CN105682676B - 利用肝细胞生长因子的两种以上的异构体的肌萎缩性侧索硬化症预防或治疗用组合物 - Google Patents

利用肝细胞生长因子的两种以上的异构体的肌萎缩性侧索硬化症预防或治疗用组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis)的预防或治疗用药学组合物，包含肝细胞生长因子(Hepatocyte Growt h Factor，HGF)的两种以上的异构体或对上述异构体进行编码的聚核苷酸作为有效成分。使用本发明的组合物，可有效地预防或治疗肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis)。

Description

利用肝细胞生长因子的两种以上的异构体的肌萎缩性侧索硬 化症预防或治疗用组合物
技术领域
本专利申请针对2013年10月22日向韩国专利厅提出的韩国特许申请第KR10-2013-0126216号及2014年10月22日向韩国专利厅提出的韩国特许申请第KR10-2014-0143377号主张优先权，上述专利申请的公开事项插入于本说明书中作为参考。
本发明涉及肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用组合物，包含肝细胞生长因子的两种以上的异构体或对上述异构体进行编码的聚核苷酸作为有效成分。
背景技术
肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis：ALS)作为发生于运动神经元的疾病，最初，1869年由法国医生Jean-Martin Chartcot报告指出。之后，1939年作为美国有名的棒球选手的Lou Gehrig患这种疾病，并公知于一般人，从此还被称为葛雷克氏症(Lou Ge hrig’s disease)。
肌萎缩性侧索硬化症的预后将临床特征、电诊断测试及与症状相关的健康状态的排除作为基础。在与肌萎缩性侧索硬化症相关的几种基因有关临床实验中可使用的分子基因检查在遗传类型诊断及遗传咨询中起到重要的作用。
肌萎缩性侧索硬化症可通过常染色体显性、常染色体隐性或X-相关方法遗传。遗传咨询及危险评价取决于特定基因诊断的准确的诊断。
众所周知，延迟肌萎缩性侧索硬化症病的发展的药剂有利鲁唑(Riluzole)。众所周知，利鲁唑抑制认为破坏运动神经细胞的原因之一的过量的谷氨酸，从而可延迟肌萎缩性侧索硬化症的发展速度。但是，利鲁唑的临床效果无法改善肌萎缩性侧索硬化症的症状，在增加肌萎缩性侧索硬化症患者不做器管切开术而生存的期间(tracheostomy-freesurvival)方面结果不明确。如上所述，据报告，有助于肌萎缩性侧索硬化症患者的利鲁唑的真正的临床效果非常有限且模糊(Stewart et al,2001)。虽然如此，当前，除了如上所述的临床有用性模糊的利鲁唑之外，无对肌萎缩性侧索硬化症的有效的预防或治疗剂，因而当前需要开发对肌萎缩性侧索硬化症可呈现预防或治疗效果的药物。
另一方面，众所周知，以往有作为用于治疗基因的基因载体的多种表达载体。在本发明的一实施例中使用的pCK载体详细记载于PCT/KR99/000855中。并且，在PCT/KR03/000548中记载有包含在本发明中所使用的pCK-肝细胞生长因子X7重组载体的缺血性疾病或肝病治疗或预防用组合物。PCT/KR99/000855及PCT/KR03/000548的全部内容合并于本说明书作为参照。
本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。
发明内容
要解决的问题
本发明人为了开发可预防或治疗肌萎缩性侧索硬化症的药物而锐意研究努力。其结果，查明了可利用包含两种以上的肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor；HGF)的异构体或对上述异构体进行编码的聚核苷酸作为有效成分的组合物治疗肌萎缩性侧索硬化症，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用药学组合物。
本发明的再一目的在于，提供肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗方法。
通过以下的发明的详细说明、发明要求保护范围及附图，更加明确本发明的其他目的及优点。
解决问题的手段
根据本发明的一实施方式，本发明提供肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用药学组合物，包含肝细胞生长因子的两种以上的异构体或对上述异构体进行编码的聚核苷酸作为有效成分。
本发明人为了开发可预防或治疗肌萎缩性侧索硬化症的药物而锐意研究努力。最终，查明如下：利用包含两种以上的肝细胞生长因子的异构体或对上述异构体进行编码的聚核苷酸作为有效成分的组合物可治疗肌萎缩性侧索硬化症。
本发明的治疗战略大致可分为蛋白质治疗及基因治疗两种。根据本发明的蛋白质治疗剂战略，利用肝细胞生长因子的两种以上的异构体蛋白质。另一方面，根据本发明的基因治疗剂战略，利用对肝细胞生长因子的两种以上的异构体进行编码的一种以上的核苷酸序列。两种以上的肝细胞生长因子异构体-编码核苷酸序列提供为一种聚核苷酸，或提供为单独的聚核苷酸。优选地，肝细胞生长因子的两种以上的肝细胞生长因子异构体-编码核苷酸序列提供为一种聚核苷酸。
以下，对本发明进行详细记载。
在本说明书中所使用的术语“肝细胞生长因子异构体(isoform)”是指包含全部对立基因变体(variants)的、具有与在动物中自然生成的(naturally occurring)肝细胞生长因子氨基酸序列至少相同80％的氨基酸序列的肝细胞生长因子聚肽。例如，肝细胞生长因子异构体具有全部包括肝细胞生长因子的正常型(normal form)或野生型(wild type)及肝细胞生长因子的多种变异体(例如，剪接变异体及缺损变异体)的意义。
在本发明的一实施例中，本发明的肝细胞生长因子的两种以上的异构体包含全长型肝细胞生长因子(full length HGF；flHGF)和缺损的变异型肝细胞生长因子(deletedvariant HGF；dHGF)。在利用均包含全长型肝细胞生长因子和缺损的变异型肝细胞生长因子的组合物的情况下，可更有效地预防或治疗肌萎缩性侧索硬化症。
在本说明书中使用的术语“全长型肝细胞生长因子”是指动物，优选地，指哺乳动物，更优选地，人类肝细胞生长因子的氨基酸序列1-序列728。
在本说明书中使用的术语“缺损的变异型肝细胞生长因子”是指在动物中，优选地，在哺乳动物中通过肝细胞生长因子基因的选择性剪接生成的肝细胞生长因子蛋白质的缺损的变体，更优选地，从全长型肝细胞生长因子序列α链的第一个三环域中由5个氨基酸(F、L、P、S及S)缺损的723个氨基酸组成的人类肝细胞生长因子。
在本发明的一具体例中，本发明的全长型肝细胞生长因子包含序列表中序列1的氨基酸序列，本发明的缺损的变异型肝细胞生长因子包含序列表中序列2的氨基酸序列。
在本发明的一实施例中，本发明的肝细胞生长因子的多个异构体借助单独的核苷酸序列进行编码，或借助单一的聚核苷酸进行编码。本发明的药学组合物在肝细胞生长因子的互不相同的种类的多个异构体借助单独的聚核苷酸进行编码的情况下，包含两种以上的聚核苷酸，在肝细胞生长因子的互不相同的种类的多个异构体借助单一的聚核苷酸进行编码的情况下，包含含有上述单一的聚核苷酸的一种以上的聚核苷酸。本发明的聚核苷酸能够以可操作的方式与用于调节多个肝细胞生长因子异构体的表达的一种以上的调节序列(例如，启动子或增强子)相连接。
在肝细胞生长因子的两种以上的异构体借助单独的聚核苷酸进行编码的情况下，能够以两种方式构建表达组件。根据第一种方式，将表达调节序列与针对各个异构体的编码序列(CDS，coding sequence)相连接来构建表达组件。根据第二种方式，以“表达调节序列-第1异构体编码序列-内部核糖体进入位点(IRES，internal ribosomal entry site)-第2异构体编码序列-转录终止序列”的方式利用内部核糖体进入位点或2A肽构建表达组件。内部核糖体进入位点使基因的翻译在内部核糖体进入位点序列中开始，从而使两种以上的感兴趣的基因在相同的结构物中表达。
在肝细胞生长因子的两种以上的异构体借助单一的聚核苷酸进行编码的情况下，对上述两种以上的异构体均进行编码的聚核苷酸以可操作的方式与单一的表达调节序列相连接。
在本发明中，肝细胞生长因子的异构体可借助两种以上的互不相同的种类的异构体，例如，一同表达全长型肝细胞生长因子及缺损的变异型肝细胞生长因子的杂交(hybrid)肝细胞生长因子基因进行编码。
根据本发明的优选实例，上述杂交肝细胞生长因子基因包含：互补脱氧核糖核酸，相当于人类肝细胞生长因子的外显子1至外显子18；以及人类肝细胞生长因子基因的内含子4或其片段，插入于上述互补脱氧核糖核酸的外显子4与外显子5之间。
根据本发明的更优选实例，上述杂交肝细胞生长因子基因包含选自由序列表中序列3至序列10组成的组中的核苷酸序列。
包含上述内含子4的杂交肝细胞生长因子基因的长度为7113bp，包含序列表中序列3的核苷酸序列。选择性地，上述杂交肝细胞生长因子基因在肝细胞生长因子的互补脱氧核糖核酸的外显子4与外显子5之间可包含内含子4的片段。
根据本发明的优选实例，追加插入于上述外显子4与外显子5之间的序列为人类肝细胞生长因子基因的内含子4、序列表中序列3的从第392至第2247的核苷酸、序列表中序列3的从第392至第727的核苷酸、序列表中序列3的从第2229至第5471的核苷酸、序列表中序列3的从第5117至第5471的核苷酸、序列表中序列3的从第3167至第5471的核苷酸、序列表中序列3的从第4167至第5471的核苷酸或其组合。
更优选地，在本发明中利用的追加插入于治疗学核苷酸序列的外显子4与外显子5之间的序列为(i)序列表中序列3的从第392至第2247的核苷酸和序列表中序列3的从第2229至第5471的核苷酸、(ii)序列表中序列3的从第392至第2247的核苷酸和序列表中序列3的从第5117至第5471的核苷酸、(iii)序列表中序列3的从第392至第2247的核苷酸和序列表中序列3的从第3167至第5471的核苷酸、(iv)序列表中序列3的从第392至第2247的核苷酸和序列表中序列3的从第4167至第5471的核苷酸、(v)序列表中序列3的从第392至第727的核苷酸和序列表中序列3的从第2229至第5471的核苷酸、(vi)序列表中序列3的从第392至第727的核苷酸和序列表中序列3的从第5117至第5471的核苷酸、(vii)序列表中序列3的从第392至第727的核苷酸和序列表中序列3的从第3167至第5471的核苷酸或(viii)序列表中序列3的从第392至第727的核苷酸和序列表中序列3的从第4167至第5471的核苷酸。
根据追加插入于上述外显子4与外显子5之间的序列，整理本发明的治疗学核苷酸序列如下：(i)(外显子1至外显子4)-(序列表中序列3的从第392至第2247的核苷酸-序列表中序列3的从第2229至第5471的核苷酸)-(外显子5至外显子18)；(ii)(外显子1至外显子4)-(序列表中序列3的从第392至第2247的核苷酸-序列表中序列3的从第5117至第5471的核苷酸)-(外显子5至外显子18)；(iii)(外显子1至外显子4)-(序列表中序列3的从第392至第2247的核苷酸-序列表中序列3的从第3167至第5471的核苷酸)-(外显子5至外显子18)；(iv)(外显子1至外显子4)-(序列表中序列3的从第392至第2247的核苷酸-序列表中序列3的从第4167至第5471的核苷酸)-(外显子5至外显子18)；(v)(外显子1至外显子4)-(序列表中序列3的从第392至第727的核苷酸-序列表中序列3的从第2229至第5471的核苷酸)-(外显子5至外显子18)；(vi)(外显子1至外显子4)-(序列表中序列3的从第392至第727的核苷酸-序列表中序列3的从第5117至第5471的核苷酸)-(外显子5至外显子18)；(vii)(外显子1至外显子4)-(序列表中序列3的从第392至第727的核苷酸-序列表中序列3的从第3167至第5471的核苷酸)-(外显子5至外显子18)；以及(viii)(外显子1至外显子4)-(序列表中序列3的从第392至第727的核苷酸-序列表中序列3的从第4167至第5471的核苷酸)-(外显子5至外显子18)。
在本说明书中，包含上述内含子4的片段的杂交肝细胞生长因子基因被命名为“肝细胞生长因子-X”，上述肝细胞生长因子-X包含具有序列表中序列4至序列表中序列10的核苷酸序列的肝细胞生长因子-X2、肝细胞生长因子-X3、肝细胞生长因子-X4、肝细胞生长因子-X5、肝细胞生长因子-X6、肝细胞生长因子-X7及肝细胞生长因子-X8。在本发明中，优选地，利用肝细胞生长因子-X7。在以往的PCT/KR03/000548中曾报告本发明中的“肝细胞生长因子异构体”、“肝细胞生长因子-X”及“肝细胞生长因子-X7”等，上述专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照。
在本说明书中可利用的肝细胞生长因子异构体的氨基酸或核苷酸序列解释为还包含与野生型人类肝细胞生长因子异构体的序列呈现实质等同性的氨基酸或核苷酸序列。上述实质等同性是指以使野生型人类肝细胞生长因子的异构体的氨基酸或核苷酸序列最大限度地与任意的其他序列相对应的方式进行排比，在利用本领域中通常利用的算法分析已排比的序列的情况下，意味着呈现最少80％的同源性，更优选地，呈现最少90％的同源性，最优选地，呈现最少95％的同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。用于序列比较的排比方法公知于本领域中。在Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needleman andWunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970)；Pearson and Lipman,Methods in Mol.Biol.24:307-31(1988)；Higgins and Sharp,Gene 73:237-44(1988)；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-3(1989)；Corpet et al.,Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988)；Huang et al.,Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)及Pearson et al.,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)中公开有排比的多种方法及算法。在NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BL AST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10(1990))在NBCI(National Center forBiological Information)等中可接近，可与网上的blastp、blasm、blastx、tblastn及tblastx等的序列分析程序联动来利用。BLSAT可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/中连接。利用上述程序的序列同源性比较方法可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.htm l中进行确认。
在本说明书中使用的术语“预防”是指通过本发明的组合物的给药抑制肌萎缩性侧索硬化症或延迟肌萎缩性侧索硬化症的发展的所有行为。
在本说明书中使用的术语“治疗”是指(a)肌萎缩性侧索硬化症的发展的抑制、(b)肌萎缩性侧索硬化症的减轻或者(c)肌萎缩性侧索硬化症的去除。
本发明的组合物可通过抑制神经细胞中的神经突起增生及生长以及运动神经细胞的生长及凋亡来预防或治疗肌萎缩性侧索硬化症。
本发明的组合物可通过在基因治疗领域中通常公知的多种运载方法适用于生物体内。
在本发明的一实施例中，本发明的聚核苷酸包含于裸脱氧核糖核酸(naked DNA)或基因运载体。作为基因运载体的例，包含质粒、载体及病毒载体。
(i)质粒(载体)
作为运载本发明的聚核苷酸的运载体，可利用质粒(载体)。优选地，包含于载体的聚核苷酸存在于适当的表达组件内。优选地，在上述表达组件中，聚核苷酸与启动子操作性地相连接。
在本说明书中，术语“操作性地相连接”是指核酸表达调节序列(例：启动子、信号序列或转录调节因子结合位置的阵列)与其他核酸序列之间的功能性结合，由此上述调节序列调节上述其他核酸序列的转录和/或翻译。
在本发明中，与聚核苷酸序列相结合的启动子可在动物细胞中，优选地，在哺乳动物细胞中，更优选地，在人类细胞中启动，来调节核苷酸序列的转录，包含来源于哺乳动物病毒的启动子及来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子，例如，包含巨细胞病毒(CMV，cytome galo virus)启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、单纯疱疹病毒(HSV)的tk启动子、呼吸道合胞体病毒(R SV)启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人类白细胞介素(IL)-2基因的启动子、人类干扰素(IFN)基因的启动子、人类白细胞介素-4基因的启动子、人类淋巴毒素基因的启动子及人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的启动子，但并不限定于此。更优选地，在本发明中利用的启动子为来源于人巨细胞病毒(hCMV)的即刻早期(IE，immediately early)基因的启动子或延伸因子(EF)1α启动子，最优选地，从人巨细胞病毒即刻早期基因的启动子/增强子及外显子1整体序列至外显子2的ATG起始密码子之前的5’-非翻译区(UTR，untranslatedregion)。
在本发明中利用的表达组件可包含聚腺苷化序列，例如，包含牛生长激素终止子(Gimmi,E.R.,et al.,Nucleic Acids Res.17:6983-6998(1989))、来源于SV40的聚腺苷化序列(Schek,N,et al.,Mol.Cell Biol.12:5386-5393(1992))、HIV-1polyA(Klasens,B.I.F.,et al.,Nucleic Acids Res.26:1870-1876(1998))、β-球蛋白polyA(Gil,A.,etal,Cell 49:399-406(1987))、HSV TK polyA(Cole,C.N.and T.P.Stacy,Mol.Cell.Biol.5:2104-2113(1985))或多瘤病毒polyA(Batt,D.B and G.G.Carmichael,Mol.Cell.Biol.15:4783-4790(1995))，但并不局限于此。
根据本发明的优选实例，作为聚核苷酸的运载体，可利用pCK、pCP、pVAX1或pCY载体，更优选地，可利用pCK载体。在WO 2000/040737中详细公开有上述pCK载体，上述专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照。
(ii)逆转录病毒
逆转录病毒将自身的基因插入于宿主的基因组，可运载大量的外源遗传物质，且可受到感染的细胞的频谱广，因而多用作基因传递载体。
为了构建逆转录病毒载体，本发明的聚核苷酸序列插入于逆转录病毒基因组来代替逆转录病毒的序列，从而生产无法复制的病毒。为了生产病毒粒子，包含gag、pol及env基因，但构建无长末端重复序列(LTR，long terminal repeat)和ψ序列的包装细胞株(Mannet al.,Cell,33:153-159(1983))。若向上述包装细胞株移入包含本发明的聚核苷酸序列、长末端重复序列及ψ序列的重组质粒，则ψ序列可实现重组质粒的核糖核酸(RNA)转录体的生产，上述转录体由病毒包装，病毒向培养基排出(Nicolas and Rubinstein"Retroviralvectors,"In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses,Rodriguez and Denhardt(eds.),Stoneham:Butterworth,494-513(1988))。收集包含重组逆转录病毒的培养基，并进行浓缩，来利用为基因传递系统。
发表了利用第二代逆转录病毒载体的基因传递。Kasahara等(Science,266:1373-1376(1994)制备了Molony Muline ryukemia病毒的变异体，其中，将促红细胞生成素(EPO，erythropoietin)序列插入于包膜部位，来生产了具有新的结合特性的嵌合蛋白质。本发明的聚核苷酸序列也可根据如上所述的第二代逆转录病毒载体的构建战略搭载于逆转录病毒。
(iii)腺病毒
腺病毒由于具有中间程度的基因组大小、操作的便利性、高的滴度、广泛的靶细胞及优秀的感染性，因而多利用为基因传递载体。基因组的两个末端包含100-200bp的反向末端重复序列(ITR，inverted terminal repeat)，这是在脱氧核糖核酸复制及包装中必须的顺式作用元件。基因组的E1区域(E1A及E1B)对调节转录细胞及宿主细胞基因的转录的蛋白质进行编码。E2区域(E2A及E2B)对参与病毒脱氧核糖核酸复制的蛋白质进行编码。
在当前已开发的腺病毒载体中，多利用缺少E1区域的无法复制的腺病毒。另一方面，E3区域通常在腺病毒载体中被去除，从而提供外源基因被插入的位置(Thimmappaya,B.et al.,Cell,31:543-551(1982)；及Riordan,J.R.et al.,Science,245:1066-1073(1989))。因此，优选地，本发明的聚核苷酸序列插入于缺失的E1区域(E1A区域和/或E1B区域)或E3区域。并且，上述核苷酸序列还可插入于已缺失的E4区域。在本说明书中，与病毒基因组序列相关地使用的术语“缺失”不仅指相应的序列完全缺失，而且还指相应的序列部分缺失。并且，腺病毒可包装至野生型基因组的约105％，因而还可追加包装约2kb(Ghosh-Choudhury et al.,EMBO J.,6:1733-1739(1987))。因此，插入于腺病毒的上述的外源序列还可追加地与腺病毒的基因组相结合。
腺病毒具有42个以上的不同的血清型及A-F的亚群。其中，属于亚群C的腺病毒类型5为用于取得本发明的腺病毒载体的最优选的起始物质。众所周知的是，腺病毒类型5的生物化学及遗传信息。借助腺病毒运载的外源基因以与附加体相同的方式进行复制，由此对宿主细胞的遗传毒性非常低。因此，判断为利用腺病毒基因传递系统的基因治疗安全。
(iv)腺相关病毒(AAV)载体
腺相关病毒可使非分裂细胞感染，并具有可感染于多种细胞的能力，因而适合作为本发明的基因传递系统。在美国专利第5139941号及第4797368号中详细公开有腺相关病毒载体的制备及用途的详细的说明。
在LaFace et al,Viology,162:483486(1988),Zhou et al.,Exp.Hematol.(NY),21:928-933(1993),Walsh et al,J.Clin.Invest.,94:1440-1448(1994)及Flotte etal.,Gene Therapy,2:29-37(1995)中公开有作为基因传递系统的腺相关病毒的研究。最近，腺相关病毒载体作为囊包性纤维症的治疗剂正在实施临床I。
典型地，在腺相关病毒中，两个腺相关病毒末端重复使位于旁边的包含目的基因序列的质粒(McLaughlin et al.,J.Virol.,62:1963-1973(1988)及Samulski et al.,J.Virol.,63:3822-3828(1989))以及包含无末端重复的野生型腺相关病毒编码序列的表达质粒(McCarty et al.,J.Virol.,65:2936-2945(1991))一同转化而制备。
(v)其他病毒载体
其他多种病毒载体也可利用于向生物体内运载本发明的聚核苷酸序列。来源于牛痘病毒(Puhlmann M.et al.,Human Gene Therapy 10:649-657(1999)；Ridgeway,"Mammalian expression vectors,"In:Vectors:A survey of molecular cloningvectors and their uses.Rodriguez and Denhardt,eds.Stoneham:Butterworth,467-492(1988)；Baichwal and Sugden,"Vectors for gene transfer derived from animalDNA viruses:Transient and stable expression of transferred genes,"In:Kucherlapati R,ed.Gene transfer.New York:Plenum Press,117-148(1986)及Couparet al.,Gene,68:1-10(1988))、慢病毒(Wang G.et al.,J.Clin.Invest.104(11):R55-62(1999))或单纯疱疹病毒(Chamber R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:1411-1415(1995))的多种载体也可利用为向细胞内运载上述聚核苷酸的运载系统。
(vi)脂质体
脂质体借助分散于水相的磷脂自动形成。在Nicolau及Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982)及Nicolau et al.,Methods Enzymol.,149:157-176(1987)中公开有作为利用脂质体向细胞内成功地运载外源脱氧核糖核酸分子的例。本发明的包含聚核苷酸序列的脂质体可通过内吞、向细胞表面的吸附或与等离子细胞膜的融合等的机制与细胞相互作用来向细胞内运载聚核苷酸序列。
在本发明中，在本发明的聚核苷酸序列搭载于裸重组脱氧核糖核酸分子或质粒(载体)的情况下，可利用微细注入法(Capecchi,M.R.,Cell,22:479(1980)及Harland和Weintraub,J.Cell Biol.101:1094-1099(1985))、磷酸钙沉淀法(Graham,F.L.et al.,Virology,52:456(1973)及Chen和Okayama,Mol.Cell.Biol.7:2745-2752(1987))、电穿孔法(Neumann,E.et al.,EMBO J.,1:841(1982)及Tur-Kaspa et al.,Mol.Cell Biol.,6:716-718(1986))、脂质体介导转染法(Wong,T.K.et al.,Gene,10:87(1980)；Nicolau及Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982)及Nicolau et al.,Methods Enzymol.,149:157-176(1987))、二乙基氨乙基(DEAE)-右旋糖酐处理法(Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190(1985))及基因轰击(Yang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:9568-9572(1990))方法向细胞内移入聚核苷酸序列。
在本发明的聚核苷酸序列基于病毒载体制备的情况下，可根据该领域中公知的多种病毒感染方法向细胞内运载聚核苷酸序列。在上述的引用文献中记载有利用病毒载体的宿主细胞的感染。
在本发明的优选实例中，本发明的基因运载体为载体。
在本发明的一具体例中，本发明的载体为质粒，最优选地，可利用pCK载体。作为包含利用pCK载体的表达肝细胞生长因子的两种以上的异构体的单一聚核苷酸的重组载体的例，可例举pCK-肝细胞生长因子X7，如上所述，其在PCT/KR99/000855及PCT/KR03/000548中详细记载。
本发明的组合物可包含在药剂学上接受的载体。包含于本发明的组合物的药剂学上接受的载体通常用于制剂，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外，还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。适当的药剂学上接受的载体及制剂详细记载于Remington’s Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中。
优选地，本发明的药剂学组合物以非口服的方式给药，例如，可利用静脉内给药、腹腔内给药、皮下给药、皮内给药、脊髓内给药、脊髓腔内给药、脑室内给药、脑实质内给药、头盖腔内给药、肌肉内给药或局部给药的方法进行给药。最优选地，可给药到肌肉内、脊髓内、脊髓腔内、脑室内、脑实质内及头盖腔内。
本发明的药剂学组合物能够以注射的方式制剂化来给药。本发明的药剂学组合物的适当的给药量可根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性等因素而多样，一般熟练的医生可容易确定对希望的治疗有效的给药量并开处方。
根据本发明的优选实例，本发明的肝细胞生长因子的异构体分别以1μg至2500mg的给药量进行给药，对上述异构体进行编码的聚核苷酸分别以1μg至2500mg的给药量进行给药。当上述肝细胞生长因子的异构体或对其进行编码的聚核苷酸的给药超过一次来反复时，给药量可每次相同或不同。
本发明的药剂学组合物可根据本发明所属技术领域的普通技术人员能够容易实施的方法利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来制剂化，从而可制备成单位容量形态或以放入大容量容器内的方式制备。此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以为浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包含分散剂或稳定剂。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗方法，上述肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗方法包括将将组合物给药到哺乳动物的步骤，上述组合物包含肝细胞生长因子的两种以上的异构体或对上述异构体进行编码的聚核苷酸作为有效成分。
在本发明的一实例中，本发明的肝细胞生长因子的两种以上的异构体包含全长型肝细胞生长因子及缺损的变异型肝细胞生长因子。
在本发明的一具体例中，本发明的全长型肝细胞生长因子包含序列表中序列1的氨基酸序列，本发明的缺损的变异型肝细胞生长因子包含序列表中序列2的氨基酸序列。
在作为本发明的肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗方法的情况下，由于是包括将作为本发明的一实施方式的肌萎缩性侧索硬化症预防或治疗用药学组合物进行给药的步骤的方法，因而为了避免本说明书过于复杂，省略重复内容的记载。
发明的效果
归纳本发明的特征及优点如下：
(a)本发明提供肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用药学组合物。
(b)本发明提供肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗方法。
(c)若利用本发明的组合物或方法，则可通过抑制胚胎神经细胞中的神经突起增生、生长及运动神经细胞的生长及凋亡，来预防或治疗肌萎缩性侧索硬化症。
附图说明
图1表示本发明一实施例的对胚胎神经细胞的神经突起增生产生的pCK-肝细胞生长因子X7的影响。
图2表示本发明一实施例的对胚胎神经细胞的生长产生的pCK-肝细胞生长因子X7的影响。
图3表示本发明一实施例的在小鼠运动神经细胞中pCK-肝细胞生长因子X7对细胞生长产生的影响。
图4a、图4b表示本发明一实施例的在小鼠运动神经细胞中pCK-肝细胞生长因子X7对细胞凋亡产生的影响。
图5表示本发明一实施例的在氧化应激培养条件下对小鼠运动神经细胞的生存产生的pCK-肝细胞生长因子X7的效果。
图6a、图6b表示本发明一实施例的在氧化应激培养条件下对小鼠运动神经细胞的细胞凋亡产生的pCK-肝细胞生长因子X7的效果。
图7表示本发明一实施例的在传递G93A突变形态的h超氧化物歧化酶1的细胞中pCK-肝细胞生长因子X7对细胞生长产生的影响。
图8表示本发明一实施例的在肌萎缩性侧索硬化症小鼠中pCK-肝细胞生长因子X7对小鼠的握力产生的影响。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅用于更加具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不受这些实施例的限制，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例
实施例1：确认在胚胎神经细胞(Embryonic neuronal cell，ENC)的成熟(maturation)中pCK-肝细胞生长因子X7产生的功效
从小鼠的胚胎(embryo)中仅采集大脑皮质部分来进行单一细胞化之后，将10μM的阿糖胞苷(Ara-C)放入培养基来仅培养神经细胞。为了确认在胚胎神经细胞的成熟中pCK-肝细胞生长因子X7产生的影响，播种2×104个细胞，并在次日，利用从转染pCK-肝细胞生长因子X7的293F细胞(美国生命科技公司(Life technologies，USA))中取得的1.25ng/mL的蛋白质对细胞进行处理，来确认了在细胞的成熟中呈现的神经突起增生(neuriteoutgrowth)的程度。有关细胞的神经突起增生的程度，通过免疫细胞化学(immunocytochemistry)确认了神经细胞特异性地表达的作为微管蛋白(tubulin)的TUJ-1的表达。
其结果，如图1所示，确认如下：与作为对照组的pCK处理组相比，pCK-肝细胞生长因子X7处理组更显著地使神经突起的长度增加。
实施例2：确认胚胎神经细胞的成熟(maturation)之后pCK-肝细胞生长因子X7对细胞生长产生的影响
确认了胚胎神经细胞成熟之后，pCK-肝细胞生长因子X7对细胞生长产生的影响。为此，播种5×104个胚胎神经细胞，并进行了6天的成熟过程。6天之后，利用1.25ng/mL的从转染pCK-肝细胞生长因子X7的293F细胞中取得的蛋白质进行处理，来确认了pCK-肝细胞生长因子X7对细胞的生长产生的影响。处理3天的pCK-肝细胞生长因子X7之后，执行MTT试验来测定了细胞生长。
其结果，如图2所示，确认如下：与作为对照组的pCK处理组相比，在pCK-肝细胞生长因子X7处理组中，细胞生长增加约40％左右。
实施例3：确认在小鼠运动神经细胞(NSC-34)中pCK-肝细胞生长因子X7对细胞生长及细胞凋亡产生的影响
3-1.细胞株及细胞培养
使用于本实验的小鼠运动神经细胞(Cellution Biosystem，Vancouver，CA)为来源于小鼠的运动神经细胞。小鼠运动神经细胞作为胚胎期来源于小鼠的脊柱神经的运动神经细胞和神经母细胞瘤细胞混合而成的细胞株，是广泛地使用于与运动神经相关的研究的细胞株。上述细胞在37℃且5％的CO2条件下进行培养，并在包含10％的牛胎儿血清(美国吉毕科BRL公司(Gibco)，(USA))及抗生物质(美国吉毕科BRL公司)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM，西格玛(Sigma)公司)中进行培养。细胞培养介质、试剂及血清从吉毕科公司和西格玛奥德里奇(Sigma aldrich)公司购买。
3-2.表达肝细胞生长因子蛋白质的上清液生产及定量
为了生产表达肝细胞生长因子蛋白质的上清液，利用了脱氧核糖核酸转染法。转染利用了FuGene HD转染系统(美国普洛麦格公司(Promega，USA))，并按照制造商的协议进行。以1×106个播种293T细胞之后，次日，分别转染了3μg的pCK、pCK-肝细胞生长因子728(PCT/KR03/000548的pCK-c肝细胞生长因子)、pCK-肝细胞生长因子723(PCT/KR03/000548的pCK-缺损的变异型肝细胞生长因子)及pCK-肝细胞生长因子X7脱氧核糖核酸。培养48小时之后，全部收获各个上清液，并利用0.22μm的过滤器进行了过滤。利用人类肝细胞生长因子免疫分析法测定了包含于各上清液的肝细胞生长因子蛋白质的表达量。以1μg/mL重新稀释各上清液来使用于实验。使用于人类肝细胞生长因子免疫分析法的重组人类肝细胞生长因子蛋白质购买R&D公司(R&D system,Inc.,美国(USA))的产品来使用。
3-3.在小鼠运动神经细胞中pCK-肝细胞生长因子X7对细胞生长产生的影响
为了确认pCK-肝细胞生长因子X7对运动神经细胞的生长产生的效果，对小鼠运动神经细胞处理pCK-肝细胞生长因子X7之后，评价了细胞的增殖程度。为了在包含10％的牛胎儿血清的培养基中培养细胞之后，使用于实验，利用包含1％的牛胎儿血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基来进行了悬浮。在2mL的包含1％的血清的培养基中，以包含3×104个细胞的方式进行悬浮，来播种于6孔板。播种2小时之后，将从转染pCK-肝细胞生长因子728、pCK-肝细胞生长因子723、pCK-肝细胞生长因子X7的293T细胞中取得的各上清液，以每孔100uL的方式分别添加于6孔板，使得肝细胞生长因子蛋白质的浓度成为50ng/mL。将pCK载体转染于293T细胞来取得的上清液用作了对照组。培养48小时之后，更换6孔板的培养基。向各个孔添加2mL的包含1％的牛胎儿血清的培养基之后，添加从转染pCK-肝细胞生长因子728、pCK-肝细胞生长因子723及pCK-肝细胞生长因子X7的293T细胞中取得的各上清液，使得肝细胞生长因子蛋白质的浓度成为50ng/mL之后，培养了48小时。使用将pCK载体转染于293T细胞来取得的上清液作为对照组。收集培养的细胞来对细胞进行了计数。将pCK载体用作了对照组。
播种细胞之后培养5天，最终观察到如下：在处理从转染pCK、pCK-肝细胞生长因子728、pCK-肝细胞生长因子723、pCK-肝细胞生长因子X7的293T细胞中取得的各上清液的实验组中，与处理pCK载体的实验组相比，处理pCK-肝细胞生长因子728或pCK-肝细胞生长因子723的实验组诱导了约20％左右的细胞增殖，处理pCK-肝细胞生长因子X7的组中，约48％左右的细胞生长增加。通过上述结果，可确认到与pCK-肝细胞生长因子728或pCK-肝细胞生长因子723相比，pCK-肝细胞生长因子X7显著地增加运动神经细胞的细胞生长(参照图3)。
3-4.在小鼠运动神经细胞中pCK-肝细胞生长因子X7对细胞凋亡产生的影响
利用包含1％的牛胎儿血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基将小鼠运动神经细胞悬浮成3×104个来播种于6孔板。播种细胞之后，将细胞稳定2小时，再添加从转染pCK-肝细胞生长因子728、pCK-肝细胞生长因子723、pCK-肝细胞生长因子X7的293T细胞中取得的各上清液，使得肝细胞生长因子蛋白质的浓度成为50ng/mL。将在293T细胞中转染pCK载体来取得的上清液用作了对照组。细胞以2-3天的间隔更换培养基和上述各上清液来培养了5天。
从培养5天的细胞中利用TRIZOL试剂(美国生命技术公司(Life technologies，USA))提取核糖核酸，提取的核糖核酸利用第一链互补脱氧核糖核酸试剂盒(美国罗氏公司(Roch，USA))来合成了互补脱氧核糖核酸。将合成的互补脱氧核糖核酸作为模板，将针对Bax基因的序列表中序列11和序列12或针对Bcl-2基因的序列表中序列13和序列14的核苷酸用作引物，来进行了实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)。实时定量聚合酶链式反应如下：混合1μL的模板互补脱氧核糖核酸、1μL的10pmole/μL的引物、12.5μL的SYBR green聚合酶链式反应预混液(SYBR green PCR master mix)(美国生命技术公司)及9.5μL的灭菌第三次蒸馏水，来制备总25μL的混合液之后，在50℃温度下反应2分钟，在95℃温度下反应10分钟之后，以95℃温度下15秒钟，60℃温度下1分钟的条件反复40次来进行了反应。此时，为了校正各反应值，作为持家基因，使用针对甘油醛脱氢酶(GAPDH)的序列表中序列15和序列16的核苷酸作为引物，来相同地进行实时定量聚合酶链式反应。试验结果如下：与pCK处理组相比，在处理各肝细胞生长因子上清液的组中，作为与细胞凋亡诱导相关的基因的Bax的基因表达减少，尤其，在pCK-肝细胞生长因子X7处理组中，与抗细胞凋亡相关的Bcl-2的表达比pCK处理组增加了1.3倍(参照图4a)。通过上述实验，确认了在包含1％的牛胎儿血清的培养基条件下，与作为对照组的pCK处理组相比，pCK-肝细胞生长因子X7抑制约40％左右的细胞凋亡(参照图4b)。
实施例4.确认氧化应激培养条件下，对小鼠运动神经细胞的生存产生的pCK-肝细胞生长因子X7的效果
4-1.借助氧化应激诱导小鼠运动神经细胞的细胞凋亡的过氧化氢水的浓度选定
在确认pCK-肝细胞生长因子X7对由过氧化氢水诱导的小鼠运动神经细胞的细胞凋亡产生的影响之前，选定了适合确认小鼠运动神经细胞的凋亡的适当的细胞的播种浓度及诱导细胞凋亡的过氧化氢水的浓度。
收集利用包含10％的牛胎儿血清的培养基培养的细胞，并利用包含1％的牛胎儿血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基进行悬浮，来对细胞进行了计数。经计数的细胞在96孔板中以1×104个的细胞浓度播种之后，次日处理了10μM、20μM、30μM、50μM及100μM的过氧化氢水。在未处理过氧化氢水的孔中添加磷酸缓冲溶液，并用作对照组。24小时之后，利用XTT实验法(美国罗氏公司)来测定了细胞凋亡程度。与对照组相比，在按浓度处理过氧化氢水的实验组中，确认了诱导0％、10％、30％、70％及85％的细胞凋亡。基于上述结果，将诱导小鼠运动神经细胞的细胞凋亡的过氧化氢水的适当的浓度选定为30μM。
并且，为了在6孔板中进行细胞凋亡实验，在6孔板中进行播种，使得1.5×105、3×105、1×106个的细胞包含于2mL的包含1％的牛胎儿血清的培养基中。次日，对小鼠运动神经细胞处理30μM的过氧化氢水之后，在第1天、第4天及第7天确认了细胞数。在第7天确认了细胞数，其结果如下：播种1.5×105个细胞的孔的细胞全部凋亡，从而无法选定于实验中，播种1×106个细胞的孔中未诱导细胞凋亡。基于上述实验结果，将使用于诱导细胞凋亡的实验的细胞数选定为3×105个，并将过氧化氢水的浓度选定为30μM。
4-2.确认在氧化应激培养条件下对小鼠运动神经细胞的生产产生的pCK-肝细胞生长因子X7的效果
为了在包含10％的牛胎儿血清的培养基中培养之后，使用于细胞凋亡抑制实验，小鼠运动神经细胞利用包含1％的牛胎儿血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基进行了悬浮。进行悬浮来播种于6孔板，使得3×105个细胞包含于2mL的包含1％的血清的培养基中。次日，将在之前实验中选定的30μM的过氧化氢水处理于各个孔之后，处理了从转染pCK-肝细胞生长因子728、pCK-肝细胞生长因子723及pCK-肝细胞生长因子X7的293T细胞中取得的各上清液，使得肝细胞生长因子蛋白质的浓度成为50ng/mL。利用转染pCK载体之后取得的培养基作为实验对照组。将细胞培养7天，并观察了细胞凋亡程度。细胞播种7天之后，收集细胞来对细胞进行了计数。根据细胞计数结果，可知如下：与最初播种的细胞数相比，处理pCK、pCK-肝细胞生长因子728及pCK-肝细胞生长因子723的实验组的细胞仅生存约60-70％的细胞，但在处理pCK-肝细胞生长因子X7的小鼠运动神经细胞中，呈现约92％左右的生存，从而确认了与其他实验物质处理组相比，抑制细胞凋亡。通过上述结果，可确认如下：有效抑制肝细胞生长因子X7蛋白质通过基于过氧化氢水的氧化应激诱导的运动神经的细胞凋亡(参照图5)。
4-3.确认在氧化应激培养条件下对小鼠运动神经细胞的细胞凋亡产生的pCK-肝细胞生长因子X7的效果
利用包含1％的牛胎儿血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基以3×105个悬浮小鼠运动神经细胞来播种于6孔板。次日，在各孔中处理30μM的过氧化氢水之后，处理从转染pCK-肝细胞生长因子728、pCK-肝细胞生长因子723及pCK-肝细胞生长因子X7的293T细胞中取得的各上清液，使得肝细胞生长因子蛋白质的浓度成为50ng/mL，并培养了7天。利用转染pCK载体之后取得的上清液作为实验对照组。
利用TRIZOL试剂从培养7天的细胞中提取核糖核酸，提取的核糖核酸利用第一链互补脱氧核糖核酸试剂盒来合成了互补脱氧核糖核酸。将合成的互补脱氧核糖核酸作为模板，将针对Bax基因的序列表中序列11和序列12或针对Bcl-2基因的序列表中序列13和序列14的核苷酸用作引物，来进行了实时定量聚合酶链式反应。实时定量聚合酶链式反应如下：混合1μL的模板互补脱氧核糖核酸、1μL的10pmol e/μL的引物、12.5μL的SYBR green聚合酶链式反应预混液(美国生命技术公司)及9.5μL的灭菌第三次蒸馏水，来制备总25μL的混合液之后，在50℃温度下反应2分钟，在95℃温度下反应10分钟之后，以95℃温度下15秒钟，60℃温度下1分钟的条件反复40次来进行了反应。此时，为了校正各反应值，作为持家基因，使用针对甘油醛脱氢酶的序列表中序列15和序列16的核苷酸作为引物，来相同地进行实时定量聚合酶链式反应。试验结果如下：与pCK处理组相比，在处理各肝细胞生长因子上清液的组中，作为与细胞凋亡诱导相关的基因的Bax的基因表达减少，并且与抗细胞凋亡相关的Bcl-2的表达增加。尤其，在pCK-肝细胞生长因子X7处理组的情况下，确认了与pCK处理组相比呈现减少约70％左右的Bax基因的表达的结果(参照图6a)，并使Bax/Bcl-2的比率(ratio)减少约75％左右，从而使细胞凋亡抑制效果优秀(参照图6b)。
实施例5.确认在传递G93A突变(mutant)形态的h超氧化物歧化酶1的细胞中pCK-肝细胞生长因子X7对细胞生长产生的影响
众所周知，通过很多研究人员开发了利用肌萎缩性侧索硬化症的原因之一的超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase 1)的G93A突变型的体外(in vitro)试验法。尤其，据报告，当向运动神经细胞的研究中广泛使用的小鼠运动神经细胞传递h超氧化物歧化酶1的G93A突变型时，可诱导细胞的凋亡(Cheema et al.,2005)。因此，在本试验中，将针对人(human)超氧化物歧化酶1野生型基因(wildtype；WT)(NM_000454)和人超氧化物歧化酶1基因的第93氨基酸序列从甘氨酸变更为丙氨酸的基因分别插入于pCK载体的BamHI部位(site)，来制备了pCK-h超氧化物歧化酶1-野生型和pCK-h超氧化物歧化酶1-G93A。为了利用制备的多个质粒确认在传递h超氧化物歧化酶1-G93A的小鼠运动神经细胞中的pCK-肝细胞生长因子X7的功效进行如下实验。
利用包含10％的牛胎儿血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基以1×104个悬浮小鼠运动神经细胞来播种于96孔板之后，次日，利用脂质体LTX试剂(美国生命技术公司)来对pCK、pCK-h超氧化物歧化酶1-野生型(wildtype；WT)及pCK-h超氧化物歧化酶1-G93A突变(G93A)进行了转染。在进行转染之前，有关多个G93A转染细胞，处理了从转染pCK-肝细胞生长因子728、pCK-肝细胞生长因子X7的293T细胞中取得的各个上清液，使得肝细胞生长因子蛋白质的浓度成为50ng/mL。利用转染pCK载体之后取得的上清液作为实验对照组。
培养3天之后，处理XTT试剂来确认了细胞生长。其结果，确认了传递野生型h超氧化物歧化酶1的细胞呈现细胞生长与传递pCK载体的细胞类似。但是，与传递pCK的细胞相比，传递G93A突变形态的h超氧化物歧化酶1的细胞呈现约85.8％的细胞生长，从而与传递野生型h超氧化物歧化酶1的细胞相比，呈现细胞生长降低。但是，在处理pCK-肝细胞生长因子X7的实验组中呈现约92.9％的细胞生长，从而呈现抑制基于G93A突变形态的h超氧化物歧化酶1的传递的细胞生长的降低的效果(参照图7)。
基因序列
序列11：GGC AGA CAG TGA CCA TCT TT
序列12：AGT GGA CCT GAG GTT TAT TG
序列13：CCA TCA ATC AAA GCC AAG CA
序列14：AGC CTT CAC GCA AGT TCA GG
序列15：CCA TCA CTG CCA CTC AGA AGA C
序列16：TCA TAC TTG GCA GGT TTC TCC
实施例6.pCK-肝细胞生长因子X7对人类突变超氧化物歧化酶1G93A Tg小鼠(以下为肌萎缩性侧索硬化症小鼠)的握力(grip strength)产生的功效评价
随着肌萎缩性侧索硬化症的原因之一确认为超氧化物歧化酶1(SOD1，Superoxidedismutase 1)的突变，开发了利用上述基因的肌萎缩性侧索硬化症小鼠模型，当前，全世界的肌萎缩性侧索硬化症研究人员利用上述动物模型来进行多种研究(Weydt P et al.,2003)。其中，选定广泛使用的B65JL-Tg(超氧化物歧化酶1*G93A)1Gur/J(002726)来使用于实验中。肌萎缩性侧索硬化症小鼠的制作委托于友谊BSC(韩国(Korea))，并通过基因型分型(genotyping)过程，确认是否表达突变形态的超氧化物歧化酶1基因之后，使用于本实验中。
将10周龄的肌萎缩性侧索硬化症小鼠以每组4只的方式分开，并分别分离为Tg-pCK、Tg-pCK-肝细胞生长因子728(PCT/KR03/00548的pCK-c肝细胞生长因子)及Tg-pCK-肝细胞生长因子X7给药组。选择不属于Tg的6只个体来设定为对照组(以下，非-Tg)。2周之后，以肌肉注射的方式将相应的质粒给药到除了阴性对照组之外的上述3种实验组的小鼠。此时，分别给药到左右的肱三头肌、胫骨前肌、股四头肌及腓肠肌，并作为容量以2μg/μl的浓度以每次50μl的方式进行了给药。给药2周之后(14周龄)，通过行动实验调查了各小鼠的握力。在行动实验的情况下，进行网眼(mesh)握力测试。网眼握力测试为将小鼠放置于具有规定的间隔的格子纹的铁制网之后，翻转上述铁质网，再测量小鼠吊在铁制网而承受的时间来调查握力的方法。上述方法为可评价小鼠的肌肉能力的最代表性的方法之一(CrawleyJN,2008)。
实验结果如下：在非-Tg小鼠的情况下，以翻转的状态承受平均9分钟左右，相反，在Tg的多个个体中给药到了pCK的小鼠的情况下，以翻转的状态吊住30秒钟左右。在给药到了pCK-肝细胞生长因子728质粒的个体的情况下，呈现比pCK给药组小幅上升的平均时间，其时间为平均49秒钟。与此相反，在给药到了pCK-肝细胞生长因子X7的小鼠的情况下，与给药到了pCK或pCK-肝细胞生长因子728的小鼠相比，更长时间以翻转的状态吊住，其平均时间为3分钟(参照图8)。这呈现如下：与pCK及pCK-肝细胞生长因子728相比，pCK-肝细胞生长因子X7显著提高了以肌萎缩性侧索硬化症小鼠的握力为首的肌肉的功能。
以上，对本发明的特定部分进行了详细记述，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，这种具体记述仅仅是优选的实例，本发明的范围并不限定于此，这是显而易见的。因此，本发明的实质性的范围根据所附的发明要求保护范围和其等同技术方案来定义。
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Claims (8)

1.一种肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，包含肝细胞生长因子的两种以上的异构体或对上述异构体进行编码的聚核苷酸作为有效成分，其中上述肝细胞生长因子的两种以上的异构体包含全长型肝细胞生长因子及缺损的变异型肝细胞生长因子，上述全长型肝细胞生长因子包含序列表中序列1的氨基酸序列，上述缺损的变异型肝细胞生长因子包含序列表中序列2的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，上述肝细胞生长因子的两种以上的异构体借助单独的核苷酸序列进行编码。
3.根据权利要求1所述的肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，上述肝细胞生长因子的两种以上的异构体借助单一的核苷酸序列进行编码。
4.根据权利要求1所述的肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，上述聚核苷酸包含于裸脱氧核糖核酸或基因运载体。
5.根据权利要求4所述的肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，上述基因运载体为载体。
6.根据权利要求5所述的肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，上述载体为质粒。
7.根据权利要求6所述的肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，上述质粒为pCK。
8.肝细胞生长因子的两种以上的异构体或对上述异构体进行编码的聚核苷酸在制备用于预防或治疗肌萎缩性侧索硬化症的组合物中的用途，其特征在于，上述肝细胞生长因子的两种以上的异构体包含全长型肝细胞生长因子及缺损的变异型肝细胞生长因子，上述全长型肝细胞生长因子包含序列表中序列1的氨基酸序列，上述缺损的变异型肝细胞生长因子包含序列表中序列2的氨基酸序列。
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