CN105102469A - 交联的肽水凝胶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水凝胶，其包含能够自组装成三维大分子纳米纤维状网络的多个两亲肽和/或类肽,所述纳米纤维状网络包埋水并形成所述水凝胶，其中至少一部分所述多个两亲肽和/或类肽是化学交联的。本发明进一步涉及制备这样的水凝胶的方法以及这样的水凝胶的各种用途，例如作为细胞培养基底的用途，用于药物递送和基因递送的用途，作为伤口敷料的用途，作为植入物的用途，作为原位胶化的可注射剂的用途，在药物组合物或化妆品组合物中的用途，在再生医学中的用途，在组织工程和组织再生中的用途，或在电子装置中的用途。其还涉及使用依照本发明的水凝胶的组织再生或组织替代的方法。

Description

交联的肽水凝胶

技术领域

本发明涉及水凝胶，其包含能够自组装成三维大分子纳米纤维状网络的多个两亲肽和/或类肽(peptoid),所述纳米纤维状网络包埋水并形成所述水凝胶，其中至少一部分所述多个两亲肽和/或类肽是化学交联的。本发明进一步涉及制备这样的水凝胶的方法以及这样的水凝胶的各种用途，例如作为细胞培养基底的用途，用于药物递送和基因递送送的用途，作为伤口敷料的用途，作为植入物的用途，作为原位胶化的可注射剂的用途，在药物组合物或化妆品组合物中的用途，在再生医学中的用途，在组织工程和组织再生中的用途，或在电子装置中的用途。其还涉及使用依照本发明的水凝胶的组织再生或组织替代的方法。

背景技术

超分子结构通过负责组织多分子系统的分子间键保持在一起。对于确定的超分子结构的组装所需要的非共价的分子间力主要是静电相互作用、氢键键合、范德华力等。超分子化学或生物学聚集了通过化学或生物学物质的缔合形成的大量二维或三维复杂结构和实体。这些缔合作用由分子互补性或分子识别和自组装的原理来决定。关于分子间缔合规则的知识可以用来设计膜、薄膜、层、胶团、小管、凝胶形式的多分子组装体，用于多种生物医学或生物技术应用(J.-M.Lehn,Science,295,2400-2403,2002)。

肽已经被用于通过分子自组装制造超分子结构(S.Zhang,NatureBiotechnology,21,1171-1178,2003)。例如肽能够组装成纳米管(US7,179,784)或自组装成超分子水凝胶，所述超分子凝胶由具有大量的约98-99％固定化的水或水溶液的三维支架组成。基于肽的生物材料是用于生物技术、医学和甚至技术应用中的潜在应用的有力工具。取决于各自的特性，这些基于肽的水凝胶被认为在用于组织工程、再生医学的新材料的开发中起作用，用作药物和疫苗递送载体或用作用于药物研究和诊断的肽芯片(E.Place等人,NatureMaterials,8,457-470,2009)。对利用基于肽的自组装的生物材料诸如凝胶用于开发分子电子装置也存在着强烈的兴趣(A.R.Hirst等人.Angew.Chem.Int.Ed.,47,8002-8018,2008)。

已经产生了多种“智能肽水凝胶”，其响应于外部操作条件诸如温度、pH、机械影响或其他刺激，具有溶胀、收缩或分解的动态表现。尽管如此，这些生物材料仍然不够“先进”从而足以模拟天然组织如例如细胞外基质(ECM)或软骨组织或其他组织的生物学变异性。对于肽水凝胶的有意义用途的挑战是不仅作为“空隙填充物”或机械支架模拟替代天然组织，而且还要理解和处理将所包含的细胞保持在正确位置并且处于“体内”条件的生物化学信号和生理要求(R.Fairman和K.Akerfeldt,CurrentOpinioninStructuralBiology,15,453-463,2005)。

已经付出了许多努力来理解和控制肽序列和结构之间的关系以合理地设计合适的水凝胶。通常水凝胶含有宏观结构诸如缠结并形成网络的纤维。大多数基于肽的水凝胶利用组装成纤维的β-折叠片层作为它们的结构单元。后来显示有可能设计完全来自α-螺旋的水凝胶化自组装纤维。除了基于β-片层结构的材料(S.Zhang等人,PNAS,90,3334-3338,1993:A.Aggeli等人,Nature,386,259-262,1997,etc.)以外，已经开发了许多α-螺旋水凝胶(W.A.Petka等人,Science,281,389-392,1998；C.Wang等人,Nature,397,417-420,1999；C.Gribbon等人,Biochemistry,47,10365-10371,2008；E.Banwell等人,NatureMaterials,8,596-600,2009,etc.)。

但是，当前已知的肽水凝胶在大部分情况下与低的刚性有关，有时与不适宜的生理学特性和/或复杂性以及对导致高的生产成本的大量加工的要求有关。因此对于容易形成、无毒性且对于标准应用具有足够高的刚性的肽水凝胶存在广泛认识到的需求。水凝胶还应当适合于递送生物活性部分(诸如核酸，小分子治疗药物，化妆品和抗微生物剂)和/或用作支持细胞的体内和体外生长并促进天然组织的再生的仿生支架。

发明内容

因此合乎需要的是提供能够形成水凝胶的生物相容性化合物，所述水凝胶比目前可获得的水凝胶更高程度地满足至少一些上面的要求并且不受上面提到的那些限制性的限制。

公开了一种能够形成水凝胶的两亲肽和/或类肽，所述两亲肽和/或类肽包含由下列各项组成的两亲序列：

n个脂肪族氨基酸的疏水序列段，其中n为2-15的整数，和

与所述疏水序列段相连并且具有极性部分的亲水序列段，所述极性部分是酸性的、中性的或碱性的，所述极性部分包含m个邻接的亲水氨基酸，其中m为1-5的整数。

在一个实施方案中，两亲肽和/或类肽具有C-末端和N-末端，其中N-末端被保护基保护，其中所述保护基优选是乙酰基。

在一个实施方案中，两亲肽和/或类肽具有C-末端,如果碱性极性氨基酸位于C-末端处，则其优选是被酰胺化的。

在一个实施方案中，n是2-6的整数。

在一个实施方案中，m是1-2的整数。

在一个实施方案中，两亲肽和/或类肽由o个如上面所定义的两亲序列组成，所述两亲序列彼此相连，o为1-50的整数。

在一个实施方案中，对于给定的两亲肽和/或类肽，所述脂肪族氨基酸和所述亲水氨基酸是D-氨基酸或L-氨基酸。

在一个实施方案中，每个亲水氨基酸具有极性基团，所述极性基团独立地选自羟基、醚基、羧基、亚胺基、酰胺基、酯基、氨基、胍基、硫代、硫醚基、硒基和碲基。

在一个实施方案中，所述亲水序列段的所述极性部分包含m个邻接的亲水氨基酸,m如上所定义，所述亲水氨基酸选自包括下列各项的组：天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(茶氨酸)、瓜氨酸、硫代-瓜氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、蛋氨酸、乙硫氨酸、硒代蛋氨酸、碲代蛋氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、丝氨酸、同型丝氨酸、精氨酸、同型精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和N(6)-羧基甲基赖氨酸、组氨酸，并且其中所述疏水序列段包含n个脂肪族氨基酸，n如上所定义，所述脂肪族氨基酸选自包括下列各项的组：异亮氨酸、正亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、同型烯丙基甘氨酸和同型炔丙基甘氨酸。

在一个实施方案中，m为1-2。

在一个实施方案中，m为2且所述极性部分包含两个相同的氨基酸,或m为1且所述极性部分包含天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和组氨酸中的任一个。

在一个实施方案中，所述极性部分邻接n个脂肪族氨基酸的疏水序列段。

在一个实施方案中，所述极性部分具有选自Asp、Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、Cys、Met、Lys、His、Asn-Asn、Asp-Asp、Glu-Glu、Gln-Gln、Asn-Gln、Gln-Asn、Asp-Gln、Gln-Asp、Asn-Glu、Glu-Asn、Asp-Glu、Glu-Asp、Gln-Glu、Glu-Gln、Asp-Asn、Asn-AspThr-Thr、Ser-Ser、Thr-Ser、Ser-Thr、Asp-Ser、Ser-Asp、Ser-Asn、Asn-Ser、Gln-Ser、Ser-Gln、Glu-Ser、Ser-Glu、Asp-Thr、Thr-Asp、Thr-Asn、Asn-Thr、Gln-Thr、Thr-Gln、Glu-Thr、Thr-Glu的序列。

在一个实施方案中，所述极性部分包含两亲肽和/或类肽的C-末端，或其中所述极性部分包含两亲肽和/或类肽的N-末端。

在一个实施方案中，所述C-末端和所述N-末端两者均不携带与它们附接的任何保护基。

在一个实施方案中，所述极性部分包含两亲肽和/或类肽的C-末端,其中所述C-末端和所述N-末端两者均不携带与它们附接的任何保护基。

在一个实施方案中，所述极性部分包含两亲肽和/或类肽的C-末端,其中所述C-末端不携带任何保护基,并且其中所述N-末端携带保护基。

在一个实施方案中，所述保护基是与所述N-末端的氨基基团附接的乙酰基。

在一个实施方案中，所述极性部分包含两亲肽和/或类肽的C-末端,其中所述C-末端携带保护基，并且其中所述N-末端不携带任何保护基。

在一个实施方案中，所述保护基是与所述C-末端的羧基基团附接的酰胺基基团。

在一个实施方案中，所述极性部分包含两亲肽和/或类肽的C-末端,其中所述C-末端和N-末端两者均携带保护基。

在一个实施方案中，所述C-末端保护基是与所述C-末端的羧基基团附接的酰胺基基团，并且其中所述N-末端保护基是与所述N-末端的氨基基团附接的乙酰基。

在一个实施方案中，所述极性部分由位于两亲肽和/或类肽的C-末端的至少一个氨基酸组成。

在一个实施方案中，所述疏水序列段包含和/或形成两亲肽和/或类肽的N-末端。

在一个实施方案中，疏水序列段的所有或部分的脂肪族氨基酸以在从两亲肽和/或类肽的N-末端至C-末端的方向上氨基酸大小递减的次序排列，其中脂肪族氨基酸的大小被定义为I＝L>V>A>G。

在一个实施方案中，以氨基酸大小递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有为重复序列或非重复序列的序列。

在一个实施方案中，以氨基酸大小递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有长度为2-7、优选2-6、更优选2-5个氨基酸的序列。

在一个实施方案中，以氨基酸大小递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有选自LIVAG、ILVAG、LIVAA、LAVAG、IVAG、LIVA、LIVG、IVA和IV的序列，其中,任选地，在N-末端处在这样的序列之前存在A。

在一个实施方案中，疏水序列段的所有或部分的脂肪族氨基酸在两亲肽和/或类肽中以相同的氨基酸大小排列。

在一个实施方案中，以相同氨基酸大小的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有长度为2-4个氨基酸的序列。

在一个实施方案中，以相同大小的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有选自LLLL、LLL、LL、IIII、III、II、VVVV、VVV、VV、AAAA、AAA、AA、GGGG、GGG和GG的序列。

在一个实施方案中，两亲序列在自组装期间经历构象变化，优选从无规卷曲构象至螺旋中间结构至最终的β构象的构象变化。

在一个实施方案中，构象变化是浓度依赖性的。

在一个实施方案中，两亲线性序列包含单个亲水氨基酸和至少两个脂肪族氨基酸。

在一个实施方案中，两亲序列是SEQIDNO:1–42中的一个。

应当注意任一个两亲序列均可以在N-末端或C-末端或两者处携带保护基。例如，SEQIDNO:1-42可以全部在N-末端处携带作为保护基的乙酰基。作为进一步的实例，SEQIDNO:19(LIVAGK)可以在C-末端处携带作为保护基的酰胺基基团，并且另外地其可以在N-末端处具有作为保护基的乙酰基。

在一个实施方案中，所述两亲肽和/或类肽在生理条件下在环境温度中在水溶液中稳定持续1天至至少6个月、优选至8个月、更优选至至少12个月的范围的时期。

在一个实施方案中，两亲肽和/或类肽在生理条件下在至多90℃的温度下在水溶液中稳定持续至少1小时。

还公开了包含如上所定义的两亲肽和/或类肽的水凝胶。

在一个实施方案中，水凝胶在环境温度下在水溶液中稳定持续至少7天、优选至少2-4周、更优选至少1-6个月的时期。

在一个实施方案中，水凝胶的特征在于大于2的储能模量G’与损耗模量G”的比率。

在一个实施方案中，水凝胶的特征在于在0.02Hz-16Hz的范围的频率下100Pa-80,000Pa的储能模量G’。

在一个实施方案中，水凝胶具有比胶原或其水解形式(明胶)更高的机械强度。

在一个实施方案中，如上所定义的水凝胶包含如上所定义的两亲肽和/或类肽的纤维，所述纤维限定能够包埋至少一种下述物质的网络：微生物、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、合成聚合物、小有机分子、或药学活性化合物中。

在一个实施方案中，水凝胶包含被两亲聚合物的纤维网络包埋的微生物、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、合成聚合物、小有机分子、或药学活性化合物中的至少一种。

在一个实施方案中，两亲聚合物的纤维与被两亲聚合物的纤维网络包埋的微生物、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、合成聚合物、小有机分子、或药学活性化合物中的至少一种偶联。

在一个实施方案中，水凝胶包含在燃料电池、太阳能电池、电子电池、生物传感装置、医用装置、植入物、药物组合物和化妆品组合物中的至少一种中。

在一个实施方案中，如上所定义的水凝胶用于下列中的至少一种中：释放药学活性化合物、医用工具成套部件、燃料电池、太阳能电池、电子电池、组织再生、干细胞治疗和基因治疗。

在一个实施方案中，如上所定义的水凝胶是可注射的。

还公开了制备水凝胶的方法，该方法包括将如上所定义的两亲肽和/或类肽溶解在水溶液中。

在一个实施方案中，将水溶液中溶解的两亲肽和/或类肽进一步暴露于温度，其中所述温度在20℃-90℃、优选20℃-70℃的范围。

在一个实施方案中，两亲肽和/或类肽以0.01μg/ml-100mg/ml的浓度、优选以1mg/ml-50mg/ml的浓度、更优选以约1mg/ml-约20mg/ml的浓度溶解。

还公开了外科植入物或支架，所述外科植入物或支架包含肽和/或类肽支架，其中所述肽和/或类肽支架由如上所定义的水凝胶形成。

还公开了包含如上所定义的两亲肽和/或类肽的药物组合物和/或化妆品组合物和/或生物医用装置和/或电子装置。

在一个实施方案中，如上所定义的药物组合物和/或化妆品组合物和/或生物医用装置和/或电子装置进一步包含药学活性化合物。

在一个实施方案中，如上所定义的药物组合物和/或化妆品组合物进一步包含药学上可接受的载体。

还公开了多个部件的成套部件，所述成套部件包括具有如上所定义的两亲肽和/或类肽的第一容器和具有水溶液的第二容器。

在一个实施方案中，第二容器的水溶液进一步包含药学活性化合物。

在一个实施方案中，具有两亲肽和/或类肽的第一容器进一步包含药学活性化合物。

还公开了组织再生的方法，该方法包括以下步骤：

提供如上所定义的水凝胶，

使所述水凝胶暴露于要形成再生组织的细胞，

允许所述细胞在所述水凝胶上生长。

在一个实施方案中，如上所定义的方法在体外(in-vitro)或体内(in-vivo)进行。

在一个实施方案中，如上所定义的方法在体内进行，其中,在步骤a)中，所述水凝胶在身体中期望进行组织再生的位置处提供。

在一个实施方案中，所述步骤a)通过将所述水凝胶在身体中期望进行组织再生的位置处注射来执行。

在第一个方面，本公开提供了能够形成水凝胶的两亲肽和/或类肽。两亲肽和/或类肽包含疏水和亲水序列。此疏水序列具有n个L-或D-氨基酸的长度。n是可以典型地为2-约15的整数。亲水序列具有包含m个L-或D-氨基酸的极性和/或带电荷的部分。m是1-5的整数。m个脂肪族氨基酸中的每一个携带独立选择的极性基团。两亲线性序列在生理pH具有净电荷并且具有携带保护基的N-末端。保护基可以是乙酰基。两亲肽和/或类肽可以包含o个连接的n个疏水的和m个亲水的L-和D-氨基酸的两亲肽和/或类肽序列，其中o是1-约50的整数。两亲肽和/或类肽可以由o个连接的n个疏水的和m个亲水的L-和D-氨基酸的两亲肽和/或类肽序列组成。n的值可以是2-约15的整数。m的值可以是1-5。m个亲水的L-和D-氨基酸中的每一个的带电荷和/或极性基团可以独立地选自羟基、醚基、羧基、酰胺基、酯基、氨基、胍基、硫代、硫醚基、硒基和碲基。亲水序列的带电荷或极性部分可以包含m个选自由下列各项组成的组的L-或D-氨基酸：天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(茶氨酸)、瓜氨酸、硫代-瓜氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、蛋氨酸、乙硫氨酸、硒代蛋氨酸、碲代蛋氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、丝氨酸、同型丝氨酸、精氨酸、同型精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和N(6)-羧基甲基赖氨酸。亲水序列的带电荷和/或极性部分可以包含两个相同的氨基酸。两个相同的氨基酸可以邻接非极性疏水部分。带电荷和/或极性部分可以由具有选自下列的序列的两个氨基酸组成：Asn-Asn、Asp-Asp、Glu-Glu、Gln-Gln、Asn-Gln、Gln-Asn、Asp-Gln、Gln-Asp、Asn-Glu、Glu-Asn、Asp-Glu、Glu-Asp、Gln-Glu、Glu-Gln、Asp-Asn、Asn-Asp、Thr-Thr、Ser-Ser、Thr-Ser、Ser-Thr、Asp-Ser、Ser-Asp、Ser-Asn、Asn-Ser、Gln-Ser、Ser-Gln、Glu-Ser、Ser-Glu、Asp-Thr、Thr-Asp、Thr-Asn、Asn-Thr、Gln-Thr、Thr-Gln、Glu-Thr、Thr-Glu。带电荷和/或极性部分可以包含两亲肽和/或类肽的C-末端。带电荷和/或极性部分可以包含：(i)C-末端,所述C-末端携带未保护的C-末端羧基；或(ii)N-末端,所述N-末端携带未保护的N-末端氨基。带电荷和/或极性部分可以包含两亲肽和/或类肽的C-末端，所述C-末端携带未保护的C-末端羧基，并且其中所述N-末端携带保护基，优选乙酰基。保护基可以是酰胺基保护基。带电荷和/或极性部分可以由位于两亲肽和/或类肽的C-末端的至少一个氨基酸组成。疏水序列可以包含至少两个脂肪族氨基酸，所述脂肪族氨基酸由包含1-约20个碳原子的主链限定。非-极性部分的一部分氨基酸可以以在两亲肽和/或类肽的N-至C-末端的方向上大小递减的总体序列排列，并且非极性部分的相邻氨基酸的大小在大小递减的总体序列的方向上可以是相同的或较小的。大小递减的总体序列优选地可以是非重复序列。其中相邻氨基酸可以具有相同的或较小的大小的大小递减的总体序列的方向可以是朝向序列的带电荷和/或极性部分的方向。以大小递减的总体序列排列的氨基酸部分可以具有2-7个、优选2-6个、更优选2、3、4、5或6个氨基酸的长度。以大小递减的总体序列排列的氨基酸部分还可以具有n-m-1个氨基酸的长度，并且其中以大小递减的总体序列排列的氨基酸部分可以位于n-m个氨基酸的非-极性部分的其余非极性氨基酸和极性部分之间。n-m个氨基酸的非极性部分的其余非极性氨基酸可以限定两亲肽和/或类肽的N-末端或C-末端。n-m个氨基酸的非-极性部分的其余非极性氨基酸可以是丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸中的一个。两亲线性序列可以在自组装期间经历从无规卷曲构象至螺旋构象的构象变化。构象变化可以是浓度依赖性的。两亲线性序列的非极性部分可以包含选自由下列各项组成的组的至少一种L-或D-氨基酸：甘氨酸、同型烯丙基甘氨酸、同型炔丙基甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸和异亮氨酸。两亲线性序列可以包含单个极性和/或带电荷部分和单个非极性部分。两亲线性序列可以具有正的或负的净电荷。净电荷可以为约-1至约-4或约+5至约+1。净电荷可以为约-1至约-2。净电荷可以为-2。净电荷可以为+1或+2或+5。两亲肽和/或类肽可以在生理条件下在环境温度下在水溶液中稳定持续1天至至少6个月、优选至少8个月、更优选至少12个月的范围的时期。两亲肽和/或类肽可以在生理条件下在至90℃的温度下在水溶液中稳定至少1小时。

在第二个方面，本公开提供了水凝胶。水凝胶包含根据第一方面的两亲肽和/或类肽。水凝胶可以在环境温度下在水溶液中稳定持续至少7天的时期。水凝胶可以在环境温度下在水溶液中稳定持续至少2-4周的时期。水凝胶可以在环境温度下在水溶液中稳定持续至少1-6个月的时期。水凝胶的机械性能的特征可以在于小于1的损耗模量G”与储能模量G’的比率。水凝胶的特征可以在于储能模量G’比损耗模量G”大最小1.5倍的幅度。水凝胶的特征可以在于在0.02Hz-16Hz的范围的频率下100Pa-80,000Pa的储能模量G’。水凝胶的特征可以在于随着肽的浓度增加而增加的储能模量G’。水凝胶可以具有比胶原或水解形式(明胶)更高的机械强度。水凝胶可以包含本文所述的两亲肽和/或类肽的纤维。纤维可以限定能够包埋下列物质中的至少一种的网络：微生物、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、合成聚合物、小有机分子或药学活性化合物。水凝胶可以包含被两亲聚合物的纤维网络包埋的微生物、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、合成聚合物、小有机分子、或药学活性化合物中的至少一种。两亲聚合物的纤维可以与被两亲聚合物的纤维网络包埋的微生物、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、合成聚合物、小有机分子、或药学活性化合物中的至少一种偶联。水凝胶可以包含在燃料电池、太阳能电池、电子电池、生物传感装置、医用装置、植入物、药物组合物、药物递送系统、组织培养基、生物传感器装置和化妆品组合物中的至少一种中。水凝胶可以用于下列中的至少一种中：释放药学活性化合物、医用工具成套部件、燃料电池、太阳能电池、电子电池、组织再生、干细胞治疗和基因治疗。在一些实施方案中，水凝胶可以用于组织再生、药物释放或基因治疗。

在第三个方面，本公开提供了制备水凝胶的方法。该方法包括提供根据第一个方面的两亲肽和/或类肽。该方法进一步包括将两亲肽和/或类肽溶解和/或分散在水溶液中。可以将在水溶液中溶解/分散的两亲肽和/或类肽进一步暴露于某个温度中。温度可以在以下的范围选择：约20℃-约90℃,优选20℃-70℃。两亲肽和/或类肽可以以约0.01μg/ml-约100mg/ml的浓度溶解。两亲肽和/或类肽可以以约1mg/ml-约50mg/ml的浓度溶解。两亲肽和/或类肽可以以约1mg/ml-约30mg/ml的浓度溶解和/或分散。

在第四个方面，本公开提供了外科植入物或支架。外科植入物或支架包括肽和/或类肽支架。肽和/或类肽支架由根据第二个方面的水凝胶限定。

在第五个方面，本公开提供了药物组合物和/或化妆品组合物。药物组合物和/或化妆品组合物包含根据第一个方面的两亲肽和/或类肽。药物组合物和/或化妆品组合物可以包含药学活性化合物。药物组合物和/或化妆品组合物可以包含药学上可接受的载体。

在第六个方面，本公开提供了多个部件的成套部件。该成套部件包含第一容器和第二容器。第一容器包含根据第一个方面的肽和/或类肽。第二容器包含水溶液。第二容器的水溶液可以进一步包含药学活性化合物。具有两亲肽和/或类肽的第一容器可以进一步包药学活性化合物。

本发明的目的是进一步提高上面公开的水凝胶的材料性能，诸如刚性、弹性和抗降解性。本发明的进一步目的是促进感兴趣的生物活性剂或其他化合物(例如纳米粒子)与水凝胶的缀合。另外又一目的是减少制备如上所公开的水凝胶所需的两亲肽和/或类肽的量。

本发明的目的通过包含能够自组装成三维大分子纳米纤维状网络的多个两亲肽和/或类肽的水凝胶来解决，所述纳米纤维状网络包埋水并形成所述水凝胶，所述两亲肽和/或类肽具有下列通式:

Z_p-(X)_n-(Y)_m-AA_硫醇-Z’_q,

其中

Z是N-末端保护基,

X在每次出现时独立地选自脂肪族氨基酸,

Y在每次出现时独立地选自亲水氨基酸,

AA_硫醇是包含硫醇基的氨基酸，

Z’是C-末端保护基,

n是选自2-6、优选2-5的整数,

m选自0、1和2,优选0和1,

并且p和q独立地选自0和1,其中,优选地，p是1,

其中至少一部分所述多个两亲肽和/或类肽是化学(例如，共价)交联的。

在一个实施方案中，所述包含硫醇基的氨基酸选自半胱氨酸和同型半胱氨酸。

在一个实施方案中，所述至少一部分所述多个两亲肽和/或类肽通过下述方式进行化学交联：经由巯基与巯基交联(即，经由二硫键)，经由巯基与羟基交联，经由巯基与醛交联，经由巯基与胺交联，经由肽聚糖或经由光诱导的交联，优选经由巯基与巯基交联。

在一个实施方案中，所述N-末端保护基具有通式–C(O)–R,其中R选自由下列各项组成的组：H、未取代的或取代的烷基和未取代的或取代的芳基。优选的烷基是甲基、乙基、丁基、异丁基、丙基和异丙基。在一个实施方案中，所述N-末端保护基是乙酰基(R＝甲基)。

在一个实施方案中，所述N-末端保护基是拟肽分子,包括天然的和合成的氨基酸衍生物,其中所述拟肽分子的N-末端可以用选自由下列各项组成的组的官能团修饰：羧酸、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、腈、脲类似物、硫醇、磷酸酯、碳酸酯、硫酸酯、硝酸酯、马来酰亚胺、乙烯砜、叠氮化物、炔烃、烯烃、碳水化合物、二酰亚胺、过氧化物、酯、硫酯、芳基、酮、亚硫酸酯、亚硝酸酯、膦酸酯和硅烷。

在一个实施方案中，所述C-末端保护基是酰胺基。在一个实施方案中，所述两亲肽和/或类肽的C-末端具有式-CONHR或-CONRR’,R和R’选自由下列各项组成的组：H、未取代的或取代的烷基和未取代的或取代的芳基。优选的烷基是甲基、乙基、丁基、异丁基、丙基和异丙基。

在一个实施方案中，所述C-末端保护基是酯基。在一个实施方案中，所述两亲肽和/或类肽的C-末端具有式–CO₂R,R选自由下列各项组成的组：H、未取代的或取代的烷基和未取代的或取代的芳基。优选的烷基是甲基、乙基、丁基、异丁基、丙基和异丙基。

在一个实施方案中，所述C-末端保护基是拟肽分子,包括天然的和合成的氨基酸衍生物,其中所述拟肽分子的C-末端可以用选自由下列各项组成的组的官能团修饰：羧酸、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、腈、脲类似物、硫醇、磷酸酯、碳酸酯、硫酸酯、硝酸酯、马来酰亚胺、乙烯砜、叠氮化物、炔烃、烯烃、碳水化合物、二酰亚胺、过氧化物、酯、硫酯、芳基、酮、亚硫酸酯、亚硝酸酯、膦酸酯和硅烷。

在一个实施方案中，对于给定的两亲肽和/或类肽，所述脂肪族氨基酸、所述亲水氨基酸和所述包含硫醇基的氨基酸是D-氨基酸或L-氨基酸。

在一个实施方案中，所述亲水氨基酸具有极性基团，所述极性基团独立地选自羟基、醚基、羧基、亚胺基、酰胺基、酯基、氨基、胍基、硫代、硫醚基、硒基和碲基。

在一个实施方案中，所述亲水氨基酸选自由下列各项组成的组：天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(茶氨酸)、瓜氨酸、硫代-瓜氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、蛋氨酸、乙硫氨酸、硒代蛋氨酸、碲代蛋氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、丝氨酸、同型丝氨酸、精氨酸、同型精氨酸、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨基丙酸(Dap)、赖氨酸和N(6)-羧基-甲基赖氨酸以及组氨酸。

在一个实施方案中，所述亲水氨基酸选自由下列各项组成的组：天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨基丙酸(Dap)和组氨酸。

在一个实施方案中，所述脂肪族氨基酸选自由下列各项组成的组：异亮氨酸、正亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、同型烯丙基甘氨酸和同型炔丙基甘氨酸。优选地，所述脂肪族氨基酸选自由下列各项组成的组：异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸。

在一个实施方案中，所述两亲肽和/或类肽的所有或部分脂肪族氨基酸(即，(X)_n)以在所述两亲肽和/或类肽的N-末端至C-末端的方向上氨基酸大小递减的次序排列，其中所述脂肪族氨基酸的大小定义为I＝L>V>A>G。

在一个实施方案中，以氨基酸大小递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有为重复序列或非重复序列的序列。

在一个实施方案中，以氨基酸大小递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有选自LIVAG、ILVAG、LIVAA、LAVAG、IVAG、LIVA、LIVG、IVA和IV的序列，其中,任选地，在N-末端处在这样的序列之前存在A。

在一个实施方案中，所述两亲肽和/或类肽在自组装期间经历构象变化，优选从无规卷曲构象至螺旋中间结构至最终的β构象的构象变化。

在一个实施方案中，所述构象变化依赖于所述两亲肽和/或类肽的浓度，依赖于离子环境，是pH依赖的和/或温度依赖的。

在一个实施方案中，所述两亲肽和/或类肽是相同的或不同的。

在一个实施方案中，(X)_n-(Y)_m选自由下列各项组成的组：SEQIDNO:1-42。

在一个实施方案中，(X)_n-(Y)_m-AA_硫醇选自由下列各项组成的组：LIVAGKC(SEQIDNO:43)、LIVAGSC(SEQIDNO:44)、LIVAGDC(SEQIDNO:45)、ILVAGKC(SEQIDNO:46)、ILVAGDC(SEQIDNO:47)、LIVAGC(SEQIDNO:48)、AIVAGC(SEQIDNO:49)、ILVAGC(SEQIDNO:50)、IVKC(SEQIDNO:51)、IVDC(SEQIDNO:52)和IVSC(SEQIDNO:53)。

在一个实施方案中，所述水凝胶在环境温度下在水溶液中稳定持续至少7天、优选至少2-4周、更优选至少1-6个月的时期。

在一个实施方案中，至少5％、优选至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、更优选至少25％、更优选至少30％、更优选至少35％、更优选至少40％、更优选至少45％、甚至更优选至少50％的所述多个两亲肽和/或类肽是化学交联的。在一个实施方案中，至少60％的所述多个两亲肽和/或类肽是化学交联的。

在一个实施方案中，水凝胶的特征在于大于2的储能模量G’与损耗模量G”的比率。

在一个实施方案中，水凝胶的特征在于通过在0.02Hz-16Hz的范围的频率下100Pa-1,000,000Pa、优选500Pa-1,000,000Pa、更优选1000Pa-1,000,000Pa的储能模量G’。

在一个实施方案中，水凝胶具有比胶原或其水解形式(明胶)更高的机械强度。

在一个实施方案中，水凝胶具有被定义为在线性粘弹性(LVE)限值的％应变的弹性，所述弹性为高于0.01％应变,优选高于0.5％应变,更优选高于1％应变,更优选高于2％应变。

在一个实施方案中，水凝胶进一步包含非肽聚合物。

在一个实施方案中，水凝胶进一步包含微生物、细胞、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米粒子或微米粒子、合成聚合物、小有机分子、化妆剂或药学活性化合物中的至少一种。

在一个实施方案中，所述微生物、细胞、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米粒子或微米粒子、合成聚合物、小有机分子、化妆剂或药学活性化合物中的至少一种被所述三维大分子纳米纤维状网络包埋。

在一个实施方案中，所述微生物、细胞、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米粒子或微米粒子、合成聚合物、小有机分子、化妆剂或药学活性化合物中的至少一种与所述两亲肽和/或类肽偶联,优选经由二硫键。

在一个实施方案中，所述微生物、细胞、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米粒子或微米粒子、合成聚合物、小有机分子、化妆剂或药学活性化合物中的至少一种与所述非肽聚合物偶联。

在一个实施方案中，所述药学活性化合物选自由下列各项组成的组：止血剂、抗生素、抗微生物剂、抗真菌剂、抗炎剂、镇痛药、抗凝剂、抗体、抗原、生长因子和细胞因子。

在一个实施方案中，所述纳米粒子或微米粒子是金属纳米粒子或金属微米粒子,优选金纳米粒子或金微米粒子。

在一个实施方案中，所述肽包含信号序列,其中,优选地，所述肽经由二硫键与所述两亲肽和/或类肽偶联。

在一个实施方案中，所述信号序列包括粘附或生长信号，诸如整合素结合序列(例如CRGD)。

在一个实施方案中，所述水凝胶以可注射形式提供并在原位胶化。

本发明的目的还通过制备水凝胶、优选根据本发明的水凝胶的方法来解决，该方法包括以下步骤：将与根据本发明的水凝胶有关的如上所定义的两亲肽和/或类肽溶解在水溶液中，

其中所述水溶液包含氧化剂，或

其中所述方法进一步包括以下步骤：将预制的水凝胶暴露于氧化剂的溶液。

在一个实施方案中，所述氧化剂是H₂O₂,其中,优选地，H₂O₂以0.02-0.3％(w/w)、优选“0.05-0.25％(w/w)、更优选“0.05-0.2％(w/w)的浓度使用。

在一个实施方案中，所述两亲肽和/或类肽以0.01μg/ml-50mg/ml的浓度、优选以1mg/ml-25mg/ml的浓度、更优选以1mg/ml-15mg/ml的浓度、甚至更优选以5mg/ml-12mg/ml的浓度溶解。

在一个实施方案中，将水溶液中溶解的两亲肽和/或类肽进一步暴露于20℃-90℃、优选20℃-70C、更优选20℃-40℃的范围的温度。

在一个实施方案中，将水溶液中溶解的两亲肽和/或类肽暴露于所述温度至少1小时,优选至少2小时,更优选至少4小时,更优选至少6小时,更优选至少8小时,更优选至少10小时,更优选至少12小时,甚至更优选至少24小时。

在一个实施方案中，该方法进一步包括将预制的水凝胶暴露于不包含所述氧化剂的水溶液的步骤，其中,如果所述方法包括将预制的水凝胶暴露于所述氧化剂的溶液的步骤，则在将预制的水凝胶暴露于所述氧化剂的溶液的所述步骤之后执行将预制的水凝胶暴露于不包含所述氧化剂的水溶液的所述步骤。

在一个实施方案中，将预制的水凝胶暴露于不包含所述氧化剂的水溶液的所述步骤重复至少一次。

在一个实施方案中，将预制的水凝胶暴露于不包含所述氧化剂的水溶液的所述步骤发生至少1小时,优选至少2小时,更优选至少4小时,甚至更优选至少6小时。

在一个实施方案中，将预制的水凝胶暴露于不包含所述氧化剂的水溶液的所述步骤在30℃-45℃、优选35℃-40℃的范围的温度发生。

将预制的水凝胶暴露于不包含所述氧化剂的水溶液的步骤用来去除来自固相肽合成的未反应的氧化剂和/或残留的酸。在一个实施方案中，去除超过90％、优选超过95％、更优选超过97％、甚至更优选超过99％的未反应的氧化剂(例如H₂O₂)。在一个实施方案中，所述不包含所述氧化剂的水溶液是水或缓冲水溶液(例如PBS)。在一个实施方案中，所述不包含所述氧化剂的水溶液是细胞培养基。

在一个实施方案中，该方法进一步包括以下步骤中的至少一个：

-添加微生物、细胞、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米粒子或微米粒子、合成聚合物、小有机分子、化妆剂或药学活性化合物中的至少一种；

-添加至少一种非肽聚合物；

-添加至少一种凝胶化增强剂；

-添加至少一种缓冲剂，优选至少一种生理上可接受的缓冲剂。

在一个实施方案中，所述凝胶化增强剂是盐或盐的溶液。

本发明的目的还由通过根据本发明的方法制备的水凝胶来解决。

本发明的目的还通过使用根据本发明的水凝胶作为细胞培养基底、优选用于3-D细胞培养的细胞培养基底来解决。

本发明的目的还通过使用根据本发明的水凝胶作为用于药物递送或基因递送的装置、优选用于缓释或控释药物递送的装置、或作为伤口敷料或作为植入物或作为原位胶化的可注射剂来解决。

本发明的目的还通过包含根据本发明的水凝胶的细胞培养基底、优选用于3-D细胞培养的细胞培养基底来解决。

本发明的目的还通过包含根据本发明的水凝胶的用于药物递送或基因递送的装置、优选用于缓释或控释药物递送的装置来解决。

本发明的目的还通过包含根据本发明的水凝胶的植入物或可注射剂或伤口敷料来解决。

本发明的目的还通过包含根据本发明的水凝胶的药物组合物或化妆品组合物来解决。

在一个实施方案中，药物组合物或化妆品组合物以局部凝胶或膏剂、喷雾剂、粉末、或片、贴片或膜的形式提供。

在一个实施方案中，药物组合物或化妆品组合物以可注射溶液的形式提供。

在一个实施方案中，药物组合物或化妆品组合物进一步包含药学活性化合物。

在一个实施方案中，药物组合物或化妆品组合物进一步包含药学上可接受的载体。

本发明的目的还通过用于再生医学或用于组织工程和组织再生例如脂肪组织和软骨组织的再生的根据本发明的水凝胶来解决。

本发明的目的还通过用于伤口处理的根据本发明的水凝胶来解决。

本发明的目的还通过用于骨骼系统的退行性疾病例如椎间盘退变性疾病或尿失禁的治疗的根据本发明的水凝胶来解决。

本发明的目的还通过用于化妆品用途的根据本发明的水凝胶来解决。

本发明的目的还通过包含根据本发明的水凝胶的电子装置来解决。

在一个实施方案中，电子装置选自燃料电池、太阳能电池、电子电池或生物传感装置。

本发明的目的还通过组织再生或组织替代的方法来解决，该方法包括以下步骤：

a)提供根据本发明的水凝胶；

b)使所述水凝胶暴露于要形成再生组织的细胞；

c)允许所述细胞在所述水凝胶上或在所述水凝胶中生长。

在一个实施方案中，该方法在体外或体内或离体(exvivo)进行。

在一个实施方案中，该方法在体内进行，其中,在步骤a)中，所述水凝胶在患者身体中期望进行组织再生或组织替代的位置处提供。在一个实施方案中，所述组织选自包括下列的组：皮肤组织、椎间盘的髓核、软骨组织、滑液和膀胱颈中的粘膜下结缔组织。在一个实施方案中，通过将与根据本发明的水凝胶有关的如上所定义的所述水凝胶或两亲肽和/或类肽的溶液在患者身体中期望进行组织再生或组织替代的位置处注射来执行所述步骤a)。在一个实施方案中，所述步骤a)进一步包括共同注射凝胶化增强剂,优选共同注射盐的溶液，和/或共同注射氧化剂。

在一个实施方案中，该方法离体进行，其中,在步骤a)或b)中，来自患者或来自供体的细胞与所述水凝胶混合，并且所得的混合物在患者身体中期望进行组织再生或组织替代的位置处提供。

在一个实施方案中，所述水凝胶包含一种或多种刺激再生过程和/或调节免疫应答的生物活性治疗药物。

本发明的目的还通过由根据本发明的水凝胶获得的薄层来解决，优选通过玻璃板浇注或利用不干扰凝胶形成的其他材料浇注获得的薄层来解决。

这样的其他材料可以是

-不锈钢板；

-惰性材料，诸如铂、金、钛；

-非反应性聚合材料，诸如有机硅等。

在结合附图1K-M和17-40阅读下面对本发明的具体实施方式的描述后，对于本领域技术人员来说本发明的其他方面和特征将变得显而易见。

附图简述

现在参照附图，其中:

图1A-1M代表一些示例性的能够形成水凝胶的肽的分类列表。这些肽是其中整个肽由单个线性两亲序列组成的实施方案。形成水凝胶的肽用短代码命名，但公开了它们各自的序列。这些实施例的肽由含有3-7个氨基酸的天然氨基酸序列组成。N-末端被乙酰化，由此去掉原本会阻止肽的两亲特性的电荷。

图2描绘了处于最低浓度的基于肽的水凝胶的凝胶化图片。

图3描绘了处于5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml的浓度的Ac-AS-6(Ac-AIVAGS)(L)的凝胶化图片。

图4描绘了对从肽单体至缩合纤维的超分子网络的自组装的假设。(A)据信组装从两个肽单体通过改变成α-螺旋构象的反向平行配对开始。随后，肽对组装成纤维和纳米结构。肽纤维缩合成纤维聚集体导致水凝胶形成。

图5描绘Ac-LD6(Ac-LIVAGD)(L)(10mg/ml)的水凝胶的环境扫描电子显微镜(ESEM)图像，其中图5A、图5B和图5C是在4℃的温度在利用10KV的HV以260X、1000X、2000X、2400X、4000X的放大倍数获得的图像。图像指示纤维结构的形成。

图6显示Ac-LD6(Ac-LIVAGD)(L)(15mg/ml)的水凝胶的场发射扫描电子显微镜(FESEM)图像，其中图6A-D是在利用10KV的HV以6000X、45000X、45000X和40000X的放大倍数获得的图像。

图7描绘Ac-AD6(Ac-AIVAGD)(D)水凝胶(20mg/ml)的水凝胶是在12KV以50X(图7A)和20000X(图7B)的放大倍数的场发射扫描电子显微镜(FESEM)图像。

图8显示在120X(图8A)和450X(图8B)获得的Ac-AD6(Ac-AIVAGD)(D)(20mg/ml)的水凝胶的场发射扫描电子显微镜(FESEM)图像。

图9A显示通过场发射扫描电子显微镜测定的肽支架的形态学和结构评价(a-f)。(a)在冻干20mg/mLAc-AD₆(Ac-AIVAGD)(D)水凝胶后观察到蜂巢多孔结构。孔隙由如在15mg/mL(b)和20mg/mL(c)Ac-ID₃(Ac-IVD)(L)水凝胶的近视图中显示的缩合纤维的膜界定。对20mg/mLAc-AD₆(L)水凝胶的进一步放大揭示了单根纤维(d,e)。在较低的浓度0.1mg/mLAc-LD₆(Ac-LIVAGD)(L)处观察到纳米结构(f)。

图9B显示在1000x的放大倍数、12KV的HV下获得的图像，图9C显示在2500x的放大倍数、12KV的HV下获得的图像，图9D显示在4000x的放大倍数、10KV的HV下获得的图像，图9E显示在35000x的放大倍数、10KV的HV下获得的图像，图9F显示在80000x的放大倍数、5KV的HV下获得的图像，图9G显示在120000x的放大倍数、10KV的HV下获得的图像，图9H显示在200000x的放大倍数、10KV的HV下获得的图像。

图10显示(a)远-UVCD光谱，其证明了随着浓度增加，存在Ac-LD₆(Ac-LIVAGD)肽构象从无规卷曲(阈值浓度以下)至α-螺旋(222和208nm峰)和进一步至β-型(在218nm的负条带)结构的转变。加热样品以促进凝胶化增加了β型聚集。(b)低于阈值浓度时,通过将温度从25℃逐步增加至90℃(实线)并冷却(虚线)可逆地影响0.2mg/mLAc-LD₆的无规卷曲构象。(c,d)高于阈值浓度时，在1mg/mLAc-LD₆凝胶中，逐步增加温度(c)不可逆地稳定了β-型结构，使得随后的冷却(d)不改变CD光谱。(e)处于不同浓度的AcID₃(Ac-IVD)的远-UVCD光谱。所有曲线均在25℃完成。

图11显示流变学测量。(a,b)通过分别在25℃和50℃在0.1％应变测量随角频率而变的储存模量(G’)确定处于20mg/mL浓度的不同肽水凝胶的高机械强度。与明胶相比，该凝胶显示出良好的热稳定性，而明胶在50℃液化(因此在4B中被排除)。(c)机械强度随浓度而变，如由使用Ac-LD₆(Ac-LIVAGD)(L)在0.1％应变在25℃的振荡频率扫描研究测定。(d)增加盐浓度(NaCl)使10mg/mLAc-LD₆(L)水凝胶的G’下降,降低了其刚度，证明凝胶化的可调性和可逆性。

图12显示了对基于肽的水凝胶的流变学测量的另一实施例。图12A和图12B描绘了在25℃和50℃的温度以[1rad-s]的恒定频率和0.8mm的间隙对处于20mg/ml浓度的Ac-AD6(Ac-AIVAGD)(L)和Ac-AD6(D)进行的振幅扫描研究。图表指示在25℃和50℃的温度下模量[Pa]相对于应变(％)作的图。在25℃和50℃的温度下在0.07％-0.2应变％处观察到线性粘弹性范围。图12C和图12D描绘了在25℃和50℃的温度下以0.1-100[Rad/s]的可变频率范围、0.1％线性粘弹性范围的恒定应变[％]和0.8mm的间隙对处于20mg/ml浓度的Ac-AD6(L)和Ac-AD6(D)的振荡频率扫描研究。

图13显示了对基于肽的水凝胶的流变学测量的另一实施例。描绘了在25℃的温度以0.1％应变对UV交联的肽的频率扫描研究。

图14描绘了对明胶-1890(A型,猪皮肤)的流变学测量。此图显示当采用不同的频率在25℃获得的模量数据。

图15图示了使用更多细胞系的本发明的基于肽的水凝胶的生物相容性。图15A显示了接种在DMEM培养基中的Ac-LD₆(Ac-LIVAGD)(L)的水凝胶上后在最佳条件下生长72小时后人原代肾小管细胞(HPRTC)的显微图像。图15B显示了接种在组织培养塑料上后在最佳条件下生长72小时后人原代肾小管细胞(HPRTC)的显微图像。图15C显示了接种在DMEM培养基中的Ac-LD₆(L)的凝胶上后在最佳条件下生长72小时后人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的显微图像。图15D显示了接种在组织培养塑料上后在最佳条件下生长72小时后人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的显微图像。

图16是对在本发明的水凝胶的存在下细胞活力的进一步图示。在存在(图16A)或缺少(图16B)Ac-LD₆(Ac-LIVAGD)(L)(5mg/ml)的条件下培养人成纤维细胞。显示了荧光素异硫氰酸酯(FITC)染色的细胞(左图)、德克萨斯红染色的细胞(中图)和利用FITC和德克萨斯红两者染色的细胞(右图)。

现在将参照下面的附图借助于实施例描述本发明的实施方案，在图中：

图17显示了本发明的交联策略，所述交联策略使用(A)两个含硫醇的氨基酸(在此:两个半胱氨酸)之间的二硫键，其在LK₆C肽纤维之间引入了(B)纤维内和纤维间化学交联。硫醇基进一步促进生物活性剂诸如整合素结合序列CRGD(C)的缀合。

图18A图示了利用LK₆对照肽序列测定合适的凝胶化浓度。建立适宜地低以在测试期间节省材料但是仍然能够形成足够强而能被操作的凝胶的工作浓度。因此LK₆凝胶以不同的浓度浇注并且测量它们的刚度(三次重复的平均值±s.d.)。如期望的，G’值随着肽浓度而增加，并且确定12mM的工作浓度为凝胶提供足以承受处理的机械完整性。图18B显示可以利用12mM的LK₆C(在考虑到氨基酸含量为89.4％后为大约10mg/mL)形成凝胶，并且凝胶形成与多种水性介质是相容的。

图19显示了与H₂O₂-辅助氧化+/-HRP相比，使LK₆C接受被空气氧化时二硫化物形成的动力学(两次重复的平均值±s.d.)。对于被空气氧化，使溶解在水中的处于12mM的LK₆C在室温在加盖的微型离心管中静置。如可以看到的那样，二硫化物形成的动力学是迟缓的，并且在5天后仍然存在约80％的硫醇，如使用Ellman测定确定的。在二硫键的形成中，H₂O₂-辅助氧化有效得多。有趣的是，马辣根过氧化物酶(HRP,0.6U/mL)(一种常与H₂O₂一起用来增加氧化效率的酶)没有显著地增加二硫化物形成的速率。

图20显示代表性的UPLC色谱图，其中峰下面积用来跟踪H₂O₂辅助氧化中二硫化物形成的速率。使用溶解在含有0.06％H₂O₂的水中的12mMLK₆C，在约3.6min处的二硫化物峰逐渐增加。在1天后仅留下约50％的硫醇。硫醇校准曲线的R²值为1.000。

图21显示对应于UPLC洗脱谱中的a)LK₆C单体-硫醇和b)(LK₆C)₂二聚体-二硫化物峰的质谱。在两种情况下，检测到预期的质量并验证了峰的归属。

图22显示H₂O₂浓度对二硫化物形成的速率的作用。LK₆C与不同浓度的H₂O₂在25℃孵育8小时，然后进行UPLC分析。然后将硫醇峰下面积对0小时的峰下面积归一化以得到剩余硫醇的％。在此之前，已经利用纯的LK₆C作为标准品生成了校准曲线(R²＝0.999)。如期望的那样，较高浓度的H₂O₂增加了二硫化物形成的动力学。然而，作为氧化效率和与H₂O₂相关的毒性之间的折衷，选择0.06％H₂O₂用于随后的实验。

图23图示了实现交联的两种不同的方法：1)浇注和浸泡：首先在水中形成凝胶，然后将凝胶浸泡在H₂O₂溶液中持续所需的时间段。2)原位氧化：将LK₆C肽粉末直接溶解在含有H₂O₂的水中以形成凝胶。

图24显示氧化作用剧烈地提高了凝胶保留它们的形状的能力，如在图A-D中所见：(A)在实验开始时浇注的LK₆C凝胶，其是(B)未氧化的并且在水中浸泡24小时，或(C)氧化2小时并在水中浸泡96小时。(D)对照肽序列LK₆不能经受24小时的水浸泡。

图25和图26显示了在浇注和浸泡法中水凝胶被均匀地氧化。在浇注和浸泡法中，LK₆C溶解在水中，在环形模具中浇注过夜，然后浸泡在含有H₂O₂的溶液中持续所需的时间段(图25A)。为了研究氧化作用在整块凝胶中是均匀的还是仅富集在表面层中，2小时后将凝胶从H₂O₂溶液中取出并使用外科手术刀小心地将其分离成其表面(顶部、底部和周边)级分和核心级分(图25B和图26A)。使用PeroXOquantH₂O₂测定试剂盒(Pierce,IL,USA)依照生产厂商的推荐定量各个级分中H₂O₂的量(三次重复的平均值±s.d.)。总是稀释样品使得吸光度读数落在利用H₂O₂标准品获得的校准曲线的线性部分(R²＝0.999)内(图25C)。还使用UPLC分析凝胶级分(图26B；两次重复的平均值±s.d.)。为了标准化表面层和核心层之间纤维密度的任何差异，取二硫化物和硫醇(D/T)峰之间的面积比来指示在级分中已经发生的氧化作用的程度。如可以见到的，在两个级分中检测到的H₂O₂的量是相当的，提示H₂O₂小分子的扩散是非常有效的。与没有氧化相比，如预期的那样，两个层的D/T比在氧化后显著地升高。然而，表面层和核心层的D/T比在氧化后没有显著的不同，指示在浇注和浸泡法中凝胶被均匀地氧化。

图27图示了LK₆C凝胶的流变学特性以及氧化作用对LK₆C凝胶的微观结构和对LK₆C凝胶保留其形状的能力的作用。在各种氧化方案后测量LK₆C凝胶的(A)刚度和(B)弹性(三次重复的平均值±s.d.)。通常，在引入S-S键后，弹性增加而刚度得到维持或增加。

图28图示了氧化的水凝胶的流变学特性。使12mMLK₆C凝胶接受利用0.06％H₂O₂和多种水浸泡持续时间的多种氧化方案，然后测量它们的(A)刚度和(B)弹性(三次重复的平均值±s.d.)。在没有氧化的条件下，LK₆C凝胶能够在水浸泡2小时后保持它们的刚度，但是在水浸泡24小时后破碎并丧失它们的刚度。另一方面，接受2或24小时浇注和浸泡氧化的凝胶或接受22小时的原位氧化的凝胶保持了它们的形状，并且实际上，在水浸泡一直到4天后变得更为坚硬。推测引入S-S化学键在有助于将肽纤维保持在一起并增加凝胶维持它们的形状和刚度方面是很重要的。与没有氧化的凝胶相比，在水浸泡一直到4天后氧化的凝胶的弹性增加也得以维持。

图29显示了浓度和LK₆-掺杂对LK₆C的流变学特性的作用。LK₆C以12或13.5mM溶解在水中，并且在环形模具中浇注过夜。然后测量凝胶的(A)刚度和(B)弹性(三次重复的平均值±s.d.)。增加LK₆C的浓度显著增加凝胶刚度但仅导致弹性的适度增加。(C-D)LK₆C还与不同量的LK₆在水中混合至12mM的终浓度并在环形模具中浇注过夜。上面给出的“％”值是指制剂中LK₆C的比例。然后将凝胶在0.06％H₂O₂溶液中浸泡2小时(即，浇注和浸泡)，然后测量它们的(C)刚度和(D)弹性(三次重复的平均值±s.d.)。如可以见到的，纯LK₆C(100％)、纯LK₆(0％)和LK₆C/LK₆75/25(75％)凝胶是相对坚硬的。然而，含有≤50％LK₆C的凝胶在处理之前/期间破碎，导致低的G’值。这些结果说明用LK₆掺杂LK₆C(终浓度为12mM)同时仍然保持凝胶刚度的窗口在75％LK₆C-50％LK₆C之间。含有氧化的LK₆C的凝胶比纯LK₆凝胶更有弹性。然而，含有75％和100％的LK₆C的凝胶之间的弹性差异仅是中度的。

图30描绘了FESEM图像，其显示LK₆C的纤维显微结构在氧化后得以保持。冻干的凝胶沉积在碳带上，用铂溅射，并在JSM-7400F电子显微镜(Jeol,Tokyo,Japan)下进行观察。

图31图示了在用于细胞培养前对水凝胶的纯化。LK₆C溶解在200μL含有0.06％H₂O₂的水中并直接在48孔板中在25℃浇注22小时。然后在凝胶的顶部添加1mL水，并以规律的时间间隔更换以浸出来自固相肽合成的(A)未反应的H₂O₂和(B)残留的H⁺(至少两次重复的平均值±s.d.)。如前面那样定量上清液中H₂O₂的量并相对于时间作图。在实验开始时H₂O₂的总量通过下面的方法获得：所有去除的上清液中的H₂O₂+在实验结束时凝胶中剩余的任何量的H₂O₂的总和。去除的H⁺的量通过测量相对于没有凝胶(仅有水)的对照孔的上清液的pH来确定。由于pH与H⁺离子的活性的负对数成正比，因此从凝胶去除的H⁺的量可以相对于对照孔进行计算，对照孔说明自然的空气酸化程度。当上清液的pH与对照孔的pH匹配时停止实验，并将去除的H⁺的累积活性作为时间的函数作图。如可以见到的，在4小时后>96％的H₂O₂被去除，且在7小时后>99％的H₂O₂被去除。类似地，在8小时后>85％的残留酸被去除。然而我们注意到，当纯化效率受扩散控制时，上面的图仅对于所报道的水更换频率是有效的。更频繁的水更换方案或使用被缓冲的介质(例如生长培养基或PBS)代替水预期会得到甚至更好的结果。

图32图示了根据本发明的水凝胶的逐渐的和可调的释放动力学。首先将含有1mg/mL葡聚糖-染料(10kDa)的LK₆C在48孔板中浇注，并孵育过夜。水凝胶不被氧化或被氧化2小时，然后在室温下在引入水。然后萃取水以测定来自水凝胶的葡聚糖释放(校准曲线的R²为0.999)。释放曲线显示没有突释，而是逐渐释放，一直至28天。氧化的水凝胶的释放速率较低，推测是由于其在水中较高的稳定性所致。

图33显示了CRGD经由半胱氨酸-介导的二硫键化学缀合在LK₆C纤维上。在0.06％H₂O₂的存在下将CRGD与LK₆C混合，并在25℃在环形模具中浇注22小时。(A)后来的UPLC揭示在色谱图中存在三个主要的峰，它们可以基于各自的MS归属为：(B)未反应的LK₆C单体,(C)(LK₆C)₂二聚体和(D)二硫化物连接的LK₆C-CRGD缀合物。所有峰均已经用颜色编码以便于解读。较早的实验也确定未反应的CRGD单体或(CRGD)₂二聚体在约1.1min(未显示的数据)洗脱，在此两者均未被观察到(参见A的放大插图)。因此整合素-识别基序CRGD被成功地缀合到LK₆C纤维上。CRGD基序的缀合仅意在说明此平台的通用性和反应条件的简单性。未来的缀合不需要限于此序列。

图34显示了3D细胞培养和RGD的掺入对HepG2细胞的活力和铺展的作用。(A)与LK₆C+/-RGD凝胶培养中的细胞相比，在常规2D表面上培养4天的用钙黄绿素染色的有活力细胞的正面视图。除了2D培养以外，所有图像均是几个序列图(z-stacks)的合并图像。(B)在RGD-官能化的、交联的和纯化的LK₆C凝胶上培养4天后细胞是有活力的，如从钙黄绿素阳性信号所显现。也实现了3D分布，如通过横截面切片所确认的，横截面切片揭示了多层细胞生长。RGD的存在增加了细胞的活力，如在(A)中视觉上所提示的和通过(C)MTT测定所证实的。(D)在HepG2细胞的情况下，在存在或缺少RGD的情况下，与常规2D培养中的那些相比，LK₆C凝胶培养对细胞铺展具有不显著的效应(p>0.05)。(C-D)至少三次重复的平均值±s.d.。

图35图示了3D原代细胞培养和它们的细胞铺展面积。(A)将从新西兰白兔的角膜/巩膜分离的成纤维细胞保持在常规的完全DMEM中并在2D培养中或在纯化的LK₆C凝胶+/-各种浓度的CRGD中生长。将细胞孵育4天，然后用钙黄绿素AM对它们染色以进行共聚焦成像。来自凝胶培养的图像是几个序列图的合并图像。如观察到的那样，在所有情况下均看到有活力的成纤维细胞。在2D培养的情况下，反复观察到细胞在整个孔区域内不均匀分布，即，孔的中间细胞稀少而边缘是汇合的。相反，凝胶培养中的细胞均匀地分布在凝胶中。我们指出，使用相同的方法在同一天完成了对细胞的接种，并且最可能地，细胞的接种不能解释细胞的不均匀分布。(B)然后使用ImageJ软件分析以较高的放大倍数拍摄的图像以定量成纤维细胞的平均细胞铺展面积(至少三次重复的平均值±s.d.)。与在各种凝胶培养中的那些相比，兔成纤维细胞在2D培养中铺展地较大(ANOVA,p<0.05)。就细胞铺展面积而言，其中具有或没有CRGD的凝胶之间不存在显著的差异。

图36显示在LK₆C/CRGD凝胶上培养或在常规2D孔上培养的HepG2细胞的共聚焦图像(40×放大倍数)。在前者中，呈现的图像是几个序列图的合并图像。在共聚焦观察前细胞用钙黄绿素AM和Hoechst(Invitrogen,Singapore)染色。然后利用ImageJ软件处理来自至少两个独立位置的图像以定量细胞的平均铺展面积。

图37显示具有或不具有CRGD(1mg/mL)的LK₆C(10mg/mL)凝胶的流变学特性，LK₆C凝胶在0.06％H₂O₂的存在下浇注过夜，然后利用振荡流变仪定量它们的(A)刚度和(B)弹性(三次重复的平均值±s.d.)。在CRGD缀合后，凝胶保持它们的刚度但弹性变小。

图38显示在LK₆C+CRGD水凝胶中3D培养的3T3鼠成纤维细胞保持有活力至少21天。在共聚焦显微镜检之前细胞利用钙黄绿素AM染色。

图39图示了用于在伤口处理中测试LK₆C+CRGD水凝胶的手术步骤。(1)去除毛发，并标记用于手术去除的区域。去除表皮和真皮以模拟损伤。通过冷冻和复温的重复循环使移除的皮瓣失活。(2)具有开放伤口的小鼠。(3)将具有或不具有3T3成纤维细胞的LK₆C+CRGD水凝胶置于伤口上并将失活的皮瓣缝回以充当包扎敷料。(4)皮瓣敷料被缝回的小鼠。

图40显示水凝胶处理促进伤口中的血管化(见红色箭头)。利用H&E染色的玻片获得的初步数据揭示凝胶+3T3+敷料组具有最显著的再上皮化和较厚的真皮再生(未显示的数据)。

图41显示了总结一小部分含有半胱氨酸的肽的物理特性的表。我们调查了含半胱氨酸的肽的家族的凝胶形成能力和机械性能。特别地，Ac-IVKC,因其突出的交联后刚度而吸引了我们的注意力并且在下面已经提供了关于此候选物的更多数据。

图42显示了如何通过改变H₂O₂的浓度(0-0.2％)来调节Ac-IVKC的交联密度。然后在各种H₂O₂浓度中在室温孵育24小时后利用超高效液相色谱(UPLC)定量单体(保留时间约2.40分钟)和二聚体(约2.67分钟)的量。如可以见到的，随着H₂O₂的浓度的增加交联度从0％增加至100％。

图43显示Ac-IVKC的交联密度对凝胶刚度(G’)的相应作用，凝胶刚度使用振荡流变仪检查。绘制了刚度(G’)相对于角频率(ω)的图。如可以见到的，随着交联度增加，凝胶的刚度增加。达到了接近1MPa的G’值，对于此类型的肽水凝胶这是迄今为止最好的之一。

图44显示了当改变H₂O₂(0-0.2％)的浓度时拍摄的Ac-IVKC凝胶的图片。如可以见到的，所有凝胶均是透明的并且当交联度随着H₂O₂的浓度增加而从0％增加至100％时变得引人注目的更坚硬。

图45显示在两块侧面被密封以保持水分的玻璃板之间浇注Ac-IVKC薄层的方法。利用被厚度为750μm的垫片隔开的夹子将两块玻璃板保持在一起。然后在玻璃板之间注射凝胶溶液并使其胶化过夜。为了回收凝胶，将玻璃板分开。很容易从玻璃板回收凝胶，其是透明的并且容易被处理。

具体实施方式

发明人之前已经描述了能够自组装成最终引起水凝胶形成的螺旋形纤维的短肽序列(3-7个残基)。尽管这些肽具有良好的机械性能，并且可以包埋大量的水，但它们完全依赖于物理力以将交织的纤维网络保持在一起。因此，一些肽序列——其一个实例是LIVAGK(或缩写成LK₆)——典型地以相当高的浓度使用以确保凝胶在水溶液中的完整性和稳定性。这显著地增加了成本。

与以前的公开(基于超小肽的和基于肽/聚合物的水凝胶)相比，如上所定义的本发明在材料的性能诸如刚度、弹性和凝胶抗降解性方面提供了显著的改进。还将反应性化学基团引入至肽纤维，这允许生物信号容易原位化学缀合。此外，与之前的制剂相比，现在对于凝胶化需要较少的材料(例如10mg/mlLK₆C代替25mg/mlLK₆),这转变成显著的成本节约和较高的含水量。此类型的材料适合于生物医学应用，例如但不限于，三维细胞培养、组织工程、传感以及药物递送和基因递送。

本发明基于引入化学键以交联肽纤维，形成具有增加的刚度、弹性和抗降解性的凝胶。根据本发明，通过修饰在C-末端具有半胱氨酸残基的肽序列例如LIVAGKC(或LK₆C)来引入化学交联。以此方式，仍然保留了凝胶的全部氨基酸组成，通常这使得其成为生物相容性材料。已经使用在水或细胞培养基(诸如添加了FBS/青霉素/链霉素的生长培养基)中的这些可交联的肽浇注成三维凝胶，并且载荷已经被包封在基质内。至关重要的是，除了物理自组装力以外，现在引入了纤维间和纤维内化学键(特别地，各自具有硫醇基的半胱氨酸或同型半胱氨酸残基之间的二硫键)。在氧化剂如过氧化氢(H₂O₂)的存在下可以促进这些化学键的形成。可选地，当在体内使用时化学键(例如二硫键)形成还可以在氧化性血液环境中得到促进。由于另外的化学键的存在，交联的形成显著地增加了凝胶的弹性。引入交联的另一个优势包括：由于在纤维内和纤维间的较强相互作用，而增加了凝胶的抗降解性。这也意味着需要较少的材料来获得具有与较早的制剂相当或甚至优于较早的制剂的机械性能的凝胶，这又转化成显著的成本节省和较高的含水量。本发明还允许通过改变氧化交联方案来调整水凝胶的物理特性(刚度、弹性等)。反应性化学基团的存在还能够实现用进一步增加凝胶的生物相容性的载荷或粘附信号(例如，CRGD)对凝胶进行官能化。因此，除了简单的物理包封以外，载荷现在可以与凝胶基质共价链接。此外，缀合步骤还可以在形成凝胶的同时方便地在原位完成。根据本发明，对过氧化氢辅助的氧化过程仅使用温和的条件。重要的是，可以避免使用在许多其他氧化实验规程中所指定的马-辣根过氧化物酶(HRP)。这进一步降低了成本并且有助于未来获得监管部门批准。而且，发明人已经设计了一种在将例如细胞引入凝胶上之前去除大多数来自固相肽合成的未反应的过氧化氢(>99％)和残留酸的方法。包封在凝胶内的载荷的释放曲线也可以通过改变氧化策略来调整。

根据本发明的水凝胶是无变应性的和无毒的。发明人还通过在纯化和交联的LK₆C-CRGD凝胶上成功地培养了数种细胞类型而证明了该水凝胶的生物相容性。他们还设法证明了细胞在LK₆C-CRGD水凝胶内的3D分布。更具体地，将细胞接种在凝胶上并利用荧光活细胞标志物钙黄绿素来染色。通过获得水凝胶的垂直横截面切片并且对细胞的穿透深度分布进行直接成像，他们观察到多层细胞生长。这证实了细胞浸润至凝胶中并且令人信服地证明了3D细胞生长环境。

根据本发明的水凝胶的潜在应用包括：

·用于组织工程的(可注射的)应用，特别是在整形外科和美容外科应用中。由于血液的总氧化还原电位是氧化性的(尽管细胞内总氧化还原电位是还原性的)，因此甚至可以完全避免H₂O₂。因此，二硫键将天然地和在该过程中形成，并且因此增加凝胶的长期稳定性，这已是对目前制剂的一个改进。

·3D细胞培养基底。粘附或生长信号可以被共价连接以增加生物相容性。这样的3D细胞培养基底可以例如用作3D癌症模型。

·皮肤移植。使用例如基于LK₆C的凝胶作为支架，首先将成纤维细胞包埋在凝胶块内，接着将角质形成细胞接种在凝胶的表面上以分别模拟人皮肤的真皮和表皮。然后可以将这种人工皮肤层开发用于移植应用。

·用于角膜内皮移植的支架。人角膜的内皮是单层并且对于视力的维持是至关重要的。因此对内皮的处理在技术上是挑战性的并且可以影响角膜内皮移植的成功。根据本发明的水凝胶,诸如基于LK₆C的那些，可以用作基质支持物，将角膜内皮细胞培养在该水凝胶上，该水凝胶然后可以用作用于移植物的内皮替代物。

·载荷递送。药物和纳米粒子，例如PEI/DNA复合物，可以被包封用于逐渐释放。细胞附近载荷的物理浓度。可以需要较少的载荷来实现相似的效应(与通过向生长培养基中直接滴入来稀释粒子相比)，降低了成本和毒性。

·载荷的表面粘附，例如，可以先将DNA溶液在凝胶的顶部铺一层。静电相互作用可以在去除DNA溶液和在凝胶上培养细胞之前将DNA固定在凝胶表面上。在此情况下，实现了局部转染。

·粒子的附着，所述粒子例如用于在传感或其他生物装置中应用的金粒子。

·伤口处理。使用根据本发明的水凝胶用于处理伤口的优势包括：水凝胶保持伤口湿润；其提供用于再生皮肤层的支架；治疗药物可以装载到凝胶内以辅助康复。

本文公开了一种新型的水凝胶，其包含形成水凝胶的尤其是来源于天然氨基酸的肽/类肽。这些肽/类肽是具有脂肪族氨基酸的疏水部分和优选地具有一个或两个极性氨基酸的小的两亲肽。肽/类肽(典型地3-7聚体)典型地处于L-或D-形式并且可以自组装成超分子纤维，所述超分子纤维组织成网状结构。水凝胶通常的特征是显著的刚性并且是生物相容的和无毒性的。取决于肽/类肽序列，这些水凝胶可以显示温敏或触变特性。通过选择肽组装条件，可以控制纤维的厚度和长度。刚性的水凝胶可以用于培养多种原代人细胞，提供可以用于修复和代替多种组织的肽支架。还公开了制备这些水凝胶的程序。进一步公开了各种水凝胶在诸如细胞培养、组织工程、整形外科、药物递送、口腔应用、化妆品、包装等的应用中的用途以及用于技术应用的用途，如例如用于可以包括太阳能或燃料电池的电子装置中。

本文还公开了能够形成水凝胶的两亲肽和/或类肽，所述水凝胶即一种其中水是分散介质的聚合物网络。所述两亲肽和/或类肽包含一个或多个线性两亲序列,每个线性两亲序列具有极性部分和非极性部分。出于简单的原因，下面的解释很大程度上聚焦于由单个相应的线性序列组成的两亲肽和/或类肽。在这些解释中，相应的肽和/或类肽被命名为“线性肽和/或类肽”。各解释适用于任意线性序列，所述任意线性序列也可以包含在具有多个这些线性序列的两亲肽和/或类肽中。单独地选择这些线性序列中的每一个。在一些实施方案中，本文公开的两亲肽和/或类肽包含几个线性两亲序列,它们中的每一个与任意其他的所述线性两亲序列不同。在一些实施方案中，本文公开的两亲肽和/或类肽包含几个相同的线性两亲序列。在一个实施方案中，本文公开的两亲肽和/或类肽包含多个线性两亲序列,每个线性两亲序列与每个其他线性两亲序列相同。

还公开了包含o个两亲线性序列的肽和/或类肽。符号o代表选自1-约25,诸如1-约20、1-约18、1-约15、1-约12、1-约10、1-约8、1-约6、1-约5、1-约4或1-约3的范围的整数。在一些实施方案中，这些两亲线性序列以连续的方式连接，从而限定肽和/或类肽的线性部分。在一些实施方案中，肽和/或类肽具有带有一个或多个支链的主链。在这样的实施方案中，这些两亲线性序列可以包含在不同的分支中。如上所提到的，独立地选择o个两亲线性序列中的每一个。相应的两亲线性序列具有n个脂肪族氨基酸的长度。符号n代表选自3-约18,诸如3-约15、3-约14、3-约13、3-约12、3-约11、3-约10、3-约9、3-约8或3-约7，诸如3、4、5、6、7、8、9或10个脂肪族氨基酸的范围的整数。

在一些实施方案中，本文所述的肽和/或类肽的两亲线性序列是手性的，赋予整个两亲肽和/或类肽以手性。对应的线性肽和/或类肽，即，由单个相应的线性序列组成的实施方案，因此是手性的肽或类肽。相应的两亲线性序列可以包含任意的线性非芳香族氨基酸。术语“氨基酸”当用于本文中时是指α-氨基羧酸,即在α-位具有氨基基团的羧酸。相应的氨基基团可以是-NH₂基团或-NHR¹基团。R¹部分可以是任何的脂肪族基团，烷基、烯基或炔基均可，它们具有包含1-5、1-10、1-15或1-20个碳原子的主链。烯基基团的实例是直链或支链的含有一个或多个双键的烃基。烯基基团通常含有约2个-约20个碳原子和一个或多个(例如两个)双键，诸如约2个-约10个碳原子和一个双键。炔基基团通常含有约2个-约20个碳原子和一个或多个(例如两个)三键，优选诸如2个-10个碳原子和一个三键。炔基基团的实例是直链或支链的含有一个或多个三键的烃基。烷基基团的实例是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基，这些基团的n-个异构体，异丙基、异丁基、异戊基、仲丁基、叔丁基、新戊基、3,3二甲基丁基。

类肽是在酰胺氮处携带有为脂肪族部分的部分的寡(N-烷基)甘氨酸，其类似于侧链与肽的α碳原子(见下)连接。因此在其中-NHR¹基团(见上)包含在氨基酸中且α原子包含在-CH₂-基团中的实施方案中，多个这样氨基酸偶联的反应产物可以称为类肽。也可以认为类肽不同于肽，因为其在酰胺氮处而不是在α碳原子处携带其侧链。类肽典型地对蛋白酶和其他修饰酶有抵抗性并且可以具有比肽大得多的细胞渗透性(参见例如Kwon,Y.-U.,和Kodadek,T.,J.Am.Chem.Soc.(2007)129,1508-1509)。

术语“氨基酸”包括其中羧酸基团被下列形式的保护基保护的化合物：酯(包括原酸酯)、甲硅烷基酯、酰胺、酰肼、唑、1,3-唑啉或5-氧代-1,3,-唑烷。术语“氨基酸”也包括其中形式-NH₂或-NHR¹(见上)的氨基基团被保护剂保护的化合物。合适的氨基保护基包括但不限于氨基甲酸酯、酰胺、氨磺酰、亚胺、二酰亚胺、组氨酸、N-2,5,-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二甲硅基氮杂环戊烷加合物、N-1,1,3,3-四甲基-1,3-二甲硅基异二氢吲哚(N-1,1,3,3-tetramethyl-1,3-disilisoindoline)、N-二苯基甲硅烷基二乙烯(N-diphenylsilyldiethylene)、1,3,5-二嗪、N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲胺、N-(5,5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺、N-4,4,4-三氟-3-氧代-1-丁烯基胺、N-9-硼二环壬烷和硝胺。也可以存在保护氨基和羧基两者的保护基，诸如例如2,2-二甲基-4-烷基-2-硅杂-5-氧代-1,3-唑烷的形式。氨基酸的α碳原子典型地还携带氢原子。与α碳原子连接的所谓“侧链”(实际上是羧酸的连续主链)是可以是直链的或支链的脂肪族部分。术语“侧链”是指肽中存在氨基酸(见上)，其中通过偶联多个氨基酸形成主链。包含在这样的肽中的键接到氨基酸的α碳原子的脂肪族部分由此限定相对于主链的侧链。如上面解释的那样，同样适用于键合到氨基酸的氨基基团上的脂肪族部分，所述脂肪族部分同样地限定相对于类肽的主链的侧链。

除非另外指明，术语"脂肪族"意指直链的或带支链的烃链，其可以是饱和的，或单不饱和的，或多不饱和的，并且包含杂原子。术语"杂原子"当用于本文中时意指除了碳或氢以外的任何元素的原子。不饱和脂肪族基团包含一个或多个双键和/或三键(烯基或炔基部分)。烃链的支链可以包含线性链以及非芳香族环状要素。除非另外指明，烃链可以具有任何长度并且含有任意数目的支链。典型地，烃(主)链包含1-5、1-10、1-15或1-20个碳原子。烯基的实例是直链或带支链的含有一个或多个双键的烃基。烯基通常含有约2-约20个碳原子以及一个或多个(例如，两个)双键，诸如约2-约10个碳原子以及一个双键。炔基通常含有约2-约20个碳原子以及一个或多个(例如，两个)三键，优选诸如2-10个碳原子以及一个三键。炔基的实例是直链或带支链的含有一个或多个三键的烃基。烷基基团的实例是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基，这些基团的n-异构体，异丙基、异丁基、异戊基、仲丁基、叔丁基、新戊基、3,3二甲基丁基。主链以及支链两者可以进一步包含杂原子如例如N、O、S、Se或Si，或碳原子可以被这些杂原子替代。

脂肪族部分可以被或不被一个或多个官能团取代。取代基可以是任何官能团，如例如但不限于氨基、酰胺基、叠氮基、羰基、羧基、酮基、氰基、异氰基、二噻烷、卤素、羟基、硝基、有机金属、有机硼、硒基、甲硅烷基、硅烷醇基(silano)、磺酰基、硫代、硫氰基、三氟甲基磺酰基、对甲苯磺酰基、溴苯磺酰基、硝基苯磺酰基和甲磺酰基。

如从上面应当显而易见的，本文所述的肽/类肽中的氨基酸的侧链可以具有0-约5、0-约10、0-约15或0-约20个碳原子的长度。其可以是带支链的并且包含不饱和的碳碳键。在一些实施方案中，一个或多个天然氨基酸包含在肽或类肽中。这样的天然氨基酸可以是天然存在的蛋白的20个结构单元之一。

在肽或类肽(包括本文所公开的肽/类肽)中，各个氨基酸是经由第一个氨基酸的羧基和第二个氨基酸的氨基之间的酰胺键共价偶联的。本文所公开的肽和/或类肽是非-重复的，使得彼此偶联的两个氨基酸总是彼此不同。

术语两亲的是指在极性和非极性流体中均是可溶的化合物。其也涵盖多相化合物。肽和/或类肽的两亲特性是由于在该肽和/或类肽内存在极性部分和非极性部分两者所导致的。就此而言，肽和/或类肽可以具有表面活性剂性质。因此，本文所公开的肽和/或类肽的极性特性基于极性部分。两个这样的部分是-COOH侧基(特别是带电荷的COO^-基团的形式)以及氨基。另一个这样的部分是C-末端-COOH基团，条件是其以游离的未保护形式存在。通常，表面活性剂分子包含与非极性部分(典型地烃部分)连接的极性的(典型地亲水的)首基。肽或类肽的非极性部分包含不携带官能团的烃链。

包含在本文所公开的肽和/或类肽中的两亲线性序列因此包含极性部分和非极性部分。极性部分包含携带极性基团的脂肪族氨基酸，所述极性基团诸如羟基基团、硫醇基、硒基基团、氨基基团、酰胺基、醚基团、硫醚基团或硒醚基团。因此，极性部分可以包含携带带有质子的极性官能团的氨基酸，所述极性官能团诸如羟基、硫醇、硒醇、胺或酰胺。极性部分还可以包含肽和/或类肽的C-末端或N-末端。在这种情况下C-末端或N-末端可以分别以游离羧基或氨基基团的形式存在，即，不含保护基。

通常本文公开的两亲肽和/或类肽的线性两亲序列的极性部分由与肽/类肽的非极性部分偶联的单个氨基酸限定，由与肽/类肽的非极性部分偶联的两个连续氨基酸限定，或由与肽/类肽的非极性部分偶联的三个连续氨基酸限定。因此，在一些实施方案中，肽/类肽的极性部分由两个经由酰胺键共价连接的氨基酸组成，这两个氨基酸均携带极性肽/类肽侧链。这两个氨基酸中的一个可以是肽/类肽的限定其N-末端或C-末端的末端氨基酸。在一些实施方案中，两亲肽/类肽具有单个具有极性侧链的氨基酸，其中肽/类肽的剩余部分限定非极性部分。在一些实施方案中，两亲肽/类肽具有两个具有极性侧链的氨基酸，而肽/类肽的剩余部分限定非极性部分。作为相应的极性侧链的三个说明性实例可以是4-甲基-4-硫代-戊基、6-乙氧基羰基-4,5-二甲基-己基和6-羟基-4-(1-羟乙基)-己基基团。当在本文中使用时，对应的肽/类肽侧链的编号在分别与氨基酸的α-碳原子或氨基酸的氨基基团共价键接的碳原子处以“1”开始。包含在极性部分中的氨基酸可以是或包括但不限于天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、4-氟-谷氨酸、2-氨基己二酸、γ-羧基-谷氨酸、4-叔丁基天冬氨酸、谷氨酰胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(茶氨酸)、瓜氨酸、硫代-瓜氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、蛋氨酸、乙硫氨酸、硒代蛋氨酸、碲代蛋氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、丝氨酸、同型丝氨酸、精氨酸、同型精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、5-羟基-赖氨酸和N(6)-羧基甲基赖氨酸。任何这样的氨基酸可以以L-或D-形式存在。

本文公开的两亲肽/类肽的两亲线性序列可以被定义为具有n个氨基酸。在单个具有极性侧链的氨基酸包含在两亲线性序列中的情况下，则非极性部分可以被认为具有n-1个氨基酸。在此情况下，极性部分由恰好一个氨基酸组成，这个氨基酸选自前面段落的任意氨基酸。在两个连续的具有极性侧链的氨基酸包含在两亲线性序列中的情况下，则非极性部分可以被认为具有n-2个氨基酸。在此情况下，极性部分由恰好两个氨基酸组成。在三个连续的具有极性侧链的氨基酸包含在两亲线性序列中的情况下，则非极性部分可以被认为具有n-3个氨基酸。在此情况下，极性部分由恰好三个氨基酸组成。在其中极性部分由两个氨基酸组成的实施方案中，极性部分可以具有选自下列的序列：Asn-Asn、Asp-Asp、Glu-Glu、Gln-Gln、Asn-Gln、Gln-Asn、Asp-Gln、Gln-Asp、Asn-Glu、Glu-Asn、Asp-Glu、Glu-Asp、Gln-Glu、Glu-Gln、Asp-Asn、Asn-Asp、Thr-Thr、Ser-Ser、Thr-Ser、Ser-Thr、Asp-Ser、Ser-Asp、Ser-Asn、Asn-Ser、Gln-Ser、Ser-Gln、Glu-Ser、Ser-Glu、Asp-Thr、Thr-Asp、Thr-Asn、Asn-Thr、Gln-Thr、Thr-Gln、Glu-Thr、Thr-Glu。在其中极性部分由三个氨基酸组成的实施方案中，极性部分可以具有选自下列的序列：Asn-Asn-Asn、Asn-Asn-Asp、Asn-Asp-Asn、Asp-Asn-Asn、Asp-Asp-Asn、Asp-Asn-Asp、Asp-Asp-Asp、Asn-Asn-Glu、Asn-Asn-Gln、Asn-Glu-Asn、Asn-Gln-Asn、Glu-Glu-Glu、Gln-Gln-Gln、Asn-Gln-Gln、Asn-Glu-Gln、Asp-Asn-Glu、Gln-Asn-Asn、Gln-Asn-Asn、Glu-Asp-Gln、Asp-Gln-Asp、Asn-Glu-Asp、Glu-Asn-Gln、Asp-Glu-Gln、Asn-Glu-Gln、Glu-Asp-Asn、andGln-Asp-Asn、Thr-Thr-Thr、Ser-Ser-Ser、Asn-Thr-Thr、Asn-Ser-SerAsn-Ser-Thr、Asn-Thr-SerAsp-Asn-Ser、Ser-Asn-Asn、Thr-Asn-Asn、Ser-Asp-Thr，仅作为举例。

在生理pH，肽/类肽的两亲线性序列具有净电荷。本领域技术人员知晓，术语“生理pH”是指血液的pH值，血液的pH值典型地为约7.4的pH值。在其中两亲线性序列排列在肽/类肽的C-末端或N-末端处的实施方案中，相应末端可以提供相应的净电荷。在其中两亲线性序列不排列在肽/类肽的C-末端或N-末端处的实施方案中，两亲线性序列的极性部分包含一个或多个具有下述侧链的氨基酸，所述侧链具有在生理pH下带电荷的官能团。相应官能团的说明性实例包括氨基、硝基、胍基、酯基、磺酰基或羧基基团。在一些实施方案中，两亲线性序列的净电荷(作为正电荷或作为负电荷)等于或小于其极性部分中包含的氨基酸的数目。在一些实施方案中，两亲线性序列的净电荷是-3、-2或-1中的一个。在一些实施方案中，两亲线性序列的净电荷是+1、+2或+3。

极性部分的氨基酸的相应极性侧链与氨基酸(见上)的α碳原子和/或其氨基基团偶联，可以典型地由包含1-约20、包含1-约15、1-约10或1-约5个碳原子的主链限定。出于清楚的原因，要说明的是相对于肽和/或类肽的主链使用术语“侧链”。此肽和/或类肽侧链可以是带支链的，并且因此由主链和支链限定。肽和/或类肽侧链的主链和支链——如果存在的话——两者可以包含一个或多个双键或三键(见上)。侧链的实例包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丙烯基、丙炔基、丁基、丁烯基、仲丁基、叔丁基、异丁基、戊基、新戊基、异戊基、戊烯基、己基、3,3二甲基丁基、庚基、辛基、壬基或癸基基团。极性官能团与此肽和/或类肽侧链键合。

在一些实施方案中，两亲线性序列的极性部分包含两个相同的氨基酸。在这些氨基酸是天然存在的氨基酸的情况下，它们可以例如限定序列Lys-Lys、Gln-Gln、Glu-Glu、Asp-Asp、Asn-Asn、Met-Met、Thr-Thr、Arg-Arg或Ser-Ser中的一个。在此语境中术语“天然存在的”是指遗传代码被任何生物体直接翻译的20个氨基酸。这两个相同的极性氨基酸可以例如邻接非极性部分。

在一些实施方案中，肽/类肽的两亲线性序列具有脂肪族氨基酸的疏水尾部和至少一个极性的(包括带电荷的)氨基酸首基。

非极性部分包含具有不携带官能团的烃链的氨基酸，通常至少两个具有不携带官能团的烃链的氨基酸。与氨基酸的α-碳原子(见上)偶联的相应侧链可以具有包含0-约20个或1个-约20个(包括0-约15个、1个-约15个、0-约10个、1个-约10个、1个-约5个或0-约5个)碳原子的主链。非极性部分可以因此包含不具有侧链的氨基酸，即，甘氨酸。肽和/或类肽侧链可以是带支链的(见上)并且可以包含一个或多个双键或三键(见上)。肽和/或类肽侧链的实例包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丙烯基、丙炔基、丁基、丁烯基、仲-丁基、叔-丁基、异丁基、戊基、新戊基、异戊基、戊烯基、己基、3,3二甲基丁基、庚基、辛基、壬基或癸基基团。作为几个说明性实例，非极性部分可以包括氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、2-(甲基氨基)-异丁酸、2-氨基-5-己炔酸。这样的氨基酸可以以任何所需的构型存在。与非极性部分键合的也可以是肽/类肽的C-末端或N-末端。在这种情况下典型地C-末端或N-末端被保护基保护(见上)。

在一些实施方案中，非极性部分包含以大小递减或递增排列的氨基酸的序列。因此，非极性部分的氨基酸部分可以以大小递减或递增的总体序列排列。相对于从N-末端至C-末端或从C-末端至N-末端的方向，此总体序列可以因此被认为是大小递减的。术语大小递减或递增的“总体序列”意指包括其中邻接氨基酸具有大体相同的大小(只要总体上是大小递减的或递增的)的实施方案。在大小递减的总体序列内，在大小递减的总体序列的方向上非极性部分的邻接氨基酸的大小因此是相同的或较小的。在一些实施方案中，大小递减或递增的总体序列是非重复序列。

作为说明性实例，在相应部分的氨基酸是5个氨基酸的序列的情况下，第一氨基酸可以具有3,4-二甲基-己基侧链。第二氨基酸可以具有新戊基侧链。第三氨基酸可以具有戊基侧链。第四氨基酸可以具有丁基侧链。第五氨基酸可以为甘氨酸，即，没有侧链。尽管新戊基和戊基侧链具有相同的大小，但这种非极性肽的总体序列的大小是递减的。作为非极性部分中大小递减的总体序列的又一说明性实例，相应的非极性部分可以是三个氨基酸的序列。第一氨基酸可以具有正壬基侧链。第二氨基酸可以具有3-乙基-2-甲基-戊基侧链。第三氨基酸可以具有叔丁基侧链。作为非极性部分中大小递减的总体序列的还又一说明性实例，非极性部分可以是9个氨基酸的序列。第一氨基酸可以具有4-丙基-壬基侧链。第二氨基酸可以具有正十二烷基侧链。第三氨基酸可以具有6,6-二乙基-3-辛烯基侧链。正十二烷基侧链和6,6-二乙基-3-辛烯基侧链两者均具有12个碳原子并且因此再次具有相当的大小。然而，6,6-二乙基-3-辛烯基包含不饱和的碳-碳键并且因此其大小比十二烷基稍小。第四氨基酸可以具有2-甲基-壬基侧链。第五氨基酸可以具有3-丙基-己基侧链。第六氨基酸可以具有正己基侧链。第七氨基酸可以具有2-丁炔基侧链。第八氨基酸可以具有异丙基侧链。第九氨基酸可以具有甲基侧链。

在大小递减(或递增)的总体序列中排列的非极性部分的氨基酸部分仅含有天然存在的氨基酸(无论是D-或L-型)的情况下，例如，其可以具有5个氨基酸的长度，诸如序列亮氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、或异亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸。仅有天然氨基酸的尺寸减小的总体序列也可以具有4个氨基酸的长度。说明性实例包括下述序列：异亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸、亮氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸、异亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、亮氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸、亮氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸、或异亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸。仅有天然氨基酸的尺寸减小的总体序列也可以具有3个氨基酸的长度。说明性实例包括以下的序列：异亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸、亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸、异亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸、亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸、亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸、或异亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸。仅有天然氨基酸的尺寸减小的总体序列也可以具有2个氨基酸的长度。说明性实例包括以下的序列：异亮氨酸-缬氨酸、亮氨酸-缬氨酸、异亮氨酸-丙氨酸、亮氨酸-丙氨酸、亮氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-甘氨酸或丙氨酸-甘氨酸。

在一些实施方案中，上述定义的大小递减的总体序列的大小递减的方向是朝向两亲线性序列的极性部分的方向。因此，在这样的实施方案中，非极性部分的此部分内的邻接氨基酸的大小因此在极性部分的方向上是相同的或较小的。在此，作为在此实施方案中的总体趋势，越靠近两亲线性序列的极性部分，在整个对应的大小递减的总体序列内，肽和/或类肽侧链的总大小越小。在上述的具有正壬基、3-乙基-2-甲基-戊基和叔丁基侧链的三个氨基酸的总体序列的说明性实例中，下一个氨基酸因为其携带具有极性官能团的肽/类肽侧链而可能是极性的。作为说明性实例，在肽/类肽内邻接叔丁基侧链的可以是3-羧基-n-丁基侧链。

在一些实施方案中，两亲线性肽和/或类肽或两亲线性序列的整个非极性部分分别由大小递减(或递增)的总体序列组成。在这样的实施方案中，大小递减(或递增)的总体序列可以具有n-m个氨基酸的长度(参见上面)。在一些实施方案中，大小递减或递增的总体序列侧接肽/类肽的另外的非极性侧链。在一个实施方案中，大小递减(或递增)的总体序列具有n-m-1个氨基酸的长度。在此实施方案中，肽/类肽中包含一个另外的氨基酸，提供非极性肽/类肽侧链。此氨基酸可以位于大小递减(或递增)的总体序列和极性氨基酸之间,极性氨基酸可以位于此另外的非极性氨基酸和大小递减(或递增)的总体序列之间，或大小递减(或递增)的总体序列可以位于极性氨基酸和此另外的非极性氨基酸之间。典型地，大小递减(或递增)的总体序列位于极性氨基酸和此另外的非极性氨基酸之间。此另外的非极性氨基酸可以例如限定肽/类肽的N-末端，所述N-末端可以被保护基保护，所述保护基诸如酰胺基,例如丙酰基(propionicacyl)或乙酰基。与如上所定义的大小递减(或递增)的总体序列一起，其可以限定肽/类肽的非极性部分。极性氨基酸可以限定肽/类肽的C-末端。在此实施例中，大小递减(或递增)的总体序列由此在一侧侧接极性氨基酸且在另一侧侧接此另外的非极性氨基酸。在一个其中大小递减(或递增)的总体序列具有n-m-1个氨基酸的长度的实施方案中，n-m个氨基酸的非极性部分的剩余非极性氨基酸是丙氨酸和甘氨酸之一。

如上面解释的，在一些实施方案中，两亲线性序列的极性部分可以被两个或三个连续氨基酸限定。极性部分包含m个脂肪族氨基酸。m个脂肪族氨基酸中的每一个被独立地选择并且携带独立选择的极性基团。符号m代表选自1、2和3的整数。因此至少基本上非极性的部分(见上)具有n-m个数目，即，n-1、n-2或n-3个氨基酸。在一些实施方案中，n等于或大于m+2。在这样的实施方案中，m可以因此代表n-2或更小的数目。

在其中两亲线性肽和/或类肽的整个非极性部分由大小递减(或递增)的总体序列组成的实施方案(见上)中，此非极性部分可以因此具有n-2或n-3个氨基酸的长度。在其中除了大小递减(或递增)的非极性部分以外两亲线性肽和/或类肽还具有另外的非极性侧链的实施方案中，此另外的非极性侧链可以包含在与大小递减(或递增)的总体序列的氨基酸直接键合的氨基酸中。非极性部分因此可以由大小递减(或递增)的非极性部分和该对应的具有非极性侧链的另外的氨基酸限定。在一个这样的其中m＝1的实施方案中，非极性部分因此可以具有n-2个氨基酸的长度，其中大小递减(或递增)的非极性部分可以具有n-3个氨基酸的长度。大小递减(或递增)的总体序列可以位于所述两个极性氨基酸和这个另外的非极性氨基酸之间，或所述另外的非极性氨基酸可以位于大小递减(或递增)的总体序列和所述两个极性氨基酸之间。典型地，大小递减(或递增)的总体序列位于所述两个极性氨基酸和这个另外的非极性氨基酸之间。如上面所提到的，所述两个极性氨基酸中之一可以限定肽/类肽的C-末端。在此实施例中，大小递减(或递增)的总体序列因此可以在一侧侧接所述两个连续的极性氨基酸并在另一侧侧接该另外的非极性氨基酸。此外，在一些其中m＝1的实施方案中，所述两个连续的极性氨基酸也可以位于大小递减(或递增)的总体序列和该另外的非极性氨基酸之间，在此情况下，非极性部分具有长度为n-3个氨基酸的第一部分和一个氨基酸的另一部分。

如上所定义的两亲线性序列(包括两亲线性肽和/或类肽)之间的静电力、氢键和范德华力导致这些两亲线性序列彼此偶联。不受理论限制，由此发生交联效应，其允许形成水凝胶。就此而言，本发明人已经观察到基于螺旋结构的纤维的形成。

由本文公开的两亲肽和/或类肽的两亲线性序列形成的纤维典型地显示高的机械强度，所述高机械强度使得它们在组织再生应用(例如，代替受损的组织)中特别有用。已经观察到本文公开的两亲肽和/或类肽通常组装成类似胶原纤维的纤维结构。胶原是动物和人体中软组织的一个组分，其是提供组织的大部分拉伸强度的纤维状蛋白。已经发现本文公开的两亲肽和/或类肽的纤维的机械强度典型地比胶原或明胶(胶原的水解形式)的机械强度高得多(参见，例如附图)。本文公开的两亲肽和/或类肽因此可以包含在用作用于受损的或患病的组织的永久或临时修复替代物的水凝胶中。

已经发现肽/类肽的两亲线性序列(可以代表整个两亲肽/类肽(见上))在生理条件下、甚至在升高的温度下显示显著的稳定性。在一些实施方案中，其在生理条件下在环境温度下在水溶液中稳定持续1天至1个月或更长时间的范围的时期。在一些实施方案中，其可以在生理条件下在90℃在水溶液中稳定持续至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时或至少5小时。

本文公开的两亲肽和/或类肽(包括两亲线性肽和/或类肽)的两亲线性序列在生理条件下在水溶液中能够提供自组装的α-螺旋纤维。处于L-型或D-型的肽/类肽(典型地3-7-聚体)可以自组装成超分子螺旋纤维，所述超分子螺旋纤维组织成模拟生物学物质诸如胶原的网状结构。以前在X射线结晶学中已经观察到具有含重复丙氨酸的序列和乙酰化C-末端的3-6个氨基酸的长度的肽采取螺旋形构象(Hatakeyama,Y等,Angew.Chem.Int.Ed.(2009)8695-8698)。使用具有本文公开的两亲序列的肽Ac-LD₆(L)，例如在0.1mg/ml已经观察到聚集体的形成。当肽的浓度增加至1mg/ml时，发现肽单体排列形成纤维状结构。由于在生理条件下在低于2mM的浓度下出现的纤维形成，因此本文公开的肽/类肽非常适合用作可以在生理条件下形成水凝胶的可注射水凝胶材料。本文还公开了如上所定义的两亲线性肽和/或类肽用于组织工程以及涉及应用(包括注射)相应的两亲线性肽和/或类肽的组织工程方法。

如本文公开的水凝胶典型地以显著的刚性为特征并且通常是生物相容的和无毒性的。取决于所选的肽/类肽序列，这些水凝胶可以显示温敏性或触变性特征。依赖于肽/类肽组装条件，纤维在厚度和长度上有所不同。通常，所获得的刚性的水凝胶非常适合用于培养多种原代人细胞，提供可以用于修复和替代各种组织的肽/类肽支架。还公开了制备这些水凝胶的方法。记载了这些水凝胶在诸如细胞培养、组织工程、整形外科、药物递送、口部应用、化妆品、包装等应用中以及用于技术应用(如例如用于可能包含太阳能电池或燃料电池的电子装置中)的示例性用途。

作为肽/类肽的两亲线性序列，如本文公开的水凝胶在生理条件下、甚至在升高的温度下显示高稳定性。在一些实施方案中，这样的水凝胶在环境温度下在水溶液中稳定持续至少7天、至少14天、至少1个月或更长时间诸如至少1-约6个月的时期。

在一些实施方案中，本文公开的水凝胶与具有特征性光谱或荧光特性(诸如标志物，包括荧光染料)的分子或粒子(包括量子点)偶联。相应的分子可以例如允许监控水凝胶的变化情况(fate)、位置和/或完整性。

在一些实施方案中，本文公开的水凝胶与对所选的靶分子具有结合亲和力的分子偶联，所述靶分子诸如微生物、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、肽、寡糖、多糖、无机分子、合成聚合物、小的有机分子或药物。

术语“核酸分子”当用于本文中时是指处于任何可能构型的任意核酸，所述构型诸如单链、双链或其组合。核酸包括例如DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物或使用核酸化学生成的DNA或RNA的类似物、锁核酸分子(LNA)和蛋白核酸分子(PNA)。DNA或RNA可以是基因组或合成来源的并且可以是单链或双链的。在本发明的一个实施方案的方法中，典型地但非必须地，将使用RNA或DNA分子。这样的核酸可以是例如mRNA、cRNA、合成的RNA、基因组DNA、cDNA、合成的DNA、DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸等。此外相应的核酸还可以含有非天然核苷酸类似物和/或连接至亲和标签或标记。在一些实施方案中，核酸分子可以被分离、富集或纯化。核酸分子可以例如通过cDNA克隆或通过消减杂交(substractivehybridization)从天然来源分离。天然来源可以是哺乳动物，诸如人、血液、精液或组织。核酸也可以例如通过三酯法或通过使用自动DNA合成仪合成。

许多核苷酸类似物是已知的并且可以在本发明的示例性实施方案的方法中所用的核酸和寡核苷酸中使用。核苷酸类似物是含有在例如碱基、糖或磷酸部分处的修饰的核苷酸。在碱基部分处的修饰包括对下述物质的天然的和合成的修饰：A、C、G和T/U；不同的嘌呤或嘧啶碱基(诸如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基和2-氨基腺嘌呤-9-基)；以及非嘌呤或非嘧啶的核苷酸碱基。其他核苷酸类似物充当通用碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基能够与任何其他碱基形成碱基对。碱基修饰经常可以与例如糖修饰(诸如例如2'-O-甲氧基乙基)组合，例如以获得独特的特性诸如增加的双链体稳定性。

肽可以是合成来源的或通过本领域中熟知的方法分离自天然来源。天然来源可以是哺乳动物，诸如人、血液、精液或组织。肽(包括多肽)可以例如使用自动多肽合成仪合成。多肽的说明性实例是抗体、其片段和具有抗体样功能的蛋白性结合分子。(重组)抗体片段的实例是Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、双特异性抗体(diabody)、三特异性抗体(triabody)(Iliades,P.,等人,FEBSLett(1997)409,437-441),decabodies(Stone,E.,等人,JournalofImmunologicalMethods(2007)318,88–94)和其他结构域抗体(Holt,L.J.,等人,TrendsBiotechnol.(2003),21,11,484-490)。具有抗体样功能的蛋白样结合分子的实例是基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白(WO03/029462,Beste等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)96,1898-1903)。脂质运载蛋白,诸如后胆色素结合蛋白、人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、人载脂蛋白D或妊娠相关子宫内膜蛋白(glycodelin),拥有天然配体结合位点，所述天然配体结合位点可以被修饰以致它们与已知作为半抗原的选择的小蛋白区域结合。其他蛋白性结合分子的实例是所谓的glubodies(参见例如国际专利申请WO96/23879),基于锚蛋白支架(Mosavi,L.K.,等人,ProteinScience(2004)13,6,1435-1448)或结晶支架(例如国际专利申请WO01/04144)的蛋白，Skerra,J.Mol.Recognit.(2000)13,167-187中所述的蛋白，AdNectin，四连接素(tetranectin)和高亲和性多聚体(avimer)。高亲和性多聚体含有所谓的A-结构域，所述A-结构域作为几种细胞表面受体的多个结构域的串出现(Silverman,J.,等人,NatureBiotechnology(2005)23,1556-1561)。来源于人纤连蛋白的一个结构域的Adnectin含有可以被改造用于与靶标的免疫球蛋白样结合的三个环(Gill,D.S.&Damle,N.K.,CurrentOpinioninBiotechnology(2006)17,653-658。来源于对应的人同源三聚体(homotrimeric)蛋白的四连接素同样含有在C-型凝集素结构域中的环区，其可以被改造用于所需的结合(同前)。当需要时，可以使用改性剂进一步增加对应部分对任何或特定形式、类型等的靶物质的亲和性。

具有抗体样功能的核酸分子的实例是适体。适体折叠成轮廓分明的三维基序并且显示对给定靶结构的高亲和性。使用本领域的标准技术诸如固相合成，可以因此形成具有对特定靶标的亲和性的适体并且可以将其固定化在本发明的实施方案的中空粒子上。

作为进一步的说明性实例，可以使用连接部分诸如亲和标签来固定化相应分子。这样的连接部分可以是包含氮基团、磷基团、硫基团、碳基团、卤素基团或假卤素基团的分子如基于烃的(包括聚合的)分子)，或其部分。作为说明性实例，包含在水凝胶中的肽/类肽可以包含(例如在肽/类肽的侧链上的)允许共价连接生物分子(例如诸如蛋白、核酸分子、多糖或其任意组合的分子)的官能团。对应的官能团可以以受保护的形式提供，被可以在所需的条件下被释放的保护基保护。对应的官能团的实例包括，但不限于，氨基基团、醛基、硫醇基、羧基基团、酯、酐、磺酸盐、磺酸酯、亚氨酸酯、甲硅烷基卤化物、环氧化物、1-氮杂环丙烷、亚磷酰胺(phosphoramidite)和重氮烷。

亲和标签的实例包括，但不限于，生物素、二硝基苯酚或地高辛、寡聚组氨酸、多聚组氨酸、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、钙调蛋白结合肽(CBP)、FLAG’-肽、T7表位(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、单纯疱疹病毒糖蛋白D的序列Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp的HSV表位、序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala的血凝素(HA)表位、序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu的转录因子c-myc的“myc”表位、或寡核苷酸标签。这样的寡核苷酸标签可以例如用于与具有互补序列的固定化的寡核苷酸杂交。连接部分的进一步实例是抗体、其片段或具有抗体样功能的蛋白性结合分子(也参见上文)。

连接部分的进一步实例是葫芦脲(cucurbituril)或能够与葫芦脲形成复合体的部分。葫芦脲是大环化合物，其包含甘脲单元，所述甘脲单元典型地由甘脲和甲醛的酸催化的缩合反应自组装而成。葫芦[n]脲(CB[n])包含n个甘脲单元，典型地具有两个具有极性脲基羰基的端口(portal)。经由这些脲基羰基，葫芦脲可以结合感兴趣的离子和分子。作为说明性实例，葫芦[7]脲(CB[7])可以与二茂铁甲铵(ferrocenemethylammonium)或金刚烷铵离子形成强复合物。葫芦[7]脲或例如二茂铁甲铵可以附接到生物分子，而剩余的结合伴侣(分别为例如二茂铁甲铵或葫芦[7]脲)可以结合至所选的表面。然后使生物分子与表面接触将导致生物分子的固定化。例如经由烷硫醇酯(alkanethiolate)结合至金表面的官能化的CB[7]单元已经被证明导致携带二茂铁甲铵单元的蛋白的固定化(Hwang,I.,等人,J.Am.Chem.Soc.(2007)129,4170-4171)。

连接部分的进一步实例包括但不限于寡糖、寡肽、生物素、二硝基苯酚、地高辛和金属螯合剂(也参见下文)。作为说明性实例，在其中靶分子是金属离子的情况下，可以使用相应的金属螯合剂诸如乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸(也称为次氮基三乙酸,NTA)、1,2-双(o-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、2,3-二巯基-1-丙醇(二巯基丙醇)、卟吩或血红素。作为实例，EDTA与大多数多价的、二价的、三价的和四价的金属离子诸如例如银(Ag⁺)、钙(Ca²⁺)、锰(Mn²⁺)、铜(Cu²⁺)、铁(Fe²⁺)、钴(Co³⁺)和锆(Zr⁴⁺)形成络合物，而BAPTA对Ca²⁺特异。在一些实施方案中，与对应的一种金属离子(或多种金属离子)的络合物中的对应金属螯合剂限定连接部分。这样的络合物例如是针对确定序列的肽的受体分子，其也可以包含在蛋白中。作为说明性实例，本领域中使用的标准方法是形成寡聚组氨酸标签和铜(Cu²⁺)、镍(Ni²⁺)、钴(Co²⁺)或锌(Zn²⁺)离子之间的络合物，其借助于螯合剂次氮基三乙酸(NTA)来呈现。

例如可以采用亲和素或链霉亲和素来固定化生物素化的核酸，或可以采用含有生物素的金单层(Shumaker-Parry,J.S.,等人,Anal.Chem.(2004)76,918)。作为又另一说明性实例，生物分子可以局部沉积，例如通过扫描电化学显微镜，例如经由吡咯-寡核苷酸模式(例如Fortin,E.,等人,Electroanalysis(2005)17,495)。在其他实施方案中，特别是在生物分子是核酸的情况下，生物分子可以直接在固定化单元的表面上合成，例如使光活化和灭活。作为说明性实例，在选择的表面区域上合成核酸或寡核苷酸(所谓的“固相”合成)可以使用电极使用电化学反应进行。例如可以为此目的采用如由Egeland&Southern(NucleicAcidsResearch(2005)33,14,e125)所述的电化学去封闭(electrochemicaldeblocking)步骤。合适的电化学合成也公开在美国专利申请US2006/0275927中。在一些实施方案中，可以进行生物分子特别是核酸分子的光引导的合成，包括UV-连接或光依赖的5’-去保护。

对选择的靶分子具有结合亲和性的分子可以通过任何方式被固定化在纳米晶体上。作为说明性实例，包含对应部分的寡肽或多肽可以经由硫醚键(例如使用ω官能化硫醇)共价连接至纳米晶体的表面。能够将本发明的实施方案的纳米晶体连接至具有选择的结合亲和性的分子的任何合适的分子可以用来将该分子固定化至纳米晶体。例如可以使用(双功能)连接剂诸如乙基-3-二甲基氨基碳二亚胺、N-(3-氨基丙基)3-巯基-苯甲酰胺、3-氨基丙基-三甲氧基硅烷、3-巯基丙基-三甲氧基硅烷、3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基-马来酰亚胺、或3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基-酰肼。在与连接剂反应前，可以对纳米晶体的表面修饰，例如通过利用冰巯基乙酸(glacialmercaptoaceticacid)处理进行修饰，以生成游离的巯基乙酸基团(mercaptoaceticgroup)，然后可以采用巯基乙酸基团来经由连接剂与分析物结合伴侣共价连接。

本发明的实施方案还包括水凝胶,水凝胶可以被认为是水溶胀的不溶于水的聚合材料。水凝胶包含如上所定义的肽和/或类肽，包括包含如上所定义的肽和/或类肽和由如上所定义的肽和/或类肽组成。由于水凝胶维持三维结构，本发明的实施方案的水凝胶可以用于多种应用。由于水凝胶具有高含水量并且包含氨基酸，因此其典型地具有优异的生物相容性。

根据本发明的实施方案的水凝胶通过自组装形成。发明人已经观察到肽/类肽组装成形成网状结构的纤维。不受理论约束，考虑如本文公开的肽/类肽的非极性部分之间的疏水相互作用辅助这样的自组装过程。

形成水凝胶的方法包括将肽/类肽溶解在水溶液中。可以采用搅动，包括混合诸如搅拌、和/或超声处理来促进溶解肽/类肽。在一些实施方案中，使其中具有肽/类肽的水溶液暴露于低于环境温度的一个温度，诸如选自约2℃-约15℃的温度。在一些实施方案中，使其中具有肽/类肽的水溶液暴露于升高的温度，即，高于环境温度的温度。典型地，使水溶液达到其暴露的温度。例如水溶液可以暴露于约25℃-约85℃或更高的温度，诸如约25℃-约75℃、约25℃-约70℃、约30℃-约70℃、约35℃-约70℃、约25℃-约60℃、约30℃-约60℃、约25℃-约50℃、约30℃-约50℃或约40℃-约65℃的温度,诸如例如约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃或约65℃的温度。其中具有肽/类肽的水溶液可以在此温度保持约5min-约10小时或更长的时期,诸如约10min-约6小时、约10min-约4小时、约10min-约2.5小时、约5min-约2.5小时、约10min-约1.5小时或约10min-约1小时的时期,诸如约15min、约20min、约25min、约30min、约35min或约40min的时期。

根据本发明的实施方案的水凝可以包含在燃料电池中，其中其可以例如提供阳极和阴极之间的基底。液体电解质可以被水凝胶包绕。同样，在电泳设备中根据本发明的实施方案的水凝胶可以提供两个电极之间的基底。水凝胶也可以是导电的。水凝胶也可以起提高电荷分离态的效率和/或减缓电荷重组的作用。因此水凝胶可以在任何形式的光电池中应用，包括太阳能电池。

在一些实施方案中，本文公开的水凝胶是生物相容的，包括药学可接受的水凝胶。术语"生物相容的"(其也可以被称为"组织相容的")当在本文中使用时是当在体内使用时产生很少(如果有的话)不良生物反应的水凝胶。因此该术语通常是指水凝胶不具有促进细胞中(包括在动物(包括人)体内)可测量到的不良生物反应的能力。生物相容性水凝胶可以具有下列特性中的一种或多种：无毒的、非致突变的、不引起变态反应的、非致癌的和/或非刺激性的。生物相容性水凝胶可以是绝对无害的并且可以被相应的细胞和/或机体耐受。生物相容性水凝胶本身也可改善机体的一种或多种功能。

取决于包含在水凝胶中的肽/类肽中所包含的氨基酸，相应的水凝胶可以是可生物降解的。可生物降解性水凝胶在体内在一段时间内(例如在数月或数年内)逐渐分解或被吸收。分解可以例如经由水解发生，可以被酶催化并且可以由水凝胶在人或动物身体内所暴露的环境(包括组织、血管或其细胞)所辅助。在肽完全由天然氨基酸组成的情况下，相应的肽通常可以被人/动物身体的酶降解。

根据本发明的实施方案的水凝胶还可以充当药学活性化合物诸如药物的储库。根据本发明的实施方案的水凝胶可以被设计成模拟生物体诸如人或动物身体的天然细胞外基质。由本发明的实施方案的肽/类肽(包括相应的水凝胶)形成的纤维可以充当生物支架。本发明的实施方案的水凝胶可以包含在植入物中，包含在隐形眼镜中或可以用于组织工程中。在一个实施方案中，所述肽典型地由3-7个氨基酸组成并且能够自组装成复杂的纤维性支架，所述纤维性支架当在水或水溶液中溶解时被视作水凝胶。这些水凝胶可以保留高达99.9％的水并且拥有足够高的机械强度。因此，这些水凝胶可以充当各种天然组织的人工替代品而没有免疫原性的风险。根据本发明的水凝胶可以用于培养合适的原代细胞并且因此形成可注射的细胞-基质化合物以在体内植入或再植入新形成的细胞-基质。因此，根据本发明的水凝胶特别地可用于组织再生或组织工程应用。当在本文中使用时，提到"植入物"或"植入"是指将含有水凝胶的装置外科和/或关节镜下植入至人或动物(例如哺乳动物)身体或肢体的用途和应用或用于将含有水凝胶的装置外科和/或关节镜下植入至人或动物(例如哺乳动物)身体或肢体的用途和应用。在本文中采用关节镜技术作为外科技术的亚组，并且对手术、外科学等的任何提及包括关节镜技术、方法和装置。包含根据本发明的实施方案的水凝胶的外科植入物可以包括肽和/或类肽支架。这种肽和/或类肽支架可以被相应的水凝胶限定。本发明的实施方案的水凝胶也可以包含在伤口覆盖物诸如纱布或片中，作用是将伤口保持在湿润状态以促进愈合。

取决于肽/类肽中所用的氨基酸序列，水凝胶可以是对温度敏感的。其可以例如具有较低的临界溶解温度或对应于此较低的临界溶解温度的温度范围，在此较低的临界溶解温度或温度范围之外，当水分子从凝胶释放时由于水分子使氢键释放，凝胶塌陷。

公开的主题也提供改进的手性的、两亲的、基于天然物质的肽和/或类肽，其装配成具有非常有利的材料性质的肽/类肽水凝胶。这些肽/类肽水凝胶的优点是它们被多种不同的原代人细胞接受，由此提供可以用于修复和替换各种组织的肽支架。取决于肽单体的手性，水凝胶的特性可以被设计成更稳定并且不易降解，但仍然是生物相容的。

本文所述的水凝胶和/或肽/类肽可以施用于生物体，包括病人本身，或施用于药物组合物中，其中其可以包含药学活性成分或合适的载体或一种或多种赋形剂，或与药学活性成分或合适的载体或一种或多种赋形剂混合。用于配制和施用相应的水凝胶或肽/类肽的技术与本领域中公认的低分子量化合物的技术类似或相同。示例性途径包括，但不限于，经口、透皮、和胃肠外递送。水凝胶或肽/类肽可以用于填充胶囊或管，或可以以压缩的形式作为药丸提供。肽/类肽或水凝胶也可以以可注射的或可喷雾的形式施用，例如，作为相应的肽/类肽的悬液使用。

本发明的实施方案的水凝胶可以例如被施用至皮肤或伤口上。更多的合适的施用途径可以包括例如储库(depot)、经口、经直肠、穿粘膜或经肠施用；胃肠外递送，包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。需注意就此而言，对于施用微米粒子，不需要外科程序。在微粒包含可生物降解性聚合物的情况下，不需要在释放抗癌剂后去除装置。然而，微米粒子可以包含在支架、涂层、贴片、复合材料、凝胶或石膏中或包含在支架、涂层、贴片、复合材料、凝胶或石膏上。

在一些实施方案中，可以以局部的方式施用水凝胶和/或肽/类肽而不是以全身方式例如经由注射施用。

包含本发明的实施方案的水凝胶和/或肽/类肽的药物组合物可以以其本身已知的方式制造，例如，通过常规的混合、溶解、粒化、制备糖衣丸(dragee-making)、磨细、乳化、包封、包埋或冻干工艺。

因此根据本发明的实施方案使用的药物组合物可以以常规的方式使用一种或多种生理可接受的载体配制，所述载体包括有助于将水凝胶和/或肽/类肽加工成可以药用的制剂的赋形剂和辅料。适宜的制剂依赖于所选择的施用途径。

对于注射，本发明的实施方案的肽/类肽可以在水溶液中配制，例如，在生理相容的缓冲液诸如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中配制。对于穿粘膜施用，在制剂中使用适于待渗透屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域中是普遍已知的。

对于口服施用，水凝胶和/或肽/类肽可以容易地通过将它们与本领域中熟知的药学可接受的载体组合来配制。这种载体能够使水凝胶和/或肽/类肽、以及药学活性化合物被配制成片剂、药丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、药浆(slurries)、悬液等，用于被要治疗的患者经口摄入。用于口服使用的药物制剂可以通过如下步骤获得：添加固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并且加工颗粒的混合物，如果需要辅料的话，在加入合适的辅料后加工颗粒的混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。合适的赋形剂是，尤其是，填料诸如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂诸如，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐诸如海藻酸钠。

对糖衣丸核心提供以合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普(carbopol)凝胶、聚乙二醇、和/或二氧化钛、漆液(lacquersolution)、和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可以添加至片剂或糖衣丸包衣用于标识或用于表征活性化合物剂量的不同组合。

可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的硬胶囊(push-fitcapsule)、以及由明胶和增塑剂诸如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊。硬胶囊可以含有与填料诸如乳糖、粘合剂诸如淀粉、和/或润滑剂诸如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，肽/类肽可以悬浮在合适的液体中，诸如在脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可以加入稳定剂。所有用于口服施用的制剂应当处于适合于这种施用的剂量。对于颊部施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

水凝胶和/或肽/类肽可以配制用于通过注射(例如通过肌内注射或推注或连续输注)进行胃肠外施用。用于注射的制剂可以与所添加的防腐剂一起以单位剂型呈现，例如，在安瓿中或在多剂量容器中。相应的组合物可以采取诸如在油性或水性载体中的悬液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

水凝胶和/或肽/类肽可以配制用于其它药物递送系统如植入物、或透皮贴片或支架。

实施例

已经进行了实验来说明本发明的示例性实施方案的技术方面。下列实施例在实验方法和结果部分中描述。技术人员将容易地认识到实施例意在是说明性的并且不意在限制本发明的范围。

实验方法和结果

肽

肽序列被设计成代表含有亲水首基和疏水尾部的两亲肽结构。肽设计的基本原理是形成类似锥形结构的大小减小的肽单体。通过使用不同的脂肪族氨基酸使疏水尾部不同。疏水尾部由诸如下列的脂肪族氨基酸组成：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，且亲水首基由一个或两个极性或带电荷的氨基酸组成。通过使用不同的脂肪族氨基酸使疏水尾部的序列次序不同。肽由中国上海的GLBiochem商业合成。为了验证肽水凝胶形成行为的再现性，还由其他公司(BiomatikCorp.,Anaspec.Inc,USA)合成肽。肽具有等于或大于95％的纯度，纯度由高效液相色谱(HPLC)和质谱法验证。肽储溶液以5-10mg/ml溶解在水中。大多数肽在N-末端被乙酰化。

基于肽的水凝胶制备

新制备所有肽(GLBiochem,上海，中国，≥98％纯度)以避免不成熟的肽聚集。将肽溶解在水中并在室温静置以形成水凝胶。取决于肽浓度，立即、在几小时内或甚至在几天内发生自组装过程(凝胶化的实验时间范围)。对于较高的肽浓度，通过涡旋将肽溶解在milliQ水中。如果需要强制和加速水凝胶制备，则使肽溶液在水浴中接受超声处理(BarnsteadLabline9319UltrasonicLC60H)。在经由自组装产生的水凝胶和其组装通过超声处理促进的那些水凝胶之间没有观察到显著的结构差异。在升高的温度即在50℃几乎没有肽更容易形成水凝胶。

为了研究浓度变化的作用，利用如上所指定的不同浓度制备AcLD₆(L)和AcID₃(L)水凝胶两者。为了研究单价和二价阳离子的作用，通过将肽溶解在10、50、100和150mMNaCl和CaCl₂溶液中来制备AcLD₆(L)水凝胶。进一步进行FESEM和流变学研究以表征这些水凝胶的形态学和强度。

明胶和胶原凝胶的制备：明胶(A型,G1890；SigmaAldrich)水凝胶如下制备：首先通过加热将明胶溶解在milliQ水中接着冷却直至观察到凝胶化。胶原蛋白(I型，来自牛，AdvancedBiomatrix,USA)用PBS缓冲液稀释至1.5mg/ml的浓度并且使用0.1MNaOH滴定至pH7.4。通过将溶液在37℃孵育1小时来实现凝胶化。

圆二色(CD)光谱法

通过使用410型Aviv圆二色光谱仪(AvivCircularDichroismSpectrometer,model410)测量椭圆率谱分析肽二级结构。通过将肽储溶液(5-10mg/ml)在水中稀释制备CD样品。将稀释的肽溶液填充至1mm光程长度的比色杯中并采集光谱。使用水作为空白参照，并且在计算摩尔椭圆率之前从原始数据中减去参照。计算基于公式：[θ]_λ＝θ_obsx1/(10Lcn),其中[θ]_λ是以degcm²d/mol为单位的在λ处的摩尔椭圆率，是以mdeg为单位的在λ处的观察到的椭圆率，L是以cm为单位的光程长度，c是以M为单位的肽的浓度，n是肽中氨基酸的数目。使用CDNN软件完成二级结构分析。

环境扫描电子显微镜(ESEM)

将样品放置在FEIQuanta200环境扫描电子显微镜的样品架上。然后在4℃的温度使用10kV的加速电压检查感兴趣的表面。

场发射扫描电子显微镜(FESEM)

将样品在-20℃冷冻，随后冷冻至-80℃。将冷冻的样品进一步冻干。使用导电胶带将冻干的样品固定在样品架上并在JEOLJFC-1600高分辨率喷镀仪中从顶部和侧面用铂喷镀。使用的电镀电流为30mA，该过程持续60秒。然后利用JEOLJSM-7400F场发射扫描电子显微镜系统使用5-10kV的加速电压检查感兴趣的表面。

流变学测量

为了确定基于肽的水凝胶的粘弹性性质，使用ARES-G2流变计(TAInstruments,Piscataway,NJ)使水凝胶接受动态时间、应变和扫频实验，采用25.0mm直径的钛平行板几何形状和0.8mm间隙距离。进行振荡频率研究以比较具有不同浓度的肽的基于肽的水凝胶的强度，或比较在单价或二价离子存在下的肽的强度。以0.1-100rad/s频率和0.1％应变在25℃和50℃进行振荡扫频研究。

Ac-LD₆[L]:

肽序列:Ac-LIVAGD-COOH

分子量:629.56

(1)对Ac-LD₆(L)的温度扫描研究：

(a)然后将肽混合物放置在流变仪下夹板上。优化下面的参数：

两块板之间的间隙:1mm

应变:10％

频率:6.28rad/sec

温度扫描:4℃-60℃

样品体积:500μl

(2)对Ac-LD₆(L)的扫频研究:

进行扫频研究所需的优化参数

两块板之间的间隙:0.8mm

应变:0.1％

温度:25和50℃

样品体积:1ml

频率扫描:0.1rad/sec-100rad/sec

Ac-LD-6(L)在水凝胶中的浓度:10mg/ml

(3)Ac-LD₆(L)的浓度变化对凝胶强度的作用：

进行用于测量凝胶强度的扫频研究所需的优化参数如下：

两块板之间的间隙:0.8mm

应变:0.1％

温度:25和50℃

样品体积:1ml

频率扫描:0.1rad/sec-100rad/sec

Ac-LD₆(L)在水凝胶中的浓度：在水中5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml和20mg/ml和30mg/ml。

(4)氯化钠(NaCl)对Ac-LD₆(L)的凝胶强度的作用

通过对通过如下方式制备的水凝胶进行扫频研究来研究氯化钠对基于Ac-LD₆(L)的水凝胶的作用：通过使用形成水凝胶的优化程序将10mgAc-LD-6(L)分散在不同浓度的NaCl溶液(例如10mM、50mM、100mM和150mM的NaCl溶液)中。在NaCl的存在下为测量凝胶强度进行扫频研究所需的优化参数如下：

两块板之间的间隙:0.5mm和0.8mm

应变:分别为10％和0.1％

温度:25℃和50℃

样品体积:1ml

频率扫描:0.1rad/sec至100rad/sec

用来制备10mg/mlAc-LD-6(L)水凝胶的NaCl溶液的浓度：10mM、50mM、100mM、150mMNaCl溶液

细胞生长实验

为了查明肽水凝胶是否可以充当用于组织工程的支架，研究了其生物相容性。将不同的原代人细胞接种在6孔、24孔或96孔培养板中的组织培养基(无血清DMEM)中的凝胶化后的水凝胶的上部，参见下面的培养条件。在后面的2-4天期间，不需要更换培养基，但最后将新鲜培养基加入到孔中。分析细胞的活力。

原代人肾脏近曲小管细胞(HPTC)和原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)获自ScienCellResearchLaboratories(Carlsbad,CA,USA)。将HPTC培养在补充了2％胎牛血清(FBS)和1％上皮细胞生长补充剂的基础上皮细胞培养基(所有组分均获自ScienCellResearchLaboratories)中。用于HUVEC的培养基是含有5％FBS和1％内皮细胞生长补充剂(ScienCellResearchLaboratories)的内皮细胞培养基。使用的所有细胞培养基均补充了1％青霉素/链霉素溶液(ScienCellResearchLaboratories),并且所有细胞均培养在37℃、5％CO₂气氛中。细胞的接种密度为约5x10⁴细胞/cm²。然而，由于HUVEC比HPTC大，因此细胞数目将稍少于HPTC细胞(约4.5x10⁴细胞/cm²)。在接种后两种细胞类型在孔中的汇合率均为约80％。

交联的水凝胶

材料和方法

肽

所有肽在AmericanPeptideCompany(CA,USA)使用SPPS合成，并纯化至>95％(HPLC)。进行氨基酸含量(AA％)分析并使用净重(总重量×AA％)用于计算。

二硫化物形成的动力学

对于空气氧化，通过强力涡旋5分钟将LK₆C溶解在MilliQ水中并分配成20μL等分试样。在合适的时间点，将180μLDTNB(Sigma,Singapore)工作溶液(4mg/mL，在0.1M磷酸盐缓冲液pH7.0中)与肽溶液混合15分钟。然后测量412nm处的吸光度(InfiniteM200,Tecan,Switzerland)。使用利用L-半胱氨酸(Sigma)作为标准品生成的校准曲线(R²＝0.999),将减去背景的值相对于在0小时的读数归一化从而得到剩余硫醇的％。对于H₂O₂-辅助的氧化，将LK₆C溶解在含有0.06％H₂O₂(Merck,Sinagpore)的水(HPLC级，J.T.Baker,NJ,USA)中并分配成等分试样。在合适的时间点，使用安装有单四极MS的UPLC(Waters,USA)分析等分试样。使用利用纯LK₆C作为标准品生成的校准曲线(R²＝0.999)，将对应于LK₆C单体的峰下面积相对于在0小时的峰下面积归一化从而得到剩余硫醇的％。

凝胶浇注

将肽溶解在200μL水+/-H₂O₂中并填充至定制的中空环形铸模(直径约1cm)中。用封口膜密封环形端部以使蒸发最小化并将铸模在25℃保持22小时，然后进行进一步操作。

流变学:利用ARES-G2(TAInstruments,USA)使用振荡法测量浇注的凝胶的流变学特性。在应变γ＝0.1％时以ω＝0-100rad/s进行频率-扫描研究。通过将G’针对ω作图表示凝胶刚度。在此之前，在1Hz以γ＝0-100％进行幅度-扫描研究。凝胶的LVE限值被定义为当G’首次下降至低于平均初始值的90％时γ的值。

流变学

利用ARES-G2(TAInstruments,USA)使用振荡法测量浇注的凝胶的流变学特性。在应变γ＝0.1％时以ω＝0-100rad/s进行频率-扫描研究。通过将G’针对ω作图表示凝胶刚度。在此之前，在1Hz以γ＝0-100％进行幅度-扫描研究。凝胶的LVE限值定义为当G’首次下降至低于平均初始值的90％时γ的值。

FESEM

将冻干的凝胶沉积在碳带上，用铂溅射并在JSM-7400F电子显微镜(Jeol,Tokyo,Japan)下观察。

3D细胞培养

将LK₆C+/-CRGD凝胶直接浇注在8室孔(Nunc,NY,USA)中并如SI中所报道的那样进行纯化。将在常规的完全DMEM(Invitrogen,Singapore)中的0.5mL细胞悬液接种在凝胶上或直接接种在孔(2D对照)并孵育4天。然后将0.5μL钙黄绿素-AM(Invitrogen)添加至培养基中以识别活细胞，并使用共聚焦显微镜(LSM5DUO,CarlZeiss,Germany)俘获图像。在此之前，验证钙黄绿素-AM仅染色活细胞因为乙醇-处理和H₂O₂-处理的细胞排出染料。除了2D对照以外，所有图像作为几个序列图的合并图像呈现。为了进一步验证细胞的3D分布，将凝胶垂直地包埋在Jung组织冰冻包埋介质(JungTissueFreezingMedium)(LeicaInstrumentsGmbH,Germany)中并使用低温恒温器(CM3050S,Leica)获得20μm横截面切片。用盖玻片封固切片并如上成像。

对细胞-铺展面积的定量

使用ImageJ(NIH,USA)处理钙黄绿素染色后的共聚焦图像以获得各种培养条件下的平均细胞-铺展面积。对于3D凝胶培养中的细胞，用于定量的图像是几个序列图的合并图像从而获得最大细胞-铺展面积。在所有情况下，至少三个独立的利用选自每个培养物的至少两个位置进行的实验用于进行平均。

MTT活力测定

3D凝胶培养4天后，通过胰蛋白酶消化和离心将细胞与基底分离，并将细胞再接种至48孔板(Nunc)贴壁过夜。然后将溶解在PBS中的MTT(Sigma)加入至培养基中持续4小时，然后使用DMSO(Sigma)溶解甲臜(formazan)晶体。在560nm读出吸光度，减去680nm参照并相对于合适的对照归一化以得到对相对细胞活力的指示。

统计学分析

对样品均数进行ANOVA检验(OriginLabCorporation,MA,USA)，p<0.05被注为*并被认为是统计学显著的。

结果

LK ₆ C肽可以被浇注成3维形状

LK₆C肽可以使用合适的模具容易地浇注成3维凝胶(参见图18)。在此实验中，使用环形的模具，并使用水或完全生长培养基浇注LK₆C凝胶。葡聚糖颗粒在此用作模型载荷，也可以被包封在凝胶基质内。

H ₂ O ₂ -辅助形成二硫化物交联

在空气氧化下二硫化物形成的动力学效率低(图19)。加入H₂O₂加速了二硫化物形成(图20)。LC-MS确认在H₂O₂的存在下二硫化物交联的二聚体的形成(图21)。数据进一步提示HRP的加入对二硫化物形成的动力学的作用不显著(图19)。二硫化物形成的速率也可以通过增加H₂O₂的使用量来加速(图22)。

氧化策略

对于H₂O₂-辅助的交联设计了两种不同的方法：1)浇注和浸泡法，其中凝胶首先被浇注过夜，然后浸泡在氧化溶液中。2)原位氧化法，其中用来溶解肽粉末的水溶液已经含有氧化剂(图23)。

氧化增加LK ₆ C在水中的长期稳定性

LK₆或LK₆C凝胶首先被浇注，然后在水中浸泡不同持续时间。水浸泡24小时后，不可交联的LK₆凝胶完全降解而未氧化的LK₆C凝胶则严重降解(图24)。显著相反的是，使用浇注和浸泡法氧化2小时的LK₆C凝胶和原位氧化的LK₆C凝胶在水浸泡96小时后仍然保持完整。这些观察结果也得到流变学测量的支持(图28)。因此，二硫化物交联的策略增加了凝胶的抗降解性并且使得能够以与以前的制剂相比较低的浓度使用所述凝胶。这将转换成显著的成本节约。

使用浇注和浸泡法氧化的凝胶是均匀氧化的

将LK₆C凝胶浇注过夜，然后在H₂O₂溶液中浸泡2小时(参见图25中的示意图)。然后将表面(圆周层+顶层+底层)与核心分离，显示两个层的H₂O₂的量和二硫化物/硫醇比率是相当的(图25和26)。这表明氧化不限于凝胶的表面并且在此实验设置中H₂O₂的扩散是快速的。然而，如果凝胶被浇注至48孔板中且H₂O₂溶液仅施加到凝胶的顶部上(按照后面的实验，参见图31中的示意图)，则H₂O₂的扩散率将降低，因为在此配置中仅顶面可接触该溶液。

氧化对凝胶的G’和弹性的作用

下一步定量各种LK₆C凝胶的流变学特性。在使凝胶接受2-24小时的利用0.06％H₂O₂的浇注和浸泡氧化或利用0.03-0.1％H₂O₂原位氧化24小时后，将作为刚度量度的弹性模量G’针对角频率ω作图(图27A)。与未氧化的凝胶相比，采用不同的氧化方案的刚度均得到维持或增加。有趣的是，浇注和浸泡24小时后达到的刚度与利用0.06％H₂O₂原位氧化后的刚度不同。这可能是由于H₂O₂的可及性和氧化顺序不同导致的。更具体地，在浇注和浸泡中，凝胶接触到H₂O₂槽并且仅在肽纤维的自组装后发生交联；而在原位氧化过程中，H₂O₂局限于凝胶体积并且在自组装的同时发生交联。然而，凝胶的线性粘弹性(LVE)限值(弹性)在氧化后增加了2.4-3.8倍(图27B)。这推测归因于引入了另外的化学键。调节LK₆C凝胶的刚度和弹性的其他策略包括改变其浓度(图29A/B)或用LK₆掺杂LK₆C(图29C/D)。这也允许对凝胶中可用的硫醇基的量进行调节。

凝胶的纤维状显微结构

场发射扫描电子显微镜(FESEM)揭示了LK₆C凝胶的纤维状显微结构在各种氧化方案后得到保持(图30)。

容易去除H ₂ O ₂ 和残留酸

使用与细胞培养实验接近的配置，将凝胶在48孔板中浇注过夜，并在凝胶上施加水从而在引入细胞前对其进行净化。仅通过定期更换水就可以去除大部分H₂O₂和残留酸(图31)。可以使用生长培养基代替水以确保凝胶基本上不含H₂O₂并调整至适合于细胞培养的pH。

逐渐的和可调的释放动力学

作为模型系统，将葡聚糖颗粒包封在凝胶内，并监控它们的释放谱。在两种情况下均没有观察到突释，并且在氧化的样品中抑制了释放率，推测由于在水中的稳定性增加所致(图32)。

水凝胶的官能化

凝胶下一步用生物活性信号官能化。在H₂O₂的存在下将CRGD(0-1mg/mL)简单地与LK₆C(固定在10mg/mL,即，CRGD配体密度0-9.1总重量％)混合并环形浇注过夜。UPLC-MS确认LK₆C-CRGD缀合物的形成以及游离CRGD的消失(图33)。需注意温和的和简单的反应条件。本领域技术人员也将认识到此肽平台的通用性以及下面的事实：未来的缀合不需要局限于RGD。凝胶下一步通过透析-吸入法来纯化，由此水在上部分层并且定期更换。通过这样，在4小时后>96％的未反应的H₂O₂被去除，7小时后>99％被去除(图31A)。类似地，8小时后>85％的来自SPPS的残留酸被去除(图31B)。

用于细胞培养的生物相容性和用途

为了测试生物相容性，将HepG2细胞直接接种至孔中(2D对照)或接种在纯化的与不同浓度的RGD缀合的LK₆C凝胶上。4天后，钙黄绿素染色揭示在所有试验中细胞是有活力的(图34A/B)。利用原代兔成纤维细胞(图35)、3T3鼠成纤维细胞(图38)和NIH-3T3鼠成纤维细胞(数据未显示)重复此实验，证实了凝胶的生物相容性。在定期更换培养基的情况下，细胞保持有活力至少3周(图38)。从凝胶培养获得的图像作为几个序列图的合并图像呈现。尽管这已经可以提示3D分布，但发明人想要验证它们不是由于例如凝胶表面上的弯月面或凝胶在非水平位置浇注所导致的假象。因此凝胶被垂直包埋并且获得横截面切片用于深度剖析。从图34B,观察到钙黄绿素-染色的细胞浸润凝胶，导致多层生长和验证了它们的3D空间分布。

如在图34A中从视觉上提示的，与没有RGD的凝胶相比，HepG2细胞看上去在含RGD的凝胶内较快速地增殖。这得到来自MTT测定的数据的支持(图34C)。作为锚定依赖性细胞系，与RGD-缀合的凝胶的较好粘附推测为细胞提供了更理想的生长环境。随后拍摄较高放大倍数的图像(图36)，并定量HepG2细胞的平均细胞-铺展面积。有趣的是，与常规2D培养相比，3D凝胶培养对HepG2细胞的平均细胞-铺展面积没有显著的作用(p>0.05)(图34D)。存在的RGD配体的量也不显著影响HepG2细胞的细胞铺展面积(p>0.05)。但是，在原代兔成纤维细胞(图35B)和NIH-3T3鼠成纤维细胞(数据未显示)的情况下，趋势是不同的，两者在2D培养中均较多地铺展。已知细胞响应于它们的微环境的机械特性诸如刚度和弹性，并且这些观察结果与之前的报道(水凝胶包封的鼠成纤维细胞保持了较圆的形态学)一致。然而，尽管从2D至3D培养的转变导致成纤维细胞不同地铺展，但存在的RGD配体的量的作用不显著(p>0.05)。与CRGD连接之前相比，在缀合后凝胶具有一样的刚度(图37A)但弹性变小(图37B)。

无变态反应性和无毒性

由CROToxikon进行的实验进一步显示LK₆C是无变态反应性的和无毒性的。更具体地，在由Toxikon依照ISO10993-10指南进行的GLP研究过程中在直接接触Kligman最大化试验中LK₆C对豚鼠的皮肤没有致敏作用。此外，在由Toxikon进行的另一个GLP研究中在直接接触V79集落测定中LK₆C没有表现出显著的毒性。

在伤口处理中的用途

进行第一轮利用小鼠的伤口愈合试验。在此模型中，去除小鼠的表皮和真皮以模拟损伤(图39)。分析下列的分组：

a)无处理的对照(即，简单用绷带包扎伤口)

b)施用LK₆C-CRGD凝胶

c)施用含有3D培养的3T3鼠成纤维细胞的LK₆C-CRGD凝胶

在此，成纤维细胞(真皮中的主要群体)充当治疗剂/生物活性剂。假设3T3细胞分泌促进构成表皮的角质形成细胞生长的因子。与仅用凝胶处理(b组)相比，这应当进一步帮助愈合。

2周后，在c组中伤口的血管化程度(康复的首要特征)实际上是最显著的，接着是b组，然后是a组(图40)。随后的组织学也显示在c组小鼠中有显著的真皮层再生。相比较，b组小鼠再生的真皮较少，a组小鼠的真皮再生程度最小。

总结

分析了半胱氨酸-介导的二硫化物交联的超小型肽水凝胶。交联由H₂O₂驱动并且仅产生水作为副产物。而且，H₂O₂帮助保持凝胶的无菌性并且实际上可以在引入细胞前被去除。氧化增加了凝胶的弹性以及在水中浸泡后保持其形状的能力。由于半胱氨酸残基，生物活性信号可以使用简易化学缀合至肽纤维，并且凝胶可以容易地纯化。形成的凝胶显示支持细胞的真实3D分布并影响它们的生长和铺展特性。此外，证明了它们在伤口处理中的实用性。

筛选含半胱氨酸的肽的小文库

我们调查了含半胱氨酸的肽的家族的凝胶形成能力和机械性能(图41)。具体地，Ac-IVKC因其突出的交联后刚度而吸引了我们的注意力并且在下面的段落已经提供了关于此候选物的更多数据。

利用H ₂ O ₂ 浓度调整Ac-IVKC的交联密度和刚度

通过改变H₂O₂的浓度(0-0.2％)调节Ac-IVKC的交联密度。然后在室温在各种H₂O₂浓度中孵育24小时后利用超高效液相色谱(UPLC)定量单体(保留时间约2.40分钟)和二聚体(约2.67分钟)的量。如可以见到的，随着H₂O₂的浓度增加，交联度从0％增加至100％。

使用振荡流变仪检查Ac-IVKC的交联密度对凝胶刚度(G’)的相应作用。将刚度(G’)相对角频率(ω)作图(图43)。如可以见到的，当交联度增加时，凝胶的刚度增加。达到了将近1MPa的G’值，其是迄今为止本发明的肽水凝胶类型中最高的一个。

当H₂O₂的浓度改变(0-0.2％)时拍摄Ac-IVKC凝胶的图片(图44)。如可以见到的，所有凝胶是透明的并且当随着H₂O₂的浓度增加交联度从0％增加至100％时变得引人注目的较为坚硬。

Ac-IVKC的薄层浇注

我们尝试在两块玻璃板之间浇注Ac-IVKC的薄层，并密封侧面以保持水分(图45A-B)。利用被厚度为750μm的垫片隔开的夹子将两块玻璃板保持在一起。然后在玻璃板之间注入凝胶溶液并使其胶化过夜。为了回收凝胶，将玻璃板分开。很容易从玻璃板回收凝胶，其是透明的(图45C-D)并且容易处理(图45E)。

在本说明书中对以前发表的文件的列举或讨论不应当被认为是必然承认所述文件是现有技术的一部分或是公知常识。所有列举的文件整体地通过引用并入本文用于所有目的。

本文说明性地描述的本发明的示例性实施方案可以在缺少没有在本文中具体公开的任一要素或多个要素、任一限制或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应当被广义地解读而没有任何限制。另外地，本文所采用的术语和表述已经用作描述的术语且没有限制，并且不意在使用排除所显示和所描述的特征或其部分的任何等效形式的此类术语和表述，而是要认识到在要求保护的本发明的范围内各种修改均是可能的。因此，应当理解尽管通过示例性实施方案和任选的特征具体地公开了本发明，但对本文中公开的示例的本发明的修改和变化可以依靠本领域技术人员进行，并且这样的修改和变化被认为在本发明的范围内。

在本文中已经广泛地和总体地描述本发明。在总的公开内容范围内的每一个较窄种类和亚上位分组也形成本发明的一部分。这包括对本发明的上位描述，具有从总的类属中去除任何主题的附带条件或负面限制，无论删去的材料是否具体地记载在本文中。

其他实施方案在下列权利要求的范围内。另外，在本发明的特征或方面按照马库什组描述的情况下，本领域技术人员将认识到本发明由此也按照马库什组的任何单个成员或成员的亚组进行描述。

Claims (75)

1.一种水凝胶，其包含能够自组装成三维大分子纳米纤维状网络的多个两亲肽和/或类肽，所述纳米纤维状网络包埋水并形成所述水凝胶,所述两亲肽和/或类肽具有下面的通式：

Z_p-(X)_n-(Y)_m-AA_硫醇-Z’_q,

其中

Z是N-末端保护基,

X在每次出现时独立地选自脂肪族氨基酸，

Y在每次出现时独立地选自亲水氨基酸，

AA_硫醇是包含硫醇基的氨基酸，

Z’是C-末端保护基，

n是选自2-6、优选2-5的整数,

m选自0、1和2,优选0和1,

并且p和q独立地选自0和1,其中,优选地，p是1，

其中至少一部分所述多个两亲肽和/或类肽是化学交联的。

2.权利要求1所述的水凝胶，其中所述包含硫醇基的氨基酸选自半胱氨酸和同型半胱氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的水凝胶，其中所述至少一部分所述多个两亲肽和/或类肽通过下述方式进行化学交联：经由巯基与巯基交联，经由巯基与羟基交联，经由巯基与醛交联，经由巯基与胺交联，经由肽聚糖或经由光诱导的交联，优选经由巯基与巯基交联。

4.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述N-末端保护基具有通式–C(O)–R,其中R选自由下列各项组成的组：H、未取代的或取代的烷基、和未取代的或取代的芳基。

5.权利要求4所述的水凝胶，其中所述N-末端保护基是乙酰基。

6.权利要求1-3中任一项所述的水凝胶，其中所述N-末端保护基是拟肽分子,包括天然的和合成的氨基酸衍生物,其中所述拟肽分子的N-末端可以用选自由下列各项组成的组的官能团修饰：羧酸、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、腈、脲类似物、硫醇、磷酸酯、碳酸酯、硫酸酯、硝酸酯、马来酰亚胺、乙烯砜、叠氮化物、炔烃、烯烃、碳水化合物、二酰亚胺、过氧化物、酯、硫酯、芳基、酮、亚硫酸酯、亚硝酸酯、膦酸酯和硅烷。

7.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述C-末端保护基是酰胺基。

8.权利要求7所述的水凝胶，其中所述两亲肽和/或类肽的C-末端具有式-CONHR或-CONRR’,R和R’选自由下列各项组成的组：H、未取代的或取代的烷基、和未取代的或取代的芳基。

9.权利要求1-6中任一项所述的水凝胶，其中所述C-末端保护基是酯基。

10.权利要求9所述的水凝胶，其中所述两亲肽和/或类肽的C-末端具有式–CO₂R,R选自由下列各项组成的组：H、未取代的或取代的烷基、和未取代的或取代的芳基。

11.权利要求1-6中任一项所述的水凝胶，其中所述C-末端保护基是拟肽分子,包括天然的和合成的氨基酸衍生物,其中所述拟肽分子的C-末端可以用选自由下列各项组成的组的官能团修饰：羧酸、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、腈、脲类似物、硫醇、磷酸酯、碳酸酯、硫酸酯、硝酸酯、马来酰亚胺、乙烯砜、叠氮化物、炔烃、烯烃、碳水化合物、二酰亚胺、过氧化物、酯、硫酯、芳基、酮、亚硫酸酯、亚硝酸酯、膦酸酯和硅烷。

12.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中,对于给定的两亲肽和/或类肽，所述脂肪族氨基酸、所述亲水氨基酸和所述包含硫醇基的氨基酸是D-氨基酸或L-氨基酸。

13.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述亲水氨基酸具有极性基团，所述极性基团独立地选自羟基、醚基、羧基、亚胺基、酰胺基、酯基、氨基、胍基、硫代、硫醚基、硒基和碲基。

14.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述亲水氨基酸选自由下列各项组成的组：天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(茶氨酸)、瓜氨酸、硫代瓜氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、蛋氨酸、乙硫氨酸、硒代蛋氨酸、碲代蛋氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、丝氨酸、同型丝氨酸、精氨酸、同型精氨酸、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨基丙酸(Dap)、赖氨酸和N(6)-羧基-甲基赖氨酸以及组氨酸。

15.权利要求14所述的水凝胶，其中所述亲水氨基酸选自由下列各项组成的组：天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨基丙酸(Dap)和组氨酸。

16.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述脂肪族氨基酸选自由下列各项组成的组：异亮氨酸、正亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、同型烯丙基甘氨酸和同型炔丙基甘氨酸。

17.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述两亲肽和/或类肽的所有或部分的脂肪族氨基酸以在从所述两亲肽和/或类肽的N-末端至C-末端的方向上氨基酸大小递减的次序排列，其中所述脂肪族氨基酸的大小被定义为I＝L>V>A>G。

18.权利要求17所述的水凝胶，其中以氨基酸大小递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有为重复序列或非重复序列的序列。

19.权利要求17或18所述的水凝胶，其中以氨基酸大小递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有选自LIVAG、ILVAG、LIVAA、LAVAG、IVAG、LIVA、LIVG、IVA和IV的序列，其中,任选地，在N-末端处在这样的序列之前存在A。

20.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述两亲肽和/或类肽在自组装期间经历构象变化，优选从无规卷曲构象至螺旋中间结构至最终的β构象的构象变化。

21.权利要求20所述的水凝胶，其中所述构象变化依赖于所述两亲肽和/或类肽的浓度，依赖于离子环境，是pH依赖的和/或温度依赖的。

22.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述两亲肽和/或类肽是相同的或不同的。

23.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中(X)_n-(Y)_m-AA_硫醇选自由下列各项组成的组：LIVAGKC(SEQIDNO:43)、LIVAGSC(SEQIDNO:44)、LIVAGDC(SEQIDNO:45)、ILVAGKC(SEQIDNO:46)、ILVAGDC(SEQIDNO:47)、LIVAGC(SEQIDNO:48)、AIVAGC(SEQIDNO:49)、ILVAGC(SEQIDNO:50)、IVKC(SEQIDNO:51)、IVDC(SEQIDNO:52)和IVSC(SEQIDNO:53)。

24.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶在环境温度中在水溶液中稳定持续至少7天、优选至少2-4周、更优选至少1-6个月的时期。

25.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中至少5％、优选至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、更优选至少25％、更优选至少30％、更优选至少35％、更优选至少40％、更优选至少45％、甚至更优选至少50％的所述多个两亲肽和/或类肽是化学交联的。

26.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶的特征在于大于2的储能模量G’比损耗模量G”。

27.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶的特征在于在0.02Hz-16Hz的范围的频率下储能模量G’为100Pa-1,000,000Pa，优选500Pa-1,000,000Pa，更优选1000Pa-1,000,000Pa。

28.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶具有被定义为在线性粘弹性(LVE)限值的以下％应变的弹性：高于0.01％应变,优选高于0.5％应变,更优选高于1％应变,更优选高于2％应变。

29.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，进一步包含非肽聚合物。

30.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶进一步包含微生物、细胞、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米粒子或微米粒子、合成聚合物、小有机分子、化妆剂或药学活性化合物中的至少一种。

31.权利要求30所述的水凝胶，其中所述微生物、细胞、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米粒子或微米粒子、合成聚合物、小有机分子、化妆剂或药学活性化合物中的至少一种被所述三维大分子纳米纤维状网络包埋。

32.权利要求30或31所述的水凝胶，其中所述微生物、细胞、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米粒子或微米粒子、合成聚合物、小有机分子、化妆剂或药学活性化合物中的至少一种与所述两亲肽和/或类肽偶联,优选经由二硫键。

33.权利要求30或31所述的水凝胶，其中所述微生物、细胞、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米粒子或微米粒子、合成聚合物、小有机分子、化妆剂或药学活性化合物中的至少一种与所述非肽聚合物偶联。

34.权利要求30-33中任一项所述的水凝胶，其中所述药学活性化合物选自由下列各项组成的组：止血剂、抗生素、抗微生物剂、抗真菌剂、抗炎剂、镇痛药、抗凝剂、抗体、抗原、生长因子和细胞因子。

35.权利要求30-33中任一项所述的水凝胶，其中所述纳米粒子或微米粒子是金属纳米粒子或金属微米粒子,优选金纳米粒子或金微米粒子。

36.权利要求30-33中任一项所述的水凝胶，其中所述肽包含信号序列,其中,优选地，所述肽经由二硫键与所述两亲肽和/或类肽偶联。

37.权利要求36所述的水凝胶，其中所述信号序列包括粘附或生长信号，诸如整合素结合序列。

38.前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶以可注射形式提供并在原位胶化。

39.一种制备水凝胶、优选权利要求1-38中任一项所述的水凝胶的方法，所述方法包括以下步骤：将如权利要求1-23中任一项所定义的两亲肽和/或类肽溶解在水溶液中，

其中所述水溶液包含氧化剂，或

其中所述方法进一步包括以下步骤：将预制的水凝胶暴露于氧化剂的溶液。

40.权利要求39所述的方法，其中所述氧化剂是H₂O₂,其中,优选地，H₂O₂以0.02-0.3％(w/w)、优选“0.05-0.25％(w/w)、更优选“0.05-0.2％(w/w)的浓度使用。

41.权利要求39或40所述的方法，其中所述两亲肽和/或类肽以0.01μg/ml-50mg/ml的浓度、优选以1mg/ml-25mg/ml的浓度、更优选以1mg/ml-15mg/ml的浓度、甚至更优选以5mg/ml-12mg/ml的浓度溶解。

42.权利要求39-41中任一项所述的方法，其中将水溶液中溶解的两亲肽和/或类肽进一步暴露于20℃-90℃、优选20℃-70℃、更优选20℃-40℃的范围的温度。

43.权利要求42所述的方法，其中将水溶液中溶解的两亲肽和/或类肽暴露于所述温度至少1小时,优选至少2小时,更优选至少4小时,更优选至少6小时,更优选至少8小时,更优选至少10小时,更优选至少12小时,甚至更优选至少24小时。

44.权利要求39-43中任一项所述的方法，进一步包括将预制的水凝胶暴露于不包含所述氧化剂的水溶液的步骤，其中,如果所述方法包括将预制的水凝胶暴露于所述氧化剂的溶液的步骤，则在将预制的水凝胶暴露于所述氧化剂的溶液的所述步骤之后执行将预制的水凝胶暴露于不包含所述氧化剂的水溶液的所述步骤。

45.权利要求44所述的方法，其中将预制的水凝胶暴露于不包含所述氧化剂的水溶液的所述步骤重复至少一次。

46.权利要求44或45所述的方法，其中将预制的水凝胶暴露于不包含所述氧化剂的水溶液的所述步骤发生至少1小时,优选至少2小时,更优选至少4小时,甚至更优选至少6小时。

47.权利要求44-46中任一项所述的方法，其中将预制的水凝胶暴露于不包含所述氧化剂的水溶液的所述步骤在30℃-45℃、优选35℃-40℃的范围的温度发生。

48.权利要求39-47中任一项所述的方法，进一步包括下列步骤中的至少一个：

-添加微生物、细胞、病毒粒子、肽、类肽、蛋白、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米粒子或微米粒子、合成聚合物、小有机分子、化妆剂或药学活性化合物中的至少一种；

-添加至少一种非肽聚合物；

-添加至少一种凝胶化增强剂；

-添加至少一种缓冲剂，优选至少一种生理上可接受的缓冲剂。

49.权利要求48所述的方法，其中所述凝胶化增强剂是盐或盐的溶液。

50.通过权利要求39-49中任一项所述的方法制备的水凝胶。

51.权利要求1-38和50中任一项所述的水凝胶作为细胞培养基底、优选用于3D细胞培养的细胞培养基底的用途。

52.权利要求1-38和50中任一项所述的水凝胶作为用于药物递送或基因递送的装置、优选用于缓释或控释药物递送的装置的用途，或作为伤口敷料或作为植入物或作为原位胶化的可注射剂的用途。

53.一种细胞培养基底,优选用于3D细胞培养的细胞培养基底，其包含权利要求1-38和50中任一项所述的水凝胶。

54.一种用于药物递送或基因递送的装置，优选用于缓释或控释药物递送的装置，其包含权利要求1-38和50中任一项所述的水凝胶。

55.一种植入物或可注射剂或伤口敷料，其包含权利要求1-38和50中任一项所述的水凝胶。

56.一种药物组合物或化妆品组合物，其包含权利要求1-38和50中任一项所述的水凝胶。

57.权利要求56所述的药物组合物或化妆品组合物，其中所述药物组合物或化妆品组合物以局部凝胶或膏剂、喷雾剂、粉末、或片、贴片或膜的形式提供。

58.权利要求56所述的药物组合物或化妆品组合物，其中所述药物组合物或化妆品组合物以可注射溶液的形式提供。

59.权利要求56-58中任一项所述的药物组合物或化妆品组合物，进一步包含药学活性化合物。

60.权利要求56-59中任一项所述的药物组合物或化妆品组合物，进一步包含药学上可接受的载体。

61.权利要求1-38和50中任一项所述的水凝胶，其用于再生医学中或用于组织工程和组织再生例如脂肪组织和软骨组织的再生中。

62.权利要求1-38和50中任一项所述的水凝胶，其用于伤口的处理中。

63.权利要求1-38和50中任一项所述的水凝胶，其用于骨骼系统的退行性疾病例如椎间盘退变性疾病或尿失禁的治疗中。

64.权利要求1-38和50中任一项所述的水凝胶，其用于化妆品用途。

65.一种电子装置，其包含权利要求1-38和50中任一项所述的水凝胶。

66.权利要求65所述的电子装置，其选自燃料电池、太阳能电池、电子电池或生物传感装置。

67.一种组织再生或组织替代的方法，其包括以下步骤：

a)提供如权利要求1-38和50中任一项所定义的水凝胶；

b)使所述水凝胶暴露于要形成再生组织的细胞；

c)允许所述细胞在所述水凝胶上或在所述水凝胶中生长。

68.权利要求67所述的方法，其在体外或体内或离体进行。

69.权利要求68所述的方法，其在体内进行，其中,在步骤a)中，所述水凝胶在患者身体中期望进行组织再生或组织替代的位置处提供。

70.权利要求69所述的方法，其中所述组织选自包括下列的组：皮肤组织、椎间盘的髓核、软骨组织、滑液和膀胱颈中的粘膜下结缔组织。

71.权利要求69或70所述的方法，其中通过将如权利要求1-23中任一项所定义的所述水凝胶或两亲肽和/或类肽溶液在患者身体中期望进行组织再生或组织替代的位置处注射来执行所述步骤a)。

72.权利要求71所述的方法，其中所述步骤a)进一步包括共同注射凝胶化增强剂,优选共同注射盐的溶液，和/或共同注射氧化剂。

73.权利要求68所述的方法，其离体进行，其中,在步骤a)或b)中，来自患者或来自供体的细胞与所述水凝胶混合，并且所得的混合物在患者身体中期望进行组织再生或组织替代的位置处提供。

74.权利要求67-73中任一项所述的方法，其中所述水凝胶包含一种或多种刺激再生过程和/或调节免疫应答的生物活性治疗药物。

75.一种薄层，其由如权利要求1-38和50中任一项所定义的水凝胶获得，优选通过玻璃板浇注或利用不锈钢、惰性金属、非反应性聚合材料浇注获得。