ES2229499T3 - Implantes recubiertos con peptidos y procedimiento para su fabricacion. - Google Patents
Implantes recubiertos con peptidos y procedimiento para su fabricacion.Info
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Abstract
Implante, adecuado para diferentes órganos humanos o animales, compuesto esencialmente por una matriz portadora y un recubrimiento peptídico que reviste a esta matriz, que comprende, para la estimulación dirigida de la adherencia de células del cuerpo humano o animal, péptidos idénticos o diferentes que poseen secuencias que reconocen puntos de unión en los receptores de las integrinas responsables de la adhesión, en células humanas o animales, en el que la matriz portadora tiene en su superficie grupos reactivos capaces de fijación que, adicionalmente, son capaces de formar con los correspondientes grupos reactivos funcionales de dicha capa peptídica, una unión covalente, caracterizado porque los mencionados péptidos dispuestos en la superficie del implante se seleccionan y se disponen localmente de manera que, gracias a su actividad estimulante de la adhesión celular, relacionada con las estructuras correspondientemente diferentes, se corresponden de forma específica con el patrón de integrina complementario, diferente y natural de las células del tejido que le son adyacentes en las respectivas regiones, en las cuales se debe introducir el implante, lo que tiene como consecuencia la presencia de un patrón de recubrimiento bioactivo, selectivo y localmente diferenciado de la superficie del implante.
Description
Implantes recubiertos con péptidos y
procedimiento para su fabricación.
La invención se refiere a implantes de tipo
general para el cuerpo humano y animal, recubiertos con péptidos,
capaces de mediar de manera selectiva en la adhesión de células
específicas en el entorno correspondiente del implante. En
particular, la invención se refiere a implantes recubiertos con
péptidos RGD y a un procedimiento para su fabricación.
La invención se basa en el principio de la
estimulación de la adherencia dirigida a las células de especies
celulares seleccionadas sobre recubrimientos superficiales de
biomateriales, en general, e implantes, en particular, para
proporcionar una integración histoselectiva, acelerada y reforzada
de los mismos tras la aplicación quirúrgica en el correspondiente
tejido.
De esta forma, resulta posible recubrir y poner a
disposición diversas partes superficiales de un implante con
diversos péptidos que fomentan la adherencia celular, en especial,
péptidos RGD, que toman en consideración el entorno tisular
específico en el que se incorporará el implante.
Así, en lo que respecta a la "Ingeniería de los
Tejidos", resulta posible la generación de órganos biohídridos
"inteligentes" gracias a su auto-organización,
que portan la información biológica necesaria para una regeneración
de órganos, mediante la activación dirigida de distintas especies
celulares por medio de diferentes péptidos en diversas regiones de
la superficie del implante.
La expresión "péptidos según la invención"
comprende, en lo sucesivo, cuando no se indique lo contrario o
aspectos adicionales, todos los péptidos capaces de mediar en la
adherencia celular. Entre ellos, se hace especial referencia a
aquéllos que contienen los aminoácidos arginina (R), glicina (G) y
ácido aspártico (D) de manera consecutiva (péptidos RGD). Más
adelante, se mencionan ejemplos de péptidos RGD adecuados y de
péptidos apropiados que no contienen RGD. Se incluyen,
adicionalmente, los correspondientes péptidos que no contienen la
secuencia RGD, pero que, no obstante, influyen sobre la adherencia
celular. En el sentido más amplio, la invención comprende también
compuestos no peptídicos que exhiben, cualitativamente, la misma
actividad biológica que los citados compuestos peptídicos.
Como biomateriales o implantes acordes con la
invención se designan materiales que se pueden incorporar al cuerpo
humano o animal con el fin de restaurar la función de un tejido
natural que haya sufrido una lesión funcional. A los mismos
pertenecen, por ejemplo, endoprótesis de cadera, articulaciones
artificiales de la rodilla, implantes de mandíbula, sustitutos de
dedos de los pies, sustitutos de la piel, prótesis vasculares,
marcapasos cardiacos, válvulas cardiacas artificiales, implantes de
mama, "stents", catéteres y "shunts" (anastomosis o
cortocircuitos).
El comportamiento de integración de los implantes
en el cuerpo sigue siendo problemático. La integración tisular de
los materiales se produce, a menudo, de forma demasiado lenta e
incompleta para lograr una estabilidad mecánica de la unión
tejido/biomaterial suficiente para la funcionalidad. Responsable
causal es, a menudo, la naturaleza de la superficie del implante
que, debido a su insuficiente compatibilidad entre las superficies
limítrofes o biotolerancia, impide un depósito activo de tejido o
células sanas circundantes. Ello dificulta la formación de una capa
de unión estable entre el tejido y el implante, conduciendo, por lo
tanto, a una inadecuada integración tisular que tiene como
consecuencia aflojamientos, resorción tisular, infecciones,
inflamaciones, alergias, formación de microtrombos
(re-estenosis). Como consecuencia de estos
problemas, son precisas nuevas intervenciones de revisión para
cambiar el implante (por ejemplo, endoprótesis de cadera, implantes
de mandíbula, catéteres o fijadores externos) y, por lo tanto,
nuevas intervenciones quirúrgicas (Malchau y Herberts, 1996,
Prognosis of the Total Hip Arthroplasty, 63, Annual Meeting
of the American Academy of Orthopaedic Surgeons, Atlanta; Hadad
et al., 1996, The Journal of Bone and Joint Surgery,
78-B: 546-549; Collinge et
al., 1996, Pin Tract Infections).
Adicionalmente, y principalmente en las
endoprótesis de cadera, el denominado aflojamiento aséptico del
implante se manifiesta como problemático, ya que en lugar de que se
forme directamente un biomaterial compuesto por células óseas y,
por lo tanto, tejido óseo, aparecen fibroblastos y tejido
conjuntivo que actúan como elementos de interferencia. Como
consecuencia, la prótesis está rodeada por tejido conjuntivo en
lugar de tejido óseo, con lo que la unión de
prótesis-tejido conjuntivo no alcanza la estabilidad
necesaria como para satisfacer las demandas mecánicas de
transferencia de fuerzas requerida en una articulación de cadera
artificial. El resultado puede ser un aflojamiento definitivo de la
prótesis (Pilliar et al., 1986, Clin. Orthop.,
208:108-113) y exige, igualmente, una revisión. Un
ejemplo adicional de la adherencia de tipos de células indeseados a
los implantes está representado por las plaquetas, que pueden
conducir a la formación de microtrombos y, por consiguiente, a una
alteración de la integración del implante (Phillips et al.,
1991, Cell, 65, 359).
Especialmente complejo resulta el déficit de
integración de los biomateriales o implantes en el cuerpo en el
caso de órganos completos de sustitución, puesto que los distintos
tipos de células entran en contacto con el implante y la
integración necesaria debería estar dirigida a las células. Para
evitar los costes extraordinariamente elevados de procedimientos de
trasplante con ayuda de otros pacientes, se tiende, por ejemplo, a
ejecutar la terapia del fallo funcional del hígado, páncreas,
riñones y bazo por medio de los denominados órganos biohíbridos, en
el marco de la "Ingeniería de Tejidos". Estos órganos
biohíbridos están formados por materiales portadores recubiertos
con células vivas y se pueden implantar como unidades funcionales.
Con mucha frecuencia, se incluyen o encapsulan in vitro,
para este fin, células sanas y funcionales en membranas resorbibles
o no resorbibles, que se trasplantan a modo de órganos biohíbridos
artificiales u órganos huecos al paciente (por ejemplo, Lim et
al., 1980, Science 210, 908-912; Altman
et al., 1982, Horm. Met. Res. Suppl. 12,
43-45; Zekorn et al., 1989,
Transplantation Proceedings 21, 2748-2750;
Altman et al., 1982, Horm. Met. Res. Suppl. 12,
43-45; documento EP 0 504 781 B1). En general,
también en este caso aparecen, con mucha frecuencia, problemas de
separación fibrótica, con una reducción asociada del aporte de
nutrientes al trasplante, reacciones inmunológicas de defensa por
la liberación de células desde la cápsula, así como la formación de
coágulos de sangre debido a trombogenicidad de las superficies del
material.
Se conoce la técnica de estimular la integración
tisular de biomateriales/implantes por medio del recubrimiento de
los mismos con péptidos que fomentan la adherencia celular. En este
sentido, se conocen los péptidos que contienen la secuencia de
aminoácidos tripeptídica de arginina-glicina-ácido
aspártico (RGD), o sus análogos no peptídicos y, por otra parte,
péptidos que fomentan la adherencia celular que no contienen la
secuencia RGD (véanse los ejemplos más adelante), o sus análogos no
peptídicos, que actúan, de manera conocida, como componentes
integrales de muchas proteínas, entre otras, de la matriz
extracelular (por ejemplo, colágeno tipo I, fibronectina, laminina,
vitronectina, entactina, osteopontina, trombospondina), o de la
cascada de la coagulación (fibrinógeno, factor de von Willebrand)
como patrón central de reconocimiento para la adherencia de células
eucarióticas (por ejemplo, Pierschbacher y Ruoslahti, 1984,
Nature, 309:30-33; Yamada, 1991, J.
Biol.. Chem., 266:12809-12812). La secuencia
definida según la invención es reconocida y fijada por los
correspondientes receptores de la superficie celular, las
integrinas. Dado que la adherencia de células a las
correspondientes proteínas está mediada por múltiples y diferentes
integrinas, el patrón de expresión de las interinas para una especie
celular actúa de forma decisiva para las propiedades de adherencia
a estas proteínas. El diseño a medida y la síntesis de péptidos, a
menudo de cadena corta, dotados de las correspondientes secuencias,
capaces de fijarse de manera selectiva y específica sólo a
determinadas integrinas, hacen posible la activación dirigida de
solamente aquellas especies celulares que expresan dichas
integrinas. De esta forma , se conocen, por ejemplo, péptidos RGD
que se unen de manera selectiva a los receptores de integrinas
alfa_{v} y, por tanto, son capaces de estimular, preferentemente,
la unión (adhesión) de células portadoras de alfa_{v}beta_{3} /
alfa_{v}beta_{5} (osteoblastos, osteoclastos, células
endoteliales), sin potenciar simultáneamente la adhesión de especies
celulares no deseadas, por ejemplo, plaquetas sanguíneas portadoras
de \alpha_{IIIb}\beta_{3} (Haubner et al., 1996,
Am. Chem. Soc., 118:7461). Otros péptidos RGD muestran, por el
contrario, una acción inversa y fijan, de forma preferente,
receptores de integrinas \alpha_{IIIb}\beta_{3}, de modo
que muestran una selectividad, por ejemplo, para las plaquetas
(Phillips et al., 1991, Cell, 65, 359).
El recubrimiento de las superficies del implante
con péptidos asequibles de forma sintética, definidos según la
invención, es conocido. En este caso, los péptidos se fijan en
mayor o menor medida a la superficie por adsorción, así como por
enlaces covalentes. En el documento DE 1 97 06 667 se describen, por
ejemplo, biomateriales que afectan a materiales de sustitución ósea,
basados sobre un material polímero poroso, que muestran un
recubrimiento de la superficie con péptidos portadores de la
secuencia de aminoácidos RGD, fijada por adsorción. Por el
documento WO 91-05036 se conocen, adicionalmente,
prótesis metálicas, en particular de titanio o de aleaciones de
titanio, que tienen péptidos que pueden mostrar, entre otras,
también las secuencias RGD, unidos a la superficie por uniones
covalentes. Valentín et al., (mayo 1997, Transactions of the
23rd Annual Meeting of the Society for Biomaterials, Nueva Orleáns,
EE.UU.) describen la fijación covalente de péptidos RGD a tornillos
de titanio provistos de una capa intermedia de
etileno-propileno fluorado. Resana et al.
informan sobre el mismo procedimiento en superficies de dióxido de
silicio o de dióxido de titanio recubiertas, por fijación
covalente, con organosilanos aminofuncionales y que, por medio de un
reticulador transversal hetero-bifuncional
estimulan la unión covalente de péptidos RGD que contienen grupos
tiol.
Estas soluciones técnicas no satisfacen, sin
embargo, la demanda de poner a disposición implantes o
biomateriales cuya superficie esté recubierta, de manera dirigida,
con los péptidos definidos según la invención, adaptados de forma
selectiva al correspondiente tipo de células del tejido que rodea el
implante en cuestión.
Sería, por lo tanto, deseable poder modificar los
biomateriales de manera que estén dirigidos, de forma exclusiva o
preferente, a aquellos tejidos o especies celulares con los que,
tras la incorporación del implante en el cuerpo, deben establecer
una función activa, es decir, por ejemplo, células óseas en las
endoprótesis de cadera, o células epiteliales en el caso de
sustituyentes de piel, cabello o piezas dentales, evitándose, a la
vez, las especies celulares que interfieren en este proceso, tales
como, por ejemplo, plaquetas sanguíneas o fibroblastos, que
estimulan la formación de microtrombos o cápsulas de tejido
conjuntivo, en una interacción selectiva con el implante.
Adicionalmente, sería una estrategia deseable y
atractiva recubrir los implantes con aquellos péptidos definidos
según la invención (o con sus análogos no peptídicos) capaces de
estimular de manera exclusiva o, por lo menos, preferente la
adherencia de los tipos de células seleccionadas, portadoras de las
correspondientes integrinas complementarias. De este modo, se podría
lograr la síntesis in vivo acelerada del correspondiente
tejido seleccionado.
En relación con el desarrollo de órganos
biohíbridos completos (piel, vasos sanguíneos, uréteres, vejiga,
esófago, páncreas, hígado, bazo, riñones), sería un avance decisivo
poder recubrir con diferentes péptidos definidos según la invención
y selectivos para las células, diversas partes de la superficie
del implante de manera dirigida para las especies de células
deseadas para ese órgano definido. La organización de los diversos
recubrimientos debería estar definida y coordinada en el espacio
para poder activar diversos procesos celulares in vivo.
La presente invención describe ahora la
posibilidad de la biofuncionalización de biomateriales, en
especial, de implantes para cualquier órgano concebible por medio
de su recubrimiento con péptidos RGD cito- o histoselectivos,
definidos según la invención, que estimulan in vitro la
adherencia predominantemente de aquellas especies celulares que son
responsables de la integración en el tejido del correspondiente
biomaterial. Simultáneamente, no deben estimular in vitro la
adhesión de aquellas especies celulares que actúan en contra de este
proceso. Con el uso de estos recubrimientos, se logra una
integración acelerada y reforzada de los distintos
biomateriales/implantes, con una estabilidad mejorada a largo plazo
tras su incorporación en el cuerpo.
Adicionalmente, con este concepto de
recubrimiento de diversas partes de la superficie del material de
implante, con diferentes péptidos definidos según la invención,
existe la posibilidad de desarrollar órganos biohíbridos
"inteligentes" ("Ingeniería de Tejidos"), portadores de la
información biológica para la activación selectiva de diversos
tejidos o células diana, y que, por lo tanto, se integran en el
cuerpo de manera auto-organizada, reforzando o
permitiendo, por primera vez, la integración tisular.
Objeto de la invención es, por lo tanto, un
implante adecuado para diferentes órganos humanos o animales,
compuesto básicamente por una matriz portadora y un recubrimiento
peptídico, el cual contiene péptidos diferentes o iguales para
estimular la adherencia dirigida de células del cuerpo humano o
animal. Los citados péptidos exhiben secuencias que reconocen los
puntos de fijación en los receptores de integrinas responsables de
la adhesión en células humanas o animales, de forma que la matriz
portadora muestra en su superficie grupos reactivos capaces de
fijarse y que son capaces de formar con los citados grupos
funcionales reactivos de la capa peptídica una unión covalente
estable, que se distingue porque los citados péptidos dispuestos
sobre la superficie del implante se seleccionan y disponen
localmente de tal forma que, gracias a su actividad estimuladora de
la adherencia, determinada por su correspondiente estructura, se
corresponden con los patrones de integrina complementarios
naturales de las células limítrofes del tejido de la región en la
que se incorpora el implante. De este modo, se establece un patrón
de recubrimiento bioactivo, selectivo y localmente diferenciado en
la superficie del implante.
Objeto de la invención es, adicionalmente, un
procedimiento para la fabricación de implantes adecuados para
órganos/tejidos basados en una matriz portadora que posee una
superficie recubierta con péptidos que estimulan la adherencia
celular, en la cual los mencionados péptidos están dispuestos
selectivamente en relación con el patrón de integrinas
complementarias de las células tisulares inmediatamente limítrofes
del implante. Este procedimiento se distingue porque, por medio de
métodos en sí conocidos (i) se determina in vitro la
estructura de los receptores de integrina de las células diana o
del tejido diana en el que se incluirá, in vivo, el implante,
(ii) se seleccionan o sintetizan los péptidos con la
correspondiente estructura complementaria, y (iii) los citados
péptidos se fijan a la superficie en cuestión del implante.
En particular, son objetos de la invención los
procedimientos e implantes/biomateriales con las siguientes
características: los citados péptidos, en especial, péptidos RGD,
están fijados por uniones covalentes, eventualmente a través de
moléculas y/o anclajes moleculares ramificados, que amplían la
superficie, a la molécula del implante; preferentemente, se
utilizan péptidos RGD capaces de estimular células portadoras de
alfa_{v}beta_{3}/alfa_{v}beta_{5}, es decir, en especial la
adhesión de osteoblastos, osteoclastos y células endoteliales y que,
simultáneamente, no estimulan la adhesión de plaquetas sanguíneas o
fibroblastos; como matrices portadoras se utilizan piezas moldeadas
o no moldeadas de cerámica, material polímero o metal, o bien un
órgano u órgano huevo biohíbrido.
Los péptidos definidos según la invención están
concebidos, en el plano molecular, básicamente con los siguientes
componentes:
- -
- un dominio portador de la secuencia de aminoácidos responsable de la adhesión (por ejemplo, la llamada secuencia RGD), que reconoce y fija de forma selectiva una especie celular seleccionada;
- -
- un espaciador, que presenta los dominios de reconocimiento celular y portador de la secuencia de reconocimiento de manera tal que resulte posible, por primera vez, una unión celular desde el punto de vista estérico;
- -
- un anclaje molecular, responsable de la fijación estable del correspondiente derivado peptídico a la superficie del biomaterial o del implante;
- -
- deforma opcional, la adhesión celular se puede potenciar por el acoplamiento adicional de los péptidos definidos según la invención a estructuras moleculares ramificadas (los llamados dendrímeros o tentáculos), que ejercen un efecto ampliador de la superficie, antes de que se produzca la unión a la superficie del biomaterial.
Por superficie del biomaterial o del implante se
debe entender no sólo la superficie inmediata de la matriz
portadora, sino también un recubrimiento adicional, eventualmente
presente, de, por ejemplo, un material polímero, materiales óseos
naturales o artificiales, proteínas o derivados proteicos. Como
matriz portadora resultan adecuados, sobre todo, materiales de
cerámica, metal, materiales polímeros (por ejemplo, PMMA) o,
preferentemente, materiales de sustitución ósea resorbibles.
Especialmente adecuados son los materiales resorbibles o
biodegradables, por ejemplo, de bio-lactidas, en
particular compuestos de D,L-polilactida racémica,
o mezclas resorbibles de fosfato cálcico o hidroxiapatita, que
pueden determinar la restauración del estado original del tejido, y
que son conocidos, por ejemplo, del documento WO 96/36562 o EP 0 543
765. En función del campo de aplicación, puede ser adecuado también
como matriz portadora colágeno o agar.
Por la expresión "órgano biohídbrido" se
entiende, habitualmente, una matriz inorgánica que está recubierta
o unida de alguna forma con células vivas (véase antes). De acuerdo
con la invención, se entiende también una correspondiente
disposición que está exenta de células y que posee solamente los
diferentes péptidos definidos según la invención sobre las partes de
la superficie del implante, capaces de activar selectivamente las
células del entorno cuando se inserta en el tejido defectuoso. La
ventaja de estos órganos biohíbridos acelulares es que se pueden
fabricar de forma económicamente favorable y controlada implantes
biocompatibles "inteligentes", que soportan la información
biológica para la regeneración de un órgano. La integración de estos
órganos biohíbridos en el cuerpo se lleva a cabo, entonces, por
procesos de regeneración propios del organismo por medio de una
auto-organización, por lo que es posible evitar la
aparición de reacciones inmunológicas de defensa como las que se
manifiestan con frecuencia, por ejemplo, con el implante de células
o proteínas ajenas.
De acuerdo con la invención, los implantes se
presentan en forma de cuerpos moldeados o prótesis, en los que el
cuerpo moldeado debe estar adaptado al defecto óseo/tisular. En el
caso de órganos biohíbridos, las prótesis pueden estar formadas
únicamente por membranas o láminas recubiertas con o sin las
células correspondientes y los péptidos definidos según la
invención, o presentar disposiciones como las que se conocen, por
ejemplo, por el documento EP 0 504 781.
Como péptidos a utilizar según la invención, se
contemplan todos los péptidos y sus compuestos con sustituyentes no
peptídicos, que contienen los dominios o secuencia de aminoácidos
responsables de la adherencia celular, y que se pueden fijar a las
superficies de los implantes por medio de sus sustituyentes
peptídicos y no peptídicos. En particular, se toman en
consideración los correspondientes péptidos con una secuencia
RGD.
La siguiente relación de péptidos o compuestos
peptídicos preferidos sólo debe tener carácter de ejemplo y no de
limitación, utilizándose las siguientes abreviaturas:
Asp (D) | = ácido aspártico |
Gly (G) | = glicina |
Arg (G) | = arginina |
Tyr (Y) | = tirosina |
Ser (S) | = serina |
Phe (F) | = fenilalanina |
Lys (K) | = lisina |
DPhe (f) | = D-fenilalanina |
Pro (P) | = prolina |
Leu (L) | = leucina |
Ile (I) | = isoleucina |
Val (V) | = valina |
Glu (E) | = ácido glutámico |
Thr (T) | = treonina |
Ala (A) | = alanina |
RGD
(Arg-Gly-Asp),
GRGD
(Gly-Arg-Gly-Asp),
GRGDY
(Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr),
RGDS
(Arg-Gly-Asp-Ser),
GRGDS
(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser),
RGDF
(Arg-Gly-Asp-Phe),
GRGDF
(Gly-Arg-Gly-Asp-Phe),
ciclo-RGDfK
(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys),
cicló-RGDfKG
(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys-Gly).
LDV
(Leu-Asp-Val),
LGTIPG
(Leu-Gly-Thr-Ile-Pro-Gly),
REDV
(Arg-Glu-Asp-Val),
IKVAV
(Ile-Lys-Val-Ala-Val),
YIGSRG
(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly),
LRE
(Leu-Arg-Glu),
PDSGR
(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg),
DGEA
(Asp-Gly-Glu-Ala),
RYVVLPR
(Arg-Tyr-Val-Val-Leu-Pro-Arg).
Los péptidos definidos según la invención pueden
ser tanto lineales como cíclicos. Los péptidos o secuencias de
péptidos anteriormente mencionados pueden estar también presentes
dentro de péptidos más largos con, en total, 4 a 20 aminoácidos,
dependiendo del péptido seleccionado según la invención. Asimismo,
se comprenden, de acuerdo con la invención, aminoácidos con
configuración D- o L- o que están C- y/o
N-alquilados. Por péptidos cíclicos se entiende,
según la invención, aquellos péptidos que están cerrados a través de
un enlace amida en forma de anillo, sin que en la molécula haya
presentes, preferentemente, grupos carboxilo o amino libres. De
acuerdo con la invención, se prefieren de manera especial péptidos
RGD, en particular aquéllos de la relación anteriormente indicada
y, de ellos, en especial el pentapéptido RGDfK, que es conocido en
su forma cíclica por el documento
DE-OS-1 95 38 741, y que es
específico para osteoblastos, así como el hexapéptido RGDfKG,
presente también en forma cíclica, y que es específico para
trombocitos.
Los correspondientes péptidos definidos según la
invención, lineales y cíclicos, se describen, por ejemplo, en las
siguientes solicitudes de patente: EP 0 632 053, EP 0 655 462, EP 0
578 083, EP 0 770 622, DE 1 95 38 741. De manera especial, resultan
adecuados aquellos péptidos que se fijan selectivamente a las
especies celulares que expresan las integrinas alfa_{v}beta_{3}
/ alfa_{v}beta_{5} (por ejemplo, osteoblastos, osteoclastos,
células endoteliales), sin que se fijen, simultáneamente, a, por
ejemplo, especies celulares portadoras de
\alpha_{IIIb}\beta_{3} (por ejemplo, plaquetas de la
sangre). Los péptidos, así como sus correspondientes derivados, se
pueden sintetizar fácilmente según métodos convencionales, siempre
que no se puedan obtener de alguna otra forma.
En principio, los péptidos definidos según la
invención pueden estar fijados a la superficie del biomaterial por
adsorción o unión covalente. El método de adsorción resulta menos
adecuado cuando se utilizan diversos péptidos unidos a un único y
mismo implante, puesto que el revestimiento diferente y localmente
selectivo, según la invención, de la superficie sólo resulta
escasamente satisfactorio.
El acoplamiento de los péptidos o de sus análogos
no peptídicos a superficies portadoras por unión covalente, muy a
menudo por medio del denominado anclaje molecular, es conocido en
sí y ha sido suficientemente descrito, por ejemplo, por Singer
et al. (1987, J. Cell Biol., 104: 573); Brandley,
Schnaar (1989, Develop. Biol. 135: 74); Massia, Hubbell
(1990, Anal. Biochem. 187: 292); Hirano et al. (1991,
J. Biomed. Mat. Res. 25: 1523); Lin et al. (1992,
Biomaterials 13: 905); Nicol et al. (1992, J.
Biomed. Mat. Res. 26: 393); Dee et al. (1995, Tissue
Engin. 1: 135), sin hacer referencia, en general, al
recubrimiento de implantes ni, en particular, a método alguno.
Objetos de la presente invención son nuevas
aplicaciones de métodos de recubrimiento en sí conocidos para la
fabricación de los implantes según la invención tales como, por
ejemplo, el procedimiento Kevloc® (documento EP 0 712 621), que se
utiliza por primera vez, según la invención, para el acoplamiento de
los citados péptidos (o de sus análogos no peptídicos) a superficies
que contienen componentes de anclaje de acriloílo o metacriloílo, o
bien el procedimiento "Silicoated®" (documento
DE-OS 42 25 106), utilizado, según la invención,
para el acoplamiento de los correspondientes péptidos por medio de
componentes de anclaje de acriloílo o metacriloílo normalmente a
través de una capa intermedia de
acriloílo/meracriloílo-derivado de silano (por
ejemplo,
3-metacriloxipropil-trimetoxisilano)
a las correspondientes matrices portadoras. Una posibilidad
adicional de fijar los péptidos definidos según la invención a la
superficie de la matriz portadora o del implante consiste en el uso
análogo de un procedimiento de silanización, descrito en el
documento DE-OS 43 21005, que originalmente se
aplicó para el recubrimiento de pigmentos de brillo perlado para
sistemas de lacas al agua para metales y materiales sintéticos de
la industria del automóvil y de las materias sintéticas.
Adicionalmente, resulta adecuado, según la invención, un
procedimiento para el recubrimiento de superficies de oro con
péptidos portadores de grupos tiol, descrito originalmente en otro
contexto (Heuvel et al., 1993, Analytical Biochem.
215:223).
Los procedimientos descritos no se han utilizado
hasta la fecha para el recubrimiento de implantes para su
bioactivación.
El acoplamiento de los correspondientes péptidos
definidos según la invención a la superficie del implante tiene
lugar, de acuerdo con la invención, mediante las correspondientes
moléculas de anclaje, es decir, el péptido no se fija, por lo
general, inmediatamente a la superficie del implante por sí mismo.
La introducción de una molécula de este tipo, definida más
detalladamente más adelante, tiene, sobre todo, la finalidad de
satisfacer los requisitos estéricos del receptor biológico sobre
las células diana en relación con la unión del correspondiente
péptido.
La superficie del implante debe contener, para
ello, los correspondientes grupos funcionales o unidades reactivas
que hacen posible una unión de los correspondientes grupos
funcionales de la molécula de anclaje. Los grupos funcionales que
se deben poner a punto en la superficie del implante están
determinados por el estado de la matriz portadora, así como por sus
diferentes requisitos (materiales metálicos, de materia sintética,
óseo). En implantes metálicos, por ejemplo, se puede conseguir una
capa superficial reactiva para los restos SH de la molécula de
anclaje mediante la aplicación por vaporización de oro. La
silanización de superficies metálicas según procedimientos conocidos
(véase antes) da lugar, asimismo, a superficies reactivas que
pueden formar compuestos con las moléculas de anclaje según la
invención adecuadas, utilizando eventualmente adhesivos que
contienen silanos (véase más adelante). Los implantes de hueso
natural o materiales óseos similares a los naturales (por ejemplo,
cementos de fosfato cálcico) pueden fijar moléculas de anclaje que
contienen un grupo fosfonato reactivo (principio descrito por Chu,
Orgel, 1997, Bioconjugates Chem. 8: 103). A los implantes de
material sintético a base de acrilato (por ejemplo, PMMA), o de
otros materiales con un correspondiente recubrimiento de material
sintético se pueden acoplar moléculas de anclaje que presentan, por
su parte, un resto acrilato reactivo propio.
Moléculas de anclaje, en el sentido de la
invención, son, por lo tanto, moléculas a base de cadenas de
alquilo o cadenas de hidrocarburos modificadas o sustituidas, que
poseen al menos dos grupos funcionales diferentes, en los que, por
lo general, un grupo funcional es un resto carboxilo libre (grupo
NH_{2} libre) que, con un grupo NH_{2} libre (grupo carboxilo
libre) produce un enlace amida de una cadena lateral de un péptido
definido según la invención, en especial, un péptido RGD, y el otro
grupo funcional que, preferentemente, está localizado en el extremo
opuesto de la cadena C de la molécula de anclaje y que produce una
unión directa o indirecta con la superficie del implante es, en
función de la estructura o requisitos de la superficie del implante,
preferentemente, un resto que contiene (met)acrilo o un
grupo mercapto. En principio, se pueden utilizar también otros
grupos funcionales, capaces de reaccionar con los respectivos
grupos reactivos inmediatamente en la superficie del implante, o en
una capa intermedia adecuada, para formar una unión estable.
Las moléculas de anclaje de la invención poseen,
como se ha indicado anteriormente, simultáneamente la función de
espaciador o "spacers"; por lo tanto, junto con las
mencionadas opciones de acoplamiento, muestran una longitud
correspondiente, eventualmente adaptada de manera específica, para
permitir que los dominios responsables del estímulo de la adherencia
celular tengan la distancia correcta frente a las células diana, de
forma que se mejore la fijación celular desde el punto de vista
estérico o, incluso, que se pueda realizar por primera vez.
La función biológica de los dominios que
reconocen las células y que portan la correspondiente secuencia de
aminoácidos se ha comprobado, por ejemplo, en base a un péptido
sintético que se une a las especies celulares que expresan una
integrina alfa_{v}beta_{3} / alfa_{v}beta_{5} (por ejemplo,
osteoblastos, osteoclastos, células endoteliales) (Haubner et
al., 1996, J. Am. Chem. Soc.,
118-7461-7472).
Las moléculas de anclaje de la invención poseen,
preferentemente, las siguientes estructuras lineales, a las que los
péptidos definidos según la invención se unen a través del grupo
NH_{2} de una de sus cadenas laterales de aminoácidos,
preferentemente, la cadena lateral de lisina, al extremo carboxilo
libre de la correspondiente molécula de anclaje.
-CO-(CH_{2})_{k}-X-SH,
en donde X es un enlace sencillo o
-CO-NH-(CH_{2})_{I}-,
k significa 2 hasta 12 e I es 2
hasta
4.
-CO-(CH_{2})_{m}-[NH-CO-(CH_{2})_{n}]_{p}-NH-CO-CH=CH_{2},
en donde m y n significan 2 hasta
8; p = 0 hasta
2,
-(CO-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-NH)
_{q}-CO-(CH_{2})_{r}-NH-CO-CH=CH_{2},
en donde significan q = 1 hasta 3 y
r = 2 hasta
8.
Se prefieren, en particular, los siguientes tipos
de moléculas de anclaje especiales:
- (ia)
- -CO-CH_{2}-CH_{2}-SH (ácido mercapto-propiónico)
- (ib)
- -CO-CH_{2}-CH_{2}-CO-N-H-CH_{2}-CH_{2}-SH (ácido mercapto- etilamido-succínico)
- (iia)
- -CO-(CH_{2})_{5}-NH-CO-CH=CH_{2} (ácido acrilamida-hexanoico)
- (iib)
- -CO-(CH_{2})_{5}-NH-CO-(CH_{2})_{5}-NH-CO-CH=CH_{2} (ácido acrilamida-hexanoico-ácido amidohexanoico),
- (iiia)
- -CO-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-(CH_{2})_{5}-NH-CO-CH=CH_{2} (ácido acrilamida-hexanoico-ácido amido-trietilenglicólico)
- (iiib)
- -(CO-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-NH)_{2}-CO-(CH_{2})_{5}-NH-CO-CH=CH_{2} (ácido acrilamida-hexanoico-di-ácido amido-trietilenglicólico)
En general, se prefieren según la invención
aquellas estructuras de moléculas de anclaje que tienen en la
cadena C lineal al menos seis átomos de C. Sorprendentemente, se ha
encontrado que esta longitud de la molécula de anclaje resulta
especialmente favorable para alcanzar resultados óptimos en relación
con la integración tisular acelerada y reforzada del implante. El
dato de al menos seis átomos de C en la cadena lineal se refiere,
de acuerdo con la invención, a la longitud total de la molécula
entre el péptido y la superficie del implante. De esta forma,
resultan también adecuadas moléculas de anclaje de las estructuras
anteriormente definidas con cadenas más cortas (por ejemplo, tipo
ia), en caso que no se hayan introducido otros componentes de
acoplamiento no mencionados, prolongadores de la cadena, entre el
péptido y la superficie del implante.
Las moléculas de anclaje se fijan, en forma de
amidas, con los péptidos definidos según la invención por métodos
estándares, a través de la función carboxilo, formándose de este
modo estructuras del tipo
péptido-NH-CO-molécula
de anclaje, que, como se ha mencionado antes, se fijan en el
implante y se generan construcciones del siguiente tipo:
péptido-NH-CO-molécula
de anclaje-(superficie del) implante. Se prefieren las
correspondientes construcciones de implante compuestas por alguno
de los péptidos definidos anteriormente mencionados de forma
aislada, en particular, péptidos RGD, una de las moléculas de
anclaje mencionada anteriormente en general y especialmente
definidas, y un correspondiente implante de superficie reactiva. Se
prefieren de manera especial los siguientes implantes:
ciclo-RGDfK
NH-CO-derivados de tiol (tipo: i) -
implante
ciclo-RGDfK
NH-CO-derivados de acrilato (tipo:
ii) - implante
ciclo-RGDfK
NH-CO-derivados de
acrilato-glicol (tipo: iii) - implante
ciclo-RGDfKG
NH-CO-derivados de
acrilato-glicol (tipo: iii) - implante,
en los que la cadena C lineal de la
molécula de anclaje total posee por lo menos seis átomos
C.
Entre éstas, se prefieren especialmente:
ciclo-RGDfK
NH-CO-derivado de tiol (tipo: ib) -
implante
ciclo-RGDfK
NH-CO-derivado de acrilato (tipo:
iia) - implante
ciclo-RGDfK
NH-CO-derivado de acrilato (tipo:
iib) - implante
ciclo-RGDfK
NH-CO-derivado de
acrilato-glicol (tipo: iiia) - implante
ciclo-RGDfKG
NH-CO-derivado de
acrilato-glicol (tipo: iiia) - implante
ciclo-RGDfK
NH-CO-derivado de
acrilato-glicol (tipo: iiib) - implante.
La fabricación de estas estructuras tiene lugar
según métodos convencionales, o se describe en la solicitud
paralela, presentada el mismo día por la solicitante, que tiene
como objeto las estructuras de anclaje de péptidos como tales.
Como se ha indicado ya anteriormente, para el
anclaje de los derivados peptídicos cito- o histoselectivos a la
superficie del biomaterial según la invención, se siguen
básicamente tres vías alternativas, en las que el patrón de
reconocimiento molecular de los dominios selectivos, portadores de
las respectivas secuencias RGD, puede permanecer inalterado para un
tipo determinado de célula, así como el separador, en tanto que el
anclaje molecular se puede variar en función de las variantes
mencionadas de acoplamiento, por ejemplo, por:
- -
- acoplamiento de derivados de péptido de tiol en superficies de biomaterial recubiertas con oro (por ejemplo, con moléculas de anclaje de tipo (i));
- -
- acoplamiento de derivados de (met)acriloílo-péptido en superficies de biomateriales recubiertas con acrilato o metacrilato (por ejemplo, con moléculas de anclaje de los tipos (ii) o (iii));
- -
- acoplamiento de derivados de (met)acriloílo-péptido sobre superficies de biomateriales recubiertas con silano (por ejemplo, con moléculas de anclaje del tipo (ii) o (iii)), con un derivado de (met)acrilato-silano como agente adhesivo o capa intermedia (por ejemplo, 3-metacriloxipropil-trimetoxisilano).
La formación de la longitud media crítica de la
molécula de anclaje para las diversas variantes de acoplamiento de
los péptidos a las superficies de los biomateriales tiene lugar por
síntesis de los péptidos definidos según la invención con las
moléculas de anclaje definidas según la invención, de una longitud
de cadena con, preferentemente, 6 a 24 átomos C y diferentes
propiedades de hidrofobia / hidrofilia a elegir (por ejemplo,
mediante el uso de unidades cuantitativamente diferentes de
-CH_{2}- y/o ácido amido-hexanoico o etilenglicol
según métodos convencionales en sí conocidos, y posterior ensayo de
la eficacia biológica por determinación de la adherencia celular
in vitro tras el recubrimiento de las correspondientes
superficies de biomateriales).
De la forma descrita, resulta posible
seleccionar, en función de las propiedades del material del
implante, un procedimiento de recubrimiento adecuado para el
acondicionamiento de las superficies antes del acoplamiento con los
derivados peptídicos de la invención. Adicionalmente, dependiendo
del tipo de tejido o de célula en el que se debe llevar a cabo la
integración del biomaterial/implante, también es posible el
recubrimiento con otros péptidos, también dirigidos a activar las
integrinas de la especie celular diana tales como, por ejemplo, la
integrina alfa_{6}beta_{4} de las células epiteliales (por
ejemplo, para la aplicación de implantes de hueso, mandíbula, piel o
cabello), o la integrina alfa_{IIb}beta_{3} de las plaquetas
sanguíneas. Los péptidos RGD
alfa_{v}beta_{3}-específicos exhiben
selectividad frente a las células endoteliales y osteoblastos, por
lo que serían adecuados, por ejemplo, para el recubrimiento de
prótesis vasculares o implantes óseos. De esta manera, se puede
llevar a cabo una recubrimiento de superficie bioactivador adecuado
para implantes en el campo del tejido óseo, vasos sanguíneos,
dientes, piel y cabello, así como para prácticamente cualquier
órgano.
Antes de poder poner a punto los implantes u
órganos biohíbridos según la invención, los péptidos adecuados para
los correspondientes tipos celulares se debe analizar y calcular en
un sistema de ensayo in vitro su eficacia biológica, para
poder emprender, posteriormente, un recubrimiento dirigido y
selectivo del implante que se debe aplicar en el tejido
investigado.
El análisis necesario para ello de la estructura
de integrina-receptor del tejido diana o de las
células diana en el que se debe incorporar el implante, tiene lugar
por medio de procedimientos inmuno-histológicos
actuales y conocidos tales como, por ejemplo, por
inmunofluorescencia o por la inmuno-histoquímica de
muestras de tejidos. Los anticuerpos contra diversos receptores de
integrina o sus subunidades, necesarios para estos análisis, son
entretanto conocidos y se encuentran disponibles o se pueden
generar por medio de métodos convencionales tales como, por
ejemplo, inmunizaciones adecuadas.
Los péptidos definidos según la invención se
acoplan de forma covalente en distintas concentraciones sobre
superficies de cultivo, por ejemplo, de poliestireno recubierto con
albúmina de suero bovino (BSA). El material del soporte para este
ensayo no juega en la determinación de los péptidos adecuados ningún
papel esencial. Igualmente, el método de acoplamiento utilizado
también es de escasa importancia. Por motivos prácticos, el
acoplamiento en estas determinaciones también se puede realizar por
incubación y adsorción de los citados péptidos sobre el soporte de
ensayo.
A continuación, se investiga la adhesión de los
cultivos celulares y tisulares (por ejemplo, osteoblastos) en las
células que deben ser activadas in vivo en el tejido
natural, analizando sus propiedades adherentes frente a las
superficies correspondientemente recubiertas. El criterio para la
selección de los cultivos celulares adecuados para los ensayos de
adhesión consiste en patrones de expresión de integración con
respecto a las células diana in vivo tras el implante, por
ejemplo, su expresión de alfa_{v}beta_{3} /
alfa_{v}beta_{5} o alfa_{IIIb}beta_{3}, que se verifica por
medio de anticuerpos, marcados por fluorescencia, contra las
integrinas alfa_{v}beta_{3}, alfa_{v}beta_{5} o
alfa_{IIIb}beta_{3}, o contra las subunidades alfa_{v},
alfa_{IIIb}, beta_{3} o beta_{5} del receptor de integrinas
en base a un "Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)"
("Clasificados de células activadas por fluorescencia"). En
otras especies de células diana, in vivo, con diferentes
patrones de receptores de integrinas, se deben utilizar, de manera
correspondiente, otros anticuerpos. Éstos son conocidos entretanto
y se encuentran disponibles o se pueden generar mediante métodos
convencionales conocidos, por ejemplo, por inmunización
adecuada.
Las diferentes especies celulares seleccionadas
se recubren con los péptidos analizados, se siembran en superficies
de cultivo de poliestireno pretratadas con BSA y se incuban.
Seguidamente, se eliminan por lavado las células que no se han
adherido.
El comportamiento de fijación de las diversas
especies celulares seleccionadas a las superficies de ensayo
recubiertas con los distintos péptidos definidos según la invención
se corresponde en caso positivo, es decir, cuando existe una
especificidad suficiente, con una curva de titulación con un índice
máximo de adsorción de aproximadamente 60 hasta 100% de las células
sembradas, así como con una unión semi-máxima de
células con una concentración de péptidos RGD en la solución de
recubrimiento de aproximadamente 5 nM hasta 5 \muM.
De forma similar a la descrita para el
acoplamiento de péptidos adecuados a superficies de poliestireno
previamente recubiertas con BSA, es posible llevar a cabo
estrategias de anclaje a superficies de biomateriales modificadas o
acondicionadas, utilizando diferentes capas intermedia que fomentan
la adherencia.
En resumen, se puede afirmar lo siguiente:
Los implantes del estado de la técnica muestran
los siguientes inconvenientes:
- -
- integración lenta e incompleta del implante en el tejido;
- -
- aceptación tisular limitada;
- -
- estabilidad funcional insuficiente del implante/capa limítrofe del tejido
- -
- acción estimulante deficitaria del implante sobre la neogénesis del tejido;
- -
- propiedades no fisiológicas de la superficie del implante.
Como consecuencia de estas desventajas, se
producen los siguientes problemas:
- -
- aflojamientos asépticos del implante (por ejemplo, formación de cápsula fibrosa);
- -
- formación local de microtrombos;
- -
- infecciones;
- -
- inflamaciones;
- -
- resorción tisular;
- -
- revisiones.
Estos problemas se pueden resolver en gran medida
por el procedimiento puesto a punto por la invención o mediante los
implantes producidos mediante el mismo. Los objetos de la invención
se caracterizan por:
- -
- diseño a medida de péptidos de adhesión, que son complementarios al patrón de expresión de integrinas del tejido / células diana;
- -
- estimulación selectiva de la adherencia celular de las células diana que deben llevar a cabo la neogénesis de tejido, sin potenciar simultáneamente la adherencia de células que afectan negativamente al proceso;
- -
- recubrimientos de mayor estabilidad por medio de moléculas de anclaje de péptidos de nueva generación;
- -
- aceleración y refuerzo del proceso de integración del implante en el tejido.
Se ha podido demostrar que la distancia mínima
absoluta, crítica y estérica, entre la secuencia de reconocimiento
celular sobre el péptido y la superficie del material no recubierto
es de entre 2,0 y 3,5 nm, preferentemente, entre 2,5 y 3,5 nm. Los
índices máximos de revestimiento (80-100%) se pueden
alcanzar con una distancia mínima de 3,0 hasta 5,0 nm.
Fig. 1: Análisis de la composición de integración
de osteoblastos humanos primarios por FACS (Clasificador de Células
Activadas por Fluorescencia) por medio de anticuerpos conjugados
con fluorescencia contra integrinas alfa_{v}beta_{3} y
alfa_{v}beta_{5}.
Eje X: intensidad de la fluorescencia
(cuentas)
Eje Y: número de células
M21: controles positivos de alfa_{v}beta_{3}
y alfa_{v}beta_{5}
M21: controles negativos de alfa_{v}beta_{3}
y alfa_{v}beta_{5}
HOB: cultivo de osteoblastos humanos
primarios
ROB: cultivo de osteoblastos de rata
primarios
Fig. 2: Adherencia de osteoblastos MC3T3 H1 a
diversos péptidos RGD en superficies de ensayo de poliestireno
recubiertas con BSA.
Eje X: concentración de péptidos RGD en la
solución de recubrimiento (\muM)
Eje Y: grado de distribución celular (%)
Curva superior:
ciclo-RGDfK
NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-S-(sulfo-SMPB)
("derivado 1-SMPB de péptido de tiol"),
SMPB =
4-(p-maleimido-fenil)-butirato
de succinimidilo;
Curva superior media:
ciclo-RGDfK
NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-CO-NH-CH_{2}-CH_{2}-S-(sulfo-SMPB)
("derivado 2-SMPB de péptido de
tiol")
Curva inferior media:
ciclo-RGDvE
CO-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CO-NH-CH_{2}-CH_{2}-S
(sulfo SMPB) ("derivado 3-SMPB de péptido de
tiol")
Curva inferior: controles de péptido de
tiol:
ciclo-R\betaAdfK-NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-S-(sulfo-SMPB)
Fig. 3: Adherencia de osteoblastos a superficies
de ensayo recubiertas con derivado 1-SMPB de
péptido de tiol (véase Fig. 2)
Eje X: concentración de péptidos en la solución
de recubrimiento (\muM),
Eje Y: grado de distribución de células (%),
Curva superior: osteoblastos de ratón
MC3T3 H1;
Curva superior media: células
osteo-progenitoras humanas primarias
Curva media: osteoblastos humanos
primarios;
Curva inferior media: controles negativos
de alfa_{v}beta_{3} M21L
Curva inferior: osteoblastos de rata
primarios
Fig. 4: Adherencia de osteoblastos a superficies
de ensayo recubiertas con el derivado 1-SMPP de
péptido de tiol (10 \muM en la solución de recubrimiento)
Eje X: concentración de RGDfK disuelto (sin
anclaje molecular) en medio adhesivo (\muM),
Eje Y: grado de distribución de células (%);
Curva superior: osteoblastos de ratón
MC3T3 H1;
Curva media: osteoblastos humanos
primarios;
Curva inferior: osteoblastos de rata
primarios.
Fig. 5: Adherencia de osteoblastos a superficies
de ensayo recubiertas con el derivado 1-SMPP de
péptido de tiol (10 \muM en la solución de recubrimiento),
Eje X: número de células sembradas / cm^{2}
Eje Y: número de células adheridas / cm^{2}
Curva superior: osteoblastos de rata
primarios;
Curva superior media: osteoblastos de
ratón MC3T3-H1;
Curva inferior media: osteoblastos humanos
primarios;
Curva inferior: recubrimiento negativo con
BSA
Fig. 6: Adherencia de osteoblastos a superficies
de ensayo recubiertas con el derivado 1-SMPP de
péptido de tiol (10 \muM en la solución de recubrimiento), (véase
Fig. 2),
Eje X: número de células sembradas / cm^{2}
Eje Y: requisito de superficie calculado /
células (\mum^{2})
Curva superior: osteoblastos humanos
primarios;
Curva media: osteoblastos de ratón
MC3T3-H1;
Curva inferior: osteoblastos de rata
primarios.
Fig. 7: Adherencia de osteoblastos a superficies
de ensayo recubiertas con el derivado 1-SMPP de
péptido de tiol (10 \muM en la solución de recubrimiento), (véase
Fig. 2),
Eje X: tiempo (min)
Eje Y: grado de distribución de células (%)
Curva superior: osteoblastos de ratón
MC3T3-H1;
Curva media: osteoblastos humanos
primarios;
Curva inferior: osteoblastos de rata
primarios.
Fig. 8: Adherencia de osteoblastos
MC3T3-H1 a superficies PMMA de cemento óseo
recubiertas con diversos péptidos RGD:
Eje X: Concentración de péptido RGD en la
solución de recubrimiento (\muM)
Eje Y: grado de distribución de células (%)
Curva superior: derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilato (tipo: iiia, péptido
de acrilato 3);
Curva superior media: derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilato (tipo: iib, péptido
de acrilato 2);
Curva inferior media: derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilato (tipo: iiib, péptido
de acrilato 4);
Curva inferior: derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilato (tipo: iia, péptido
de acrilato 1);
Fig. 9: Adherencia de osteoblastos
MC3T3-H1 a las superficies porosas de PMMA/PHEMA
recubiertas con diversos péptidos RGD:
Eje X: concentración de péptido RGD en la
solución de recubrimiento (\muM),
Eje Y: grado de distribución de células (%)
Curva superior: derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilato (tipo iiia, péptido
de acrilato 3);
Curva media: derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilato (tipo iiib, péptido
de acrilato 4);
Curva inferior: derivado de
ciclo-RGDfK
CO-NH-acrilato (tipo iib, péptido de
acrilato 2),
Fig. 10: Adherencia de osteoblastos
MC3T3-H1 a superficies porosas de PMMA/Plex Y7H
recubiertas con diversos péptidos RGD:
Eje X: concentración de péptido RGD en la
solución de recubrimiento (\muM),
Eje Y: grado de distribución de células (%)
Curva superior: derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilato (tipo iiia, péptido
de acrilato 3);
Curva media: derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilato (tipo iiib, péptido
de acrilato 4);
Curva inferior: derivado de
ciclo-RGDfK
CO-NH-acrilato (tipo iib, péptido de
acrilato 2).
Fig. 11: Adherencia máxima de osteoblastos
MC3T3-H1 a superficies de cemento óseo PMMA o
poliestireno-BSA-SMPB recubiertas
con diferentes péptidos RGD de diversa longitud molecular:
Eje X: longitudes moleculares de los péptidos RGD
(nm)
Eje Y: grado de distribución máximo (%).
Fig. 12: Adherencia de osteoblastos
MC3T3-H1 a superficies de acero fino V4A recubiertas
con el péptido RGD derivado de ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilato (tipo: iiia, péptido
de acrilato 3). Las superficies de acero fino se han recubierta
previamente, por su parte, con diversos procedimientos.
Eje X: concentración de péptido RGD en la
solución de recubrimiento (\muM),
Eje Y: grado de distribución de células (%);
Curva superior: recubrimiento Kevloc®;
Curva media: recubrimiento
Silicoater®;
Curva inferior: recubrimiento con
pigmento.
Fig. 13: Proliferación de osteoblastos
MC3T3-H1 a superficies de cemento
óseo-PMMA recubiertas con el péptido RGD derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilato (tipo: iiia, péptido
de acrilato 3).
Eje X: duración del cultivo (días),
Eje Y: número de células,
Curva superior: péptido 100 \muM en la
solución de recubrimiento;
Curva superior media: péptido 1 \muM en
la solución de recubrimiento;
Curva inferior media: péptido 0,1 \muM
en la solución de recubrimiento;
Curva inferior: controles no
recubiertos.
Fig. 14: Adherencia de osteoblastos
MC3T3-H1 y trombocitos a superficies de cemento
óseo-PMMA recubiertas con el péptido RGD derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilato (tipo: iiia, péptido
de acrilato 3).
Eje X: osteoblastos solos y trombocitos solos
sembrados sobre superficies con diversas concentraciones de
péptidos en la solución de recubrimiento de 100 \muM, 10 \muM y
1 \muM.
Eje Y: número de células (absorción a 405
nm).
Fig. 15: Adherencia de osteoblastos
MC3T3-H1 y trombocitos a superficies de cemento
óseo-PMMA recubiertas con el péptido RGD derivado de
ciclo RGDfK NH-CO-acrilato (tipo:
iiia, péptido de acrilato 5).
Eje X: osteoblastos solos y trombocitos solos
sembrados sobre superficies con diversas concentraciones de
péptidos en la solución de recubrimiento de 100 \muM, 10 \muM y
1 \muM.
Eje Y: número de células (absorción a 405
nm).
Fig. 16: Adherencia de osteoblastos
MC3T3-H1, trombocitos y una mezcla de osteoblastos
y trombocitos a superficies de cemento óseo-PMMA
recubiertas con el péptido RGD derivado de
ciclo-RGDfK-acrilato (tipo: iiia,
péptido de acrilato 3).
Eje X: osteoblastos solos, trombocitos solos y
mezcla de osteoblastos y trombocitos sembrados sobre las
superficies con la concentración de péptidos en la solución de
recubrimiento de 100 \muM.
Eje Y: número de células (absorción a 405
nm).
Fig. 17: Adherencia de osteoblastos
MC3T3-H1, trombocitos y una mezcla de osteoblastos
y trombocitos a superficies de cemento óseo-PMMA
recubiertas con el péptido RGD derivado de ciclo RGDfK
NH-CO-acrilato (tipo: iiia, péptido
de acrilato 5).
Eje X: osteoblastos solos, trombocitos solos y
mezcla de osteoblastos y trombocitos sembrados sobre la superficie,
con una concentración de péptidos en la solución de recubrimiento
de 100 \muM.
Eje Y: número de células (absorción a 405
nm).
Los siguientes Ejemplos explican adicionalmente
la invención, sin limitarla en ningún sentido.
(a) Se llevó a cabo la síntesis del péptido
ciclo-RGD
(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)
con el anclaje de ácido mercapto-propiónico
(\rightarrow derivado de ciclo-RGDfK
NH-CO-tiol tipo: ia) de acuerdo con
el procedimiento del documento DE 1 95 38 741. De manera análoga,
se llevó a cabo la síntesis del correspondiente derivado
ciclo-R\betaAdfK inactivo desde el punto de
vista biológico, así como del derivado ciclo-RGDfK
sin molécula de anclaje.
(b) Se obtuvo
ciclo-(R(Pbf)GD(tBu)fK(Z) (Pbf =
pentametil-benzofuran-sulfonilo; tBu
= terc-butilo) por síntesis peptídica de fase sólida
(Merrifield, Angew. Chem. 1985, 97:801) y subsiguiente
ciclación (por ejemplo, según Zimmer et al., 1993,
Liebigs Ann. Chem: 497). Tras la separación selectiva del
grupo protector Z según métodos convencionales se puede prolongar
la cadena lateral de lisina por reacción de 0,1 mmol de ciclo
(R(Pbf)GD(tBu)f[bsa-K])
con 0,2 mmol de anhídrido de ácido succínico (bsa) en 5 ml de
dimetilformamida en ciclo
(R(Pbf)GD(tBu)f[bsa-K]).
(c) La síntesis del péptido
ciclo-RGD
(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)
con el anclaje de ácido
mercapto-etil-amidosuccínico
(\rightarrow derivado de ciclo-RGDfK
NH-CO-tiol tipo: ib =
ciclo(RGDf[tiol-bsa-K])
se llevó a cabo de la forma siguiente: se disolvieron 10 mmol de
hidrocloruro de cisteamino y una cantidad equimolar (eq.) de
trifenil-metanol a 60ºC en acético glacial y se
mezclaron, bajo agitación, con 1,1 eq. de eterato de BF_{3}.
Después de agitar durante 50 minutos, se neutralizó con una
solución saturada de NaHCO_{3} y se extrajo con éster acético. El
aceite remanente del extracto se disolvió en
terc-butanol para convertirlo en el hidrocloruro,
se llevó a pH = 2 con ácido clorhídrico diluido y se liofilizó,
rendimiento 99%. El componente obtenido de esta forma se acopla
según métodos convencionales con EDCl x HCl a
ciclo(R(Pbf)GD(tBu)f[bsa-K])
y se separan los grupos protectores laterales.
(d) La síntesis del péptido
ciclo-RGD
(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)
con el anclaje ácido
acril-amido-hexanoico
(\rightarrow derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilo tipo: iia = ciclo(RGDf[acril-ahx-K]) se llevó a cabo de la forma siguiente:
(\rightarrow derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilo tipo: iia = ciclo(RGDf[acril-ahx-K]) se llevó a cabo de la forma siguiente:
El sistema de anclaje acrílico se sintetizó de
modo separado y se acopló como éster alquílico de la cadena lateral
del péptido. Adicionalmente, se suspendieron 10 mmol de ácido
6-amino-hexanoico y 1,8 eq. de
hidróxido de calcio en agua y se agregaron a 0ºC, 1,2 eq. de
cloruro ácido de acrilo. El hidróxido de calcio insoluble se separó
por filtración y el filtrado de acidificó con ácido clorhídrico
concentrado a pH = 2. El producto precipitado de recristalizó a
partir de éster acético. Rendimiento: 65%. 10 mmol del ácido
6-acrilamido-hexanoico cristalino se
suspendieron en 50 ml de diclorometano, se mezclaron con 1 eq. de
1-hidroxi-succinimida y, a 0ºC, se
agregaron 1,2 eq. de CDClxHCl. Después de agitar durante una hora,
se detuvo la reacción por la adición de 10 \mul de acético
glacial. Se extrajo múltiples veces con una solución fría y saturada
de carbonato sódico y agua y, a continuación, se secó sobre sulfato
sódico. Rendimiento: 52%. El éster activo presente ahora se acopló
en DMF a ciclo(R(Pbf)GD(tBu)fK)
y se separaron los grupos protectores de las cadenas laterales
según métodos convencionales.
(e) La síntesis del péptido
ciclo-RGD
(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)
con el anclaje de ácido
acril-amino-hexanoico-ácido
amido-hexanoico (\rightarrow derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilo tipo: iib =
ciclo(RGDf[acril-ahx-ahx-K])
se llevó a cabo de la forma siguiente: para la síntesis del sistema
de anclaje acrílico se disuelven 10 mmol de ácido
amino-hexanoico en tampón acuoso de fosfato sódico
(pH 8) y se enfría a 0ºC. Se disolvieron 2 mmol de éster activo del
ácido acril-amido-hexanoico (véase
(d)) en etanol/CHCl_{3} y se agregaron lentamente. El valor de pH
se mantuvo constante en 8 con NaOH diluido. Después de la
separación por destilación del disolvente orgánico, se acidificó la
fase acuosa con ácido clorhídrico concentrado a pH 2,6 y se separó
por filtración el sólido que precipitó, se lavó con agua y se secó
sobre pentóxido de fósforo. Rendimiento: 70%. El sistema de anclaje
acrílico presente ahora se acopla con EDClxHCl según métodos en sí
conocidos a la cadena lateral del péptido y se separan los grupos
protectores.
(f) La síntesis del péptido
ciclo-RGD
(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)
con el anclaje ácido
acril-amido-hexanoico-ácido
amido-trietilenglicólico (\rightarrow derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilo tipo: iiia =
ciclo(RGDf[acril-ahx-tEG-K])
se llevó a cabo de la forma siguiente: el sistema de anclaje
acrílico se efectuó por síntesis peptídica de fase sólida (véase
antes). Como último componente se acopló el ácido
acril-amido-hexanoico (véase
antes). Rendimiento: 97%. El sistema de anclaje acrílico ahora
presente se acopla con EDClxHCl según métodos en sí conocidos a la
cadena lateral peptídica y se separan los grupos protectores.
(g) La síntesis del péptido
ciclo-RGD
(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)
con el anclaje de ácido
acril-amido-hexanoico-ácido
amido-trietilenglicólico-ácido
amido-trietilenglicólico (\rightarrow derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilo tipo: iiib =
ciclo-(RGDf[acril-ahxEG-tEGK])
tuvo lugar de forma análoga a (f). Rendimiento: 85%.
(i) La síntesis del péptido
ciclo-RGD
(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)
con el anclaje de ácido
acril-amido-hexanoico-ácido
amido-trietilenglicólico (\rightarrow derivado de
ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilo tipo: iiia = ciclo-
(RGDf[acril-ahx-tEG-KG])
tuvo lugar de forma análoga a (f). Rendimiento: 81%.
De acuerdo con el procedimiento establecido por
Singer et al, 1987, J. Cell Biol., 104:573, o por
Ruoslahti et al. (1982, Methods Enzymol., 32:
803-831), se llevó a efecto el acoplamiento
covalente de los péptidos según la invención con
4-(p-maleimidofenil)-butirato de
sulfosuccinimidilo (Sulfo-SMPB) sobre superficies de
cultivo de poliestireno previamente recubiertas con albúmina de
suero bovino (BSA).
Para ello, se recubrieron 48 pocillos (Costar,
"non-tissue culture treated", Art, nº 3547)
con sendos 2450 \mul de PBS (solución salina tamponada con
fosfato), pH = 8,3, 2% de BSA por pocillo y se incubaron a
temperatura ambiente durante la noche con el fin de generar una
capa de BSA sobre el poliestireno. Seguidamente, se lavó con 250
\mul de PBS, pH = 8,3, por pocillo y se incubaron con sendos 250
\mul de una solución con 100 \mug/ml de SMPB en PBS, pH 8,3,
durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, tuvo lugar
un lavado triple de los pocillos con sendos 250 \mul de PBS, pH
8,3. Para la preparación de las soluciones de recubrimiento, se
péptido tiol-RGD se aplicó a las siguientes
concentraciones finales en PBS, pH 8,3: 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1
\muM, 10 \muM, 100 \muM y 1 mM. Tras la adición de sendos 250
\mul de solución de recubrimiento/pocillo se incubó durante la
noche a temperatura ambiente y, a continuación, se lavó tres veces
con PBS, pH 8,3. Mediante la adición de sendos 250 \mul de una
solución al 5% de BSA en PBS, pH 7,4, la subsiguiente incubación
durante 2 horas a temperatura ambiente y el lavado con PBS, pH 7,4,
se bloquearon puntos de fijación celulares inespecíficos. Como
controles de recubrimiento negativo se utilizaron superficies de
poliestireno, que se trataron, a partir del recubrimiento con una
solución de BSA al 5%, de manera idéntica a las muestras positivas.
A continuación se analizó la adherencia de cuatro cultivos
celulares, obtenidos a partir de tres especies diferentes, a las
superficies recubiertas con péptido RGD anteriormente
mencionadas:
- -
- osteoblastos humanos primarios de la esponjosa de la cabeza del fémur de pacientes adultos (Siggelkow et al., 1997, Bone, 20: P231);
- -
- células osteo-progenitoras humanas primarias de la médula ósea de pacientes adultos (Vilamitjana-Amedee et al., 1993, In vitro Cell Dev. Biol., 29: 699);
- -
- osteoblastos primarios del cráneo de ratas recién nacidas, cuya preparación y cultivo se efectuó de acuerdo con los métodos de Yagiela y Woodbury (1977, The Anatomical Record, 188: 287-305);
- -
- línea celular de osteoblastos MC3T3-H1, obtenida del cráneo de ratones recién nacidos (Heermeier et al., 1995, Cells and Materials, 5:309-321), y
- -
- línea celular del melanoma humano M21L como controles negativos de la integrina alfa_{v}beta_{3}/alfa_{v}beta_{5}.
Antes de utilizar estas especies celulares en los
experimentos de adherencia, se verificó su expresión de integrinas
por medio de anticuerpos marcados con fluorescencia contra los
receptores alfa_{v}beta_{3} o alfa_{v}beta_{5}, así como
contra las subunidades de integrinas alfa_{v}, beta_{3} y
beta_{5}, por medio de un Clasificador de Células Activadas por
Fluorescencia (FACS) de Becton-Dickenson. De esta
forma, se demostró una fuerte expresión de las citadas integrinas
(Fig. 1).
Las especies celulares descritas se sembraron con
una densidad de siembre a 48.000 células/cm^{2}, como se ha
descrito anteriormente, con placas de 48 pocillos Costar
recubiertas con péptido RGD y, seguidamente, se incubaron durante
1 hora a 37ºC, 95% de humedad relativa del aire y 5% de CO_{2}.
Subsiguientemente, se separaron dos veces por lavado con PBS, pH
7,4, las células no adheridas durante el ensayo.
La cuantificación de las células adheridas tuvo
lugar de manera indirecta durante la determinación de actividad de
la enzima celular N-acetil- hexosaminidasa,
utilizando una curva estándar correspondiente, según el método de
Landegren (1984, J. Immunol. Methods, 67:
379-388).
El recubrimiento de superficies de cultivo
celular de poliestireno pretratadas con BSA con los 1- y
2-derivados (sulfo-SMPB)de
péptido de tiol alfa_{v}beta_{3} o alfa_{v}beta_{5}
-selectivos conduce a una estimulación potente y dependiente de la
dosis de la adherencia de los osteoblastos cultivados de ratón
MC3T3-H1 (véase la Fig. 2). Por el contrario, el
control de péptido de tiol biológicamente inactivo carece de efecto
significativo, con lo que se demuestra la alta selectividad y la
elevada especificidad de la interacción
integrina-péptido RGD. También el péptido de tiol 3
escasamente
alfa_{v}beta_{3}/alfa_{v}beta_{5}-selectivo
(sulfo-SMPB)
(ciclo-RGDvE-aminocisteína-ácido
amido-hexanoico; Delforge et al., 1996,
Anal. Biochem. 242, 180) muestra un efecto claramente más
débil que los correspondientes 1- y 2-derivados del
péptido de tiol.
El comportamiento de unión de las diferentes
especies celulares a las superficies de poliestireno, pretratadas
con BSA, recubiertas con el derivado de péptido de tiol
1-(sulfo-SMPB) o con el derivado de péptido de tiol
2-(sulfo-SMPB), se corresponde un una curva de
titulación con un índice máximo de adsorción de aproximadamente 70%
(osteoblastos de rata primarios), aproximadamente 80% (osteoblastos
humanos primarios y células osteo-progenitoras
humanas primarias) y de aproximadamente 90-100%
(osteoblastos de ratón MC3T3-H1) de las células
sembradas, así como una fijación celular semi-máxima
con una concentración de péptido RGD en la solución de
recubrimiento de 50-1000 nM (Fig. 3). Los controles
negativos de alfa_{v}beta_{3} / alfa_{v}beta_{5} (M21L) no
muestran, por el contrario, ninguna adherencia celular
significativa.
Los índices de adsorción celular descritos se
encuentran elevados en aproximadamente 20-40 veces
con respecto a superficies recubiertas con BSA al 5%, que no
conducen a adherencia celular significativa alguna con ninguno de
los cultivos de osteoblastos utilizados.
El comportamiento similar de los citados cultivos
de osteoblastos confirma que el efecto estimulante de la adhesión
es específico para los osteoblastos, pero independiente de la
especie usada.
La unión de los anteriormente citados cultivos de
osteoblastos a superficies de poliestireno pretratadas con BSA
recubiertas con el derivado de tiol-péptido
1-sulfo-SMPB se puede inhibir por
completo mediante la adición de RGDfK cíclico disuelto en medio de
adhesión (Fig. 4). Este resultado pone de manifiesto que los
fenómenos de adherencia celular observados sólo pueden ser mediados
por los péptidos RGD.
La dependencia de la adherencia celular de los
osteoblastos humanos primarios o de las células
MC3T3-H1 sobre las mencionadas superficies de
poliestireno, pretratadas con BSA, y recubiertas con el péptido de
tiol 1,2 (sulfo-SMPB), del número de células
sembradas proporciona una curva de siembra (Fig. 5). Sobre el
recubrimiento negativo de BSA, por el contrario, no se produce
ninguna adhesión significativa de células. La superficie media por
célula adherida, calculada con una densidad máxima de siembra
celular, de aproximadamente 200 hasta 500 \mum^{2} indica en
esta superficie una distancia media entre células de
aproximadamente 15 hasta 25 \mum (Fig. 6). Dado que el diámetro
celular de los osteoblastos es de aproximadamente 10 a 15 \mum,
resulta evidente que el recubrimiento peptídico de las posiciones de
adherencia celular se encuentra en valores tales que se puede
generar una superficie densamente ocupada con osteoblastos, en la
que las células adyacentes están estrechamente dispuestas unas
junto a otras. La evolución en el tiempo del proceso de adhesión
celular sobre la citada superficie muestra una rápida adhesión de
las células, que, en función del tipo celular, finaliza después de
aproximadamente 45 a 60 minutos (Fig. 7). Las líneas celulares (por
ejemplo, MC3T3-H1) muestran, en este caso, una
cinética de adherencia más rápida que los cultivos celulares
primarios (humano, de rata). En este ensayo, no se reconocen
diferencias significativas entre los dos derivados de péptido de
tiol utilizados.
Para investigar la influencia de diversas
longitudes de las moléculas de anclaje y, con ella, la distancia
entre la secuencia RGD de reconocimiento celular y la superficie
del material sobre el grado de adhesión de los osteoblastos, se
prepararon cuatro péptidos de acrilato-RGD
diferentes (derivado de ciclo-RGDfK
NH-CO-acrilato (tipos: iia, iib,
iiia, iiib), con diferentes longitudes de espaciadores
moleculares.
Las síntesis de los
ciclo-RGD-péptidos se llevaron a
cabo como se muestra en el Ejemplo 1 o de acuerdo con el
procedimiento de Pless et al. 1983, J. Biol. Chem.
258: 2340-2349, o de Gurrath et al., 1992,
Eur. J. Biochem., 210: 911-921.
Las correspondientes longitudes de anclaje de
estos péptidos ascienden a aproximadamente 2,6 nm (péptido de
acrilato 1, tipo iia), 3,5 nm (péptido de acrilato 2, tipo iib),
3,7 nm (péptido de acrilato 3, tipo iiia) ó 4,2 nm (péptido de
acrilato 4, tipo iiib).
Para el acoplamiento covalente de estos péptidos
sobre superficies PMMA (poli(metacrilato metílico)
polimerizadas, se prepararon los correspondientes cuerpos moldeados
de diversa porosidad (diámetro: 10 mm; altura: 2 mm) a partir de
tres diferentes componentes de PMMA.
- -
- Cemento óseo a base de PMMA (Cía. Merck KgaG, Alemania, Aut. nº 5181.00.00), conformes con la descripción de producto (40 g de polvo + 20 ml de líquido);
- -
- Se mezclaron 10 g de granulado de PMMA/PHEMA (metacrilato de polihidroxietilo), tamaño de partícula 0,5-0,6 mm (Cía. Biomet) con 1,3 ml de una solución de HEMA (68,6% de HEMA, 29,4% de TEGMA [dimetacrilato de trietilenglicol], 2% de tBPB (peroxibenzoato de terc-butilo), adhiriéndolo de esta forma a un material de soporte poroso.
- -
- Se mezclaron 10 g de granulado de PMMA (Plex Y7H, Röhm, Alemania), fracción de grano 0,7-2 mm, con 1,5 ml de una solución de metacrilato de metilo (MMA) (68,6% de MMA, 29,4% de TEGMA, 2% de tBPB), adhiriéndolos de esta forma a un material de soporte poroso.
Para el acoplamiento covalente de los péptidos de
acrilato a los cuerpos moldeados de PMMA
pre-polimerizados, se prepararon soluciones madre de
los péptidos de acrilato 1, 2, 3 y 4 en una concentración final de,
respectivamente, 100 \muM en DMSO/0,2% de
canfor-quinona (peso/volumen). A continuación, y
mediante dilución con isopropanol/0,2% de
canfor-quinona (p/v) se prepararon series de
dilución con concentraciones de péptidos de, respectivamente, 0,1
nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 \muM y 10 \muM. Los cuerpos
moldeados se incubaron durante 2 horas a luz solar y a temperatura
ambiente y, seguidamente, se almacenaron bajo condiciones de
sequedad a 4ºC. Antes de su uso, las muestras se lavaron tres veces
con PBS, pH 7,4, para retirar los péptidos no fijados, y se
almacenaron durante una noche en PBS, pH 7,4, a 4ºC.
Por la adición de sendos 250 \mul/cuerpo
moldeado de una solución de BSA al 5% en PBS, pH 7,4, y
subsiguiente incubación durante 2 horas a temperatura ambiente y un
lavado único con PBS, pH 7,4, se bloquearon las posiciones de unión
celular inespecíficas.
A modo de controles negativos, se utilizan
cuerpos moldeados de PMMA tratados con una solución de
isopropanol/canfor-quinona al 0,2% (p/v) en lugar
de las soluciones de péptidos.
A continuación, se investigó la adhesión de
osteoblastos de la línea MC3T3-H1, obtenidos del
cráneo de ratones neonatos (Heermeier et al., 1995, Cells
and Materials 5: 309-321) sobre las superficies
recubiertas de péptidos anteriormente mencionadas.
Los osteoblastos MC3T3-H1 se
sembraron, con una densidad de siembre a 48.000 células/cm^{2},
de la forma anteriormente descrita, en el interior de placas de 48
pocillos de Costar, sobre cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con
el péptido RGD y, seguidamente, se incubaron a 37ºC durante 1 hora
con 95% de humedad relativa del aire y 5% de CO_{2}. A
continuación, se retiraron con dos lavados con PBS, pH 7,4, las
células no adheridas durante el experimento.
La cuantificación de las células adheridas tuvo
lugar de manera indirecta durante la determinación de actividad de
la enzima celular N-acetil- hexosaminidasa,
utilizando una curva estándar correspondiente, según el método de
Landegren (1984, J. Immunol. Methods, 67:
379-388).
El comportamiento de fijación de los osteoblastos
MC3T3-H1 a diferentes cuerpos moldeados de PMMA,
recubiertos con los citados péptidos RGD de acrilato 1 (tipo iia),
2 (tipo iib), 3 (tipo IIIa) y 4 (tipo iiib) se corresponde,
respectivamente, con una curva de titulación. Los índices máximos de
adsorción ascienden a aproximadamente 20% para el péptido de
acrilato 1 y a aproximadamente 80-100% para los
péptidos de acrilato 2, 3 y 4. Los fijaciones celulares
semi-máximas tienen lugar con una concentración de
péptidos RGD en la solución de recubrimiento de aproximadamente
1-10.000 nM para los péptidos de acrilato 2, 3 y
4.
Los índices de adsorción celular descritos sobre
cuerpos moldeados de cemento óseo recubiertos con péptidos RGD
están aumentados con respecto a las superficies no recubiertas en
aproximadamente 1,5 veces (péptido de acrilato 1) y en
aproximadamente 5-15 veces (péptidos de acrilato 2,
3 y 4) (Fig. 8).
Los índices de adsorción celular descritos sobre
cuerpos moldeados porosos de PMMA/granulado de PHEMA, recubiertos
con el péptido RGD están aumentados con respecto a las superficies
no recubiertas en 2-5 veces (péptidos de acrilato 2,
3 y 4) (Fig. 9).
Los índices de adsorción celular descritos sobre
cuerpos moldeados porosos de granulado de Plex Y7H, recubiertos con
el péptido RGD están aumentados con respecto a las superficies no
recubiertas en 2-3 veces (péptidos de acrilato 2, 3
y 4) (Fig. 10).
Para las muestras de PMMA/PHEMA o para las
muestras de PMMA-Plex Y7H se observa tanto un mayor
ancho de fluctuación de los valores de adherencia celular como una
adhesión más intensa de los osteoblastos sobre muestras de control
no recubiertas, manteniéndose invariables los índices máximos de
adsorción sobre muestras recubiertas con péptidos RGD, que para los
cuerpos moldeados de cemento óseo de PMMA.
Para los péptidos de acrilato 2, 3 y 4 se
observan, tanto en la comparación entre sí, como en comparación con
los péptido de tiol 1 y 2 usados en los controles de
BSA-ensayo, estimulaciones muy similares de la
adhesión celular. Por el contrario, el péptido más corto, el
péptido de acrilato 1, es casi inactivo. De aquí puede deducirse
que es necesaria una distancia mínima crítica entre la secuencia de
reconocimiento celular RGD y la superficie del material de
aproximadamente 2,5-3,5 nm para poder alcanzar una
adherencia celular estéricamente eficaz (Fig. 11).
La superior actividad del péptido de acrilato 3
sobre el soporte de cemento óseo-PMMA indica una
estructura molecular óptima para la adhesión celular en lo que se
refiere tanto a la longitud de la molécula como, eventualmente, a la
distribución y comportamiento de hidrofilia/hidrofobia en el
espaciador.
Para analizar la adhesión celular de osteoblastos
a superficies metálicas recubiertas con péptidos, se dotaron
cuerpos moldeados de acero fino V4A (7x7x1 mm^{3}) con tres
diferentes variantes de recubrimiento, recubriéndolas
respectivamente y a continuación con péptidos RGD. A tal efecto, los
cuerpos moldeados de acero fino se incubaron, con objeto de
purificarlos, durante 15 min a 60ºC en un baño de ultrasonidos, se
enjuagaron con agua VE, se incubaron durante 30 min en acetona, se
volvieron a enjuagar con agua VE y se incubaron durante 24 horas a
60ºC para
secarlos.
secarlos.
A continuación, las placas de acero fino de
recubrieron por medio de tres variantes:
Se aplicó la solución Kevloc®-Primer en una capa
delgada y se incubó durante 3 min a temperatura ambiente.
Seguidamente, se aplicó también la solución Kevloc®-Bond en capa
delgada y se activó durante 20 min en un horno de calcinación a
180ºC. Puesto que esta variante de recubrimiento dispone
directamente restos acrilato libres sobre la superficie metálica,
fue posible acoplar seguidamente el péptido de acrilato 3, tipo
iiia, directamente de forma covalente, del modo descrito en el
Ejemplo 3 para el cemento óseo de PMMA polimerizado.
Se aplica la solución Siliseal® en una capa
delgada y se seca durante 5 min a temperatura ambiente. A
continuación, se aplica también la solución Sililink® y se activa
durante 3 min a 320ºC en un horno de calcinación.
Para la disposición de restos acrilato sobre las
superficies metálicas, los cuerpos moldeados de acero fino
pretratados se sumergieron en agua VE calentada a 75ºC y ajustada a
pH aproximadamente 8,00 con NaOH. Seguidamente, se añadió durante
el espacio de una hora una solución al 1% de
3-metacriloxi-propil-trimetoxisilano
(Cía. Hüls AG, Alemania) bajo agitación, hasta alcanzar un valor
de pH de aproximadamente 6,50. Se continuó agitando durante una
hora a 75ºC y el valor de pH descendió en ese momento a
aproximadamente 6,35.
La unión del péptido de acrilato 3, tipo iiia,
tuvo lugar de la forma descrita en el Ejemplo 3 para el cemento
óseo PMMA polimerizado.
Esta variante de recubrimiento tuvo lugar de
forma correspondiente con un procedimiento de silanización,
descrito en el documento DE-OS 43321005, y que se
refirió originalmente a la práctica técnica del recubrimiento de
pigmentos con brillo perlado para sistemas de laca en agua para
metales y materias sintéticas en la industria del automóvil y de las
materias sintéticas. Para ello, los cuerpos moldeados de acero fino
se sumergieron en agua VE calentada a 75ºC y ajustada a pH
aproximadamente 8,00 con NaOH y, durante un período de dos horas se
agregó una solución de AlCl_{3} bajo agitación. A continuación,
se agregó, también con agitación y durante dos horas, una solución
al 5% de silicato sódico. Seguidamente, se añadió, bajo agitación,
una solución al 1% de
metacriloxi-propil-trimetoxisilano
(Cía. Hüls AG, Alemania) durante una hora. Entonces, se agitó
durante una hora a 75ºC y el valor de pH estuvo en ese momento en
aproximadamente 6,40.
La fijación del péptido de acrilato 3, tipo iiia,
tuvo lugar de la forma descrita en el Ejemplo 3 para el cemento
óseo de PMMA polimerizado.
Después de haber recubierto los cuerpos moldeados
de acero fino con el péptido de acrilato 3, tipo iiia, según los
tres procedimientos diferentes, se investigó la adhesión de
osteoblastos de la línea MC3T3-H1.Para ello, se
procedió de la forma descrita en el Ejemplo 3.
El comportamiento de unión de los osteoblastos
MC3T3-H1 a los cuerpos moldeados de acero fino V4A
pretratados con tres procedimientos diferentes y recubiertos con el
citado péptido de acrilato 3, se corresponde, respectivamente, con
una curva de titulación (Fig. 12). Los índices máximos de adhesión
ascienden a aproximadamente 60% para el recubrimiento de pigmento y
a aproximadamente 80% para los procedimiento Kevloc® y Silicoater®.
Las uniones celulares semi-máximas tienen lugar con
una concentración de péptido RGD en la solución de recubrimiento de
aproximadamente 1-100 nM para todas las variantes de
recubrimiento. Los índices de adsorción celular descritos sobre
cuerpos moldeados de acero fino recubiertos con péptido RGD se
encuentran elevados, con respecto a los controles no recubiertos,
en aproximadamente 3-8 veces. Para los
procedimientos Kevloc® y Silicoater® se prepararon,
respectivamente, recubrimientos adicionales, utilizando únicamente
una solución de recubrimiento (Kevloc®-Primer solo, Kevloc®-Bond
solo, Siliseal® solo, Sililink® solo). No se encontraron
diferencias significativas de la adhesión celular en comparación con
los correspondientes dobles recubrimientos (Kevloc®-Primer/Bond,
Siliseal®/Sililink®).
Como investigación complementaria, no sólo de la
adhesión de osteoblastos, sino también de su proliferación sobre
superficies recubiertas con péptidos RGD, se procedió del modo
siguiente:
En relación con el acoplamiento covalente del
péptido de acrilato 3, tipo iiia, sobre un cuerpo moldeado de
cemento óseo PMMA, se seleccionó un procedimiento de recubrimiento
descrito en el Ejemplo 3.
A continuación, se adhirieron osteoblastos de
ratón MC3T3-H1, de la forma descrita también en el
Ejemplo 3, sobre este cuerpo moldeado de cemento óseo recubierto
con el péptido RGD, pero con dos diferencias: se sembraron 12.000
células/cm^{2} en lugar de 48.000 células/cm^{2} y el tiempo de
adhesión ascendió a dos horas en lugar de una. Adicionalmente, sólo
se analizaron tres concentraciones de péptidos diferentes en la
solución de recubrimiento: 0,01 \muM, 1 \muM y 100 \muM.
Después de retirar por lavado las células no
adheridas, los osteoblastos MC3T3-H1 se cultivaron
en medio de cultivo que contuvo suero (al 10%), durante un período
de 15 días, a 37ºC bajo 95% de humedad relativa del aire y 5% de
CO_{2}. Se cambió el medio dos veces a la semana y se determinó el
número de células después de 1, 2, 3, 4, 5, 10 y 15 días por medio
del Ensayo WST-1 de Boehringer Mannheim, Alemania.
Se demostró, respectivamente, una evolución típicamente exponencial
de la proliferación celular de los osteoblastos cultivados (Fig.
13). El número máximo de células alcanzado dependió, de forma
directa, de la concentración del péptido RGD en la solución de
recubrimiento. De esta forma, después de 15 días de cultivo se
determinaron por cm^{2} aproximadamente 1.000.000 células
(péptido 100 \muM ), aproximadamente 550.000 células (péptido 1
\muM), aproximadamente 300.000 células (péptido 0,01 \muM) o
aproximadamente 230.000 células (controles sin péptido). Con la
concentración máxima de péptido, de 100 \muM, se logró, por
consiguiente, un incremento de 4-5 veces de la
proliferación celular en comparación con las muestras no
recubiertas.
Como modelo del recubrimiento de material con
péptidos RGD de diferentes selectividad celular para la obtención
de implantes con patrones de recubrimiento bioactivo localmente
diferenciados, que deben estimular la adhesión de diversas especies
celulares, se utilizaron cuerpos moldeados de cemento óseo PMMA
polimerizado, a los cuales se acoplaron de forma covalente dos
péptidos RGD de distinta selectividad celular. En este caso, se
fijaron al cuerpo moldeado de PMMA el péptido de acrilato 3, tipo
iiia, con selectividad para osteoblastos portadores de la integrina
alfa_{v}beta_{3}/alfa_{v}beta_{5}, y el péptido de acrilato
5, tipo iiia, con selectividad para trombocitos
alfa_{IIb}beta_{3}-positivos, como se han
descrito en el Ejemplo 3.
- a.
- En el primer ensayo parcial, se recubrieron cuerpos moldeados de PMMA con los péptidos de acrilato 3 y 5, en concentraciones en la solución de recubrimiento de, respectivamente, 100 \muM, 10 \muM y 1 \muM. Acto seguido, estos materiales recubiertos con péptidos RGD se inocularon paralelamente con osteoblastos y trombocitos y se determinó su adhesión celular. Tanto sobre los cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con el péptido de acrilato 3 como sobre los recubiertos con el péptido de acrilato 5 se sembraron, de manera paralela, osteoblastos MC3T3-H1 (350.000 células/cm^{2}) o trombocitos humanos (50 millones de células/cm^{2}) y se determinó su adherencia celular, de la forma descrita en el Ejemplo 3.
- Los trombocitos humanos se prepararon de acuerdo con el procedimiento de Shattil y Brass (J. Biol. Chem. 262: 992-1000, 1987).
- Con este experimento se pudo demostrar la selectividad celular de los dos péptidos RGD.
- Sobre los cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con el péptido de acrilato 3 (alfa_{v}beta_{3}/alfa_{v}beta_{5}-selectivo) se adhirieron, preferentemente, los osteoblastos alfa_{v}beta_{3}/alfa_{v}beta_{5}-positivos, en comparación con los trombocitos alfa_{v}beta_{3}/alfa_{v}beta_{5}-negativos (Fig. 14). En este caso, se encontraron para los osteoblastos Abs calculadas (405 nm) de aproximadamente 6,0 (para el péptido 100 \muM en la solución de recubrimiento), aproximadamente 2,0 (para el péptido 10 \muM) o aproximadamente 1,8 (para el péptido 1 \muM). Por el contrario, para los trombocitos se encontraron valores de adhesión celular significativamente menores de aproximadamente 3,0 Abs (para el péptido 100 \muM en la solución de recubrimiento), aproximadamente 1,5 Abs (para el péptido 10 \muM), o aproximadamente 0,2 Abs (para el péptido 1 \muM). Por el contrario, sobre los cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con el péptido de acrilato 5 (alfa_{IIb}beta_{3}-selectivo), se encontró el efecto inverso. En este caso, se adhirieron, preferentemente, los trombocitos alfa_{IIb}beta_{3}-positivos, en comparación con los osteoblastos alfa_{IIb}beta_{3}-negativos (Fig. 15).
- En este caso, se encontraron Abs calculadas para los trombocitos (405 nm) de aproximadamente 4,0 (para el péptido 100 \muM en la solución de recubrimiento), aproximadamente 0,5 (para el péptido 10 \muM) o aproximadamente 0,2 (para el péptido 1 \muM). Para los osteoblastos, por el contrario, se encontraron valores de adhesión celular significativamente menores de aproximadamente 1,5 Abs (para el péptido 100 \muM en la solución de recubrimiento), aproximadamente 1,0 Abs (para el péptido 10 \muM) o aproximadamente 0,2 Abs (para el péptido 1 \muM).
- b.
- En el segundo ensayo parcial se recubrieron también cuerpos moldeados de PMMA con los péptidos de acrilato 3 y 5, pero con sólo una concentración en la solución de recubrimiento de 100 \muM. A continuación, estos materiales recubiertos con péptidos RGD se inocularon paralelamente con osteoblastos, trombocitos o una mezcla de osteoblastos y trombocitos, determinando su adhesión celular. Tanto en los cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con el péptido de acrilato 3 como en los recubiertos con el péptido de acrilato 5, se sembraron, de forma paralela, osteoblastos MC3T3-H1 (350.000 células/ cm^{2}), trombocitos humanos (50 millones de células/cm^{2}) o una mezcla celular (350.000 osteoblastos/cm^{2} o 50 millones de trombocitos/cm^{2}) y se determinó su adherencia celular de la forma descrita en el Ejemplo 3.
En los cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con
el péptido de acrilato 3 se adhirieron, preferentemente,
osteoblastos
alfa_{v}beta_{3}/alfa_{v}beta_{5}-positivos
(aproximadamente, 6,0 Abs), en comparación con los trombocitos
alfa_{v}beta_{3}/
alfa_{v}beta_{5}-negativos (aproximadamente 3,0 Abs) (Fig. 16). Al sembrar las dos especies celulares en forma de mezcla, se obtuvo un resultado correspondiente al de los osteoblastos solos (aproximadamente 6,5 Abs).
alfa_{v}beta_{5}-negativos (aproximadamente 3,0 Abs) (Fig. 16). Al sembrar las dos especies celulares en forma de mezcla, se obtuvo un resultado correspondiente al de los osteoblastos solos (aproximadamente 6,5 Abs).
Sobre los cuerpos moldeados de PMMA recubiertos
con el péptido de acrilato 5
(alfa_{IIb}beta_{3}-selectivo), por el
contrario, se encontró el efecto inverso. En este caso, se
adhirieron, preferentemente, los trombocitos
alfa_{IIb}beta_{3}-positivos (aproximadamente
4,0 Abs), en comparación con los osteoblastos
alfa_{IIb}beta_{3}-negativos (aproximadamente
1,5 Abs) (Fig. 17). Al sembrar ambas especies celulares en forma de
mezcla, se obtuvo un resultado correspondiente, aproximadamente, a
la suma de los valores individuales para trombocitos y osteoblastos
(aproximadamente 6,5 Abs).
Estos resultados confirman que los recubrimientos
de las superficies de implantes con diferentes péptidos RGD
cito-selectivos se pueden utilizar para generar
implantes que medien en la adherencia preferida de especies
celulares seleccionadas. En este caso, la comparación entre
osteoblastos y trombocitos demuestra que:
- -
- el recubrimiento superficial con péptidos RGD selectivos para las integrinas puede estimular claramente la adhesión de aquellas especies celulares que disponen de una configuración de integrina complementaria, frente a las células que no poseen, o sólo lo hacen en grado reducido, estas integrinas especiales;
- -
- este efecto se mantiene también en caso de utilizar mezclas de células, lo que se aproxima esencialmente más al estado real in vivo.
Claims (14)
1. Implante, adecuado para diferentes órganos
humanos o animales, compuesto esencialmente por una matriz
portadora y un recubrimiento peptídico que reviste a esta matriz,
que comprende, para la estimulación dirigida de la adherencia de
células del cuerpo humano o animal, péptidos idénticos o diferentes
que poseen secuencias que reconocen puntos de unión en los
receptores de las integrinas responsables de la adhesión, en
células humanas o animales, en el que la matriz portadora tiene en
su superficie grupos reactivos capaces de fijación que,
adicionalmente, son capaces de formar con los correspondientes
grupos reactivos funcionales de dicha capa peptídica, una unión
covalente, caracterizado porque los mencionados péptidos
dispuestos en la superficie del implante se seleccionan y se
disponen localmente de manera que, gracias a su actividad
estimulante de la adhesión celular, relacionada con las estructuras
correspondientemente diferentes, se corresponden de forma específica
con el patrón de integrina complementario, diferente y natural de
las células del tejido que le son adyacentes en las respectivas
regiones, en las cuales se debe introducir el implante, lo que
tiene como consecuencia la presencia de un patrón de recubrimiento
bioactivo, selectivo y localmente diferenciado de la superficie del
implante.
2. Implante según la reivindicación 1,
caracterizado porque los citados péptidos se fijan en la
superficie del implante con la ayuda de moléculas de anclaje.
3. Implante según la reivindicación 2,
caracterizado porque las moléculas de anclaje están
compuestas por una de las siguientes estructuras:
(i)-CO-(CH_{2})_{k}-X-SH,
en donde X es un enlace sencillo o
-CO-NH-(CH_{2})_{I}-,
k significa 2 hasta 12 e I = 2
hasta
4;
(ii)-CO-(CH_{2})_{m}-[NH-CO-(CH_{2})_{n}]_{p}-NH-CO-CH=CH_{2},
en donde m, n significan 2 hasta 8;
p = 0 hasta
2;
(iii)-(CO-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-NH)
_{q}-CO-(CH_{2})_{r}-NH-CO-CH=CH_{2}
en donde q significa 1 hasta 3 y r
= 2 hasta
8.
4. Implante según la reivindicación 3,
caracterizado porque la molécula de anclaje se selecciona de
una de las siguientes estructuras:
(ia)-CO-CH_{2}-CH_{2}-SH;
(ib)-CO-CH_{2}-CH_{2}-CO-NH-CH_{2}-CH_{2}-SH;
(iia)-CO-(CH_{2})_{5}-NH-CO-CH=CH_{2};
(iib)-CO-(CH_{2})_{5}-NH-CO-(CH_{2})_{5}-NH-CO-CH=CH_{2};
(iiia)-CO-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-(CH_{2})_{5}-NH-CO-CH=CH_{2};
(iiib)-(CO-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-NH)
_{2}-CO-(CH_{2})_{5}-NH-CO-CH=CH_{2}
5. Implante según una de las reivindicaciones 2 a
4, caracterizado porque los péptidos están unidos a través
del grupo carboxilo de la molécula de anclaje por enlaces de amida,
y la molécula de anclaje está unida a la superficie del implante a
través de los grupos mercapto o acrilato.
6. Implante según la reivindicación 5,
caracterizado porque la molécula de
anclaje-péptido de este tipo se fija a la superficie
del implante, de modo que se establece una distancia mínima
absoluta y estéricamente crítica entre los dominios de
reconocimiento celular del péptido y una superficie recubierta del
material de 2,5 hasta 3,5 nm.
\newpage
7. Implante según las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque los péptidos son capaces de fijarse a
células que expresan
\alpha_{v}\beta_{3}/\alpha_{v}\beta_{5}.
8. Implante según una de las reivindicaciones 1 a
7, caracterizado porque posee péptidos con la secuencia de
aminoácidos RGD.
9. Implante según la reivindicación 8,
caracterizado porque posee péptidos de la secuencia
ciclo-RGDfK.
10. Implante según una de las reivindicaciones 1
a 9, caracterizado porque tiene entre los citados péptidos
o moléculas de anclaje-péptidos y la superficie de
la matriz portadora, una capa intermedia que fomenta la adhesión
y/o moléculas ramificadas que ejercen un efecto amplificador de la
superficie.
11. Implante según una de las reivindicaciones 1
a 10, caracterizado porque la matriz portadora es una pieza
moldeada de cerámica, material polímero o metal, o representa una
estructura de estos materiales que puede estar formada como órgano
biohíbrido por medio de la colonización con células in vivo o
in vitro.
12. Procedimiento para la fabricación de
implantes según las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado
porque
- (i)
- se determina por un sistema de ensayo in vitro la estructura del receptor de integrina del tejido diana, en el que se debe incorporar in vivo el implante,
- (ii)
- se seleccionan o sintetizan los citados péptidos con la correspondiente estructura complementaria, y
- (iii)
- los citados péptidos se fijan de forma covalente directamente, o a través de las mencionadas moléculas de anclaje, sobre la respectiva superficie, eventualmente modificada del implante, en donde la disposición local de los diferentes péptidos sobre la superficie del implante debe corresponderse con la respectiva disposición local, previamente determinada, de las células diana con el patrón de integrinas complementario, en el que se debe incorporar el implante.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la determinación in vitro de la
estructura de los receptores de integrina del tejido diana se lleva
a cabo por medio de anticuerpos inmuno- histológicamente
activos.
14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó
13, caracterizado porque el acoplamiento de los citados
péptidos, o de la molécula de anclaje-péptido, se
realiza sobre la superficie del implante por medio de otros
procedimientos conocidos para otros tipos de recubrimiento.
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Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6312474B1 (en) * | 1999-09-15 | 2001-11-06 | Bio-Vascular, Inc. | Resorbable implant materials |
US6726718B1 (en) | 1999-12-13 | 2004-04-27 | St. Jude Medical, Inc. | Medical articles prepared for cell adhesion |
JP2001190570A (ja) * | 2000-01-14 | 2001-07-17 | Science & Tech Agency | 人工歯根 |
DE10040103A1 (de) * | 2000-08-17 | 2002-02-28 | Merck Patent Gmbh | Peptid- und Peptidmimetika-Derivate mit Integrin-Inhibitor-Eigenschaften II |
DE10040105A1 (de) * | 2000-08-17 | 2002-02-28 | Merck Patent Gmbh | Peptid- und Peptidmimetika-Derivate mit Integrin-Inhibitor-Eigenschaften |
AU2001221607A1 (en) | 2000-11-20 | 2002-05-27 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Endosseous implant |
JP4043789B2 (ja) * | 2001-01-24 | 2008-02-06 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 表面を修飾するための方法 |
US20040126900A1 (en) * | 2001-04-13 | 2004-07-01 | Barry Stephen E | High affinity peptide- containing nanoparticles |
WO2003014072A1 (en) * | 2001-08-07 | 2003-02-20 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | Disulfide and thiosulfonate ligands and libraries comprising these ligands |
US7371258B2 (en) | 2001-10-26 | 2008-05-13 | St. Jude Medical, Inc. | Valved prosthesis with porous substrate |
WO2003072542A2 (en) * | 2001-11-20 | 2003-09-04 | Duke University | Interfacial biomaterials |
US20030161938A1 (en) * | 2002-02-22 | 2003-08-28 | Bo Johnson | Composition and method for coating medical devices |
KR20030087430A (ko) * | 2002-05-10 | 2003-11-14 | 장준혁 | Ti 금속에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드 |
US20030220696A1 (en) * | 2002-05-23 | 2003-11-27 | Levine David Jerome | Implantable porous metal |
US20050074437A1 (en) * | 2003-10-06 | 2005-04-07 | Domonkos Horvath | Device for the regeneration of tissue, specifically bone regeneration by means of callus distraction |
KR101013999B1 (ko) * | 2004-03-19 | 2011-02-14 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 차폐막 및임플란트 |
CA2562018A1 (en) * | 2004-04-05 | 2005-10-20 | Medivas, Llc | Bioactive stents for type ii diabetics and methods for use thereof |
DE102004025130A1 (de) * | 2004-05-18 | 2005-12-08 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Körperschaft des Öffentlichen Rechts | Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von Sludgeablagerungen auf Materialien für Endoprothesen sowie Endoprothese |
EP1771214A2 (en) | 2004-06-16 | 2007-04-11 | Affinergy Inc. | Biofunctional coatings |
JP2006068378A (ja) * | 2004-09-03 | 2006-03-16 | Terumo Corp | 血管内留置物 |
US7531505B2 (en) * | 2006-01-11 | 2009-05-12 | Affinergy, Inc. | Compositions and methods for promoting attachment of cells of endothelial cell lineage to medical devices |
US7807624B2 (en) * | 2006-01-11 | 2010-10-05 | Affinergy, Inc. | Methods and compositions for promoting attachment of cells of endothelial cell lineage to medical devices |
WO2008143733A2 (en) * | 2007-03-02 | 2008-11-27 | Dohney Eye Institute | Biocompatible implants and methods of making and attaching the same |
US20080305320A1 (en) * | 2007-03-02 | 2008-12-11 | Lucien Laude | Nanoscale surface activation of silicone via laser processing |
US20090053280A1 (en) * | 2007-05-15 | 2009-02-26 | Michael Joner | Coating stents with cyclic rgd peptides or mimetics |
CN101891801B (zh) * | 2009-05-22 | 2012-09-05 | 首都医科大学 | 饱和脂肪链醇rgd五肽双酯化合物及其合成方法和应用 |
CN101891800B (zh) * | 2009-05-22 | 2012-09-12 | 首都医科大学 | 饱和脂肪链醇rgd五肽酯化合物及其合成方法和用途 |
DE102009026622A1 (de) | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Formkörper mit eingebetteten Kopplungspartikeln für Biomoleküle |
CN101817873A (zh) * | 2010-03-11 | 2010-09-01 | 复旦大学 | 一种促进细胞黏附的多肽及其制备方法 |
CN103845759A (zh) * | 2014-03-14 | 2014-06-11 | 国家纳米科学中心 | 一种组织工程界面修饰材料、其修饰方法及应用 |
KR101681886B1 (ko) | 2015-04-06 | 2016-12-12 | 서울대학교산학협력단 | 지르코니아 결합능을 가지는 펩타이드 |
DE202015006574U1 (de) * | 2015-09-17 | 2015-11-13 | Universität Leipzig | Peptid zur Beschichtung von Oberflächen |
CN106361280A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-01 | 孟玲 | 一种组合虹膜和皮层组织的生物光学成像装置采用的光学成像装置 |
CN109675098A (zh) * | 2019-01-09 | 2019-04-26 | 山东大学 | 一种便于骨结合的氧化锆表面制备生物活性涂层的方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1992000047A1 (en) | 1990-06-22 | 1992-01-09 | Case Western Reserve University | Process for controlling cell growth on surfaces |
DE4228717A1 (de) * | 1992-08-28 | 1994-03-03 | Cassella Ag | Imidazolidin-Derivate |
US5641644A (en) * | 1994-12-09 | 1997-06-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method and apparatus for the precise positioning of cells |
US7008634B2 (en) * | 1995-03-03 | 2006-03-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell growth substrates with tethered cell growth effector molecules |
-
1998
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PL337019A1 (en) | 2000-07-31 |
CN1256635A (zh) | 2000-06-14 |
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