CN114341173A - 超分子结构 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含多个融合的原纤维的超分子结构,其中每个原纤维包含多个细胞黏附基序脂肽。本发明还涉及包含所述结构的水性培养基;用于细胞维持、细胞培养和/或细胞生物加工的表面,其中所述结构固定在表面中或表面上;以及所述结构在细胞维持、细胞培养和/或生物加工中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及包含多个融合的原纤维的超分子结构,其中每个原纤维包含多个细胞黏附基序脂肽。本发明还涉及包含所述结构的水性培养基;用于细胞维持、细胞培养和/或细胞生物加工的表面,其中所述结构固定在表面中或表面上;以及所述结构在细胞维持、细胞培养和/或生物加工中的用途。
背景技术
有许多已建立的和新兴的商业市场利用在培养活细胞方面的科学进步来制造新产品,包括药物、干细胞、基因治疗甚至基于细胞的肉。这些产品的目标是创造适合人未来需要的产品。这样的产品可以是更可持续的,并解决与食物稀缺、全球变暖或获得医学治疗相关的问题。
许多这些应用依赖于贴壁细胞的使用。然而,目前有许多挑战阻碍这些领域的发展。这些挑战包括使用与污染风险、高成本和批次间变化性相关的动物来源的组分(例如血清)。动物产品的使用也不符合良好生产规范(Good Manufacturing Practice)并且通常在伦理上有争议。虽然存在无血清培养基替代物,但这些替代物是昂贵的并且无法使用于所有细胞类型。
此外,目前的贴壁细胞培养方法与传统批次细胞培养的局限性相关。当前的批次生物加工技术需要大表面积和大量生长培养基(占总成本的高至70%),这二者均是对可扩展性的限制。作为结果,公司无法满足市场需求,这降低了其产品的潜力,并总体上减缓了更可持续的、更便宜和更环境友好的产品的开发。
因此,需要更有效地用于维持、培养和生物加工细胞(包括贴壁细胞) 并且具有更少的潜在副作用的产品。本发明旨在提供至少部分地解决这些问题的产品。
发明内容
本发明人已产生了具有独特拓扑结构的新脂肽超分子结构。这种新结构具有多个融合的原纤维,其中每个原纤维包含多个细胞黏附基序脂肽。
由于由本发明人开发的制备该结构的新方法,使这种新超分子结构的产生成为可能。特别地,本发明人已表明,通过将冻干脂肽溶于无血清细胞培养基(serum-free cellculture medium,SFM)中,脂肽自组装以形成融合在一起以产生与在水中产生的本领域定义的脂肽结构在拓扑上不同的超分子结构的原纤维。因此,虽然本文中示例性的结构已使用SFM产生,但是应当理解,这样的结构也可使用离子强度大于水之离子强度的其他溶剂来产生。
本发明人相信,这种新结构是作为脂肽在其中自组装的溶剂的离子强度的结果来形成的。本发明人假设溶剂(与水相比)提高的离子强度在脂肽之间产生静电吸引力,这改变脂肽组装的方式。
本发明人已表明,这种新超分子结构可通过多种不同脂肽的自组装形成。特别地,本发明人已通过使用包含细胞黏附基序例如 RGD(SEQ ID NO:1),KTTKS(SEQ ID NO:2)或YEALRVANEVTLN(SEQ ID NO:3) 的三种脂肽表明了这一点。
出人意料地,本发明人已发现包含多个融合的原纤维的超分子结构,其中每个原纤维包含提高细胞生长和/或细胞胶原蛋白产生的多个细胞黏附基序脂肽(如RGD,KTTKS或YEALRVANEVTLN)。本发明人相信具有融合的原纤维的超分子结构与本领域的原纤维超分子结构相比具有不同的生物活性并且可更好地模拟内源生物分子的功能,其中脂肽的部分或全部氨基酸部分是从该内源生物分子获得的。
另外,由本发明人产生的超分子结构具有比本领域中使用水产生的那些结构更高的原纤维密度。这可以是有利的,因为可导致具有更高细胞黏附基序密度的超分子结构。
在一个方面中,本文中提供了包含多个融合的原纤维的超分子结构,其中每个原纤维包含多个细胞黏附基序脂肽。
在一个实施方案中,细胞黏附基序是胞外基质蛋白序列或其片段或变体。
在一个实施方案中,胞外基质蛋白选自纤连蛋白、胶原蛋白、光蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖、层黏连蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、双糖链蛋白聚糖、肝素、生腱蛋白和骨桥蛋白。
在一个实施方案中,细胞黏附基序是:
a)包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的纤连蛋白片段:
RGD(SEQ ID NO:1),RGDS(SEQ ID NO:5),PHSRN(SEQ ID NO:6),LDVP(SEQ ID NO:7),WQPPRARI(SEQ ID NO:8),IGD(SEQ ID NO:9),REDV(SEQ ID NO:10),和IDAP (SEQ IDNO:11) ,
或其变体;
b)包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的胶原蛋白片段:
KTTKS(SEQ ID NO:2),GTPGPQGIAGQRGVV(SEQ ID NO:12),GROGER(SEQ ID NO:13),GLKGEN(SEQ ID NO:14),GFOGER(SEQ ID NO:15),和MNYYSNS(SEQ ID NO: 16),
或其变体;或者
c)包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的光蛋白聚糖片段:
EVTLN(SEQ ID NO:17),ELDLSYNKLK(SEQ ID NO:18)和YEALRVANEVTLN(SEQ IDNO:3);
或者
d)包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的层黏连蛋白片段:
YIGSR(SEQ ID NO:19),IKVAV(SEQ ID NO:20),CCRRIKVAVWLC(SEQ ID NO:21)和RGD。
在一个实施方案中,多个细胞黏附基序脂肽包含至少两种不同的细胞黏附基序脂肽。
在一个实施方案中,至少两种不同的细胞黏附基序脂肽是:
a)包含KTTKS(SEQ ID NO:2)或由KTTKS(SEQ ID NO:2)组成的细胞黏附基序脂肽;以及
b)包含YEALRVANEVTLN(SEQ ID NO:3)或由YEALRVANEVTLN(SEQ ID NO:3) 组成的细胞黏附基序脂肽。
在一个实施方案中,脂肽包含含有6至24个碳原子的碳链的脂质部分。
在一个方面中,本文中提供了包含如本文中所述的超分子结构的水性培养基。
在一个实施方案中,培养基是细胞培养基。
在一个实施方案中,细胞培养基是无血清的。
在一个实施方案中,细胞培养基是Dulbecco改良Eagle培养基 (Dulbecco’sModified Eagle Medium,DMEM)、Ham’s F12、Leibovitz’s L-15培养基、RPMI-1640、MesencultTM基础培养基或DMEM-F12。
在一个方面中,本文中提供了用于细胞维持、细胞培养和/或细胞生物加工的表面,其中固定在表面中或表面上的是如本文中所述的超分子结构。
在一个实施方案中,表面是2D或3D的。
在一个实施方案中,2D表面是盖玻片或细胞培养容器的表面,任选地其中细胞培养容器选自管、烧瓶、培养皿或包含多个孔的板。
在一个实施方案中,3D表面是支架,任选地其中支架是水凝胶或聚苯乙烯支架。
在一个方面中,本文中提供了如本文中所述的超分子结构、或水性培养基或表面用于细胞的维持、培养和/或生物加工的用途。
在一个实施方案中,生物加工是针对胶原蛋白的产生的。
在一个实施方案中,超分子结构、培养基或表面促进细胞生长。
在一个实施方案中,细胞选自:人基质祖细胞、人脂肪来源的间充质干细胞和永生化的小鼠成肌细胞。
除非上下文另有要求,本公开内容中所述的考虑应被认为适用于根据本发明的结构、水性培养基和表面及其用途。
在本说明书的描述和权利要求书通篇,词语“包含/包括”和“包含/ 含有”及其变化形式意指“包括但不限于”,并且它们不旨在(并且不) 排除其他部分、添加物、组分、整数或步骤。
在本说明书的描述和权利要求书通篇,除非上下文另有要求,否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。特别地,在使用没有数量词修饰的名词的情况下,除非上下文另有要求,否则本说明书应理解为涵盖一个/种或更多个/种。
结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文中所述的任何其他方面、实施方案或实施例,除非与其不相容。
以下进一步详细描述本发明的多个方面。
附图说明
在下文中参照附图进一步描述本发明的一些实施方案,其中:
图1示出了通过由原子力显微术(atomic force microscopy,AFM)对 RGDS脂肽进行前向偏转扫描分析的在水(左)或无血清培养基(serum-free medium,SFM;右)中自组装的单一类型RGDS脂肽的形貌特征。比例尺:1μm。插入尺寸:1μm×1μm。该图突出了来源于溶解在水中的脂肽相较于来源于溶解在SFM中的脂肽(后者包含如本文中所述的融合的原纤维)的自组装结构的差异。
图2示出了在无血清培养基(SFM;顶部)或水(底部)中自组装的单一类型和复合脂肽系统的形貌特征。通过原子力显微术(AFM)对 RGDS、光蛋白聚糖、五胜肽(Matrixyl)和光蛋白聚糖:五胜肽脂肽进行前向偏转扫描(灰度分别为500和100nm)。顶部图像比例尺:对于图像和对于插图分别为8和2μm。底部图像比例尺:对于插图分别为1和0.5 μm。
图3示出了对用无血清培养基(SFM)或水中自组装的脂肽培养的人基质祖细胞进行的细胞生物相容性和生物活性测定的结果。该图显示了当使用以不同浓度溶解在蒸馏水(H2O)或SFM中的光蛋白聚糖(A)、五胜肽(C)和RGDS脂肽(E)时人基质祖细胞在第3天和第7天的增殖,以及由使用先前溶解在水或SFM中的光蛋白聚糖(B)、五胜肽(D)和 RGDS脂肽(F)培养7天之后的人基质祖细胞沉积的胶原蛋白的量。对于所有实验,平均值±S.D.,n=3;*、**、***和****是指与对照(0SFM) 相比的统计学显著性差异,并且分别对应于p<0.05、0.01、0.001和0.0001。
图4示出了细胞培养基对补充RGDS的人脂肪来源的间充质干细胞 (hASC)的增殖的作用。在存在以50μM溶解在SFM或蒸馏水(H2O) 中的RGDS脂肽的情况下,hASC在第3天和第7天的增殖。对于所有实验,平均值±S.D.,n=3;****是指与SFM中的对照相比的统计学显著性差异,并且对应于p<0.0001。
图5示出了细胞培养基对补充光蛋白聚糖或五胜肽的hASC的增殖的作用。(A)图报道了在存在以50μM溶解在无血清培养基(SFM)或蒸馏水(H2O)中的光蛋白聚糖或五胜肽脂肽的情况下,使用阿尔玛蓝 (Alamar Blue)测定的在第3天和第7天hASC的增殖。图报道了由使用以50或25μM溶解在SFM或H2O中的光蛋白聚糖(B)或五胜肽脂肽(C) 培养7天之后的hASC沉积的胶原蛋白的总量。对于所有实验,平均值±S.D.,n=3。
图6示出了其中自组装脂肽的细胞培养基如何影响C2C12细胞的生物相容性和生物活性。(A)图示出了当使用以不同浓度溶解在蒸馏水 (H2O)或无血清培养基(SFM)中的光蛋白聚糖脂肽时,在第3天和第 7天C2C12的增殖。(B)图示出了由使用先前溶解在H2O或SFM中的光蛋白聚糖脂肽培养7天之后的C2C12沉积的胶原蛋白的量。对于所有实验,平均值±S.D.,n=1;*、**、***和****是指统计学显著性差异,分别对应于p<0.05、0.01、0.001和0.0001。
图7示出了其中自组装脂肽的细胞培养基如何影响C2C12细胞的生物相容性和生物活性。(A)图示出了当使用以不同浓度溶解在蒸馏水 (H2O)或无血清培养基(SFM)中的五胜肽脂肽时,在第3天和第7天 C2C12的增殖。(B)图示出了由使用先前溶解在H2O或SFM中的五胜肽脂肽培养7天之后的C2C12沉积的胶原蛋白的量。对于所有实验,平均值±S.D.,n=1;*、**、***和****是指统计学显著性差异,分别对应于 p<0.05、0.01、0.001和0.0001。
图8示出了其中自组装脂肽的细胞培养基如何影响C2C12细胞的生物相容性和生物活性。(A)图示出了当使用以不同浓度溶解在蒸馏水 (H2O)或无血清培养基(SFM)中的RGDS脂肽时,在第3天和第7天 C2C12的增殖。(B)图示出了由使用先前溶解在H2O或SFM中的RGDS 脂肽培养7天之后的C2C12沉积的胶原蛋白的量。对于所有实验,平均值±S.D.,n=1;*、**、***和****是指统计学显著性差异,分别对应于p<0.05、0.01、0.001和0.0001。
图9示出了在(A)Leibovitz’s L-15培养基、(B)RPMI 1640培养基、 (C)DMEM-F12培养基、(D)MesencultTM基础培养基、(E)水对照中自组装的单一类型RGDS脂肽的形貌特征。可看出,在细胞培养基中组装的脂肽形成了包含多个融合的原纤维的超分子结构。比例尺对应于2μm。
具体实施方式
本文中提供了包含多个融合的原纤维的超分子结构。
术语“超分子结构”、“融合的原纤维结构”或“该结构”在本文中可互换使用并且是指由多种原纤维构成的聚集体。原纤维在超分子结构内融合在一起。每个原纤维包含多个细胞黏附基序脂肽。超分子结构也可描述为其中原纤维融合在一起的原纤维排列。
应理解的是,融合的原纤维可使用冷冻透射电子显微术 (cryo-transmissionelectron microscopy,冷冻-TEM)、AFM或小角度X射线散射来鉴定。适当方法的细节在本文别处提供。
本文中使用的术语“原纤维”是指由脂肽构成的纤维状结构。该纤维状结构(即该原纤维)可以是纳米纤维、长丝、带、管、加捻纤维、加捻长丝、加捻带、加捻管或网络,或其组合。原纤维的结构特征是本领域公知的(参见例如I.W.Hamley(Soft Matter,2011,7:4122)和Stupp et al. (Faraday Discussions,2013,166:9-30)的以下综述)。
通常,原纤维可在约40至290nm宽和/或约150至2500nm长的区域中。该结构可由均匀和/或非均匀成形的原纤维构成。在该结构内,原纤维可具有基本相同的尺寸或不同的尺寸。
存在于该结构中的多种原纤维融合在一起。例如,至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种原纤维可融合在一起以形成该结构。
融合的原纤维结构可形成致密的球状沉积物。球状沉积物的直径可为至少200nm。例如,球状沉积物的直径可为至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800等nm。在一个实例中,其直径为约200至约800nm宽。
本文中所述的超分子结构与本领域中使用在水中自组装的相同脂肽产生的那些相比具有更高的原纤维密度。应当理解,密度可使用冷冻透射电子显微术(冷冻-TEM)或AFM,通过分析由在不同条件下形成的结构占据的总面积来确定。其他适当方法的细节也是本领域公知的。
在一个实例中,本文中所述的超分子结构的原纤维密度与使用在水中自组装的相同脂肽产生的超分子结构中的原纤维密度相比高至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%。例如,本文中产生的超分子结构的原纤维密度与使用在水中自组装的相同脂肽产生的超分子结构中原纤维密度相比高至少40%。
本领域技术人员应理解,在本说明书的上下文中,当与使用水作为溶剂产生的超分子结构进行比较时,水意指蒸馏水。因此,本文中对“水”溶剂的任何提及是指蒸馏水。
在一个实例中,原纤维是纳米带。换言之,在该实例中,超分子结构包含多个融合的纳米带。
通常,纳米带可在约40至290nm宽和/或约150至2500nm长的区域中。该结构可由均匀和/或非均匀成形的纳米带构成。在该结构内,纳米带可具有基本相同的尺寸或不同的尺寸。
存在于该结构中的多种纳米带融合在一起。例如,至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或更多种纳米带可融合在一起以形成该结构。
本文中所述的术语“脂肽”是指包含脂质部分和氨基酸部分或者由脂质部分和氨基酸部分组成的两亲性分子。术语“脂肽”、“两亲性分子”、“肽两亲物”和“PA”在本文中可互换使用。两亲特性使多种脂肽能够自组装成超分子结构。脂肽在本领域中是公知的并且其自组装特性是良好表征的(参见例如Cui H.et al.,Biopolymers,2010;94(1):1–18)。因此,合适的脂肽可容易地由本领域技术人员例如通过测试其在某些条件下自组装并形成超分子结构的倾向来鉴定。脂肽自组装和对应的c.a.c.可通过硫磺素(ThT)和芘(Pyr)荧光光谱法进行评价。荧光光谱是用荧光光谱仪记录的。对于ThT测定,通常使用λex=440nm的激发波长和溶于4至5×10-3%(w/v)ThT溶液中的脂肽来记录460至600nm的谱。对于Pyr测定,通常使用λex=339nm的激发波长来记录360至550nm的谱。Pyr测定使用1 至1.5×10-5%(w/v)Pyr溶液作为稀释剂来进行。针对脂肽浓度的对数绘制荧光强度。数据的拐点表示ThT/Pyr分子的环境变化并用于鉴定c.a.c。
脂肽纳米结构可通过使用场发射冷冻电子显微镜(例如JEOL JEM-3200FSC)的冷冻透射电子显微术(冷冻-TEM)、AFM或小角度X 射线散射进行评价。对于冷冻-TEM,经玻璃化的试样是在具有3.5μm孔尺寸的多孔碳铜网格上制备的。将脂肽溶液施加至网格上并随后在-180℃下在液体乙烷和丙烷的1/1混合物中玻璃化。冷冻电子显微镜在成像期间在-187℃下运行。脂肽溶液在约10至5 Pa下从-187℃加热至-60℃,随后在-187℃下成像。从-187℃至-60℃的加热过程,等同于显微镜中的冷冻干燥过程,其允许冰从样品中升华并除去经玻璃化的水。图像是使用明视场模式和具有20 eV狭缝宽度的零损耗能量滤波(ω型)进行拍摄的。使用 CCD相机(例如Gatan Ultrascan 4000)记录显微照片。
本文中使用的术语“多个/种”被定义为两个/种或多于两个/种。结构中的两种或更多种脂肽可以是相同的或者其可以是不同的。
脂肽的氨基酸部分可以是天然的或合成的氨基酸序列。天然的氨基酸序列是存在于自然界并编码蛋白质或其片段的氨基酸序列。天然的氨基酸序列可编码人、动物、植物、真菌、原生生物、古细菌和/或细菌蛋白质或其片段。例如,片段可包含约3至约40个氨基酸,例如约3至约20个,或约3至约10个氨基酸。
氨基酸部分可包含涉及细胞黏附的胞外基质蛋白序列(即胞外基质蛋白的序列;也称为基序)。作为替选,氨基酸部分可包含这样的序列的片段或变体,其中所述片段或变体也涉及细胞黏附。这样的序列(包括片段和其变体)在本文中称为“细胞黏附基序”。换言之,本文中使用的术语“细胞黏附基序”涵盖涉及细胞黏附的胞外基质蛋白基序及片段及其变体。因此,术语“细胞黏附基序”涵盖胞外基质蛋白细胞黏附基序或片段或其变体,其中所述片段或变体也涉及细胞黏附。
因此,本文中使用的术语“细胞黏附基序脂肽”描述了包含氨基酸部分的脂肽,所述氨基酸部分包含涉及细胞黏附的胞外基质蛋白基序或片段或其变体,或者由涉及细胞黏附的胞外基质蛋白基序或片段或其变体组成。
本文中使用的“涉及细胞黏附”是指促进细胞黏附至脂肽,和/或直接黏附或结合至细胞,例如,通过经由显示在细胞表面的细胞表面分子(例如整合素)与细胞结合来直接黏附或结合至细胞。细胞黏附基序通常能够直接黏附至细胞,例如,通过经由显示在细胞表面的细胞表面分子(例如整合素)与细胞结合来直接黏附至细胞。
许多涉及细胞黏附的胞外基质蛋白是本领域已知的。举例来说,涉及细胞黏附的胞外基质蛋白可选自纤连蛋白、胶原蛋白(例如I、II、III和 V型)、光蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖、层黏连蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、双糖链蛋白聚糖、肝素、生腱蛋白和骨桥蛋白。另外,细胞黏附基序可以是来源于任何上述蛋白质的任何肽,包括包含上述分子的结合结构域的衍生物或片段。一些示例性基序包括整合素结合基序,例如 RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)基序、YIGSR(酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸)基序和功能等同的相关肽。例如,已知包含RGD序列(例如RGDS)和WQPPRARI序列的肽指导内皮细胞的扩散和迁移特性,并且YIGSR肽已显示出促进上皮细胞黏附。氨基酸序列是否是细胞黏附基序可通过针对特定细胞类型的黏附和选择性的筛选肽库来确定。细胞黏附基序也可通过噬菌体展示技术凭经验来开发。
脂肽的氨基酸部分可包含一个或更多个细胞黏附基序或由一个或更多个细胞黏附基序组成。例如,脂肽的氨基酸部分可包含2、3、4、5或更多个细胞黏附基序或由2、3、4、5或更多个细胞黏附基序组成(其可串联或可例如通过脂肽的氨基酸部分内的其他氨基酸或接头在空间上分离)。在其中脂肽的氨基酸部分包含多于一种细胞黏附基序的一个实例中,一些或所有基序可以是相同的。或者,一些或所有基序可以是不同的。
细胞黏附基序可以是涉及细胞黏附的胞外基质蛋白或片段或其变体 (即涉及细胞黏附的胞外基质蛋白;胞外基质蛋白的变体,其中所述变体涉及细胞黏附;胞外基质蛋白的片段,其中所述片段涉及细胞黏附;或胞外基质蛋白的片段的变体,其中所述片段的变体涉及细胞黏附)。
细胞黏附基序可以是包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的纤连蛋白片段:
RGD,RGDS,PHSRN,LDVP,WQPPRARI,IGD,REDV,和IDAP,或其变体。变体可以是保守的氨基酸替换变体,例如与选自 RGD,RGDS,PHSRN,LDVP,WQPPRARI,IGD,REDV,和IDAP的氨基酸序列相比具有一个、二个或三个保守的氨基酸替换。
或者,细胞黏附基序可以是包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的胶原蛋白片段:
KTTKS,GTPGPQGIAGQRGVV,GROGER,GLKGEN,GFOGER,和MNYYSNS,或其变体。变体可以是保守的氨基酸替换变体,例如与选自KTTKS,GTPGPQGIAGQRGVV,GROGER,GLKGEN,GFOGER,和MNYYSNS 的氨基酸序列相比具有一个、二个或三个保守的氨基酸替换。
或者,细胞黏附基序可以是包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的光蛋白聚糖片段:
EVTLN,ELDLSYNKLK和YEALRVANEVTLN,或其变体。变体可以是保守的氨基酸替换变体,例如与选自EVTLN,ELDLSYNKLK和YEALRVANEVTLN 的氨基酸序列相比具有一个、二个或三个保守的氨基酸替换。
或者,细胞黏附基序可以是包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的层黏连蛋白片段:
YIGSR,IKVAV,CCRRIKVAVWLC和RGD,或其变体。变体可以是保守的氨基酸替换变体,例如与选自YIGSR,IKVAV,CCRRIKVAVWLC和RGD 的氨基酸序列相比具有一个、二个或三个保守的氨基酸替换。
如上所述,脂肽的氨基酸部分可以是合成的。通过“合成的”意指其包含自然界中不存在的氨基酸序列。合成的氨基酸部分可类似于自然界中存在的氨基酸序列,例如肽。仅举例来说,合成的细胞黏附基序可选自
V2A2E2,HSNGLPLGGGSEEEAAAVVV(SEQ ID NO:22), HSNGLPLGGGSEEEAAAVVV(K)(SEQID NO:23)和HSNGLPLGGGSEEEAAAVVVK (SEQ ID NO:24),
或其变体。
氨基酸部分可包含酶可切割序列。
在一个实例中,氨基酸部分可包含酶可切割序列和细胞黏附基序或由酶可切割序列和细胞黏附基序组成。在这样的一个实例中,酶可切割序列可在氨基酸部分的N端,而细胞黏附基序可在氨基酸部分的C端。
术语“酶可切割序列”是指可被酶切割的氨基酸序列。酶可以是例如蛋白酶。应当理解,可被蛋白酶切割的酶可切割序列也可称为蛋白酶可切割序列。蛋白酶和被蛋白酶切割的序列的一些实例是本领域技术人员公知的。仅举例来说,蛋白酶可选自金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和天冬酰胺肽裂解酶。金属蛋白酶可以是例如MMP1或MMP2。TPGPQGIAGQ(SEQ ID NO:25) 是可被MMP1或MMP2切割的酶可切割序列的一个实例。
酶可切割序列的存在可用于使在本文中公开的融合的原纤维超分子结构上维持和/或培养的细胞能够自定向释放。通过酶可切割序列的切割从超分子结构中释放的细胞可以是无载体的、在结构上和/或表型上与其天然对应物等同的。这样的细胞可以是有利的,例如在自体移植的上下文中。通过“无载体”意指细胞没有在其上维持和/或培养细胞的超分子结构的残留物。
本文中使用的术语“片段”是指截短的对应野生型氨基酸序列的肽。肽的片段可与其对应的野生型氨基酸序列的一部分具有100%的同一性。
本文中使用的术语“变体”是指与对应的野生型氨基酸序列相比,其中一个或更多个氨基酸已被不同氨基酸替代的肽。本领域公知的,一些氨基酸可改变为具有广泛相似特性的其他氨基酸而不改变肽的活性性质(保守替换)。一般来说,可能对肽的特性产生最大变化的替换是这些:其中 (a)亲水性残基(例如,Ser或Thr)被疏水性残基(例如Leu、lie、Phe 或Val)替换;(b)半胱氨酸或脯氨酸被任何其他残基替换;(c)具有带正电的侧链的残基(例如,Arg、His或Lys)被带负电的残基(例如,Glu 或Asp)替换;或者(d)具有庞大侧链的残基(例如,Phe或Trp)被具有较小侧链的残基(例如Ala、Ser)或无侧链的残基(例如Gly)替换。
细胞黏附蛋白的片段或变体可基本上保留对应野生型肽的生物学功能。本文中使用的术语“生物学功能”可指促进细胞结合的能力。通过“基本上保留的”生物学功能意指片段或变体保留至少约50%、60%、75%、 85%、90%、95%、97%、98%、99%或更多的野生型肽的生物学功能,例如促进细胞结合。实际上,片段或变体与野生型肽相比可具有更高的生物学功能。片段或变体可具有110%、120%、130%、140%、150%、160%、 170%、180%、190%、200%或更多的野生型肽的生物学功能,例如促进细胞结合。
脂肽的脂质部分可以是线性的、分支的或环状的。例如,脂质部分可以是线性的。
脂质部分可包含6至24个碳原子的疏水碳链。因此,脂质部分可包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24或更多个碳原子的碳链。例如,脂质部分将包含16或18个碳原子的碳链。应当理解,当脂质部分被称为例如C16或C18时,这意味着脂质部分分别包含16或18个碳原子的碳链。举例来说而非限制性的,脂质部分可包含以下或由以下组成:十二烷酸(月桂酸)、十四烷酸(肉豆蔻酸)、十六烷酸(棕榈酸)、十八碳烯酸(硬脂酸)、油酸、亚油酸和亚麻酸。
脂质部分可以是饱和的或不饱和的。
脂肽的脂质部分和氨基酸部分可直接或间接连接。通过直接连接意指脂质和肽部分不被接头分离。例如,脂质和氨基酸部分可共价偶联。通过间接连接意指脂质和肽部分被接头分离。
本文中使用的术语“接头”是指位于脂质部分和氨基酸部分之间的部分。选择合适的接头是在本领域普通技术人员的能力内的。例如,在期望刚性接头的情况下,其可以是刚性多不饱和烷基或芳基、联芳基、杂芳基等。当期望柔性接头时,其可以是柔性肽(例如Gly-Gly-Gly)或者柔性饱和链烷基或杂链烷基。亲水性接头或间隔物可以是例如多元醇或聚醚,例如聚亚烷基二醇。疏水性接头或者可以是例如烷基或芳基。
例如,接头可以是柔性肽,例如Gly-Gly-Gly。
在一个实例中,细胞黏附基序脂肽可包含C16脂质部分和氨基酸部分,所述氨基酸部分包含序列RGDS或由序列RGDS组成。在该实例中,脂肽可包含在脂质和RGDS序列之间的接头(例如Gly-Gly-Gly接头)。
在另一个实例中,细胞黏附基序脂肽可包含C16脂质部分和氨基酸部分,所述氨基酸部分包含序列RGDS和酶可切割序列或者由序列RGDS和酶可切割序列组成。在该实例中,酶可切割序列可以是TPGPQGIAGQ。酶可切割序列可在氨基酸部分的N端并且细胞黏附基序可在氨基酸部分的C 端。
在另一个实例中,细胞黏附基序脂肽可包含C16脂质部分和氨基酸部分,所述氨基酸部分包含序列YEALRVANEVTLN或由序列YEALRVANEVTLN 组成。在该实例中,可不需要脂质部分与氨基酸部分之间的接头,例如脂质部分和YEALRVANEVTLN氨基酸序列可直接连接。
在另一个实例中,细胞黏附基序脂肽可包含C16脂质部分和氨基酸部分,所述氨基酸部分包含序列KTTKS或由序列KTTKS组成。在该实例中,可不需要脂质部分与氨基酸部分之间的接头,例如脂质部分和KTTKS氨基酸序列可直接连接。
超分子结构可以是单一类型的或复合的。
当结构由不同分子构成时,该结构是复合的,其中一些或所有分子是脂肽并且其中至少一种脂肽是细胞黏附基序脂肽。
在一个实例中,复合的结构包含至少两种不同的脂肽或由至少两种不同的脂肽组成,其中至少一种脂肽是细胞黏附基序脂肽。复合的结构还可包含至少一种非细胞黏附基序脂肽。非细胞黏附基序脂肽是不包含促进细胞结合的氨基酸序列的脂肽。复合的结构可由均匀散布或分离在结构的明确限定的离散结构域中的不同脂肽构成。
在一个实例中,至少一种细胞黏附基序脂肽可包含C16脂质部分和氨基酸部分,所述氨基酸部分包含序列YEALRVANEVTLN或由序列 YEALRVANEVTLN组成。黏附基序脂肽还可进一步包含在脂质部分与氨基酸部分之间的Gly-Gly-Gly接头(例如,可以是在脂质部分与YEALRVANEVTLN 序列之间的Gly-Gly-Gly接头)。
至少一种非细胞黏附基序脂肽可用于稀释形成超分子结构的细胞黏附基序脂肽,以用于降低空间位阻。
在一个实例中,复合的结构可包含至少两种不同的脂肽或由至少两种不同的脂肽组成,其中至少两种脂肽二者均是(不同的)细胞黏附基序脂肽。例如,至少两种细胞黏附基序脂肽中的一种可包含C16脂质部分和氨基酸部分,所述氨基酸部分包含序列YEALRVANEVTLN或由序列 YEALRVANEVTLN组成。这样的脂肽可称为“C16-YEALRVANEVTLN”。黏附基序脂肽还可包含在脂质部分与氨基酸部分之间的Gly-Gly-Gly接头。这样的脂肽可称为“C16-GGG-YEALRVANEVTLN”。至少两种细胞黏附基序脂肽中的第二种可包含C16脂质部分和氨基酸部分,所述氨基酸部分包含序列KTTKS或由序列KTTKS组成。这样的脂肽可称为“C16-KTTKS”。
应当理解,在复合的结构中,不同脂肽的比例可变化。例如,在结构包含两种不同类型的脂肽的情况下,第一脂肽与第二脂肽的摩尔比可为约 1:10至约10:1、约1:9至约9:1、约1:8至约8:1、约1:7至约7:1、约1:6 至约6:1、约1:5至约5:1、约1:4至约4:1、约1:3至约3:1、约1:2至约 2:1、或约1:1。例如,第一脂肽与第二脂肽的比例可为约1:7至约7:1、约 1:6至约6:1、或约1:5至约5:1。
当结构由相同的脂肽分子构成时,该结构是单一类型的。
在一个实施方案中,在结构是单一类型的情况下,该结构可包含含有 C16脂质部分和氨基酸部分的细胞黏附基序脂肽,所述氨基酸部分包含选自RGDS,EALRVANEVTLN和KTTKS的细胞黏附基序。在一个实例中,当氨基酸序列是RGDS时,细胞黏附基序脂肽还可包含在脂质部分与RGDS序列之间的Gly-Gly-Gly接头。
在一个实施方案中,在结构是单一类型的情况下,该结构可包含含有 C16脂质部分和氨基酸部分的细胞黏附基序脂肽,所述氨基酸部分包含选自RGDS,EALRVANEVTLN和KTTKS的细胞黏附基序。在一个实例中,当氨基酸序列是RGDS时,氨基酸部分还可包含酶可切割序列(例如 TPGPQGIAGQ)。酶可切割序列可在氨基酸部分的N端并且细胞黏附基序可在氨基酸部分的C端。
本发明人已发现,当脂肽在离子强度大于蒸馏水之离子强度的水性培养基中自组装时,本文中所述的融合的原纤维超分子结构由脂肽形成。然而,出人意料的是,一旦形成融合的原纤维超分子结构,即使置于不同的培养基(例如,具有比结构在其中自组装的溶剂(例如水)更低的离子强度的培养基)中,该结构仍保持其拓扑结构。
因此,本文中提供了水性培养基,其包含如本文中所述的融合的原纤维超分子结构。如本文中先前所述,融合的原纤维超分子结构包含多个细胞黏附基序脂肽。
本文中使用的术语“水性培养基”是指包含水的任何液体培养基。水性培养基可以是细胞培养基、磷酸缓冲盐水(phosphate-buffered saline, PBS)或其他盐水溶液,或者实际上可以是水。然而,应当理解,术语“水性培养基”并不意味着水应该始终是培养基的主要成分。水性培养基可以是无血清的。
术语“细胞培养基”和“培养基”(在每种情况下为复数“培养基”) 是指用于培养活细胞的营养溶液并且可互换使用。细胞培养基可以是完全制剂,即不需要补充以培养细胞的细胞培养基,或者可以是不完全制剂,即需要补充的细胞培养基,或者可以是可补充不完全制剂或在完全制剂的情况下可改善培养或培养结果的培养基。
本领域技术人员将知道多种细胞培养基,本领域技术人员还将理解待培养的细胞的类型可决定待使用的培养基的类型。
仅举例来说而非限制性的,培养基可选自Dulbecco改良Eagle培养基 (DMEM)、Ham’s F12(F-12)、Leibovitz’s L-15培养基、RPMI-1640、 MesencultTM基础培养基、最低必需培养基(Minimal Essential Medium,MEM)、基础培养基Eagle(Basal Medium Eagle,BME)、Ham’s F-10、α最低必需培养基(αMinimal Essential Medium,αMEM)、格拉斯哥最低必需培养基(Glasgow’s Minimal Essential Medium,G-MEM)和Iscove改良 Dulbecco培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium,IMDM),或其任何组合。商业上可获得的(例如,来自Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA)或本领域另外已知的其他培养基可在本公开内容的上下文中等同地使用。再次,仅举例来说,培养基可选自293SFM、CD-CHO培养基、 VP SFM、BGJb培养基、Brinster’s BMOC-3培养基、细胞培养冷冻培养基、 CMRL培养基、EHAA培养基、eRDF培养基、Fischer’s培养基、Gamborg’s B-5培养基、GLUTAMAXTM补充培养基、Grace’s昆虫细胞培养基、HEPES 缓冲培养基、Richter改良MEM、IPL-41昆虫细胞培养基、McCoy’s 5A 培养基、MCDB 131培养基、培养基199、改良Eagle培养基(Modified Eagle’s Medium,MEM)、培养基NCTC-109、Schneider’s果蝇培养基、 TC-100昆虫培养基、Waymouth’s MB 752/1培养基、William’s培养基E、无蛋白质的杂交瘤培养基II(proteinfree hybridoma medium II,PFHM II)、 AIM V培养基、角质形成细胞SFM、限定性角质形成细胞SFM、SFM、完全甲基纤维素培养基、 HepatoZYME-SFM、NeurobasalTM培养基、Neurobasal-A培养基、 HibernateTMA培养基、Hibernate E培养基、内皮SFM、人内皮SFM、杂交瘤SFM、PFHM II、Sf 900培养基、Sf 900II SFM、EXPRESS培养基、CHO-S-SFM、AMINOMAX-II完全培养基、AMINOMAX-C100完全培养基、AMINOMAX-C140基础培养基、PUB-MAXTM核型分析培养基、 KARYOMAX骨髓核型分析培养基和KNOCKOUT D-MEM,或其任何组合。
细胞培养基可以是无血清的。例如,无血清培养基可以是DMEM、 F-12、Leibovitz’s L-15培养基、RPMI-1640、MesencultTM基础培养基,或其组合(例如DMEM-F12)。
水性培养基(例如无血清培养基,例如DMEM、F-12、Leibovitz’s L-15 培养基、RPMI-1640、MesencultTM基础培养基或DMEM-F12)可包含浓度为约1μM至约100μM的融合的原纤维超分子结构。合适地,水性培养基可包含浓度为约5μM至约50μM、约10μM至约30μM、或约12μM 至约25μM的融合的原纤维超分子结构。例如,水性培养基可包含浓度为约10μM、约11μM、约12μM、约13μM、约14μM、约15μM、约16 μM、约17μM、约18μM、约19μM、约20μM、约21μM、约22μM、约23μM、约24μM、约25μM、约26μM、约27μM、约28μM、约29 μM、约30μM或更多的融合的原纤维超分子结构。技术人员将能够确定合适的浓度,例如通过分析培养基对细胞增殖的作用或对细胞生物加工 (例如胶原蛋白产生)的作用。在本说明书的别处提供了用于分析细胞增殖和胶原蛋白产生的一些示例性方法。
本文中还提供了用于细胞维持、细胞培养和/或细胞生物加工的表面。固定在表面中或表面上的是如本文中所述的融合的原纤维超分子结构。
本文中使用的术语“表面”是指在其中细胞可生长的区域。表面可以是二维(2D)的或3维(3D)的。2D表面的一个实例是盖玻片或培养容器(例如管、烧瓶、培养皿或包含多个孔的板)的表面。培养容器可以是可提供无菌环境用于培养细胞的玻璃、塑料或金属容器。3D表面的一个实例是支架,例如聚苯乙烯支架(例如AlvetexTM)或凝胶支架(例如水凝胶)。
如上所述,可将融合的原纤维超分子结构固定在表面上以便提供用超分子结构包被的表面。表面可部分或完全地被包被。用超分子结构包被表面的方法一般是本领域已知的。举例来说,可通过在表面上滴点 (drop-spotting)并均匀分布包含脂肽的溶液来包被表面,随后干燥表面以形成自组装的融合的原纤维超分子结构的薄膜。在一个实例中,该结构可固定在2D表面上,例如盖玻片或培养容器(例如管、烧瓶、培养皿或包含多个孔的板)的表面。
融合的原纤维超分子结构可在表面中用于细胞维持、细胞培养和/或细胞生物加工。通过“在表面中”意指该结构并入到表面中,使得其部分或完全被表面包封。用于将超分子结构并入到表面中的方法也是本领域已知的。例如,可将形成超分子结构的脂肽添加至从其中制造表面(例如 3D支架)的溶液中。
应当理解,在一些实例中,本文中所述的融合的原纤维超分子结构实际上本身可以是用于细胞维持、细胞培养和/或细胞生物加工的表面。在这样的一个实施方案中,该结构可在水性培养基中或者可固定在表面中或表面上。其中水性培养基包含该结构并且其中该结构是表面的一个实施方案在贴壁细胞的上下文中可以是特别有利的,其中表面面积可以是细胞生长的限制因素。溶液中融合的原纤维超分子结构可为细胞生长提供比例如包含水性培养基的细胞培养容器的表面更大的表面面积。这可具有优点例如降低与细胞培养相关的成本和/或改善生物加工。该结构可以是3D表面。
本文中使用的术语“细胞维持”是指在人工(例如,体外)环境中保持细胞存活而不显著提高细胞数目。本文中使用的术语“细胞培养”是指在有利于细胞生长、分化和/或持续的生存力的条件下将细胞保持在人工环境中。在本公开内容的上下文中,细胞可以是个体或细胞群,或者组织、器官或器官系统。细胞可以是真核细胞(例如动物、植物和真菌细胞)或原核细胞(例如细菌细胞)。细胞可以是动物细胞。例如,细胞是哺乳动物的(例如人或小鼠)。仅举例来说,人细胞可以是人基质祖细胞或人脂肪来源的间充质干细胞。仅举例来说,小鼠细胞可以是永生化的小鼠成肌细胞。
本文中所述的水性培养基、表面或实际上的结构可促进细胞生长。例如,如果与合适的对照相比细胞数目和/或细胞生存力提高,则可促进细胞生长。
本文中使用的术语“细胞生物加工”是指产生生物来源的分子。本文中所述的水性培养基、表面或实际上融合的原纤维超分子结构可改善细胞的生物加工。改善细胞生物加工意指与合适的对照相比,在存在本文中所述的融合的原纤维超分子结构的情况下维持或培养的细胞可产生更多的生物来源的分子。生物来源的分子可以是例如胶原蛋白。
细胞培养的方法是本领域技术人员公知的。在本说明书的上下文中,细胞培养可持续所需的时间以获得所需的作用,例如提高生物来源的分子 (例如胶原蛋白)的细胞产生。仅举例来说,在存在如本文中所述的融合的原纤维超分子结构的情况下细胞培养可持续约3小时、约4小时、约5 小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时或更多。合适地,细胞培养可持续约24小时(约1天)、约36小时、约48小时(约2天)、约60小时、约72小时(约3天)或更多。合适地,细胞培养可持续约84小时、约96小时(约4天)、约108小时、约120 小时(约5天)、约132小时、约144小时(约6天)、约156小时、约 168小时(约7天)、约180小时、约192小时(约8天)、约204小时、约216小时(约9天)或更多。
适当地,细胞培养可为约1天至约9天,例如约2天至约8天,或约 3天至约7天。
合适的对照可以是例如在不存在本文中所述的融合的原纤维超分子结构的情况下生长的细胞。对照细胞可在存在本领域的纤维状超分子结构例如在水中自组装的结构的情况下生长。
结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文中所述的任何其他方面、实施方案或实施例,除非与其不相容。本说明书(包括任何随附的权利要求书、摘要和附图)中所公开的所有特征均可以以任何组合形式进行组合,其中这样的特征和/或步骤中的至少一些为不相容的组合除外。本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明扩展到本说明书(包括任何随附的权利要求书、摘要和附图)中所公开的特征中的任一新特征或任何新组合,或如此公开的任何方法或过程的步骤中的任一新步骤或任何新组合。
鉴于本公开内容,本发明的多个其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是明显的。
实施例
1.材料和方法
1.1无血清培养基中脂肽溶液的制备
在开启静电消除器的情况下称量冻干的脂肽。冻干的脂肽具有高度静电性,因此在无静电消除器的情况下粉末转移受到影响。这是不松散脂肽粉末以及精确称量所需脂肽量的基本要求。
随后将脂肽以所期望的浓度溶解在无血清培养基中。无血清培养基是补充有1mM抗坏血酸和1:100胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM-F12、 Leibovitz’s L-15培养基、RPMI 1640培养基或MesencultTM基础培养基。储备溶液必须以具有大于所使用脂肽的c.a.c.值的c.a.c.值进行准备。C.a.c. 值的变化取决于脂肽序列,并通过芘荧光测量来确定。
示例性的储备液:1.52mM的RGDS脂肽和1.25mM的光蛋白聚糖: 五胜肽脂肽(后者由以15:85的比例混合在一起以获得1.25mM的终浓度的2种粉末组成)。溶液在室温下涡旋30至45分钟,随后在55℃下超声处理30分钟。溶液应在4℃下旋转过夜。如果脂肽仍未很好地溶解,重复涡旋和超声处理步骤。最终的储备溶液需要基本上、优选地完全透明并且无脂肽聚集体。储备液应在4℃下储存。
1.2在水中的脂肽溶液的制备
1)称量脂肽。
2)将脂肽以所期望的高于临界聚集浓度(critical aggregationconcentration, c.a.c.)的浓度溶于水溶液中
3)将溶液进行涡旋至少15分钟
4)将溶液进行超声处理至少30分钟且不超过55℃
5)将溶液在冷却环境中旋转过夜。
6)将最终的储备溶液在冷却环境中储存。
1.3细胞增殖
细胞增殖可通过阿尔玛蓝测定进行评价,细胞数目从使用每个实验的已知细胞数目的标准校准曲线中推测出。细胞在37℃下与50μM刃天青 (resazurin)试剂(SigmaAldrich)一起孵育,使用新鲜培养基按1:10稀释制备5至3小时,随后对100μl培养上清液(一式三份)进行取样以用于在590nm处使用Fluoroskan Ascent荧光分光光度计或VarioskanTMLux (二者均来自Thermo Scientific)进行荧光发射分析。孵育时间根据实验和细胞类型而不同。
1.4胶原蛋白沉积测定
由细胞沉积的胶原蛋白的量是使用天狼星红(Sirius Red)测定 (Jimenez etal.,1985)进行研究的。特别地,将细胞在70%冰冷的乙醇中进行固定,并转移至-80℃至少10分钟,以确保材料的完全固定。随后,除去乙醇溶液,并用蒸馏水轻轻洗涤各孔。细胞用天狼星红/苦味酸溶液 (Sigma Aldrich)处理,并在4℃下在温和搅拌下孵育过夜。第二天,除去任何未结合的染料,并用蒸馏水轻轻冲洗细胞。随后在室温下在搅拌下用500μl的1MNaOH(Fisher Scientific)处理细胞10分钟以分散溶液,并且随后将每个样品的100μL等分试样一式三份地转移至96孔板。通过将使用Multiskan AscentTM或VarioskanTMLux(二者均来自Thermo Fisher Scientific)在490nm处读取的所得样品的吸光度与已知标准浓度的胶原蛋白的吸光度进行比较来计算总胶原蛋白。每个测试条件一式三份地进行。
1.5原子力显微术(Atomic Force Microscopy,AFM)
物质表面形貌的分析是使用Nanosurf Easyscan 2控制的原子力显微镜进行的,所述显微镜装备有具有共振频率为13kHz且标称弹簧常数为0.2 N/m的ContAI-G软接触模式悬臂(BudgetSensors;Bulgaria)。简而言之,不同的样品安装在封口膜覆盖的载玻片上(分别是Bemis;USA和Thermo Fisher Scientific),以使样品位移和漂移最小化。在512×双向线扫描为10 μm/s、1nV的情况下并且在P增益和I增益为1的情况下,从每个样品中的三个独立区域中分析表面形貌。形貌数据是针对线向和倾斜校正使用扫描探针图像处理器软件包(Image Metrology A/S)进行处理的。数据使用来自ImageJ(开源Java应用NIH,USA)v1.46的OrientationJ插件进行分析以用于测量样本的尺寸和分布。所有实验均在每个样品(n=3)的四个单独区域上进行。
2.结果
2.1通过溶解在培养基中制备的脂肽的自组装
当脂肽(脂化的肽)溶解在无血清培养基(SFM)中而不是双蒸水中 (如其通常情况)时,其自组装发生假定不同的超分子纳米结构(图2和图9)。
结果显示,与水相比,在培养基中自组装的单一类型的RGDS脂肽完全不同。在水中,RGDS脂肽形成单个纳米带/加捻纳米带的网络 (Castelletto et al.,2013;Gouveiaet al.,2013)。另一方面,在SFM中,这样的脂肽形成更大且更致密的包含融合的纳米带的排列。类似地,与水相比,在SFM中自组装的单一类型的光蛋白聚糖和五胜肽脂肽完全不同(图 2)。在水中,光蛋白聚糖脂肽在脂质样与淀粉样肽样自组装之间(即纳米带与原纤维结构之间)的边界结构中进行组装(Hamley et al.,2015),然而一旦自组装则五胜肽呈现宽纳米带(Castelletto et al.,2010)。相比之下,光蛋白聚糖和五胜肽脂肽在SFM中形成排列成致密聚集体的融合的原纤维结构。最后,复合系统光蛋白聚糖85:五胜肽15和光蛋白聚糖15:五胜肽85形成的结构更类似于单一类型的光蛋白聚糖脂肽而不是单一类型的五胜肽脂肽。总之,这些结果显示,当与在水中组装的结构相比时,培养基中存在单一类型的和复合的脂肽的超分子自组装结构,并且在结构上存在显著性差异。
2.2细胞培养基对脂肽生物相容性和生物活性的作用
接下来研究了不同纳米结构对生物相容性和生物活性的作用。对于该研究,脂肽被用作培养基补充物,而不是包衣。已针对三种不同的细胞类型即人基质祖细胞、人脂肪来源的间充质干细胞(hASC)和永生化的小鼠成肌细胞系(C2C12)评价了脂肽的生物活性。
2.2.1对人基质祖细胞的作用
本发明人假设,由相同脂肽分子发挥的作用可根据引发自组装的溶剂而不同。光蛋白聚糖、五胜肽和RGDS脂肽被研究作为使用先前在水中或在培养基中自组装的储备溶液的培养基的补充物。特别地,将细胞培养7 天,并在第3天和第7天评估增殖,而在第7天分析胶原蛋白沉积。
结果显示,当与未补充的无血清培养基(SFM)相比光蛋白聚糖脂肽在水中自组装并补充25μM(25μM H2O)和12μM(12μM H2O)两种情况下时,光蛋白聚糖脂肽在第3天(p<0.0001)和第7天(p=0.001和 p=0.0005)显著提高细胞增殖(图3A)。
另一方面,在培养基中自组装并以相同浓度补充的光蛋白聚糖脂肽仅在多至第3天略微提高细胞增殖(对于12和25μM分别为p=0.003和 p=0.0012)(图3A)。
类似地,与其对应的在培养基中自组装的PA的浓度相比,由用在水中自组装的光蛋白聚糖脂肽在25μM和12μM下培养7天的人基质祖细胞沉积的胶原蛋白的量分别高≈75%和15%(图3B)。
然而,与对照(SFM)相比,脂肽的存在显著提高了胶原蛋白沉积,而不依赖于其中发生自组装的溶剂。相比之下,发现在SFM中自组装的五胜肽脂肽:i)在第7天与对照相比在两种条件下显著降低细胞生存力 (p<0.0001)(图3C)以及ii)在第7天与对照相比显著提高沉积的胶原蛋白的量(p<0.0001)并且与在水中自组装的五胜肽脂肽相比高≈55%(图3D)。
此外,在第3天和第7天条件和浓度二者均显著低于对照(p<0.0001) 的情况下,与在培养基中自组装的两种浓度(50和500μM)的RGDS脂肽相比,发现在水中自组装的RGDS脂肽极大地损害细胞增殖(图3E)。然而,与对照相比,条件和浓度二者均显著提高了沉积的胶原蛋白的量,并且与其对应的在培养基中自组装的脂肽的浓度相比,在水中自组装的RGDS脂肽在500μM和50μM下分别提高了65%和35%的胶原蛋白的量 (图3F)。总之,图3中报道的结果表明,最初发生自组装的溶剂对脂肽对人基质祖细胞的生物相容性和生物活性具有持续作用。
2.2.3对人脂肪来源的间充质干细胞(hASC)的作用
hASC也与RGDS脂肽一起培养,所述脂肽先前在其c.a.c.以上在水中溶解并随后在SFM中稀释为终浓度为50μM(图4)。这是为了理解不同的自组装结构是否影响如针对人基质祖细胞发现的hASC行为。结果显示,在水中自组装的RGDS实际上对细胞增殖具有统计学显著性(从第3 天起p<0.0001)毒性作用,而在培养基中自组装的RGDS脂肽未显示(与图3E相比)。
此外,hASC也与光蛋白聚糖或五胜肽脂肽一起培养,所述脂肽先前在其c.a.c.以上在水中溶解并随后在SFM中稀释为终浓度为50μM(图5)。虽然不显著,但结果显示,当溶解在培养基而不是水中时,两种脂肽均略微提高细胞增殖(图5A)。在胶原蛋白沉积方面不存在显著性差异,然而,在水中的光蛋白聚糖脂肽(图5B)和在SFM中的五胜肽脂肽(图5C) 均略微提高了由培养7天之后的hASC沉积的胶原蛋白。
2.2.3对永生化的小鼠成肌细胞系(C2C12)的作用
C2C12在补充有光蛋白聚糖或五胜肽或RGDS脂肽的无血清培养基 (SFM)中培养多至7天。每种脂肽储备液均在其c.a.c.以上在无血清培养基(SFM)中或在水(H2O)中进行制备。C2C12增殖在第3天和第7 天使用阿尔玛蓝测定进行评价。沉积的胶原蛋白的量在第7天使用天狼星红测定进行定量。
光蛋白聚糖脂肽在25和50μM下进行测试,并且结果显示,当溶解在培养基中时,从第3天起细胞增殖显著提高(图6)。此外,当这样的脂肽溶解在SFM而不是水中时,沉积的胶原蛋白显著提高(图6)。
类似地,五胜肽脂肽在25和50μM下进行测试,并且当脂肽溶解在培养基中时,细胞增殖和胶原蛋白沉积二者均显著提高(图7)。
最后,RGDS脂肽在25、50和500μM下进行测试,并且结果显示,当溶解在水中时,像这样的脂肽对C2C12具有相当强的毒性作用(图8)。另一方面,当溶解在SFM中时,其显著降低其毒性作用并提高胶原蛋白沉积(图8)。
参考文献
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Gouveia,R.M.,Castelletto,V.,Alcock,S.G.,Hamley,1.W.and Connon,C.J.(2013)′Bioactive films produced from self-assembling peptide amphiphiles asversatile substrates for tuning cell adhesion and tissue architecture inserum-free conditions′,Journal of Materials Chemistry B, 1(44),pp.6157-6169
Jimenez,W.,Pares,A.,Caballeria,J.,Heredia,D.,Bruguera,M.,Torres,M.,Rojkind,M.and Rodes,J.(1985)′Measurement of fibrosis in needle liverbiopsies:evaluation of a colorimetric method′,Hepatology,5(5),pp.815-8.
Hamley,I.W.,Dehsorkhi,A.,Castelletto,V.,Walter,M.N.M.,Connon,C.J.,Reza,M.and Ruokolainen,J.(2015)′Self-Assembly and Collagen-StimulatingActivity of a Peptide Amphiphile Incorporating a Peptide Sequence fromLumican′,Langmuir,31(15),pp.4490- 4495。
Claims (19)
1.包含多个融合的原纤维的超分子结构,其中每个原纤维包含多个细胞黏附基序脂肽。
2.权利要求1所述的结构,其中所述细胞黏附基序是胞外基质蛋白序列或其片段或变体。
3.权利要求2所述的结构,其中所述胞外基质蛋白选自纤连蛋白、胶原蛋白、光蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖、层黏连蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、双糖链蛋白聚糖、肝素、生腱蛋白和骨桥蛋白。
4.权利要求2或3所述的结构,其中所述细胞黏附基序是:
a)包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的纤连蛋白片段:
RGD(SEQ ID NO:1),RGDS(SEQ ID NO:5),PHSRN(SEQ ID NO:6),LDVP(SEQ ID NO:7),WQPPRARI(SEQ ID NO:8),IGD(SEQ ID NO:9),REDV(SEQ ID NO:10),和IDAP(SEQ ID NO:11),
或其变体;
b)包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的胶原蛋白片段:
KTTKS(SEQ ID NO:2),GTPGPQGIAGQRGVV(SEQ ID NO:12),GROGER(SEQ ID NO:13),GLKGEN(SEQ ID NO:14),GFOGER(SEQ ID NO:15),和MNYYSNS(SEQ ID NO:16),
或其变体;或者
c)包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的光蛋白聚糖片段:
EVTLN(SEQ ID NO:17),ELDLSYNKLK(SEQ ID NO:18)和YEALRVANEVTLN(SEQ IDNO:3);
或者
d)包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的层黏连蛋白片段:
YIGSR(SEQ ID NO:19),IKVAV(SEQ ID NO:20),CCRRIKVAVVVLC(SEQ ID NO:21)和RGD。
5.前述权利要求中任一项所述的结构,其中所述多个细胞黏附基序脂肽包含至少两种不同的细胞黏附基序脂肽。
6.权利要求5所述的结构,其中所述至少两种不同的细胞黏附基序脂肽是:
a)包含KTTKS(SEQ ID NO:2)或由KTTKS(SEQ ID NO:2)组成的细胞黏附基序脂肽;以及
b)包含YEALRVANEVTLN(SEQ ID NO:3)或由YEALRVANEVTLN(SEQ ID NO:3)组成的细胞黏附基序脂肽。
7.前述权利要求中任一项所述的结构,其中所述脂肽包含含有6至24个碳原子的碳链的脂质部分。
8.水性培养基,其包含根据权利要求1至7中任一项所定义的超分子结构。
9.权利要求8所述的培养基,其中所述培养基是细胞培养基。
10.权利要求9所述的培养基,其中所述细胞培养基是无血清的。
11.权利要求9或10所述的培养基,其中所述细胞培养基选自Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、Ham’s F12、Leibovitz’s L-15培养基、RPMI-1640、MesencultTM基础培养基或DMEM-F12。
12.用于细胞维持、细胞培养和/或细胞生物加工的表面,其中固定在所述表面中或所述表面上的是根据权利要求1至7中任一项所定义的超分子结构。
13.权利要求12所述的表面,其中所述表面是2D或3D的。
14.权利要求13所述的表面,其中所述2D表面是盖玻片或细胞培养容器的表面,任选地其中所述细胞培养容器选自管、烧瓶、培养皿或包含多个孔的板。
15.权利要求13所述的表面,其中所述3D表面是支架,任选地其中所述支架是水凝胶或聚苯乙烯支架。
16.根据权利要求1至7中任一项所定义的超分子结构、或根据权利要求8至11中任一项所定义的水性培养基、或根据权利要求12至15中任一项所定义的表面用于细胞的维持、培养和/或生物加工的用途。
17.根据权利要求16所述的用途,其中所述生物加工是针对胶原蛋白的产生的。
18.根据权利要求16所述的用途,其中所述超分子结构、培养基或表面促进细胞生长。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的用途,其中所述细胞选自:人基质祖细胞、人脂肪来源的间充质干细胞和永生化的小鼠成肌细胞。
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