JP7526397B2 - 細胞構造体及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞構造体及びその製造方法に関する。

動脈硬化は、人々が健康に暮らすために回避すべき問題である。また、動脈硬化は、血管壁内部で生じた炎症反応に誘引されて浸潤した免疫細胞がその場に滞留し続けてしまうことに関連すると言われている。

動脈硬化等の血管疾患の研究、予防又は治療のための薬剤のスクリーニングに用いることができる、血管平滑筋細胞を含む血管モデルを構築するための研究が行われている。例えば、非特許文献１には、交互積層法（Ｌａｙｅｒ－ｂｙ－ｌａｙｅｒ：Ｌｂ法）により、平滑筋細胞層と内皮細胞層からなる三次元細胞構造体を作製することが開示されている。

より多くの細胞外マトリックスを含むことができ、また、免疫細胞を含むことで血管疾患モデルとして利用可能な細胞構造体及びその製造方法が依然として求められている。

M.Matsusaki, U. Yokoyama et al., Atherosclerosis, 2014, 233, 590.

本発明は、平滑筋細胞、血管内皮細胞及び細胞マトリックスを有し、免疫細胞を含む細胞構造体及びその製造方法を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は、例えば以下の各発明に関する。

［１］ 免疫細胞を含む細胞構造体の製造方法であって、
水性媒体中で平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合し、インキュベートして平滑筋細胞層を形成すること、及び上記平滑筋細胞層に血管内皮細胞を接触させ、インキュベートして、上記平滑筋細胞層と接する血管内皮細胞層を形成することと、を含む細胞構造体の作製工程と、
上記細胞構造体に炎症促進剤を接触させる工程と、
上記細胞構造体に免疫細胞を接触させる工程とを含む、方法。
［２］ 上記細胞構造体に免疫細胞を接触させる工程が、上記免疫細胞を上記血管内皮細胞層に接触させることを含む、［１］に記載の製造方法。
［３］ 上記断片化細胞外マトリックスが配列番号１で示される配列（ＧＶＧＶＰ配列）及び／又は配列番号２で示される配列（ＶＧＶＡＰＧ配列）を有する、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ 上記断片化細胞外マトリックスがエラスチンである、［３］に記載の製造方法。
［５］ 上記炎症促進剤が、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ又はリポタンパク質である、［１］から［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ 上記リポタンパク質が変性されたリポタンパク質である、［５］に記載の製造方法。
［７］ 平滑筋細胞及び断片化細胞外マトリックスを含む平滑筋細胞層と、
血管内皮細胞を含む血管内皮細胞層と、を有し、
上記平滑筋細胞層と上記血管内皮細胞層が接しており、
免疫細胞を含む、細胞構造体。
［８］ 上記平滑筋細胞層又は上記血管内皮細胞層に免疫細胞を含む、［７］に記載の細胞構造体。
［９］ 上記免疫細胞が内部にリポタンパク質を含む、［７］又は［８］に記載の細胞構造体。
［１０］ ［７］又は［８］に記載の細胞構造体を用いた薬剤の効果の評価方法。
［１１］ 薬剤を細胞構造体に投与する投与工程と、
上記薬剤を投与した細胞構造体における変化により、薬剤の効果を評価する評価工程と
を含む、［１０］に記載の評価方法。
［１２］ 上記薬剤が、動脈硬化抑制剤又は動脈硬化促進剤である、［１０］又は［１１］に記載の評価方法。
［１３］ 平滑筋細胞及び断片化細胞外マトリックスを含む平滑筋細胞層と、血管内皮細胞を含む血管内皮細胞層とを有する細胞構造体に、
炎症促進剤を接触させる工程、
免疫細胞を接触させる工程、
薬剤を細胞構造体に投与する投与工程、及び
上記薬剤を投与した細胞構造体における変化により、薬剤の効果を評価する評価工程
を含む、薬剤の効果の評価方法。
［１４］ 上記薬剤が、動脈硬化抑制剤又は動脈硬化促進剤である、［１３］に記載の評価方法。
［１５］ 上記細胞構造体に免疫細胞を接触させる工程が、上記免疫細胞を上記血管内皮細胞層に接触させることを含む、［１３］又は［１４］に記載の評価方法。

本発明によれば、平滑筋細胞、血管内皮細胞及び細胞マトリックスを有し、免疫細胞を含む細胞構造体及びその製造方法を提供することができる。当該細胞構造体は、免疫細胞を含むため、血管疾患を有する血管壁モデルとして使用することができる。また、当該細胞構造体に含まれる細胞外マトリックスの含有量は調整が容易であり、細胞外マトリックス含有率の高い細胞構造体を製造することも可能である。

試験例３における、ＣＤ１１ｂ染色及びＣＤ１４染色による細胞構造体の観察結果を示す写真である。 試験例３における、ＣＤ１１ｂ染色及びＣＤ１４染色による細胞構造体における蛍光面積の比較を行ったグラフである。 試験例４における、ＣＤ３１染色、ＣＤ５４染色及びＣＤ１０６染色による細胞構造体の観察結果（上から観察）を示す写真である。 試験例４における、ＣＤ５４染色による蛍光面積の比較を行ったグラフである。 試験例４における、（ａ）ＣＤ５４染色による蛍光面積の比較を行ったグラフ及び（ｂ）Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩを含まない場合における蛍光面積を１．０とした場合の蛍光面積の比率の比較を行ったグラフである。 試験例５における、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色による細胞構造体の観察結果を示す写真及び内皮細胞層を含む部分を一部拡大した写真である。 試験例５における、アセチル化低比重リポタンパク質の濃度に対する細胞構造体の内皮細胞層の厚さの変化を示すグラフである。 試験例５における、（ａ）ＣＤ３１染色による細胞構造体の観察結果及び（ｂ）α－ＳＭＡ染色による細胞構造体の観察結果を示す写真である。 試験例６における、ＣＤ３１染色による細胞構造体の観察結果を示す写真である。 試験例６における、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）の濃度に対する細胞構造体の内皮細胞層の厚さの変化を示すグラフである。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

［細胞構造体］
本実施形態に係る細胞構造体は、平滑筋細胞及び断片化細胞外マトリックスを含む平滑筋細胞層と、血管内皮細胞を含む血管内皮細胞層と、を有し、免疫細胞を含む。上記平滑筋細胞層と上記血管内皮細胞層は接している。本実施形態に係る細胞構造体は、血管疾患を有する血管壁の少なくとも一部の機能に類似した機能及び／又は血管疾患を有する血管壁の少なくとも一部の構造に類似した構造を有する生体組織モデルである、血管疾患を有する血管壁組織として用いることができる。

本明細書において「細胞構造体」とは、細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体（塊状の細胞集団）であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。少なくとも一部の細胞間には細胞外マトリックス成分が配置されていてよい。細胞構造体において、細胞同士が直接接している部分があってもよい。

細胞構造体の形状は特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、略球体状、楕円体状、略楕円体状、半球状、略半球状、半円状、略半円状、直方体状、略直方体状等が挙げられる。ここで、生体組織は、汗腺、リンパ管、脂腺等を含み、構成が細胞構造体より複雑である。そのため、細胞構造体と生体組織とは容易に区別可能である。また、細胞構造体は、支持体と接着した状態で塊状に集合したものであってもよく、支持体と接着していない状態で塊状に集合したものであってもよい。

細胞は体細胞又は生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、幹細胞であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能及び多分化能を有する細胞を意味する。幹細胞には、任意の細胞腫に分化する能力を持つ多能性幹細胞と、特定の細胞腫に分化する能力を持つ組織幹細胞（体性幹細胞とも呼ばれる）が含まれる。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。組織幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（例えば、骨髄由来幹細胞）、造血幹細胞及び神経幹細胞が挙げられる。

本実施形態に係る細胞構造体を構成する細胞の総数は、特に限定されるものではなく、構築する細胞構造体の厚み、形状、構築に使用する細胞培養容器の大きさ等を考慮して適宜決定される。

（平滑筋細胞層）
本実施形態に係る細胞構造体における、平滑筋細胞層は、平滑筋細胞及び断片化細胞外マトリックスを含む。

平滑筋細胞は、平滑筋を構成する紡錘形の細胞であり、主に消化管、膀胱、子宮、血管壁に分布している。平滑筋細胞は、例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ－ＳＭＣ）、冠状動脈平滑筋細胞（ＣＡＳＭＣ）、臍帯動脈平滑筋細胞（ＵＡＳＭＣ）、肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）、気管平滑筋細胞（ＴＳＭＣ）、気管支平滑筋細胞（ＢＳＭＣ）、子宮平滑筋細胞（ＨＵｔＳＭＣ）であってよい。細胞構造体を構成する平滑筋細胞としては、動物（例えばヒト）の大動脈から採取された初代細胞（初代平滑筋細胞）であってもよく、初代細胞を培養した細胞であってもよく、初代細胞を株化した培養細胞株であってもよく、幹細胞から人工的に分化させた細胞であってもよい。培養細胞株としては、例えば、Ｌｏｎｚａ社のヒト臍帯動脈由来平滑筋細胞（ＵＡＳＭＣ）の細胞株が挙げられる。分化させる幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞等が挙げられる。本実施形態に係る細胞構造体に含まれる平滑筋細胞は、非がん性であってよい。

細胞構造体における細胞の総数（Ｘ_０）に対する、平滑筋細胞の数（Ｘ_１）の比率（Ｘ_１／Ｘ_０×１００）は、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、又は６５％以上であってよく、９５％以下、９０％以下、８０％以下又は７５％以下であってよい。細胞構造体における細胞の総数（Ｘ_０）に対する、平滑筋細胞の数（Ｘ_１）の比率（Ｘ_１／Ｘ_０×１００）は、血管壁組織としてより一層好適である観点から、６０％以上８０％以下、又は６０％以上７０％以下であってよい。

平滑筋細胞層の厚さは、２０μｍ～５００μｍであることが好ましく、５０μｍ～２００μｍであることがより好ましい。平滑筋細胞層の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、４００μｍ以下であってもよいし、３００μｍ以下であってもよいし、２００μｍ以下であってもよいし、１００μｍ以下であってもよい。血管疾患（例えば、動脈硬化）を有する血管壁モデルとして用いる観点からは、平滑筋細胞層の厚さは、５０μｍ～１５０μｍであることが好ましい。

ここで、「細胞層の厚さ」とは、細胞構造体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における距離を意味する。

また、細胞構造体が球体状又は略球体状である場合、その直径方向における距離を意味する。さらにまた、細胞構造体が楕円体状又は略楕円体状である場合、その短径方向における距離を意味する。

（断片化細胞外マトリックス）
細胞外マトリックスは、細胞構造体において少なくとも一部の細胞間の隙間を埋める材料である。細胞外マトリックスは、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている、細胞外マトリックス分子の集合体であってよい。細胞外マトリックス分子は、生物において細胞の外に存在する物質であってもよい。細胞外マトリックスは、生体内に存在する分子と同一の分子である生体親和性材料であることが好ましい。細胞外マトリックス分子としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。細胞外マトリックス分子として、エラスチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、及びプロテオグリカン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックスは、これらを１種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。細胞外マトリックスは、例えば、エラスチンを含んでいてよく、エラスチンであってもよい。細胞外マトリックスがエラスチンである場合、エラスチンが細胞接着の足場として機能し、三次元的な細胞構造体の形成がより一層促進される。本実施形態における細胞外マトリックスは、動物細胞の外に存在する物質、すなわち動物の細胞外マトリックスであることが好ましい。なお、細胞外マトリックス分子は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよく、化学合成ペプチド等のポリペプチドであってもよい。

細胞外マトリックスは、エラスチンに特徴的なＧｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏで示される配列（以下「ＧＶＧＶＰ配列」とも表す、配列番号１）及び／又はＶａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙで示される配列（以下、「ＶＧＶＡＰＧ配列」とも表す、配列番号２）を有してよく、これらの配列の繰り返しを有していてよい。

細胞外マトリックスが、ＧＶＧＶＰ配列を有する場合、弾性の向上及びコアセルベーションが促進される。ＧＶＧＶＰ配列の繰り返しを有する細胞外マトリックスにおいて、ＧＶＧＶＰ配列の割合は、全アミノ酸配列のうち、８０％以上であってよく、好ましくは９５％以上である。また、細胞外マトリックス１分子にＧＶＧＶＰ配列が２以上含まれてよい。

ＶＧＶＡＰＧ配列については、細胞遊走・増殖等を惹起する機能が報告されている。ＶＧＶＡＰＧ配列の繰り返しを有する細胞外マトリックスにおいて、ＶＧＶＡＰＧ配列の割合は、全アミノ酸配列のうち、８０％以上であってよく、好ましくは９５％以上である。また、細胞外マトリックス１分子にＶＧＶＡＰＧ配列が２以上含まれてよい。

エラスチンとしては、例えば、血管由来のエラスチン、肺由来のエラスチン及び皮膚由来のエラスチンが挙げられる。血管壁モデルとして用いる観点からは、血管由来のエラスチンを用いることが好ましい。また、血管関連疾患（例えば、動脈硬化）を有する血管壁モデルとして用いる観点からは、大動脈由来のエラスチンを用いることが好ましい。また、エラスチンは、非水溶性エラスチン及び水溶性エラスチンのいずれを用いてもよいが、非水溶性エラスチンを用いることが好ましい。

コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン及び非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。

プロテオグリカンとして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。

細胞外マトリックスは、エラスチン、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよく、エラスチンを含むことが好ましい。エラスチンは好ましくは血管由来のエラスチンである。血管由来のエラスチンは、市販されているエラスチンを用いてもよく、その具体例としては、Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ製のヒト大動脈由来エラスチンが挙げられる。

細胞外マトリックスがＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンのように、複数の型の混合細胞外マトリックスを用いる場合には、精製することにより、単一の型の細胞外マトリックスに分離して用いてもよい。例えば、複数の型の混合細胞外マトリックスを含む溶液に塩を添加し、遠心分離することで複数の型の細胞外マトリックスを分離し、沈殿物又は上清を回収することで、目的の型の細胞外マトリックスのみを得ることができる。得られた目的の型の細胞外マトリックスは、さらに透析により塩を除去することもでき、透析の後、さらに凍結乾燥をしてもよい。

細胞外マトリックスは、動物由来の細胞外マトリックスであってよい。細胞外マトリックスの由来となる動物種として、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックスは、一種類の動物に由来する成分を用いてもよいし、複数種の動物に由来する成分を併用して用いてもよい。細胞外マトリックスの由来となる動物種は、三次元組織化する細胞の由来と同じであっても異なっていてもよい。

細胞外マトリックスの形状としては、例えば、線維状が挙げられる。線維状とは、糸状の細胞外マトリックスで構成される形状、又は糸状の細胞外マトリックスが分子間で架橋して構成される形状を意味する。細胞外マトリックスの少なくとも一部は、線維状であってよい。細胞外マトリックスの形状は、顕微鏡観察した際に観察されるひとかたまりの細胞外マトリックス（細胞外マトリックスの集合体）の形状であり、細胞外マトリックスは、好適には後述する平均径及び／又は平均長の大きさを有するものである。線維状の細胞外マトリックスには、複数の糸状細胞外マトリックス分子が集合して形成された細い糸状物（細線維）、細線維が更に集合して形成される糸状物、これらの糸状物を解繊したもの等が含まれる。形状が線維状である細胞外マトリックスを含むと、線維状の細胞外マトリックスでは、例えば、ＧＶＧＶＰ配列（配列番号１）及びＶＧＶＡＰＧ配列（配列番号２）が破壊されることなく保存されており、細胞接着のための足場材としてより一層効果的に機能することができる。

「断片化」とは、細胞外マトリックスの集合体をより小さなサイズにすることを意味する。断片化された細胞外マトリックス（「断片化細胞外マトリックス」とも称される）は、解繊された細胞外マトリックスを含んでもよい。解繊された細胞外マトリックスは、上述の細胞外マトリックスを物理的な力の印加により解繊したものである。例えば、解繊は、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われるものである。

断片化細胞外マトリックスは、解繊された細胞外マトリックスを少なくとも一部に含んでいてよい。また、断片化細胞外マトリックスは、解繊された細胞外マトリックスのみからなっていてもよい。すなわち、断片化細胞外マトリックスは、解繊された細胞外マトリックスであってよい。解繊された細胞外マトリックスは、解繊されたエラスチン（解繊エラスチン）を含むことが好ましい。解繊エラスチンは、エラスチンに由来する三重らせん構造を維持していることが好ましい。解繊エラスチンは、エラスチンに由来する三重らせん構造を部分的に維持している成分であってよい。断片化エラスチンは、水性媒体に分散させることにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、細胞構造体の形成を促進し得る。

断片化細胞外マトリックスの平均長は、１００ｎｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上２００μｍ以下であってよい。一実施形態において、断片化細胞外マトリックスの平均長は、厚い組織が形成しやすくなる観点から、５μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１０μｍ以上４００μｍ以下であってよく、２２μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００μｍ以上４００μｍ以下であってよい。他の実施形態において、断片化細胞外マトリックスの平均長は、組織形成が安定しやすくなる観点及び再分散性がより一層優れたものとなる観点から、１００μｍ以下であってよく、５０μｍ以下であってよく、３０μｍ以下であってよく、１５μｍ以下であってよく、１０μｍ以下であってよく、１μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上であってよい。断片化細胞外マトリックス全体のうち、大部分の断片化細胞外マトリックスの平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。具体的には、断片化細胞外マトリックス全体のうち９５％の断片化細胞外マトリックスの平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。断片化細胞外マトリックスは、平均長が上記範囲内である断片化エラスチンであることが好ましく、平均長が上記範囲内である解繊エラスチンであることがより好ましい。

断片化細胞外マトリックスの平均径は、例えば、２０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、２０ｎｍ以上１０μｍ以下であってもよい。

細胞構造体中の全断片化細胞外マトリックスの含有率は、例えば、断片化細胞外マトリックス及び細胞の合計質量を基準として、０．３３質量％以上、０．５質量％以上、又は５重量％以上であってよい。細胞構造体中の断片化細胞外マトリックスの含有量は、例えば、断片化された細胞外マトリックス及び細胞の合計質量を基準として、９０質量％以下、８０質量％以下、７０質量％以下、６０質量％以下、５０質量％以下、４０質量％以下、３０質量％以下、２０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、又は１質量％以下であってよい。細胞構造体中の断片化細胞外マトリックスの含有量は、例えば、断片化された細胞外マトリックス及び細胞の合計質量を基準として、０．３３質量％以上９０質量％以下であってよく、０．５質量％以上９０質量％以下であってよく、１．０質量％以上９０質量％以下であってよく、５重量％以上９０重量％以下であってよく、５重量％以上４０重量％以下であってよい。

上述の平均長及び平均径の範囲は、組織形成の観点から至適化されたものであるため、組織形成に用いる段階で上記の平均長又は平均径の範囲内に収まっていることが望ましい。

断片化細胞外マトリックスの平均長及び平均径は、光学顕微鏡によって個々の断片化細胞外マトリックスを測定し、画像解析することによって求めることが可能である。本明細書において、「平均長」は、測定した試料の長手方向の長さの平均値を意味し、「平均径」は、測定した試料の長手方向に直交する方向の長さの平均値を意味する。

細胞外マトリックスを断片化する方法は、特に制限はなく、物理的な力の印加によって断片化してよい。物理的な力の印加によって断片化された細胞外マトリックスは、酵素処理とは異なり、通常、分子構造は断片化する前とは変化しない（分子構造は維持されている。）。細胞外マトリックスを断片化する方法は、例えば、塊状の細胞外マトリックスを細かく砕く方法であってよい。細胞外マトリックスは、固相で断片化されてもよく、水性媒体中で断片化されてもよい。例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等の物理的な力の印加によって細胞外マトリックスを断片化してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックスをそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することで断片化細胞外マトリックスの平均径を調整することができる。例えば、細胞外マトリックス（例えば、エラスチン）を含む水性媒体に分散させた分散液をホモジナイズすること及びその後任意で水性媒体中で１０℃以下（例えば、４℃±１℃）でインキュベートすることが挙げられる。ホモジナイズすることの例としては、ホモジナイザーを用いてホモジナイズすること、攪拌すること、圧力をかけること等が挙げられ、スターラーを用いて攪拌してもよい。水性媒体は純水でもよく、リン酸を含有する水溶液（例えば、ＰＢＳバッファー）のような水溶液でもよい。また、ホモジナイズした後に１０℃以下（例えば、４℃±１℃）でインキュベートする時間は、例えば、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、４８時間以上、又は７２時間以上であってもよい。ホモジナイズする際の水性媒体（第１の水性媒体）と、細胞を培養する水性媒体は、同じでも異なっていてもよい。また、水性媒体は塩を含んでも含まなくてもよい。

細胞外マトリックスを水性媒体中で断片化する場合、断片化された細胞外マトリックスは、例えば、細胞外マトリックスを水性媒体中で断片化する工程と、断片化された細胞外マトリックス及び水性媒体を含む液から水性媒体を除去する工程（除去工程）とを含む方法によって製造することができる。除去工程は、例えば、凍結乾燥法により実施してよい。「水性媒体を除去する」とは、断片化された細胞外マトリックス成分中に一切の水分が付着していないことを意味するものではなく、上述の一般的な乾燥手法により、常識的に達することができる程度に水分が付着していないことを意味する。

断片化細胞外マトリックスの少なくとも一部は分子間又は分子内で架橋されていてよい。断片化された細胞外マトリックスは、断片化された細胞外マトリックスを構成する分子内で架橋されていてもよく、断片化された細胞外マトリックスを構成する分子間で架橋されていてよい。

架橋する方法としては、例えば、熱、紫外線、放射線等の印加による物理架橋、架橋剤、酵素反応等による化学架橋等による方法が挙げられるが、その方法は特に限定されない。架橋（物理架橋及び化学架橋）は、共有結合を介した架橋であってよい。

断片化エラスチンにおいて、架橋は、エラスチン分子（三重らせん構造）の間で形成されていてもよく、エラスチン分子によって形成されたエラスチン細線維の間で形成されていてもよい。架橋は、熱による架橋（熱架橋）であってよい。熱架橋は、例えば、真空ポンプを使って減圧下で、加熱処理を行うことにより実施することができる。エラスチン分子の熱架橋を行う場合、解繊エラスチンは、エラスチン分子のアミノ基が同一又は他のエラスチン分子のカルボキシ基とペプチド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）を形成することにより、架橋されていてよい。

断片化細胞外マトリックスは架橋剤を使用することによっても、架橋させることができる。架橋剤は、例えば、カルボキシル基とアミノ基を架橋可能なもの、又はアミノ基同士を架橋可能なものであってよい。架橋剤としては、例えば、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系及びイミダゾール系架橋剤が経済性、安全性及び操作性の観点から好ましく、具体的には、グルタルアルデヒド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドを挙げることができる。

架橋度の定量は、断片化細胞外マトリックスの種類、架橋する手段等に応じて、適宜選択することができる。架橋度は、１％以上、２％以上、４％以上、８％以上、又は１２％以上であってよく、３０％以下、２０％以下、又は１５％以下であってもよい。

細胞外マトリックス分子中のアミノ基が架橋に使用される場合、架橋度は、非特許文献２等に記載されているＴＮＢＳ法に基づき定量することが可能である。ＴＮＢＳ法による架橋度が、上述の範囲内であってもよい。ＴＮＢＳ法による架橋度は、細胞外マトリックスが有するアミノ基のうち架橋に使われているアミノ基の割合である。

架橋度は、カルボキシル基を定量することにより、算出してもよい。例えば、水に不溶性の細胞外マトリックスの場合、ＴＢＯ（トルイジンブルーＯ）法により定量してもよい。ＴＢＯ法による架橋度が、上述した範囲内であってもよい。

細胞構造体における細胞外マトリックスの含有量は、細胞構造体の乾燥重量を基準として、０．０１質量％以上、０．０５質量％以上、０．１質量％以上、０．５質量％以上、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上、８質量％以上、９質量％以上、１０質量％、１５質量％以上、２０質量％以上、２５質量％以上、又は３０質量％以上であってよく、９０質量％以下、８０質量％以下、７０質量％以下、６０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、２０質量％以下、又は１５質量％以下であってよい。細胞構造体における細胞外マトリックスの含有量は、細胞構造体の乾燥重量を基準として、０．０１～９０質量％であってよく、１０～９０質量％、１０～８０質量％、１０～７０質量％、１０～６０質量％、１～５０質量％、１０～５０質量％、１０～３０質量％、又は２０～３０質量％であってよい。

ここで、「細胞構造体における細胞外マトリックス」とは、細胞構造体を構成する細胞外マトリックスを意味し、内因性細胞外マトリックスに由来していてもよく、外因性細胞外マトリックスに由来していてもよい。

「内因性の細胞外マトリックス」とは、細胞外マトリックス産生細胞が産生する細胞外マトリックスを意味する。細胞外マトリックス産生細胞としては、例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられる。内因性細胞外マトリックスは、線維性であってもよいし、非線維性であってもよい。

「外因性の細胞外マトリックス」とは、外部から供給される細胞外マトリックスを意味する。本実施形態に係る細胞構造体は、外因性の細胞外マトリックスである断片化された細胞外マトリックスを含む。外因性の細胞外マトリックスは、由来となる動物種が内因性の細胞外マトリックスと同じであっても異なっていてもよい。由来となる動物種としては、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられる。また、外因性の細胞外マトリックスは、人工の細胞外マトリックスであってもよい。

細胞外マトリックスがエラスチンである場合には、外因性の細胞外マトリックスは「外因性エラスチン」とも称され、外部から供給されるエラスチンを意味する「外因性エラスチン」は、複数のエラスチン分子によって形成されている、エラスチン分子の集合体である。外因性エラスチンは、血管由来のエラスチンであることが好ましく、大動脈由来のエラスチンであることがより好ましい。エラスチンは、市販されているエラスチンを用いてもよく、その具体例としては、Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ製のヒト大動脈由来エラスチンが挙げられる。

外因性の細胞外マトリックスにおいて、由来する動物種は、細胞とは異なっていてよい。また、細胞が、細胞外マトリックス産生細胞を含む場合、外因性の細胞外マトリックスにおいて、由来する動物種は、細胞外マトリックス産生細胞とは異なっていてもよい。つまり、外因性の細胞外マトリックスは、異種細胞外マトリックスであってよい。

すなわち、細胞構造体が内因性細胞外マトリックス及び断片化された細胞外マトリックスを含む場合、上記細胞構造体を構成する細胞外マトリックス含有率は、内因性細胞外マトリックス及び断片化された細胞外マトリックスの合計量を意味する。上記細胞外マトリックス含有率は、得られた細胞構造体の体積、及び脱細胞化した細胞構造体の質量から算出することが可能である。

例えば、細胞構造体に含まれる細胞外マトリックスがコラーゲンである場合、細胞構造体におけるコラーゲン量を定量する方法としては、例えば、以下のようなヒドロキシプロリンを定量する方法が挙げられる。細胞構造体を溶解した溶解液に、塩酸（ＨＣｌ）を混合し、高温で所定の時間インキュベートした後に室温に戻し、遠心分離した上澄みを所定の濃度に希釈することでサンプルを調製する。ヒドロキシプロリンスタンダード溶液をサンプルと同様に処理した後、段階的に希釈してスタンダードを調製する。サンプル及びスタンダードのそれぞれに対してヒドロキシプロリンアッセイバッファ及び検出試薬で所定の処理をし、５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。なお、細胞構造体を、高濃度の塩酸に直接懸濁して溶解した溶解液を遠心分離して上澄みを回収し、コラーゲン成分定量に用いてもよい。また、溶解させる細胞構造体は、培養液から回収したままの状態であってもよいし、回収後に乾燥処理を行い、液体成分を除去した状態で溶解させてもよい。但し、培養液から回収したままの状態の細胞構造体を溶解してコラーゲン成分定量を行う場合、細胞構造体が吸収している培地成分、及び実験手技の問題による培地の残りの影響で、細胞構造体重量の計測値がばらつくことが予想されるため、組織体の重量及び単位重量あたりに占めるコラーゲン量を安定して計測する観点からは、乾燥後の重量を基準とすることが好ましい。

コラーゲン量を定量する方法として、より具体的には、例えば、以下のような方法が挙げられる。

（サンプルの調製）
凍結乾燥処理を行った細胞構造体の全量を６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌと混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間以上インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌで適宜希釈した後、２００μＬを１００μＬの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは３５μＬ用いる。

（スタンダードの調製）
スクリューキャップチューブに１２５μＬのスタンダード溶液（１２００μｇ／ｍＬ ｉｎ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）と、１２５μＬの１２ｍｏｌ／ｌ ＨＣｌを加え混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して３００μｇ／ｍＬのＳ１を作製し、Ｓ１を段階的に希釈してＳ２（２００μｇ／ｍＬ）、Ｓ３（１００μｇ／ｍＬ）、Ｓ４（５０μｇ／ｍＬ）、Ｓ５（２５μｇ／ｍＬ）、Ｓ６（１２．５μｇ／ｍＬ）、Ｓ７（６．２５μｇ／ｍＬ）を作製する。４ｍｏｌ／ｌ ＨＣｌ９０μＬのみのＳ８（０μｇ／ｍＬ）も準備する。

（アッセイ）
３５μＬのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙキット付属、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加える。７５μＬのアッセイバッファ（上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、２０分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、７５μＬのｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ （ｒｅａｇｅｎｔ Ａ：Ｂ＝３０μＬ：４５μＬ、上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、６０℃で６０分インキュベートする。氷上で十分に冷まし、シールをはがして５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。

細胞構造体中に占めるエラスチンを、その面積比又は体積比によって規定してもよい。「面積比又は体積比によって規定する」とは、例えば細胞構造体中のエラスチンを既知の染色手法（例えば、抗エラスチン抗体を用いた免疫染色）等で他の組織構成物と区別可能な状態にした上で、肉眼観察、各種顕微鏡及び画像解析ソフト等を用いて、細胞構造体全体に占めるエラスチンの存在領域の比率を算出することを意味する。面積比で規定する場合、細胞構造体中の如何なる断面もしくは表面によって面積比を規定するかは限定されないが、例えば細胞構造体が球状体等である場合には、その略中心部を通る断面図によって規定してもよい。

例えば、細胞構造体中のエラスチンを面積比によって規定する場合、その面積の割合は、上記細胞構造体の全体の面積を基準として０．０１～９９％であり、１～９９％であることが好ましく、５～９０％であることが好ましく、７～９０％であることが好ましく、２０～９０％であることが好ましく、５０～９０％であることがより好ましい。「細胞構造体におけるエラスチン」については、上述したとおりである。細胞構造体を構成するエラスチンの面積の割合は、内因性エラスチン及び外因性エラスチンを合わせた面積の割合を意味する。エラスチンの面積の割合は、例えば、得られた細胞構造体を染色し、細胞構造体の略中心部を通る断面の全体の面積に対する、染色したエラスチンの面積の割合として算出することが可能である。

細胞構造体は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような細胞構造体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における細胞構造体の質量から算出できる。

上記細胞構造体は、エラスターゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でエラスターゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であってもよく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような細胞構造体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。

上記細胞構造体の厚さは１０μｍ以上であることが好ましく、１００μｍ以上であることがより好ましく、１０００μｍ以上であることが更により好ましい。このような細胞構造体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。細胞構造体の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍｍ以下であってもよいし、３ｍｍ以下であってもよいし、２ｍｍ以下であってもよいし、１．５ｍｍ以下であってもよいし、１ｍｍ以下であってもよい。

ここで、「細胞構造体の厚さ」とは、細胞構造体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。

また、細胞構造体が球体状又は略球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、細胞構造体が楕円体状又は略楕円体状である場合、その短径を意味する。細胞構造体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、細胞構造体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。

（血管内皮細胞層）
本実施形態に係る細胞構造体における、血管内皮細胞層は、血管内皮細胞を含む。

血管内皮細胞は、血管内腔の表面を構成する扁平状の細胞を意味する。血管内皮細胞は、例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であってよい。細胞構造体を構成する血管内皮細胞としては、動物（例えばヒト）の臍帯静脈又は臍帯動脈から採取された初代細胞（初代血管内皮細胞）であってもよく、初代細胞を培養した細胞であってもよく、初代細胞を株化した培養細胞株であってもよく、幹細胞から人工的に分化させた細胞であってもよい。培養細胞株としては、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製の製品型番Ｔ００５６の培養細胞株が挙げられる。分化させる幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。本実施形態に係る細胞構造体に含まれる血管内皮細胞は、非がん性細胞であってよい。

細胞構造体における細胞の総数（Ｘ_０）に対する、血管内皮細胞の数（Ｘ_２）の比率（Ｘ_２／Ｘ_０×１００）は、５％以上、１０％以上、１２％以上、１４％以上、１５％以上、２０％以上、又は２５％以上であってよく、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、又は１８％以下であってよい。細胞構造体における細胞の総数（Ｘ_０）に対する、血管内皮細胞の数（Ｘ_２）の比率（Ｘ_２／Ｘ_０×１００）は、血管壁組織としてより一層好適である観点から、５％以上４０％以下、５％以上３５％以下、１０％以上３５％以下、１０％以上２５％以下、又は１２％以上２０％以下であってよい。

血管内皮細胞層がさらに断片化細胞外マトリックスを含んでもよい。

血管内皮細胞層の厚さは、５μｍ～３０μｍであることが好ましく、５μｍ～１５μｍであることがより好ましい。血管内皮細胞層の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、３０μｍ以下であってもよいし、２０μｍ以下であってもよいし、１０μｍ以下であってもよい。血管内皮細胞層が通常より厚くなる疾患（例えば、動脈硬化）を有する血管壁モデルとして用いる観点からは、血管内皮細胞層の厚さは、５μｍ～１５μｍであることが好ましい。

ここで、「細胞層の厚さ」とは、細胞構造体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における距離を意味する。

また、細胞構造体が球体状又は略球体状である場合、その直径方向における距離を意味する。さらにまた、細胞構造体が楕円体状又は略楕円体状である場合、その短径方向における距離を意味する。

平滑筋細胞と血管内皮細胞の細胞数の比（平滑筋細胞／血管内皮細胞）は、９／１～９９／１であってもよく、５０／５０～８０／２０であってもよく、２０／８０～５０／５０であってもよく、１０／９０～５０／５０であってもよい。

本実施形態の細胞構造体において、上記平滑筋細胞層と上記血管内皮細胞層は、少なくとも一部において接している。

本実施形態の細胞構造体は、免疫細胞を含む。

免疫細胞は、抗原を認識し、特異的に反応する能力をもち、免疫に関与する細胞を意味する。免疫細胞は、例えば、マクロファージ、その前駆細胞である単球、樹状細胞、又は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等のリンパ球であってよく、マクロファージ及び／又は単球であってもよい。免疫細胞は、例えば、ヒト末梢血単球細胞株（ＴＨＰ－１）であってよい。細胞構造体に含まれる免疫細胞としては、動物（例えばヒト）の末梢血又はリンパ液から採取された初代細胞（初代免疫細胞）であってもよく、初代細胞を培養した細胞であってもよく、初代細胞を株化した培養細胞株であってもよく、幹細胞から人工的に分化させた細胞であってもよい。培養細胞株としては、例えば、ＪＣＲＢ細胞バンクの細胞番号ＪＣＲＢ０１１２の培養細胞株が挙げられる。分化させる幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。本実施形態に係る細胞構造体に含まれる免疫細胞は、非がん性細胞であってよい。

細胞構造体における細胞の総数（Ｘ_０）に対する、免疫細胞の数（Ｘ_２）の比率（Ｘ_３／Ｘ_０×１００）は、５％以上、１０％以上、１２％以上、１４％以上、１５％以上、２０％以上、又は２５％以上であってよく、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、又は１８％以下であってよい。細胞構造体における細胞の総数（Ｘ_０）に対する、免疫細胞の数（Ｘ_３）の比率（Ｘ_３／Ｘ_０×１００）は、血管疾患を有する血管壁モデルとしての血管壁組織としてより一層好適である観点から、５％以上４０％以下、５％以上３５％以下、１０％以上３５％以下、１０％以上２５％以下、又は１２％以上２０％以下であってよい。

免疫細胞は、細胞構造体の表面に含まれてもよく、細胞構造体の内部に含まれてもよく、表面及び内部の両方に含まれてもよい。また、免疫細胞は、平滑筋細胞層又は血管内皮細胞層に含まれてもよく、平滑筋細胞層又は血管内皮細胞層の表面及び／又は内部に含まれてもよい。

細胞構造体が免疫細胞を含むことを確認するためには、例えば、細胞接着分子の発現が、免疫細胞を含まない細胞構造体と比較して増加しているかで判断することができる。細胞接着分子としては、例えば、活性化リンパ球の血管内皮細胞への結合に関与することが知られているＩＣＡＭ－１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１）が挙げられる。また、例えば、免疫細胞を含まない細胞構造体と比較して、単球の接着を示唆するＣＤ１１ｂの発現、及び／又は単球のマクロファージへの分化を示唆するＣＤ１４の発現が増加しているかで判断することもできる。ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４が共局在化していることは、細胞構造体がマクロファージを含むことを意味する。例えば、細胞構造体又は各層における単位面積（例えば、１ｍｍ^２）当たりのＣＤ１１ｂの９０％以上がＣＤ１４と共局在化していることが好ましい。同様に、例えば、平滑筋細胞層又は血管内皮細胞層の各層において細胞接着分子、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４等の発現を解析することで、免疫細胞が表面及び／又は内部に含まれているか判断することができる。

免疫細胞は、内部にリポタンパク質を含んでもよい。リポタンパク質としては、例えば、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、レムナント及びＬｐ（ａ）等が挙げられる。リポタンパク質は、変性されたリポタンパク質であってもよい。変性されたリポタンパク質としては、例えば、酸化リポタンパク質、糖化リポタンパク質及びアセチル化されたリポタンパク質が挙げられる。変性されたリポタンパク質は、例えば、酸化ＬＤＬ、糖化ＬＤＬ及びアセチル化ＬＤＬであってもよい。また、例えば、免疫細胞がマクロファージであり、アセチル化ＬＤＬを取り込んでいてもよい。

本実施形態において、細胞は、平滑筋細胞、血管内皮細胞及び免疫細胞以外の他の細胞を含んでいてもよい。他の細胞は、例えば、成熟した体細胞であってよく、幹細胞のような未分化な細胞であってもよい。体細胞の具体例としては、例えば、神経細胞、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、心筋細胞、膵島細胞、骨細胞、肺胞上皮細胞、脾臓細胞等が挙げられる。幹細胞としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞等が挙げられる。他の細胞は、正常細胞であってもよく、がん細胞のようにいずれかの細胞機能が亢進又は抑制されている細胞であってもよい。「がん細胞」とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。

細胞構造体に含まれる平滑筋細胞、血管内皮細胞、免疫細胞又は上記他の細胞の由来は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の哺乳類動物に由来する細胞であってよい。

本実施形態に係る細胞構造体は、生体の血管組織に近い構造であり、免疫細胞を含むため、血管疾患を有する血管壁モデル、例えば、動脈硬化血管壁モデルとして利用することができる。

［免疫細胞を含む細胞構造体の製造方法］
本実施形態に係る免疫細胞を含む細胞構造体の製造方法は、水性媒体中で平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合し、インキュベートして平滑筋細胞層を形成すること、及び上記平滑筋細胞層に血管内皮細胞を接触させ、インキュベートして、上記平滑筋細胞層と接する血管内皮細胞層を形成することと、を含む細胞構造体の作製工程と、
上記細胞構造体に炎症促進剤を接触させる工程と、
上記細胞構造体に免疫細胞を接触させる工程とを含む。

「水性媒体」とは、水を必須構成成分とする液体を意味する。水性媒体としては、断片化細胞外マトリックス及び細胞が安定に存在できるものであれば、特に制限はない。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の生理食塩水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、平滑筋細胞用培地（ＳＭＣＧＭ２）、血管内皮細胞用培地（ＥＧＭ２）、単球用培地（ＲＰＭＩ）等の液体培地が挙げられる。液体培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。細胞に対する負荷を軽減する観点から、水性媒体は液体培地であることが好ましい。培地は、平滑筋細胞を増殖させる際には、平滑筋細胞用培地を含むことが好ましく、血管内皮細胞を増殖させる際には、血管内皮細胞用培地を含むことが好ましく、免疫細胞を増殖させる際には、免疫細胞用培地を含むことが好ましい。培地が平滑筋細胞用培地及び血管内皮細胞用培地を含む場合には、その割合（平滑筋細胞用培地：血管内皮細胞用培地）は、１～５：１～５であることが好ましい。また、培地が平滑筋細胞用培地、血管内皮細胞用培地及び免疫細胞用培地を含む場合には、その割合（平滑筋細胞用培地：血管内皮細胞用培地：免疫細胞用培地）は、１～５：１～５：１～５であることが好ましい。

インキュベートする際に用いられる培養器（支持体）は、特に制限されず、例えば、ウェルインサート、低接着プレート、Ｕ字やＶ字等の底面形状を有するプレートであってよい。細胞を支持体と接着させたまま培養してもよく、細胞を支持体と接着させずに培養してもよく、培養の途中で支持体から引き離して培養してもよい。細胞を支持体と接着させずに培養する場合や、培養の途中で支持体から引き離して培養する場合には、細胞の支持体への接着を阻害するＵ字やＶ字等の底面形状を有するプレートや、低吸着プレートを用いることが好ましい。

インキュベートの方法は、特に制限はなく、細胞の種類に応じて好適な方法で行うことができる。例えば、インキュベート温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。インキュベート時の培地のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。インキュベート時間は、細胞構造体の作製全体について、１日～２週間であってもよく、１週間～２週間であってもよい。

〔細胞構造体の作製〕
水性媒体中で平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合し、インキュベートして平滑筋細胞層を形成すること、及び上記平滑筋細胞層に血管内皮細胞を接触させ、インキュベートして、上記平滑筋細胞層と接する血管内皮細胞層を形成することと、を含む工程により、細胞構造体を作製する。

（平滑筋細胞層の形成）
細胞構造体の作製は、水性媒体中で平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合し、インキュベートして平滑筋細胞層を形成することを含む。

断片化細胞外マトリックスは、水性媒体に分散させることにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、細胞構造体の形成を促進し得る。水性媒体中で細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合し、細胞と断片化細胞外マトリックスが分散することで細胞懸濁液が得られる。

水性媒体中で平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合する方法としては、断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体と平滑筋細胞を含有する水性媒体とを混合する方法、断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体に平滑筋細胞を添加する方法、平滑筋細胞を含む培養液に断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体を加える方法、断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体に平滑筋細胞を加える方法、予め用意した水性媒体に、断片化細胞外マトリックス及び平滑筋細胞をそれぞれ加える方法等の方法が挙げられるが、これらに限られるものではない。また、水性媒体中において、断片化細胞外マトリックスと平滑筋細胞をピペッティング等で攪拌してもよい。

水性媒体中で平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合する際の水性媒体（第２の水性媒体）は、上述した断片化細胞外マトリックスをホモジナイズする際の水性媒体（第１の水性媒体）と同じでもよく、異なっていてもよいが、平滑筋細胞用培地を含むことが好ましい。また、平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合する際の水性媒体が、平滑筋細胞用培地及び血管内皮細胞用培地を含んでいても、平滑筋細胞用培地、血管内皮細胞用培地及び免疫細胞用培地を含んでいてもよい。

平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合する水性媒体中の断片化細胞外マトリックスの濃度は、目的とする細胞構造体及び平滑筋細胞層の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、上記水性媒体中の断片化細胞外マトリックスの濃度は、０．１～９０重量％であってもよいし、１～３０重量％であってもよい。

平滑筋細胞と混合する断片化細胞外マトリックスの量、すなわち細胞懸濁液に含まれる量は、例えば、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓの平滑筋細胞に対して、０．１～１００ｍｇ、０．５～５０ｍｇ、０．８～２５ｍｇ、１．０～１０ｍｇ、１．０～５．０ｍｇ、１．０～２．０ｍｇ、又は１．０～１．８ｍｇであってよく、０．７ｍｇ以上、１．１ｍｇ以上、１．２ｍｇ以上、１．３ｍｇ以上又は１．４ｍｇ以上であってよく、７．０ｍｇ以下、３．０ｍｇ以下、２．３ｍｇ以下、１．８ｍｇ以下、１．７ｍｇ以下、１．６ｍｇ以下又は１．５ｍｇ以下であってもよい。また、断片化細胞外マトリックスと平滑筋細胞との質量比（断片化細胞外マトリックス／平滑筋細胞）は、１／１～１０００／１であることが好ましく、９／１～９００／１であることがより好ましく、１０／１～５００／１であることがさらに好ましい。

平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合した後、インキュベートする前に、フィブリノゲン及び／又はトロンビンを添加することを含んでもよい。フィブリノゲン及びトロンビンの両方を添加する場合には、例えば、フィブリノゲン及びトロンビンは同時に添加してもよく、先にフィブリノゲンを添加した後にトロンビンを添加してもよい。フィブリノゲン及び／又はトロンビンを添加するタイミングは特に制限されず、例えば、平滑筋細胞及び断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体に添加してもよく、平滑筋細胞及び断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体にフィブリノゲンを添加した後にトロンビンを添加してもよい。フィブリノゲン及び／又はトロンビンを添加することにより、インキュベート時に生じ得るシュリンクを抑制し、細胞構造体の形状及び大きさを制御しやすくすることができる。また、平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスの混合液をゲル化することができるため、当該混合液を培養器（支持体）に滴下した後、培養器から剥離しやすくすることができる。

また、本実施形態の製造方法は、平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合した後、インキュベートする前に、外力を加えて、平滑筋細胞及び断片化細胞外マトリックスを集積する工程を含んでもよい。このような工程を行うことで、細胞構造体における断片化細胞外マトリックス及び平滑筋細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば、細胞外マトリックスと平滑筋細胞とを含む水性媒体を遠心操作する方法が挙げられる。遠心分離の条件も適宜設定することができるが、例えば、２００～３０００ｒｐｍで１～１０分遠心することが挙げられる。

水性媒体中で混合した平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスをインキュベートすることで、断片化細胞外マトリックスが接触した平滑筋細胞が培養され、平滑筋細胞層が形成される。

細胞外マトリックスと平滑筋細胞とを含む水性媒体（細胞懸濁液）をインキュベートする方法は、特に制限はないが、例えば、インキュベート温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスを混合した水性媒体のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。インキュベート時間は、例えば、１日～２週間であってよく、２日～１週間であってよく、２日～５日であってよい。

細胞懸濁液をインキュベートする際に用いられる培養器（支持体）は、特に制限されず、例えば、ウェルインサート、低接着プレート、Ｕ字やＶ字等の底面形状を有するプレートであってよい。上記細胞を支持体と接着させたまま培養してもよく、上記細胞を支持体と接着させずに培養してもよく、培養の途中で支持体から引き離して培養してもよい。上記細胞を支持体と接着させずに培養する場合や、培養の途中で支持体から引き離して培養する場合には、細胞の支持体への接着を阻害するＵ字やＶ字等の底面形状を有するプレートや、低吸着プレートを用いることが好ましい。

インキュベート（培養）することにより、細胞懸濁液中の断片化された細胞外マトリックスが接触した平滑筋細胞が培養される。インキュベートは、断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を支持体に接着しない状態で行うことを含んでもよい。これにより、支持体に接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体を製造することができる。断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞が支持体に接着している場合には、支持体から断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離すことを含んでもよい。培養において断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞が最初から支持体に接着していない場合には、そのまま培養することで支持体に接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体を製造することができる。

支持体から断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離す方法は、特に制限されず、例えば、低接着性の支持体を使用し、培養液を追加することで細胞を支持体から引き離してもよく、器具等を利用して直接細胞を物理的に支持体から引き離してもよく、振動を与えることにより細胞を支持体から引き離してもよく、熱及び光等の刺激に反応することで支持体と細胞の結合が外れる機能性材料を表面に塗布した支持体を用い、刺激を与えることで細胞を支持体から引き離してもよい。培養液を追加することで細胞を支持体から引き離す場合の培養液には、本明細書に例示した培地等を使用することができる。

培養において、断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を最初から支持体に接着していない状態で培養する方法としては、例えば、断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を含む懸濁液をゲル化させ、培養液中にそっと滴下して培養する方法、及び高粘度の溶媒中において断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞の形状をある程度固定したのち、溶媒のみを取り除いて培養容器に移す方法が挙げられる。

培養において、支持体から上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離すタイミングは、特に制限されず、例えば、インキュベート開始から１日～７日に行ってもよく、１時間～２４時間に行ってもよく、１分～６０分に行ってもよく、５分～３０分に行ってもよく、１０分～２０分に行ってもよい。

支持体から断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離した後のインキュベート期間は、特に制限されず、１日以上であってよく、１日～２１日であってよく、３日～１４日であってよく、７日～１４日であってよい。

インキュベート（培養）における培地中の細胞密度は、目的とする細胞構造体及び平滑筋細胞層の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、培養における培地中の細胞密度は、１～１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよく、１０^３～１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよい。

細胞構造体における平滑筋細胞層の厚さは、２０μｍ～５００μｍであることが好ましく、５０μｍ～２００μｍであることがより好ましい。平滑筋細胞層の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、４００μｍ以下であってもよいし、３００μｍ以下であってもよいし、２００μｍ以下であってもよいし、１００μｍ以下であってもよい。血管疾患（例えば、動脈硬化）を有する血管壁モデルとして用いる観点からは、平滑筋細胞層の厚さは、５０μｍ～１５０μｍであることが好ましい。インキュベートにより、平滑筋細胞層が最終的に上記の好ましい厚さに形成されることが好ましい。

本実施形態に係る製造方法は、さらに、細胞外マトリックスを断片化する前に細胞外マトリックスを加熱して、細胞外マトリックスの少なくとも一部を架橋することを備えていてもよいし、断片化後かつ平滑筋細胞と混合する前に、細胞外マトリックスを加熱して、細胞外マトリックスの少なくとも一部を架橋することを備えていてよい。

架橋において、細胞外マトリックスを加熱する際の温度（加熱温度）及び時間（加熱時間）は適宜定めることができる。加熱温度は、例えば１００℃以上であってよく、２００℃以下であってよく、２２０℃以下であってよい。加熱温度は、具体的には、例えば、１００℃、１１０℃、１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１６０℃、１７０℃、１８０℃、１９０℃、２００℃、２２０℃等であってよい。加熱時間（上記加熱温度で保持する時間）は、加熱温度により適宜設定することができる。加熱時間は、例えば、１００℃～２００℃で加熱する場合、６時間以上７２時間以下であってよく、より好ましくは２４時間以上４８時間以下である。架橋においては、溶媒非存在下で加熱してよく、また、減圧条件下で加熱してもよい。

本実施形態に係る製造方法は、断片化後に、断片化された細胞外マトリックスを乾燥することを備えていてよい。

乾燥においては、解繊された細胞外マトリックスを乾燥する。乾燥は、例えば、凍結乾燥法により実施してよい。解繊後に、乾燥を行うことで、断片化細胞外マトリックス成分及び水性媒体を含む液から、水性媒体が除去される。水性媒体が除去されるとは、断片化された細胞外マトリックス中に一切の水分が付着していないことを意味するものではなく、上述の一般的な乾燥手法により、常識的に達することができる程度に水分が付着していないことを意味する。

（血管内皮細胞層の形成）
細胞構造体の作製は、平滑筋細胞層に血管内皮細胞を接触させ、インキュベートして、上記平滑筋細胞層と接する血管内皮細胞層を形成することを含む。

平滑筋細胞層に血管内皮細胞を接触させる方法としては、例えば、平滑筋細胞層を形成した水性媒体に血管内皮細胞を添加する方法、平滑筋細胞層を形成した水性媒体に血管内皮細胞を含む水性媒体を添加する方法、平滑筋細胞層を形成した後に一度水性媒体を除去し、血管内皮細胞を含む水性媒体を平滑筋細胞層に添加する方法が挙げられるが、これらに限られるものではない。また、血管内皮細胞を含む水性媒体は、断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体であってもよい。断片化細胞外マトリックスを含有する場合には、水性媒体中で血管内皮細胞と断片化細胞外マトリックスを混合した細胞懸濁液を用いることが好ましい。

血管内皮細胞を含む水性媒体が断片化細胞外マトリックスを含有する場合には、水性媒体中の断片化細胞外マトリックスの濃度は、目的とする細胞構造体及び血管内皮細胞層の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、上記水性媒体中の断片化細胞外マトリックスの濃度は、０．１～９０重量％であってもよいし、１～３０重量％であってもよい。

血管内皮細胞と混合する断片化細胞外マトリックスの量は、１×１０^５ｃｅｌｌｓの血管内皮細胞に対して、０．１～１００ｍｇであってもよいし、１～５０ｍｇであってもよい。また、断片化細胞外マトリックスと血管内皮細胞との質量比（断片化細胞外マトリックス／血管内皮細胞）は、１／１～１０００／１であってよく、９／１～９００／１であってよく、１０／１～５００／１であってもよい。

血管内皮細胞をインキュベートする際の水性媒体は、血管内皮細胞用培地を含むことが好ましい。血管内皮細胞を含む水性媒体（第３の水性媒体）が別途添加される場合には、上述した断片化細胞外マトリックスをホモジナイズする際の水性媒体（第１の水性媒体）及び平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合する際の水性媒体（第２の水性媒体）のいずれかと同じでもよく、異なってもよいが、血管内皮細胞用培地を含むことが好ましい。

平滑筋細胞層の形成における、フィブリノゲン及び／又はトロンビンの添加、並びにインキュベート前に外力を加えて、細胞及び断片化細胞外マトリックスを集積する工程は、血管内皮細胞層の形成においても同様に適用することができる。

平滑筋細胞層に血管内皮細胞を接触させてインキュベートすることで、血管内皮細胞が培養され、平滑筋細胞層と接する血管内皮細胞層が形成される。

平滑筋細胞層に血管内皮細胞を接触させ、インキュベートする方法は、特に制限はないが、例えば、インキュベート温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。血管内皮細胞を含む水性媒体のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。インキュベート時間は、例えば、５日間～２週間であってよく、１週間～２週間であってよく、５日～８日であってよい。

インキュベート（培養）における培地中の細胞密度は、目的とする細胞構造体及び血管内皮細胞層の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、培養における培地中の細胞密度は、１～１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよく、１０^３～１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよい。

血管内皮細胞層の厚さは、５μｍ～３０μｍであることが好ましく、５μｍ～１５μｍであることがより好ましい。血管内皮細胞層の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、３０μｍ以下であってもよいし、２０μｍ以下であってもよいし、１０μｍ以下であってもよい。血管内皮細胞層が通常より厚くなる疾患（例えば、動脈硬化）を有する血管壁モデルとして用いる観点からは、血管内皮細胞層の厚さは、５μｍ～１５μｍであることが好ましい。インキュベートにより、血管内皮細胞層が最終的に上記の好ましい厚さに形成されることが好ましい。

上述した作製工程により、安定で、細胞が均一に分布している細胞構造体が得られる。

本実施形態に係る作製方法により製造される細胞構造体は、培養中の収縮率が２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。上記収縮率は、例えば、以下の式で算出できる。式中Ｌ１は、培養後１日目の細胞構造体のもっとも長い部分の長さを示し、Ｌ３は、培養後３日目の細胞構造体における対応する部分の長さを示す。

収縮率（％）＝｛（Ｌ１―Ｌ３）／Ｌ１｝×１００
上記の例では収縮率を、培養後１日目の細胞構造体と培養３日目の細胞組織体から算出しているが、培養の終了時点を含む培養期間の任意の時点での細胞構造体から算出してもよい。例えば、培養後１日目の細胞構造体と培養２日目の細胞構造体から算出してもよく、培養後１日目の細胞構造体と培養５日目の細胞構造体から算出してもよく、培養後１日目の細胞構造体と培養８日目の細胞構造体から算出してもよい。

〔細胞構造体に炎症促進剤を接触させる工程及び免疫細胞を接触させる工程〕
本実施形態に係る免疫細胞を含む細胞構造体の製造方法は、作製した細胞構造体に炎症促進剤を接触させる工程と、上記細胞構造体に免疫細胞を接触させる工程とを含む。

炎症促進剤を接触させた細胞構造体に免疫細胞を接触させることで、細胞構造体に免疫細胞を含ませることができる。炎症促進剤を平滑筋細胞等の細胞に接触させると、細胞接着因子及び炎症性サイトカインの発現が促進され、内皮細胞における免疫細胞の接着及び細胞層浸潤（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が起こる。免疫細胞は、細胞構造体の表面に含まれてもよく、細胞構造体の内部に含まれてもよく、表面及び内部の両方に含まれてもよい。また、免疫細胞は、平滑筋細胞層又は血管内皮細胞層に含まれてもよく、平滑筋細胞層又は血管内皮細胞層の表面及び／又は内部に含まれてもよい。

（細胞構造体に炎症促進剤を接触させる工程）
炎症促進剤としては、細胞構造体に免疫細胞を含ませることができる限り特に限定されないが、例えば、動脈硬化を誘導する因子、具体的には、例えば、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ及びリポタンパク質が挙げられる。リポタンパク質は、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）であってよく、アセチル化されたリポタンパク質であってよく、アセチル化されたＬＤＬであってもよい。

細胞構造体に炎症促進剤を接触させる方法としては、細胞構造体を作製する際の水性媒体（例えば、平滑筋細胞層形成の際の水性媒体）に予め添加する方法、細胞構造体を作製した水性媒体（例えば、血管内皮細胞層形成の際の水性媒体）に炎症促進剤を添加する方法、細胞構造体を作製した水性媒体に炎症促進剤を含む水性媒体を添加する方法、細胞構造体を作製した後に一度水性媒体を除去し、炎症促進剤を含む水性媒体を添加する方法が挙げられるが、これらに限られるものではない。

炎症促進剤を含む水性媒体（第４の水性媒体）が別途添加される場合には、上述した断片化細胞外マトリックスをホモジナイズする際の水性媒体（第１の水性媒体）、平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合する際の水性媒体（第２の水性媒体）及び血管内皮細胞を含む水性媒体（第３の水性媒体）のいずれかと同じでもよく、異なっていてもよい。

炎症促進剤の濃度は、細胞構造体に免疫細胞を含ませることができる限り特に限定されないが、炎症促進剤の濃度を高くすることで、血管内皮細胞層が厚くなる傾向があるため、目的の血管内皮細胞層の厚さに応じて適宜設定することができる。例えば、炎症促進剤がＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩである場合には、細胞構造体を含む水性媒体に対して０．１μＭ～５μＭ、炎症促進剤がリポタンパク質である場合には、細胞構造体を含む水性媒体に対して２００～５００μｇ／ｍＬの濃度とすることができる。炎症促進剤の濃度を高くすることで、血管内皮細胞層が通常より厚くなる疾患（例えば、動脈硬化）を有する血管壁モデルとして用いるのに適した細胞構造体を製造することができる。

（細胞構造体に免疫細胞を接触させる工程）
免疫細胞については、［細胞構造体］において上述したとおりである。免疫細胞は、内部に上記のリポタンパク質を含んでもよい。リポタンパク質は、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）であってよく、アセチル化されたリポタンパク質であってよく、アセチル化されたＬＤＬであってもよい。例えば、免疫細胞がマクロファージであり、アセチル化されたＬＤＬを取り込んでいてもよい。

細胞構造体に免疫細胞を接触させる方法としては、細胞構造体を作製した水性媒体（例えば、血管内皮細胞層形成の際の水性媒体）に免疫細胞を添加する方法、細胞構造体を作製した水性媒体に免疫細胞を含む水性媒体を添加する方法、細胞構造体を作製した後に一度水性媒体を除去し、免疫細胞を含む水性媒体を添加する方法が挙げられるが、これらに限られるものではない。

細胞構造体に免疫細胞を接触させる際の水性媒体は、免疫細胞用培地を含むことが好ましい。免疫細胞を含む水性媒体（第５の水性媒体）が別途添加される場合には、上述した断片化細胞外マトリックスをホモジナイズする際の水性媒体（第１の水性媒体）、平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合する際の水性媒体（第２の水性媒体）、血管内皮細胞を含む水性媒体（第３の水性媒体）及び炎症促進剤を含む水性媒体（第４の水性媒体）のいずれかと同じでもよく、異なっていてもよいが、免疫細胞用培地を含むことが好ましい。

細胞構造体に免疫細胞を接触させた後、インキュベートをしてもよい。細胞構造体に免疫細胞を接触させ、インキュベートする方法は、特に制限はないが、例えば、インキュベート温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。免疫細胞を含む水性媒体のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。インキュベート時間は、例えば、２日間～２週間であってよく、２日間～１週間であってよく、２日～５日であってよい。

細胞構造体に免疫細胞を接触させる工程は、免疫細胞を血管内皮細胞層に接触させることを含むことが好ましい。

細胞構造体が免疫細胞を含むことを確認する方法については、［細胞構造体］において上述した方法と同様に行うことができる。

本実施形態に係る製造方法における具体的な態様等は、上述した細胞構造体における具体的な態様等を制限なく適用できる。

〔細胞構造体を用いた薬剤の効果の評価方法〕
上述したように、本実施形態に係る細胞構造体は、生体の血管組織により近い構造であり、免疫細胞を含むため、血管疾患を有する血管壁モデル、例えば、動脈硬化血管壁モデルとして利用することができる。したがって、本実施形態に係る細胞構造体を用いて、薬剤の効果を評価したり、薬剤をスクリーニングしたりすることができる。

本発明の一実施形態として、上述した細胞構造体を用いた薬剤の効果の評価方法が提供される。

本実施形態に係る評価方法は、薬剤を細胞構造体に投与する投与工程と、上記薬剤を投与した細胞構造体における変化により、薬剤の効果を評価する評価工程とを含むことが好ましい。

効果を評価する薬剤は、特に制限されないが、本実施形態に係る細胞構造体の特徴が生かされるという観点から、血管疾患に関連する薬剤（治療又は予防する薬剤）、特に動脈硬化に関連する薬剤であることが好ましい。動脈硬化に関連する薬剤としては、例えば、動脈硬化抑制剤及び動脈硬化促進剤が挙げられる。動脈硬化抑制剤としては、例えば、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、アポリポタンパクＡ－Ｉ、スタチン及びＰＣＳＫ９阻害剤等が挙げられる。動脈硬化促進剤としては、例えば、変性ＬＤＬ、レムナント、Ｌｐ（ａ）及びＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ等が挙げられる。

薬剤の細胞構造体への投与は、細胞構造体を培養する培地として上記薬剤を含有する培地を用いることにより実施してもよく、細胞構造体を培養する培地に上記薬剤を添加することにより実施してもよい。

薬剤を投与する細胞構造体は、１日以上培養された細胞構造体であってよく、５日以上培養された細胞構造体であってよく、６日以上培養された細胞構造体であってよく、７日以上培養された細胞構造体であってよく、それ以上の日数培養された細胞構造体であってよく、７日以上１４日以下の期間培養された細胞構造体であってもよい。

評価工程では、薬剤を投与した細胞構造体における変化により薬効を評価する。評価の指標となる変化としては、例えば、血管内皮細胞層の変化及び免疫細胞の接着量等が挙げられる。血管内皮細胞層の変化は、例えば、血管内皮細胞層の厚さの変化、又は弾性の変化であってよい。薬効は、上記指標１種のみの変化に基づいて評価してもよいし、上記指標の２種以上の変化に基づいて評価してもよい。細胞構造体における変化は、定性的な比較により評価してもよいし、定量的な比較により評価してもよい。

評価工程は、例えば、薬剤を投与した細胞構造体における血管内皮細胞層を、薬剤を投与しなかった細胞構造体における血管内皮細胞層と比較することにより、行うことができる。また、例えば、薬剤を投与した細胞構造体における免疫細胞の接着量を、薬剤を投与しなかった細胞構造体における免疫細胞の接着量と比較することにより、行うことができる。

評価工程においては、例えば、薬剤を投与しなかった細胞構造体における血管内皮細胞層と比較して、薬剤を投与した細胞構造体における血管内皮細胞層の厚さが小さい場合には、血管疾患を治療又は予防する薬剤として効果があると評価し、薬剤を投与した細胞構造体における血管内皮細胞層の厚さが大きい又は変化がない場合には、血管疾患を治療又は予防する薬剤として効果がないと評価してもよい。また、例えば、薬剤を投与しなかった細胞構造体における血管内皮細胞層と比較して、薬剤を投与した細胞構造体における血管内皮細胞層の厚さが大きい場合には、動脈硬化を促進する薬剤として効果があると評価し、薬剤を投与した細胞構造体における血管内皮細胞層の厚さが小さい又は変化がない場合には、動脈硬化を促進する薬剤として効果がないと評価してもよい。

また、評価工程においては、例えば、薬剤を投与しなかった細胞構造体における免疫細胞の接着量と比較して、薬剤を投与した細胞構造体における免疫細胞の接着量が小さい場合には、血管疾患を治療又は予防する薬剤として効果があると評価し、薬剤を投与した細胞構造体における免疫細胞の接着量が大きい又は変化がない場合には、血管疾患を治療又は予防する薬剤として効果がないと評価してもよい。また、例えば、薬剤を投与しなかった細胞構造体における免疫細胞の接着量と比較して、薬剤を投与した細胞構造体における免疫細胞の接着量が大きい場合には、動脈硬化を促進する薬剤として効果があると評価し、薬剤を投与した細胞構造体における免疫細胞の接着量が小さい又は変化がない場合には、動脈硬化を促進する薬剤として効果がないと評価してもよい。

本発明の他の実施形態として、平滑筋細胞及び断片化細胞外マトリックスを含む平滑筋細胞層と、血管内皮細胞を含む血管内皮細胞層とを有する細胞構造体に、
炎症促進剤を接触させる工程、
免疫細胞を接触させる工程、
薬剤を細胞構造体に投与する投与工程、及び
上記薬剤を投与した細胞構造体における変化により、薬剤の効果を評価する評価工程
を含む、薬剤の効果の評価方法も提供される。

本実施形態に係る評価方法における具体的な態様等は、上述した細胞構造体及びその製造方法における具体的な態様等を制限なく適用できる。

また、本発明の一実施形態として、細胞構造体を用いた薬剤のスクリーニング方法を提供する。本実施形態によれば、例えば、血管疾患を治療又は予防する薬剤を効果的に選抜することができる。

細胞構造体を用いた薬剤のスクリーニング方法は、上記評価方法における評価工程において、血管疾患を治療又は予防する薬剤として効果があると評価された薬剤を選択する工程を含んでもよい。

評価の指標となる変化は、上記評価方法において上述したとおりである。薬効は、上記指標１種のみの変化に基づいて評価してもよいし、上記指標の２種以上の変化に基づいて評価してもよい。細胞構造体における変化は、定性的な比較により評価してもよいし、定量的な比較により評価してもよい。

また、スクリーニング方法は、例えば、薬剤を投与した細胞構造体における血管内皮細胞層の厚さを測定する工程と、
薬剤を投与した細胞構造体における血管内皮細胞層の厚さを、薬剤を投与しなかった細胞構造体における血管内皮細胞層の厚さと比較し、薬剤を投与した細胞構造体における血管内皮細胞層の厚さが小さい場合に、上記薬剤を血管疾患を治療又は予防する薬剤の候補物質として選択する工程と、を含むか、又は、
薬剤を投与した細胞構造体における血管内皮細胞層の弾性を測定する工程と、
薬剤を投与した細胞構造体における血管内皮細胞層の弾性を、薬剤を投与しなかった細胞構造体における血管内皮細胞層の弾性と比較し、薬剤を投与した細胞構造体における血管内皮細胞層の弾性が小さい場合に、上記薬剤を血管疾患を治療又は予防する薬剤の候補物質として選択する工程と、を含むか、又は、
薬剤を投与した細胞構造体における免疫細胞の接着量を測定する工程と、
薬剤を投与した細胞構造体における免疫細胞の接着量を、薬剤を投与しなかった細胞構造体における免疫細胞の接着量と比較し、薬剤を投与した細胞構造体における免疫細胞の接着量が小さい場合に、上記薬剤を血管疾患を治療又は予防する薬剤の候補物質として選択する工程と、を含むことができる。

候補物質は、特に制限されないが、本実施形態に係る細胞構造体の特徴が生かされるという観点から、血管疾患に関連する薬剤、特に動脈硬化に関連する薬剤であることが好ましい。動脈硬化に関連する薬剤としては、例えば、動脈硬化抑制剤及び動脈硬化促進剤が挙げられる。動脈硬化抑制剤としては、例えば、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、アポリポタンパクＡ－Ｉ、スタチン及びＰＣＳＫ９阻害剤等が挙げられる。動脈硬化促進剤としては、例えば、変性ＬＤＬ、レムナント、Ｌｐ（ａ）及びＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ等が挙げられる。

細胞構造体における血管内皮細胞層の厚さの比較は、複数回行ってもよい。すなわち、細胞構造体における血管内皮細胞層の厚さの比較は、薬剤の投与後、所定の間隔ごとに複数回行われてもよい。

細胞構造体における血管内皮細胞層の弾性の比較は、複数回行ってもよい。すなわち、細胞構造体における血管内皮細胞層の弾性の比較は、薬剤の投与後、所定の間隔ごとに複数回行われてもよい。

また、細胞構造体における免疫細胞の接着量の比較は、複数回行ってもよい。すなわち、細胞構造体における免疫細胞の接着量の比較は、薬剤の投与後、所定の間隔ごとに複数回行われてもよい。

薬剤の投与は、上述した評価方法と同様に行うことができる。また、使用する細胞構造体等についても、上述したものを用いることができる。

本実施形態に係るスクリーニング方法における具体的な態様等は、上述した細胞構造体、その製造方法、及び評価方法における具体的な態様等を制限なく適用できる。

以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

細胞構造体を作製するため、以下の細胞及び培地を準備した。
（細胞）
ヒト臍帯静脈由来内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）：Ｌｏｎｚａ社製
ヒト臍帯動脈由来平滑筋細胞（ＵＡＳＭＣ）：Ｌｏｎｚａ社製
ヒト単球細胞：ＪＣＲＢ細胞バンクのＴＨＰ－１
（培地）
平滑筋細胞用培地：製品名ＳＭＣＧＭ２、製品コードＣ－２２０６２、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社製
血管内皮用培地：製品名ＥＧＭ２ＭＶ、製品コードＣＣ－３２０２、Ｌｏｎｚａ社製
単球用培地：製品名ＲＰＭＩ、製品コード３０２６４－８５、ナカライテスク社製

＜試験例１：断片化エラスチンの作製＞
ウシ血管由来エラスチン（製品名ＳＢ８７、Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）５０ｍｇをＭｉllｉ－Ｑ ５ｍＬに懸濁し、撹拌式ホモジナイザーを用いて室温で６分間ホモジナイズすることにより、断片化エラスチン（以下、「エラスチンマイクロファイバー（ＥＭＦ）」ともいう）を含有する分散液を得た。得られた断片化エラスチンの平均径は、１．３±０．４μｍ、平均長（長さ）は、９．２±４．８μｍであった。

＜試験例２：細胞構造体の作製＞
試験例１で得られた断片化エラスチンを含有する分散液５０μＬ（断片化エラスチン、０．５ｍｇ相当）と、８×１０^５ｃｅｌｌｓのヒト臍帯動脈由来平滑筋細胞（ＵＡＳＭＣ）とを２４ウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に添加した。１１００ｒｐｍで５分間遠心した後、３７℃で２日間培養し、平滑筋細胞層を構築した。さらに、構築した平滑筋細胞層の上に、さらに、２×１０^５個のヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を培地に懸濁し、自然沈降で平滑筋細胞層上に堆積させた。３７℃で７日間培養して平滑筋細胞層上に血管内皮細胞層を有する細胞構造体を作製した。作製した細胞構造体を１０％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定後、薄切し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）による染色及び抗ＣＤ３１抗体による免疫染色を行った。細胞構造体がエラスチンマイクロファイバーを高い濃度で含むこと、平滑筋細胞層と血管内皮細胞層を有していることを確認した。また、細胞構造体を上から観察した際に、細胞構造体の上部表面が血管内皮細胞により均一に覆われていることも確認した。

＜試験例３：Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ処理（単球細胞の接着及び分化の解析）＞
動脈硬化の誘導因子の一つであるＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩは、平滑筋細胞に接触させることで、細胞接着因子及び炎症性サイトカインの発現が促進され、内皮細胞における免疫細胞の接着及び細胞層浸潤が起こることが分かっている。そこで、試験例２の細胞構造体にＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩが与える影響を解析した。

具体的には、試験例２において、平滑筋細胞層上に血管内皮細胞層を有する細胞構造体を作製した後、さらに、血管内皮細胞層の上に、５×１０^４個のヒト単球細胞（ＴＨＰ－１）を培地に懸濁し、自然沈降で血管内皮細胞層の上に堆積させ、３７℃で７日間培養した。ヒト単球細胞を加えて培養する際の、平滑筋細胞用培地、血管内皮細胞用培地、及び単球細胞培地の質量比は１：１：１であり、さらに、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）（製品コード４００１－Ｖ、ペプチド研究所社製）を含まない場合と、１μＭ含む場合に分けて培養を行った。メタノールで固定後、薄切し、抗ＣＤ１１ｂ抗体（製品コード３０１３０５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及び抗ＣＤ１４抗体（製品コード３６７１０１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）による免疫染色を行った。

免疫染色した写真を図１に、蛍光面積による比較を行ったグラフを図２に示す。ＣＤ１１ｂの発現は単球の接着を示唆し、ＣＤ１４の発現は、単球の分化を示唆する。Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩを含まない培地で培養した細胞構造体と比較して、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩを含む培地で培養した細胞構造体において、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４が強く発現していること、また、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４が共局在していることが示された（図１及び図２の「Ａｎｇ ＩＩ＋」）。これらの結果から、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩにより、ヒト単球細胞（ＴＨＰ－１）の接着及びマクロファージへの分化が促進されていることが示唆された。

＜試験例４：Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ処理（細胞接着分子の発現解析）＞
ヒト単球細胞を血管内皮細胞層の上に堆積させてからの培養が５日間である以外は試験例３と同様に作製したＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩを含む培地で培養した細胞構造体を、抗ＣＤ３１抗体（製品コードＭ０８２３、ＤＡＫＯ社製）及び抗ＣＤ５４抗体（製品コード１１６１０１、ＢＩＯｌｅｇｅｎｄ社製）により免疫染色した。免疫染色した写真（上から観察）を図３に、抗ＣＤ５４抗体の免疫染色による蛍光面積の比較を行ったグラフを図４に示す。抗ＣＤ５４抗体の発現は、細胞接着分子の一種であるＩＣＡＭの発現を示唆する。図３において白で表されている部分は抗ＣＤ５４抗体による蛍光、黒で表されている部分は抗ＣＤ３１抗体による蛍光を示す。これらの結果から、細胞構造体において、抗ＣＤ５４抗体の強い発現が確認され、ＩＣＡＭの強い発現が示唆された。

また、エラスチンマイクロファイバーを除く以外は細胞構造体と同様に作製した組織（図３及び図４の「ＥＭＦなし」）においては、抗ＣＤ５４抗体の強い発現が確認されたが、エラスチンマイクロファイバーの上で血管内皮細胞を培養して作製した組織（図３及び図４の「ＳＭＣなし」）及び血管内皮細胞のみで作製された組織（図３及び図４の「ＨＵＶＥＣのみ」）では、抗ＣＤ５４抗体の発現が確認されなかった。なお、いずれの組織も細胞構造体と同様に平滑筋細胞用培地：血管内皮細胞用培地：単球細胞培地の質量比が１：１：１の培地を使用して作製したものである。これらの結果から、ＩＣＡＭの発現に平滑筋細胞層が必要であることも示唆された。

抗ＣＤ５４抗体の免疫染色による蛍光面積を、異なる濃度のＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩを含む培地で培養した細胞構造体と、血管内皮細胞のみで作製された組織（「ＨＵＶＥＣ」）間で比較したグラフを図５に示す。図５の（ａ）は蛍光面積の比較、（ｂ）は、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩを含まない場合における蛍光面積を１．０とした場合の蛍光面積の比率の比較を示す。血管内皮細胞のみで作製された組織では、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩの濃度を増加させても蛍光面積は増加しなかったが、細胞構造体においては、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩの濃度が０．１μＭ以上の時、蛍光面積が増加する蛍光が観察された。これらの結果から、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩの作用により、細胞構造体においてＩＣＡＭの発現が増加する可能性が示唆された。

＜試験例５：アセチル化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）処理＞
動脈硬化の誘導因子の一つであるアセチル化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）は、細胞の増殖と免疫細胞の浸潤を促進し、マクロファージにより取り込まれることが分かっている。そこで、試験例２の細胞構造体にアセチル化低比重リポタンパク質が与える影響を解析した。

具体的には、試験例２において、平滑筋細胞層上に血管内皮細胞層を有する細胞構造体を作製した後、さらに、血管内皮細胞層の上に、５×１０^４個のヒト単球細胞（ＴＨＰ－１）を培地に懸濁し、自然沈降で血管内皮細胞層の上に堆積させ、３７℃で３日間培養した。その後、ヒト由来のアセチル化低比重リポタンパク質（国立研究開発法人国立循環器病研究センターより分譲）を０～４００μｇ／ｍＬの濃度で培地に加え、さらに３７℃で５日間培養した。作製した細胞構造体を１０％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定後、薄切し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）による染色を行った結果を図６に示す。各写真の左上の濃度は、アセチル化低比重リポタンパク質の濃度を示す。アセチル化低比重リポタンパク質の濃度が高くなるほど、内皮細胞層の厚さが増加する傾向が見られた。

また、アセチル化低比重リポタンパク質の濃度に対する細胞構造体の内皮細胞層の厚さ（μｍ）の変化を図７のグラフに示す。血管内皮細胞のみで作製された組織（「ＨＵＶＥＣのみ」）は、アセチル化低比重リポタンパク質の濃度（ＬＤＬ濃度／μｇ／ｍＬ）の変化により内皮細胞層の厚さは変化しなかったが、細胞構造体においては、アセチル化低比重リポタンパク質の濃度が高くなるほど、内皮細胞層の厚さが増加する傾向が見られた。

さらに、作製した細胞構造体を抗ＣＤ３１抗体（製品コードＭ０８２３、ＤＡＫＯ社製）及び抗α－ＳＭＡ抗体（製品コード９０４６０１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）により免疫染色した写真を図８に示す。「ＨＵＶＥＣのみ」は、血管内皮細胞のみで作製された組織を用いた結果を示す。図８（ａ）は抗ＣＤ３１抗体による免疫染色の結果、図８（ｂ）は抗α－ＳＭＡ抗体による免疫染色の結果をそれぞれ示す。各写真の左上に記載された濃度は、アセチル化低比重リポタンパク質の濃度を示す。図８（ａ）から、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、黒で表されている部分）が、内皮細胞層に広く分布していることが分かった。また、図８（ｂ）から、平滑筋細胞（ＳＭＣ、黒で表されている部分）が、内皮細胞層に存在していないことも示された。当該細胞構造体の内皮細胞層は内皮細胞及びＴＨＰ－１からなる。平滑筋細胞層がＴＨＰ－１の吸収及び浸潤を促進することで、アセチル化低比重リポタンパク質に反応して内皮細胞層を厚くすることが示唆された。

＜試験例６：高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）処理＞
高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）は、血液中の主要なリポタンパク質であり、リン脂質とアポリポタンパク質とで構成され、体内のコレステロール輸送を仲介している。また、高比重リポタンパク質は、コレステロール引き抜き能、抗酸化作用、抗炎症作用、内皮細胞の活性抑制等多くの抗動脈硬化作用を有することが分かっている。そこで、試験例４の細胞構造体に高比重リポタンパク質が与える影響を解析した。試験例４の細胞構造体は、平滑筋細胞層上に血管内皮細胞層を有する細胞構造体に５×１０^４個のヒト単球細胞（ＴＨＰ－１）を堆積させて培養したものである。

具体的には、ヒト単球細胞（ＴＨＰ－１）を堆積させて３７℃で３日間培養した後、ヒト由来のアセチル化低比重リポタンパク質（国立研究開発法人国立循環器病研究センターより分譲）２００μｇ／ｍＬ及びヒト由来の高比重リポタンパク質（国立研究開発法人国立循環器病研究センターより分譲）０～２０００μｇ／ｍＬを培地に加え、さらに３７℃で５日間培養した。作製した細胞構造体を１０％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定後、薄切し、抗ＣＤ３１抗体（製品コードＭ０８２３、ＤＡＫＯ社製）により免疫染色を行った結果の写真を図９に、高比重リポタンパク質の濃度に対する内皮細胞層の厚さの変化を表すグラフを図１０に示す。図９において点線で区切られている内側が内皮細胞層（白く表されている部分が内皮細胞）に該当する部分であり、各写真の上の濃度は、高比重リポタンパク質の濃度を示す。高比重リポタンパク質を添加していないサンプル（０μｇ／ｍＬ）が、アセチル化低比重リポタンパク質の影響により最も内皮細胞層が厚く、高比重リポタンパク質の濃度が高くなるほど、内皮細胞層の厚さが減少する傾向が見られた。

Claims (10)

1. 免疫細胞を含む細胞構造体の製造方法であって、
   水性媒体中で平滑筋細胞と断片化細胞外マトリックスとを混合し、インキュベートして平滑筋細胞層を形成すること、及び前記平滑筋細胞層に血管内皮細胞を接触させ、インキュベートして、前記平滑筋細胞層と接する血管内皮細胞層を形成することと、を含む細胞構造体の作製工程と、
   前記細胞構造体に炎症促進剤を接触させる工程と、
   前記細胞構造体に免疫細胞を接触させる工程とを含み、
   前記断片化細胞外マトリックスがエラスチンである、方法。
2. 前記細胞構造体に免疫細胞を接触させる工程が、前記免疫細胞を前記血管内皮細胞層に接触させることを含む、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記炎症促進剤が、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ又はリポタンパク質である、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 前記リポタンパク質が変性されたリポタンパク質である、請求項３に記載の製造方法。
5. 平滑筋細胞及び断片化細胞外マトリックスを含む平滑筋細胞層と、
   血管内皮細胞を含む血管内皮細胞層と、を有し、
   前記平滑筋細胞層と前記血管内皮細胞層が接しており、
   免疫細胞を含み、
   前記断片化細胞外マトリックスがエラスチンである、細胞構造体。
6. 前記平滑筋細胞層又は前記血管内皮細胞層に免疫細胞を含む、請求項５に記載の細胞構造体。
7. 前記免疫細胞が内部にリポタンパク質を含む、請求項５又は６に記載の細胞構造体。
8. 請求項５又は６に記載の細胞構造体を用いた薬剤の効果の評価方法。
9. 薬剤を細胞構造体に投与する投与工程と、
   前記薬剤を投与した細胞構造体における変化により、薬剤の効果を評価する評価工程と
   を含む、請求項８に記載の評価方法。
10. 前記薬剤が、動脈硬化抑制剤又は動脈硬化促進剤である、請求項８又は９に記載の評価方法。

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