie2 humana. Un conjunto de cebadores específicos para las regiones variables de la cadena pesada y ligera expresadas en linfocitos B murinos se utilizó para la transcripción inversa y la amplificación de estos fragmentos de anticuerpos. Se juntaron los genes de la cadena pesada y ligera con un conector flexible para formar un anticuerpo monocatenario (scFv). Se clonaron Los anticuerpos monocatenarios dentro del vector fagémido pCANTAB 5E (Amersham Biosciences, Piscataway, Nueva Jersey, Estados Unidos de América), permitiendo que se expresaran como proteínas de fusión en la superficie del fago. Se llevó a cabo la selección de los clones de los fagos que se unían al receptor Tie2 utilizando el dominio extracelular del receptor Tie2 purificado (ExTek). Durante la selección iterativa, los niveles de unión a la proteína ExTek señalizada de los clones de los fagos seleccionados acumulados aumentaron con cada ronda de selección, según se midió mediante ELISA, y parecieron estancarse mediante la segunda ronda. La unión de estos clones de fagos seleccionados a una proteína de control no relacionada y al agente de bloqueo se mantuvo insignificante a lo largo de toda la selección iterativa.

Se recogieron clones individuales de los pools seleccionados de la primera y segunda rondas para evaluar la heterogeneidad clonal mediante análisis de la huella genética. Estos estudios mostraron que ya había comenzado a emerger una especie dominante mediante la ronda 2. Por consiguiente, los análisis siguientes se restringieron a los clones más heterogéneos aislados del pool seleccionado de la ronda 1.

Se sometieron a ensayo los clones individuales del pool seleccionado de la Ronda 1 para verificar su afinidad por Tie2 y por los controles. Los clones representativos mostraron una unión específica a un dominio extracelular del receptor Tie2 purificado (ExTek) pero no a un dominio extracelular del receptor tirosina quinasa Fms purificado (ExFms) estrechamente emparentado. Se utilizó un clon de no unión (1C8) como control negativo.

También se sometieron a ensayo estos clones mediante ELISA celular para verificar su capacidad de reconocer el Tie2 expresado en la superficie de 293 células. Se identificaron numerosos clones que se unían a las 293 células establemente transfectadas para expresar Tie2. Estos clones no se unían a las 293 células parentales sin receptor Tie2.

Se expresaron anticuerpos monoclonales solubles en una cepa no supresora y se purificaron de los extractos periplásmicos utilizando un anticuerpo anti- marcador del extremo C-terminal del péptido E en el scFv soluble. Este sistema produce scFv puro en cantidades suficientemente altas como para un análisis molecular detallado (> 500 \mug del extracto periplásmico de un litro de bacterias).

Los experimentos adicionales demostraron que uno de estos scFv, 1B1, era capaz de inhibir la activación del receptor Tie2 en EC según se midió por su capacidad de inhibir la fosforilación de Tie2 mediada por la Angiopoyetina-1 (Ang-1) y la protección de la Ang1 de la aptosis inducida por TNF. Tales anticuerpos se pueden convertir en biomateriales interfaciales de modificación de la función (IFBMs). Los demás scFvs no mostraron ningún efecto sobre la fisiología del Tie2, lo que sugiere que estos anticuerpos pueden resultar útiles como módulos de afinidad del IFBM.

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Ejemplo 18

Adhesión de un Polipéptido a un Poliestireno

La fuerza de adhesión y modo de unión dependen del IFBM y del sustrato. Para caracterizar y cuantificar las fuerzas de adhesión entre los IFBMs y los sustratos sintéticos y biológicos, se utilizó un espectrómetro de fuerza de avanzada tecnología que utiliza una plataforma flexible de tipo piezoeléctrico de alta precisión equipada con un sensor de desplazamiento capacitivo con una resolución de posición de aproximadamente 0,5 nm. Se utilizó un péptido que se unía al poliestireno de la biblioteca de péptidos X_{6}YX_{6} (un péptido terminado en cisteína que contiene el dominio de unión al poliestireno en dirección hacia delante; CGSSLVGLHSYWSSPFF; nº de identidad en la SEQ: 117). A continuación se unieron los péptidos terminados en cisteína al cantilever de un microscopio de fuerza atómica (AFM) recubierto con oro incubando el cantilever en una solución del péptido (1 mg/ml). Se llevaron a cabo las mediciones de fuerza de despegado en solución tampón PBS en un equipo MultiMode AFM (Digital Instruments, en la actualidad Veeco Instruments, Inc. Woodbury, Nueva York, Estados Unidos de América) mediante la unión repetida de una superficie de poliestireno con la punta del cantilever modificada a una velocidad de 300 nm/seg. La fuerza de adhesión media para el péptido fue de aproximadamente 300 pN.

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Ejemplo 19

Recubrimientos Citofóbicos

Una vez que se identificaron las secuencias de los péptidos, se utilizó la síntesis de péptidos en fase sólida automatizada siguiendo los protocolos estándares 9-fluorenilmetiloxicarbonil (FMOC) para producir un péptido de adhesión al poliestireno (FFPSSWYSHLGVL; nº de identidad en la SEQ: 18) con un marcador polietilén glicol (PEG) en el C-terminal (PEG de peso molecular 2.500). Se seleccionó el PEG como el segmento para repeler a las células de un biomaterial interfacial puesto que es bien sabido que inhibe/evita la adhesión y dispersión de las células. Se recubrió una muestra cuadrada de poliestireno de 4 cm^{2} con el biomaterial interfacial no ensuciante (1 mg/ml en PBS/DMSO al 90%/10% a pH = 7,4; durante toda la noche). El poliestireno recubierto con IFMB fue posteriormente lavado con un exceso de PBS a pH 7,4. Las mediciones del ángulo de contacto en el poliestireno tratado y no tratado correspondiente confirmaron que el biomaterial interfacial recubría la superficie.

Para demostrar que el péptido multifuncional o el biomaterial interfacial (IFBM) FFPYSHLGVLSSGPEG (nº de identidad en la SEQ: 104) puede cubrir una superficie y evitar o reducir la adhesión de las células, determinamos si los fibroblastos dérmicos de un humano adulto (NHDFs) o las células endoteliales del cordón umbilical humano (HUVECs) se adherirían al poliestireno recubierto con IFBM. Primero, se preparó una solución de 1,0 mg/ml de FFPYSHLGVLSSG-PEG (nº de identidad en la SEQ: 104) en agua. Se añadió la solución a los pocillos de una placa de cultivo de poliestireno de 96 pocillos y se incubó a 50ºC durante toda la noche. A continuación se lavaron los pocillos dos veces con PBS antes de sembrarlos con 300 \mul de cualquiera de los dos tipos de células. También se sembraron los fibroblastos humanos y las células endoteliales en poliestireno no tratado (N=3) y poliestireno recubierto con péptido (no pegilado) (N=3). Después de incubarlos toda la noche a 37ºC, se lavaron los pocillos 5 veces en exceso de PBS, a continuación se fijaron en etanol y se tiñeron con eosina Y para el conteo de células y visualización al microscopio óptico. Tanto las células NHDF como las HUVEC perdieron su morfología redondeada, se dispersaron y se adhirieron al plástico control no tratado. A mayor resolución, el arrugamiento de la membrana marcada resulta evidente. Las NHDF ó HUVECs sembradas en el poliestireno tratado mantienen una morfología redondeada y no se adhieren con fuerza a la superficie. Los estudios de conteo de células muestran que la adhesión disminuye sustancialmente y que el número de células se reduce drásticamente cuando el poliestireno está recubierto con FFPYSHLGVLSSG-PEG (nº de identidad en la SEQ: 104).

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Ejemplo 20

Determinación de un Antígeno de Unión utilizando la Técnica tipo "Sándwich"

Se lavaron tubos de polipropileno (12 mm x 75 mm) recubiertos con antígenos tres veces con NaCl al 0,9% que contiene TWEEN®-20 al 0,5% antes de su uso. Se añaden a cada tubo 200 \mul de un estándar de un antígeno o una muestra desconocida. Se tapan los tubos y se incuban a temperatura ambiente durante 3 horas. Después, se aspiran los tubos y a continuación se lavan 3 veces con NaCl al 0,9% que contiene TWEEN®-20 al 0,5% como se ha indicado anteriormente. Se añaden a cada tubo 200 \mul del anticuerpo marcado con biotina diluido apropiadamente, y se incuban los tubos durante toda la noche a 4ºC. Tras la incubación, se aspiran y se lavan los tubos 3 veces con NaCl al 0,9% que contiene solución TWEEN®-20 al 0,5%. Tras el lavado, se añaden a cada tubo 200 \mul de una disolución apropiada de avidina marcada con HRP, y se incuban los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos a 60 minutos, se aspiran y a continuación se lavan como se ha indicado anteriormente. Se determina la actividad enzimática en la fase soluble añadiendo a cada tubo 1 ml de tampón fosfato de sodio 0,033 M a pH 6,6 que contiene 5,4 mM de o-fenilenediamina dihidrocloro y H_{2}O_{2} al 0,03% a intervalos programados. Cuando la intensidad de color se considera adecuada (de 15 a 30 minutos), se interrumpe la reacción enzimática y se mide la absorbancia a una longitud de onda
apropiada.

Cuando se utiliza avidina marcada con fosfatasa alcalina en lugar de avidina marcada con HPR, la actividad enzimática en la fase soluble se determina añadiendo 1 ml de tampón carbonato de sodio 0,05 M a pH 9,8 que contiene 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato y 1 mM de MgCl_{2}. Tras un período de incubación apropiado, se interrumpe la reacción con 100 \mul de NaOH 1N y se mide la absorbancia a 400 nm.

Los inmunoensayos de enzimas realizados en placas microtiter se llevan a cabo básicamente de la misma manera descrita anteriormente. Los ensayos de enzimas se llevan a cabo utilizando 250 \mul de la solución sustrato y se interrumpen con 50 \mul de NaOH 1N. La intensidad del color se puede estimar cualitativamente o determinar cuantitativamente mediante un análisis espectrofotométrico de los contenidos de cada pocillo de la placa microtiter utilizando una microcubeta de 250 \mul.

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Patente estadounidense nº 4,208,479

Patente estadounidense nº 4,228,237

Patente estadounidense nº 4,230,797

Patente estadounidense nº 4,244,946

Patente estadounidense nº 4,253,995

Patente estadounidense nº 4,279,992

Patente estadounidense nº 4,282,287

Patente estadounidense nº 4,298,685

Patente estadounidense nº 4,378,224

Patente estadounidense nº 4,551,482

\newpage

Patente estadounidense nº 4,839,293

Patente estadounidense nº 4,960,423

Patente estadounidense nº 5,147,631

Patente estadounidense nº 5,088,499

Patente estadounidense nº 5,223,409

Patente estadounidense nº 5,292,362

Patente estadounidense nº 5,490,840

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Patente estadounidense nº 5,510,103

Patente estadounidense nº 5,512,131

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Patente estadounidense nº 5,702,892

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Patente estadounidense nº 5,811,392

Patente estadounidense nº 5,811,512

Patente estadounidense nº 5,811,515

Patente estadounidense nº 5,817,757

Patente estadounidense nº 5,817,879

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Patente estadounidense nº 5,855,900

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Patente estadounidense nº 6,015,881

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Patente estadounidense nº 6,214,553

Patente estadounidense nº 6,221,018

Patente estadounidense nº 6,225,447

Patente estadounidense nº 6,231,834

Patente estadounidense nº 6,245,318

Patente estadounidense nº 6,254,852

Patente estadounidense nº 6,280,760

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\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante es solamente para conveniencia del lector. La misma no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha tenido mucho cuidado durante la recopilación de las referencias, no deben excluirse errores u omisiones y a este respecto la OEP se exime de toda responsabilidad. Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5856308 A: \bullet US 5650489 A

\bullet US 5635482 A: \bullet US 5858670 A

\bullet US 5292362 A: \bullet US 6180348 B

\bullet US 6280760 B: \bullet US 5756291 B

\bullet US 6140127 B: \bullet US 6168912 B

\bullet US 4960423 B: \bullet US 5738996 B

\bullet US 4378224 B: \bullet US 6174708 B

\bullet US 5948635 A, Kay: \bullet US 6057098 A

\bullet US 5948DI35 A, Kay: \bullet US 5922254 A

\bullet US 6180239 B: \bullet US 5840479 A

\bullet US 6048623 B: \bullet US 5780225 A

\bullet US 5512131 A: \bullet US 5702892 A

\bullet US 5776748 A: \bullet US 5667988 A

\bullet WO 0056375 A: \bullet US 6214553 B

\bullet US 5651991 A: \bullet US 5747334 A

\bullet US 5858410 A: \bullet US 5498538 A

\bullet US 4551482 A: \bullet US 5264563 A

\bullet US 5714166 A: \bullet US 5824483 A

\bullet US 5510103 A: \bullet US 6225447 B

\bullet US 5490840 A: \bullet US 5580717 B

\bullet US 5855900 A: \bullet US 5702892 B

\bullet US 6214375 B: \bullet US 6068829 A

\bullet US 6200598 B: \bullet US 6086829 A

\bullet US 6197333 B: \bullet US 6060582 A

\bullet US 5922545 A: \bullet US 6180084 A

\bullet US 6015561 A: \bullet WO 9810795 A

\bullet US 6015881 A: \bullet WO 0109611 A

\bullet US 6031071 A: \bullet US 6245318 B

\bullet US 4244946 A: \bullet US 6231834 B

\bullet US 6184344 B: \bullet US 6221018 B

\bullet US 5811392 A: \bullet US 5088499 B

\bullet US 5811512 A: \bullet US 6254852 B

\bullet US 5578629 A: \bullet US 5147631 B

\bullet US 5817879 A: \bullet US 5928627 A

\bullet US 5817757 A: \bullet US 4839293 A

\bullet US 5811515 A: \bullet US 6429015 B

\bullet US 5874542 A, Rockwell: \bullet US 6428955 B

\bullet US 5977322 A: \bullet US 4298685 A, Parikh

\bullet US 5837243 A: \bullet US 4282287 A

\bullet US 5840300 A: \bullet US 4279992 A

\bullet US 5952087 A: \bullet US 4253995 A

\bullet US 5705177 A: \bullet US 4230797 A

\bullet US 4378224 A: \bullet US 4228237 A

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\bullet EP 0439095 A: \bullet US 4205058 A

\bullet EP 0712621 A: \bullet US 4960423 A

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\bullet US 6107059 A: \bullet US 5088499 A

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<110> Duke University

{}\hskip1cm Grinstaff, Mark W.

{}\hskip1cm Kenan, Daniel J.

{}\hskip1cm Walsh, Elisabeth B.

{}\hskip1cm Middleton, Crystan

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<120> BIOMATERIALES INTERFACIALES

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<130> 180/143/2

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<150> US 60/331,843

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<151> 2001-11-20

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<160> 117

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 1

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\hskip0,8cm

13

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<210> 3

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 3

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\hskip0,8cm

14

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<210> 4

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 4

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15

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<212> PRT

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16

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17

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18

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19

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20

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21

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22

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<212> PRT

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23

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<210> 13

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<212> PRT

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\hskip0,8cm

24

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<211> 19

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<212> PRT

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<400> 14

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\hskip0,8cm

25

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<210> 15

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 15

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\hskip0,8cm

26

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<210> 16

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 16

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\hskip0,8cm

27

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<210> 17

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 17

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\hskip0,8cm

28

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<210> 18

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<220>

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<221> característica misc

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<222> (13)..(13)

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<223> el residuo 13 (leucina) puede opcionalmente tener unida una fracción de polietilenglicol

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<400> 18

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\hskip0,8cm

29

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<210> 19

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 19

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\hskip0,8cm

30

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<210> 20

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 20

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\hskip0,8cm

31

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<210> 21

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 21

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\hskip0,8cm

32

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<210> 22

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 22

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\hskip0,8cm

33

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<210> 23

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<211> 19

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<212> PRT

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\hskip0,8cm

34

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<210> 24

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<211> 19

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<212> PRT

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\hskip0,8cm

35

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<210> 25

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\hskip0,8cm

36

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\hskip0,8cm

37

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<210> 27

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\hskip0,8cm

38

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<210> 28

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<211> 19

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\hskip0,8cm

39

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<210> 29

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<211> 18

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<212> PRT

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\hskip0,8cm

40

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<210> 30

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 30

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\hskip0,8cm

41

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<210> 31

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 31

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\hskip0,8cm

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<210> 32

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 32

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\hskip0,8cm

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<210> 33

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 33

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\hskip0,8cm

44

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<210> 34

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 34

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\hskip0,8cm

45

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<210> 35

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 35

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\hskip0,8cm

46

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<210> 36

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 36

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\hskip0,8cm

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<210> 37

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 37

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\hskip0,8cm

48

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<210> 38

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> constructo sintético

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<400> 38

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\hskip0,8cm

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

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<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

67

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

69

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(70)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N es A, G, C, ó T

\hskip1cm

K es A, G, C, ó T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(39)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N es A, C, G, ó T

\hskip1cm

K es A, C, G, ó T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

nnknnknnkn nknnknnkta tnnknnknnk nnknnknnk

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

127

Claims

1. Biomaterial interfacial que comprende de una pluralidad de agentes de unión, donde cada agente de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana no biológico, y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana biológico, donde cada agente de unión comprende de dos o más especificidades de unión, donde la pluralidad de agentes de unión son capaces de definir una interfaz entre el sustrato diana no biológico y el sustrato diana biológico, y donde la primera parte de unión comprende de un péptido y la segunda parte de unión comprende de un péptido.

2. Biomaterial interfacial según la reivindicación 1, donde la pluralidad de agentes de unión comprenden de una pluralidad de agentes de unión idénticos o de agentes de unión no idénticos.

3. Biomaterial interfacial según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente de un conector, donde el conector une una primera parte de unión y una segunda parte de unión.

4. Biomaterial interfacial según la reivindicación 1, donde el sustrato diana no biológico comprende de un sustrato seleccionado de entre un polímero sintético, un plástico, un metal, un óxido metálico, un óxido no metálico, un material de silicona, un material cerámico, un fármaco, un portador de fármaco, y combinaciones de los mismos.

5. Biomaterial interfacial según la reivindicación 1, donde el sustrato diana biológico comprende de un sustrato seleccionado de entre un tejido, una célula, una macromolécula, y combinaciones de las mismas.

6. Biomaterial interfacial según la reivindicación 1, donde la primera parte de unión comprende de un péptido que comprende de una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre cualquiera de los números de identidad en la SEQ: 1-71.

7. Biomaterial interfacial según la reivindicación 1, donde la primera parte de unión se une a un metal que comprende de titanio, acero inoxidable, y una combinación de los mismos.

8. Biomaterial interfacial según la reivindicación 1, donde la primera parte de unión se une a un plástico que comprende de poliestireno, policarbonato, poliuretano, y una combinación de los mismos.

9. Procedimiento para preparar un biomaterial interfacial según la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento de:

(a): poner en contacto un sustrato no biológico con una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al sustrato no biológico y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana biológico, y donde la pluralidad de agentes de unión se quedan unidos a un sustrato no biológico mediante una especificidad de unión de la pluralidad de agentes de unión para el sustrato no biológico;

(b): poner en contacto el sustrato no biológico, que tiene una pluralidad de agentes de unión unidos al mismo, con una muestra que comprende de un sustrato diana biológico; y

(c): dejar pasar un tiempo suficiente para que el sustrato diana biológico se una a la pluralidad de agentes de unión mediante una especificidad de unión de la pluralidad de agentes de unión para el sustrato diana biológico.

10. Procedimiento para aplicar un biomaterial interfacial según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, procedimiento que comprende de:

(a): poner en contacto un sustrato no biológico con una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al sustrato no biológico y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un sustrato diana biológico, y donde la pluralidad de agentes de unión se quedan unidos al sustrato no biológico mediante una especificidad de unión de la pluralidad de agentes de unión para el sustrato no biológico;

11. Procedimiento según la reivindicación 10, donde dicho procedimiento es para el cultivo de células, donde dicho sustrato diana biológico son células, y cuyo procedimiento comprende adicionalmente de (d) cultivar las células.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, donde el biomaterial interfacial se aplica en un patrón para formar una matriz biológica.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, donde la aplicación cosiste en una impresión por "dip-pen".

14. Matriz biológica preparada mediante el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13.

15. Biomaterial interfacial según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en un procedimiento que comprende de:

(a): poner en contacto un sustrato no biológico con una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al sustrato no biológico y de una segunda parte de unión que se une específicamente a un sustrato biológico, y donde la pluralidad de agentes de unión se quedan unidos al sustrato no biológico mediante una especificidad de unión de la pluralidad de agentes de unión para el sustrato no biológico;

(c): dejar pasar un tiempo suficiente para que el sustrato diana biológico se una a la pluralidad de agentes de unión mediante una especificidad de unión de la pluralidad de agentes de unión para el sustrato diana biológico;

Donde dicho procedimiento es para aplicar un biomaterial interfacial a un dispositivo que comprende de un implante, donde dicho sustrato no biológico está contenido en un implante, y donde dicho sustrato diana biológico son células; y donde en la etapa (b) el implante, que tiene una pluralidad de agentes de unión unidos al mismo, está en contacto con las células, estimulando la unión de las células a la pluralidad de agentes de unión en el implante.

16. Sustrato no biológico que comprende de una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente a un sustrato no biológico y de una segunda parte de unión que se une específicamente a las células, donde la primera parte de unión comprende de un péptido y la segunda parte de unión comprende de un péptido, donde la pluralidad de agentes de unión se quedan unidos al sustrato no biológico mediante una especificidad de unión de la pluralidad de agentes de unión para el sustrato no biológico al formar un sustrato no biológico recubierto; para su uso en un procedimiento de modulación de la actividad de un sustrato biológico, comprendiendo dicho uso de:

(a): colocar el sustrato no biológico recubierto en un sitio diana, donde el sustrato biológico está presente en el sitio diana; y

(b): dejar pasar un tiempo suficiente para que el sustrato biológico se una a la pluralidad de agentes de unión en el sustrato no biológico recubierto en el sitio diana, donde la unión modula la actividad del sustrato biológico.

17. Sustrato según la reivindicación 16, donde la actividad modulada comprende de la angiogénesis o cicatrización de una herida.

18. Procedimiento o sustrato según cualquiera de las reivindicaciones 10, 12, 13, 16 ó 17, donde el sustrato biológico se selecciona de entre el grupo que consiste de un tejido, una célula, una macromolécula y combinaciones de las mismas.

19. Procedimiento o sustrato según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, donde se utiliza un conector para unir una primera parte de unión a una segunda parte de unión.

20. Fármaco no biológico, o portador no biológico del fármaco que comprende de una pluralidad de agentes de unión, donde cada uno de la pluralidad de agentes de unión comprende de una primera parte de unión que se une específicamente al fármaco o al portador del fármaco y de una segunda parte de unión que se une específicamente a una célula diana, donde la primera parte de unión comprende de un péptido y la segunda parte de unión comprende de un péptido, para su uso en un procedimiento para la administración de un fármaco a un sujeto, comprendiendo el uso de:

(a): administrar el fármaco a un sujeto; y

(b): dejar pasar un tiempo suficiente para que la pluralidad de agentes de unión se una a la célula diana.