KR100432151B1 - 포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및 이 세포를 이용한 이종단백질의 생산방법 - Google Patents

포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및 이 세포를 이용한 이종단백질의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및 이 세포를 이용한 이종단백질의 생산방법에 관한 것으로, 쥐 사이토메갈로바이러스(murine cytomegalovirus, MCMV) 즉시 초기(immediate early, IE) 유전자의 인핸서/프로모터와 그 하단부(downstream)에 인간 연장인자-1α(elongation factor-1α, EF-1α)의 첫 번째 인트론을 포함함으로써 발현율이 우수한 포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및 이 세포를 이용한 이종단백질의 생산방법에 관한 것이다.

Description

포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및 이 세포를 이용한 이종단백질의 생산방법{Expression vector for mammal, cell transformed therewith and method for producing heterologous protein using said cell}
본 발명은 포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및 이 세포를 이용한 이종단백질의 생산방법에 관한 것으로, 쥐 사이토메갈로바이러스(murine cytomegalovirus, MCMV) 즉시 초기(immediate early, IE) 유전자의 인핸서/프로모터와 그 하단부(downstream)에 인간 연장인자-1α(elongation factor-1α, EF-1α)의 첫 번째 인트론을 포함함으로써 발현율이 우수한 포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및 이 세포를 이용한 이종단백질의 생산방법에 관한 것이다.
동물용 발현벡터는 이종단백질의 대량 생산뿐만 아니라 최근 각광을 받고 있는 유전자 치료에도 유용하게 사용될 수 있어 그 중요성이 급증하는 추세이다. 이에 따라 동물세포에서 이종유전자를 고효율로 지속적으로 발현하는 발현벡터를 개발하기 위한 연구가 계속되고 있다.
현재 강력하고 안정적인 발현을 유도할 목적으로 진핵세포에서 강한 전사활성을 가지는 프로모터가 도입된 발현벡터들이 개발된 바 있다. 이러한 프로모터로는 인간 사이토메갈로바이러스(human cytomegalovirus, HCMV) 즉시초기(immediate early, IE) 유전자 프로모터가 잘 알려져 있으며, 이외에 시미안 바이러스(simian virus, SV) 40 IE 유전자 프로모터, 라우스육종 바이러스(rous sarcoma virus, RSV) 유전자 프로모터, 인간 EF-1α유전자의 프로모터 등도 사용되고 있다. 최근 인간 유비퀴틴(ubiquitin) 유전자 프로모터가 다양한 세포에서 균일한 발현을 유도하도록 개발되었다.
최근 쥐 사이토메갈로바이러스 IE 유전자의 프로모터가 특정 세포에서 HCMV IE 유전자의 프로모터에 비해 수배 내지 수십배 높은 발현을 유도하며[Lafemina R et al, J. Gen. Virol., 69, 355-374 (1988)], 다양한 세포에서 균일하게 안정적인 발현을 유도함이 보고된 바 있다[Aiba-Masago S et al., Am. J. Pathol. 154, 735-743 (1999)]. 특히, MCMV 주 즉시 초기 프로모터(major immediate-early promoter, MIEP) 부위에서 상단부(upstream)가 제거된 것이 영장류와 마우스 세포에서 매우 강력한 발현을 유도함이 보고되었다[Kim and Risser, J. Virol. 67, 239-248 (1993); 및 Kim, Biochem. Biophys. Res. Comm., 203, 1152-1159 (1994)].
한편, 인트론도 높은 발현을 유도함이 보고된 후[Buchman A and Berg P Mol, Mol. Cell. Biol., 8: 4395-4405 (1988); Choi T et al, Mol. Cell. Biol., 11: 3070-3074 (1991); 및 Palmiter R D et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 478-482 (1991)], 안정적이고 강력한 발현을 유도할 목적으로 이종인트론을 도입한 발현벡터들이 개발된 바 있다.
그러나, 이들 발현벡터는 그 발현율이 만족할만한 수준이 아니므로, 보다 높은 발현율을 가지는 발현벡터가 절실히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 기존 발현벡터보다 월등히 뛰어난 발현벡터를 개발하기 위하여 쥐 사이토메갈로바이러스 즉시 초기(immediate early, IE) 유전자 인핸서/프로모터 및 그 하단부에 인간 연장인자(EF-1α) 첫 번째 인트론을 조합한 발현벡터를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 동물세포에서 이종유전자를 강력하고 안정하게 발현하는 포유동물용 발현벡터를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세포를 이용하여 이종단백질을 생산하는 방법을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.
도 1은 발현벡터 pMYK의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 2는 발현벡터 pMYK/EF1-i의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 3은 발현벡터 pMYK/EF1-i/luc의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 4는 발현벡터 pMYK(del)/EF1-i의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 5는 발현벡터 pHYK/luc와 pMYK/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준을 나타내는 그래프이다.
도 6은 발현벡터 pMYK/luc와 pMYK/EF1-i/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준을 나타내는 그래프이다.
도 7은 발현벡터 pHYK/luc와 pMYK/EF1-i/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준을 나타내는 그래프이다.
도 8은 발현벡터 pHYK/EF1-i/luc와 pMYK/EF1-i/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준을 나타내는 그래프이다.
도 9는 pcDNA3.1/EPO와 pMYKD/EF1-i/EPO로부터 발현된 에리쓰로포이에틴 단백질의 양을 보여주는 웨스턴 블랏팅 결과를 나타낸 것이다[1: pcDNA3.1, 2: pcDNA3.1/EPO, 3: pMYKD/EF1-i/EPO].
본 발명은 쥐 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자의 인핸서/프로모터 및 그 하단부에 인간 연장인자 유전자의 첫 번째 인트론(EF1-i)을 포함하는 포유동물용 발현벡터를 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서는 상기 발현벡터로 형질전환된 세포를 또 다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서는 쥐 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 유전자의인핸서/프로모터, 인간 EF-1α유전자의 첫 번째 인트론 및 그 하단부에 이종단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 포유동물용 발현벡터로 형질전환된 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 이종단백질의 생산방법을 또 다른 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 발현벡터에 사용되는 쥐 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 유전자의 인핸서/프로모터(PMCMV)는 유전자은행 등록번호(GenBank Accession) M11788에 공지되어 있으며, 이 중 약 890 bp의 상단부가 제거된 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 발현벡터에 사용되는 인간 EF-1α유전자의 인트론(EF1-i)은 유전자은행 등록번호(GenBank Accession) E02627에 공지되어 있으며, 예를 들어 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것이다. EF1-i은 PMCMV의 하단부에 위치하며, 이러한 PMCMV및 그 하단부의 EF1-i를 포함하는 영역은 예를 들어 서열번호 3의 염기서열을 가진다.
특히, 상기 PMCMV및 그 하단부의 EF1-i 영역은 강력하고 안정하게 발현을 유도하는데, 기존에 쓰이고 있는 인간 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터(PHCMV) 보다 약 5.3 배 이상 높은 발현 효율을 보이며, 또한 PMCMV및 EF1-i 각각으로부터의 발현 효율의 총합 이상의 탁월한 발현 효율을 가진다.
본 발명의 발현벡터에는 필요에 따라 이종유전자의 클로닝을 용이하게 할 목적으로 다중클로닝 부위(multiple cloning site)를 EF1-i 하단부에 추가로 포함할 수 있다.
상기 PMCMV, EF1-i 및 다중클로닝 부위는 각각 쥐 사이토메갈로바이러스, 인간 조직 및 벡터로부터 분리하거나 공지의 DNA 합성방법에 따라 합성할 수도 있다.
본 발명의 발현벡터에는 PMCMV, EF1-i 및 다중클로닝 부위 외에도 필요에 따라 대장균에서 복제와 선별을 위한 암피실린 내성 유전자(Ampr) 및 폴리(A) 아데닐화 신호 부위 등을 포함할 수 있으며, 영구적인 발현을 위해 네오마이신 또는 지오신 내성 유전자와 같은 선별 표지 유전자를 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 발현벡터의 EF1-i 부위 하단부 또는 다중클로닝 부위에 목적하는 이종유전자를 포함할 수 있다. 이러한 재조합 발현벡터는 목적하는 이종유전자를 공지된 클로닝 방법에 따라 상기 발현벡터에 삽입하여 얻을 수 있다.
이 발현벡터를 적절한 미생물 또는 동물 세포에 도입하여 형질전환된 세포를 얻을 수 있다. 본 발명자들은 도 2의 구조를 갖는 발현벡터 pMYK/EF1-i를E. coliDH5α에 도입하여E. coliDH5α/MYK/EF1-i로 명명된 형질전환된 대장균 세포를 얻었으며, 이를 한국생명공학연구원 부설 유전자 은행에 2000년 9월 20일자 수탁번호 KCTC 0863BP로 기탁하였다.
이렇게 제조된 본 발명의 세포는 상기 발현벡터를 증폭하며, 특히 동물 세포는 이종유전자를 고효율로 지속적으로 발현한다. 따라서, 본 발명의 동물 세포를 배양함으로써 이종단백질을 고효율로 생산할 수 있다.
이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 인간 사이토메갈로바이러스 IE 유전자의 인핸서/프로모터(P HCMV )를 포함하는 벡터의 제작
시판되는 클로닝 벡터 pCRTM3[Invitrogen, 미국]EcoRI으로 절단한 후 자가 연결하여 발현벡터 pHYK를 제작하였다. 이 발현벡터는 PHCMV하단부에 다중클로닝 부위, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리(A) 아데닐화 신호부위(pA)를 포함하며, SV40 프로모터(PSV40)와 이의 복제 원점, 네오마이신 내성 유전자(neo r) 및 ColE1 복제 원점, 및 암피실린 내성 유전자(Ampr)를 포함한다.
제조예 2: 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 벡터의 제작
벡터 pGL2/basic[Promega, 미국]을HindIII와SalI으로 절단하여, 루시퍼라아제 유전자의 ATG 개시 코돈과 종결 코돈이 포함된 약 2.7 kb 크기의 절편을 얻은 후, 이 절편을 벡터 pBluescript/KS(+)[Stratagene, 미국]의HindIII/SalI 부위에 클로닝하여 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 벡터 pKS/luc을 제작하였다.
제조예 3: 에리쓰로포이에틴 유전자를 포함하는 벡터의 제작
벡터 pSK/EPO[한국생명공학연구원의 홍효정 박사님으로부터 제공받음]에서BamHI과EcoRV로 절단하여 유전자의 ATG 개시 코돈과 종결 코돈이 포함된 약 0.54 kb 크기의 에리쓰로포이에틴 유전자 절편을 얻은 후, 역시BamHI과EcoRV로 절단한 pcDNA3.1[Invitrogen, 미국], pMYK(del), pMYK(del)/EF1-i 벡터에 클로닝하여 에리쓰로포이에틴 유전자를 포함하는 발현벡터 pcDNA3.1/EPO와 pMYK(del)/EF1-i/EPO를 얻었다.
실시예 1: 동물용 발현벡터의 제작
쥐 사이토메갈로바이러스(MCMV) IE 유전자의 인핸서/프로모터(PMCMV), EF-1α유전자의 인트론(EF1-i) 및 다중클로닝 부위를 차례로 포함하는 동물용 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.
(단계 1) P MCMV 를 포함하는 발현벡터의 제작
벡터 pUCMV18[Yeon-Soo Kim and Rex Risser, J. Virol., 67, p239-248, 1993]를ScaI 및HindIII로 절단하여 PMCMV를 포함하는 995 bp 절편을 얻은 후 이 절편을 제조예 1에서 얻은 벡터 pHYK의ScaI/HindIII 부위에 삽입하여 약 4.5 kb 크기의 발현벡터 pMYK를 제작하였다. 이 발현벡터는 pHYK 발현벡터에서 유래하는BGH pA, PSV40와 SV40 복제 원점, 네오마이신 내성 유전자(neo r), ColE1 복제 원점 및 암피실린 내성 유전자(Ampr)를 가진다[도 1].
(단계 2) P MCMV 하단부에 EF1-i의 삽입
인간 EF-1α유전자의 인트론(EF1-i)은 벡터 pEF321-CAT[Dong Wan Kim, Taichi Uetsuki, yoshito Kaziro, nobuo Yamaguchi, Sumio Sugano. Gene 91, p217-223,1990]을 주형(template)으로 사용하고, 서열 번호 5 및 6의 프라이머를 사용하여 DNA 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, "PCR")을 수행하고 약 1.0 kb 길이의 절편을 얻은 후 이 절편을 단계 1에서 얻은 발현벡터 pMYK의HindIII-BamHI부위에 삽입하여 발현벡터 pMYK/EF1-i를 제조하였다.
이렇게 얻어진 PMCMV및 그 하단부의 EF1-i를 포함하는 영역은 서열번호 4의 염기서열을 가지며, 여기에서 뉴클레오티드 1 내지 660번 영역은 PMCMV부위로 특히 583 내지 589번 영역은 TATA 시그널이며, 716 내지 1600번 영역은 EF1-i이고, 1601 내지 1667번 영역은 이종유전자의 삽입을 위한 다중클로닝 부위이다[도 2].
얻어진 발현벡터 pMYK/EF1-i를E. coliDH5α에 도입하여 형질전환시킨E. coliDH5α/MYK/EF1-i로 명명된 세포를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행에 2000 년 9월 20일자 수탁번호 KCTC 0863BP로 기탁하였다.
(단계 3) 루시퍼라아제 유전자의 삽입
상기 제조예 2에서 얻은 발현벡터 pKS/luc를SmaI 및NotI으로 절단하여 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 2.7kb 크기의 절편을 얻은 후 이 절편을 단계 2에서 얻은 발현벡터 pMYK/EF1-i의EcoRV 및NotI 부위에 삽입하여 발현벡터 MYK/EF1-i/luc를 제작하였다[도 3].
실시예 2: 동물용 발현벡터의 제작
인간에 도입될 경우 발현되어 항생제 내성반응과 같은 부작용을 유발할 우려가 있는 PSV40, SV40 복제원점 및neo r을 제거하기 위해, 상기 실시예 1의 단계 1에서 얻은 발현벡터 pMYK를Bsu36I로 절단하여 PSV40, SV40 복제원점 및neo r이 포함된 약 2 kb 영역을 제거한 후 자가 연결하여 약 3.0 kb 크기의 벡터 pMYK(del)를 제작한 다음 이 벡터를 사용하여 상기 실시예 1의 단계 2에서와 동일한 방법으로 실시하여 발현벡터 pMYK(del)/EF1-i를 제작하였다[도 4].
비교예 1
발현벡터 pMYK/EF1-i 대신에 상기 제조예 1에서 얻은 벡터 pHYK를 사용한다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1의 단계 3에서와 동일한 방법으로 실시하여 발현벡터 pHYK/luc를 제작하였다.
비교예 2
발현벡터 pMYK/EF1-i 대신에 상기 실시예 1의 단계 1에서 얻은 벡터 pMYK를 사용한다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1의 단계 3에서와 동일한 방법으로 실시하여 발현벡터 pMYK/luc를 제조하였다.
비교예 3
벡터 pMYK 대신에 상기 제조예 1에서 얻은 벡터 pHYK를 사용한다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1의 단계 2에서와 동일한 방법으로 실시하여 발현벡터 pHYK/EF1-i을 제작한 후, 이 벡터를 사용하여 상기 실시예 1의 단계 3에서와 동일한 방법으로 실시하여 발현벡터 pHYK/EF1-i/luc를 제작하였다.
실시예 3: 에리쓰로포이에틴 유전자를 발현하는 동물발현벡터의 제작
벡터 pSK/EPO[한국생명공학연구원의 홍효정 박사님으로부터 제공받음]에서BamHI과EcoRV로 절단하여 유전자의 ATG 개시 코돈과 종결 코돈이 포함된 약 0.54 kb 크기의 에리쓰로포이에틴 유전자 절편을 얻은 후, 역시BamHI과EcoRV로 절단한 pcDNA3.1[Invitrogen, 미국]와 pMYK(del)/EF1-i 벡터에 클로닝하여 에리쓰로포이에틴 유전자를 포함하는 발현벡터 pcDNA3.1/EPO와 pMYK(del)/EF1-i/EPO를 얻었다.
실시예 4: 형질감염된 세포주의 제조
상기 실시예 1의 단계 3, 상기 비교예 1, 2 및 3에서 얻은 발현벡터 pMYK/EF1-i/luc, pHYK/luc, pMYK/luc 및 pHYK/EF1-i/luc를 각각 인간 세포주 293T(ATCC CRL-1573), HT1080(ATCC CCL-121), HeLa(ATCC CCL-2) 및 U937(ATCC CRL-1593)과 설치류 세포주 NIH3T3(ATCC CRL 1658), CHO(ATCC CCL-6), Neuro2a(ATCC CCL-13)에 전기적 형질도입 방법(electroporation)에 따라 다음과 같이 형질감염시켰다. 즉, 1.5 ×106개 세포를 250 ㎕의 RPMI 배지에 현탁하고 여기에 발현벡터 DNA 2 ㎍를 가한 후 260 V, 1050 ㎌의 전기 충격을 주어, 발현벡터 DNA를 세포에 형질도입하였다.
시험예: 발현벡터의 발현율 조사
발현벡터의 발현율을 조사하기 위해, 상기 실시예 3에서 발현벡터 pMYK/EF1-i/luc, pHYK/luc, pMYK/luc 또는 pHYK/EF1-i/luc로 형질감염된 세포주를 각각 미리 준비한 3 ㎖의 DMEM 배지에 가하고 6 시간 동안 방치하여 세포가 배양 플레이트에 정착하게 하였다. 이어서 세포를 인산완충용액(PBS)으로 2 회 세척한 후 3 ㎖의 DMEM 배지를 가하고 48 시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하여 루시퍼라아제 발광측정 키트[Promega, 미국]를 사용하여 루시퍼라아제 역가를 측정하였다. 이 때 사용된 키트는 이중 루시퍼라아제 발광측정 키트로서, 본 발명에 사용된 개똥벌레(firefly) 루시퍼라아제와 기질특이성이 다른 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제를 동시에 형질전환감염시켜 형질전환 효율(transfection efficiency)을 동일화할수 있다. 본 발명자들은 모든 개똥벌레 루시퍼라아제 발현 수준치를 2 ㎍의 레닐라 루시퍼라아제 발현벡터를 형질감염시켜 얻은 발현 수준치로 나누어 비교발광도 값을 얻었으며, 동일 세포주로 3 회 독립적인 시험을 실시하여 측정된 비교발광도의 평균값을 사용하였다.
(1) PHCMV와 PMCMV의 발현율 비교
다양한 세포주에서 PHCMV와 PMCMV의 발현율을 비교하기 위해, 발현벡터 pHYK/luc와 pMYK/luc로 형질감염된 세포주의 루시퍼라아제 역가를 비교하였다. 이때 루시퍼라아제 역가는 발현벡터 pHYK/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도를 1로 하였을 때 발현벡터 pMYK/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도의 상대비율로 나타내었으며, 그 결과는 다음 표 1 및 도 5와 같다.
상기 표 1 및 도 5에서 보듯이, HeLa와 CHO를 제외한 모든 세포주에서 발현벡터 pMYK/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준이 발현벡터 pHYK/luc의 경우와 비슷하거나 높게 나타났다. 이 결과로부터, PMCMV가 PHCMV보다 이종유전자의 발현을 더욱 강력하고 안정적으로 유도함을 알 수 있었다.
(2) PMCMV및 그 하단부의 EF1-i 부위의 발현율
PMCMV하단부의 EF1-i가 유전자의 발현율에 미치는 영향를 조사하기 위해, 발현벡터 pMYK/luc 및 pMYK/EF1-i/luc로 형질감염된 세포주의 루시퍼라아제 역가를 비교하였다. 이때 루시퍼라아제 역가는 발현벡터 pMYK/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도를 1로 하였을 때 발현벡터 pMYK/EF1-i/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도의 상대비율로 나타내었으며, 그 결과는 다음 표 2 및 도 6과 같다.
상기 표 2 및 도 6에서 보듯이, 모든 세포주에서 발현벡터 pMYK/EF1-i/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준이 발현벡터 pMYK/luc의 경우보다 높게 나타났다. 이 결과로부터 PMCMV하단부의 EF1-i이 PMCMV보다 이종유전자의 발현을 더욱 안정적으로 향상시킴을 알 수 있었다.
(3) PHCMV와 PMCMV하단부의 EF1-i 부위의 발현율 비교
현재 가장 널리 사용되고 있는 PHCMV와 본 발명에 따른 PMCMV하단부의 EF1-i 부위의 발현율을 비교하기 위해, 발현벡터 pHYK/luc 및 pMYK/EF1-i/luc로 형질감염된 세포주의 루시퍼라아제 역가를 비교하였다. 이때 루시퍼라아제 역가는 발현벡터 pHYK/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도를 1로 하였을 때 발현벡터 pMYK/EF1-i/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도의 상대비율로 나타내었으며, 그 결과는 다음 표 3 및 도 7과 같다.
상기 표 3 및 도 7에서 보듯이, 모든 세포주에서 발현벡터 pMYK/EF1-i/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준이 발현벡터 pHYK/luc의 경우보다 4.33 내지 65.51 배 높게 나타났다. 이 결과로부터 PMCMV및 그 하단부의 EF-1α인트론 부위가 기존의 PHCMV보다 이종유전자의 발현을 더욱 향상시킴을 알 수 있었다.
(4) PHCMV및 그 하단부의 EF1-i 부위와 PMCMV및 그 하단부의 EF1-i 부위의 발현율 비교
기존 PHCMV의 하단부에 삽입된 EF1-i 부위와 본 발명에 따른 PMCMV하단부의 EF1-i 부위의 발현율을 비교하기 위해, 발현벡터 pHYK/EF1-i/luc 및 pMYK/EF1-i/luc로 형질감염된 세포주에서 루시퍼라아제 역가를 조사하였다. 이때, 루시퍼라아제 역가는 발현벡터 pHYK/EF1-i/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도를 1로 하였을 때 발현벡터 pMYK/EF1-i/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도의 상대비율로 나타내었으며, 그 결과는 다음 표 4 및 도 8과 같다.
상기 표 4에서 보듯이, 발현벡터 pMYK/EF1-i/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준은 세포주에 따라 다르게 나타나지만, 전반적으로 발현벡터 pHYK/EF1-i/luc의 경우보다 높게 나타났다. 세포주 HT1080, HeLa, COS, CHO, 및 NIH3T3에서는 1.52배에서 3.51 배까지 높은 발현을 나타내었고, 293T와 Neuro-2a에서는 조금 낮게 나타났다.
(5) 에리쓰로포이에틴 유전자의 발현율 조사
상기 제조한 pcDNA3.1/EPO와 pMYK(del)/EF1-i/EOP 발현벡터로부터 에리쓰로포이에틴 유전자의 발현을 조사하기 위하여, 발현벡터 pcDNA3.1, pcDNA3.1/EPO, 및pMYK(del)/EF1-i/EPO를 각각 설치류 세포주 CHO에 전기적 형질도입 방법(electroporation)에 따라 다음과 같이 형질감염시켰다. 즉, 1.5 ×106개 세포를 400 ㎕의 RPMI 배지에 현탁하고 여기에 발현벡터 DNA 3 ㎍을 가한 후 260 V, 1050 ㎌의 전기 충격을 주어, 발현벡터 DNA를 세포에 형질도입하였다. 형질도입 후 세포주를 각각 미리 준비한 3 ㎖의 DMEM 배지에 가하고 6시간 동안 방치하여 세포 배양 플레이트에 정착하게 하였다. 이어서 세포를 인산완충용액(PBS)으로 2 회 세척한 후 3 ㎖의 DMEM 배지를 가하고 24 시간 동안 배양하였다. 다음으로 인산완충용액(PBS)으로 2회 세척한 후 3 ㎖의 CHO 혈청(serum-free) 배지를 가하고 24시간 동안 배양하였다. 각각의 CHO 혈청 배지로 배양한 세포배양액에 있는 에리쓰로포이에틴 단백질은 원심여과장치(centrifugal filter devices)[Millipore, 미국]를 이용하여 각각 15 배로 농축시킨 후 웨스턴 블랏팅을 실시하여 그 발현을 확인하였다. 농축한 세포 배양액 30 ㎕를 10 ㎕의 5×SDS-PAGE 로딩 버퍼(loading buffer)[60mM Tris-Cl; pH 6.8, 25% 글리세롤, 2% SDS, 5%??-머캡토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루]와 섞은 후, 5분 동안 중탕하고 SDS-폴리아크릴아마이드 젤로 전기 영동하였다. 이 때, 리절빙 겔(resolving gel)의 조성은 15% 아크릴아미드(acrylamide : N, N'-methylene-bis-acrylamide = 29.2 : 0.8), 0.375 M Tris-Cl(pH 8.8), 0.1% SDS이었고, 스태킹 겔(stacking gel)의 조성은 5% 아크릴아미드, 0.125 M Tris-Cl(pH 6.8), 0.1% SDS이었다. 세포 단백질들은 전기 영동 후, 전기적인 방법으로 폴리비닐이덴다이플루오라이드(Polyvinylidene difluoride, PVDF) 막에 옮겼는데, 옮기는 조건은 25 mM Tris, 192 mM 글리신, 20%v/v 메탄올, pH 8.3 전이완충용액에서 100 V의 전압을 1 시간 동안 적용하였다. 옮긴 후, 웨스턴 블랏팅에 있어서 비특이적인 반응을 줄이기 위하여, 5% 탈지분유(skim milk) 용액으로 1 시간 동안 막을 차단시켰다. 발현된 인간 면역결핍 바이러스 외피(envelope) 단백질을 확인하기 위하여, 항 에리쓰로포이에틴 1차 단일클론항체(anti-EPO antibody)[한국생명공학원 홍효정 박사님에게서 얻음]를 1 : 1,000의 비율로, 0.1% 트윈 20이 포함된 트리스 완충 용액(Tris buffered saline with Tween 20, TBS-T)으로 희석하여 1 시간 동안 반응시켰다. 그 다음으로 트리스 완충 용액으로 세 번 씻어주고, 트리스 완충 용액에 1 : 1,000으로 희석한 항쥐 이차 항체(anti-mouse secondary antibody)를 가지고, 1 시간 동안 반응시켰다. 다음, 0.1% 트윈 20이 포함된 트리스 완충 용액으로 3회 세척한 후, 아머셤 회사(Amersham, 미국)의 화학적 발광반응(Enhanced chemiluminescent, ECL) 킷트를 이용하여, 발광반응을 시키고 엑스선 필름[Kodak, 독일]에 감광하였다.
도 9는 상기에서 제조한 pcDNA3.1/EPO와 pMYK(del)/EF1-i/EPO 발현 벡터에 의하여 에리쓰로포이에틴 단백질이 발현되는 것을 보여주는 웨스턴 블랏팅 결과이다. 그림에서 보듯, pMYK(del)/EF1-i/EPO에서 pcDNA3.1/EPO보다 월등히 많은 에리쓰로포이에틴 단백질을 발현하는 것을 관찰할 수 있다. 한편, 음성 대조군인 pcDNA3.1에서는 에리쓰로포이에틴 단백질이 발현되지 않았다. 이렇듯, 본 발명에서 개발한 쥐 싸이토메갈로바이러스 프로모터와 인간 연장인자 첫 번째 인트론의조합은 루시퍼라아제 및 에리쓰로포이에틴 유전자 모두에서 기존 인간 싸이토메갈로바이러스 프로모터보다 월등히 높은 유전자 발현을 유도함을 보여주었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 발현벡터는 PMCMV하단부의 EF1-i 부위를 포함함으로써 동물 세포에서 그 하단부의 이종유전자의 발현을 강력하고 안정하게 유도하므로, 탁월한 동물용 발현벡터로 사용되어 이종단백질의 대량 생산에서 유용하게 사용될 수 있고, 또한 이 발현벡터는 네이키드(naked) DNA 유전자 치료요법 및 DNA 백신요법에 유용하게 사용될 수 있으며, 모든 세포생물학 실험에서 활용가치가 높은 발현벡터로 이용될 수 있다.

Claims (7)

  1. 서열번호 1로 표시되는 쥐 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기(immediate early) 유전자 인핸서/프로모터와, 서열번호 2로 표시되는 인간 연장인자(elongation factor-1α, "EF-1α") 유전자 인트론을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물용 발현벡터 pMYK/EF1-i.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 상기 청구항 1의 발현벡터 pMYK/EF1-i를 대장균에 형질전환시켜 얻은 것임을 특징으로 하는 형질전환된E. coliDH5α/MYK/EF1-i[KCTC 0863BP].
  6. 삭제
  7. 쥐 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 유전자의 인핸서/프로모터, 인간 연장인자(elongation factor-1α, "EF-1α") 유전자의 인트론 및 그 하단부에 이종단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 포유동물용 발현벡터로 형질전환된 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이종단백질의 생산방법.
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