KR100761675B1

KR100761675B1 - 간 실질세포 증식인자 투여용 제제

Info

Publication number: KR100761675B1
Application number: KR1020017001435A
Authority: KR
Inventors: 나가노도모카즈; 가와무라다카오; 다이지무쓰오; 구도이쿠에; 노구치히로시; 다니슈ㄴ스케; 마에다히로오
Original assignee: 나카무라 도시카즈
Priority date: 1998-08-05
Filing date: 1999-08-04
Publication date: 2007-10-04
Also published as: CN1315867A; EP1103269B1; AU5065599A; CA2339378A1; KR20010072207A; ATE499946T1; EP1103269A1; US6887477B1; TWI263502B; CN1222310C; DE69943240D1; WO2000007615A1; EP1103269A4

Abstract

본 발명은 간 실질세포 증식인자(HGF)를 유효 성분으로서 함유하며 허혈성 질환 또는 동맥 질환을 치료하거나 예방하기 위한 투여용 제제에 관한 것이다.

정맥내 투여와 비교하여 HGF가 투여된 환부의 HGF 농도가 유지되어 반감기가 길며 투여량을 감소시킬 수 있으며, 또한 환부 이외에 대한 작용이 적다는 효과가 있다.

간 실질세포 증식인자(HGF), 근육내 투여, 허혈성 질환, 동맥 질환, 반감기

Description

간 실질세포 증식인자 투여용 제제{Preparations for the administration of hepatocyte growth factor}

본 발명은 간 실질세포 증식인자(HGF)를 유효 성분으로서 함유하며 허혈성 질환 또는 동맥 질환을 치료하거나 예방하기 위한 투여용 제제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 심장 또는 사지의 허혈성 질환 또는 동맥 질환을 치료하거나 예방하기 위해 환부 및 이의 주변의 근육 국소부위에 투여하는 것으로 이루어진 근육내 투여용 제제 등에 관한 것이다.

간 실질세포 증식인자(HGF)는 성숙 간세포에 대한 강력한 증식 촉진인자로서 발견되며 이의 유전자 클로닝이 이루어진 단백질이다[참조: Biochem Biophys Res Commun, 122, 1450(1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6489, (1986), FEBS Letter, 22, 231(1987), Nature, 342, 440(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 320O(1991)]. 이후의 연구에 따라 HGF는 생체내에서 간 재생인자로서 장애 간의 회복 재생에 작용할 뿐만 아니라 혈관 신생작용을 가지며 허혈성 질환이나 동맥 질환의 치료 또는 예방에 큰 역할을 다하고 있는 것이 명백해졌다[참조: Symp. Soc. Exp. Biol., 47cell behavior, 227-234(1993), Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 1937-1941(1993), Circulation, 97, 381-390(1998)]. 즉, 토끼의 하지 허혈 모델에서 HGF를 투여하면 현저한 혈관 신생이 나타나며 혈류량의 개선, 혈압 감소의 억제, 허혈 증상의 개선이 나타난다는 보고가 이루어지고 있다. 이들 보고에 따라 오늘날에는 혈관 신생인자의 하나로서 HGF가 발현, 기능하고 있다고 생각하게 되었다.

이와 같이 HGF는 혈관 신생인자의 기능을 비롯하여 각종 기능을 가지고 있으며 의약품으로서 활용하기 위한 여러가지 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 여기서 문제가 되고 있는 것은 HGF의 혈중에서의 반감기이다. HGF의 반감기는 약 10분으로 짧으며 혈중 농도를 유지하는 것이 곤란하며 또한 HGF 유효량의 환부로의 이행성이 문제가 된다.

일반적으로 단백질성 제제의 경우에는 정맥내로의 투여가 많은 것이 상식으로 되어 있으며 허혈성 질환 모델에 대한 HGF의 투여에 관해서도 예를 들면, 정맥이나 동맥내로의 투여의 예가 기재되어 있다[참조: Circulation, 97, 381-390(1998)]. 이러한 동물 모델에 대한 정맥 또는 동맥내 투여에 따라 허혈성 질환 또는 동맥 질환에 대한 HGF의 유효성이 명백하게 되고 있지만 구체적인 HGF의 효과적인 투여방법 또는 투여량 등에 관해서는 아직 결론이 나고 있지 않다. 특히 HGF의 경우에는 상기와 같은 반감기의 문제, 환부로의 이행성의 문제도 있으며 HGF의 효과적인 투여법 또는 투여량 등에 관해서는 아직 결론이 나고 있지 않다.

본 발명은 HGF를 유효 성분으로서 함유하며 허혈성 질환 또는 동맥 질환을 치료하거나 예방하기 위한 투여용 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게는 심장 또는 사지의 허혈성 질환 또는 동맥 질환을 치료하거나 예방하기 위해 환부 및 이의 주변의 근육 국소부위에 투여하는 것으로 이루어진 근육내 투여용 제제 등에 관한 것이다. 본 발명의 근육내 투여용 제제는 예를 들면, 장애부위인 심장, 사지의 허혈 부위의 근육내에 직접 투여되는 것이며 투여된 HGF의 이용 효율이 매우 높으며 정맥내 투여와 비교하여 투여량을 감소시킬 수 있다. 또한 투여 부위인 근육으로부터 혈액 중에서 투여 부위의 근육조직 및 이의 주변의 조직을 제외한 전신으로의 이행, 분포, 작용이 적으므로 다른 부위로의 작용을 경감시킬 수 있으며 보다 선택성이 높다는 효과가 있다.

본 발명자들은 HGF를 허혈성 질환 또는 동맥 질환에 적용하는 데 있어서 투여량, 투여법의 검토를 예의 실시하고 있다. 상기한 질환에 대한 HGF의 투여법으로서 정맥내 일시(bolus) 투여, 정맥내 지속 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 근육내 투여 등의 방법을 상정하여 검토를 실시해 왔다.

상기한 바와 같이 일반적으로 단백질성 제제의 경우에는 정맥내 투여가 많은 것이 상식으로 되어 있으며 추가하여 허혈성 질환 및 동맥 질환이 혈관 상해라는 관점에서 상식적으로 약제가 혈관의 내측으로부터 작용하는 것이 효과적이다. 따라서 허혈성 질환 모델이나 동맥 질환 모델에 대한 HGF의 투여에 관해서도 정맥 또는 동맥내로의 투여의 예가 대부분이며 HGF의 근육내로의 투여에 관한 정보를 포함하는 문헌이 없으며 또한 HGF의 체내 동태에 관해서도 보고를 찾아낼 수 없다. 이와 같이 허혈성 질환 모델이나 동맥 질환 모델에 대하여 HGF의 근육내 투여를 시도한 보고는 이루어지고 있지 않으며 따라서 HGF의 근육내 투여가 효과적인지 여부에 관해서는 지금까지 전혀 명백하지 않다.

본 발명자들은 래트를 사용하여 하지 허혈부위에 대한 근육내 투여의 체내 동태와 다른 투여경로(정맥내 투여)의 체내 동태를 비교 검토했다. 그 결과, 근육내 투여의 경우에는 정맥내 투여하는 경우와 비교하여 투여된 HGF가 투여 부위에서 대단히 높은 농도로 유지되며 혈청중 및 간장이나 신장으로의 이행이 낮은 것이 명백해졌다. 또한 HGF를 피하투여하는 경우에도 근육내 투여와 동일하게 투여 부위에서의 HGF 농도가 높게 유지되며 투여 부위로부터 순환 혈중으로의 이행율은 낮다.

한편, HGF를 정맥내 투여하는 경우에는 혈중의 HGF 농도가 높게 유지되는 것에 대해 근육내에서의 HGF 농도는 극단적으로 낮은 것으로 밝혀졌다. 이러한 점으로부터 허혈 환부 및 이의 주변의 근육 또는 여기에 존재하는 혈관에 HGF를 작용시키려고 하는 경우에는 정맥내 투여로는 효율이 불량하며 환부 또는 이의 주변의 근육내로 직접 투여하는 것이 효과적임을 처음으로 명백하게 했다.

또한 HGF의 근육내 투여와 정맥내 일시 투여를 비교한 바, 근육내 투여에서는 혈액, 간장 및 신장에서의 최대 농도가 정맥내 일시 투여의 경우의 100분의 1 이하, 보다 적절하게는 1000분의 1 이하로 되는 것을 밝혀냈다. 또한 근육내 투여에서는 투여 부위의 근육 조직내 농도가 정맥내 일시 투여의 경우의 50배 이상, 보다 적절하게는 200배 이상으로 되는 것이 밝혀졌다.

또한 혈액, 간장 및 신장에서의 AUC를 근육내 투여와 정맥내 일시 투여로 비 교한 바, 근육내 투여에서는 혈액, 간장 및 신장에서의 AUC가 정맥내 일시 투여의 5분의 1 이하, 보다 적절하게는 10분의 1 이하로 되는 것을 밝혀냈다. 또한 투여 부위의 근육 조직내 AUC는 근육내 투여에서는 정맥내 일시 투여의 50배 이상, 보다 적절하게는 200배 이상으로 되는 것이 밝혀졌다.

상기와 같이 근육내 투여에 의해, 환부의 투여 부위에 HGF가 고농도로 유지됨을 깨달아 다음에 근육 조직내의 HGF가 환부의 조직이나 혈관으로 이행하여 HGF로서 실질적으로 작용하고 있는지의 여부를 조사하였다. 즉, HGF의 수용체인 c-Met의 인산화의 발생 여부를 지표로서 HGF의 기능을 확인하였다. 그 결과, 30 내지 3000μg/kg의 HGF를 래트 근육내에 투여하는 경우, 근육 조직에서는 HGF의 수용체인 c-Met의 Tyr 잔기가 인산화되어 활성화되어 있지만 간장이나 신장 조직에서는 무처치(無處置) 그룹과 비교하여 c-Met는 전혀 활성화되어 있지 않은 것이 명백해졌다. 이러한 점은 투여하는 근육 조직에서 HGF는 그 작용을 발휘하며 간장이나 신장에서는 작용을 나타내지 않는 것을 의미하고 있다.

상기와 같이 HGF의 작용이 확인되므로 본 발명자들은 실제로 HGF의 근육내 투여에 의한 유효성을 조사하기 위해 폐색성 동맥 경화증(ASO)의 동물 모델을 사용하여 검토하였다. 즉, 래트 하지 허혈 모델을 사용하여 근육내 투여를 실시하는 경우, 하지의 허혈 장애가 어떻게 개선되는지를 검토하였다. 검토방법으로서 하지의 피부 표면온도를 써모그래피를 사용하여 측정하며 피부 표면온도의 저하 억제를 지표로 근육내 투여 효과를 확인하였다. 그 결과, 이러한 근육내 투여에 의해 허혈 하지에서의 피부 표면온도의 저하가 억제되는 것을 밝혀냈다. 이것은 HGF가 가 지는 혈관 신생작용에 의해 허혈 하지의 혈행 동태가 개선되어 온도의 저하가 억제되는 것을 나타낸다.

이상과 같이 ASO 모델에 대한 HGF의 근육내 투여의 유효성이 처음으로 명백해졌다.

또한 본 발명자들은 래트 하지 허혈 ASO 모델 및 토끼 하지 허혈 AS0 모델을 사용하여 근육내 투여를 실시하고 I/N 비(%)[허혈지(肢) 혈압/정상지(肢) 혈압×100]를 조사하였다. 그 결과, 저투여량·저투여 빈도에서 I/N 비의 유의적인 개선이 확인된다. 이것은 HGF가 가지는 혈관 신생작용에 의해 허혈지의 혈행 동태가 개선되는 것을 나타낸다. 또한 토끼 모델에 관해서는 혈관 조영(造影)도 실시한 바, HGF 투여 그룹 쪽이 유의적으로 혈관 조영 스코어(score)의 증가율이 높다. 이러한 점은 즉, HGF의 작용에 의해 측부(側副) 혈행로의 발달이 촉진된 것을 나타낸다. 또한 허혈지 관절의 경화도, 허혈지 손톱 끝의 괴사·탈락 및 허혈지 하퇴부의 궤양의 유무에 관해서도 아울러 조사한 바, HGF의 근육내 투여에 의해 개선되는 경향이 확인되었다.

이상과 같이 허혈성 질환에 대한 HGF의 근육내 투여가 매우 유효한 것이 명백해졌다.

상기한 실험결과 중에서 써모그래피(thermography)를 사용하여 유효성이 확인될 수 있는 것은 임상의 ASO 환자, 특히 경증의 단계에서 자각증상으로서 허혈 하지의 냉감을 갖는 환자에 대하여도 HGF의 근육내 투여가 효과적인 것을 의미하고 있으며 추가하여 I/N 비나 혈관 조영의 회복 촉진, 또한 허혈지 증상의 경감 등의 개선효과도 확인할 수 있는 것은 초기의 ASO 환자로부터 중증인 ASO 환자까지 이러한 HGF의 근육내 투여에 의한 치료가 효과적인 것을 나타낸다. 이러한 점은 허혈에 따른 하지의 절단 등이 필요한 중증인 ASO로 진행하기 전에 경증의 단계에서 AS0의 치료를 할 수 있게 하는 것이며 따라서 본 발명의 근육내 투여용 제제는 현재 효과적인 치료방법이 아직 없는 많은 경증의 ASO 환자에게 있어서 병적 상태의 진행을 억제, 개선·회복할 수 있다는 획기적인 치료법을 제공할 수 있다. 또한 저투여량으로 효과를 나타내며 또한 정맥내 투여와 비교하여 환부 이외에 대한 작용이 적은 의약품을 제공할 수 있다.

또한 상기와 같은 HGF의 효과를 더욱 발휘시키기 위해서는 콘드로이틴황산 등의 세포외 기질을 구성하는 프로테오글리칸 및 이들을 성분으로서 함유하는 단백질 담체를 함유하지 않는 HGF 제제가 바람직한 것도 명백해졌다. 즉, 콜라겐을 기질로 하여 제조한 미니 펠릿으로부터 HGF의 방출에 대한 콘드로이틴황산 배합의 영향을 검토한 바, 콘드로이틴황산을 배합한 HGF 함유 미니 펠릿에서는 콘드로이틴황산을 배합하지 않고 알라닌을 배합한 HGF 함유 미니 펠릿과 비교하여 미니 펠릿으로부터 HGF의 방출이 빠르다는 결과가 얻어진다. 이러한 점은 콘드로이틴황산 등의 세포외 기질을 구성하는 프로테오글리칸을 배합하지 않은 HGF 제제 쪽이 HGF의 방출이 느린 것을 나타낸다. 이것은 상기한 바와 같이 콘드로이틴황산 등의 세포외 기질을 구성하는 프로테오글리칸을 함유하지 않은 HGF 제제 쪽이 투여 국소 조직에서 유지되기 쉬우며 혈액을 통한 전신의 다른 장기로의 이행, 분포를 억제할 수 있는 것을 의미하고 있다.

본 발명은 상기와 같은 발견에 근거하여 이루어진 것이다. 즉 본 발명은

(1) HGF를 유효 성분으로 하고 투여 부위인 국소 조직 및 이의 근방 조직에 유효량의 당해 인자를 이행·분포·작용시키고 또한 투여 부위 이외의 혈액중 및 전신 조직으로의 이행·분포·작용을 감소시킬 수 있는 제제,

(2) (1)에 있어서, 허혈성 질환 또는 동맥 질환을 치료하거나 예방하기 위한 제제,

(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 투여 부위가 근육인 근육내 투여용 제제.

(4) (1) 또는 (2)에 있어서, 투여 부위가 피하 또는 표피인 피하 투여용 제제, 외용제 또는 퍼프제,

(5) (3)에 있어서, 투여 부위가 골격근 또는 심근인 근육내 투여용 제제,

(6) (1), (2), (3) 및 (5) 중의 어느 하나에 있어서, 투여 부위인 근육 조직으로의 이행·분포·작용이 혈액, 간장 및 신장으로의 이행·분포·작용을 능가함을 특징으로 하는 제제,

(7) (1), (2), (3), (5) 및 (6) 중의 어느 하나에 있어서, HGF를 유효 성분으로서 함유하는 제제의 동일량을 정맥내 일시 투여한 경우와 비교하여 혈액, 간장 및 신장에서의 최대 농도가 100분의 1이하이며 투여 부위인 근육 조직내 농도가 50배 이상임을 특징으로 하는 근육내 투여용 제제.

(8) (1), (2), (3), (5) 및 (6) 중의 어느 하나에 있어서, HGF를 유효 성분으로서 함유하는 제제의 동일량을 정맥내 일시 투여한 경우와 비교하여 혈액, 간장 및 신장에서의 AUC가 5분의 1이하이며 투여 부위인 근육 조직내 AUC가 50배 이상임을 특징으로 하는 근육내 투여용 제제,

(9) (1), (2), (3), (5), (6), (7) 및 (8) 중의 어느 하나에 있어서, 심장 또는 사지의 허혈성 질환 또는 동맥 질환을 치료하거나 예방하기 위한 근육내 투여용 제제,

(10) (9)에 있어서, 심장 또는 사지의 허혈성 질환 또는 동맥 질환을 치료하거나 예방하기 위한 투여 부위가 환부 및 이의 주변의 근육 국소인 근육내 투여용 제제,

(11) (1), (2), (3), (5), (6), (7), (8), (9) 및 (10) 중의 어느 하나에 있어서, 1회 투여량이 0.01 내지 500μg/kg임을 특징으로 하는 근육내 투여용 제제,

(12) (11)에 있어서, 1회 투여량이 0.1 내지 10μg/kg임을 특징으로 하는 근육내 투여용 제제,

(13) (1) 내지 (12) 중의 어느 하나에 있어서, 동맥 질환이 폐색성 동맥 경화증인 제제,

(14) (1) 내지 (12) 중의 어느 하나에 있어서, 허혈성 질환이 허혈성 심질환인 제제 및

(15) (1) 내지 (14) 중의 어느 하나에 있어서, HGF를 유효 성분으로서 함유하며 또한 HGF를 결합·흡착하는 물질을 함유하지 않음을 특징으로 하는 제제에 관한 것이다.

도 1은 래트 대퇴 후부 근육내에 HGF를 투여한 후의 근육중 농도 추이를 도시하는 도면이다.

도 2는 래트 대퇴부 근육내에 HGF를 투여한 후의 혈청중의 농도 추이를 도시하는 도면이다.

도 3은 래트 대퇴부 근육내에 HGF를 투여한 후의 간장중의 농도 추이를 도시하는 도면이다.

도 4는 래트 대퇴부 근육내에 HGF를 투여한 후의 신장중의 농도 추이를 도시하는 도면이다.

도 5는 래트 하지 허혈 모델의 피부 표면온도에 대한 HGF의 개선효과를 도시하는 그래프이다.

도 6은 HGF 함유 콜라겐 미니 펠릿으로부터 HGF의 방출을 도시하는 도면이다.

도 7은 래트 대퇴부 근육내에 HGF를 투여한 후의 근육, 간장, 신장에서의 c-Met의 인산화를 도시하는 도면이다.

도 8은 래트 하지 허혈 ASO 모델에 대하여 HGF를 근육내 투여하여 I/N 비(%)(허혈지 혈압/정상지 혈압×100)를 조사한 결과를 도시하는 도면이다.

도 9는 토끼 하지 허혈 ASO 모델에 대하여 HGF를 근육내 투여하여 하지 혈압의 I/N 비의 추이를 조사한 결과를 도시하는 도면이다.

도 10은 토끼 하지 허혈 ASO 모델에 대하여 HGF를 근육내 투여하여 하지 혈 압의 I/N 비의 증가율을 조사한 결과를 도시하는 도면이다.

도 11은 토끼 하지 허혈 ASO 모델에 대하여 HGF를 근육내 투여하여 혈관 조영 스코어의 증가율을 조사한 결과를 도시하는 도면이다.

도 12는 래트 하지 허혈 ASO 모델에 대하여 HGF를 근육내 투여(1μg/kg×2회 투여)하여 I/N 비를 조사한 결과를 도시하는 도면이다.

도 13은 래트 하지 허혈 ASO 모델에 대하여 HGF를 근육내 투여(3μg/kg×1회 투여)하여 I/N 비를 조사한 결과를 도시하는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최상의 양태

본 발명에서 사용되는 HGF는 공지된 물질이며 의약으로서 사용할 수 있는 정도로 정제된 것이면 각종 방법으로 조제된 것을 사용할 수 있으며 또한 이미 시판되고 있는 제품(예: 도요보가부시키가이샤, Code No. HGF-101 등)을 사용할 수 있다. HGF의 제조법으로서는 예를 들면, HGF를 생성하는 초대 배양세포나 주화(株化) 세포를 배양하고 배양 상등액 등으로부터 분리, 정제하여 당해 HGF를 수득할 수 있다. 또는 유전공학적 방법에 의해 HGF를 암호화하는 유전자를 적절한 벡터에 편입하고 이것을 적당한 숙주에 삽입하여 형질전환시키고 이러한 형질전환체의 배양 상등액에서 목적하는 재조합 HGF를 얻을 수 있다[참조: Nature, 342, 440(1989), 일본 공개특허공보 제(평)5-111383호, Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 967(1989) 등]. 상기한 숙주세포는 특별히 한정되지 않으며 종래부터 유전공학적 방법에서 사용되고 있는 각종의 숙주세포, 예를 들면, 대장균, 효모 또는 동 물세포 등을 사용할 수 있다. 이와 같이 수득된 HGF는 천연형 HGF와 실질적으로 동일한 작용을 갖는 한, 이의 아미노산 서열중의 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가될 수 있으며 또한 동일하게 당쇄가 치환, 결실 및/또는 부가될 수 있다.

본 발명의 HGF 함유 제제는 투여 부위인 국소 조직 및 이의 근방 조직에 유효량의 당해 인자를 이행·분포·작용시키며 또한 투여 부위 이외의 혈액중 및 전신의 조직으로의 이행·분포·작용을 감소시킬 수 있음을 특징으로 한다.

구체적인 적용 질환으로서는 예를 들면, 허혈성 질환 또는 동맥 질환이라고 하는 현재까지 HGF의 약효가 확인되어 있는 모든 순환기 계통의 질환을 들 수 있다. 즉, 심질환으로서는 허혈성 심질환, 심근 경색, 급성 심근 경색, 심근증, 협심증, 불안정 협심증, 관동맥 경화, 심부전 등을 들 수 있으며 사지 허혈성 질환으로서는 폐색성 동맥 경화증, 바쟈병, 혈관 손상, 동맥 색전증, 동맥 혈전증, 장기 동맥폐색, 동맥류 등을 들 수 있다.

투여방법으로서는 상기와 같이 투여 부위인 국소 조직 및 이의 근방 조직에 유효량의 HGF를 이행·분포·작용시키며 또한 투여 부위 이외의 혈액중 및 전신의 조직으로의 이행·분포·작용을 감소시킬 수 있는 투여방법이면 어떠한 투여방법이라도 양호하다. 구체적으로는 근육(골격근, 심근)내 투여, 피하 또는 표피에 대한 투여를 들 수 있다. 투여형태로서는 예를 들면, 주사용 수성제 또는 유성제, 연고제, 크림제, 로숀제, 에어로졸제, 퍼프제 등을 들 수 있다. 또한 서방성의 미니 펠릿 제제를 조제하여 환부 근처에 채우거나 삼투압 펌프 등을 사용하여 환부에 연속적으로 서서히 투여할 수 있다. 이들 제제는 종래부터 공지된 기술을 사용하여 조제하며 유효 성분인 HGF에 대해 필요에 따라 pH 조정제, 완충제, 안정화제, 보존제 또는 가용화제 등을 첨가할 수 있다.

이때에 본 발명의 HGF 함유 제제는 HGF에 결합·흡착되는 물질을 함유하지 않는 제제인 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에서 처음으로 제시한 콘드로이틴황산 등의 세포외 기질의 구성 성분을 배합하지 않은 HGF 제제는 이를 배합한 것과 비교하여 투여 부위로부터 HGF의 방출이 느리다는 특징이 있다. 따라서 투여국소로부터 혈중, 다른 장기로의 대량의 이행을 억제할 수 있다. 또한 콘드로이틴황산과 동일하게 세포외 기질의 구성 성분인 발린을 배합함으로써 혈중 제거가 억제되는 것이 공지되어 있지만[참조: Hepatology, 20, 417(1994)], 본 발명의 제제는 세포외 기질의 구성 성분을 함유하지 않으므로 혈중으로 이행한 HGF의 제거를 억제하지 않는다. 따라서 다른 장기으로의 이행성, 반응성을 보다 억제하며 투여 부위인 근육에서의 유효성을 높일 수 있다고 생각된다.

여기서 HGF에 흡착·결합하는 물질로서는 예를 들면, 세포외 기질(매트릭스)의 구성 성분인 당, 당단백질, 당지질, 복합 당질 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 콘드로이틴황산, 헤파란황산, 헤파린, 헤파린형 물질 등을 들 수 있다. 황산기 등을 함유하는 당, 당단백질, 당지질, 복합 당질 등의 HGF에 결합·흡착되는 물질도 동일하다. 또한 생체 구성성분에 한정되지 않으며 상기한 당, 당단백질, 당지질, 복합 당질의 일부분을 함유함으로써 HGF에 흡착·결합되는 물질도 동일하다. 또한 HGF에 흡착·결합하는 물질로서는 단백질 제제에 사용되는 단백질, 당단백질 등의 단백질 담체 또는 이들에 함유되는 HGF에 결합·흡착되는 물질도 포함된다. HGF에 흡착·결합하는 물질로서 단백질 담체에 미량으로 함유되는 HGF에 결합·흡착되는 물질도 이러한 범주에 포함된다. 상기와 같은 HGF에 결합·흡착되는 물질을 함유하지 않는 것이 본 발명의 HGF 함유 제제로서 바람직하다.

또한 단백질 제제에서 pH나 이온 강도, 이온 농도 등의 조건 또는 화학 개질 등에 따라 단백질의 중합 비율 등의 물성이 상이한 것이 공지되어 있다. 이러한 단백질의 물성이 상이한 것도 근육 등의 투여된 조직에서 본 발명의 투여용 제제의 유지, 혈중으로의 이행성에 영향을 준다고 생각된다.

하기의 실시예에 기재된 바와 같이 본 발명의 투여용 제제는 투여량이 적은 것을 특징으로 한다. 투여량은 환자의 증상, 연령, 성별 등에 따라 상이하지만 예를 들면, 성인 환자의 환부 또는 이의 주변에 근육내 투여하는 경우, 하기의 투여량을 들 수 있다.

즉, 1)본 실시예에서 1μg/kg의 투여량으로 유효성이 확인되는 점, 2)본 실시예로 유효성이 확인된 래트의 투여량(체중당)을 체표면적당 투여량으로 환산하여 사람 유효 투여량을 추정하면 0.2μg/kg 정도라고 생각되는 점 및 3)당업자의 기술상식 등을 감안하면 본 발명의 제제의 투여량으로서는 적어도 500μg/kg/회 이하, 보다 구체적으로는 O.01 내지 500μg/kg/회, 바람직하게는 0.1 내지 10μg/kg/회 정도를 들 수 있다. 또한 투여기간·투여빈도로서는 길어도 3개월 이내의 투여기간 동안 주 1 또는 2회의 투여빈도를 들 수 있으며, 바람직하게는 1주간 이내의 투여기간 동안 주 7회 이하의 투여빈도를 들 수 있다. 보다 바람직하게는 1주간 이내의 투여기간 동안 1회 또는 2회의 투여빈도를 들 수 있다.

본 발명의 투여용 제제를 적용하는 환자의 투여 부위의 특정 및 투여방법으로서는 하기의 것을 들 수 있다. 예를 들면, 폐색성 동맥 경화증의 허혈지의 진단에서는 안정시의 동통, 간헐성 파행, 궤양의 유무, 트레드 밀을 사용하는 보행할 수 있는 거리의 측정, 도플러 혈류계 등을 사용하는 발목 압력 지수(Ankle Pressure Index)[하지 혈압과 상완(上腕) 혈압의 비]의 측정을 실시하고 허혈지, 허혈 영역을 추정한다. 조영제를 사용하는 혈관 조영(Angiography), 디지탈 공제 조영(Digital Subtraction Angiography), 자기 공명 조영(Magnetic Resonance Angiography) 등에 의해 혈관의 협착, 폐색 부위를 상세하게 특정한다. 팔다리의 상태의 판정에 관해서는 예를 들면, 기관[Society for Vascu1ar Surgery/North American Chapter and International Society for Cardiovascu1ar Surgery]에 의해 추천된 표준서 등에 따른다. 혈관 조영 등에 따라 특정된 허혈 부위의 근육 및 이의 주변의 근육에 대해 본 발명의 투여 제제를 이의 영역의 크기에 따라 1개소 내지 20개소, 바람직하게는 3개소 내지 6개소로 나누어 투여한다.

또한 본 발명의 근육내 투여용 제제는 상기한 치료 목적 이외에 예방용으로 사용할 수 있다.

하기에 실시예에 따라 본 발명을 구체적으로 설명하며 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되지 않는다.

실시예 1

투여경로에 의한 HGF의 체내 동태의 비교

1. 근육내 투여에 의한 HGF의 체내 동태의 검토

(1) 방법

피셔계 래트를 사용하여 HGF를 0.3, 1, 3mg/kg로 근육내 투여하는 경우와 6, 60, 600μg/kg/hr로 3시간 동안 정맥내 지속 투여하는 경우의 혈청, 간장, 신장, 근육(투여부 및 상대측) 중의 HGF 농도를 측정한다. 근육내 투여는 에테르 마취하에 래트의 좌대퇴 후부 근육의 중앙부에 실시한다. 투여 용량은 1ml/kg으로 하며 O.3M NaCl, 0.03% 트윈(Tween) 80, 5mg/ml L-알라닌을 함유하는 10mM 시트르산 완충액(pH 5.5)을 비이클(vihicle)로서 사용한다. HGF 투여로부터 5분, 30분, 2시간, 8시간, 24시간 경과후, 래트로부터 혈청, 간 좌측엽, 신장, 근육(투여부 및 상대측)을 수득한다. 정맥내 지속 투여는 래트의 꼬리 정맥으로부터 실시하고 투여속도는 0.O7ml/hr로 한다. 투여 개시로부터 3시간 이상 경과한 후에 동일하게 혈청, 간 좌측엽, 신장, 근육을 수득한다. 혈청중 및 각 장기중의 사람 HGF 농도에 관해서는 사람 HGF 측정용 ELISA 키트인 이뮤니스 HGF EIA(도쿠슈멘에키겐큐쇼제)를 사용하여 측정한다. 장기중의 HGF는 2M NaCl, 1mM PMSF, 1mM EDTA, 0.1% 트윈 80을 함유하는 20mM Tris-HCl(pH 7.5)를 추출액으로서 사용하여(근육: 12ml/조직g, 간장·신장: 8ml/조직g) 1분 동안 균질화한 다음, 4℃, 15,000rpm에서 60분 동안 원심분리하고 추출액 중의 HGF량을 상기한 ELISA 키트로 측정한다. 이때에 표준 용액에 대해서도 HGF를 투여하지 않은 래트의 장기에 특정 농도의 HGF를 첨가하며 동일하게 추출한 용액을 사용한다. 또한 샘플의 희석액에 대해서도 HGF를 투여하지 않은 래트의 장기의 추출액을 동일하게 조제하여 사용한다. 농도 추이의 해석에는 모먼트 해석법을 사용한다.

(2) 결과

HGF를 대퇴부 근육내에 투여한 후의 근육에서의 HGF 농도의 추이에 관해서 도 1에 도시한다. HGF를 꼬리 정맥내로 지속 투여한 후의 결과에 관해서도 아울러 도 1에 도시한다. HGF를 꼬리 정맥으로부터 6μg/kg/hr, 60μg/kg/hr에서 3시간 동안 지속 투여할 때의 근육중 농도에 관해서는 측정 한계(1.5ng/조직g) 이하이다. 3mg/kg으로 근육내 투여하는 경우에 근육 중에서의 약물 동태 파라미터를 표 1에 기재한다. 투여 부분 근육내에서 HGF의 t_1/2은 10.6시간이며 투여 24시간 후에도 피크시의 약 18%의 농도가 유지되고 있다. HGF를 꼬리 정맥에서 일시 투여하는 경우에도 예를 들면, O.3mg/kg의 HGF의 투여에 의해 근육내에 검출되는 HGF 농도는 10ng/조직g의 등급이다.

투여경로, 투여량	근육내 투여 3mg/kg
근육 부위	투여부	상대측
AUC(시간·ng/조직g)(무한)	11.6 × 10⁵	820
t_1/2(시간)	10.6	11.2
Cmax(ng/조직g)	84.1 × 10³	82.4
Tmax	5분	5분

또한 표 1에서 상대측이란 반대측의 투여 부위에 대응하는 부위이다. 즉, 본 실시예에서는 좌대퇴 후부 근육에 투여하고 있으므로 이의 반대측인 우대퇴 후부 근육이다.

상기한 도 1 및 표 1에 기재된 바와 같이 HGF를 근육내 투여하는 경우, 투여한 근육내에서 대단히 높은 농도를 나타낸다. 이들은 HGF가 약효를 나타내기 위해서 지나치게 충분한 농도라고 생각된다. 한편, 상대측의 근육 내에서는 투여부의 약 1/1000의 농도에 멈춘다. 도 2에 도시된 바와 같이 HGF를 근육내에 투여하는 경우, 혈청중의 HGF 농도는 비교적 낮게 추이하며 투여부 근육내로부터 순환 혈중으로의 이행율은 6.7%로 낮다. 또한 도 3, 4에 도시된 바와 같이 HGF를 근육내 투여하는 경우, 간장, 신장중의 HGF 농도는 정맥내 투여하는 경우와 비교하여 극단적으로 낮다. HGF를 정맥내로 지속 투여한 후의 혈청중, 간장, 신장의 HGF 농도의 결과에 관해서도 아울러 도 2, 3, 4에 도시한다.

HGF를 정맥내에 지속 투여하는 경우, 혈청, 간장, 신장중의 HGF 농도가 높게 지속되는 데 대해 근육내에서의 HGF 농도는 극단적으로 낮다. 최고 투여량인 600μg/kg/시간 그룹을 예로 들면 혈청중에서는 536ng/ml의 HGF가 존재하는 데 대해 근육속에서는 10ng/조직g 미만밖에 존재하지 않는다. 이러한 점으로부터 허혈 근육 환부 및 이의 주변의 근육 또는 여기에 존재하는 혈관에 선택적으로 HGF를 작용시키는 것을 목적으로 하는 경우, 정맥내 투여에서는 효율이 불량하며 국소 근육내에 직접 투여하는 편이 효과적이라고 생각된다. 또한 HGF를 근육내에 투여함으로써 다른 부위에는 작용시키지 않고 근육 조직에 선택적으로 HGF를 작용시킬 수 있다고 생각된다.

2. 투여경로에 의한 HGF 혈중 농도추이의 비교

(1) 방법

피셔계 래트를 사용하여 HGF를 3mg/kg으로 근육내 투여하는 경우, 0.3mg/kg으로 정맥내 일시 투여하는 경우 및 3mg/kg으로 피하 투여하는 경우에 혈청중 HGF 농도를 측정한다. 근육내 투여는 에테르 마취하에 래트의 좌대퇴 후부 근육의 중앙부에서 실시한다. 투여 용량은 1ml/kg으로 하며 0.3M NaCl, 0.03% 트윈 80, 0.5mg/ml L-알라닌을 함유하는 10mM 시트르산 완충액(pH 5.5)을 비이클로서 사용한다. 근육내 투여에서는 HGF의 투여로부터 5분, 3O분, 2시간, 8시간, 24시간 경과후에 래트로부터 혈청을 채취한다. 정맥내 투여는 래트의 꼬리 정맥으로부터 실시하며 투여한 지 2분, 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 12시간, 24시간 경과후에 혈청을 채취한다. 또한 피하 투여에서는 투여후 5분, 15분, 30분, l시간, 2시간, 5시간, 12시간, 24시간 혈청을 수득한다. 래트 혈청중의 사람 HGF 농도에 관해서는 사람 HGF 측정용 ELISA 키트인 이뮤니스 HGF EIA(도쿠슈멘에키겐큐쇼제)를 사용하여 측정한다. 농도 추이의 해석에는 모먼트 해석법을 사용한다.

(2) 결과

측정결과를 해석하여 수득된 약물 동태 파라미터를 표 2에 기재한다. 단, 정맥내 일시 투여에 관해서는 투여량에 대한 선형성을 가정하고 3mg/kg의 HGF 투여시의 파라미터를 산출한다. 혈청중에서의 AUC는 정맥내 일시 투여와 비교하여 근육내 투여, 피하 투여에서 낮으며 각각 정맥내 일시 투여의 AUC의 6.7%, 2.6%이다. 또한 최고 혈청중 농도(Cmax)에 대해서도 정맥내 일시 투여와 비교하여 근육내 투여, 피하 투여에서 낮으며 각각 정맥내 일시 투여의 C0의 0.012%, O.0087%이다.

투여경로	근육내	정맥내 일시	피하
투여량	3mg/kg	3mg/kg	3mg/kg
AUC(분·ng/ml) (무한)	6310	94390	2419
t_1/2 (분)	801	8.8	525
Cmax 또는 C0(ng/ml)	8.96	73380(C0)	6.42
Tmax	5분	-	5분
AUC 비(% i.v.)	6.7%	-	2.6%
Cmax 비(% i.v. C0)	0.012%	-	0.0087%

3. 투여경로에 의한 HGF 근육내 농도 추이의 비교

(1) 방법

SD계 래트를 사용하여 HGF를 0.01mg/kg으로 근육내 투여하는 경우와 30mg/kg으로 정맥내 일시 투여하는 경우의 근육중 HGF 농도를 측정한다. 근육내 투여는 에테르 마취하에 래트의 좌대퇴 후부 근육의 중앙부에서 실시한다. 투여 용량은 0.5ml/kg으로 하며 0.3M NaCl, 0.03% 트윈 80, 5mg/ml L-알라닌을 함유하는 10mM 시트르산 완충액(pH 5.5)을 비이클로서 사용한다. HGF 투여로부터 30분, 6시간, 24시간이 경과한 후, 래트로부터 근육(투여부)를 수득한다. 정맥내 일시 투여는 래트의 꼬리 정맥에서 1ml/kg으로 실시하고 투여로부터 5분, 30분, 1시간, 24시간이 경과한 후, 동일하게 근육을 채취한다. 근육중의 사람 HGF 농도에 관해서는 사람 HGF 측정용 ELISA 키트인 이뮤니스 HGF EIA(도쿠슈멘에키겐큐쇼제)를 사용하여 측정한다. 장기중의 HGF는 2M NaCl, 1mM PMSF, 1mM EDTA, 0.1% 트윈 8O을 함유하는 20mM Tris-HCl(pH 7.5)를 추출액으로서 사용하고(12ml/조직g) 1분 동안 균질화한 다음, 4℃, 15,000rpm에서 6O분 동안 원심분리하며 추출액 중의 HGF량을 상기한 ELISA 키트로 측정한다. 이때에 표준 용액에 대해서도 HGF를 투여하지 않은 래트의 근육에 특정 농도의 HGF를 첨가하며 동일하게 추출된 용액을 사용한다. 또한 샘플의 희석액에 대해서도 HGF를 투여하지 않은 래트의 근육 추출액을 동일하게 조제하여 사용한다. 농도 추이의 해석에는 모먼트 해석법을 사용한다.

(2) 결과

근육내 사람 HGF 농도를 측정한 결과로부터 수득된 약물 동태 파라미터에 관해서 표 3에 기재한다. 단, 비교하기 위해 정맥내 일시 투여에 관해서는 투여량에 대한 선형성을 가정하고 0.01mg/kg의 HGF 투여시의 파라미터를 산출한다. 동일량의 HGF 투여를 가정하는 경우, 근육중에서의 AUC는 정맥내 일시 투여와 비교하여 근육내 투여(투여부)에서 현저하게 높으며 정맥내 일시 투여의 약 650배이다. 또한 최고 근육중 농도(Cmax)에 관해서도 정맥내 일시 투여와 비교하여 근육내 투여(투여부)에서 현저하게 높으며 정맥내 일시 투여의 약 960배이다.

	근육내 투여(im)	정맥내 일시 투여(iv)	im/iv
AUC (시간·ng/근육g)	4160	6.37	650
Cmax (ng/근육g)	459	0.476	960

실시예 2

래트 하지 허혈 ASO 모델에 대한 근육내 투여의 약효 검토

(1) 방법

SD계 래트(9주 나이, 수컷)을 사용한다. 약 5Omg/kg의 펜토바르비탈(다이나보트사제, 넴부탈)을 복강내 투여하여 래트를 마취한다. 분지(分枝)를 동여맨 다음, 좌대퇴 동맥을 적출하고 래트 하지 허혈 모델을 제조한다. 래트를 에테르로 마취시켜 좌대퇴부 내측의 근육내에 HGF 또는 비이클을 투여한다. 대퇴 동맥 적출 직후에 투여를 개시하며 투여량 1mg/kg/일, 투여용량 1ml/kg/일, 1일 1회, 5일 동안 투여한다. 비이클로서 0.3M NaCl, 0.O3% 트윈 80, 5mg/ml 알라닌, 10mM Na-시트레이트 완충액(pH 5.5)을 사용한다. 대퇴 동맥 적출로부터 14일 후에 펜토바르비탈로 래트를 마취하고 하지 주변의 털을 털 제거 크림으로 제거한 다음, 써모그래피(니혼아비오닉스사제)를 사용하여 대퇴 하부 내측(도 5의 부위1)·하퇴부 내측(도 5의 부위2)·무릎하 외측(도 5의 부위3)·하퇴 앞부분 외측(도 5의 부위4)·대퇴 하부 외측(도 5의 부위5)·하퇴부 외측(도 5의 부위6)의 6개 위치의 피부 표면온도를 양쪽 하지 동시에 측정한다. 각각의 측정 부위에 관해서 허혈지 온도로부터 정상지 온도를 빼고 피부 표면온도의 차이를 산출한다.

(2) 결과

허혈지와 정상지의 피부 표면온도의 차이를 도 5에 도시한다. 즉, 대퇴 동맥을 적출하고 비이클을 투여한 그룹(도면중 백색)에서는 허혈지의 각 부위에서 정상지와 비교하여 O.8 내지 1.7℃의 온도 저하가 보인다. 이에 대해 HGF를 투여하 는 그룹(도면중 흑색)에서는 0.2 내지 1.0℃의 온도 저하로 억제되어 있다. 각 부위마다 온도 저하를 2그룹 간에 비교한 바, 6개 위치의 전체 부위에서 HGF 투여 그룹의 쪽 편이 온도 저하가 작은 경향이 보인다. 또한 하퇴부 내측 및 대퇴 하부 외측의 2개 위치에서는 HGF의 투여에 의해 유의적으로 온도 저하가 억제된다.

상기한 도 5에 도시된 바와 같이 래트 하지 허혈 모델을 제조하여 허혈지의 대퇴부 근육내에 HGF를 투여한 바, 허혈지에서 피부 표면온도의 저하가 억제된다. 이것은 HGF가 가지는 혈관 신생작용에 의해 허혈지에서 혈행 동태가 개선되어 온도의 저하가 억제된다고 생각한다.

실시예 3

HGF 함유 미니 펠릿으로부터의 시험관내 HGF 방출에서의 콘드로이틴황산의 영향

(1) 알라닌 10%를 함유하는 HGF 함유 미니 펠릿의 조제법

HGF 함유량: 131.2μg/mg 미니 펠릿

HGF 65.3mg을 함유하는 수용액 6.9ml와 1% 알라닌 수용액 4.4ml와 증류수 16ml 및 2% 아테로콜라겐 16.7g을 혼합하여 동결 건조한 다음, 소량의 증류수를 가하여 팽윤시켜 혼련하고 균질한 혼합액으로 한다. 이것을 10ml의 1회용 실린더에 투입하고 10,000G에서 60분 동안 원심 탈포한다. 이것을 실린더로부터 압출한 다음, 건조시켜 절단함으로써 1개당 500μg의 HGF를 함유하는 막대상의 미니 펠릿(직경 1.1mm, 길이 4mm)을 수득한다.

(2) 콘드로이틴황산 10%를 함유하는 HGF 함유 미니 펠릿의 조제법

HGF 함유량: 132.8μg/mg 미니 펠릿

HGF 65.3mg을 함유하는 수용액 6.9ml와 1.5% 콘드로이틴황산나트륨 수용액 2.9ml와 증류수 17ml 및 2% 아테로콜라겐 16.7g을 혼합하여 동결 건조한 다음, 소량의 증류수를 가하여 팽윤시켜 혼련하고 균질한 혼합액으로 한다. 이것을 10ml의 1회용 실린더에 투입하고 10,000G에서 60분 동안 원심 탈포한다. 이것을 실린더로부터 압출한 다음, 건조시켜 절단함으로써 1개당 500μg의 HGF를 함유하는 막대상의 미니 펠릿(직경 0.9mm, 길이 4mm)을 수득한다.

(3) 시험관내 방출시험

0.3% 트윈 20을 함유하는 PBS(pH 7.4)를 방출액으로서 사용한다. 37℃에서 2ml의 방출액 중에 상기한 방법으로 조제한 미니 펠릿을 각각 투입하고 HGF의 방출 속도를 측정한다(n=2). 방출액 중의 HGF 농도에 관해서는 헤파린 친화성 크로마토그래피법으로 측정한다.

실험결과를 도 6에 도시한다. 즉, 콘드로이틴황산 함유의 미니 펠릿에서는 1일 후에는 거의 100%의 HGF가 방출된 데 대해 콘드로이틴황산을 함유하지 않은 알라닌 함유 미니 펠릿으로부터는 완만하게 HGF가 방출된다. 방출 개시로부터 7일 후에도 방출된 HGF량은 미니 펠릿 함유량의 30% 미만에서 멈춘다. 이것은 HGF와 친화성을 가지는 콘드로이틴황산 등의 프로테오글리칸과 HGF를 공존시킴으로써 HGF의 방출을 촉진시킬 수 있는 것을 나타낸다. 또한 역으로 콘드로이틴황산 등의 프 로테오글리칸을 공존시키지 않는 것에 의해 방출을 완만하게 하며 투여 부위에 국소적으로 HGF를 작용시킬 수 있는 가능성을 나타낸다.

실시예 4

래트 근육내 HGF 투여후의 각 장기에서의 c-Met의 인산화

(1) 방법

SD계 래트(12주 나이, 수컷)을 사용하여 근육내 투여한 후의 근육, 간장, 신장에서의 c-Met의 인산화에 관해서 검토한다. 에테르 마취하에 래트의 좌대퇴 후부 근육내에 3, 0.3, 0.03mg/kg의 HGF를 투여한다. 투여로부터 5분, 30분후에 래트를 탈혈(脫血)하며 근육, 간장, 신장을 적출한다. 적출한 장기에 RIPA 완충액[50mM Tris-HCl(pH 7.4), 50mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 5mM EDTA, 10mM Na₄P₂O₇, 50mM NaF, 1mM Na₃V0₄, 0.4mM AEBSF, 10μg/ml 류펩틴, 10μg/ml 아프로티닌, 1μg/ml 펩스타틴 A]을 5ml/조직g(근육) 또는 8ml/조직g(간장, 신장) 첨가하며 폴리트론을 사용하여 균질화한다. 그리고, 16000rpm, 4℃, 30분 동안 원심분리함으로써 침전을 제거한다. 10mg(근육) 또는 5mg(간장, 신장)의 단백질을 함유하는 추출액을 RIPA 완충액으로 1ml로 하고 50μl(약 50%)의 프로테인 G 세파로스(Protein G Sepharose)[파마샤(Pharmacia)사]를 가하여 4℃에서 2시간 동안 교반한다. 원심에 의해 프로테인 G 세파로스를 제거하고 이의 상등액에 1μg의 항 c-Met 항체[산타 크루즈(Santa Cruz)사]를 가하고 4℃에서 밤새 교반한다. 또한 20μl의 프로테인 G 세파로스를 가하고 4℃에서 2시간 동안 교반한다. 원심에 의해 상등액을 제거하고 프로테인 G 세파로스를 1ml의 RIPA 완충액으로 3회 세정한 다음, 2×로딩 완충액을 가하여 100℃, 5분 동안 가열하고 7.5% SDS-PAGE에 제공한다. 전기영동한 단백질은 니트로셀룰로스 필터 위에서 전기적으로 전사, 결합된다. 필터는 3% BSA를 함유하는 TBS-T(10mM Tris-HCl(pH 7.6), 150mM NaCl, O.05% 트윈 20) 중에서 진탕함으로써 블로킹한다. TBS-T로 가볍게 세정한 다음, 1μg/ml의 항 인산화티로신 항체[업 스테이트 바이오테크놀로지(Up state Biotechnology)사]를 함유하는 TBS-T 속에서 실온, 1시간 동안 진탕한다. 다시 TBS-T로 세정한 다음, 2000배 희석한 퍼옥시다제 표지 항 마우스 Ig 항체[아머샴(Amersham)사]를 함유하는 TBS-T 속에서 실온, 1시간 동안 진탕한다. TBS-T로 세정한 다음, ECL 웨스턴 브로스 검출시약(아머샴사)를 사용하여 인산화된 c-Met의 검출을 실시한다.

필터는 62.5mM Tris-HCl(pH 6.7), 100mM 2-머캅토에탄올, 2% SDS 용액 속에서 60℃, 30분 동안 진탕함으로써 탈프로브하며 TBS-T에서 세정한 다음, 3% BSA를 함유하는 TBS-T 속에서 진탕함으로써 블로킹한다. TBS-T로 가볍게 세정한 다음, 0.5μg/ml의 항 c-Met 항체를 함유하는 TBS-T 속에서 실온으로 1시간 동안 진탕한다. 다시 TBS-T로 세정한 다음, 2000배 희석한 퍼옥시다제 표지 항 토끼 Ig 항체(아머샴사)를 함유하는 TBS-T 속에서 실온으로 1시간 동안 진탕한다. TBS-T로 세정한 다음, ECL 웨스턴 브로스 검출시약을 사용하여 c-Met의 검출을 실시한다.

(2) 결과

인산화 c-Met에 대한 IP-웨스턴의 결과를 도 7에 도시한다. 근육 조직에서는 0.03 내지 3mg/kg의 각 투여량에서 c-Met의 현저한 인산화가 나타난다. 한편, 간장 및 신장에서는 HGF 근육내 투여에 따른 c-Met의 인산화는 보이지 않는다. 이러한 점은 3mg/kg 이하의 HGF를 근육내에 투여함으로써 간장·신장에 작용시키지 않고 근육조직·근육조직 중의 혈관에 선택적으로 HGF를 작용시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 5

래트 하지 허혈 ASO 모델에 대한 근육내 투여의 약효 검토(1)

(1) 방법

SD계 래트(14주 나이, 수컷)을 사용한다. 약 50mg/kg의 펜토바르비탈(다이나보트사제, 넴부탈)을 복강내 투여하여 래트를 마취한다. 분지를 동여맨 다음, 좌대퇴 동맥을 적출하고 래트 하지 허혈 모델을 작성한다[참조: Cardiovascular Research, 35, 547-552(1997)]. 그 직후에 좌대퇴부의 근육내에 HGF 또는 비이클을 투여한다. 투여량은 100μg/kg, 투여 용량은 1ml/kg으로 한다. 다시 4일후에 에테르 마취하에 동일하게 투여를 실시한다. 비이클로서 0.3M NaCl, 0.03% 트윈 8O, 5mg/ml 알라닌, 10mM Na-시트레이트 완충액(pH 5.5)을 사용한다. 대퇴 동맥 적출로부터 14일 후에 펜토바르비탈에 의해 래트를 마취하고 실험 동물용 비관혈식 혈압계를 사용하여 하지 혈압을 측정한다. 정상지, 허혈지 각각의 혈압으로부터 I/N 비(%)= 허혈지 혈압 /정상지 혈압×100을 계산하며 평가를 실시한다.

(2) 결과

결과를 도 8에 기재한다. HGF 투여 그룹에서는 비이클 투여 그룹과 비교하여 유의적으로 I/N 비가 개선된다. 이것은 HGF가 가지는 혈관 신생작용에 의한 것이라고 생각된다.

실시예 6

토끼 하지 허혈 ASO 모델에 대한 근육내 투여의 약효 검토

(1) 방법

NZW계 토끼(22주 나이, 수컷)을 사용한다. 5mg/kg의 크실라딘(바이엘가부시키가이샤제, 세락탈) 및 50mg/kg의 케타민(산교가부시키가이샤제, 케타랄)을 상완부 근육내에 투여하여 토끼를 마취한다. 좌대퇴부를 절개하고 좌대퇴 동맥을 적출함으로써 토끼 하지 허혈 모델을 제조한다[참조: J. Clin. Invest., 93, 662-670(1994)]. 그 다음 10일 후 및 15일 후에 동일하게 마취를 실시하고 좌대퇴부의 근육내에 HGF 또는 비이클을 투여한다. 투여량은 100μg/kg, 투여 용량은 1ml/kg으로 한다. 비이클로서 0.3M NaCl, O.03% 트윈 80, 5mg/ml 알라닌, 10mM Na-시트레이트 완충액(pH 5.5)을 사용한다. 대퇴 동맥 적출로부터 10일후(약제액 투여전), 22일후 및 42일후에 상기한 방법에 따라 토끼를 마취하고 도플러 혈류계(트리톤사제)와 수은 혈압계를 사용하여 양쪽 하지의 혈압을 측정한다. 정상지, 허혈지 각각의 혈압으로부터 I/N 비(%) = 허혈지 혈압/정상지 혈압×100을 계산하고 평가를 실시한다. 10일 후부터의 I/N 비의 증가율에 관해서도 산출하고 평가한다. 또한 동맥 적출로부터 10일후 및 최종일(41 또는 42일후)에 조영(造影)제(야마노우치세이야쿠가부시키가이샤제, 오프티레이 350)를 사용하여 좌하지 선택적으로 혈관 조영을 실시한다. 수득된 혈관 조영사진에 직경 2.5mm의 원을 늘어 놓은 시트를 겹치고 혈관과 겹쳐 있는 원의 수를 계수하여 원의 전체 수(800개)에 대한 비율을 산출하고 혈관 조영 스코어로 한다. 각 토끼의 혈관 적출 10일후의 혈관 조영 스코어로부터 최종일의 혈관 조영 스코어로의 증가율(%)을 계산하고 혈관 조영 스코어 증가율로서 평가한다. 최종일에 허혈지 관절의 경화도, 허혈지 손톱 끝의 괴사·탈락, 허혈지 하퇴부의 궤양에 관해서 관찰한다.

(2) 결과

하지 혈압의 I/N 비의 추이를 도 9에 도시한다. 동맥 적출 22일후로부터 HGF 투여 그룹에서 높은 값의 경향을 나타내며 42일후에 HGF 투여 그룹에서는 비이클 투여 그룹과 비교하여 유의적으로 I/N 비가 개선된다. 이것은 HGF가 가지는 혈관 신생작용에 의해 허혈지의 혈행 동태가 개선된 것으로 생각한다. 또한 하지 혈압의 I/N 비의 증가율을 도 10에 도시한다. 동맥 적출 10일후로부터 42일후까지의 I/N 비의 증가율은 비이클 그룹과 비교하여 HGF 투여 그룹에서 유의적으로 높다. 혈관 조영 스코어의 증가율을 도 11에 도시한다. 비이클 투여 그룹과 비교하여 HGF 투여 그룹 쪽이 유의적으로 증가율이 높으며 HGF의 작용에 의해 측부(側副) 혈행로의 발달이 촉진되는 것으로 생각된다. 평가 최종일의 허혈지의 관찰에서도 HGF 투여 그룹 쪽이 비이클 투여 그룹과 비교하여 증상이 가벼운 경향이 확인되며( 표 4) HGF 투여에 따른 허혈지의 혈행 동태의 개선을 반영한다고 생각된다.

그룹	하지 관절의 경화			손톱끝의 괴사·탈락	허혈지의 궤양
그룹	없음	경도	중도	손톱끝의 괴사·탈락	허혈지의 궤양
비이클(n=8)	4	1	3	1	3
HGF(n=8)	6	2	0	0	0

실시예 7

래트 하지 허혈 ASO 모델에 대한 근육내 투여의 약효 검토(2)

(1) 방법

SD계 래트(14주 나이, 수컷)을 사용한다. 약 50mg/kg의 펜토바르비탈(다이나보트사제, 넴부탈)을 복강내 투여하여 래트를 마취한다. 분지를 동여맨 다음, 좌대퇴 동맥을 적출하며 래트 하지 허혈 모델을 제조한다[참조: Cardiovascular Research, 35, 547-552(1997)]. 그 직후에 좌대퇴부의 근육내에 HGF 또는 비이클을 투여한다. 투여량은 1μg/kg으로 하며 투여 용량은 모든 실험에서 1ml/kg으로 한다. 다시 4일후에 에테르 마취하에 동일하게 2회째의 투여를 실시한다. 비이클로서 0.3M NaCl, 0.03% 트윈 80, 5mg/ml 알라닌, 10mM Na-시트레이트 완충액(pH 5.5)를 사용한다. 대퇴 동맥 적출로부터 7일후에 펜토바르비탈에 의해 래트를 마취하고 실험 동물용 비관혈식 혈압계를 사용하여 하지 혈압을 측정한다. 정상지, 허혈지 각각의 혈압으로부터 I/N 비 = 허혈지 혈압/정상지 혈압을 계산하며 평가를 실시한다.

또한 1회 투여에서의 효과를 조사하기 위해 대퇴 동맥 적출 당일에만 투여를 실시하고 동일한 실험을 실시한다. HGF의 투여량은 3μg/kg으로 한다.

(2) 결과

2회 투여에 의한 결과를 도 12에 도시한다. 대퇴 동맥 적출 7일후에 HGF 투여 그룹에서는 비이클 투여 그룹과 비교하여 유의적으로 I/N 비가 개선된다. 이것은 HGF가 가지는 혈관 신생작용에 기인하는 것이라고 생각된다. HGF는 1μg/kg×2회라는 저용량으로 효과가 있는 것으로 나타난다. .

또한 1회 투여에 의한 결과를 도 13에 도시한다. 대퇴 동맥 적출 7일후에 HGF 투여 그룹에서는 비이클 투여 그룹과 비교하여 유의적으로 I/N 비가 개선된다. HGF는 1회 투여라도 효과가 있는 것으로 나타난다.

제제예 1

생리 식염수 100ml 중에 HGF 1mg, 만니톨 1g 및 폴리소르비트 80 10mg을 함유하는 용액을 무균적으로 조제하며 1ml씩 바이알에 분주한 다음, 동결 건조시켜 밀봉함으로써 동결 건조제제를 수득한다.

제제예 2

0.02M 인산 완충액(0.15M NaCl 및 0.01% 폴리소르비트 80 함유, pH 7.4) 10Oml 중에 HGF 1mg 및 사람 혈청 알부민 100mg을 함유하는 수용액을 무균적으로 조제하고 1ml씩 바이알에 분주한 다음, 동결 건조시켜 밀봉함으로써 동결 건조제제를 수득한다.

본 발명에 의해 HGF를 유효 성분으로서 함유하며 허혈성 질환 또는 동맥 질환을 치료하거나 예방하기 위한 투여용 제제가 제공된다. 본 발명의 근육내 투여용 제제는 정맥내 투여와 비교하여 반감기가 길며 근육내에 유지되기 쉬우므로 종래의 정맥주사와 비교하여 투여량을 감소시킬 수 있으며, 또한 환부 이외에 대한 작용이 적다는 효과가 있다.

Claims

활성 성분으로서 간 실질세포 증식인자(HGF)를 함유하며, 이때, 유효량의 간 실질세포 증식인자는, 투여되는 부위의 국소 조직 및 당해 부위의 근방 조직으로 이행 및 분포되어 당해 조직상에서 작용하는 반면, 당해 인자가 투여되는 부위 이외의 혈액 및 신체 다른 기관으로의 이행, 분포 및 작용이 감소되고,

활성 성분으로서 HGF를 함유하는 제제의 동일양을 정맥내 일시 투여한 경우와 비교하여, 혈액, 간장 및 신장에서의 최대 농도가 100분의 1 이하이고 투여 부위인 근육 조직에서의 최대 농도가 50배 이상임을 특징으로 하는,

심장 또는 사지의 허혈성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 근육내 투여용 제제.
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활성 성분으로서 간 실질세포 증식인자(HGF)를 함유하며, 이때, 유효량의 간 실질세포 증식인자는, 투여되는 부위의 국소 조직 및 당해 부위의 근방 조직으로 이행 및 분포되어 당해 조직상에서 작용하는 반면, 당해 인자가 투여되는 부위 이외의 혈액 및 신체 다른 기관으로의 이행, 분포 및 작용이 감소되고,

활성 성분으로서 HGF를 함유하는 제제의 동일양을 정맥내 일시 투여한 경우와 비교하여, 혈액, 간장 및 신장에서의 AUC가 5분의 1 이하이고 투여 부위인 근육 조직에서의 AUC가 50배 이상임을 특징으로 하는,

심장 또는 사지의 허혈성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 근육내 투여용 제제.
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활성성분으로서 간 실질세포 증식인자(HGF)를 함유하며, 이때, 유효량의 간 실질세포 증식인자는 투여되는 부위의 국소 근육 조직 및 당해 부위의 근방 조직으로 이행 및 분포되어 당해 조직상에서 작용하는 반면, 당해 인자가 투여되는 부위 이외의 혈액 및 신체 다른 기관으로의 이행, 분포 및 작용이 감소되고,

1회 투여량이 0.1 내지 10㎍/kg임을 특징으로 하는,

심장 또는 사지의 허혈성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 근육내 투여용 제제.
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