CN116391029A - 组织体的制造方法和脂肪来源干细胞的分化促进方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有血管细胞的组织体的制造方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在马血清的存在下进行孵育的步骤。

Description

组织体的制造方法和脂肪来源干细胞的分化促进方法

技术领域

本发明涉及组织体的制造方法和脂肪来源干细胞的分化促进方法。

背景技术

作为人工地制作模仿生物体组织的结构体的方法，例如已知有下述方法等：一种制造三维组织体的方法(专利文献1)，其包含三维地配置由含有胶原蛋白的被膜涂敷的细胞、形成三维组织体的步骤；一种立体性细胞组织的制造方法(专利文献2)，其包含将细胞与阳离子性物质和细胞外基质成分混合而得到混合物，从得到的混合物收集细胞，在基材上形成细胞集合体的步骤。另外，本发明者们提出了下述方法(专利文献3)：通过使细胞与经片段化的外源性胶原蛋白接触，以较少的细胞数制造厚度为1mm以上的尺寸大的三维组织体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2015/072164号

专利文献2：国际公开第2017/146124号

专利文献3：国际公开第2018/143286号

发明内容

发明所要解决的课题

根据上述的制造方法，能够得到作为通过细胞培养而人工地制作的细胞的集合体的三维组织体。特别是，从三维组织体的维持、进行移植时的植入等观点出发，含有血管细胞的三维组织体期待用作实验动物的替代品、移植材料等，在制造含有血管细胞的三维组织体时，期望有促进脂肪来源干细胞向血管细胞的分化的方法。

本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种在含有血管细胞的组织体的制造中促进脂肪来源干细胞向血管细胞的分化的方法。

用于解决课题的手段

本发明者们反复进行了深入研究，结果发现，通过将脂肪来源干细胞在马血清的存在下进行孵育，脂肪来源干细胞向血管细胞的分化得到促进，从而完成了本发明。

即，本发明例如包含以下的发明。

[1]

一种含有血管细胞的组织体的制造方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在马血清的存在下进行孵育的步骤。

[2]

根据[1]所述的制造方法，其中，含有血管细胞的组织体具有血管网。

[3]

根据[1]或[2]所述的制造方法，其中，至少包含脂肪来源干细胞的细胞不包含血管细胞。

[4]

根据[1]～[3]中任一项所述的制造方法，其中，在上述马血清的存在下进行孵育的步骤是在含有上述马血清的培养基中进行孵育的步骤。

[5]

根据[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，上述脂肪来源干细胞是牛来源的。

[6]

根据[1]～[5]中任一项所述的制造方法，其中，孵育进行144小时以上。

[7]

根据[1]～[6]中任一项所述的制造方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞与片段化细胞外基质成分一起在马血清的存在下进行孵育的步骤。

[8]

根据[7]所述的制造方法，其中，在含有上述血管细胞的组织体中，上述片段化细胞外基质成分配置于上述细胞彼此的间隙。

[9]

根据[7]或[8]所述的制造方法，其中，上述片段化细胞外基质成分为片段化胶原蛋白成分。

[10]

根据[7]～[9]中任一项所述的制造方法，其包含在孵育前使上述细胞与上述片段化细胞外基质成分在水性介质中接触的工序，其中，

将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在马血清的存在下进行孵育的步骤是在马血清的存在下将上述片段化细胞外基质成分接触过的上述细胞进行孵育的工序，

含有上述血管细胞的组织体是含有血管细胞的三维组织体。

[11]

一种脂肪来源干细胞的分化促进方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在马血清的存在下进行孵育的步骤。

[12]

根据[11]所述的方法，其中，在上述马血清的存在下进行孵育的步骤是在含有上述马血清的培养基中进行孵育的步骤。

[13]

根据[11]或[12]所述的方法，其中，上述脂肪来源干细胞是牛来源的。

[14]

根据[11]～[13]中任一项所述的方法，其中，孵育进行144小时以上。

[15]

根据[11]～[14]中任一项所述的方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞与片段化细胞外基质成分在马血清的存在下进行孵育的步骤。

[16]

根据[15]所述的方法，其中，上述片段化细胞外基质成分为片段化胶原蛋白成分。

发明效果

根据本发明，脂肪来源干细胞向血管细胞的分化得到促进。通过促进向血管细胞的分化，能够在短时间内制造含有血管细胞的组织体。

附图说明

图1表示制造例1中制作的组织体的CD31免疫染色的结果。

图2表示制造例2中制作的组织体的CD31免疫染色和基于Hoechst的对比染色的结果。

图3表示制造例3中制作的组织体的CD31免疫染色和基于Hoechst的对比染色的结果。白色的点表示核(Hoechst染色)。

图4表示制造例4中制作的组织体的CD31免疫染色和基于Hoechst的对比染色的结果。白色的点表示核(Hoechst染色)。

图5表示制造例5中制作的组织体的CD31免疫染色和基于Hoechst的对比染色的结果。白色的点表示核(Hoechst染色)。

图6表示制造例6中制作的组织体的CD31免疫染色定量的结果。

图7表示制造例6中制作的组织体的CD31免疫染色定量的结果。

具体实施方式

以下，对用于实施本发明的方式详细地进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。

作为一个实施方式，本发明提供一种含有血管细胞的组织体的制造方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在马血清的存在下进行孵育的步骤。

在本说明书中，“组织体”是指含有通过细胞培养而人工地制作的细胞的组织。“组织体”可以是细胞二维地配置的“二维组织体”，也可以是细胞三维地配置的细胞的集合体(块状的细胞集团)即“三维组织体”。二维组织体是细胞被培养成平面状的组织体，例如，细胞在基材上以平面状拉伸的形状存在。在三维组织体含有后述的细胞外基质成分的情况下，细胞介由细胞外基质成分三维地配置。三维组织体的形状没有特别限制，例如可举出片状、球体状、大致球体状、椭圆体状、大致椭圆体状、半球状、大致半球状、半圆状、大致半圆状、长方体状、大致长方体状等。在此，生物体组织包含汗腺、淋巴管、脂腺等，构成比三维组织体复杂。因此，能够容易地区分三维组织体和生物体组织。

在本说明书中，“细胞”没有特别限定，例如可以是人、猴、狗、猫、兔、猪、牛、小鼠、大鼠等哺乳类动物来源的细胞。细胞的来源部位也没有特别限定，可以是骨、肌肉、内脏、神经、脑、骨、皮肤、血液等来源的体细胞，也可以是生殖细胞。此外，细胞可以是干细胞，另外，可以是原代培养细胞、传代培养细胞及细胞株细胞等培养细胞。

在本说明书中，“干细胞”是指具有自我复制能力及多分化能力的细胞。干细胞中包括具有分化为任意的细胞种类的能力的多能性干细胞、和具有分化为特定的细胞种类的能力的组织干细胞(也称为体干细胞)。作为多能性干细胞，例如可举出胚胎干细胞(ES细胞)、体细胞来源ES细胞(ntES细胞)及人工多能性干细胞(iPS细胞)。作为组织干细胞，例如可举出间充质干细胞(例如脂肪来源干细胞、骨髓来源干细胞)、造血干细胞及神经干细胞。作为脂肪来源干细胞(ADSC)，例如可举出人脂肪来源干细胞和牛脂肪来源干细胞。

细胞至少包含脂肪来源干细胞。脂肪来源干细胞的来源没有特别限定，例如，可以使用从皮下脂肪组织和心外膜来源的脂肪组织等采集的干细胞。在将通过本实施方式的方法制造的含有成熟脂肪细胞的组织体(例如三维组织体)最终选择用于生物体的特定部位的组织的情况下，优选使用与该部位的组织对应的组织来源的组织体。另外，脂肪来源干细胞可以使用例如牛来源、马来源、小鼠来源、大鼠来源、猪来源和人来源等的干细胞。根据本实施方式的方法，即使使用已知特别难以向血管细胞分化的牛来源的脂肪来源干细胞，也能够促进向血管细胞的分化。因此，从本发明的效果变得更为显著的角度出发，优选使用牛来源的脂肪来源干细胞。

细胞可以进一步包含除脂肪来源干细胞以外的细胞。作为除脂肪来源干细胞以外的细胞，例如可举出血管内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间充质细胞、大肠癌细胞(例如人大肠癌细胞(HT29))、肝癌细胞等癌细胞、心肌细胞、上皮细胞(例如人牙龈上皮细胞)、淋巴管内皮细胞、神经细胞、树突状细胞、肝细胞、粘附性细胞(例如免疫细胞)、平滑肌细胞(例如主动脉平滑肌细胞(Aorta-SMC))、胰岛细胞、角化细胞(例如人表皮角化细胞)等。需要说明的是，在本说明书中，“脂肪细胞”是指除脂肪来源干细胞以外的所有脂肪细胞，包括成熟脂肪细胞、以及脂肪来源干细胞中不包括的脂肪细胞。

但是，本发明由于发挥促进脂肪来源干细胞分化为成熟脂肪细胞的效果，因此从本发明的效果变得更为显著的角度出发，优选至少包含脂肪来源干细胞的细胞、即孵育前的细胞不包含血管细胞。

在孵育前的细胞中，优选总细胞数中的90％以上为脂肪来源干细胞，更优选全部为脂肪来源干细胞。

细胞可以进一步包含血管内皮细胞。在本说明书中“血管内皮细胞”是指构成血管内腔的表面的扁平状的细胞。作为血管内皮细胞，例如可举出人脐静脉来源的血管内皮细胞(HUVEC)。

作为表示脂肪细胞的成熟度的指标，可以使用脂肪滴的大小。脂肪滴是指储存甘油三酯(中性脂肪)、胆固醇等脂质的细胞内小器官，上述脂质类被磷脂单层膜覆盖而具有液滴样的形状。另外，在上述磷脂的表面可见脂肪组织特有的蛋白(围脂滴蛋白等)的出现。成熟的脂肪细胞的脂肪滴的大小之间存在偏差，例如，在脂肪滴的大小的平均值为20μm以上的情况下，可以认为脂肪细胞某种程度成熟即为成熟脂肪细胞。

组织体至少含有血管细胞。血管细胞中例如包括血管内皮细胞。在本说明书中，“血管内皮细胞”是指构成血管内腔的表面的扁平状的细胞。

组织体中的血管细胞的含有率相对于组织体中的总细胞数例如可以为5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、或30％以上，且可以为95％以下、90％以下、80％以下或75％以下。

在组织体含有血管内皮细胞的情况下，血管内皮细胞的含有率相对于组织体中的总细胞数例如可以为5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上或30％以上，且可以为95％以下、90％以下、80％以下、或75％以下。

组织体还可以进一步含有除血管细胞以外的细胞。作为除血管细胞以外的细胞，例如可举出成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间充质细胞、大肠癌细胞(例如人大肠癌细胞(HT29))、肝癌细胞等癌细胞、心肌细胞、上皮细胞(例如人牙龈上皮细胞)、淋巴管内皮细胞、神经细胞、树突状细胞、肝细胞、粘附性细胞(例如免疫细胞)、平滑肌细胞(例如主动脉平滑肌细胞(Aorta-SMC))、胰岛细胞、角化细胞(例如人表皮角化细胞)等。但是，本发明为了发挥促进脂肪来源干细胞向血管细胞分化的效果，从本发明的效果变得更为显著的角度出发，后述的孵育后的组织体中，脂肪来源干细胞相对于组织体中的总细胞数优选为10％以下，更优选为5％以下，进一步优选不含有脂肪来源干细胞。

组织体可以在细胞间具有血管网。当在细胞间形成有血管网时，可期待能够长期维持组织体、以及在将组织体移植到哺乳类等时变得容易植入。

“在细胞间具有血管网”是指与生物体组织同样地具有按照分支的血管包围细胞的方式在细胞与细胞之间延伸的结构。关于是否形成有与生物体组织同样的血管网，例如可以基于生物体组织中的血管的分支数和/或血管的分支间的长度和/或血管的直径的多样性来判断。例如，在组织体中的血管的分支数的平均值相对于生物体组织中的血管的分支数的平均值为80％以上且150％以下、85％以上且130％以下、或90％以上且120％以下的情况下，可以判断为与生物体组织中的血管的分支数类似。另外，例如，在组织体中的血管的分支数的平均值为2.5以上且4.5以下、或3.0以上且4.2以下的情况下，可以判断为与生物体组织中的血管的分支数类似。例如，在组织体中的血管的分支间的长度的平均值相对于生物体组织中的血管的分支间的长度的平均值为80％以上且150％以下、85％以上且130％以下、以及90％以上且120％以下的情况下，可以判断为与生物体组织中的血管的分支间的长度类似。在生物体组织中，可观察到较粗的血管及较细的血管这两者。因此，例如，在与生物体组织同样地观察到直径较粗的血管(例如10μm以上且小于25μm)和较细的血管(例如超过0μm且小于10μm)这两者的情况下，可以判断为具有与生物体组织中的血管的直径同样的多样性。另外，例如，以超过0μm且小于25μm分布有血管直径整体的60％以上、70％以上或80％以上的情况下，可以判断为具有与生物体组织中的血管的直径同样的多样性。在组织体含有脂肪细胞的情况下，组织体优选在脂肪细胞间具有血管网。在该情况下，不仅具有血管网，被血管包围的脂肪细胞也优选与生物体组织接近。例如，在本实施方式的组织体中的脂肪细胞的脂肪滴的大小的平均值为20μm～180μm或100μm～180μm的情况下，可以判断为组织体具有与生物体组织中的脂肪细胞同样的脂肪细胞。在对上述生物体组织和组织体进行比较时，以相同的条件(例如，单位规定体积，当进行图像解析时则为单位规定面积，单位规定样品等)对生物体组织和组织体进行比较。

在组织体为三维组织体的情况下，三维组织体的厚度优选为10μm以上，更优选为100μm以上，更进一步优选为1000μm以上。这样的三维组织体为更接近生物体组织的结构，适合作为实验动物的替代品和移植材料。三维组织体的厚度的上限没有特别限制，例如可以为10mm以下，可以为3mm以下，可以为2mm以下，可以为1.5mm以下，也可以为1mm以下。

在此，“三维组织体的厚度”在三维组织体为片状或长方体状的情况下，是指与主面垂直的方向上的两端的距离。在上述主面存在凹凸的情况下，厚度是指上述主面的最薄部分的距离。

另外，在三维组织体为球体状或大致球体状的情况下，厚度是指其直径。此外，在三维组织体为椭圆体状或大致椭圆体状的情况下，厚度是指其短径。在三维组织体为大致球体状或大致椭圆体状且表面存在凹凸的情况下，厚度是指通过三维组织体的重心的直线与上述表面交叉的2点间的距离中的最短的距离。

在本实施方式的方法中，包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在马血清的存在下进行孵育的步骤。通过在马血清的存在下进行孵育，脂肪来源干细胞向血管细胞的分化得到促进。

本实施方式的方法只要至少一部分的脂肪来源干细胞与马血清接触而分化得到促进即可，因此组织体的制造中的制造方法没有特别限定，可以为三维培养，也可以为二维培养。在本实施方式的方法中，通过在脂肪来源干细胞包含于组织体的状态下促进分化、或者在按照使脂肪来源干细胞包含于组织体的方式形成组织体的状况下促进分化，能够最终制作含有血管细胞的组织体。因此，将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在马血清的存在下进行孵育可以在马血清存在下仅孵育细胞，也可以以细胞和细胞外基质成分混合的状态在马血清存在下进行孵育，也可以以形成有含有细胞和细胞外基质成分的组织体的状态在马血清存在下进行孵育。

利用二维培养进行的组织体的制造可以通过以平面状培养细胞的公知的方法进行。例如可举出包含在基材上添加细胞和培养基的步骤、以及培养细胞的步骤的方法；以及包含在基材上涂布凝胶的步骤、在涂层上添加细胞和培养基的步骤、以及培养细胞的步骤的方法等。作为用于涂布基材的凝胶，可以使用上述的纤维蛋白凝胶、水凝胶、基质凝胶、胶原蛋白凝胶及明胶凝胶等。

利用三维培养进行的组织体的制造也可以通过公知的方法进行，关于用于制造使用了片段化细胞外基质成分的三维组织体的优选例，在后文叙述。

马血清(Horse Serum，HS)可以通过常规方法制作，也可以使用市售品。作为市售的马血清，例如可举出S0900(BioWest公司)、SH30074.02(Cytiva公司)、以及16050130(ThermoFisher公司)等。

在马血清的存在下进行孵育的步骤例如可以是将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在含有马血清的培养基中进行孵育(培养)的步骤。

培养基没有特别限制，可以根据所要培养的细胞的种类选择适当的培养基。培养基可以为固体培养基，也可以为液体培养基，优选为液体培养基。作为培养基，例如可举出Eagle’s MEM培养基、DMEM、F12K培养基、Modified Eagle培养基(MEM)、Minimum Essential培养基、RPMI、及GlutaMax培养基等。另外，液体培养基也可以使用如纤维蛋白凝胶、水凝胶、基质凝胶、胶原蛋白凝胶以及明胶凝胶那样的凝胶状的液体培养基。可以在凝胶状的液体培养基中添加细胞，也可以使含有细胞的液体培养基凝胶化后使用。培养基可以含有除马血清以外的血清，也可以不含有除马血清以外的血清。培养基可以是混合有两种培养基的混合培养基。

马血清相对于脂肪来源干细胞1×10⁴cells可以为20～400μL、20～240μL、或160～240μL。

在将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在含有马血清的培养基中进行孵育的情况下，培养基中的马血清的含量例如可以为1％以上且20％以下、3％以上且17％以下、4％以上且15％以下、或5％以上且12％以下，可以为1％以上、2％以上、3％以上、4％以上、5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、或10％以上，且可以为20％以下、18％以下、16％以下、14％以下、或12％以下。

孵育前的培养基中的细胞密度可以根据目标组织体的形状、厚度、培养器的尺寸等适当决定。例如，培养基中的细胞密度可以为1～10⁸cells/mL，可以为10³～10⁷cells/mL，也可以为10⁵～10⁶cells/mL。

孵育没有特别限制，可以根据所要培养的细胞的种类在适当的条件下进行。例如，孵育的温度可以为20℃～40℃，也可以为30℃～37℃。培养基的pH可以为6～8、也可以为7.2～7.4。孵育的时间可以为24小时以上且336小时以下，可以为72小时以上且336小时以下，也可以为96小时以上且288小时以下。马血清存在下的孵育的时间可以为24小时以上且336小时以下，可以为72小时以上且336小时以下，也可以为96小时以上且288小时以下。另外，马血清存在下的孵育的时间可以为72小时以上、84小时以上、96小时以上、108小时以上、120小时以上、132小时以上或144小时以上，且可以为336小时以下、312小时以下、288小时以下、264小时以下、240小时以下或226小时以下。

细胞的培养中使用的培养器(支撑体)没有特别限制，例如可以是孔插件、低吸附平板、具有U字或V字等底面形状的平板。可以将上述细胞在粘附于支撑体的状态下进行培养，也可以将上述细胞在不粘附于支撑体的状态下进行培养，也可以在培养中途从支撑体分离而进行培养。在将上述细胞在不粘附于支撑体的状态下进行培养的情况下、或在培养中途从支撑体分离而进行培养的情况下，优选使用抑制细胞对支撑体的粘附的具有U字或V字等底面形状的平板、低吸附平板。

本实施方式的方法可以包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞与片段化细胞外基质成分一起在马血清的存在下进行孵育的步骤。通过与片段化细胞外基质成分一起进行孵育，能够得到细胞介由片段化细胞外基质成分三维地配置的三维组织体。优选为片段化细胞外基质成分配置于上述细胞彼此的间隙的三维组织体。细胞彼此中的细胞可以是同种细胞，也可以是异种细胞。

片段化细胞外基质成分可以通过将细胞外基质成分片段化而得到。在本说明书中，“细胞外基质成分”是指由多个细胞外基质分子形成的细胞外基质分子的集合体。细胞外基质是指在生物中存在于细胞外的物质。作为细胞外基质，只要不对细胞的生长及细胞集合体的形成产生不良影响，就可以使用任意的物质。作为具体例，可举出胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、纤连蛋白、透明质酸、层粘连蛋白、波连蛋白、细胞粘合素、巢蛋白和纤维蛋白等，但并不限定于这些。细胞外基质成分可以单独使用它们中的1种，也可以组合使用。细胞外基质成分例如可以含有胶原蛋白成分，也可以是胶原蛋白成分。本实施方式中的细胞外基质成分优选为存在于动物细胞外的物质、即动物的细胞外基质成分。

胞外基质分子只要不对细胞的生长及细胞集合体的形成产生不良影响，就可以是上述的细胞外基质分子的修饰体及突变体，也可以是化学合成肽等多肽。细胞外基质分子可以具有胶原蛋白特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复。在此，Gly表示甘氨酸残基，X和Y分别独立地表示任意的氨基酸残基。多个Gly-X-Y分别可以相同也可以不同。通过具有由Gly-X-Y表示的序列的重复，对分子链的配置的束缚变少，因此，例如作为细胞培养时的支架材料的功能更为优异。在具有由Gly-X-Y表示的序列的重复的细胞外基质分子中，由Gly-X-Y表示的序列的比例在全部氨基酸序列中可以为80％以上，优选为95％以上。另外，细胞外基质分子也可以是具有RGD序列的多肽。RGD序列是指由Arg-Gly-Asp(精氨酸残基-甘氨酸残基-天冬氨酸残基)表示的序列。通过具有RGD序列，细胞粘附得到更进一步促进，因此例如作为细胞培养时的支架材料更为合适。作为包含由Gly-X-Y表示的序列和RGD序列的细胞外基质分子，可举出胶原蛋白、纤连蛋白、波连蛋白、层粘连蛋白、钙黏着蛋白等。

作为胶原蛋白，例如可举出纤维性胶原蛋白及非纤维性胶原蛋白。纤维性胶原蛋白是指成为胶原蛋白纤维的主要成分的胶原蛋白，具体而言可举出I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白等。作为非纤维性胶原蛋白，例如可举出IV型胶原蛋白。

作为蛋白多糖，可举出硫酸软骨素蛋白多糖、硫酸肝素蛋白多糖、硫酸角质素蛋白多糖、硫酸皮肤素蛋白多糖，但并不限定于这些。

从本发明的效果变得更为显著的角度出发，细胞外基质成分可以含有选自由胶原蛋白、层粘连蛋白及纤连蛋白组成的组中的至少1种，优选含有胶原蛋白。胶原蛋白优选为纤维性胶原蛋白，更优选为I型胶原蛋白。作为纤维性胶原蛋白，可以使用市售的胶原蛋白，作为其具体例，可举出日本Ham株式会社制的猪皮来源的I型胶原蛋白。

细胞外基质成分可以是动物来源的细胞外基质成分。作为成为细胞外基质成分的来源的动物种，例如可举出人、猪、牛等，但并不限定于这些。细胞外基质成分可以使用一种动物来源的成分，也可以并用多种动物来源的成分。

“片段化”是指使细胞外基质成分的集合体成为更小的尺寸。片段化可以在切断细胞外基质分子内的键的条件下进行，也可以在不切断细胞外基质分子内的键的条件下进行。通过施加物理性的力而片段化的细胞外基质与酶处理不同，通常分子结构在片段化之前不发生变化(维持了分子结构)。片段化细胞外基质成分可以包含通过物理性的力的施加而对上述的细胞外基质成分进行解纤而得到的成分、即经解纤的细胞外基质成分(解纤细胞外基质成分)。解纤是片段化的一个方式，例如是在不切断细胞外基质分子内的键的条件下进行的。

作为将细胞外基质成分片段化的方法，没有特别限制。作为对细胞外基质成分进行解纤的方法，例如可以通过超声波式均化器、搅拌式均化器、及高压式均化器等施加物理性的力而对细胞外基质成分进行解纤。在使用搅拌式均化器的情况下，可以将细胞外基质成分直接均化，也可以在生理盐水等水性介质中进行均化。另外，通过调整进行均化的时间、次数等，还可以得到毫米尺寸、纳米尺寸的解纤细胞外基质成分。解纤细胞外基质成分也可以通过反复冷冻融解进行解纤而得到。

片段化细胞外基质成分可以至少部分包含经解纤的细胞外基质成分。另外，片段化细胞外基质成分也可以仅由经解纤的细胞外基质成分构成。即，片段化细胞外基质成分可以是经解纤的细胞外基质成分。经解纤的细胞外基质成分优选包含经解纤的胶原蛋白成分(解纤胶原蛋白成分)。解纤胶原蛋白成分优选维持来自胶原蛋白的三重螺旋结构。解纤胶原蛋白成分可以是部分地维持来自胶原蛋白的三重螺旋结构的成分。

作为片段化细胞外基质成分的形状，例如可举出纤维状。纤维状是指由丝状的胶原蛋白成分构成的形状，或者丝状的细胞外基质成分在分子间交联而构成的形状。片段化细胞外基质成分的至少一部分可以是纤维状。纤维状的细胞外基质成分中包括多个丝状的细胞外基质分子集合而形成的细丝状物(细纤维)、细纤维进一步集合而形成的丝状物、将这些丝状物解纤而得到的物质等。在纤维状的细胞外基质成分中，RGD序列不被破坏地得以保存。

片段化细胞外基质成分的平均长度可以为100nm以上且400μm以下，也可以为100nm以上且200μm以下。在一个实施方式中，片段化细胞外基质成分的平均长度可以为5μm以上且400μm以下，可以为10μm以上且400μm以下，可以为22μm以上且400μm以下，也可以为100μm以上且400μm以下。在另一实施方式中，从再分散性更进一步优异的观点出发，片段化细胞外基质成分的平均长度可以为100μm以下，可以为50μm以下，可以为30μm以下，可以为15μm以下，可以为10μm以下，也可以为1μm以下，且可以为100nm以上。片段化细胞外基质成分整体中，大部分的片段化细胞外基质成分的平均长度优选在上述数值范围内。具体而言，优选片段化细胞外基质成分整体中的95％的片段化细胞外基质成分的平均长度在上述数值范围内。片段化细胞外基质成分优选为平均长度在上述范围内的片段化胶原蛋白成分，更优选为平均长度在上述范围内的解纤胶原蛋白成分。

片段化细胞外基质成分的平均直径可以为10nm以上且30μm以下，可以为30nm以上且30μm以下，可以为50nm以上且30μm以下，可以为100nm以上且30μm以下，可以为1μm以上且30μm以下，可以为2μm以上且30μm以下，可以为3μm以上且30μm以下，可以为4μm以上且30μm以下，也可以为5μm以上且30μm以下。片段化细胞外基质成分优选为平均直径在上述范围内的片段化胶原蛋白成分，更优选为平均直径在上述范围内的解纤胶原蛋白成分。

片段化细胞外基质成分的平均长度及平均直径可以通过利用光学显微镜测定各个片段化细胞外基质成分并进行图像解析而求出。在本说明书中，“平均长度”是指所测定的试样的长度方向的长度的平均值，“平均直径”是指与所测定的试样的长度方向正交的方向的长度的平均值。

片段化细胞外基质成分例如可以含有片段化胶原蛋白成分，也可以由片段化胶原蛋白成分构成。“片段化胶原蛋白成分”是指将纤维性胶原蛋白成分等胶原蛋白成分片段化而得到的成分，其维持有三重螺旋结构。片段化胶原蛋白成分的平均长度优选为100nm～200μm，更优选为22μm～200μm，更进一步优选为100μm～200μm。片段化胶原蛋白成分的平均直径优选为50nm～30μm，更优选为4μm～30μm，更进一步优选为20μm～30μm。

片段化细胞外基质成分中的至少一部分可以在分子间或分子内交联。细胞外基质成分可以在构成细胞外基质成分的细胞外基质分子的分子内或分子间交联。

作为进行交联的方法，例如可举出通过施加热、紫外线、放射线等进行的物理交联、利用交联剂、酶反应等进行的化学交联等方法，其方法没有特别限定。从不妨碍细胞生长的观点出发，优选物理交联。交联(物理交联及化学交联)可以是介由共价键的交联。

在细胞外基质成分包含胶原蛋白成分的情况下，交联可以在胶原蛋白分子(三重螺旋结构)之间形成，也可以在由胶原蛋白分子形成的胶原蛋白细纤维之间形成。交联可以是利用热进行的交联(热交联)。热交联例如可以通过使用真空泵在减压下进行加热处理来实施。在进行胶原蛋白成分的热交联的情况下，细胞外基质成分可以通过胶原蛋白分子的氨基与同一或其他胶原蛋白分子的羧基形成肽键(-NH-CO)而交联。

通过使用交联剂，也可以使细胞外基质成分交联。交联剂例如可以为能够使羧基与氨基交联的交联剂、或者能够使氨基彼此交联的交联剂。作为交联剂，例如从经济性、安全性及操作性的观点出发，优选醛类、碳二亚胺类、环氧化物类和咪唑系交联剂，具体而言，可举出戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺磺酸盐等水溶性碳二亚胺。

交联度的定量可以根据细胞外基质成分的种类、进行交联的手段等适当选择。交联度可以为1％以上、2％以上、4％以上、8％以上、或12％以上，且可以为30％以下、20％以下、或15％以下。通过使交联度在上述范围内，细胞外基质分子能够适度地分散，并且干燥保存后的再分散性良好。

在细胞外基质成分中的氨基用于交联的情况下，交联度可以基于TNBS(三硝基苯磺酸)法进行定量。基于TNBS法的交联度可以在上述的范围内。基于TNBS法的交联度是细胞外基质所具有的氨基中用于交联的氨基的比例。在细胞外基质成分包含胶原蛋白成分的情况下，优选通过TNBS法测定的交联度在上述范围内。

交联度也可以通过对羧基进行定量来计算。例如，在水不溶性的细胞外基质成分的情况下，也可以通过TBO(甲苯胺蓝O)法进行定量。通过TBO法得到的交联度也可以在上述的范围内。

以组织体(干燥重量)为基准，上述组织体(例如三维组织体)中的细胞外基质成分含有率可以为0.01～90质量％、优选为10～90质量％、优选为10～80质量％、优选为10～70质量％、优选为10～60质量％、优选为1～50质量％、优选为10～50质量％、更优选为10～30质量％、更优选为20～30质量％。

在此，“组织体中的细胞外基质成分”是指构成组织体的细胞外基质成分，可以来源于内源性细胞外基质成分，也可以来源于外源性细胞外基质成分。

“内源性的细胞外基质成分”是指由细胞外基质产生细胞产生的细胞外基质成分。作为细胞外基质产生细胞，例如可举出上述的成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间充质细胞。内源性细胞外基质成分可以为纤维性，也可以为非纤维性。

“外源性的细胞外基质成分”是指从外部供给的细胞外基质成分。外源性的细胞外基质成分与作为来源的动物种的内源性的细胞外基质成分可以相同也可以不同。作为成为来源的动物种，例如可举出人、猪、牛等。另外，外源性的细胞外基质成分也可以是人工的细胞外基质成分。

在细胞外基质成分为胶原蛋白成分的情况下，外源性的细胞外基质成分也被称为“外源性胶原蛋白成分”，是指从外部供给的胶原蛋白成分。“外源性胶原蛋白成分”是由多个胶原蛋白分子形成的胶原蛋白分子的集合体，具体地可举出纤维性胶原蛋白、非纤维性胶原蛋白等。外源性胶原蛋白成分优选为纤维性胶原蛋白。上述纤维性胶原蛋白是指成为胶原蛋白纤维主成分的胶原蛋白成分，例如可举出I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白。上述纤维性胶原蛋白可以使用市售的胶原蛋白，作为其具体例，可举出日本Ham株式会社制的猪皮来源的I型胶原蛋白。作为外源性的非纤维性胶原蛋白，例如可举出IV型胶原蛋白。

在外源性的细胞外基质成分中，所来源的动物种可以与细胞不同。另外，在细胞包含细胞外基质产生细胞的情况下，就外源性的细胞外基质成分而言，所来源的动物种可以与细胞外基质产生细胞不同。即，外源性的细胞外基质成分可以是异种细胞外基质成分。

即，在组织体包含内源性细胞外基质成分及片段化细胞外基质成分的情况下，构成上述组织体的细胞外基质成分含有率是指内源性细胞外基质成分和片段化细胞外基质成分的合计量。上述细胞外基质含有率可以根据所得到的组织体的体积和经脱细胞化的组织体的质量来计算。

例如，在三维组织体所含有的细胞外基质成分为胶原蛋白成分的情况下，作为对三维组织体中的胶原蛋白成分量进行定量的方法，例如可举出以下那样的对羟基脯氨酸进行定量的方法。在溶解有三维组织体的溶解液中混合盐酸(HCl)，在高温下孵育规定的时间后恢复至室温，将离心分离后的上清液稀释至规定的浓度，由此制备样品。将羟基脯氨酸标准溶液与样品同样地进行处理后，阶段性地进行稀释而制备标准溶液。对样品和标准溶液分别用羟基脯氨酸分析缓冲液和检测试剂进行规定的处理，测定570nm的吸光度。通过将样品的吸光度与标准溶液进行比较来计算胶原蛋白成分量。需要说明的是，也可以将三维组织体直接悬浮在高浓度的盐酸中，将溶解后的溶解液离心分离而回收上清液，用于胶原蛋白成分定量。另外，所要溶解的三维组织体可以为直接从培养液中回收的状态，也可以在回收后进行干燥处理、在除去了液体成分的状态下使其溶解。但是，在将直接从培养液中回收的状态的三维组织体溶解而进行胶原蛋白成分定量的情况下，由于因三维组织体所吸收的培养基成分和实验手法的问题所引起的培养基残留的影响，预测三维组织体重量的测量值会发生偏差，因此从稳定地测量结构体的重量和每单位重量中所占的胶原蛋白成分量的观点出发，优选以干燥后的重量为基准。

作为对胶原蛋白成分量进行定量的方法，更具体而言，例如可举出以下方法。

(样品的制备)

将进行了冷冻干燥处理的三维组织体的总量与6mol/L HCl混合，用加热块在95℃下孵育20小时以上后，恢复至室温。以13000g离心分离10分钟后，回收样品溶液的上清液。在后述的测定中，用6mol/L HCl进行适当稀释以使结果收束在标准曲线的范围内后，用100μL的超纯水稀释200μL，由此制备样品。样品使用35μL。

(标准溶液的制备)

在螺口试管中加入125μL的标准溶液(1200μg/mL醋酸溶液)和125μL的12mol/lHCl进行混合，用加热块在95℃下孵育20小时后，恢复至室温。以13000g离心分离10分钟后，用超纯水稀释上清液，制作300μg/mL的S1，将S1阶段性地稀释，制作S2(200μg/mL)、S3(100μg/mL)、S4(50μg/mL)、S5(25μg/mL)、S6(12.5μg/mL)、S7(6.25μg/mL)。也准备仅有4mol/HCl90μL的S8(0μg/mL)。

(分析)

将35μL的标准溶液和样品分别加入到平板(QuickZyme Total Collagen Assay试剂盒附带、QuickZyme Biosciences公司)中。将75μL的分析缓冲液(上述试剂盒附带)加入到各孔中。用密封件封闭平板，摇动20分钟，同时在室温下进行孵育。剥离密封件，将75μL的检测试剂(detection reagent：reagent A：B＝30μL：45μL，上述试剂盒附带)加入到各孔中。用密封件封闭平板，通过摇动混合溶液，在60℃下孵育60分钟。在冰上充分冷却，剥离密封件，测定570nm的吸光度。通过将样品的吸光度与标准溶液进行比较来计算胶原蛋白成分量。

组织体中所占的胶原蛋白成分也可以通过其面积比或体积比来规定。“通过面积比或体积比来规定”是指，例如在使组织体中的胶原蛋白成分为能够通过已知的染色方法(例如使用了抗胶原蛋白抗体的免疫染色、或马松三色染色)等与其他组织结构物区别的状态的基础上，使用肉眼观察、各种显微镜和图像分析软件等，计算胶原蛋白成分在整个组织体中所占的存在区域的比率。在通过面积比规定的情况下，并不限定是通过组织体中的怎样的截面或表面来规定面积比，例如在组织体为三维组织体、为球状体等的情况下，可以通过从其大致中心部通过的剖视图来规定。

例如，在通过面积比规定组织体中的胶原蛋白成分的情况下，其面积的比例以上述组织体整体的面积为基准为0.01～99％，优选为1～99％，优选为5～90％，优选为7～90％，优选为20～90％，更优选为50～90％。构成组织体的胶原蛋白成分的面积的比例是指将内源性胶原蛋白成分和外源性胶原蛋白成分合起来的面积的比例。胶原蛋白成分的面积的比例例如可以将所得到的组织体用马松三色染色，作为蓝色染色的胶原蛋白成分的面积相对于从组织体的大致中心部通过的截面的整体面积的比例来计算。

组织体在胰蛋白酶的浓度为0.25％、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟的条件下进行胰蛋白酶处理后的残留率优选为70％以上，更优选为80％以上，更进一步优选为90％以上。这样的组织体在培养中或培养后不易发生由酶引起的分解，是稳定的。上述残留率例如可以根据胰蛋白酶处理前后的组织体的质量来计算。

上述组织体在胶原蛋白酶的浓度为0.25％、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟的条件下进行胶原蛋白酶处理后的残留率可以为70％以上，更优选为80％以上，更进一步优选为90％以上。这样的组织体不易在培养中或培养后发生由酶引起的分解，是稳定的。

将至少包含脂肪来源干细胞的细胞与片段化细胞外基质成分一起在马血清的存在下进行孵育的步骤可以是例如将细胞在含有马血清及片段化细胞外基质成分的培养基中进行孵育(培养)的步骤。此时，例如可以使用预先含有片段化细胞外基质成分和马血清的培养基，可以在含有片段化细胞外基质成分的培养基中添加马血清，也可以在含T马血清的培养基中添加片段化细胞外基质成分。

可以进一步包含在孵育前使上述细胞与上述片段化细胞外基质成分在水性介质中接触的工序。此时，马血清可以包含在水性介质中，可以在孵育前添加，也可以在孵育中添加。水性介质可以与孵育时相同，也可以不同。通过使上述细胞与上述片段化细胞外基质成分在水性介质中接触并进行孵育，片段化细胞外基质成分配置于上述细胞彼此的间隙，能够制造细胞与片段化细胞外基质成分三维地均匀分布的三维组织体。因此，在进一步包含使上述细胞与上述片段化细胞外基质成分在水性介质中接触的工序的情况下，将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在马血清的存在下进行孵育的步骤也可以是在马血清的存在下将上述片段化细胞外基质成分接触过的上述细胞进行孵育的工序。此时，所制造的含有血管细胞的组织体是含有血管细胞的三维组织体。

“水性介质”是指以水为必须构成成分的液体。作为水性介质，只要片段化细胞外基质成分能够稳定地存在的介质，就没有特别限制。例如，作为水性介质，可举出磷酸缓冲生理盐水(PBS)等生理盐水、Dulbecco’sModified Eagle培养基(DMEM)、F12K培养基、血管内皮细胞专用培养基(EGM2)等液体培养基，但不限于此。

水性介质的pH优选不对细胞的生长及细胞集合体的形成产生不良影响的范围。从减轻投入细胞时对细胞的负荷的观点出发，水性介质的pH例如可以为7.0以上，且可以为8.0以下。具体而言，水性介质的pH可以为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。水性介质优选在上述pH的范围内具有缓冲能力，更优选为液体培养基。液体培养基没有特别限制，可以根据所要培养的细胞的种类选择适当的培养基。作为该培养基，例如可举出Eagle’s MEM培养基、DMEM、F12K培养基、Modified Eagle培养基(MEM)、MinimumEssential培养基、RPMI、及GlutaMax培养基等。培养基可以是添加有血清的培养基，也可以是无血清培养基。此外，液体培养基也可以是混合有两种以上的培养基的混合培养基。

片段化细胞外基质成分通过分散在水性介质中，在水性介质中变得容易与细胞接触，能够促进三维组织体的形成。作为接触工序，可举出将含有片段化细胞外基质成分的水性介质与含有细胞的水性介质混合的方法、在含有片段化细胞外基质成分的水性介质中添加细胞的方法、在含有细胞的培养液中加入含有细胞外基质成分的水性介质的方法、在含有细胞外基质细胞外基质成分的水性介质中加入细胞的方法、在预先准备的水性介质中分别加入细胞外基质成分及细胞的方法等方法，但不限于这些。

接触工序中的片段化细胞外基质成分的浓度可以根据目标三维组织体的形状、厚度、培养器的尺寸等适当决定。例如，接触工序中的水性介质中的片段化细胞外基质成分的浓度可以为0.1～90质量％，也可以为1～30质量％。

接触工序中的片段化细胞外基质成分的量例如相对于1.0×10⁶cells的细胞可以为0.1～100mg、0.5～50mg、0.8～25mg、1.0～10mg、1.0～5.0mg、1.0～2.0mg、或1.0～1.8mg，可以为0.7mg以上、1.1mg以上、1.2mg以上、1.3mg以上或1.4mg以上，且可以为7.0mg以下、3.0mg以下、2.3mg以下、1.8mg以下、1.7mg以下、1.6mg以下或1.5mg以下。

在接触工序中，片段化细胞外基质成分与细胞的质量比(片段化细胞外基质成分/细胞)优选为1/1～1000/1，更优选为9/1～900/1，进一步优选为10/1～500/1。

另外，接触工序中的片段化细胞外基质成分的量相对于培养基整体的重量可以为0.1重量％～10重量％、0.5重量％～8重量％、或1～5重量％。

三维组织体的制造方法的一个实施方式在接触工序、或接触工序后且培养工序前可以包含将纤维蛋白原和凝血酶同时或分别混合的步骤。通过将纤维蛋白原和凝血酶混合，它们将反应而形成纤维蛋白。纤维蛋白原的含量例如相对于培养基可以为1～10mg/mL、可以为2～8mg/mL、也可以为5～6mg/mL。

在接触工序后且孵育工序前还可以包含使水性介质中的片段化细胞外基质成分与细胞一起沉降的工序。通过进行这样的工序，三维组织体中的片段化细胞外基质成分及细胞的分布变得更为均匀。作为具体的方法，没有特别限制，例如可举出对含有片段化细胞外基质成分和细胞的培养液进行离心操作的方法。

上述的孵育前的培养基中的细胞密度可以与接触工序中的水性介质中的细胞密度相同。

作为一个实施方式，本发明还提供一种脂肪来源干细胞的分化促进方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在马血清的存在下进行孵育的步骤。如上所述，通过在马血清的存在下孵育脂肪来源干细胞，能够促进脂肪来源干细胞向血管细胞的分化。本实施方式的方法也可以用于包含细胞的孵育的组织体的制造中，组织体的制造可以是三维培养，也可以是二维培养。

细胞、孵育、片段化细胞外基质成分及各工序等、本实施方式的方法中的具体的方式等可以没有限制地适用上述的具体的方式等。例如，在本实施方式的方法中，也可以包含在孵育前使上述细胞与上述片段化细胞外基质成分在水性介质中接触的工序。

另外，本实施方式的方法也可以是三维组织体的制造方法中的脂肪来源干细胞的分化促进方法。

三维组织体、细胞、孵育、片段化细胞外基质成分及各工序等、本实施方式的方法中的具体的方式等可以没有限制地适用上述的具体的方式等。

实施例

以下，基于实施例对本发明更具体地进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施例。

在组织体的制作中使用的细胞、试剂及制作方法等如下所述。

(细胞和胶原蛋白)

·皮下脂肪来源干细胞(ADSC、牛来源、由食肉用牛肉通过常规方法采集)

·牛血浆来源纤维蛋白原I-S型(Sigma公司#F8630)

·马血清(HS、ThermoFisher#16050130)

·胎牛血清(FBS、ThermoFisher#26140)

·小牛血清(Calf serum、GE Health care#SH30118)

·人血清(Human serum、Lonza#4W-820)

(培养基和各种溶液)

·DMEM培养基(高葡萄糖、Nacalai Tesque公司)

·F12K培养基(ThermoFisher#21127022)

·50mg/mL纤维蛋白原储备溶液：将50mg的纤维蛋白原称取到Eppendorf管中，立即加入DMEM(0％FBS、1％抗生素)1mL。手动摇管混合后，在37℃的水浴中放置3～5分钟，用孔径为0.2μm的过滤器过滤，等量分注到Eppendorf管中后使用。

制造例1

如下通过二维培养制作组织体。

准备48孔板(IWAKI公司制)。在各孔中接种5000(cells/孔)的牛皮下脂肪来源干细胞，分别使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基、含有10％胎牛血清的F12K培养基、含有10％马血清的DMEM培养基以及含有10％马血清的F12K培养基1mL，培养7天。

将所得到的各组织体进行CD31免疫染色，使用共焦定量图像细胞仪CQ(YOKOGAWA)进行荧光观察，将得到的照片示于图1。“×4”及“×20”表示在各个培养基中，以4倍(左)及20倍(右)的倍率观察时的照片。

在使用含有胎牛血清的培养基制作的组织体中，未确认到内皮形成。另一方面，使用含有马血清的FK12培养基制作的组织体中，显示了内皮形成进展、构建了血管网。未观察到DMEM培养基和F12K培养基的不同所导致的差异。显示了通过添加马血清，脂肪来源干细胞向血管细胞的分化得到促进。

制造例2

如下通过二维培养制作组织体。

与制造例1同样地准备48孔板。在含有10％马血清的F12K培养基或DMEM培养基200μL中，将5×10⁵cells/mL或1×10⁶cells/mL的牛皮下脂肪来源干细胞培养7天，然后接种于各孔上，48小时后对得到的各组织体通过CD31免疫染色及基于Hoechst的对比染色进行评价。

将使用共焦定量图像细胞仪CQ(YOKOGAWA)进行荧光观察而得到的照片示于图2。右侧所观察到的白色点状的是核。

在细胞数为5×10⁵cells和1×10⁶cells的任一情况下，均确认到通过内皮形成在细胞间构建了血管网。未确认到DMEM培养基和F12K培养基的不同所导致的差异。显示了无论细胞数如何，通过添加马血清，脂肪来源干细胞向血管细胞的分化得到促进。

制造例3

如下通过二维培养制作组织体。

在24孔或48孔板(IWAKI公司制)中接种5000(cells/孔)的牛皮下脂肪来源干细胞，在分别含有1％、5％及10％的马血清的DMEM培养基1mL中培养7天，得到组织体。

对所得到的各组织体通过CD31免疫染色和基于Hoechst的对比染色进行评价。将使用共焦定量图像细胞仪CQ(YOKOGAWA)进行荧光观察而得到的照片示于图3。在各个马血清含量下，细胞浓度达到2600(cells/cm²)的是使用了24孔板的结果，达到5200(cells/cm²)的是使用了48孔板的结果。

与使用1％马血清的情况相比，确认了在使用5％马血清的情况下，内皮形成较有进展，在使用10％马血清的情况下，内皮形成进一步进展。显示出所添加的马血清越多，脂肪来源干细胞向血管细胞的分化越得到促进。

制造例4

如下通过二维培养制作组织体。

在24孔或48孔板(IWAKI公司制)中接种5000(cells/孔)的牛皮下脂肪来源干细胞，在分别含有10％的胎牛血清、胎牛血清、马血清、以及人血清的DMEM培养基1mL中培养7天，得到组织体。

对所得到的各组织体通过CD31免疫染色和基于Hoechst的对比染色进行评价。将使用共焦定量图像细胞仪CQ(YOKOGAWA)进行荧光观察而得到的照片示于图4。在各个培养基中，细胞浓度达到2600(cells/cm²)的是使用了24孔板的结果，达到5200(cells/cm²)的是使用了48孔板的结果。

在使用马血清制作的组织体中，确认了通过内皮形成在细胞间构建了血管网，但在使用胎牛血清、胎牛血清、以及人血清制作的组织体中，并未发现内皮形成进展到那种程度。与使用其他血清的情况相比，明显地，在使用马血清的情况下，内皮形成较有进展。由此显示了，通过添加马血清，脂肪来源干细胞向血管细胞的分化得到促进。

制造例5

如下通过三维培养制作三维组织体

通过在200℃下对猪皮来源的胶原蛋白I型海绵片段(日本Ham株式会社制)100mg进行24小时加热，得到至少一部分交联的胶原蛋白成分(交联胶原蛋白成分)。需要说明的是，在200℃的加热前后，胶原蛋白在外观上没有确认到大的变化。将50mg的交联胶原蛋白成分放入15mL试管中，加入5mL的超纯水，使用均化器(AS ONE公司VH-10)进行6分钟的均化，由此对交联胶原蛋白成分进行解纤。

在21℃的条件下，以10000rpm离心10分钟。抽吸上清液，将胶原料粒与5mL的新的超纯水混合，制作胶原蛋白溶液。在将装有胶原蛋白溶液的试管维持在冰上的状态下，使用超声发生器(Sonics and Materials公司VC50)以100V进行20秒的超声波处理，从超声发生器取出后将装有胶原蛋白溶液的试管在冰上冷却10秒，反复进行100次。进行100次超声波处理后，用孔径为40μm的过滤器过滤胶原蛋白溶液，得到含有经解纤的胶原蛋白成分(CMF)的分散液。通过利用常规方法使分散液冷冻干燥，得到干燥体形式的解纤胶原蛋白成分(CMF)。CMF的平均长度(长度)为14.8±8.2μm(N＝20)。

使用培养基(F12K)以浓度达到10mg/mL的方式将片段化胶原蛋白分散后，将纤维蛋白原和细胞混合，得到解纤胶原蛋白成分(最终浓度为1.2重量％)、纤维蛋白原(最终浓度为6mg/mL)和牛皮下脂肪来源干细胞(最终浓度为2×10⁶cells/mL)的混合物，将该混合物30μL接种于24孔板Transwell(IWAKI公司制)中。在所接种的混合物中加入含有10％马血清的培养基2mL进行培养。每隔2天更换培养基，培养至培养第10天，得到三维组织体。

对得到的各三维组织体进行CD31免疫染色，并通过Hoechst染色对核进行染色。将使用共焦定量图像细胞仪CQ(YOKOGAWA)进行荧光观察而得到的照片示于图5。左侧是观察仅CD31免疫染色而得到的照片，右侧是观察CD31免疫染色和Hoechst染色而得到的照片。右侧观察到的白色点状的是核。

在使用含有10％马血清的FK12培养基制作的三维组织体中，确认了通过内皮形成在细胞间构建了血管网。显示了通过添加马血清，脂肪来源干细胞向血管细胞的分化得到促进。

制造例6

如下通过二维培养制作组织体，观察牛皮下脂肪来源干细胞的培养和向牛内皮细胞的分化。

准备48孔板(IWAKI公司制)。在各孔中接种预先在DMEM培养基中培养的第一传代的牛皮下脂肪来源干细胞5000(cells/孔)，分别使用以下的不同的8个培养基，在每2～3天更换培养基的情况下培养7天。

(1)含有1％马血清的DMEM培养基

(2)含有5％马血清的DMEM培养基

(3)含有10％马血清的DMEM培养基

(4)含有10％胎牛血清的DMEM培养基

(5)含有10％人血清的DMEM培养基

(6)含有10％小牛血清的DMEM培养基

(7)含有10％马血清的F12K培养基

(8)含有10％胎牛血清的F12K培养基

需要说明的是，(1)～(8)的培养基均含有1％的抗菌药-抗真菌药混合溶液。

对所得到的各组织体进行CD31免疫染色定量(n＝3)，进行基于DMEM培养基中的血清条件的不同的比较，将结果示于图6(one-way unpaired ANOVA with a Tukey’s HSDpost-test，单因素不配对方差分析的Tukey’s HSD多重比较)。显示了在添加马血清的情况下，特别是在添加了5％和10％的马血清的情况下，脂肪来源干细胞向内皮细胞的分化得到促进。

另外，对得到的各组织体进行CD31免疫染色定量(n＝3)，在不同的基础培养基中分别使用10％马血清及10％胎牛血清，将结果示于图7(two-ways unpaired ANOVA with aSidak post-test，双因素不配对方差分析的Sidak多重比较)。在使用含有10％马血清的FK12培养基和DMEM培养基制作的组织体中，与使用含有10％胎牛血清的FK12培养基和DMEM培养基制作的组织体相比，显示了脂肪来源干细胞向内皮细胞的分化得到促进。在此，也未确认到DMEM培养基和F12K培养基的不同所带来的显著差异。

Claims (16)

1.一种含有血管细胞的组织体的制造方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在马血清的存在下进行孵育的步骤。

2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，含有血管细胞的组织体具有血管网。

3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，至少包含脂肪来源干细胞的细胞不包含血管细胞。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，在所述马血清的存在下进行孵育的步骤是在含有所述马血清的培养基中进行孵育的步骤。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，所述脂肪来源干细胞是牛来源的。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，孵育进行144小时以上。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞与片段化细胞外基质成分一起在马血清的存在下进行孵育的步骤。

8.根据权利要求7所述的制造方法，其中，在含有所述血管细胞的组织体中，所述片段化细胞外基质成分配置于所述细胞彼此的间隙。

9.根据权利要求7或8所述的制造方法，其中，所述片段化细胞外基质成分为片段化胶原蛋白成分。

10.根据权利要求7～9中任一项所述的制造方法，其包含在孵育前使所述细胞与所述片段化细胞外基质成分在水性介质中接触的工序，其中，

将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在马血清的存在下进行孵育的步骤是在马血清的存在下将所述片段化细胞外基质成分接触过的所述细胞进行孵育的工序，

含有所述血管细胞的组织体是含有血管细胞的三维组织体。

11.一种脂肪来源干细胞的分化促进方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在马血清的存在下进行孵育的步骤。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，在所述马血清的存在下进行孵育的步骤是在含有所述马血清的培养基中进行孵育的步骤。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述脂肪来源干细胞是牛来源的。

14.根据权利要求11～13中任一项所述的方法，其中，孵育进行144小时以上。

15.根据权利要求11～14中任一项所述的方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞与片段化细胞外基质成分在马血清的存在下进行孵育的步骤。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述片段化细胞外基质成分为片段化胶原蛋白成分。

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