JPH07188048A - 血管内膜肥厚改善剤 - Google Patents
血管内膜肥厚改善剤Info
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- JPH07188048A JPH07188048A JP5352473A JP35247393A JPH07188048A JP H07188048 A JPH07188048 A JP H07188048A JP 5352473 A JP5352473 A JP 5352473A JP 35247393 A JP35247393 A JP 35247393A JP H07188048 A JPH07188048 A JP H07188048A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳ
Ｆ）を有効成分とする血管内膜肥厚改善剤。 【効果】 上記血管内膜肥厚改善剤は、動脈硬化巣の形
成を抑制するとともに、弓部大動脈を含めた各大動脈の
内膜肥厚を特異的にかつ有意に改善する作用を有し、動
脈硬化症に起因する血管内膜肥厚の治療剤として有用で
ある。
Ｆ）を有効成分とする血管内膜肥厚改善剤。 【効果】 上記血管内膜肥厚改善剤は、動脈硬化巣の形
成を抑制するとともに、弓部大動脈を含めた各大動脈の
内膜肥厚を特異的にかつ有意に改善する作用を有し、動
脈硬化症に起因する血管内膜肥厚の治療剤として有用で
ある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はマクロファージコロニー
刺激因子（以下、Ｍ−ＣＳＦという。）を有効成分とす
る血管内膜肥厚改善剤に関する。
刺激因子（以下、Ｍ−ＣＳＦという。）を有効成分とす
る血管内膜肥厚改善剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】血管内膜肥厚は、動脈硬化巣とともに、
粥状動脈硬化発症時に代表的に見られる病変である。血
管内膜肥厚は、血管内皮細胞の機能的障害が引き金とな
り、中膜平滑筋（収縮型）細胞が内膜に遊走し、ここで
合成型に変わって増殖することにより起こる。つまり、
粥状動脈硬化発症過程の初期において、血管内皮細胞に
酸化ＬＤＬ（その他のmodified LDLや機械的刺激等) に
よる障害が引き起こされると、単球が内皮細胞の間隙を
通って血管内膜内に浸潤し、単球はマクロファージに分
化し、脂質を取り込み、泡沫細胞となって脂肪線糸(fat
ty steak) が完成する。泡沫細胞は同時に種々のサイト
カインを分泌し、さらに内膜への細胞浸潤を招くととも
に、中膜平滑筋細胞を内膜へ遊走させ、ここで合成型平
滑筋細胞に変わって増殖する。増殖した平滑筋細胞は脂
肪小体を取り込み泡沫細胞化し、マクロファージととも
に内膜肥厚をきたし、線維斑（fibrous plaque) を形成
する。次いで、内膜肥厚が高度になり、血管内皮細胞が
破綻すると、血小板が付着してさらに病変進行する。血
管内膜肥厚は、上記のような発生・進行機序を有し、主
に弓部大動脈、胸部大動脈、腹部大動脈等に発生する。
粥状動脈硬化発症時に代表的に見られる病変である。血
管内膜肥厚は、血管内皮細胞の機能的障害が引き金とな
り、中膜平滑筋（収縮型）細胞が内膜に遊走し、ここで
合成型に変わって増殖することにより起こる。つまり、
粥状動脈硬化発症過程の初期において、血管内皮細胞に
酸化ＬＤＬ（その他のmodified LDLや機械的刺激等) に
よる障害が引き起こされると、単球が内皮細胞の間隙を
通って血管内膜内に浸潤し、単球はマクロファージに分
化し、脂質を取り込み、泡沫細胞となって脂肪線糸(fat
ty steak) が完成する。泡沫細胞は同時に種々のサイト
カインを分泌し、さらに内膜への細胞浸潤を招くととも
に、中膜平滑筋細胞を内膜へ遊走させ、ここで合成型平
滑筋細胞に変わって増殖する。増殖した平滑筋細胞は脂
肪小体を取り込み泡沫細胞化し、マクロファージととも
に内膜肥厚をきたし、線維斑（fibrous plaque) を形成
する。次いで、内膜肥厚が高度になり、血管内皮細胞が
破綻すると、血小板が付着してさらに病変進行する。血
管内膜肥厚は、上記のような発生・進行機序を有し、主
に弓部大動脈、胸部大動脈、腹部大動脈等に発生する。
【０００３】血管内膜肥厚を放置すれば、狭心症、心筋
梗塞、虚血性心疾患、大動瘤、下肢閉塞性動脈硬化症を
誘発することになり、臨床上大きな問題となる。最近、
Ｒｏｓｓらは血管障害性を取り除いてやることにより、
内膜肥厚が改善される可能性を提唱している（R. Ross,
Nature 362 巻, 801-809 頁, 1993年) 。また、動脈硬
化症自体の治療には数多くの薬剤があり、臨床的には、
プロプコール製剤（渡辺彰他, 動脈硬化, 11巻, ３号,
597 頁, 1983年）及び蛋白分解酵素であるエラスターゼ
（吉村正蔵, 動脈硬化, ３巻, 223 頁, 1975年）が主に
用いられている。これらの薬剤の作用はコレステロール
を血管壁に付着しにくくしたり、血管壁に付いたコレス
テロールを洗い流すものであるが、その効果には一定の
限界があり、根治治療をするものではなく、血管内膜肥
厚の改善について報告するものはない。
梗塞、虚血性心疾患、大動瘤、下肢閉塞性動脈硬化症を
誘発することになり、臨床上大きな問題となる。最近、
Ｒｏｓｓらは血管障害性を取り除いてやることにより、
内膜肥厚が改善される可能性を提唱している（R. Ross,
Nature 362 巻, 801-809 頁, 1993年) 。また、動脈硬
化症自体の治療には数多くの薬剤があり、臨床的には、
プロプコール製剤（渡辺彰他, 動脈硬化, 11巻, ３号,
597 頁, 1983年）及び蛋白分解酵素であるエラスターゼ
（吉村正蔵, 動脈硬化, ３巻, 223 頁, 1975年）が主に
用いられている。これらの薬剤の作用はコレステロール
を血管壁に付着しにくくしたり、血管壁に付いたコレス
テロールを洗い流すものであるが、その効果には一定の
限界があり、根治治療をするものではなく、血管内膜肥
厚の改善について報告するものはない。
【０００４】一方、Ｍ−ＣＳＦは、単球，線維芽細胞，
内皮細胞で産生され、免疫担当細胞であるマクロファー
ジの分化誘導を行うサイトカインで、ある種の造血幹細
胞に働きかけ単球への分化を促し、さらに単球に対して
作用してマクロファージへと分化させる。Ｍ−ＣＳＦを
高コレステロール血症のモデル動物である渡辺ウサギに
投与すると血中コレステロールと低比重リポ蛋白（ＬＤ
Ｌ）の量が減少すること (H.Simano et al., Ann. NY A
cad. Sci., 587巻, 362 頁, 1990年) 、また動脈硬化巣
が退縮することが明らかにされており (Inoue et al.,
Atherosclerosis, 93巻,245-254 頁, 1992年) 、高脂
血症ならびに動脈硬化の治療薬として大きな可能性を秘
めている。Ｍ−ＣＳＦは、その蛋白質及び遺伝子構造に
ついても明らかにされており (G.G.Wong et al., Scien
ce, 2, 35 巻 (20号), 1504-1508頁, 1987年) 、各研究
グループによりそのｃＤＮＡのクローン化が成功してい
る (Science, 230巻, 291頁, 1985年, Science, 235巻,
1504頁, 1987年) 。さらに、その遺伝子組換えによる
調製も試みられ、Ｍ−ＣＳＦをコードする遺伝子をチャ
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に組み込んで発
現された遺伝子組換え体のＭ−ＣＳＦが、すでに高脂血
症治療剤として開発されつつある。当該製剤は泡沫化マ
クロファージでニュートラルＣＥＨ (cholesteryl este
r hydrolase)活性を増加させると共に、ＨＤＬによるコ
レステロール排泄を促進させ、その結果、脱泡沫化を促
進させることがインビトロで確認されており、動脈硬化
巣中に蓄積した変性ＬＤＬのマクロファージによる除去
を促進し、粥状動脈硬化巣形成を抑制する可能性が示唆
されている [日本動脈硬化学会誌, 21巻 (3 号), 225
頁, (1993 年 5月) 東大・３内 稲葉寿守ら] 。しか
し、Ｍ−ＣＳＦの血管内膜肥厚改善の可能性については
未検討であり、現在のところ、動脈硬化症において発生
した血管内膜肥厚を改善させる有用な薬剤は知られてい
ない。
内皮細胞で産生され、免疫担当細胞であるマクロファー
ジの分化誘導を行うサイトカインで、ある種の造血幹細
胞に働きかけ単球への分化を促し、さらに単球に対して
作用してマクロファージへと分化させる。Ｍ−ＣＳＦを
高コレステロール血症のモデル動物である渡辺ウサギに
投与すると血中コレステロールと低比重リポ蛋白（ＬＤ
Ｌ）の量が減少すること (H.Simano et al., Ann. NY A
cad. Sci., 587巻, 362 頁, 1990年) 、また動脈硬化巣
が退縮することが明らかにされており (Inoue et al.,
Atherosclerosis, 93巻,245-254 頁, 1992年) 、高脂
血症ならびに動脈硬化の治療薬として大きな可能性を秘
めている。Ｍ−ＣＳＦは、その蛋白質及び遺伝子構造に
ついても明らかにされており (G.G.Wong et al., Scien
ce, 2, 35 巻 (20号), 1504-1508頁, 1987年) 、各研究
グループによりそのｃＤＮＡのクローン化が成功してい
る (Science, 230巻, 291頁, 1985年, Science, 235巻,
1504頁, 1987年) 。さらに、その遺伝子組換えによる
調製も試みられ、Ｍ−ＣＳＦをコードする遺伝子をチャ
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に組み込んで発
現された遺伝子組換え体のＭ−ＣＳＦが、すでに高脂血
症治療剤として開発されつつある。当該製剤は泡沫化マ
クロファージでニュートラルＣＥＨ (cholesteryl este
r hydrolase)活性を増加させると共に、ＨＤＬによるコ
レステロール排泄を促進させ、その結果、脱泡沫化を促
進させることがインビトロで確認されており、動脈硬化
巣中に蓄積した変性ＬＤＬのマクロファージによる除去
を促進し、粥状動脈硬化巣形成を抑制する可能性が示唆
されている [日本動脈硬化学会誌, 21巻 (3 号), 225
頁, (1993 年 5月) 東大・３内 稲葉寿守ら] 。しか
し、Ｍ−ＣＳＦの血管内膜肥厚改善の可能性については
未検討であり、現在のところ、動脈硬化症において発生
した血管内膜肥厚を改善させる有用な薬剤は知られてい
ない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、動脈硬化治療として動脈巣の退縮のみならず、
血管内膜肥厚改善という新しい知見に基づき、副作用の
ない優れた血管内膜肥厚改善剤を提供することにある。
課題は、動脈硬化治療として動脈巣の退縮のみならず、
血管内膜肥厚改善という新しい知見に基づき、副作用の
ない優れた血管内膜肥厚改善剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑みて鋭意研究を進めた結果、Ｍ−ＣＳＦが動脈硬化
発症時に見られる血管内膜肥厚を有意に改善することを
見出し、本発明を完成した。
に鑑みて鋭意研究を進めた結果、Ｍ−ＣＳＦが動脈硬化
発症時に見られる血管内膜肥厚を有意に改善することを
見出し、本発明を完成した。
【０００７】前記課題を解決する本発明は、Ｍ−ＣＳＦ
を有効成分とする血管内膜肥厚改善剤である。
を有効成分とする血管内膜肥厚改善剤である。
【０００８】本発明に係わるＭ−ＣＳＦは由来は問わな
いが、例えば、尿からの精製、細胞培養、または遺伝子
組換え技術を用いて得ることができる。遺伝子組換えＭ
−ＣＳＦは、例えば、特表平１−５０２３９７号公報の
方法に従って、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子を組み込んだベクター
で適当な宿主を形質転換することにより得られる。ま
た、形質転換体より得られたＭ−ＣＳＦは、イオン交換
体処理、吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラ
フィー、モノクローナル抗体アフィニティークロマトグ
ラフィーを単独又は適当に組み合わせて精製される。例
えば、特開平３─２１２５号公報の記載に基づき、次の
方法によって精製したものを凍結乾燥して調製すること
ができる。まず、純化したＭ−ＣＳＦをウサギに免疫し
た抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）中で透析し、２０ｍｇ／ｍｌ濃度に調製する。該抗
体溶液２００ｍｌを、予め蒸留水及び０．１Ｍリン酸緩
衝液で洗浄した１００ｇのフォルミル−セルロファイン
へ加え、室温で２時間攪拌した後、水素化シアノホウ素
ナトリウム７００ｍｇを加えて、更に１６時間攪拌し、
フォルミル−セルロファインと抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を結合
させ、抗体結合支持体を調製する。結合後、０．２Ｍト
リス−塩酸緩衝液で洗浄し、更に水素シアノホウ素ナト
リウム５００ｍｇを含むトリス緩衝液２００ｍｌを加
え、室温で４時間攪拌して、反応基を不活化する。次い
で、抗体結合支持体を０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する
０．０２Ｍリン酸緩衝液で十分洗浄する。抗体結合支持
体は支持体１ｇ当たり３２．６ｍｇの抗ＣＳＦ抗体を結
合している。次にヒトＭ−ＣＳＦ遺伝子組換え細胞（Ｃ
ＨＯ細胞）の培養液１０Ｌを限外濾過濃縮機で濃縮し、
脱塩した後、ＤＥＡＥ−セルロースに吸着させ、非吸着
の夾雑物質を除去し、０．３Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出
し、該溶出液に０．５Ｍ濃度となるように塩化ナトリウ
ムを加えてヒトＭ−ＣＳＦを含有する溶液を調製する。
このヒトＭ−ＣＳＦの比活性は、３×１０4 単位／ｍｇ
である。上記抗体結合支持体１００ｇに対し、このヒト
Ｍ−ＣＳＦを含有する溶液（全量５００ｍｌ）を加え、
１０℃以下で一夜攪拌しバッチ式クロマトグラフィー処
理を行う。攪拌後、ガラスフィルターで濾過して、抗体
結合支持体を集め、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．
０２Ｍリン酸緩衝液で該抗体結合支持体を十分に洗浄す
る。洗浄後、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２．５）５００
ｍｌを加え、１０℃、１時間攪拌してＭ−ＣＳＦを溶出
する。溶出液のｐＨを７．０にした後、限外濾過膜で濃
縮・脱塩してＭ−ＣＳＦ分画を得る。この分画をＨｉ−
Ｐｏｕｒ２１４ＴＰ（バイダック社、径２．２×２．５
ｃｍ）の逆相カラムで０．１Ｍトリフルオロ酢酸を含む
アセトニトリル０〜１００（ｐＨ２．０）の直線濃度勾
配による高速液体クロマトグラフィーにかけ、ヒトＭ−
ＣＳＦを集め、凍結乾燥し、Ｍ−ＣＳＦ２５ｍｇを得
る。かくして得られる精製Ｍ−ＣＳＦの比活性は１．９
×１０8 単位／ｍｇ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による純度は
９８％以上である。
いが、例えば、尿からの精製、細胞培養、または遺伝子
組換え技術を用いて得ることができる。遺伝子組換えＭ
−ＣＳＦは、例えば、特表平１−５０２３９７号公報の
方法に従って、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子を組み込んだベクター
で適当な宿主を形質転換することにより得られる。ま
た、形質転換体より得られたＭ−ＣＳＦは、イオン交換
体処理、吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラ
フィー、モノクローナル抗体アフィニティークロマトグ
ラフィーを単独又は適当に組み合わせて精製される。例
えば、特開平３─２１２５号公報の記載に基づき、次の
方法によって精製したものを凍結乾燥して調製すること
ができる。まず、純化したＭ−ＣＳＦをウサギに免疫し
た抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）中で透析し、２０ｍｇ／ｍｌ濃度に調製する。該抗
体溶液２００ｍｌを、予め蒸留水及び０．１Ｍリン酸緩
衝液で洗浄した１００ｇのフォルミル−セルロファイン
へ加え、室温で２時間攪拌した後、水素化シアノホウ素
ナトリウム７００ｍｇを加えて、更に１６時間攪拌し、
フォルミル−セルロファインと抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を結合
させ、抗体結合支持体を調製する。結合後、０．２Ｍト
リス−塩酸緩衝液で洗浄し、更に水素シアノホウ素ナト
リウム５００ｍｇを含むトリス緩衝液２００ｍｌを加
え、室温で４時間攪拌して、反応基を不活化する。次い
で、抗体結合支持体を０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する
０．０２Ｍリン酸緩衝液で十分洗浄する。抗体結合支持
体は支持体１ｇ当たり３２．６ｍｇの抗ＣＳＦ抗体を結
合している。次にヒトＭ−ＣＳＦ遺伝子組換え細胞（Ｃ
ＨＯ細胞）の培養液１０Ｌを限外濾過濃縮機で濃縮し、
脱塩した後、ＤＥＡＥ−セルロースに吸着させ、非吸着
の夾雑物質を除去し、０．３Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出
し、該溶出液に０．５Ｍ濃度となるように塩化ナトリウ
ムを加えてヒトＭ−ＣＳＦを含有する溶液を調製する。
このヒトＭ−ＣＳＦの比活性は、３×１０4 単位／ｍｇ
である。上記抗体結合支持体１００ｇに対し、このヒト
Ｍ−ＣＳＦを含有する溶液（全量５００ｍｌ）を加え、
１０℃以下で一夜攪拌しバッチ式クロマトグラフィー処
理を行う。攪拌後、ガラスフィルターで濾過して、抗体
結合支持体を集め、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．
０２Ｍリン酸緩衝液で該抗体結合支持体を十分に洗浄す
る。洗浄後、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２．５）５００
ｍｌを加え、１０℃、１時間攪拌してＭ−ＣＳＦを溶出
する。溶出液のｐＨを７．０にした後、限外濾過膜で濃
縮・脱塩してＭ−ＣＳＦ分画を得る。この分画をＨｉ−
Ｐｏｕｒ２１４ＴＰ（バイダック社、径２．２×２．５
ｃｍ）の逆相カラムで０．１Ｍトリフルオロ酢酸を含む
アセトニトリル０〜１００（ｐＨ２．０）の直線濃度勾
配による高速液体クロマトグラフィーにかけ、ヒトＭ−
ＣＳＦを集め、凍結乾燥し、Ｍ−ＣＳＦ２５ｍｇを得
る。かくして得られる精製Ｍ−ＣＳＦの比活性は１．９
×１０8 単位／ｍｇ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による純度は
９８％以上である。
【０００９】Ｍ−ＣＳＦは、通常、静脈内、動脈内、筋
肉内、皮下、腹腔内などの非経口投与により投与するこ
とができる。投与用の製剤としては、注射剤、注入剤な
どが挙げられ、これらの製剤は其自体公知の方法によっ
て調製することができる。例えば、ヒトＭ−ＣＳＦに医
薬品として適当な賦形剤に加えて、無菌濾過し、ガラス
バイアル中に無菌的に充填して密封し、必要に応じて凍
結乾燥して製剤を調製することができる。
肉内、皮下、腹腔内などの非経口投与により投与するこ
とができる。投与用の製剤としては、注射剤、注入剤な
どが挙げられ、これらの製剤は其自体公知の方法によっ
て調製することができる。例えば、ヒトＭ−ＣＳＦに医
薬品として適当な賦形剤に加えて、無菌濾過し、ガラス
バイアル中に無菌的に充填して密封し、必要に応じて凍
結乾燥して製剤を調製することができる。
【００１０】Ｍ−ＣＳＦの血管内膜肥厚患者に対する投
与量は、患者の年齢、体重、症状等によって変動する
が、通常０．１〜１００μｇ／ｋｇ体重／日が例示され
る。
与量は、患者の年齢、体重、症状等によって変動する
が、通常０．１〜１００μｇ／ｋｇ体重／日が例示され
る。
【００１１】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために、実施
例、試験例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限
定されるものではない。
例、試験例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限
定されるものではない。
【００１２】実施例１ 特表平１−５０２３９７号公報の方法に従い、２２３個
のアミノ酸からなるＭ−ＣＳＦタンパク質を得、特開平
３−２１２５号公報の方法に従い、高度精製を行った。
安定化剤を加えて、Ｍ−ＣＳＦを４００μｇ／ｍｌ（＞
０．５×１０6ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、
０．５Ｍグリシン、１％（ｗ／ｖ）シュクロース、０．
００５％（Ｖ／Ｖ）Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０およ
び０．０１Ｍクエン酸ナトリウムに調製した。ニトロセ
ルロース系無菌濾過膜にて無菌濾過した後、ガラスバイ
アル中に無菌的に１ｍｌ充填し、本発明の血管内膜肥厚
改善剤を調製した。
のアミノ酸からなるＭ−ＣＳＦタンパク質を得、特開平
３−２１２５号公報の方法に従い、高度精製を行った。
安定化剤を加えて、Ｍ−ＣＳＦを４００μｇ／ｍｌ（＞
０．５×１０6ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、
０．５Ｍグリシン、１％（ｗ／ｖ）シュクロース、０．
００５％（Ｖ／Ｖ）Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０およ
び０．０１Ｍクエン酸ナトリウムに調製した。ニトロセ
ルロース系無菌濾過膜にて無菌濾過した後、ガラスバイ
アル中に無菌的に１ｍｌ充填し、本発明の血管内膜肥厚
改善剤を調製した。
【００１３】実施例２ 実施例１の方法に従い、バイアル瓶に無菌的に充填した
後、凍結乾燥し、本発明の製剤を得た。
後、凍結乾燥し、本発明の製剤を得た。
【００１４】試験例１（血管内膜肥厚の改善に対する効
果） １．動脈硬化症モデル動物作出 １２週齢のＮＺＷ系雄性ウサギを用い、各動物に２％コ
レステロール食を５９日間負荷することにより作出し
た。なお、コレステロール食負荷期間終了後、薬剤投与
開始前に２例について剖検を行い、大動脈弓、胸大動
脈、腹大動脈、ならびに大腿動脈に動脈硬化巣が形成さ
れ、血管内膜肥厚が発生していることを確認した。
果） １．動脈硬化症モデル動物作出 １２週齢のＮＺＷ系雄性ウサギを用い、各動物に２％コ
レステロール食を５９日間負荷することにより作出し
た。なお、コレステロール食負荷期間終了後、薬剤投与
開始前に２例について剖検を行い、大動脈弓、胸大動
脈、腹大動脈、ならびに大腿動脈に動脈硬化巣が形成さ
れ、血管内膜肥厚が発生していることを確認した。
【００１５】２．供試薬剤 実施例１の製剤を供試薬剤として用いた。また、比較対
照として、異種タンパク投与の影響を考慮して、血漿由
来ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡという。）２５０
ｍｇ／ｍｌの他、０．０２Ｍアセチルトリプトファンお
よび０．０２Ｍカプリル酸ナトリウムを含有する液状ヒ
ト血清アルブミン製剤を、同じく生理食塩水で４００μ
ｇ／ｍｌに無菌的に調製したものをを供試薬剤として用
いた。
照として、異種タンパク投与の影響を考慮して、血漿由
来ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡという。）２５０
ｍｇ／ｍｌの他、０．０２Ｍアセチルトリプトファンお
よび０．０２Ｍカプリル酸ナトリウムを含有する液状ヒ
ト血清アルブミン製剤を、同じく生理食塩水で４００μ
ｇ／ｍｌに無菌的に調製したものをを供試薬剤として用
いた。
【００１６】３．薬剤投与経路・投与量 大腿部筋肉内に、１日１回１２週間連日定時に投与し
た。投与量は副作用を発現しないと考えられる、８０μ
ｇ／ｋｇの１用量のみを設定した。ＨＳＡではＭ−ＣＳ
Ｆの投与用量と同一の１用量群を設定した。投与容量は
Ｍ−ＣＳＦ、ＨＳＡともに０．２ｍｌ／ｋｇとした。
た。投与量は副作用を発現しないと考えられる、８０μ
ｇ／ｋｇの１用量のみを設定した。ＨＳＡではＭ−ＣＳ
Ｆの投与用量と同一の１用量群を設定した。投与容量は
Ｍ−ＣＳＦ、ＨＳＡともに０．２ｍｌ／ｋｇとした。
【００１７】４．試験項目および方法 (1) 剖検 投与終了後に各群ともに生存例全例をチオペンタール・
ナトリウム麻酔下、頚動脈より放血屠殺し、心臓、大動
脈弓、胸大動脈、腹大動脈ならびに肝臓を摘出し、肉眼
的異常の有無を観察した。
ナトリウム麻酔下、頚動脈より放血屠殺し、心臓、大動
脈弓、胸大動脈、腹大動脈ならびに肝臓を摘出し、肉眼
的異常の有無を観察した。
【００１８】(2) 動脈硬化巣形成率 剖検時に摘出した大動脈弓、胸大動脈および腹大動脈を
大動脈弓の小湾側より縦走筋方向に沿って縦に切開した
後、４℃条件下１％ホルマリンＰＢＳに浸漬し、１２時
間以上固定した。ついで、第１肋間動脈分岐部、第１肋
間動脈分岐部より４ｃｍ遠位部、さらに４ｃｍ遠位部の
３か所で切断し、各々弓部大動脈、第１胸部大動脈、第
２胸部大動脈、腹大動脈とした。各々の大動脈はゼロッ
クス法（Hata, Y. et al. : Atherosclerosis, 29, 25
1, 1978) にてその動脈および硬化巣部をトレースし、
画像解析装置（LUZEX II D, ニレコ) を用いて動脈面積
ならびに硬化巣面積を測定し、硬化巣形成率〔硬化巣面
積／動脈内腔面積) ×１００〕を算出した。
大動脈弓の小湾側より縦走筋方向に沿って縦に切開した
後、４℃条件下１％ホルマリンＰＢＳに浸漬し、１２時
間以上固定した。ついで、第１肋間動脈分岐部、第１肋
間動脈分岐部より４ｃｍ遠位部、さらに４ｃｍ遠位部の
３か所で切断し、各々弓部大動脈、第１胸部大動脈、第
２胸部大動脈、腹大動脈とした。各々の大動脈はゼロッ
クス法（Hata, Y. et al. : Atherosclerosis, 29, 25
1, 1978) にてその動脈および硬化巣部をトレースし、
画像解析装置（LUZEX II D, ニレコ) を用いて動脈面積
ならびに硬化巣面積を測定し、硬化巣形成率〔硬化巣面
積／動脈内腔面積) ×１００〕を算出した。
【００１９】(3) 大動脈脂質含量 腹部大動脈を除く動脈硬化巣形成率測定に供した各大動
脈を縦に２分割し、その一方（左側）の内腔面積および
湿重量を測定後、湿重量の２０倍量の２：１（Ｖ／Ｖ）
クロロホルム−メタノール混合液中ですり砕き、さらに
Potter-Elvehjem 型テフロンホモジナイザーでホモジナ
イズすることにより脂質を抽出した [Folch, J. et a
l., J. Biol. Chem., 226 (1957), 497]。ホモジナイズ
終了後、ナイロンメッシュ（１００μｍ）でホモジナイ
ト中の固形物を濾過し、濾液に窒素ガスを吹き込むこと
により最終的に得られた沈渣の脂質を定量した。次い
で、沈渣を脂質溶解用界面活性剤（片山化学工業）に再
溶解し、この溶液について用手法による市販測定キット
を用いて総コレステロール濃度（コレステロールＣテス
ト−ワコー，和光純薬工業）ならびに遊離コレステロー
ル濃度（遊離コレステロールＣテスト−ワコー，和光純
薬工業）を測定した。なお、エステル型コレステロール
濃度は総コレステロールより遊離コレステロール濃度を
減じて求め、各大動脈片の脂質含量は単位動脈内腔面積
当たりとして算出した。
脈を縦に２分割し、その一方（左側）の内腔面積および
湿重量を測定後、湿重量の２０倍量の２：１（Ｖ／Ｖ）
クロロホルム−メタノール混合液中ですり砕き、さらに
Potter-Elvehjem 型テフロンホモジナイザーでホモジナ
イズすることにより脂質を抽出した [Folch, J. et a
l., J. Biol. Chem., 226 (1957), 497]。ホモジナイズ
終了後、ナイロンメッシュ（１００μｍ）でホモジナイ
ト中の固形物を濾過し、濾液に窒素ガスを吹き込むこと
により最終的に得られた沈渣の脂質を定量した。次い
で、沈渣を脂質溶解用界面活性剤（片山化学工業）に再
溶解し、この溶液について用手法による市販測定キット
を用いて総コレステロール濃度（コレステロールＣテス
ト−ワコー，和光純薬工業）ならびに遊離コレステロー
ル濃度（遊離コレステロールＣテスト−ワコー，和光純
薬工業）を測定した。なお、エステル型コレステロール
濃度は総コレステロールより遊離コレステロール濃度を
減じて求め、各大動脈片の脂質含量は単位動脈内腔面積
当たりとして算出した。
【００２０】(4) 血管内膜肥厚率 大動脈脂質含量に供されなかった各大動脈片の一方（右
側）ならびに腹部大動脈をホルマリン・カルシウム固定
液で固定後、４ｍｍ間隔で各々１０小片に細切し、近位
側より交互に脂肪染色用組織（５小片）およびＨ．Ｅ．
染色用組織（５小片）とし、さらにＨ．Ｅ．染色用組織
は１０％中性ホルマリンで再固定を行った。固定後、各
小片は常法に従い、パラフィン切片を作製し、脂肪染色
（オスミウム染色）もしくはＨ．Ｅ．染色を施した。次
いで、画像解析装置を用いて染色法ごとに５小片各々の
内膜面積（肥厚部面積）ならびに中膜面積を測定し、内
膜肥厚率〔｛内膜面積／（中膜面積＋内膜面積）｝×１
００〕を算出後、５小片の平均を各動脈部位の内膜面
積、中膜面積および内膜肥厚率とした。さらに、Ｈ．
Ｅ．染色標本を用いて弓部大動脈の内膜部（肥厚部）の
単位面積（１５６２５μｍ2)当たりの細胞数（核数）を
画像解析装置により測定した。
側）ならびに腹部大動脈をホルマリン・カルシウム固定
液で固定後、４ｍｍ間隔で各々１０小片に細切し、近位
側より交互に脂肪染色用組織（５小片）およびＨ．Ｅ．
染色用組織（５小片）とし、さらにＨ．Ｅ．染色用組織
は１０％中性ホルマリンで再固定を行った。固定後、各
小片は常法に従い、パラフィン切片を作製し、脂肪染色
（オスミウム染色）もしくはＨ．Ｅ．染色を施した。次
いで、画像解析装置を用いて染色法ごとに５小片各々の
内膜面積（肥厚部面積）ならびに中膜面積を測定し、内
膜肥厚率〔｛内膜面積／（中膜面積＋内膜面積）｝×１
００〕を算出後、５小片の平均を各動脈部位の内膜面
積、中膜面積および内膜肥厚率とした。さらに、Ｈ．
Ｅ．染色標本を用いて弓部大動脈の内膜部（肥厚部）の
単位面積（１５６２５μｍ2)当たりの細胞数（核数）を
画像解析装置により測定した。
【００２１】５．試験結果 (1) 剖検 投薬期間終了後の剖検において、心・血管系では全ての
個体の大動脈内膜面に多数の硬化巣の形成は認められた
が、その程度はＭ−ＣＳＦ投与群でより軽度であった
（図１）。
個体の大動脈内膜面に多数の硬化巣の形成は認められた
が、その程度はＭ−ＣＳＦ投与群でより軽度であった
（図１）。
【００２２】(2) 動脈硬化巣形成率 結果を図２に示した。尚、結果は、各群ともに投与期間
終了時の生存例の平均値で示した。弓部、胸部、腹部の
いずれの大動脈においても、Ｍ−ＣＳＦ投与群の硬化巣
形成巣はＨＳＡ投与群より低く、特に胸部大動脈および
腹部大動脈では有意な差が認められた。
終了時の生存例の平均値で示した。弓部、胸部、腹部の
いずれの大動脈においても、Ｍ−ＣＳＦ投与群の硬化巣
形成巣はＨＳＡ投与群より低く、特に胸部大動脈および
腹部大動脈では有意な差が認められた。
【００２３】(3) 大動脈脂質含量 結果を図３に示した。尚、結果は、各群ともに投与期間
終了時の生存例の平均値で示した。定量を実施したいず
れの部位においてもＭ−ＣＳＦ投与群の総コレステロー
ル含量はＨＳＡ投与群より概して低値であり、胸部では
有意な低下が認められた。また、Ｍ−ＣＳＦ投与群の弓
部大動脈の遊離コレステロール含量および近位（第１）
胸部大動脈のエステル型コレステロール含量も有意に低
い値であった。なお、Ｍ−ＣＳＦ投与群の近位（第１）
ならびに遠位（第２）胸部大動脈における単位動脈内腔
面積当たりの遊離コレステロール含量は検出限界以下で
あった。
終了時の生存例の平均値で示した。定量を実施したいず
れの部位においてもＭ−ＣＳＦ投与群の総コレステロー
ル含量はＨＳＡ投与群より概して低値であり、胸部では
有意な低下が認められた。また、Ｍ−ＣＳＦ投与群の弓
部大動脈の遊離コレステロール含量および近位（第１）
胸部大動脈のエステル型コレステロール含量も有意に低
い値であった。なお、Ｍ−ＣＳＦ投与群の近位（第１）
ならびに遠位（第２）胸部大動脈における単位動脈内腔
面積当たりの遊離コレステロール含量は検出限界以下で
あった。
【００２４】(4) 内膜肥厚率 脂肪染色を施した標本を用いて測定した結果を図４、図
５に示した。尚、結果は、各群ともに投与期間終了時の
生存例の平均値で示した。中膜面積は両投与群で差は認
められなかったが、Ｍ−ＣＳＦ投与群の内膜面積（肥厚
面積）は、弓部大動脈、胸部大動脈、腹部大動脈のいず
れの部位においても有意に低値であった（図４）。さら
に、中膜面積と内膜面積（肥厚面積）より算出した内膜
肥厚率においてもＭ−ＣＳＦ投与群のいずれの部位とも
に有意に低値であった（図５）。また、これらの変化は
Ｈ．Ｅ．染色標本（図６，７，８，９）を用いて測定し
た場合においても同様であった尚、Ｍ−ＣＳＦ投与群の
弓部大動脈内膜（肥厚）部分に存在する単位面積当たり
の細胞数は、ＨＳＡ投与群より増加していた（Ｍ−ＣＳ
Ｆ投与群：2236.3±652.2 個/15625μｍ2 、ＨＳＡ投与
群：199.8 ±111.4 個/15625μｍ2 、ｐ≧０．０５) 。
５に示した。尚、結果は、各群ともに投与期間終了時の
生存例の平均値で示した。中膜面積は両投与群で差は認
められなかったが、Ｍ−ＣＳＦ投与群の内膜面積（肥厚
面積）は、弓部大動脈、胸部大動脈、腹部大動脈のいず
れの部位においても有意に低値であった（図４）。さら
に、中膜面積と内膜面積（肥厚面積）より算出した内膜
肥厚率においてもＭ−ＣＳＦ投与群のいずれの部位とも
に有意に低値であった（図５）。また、これらの変化は
Ｈ．Ｅ．染色標本（図６，７，８，９）を用いて測定し
た場合においても同様であった尚、Ｍ−ＣＳＦ投与群の
弓部大動脈内膜（肥厚）部分に存在する単位面積当たり
の細胞数は、ＨＳＡ投与群より増加していた（Ｍ−ＣＳ
Ｆ投与群：2236.3±652.2 個/15625μｍ2 、ＨＳＡ投与
群：199.8 ±111.4 個/15625μｍ2 、ｐ≧０．０５) 。
【００２５】以上の試験結果より明らかなように、Ｍ−
ＣＳＦ投与群では、動脈硬化巣形成率、脂質含量および
内膜肥厚率の有意な低下が確認された。
ＣＳＦ投与群では、動脈硬化巣形成率、脂質含量および
内膜肥厚率の有意な低下が確認された。
【００２６】試験例２（急性毒性） ラット１０匹を５匹ずつの２群に分け、それぞれにＭ−
ＣＳＦを１ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で尾
静脈より投与した。いずれの投与量でも死亡例は認めら
れず、ＬＤ50は１ｍｇ／ｋｇ以上と考えられた。
ＣＳＦを１ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で尾
静脈より投与した。いずれの投与量でも死亡例は認めら
れず、ＬＤ50は１ｍｇ／ｋｇ以上と考えられた。
【００２７】
【作用・効果】本発明の有効成分であるＭ−ＣＳＦは、
動脈硬化巣の形成を抑制するとともに、弓部大動脈を含
めた各大動脈の内膜肥厚を特異的にかつ有意に改善する
作用を有するため、哺乳動物（例えば、マウス、ラッ
ト、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒトなど）における動脈硬化
に起因する血管内膜肥厚改善剤として有用である。
動脈硬化巣の形成を抑制するとともに、弓部大動脈を含
めた各大動脈の内膜肥厚を特異的にかつ有意に改善する
作用を有するため、哺乳動物（例えば、マウス、ラッ
ト、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒトなど）における動脈硬化
に起因する血管内膜肥厚改善剤として有用である。
【図１】Ｍ−ＣＳＦ、ＨＳＡを１２週間筋肉内反復投与
した、コレステロール食負荷ラビットの大動脈（大動脈
弓〜腹大動脈）内膜面を示す。
した、コレステロール食負荷ラビットの大動脈（大動脈
弓〜腹大動脈）内膜面を示す。
【図２】Ｍ−ＣＳＦ、ＨＳＡを１２週間筋肉内反復投与
した、コレステロール食負荷ラビットの各大動脈部位に
おける硬化巣形成率を示す。
した、コレステロール食負荷ラビットの各大動脈部位に
おける硬化巣形成率を示す。
【図３】Ｍ−ＣＳＦ、ＨＳＡを１２週間筋肉内反復投与
した、コレステロール食負荷ラビットの各大動脈部位に
おける脂質含量（総コレステロール含量、エステル型コ
レステロール含量、遊離コレステロール含量）を示す。
した、コレステロール食負荷ラビットの各大動脈部位に
おける脂質含量（総コレステロール含量、エステル型コ
レステロール含量、遊離コレステロール含量）を示す。
【図４】Ｍ−ＣＳＦ、ＨＳＡを１２週間筋肉内反復投与
した、コレステロール食負荷ラビットの各大動脈部位の
内膜面積（肥厚面積）、中膜面積を示す。
した、コレステロール食負荷ラビットの各大動脈部位の
内膜面積（肥厚面積）、中膜面積を示す。
【図５】Ｍ−ＣＳＦ、ＨＳＡを１２週間筋肉内反復投与
した、コレステロール食負荷ラビットの各大動脈部位の
内膜肥厚率を示す。
した、コレステロール食負荷ラビットの各大動脈部位の
内膜肥厚率を示す。
【図６】Ｍ−ＣＳＦを１２週間筋肉内反復投与した、コ
レステロール食負荷ラビットの各大動脈部位（大動脈弓
・近位（第１）胸大動脈）のＨ．Ｅ．染色の顕微鏡写真
を示す。
レステロール食負荷ラビットの各大動脈部位（大動脈弓
・近位（第１）胸大動脈）のＨ．Ｅ．染色の顕微鏡写真
を示す。
【図７】Ｍ−ＣＳＦを１２週間筋肉内反復投与した、コ
レステロール食負荷ラビットの各大動脈部位（遠位（第
２）胸大動脈・腹大動脈）のＨ．Ｅ．染色の顕微鏡写真
を示す。
レステロール食負荷ラビットの各大動脈部位（遠位（第
２）胸大動脈・腹大動脈）のＨ．Ｅ．染色の顕微鏡写真
を示す。
【図８】ＨＳＡを１２週間筋肉内反復投与した、コレス
テロール食負荷ラビットの各大動部位（大動脈弓・近位
（第１）胸大動脈）のＨ．Ｅ．染色の顕微鏡写真を示
す。
テロール食負荷ラビットの各大動部位（大動脈弓・近位
（第１）胸大動脈）のＨ．Ｅ．染色の顕微鏡写真を示
す。
【図９】ＨＳＡを１２週間筋肉内反復投与した、コレス
テロール食負荷ラビットの各大動部位（遠位（第２）胸
大動脈・腹大動脈）のＨ．Ｅ．染色の顕微鏡写真を示
す。
テロール食負荷ラビットの各大動部位（遠位（第２）胸
大動脈・腹大動脈）のＨ．Ｅ．染色の顕微鏡写真を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ (72)発明者 岩井 正和 兵庫県神崎郡福崎町山崎214番地の１ 株 式会社ミドリ十字安全性研究所内 (72)発明者 中村 憲史 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 横山 和正 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 マクロファージコロニー刺激因子を有効
成分とする血管内膜肥厚改善剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5352473A JPH07188048A (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 血管内膜肥厚改善剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5352473A JPH07188048A (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 血管内膜肥厚改善剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07188048A true JPH07188048A (ja) | 1995-07-25 |
Family
ID=18424312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5352473A Pending JPH07188048A (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 血管内膜肥厚改善剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07188048A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7507705B2 (en) | 1997-10-02 | 2009-03-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Methods for the modulation of neovascularization and/or the growth of collateral arteries and/or other arteries from preexisting arteriolar connections |
-
1993
- 1993-12-27 JP JP5352473A patent/JPH07188048A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7507705B2 (en) | 1997-10-02 | 2009-03-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Methods for the modulation of neovascularization and/or the growth of collateral arteries and/or other arteries from preexisting arteriolar connections |
| US8101188B2 (en) | 1997-10-02 | 2012-01-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Methods for the modulation of neovascularization and/or the growth of collateral arteries and/or other arteries from preexisting arteriolar connections |
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