KR20000046969A - 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한전사 활성을 가진 진핵세포 발현벡더 - Google Patents

이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한전사 활성을 가진 진핵세포 발현벡더 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람 싸이토메갈로 바이러스(human cytomegalovirus, "HCMV")의 즉시초기(immediate early, "IE") 유전자 또는 사람 EF1α 유전자로부터 유래된 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한 전사활성을 가진 진핵세포 발현벡터에 관한 것이다. 본 발명의 진핵세포 발현벡터는 다음과 같은 특징을 가진다: 첫째, HCMV IE 유전자 또는 사람 EFlα 유전자의 인핸서/프로모터를 삽입하여 다양한 종류의 진핵세포에서 강력한 전사활성이 유도될 수 있도록 하였다; 둘째, 다클로닝 부위(multiple cloning site) 상류에 HCMV IE 유전자 또는 사람 EFlα 유전자의 5' UTR(5' untranslated region)을 삽입하여 하류의 이종 유전자 발현효율을 극대화하였다; 셋째, 다양한 진핵세포에서 강력하고 안정한 유전자 발현을 유도할 수 있으므로, 진핵세포에서 일시적 혹은 영구적으로 높은 유전자 발현을 유도하고자 할 때 또는 레트로바이러스 패키징 벡터의 제조에 유용하게 사용될 수 있다; 넷째, 생체내에서도 강력하고 안정한 유전자 발현을 유도할 수 있으므로, 유전자 치료요법에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한 전사활성을 가진 진핵세포 발현벡터
본 발명은 이종 유전자로부터 유래된 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한 전사활성을 가진 진핵세포 발현벡터에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 사람 싸이토메갈로 바이러스(human cytomegalovirus, "HCMV")의 즉시초기(immediate early, "IE") 유전자 또는 사람 EF1α 유전자로부터 유래된 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한 전사활성을 가진 진핵세포 발현벡터에 관한 것이다.
재조합 발현벡터가 진핵세포에서 이종 유전자를 일시적으로 혹은 안정하게 영구적으로 발현시키기 위한 목적으로 사용될 수 있으려면, 대장균에서의 복제와 선별이 가능한 유전자들 이외에, 진핵세포에서 전사를 유도할 수 있는 프로모터, poly(A) 아데닐화 신호부위 및 네오마이신 내성유전자와 같은 진핵세포에서의 선별표지 유전자를 필수적으로 포함해야 한다.
다양한 진핵세포에서 보다 강력하고 안정된 유전자 발현을 유도할 수 있는 재조합 발현벡터를 제조하기 위하여 사용되고 있는 여러가지 전략들 중에서 대표적인 것은 강력한 이종 프로모터를 포함시켜 유전자 발현효율을 증대시키거나, 또는 SV40 복제원점(replication origin)을 포함시켜 SV40 T 항원을 발현하는 세포에서 자가복제가 가능하도록 하는 것이다. 진핵세포에서 강력한 전사활성을 유도할 수 있는 프로모터로는 HCMV IE 유전자의 프로모터가 잘 알려져 있으며, 이외에도 하우스 키핑(house keeping) 유전자의 일종인 사람 EF1α 유전자의 프로모터가 최근 주목을 받고 있다. 전기 EF1α 유전자의 프로모터는 바이러스 유래의 프로모터에 비하여 동물세포의 게놈 내로 삽입된 후에도 장기간 비활성화되지 않고 지속적으로 유전자 발현을 유도할 수 있을 것으로 보여, 유전자 치료요법용 재조합 발현벡터의 개발에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.
이와 더불어, 최근에는 인트론을 포함하는 플라스미드의 유전자 발현량이 인트론을 포함하지 않는 경우에 비하여 더 높다는 연구결과들이 축적됨에 따라, 재조합 발현벡터에 이종 인트론을 도입함으로써 보다 안정하고 지속적인 유전자 발현이 가능하도록 개선된 벡터들이 개발되어 사용되고 있다.
강력하고 안정한 진핵세포의 개발은 특히 최근 각광을 받고 있는 유전자 치료요법 분야의 새로운 장을 열어줄 것으로 기대되는 바, 종래의 발현벡터에 비하여 다양한 종류의 진핵세포에서 이종 유전자를 효율적이며 지속적으로 발현할 수 있는 새로운 진핵세포 발현벡터의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 진핵세포에서 보다 강력하고 안정하게 이종유전자를 발현할 수 있는 진핵세포 발현벡터를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 사람 싸이토메갈로 바이러스의 즉시초기 유전자("HCMV IE 유전자") 또는 사람 EF1α 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소(gene expression regulatory element)를 이종유전자 삽입위치 상류에 삽입함으로써 이종유전자의 발현 효율 및 안정성을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하여 다양한 진핵세포에서 강력하고 안정하게 유전자발현을 유도할 수 있는 진핵세포 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 진핵세포 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
도 1은 사람 싸이토메갈로 바이러스 즉시 초기 유전자의 인핸서/프로모터("PCMV") 및 5′UTR을 포함하는 염기서열을 나타낸다.
도 2는 PCMV및 5′UTR을 포함하는 유전자 절편을 pCDNA3.1 벡터에 클로닝하여 진핵세포 발현벡터 pCN을 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 사람 EF1α 유전자의 인핸서/프로모터("PEF") 및 5′UTR을 포함하는 염기서열을 나타낸다.
도 4는 PEF및 5′UTR을 포함하는 유전자 절편을 pCDNA3.1 벡터에 클로닝하여 진핵세포 발현벡터 pEF을 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 5는 전기 pCDNA3.1 벡터와 pCN 벡터에 각각 CAT 유전자를 삽입하여 pCDNA3.1-CAT 벡터와 pCN-CAT 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 6a 및 도 6b는 gag-pol 발현벡터인 pCP-gag·pol 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 7a 및 도 7b는 env 발현벡터인 pCH-env 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 8a는 VEGF 발현벡터인 pCN-VEGF 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 8b는 VEGF 발현벡터인 pEF-VEGF 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 9는 전기 pCN-VEGF 벡터를 주사한 마우스 근육에서 VEGF 유전자의 발현수준을 보여주는 그래프이다.
본 발명자들은 강력한 유전자 발현을 유도할 수 있는 이종 유전자-유래의 유전자 발현 조절요소로서 사람 싸이토메갈로 바이러스 즉시초기 유전자("HCMV IE 유전자") 또는 하우스 키핑(house keeping) 유전자인 사람의 EFlα 유전자로부터 유래된 인핸서/프로모터("PCMV") 및 5'UTR (5' untranslated region)을 포함하는 진핵세포 발현벡터 pCN 및 pEF 벡터를 제조하였다. 전기 pCN 벡터를 이용하여 HCMV IE 유전자의 인핸서/프로모터 및 5'UTR을 포함하는 CAT 발현벡터와 레트로바이러스 패키징 벡터들을 각각 제조하고, 전기 벡터들로 각각 트랜스펙션된 세포에서 CAT 역가 및 패키징 효율을 조사한 결과, HCMV IE 유전자의 5'UTR이 이종 유전자의 발현효율을 크게 증가시킴을 확인하였다. 아울러, 전기 pCN 벡터와 pEF 벡터에 사람 VEGF(vascular endothelial growth factor) 유전자를 각각 삽입하여 제조된 pCN-VEGF 벡터 및 pEF-VEGF 벡터로 각각 트랜스펙션된 쥐 근육세포의 배양액에서는 높은 수준의 VEGF가 검출되었으며, 전경골근(anterior tibialis)에 전기 pCN-VEGF 벡터를 주사한 Blab/C 마우스의 근육에서도 역시 높은 수준의 VEGF가 검출되었다. 이러한 결과들은 본 발명의 pCN 및 pEF 벡터를 이용하여 진핵세포에서 이종 유전자를 높은 효율로 안정하게 발현시킬 수 있음과 더불어 유전자치료 요법에서의 이용가능성을 강력히 제시하였다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 종래의 진핵세포 발현벡터인 pCDNA 3.1(Invitrogen, USA)을 시발벡터로 하여 보다 우수한 진핵세포 발현벡터를 제조하고자 하였다: 우선, HCMV IE 유전자-유래의 유전자 발현 조절요소들을 포함하는 발현벡터를 제조하기 위하여, pEQ 276 벡터(참조: Biegalke et al., Virology, 183:381-385(1991))를 주형으로 삼아, HCMV IE 유전자의 인핸서/프로모터와 5' UTR 즉, 엑손 1, 인트론 A 및 엑손 2의 ATG 개시코돈 직전까지의 염기서열을 포함하는 유전자 절편을 PCR로 증폭한 다음, 전기 절편을 pCDNA3.1의 HCMV 인핸서/프로모터 부위와 대치하여 pCN 벡터를 제조하였다. 이렇게 제조된 pCN 벡터는 그 기본 주형은 전기 pCDNA3.1과 동일하면서, 다클로닝 부위의 상류에 HCMV IE 유전자의 프로모터/인핸서와 더불어 엑손 1, 인트론 A 및 엑손 2의 일부를 가지므로, 전기 다클로닝 부위에 삽입된 이종 유전자는 스플라이싱된 RNA로부터 발현되게 된다. 한편, 본 발명자들은 전기 pCN 벡터로 형질전환된 대장균을 'Top10-pCN'이라 명명하고, 이를 1998년 7월 20일자로 사단법인 한국종균협회(KFCC, 대한민국 서울시 서대문구 신촌동 134 소재)에 기탁번호 KFCC-11045로 기탁하였다. HCMV IE 유전자의 5'UTR이 유전자 발현 효율에 미치는 영향을 조사하고자, 전기 pCN 벡터와 PCMV만을 포함하는 pCDNA3.1 벡터(Invitrogen, USA), 그리고 이종 인트론을 포함하는 pCIneo 벡터(Promega, USA)에 각각 CAT 유전자를 삽입하여, pCN-CAT, pCDNA3.1-CAT 및 pCIneo-CAT을 제조한 다음, 이들을 각각 293T 세포((참조: DuBridge et al., Mol. Cell. Biol., 7:379-387(1987))에 트랜스팩션시키고 CAT 역가를 측정해본 결과, pCN-CAT으로 트랜스펙션시킨 경우에 가장 높은 CAT 역가가 관찰되었다. 이러한 결과는 HCMV IE 유전자의 인핸서/프로모터와 더불어 5'UTR을 함께 포함시킴으로써 발현벡터의 유전자 발현효율을 크게 향상시킬 수 있음을 제시하였다. 또한, HCMV IE 유전자의 인핸서/프로모터와 더불어 5'UTR을 포함하는 레트로바이러스 패키징 벡터인 pCP-gagㆍpol 및 pCH-env를 제조하고, 이들을 CAT 유전자를 리포터 유전자로 가지고 있는 레트로바이러스 벡터인 MFG-CAT(참조: Kim et al., J. Virol., 72:994-1004(1998))과 함께 293T 세포에 트랜스팩션시킨 다음, 바이러스 상층액을 얻어 NIH 3T3 세포(ATCC CRL 1658)를 감염시키고, 패키징 효율을 조사해본 결과, HCMV IE 유전자의 프로모터를 포함하는 종래의 패키징벡터를 사용한 경우에 비하여 높은 CAT 역가가 관찰됨으로써, HCMV IE 유전자의 5'UTR을 포함하는 본 발명의 pCN 벡터가 우수한 유전자 발현효율을 가지고 있음이 다시 한번 입증되었다.
한편, 본 발명자들은 HCMV IE 유전자-유래의 유전자 발현 조절요소 대신 하우스 키핑(house keeping) 유전자의 일종인 사람 EF1α유전자-유래의 유전자 발현 조절요소들을 포함하는 발현벡터를 제조하기 위하여, 사람의 태반 RNA를 주형으로 삼아, EF1α유전자의 인핸서/프로모터와 5' UTR을 포함하는 유전자 절편을 RT-PCR로 증폭한 다음, 전기 절편을 pCDNA3.1의 HCMV 인핸서/프로모터 부위와 대치하여 pEF 벡터를 제조하였다. 이렇게 제조된 pEF 벡터 역시 전기 pCN 벡터와 마찬가지로 그 기본 주형은 pCDNA3.1과 동일하면서, 다클로닝 부위의 상류에 EF1α유전자의프로모터/인핸서와 더불어 엑손 1, 인트론 A 및 엑손 2의 일부를 가지므로, 전기 다클로닝 부위에 삽입된 이종 유전자는 스플라이싱된 RNA로부터 발현되게 된다.
전기 pCN 벡터 및 pEF 벡터의 유전자 치료요법에서의 이용가능성을 검증하기 위하여, pCN과 pEF 벡터 각각에 발현코자 하는 이종유전자의 일례로서 사람의 VEGF 유전자를 삽입하여 pCN-VEGF와 pEF-VEGF를 제조한 다음, 쥐의 근육세포주인 C2C12 세포(ATCC CRL-1772)에 트랜스펙션시키고 VEGF 단백질의 발현수준을 ELISA로 측정해 본 결과, 두 가지 벡터 모두 뛰어난 유전자 발현 효율을 보였다. 또한, 생체내에서 본 발명의 VEGF 발현벡터의 유전자 발현 효율을 확인하기 위해서, 2주령의 웅성 Balb/C 마우스의 전경골근에 전기 pCN-VEGF 벡터를 주사한 후, 주사한 근육 조직에서 총 단백질을 추출하여 ELISA로 VEGF의 발현수준을 측정해 본 결과, 전술한 배양세포에서의 측정결과와 마찬가지로 높은 발현수준이 관찰되었다. 이에, 본 발명자들은 전기 pCN-VEGF 벡터로 형질전환된 대장균을 'Top10-pCN/VEGF'로, 그리고 전기 pEF-VEGF벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 'Top10-pEF/VEGF'이라 각각 명명하고, 이들을 1998년 11월 19일자로 사단법인 한국종균협회(KFCC, 대한민국 서울시 서대문구 신촌동 134 소재)에 각각 기탁번호 KFCC-11064와 KFCC-11063으로 기탁하였다.
상기와 같은 결과들을 종합해 볼 때, 본 발명의 pCN 벡터 및 pEF 벡터는 강력한 유전자 발현을 유도할 수 있으며 생체내에서도 이종 유전자의 발현을 유도할 수 있어, 유전자 치료요법에서와 같이 이종 유전자의 지속적인 발현이 필요한 경우에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: pCN 벡터의 제조
HCMV(human cytomegalovirus) 즉시초기(immediate early, "IE") 유전자의 인핸서/프로모터 부위("PCMV")로부터 5′UTR(5' untranslated region)까지를 포함하는 유전자 절편을 클로닝하기 위하여, HCMV IE 유전자의 프로모터로부터 엑손 5 까지를 포함하는 pEQ 276 벡터(참조: Biegalke et al., Virology, 183:381-385(1991))를 주형으로 삼아, HCMV 인핸서의 5′말단과 엑손 2의 ATG 개시코돈 상류에 각각 결합하는 다음과 같은 염기서열을 가지는 프라이머들을 이용하여 DNA 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, "PCR")을 수행하였다:
5'- ACG CGT TGA CAT TGA TTA TTG -3' (서열번호: 1)
MluI
5'- AAG CTT CGT GTC AAG GAC GGT -3' (서열번호: 2)
HindⅢ
전기 PCR로부터 증폭된 약 1.6kb의 DNA 절편은 HCMV IE 유전자의 인핸서/프로모터("PCMV"), 엑손 1, 인트론 A 및 엑손 2의 ATG 개시코돈 직전까지의 염기서열을 포함한다(참조: 도 1, 서열번호: 3). 도 1에서, 뉴클레오티드 1부터 599까지의 염기서열은 PCMV에, 뉴클레오티드 600부터 720까지의 염기서열은 엑손 1에, 뉴클레오티드 721부터 1547까지의 염기서열은 인트론 A에, 그리고 뉴클레오티드 1548부터 1564까지의 염기서열은 엑손 2의 ATG 개시코돈 직전까지에 각각 해당한다. 전기 약 1.6kb DNA 절편을 pZeroBlunt 벡터(Invitrogen, USA)에 클로닝하여 pZero-CMV 벡터를 제조한 다음, 전기 pZero-CMV 벡터로부터 MluI/HindⅢ 절편을 분리하고, 진핵세포 발현벡터인 pCDNA3.1 벡터(Invitrogen, USA)의 PCMV를 포함하는 MluI-HindⅢ 부위를 전기 절편으로 대치하여 pCN 벡터를 제조하였다(참조: 도2). 전기 pCN 벡터는 그 기본 주형은 전기 pCDNA3.1과 동일하여, 다클로닝 부위, BGH(bovine growth hormone) poly (A) 아데닐화 신호부위("pA"), SV40 프로모터(PSV40)와 복제원점, 네오마이신 내성유전자("NEO") 및 ColE1 복제원점 등을 모두 포함하면서, 다클로닝 부위 상류에 PCMV와 더불어 HCMV IE 유전자의 5'UTR 즉, 엑손 1, 인트론 A 및 엑손 2의 일부를 가지므로, 전기 다클로닝 부위에 삽입된 이종 유전자는 스플라이싱된 RNA로부터 발현된다. 한편, 본 발명자들은 전기 pCN 벡터로 형질전환된 대장균을 'Top10-pCN'이라 명명하고, 이를 1998년 7월 20일자로 사단법인 한국종균협회(KFCC, 대한민국 서울시 서대문구 신촌동 134소재)에 기탁번호 KFCC-11045로 기탁하였다.
실시예 2: pEF 벡터의 제조
사람 Ef1α 유전자의 인핸서/프로모터 부위("PEF")로부터 5' UTR 까지를 포함하는 유전자 절편을 클로닝하기 위하여, 사람의 게놈 DNA를 주형으로 삼아, Ef1α 인핸서의 5' 말단과 엑손 2의 ATG 개시코돈 상류에 각각 결합하는 다음과 같은 염기서열을 가지는 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행하였다:
5'- ACG CGT GGC AAT TGA ACC GGT GCC TAG AGA AGG TGG -3' (서열번호: 4)
Mlu1
5'- GCT AGC TTT GGC TTT TAG GGG TAG TTT TCA CGA CAC -3' (서열번호: 5)
Nhe1
전기 PCR로부터 증폭된 약 1.2 Kb의 DNA 절편은 EF1α유전자의 인핸서/프로모터("PEF"), 엑손 1, 인트론 A 및 엑손 2의 ATG 개시코돈 직전까지의 염기서열을 포함한다(참조: 도 3, 서열번호: 6). 도 3에서, 뉴클레오티드 1부터 137까지의 염기서열은 PEF에, 뉴클레오티드 138부터 158까지의 염기서열은 엑손 1에, 뉴클레오티드 159부터 1104까지의 염기서열은 인트론 A에, 그리고 뉴클레오티드 1105부터 1136까지의 염기서열은 엑손 2의 ATG 개시코돈 직전까지에 각각 해당한다. 전기 약 1.2kb DNA 절편을 pZeroBlunt 벡터( Invirtogen, USA)에 클로닝하여 pZero-Ef1α 벡터를 제조한 다음, 전기 pZero-Ef1α 벡터로부터 Mlu/Nhe1 절편을 분리하고, 진핵세포 발현벡터인 pCDNA 3.1 벡터(Invirtogen, USA)의 PCMV를 포함하는 Mlu1-Nhe1부위를 전기 절편으로 대치하여 pEF 벡터를 제조하였다(참조: 도 4). 전기 pEF 벡터는 그 기본 주형이 전기 pCDNA3.1과 동일하여, 다클로닝 부위, BGH poly(A) 아데닐화 신호부위, SV 프로모터와 복제원점, 네오마이신 내성유전자 및 ColE1 복제원점 등을 모두 포함하면서, 다클로닝 부위 상류에 pEF와 더불어 사람 EF 유전자의 5' UTR 즉, 엑손 1, 인트론 A 및 엑손 2의 일부를 가지므로, 전기 다클로닝 부위에 삽입된 이종 유전자는 스플라이싱된 RNA로부터 발현된다.
실시예 3: HCMV IE 유전자의 5' UTR이 유전자 발현효율에 미치는 영향
실시예 3-1: pCDNA3.1-CAT 벡터와 pCN-CAT 벡터의 제조
전기 실시예 1로부터 수득한 HCMV IE 유전자의 인핸서/프로모터 및 5' UTR을 포함하는 pCN 벡터의 유전자 발현효율을, PCMV만을 포함하는 pCDNA3.1 벡터 및 이종 인트론을 포함하는 pCIneo 벡터(Promega, USA)의 유전자 발현효율과 비교분석하기 위하여, 리포터 유전자인 CAT 유전자를 전기 pCDNA3.1 벡터와 pCN 벡터 그리고 pCIneo 벡터의 BamHI 위치에 각각 삽입하여, pCDNA3.1-CAT 벡터, pCN-CAT 벡터 및 pCIneo-CAT 벡터를 제조하였다(참조: 도 5).
실시예 3-2: CAT 역가 측정
전기 실시예 3-1로부터 수득한 pCN-CAT 벡터와 대조군인 pCDNA3.1-CAT 벡터 및 pCIneo-CAT 벡터를 각각 293T 세포(참조: DuBridge et al., Mol. Cell. Biol., 7:379-387(1987))에 트랜스팩션시키고 48시간 동안 배양한 다음, 세포질 단백질을 제조하여 CAT 역가를 측정함으로써 각 벡터들의 유전자 발현효율을 조사하였다. 그 결과, 하기 표 1에서 보듯이 PCMV이외에 HCMV IE 유전자의 5′ UTR을 추가로 포함하는 pCN-CAT의 경우, PCMV만을 포함하는 pCDNA3.1-CAT 벡터나 이종 인트론을 포함하는 pCIneo 벡터에 비하여, 이종 유전자 발현효율이 60배 이상 증가되었음을 확인하였다.
HCMV IE 유전자의 5'UTR이 CAT 유전자 발현에 미치는 영향
벡터 CAT 역가
pCDNA3.1-CAT 0.6 (±0.1)
pCN-CAT 37.9(±2.0)
pCIneo-CAT 0.7(±0.2)
실시예 4: pCN 벡터를 이용한 레트로바이러스 패키징 벡터의 제조
전기 실시예 1로부터 수득한 pCN 벡터의 우수한 유전자 발현효율을 재검증하는 동시에 레트로바이러스 생산을 위한 패키징 벡터로서의 유용성을 조사하고자, 전기 pCN 벡터를 이용하여 레트로바이러스 패키징 벡터인 gag-pol 발현벡터와 env 발현벡터를 제조하였다. 전기 패키징 벡터에 삽입할 진핵세포 선별마커로는, 대부분의 레트로바이러스 벡터에 존재하는 네오마이신 내성유전자와 차별성을 두기 위하여, gag-pol 발현벡터에는 퓨로마이신(puromycin) 내성유전자를, 그리고 env 발현 벡터에는 하이그로마이신(hygromycin) 내성유전자를 각각 삽입하였다.
실시예 4-1: pCP-gag·pol 벡터의 제조
진핵세포 선별마커로 퓨로마이신 내성유전자를 가지며, gag-pol 유전자의 발현이 HCMV IE 유전자의 인핸서/프로모터와 5′UTR에 의하여 조절되는 pCP-gag·pol 벡터를 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 먼저, pCI-neo 벡터(Promega, USA)로부터 네오마이신 내성유전자를 제거한 다음, pCII-puro 벡터로부터 분리된 퓨로마이신 내성유전자를 삽입하여 pCI-puro 벡터를 제조하였다(참조: 도 6a). 전기 pCI-puro 벡터를 BglⅡ와 NheⅠ으로 절단하여 PCMV절편을 제거한 다음, 대신 전기 실시예 1로부터 수득한 pCN 벡터로부터 분리된 PCMV및 5′UTR을 포함하는 MluI-HindIII 유전자 절편을 전기 pCI-Puro 벡터에 삽입하여 pCP 벡터를 제조하였다(참조: 도 6a). 한편, 종래의 gag-pol 발현벡터인 pHIT60(참조: Cannon et al., J. Virol., 70:8234-8240(1996))을 주형으로 삼아, 다음과 같은 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 MLV(molony leukemia virus)-유래의 gag-pol 유전자를 PCR로 증폭한 다음, 증폭된 gag-pol 절편을 pCII 벡터(입수처: Invitrogen, USA)에 삽입하여 pCII-gag·pol 벡터를 제조하였다. 이어서, 전기 pCP 벡터의 MluⅠ-HindⅢ 부위에 전기 pCII-gag·pol 벡터로부터 분리된 gag-pol 절편을 삽입하여, gag-pol 발현벡터인 pCP-gag·pol 벡터를 제조하였다(참조: 도 6b):
5'- GCT AGC GCA ACC CTG GGA GAC GTC -3' (서열번호: 7)
NheⅠ
5'- GCG GCC GCA CTG ACC CCT CTG AGC AT -3' (서열번호: 8)
NotⅠ
실시예 4-2: pCH-env 벡터의 제조
진핵세포 선별마커로 하이그로마이신 내성유전자를 가지며, env 유전자의 발현이 HCMV IE 유전자의 인핸서/프로모터와 5′UTR에 의하여 조절되는 pCH-env 벡터를 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 먼저, pCI-neo 벡터(Promega, USA)로부터 SV40 프로모터와 네오마이신 내성유전자를 제거한 다음, pCII-MMTVhyg 벡터로부터 분리된 MMTV(mouse mammary tumor virus) LTR(long terminal repeats) 및 하이그로마이신 내성유전자를 포함하는 DNA 절편을 삽입하여 pCI-hygro 벡터를 제조하였다(참조: 도 7a). 전기 pCI-hygro 벡터를 BglⅡ와 NheⅠ으로 절단하여 PCMV를 제거한 다음, 대신 전기 실시예 1로부터 수득한 pCN 벡터로부터 분리된 PCMV및 5′UTR을 포함하는 MluI-HindIII 절편을 전기 pCI-hygro 벡터에 삽입하여 pCH 벡터를 제조하였다(참조: 도 7a). 한편, 종래의 env 발현벡터인 pHIT456(참조: Cannon et al., J. Virol., 70:8234-8240(1996))을 주형으로 삼아, 다음과 같은 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 MLV-유래의 env 유전자를 PCR로 증폭한 다음, 증폭된 env 절편을 pCII(Invitrogen, USA) 벡터에 삽입하여 pCII-env 벡터를 제조하였다:
5'- GCTAGCGCCACCATGGCGCGTTCA -3' (서열번호: 9)
NheⅠ
5'- GCGGCCGCGATATCTCATGGCTCGTA -3' (서열번호: 10)
NotⅠ
이어서, 전기 pCH 벡터의 MluⅠ-NotI 부위에 전기 pCII-env 벡터로부터 분리된 env 절편을 삽입하여 env 발현벡터인 pCH-env 벡터를 제조하였다(참조: 도 7b).
실시예 4-3: 패키징 효율의 검증
전기 실시예 4-1 및 4-2로부터 수득한 pCP-gag·pol 벡터 및 pCH-env 벡터와 종래의 패키징 벡터들의 패키징 효율을 비교분석하기 위하여, CAT 유전자를 리포터 유전자로 가지고 있는 레트로바이러스 벡터 MFG-CAT(참조: Kim et al., J. Virol., 72:994-1004(1998))을 전기 pCP-gag·pol 및 pCH-env 벡터와 함께 293T 세포에 트랜스팩션시키고 48시간 동안 배양한 다음, 세포배양액을 0.45㎛ 필터에 여과시켜 무세포 바이러스를 제조하였다. 이어서, 전기 바이러스로 미합중국 종균협회(ATCC, Rockville, MD 20852, USA)로부터 입수한 NIH3T3 세포(ATCC CRL 1658)를 트랜스팩션시키고 48시간 동안 배양한 다음, 세포질 단백질을 제조하여 CAT 역가를 측정함으로써 패키징효율을 결정하였다. 이 때, 대조구로는 HCMV IE 유전자의 프로모터에 의하여 유전자발현이 조절되는 pHIT60 벡터와 pHIT456 벡터를 사용하였다. 그 결과 하기 표 2에서 보듯이, 종래의 패키징벡터를 사용한 경우에 비하여 본 발명의 pCP-gag·pol 벡터 및 pCH-env 벡터를 패키징벡터로 사용하였을 때 패키징효율이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 전기 실시예 3-2의 결과와도 일치하는 것으로, HCMV IE 유전자의 인핸서/프로모터 이외에 5' UTR을 추가로 포함시킴으로써 재조합 발현벡터의 유전자 발현효율을 증가시킬 수 있음을 입증하였으며, 결과적으로 본 발명의 pCN 벡터가 다양한 목적의 진핵세포 발현벡터로 유용하게 사용될 수 있음을 제시하였다.
HCMV IE 유전자의 5'UTR이 패키징 효율에 미치는 영향
패키징벡터 CAT 역가(%)
pHIT456, pHIT60 50
pCP-gag·pol, pCH-env 60
실시예 5: VEGF 발현벡터의 제조
본 발명의 pCN과 pEF 벡터를 이용하여 발현코자 하는 이종유전자의 일례로서 사람의 VEGF(vascular endothelial growth factor) 유전자가 삽입된 pCN-VEGF 벡터와 pEF-VEGF 벡터를 각각 제조하였다.
실시예 5-1: pCN-VEGF 벡터의 제조
사람 VEGF 유전자의 cDNA를 클로닝 하기 위하여, 사람의 태반에서 분리한 RNA를 주형으로 삼아 다음과 같은 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)으로 VEGF 유전자를 증폭하였다:
5'- ATG AAC TTT CTG CTG TCT -3' (서열번호: 11)
5'- TCA CCT CGG CTT GTC ACA TTT TTC -3' (서열번호: 12)
증폭된 VEGF 유전자 절편을 pCR 2.1 벡터(Invitrogen, USA)에 클로닝하여 PCR 2.1-VEGF 벡터를 제조하였다(참조: 도 8a). 이어서, 전기 PCR 2.1-VEGF 벡터로부터 VEGF 유전자를 포함하는 EcoRI 절편을 분리하고, 이를 전기 실시예 1로부터 수득한 pCN벡터의 EcoRI 부위에 삽입하여, HCMV IE 유전자의 프로모터/인핸서, 5' UTR 및 사람 VEGF 유전자를 포함하는 pCN-VEGF 벡터를 제조하였다(참조: 도 8a). 한편, 본 발명자들은 전기 pCN-VEGF벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 'Top10-pCN/VEGF'라 명명하고, 이를 1998년 11월 19일자로 사단법인 한국종균협회(KFCC, 대한민국 서울시 서대문구 신촌동 134 소재)에 기탁번호 KFCC-11064로 기탁하였다.
실시예 5-2: pEF-VEGF 벡터의 제조
전기 실시예 5-1로부터 수득한 pCN-VEGF 벡터의 사람 VEGF 유전자를 포함하는 HindIII/XbaI 절편을 전기 실시예 2로부터 수득한 pEF 벡터의 Hindlll-XbaI 부위에 삽입하여, 사람 EF 유전자의 프로모터/인핸서, 5'UTR 및 사람 VEGF 유전자를 포함하는 pEF-VEGF 벡터를 제조하였다(참조: 도 8b). 한편, 본 발명자들은 전기 pEF-VEGF벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 'Top10-pEF/VEGF'라 명명하고, 이를 1998년 11월 19일자로 사단법인 한국종균협회(KFCC, 대한민국 서울시 서대문구 신촌동 134 소재)에 기탁번호 KFCC-11063으로 기탁하였다.
실시예 6: 유전자 치료요법에의 이용가능성 검증
실시예 6-1: 배양 세포에서 VEGF 유전자의 발현
전기 실시예 5-1 및 5-2로부터 각각 수득한 pCN-VEGF 벡터 및 pEF-VEGF 벡터를 각각 쥐 근육세포인 C2C12 세포(ATCC CRL-1772)에 트랜스팩션시키고 48시간 동안 배양한 다음, ELISA 방법으로 세포 배양액에서의 VEGF 수준을 측정하였다. 그 결과, pCN-VEGF 벡터와 pEF-VEGF 벡터로 트랜스펙션된 세포 모두 높은 효율로 VEGF를 분비하는 것으로 확인되어, 전기 두 가지 벡터가 이종 유전자의 발현을 강력하고 안정하게 유도할 수 있음을 제시하였다.
배양 세포에서 VEGF 유전자의 발현
벡터 VEGF 발현량(pg/ml)
pCN/VEGF 2620
pEF/VEGF 2430
실시예 6-2: 생체내에서 VEGF 유전자의 발현
본 발명의 VEGF 발현벡터의 유전자 치료요법에의 이용가능성을 조사하기 위하여, 전기 실시예 5-1로부터 수득한 pCN-VEGF 벡터를 2주령의 웅성 Balb/C 마우스의 전경골근(anterior tibialis)에 주사한 다음, 주사한 근육조직에서 총단백질을 추출하여 VEGF에 대한 ELISA를 수행하였다(참조: 도 9). 도 9에서, ●, ◆, △ 및 □는 pCN-VEGF 벡터를 주사한 각 마우스 개체를 나타내며, con은 아무것도 주사하지 않은 마우스를, vegf는 pCN-VEGF 벡터를 주사한 마우스를 각각 나타낸다. 도 9에서 보듯이, pCN-VEGF 벡터는 생체내에서도 높은 유전자 발현 효율을 유지하였으며, 이러한 결과는 전기 실시예 6-1의 결과와 더불어 본 발명의 pCN 벡터 및 pEF 벡터가 유전자 치료요법에 유용하게 사용될 수 있음을 제시하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하여 다양한 진핵세포에서 강력하고 안정하게 유전자발현을 유도할 수 있는 진핵세포 발현벡터를 제공한다. 본 발명의 진핵세포 발현벡터는 다음과 같은 특징을 가진다:
첫째, HCMV IE 유전자 또는 사람 EFlα 유전자의 인핸서/프로모터를 삽입하여 다양한 종류의 진핵세포에서 강력한 전사활성이 유도될 수 있도록 하였다.
둘째, 다클로닝 부위(multiple cloning site) 상류에 HCMV IE 유전자 또는 사람 EFlα 유전자의 5' UTR(5' untranslated region)을 삽입하여 하류의 이종 유전자 발현효율을 극대화하였다.
셋째, 다양한 진핵세포에서 강력하고 안정한 유전자발현을 유도할 수 있으므로, 진핵세포에서 일시적 혹은 영구적으로 높은 유전자발현을 유도하고자 할 때 또는 레트로바이러스 패키징 벡터의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
넷째, 생체내에서도 강력하고 안정한 유전자 발현을 유도할 수 있으므로, 유전자 치료요법에 유용하게 사용될 수 있다.
(서열목록)
<110> ViroMedica Pacific Limited
<110KR> 주식회사 바이로메디카 패시픽
<120> Eukaryotic Expression Vector Which Comprises Heterologous Gene Expression Regulatory Elements
<120KR> 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한 전사 활성을 가진 진핵세포 발현벡터
<160> 12
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<213KR> 인공 서열
<400> 1
acgcgttgac attgattatt g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<213KR> 인공 서열
<400> 2
aagcttcgtg tcaaggacgg t 21
<210> 3
<211> 1564
<212> DNA
<213> human cytomegalo virus
<213KR> 사람 싸이토메갈로 바이러스
<400> 3
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<213KR> 인공 서열
<400> 4
acgcgtggca attgaaccgg tgcctagaga aggtgg 36
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<213KR> 인공 서열
<400> 5
gctagctttg gcttttaggg gtagttttca cgacac 36
<210> 6
<211> 1136
<212> DNA
<213> human
<213KR> 인간
<400> 6
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<213KR> 인공 서열
<400> 7
gctagcgcaa ccctgggaga cgtc 24
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<213KR> 인공 서열
<400> 8
gcggccgcac tgacccctct gagcat 26
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<213KR> 인공 서열
<400> 9
gctagcgcca ccatggcgcg ttca 24
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<213KR> 인공 서열
<400> 10
gcggccgcga tatctcatgg ctcgta 26
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<213KR> 인공 서열
<400> 11
atgaactttc tgctgtct 18
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<213KR> 인공 서열
<400> 12
tcacctcggc ttgtcacatt tttc 24

Claims (11)

  1. 다클로닝 부위, BGH(bovine growth hormone) poly(A) 아데닐화 신호부위, SV40 프로모터와 복제원점, 네오마이신 내성유전자 및 ColE1 복제원점을 포함하며, 전기 다클로닝 부위의 상류에 강력한 전사활성을 가진 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 진핵세포 발현벡터.
  2. 제 1항에 있어서,
    이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소는 사람 싸이토메갈로 바이러스(human cytomegalo virus) 즉시초기 유전자의 프로모터/인핸서, 엑손 1, 인트론 A 및 엑손 2의 ATG 개시코돈 직전까지의 염기서열인 것을 특징으로 하는
    진핵세포 발현벡터.
  3. 제 1항에 있어서,
    이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소는 사람 EF1α 유전자의 프로모터/인핸서, 엑손 1, 인트론 A 및 엑손 2의 ATG 개시코돈 직전까지의 염기서열인 것을 특징으로 하는
    진핵세포 발현벡터.
  4. 제 1항에 있어서,
    다클로닝 부위에 사람의 VEGF(vascular endothelial growth factor) 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는
    진핵세포 발현벡터.
  5. 다클로닝 부위, BGH(bovine growth hormone) poly(A) 아데닐화 신호부위, SV40 프로모터와 복제원점, 네오마이신 내성유전자 및 ColE1 복제원점을 포함하며, 전기 다클로닝 부위의 상류에 서열번호 3의 유전자 서열을 포함하는 하기와 같은 유전자 지도를 가지는 진핵세포 발현벡터 pCN:
  6. 다클로닝 부위, BGH(bovine growth hormone) poly(A) 아데닐화 신호부위, SV40 프로모터와 복제원점, 네오마이신 내성유전자 및 ColE1 복제원점을 포함하며, 전기 다클로닝 부위의 상류에 서열번호 6의 유전자 서열을 포함하는 하기와 같은 유전자 지도를 가지는 진핵세포 발현벡터 pEF:
  7. 다클로닝 부위, BGH(bovine growth hormone) poly(A) 아데닐화 신호부위, SV40 프로모터와 복제원점, 네오마이신 내성유전자 및 ColE1 복제원점을 포함하며, 전기 다클로닝 부위의 상류에 서열번호 3의 유전자 서열을 포함하고, 전기 다클로닝 부위에 사람의 VEGF 유전자가 삽입된 하기와 같은 유전자 지도를 가지는 진핵세포 발현벡터 pCN-VEGF:
  8. 다클로닝 부위, BGH(bovine growth hormone) poly(A) 아데닐화 신호부위, SV40 프로모터와 복제원점, 네오마이신 내성유전자 및 ColE1 복제원점을 포함하며, 전기 다클로닝 부위의 상류에 서열번호 6의 유전자 서열을 포함하고, 전기 다클로닝 부위에 사람의 VEGF 유전자가 삽입된 하기와 같은 유전자 지도를 가지는 진핵세포 발현벡터 pEF-VEGF:
  9. 제 5항의 pCN 벡터로 형질전환된 재조합 대장균(E. coli) Top10-pCN(KFCC-11045).
  10. 제 7항의 pCN-VEGF 벡터로 형질전환된 재조합 대장균(E. coli) Top10-pCN/VEGF(KFCC-11064).
  11. 제 8항의 pEF-VEGF 벡터로 형질전환된 재조합 대장균(E. coli) Top10-pEF/VEGF(KFCC-11063).
KR1019980063711A 1998-12-31 1998-12-31 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한전사 활성을 가진 진핵세포 발현벡더 KR20000046969A (ko)

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