CN111955415A - 一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏再激活感染模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏再激活感染模型的建立方法，先向小鼠腹腔内注射MCMV病毒建立小鼠肺部潜伏性感染巨细胞病毒，再选取潜伏性MCMV感染小鼠，口服药物强的松诱导肺部潜伏性巨细胞病毒再活化，鉴定肺部潜伏性巨细胞病毒的再激活。本发明通过口服药物强的松的方法诱导肺部潜伏性巨细胞病毒感染发生再激活，小鼠肺部发生巨细胞病毒潜伏再激活感染，可以构建出巨细胞病毒潜伏再激活的动物模型，该小鼠模型表现出肺部巨细胞病毒潜伏再激活的典型特征：肺组织出现病毒表达相关蛋白。该模型可用于巨细胞病毒感染相关领域的基础研究，为探索巨细胞病毒潜伏再激活的致病机理奠定实验动物基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体地，涉及一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏再激活感染模型的建立方法。
背景技术
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)在人群中感染率极高，其感染率与性别、人种、年龄段、地域及经济状况等因素相关，总体人群感染率约为60～100％，在我国新生儿中HCMV高达96.2％。HCMV具有疱疹病毒感染特性，即人体一旦感染HCMV将终身携带，并可导致先天性神经系统发育不良、诱发移植器官排斥和减弱免疫防御功能等不良结局，严重威胁生命健康，但是目前治疗和预防措施不多。
巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)具有明显的种属特异性，HCMV不能有效感染人以外的实验动物，尤其是鼠类。因此，一直以来众多研究建立以鼠巨细胞病毒(MurineCytomegalovirus，MCMV)感染小鼠为动物模型来模拟HCMV的在体感染过程。目前，具有以下方式构建MCMV毒感染的小鼠模型：(1)显微注射方式经胎盘接种MCMV建立MCMV宫内感染模型；(2)用插入LacZ基因的重组病毒株建立BALB/c小鼠MCMV肝炎模型；(3)异体注射外周血感染MCMV的小鼠模型。另外，胡雪影等(2006)公开了建立HCMV先天性潜伏感染再激活致肝脏损伤的BALB/c老年小鼠模型，是随机将HCMV病毒感染后的老年小鼠进行环磷酰胺激活，建立HCMV潜伏再激活感染鼠模型，用于研究人类HCMV潜伏感染至中老年时期再激活对肝脏损伤(胡雪影，王明丽.人巨细胞病毒先天性潜伏感染再激活致老年小鼠肝脏的损伤[J].世界华人消化杂志，2006，14(12)：1146-1150.)；王宇等(2015)公开了小鼠脑潜伏巨细胞病毒激活模型的建立，采用BALB/c幼鼠，经右侧耳和眼连线为底边的正三角形的中心将SmithStrain MCMV 500 PFU/5μL注射进入右侧脑室，培养至16周之后，将脂多糖(LPS)依15μg/kg体重(接近致死量)分别经腹腔和侧脑室内注射，建立了小鼠脑潜伏巨细胞病毒激活模型(王宇，刘军，刘营营，等.小鼠脑潜伏巨细胞病毒激活模型的建立[J].现代生物医学进展，2015(23)：4414-4418.)。但是，目前尚未见有如何构建肺部MCMV潜伏再激活感染的实验小鼠模型的相关报道，而且由于组织差异性和检测物质不同，上述现有方法并不适用于肺部MCMV潜伏再激活感染的建立，而且上述现有方法构建时间过短，评估手段少，并不能全面评价HCMV机体组织的影响。因此为深入研究人CMV的致病机制，评估药物抗病毒治疗效果以及进行疫苗研发，亟须建立一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏再激活感染模型。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏再激活感染模型的建立方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏再激活感染模型的建立方法，先向小鼠腹腔内注射MCMV病毒建立小鼠肺部潜伏性感染巨细胞病毒，再选取潜伏性MCMV感染小鼠，口服药物强的松诱导肺部潜伏性巨细胞病毒再活化，鉴定肺部潜伏性巨细胞病毒的再激活。
本发明先建立实验小鼠肺部潜伏性感染巨细胞病毒，再口服药物强的松诱导肺部潜伏性巨细胞病毒再活化，鉴定肺部潜伏性巨细胞病毒的再激活。本发明成功构建肺部CMV潜伏再激活感染动物模型，尤其是与人类基因组高度同源、经济性良好和繁殖能力强的小鼠CMV潜伏再激活感染模型，该实验小鼠模型表现出肺部巨细胞病毒潜伏再激活的典型特征：肺组织出现病毒表达相关蛋白。
优选地，是在MCMV感染小鼠后，培养16周～24周后再口服药物强的松诱导肺部潜伏性巨细胞病毒再活化。
优选地，所述MCMV病毒为MCMV Smith病毒株。
优选地，所述腹腔内注射MCMV病毒的剂量为5×104PFU。
优选地，所述小鼠为6至8周龄的雌性BALB/c小鼠。
优选地，潜伏性MCMV感染小鼠是通过转录聚合酶链式反应，体外空斑实验和聚焦扩增测定方法以确认存在MCMV潜伏性感染，当肺组织中MCMV RNA和IVPA或FEA均为阴性时，表明成功构建潜伏性MCMV感染小鼠，否则失败。
优选地，所述口服药物强的松为糖皮质激素，潜伏性MCMV感染小鼠口服剂量为1mg/kg，每周服用一次。
优选地，鉴定肺部潜伏性巨细胞病毒的再激活为用PCR和RT-PCR技术检测立即早期基因、糖蛋白B基因，DNA聚合酶基因和β-actin基因RNA表达水平，以及CMV DNA表达水平，当立即早期基因、糖蛋白B基因，DNA聚合酶基因和β-actin基因RNA，以及CMV DNA均表达为阳性时，表示潜伏状态MCMV发生再激活。
进一步优选地，还包括体外空斑实验和聚焦扩增测定方法MCMV。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过口服药物强的松的方法诱导肺部潜伏性巨细胞病毒感染发生再激活，实验小鼠肺部发生巨细胞病毒潜伏再激活感染，可以构建出巨细胞病毒潜伏再激活的动物模型，构建方法新颖，目前还没有这种构建方式。同时本发明模型建立方法持续时间长，评估方式全面、系统、准确，较现有巨细胞病毒潜伏-再活化动物模型更加准确。
附图说明
图1为口服药物强的松后第7天、第14天和第21天潜伏性MCMV感染小鼠：立即早期基因(IE)、糖蛋白B基因(GB)，DNA聚合酶基因、β-actin基因RNA，CMV DNA表达量情况(出现白色条带表明阳性，粗细/光度表明表达量)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下具体实施方式中使用的评价技术：
(1)PCR引物设计
以下引物用于所有CMV-PCR和RT-PCR反应。利用DNASTAR软件设计引物。小鼠巨细胞病毒IE-1、DNA聚合酶(＝修复聚合酶)和糖蛋白B基因(GB)的序列来自GenBank.序列PCR扩增产物的特异性通过使用ABI-PRISM测序器进行确认。
(2)引物
IE-1：5’-TAGCCAATGATATCGAGCG-3’
IE-1：3’-ATCTGGTGCTCCTCAGATCAGCTACTCCGACGACGACGTG-5’
DNA pol：5’-GGGACCCTACTCCGACGACGTG-3’
DNA pol：3’-GCTCTGCTCTTCGATCGGTAGG-5’
GB：5’-TTCAGTTCAACTCGAA-3’
GB：3’-GGGAAGAAGTACTCGACCGG-5’
(3)PCR
用QIAamp组织试剂盒(QIAGENGmbH)从组织中提取DNA。从组织匀浆中提取的DNA在100微升蒸馏水中洗脱，并保存在-20℃直到分析。在总体积为25微升的PCR缓冲液(50mMKCl，20mM TrisHCl[pH8.4]和1.5mM MgCl2)中加入200nM的引物和1.0U的Taq DNA聚合酶(GibcoBRL)扩增DNA。采用以下程序对PerkinElmer 9700热循环器进行PCR：94℃初始变性4min，94℃变性35次30s，在53℃退火30s，在72℃下延伸30s，然后在72℃下最终延伸为7min，然后在4℃下保持。以上列出了用于转录IE-1、GB和DNA聚合酶基因的引物。β-肌动蛋白转录本作为细胞转录对照。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙锭染色。
(4)RT-PCR和巢式PCR
用Trizol试剂从组织中提取RNA，溶于100微升二乙基焦碳酸水中，保存于-80℃。用1U DNaseI在37℃下消化1-5微克RNA进行RT反应20min。在总体积为20微升的情况下进行RT反应，其中含有60mM KCl、15mM Tris-HCl(pH8.4)、3mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、20％(vol/vol)甘油、每1mM dNTP三磷酸、随机引物12.5pM和2.5U超转录酶。在25℃下进行引物退火10min，在42℃下进行RT 30min，然后用1URNAseH消化，然后在95℃下变性5min。为了控制DNA污染，每个样本都有一个平行实验，没有RT反应。
(5)体外空斑实验(IVPA)
对于IVPA，小鼠胚胎成纤维细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基中在6孔板中培养。离心后(1000g，10min)5mL均质组织，1mL上清液放置在每孔中。然后将这些板离心1000克，在37℃下在5％CO2中孵育34h，用PBS洗涤3次，然后覆盖3mL在DMEM中的1％琼脂。孵育6-7天后(37C，5％CO2)，将平板固定在10％福尔马林中，用1％结晶紫染色，用低倍相对比度显微镜分析空斑形成。
(6)聚焦扩增测定(Focused expansion assay，FEA)
组织在4℃时进行Dounce均匀化，匀浆用于DMEM的适当稀释，用于MEFs的感染。将MEFs的单层(75cm2烧瓶中的5×106个细胞)接种2mL的冻融和均质组织，离心(1000g，20℃下30min)。离心后弃去上清液，用PBS洗涤细胞两次。病毒复制被允许在5％CO2加湿气氛中在37℃下进行72小时。孵育后，用胰蛋白酶分离指示剂MEFs(含0.05％wt/vol胰酶和0.02％wt/volEDTA的PBS[pH7.2])，加入含10％胎儿小牛血清的DMEM。细胞在500g下沉淀10min，在PBS中吸收，溶解在TRlzol试剂(GibcoBRL)的提取缓冲液中)。分离RNA并通过RT-PCR分析病毒RNA。
实施例1小鼠肺部巨细胞病毒潜伏再激活感染模型的建立及评价
1、建立实验小鼠肺部潜伏性感染巨细胞病毒
(1)动物选择和处理：使用6至8周龄的雌性BALB/c小鼠。在获取动物伦理审核通过后，将小鼠饲养在动物生物安全实验室2级实验室中。小鼠在吸入麻醉药异氟烷后使用颈椎脱臼方法进行安乐死。无菌解剖小鼠肺部和唾液腺，并将取出的肺部和唾液腺立即在液氮中冷冻，然后保存在-80℃冰箱中保存。
(2)构建潜伏性MCMV感染小鼠：纯化的MCMV Smith病毒株(VR-194/1981)从美国模式菌种保藏中心获得。通过腹腔内注射5×104PFU MCMV Smith病毒株实现了原代MCMV感染。MCMV感染后，维持饲养小鼠16周。分别在第2、4、8、12、16、20、24周处死小鼠，随后获取小鼠肺组织。
(3)评估潜伏性MCMV感染小鼠：通过逆转录聚合酶链式反应(Reversetranscription polymerase chain reaction，RT-PCR)，体外空斑实验(in vitro plaqueassay，IVPA)和聚焦扩增测定(Focused expansion assay，FEA)方法以确认存在MCMV潜伏性感染。获取小鼠肺组织并处理为肺组织匀浆，当肺组织中MCMV RNA和IVPA或FEA均为阴性时，表明成功构建潜伏性MCMV感染小鼠，否则失败。结果如表1所示，小鼠感染MCMV第16周之后，肺组织中MCMV RNA和IVPA或FEA均为阴性，确认存在MCMV潜伏性感染，表明成功构建潜伏性MCMV感染小鼠。
表1第2、4、8、12、16、20、24周小鼠肺组织RNA、IVPA/FEA、DNA情况
(每组5只小鼠；+：代表1只小鼠阳性；-：代表1只小鼠阴性)
2、口服药物强的松诱导肺部潜伏性巨细胞病毒再活化
选取潜伏性MCMV感染小鼠，口服药物强的松为糖皮质激素，潜伏性MCMV感染小鼠口服剂量为1mg/kg，每周服用一次。然后分别饲养小鼠至第7天、第14天和第21天后处死小鼠，并获取小鼠肺组织。
3、鉴定肺部潜伏性巨细胞病毒的再激活
获取步骤二小鼠肺组织并处理为肺组织匀浆，应该用PCR和RT-PCR技术检测立即早期基因(IE)、糖蛋白B基因(GB)，DNA聚合酶基因和β-actin基因RNA表达水平，以及CMVDNA表达水平。
当立即早期基因(IE)、糖蛋白B基因(GB)，DNA聚合酶基因和β-actin基因RNA，以及CMV DNA均表达为阳性时，表示潜伏状态MCMV发生再激活。结果如图1和表2所示，在口服药物强的松后第14天时，立即早期基因(IE)、糖蛋白B基因(GB)，DNA聚合酶基因和β-actin基因RNA，以及CMV DNA均表达为阳性，表明成功构建了肺部潜伏性巨细胞病毒的再激活小鼠，且随着培养天数增加，激活后的MCMV病毒复制量逐渐增加。
表2结扎漫长后第0、14、21天小鼠肺组织RNA、IVPA/FEA、DNA情况
(+：代表1只小鼠阳性；-：代表1只小鼠阴性)
Claims (9)
1.一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏再激活感染模型的建立方法，其特征在于，先向小鼠腹腔内注射MCMV病毒建立小鼠肺部潜伏性感染巨细胞病毒，再选取潜伏性MCMV感染小鼠，口服药物强的松诱导肺部潜伏性巨细胞病毒再活化，鉴定肺部潜伏性巨细胞病毒的再激活。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，是在MCMV感染小鼠后，培养16周～24周后再口服药物强的松诱导肺部潜伏性巨细胞病毒再活化。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述MCMV病毒为MCMV Smith病毒株。
4.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于，所述腹腔内注射MCMV病毒的剂量为5×104PFU。
5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述小鼠为6至8周龄的雌性BALB/c小鼠。
6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，潜伏性MCMV感染小鼠是通过转录聚合酶链式反应，体外空斑实验和聚焦扩增测定方法以确认存在MCMV潜伏性感染，当肺组织中MCMV RNA和IVPA或FEA均为阴性时，表明成功构建潜伏性MCMV感染小鼠，否则失败。
7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述口服药物强的松为糖皮质激素，潜伏性MCMV感染小鼠口服剂量为1mg/kg，每周服用一次。
8.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，鉴定肺部潜伏性巨细胞病毒的再激活为用PCR和RT-PCR技术检测立即早期基因、糖蛋白B基因，DNA聚合酶基因和β-actin基因RNA表达水平，以及CMV DNA表达水平，当立即早期基因、糖蛋白B基因，DNA聚合酶基因和β-actin基因RNA，以及CMV DNA均表达为阳性时，表示潜伏状态MCMV发生再激活。
9.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，还包括体外空斑实验和聚焦扩增测定方法MCMV。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113100175A (zh) * | 2021-03-08 | 2021-07-13 | 北京大学人民医院 | 一种巨细胞病毒感染的人源化小鼠模型及其构建方法 |
| CN114651786A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-06-24 | 广西医科大学 | 一种小鼠马尔尼菲篮状菌潜伏再激活模型的构建方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020075617A (ko) * | 2001-03-26 | 2002-10-05 | 한국생명공학연구원 | 포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및이 세포를 이용한 이종단백질의 생산방법 |
| CN1724075A (zh) * | 2005-06-28 | 2006-01-25 | 王明丽 | 人巨细胞病毒潜伏感染致Alzheimer’s病模型鼠及建立方法 |
| CN1888074A (zh) * | 2004-06-30 | 2007-01-03 | 东曹株式会社 | 巨细胞病毒的检测和定量方法 |
| CN104762264A (zh) * | 2015-04-20 | 2015-07-08 | 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 | 曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株及其制备方法和应用 |
| CN105866422A (zh) * | 2015-02-09 | 2016-08-17 | 厦门大学 | 用于评估机体发生人巨细胞病毒活动性感染风险的方法及相关的试剂盒 |
-
2020
- 2020-08-13 CN CN202010847768.8A patent/CN111955415A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020075617A (ko) * | 2001-03-26 | 2002-10-05 | 한국생명공학연구원 | 포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및이 세포를 이용한 이종단백질의 생산방법 |
| CN1888074A (zh) * | 2004-06-30 | 2007-01-03 | 东曹株式会社 | 巨细胞病毒的检测和定量方法 |
| CN1724075A (zh) * | 2005-06-28 | 2006-01-25 | 王明丽 | 人巨细胞病毒潜伏感染致Alzheimer’s病模型鼠及建立方法 |
| CN105866422A (zh) * | 2015-02-09 | 2016-08-17 | 厦门大学 | 用于评估机体发生人巨细胞病毒活动性感染风险的方法及相关的试剂盒 |
| CN104762264A (zh) * | 2015-04-20 | 2015-07-08 | 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 | 曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JORDAN M C; SHANLEY J D; STEVENS J G: "《Immunosuppression Reactivates and Disseminates Latent murine Cytomegalovirus》", 《THE JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113100175A (zh) * | 2021-03-08 | 2021-07-13 | 北京大学人民医院 | 一种巨细胞病毒感染的人源化小鼠模型及其构建方法 |
| CN113100175B (zh) * | 2021-03-08 | 2022-07-12 | 北京大学人民医院 | 一种巨细胞病毒感染的人源化小鼠模型及其构建方法 |
| CN114651786A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-06-24 | 广西医科大学 | 一种小鼠马尔尼菲篮状菌潜伏再激活模型的构建方法 |
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