TW202309290A - 去優化之sars-cov-2變體及其方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述經修飾SARS-CoV-2變體。此等病毒已經重新編碼(例如密碼子去優化或密碼子對偏好去優化)，且適用於降低SARS-CoV-2變體感染之可能性或嚴重性、預防SARS-CoV-2變體感染、引發免疫反應或治療SARS-CoV-2變體感染。

Description

去優化之SARS-COV-2變體及其方法及用途
本發明係關於經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒變體、用於引發免疫反應之組合物及用於提供保護性免疫、預防及治療之疫苗。
本文中之所有公開案以引用之方式併入本文中，其引用的程度如同特定且個別地將各個別公開案或專利申請案以引用之方式併入一般。以下描述包括可適用於理解本發明之資訊。不承認本文所提供之資訊中之任一者為先前技術或與當前所主張之發明有關，或特定地或隱含地參考之任何出版物為先前技術。
在2019年12月中旬期間，在中國中部城市武漢鑑別出新型冠狀病毒之爆發。鑑別出現命名為SARS-CoV-2之新冠狀病毒病毒株。WHO已宣告致命冠狀病毒為大流行性的。此病毒之公共衛生危機快速生長，從截至2020年1月底奪去數十人的生命及感染超過一千人，至截至2021年7月初奪去超過400萬人的生命及感染超過1.85億人，至截至2022年6月奪去超過630萬人的生命。
自從爆發，SARS-CoV-2變體之出現尤其棘手且阻礙了疫苗向每個人提供免疫力的努力。因此，仍然極其及迫切地需要有效針對SARS-CoV-2變體之防治性及治療性治療。
結合在範疇中意謂為例示性及說明性、非限制性之組合物及方法，描述且說明以下實施例及其態樣。
本發明之各種實施例提供一種聚核苷酸，其包含編碼親本SARS-CoV-2變體之一或多種病毒蛋白或其一或多個片段的聚核苷酸，其中該聚核苷酸與其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸相比經重新編碼，且其中由該聚核苷酸編碼的該親本SARS-CoV-2變體之該一或多種病毒蛋白或其一或多個片段之胺基酸序列保持相同，或其中由該聚核苷酸編碼的該親本SARS-CoV-2變體之該一或多種病毒蛋白或其一或多個片段之胺基酸序列包含至多20個胺基酸取代、添加或缺失，且其中該一或多種病毒蛋白或其一或多個片段包含棘蛋白(spike protein)或其片段。
在各種實施例中，該親本SARS-CoV-2變體包含SEQ ID NO:1，或該親本SARS-CoV-2變體可包含其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1，或該親本SARS-CoV-2變體可包含其中SEQ ID NO:1中存在一或多個突變之SEQ ID NO:1；且其中SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或其中存在一或多個突變之SEQ ID NO:1中的棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換。
在各種實施例中，該SARS-CoV-2變體可選自由以下組成之群：英國變體(U.K. variant)、南非變體(South Africa variant)、巴西變體(Brazil variant)、德耳塔變體(Delta variant)及奧密克戎變體(Omicron variant)。
在各種實施例中，該聚核苷酸可藉由相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸減少密碼子對偏好(codon-pair bias；CPB)或減少密碼子使用偏好來重新編碼。在各種實施例中，該聚核苷酸可藉由相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸增加CpG或UpA二核苷酸之數目來重新編碼。在各種實施例中，該等經重新編碼之一或多種病毒蛋白中之各者或該等其經重新編碼之一或多個片段中之各者可具有小於-0.05、小於−0.1、小於−0.2、小於−0.3或小於−0.4之密碼子對偏好。在各種實施例中，該聚核苷酸可相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸經CPB去優化。在各種實施例中，該聚核苷酸可相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸經密碼子去優化。在各種實施例中，該密碼子去優化或該CPB去優化可基於人類中頻繁使用之密碼子或CPB。在各種實施例中，該密碼子去優化或該CPB去優化可基於冠狀病毒中頻繁使用之密碼子或CPB。在各種實施例中，該密碼子去優化或CPB去優化可基於野生型SARS-CoV-2冠狀病毒中頻繁使用之密碼子或CPB。在各種實施例中，可消除弗林蛋白酶裂解位點(furin cleavage site)。
各種實施例提供一種載體，其包含本文所描述的本發明之聚核苷酸。
各種實施例提供一種細胞，其包含本文所描述的本發明之聚核苷酸或本文所描述的本發明之載體。在各種實施例中，該細胞可為Vero細胞或幼倉鼠腎(baby hamster kidney；BHK)細胞。
各種實施例提供一種多肽，其由本文所描述的本發明之聚核苷酸編碼。
各種實施例提供一種經修飾SARS-CoV-2變體，其包含本文所描述的本發明之聚核苷酸。各種實施例提供一種經修飾SARS-CoV-2變體，其包含本文所描述的由本發明之聚核苷酸編碼之多肽。各種實施例提供如本文中所描述的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體，其中其病毒蛋白中之一或多者之表現與其親本SARS-CoV-2變體相比可降低。各種實施例提供如本文中所描述的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體，其中其病毒蛋白中之一或多者之表現的降低可由於重新編碼棘蛋白或其片段而降低。
各種實施例提供一種用於誘導個體中之免疫反應的免疫組合物或疫苗組合物，其包含：一或多種如本文所描述的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體。在各種實施例中，如本文中所描述的本發明之免疫組合物或疫苗組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
各種實施例提供一種用於誘導個體中之免疫反應的多價免疫組合物或疫苗組合物，其包含：一或多種如本文所描述的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體。在各種實施例中，如本文所描述的本發明之多價免疫組合物或如本文中所描述的本發明之多價疫苗組合物進一步包含經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒，該經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸，其中具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸與經修飾SARS-CoV-2變體中之聚核苷酸不相同。在各種實施例中，如本文所描述的本發明之多價免疫組合物或如本文中所描述的本發明之多價疫苗組合物可進一步包含經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒，該經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含由具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸編碼的多肽，其中由具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸編碼的多肽與經修飾SARS-CoV-2變體中之多肽不相同。在各種實施例中，如本文所描述的本發明之多價免疫組合物或如本文中所描述的本發明之多價疫苗組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與一定劑量的如本文所描述的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與一定劑量的如本文所描述的本發明之免疫組合物。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與一定劑量的如本文所描述的本發明之疫苗組合物。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與一定劑量的如本文所描述的本發明之多價免疫組合物或多價疫苗組合物。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與預致敏劑量的如本文中所描述的本發明之經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒或如本文中所描述的本發明之疫苗組合物或如本文中所描述的本發明之免疫組合物或如本文所描述的多價免疫或疫苗組合物；及向個體投與一或多種增強免疫劑量的如本文中所描述的本發明之經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒或如本文中所描述的本發明之疫苗組合物或如本文中所描述的本發明之免疫組合物或如本文所描述的多價免疫或疫苗組合物。
在各種實施例中，免疫反應可為保護性免疫反應。在各種實施例中，劑量為防治有效或治療有效劑量。
在各種實施例中，投與可經由經鼻途徑進行。在各種實施例中，投與可經由經鼻滴劑進行。在各種實施例中，投與可經由經鼻噴霧進行。
在各種實施例中，該劑量可為約10 4-10 6PFU，或該預致敏劑量可為約10 4-10 6PFU且該一或多種增強免疫劑量可為約10 4-10 6PFU。
各種實施例提供一種製備去優化SARS-CoV-2變體之方法，其包含：獲得編碼親本SARS-CoV-2變體之一或多種蛋白質或其一或多個片段的核苷酸序列；重新編碼核苷酸序列以降低一或多種蛋白質或其一或多個片段之蛋白質表現，及將具有經重新編碼之核苷酸序列之核酸取代至親本SARS-CoV-2變體基因體中以製備去優化SARS-CoV-2變體基因體，其中相較於親本病毒，經重新編碼之核苷酸序列之表現降低。在各種實施例中，去優化SARS-CoV-2變體可為如本文所描述的去優化SARS-CoV-2變體。
根據以下結合隨附圖式之詳細描述，本發明之其他特徵及優點將變得顯而易見，該隨附圖式藉助於實例說明本發明之實施例之各種特徵。
相關申請案之交叉參考
本申請案包括2021年7月7日申請之美國臨時專利申請案第63/219,263號及2022年6月30日申請之國際申請案第PCT/US2022/035824號之優先權要求，兩種申請案之全部內容特此以引用之方式併入。 序列表之參考
本申請案含有以電子化文本文件形式提交的序列表，其命名為「sequencelisting_064955_000051TW00_ST26 2022_07_03.xml」，具有268,000位元組之位元組大小且創建於2022年7月3日。此電子檔中所含有之資訊特此以全文引用之方式併入。
本文中所引用之所有文獻以全文引用之方式併入，如同將其完全闡述一般。除非另外定義，否則本文所使用之技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。Singleton等人, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第 3 版 , 經修訂, J. Wiley & Sons (New York, NY 2006)；March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure第7版, J. Wiley & Sons (New York, NY 2013)；以及Sambrook及Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)為熟習此項技術者提供本申請案中使用之許多術語之通用指南。
熟習此項技術者應能識別類似或等效於本文所描述之多種方法及材料，其可用於本發明之實踐中。實際上，本發明決不受限於所描述之方法及材料。出於本發明之目的，以下術語定義如下。
如本文所使用，除非本文另外特定提供，否則術語「約」在與參考數值指示結合使用時意謂參考數值指示加或減該參考數值指示之至多5%。舉例而言，語言「約50%」涵蓋45%至55%之範圍。在各種實施例中，若在申請專利範圍中特定提供，則術語「約」在與參考數值指示結合使用時可意謂參考數值指示加或減該參考數值指示之至多4%、3%、2%、1%或0.5%。
如本文所使用之「親本病毒」係指將經重新編碼之核苷酸序列與其比較以編碼相同或類似胺基酸序列的參考病毒。
如本文所使用之「SARS-CoV-2」及「2019-nCoV」為可互換的，且係指具有野生型序列、天然分離株序列或引起COVID-19之野生型序列或天然分離株序列之突變形式的冠狀病毒。突變形式經由病毒之複製週期或經由基因工程改造天然產生。
如本文所使用之「SARS-CoV-2變體」係指SARS-CoV-2之突變形式，該突變形式由於其在諸如人類之宿主之間複製及/或傳播而已經由病毒之複製週期天然產生。SARS-CoV-2變體之實例包括但不限於阿爾法變體(也稱為英國變體、20I/501Y.V1、VOC 202012/01或B.1.1.7)、貝塔變體(也稱為南非變體、20H/501Y.V2或B.1.351)、德耳塔變體(B.1.617.2)、伽瑪變體(也稱為巴西變體或P.1)、奧密克戎變體(B.1.1.529)、奧密克戎變體譜系(BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4及BA.5)。
如本文所使用，參見SARS-CoV-2之「天然分離株」係指已自宿主(例如，人類、蝙蝠、貓、豬或任何其他宿主)或天然貯主分離之病毒，諸如SARS-CoV-2。在其在宿主(例如，人類)中複製及/或在宿主(例如，人類)之間傳播時，天然分離株之序列可為相同的或具有經由病毒之複製週期天然產生的突變。
如本文所使用之「華盛頓冠狀病毒分離株」或「華盛頓分離株」係指截至2020年7月5日具有GenBank寄存編號MN985325.1的SARS-CoV-2之野生型分離株，其如同完全闡述於其全文中而以引用之方式併入本文中。
「WW-WWD」、「CDX-005」及「COVI-VAC」可互換使用。「COVI-VAC」為先前用於優先權申請案中以描述CDX-005之名稱。
如本文所使用之「頻繁使用之密碼子」或「密碼子使用偏好」係指同義密碼子在特定物種(例如，人類、冠狀病毒或SARS-CoV-2)之DNA中出現頻率之差異。
如本文所使用之「密碼子對偏好」係指在特定物種(例如，人類、冠狀病毒或SARS-CoV-2)中比統計學上預測更頻繁或較不頻繁使用之同義密碼子對。
如本文所使用之「個體」意謂任何動物或人工修飾之動物。動物包括但不限於人類、非人類靈長類動物、猴、牛、馬、綿羊、豬、狗、貓、兔、雪貂、嚙齒動物(諸如小鼠、大鼠及天竺鼠)、蝙蝠、蛇及鳥。人工修飾之動物包括但不限於具有人類免疫系統之SCID小鼠。在一較佳實施例中，個體為人類。
「病毒宿主」意謂可感染病毒的任何動物或人工修飾之動物。動物包括但不限於人類、非人類靈長類動物、猴、牛、馬、綿羊、豬、狗、貓、兔、雪貂、嚙齒動物(諸如小鼠、大鼠及天竺鼠)及鳥類。人工修飾之動物包括但不限於具有人類免疫系統之SCID小鼠。在各種實施例中，病毒宿主為哺乳動物。在各種實施例中，病毒宿主為靈長類動物。在各種實施例中，病毒宿主為人類。鳥類之實施例為家養的家禽物種，包括但不限於雞、火雞、鴨及鵝。
「防治上有效劑量」為當向有病毒感染傾向或有罹患病毒相關之病症傾向的個體投與時，在個體中誘導保護個體免於感染病毒或罹患病症之免疫反應的疫苗或病毒組合物之任何量。「保護」個體意謂降低個體感染病毒之可能性或降低個體中病症發作之可能性至少兩倍，較佳至少10倍、25倍、50倍或100倍。舉例而言，若個體具有1%機率感染病毒，兩倍地減少個體感染病毒之可能性將使得個體具有0.5%機率感染病毒。
如本文所使用，「治療有效劑量」為當向罹患針對疫苗有效之病症的個體投與時，在個體中誘導引起個體經歷病症及/或其症狀之減少、緩解或消退之免疫反應的疫苗或病毒組合物之任何量。在較佳實施例中，防止病症及/或其症狀之復發。在其他較佳實施例中，治癒個體之病症及/或其症狀。
如本文所使用之「對應序列」係指經修飾序列編碼比較序列之相同或類似胺基酸序列的比較序列。在各種實施例中，對應序列為編碼病毒蛋白之序列。在各種實施例中，對應序列之長度為至少50個密碼子。在各種實施例中，對應序列之長度為至少100個密碼子。在各種實施例中，對應序列之長度為至少150個密碼子。在各種實施例中，對應序列之長度為至少200個密碼子。在各種實施例中，對應序列之長度為至少250個密碼子。在各種實施例中，對應序列之長度為至少300個密碼子。在各種實施例中，對應序列之長度為至少350個密碼子。在各種實施例中，對應序列之長度為至少400個密碼子。在各種實施例中，對應序列之長度為至少450個密碼子。在各種實施例中，對應序列之長度為至少500個密碼子。在各種實施例中，對應序列為病毒蛋白序列。在各種實施例中，對應序列為整個病毒之序列。
在各種實施例中，如本文所使用之「類似胺基酸序列」係指相較於比較序列具有少於2%胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。在各種實施例中，若在申請專利範圍中特定提供，則「類似胺基酸序列」係指相較於比較序列具有少於1.75%胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。在各種實施例中，若在申請專利範圍中特定提供，則「類似胺基酸序列」係指相較於比較序列具有少於1.5%胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。在各種實施例中，若在申請專利範圍中特定提供，則「類似胺基酸序列」係指相較於比較序列具有少於1.25%胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。在各種實施例中，若在申請專利範圍中特定提供，則「類似胺基酸序列」係指相較於比較序列具有少於1%胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。在各種實施例中，若在申請專利範圍中特定提供，則「類似胺基酸序列」係指相較於比較序列具有少於0.75%胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。在各種實施例中，若在申請專利範圍中特定提供，則「類似胺基酸序列」係指相較於比較序列具有少於0.5%胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。在各種實施例中，若在申請專利範圍中特定提供，則「類似胺基酸序列」係指相較於比較序列具有少於0.25%胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。
本發明之免疫接種及治療方法中之任一者之某些實施例進一步包含向個體投與至少一種佐劑。「佐劑」應意謂適合於增強抗原之免疫原性且增強個體之免疫反應的任何試劑。包括顆粒狀佐劑之諸多佐劑適合於與基於蛋白質及核酸兩者之疫苗一起使用，且將佐劑與抗原組合之方法已為熟習此項技術者所熟知。用於基於核酸之疫苗之適合佐劑包括但不限於以經純化蛋白質或核酸形式遞送之Quil A、咪喹莫特(imiquimod)、雷西莫特(resiquimod)及介白素-12。適合於與蛋白質免疫接種一起使用之佐劑包括但不限於明礬、弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant；FIA)、皂素、Quil A及QS-21。
本文描述SARS-CoV-2變體，其中其基因已經重新編碼，例如密碼子對偏好去優化或密碼子使用去優化。在各種實施例中，本發明之SARS-CoV-2變體之病毒蛋白具有與其親體SARS-CoV-2變體相同的胺基酸序列；然而，核苷酸序列已經重新編碼。根據本發明之核苷酸序列之重新編碼導致降低之蛋白質表現、減毒或兩者。此等經重新編碼之SARS-CoV-2變體適用作疫苗，且特定言之，適用作減毒活疫苗。
吾等先前自野生型SARS-CoV-2產生合成的高度減毒活疫苗候選物CDX-005。雖然不希望受任何特定理論束縛，但吾等咸信，最可能的減毒機制為減緩之轉譯，經由轉譯中引起蛋白質錯誤摺疊之誤差、RNA二級結構中之變化或改變之調節信號均可有助於蛋白質產生減少。無論機制如何，減毒之CDX-005病毒以其野生型形式呈遞每一種病毒抗原，從而提供廣泛免疫反應之潛力且使得即使在目標病毒株中存在基因漂移，但其可能保留功效。由於數百個沈默(同義)突變促成表型，因此CDX-005預期對病原性之逆轉具有高度抗性。吾等逆轉測試指示，如藉由晚期繼代病毒之整體定序及評估弗林蛋白酶裂解位點(furin cleavage site)中之潛在變化所評定，疫苗為穩定的。
吾等倉鼠研究顯示，CDX-005在此等動物中為安全的。其為高度減毒的，在肺及嗅球中誘導較低的總病毒負荷且在大腦中將其完全消除，且在接種有CDX-005之動物之肺中誘導比接種有野生型WA1之彼等動物更低的活病毒負荷。不同於野生型病毒，CDX-005在經接種倉鼠中不誘導體重減輕或顯著肺病變。
倉鼠研究亦表明，CDX-005有效地預防SARS CoV-2。Ab效價之評定顯示，其在誘導血清IgG及中和Ab中與野生型病毒一樣有效。其針對野生型攻擊具有保護作用；接種有CDX-005導致肺病毒效價降低且針對大腦中之病毒具有完全保護作用。接種有CDX-005之倉鼠亦不展現經媒劑接種之動物中所觀測到的體重減輕。此外，不存在疾病增強之跡象。
吾等資料一起指示，CDX-005為目前正研發用於動物及人類中之一類重要的新型減毒活疫苗之一部分。其呈遞所有類似於其天然胺基酸序列之病毒抗原，可經鼻內投與，在具有單次劑量之小動物模型中為安全且有效的，對逆轉具有抗性，且可在容許溫度下生長至高效價。當前正在進行臨床試驗以測試其在人類中之安全性及功效。
為了構築去優化CDX-005 (例如，包含SEQ ID NO:1)活減毒疫苗候選物，首先將野生型WA1供體病毒之基因體電子雜交解析成19個重疊片段。各片段與各相鄰片段共用大約200 bp之序列重疊。藉由RT-PCR由野生型WA1病毒RNA之cDNA產生F1-F19。片段為藉由桑格定序(Sanger sequencing)確認之序列。吾等接著將野生型WA1病毒之片段16交換為具有去優化棘蛋白基因序列之片段16以產生CDX-005之cDNA基因體。
在各種實施例中，將目標SARS-CoV-2及其變體解析成各自具有約50至300 bp之小片段經由RT-PCR重疊且此等片段中之任一者的交換為可用於構築任何密碼子或密碼子對去優化病毒之cDNA基因體或基因體片段的過程。具有去優化卡匣之此cDNA基因體接著可用於經由反向遺傳學回收去優化病毒。
對於CDX-005，吾等所識別出吾等WA1供體病毒(Vero細胞繼代6)之序列相較於公開的WA1序列(Vero細胞繼代4)的一個顯著差異。在自BEI資源接收到之WA1病毒之Codagenix處的Vero E6細胞上之兩個額外WA1病毒繼代期間，棘蛋白基因中出現36 nt缺失(基因體位置23594-23629)。缺失涵蓋包括多鹼基弗林蛋白酶裂解位點之12個胺基酸TNSPRRARSVAS (SEQ ID NO:13)。已提出SARS-CoV2棘蛋白中之弗林蛋白酶裂解位點作為人類宿主中SARS-CoV2之高度病原性表型之潛在驅動因子。雖然不希望受任何特定理論束縛，但吾等咸信弗林蛋白酶裂解之缺失對SARS-CoV-2病毒及其變體在Vero細胞中活體外生長有益，且咸信缺失在Vero細胞培養物中繼代期間進化。吾等進一步咸信，弗林蛋白酶裂解位點之缺失可促成攜帶此類突變之SARS-CoV-2病毒或變體之人類宿主中的減毒。吾等因此決定併入來源於吾等疫苗候選物CDX-005之弗林蛋白酶裂解位點。弗林蛋白酶裂解位點缺失位於組裝片段F15中。
然而，由於SARS-CoV-2變體之出現，因此需要新的疫苗來確保針對變體形式之穩固保護。因此，吾等陳述產生去優化SARS-CoV-2變體以允許針對SARS-CoV-2變體之較大保護。
本發明至少部分基於前述內容及基於如本文所描述之其他資訊。
在各種實施例中，本發明之SARS-CoV-2變體之病毒蛋白具有與其親體SARS-CoV-2變體相同的胺基酸序列，但其具有至多約20個胺基酸缺失、取代或添加。然而，核苷酸序列已經重新編碼，其導致蛋白質表現降低、減毒或兩者。在各種實施例中，本發明之SARS-CoV-2變體之病毒蛋白具有與其親本SARS-CoV-2變體相同的胺基酸序列，但具有至多10個胺基酸缺失、取代或添加；然而，核苷酸序列已經重新編碼，其導致蛋白質表現降低、減毒或兩者。在各種實施例中，本發明之SARS-CoV-2變體之病毒蛋白具有與其親本SARS-CoV-2變體相同的胺基酸序列，但在1-5個胺基酸缺失、取代或添加之間。在各種實施例中，本發明之SARS-CoV-2變體之病毒蛋白具有與其親本SARS-CoV-2變體相同的胺基酸序列，但在6-10個胺基酸缺失、取代或添加之間。在各種實施例中，本發明之SARS-CoV-2變體之病毒蛋白具有與其親本SARS-CoV-2變體相同的胺基酸序列，但在11-15個胺基酸缺失、取代或添加之間。在各種實施例中，本發明之SARS-CoV-2變體之病毒蛋白具有與其親本SARS-CoV-2變體相同的胺基酸序列，但在16-20個胺基酸缺失、取代或添加之間。然而，同樣，核苷酸序列已經重新編碼，其導致蛋白質表現降低、減毒或兩者。在各種實施例中，本發明之SARS-CoV-2變體之病毒蛋白具有與其親本SARS-CoV-2變體相同的胺基酸序列，但具有12個胺基酸缺失、取代或添加；然而，核苷酸序列已經重新編碼，其導致蛋白質表現降低、減毒或兩者。在各種實施例中，胺基酸缺失、取代或添加係由在親本SARS-CoV-2變體序列之核酸序列之polyA尾之前的核酸缺失、取代或添加產生。
在各種實施例中，本發明之SARS-CoV-2變體之病毒蛋白具有與其親本SARS-CoV-2變體相同的胺基酸序列，但具有12個胺基酸缺失。在各種實施例中，本發明之SARS-CoV-2變體之病毒蛋白具有與其親本SARS-CoV-2變體相同的胺基酸序列，但具有1-5個胺基酸缺失、或6-10個胺基酸缺失、或11-15個胺基酸缺失、或16-20個胺基酸缺失。在各種實施例中，胺基酸缺失在消除弗林蛋白酶裂解位點之棘蛋白中。在各種特定實施例中，本發明之SARS-CoV-2變體之病毒蛋白具有與其親本SARS-CoV-2變體相同的胺基酸序列，但具有導致消除棘蛋白上之弗林蛋白酶裂解位點的12個胺基酸缺失。在各種實施例中，胺基酸缺失、取代或添加係由在親本SARS-CoV-2變體序列之核酸序列之polyA尾之前的核酸缺失、取代或添加產生。
在各種實施例中，對編碼SARS-CoV-2變體之棘蛋白(亦稱為S基因)之核酸進行重新編碼。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白包含消除弗林蛋白酶裂解位點之核苷酸缺失；例如，具有以下序列actaattctcctcggcgggcacgtagtgtagctagt (SEQ ID NO:14)或編碼TNSPRRARSVAS (SEQ ID NO:13)之核酸序列的36個核苷酸序列。
根據本文所論述之揭示內容，藉由熟習此項技術者已經或可對本發明之減毒病毒之棘蛋白編碼序列進行重新編碼。根據本發明之各種實施例，在棘蛋白編碼序列中之多個位置中工程改造核苷酸取代，其中取代將複數個同義密碼子引入至基因體中。在某些實施例中，同義密碼子取代改變基因體中之密碼子偏好、密碼子對偏好、不頻繁密碼子或不頻繁出現的密碼子對之密度、RNA二級結構、CG及/或TA (或UA)二核苷酸含量、C+G含量、轉譯移碼位點、轉譯暫停位點、存在或不存在微小RNA識別序列或其任何組合。密碼子取代可在整個棘蛋白編碼序列中分佈之多個位置中，或在受限於棘蛋白編碼序列之一部分的多個位置中經工程改造。由於所涉及之大量缺陷(亦即，核苷酸取代)，因此本發明允許生產穩定減毒之病毒及活疫苗。
在一些實施例中，病毒密碼子對經重新編碼以減少密碼子對偏好(亦即，降低密碼子對偏好之值)。在某些實施例中，密碼子對偏好係藉由在棘蛋白編碼序列中鑑別具有可降低之密碼子對評分的密碼子對且藉由用具有較低密碼子對評分之密碼子對取代密碼子對來減少密碼子對偏好來減少。在一些實施例中，密碼子對之此取代採用重排序列之現有密碼子的形式。在一些此類實施例中，密碼子對之子組經重排同義密碼子之子組取代。在其他實施例中，藉由使經重排同義密碼子之數目最大化來取代密碼子對。應指出，雖然密碼子之重排導致密碼子對偏好總體上對於病毒編碼序列而言減少(使其更負)，且重排導致在許多位置處之CPS減少，但在其他位置處可伴隨CPS增加，但平均而言，密碼子對評分，且因此經修飾序列之CPB減少。在一些實施例中，密碼子或密碼子對之重新編碼可考慮改變棘蛋白編碼序列之G+C含量。在一些實施例中，密碼子或密碼子對之重新編碼可考慮改變棘蛋白編碼序列中CG及/或TA二核苷酸之頻率。
在某些實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列具有小於−0.1、或小於−0.2、或小於−0.3、或小於−0.4之密碼子對偏好。在一些實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列具有小於−0.01、小於−0.02、小於−0.03、或小於−0.04之密碼子對偏好。在一些實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列具有小於−0.05、或小於−0.06、或小於−0.07、或小於−0.08、或小於−0.09、或小於−0.1、或小於−0.11、或小於−0.12、或小於−0.13、或小於−0.14、或小於−0.15、或小於−0.16、或小於−0.17、或小於−0.18、或小於−0.19、或小於−0.2、或小於−0.25、或小於−0.3、或小於−0.35、或小於−0.4、或小於−0.45、或小於−0.5之密碼子對偏好。
在某些實施例中，相較於自其衍生之親本棘蛋白編碼序列(例如，親本序列棘蛋白編碼序列、變體序列棘蛋白編碼序列)，經重新編碼之棘蛋白編碼序列之密碼子對偏好減少了至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4。在某些實施例中，相較於自其衍生之親本棘蛋白編碼序列，棘蛋白編碼序列之同義密碼子之重排提供至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4之密碼子對偏好減少。在某些實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列之密碼子對偏好減少了至少0.01、至少0.02、至少0.03或至少0.04。在某些實施例中，相較於親本病毒上之對應序列，經重新編碼之棘蛋白編碼序列之密碼子對偏好減少了至少0.05、或至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5。在某些實施例中，比較自其中待進行計算之對應序列；例如，變體病毒之對應序列(例如，變體病毒上之棘蛋白編碼序列)。
在一些實施例中，病毒編碼序列係藉由用SARS-CoV-2冠狀病毒宿主(例如，人類、蛇、蝙蝠)中以更低頻率使用之同義密碼子取代一或多個密碼子來重新編碼。在一些實施例中，病毒編碼序列係藉由用在冠狀病毒(例如，SARS-CoV-2冠狀病毒)中以更低頻率使用之同義密碼子取代一或多個密碼子來重新編碼。在某些實施例中，經同義密碼子取代之密碼子之數目為至少5。在一些實施例中，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450或500個密碼子經宿主中以更低頻率使用之同義密碼子取代。在某些實施例中，經修飾序列包含至少20個經以更低頻率使用之同義密碼子取代之密碼子。在某些實施例中，經修飾序列包含至少50個經以更低頻率使用之同義密碼子取代之密碼子。在某些實施例中，經修飾序列包含至少100個經以更低頻率使用之同義密碼子取代之密碼子。在某些實施例中，經修飾序列包含至少250個經以更低頻率使用之同義密碼子取代之密碼子。在某些實施例中，經修飾序列包含至少500個經以更低頻率使用之同義密碼子取代之密碼子。
舉例而言，對於經重新編碼之棘蛋白，經宿主中以更低頻率使用之同義密碼子取代之密碼子之數目為至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500個密碼子。
在一些實施例中，同義密碼子之取代係在病毒宿主(例如，人類)中頻繁較低之彼等。病毒宿主之其他實例包括但不限於上文提及之彼等。在一些實施例中，同義密碼子之取代係用病毒自身(例如，SARS-CoV-2冠狀病毒)中頻繁較低之彼等進行。
在其中相較於親本病毒上之對應序列，經修飾序列包含增加數目之CpG或UpA二核苷酸的實施例中，相較於對應序列，該增加具有約15-55個CpG或UpA二核苷酸。在各種實施例中，相較於對應序列，增加約15、20、25、30、35、40、45或55個CpG或UpA二核苷酸。在一些實施例中，相較於對應序列，CpG或UpA二核苷酸相比於對應序列之增加數目為約10-75、15-25、25-50或50-75個CpG或UpA二核苷酸。
通常，進行此等取代及改變且在不改變所編碼蛋白質之胺基酸序列的情況下降低所編碼病毒蛋白之表現。在某些實施例中，本發明亦包括導致非同義密碼子之取代及所編碼蛋白質中之胺基酸取代的棘蛋白編碼序列中之改變，其可為或可不為保守的。在一些實施例中，此等取代及改變進一步包括導致胺基酸缺失、添加、取代之取代或改變。舉例而言，棘蛋白可經導致弗林蛋白酶裂解位點之消除的36個核苷酸缺失重新編碼。
在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約3/4。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約½。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約1/3。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約1/4。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約1/5。
在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約10-20%。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約20-30%。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約25-35%。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約30-40%。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約35-45%。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約40-50%。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約45-55%。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約50-60%。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約55-65%。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約60-70%。在各種實施例中，病毒蛋白之連續區段經重新編碼，其中連續區段為病毒蛋白之長度之約70-80%。
大多數胺基酸係藉由超過一種密碼子編碼。參見表1中之遺傳密碼。舉例而言，丙胺酸係由GCU、GCC、GCA及GCG編碼。三種胺基酸(Leu、Ser及Arg)係由六種不同密碼子編碼，而僅Trp及Met具有獨特密碼子。「同義」密碼子為編碼相同胺基酸之密碼子。因此，舉例而言，CUU、CUC、CUA、CUG、UUA及UUG為編碼Leu之同義密碼子。同義密碼子不以相同頻率使用。一般而言，特定生物體中最頻繁使用之密碼子為其中同源tRNA豐富之彼等，且使用此等密碼子提高蛋白質轉譯之速率及/或準確性。相反，以相對較低水準發現很少使用之密碼子之tRNA，且認為使用稀有密碼子降低轉譯速率及/或準確性。 表 1 . 遺傳密碼
   U C A G  
U Phe Ser Tyr Cys U
Phe Ser Tyr Cys C
Leu Ser STOP STOP A
Leu Ser STOP Trp G
C Leu Pro His Arg U
Leu Pro His Arg C
Leu Pro Gln Arg A
Leu Pro Gln Arg G
A Ile Thr Asn Ser U
Ile Thr Asn Ser C
Ile Thr Lys Arg A
Met Thr Lys Arg G
G Val Ala Asp Gly U
Val Ala Asp Gly C
Val Ala Glu Gly A
Val Ala Glu Gly G
a編碼特定胺基酸之各密碼子中之第一個核苷酸展示於最左行中；第二個核苷酸展示於頂部列中；及第三個核苷酸展示於最右行中。 密碼子偏好
如本文所使用，「稀有」密碼子為至少兩種編碼特定胺基酸之同義密碼子中之一者，該特定胺基酸以顯著低於該胺基酸最頻繁使用之密碼子的頻率存在於mRNA中。因此，稀有密碼子可以比最頻繁使用之密碼子低約2倍的頻率存在。較佳地，稀有密碼子呈比胺基酸之最頻繁使用之密碼子低至少3倍，更佳至少5倍的頻率。相反，「頻繁」密碼子為至少兩種編碼特定胺基酸之同義密碼子中之一者，該特定胺基酸以顯著高於該胺基酸至少頻繁使用之密碼子的頻率存在於mRNA中。頻繁密碼子可以比胺基酸之至少頻繁使用之密碼子高約2倍、較佳至少3倍、更佳至少5倍的頻率存在。舉例而言，人類基因使用白胺酸密碼子CTG之時間為40%，但使用同義CTA之時間僅為7%(參見表2)。因此，CTG為頻繁密碼子，而CTA為稀有密碼子。與此等使用頻率大致一致，識別CTG之tRNA之基因的基因體中存在6個複本，而識別CTA之tRNA之基因僅存在2個複本。類似地，人類基因分別使用絲胺酸之頻繁密碼子TCT及TCC之時間為18%及22%，但稀有密碼子TCG之時間僅為5%。TCT及TCC藉由同一tRNA經由擺動讀取，該tRNA在基因體中具有其基因之10個複本，而TCG藉由僅具有4個複本之tRNA讀取。眾所周知，極其積極轉譯之彼等mRNA很大程度上偏好於僅使用最頻繁的密碼子。此包括核糖體蛋白及糖酵解酶之基因。另一方面，相對不豐富之蛋白質之mRNA可使用稀有密碼子。 表 2. 智人中之密碼子使用 ( 來源 :www.kazusa.or.jp/codon/)
胺基酸 密碼子 數目 /1000 分數    胺基酸 密碼子 數目 /1000 分數
Gly GGG 636457.00 16.45 0.25    Trp TGG 510256.00 13.19 1.00
Gly GGA 637120.00 16.47 0.25    End TGA 59528.00 1.54 0.47
Gly GGT 416131.00 10.76 0.16    Cys TGT 407020.00 10.52 0.45
Gly GGC 862557.00 22.29 0.34    Cys TGC 487907.00 12.61 0.55
Glu GAG 1532589.00 39.61 0.58    End TAG 30104.00 0.78 0.24
Glu GAA 1116000.00 28.84 0.42    End TAA 38222.00 0.99 0.30
Asp GAT 842504.00 21.78 0.46    Tyr TAT 470083.00 12.15 0.44
Asp GAC 973377.00 25.16 0.54    Tyr TAC 592163.00 15.30 0.56
Val GTG 1091853.00 28.22 0.46    Leu TTG 498920.00 12.89 0.13
Val GTA 273515.00 7.07 0.12    Leu TTA 294684.00 7.62 0.08
Val GTT 426252.00 11.02 0.18    Phe TTT 676381.00 17.48 0.46
Val GTC 562086.00 14.53 0.24    Phe TTC 789374.00 20.40 0.54
Ala GCG 286975.00 7.42 0.11    Ser TCG 171428.00 4.43 0.05
Ala GCA 614754.00 15.89 0.23    Ser TCA 471469.00 12.19 0.15
Ala GCT 715079.00 18.48 0.27    Ser TCT 585967.00 15.14 0.19
Ala GCC 1079491.00 27.90 0.40    Ser TCC 684663.00 17.70 0.22
Arg AGG 461676.00 11.93 0.21    Arg CGG 443753.00 11.47 0.20
Arg AGA 466435.00 12.06 0.21    Arg CGA 239573.00 6.19 0.11
Ser AGT 469641.00 12.14 0.15    Arg CGT 176691.00 4.57 0.08
Ser AGC 753597.00 19.48 0.24    Arg CGC 405748.00 10.49 0.18
Lys AAG 1236148.00 31.95 0.57    Gln CAG 1323614.00 34.21 0.74
Lys AAA 940312.00 24.30 0.43    Gln CAA 473648.00 12.24 0.26
Asn AAT 653566.00 16.89 0.47    His CAT 419726.00 10.85 0.42
Asn AAC 739007.00 19.10 0.53    His CAC 583620.00 15.08 0.58
Met ATG 853648.00 22.06 1.00    Leu CTG 1539118.00 39.78 0.40
Ile ATA 288118.00 7.45 0.17    Leu CTA 276799.00 7.15 0.07
Ile ATT 615699.00 15.91 0.36    Leu CTT 508151.00 13.13 0.13
Ile ATC 808306.00 20.89 0.47    Leu CTC 759527.00 19.63 0.20
Thr ACG 234532.00 6.06 0.11    Pro CCG 268884.00 6.95 0.11
Thr ACA 580580.00 15.01 0.28    Pro CCA 653281.00 16.88 0.28
Thr ACT 506277.00 13.09 0.25    Pro CCT 676401.00 17.48 0.29
Thr ACC 732313.00 18.93 0.36    Pro CCC 767793.00 19.84 0.32
高度表現之基因使用頻繁密碼子之傾向稱作「密碼子偏好」。核糖體蛋白之基因僅可使用20至25個最頻繁之61個密碼子，且具有高密碼子偏好(密碼子偏好將近1)，而不良表現之基因可使用所有61個密碼子，且很少具有或沒有密碼子偏好(密碼子偏好接近0)。據認為，頻繁使用之密碼子為其中表現較大量之同源tRNA的密碼子，且認為此等密碼子之使用允許轉譯更加快速或更精確或兩者進行。 密碼子對偏好
另外，給定生物體對給定密碼子A之最近密碼子相鄰者具有優先權，稱為密碼子對利用偏好。密碼子對偏好之變化在不改變現有密碼子之情況下可影響蛋白質合成及蛋白質產生之速率。
密碼子對偏好可藉由考慮胺基酸對Ala-Glu來說明，該胺基酸對可由8個不同密碼子對編碼。若除各個別密碼子之頻率(如表2中所示)以外之因子不對密碼子對之頻率負責，則8個編碼中之各者的預期頻率可藉由使兩個相關密碼子之頻率相乘來計算。舉例而言，藉由此計算，預期密碼子對GCA-GAA將以0.097之頻率出現於所有Ala-Glu編碼對(0.23×0.42；基於表2中之頻率)中。為了使各密碼子對之預期(假設)頻率與人類基因體中之實際觀測到之頻率相關，使用持續標註之人類編碼區的共識CDS (CCDS)資料庫，其含有總計14,795個人類基因。此組基因為人類編碼序列之最全面表示。使用此組基因，密碼子使用之頻率係藉由密碼子之出現數目除以編碼相同胺基酸之所有同義密碼子之數目來重新計算。如所預期，頻率與先前公開之頻率(諸如表2中給出之頻率)緊密相關。輕微的頻率變化可能由於Kazusa DNA研究機構密碼子使用資料庫(www.kazusa.or.jp/codon/codon.html)提供之資料中的過取樣效應所致，其中84949個人類編碼序列包括於計算中(遠大於人類基因之實際數目)。接著由此計算之密碼子頻率用於藉由以下計算預期密碼子對頻率：首先將兩個相關密碼子之頻率彼此相乘(參見表3預期頻率)，且接著將此結果與觀測到之頻率(在整個CCDS資料集中)相乘，藉以由所討論之密碼子對編碼之胺基酸對進行該頻率。在密碼子對GCA-GAA之實例中，此第二次計算給出0.098之預期頻率(相比於使用Kazusa資料集之第一次計算中之0.097)。最後，如在以一組14,795個人類基因中觀測到之實際密碼子對頻率係藉由對該組中各密碼子對之出現之總數目進行計數且將其除以編碼相同胺基酸對之組中所有同義編碼對之數目來測定(表3；觀測到之頻率)。基於14,795個人類基因集，如表3特此提供3721 (612)個密碼子對全集之頻率及觀測/預期值。 表 3. 由胺基酸對 Ala-Glu 例示之密碼子對評分
胺基酸對 密碼子對 預期頻率 觀測頻率 觀測/預期比例
AE GCAGAA 0.098 0.163 1.65
AE GCAGAG 0.132 0.198 1.51
AE GCCGAA 0.171 0.031 0.18
AE GCCGAG 0.229 0.142 0.62
AE GCGGAA 0.046 0.027 0.57
AE GCGGAG 0.062 0.089 1.44
AE GCTGAA 0.112 0.145 1.29
AE GCTGAG 0.150 0.206 1.37
總計    1.000 1.000   
若密碼子對之觀測頻率/預期頻率之比率大於一，則密碼子對稱為過表現。若比率小於一，則其稱為低表現。在實例中，密碼子對GCA-GAA過表現1.65倍，而編碼對GCC-GAA低表現大於5倍。
許多其他密碼子對展示極強偏好；一些對低表現，而其他對過表現。舉例而言，密碼子對GCCGAA (AlaGlu)及GATCTG (AspLeu)為低表現三至六倍(較佳的對分別為GCAGAG及GACCTG)，而密碼子對GCCAAG (AlaLys)及AATGAA (AsnGlu)過表現約兩倍。值得注意的，密碼子對偏好與胺基酸對之頻率無關，亦與個別密碼子之頻率無關。舉例而言，低表現對GATCTG (AspLeu)恰好使用最頻繁之Leu密碼子(CTG)。
如下文更充分地論述，密碼子對偏好考慮編碼序列中各密碼子對在編碼序列之整個長度上平均化之評分。根據本發明，密碼子對偏好係藉由以下測定
Figure 02_image001
因此，編碼序列之類似密碼子對偏好可例如藉由使子序列上之密碼子對評分降至最低或使編碼序列之全長上的密碼子對評分適當降低來獲得。 密碼子對偏好之計算
可能含有3721個非「STOP」之密碼子對(例如，GTT-GCT)之每個個別密碼子對攜帶指定之「密碼子對評分」或對給定基因之「訓練集」具有特異性之「CPS」。給定密碼子對之CPS定義為觀測出現次數相對於在此基因集(在此實例中為人類基因體)中將預期之次數的對數比。確定特定密碼子對之實際出現次數(或換言之，特定胺基酸對由特定密碼子對編碼之可能性)僅為計算特定編碼序列集中密碼子對之實際出現次數的問題。然而，確定預期次數需要額外計算。類似於Gutman及Hatfield，計算預期次數以便獨立於胺基酸頻率及密碼子偏好兩者。亦即，預期頻率係基於胺基酸由特定密碼子編碼之次數的相對比例來計算。正CPS值表示給定密碼子對在統計學上過表現，且負CPS指示該對在人類基因體中在統計學上低表現。
為了在人類背景下進行此等計算，使用持續標註之人類編碼區的最新共識CDS (CCDS)資料庫，其含有總計14,795個基因。此資料集提供密碼子及密碼子對，且因此以基因體標度提供胺基酸及胺基酸對頻率。
Federov等人之範例(2002)用於進一步增強Gutman及Hatfield之方法(1989)。此允許計算給定密碼子對之預期頻率，而與密碼子頻率及編碼特定胺基酸對之相鄰密碼子之非隨機締合無關。用於計算CPB之詳細等式揭示於WO 2008/121992及WO 2011/044561中，其以引用之方式併入。
Figure 02_image003
在計算中，P ij為在其同義組中以N O(P ij)之頻率出現的密碼子對。C i及C j為包含P ij之兩個密碼子，其分別在其同義組中以頻率F(C i)及F(C j)出現。更明確地，F(C i)為在整個所有編碼區中對應胺基酸X i經密碼子C i編碼之頻率，且F(C i)=N O(C j)/N O(X i)，其中N O(C i)及N O(X i)分別為所觀測到之密碼子C i及胺基酸X i之出現次數。相應地計算F(C j)。此外，N O(X ij)為整個所有編碼區中胺基酸對X ij之出現次數。P ij之密碼子對偏好評分S(P ij)計算為觀測頻率N o(P ij)相對於N e(P ij)之預期出現次數的對數-幾率比。
使用上式，接著確定個別編碼序列中之個別密碼子對在與藉由使用整個人類CCDS資料集計算之對應基因體N e(P ij)值相比時是否過表現或低表現。此計算產生人類編碼區中過表現密碼子對之正S(P ij)評分值及低表現密碼子對之負值。
個別編碼序列之「組合」密碼子對偏好係藉由對根據下式之所有密碼子對評分取平均值來計算：
Figure 02_image005
因此，整個編碼區之密碼子對偏好係藉由將包含該區之所有個別密碼子對評分相加且將此總和除以編碼序列之長度來計算。 計算密碼子對偏好，實施改變密碼子對偏好之演算法。
開發演算法以量化密碼子對偏好。向每個可能的個別密碼子對給與「密碼子對評分」或「CPS」。CPS定義為在所有人類編碼區上相對於各密碼子對之預期出現次數所觀測到之比率的自然對數，其中人類表示待重新編碼之本發明之疫苗病毒的宿主物種。
Figure 02_image007
儘管所觀測到之特定密碼子對之出現的計算為簡單的(基因集內之實際計數)，但密碼子對之預期出現次數需要額外計算。吾等計算此預期次數以與胺基酸頻率及密碼子偏好之兩者無關，類似於Gutman及Hatfield。亦即，預期頻率係基於胺基酸由特定密碼子編碼之次數的相對比例來計算。正CPS值表示給定密碼子對在統計學上過表現，且負CPS指示該對在人類基因體中在統計學上低表現。
使用此等計算之CPS，藉由對密碼子對評分取平均值，接著可將任何編碼區評定為使用過表現或低表現之密碼子對，因此為整個基因提供密碼子對偏好(CPB)。
Figure 02_image009
已使用所展示及繪製之等式計算所有標註人類基因之CPB。圖示中之各點對應於單一人類基因之CPB。分佈峰具有0.07之正密碼子對偏好，其為所有標註人類基因之平均評分。此外，存在極少具有負密碼子對偏好之基因。接著定義及計算CPB而確立之等式用於操控此偏好。 用於減少密碼子對偏好之演算法。
可藉助於或可不藉助於電腦，使用例如梯度下降或模擬退火或其他最小化常式來進行蛋白質編碼序列之重新編碼。重排存在於起始序列中之密碼子之程序的實例可由以下步驟表示： 1)獲得野生型病毒基因體序列。 2)選擇靶向減毒設計之蛋白質編碼序列。 3)用非編碼功能鎖定已知或推測之DNA區段。 4)為重新設計之蛋白質中之其餘胺基酸選擇所需密碼子分佈。 5)對至少兩個同義解鎖密碼子位置進行隨機混洗且計算密碼子對評分。 6)視情況採用模擬退火程序進一步降低(或增加)密碼子對評分。 7)檢查所得設計是否存在過度二級結構及非所需限制位點： ●  若是-＞轉至步驟(5)或藉由用野生型序列置換有問題的區域來校正設計且轉至步驟(8)。 8)合成DNA序列對應於病毒設計。 9)創建病毒構築體且評定病毒表型： ●  若過於減毒，則製備次純系構築體且轉至9； ●  若減毒不充分，則轉至2。
藉由減少密碼子對偏好來對病毒之減毒揭示於WO 2008/121992及WO 2011/044561中，其如同完全闡述一般以引用之方式併入。
獲得嵌入於野生型SARS-CoV-2基因體序列(或其引起COVID-19之野生型序列之突變形式)中之全長SARS-CoV-2基因體序列或密碼子對去優化序列之方法可包括例如構築感染性cDNA純系，使用BAC載體，使用重疊延伸PCR策略或基於長PCR之融合策略。 經重新編碼之聚核苷酸
本發明之各種實施例提供一種編碼親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段的聚核苷酸，其中聚核苷酸相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸經重新編碼，且其中由聚核苷酸編碼的親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段之胺基酸序列保持相同。在各種實施例中，由聚核苷酸編碼的親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段之胺基酸序列在親本SARS-CoV-2變體序列之核酸序列之polyA尾之前保持相同。
本發明之各種實施例提供一種編碼親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段的聚核苷酸，其中聚核苷酸相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸經重新編碼，且其中由聚核苷酸編碼的親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段之胺基酸序列包含至多20個胺基酸取代、添加或缺失。在各種實施例中，由聚核苷酸編碼的親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段之胺基酸序列包含至多20個在親本SARS-CoV-2變體序列之核酸序列之polyA尾之前的胺基酸取代、添加或缺失。
本發明之各種實施例提供一種編碼親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段的聚核苷酸，其中聚核苷酸相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸經重新編碼，且其中由聚核苷酸編碼的親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段之胺基酸序列包含至多10個胺基酸取代、添加或缺失。在各種實施例中，由聚核苷酸編碼的親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段之胺基酸序列包含至多10個在親本SARS-CoV-2變體序列之核酸序列之polyA尾之前的胺基酸取代、添加或缺失。
本發明之各種實施例提供一種編碼親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段的聚核苷酸，其中聚核苷酸相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸經重新編碼，且其中由聚核苷酸編碼的親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段之胺基酸序列包含至多12個胺基酸取代、添加或缺失。在各種實施例中，由聚核苷酸編碼的親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段之胺基酸序列包含至多12個在親本SARS-CoV-2變體序列之核酸序列之polyA尾之前的胺基酸取代、添加或缺失。
在各種實施例中，胺基酸序列包含至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代、添加或缺失。在各種實施例中，胺基酸序列包含1-5、6-10、11-15或16-20個胺基酸取代、添加或缺失。在各種實施例中，胺基酸缺失、取代或添加係由在親本SARS-CoV-2變體序列之核酸序列之polyA尾之前的核酸缺失、取代或添加產生。
在各種實施例中，胺基酸序列包含12個胺基酸缺失。在各種實施例中，胺基酸序列包含1-5、6-10、11-15或16-20個胺基酸缺失。在各種實施例中，胺基酸取代、添加或缺失可歸因於經重新編碼之序列中之一或多個點突變。在各種實施例中，胺基酸缺失、取代或添加係由在親本SARS-CoV-2變體序列之核酸序列之polyA尾之前的核酸缺失、取代或添加產生。
因此，在各種實施例中，對於此等經重新編碼之聚核苷酸(具有或不具有核酸缺失、取代或添加)，經重新編碼之聚核苷酸針對polyA尾可具有不同長度；例如在3'端上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54個連續腺嘌呤；或例如在3'端上1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48或49-54個連續腺嘌呤；或例如在3'端上9-37、12-34、15-33、18-30或21-27個連續腺嘌呤；或例如在3'端上19-25個連續腺嘌呤。
在各種實施例中，該聚核苷酸係藉由相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸減少密碼子對偏好(CPB)來重新編碼。在各種實施例中，該聚核苷酸係藉由相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸減少密碼子使用偏好來重新編碼。在各種實施例中，該聚核苷酸係藉由相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸增加CPG或UpA二核苷酸之數目來重新編碼。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白或其片段具有小於-0.05、小於−0.1、小於−0.2、小於−0.3或小於−0.4之密碼子對偏好。
在某些實施例中，經重新編碼之棘蛋白或其片段具有小於−0.05、或小於−0.06、或小於−0.07、或小於−0.08、或小於−0.09、或小於−0.1、或小於−0.11、或小於−0.12、或小於−0.13、或小於−0.14、或小於−0.15、或小於−0.16、或小於−0.17、或小於−0.18、或小於−0.19、或小於−0.2、或小於−0.25、或小於−0.3、或小於−0.35、或小於−0.4、或小於−0.45、或小於−0.5之密碼子對偏好。
在某些實施例中，相較於親本序列上之對應序列，經重新編碼之棘蛋白或其片段減少了至少0.05、或至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5。在某些實施例中，比較自其中待進行計算之親本序列上之對應序列；例如，變體病毒之對應序列。
在各種實施例中，親本SARS-CoV-2冠狀病毒為SARS-CoV-2變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為英國變體。在一些實施例中，SARS-CoV-2變體為南非變體。在一些實施例中，SARS-CoV-2變體為巴西變體。在一些實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在一些實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在一些實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體子譜系BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4或BA.5。在一些實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體子譜系BA.4。在一些實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體子譜系BA.5。
英國變體之實例包括但不限於GenBank寄存編號MW462650 (SARS-CoV-2/human/USA/MN-MDH-2252/2020)、MW463056 (SARS-CoV-2/human/USA/FL-BPHL-2270/2020)及MW440433 (SARS-CoV-2/human/USA/NY-Wadsworth-291673-01/2020)，全部截至2021年1月19日，如同以其全文完全闡述而全部以引用之方式併入本文中。英國變體之額外實例包括但不限於GISAID ID第EPI_ISL_778842號(hCoV-19/USA/TX-CDC-9KXP-8438/2020；2020-12-28)、第EPI_ISL_802609號(hCoV-19/USA/CA-CDC-STM-050/2020；2020-12-28)、第EPI_ISL_802647號(hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-043/2020；2020-12-26)、第EPI_ISL_832014號(hCoV-19/USA/UT-UPHL-2101178518/2020；2020-12-31)、第EPI_ISL_850618號(hCoV-19/USA/IN-CDC-STM-183/2020；2020-12-31)及第EPI_ISL_850960號(hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-A100002/2021；2021-01-04)，全部截至2021年1月20日，且如同以其全文完全闡述而全部以引用之方式併入本文中。英國變體之額外實例包括但不限於GISAID ID第EPI_ISL_778842號(hCoV-19/USA/TX-CDC-9KXP-8438/2020；2020-12-28)、第EPI_ISL_802609號(hCoV-19/USA/CA-CDC-STM-050/2020；2020-12-28)、第EPI_ISL_802647號(hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-043/2020；2020-12-26)、第EPI_ISL_832014號(hCoV-19/USA/UT-UPHL-2101178518/2020；2020-12-31)、第EPI_ISL_850618號(hCoV-19/USA/IN-CDC-STM-183/2020；2020-12-31)及第EPI_ISL_850960號(hCoV-19/USA/FL-CDC-STM-A100002/2021；2021-01-04)，全部截至2021年1月20日；以及第EPI_ISL_581117號、第EPI_ISL_596982號、第EPI_ISL_599956號、第EPI_ISL_600093號、第EPI_ISL_606375號、第EPI_ISL_606415號、第EPI_ISL_606424號、第EPI_ISL_608363號及第EPI_ISL_608430號，全部截至2021年6月28日，且如同以其全文完全闡述而全部以引用之方式併入本文中。
南非變體之實例包括但不限於GISAID ID第EPI_ISL_766709號(hCoV-19/Sweden/20-13194/2020；2020-12-24)、第EPI_ISL_768828號(hCoV-19/France/PAC-NRC2933/2020；2020-12-22)、第EPI_ISL_770441號(hCoV-19/England/205280030/2020；2020-12-24)及第EPI_ISL_819798號(hCoV-19/England/OXON-F440A7/2020；2020-12-18)，全部截至2021年1月20日，且如同以其全文完全闡述而全部以引用之方式併入本文中。額外實例包括但不限於hCoV-19/Sweden/20-13194/2020 (EPI_ISL_766709)、hCoV-19/England/205280030/2020 (EPI_ISL_770441)、hCoV-19/France/PAC-NRC2933/2020 (EPI_ISL_768828)、hCoV-19/South Korea/KDCA0463/2020 (EPI_ISL_762992)、hCoV-19/Japan/IC-0433/2020 (EPI_ISL_768642)、hCoV-19/Australia/NSW3876/2021 (EPI_ISL_775242)、hCoV-19/Australia/NSW3872/2021 (EPI_ISL_775245)、hCoV-19/France/PAC-NRC2929/2020 (EPI_ISL_768827)、hCoV-19/England/205300109/2020 (EPI_ISL_770467)、hCoV-19/England/205320747/2020 (EPI_ISL_770469)、hCoV-19/England/205261884/2020 (EPI_ISL_770438)、hCoV-19/England/205260233/2020 (EPI_ISL_770437)、hCoV-19/England/ALDP-C8FEC7/2020 (EPI_ISL_777292)、hCoV-19/England/205221138/2020 (EPI_ISL_766245)、hCoV-19/England/205300065/2020 (EPI_ISL_770463)、hCoV-19/Botswana/1217-IN1699/2020 (EPI_ISL_770472)、hCoV-19/Botswana/1217-IN1660/2020 (EPI_ISL_770471)、hCoV-19/England/ALDP-C8E7FA/2020 (EPI_ISL_777266)、hCoV-19/England/MILK-C90388/2020 (EPI_ISL_777229)、hCoV-19/Botswana/CV1615722/2020 (EPI_ISL_770474)、hCoV-19/Botswana/CV1605828/2020 (EPI_ISL_770473)、hCoV-19/Scotland/EDB11343/2020 (EPI_ISL_764279)、hCoV-19/Scotland/EDB11342/2020 (EPI_ISL_764278)、hCoV-19/England/ALDP-C690AF/2020 (EPI_ISL_777190)、hCoV-19/Botswana/1223-IN1490/2020 (EPI_ISL_770475)、hCoV-19/England/MILK-CA9C09/2020 (EPI_ISL_762362)、hCoV-19/England/ALDP-CB4807/2020 (EPI_ISL_761052)、hCoV-19/England/205300064/2020 (EPI_ISL_770462)、hCoV-19/England/MILK-CA9BB1/2020 (EPI_ISL_762499)、hCoV-19/England/MILK-CAE2B7/2020 (EPI_ISL_761059)、hCoV-19/England/205390867/2021 (EPI_ISL_768815)、hCoV-19/Botswana/1224-IN462/2020| (EPI_ISL_770470)、hCoV-19/England/205280028/2020 (EPI_ISL_770439)及hCoV-19/England/205280029/2020 (EPI_ISL_770440)，全部截至2021年6月28日，且如同以其全文完全闡述而全部以引用之方式併入本文中。
巴西變體之實例包括但不限於GISAID ID第EPI_ISL_677212號(hCoV-19/USA/VA-DCLS-2187/2020；2020-11-12)、第EPI_ISL_723494號(hCoV-19/USA/VA-DCLS-2191/2020；2020-11-12)、第EPI_ISL_845768號(hCoV-19/USA/GA-EHC-458R/2021；2021-01-05)、第EPI_ISL_848196號(hCoV-19/Canada/LTRI-1192/2020；2020-12-24)及第EPI_ISL_848197號(hCoV-19/Canada/LTRI-1258/2020；2020-12-24)，全部截至2021年1月20日，且如同以其全文完全闡述而全部以引用的方式併入本文中。
德耳塔(B1.617.2)變體之實例包括但不限於GISAID ID第EPI_ISL_1653403號、第EPI_ISL_1697977號、第EPI_ISL_1718959號、第EPI_ISL_1719027號、第EPI_ISL_2121225號、第EPI_ISL_2121637號、第EPI_ISL_2121989號、第EPI_ISL_2122659號、第EPI_ISL_2125463號、第EPI_ISL_2126212號、第EPI_ISL_2126374號、第EPI_ISL_2127610號、第EPI_ISL_2127624號、第EPI_ISL_2127831號及第EPI_ISL_2131345號，全部截至2021年6月28日。
在各種實施例中，親本SARS-CoV-2變體為先前經修飾病毒核酸或先前減毒病毒核酸。
在各種實施例中，該聚核苷酸相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸經CPB去優化。在各種實施例中，該聚核苷酸相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸經密碼子使用去優化。
在各種實施例中，CPB去優化係基於人類中之CPB。在各種實施例中，CPB去優化係基於冠狀病毒中之CPB。在各種實施例中，CPB去優化係基於SARS-CoV-2冠狀病毒中之CPB。在各種實施例中，CPB去優化係基於野生型SARS-CoV-2冠狀病毒中之CPB。根據本文論述之各種實施例，野生型SARS-CoV-2冠狀病毒可為SARS-CoV-2變體冠狀病毒。
在各種實施例中，密碼子使用去優化係基於人類中頻繁使用之密碼子。在各種實施例中，密碼子使用去優化係基於冠狀病毒中頻繁使用之密碼子。在各種實施例中，密碼子使用去優化係基於SARS-CoV-2冠狀病毒中頻繁使用之密碼子。在各種實施例中，密碼子使用去優化係基於野生型SARS-CoV-2冠狀病毒中頻繁使用之密碼子或CPB。根據本文論述之各種實施例，野生型SARS-CoV-2冠狀病毒可為SARS-CoV-2變體冠狀病毒。
在各種實施例中，聚核苷酸包含經重新編碼之棘蛋白、棘蛋白之片段及其組合。在各種實施例中，聚核苷酸包含導致消除弗林蛋白酶裂解位點之棘蛋白中之胺基酸缺失的核苷酸缺失。雖然不希望受任何特定理論束縛，但本發明人咸信消除弗林蛋白酶裂解位點為疫苗及/或免疫組合物之安全性之驅動子中之一者。
在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換。
在各種實施例中，聚核苷酸包含其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換。
在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在一或多個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在兩個或更多個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多5個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多10個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多30個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多40個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多50個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多60個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多70個突變。在各種實施例中，SEQ ID NO:1中之突變不為阿爾法變體、貝塔變體、德耳塔變體、伽瑪變體或奧密克戎變體。
SEQ ID NO:1為與野生型WA -1序列相比之去優化序列(GenBank：MN985325.1，如同完全闡述，以引用之方式併入本文中)。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為阿爾法變體。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8，在SEQ ID NO:8中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9，在SEQ ID NO:9中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為伽瑪變體。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。
在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:12。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:12中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。 全長經重新編碼之序列
變體 經重新編碼之序列 SEQ ID NO:
貝塔 (P1) w/o polyA尾及弗林蛋白酶裂解位點 棘蛋白區域加粗 ATTAaaggtttataccttcccaggtaacaaaccaaccaactttcgatctcttgtagatctgttctctaaacgaactttaaaatctgtgtggctgtcactcggctgcatgcttagtgcactcacgcagtataattaataactaattactgtcgttgacaggacacgagtaactcgtctatcttctgcaggctgcttacggtttcgtccgtgttgcagccgatcatcagcacatctaggtttcgtccgggtgtgaccgaaaggtaagatggagagccttgtccctggtttcaacgagaaaacacacgtccaactcagtttgcctgttttacaggttcgcgacgtgctcgtacgtggctttggagactccgtggaggaggtcttatcagaggcacgtcaacatcttaaagatggcacttgtggcttagtagaagttgaaaaaggcgttttgcctcaacttgaacagccctatgtgttcatcaaacgttcggatgctcgaactgcacctcatggtcatgttatggttgagctggtagcagaactcgaaggcattcagtacggtcgtagtggtgagacacttggtgtccttgtccctcatgtgggcgaaataccagtggcttaccgcaaggttcttcttcgtaagaacggtaataaaggagctggtggccatagttacggcgccgatctaaagtcatttgacttaggcgacgagcttggcactgatccttatgaagattttcaagaaaactggaacactaaacatagcagtggtgttacccgtgaactcatgcgtgagcttaacggaggggcatacactcgctatgtcgataacaacttctgtggccctgatggctaccctcttgagtgcattaaagaccttctagcacgtgctggtaaagcttcatgcactttgtccgaacaactggactttattgacactaagaggggtgtatactgctgccgtgaacatgagcatgaaattgcttggtacacggaacgttctgaaaagagctatgaattgcagacaccttttgaaattaaattggcaaagaaatttgacaccttcaatggggaatgtccaaattttgtatttcccttaaattccataatcaagactattcaaccaagggttgaaaagaaaaagcttgatggctttatgggtagaattcgatctgtctatccagttgcgtcaccaaatgaatgcaaccaaatgtgcctttcaactctcatgaagtgtgatcattgtggtgaaacttcatggcagacgggcgattttgttaaagccacttgcgaattttgtggcactgagaatttgactaaagaaggtgccactacttgtggttacttaccccaaaatgctgttgttaaaatttattgtccagcatgtcacaattcagaagtaggacctgagcatagtcttgccgaataccataatgaatctggcttgaaaaccattcttcgtaagggtggtcgcactattgcctttggaggctgtgtgttctcttatgttggttgccataacaagtgtgcctattgggttccacgtgctagcgctaacataggttgtaaccatacaggtgttgttggagaaggttccgaaggtcttaatgacaaccttcttgaaatactccaaaaagagaaagtcaacatcaatattgttggtgactttaaacttaatgaagagatcgccattattttggcatctttttctgcttccacaagtgcttttgtggaaactgtgaaaggtttggattataaagcattcaaacaaattgttgaatcctgtggtaattttaaagttacaaaaggaaaagctaaaaaaggtgcctggaatattggtgaacagaaatcaatactgagtcctctttatgc 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德耳塔(P2) w/o polyA尾 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CoV 2-奧密克戎BA1-WWD FL基因體(w/o弗林蛋白酶裂解位點及poly(A)) 棘蛋白序列加粗。 ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTGGCTGTCACTCGGCTGCATGCTTAGTGCACTCACGCAGTATAATTAATAACTAATTACTGTCGTTGACAGGACACGAGTAACTCGTCTATCTTCTGCAGGCTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGCCGATCATCAGCACATCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGATGGAGAGCCTTGTCCCTGGTTTCAACGAGAAAACACACGTCCAACTCAGTTTGCCTGTTTTACAGGTTCGCGACGTGCTCGTACGTGGCTTTGGAGACTCCGTGGAGGAGGTCTTATCAGAGGCACGTCAACATCTTAAAGATGGCACTTGTGGCTTAGTAGAAGTTGAAAAAGGCGTTTTGCCTCAACTTGAACAGCCCTATGTGTTCATCAAACGTTCGGATGCTCGAACTGCACCTCATGGTCATGTTATGGTTGAGCTGGTAGCAGAACTCGAAGGCATTCAGTACGGTCGTAGTGGTGAGACACTTGGTGTCCTTGTCCCTCATGTGGGCGAAATACCAGTGGCTTACCGCAAGGTTCTTCTTCGTAAGAACGGTAATAAAGGAGCTGGTGGCCATAGTTACGGCGCCGATCTAAAGTCATTTGACTTAGGCGACGAGCTTGGCACTGATCCTTATGAAGATTTTCAAGAAAACTGGAACACTAAACATAGCAGTGGTGTTACCCGTGAACTCATGCGTGAGCTTAACGGAGGGGCATACACTCGCTATGTCGATAACAACTTCTGTGGCCCTGATGGCTACCCTCTTGAGTGCATTAAAGACCTTCTAGCACGTGCTGGTAAAGCTTCATGCACTTTGTCCGAACAACTGGACTTTATTGACACTAAGAGGGGTGTATACTGCTGCCGTGAACATGAGCATGAAATTGCTTGGTACACGGAACGTTCTGAAAAGAGCTATGAATTGCAGACACCTTTTGAAATTAAATTGGCAAAGAAATTTGACACCTTCAATGGGGAATGTCCAAATTTTGTATTTCCCTTAAATTCCATAATCAAGACTATTCAACCAAGGGTTGAAAAGAAAAAGCTTGATGGCTTTATGGGTAGAATTCGATCTGTCTATCCAGTTGCGTCACCAAATGAATGCAACCAAATGTGCCTTTCAACTCTCATGAAGTGTGATCATTGTGGTGAAACTTCATGGCAGACGGGCGATTTTGTTAAAGCCACTTGCGAATTTTGTGGCACTGAGAATTTGACTAAAGAAGGTGCCACTACTTGTGGTTACTTACCCCAAAATGCTGTTGTTAAAATTTATTGTCCAGCATGTCACAATTCAGAAGTAGGACCTGAGCATAGTCTTGCCGAATACCATAATGAATCTGGCTTGAAAACCATTCTTCGTAAGGGTGGTCGCACTATTGCCTTTGGAGGCTGTGTGTTCTCTTATGTTGGTTGCCATAACAAGTGTGCCTATTGGGTTCCACGTGCTAGCGCTAACATAGGTTGTAACCATACAGGTGTTGTTGGAGAAGGTTCCGAAGGTCTTAATGACAACCTTCTTGAAATACTCCAAAAAGAGAAAGTCAACATCAATATTGTTGGTGACTTTAAACTTAATGAAGAGATCGCCATTATTTTGGCATCTTTTTCTGCTTCCACAAGTGCTTTTGTGGAAACTGTGAAAGGTTTGGATTATAAAGCATTCAAACAAATTGTTGAATCCTGTGGTAATTTTAAAGTTACAAAAGGAAAAGCTAAAAAAGGTGCCTGGAATATTGGTGAACAGAAATCAATACTGAGTCCTCTTTATGCATTTGCATCAGAGGCTGCTCGTGTTGTACGATCAATTTTCTCCCGCACTCTTGAAACTGCTCAAAATTCTGTGCGTGTTTTACAGAAGGCCGCTATAACAATACTAGATGGAATTTCACAGTATTCACTGAGACTCATTGATGCTATGATGTTCACATCTGATTTGGCTACTAACAATCTAGTTGTAATGGCCTACATTACAGGTGGTGTTGTTCAGTTGACTTCGCAGTGGCTAACTAACATCTTTGGCACTGTTTATGAAAAACTCAAACCCGTCCTTGATTGGCTTGAAGAGAAGTTTAAGGAAGGTGTAGAGTTTCTTAGAGACGGTTGGGAAATTGTTAAATTTATCTCAACCTGTGCTTGTGAAATTGTCGGTGGACAAATTGTCACCTGTGCAAAGGAAATTAAGGAGAGTGTTCAGACATTCTTTAAGCTTGTAAATAAATTTTTGGCTTTGTGTGCTGACTCTATCATTATTGGTGGAGCTAAACTTAAAGCCTTGAATTTAGGTGAAACATTTGTCACGCACTCAAAGGGATTGTACAGAAAGTGTGTTAAATCCAGAGAAGAAACTGGCCTACTCATGCCTCTAAAAGCCCCAAAAGAAATTATCTTCTTAGAGGGAGAAACACTTCCCACAGAAGTGTTAACAGAGGAAGTTGTCTTGAAAACTGGTGATTTACAACCATTAGAACAACCTACTAGTGAAGCTGTTGAAGCTCCATTGGTTGGTACACCAGTTTGTATTAACGGGCTTATGTTGCTCGAAATCAAAGACACAGAAAAGTACTGTGCCCTTGCACCTAATATGATGGTAACAAACAATACCTTCACACTCAAAGGCGGTGCACCAACAAAGGTTACTTTTGGTGATGACACTGTGATAGAAGTGCAAGGTTACAAGAGTGTGAATATCACTTTTGAACTTGATGAAAGGATTGATAAAGTACTTAATGAGAAGTGCTCTGCCTATACAGTTGAACTCGGTACAGAAGTAAATGAGTTCGCCTGTGTTGTGGCAGATGCTGTCATAAAAACTTTGCAACCAGTATCTGAATTACTTACACCACTGGGCATTGATTTAGATGAGTGGAGTATGGCTACATACTACTTATTTGATGAGTCTGGTGAGTTTATATTGGCTTCACATATGTATTGTTCTTTCTACCCTCCAGATGAGGATGAAGAAGAAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAGTTTGAGCCATCAACTCAATATGAGTATGGTACTGAAGATGATTACCAAGGTAAACCTTTGGAATTTGGTGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGTTGTTCAGACTATTGAAGTGAATAGTTTTAGTGGTTATTTAAAACTTACTGACAATGTATACATTAAAAATGCAGACATTGTGGAAGAAGCTAAAAAGGTAAAACCAACAGTGGTTGTTAATGCAGCCAATGTTTACCTTAAACATGGAGGAGGTGTTGCAGGAGCCTTAAATAAGGCTACTAACAATGCCATGCAAGTTGAATCTGATGATTACATAGCTACTAATGGACCACTTAAAGTGGGTGGTAGTTGTGTTTTAAGCGGACACAATCTTGCTAAACACTGTCTTCATGTTGTCGGCCCAAATGTTAACAAAGGTGAAGACATTCAACTTCTTAAGAGTGCTTATGAAAATTTTAATCAGCACGAAGTTCTACTTGCACCATTATTATCAGCTGGTATTTTTGGTGCTGACCCTATACATTCTTTAAGAGTTTGTGTAGATACTGTTCGCACAAATGTCTACTTAGCTGTCTTTGATAAAAATCTCTATGACAAACTTGTTTCAAGCTTTTTGGAAATGAAGAGTGAAAAGCAAGTTGAACAAAAGATCGCTGAGATTCCTAAAGAGGAAGTTAAGCCATTTATAACTGAAAGTAAACCTTCAGTTGAACAGAGAAAACAAGATGATAAGAAAATCAAAGCTTGTGTTGAAGAAGTTACAACAACTCTGGAAGAAACTAAGTTCCTCACAGAAAACTTGTTACTTTATATTGACATTAATGGCAATCTTCATCCAGATTCTGCCACTCTTGTTAGTGACATTGACATCACTTTCTTAAAGAAAGATGCTCCATATATAGTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGTTTTAACTGCTGTGGTTATACCTACTAAAAAGGCTGGTGGCACTACTGAAATGCTAGCGAAAGCTTTGAGAAAAGTGCCAACAGACAATTATATAACCACTTACCCGGGTCAGGGTTTAAATGGTTACACTGTAGAGGAGGCAAAGACAGTGCTTAAAAAGTGTAAAAGTGCCTTTTACATTCTACCATCTATTATCTCTAATGAGAAGCAAGAAATTCTTGGAACTGTTTCTTGGAATTTGCGAGAAATGCTTGCACATGCAGAAGAAACACGCAAATTAATGCCTGTCTGTGTGGAAACTAAAGCCATAGTTTCAACTATACAGCGTAAATATAAGGGTATTAAAATACAAGAGGGTGTGGTTGATTATGGTGCTAGATTTTACTTTTACACCAGTAAAACAACTGTAGCGTCACTTATCAACACACTTAACGATCTAAATGAAACTCTTGTTACAATGCCACTTGGCTATGTAACACATGGCTTAAATTTGGAAGAAGCTGCTCGGTATATGAGATCTCTCAAAGTGCCAGCTACAGTTTCTGTTTCTTCACCTGATGCTGTTACAGCGTATAATGGTTATCTTACTTCTTCTTCTAAAACACCTGAAGAACATTTTATTGAAACCATCTCACTTGCTGGTTCCTATAAAGATTGGTCCTATTCTGGACAATCTACACAACTAGGTATAGAATTTCTTAAGAGAGGTGATAAAAGTGTATATTACACTAGTAATCCTACCACATTCCACCTAGATGGTGAAGTTATCACCTTTGACAATCTTAAGACACTTCTTTCTTTGAGAGAAGTGAGGACTATTAAGGTGTTTACAACAGTAGACAACATTAACC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CoV 2-奧密克戎BA2-WWD FL基因體(w/o弗林蛋白酶裂解位點及poly(A)) 棘蛋白序列加粗 ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTGGCTGTCACTCGGCTGCATGCTTAGTGCACTCACGCAGTATAATTAATAACTAATTACTGTCGTTGACAGGACACGAGTAACTCGTCTATCTTCTGCAGGCTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGCCGATCATCAGCACATCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGATGGAGAGCCTTGTCCCTGGTTTCAACGAGAAAACACACGTCCAACTCAGTTTGCCTGTTTTACAGGTTCGCGACGTGCTCGTACGTGGCTTTGGAGACTCCGTGGAGGAGGTCTTATCAGAGGCACGTCAACATCTTAAAGATGGCACTTGTGGCTTAGTAGAAGTTGAAAAAGGCGTTTTGCCTCAACTTGAACAGCCCTATGTGTTCATCAAACGTTCGGATGCTCGAACTGCACCTCATGGTCATGTTATGGTTGAGCTGGTAGCAGAACTCGAAGGCATTCAGTACGGTCGTAGTGGTGAGACACTTGGTGTCCTTGTCCCTCATGTGGGCGAAATACCAGTGGCTTACCGCAAGGTTCTTCTTCGTAAGAACGGTAATAAAGGAGCTGGTGGCCATAGTTACGGCGCCGATCTAAAGTCATTTGACTTAGGCGACGAGCTTGGCACTGATCCTTATGAAGATTTTCAAGAAAACTGGAACACTAAACATAGCAGTGGTGTTACCCGTGAACTCATGCGTGAGCTTAACGGAGGGGCATACACTCGCTATGTCGATAACAACTTCTGTGGCCCTGATGGCTACCCTCTTGAGTGCATTAAAGACCTTCTAGCACGTGCTGGTAAAGCTTCATGCACTTTGTCCGAACAACTGGACTTTATTGACACTAAGAGGGGTGTATACTGCTGCCGTGAACATGAGCATGAAATTGCTTGGTACACGGAACGTTCTGAAAAGAGCTATGAATTGCAGACACCTTTTGAAATTAAATTGGCAAAGAAATTTGACACCTTCAATGGGGAATGTCCAAATTTTGTATTTCCCTTAAATTCCATAATCAAGACTATTCAACCAAGGGTTGAAAAGAAAAAGCTTGATGGCTTTATGGGTAGAATTCGATCTGTCTATCCAGTTGCGTCACCAAATGAATGCAACCAAATGTGCCTTTCAACTCTCATGAAGTGTGATCATTGTGGTGAAACTTCATGGCAGACGGGCGATTTTGTTAAAGCCACTTGCGAATTTTGTGGCACTGAGAATTTGACTAAAGAAGGTGCCACTACTTGTGGTTACTTACCCCAAAATGCTGTTGTTAAAATTTATTGTCCAGCATGTCACAATTCAGAAGTAGGACCTGAGCATAGTCTTGCCGAATACCATAATGAATCTGGCTTGAAAACCATTCTTCGTAAGGGTGGTCGCACTATTGCCTTTGGAGGCTGTGTGTTCTCTTATGTTGGTTGCCATAACAAGTGTGCCTATTGGGTTCCACGTGCTAGCGCTAACATAGGTTGTAACCATACAGGTGTTGTTGGAGAAGGTTCCGAAGGTCTTAATGACAACCTTCTTGAAATACTCCAAAAAGAGAAAGTCAACATCAATATTGTTGGTGACTTTAAACTTAATGAAGAGATCGCCATTATTTTGGCATCTTTTTCTGCTTCCACAAGTGCTTTTGTGGAAACTGTGAAAGGTTTGGATTATAAAGCATTCAAACAAATTGTTGAATCCTGTGGTAATTTTAAAGTTACAAAAGGAAAAGCTAAAAAAGGTGCCTGGAATATTGGTGAACAGAAATCAATACTGAGTCCTCTTTATGCATTTGCATCAGAGGCTGCTCGTGTTGTACGATCAATTTTCTCCCGCACTCTTGAAACTGCTCAAAATTCTGTGCGTGTTTTACAGAAGGCCGCTATAACAATACTAGATGGAATTTCACAGTATTCACTGAGACTCATTGATGCTATGATGTTCACATCTGATTTGGCTACTAACAATCTAGTTGTAATGGCCTACATTACAGGTGGTGTTGTTCAGTTGACTTCGCAGTGGCTAACTAACATCTTTGGCACTGTTTATGAAAAACTCAAACCCGTCCTTGATTGGCTTGAAGAGAAGTTTAAGGAAGGTGTAGAGTTTCTTAGAGACGGTTGGGAAATTGTTAAATTTATCTCAACCTGTGCTTGTGAAATTGTCGGTGGACAAATTGTCACCTGTGCAAAGGAAATTAAGGAGAGTGTTCAGACATTCTTTAAGCTTGTAAATAAATTTTTGGCTTTGTGTGCTGACTCTATCATTATTGGTGGAGCTAAACTTAAAGCCTTGAATTTAGGTGAAACATTTGTCACGCACTCAAAGGGATTGTACAGAAAGTGTGTTAAATCCAGAGAAGAAACTGGCCTACTCATGCCTCTAAAAGCCCCAAAAGAAATTATCTTCTTAGAGGGAGAAACACTTCCCACAGAAGTGTTAACAGAGGAAGTTGTCTTGAAAACTGGTGATTTACAACCATTAGAACAACCTACTAGTGAAGCTGTTGAAGCTCCATTGGTTGGTACACCAGTTTGTATTAACGGGCTTATGTTGCTCGAAATCAAAGACACAGAAAAGTACTGTGCCCTTGCACCTAATATGATGGTAACAAACAATACCTTCACACTCAAAGGCGGTGCACCAACAAAGGTTACTTTTGGTGATGACACTGTGATAGAAGTGCAAGGTTACAAGAGTGTGAATATCACTTTTGAACTTGATGAAAGGATTGATAAAGTACTTAATGAGAAGTGCTCTGCCTATACAGTTGAACTCGGTACAGAAGTAAATGAGTTCGCCTGTGTTGTGGCAGATGCTGTCATAAAAACTTTGCAACCAGTATCTGAATTACTTACACCACTGGGCATTGATTTAGATGAGTGGAGTATGGCTACATACTACTTATTTGATGAGTCTGGTGAGTTTATATTGGCTTCACATATGTATTGTTCTTTCTACCCTCCAGATGAGGATGAAGAAGAAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAGTTTGAGCCATCAACTCAATATGAGTATGGTACTGAAGATGATTACCAAGGTAAACCTTTGGAATTTGGTGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGTTGTTCAGACTATTGAAGTGAATAGTTTTAGTGGTTATTTAAAACTTACTGACAATGTATACATTAAAAATGCAGACATTGTGGAAGAAGCTAAAAAGGTAAAACCAACAGTGGTTGTTAATGCAGCCAATGTTTACCTTAAACATGGAGGAGGTGTTGCAGGAGCCTTAAATAAGGCTACTAACAATGCCATGCAAGTTGAATCTGATGATTACATAGCTACTAATGGACCACTTAAAGTGGGTGGTAGTTGTGTTTTAAGCGGACACAATCTTGCTAAACACTGTCTTCATGTTGTCGGCCCAAATGTTAACAAAGGTGAAGACATTCAACTTCTTAAGAGTGCTTATGAAAATTTTAATCAGCACGAAGTTCTACTTGCACCATTATTATCAGCTGGTATTTTTGGTGCTGACCCTATACATTCTTTAAGAGTTTGTGTAGATACTGTTCGCACAAATGTCTACTTAGCTGTCTTTGATAAAAATCTCTATGACAAACTTGTTTCAAGCTTTTTGGAAATGAAGAGTGAAAAGCAAGTTGAACAAAAGATCGCTGAGATTCCTAAAGAGGAAGTTAAGCCATTTATAACTGAAAGTAAACCTTCAGTTGAACAGAGAAAACAAGATGATAAGAAAATCAAAGCTTGTGTTGAAGAAGTTACAACAACTCTGGAAGAAACTAAGTTCCTCACAGAAAACTTGTTACTTTATATTGACATTAATGGCAATCTTCATCCAGATTCTGCCACTCTTGTTAGTGACATTGACATCACTTTCTTAAAGAAAGATGCTCCATATATAGTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGTTTTAACTGCTGTGGTTATACCTACTAAAAAGGCTGGTGGCACTACTGAAATGCTAGCGAAAGCTTTGAGAAAAGTGCCAACAGACAATTATATAACCACTTACCCGGGTCAGGGTTTAAATGGTTACACTGTAGAGGAGGCAAAGACAGTGCTTAAAAAGTGTAAAAGTGCCTTTTACATTCTACCATCTATTATCTCTAATGAGAAGCAAGAAATTCTTGGAACTGTTTCTTGGAATTTGCGAGAAATGCTTGCACATGCAGAAGAAACACGCAAATTAATGCCTGTCTGTGTGGAAACTAAAGCCATAGTTTCAACTATACAGCGTAAATATAAGGGTATTAAAATACAAGAGGGTGTGGTTGATTATGGTGCTAGATTTTACTTTTACACCAGTAAAACAACTGTAGCGTCACTTATCAACACACTTAACGATCTAAATGAAACTCTTGTTACAATGCCACTTGGCTATGTAACACATGGCTTAAATTTGGAAGAAGCTGCTCGGTATATGAGATCTCTCAAAGTGCCAGCTACAGTTTCTGTTTCTTCACCTGATGCTGTTACAGCGTATAATGGTTATCTTACTTCTTCTTCTAAAACACCTGAAGAACATTTTATTGAAACCATCTCACTTGCTGGTTCCTATAAAGATTGGTCCTATTCTGGACAATCTACACAACTAGGTATAGAATTTCTTAAGAGAGGTGATAAAAGTGTATATTACACTAGTAATCCTACCACATTCCACCTAGATGGTGAAGTTATCACCTTTGACAATCTTAAGACACTTCTTTCTTTGAGAGAAGTGAGGACTATTAAGGTGTTTACAACAGTAGACAACATTAACC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CoV 2-奧密克戎BA4/5-WWD FL基因體(w/o弗林蛋白酶裂解位點及poly(A)) 棘蛋白序列加粗。 ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTGGCTGTCACTCGGCTGCATGCTTAGTGCACTCACGCAGTATAATTAATAACTAATTACTGTCGTTGACAGGACACGAGTAACTCGTCTATCTTCTGCAGGCTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGCCGATCATCAGCACATCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGATGGAGAGCCTTGTCCCTGGTTTCAACGAGAAAACACACGTCCAACTCAGTTTGCCTGTTTTACAGGTTCGCGACGTGCTCGTACGTGGCTTTGGAGACTCCGTGGAGGAGGTCTTATCAGAGGCACGTCAACATCTTAAAGATGGCACTTGTGGCTTAGTAGAAGTTGAAAAAGGCGTTTTGCCTCAACTTGAACAGCCCTATGTGTTCATCAAACGTTCGGATGCTCGAACTGCACCTCATGGTCATGTTATGGTTGAGCTGGTAGCAGAACTCGAAGGCATTCAGTACGGTCGTAGTGGTGAGACACTTGGTGTCCTTGTCCCTCATGTGGGCGAAATACCAGTGGCTTACCGCAAGGTTCTTCTTCGTAAGAACGGTAATAAAGGAGCTGGTGGCCATAGTTACGGCGCCGATCTAAAGTCATTTGACTTAGGCGACGAGCTTGGCACTGATCCTTATGAAGATTTTCAAGAAAACTGGAACACTAAACATAGCAGTGGTGTTACCCGTGAACTCATGCGTGAGCTTAACGGAGGGGCATACACTCGCTATGTCGATAACAACTTCTGTGGCCCTGATGGCTACCCTCTTGAGTGCATTAAAGACCTTCTAGCACGTGCTGGTAAAGCTTCATGCACTTTGTCCGAACAACTGGACTTTATTGACACTAAGAGGGGTGTATACTGCTGCCGTGAACATGAGCATGAAATTGCTTGGTACACGGAACGTTCTGAAAAGAGCTATGAATTGCAGACACCTTTTGAAATTAAATTGGCAAAGAAATTTGACACCTTCAATGGGGAATGTCCAAATTTTGTATTTCCCTTAAATTCCATAATCAAGACTATTCAACCAAGGGTTGAAAAGAAAAAGCTTGATGGCTTTATGGGTAGAATTCGATCTGTCTATCCAGTTGCGTCACCAAATGAATGCAACCAAATGTGCCTTTCAACTCTCATGAAGTGTGATCATTGTGGTGAAACTTCATGGCAGACGGGCGATTTTGTTAAAGCCACTTGCGAATTTTGTGGCACTGAGAATTTGACTAAAGAAGGTGCCACTACTTGTGGTTACTTACCCCAAAATGCTGTTGTTAAAATTTATTGTCCAGCATGTCACAATTCAGAAGTAGGACCTGAGCATAGTCTTGCCGAATACCATAATGAATCTGGCTTGAAAACCATTCTTCGTAAGGGTGGTCGCACTATTGCCTTTGGAGGCTGTGTGTTCTCTTATGTTGGTTGCCATAACAAGTGTGCCTATTGGGTTCCACGTGCTAGCGCTAACATAGGTTGTAACCATACAGGTGTTGTTGGAGAAGGTTCCGAAGGTCTTAATGACAACCTTCTTGAAATACTCCAAAAAGAGAAAGTCAACATCAATATTGTTGGTGACTTTAAACTTAATGAAGAGATCGCCATTATTTTGGCATCTTTTTCTGCTTCCACAAGTGCTTTTGTGGAAACTGTGAAAGGTTTGGATTATAAAGCATTCAAACAAATTGTTGAATCCTGTGGTAATTTTAAAGTTACAAAAGGAAAAGCTAAAAAAGGTGCCTGGAATATTGGTGAACAGAAATCAATACTGAGTCCTCTTTATGCATTTGCATCAGAGGCTGCTCGTGTTGTACGATCAATTTTCTCCCGCACTCTTGAAACTGCTCAAAATTCTGTGCGTGTTTTACAGAAGGCCGCTATAACAATACTAGATGGAATTTCACAGTATTCACTGAGACTCATTGATGCTATGATGTTCACATCTGATTTGGCTACTAACAATCTAGTTGTAATGGCCTACATTACAGGTGGTGTTGTTCAGTTGACTTCGCAGTGGCTAACTAACATCTTTGGCACTGTTTATGAAAAACTCAAACCCGTCCTTGATTGGCTTGAAGAGAAGTTTAAGGAAGGTGTAGAGTTTCTTAGAGACGGTTGGGAAATTGTTAAATTTATCTCAACCTGTGCTTGTGAAATTGTCGGTGGACAAATTGTCACCTGTGCAAAGGAAATTAAGGAGAGTGTTCAGACATTCTTTAAGCTTGTAAATAAATTTTTGGCTTTGTGTGCTGACTCTATCATTATTGGTGGAGCTAAACTTAAAGCCTTGAATTTAGGTGAAACATTTGTCACGCACTCAAAGGGATTGTACAGAAAGTGTGTTAAATCCAGAGAAGAAACTGGCCTACTCATGCCTCTAAAAGCCCCAAAAGAAATTATCTTCTTAGAGGGAGAAACACTTCCCACAGAAGTGTTAACAGAGGAAGTTGTCTTGAAAACTGGTGATTTACAACCATTAGAACAACCTACTAGTGAAGCTGTTGAAGCTCCATTGGTTGGTACACCAGTTTGTATTAACGGGCTTATGTTGCTCGAAATCAAAGACACAGAAAAGTACTGTGCCCTTGCACCTAATATGATGGTAACAAACAATACCTTCACACTCAAAGGCGGTGCACCAACAAAGGTTACTTTTGGTGATGACACTGTGATAGAAGTGCAAGGTTACAAGAGTGTGAATATCACTTTTGAACTTGATGAAAGGATTGATAAAGTACTTAATGAGAAGTGCTCTGCCTATACAGTTGAACTCGGTACAGAAGTAAATGAGTTCGCCTGTGTTGTGGCAGATGCTGTCATAAAAACTTTGCAACCAGTATCTGAATTACTTACACCACTGGGCATTGATTTAGATGAGTGGAGTATGGCTACATACTACTTATTTGATGAGTCTGGTGAGTTTATATTGGCTTCACATATGTATTGTTCTTTCTACCCTCCAGATGAGGATGAAGAAGAAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAGTTTGAGCCATCAACTCAATATGAGTATGGTACTGAAGATGATTACCAAGGTAAACCTTTGGAATTTGGTGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGTTGTTCAGACTATTGAAGTGAATAGTTTTAGTGGTTATTTAAAACTTACTGACAATGTATACATTAAAAATGCAGACATTGTGGAAGAAGCTAAAAAGGTAAAACCAACAGTGGTTGTTAATGCAGCCAATGTTTACCTTAAACATGGAGGAGGTGTTGCAGGAGCCTTAAATAAGGCTACTAACAATGCCATGCAAGTTGAATCTGATGATTACATAGCTACTAATGGACCACTTAAAGTGGGTGGTAGTTGTGTTTTAAGCGGACACAATCTTGCTAAACACTGTCTTCATGTTGTCGGCCCAAATGTTAACAAAGGTGAAGACATTCAACTTCTTAAGAGTGCTTATGAAAATTTTAATCAGCACGAAGTTCTACTTGCACCATTATTATCAGCTGGTATTTTTGGTGCTGACCCTATACATTCTTTAAGAGTTTGTGTAGATACTGTTCGCACAAATGTCTACTTAGCTGTCTTTGATAAAAATCTCTATGACAAACTTGTTTCAAGCTTTTTGGAAATGAAGAGTGAAAAGCAAGTTGAACAAAAGATCGCTGAGATTCCTAAAGAGGAAGTTAAGCCATTTATAACTGAAAGTAAACCTTCAGTTGAACAGAGAAAACAAGATGATAAGAAAATCAAAGCTTGTGTTGAAGAAGTTACAACAACTCTGGAAGAAACTAAGTTCCTCACAGAAAACTTGTTACTTTATATTGACATTAATGGCAATCTTCATCCAGATTCTGCCACTCTTGTTAGTGACATTGACATCACTTTCTTAAAGAAAGATGCTCCATATATAGTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGTTTTAACTGCTGTGGTTATACCTACTAAAAAGGCTGGTGGCACTACTGAAATGCTAGCGAAAGCTTTGAGAAAAGTGCCAACAGACAATTATATAACCACTTACCCGGGTCAGGGTTTAAATGGTTACACTGTAGAGGAGGCAAAGACAGTGCTTAAAAAGTGTAAAAGTGCCTTTTACATTCTACCATCTATTATCTCTAATGAGAAGCAAGAAATTCTTGGAACTGTTTCTTGGAATTTGCGAGAAATGCTTGCACATGCAGAAGAAACACGCAAATTAATGCCTGTCTGTGTGGAAACTAAAGCCATAGTTTCAACTATACAGCGTAAATATAAGGGTATTAAAATACAAGAGGGTGTGGTTGATTATGGTGCTAGATTTTACTTTTACACCAGTAAAACAACTGTAGCGTCACTTATCAACACACTTAACGATCTAAATGAAACTCTTGTTACAATGCCACTTGGCTATGTAACACATGGCTTAAATTTGGAAGAAGCTGCTCGGTATATGAGATCTCTCAAAGTGCCAGCTACAGTTTCTGTTTCTTCACCTGATGCTGTTACAGCGTATAATGGTTATCTTACTTCTTCTTCTAAAACACCTGAAGAACATTTTATTGAAACCATCTCACTTGCTGGTTCCTATAAAGATTGGTCCTATTCTGGACAATCTACACAACTAGGTATAGAATTTCTTAAGAGAGGTGATAAAAGTGTATATTACACTAGTAATCCTACCACATTCCACCTAGATGGTGAAGTTATCACCTTTGACAATCTTAAGACACTTCTTTCTTTGAGAGAAGTGAGGACTATTAAGGTGTTTACAACAGTAGACAACATTAACC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12
在各種實施例中，聚核苷酸包含來自天然分離株之SARS-CoV-2變體序列，其中SARS-CoV-2變體序列中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為阿爾法變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為伽瑪變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體子譜系BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4或BA.5。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體子譜系BA.4或BA.5。此等變體之實例序列係如本文所提供。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:8之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:9之核苷酸21,563至25,342。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:3至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:4至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:5至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:6至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:7至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333至少98%或至少99%一致。
變體 經重新編碼之棘蛋白序列 SEQ ID NO:
阿爾法(英國) ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTtATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGaTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGgTGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCAtAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGAcCTCATTTGCGCTCAAAAATTTAACGGACTTACAGTTTTACCACCTTTACTTACTGACGAAATGATTGCGCAATATACATCCGCATTGTTAGCCGGAACTATTACATCCGGATGGACTTTTGGCGCAGGCGCAGCATTACAGATTCCATTCGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAACGGTATAGGCGTTACGCAAAACGTACTTTATGAGAATCAAAAACTTATCGCTAACCAATTTAATTCCGCTATCGGTAAGATTCAGGATTCATTGTCTAGTACTGCTAGTGCACTCGGTAAGTTGCAAGACGTAGTGAATCAAAACGCTCAAGCACTTAATACACTCGTTAAACAGCTTAGTTCTAATTTTGGCGCAATTTCTAGTGTGCTTAACGATATACTAgCAAGACTCGATAAAGTCGAAGCCGAAGTGCAAATCGATAGATTGATTACCGGTAGGTTGCAATCATTGCAAACATACGTTACACAGCAATTGATTAGGGCCGCAGAGATACGCGCTAGCGCTAATCTCGCAGCTACTAAAATGTCTGAATGCGTACTCGGACAATCTAAACGTGTCGATTTTTGCGGTAAGGGATATCATCTTATGTCTTTTCCACAATCTGCACCTCACGGAGTCGTGTTTTTACACGTTACTTATGTGCCAGCTCAAGAGAAAAATTTTACAACCGCTCCTGCTATTTGTCATGACGGTAAGGCACATTTTCCTAGAGAGGGCGTATTCGTTTCTAACGGTACACATTGGTTCGTTACACAACGTAATTTTTACGAACCTCAAATTATTACTACTcACAATACATTCGTATCAGGTAATTGTGACGTAGTGATAGGTATCGTTAATAATACAGTTTACGATCCACTTCAACCTGAACTCGATAGTTTTAAAGAGGAACTCGATAAGTATTTTAAAAATCATACATCACCTGACGTCGACTTAGGCGATATTTCAGGTATTAACGCTAGTGTCGTTAACATTCAAAAAGAGATTGATAGACTTAACGAAGTCGCTAAAAATCTTAACGAATCACTTATCGATCTGCAAGAGTTAGGTAAGTATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATATTTGGTTAGGCTTTATAGCCGGATTGATCGCAATCGTTATGGTTACAATTATGTTATGTTGTATGACATCATGTTGTTCATGTCTTAAGGGATGTTGTTCATGCGGATCATGTTGTAAATTTGACGAAGACGATTCCGAACCAGTGCTTAAAGGCGTTAAGTTACATTATACATAA 3
貝塔(南非) 參見序列表。 4
德耳塔(B.1.617.2) 參見序列表。 5
貝塔 ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATTTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGCTAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGGTCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAATATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTAAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTTATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGGTGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGTAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGATCTCATTTGCGCTCAAAAATTTAACGGACTTACAGTTTTACCACCTTTACTTACTGACGAAATGATTGCGCAATATACATCCGCATTGTTAGCCGGAACTATTACATCCGGATGGACTTTTGGCGCAGGCGTAGCATTACAGATTCCATTCGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAACGGTATAGGCGTTACGCAAAACGTACTTTATGAGAATCAAAAACTTATCGCTAACCAATTTAATTCCGCTATCGGTAAGATTCAGGATTCATTGTCTAGTACTGCTAGTGCACTCGGTAAGTTGCAAGACGTAGTGAATCAAAACGCTCAAGCACTTAATACACTCGTTAAACAGCTTAGTTCTAATTTTGGCGCAATTTCTAGTGTGCTTAACGATATACTATCTAGACTCGATAAAGTCGAAGCCGAAGTGCAAATCGATAGATTGATTACCGGTAGGTTGCAATCATTGCAAACATACGTTACACAGCAATTGATTAGGGCCGCAGAGATACGCGCTAGCGCTAATCTCGCAGCTACTAAAATGTCTGAATGCGTACTCGGACAATCTAAACGTGTCGATTTTTGCGGTAAGGGATATCATCTTATGTCTTTTCCACAATCTGCACCTCACGGAGTCGTGTTTTTACACGTTACTTATGTGCCAGCTCAAGAGAAAAATTTTACAACCGCTCCTGCTATTTGTCATGACGGTAAGGCACATTTTCCTAGAGAGGGCGTATTCGTTTCTAACGGTACACATTGGTTCGTTACACAACGTAATTTTTACGAACCTCAAATTATTACTACTGATAATACATTCGTATCAGGTAATTGTGACGTAGTGATAGGTATCGTTAATAATACAGTTTACGATCCACTTCAACCTGAACTCGATAGTTTTAAAGAGGAACTCGATAAGTATTTTAAAAATCATACATCACCTGACGTCGACTTAGGCGATATTTCAGGTATTAACGCTAGTGTCGTTAACATTCAAAAAGAGATTGATAGACTTAACGAAGTCGCTAAAAATCTTAACGAATCACTTATCGATCTGCAAGAGTTAGGTAAGTATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATATTTGGTTAGGCTTTATAGCCGGATTGATCGCAATCGTTATGGTTACAATTATGTTATGTTGTATGACATCATGTTGTTCATGTCTTAAGGGATGTTGTTCATGCGGATCATGTTGTAAATTTGACGAAGACGATTCCGAACCAGTGCTTAAAGGCGTTAAGTTACATTATACATAA 6
德耳塔 ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTAgAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGaTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCgGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCAaACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGgTGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGATCTCATTTGCGCTCAAAAATTTAACGGACTTACAGTTTTACCACCTTTACTTACTGACGAAATGATTGCGCAATATACATCCGCATTGTTAGCCGGAACTATTACATCCGGATGGACTTTTGGCGCAGGCGCAGCATTACAGATTCCATTCGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAACGGTATAGGCGTTACGCAAAACGTACTTTATGAGAATCAAAAACTTATCGCTAACCAATTTAATTCCGCTATCGGTAAGATTCAGGATTCATTGTCTAGTACTGCTAGTGCACTCGGTAAGTTGCAAaAtGTAGTGAATCAAAACGCTCAAGCACTTAATACACTCGTTAAACAGCTTAGTTCTAATTTTGGCGCAATTTCTAGTGTGCTTAACGATATACTATCTAGACTCGATAAAGTCGAAGCCGAAGTGCAAATCGATAGATTGATTACCGGTAGGTTGCAATCATTGCAAACATACGTTACACAGCAATTGATTAGGGCCGCAGAGATACGCGCTAGCGCTAATCTCGCAGCTACTAAAATGTCTGAATGCGTACTCGGACAATCTAAACGTGTCGATTTTTGCGGTAAGGGATATCATCTTATGTCTTTTCCACAATCTGCACCTCACGGAGTCGTGTTTTTACACGTTACTTATGTGCCAGCTCAAGAGAAAAATTTTACAACCGCTCCTGCTATTTGTCATGACGGTAAGGCACATTTTCCTAGAGAGGGCGTATTCGTTTCTAACGGTACACATTGGTTCGTTACACAACGTAATTTTTACGAACCTCAAATTATTACTACTGATAATACATTCGTATCAGGTAATTGTGACGTAGTGATAGGTATCGTTAATAATACAGTTTACGATCCACTTCAACCTGAACTCGATAGTTTTAAAGAGGAACTCGATAAGTATTTTAAAAATCATACATCACCTGACGTCGACTTAGGCGATATTTCAGGTATTAACGCTAGTGTCGTTAACATTCAAAAAGAGATTGATAGACTTAACGAAGTCGCTAAAAATCTTAACGAATCACTTATCGATCTGCAAGAGTTAGGTAAGTATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATATTTGGTTAGGCTTTATAGCCGGATTGATCGCAATCGTTATGGTTACAATTATGTTATGTTGTATGACATCATGTTGTTCATGTCTTAAGGGATGTTGTTCATGCGGATCATGTTGTAAATTTGACGAAGACGATTCCGAACCAGTGCTTAAAGGCGTTAAGTTACATTATACATAA 7
在各種實施例中，聚核苷酸進一步包含3'端上之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54個連續腺嘌呤。 載體、細胞、多肽
各種實施例提供一種包含本發明之聚核苷酸的載體。本發明之聚核苷酸為如本文所論述的經重新編碼之多肽。
各種實施例提供一種包含載體之細胞，該載體包含本發明之聚核苷酸。包含本發明之聚核苷酸的載體為如本文所論述之彼等載體。
各種實施例提供包含本發明之聚核苷酸的細菌人工染色體(BAC)。本發明之聚核苷酸為如本文所論述的經重新編碼之多肽。
各種實施例提供一種包含本發明之聚核苷酸的細胞。
各種實施例提供一種包含本發明之經修飾/去優化感染性SARS-CoV-2變體RNA的細胞。
在各種實施例中，細胞為Vero細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、MA104細胞、293T細胞、BSR-T7細胞、MRC-5細胞、CHO細胞或PER.C6細胞。在特定實施例中，細胞為Vero細胞或幼倉鼠腎(BHK)細胞。
各種實施例提供一種由本發明之聚核苷酸編碼的多肽。本發明之聚核苷酸為如本文所論述的經重新編碼之多肽。多肽展現與由來自天然分離株之SARS-CoV-2變體編碼之多肽不同的特性。舉例而言，由如本文所論述的經重新編碼之聚核苷酸及去優化聚核苷酸編碼的多肽可對病毒發揮減毒特性。 經修飾病毒
本發明之各種實施例提供一種經修飾SARS-CoV-2變體，其包含由本發明之聚核苷酸編碼的多肽。本發明之聚核苷酸為如本文所論述的經重新編碼之多肽。
本發明之各種實施例提供一種經修飾SARS-CoV-2變體，其包含本發明之聚核苷酸。本發明之聚核苷酸為本文所論述的經重新編碼之多肽中之任一者。
在各種實施例中，其病毒蛋白中之一或多者之表現相較於其親本SARS-CoV-2變體降低。
在各種實施例中，親本SARS-CoV-2冠狀病毒為SARS-CoV-2變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為英國變體、南非變體、巴西變體、德耳塔變體或奧密克戎變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體子譜系BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4或BA.5。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體子譜系BA.4或BA.5。
英國變體、南非變體、巴西變體、德耳塔變體及奧密克戎變體之實例包括但不限於本文中所論述之彼等。
在各種實施例中，親本SARS-CoV-2變體為先前經修飾病毒核酸或先前減毒病毒核酸。
在各種實施例中，其病毒蛋白中之一或多者之表現的降低係由於重新編碼棘蛋白而降低。
在各種實施例中，聚核苷酸編碼親本SARS-CoV-2變體之一或多種病毒蛋白或其一或多個片段，其中聚核苷酸相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸經重新編碼，且其中由聚核苷酸編碼的親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段之胺基酸序列保持相同。
在各種實施例中，聚核苷酸編碼親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段，其中聚核苷酸相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸經重新編碼，且其中由聚核苷酸編碼的親本SARS-CoV-2變體之棘蛋白或其片段之胺基酸序列包含至多15個胺基酸取代、添加或缺失。在各種實施例中，胺基酸序列包含至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸取代、添加或缺失。在各種實施例中，胺基酸序列包含12個胺基酸缺失。在各種實施例中，胺基酸序列包含1-3、4-6、7-9、10-12或13-15個胺基酸缺失。胺基酸取代、添加或缺失可歸因於經重新編碼之序列中之一或多個點突變。在各種實施例中，胺基酸缺失、取代或添加係由在親本SARS-CoV-2變體序列之核酸序列之polyA尾之前的核酸缺失、取代或添加產生。
在各種實施例中，聚核苷酸係藉由相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸減少密碼子對偏好(CPB)或減少密碼子使用偏好來重新編碼。
在各種實施例中，該聚核苷酸藉由相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸增加CPG或UpA二核苷酸之數目來重新編碼。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白或其片段中之各者具有小於-0.05、小於−0.1、小於−0.2、小於−0.3或小於−0.4之密碼子對偏好。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白或其片段中之各者具有小於−0.01、小於−0.02、小於−0.03或小於−0.04之密碼子對偏好。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白或其片段中之各者具有小於−0.05、或小於−0.06、或小於−0.07、或小於−0.08、或小於−0.09、或小於−0.1、或小於−0.11、或小於−0.12、或小於−0.13、或小於−0.14、或小於−0.15、或小於−0.16、或小於−0.17、或小於−0.18、或小於−0.19、或小於−0.2、或小於−0.25、或小於−0.3、或小於−0.35、或小於−0.4、或小於−0.45、或小於−0.5之密碼子對偏好。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白或其片段中之各者之密碼子對偏好減少了至少0.01、或至少0.02、或至少0.03、或至少0.04。在各種實施例中，相較於編碼棘蛋白或其片段之對應核酸，經重新編碼之棘蛋白或其片段中之各者之密碼子對偏好減少了至少0.05、或至少0.06、或至少0.07、或至少0.08、或至少0.09、或至少0.1、或至少0.11、或至少0.12、或至少0.13、或至少0.14、或至少0.15、或至少0.16、或至少0.17、或至少0.18、或至少0.19、或至少0.2、或至少0.25、或至少0.3、或至少0.35、或至少0.4、或至少0.45、或至少0.5。在某些實施例中，比較自其中待進行計算之對應序列；例如，SARS-CoV-2變體之棘蛋白編碼核酸之對應序列。
在各種實施例中，親本SARS-CoV-2冠狀病毒為SARS-CoV-2變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為英國變體、南非變體、巴西變體、德耳塔變體或奧密克戎變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體子譜系BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4或BA.5。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體子譜系BA.4或BA.5。
英國變體、南非變體、巴西變體、德耳塔變體及奧密克戎變體之實例包括但不限於本文中所論述之彼等。
在各種實施例中，親本SARS-CoV-2變體為先前經修飾病毒核酸或先前減毒病毒核酸。
在各種實施例中，該聚核苷酸相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸經CPB去優化。在各種實施例中，該聚核苷酸相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸經密碼子去優化。
在各種實施例中，CPB去優化係基於人類中之CPB。在各種實施例中，CPB去優化係基於冠狀病毒中之CPB。在各種實施例中，CPB去優化係基於SARS-CoV-2冠狀病毒中之CPB。在各種實施例中，CPB去優化係基於野生型SARS-CoV-2冠狀病毒中之CPB。根據本文論述之各種實施例，野生型SARS-CoV-2冠狀病毒可為SARS-CoV-2變體冠狀病毒。
在各種實施例中，密碼子使用去優化係基於人類中頻繁使用之密碼子。在各種實施例中，密碼子使用去優化係基於冠狀病毒中頻繁使用之密碼子。在各種實施例中，密碼子使用去優化係基於SARS-CoV-2冠狀病毒中頻繁使用之密碼子。在各種實施例中，密碼子使用去優化係基於野生型SARS-CoV-2冠狀病毒中頻繁使用之密碼子。在一些實施例中，根據本文論述之各種實施例，野生型SARS-CoV-2冠狀病毒可為SARS-CoV-2變體冠狀病毒。
在各種實施例中，聚核苷酸包含棘蛋白或其片段。在各種實施例中，聚核苷酸包含導致消除弗林蛋白酶裂解位點之棘蛋白中之胺基酸缺失的核苷酸缺失。雖然不希望受任何特定理論束縛，但本發明人咸信消除弗林蛋白酶裂解位點將為疫苗及/或免疫組合物之安全性的驅動子中之一者。
在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換。
在各種實施例中，聚核苷酸包含其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換。
在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在一或多個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在兩個或更多個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多5個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多10個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多30個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多40個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多50個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多60個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:1，其中SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換，且其中SEQ ID NO:1中存在至多70個突變。在各種實施例中，SEQ ID NO:1中之突變不為阿爾法變體、貝塔變體、德耳塔變體、伽瑪變體或奧密克戎變體。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為阿爾法變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為伽瑪變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體子譜系BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3、BA.4或BA.5。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體子譜系BA.4或BA.5。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8，在SEQ ID NO:8中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9，在SEQ ID NO:9中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:12。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:12中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，聚核苷酸包含來自天然分離株之SARS-CoV-2變體序列，其中SARS-CoV-2變體序列中之棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為阿爾法變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為伽瑪變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體子譜系。此等變體之實例序列係如本文所提供。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:8之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:9之核苷酸21,563至25,342。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:3至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:4至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:5至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:6至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:7至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333至少98%或至少99%一致。
在各種實施例中，聚核苷酸進一步包含3'端上之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54個連續腺嘌呤。
在各種實施例中，聚核苷酸編碼SEQ ID NO:2 (經重新編碼之棘蛋白)。在各種實施例中，聚核苷酸編碼具有至多10個突變之SEQ ID NO:2 (經重新編碼之棘蛋白)。
在各種實施例中，此等經修飾變體的具有至多10個突變的經重新編碼之棘蛋白編碼序列不為SEQ ID NO:1之棘蛋白編碼序列。在各種實施例中，此等經修飾變體的具有至多10個突變的經重新編碼之棘蛋白編碼序列不為其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G的SEQ ID NO:1中之棘蛋白編碼序列。 免疫及 / 或疫苗組合物
各種實施例提供一種用於誘導個體中之免疫反應的免疫組合物，其包含：本發明之經修飾SARS-CoV-2變體。經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8，在SEQ ID NO:8中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9，在SEQ ID NO:9中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:12。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:12中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2變體包含經重新編碼之棘蛋白。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:8之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:9之核苷酸21,563至25,342。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:3至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:4至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:5至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:6至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:7至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333至少98%或至少99%一致。
在各種實施例中，本發明之經修飾SARS-CoV-2變體為減毒活病毒。
各種實施例提供一種用於誘導個體中之保護性免疫反應的多價免疫組合物，其包含：兩種或更多種本發明之經修飾SARS-CoV-2變體。
各種實施例提供一種用於誘導個體中之保護性免疫反應的多價免疫組合物，其包含：經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒，其參考原始SARS-CoV2及一或多種本發明之經修飾SARS-CoV-2變體去優化。亦即，參考原始SARS-CoV-2冠狀病毒去優化之經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒不為經修飾SARS-CoV-2變體。各經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者。
參考原始SARS-CoV2去優化的經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒之實例係關於參考華盛頓分離株去優化之冠狀病毒。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸，其中具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸與經修飾SARS-CoV-2變體中之聚核苷酸不相同。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含由具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸編碼的多肽，其中由具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸編碼的多肽與經修飾SARS-CoV-2變體中之多肽不相同。
在一些實施例中，免疫組合物進一步包含如本文所描述之可接受賦形劑或載劑。在一些實施例中，免疫組合物進一步包含如本文所描述之穩定劑。在一些實施例中，免疫組合物進一步包含如本文所描述之佐劑。在一些實施例中，免疫組合物進一步包含蔗糖、甘胺酸或兩者。在各種實施例中，免疫組合物進一步包含約蔗糖(5%)及約甘胺酸(5%)。在各種實施例中，可接受之載劑或賦形劑係選自由以下組成之群：糖、胺基酸、界面活性劑及其組合。在各種實施例中，胺基酸之濃度為約5% w/v。適合胺基酸之非限制性實例包括精胺酸及組胺酸。適合載劑之非限制性實例包括明膠及人類血清白蛋白。適合界面活性劑之非限制性實例包括非離子界面活性劑，諸如呈0.01-0.05%之極低濃度的聚山梨醇酯80。
在各種實施例中，免疫組合物係以約10 3-10 7PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約10 4-10 6PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約10 3PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約10 4PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約10 5PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約10 6PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約10 7PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約10 8PFU之劑量提供。
在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 3PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 4PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 5PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 6PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 7PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 8PFU之劑量提供。
各種實施例提供一種用於誘導個體中之免疫反應的疫苗組合物，其包含：本發明之經修飾SARS-CoV-2變體。經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8，在SEQ ID NO:8中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9，在SEQ ID NO:9中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:12。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:12中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2變體包含經重新編碼之棘蛋白。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:8之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:9之核苷酸21,563至25,342。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:3至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:4至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:5至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:6至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:7至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333至少98%或至少99%一致。
在各種實施例中，本發明之經修飾SARS-CoV-2變體為減毒活病毒。
各種實施例提供一種用於誘導個體中之免疫反應的多價疫苗組合物，其包含：兩種或更多種本發明之經修飾SARS-CoV-2變體。
各種實施例提供一種用於誘導個體中之保護性免疫反應的多價疫苗組合物，其包含：經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒，其參考原始SARS-CoV2及一或多種本發明之經修飾SARS-CoV-2變體去優化。亦即，參考原始SARS-CoV2去優化之經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒不為經修飾SARS-CoV-2變體。各經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者。
參考原始SARS-CoV2去優化的經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒之實例係關於參考華盛頓分離株去優化之冠狀病毒。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸，其中具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸與經修飾SARS-CoV-2變體中之聚核苷酸不相同。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含由具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸編碼的多肽，其中由具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸編碼的多肽與經修飾SARS-CoV-2變體中之多肽不相同。
在一些實施例中，疫苗組合物進一步包含如本文所描述之可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，免疫組合物進一步包含如本文所描述之穩定劑。在一些實施例中，疫苗組合物進一步包含如本文所描述之佐劑。在一些實施例中，疫苗組合物進一步包含蔗糖、甘胺酸或兩者。在各種實施例中，疫苗組合物進一步包含蔗糖(5%)及甘胺酸(5%)。在各種實施例中，可接受之載劑或賦形劑係選自由以下組成之群：糖、胺基酸、界面活性劑及其組合。在各種實施例中，胺基酸之濃度為約5% w/v。適合胺基酸之非限制性實例包括精胺酸及組胺酸。適合載劑之非限制性實例包括明膠及人類血清白蛋白。適合界面活性劑之非限制性實例包括非離子界面活性劑，諸如呈0.01-0.05%之極低濃度的聚山梨醇酯80。
在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 3-10 7PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 4-10 6PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 3PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 4PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 5PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 8PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 7PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 8PFU之劑量提供。
在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 3PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 4PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 5PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 6PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 7PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 8PFU之劑量提供。
各種實施例提供一種用於誘導個體中之保護性免疫反應的疫苗組合物，其包含：本發明之經修飾SARS-CoV-2變體。經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8，在SEQ ID NO:8中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9，在SEQ ID NO:9中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:12。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:12中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2變體包含經重新編碼之棘蛋白。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:8之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:9之核苷酸21,563至25,342。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:3至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:4至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:5至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:6至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:7至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333至少98%或至少99%一致。
在各種實施例中，本發明之經修飾SARS-CoV-2變體為減毒活病毒。
各種實施例提供一種用於誘導個體中之保護性免疫反應的多價疫苗組合物，其包含：兩種或更多種本發明之經修飾SARS-CoV-2變體。
各種實施例提供一種用於誘導個體中之保護性免疫反應的多價疫苗組合物，其包含：經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒，其參考原始SARS-CoV-2及一或多種本發明之經修飾SARS-CoV-2變體去優化。亦即，參考原始SARS-CoV2去優化之經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒不為經修飾SARS-CoV-2變體。各經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者。
參考原始SARS-CoV2去優化的經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒之實例係關於參考華盛頓分離株去優化之冠狀病毒。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸，其中具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸與經修飾SARS-CoV-2變體中之聚核苷酸不相同。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含由具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸編碼的多肽，其中由具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸編碼的多肽與經修飾SARS-CoV-2變體中之多肽不相同。
在一些實施例中，疫苗組合物進一步包含如本文所描述之可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，疫苗組合物進一步包含如本文所描述之佐劑。在一些實施例中，疫苗組合物進一步包含蔗糖、甘胺酸或兩者。在各種實施例中，疫苗組合物進一步包含蔗糖(5%)及甘胺酸(5%)。在各種實施例中，可接受之載劑或賦形劑係選自由以下組成之群：糖、胺基酸、界面活性劑及其組合。在各種實施例中，胺基酸之濃度為約5% w/v。適合胺基酸之非限制性實例包括精胺酸及組胺酸。適合載劑之非限制性實例包括明膠及人類血清白蛋白。適合界面活性劑之非限制性實例包括非離子界面活性劑，諸如呈0.01-0.05%之極低濃度的聚山梨醇酯80。
在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 3-10 7PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 4-10 6PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 3PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 4PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 5PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 6PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 7PFU之劑量提供。在各種實施例中，疫苗組合物係以約10 8PFU之劑量提供。
在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 3PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 4PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 5PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 6PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 7PFU之劑量提供。在各種實施例中，免疫組合物係以約5×10 8PFU之劑量提供。
應理解，本發明之減毒病毒，在用於引發個體中之免疫反應(或保護性免疫反應)或防止個體罹患病毒相關之疾病或降低罹患病毒相關之疾病之可能性的情況下，可以另外包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑之組合物的形式向個體投與。醫藥學上可接受之載劑及賦形劑為熟習此項技術者所已知且包括但不限於0.01-0.1M且較佳0.05M磷酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、DMEM、L-15、含10-25%蔗糖溶液之PBS、含10-25%蔗糖溶液之DMEM或0.9%鹽水中之一或多者。此類載劑亦包括水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。水性載劑包括水、醇/水性溶液、乳液或懸浮液、鹽水及緩衝介質。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏油或不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖之彼等補充劑)及類似者。固體組合物可包含無毒性固體載劑，諸如(例如)葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、纖維素或纖維素衍生物、碳酸鈉、明膠、重組人類血清白蛋白、人類血清白蛋白及/或碳酸鎂。對於以氣溶膠形式投與，諸如對於經肺及/或鼻內遞送，藥劑或組合物較佳與無毒性界面活性劑(例如，C6至C22脂肪酸之酯或偏酯或天然甘油酯)及推進劑一起調配。可包括諸如卵磷脂之額外載劑以有助於鼻內遞送。醫藥學上可接受之載劑或賦形劑可進一步包含少量輔助物質(諸如濕潤劑或乳化劑)、防腐劑及其他添加劑(諸如(例如)抗菌劑、抗氧化劑及螯合劑)，其增強活性成分之存放期及/或有效性。如此項技術中所熟知，可調配本發明之組合物以在向個體投與之後提供活性成分之快速、持續或延遲釋放。
在各種實施例中，疫苗組合物或免疫組合物經調配用於靜脈內或鞘內、皮下、肌肉內、皮內或鼻內遞送。在各種實施例中，疫苗組合物或免疫組合物經調配用於鼻內遞送。在各種實施例中，疫苗組合物或免疫組合物經調配用於經由經鼻滴劑或經鼻噴霧遞送。 使用本發明之組合物之方法。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與一定劑量的本發明之免疫組合物。免疫組合物為本文所論述之免疫組合物中之任一者。在各種實施例中，劑量為防治有效或治療有效劑量。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與一定劑量的本發明之多價免疫組合物。多價免疫組合物為本文所論述之免疫組合物中之任一者。在各種實施例中，劑量為防治有效或治療有效劑量。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8，在SEQ ID NO:8中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9，在SEQ ID NO:9中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:12。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:12中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2變體包含經重新編碼之棘蛋白。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:8之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:9之核苷酸21,563至25,342。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:3至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:4至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:5至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:6至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:7至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333至少98%或至少99%一致。
在各種實施例中，多價免疫組合物包含：經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒，其參考原始SARS-CoV2及一或多種本發明之經修飾SARS-CoV-2變體去優化。亦即，參考原始SARS-CoV2去優化之經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒不為經修飾SARS-CoV-2變體。各經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者。
參考原始SARS-CoV2去優化的經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒之實例係關於參考華盛頓分離株去優化之冠狀病毒。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸，其中具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸與經修飾SARS-CoV-2變體中之聚核苷酸不相同。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含由具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸編碼的多肽，其中由具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸編碼的多肽與經修飾SARS-CoV-2變體中之多肽不相同。
在各種實施例中，免疫組合物係靜脈內或鞘內、皮下、肌肉內、皮內或鼻內投與。在各種實施例中，免疫組合物係鼻內投與。在各種實施例中，免疫組合物係經由經鼻滴劑或經鼻噴霧投與。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與一定劑量的本發明之疫苗組合物。疫苗組合物為本文所論述之疫苗組合物中之任一者。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與一定劑量的本發明之多價疫苗組合物。多價疫苗組合物為本文所論述之疫苗組合物中之任一者。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8，在SEQ ID NO:8中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9，在SEQ ID NO:9中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:12。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:12中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2變體包含經重新編碼之棘蛋白。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:8之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:9之核苷酸21,563至25,342。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:3至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:4至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:5至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:6至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:7至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333至少98%或至少99%一致。
在各種實施例中，多價疫苗組合物包含經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒，其參考原始SARS-CoV2及一或多種本發明之經修飾SARS-CoV-2變體去優化。亦即，參考原始SARS-CoV2去優化之經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒不為經修飾SARS-CoV-2變體。各經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者。
參考原始SARS-CoV2去優化的經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒之實例係關於參考華盛頓分離株去優化之冠狀病毒。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸，其中具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸與經修飾SARS-CoV-2變體中之聚核苷酸不相同。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含由具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸編碼的多肽，其中由具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸編碼的多肽與經修飾SARS-CoV-2變體中之多肽不相同。
在各種實施例中，免疫反應為保護性免疫反應。在各種實施例中，劑量為防治有效或治療有效劑量。
在各種實施例中，疫苗組合物係靜脈內或鞘內、皮下、肌肉內、皮內或鼻內投與。在各種實施例中，疫苗組合物係鼻內投與。在各種實施例中，疫苗組合物係經由經鼻滴劑或經鼻噴霧投與。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與一定劑量的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體。經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8，在SEQ ID NO:8中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9，在SEQ ID NO:9中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:12。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:12中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2變體包含經重新編碼之棘蛋白。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:8之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:9之核苷酸21,563至25,342。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:3至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:4至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:5至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:6至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:7至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333至少98%或至少99%一致。
在各種實施例中，免疫反應為保護性免疫反應。在各種實施例中，劑量為防治有效或治療有效劑量。
在各種實施例中，劑量為約10 3-10 7PFU。在各種實施例中，劑量為約10 4-10 6PFU。在各種實施例中，劑量為約10 3PFU。在各種實施例中，劑量為約10 4PFU。在各種實施例中，劑量為約10 5PFU。在各種實施例中，劑量為約10 6PFU。在各種實施例中，劑量為約10 7PFU。在各種實施例中，劑量為約10 8PFU。
在各種實施例中，劑量為約5×10 3PFU。在各種實施例中，劑量為約5×10 4PFU。在各種實施例中，劑量為約5×10 5PFU。在各種實施例中，劑量為約5×10 6PFU。在各種實施例中，劑量為約5×10 7PFU。在各種實施例中，劑量為約5×10 8PFU。
在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2變體係靜脈內或鞘內、皮下、肌肉內、皮內或鼻內投與。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒係鼻內投與。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒係經由經鼻滴劑或經鼻噴霧投與。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與預致敏劑量的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體；及向個體投與一或多種增強免疫劑量的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8，在SEQ ID NO:8中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9，在SEQ ID NO:9中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:12。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:12中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2變體包含經重新編碼之棘蛋白。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:8之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:9之核苷酸21,563至25,342。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:3至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:4至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:5至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:6至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:7至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333至少98%或至少99%一致。
在各種實施例中，預致敏劑量及一或多種增強免疫劑量利用相同的經修飾SARS-CoV-2變體。在各種實施例中，預致敏劑量及一或多種增強免疫劑量利用不同的經修飾SARS-CoV-2變體。在各種實施例中，劑量為防治有效或治療有效劑量。
在各種實施例中，預致敏劑量及/或一或多種增強免疫劑量的經修飾SARS-CoV-2變體係靜脈內或鞘內、皮下、肌肉內、皮內或鼻內投與。在各種實施例中，預致敏劑量及/或一或多種增強免疫劑量的經修飾SARS-CoV-2變體係鼻內投與。在各種實施例中，預致敏劑量及/或一或多種增強免疫劑量的經修飾SARS-CoV-2變體係經由經鼻滴劑或經鼻噴霧投與。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與預致敏劑量的本發明之免疫組合物；及向個體投與一或多種增強免疫劑量的本發明之免疫組合物。在各種實施例中，免疫組合物為本文所論述之免疫組合物中之任一者。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與預致敏劑量的本發明之多價免疫組合物；及向個體投與一或多種增強免疫劑量的本發明之多價免疫組合物。在各種實施例中，多價免疫組合物為本文所論述之免疫組合物中之任一者。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8，在SEQ ID NO:8中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9，在SEQ ID NO:9中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:12。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:12中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2變體包含經重新編碼之棘蛋白。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:8之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:9之核苷酸21,563至25,342。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:3至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:4至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:5至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:6至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:7至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333至少98%或至少99%一致。
在各種實施例中，多價免疫組合物包含：經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒，其參考原始SARS-CoV2及一或多種本發明之經修飾SARS-CoV-2變體去優化。亦即，參考原始SARS-CoV2去優化之經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒不為經修飾SARS-CoV-2變體。各經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者。
參考原始SARS-CoV2去優化的經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒之實例係關於參考華盛頓分離株去優化之冠狀病毒。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸，其中具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸與經修飾SARS-CoV-2變體中之聚核苷酸不相同。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含由具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸編碼的多肽，其中由具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸編碼的多肽與經修飾SARS-CoV-2變體中之多肽不相同。
在各種實施例中，預致敏劑量及一或多種增強免疫劑量利用包含相同經修飾SARS-CoV-2變體之相同免疫組合物。在各種實施例中，預致敏劑量及一或多種增強免疫劑量利用包含不同經修飾SARS-CoV-2變體之不同免疫組合物。在各種實施例中，劑量為防治有效或治療有效劑量。
在各種實施例中，預致敏劑量及/或一或多種增強免疫劑量的免疫組合物係靜脈內或鞘內、皮下、肌肉內、皮內或鼻內投與。在各種實施例中，預致敏劑量及/或一或多種增強免疫劑量的免疫組合物係鼻內投與。在各種實施例中，預致敏劑量及/或一或多種增強免疫劑量的免疫組合物係經由經鼻滴劑或經鼻噴霧投與。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與預致敏劑量的本發明之疫苗組合物；及向個體投與一或多種增強免疫劑量的本發明之疫苗組合物。在各種實施例中，疫苗組合物為本文所論述之疫苗組合物中之任一者。
各種實施例提供一種引發個體中之免疫反應的方法，其包含：向個體投與預致敏劑量的本發明之多價疫苗組合物；及向個體投與一或多種增強免疫劑量的本發明之多價疫苗組合物。在各種實施例中，疫苗組合物為本文所論述之疫苗組合物中之任一者。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為貝塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:8，在SEQ ID NO:8中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為德耳塔變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:9，在SEQ ID NO:9中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:9具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:11，在SEQ ID NO:10中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，SARS-CoV-2變體為奧密克戎變體。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:12。在各種實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO:10，在SEQ ID NO:12中具有至多20個突變。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、98%、99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99%序列一致性之聚核苷酸。在各種實施例中，聚核苷酸包含與SEQ ID NO:12具有至少99.5 %序列一致性之聚核苷酸。
在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2變體包含經重新編碼之棘蛋白。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:8之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:9之核苷酸21,563至25,342。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:3。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:4。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:5。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:6。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:7。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列為具有至多10個突變之SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333。
在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:3至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:4至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:5至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:6至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:7至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:10之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:11之核苷酸21,563至25,339至少98%或至少99%一致。在各種實施例中，經重新編碼之棘蛋白編碼序列與SEQ ID NO:12之核苷酸21,563至25,333至少98%或至少99%一致。
在各種實施例中，多價疫苗組合物包含：經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒，其參考原始SARS-CoV2及一或多種本發明之經修飾SARS-CoV-2變體去優化。亦即，參考原始SARS-CoV2去優化之經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒不為經修飾SARS-CoV-2變體。各經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者。
參考原始SARS-CoV2去優化的經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒之實例係關於參考華盛頓分離株去優化之冠狀病毒。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸，其中具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸與經修飾SARS-CoV-2變體中之聚核苷酸不相同。在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含由具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸編碼的多肽，其中由具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸編碼的多肽與經修飾SARS-CoV-2變體中之多肽不相同。
在各種實施例中，預致敏劑量及一或多種增強免疫劑量利用包含相同經修飾SARS-CoV-2變體之相同疫苗組合物。在各種實施例中，預致敏劑量及一或多種增強免疫劑量利用包含不同經修飾SARS-CoV-2變體之不同疫苗組合物。在各種實施例中，劑量為防治有效或治療有效劑量。
在各種實施例中，預致敏劑量及/或一或多種增強免疫劑量的疫苗組合物係靜脈內或鞘內、皮下、肌肉內、皮內或鼻內投與。在各種實施例中，預致敏劑量及/或一或多種增強免疫劑量的疫苗組合物係鼻內投與。在各種實施例中，預致敏劑量及/或一或多種增強免疫劑量的疫苗組合物係經由經鼻滴劑或經鼻噴霧投與。
預致敏及增強免疫劑量之間的時序可例如視感染或疾病之階段(例如，未感染、感染、感染後數天)及患者之健康狀況而變化。在各種實施例中，在預致敏劑量之後約2週投與一或多種增強免疫劑量。亦即，投與預致敏劑量且其後約兩週，投與增強免疫劑量。在各種實施例中，在預致敏劑量之後約4週投與一或多種增強免疫劑量。在各種實施例中，在預致敏劑量之後約6週投與一或多種增強免疫劑量。在各種實施例中，在預致敏劑量之後約8週投與一或多種增強免疫劑量。在各種實施例中，在預致敏劑量之後約12週投與一或多種增強免疫劑量。在各種實施例中，在預致敏劑量之後約1-12週投與一或多種增強免疫劑量。
在各種實施例中，一或多種增強免疫劑量可以一種增強免疫劑量形式給與。在其他實施例中，一或多種增強免疫劑量可以增強免疫劑量形式週期性地給與。舉例而言，其可每季度、每4個月、每6個月、每年、每2年、每3年、每4年、每5年、每6年、每7年、每8年、每9年或每10年給與。
在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量各自為約10 3-10 7PFU。在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量各自為約10 4-10 6PFU。在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量各自為約10 3PFU。在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量各自為約10 4PFU。在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量各自為約10 5PFU。在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量各自為約10 6PFU。在各種實施例中，劑量為約10 7PFU。在各種實施例中，劑量為約10 8PFU。
在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量各自為約5×10 3PFU。在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量各自為約5×10 4PFU。在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量各自為約5×10 5PFU。在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量各自為約5×10 6PFU。在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量各自為約5×10 7PFU。在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量各自為約5×10 8PFU。
在各種實施例中，預致敏劑量及增強免疫劑量之劑量為相同的。
在各種實施例中，劑量可在預致敏劑量與增強免疫劑量之間變化。作為一非限制性實例，相較於增強免疫劑量，預致敏劑量可含有更少的病毒複本。舉例而言，預致敏劑量為約10 3PFU且增強免疫劑量為約10 4-10 6PFU，或預致敏劑量為約10 4PFU且增強免疫劑量為約10 5-10 7PFU。
在各種實施例中，其中週期性地投與增強免疫劑量，後續增強免疫劑量可低於第一增強免疫劑量。
作為另一非限制性實例，相較於增強免疫劑量，預致敏劑量可含有更多的病毒複本。
在各種實施例中，免疫反應為保護性免疫反應。
在各種實施例中，劑量為防治有效或治療有效劑量。
在各種實施例中，鼻內投與本發明之經修飾SARS-CoV-2變體、本發明之免疫組合物、本發明之疫苗組合物、本發明之多價免疫組合物或本發明之多價疫苗組合物包含：指示個體擤鼻涕且使頭部向後傾斜；(視情況)指示個體改變頭部的位置以避免組合物滴落在鼻子外面或喉嚨下方；將包含劑量之約0.25 mL投與至各鼻孔中；指示個體輕輕地嗅；且指示個體在一段時間內不擤鼻涕；例如約60分鐘。
在一些實施例中，個體未服用任何免疫抑制藥物。在各種實施例中，在投與本發明之經修飾SARS-CoV-2變體、本發明之免疫組合物或本發明之疫苗組合物之前約180天、150天、120天、90天、75天、60天、45天、30天、15天或7天，個體未服用任何免疫抑制藥物。在各種實施例中，在投與本發明之經修飾SARS-CoV-2變體、本發明之免疫組合物或本發明之疫苗組合物之後約1天、7天、14天、30天、45天、60天、75天、90天、120天、150天、180天、9個月、12個月、15個月、18個月、21個月或24個月內，個體未服用任何免疫抑制藥物。
免疫抑制藥物包括但不限於以下：皮質類固醇(例如，普賴松(prednisone) (Deltasone，Orasone)、布地奈德(budesonide) (Entocort EC)、普賴蘇穠(prednisolone) (Millipred))、鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如，環孢靈(cyclosporine) (Neoral，Sandimmune，SangCya)、他克莫司(tacrolimus) (Astagraf XL，Envarsus XR，Prograf)、雷帕黴素機制性目標(Mechanistic target of rapamycin；mTOR)抑制劑(例如，西羅莫司(sirolimus) (Rapamune)、依維莫司(everolimus) (Afinitor，Zortress))、肌苷單磷酸去氫酶(IMDH)抑制劑(例如，硫唑嘌呤(Azasan，Imuran)、來氟米特(leflunomide) (Arava)、黴酚酸酯(CellCept，Myfortic))、生物製劑(例如，阿巴西普(abatacept) (Orencia)、阿達木單抗(adalimumab) (Humira)、阿那白滯素(anakinra) (Kineret)、賽妥珠單抗(certolizumab) (Cimzia)、依那西普(etanercept) (Enbrel)、戈利木單抗(golimumab) (Simponi)、英夫利昔單抗(infliximab) (Remicade)、依奇珠單抗(ixekizumab) (Taltz)、那他珠單抗(natalizumab) (Tysabri)、利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan)、司庫奇尤單抗(secukinumab) (Cosentyx)、托珠單抗(tocilizumab) (Actemra)、烏司奴單抗(ustekinumab) (Stelara)、維多珠單抗(vedolizumab) (Entyvio))、單株抗體(例如，巴利昔單抗(basiliximab) (Simulect)、達利珠單抗(daclizumab) (Zinbryta)、莫羅莫那(muromonab) (Orthoclone OKT3))。 醫療用途
本發明之各種實施例提供用於引發免疫反應的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體、本發明之疫苗組合物或本發明之免疫組合物，或提供COVID-19之治療性或防治性治療。
本發明之各種實施例提供用於引發免疫反應的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體、本發明之疫苗組合物或本發明之免疫組合物，或提供COVID-19之治療性或防治性治療，其中使用包含預致敏劑量的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體，或本發明之疫苗組合物，或本發明之免疫組合物，及一或多種增強免疫劑量的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體，或本發明之疫苗組合物，或本發明之免疫組合物。
本發明之各種實施例提供用於製造用於引發免疫反應之藥劑的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體、本發明之疫苗組合物或本發明之免疫組合物的用途，或提供COVID-19之治療性或防治性治療。
本發明之各種實施例提供本發明之經修飾SARS-CoV-2變體、本發明之疫苗組合物或本發明之免疫組合物用於製造用於引發免疫反應之藥劑的用途；或提供COVID-19之治療性或防治性治療，其中藥劑包含預致敏劑量的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體，或本發明之疫苗組合物，或本發明之免疫組合物，及一或多種增強免疫劑量的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體，或本發明之疫苗組合物，或本發明之免疫組合物。
在各種實施例中，免疫組合物為如本文所描述之多價免疫組合物。
在各種實施例中，疫苗組合物為如本文所描述之多價疫苗組合物。
本發明之經修飾SARS-CoV-2變體為本文所論述之經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒中之任一者。本發明之疫苗組合物為本文所論述之疫苗組合物中之任一者。本發明之免疫組合物為本文所論述之免疫組合物中之任一者。
在各種實施例中，免疫反應為保護性免疫反應。 製備方法
各種實施例提供一種製備經修飾SARS-CoV-2變體之方法，其包含：獲得編碼親本SARS-CoV-2變體之一或多種蛋白質或其一或多個片段的核苷酸序列；重新編碼核苷酸序列以降低一或多種蛋白質或其一或多個片段之蛋白質表現，及將具有經重新編碼之核苷酸序列之核酸取代至親本SARS-CoV-2變體基因體中以製備經修飾SARS-CoV-2變體基因體，其中相較於親本病毒，經重新編碼之核苷酸序列之表現降低。
在各種實施例中，製備經修飾SARS-CoV-2變體基因體包含使用選殖宿主。
在各種實施例中，製備經修飾SARS-CoV-2變體基因體包含使用BAC載體、使用重疊延伸PCR策略或基於長PCR之融合策略來構築感染性cDNA純系。
在各種實施例中，經修飾SARS-CoV-2變體基因體進一步包含一或多種突變，包括缺失、取代及添加。一或多種可為1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、51-60、61-70、71-80、81-90或91-100種突變。
在各種實施例中，重新編碼核苷酸序列以降低一或多種蛋白質或其一或多個片段之蛋白質表現係藉助於相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸減少密碼子對偏好(CPB)；相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸減少密碼子使用偏好；或相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸增加CpG或UpA二核苷酸之數目，如本文所論述。
本發明之各種實施例提供一種產生經修飾病毒基因體之方法，其包含對來自SARS-CoV-2變體之病毒RNA進行反轉錄聚合酶連鎖反應(「RT-PCR」)以產生cDNA；進行聚合酶連鎖反應(「PCR」)以產生且擴增來自cDNA之兩個或更多個重疊cDNA片段，其中兩個或更多個重疊cDNA片段共同地編碼SARS-CoV-2變體；用包含經修飾序列之一或多個重疊cDNA片段取代由病毒RNA產生之一或多個對應重疊cDNA片段；且進行重疊且擴增PCR以構築經修飾病毒基因體，其中經修飾病毒基因體包含一或多個經修飾序列。在各種實施例中，該方法包含在對來自SARS-CoV-2變體之病毒RNA進行RT-PCR以產生cDNA之前，在容許細胞上進行至少1次SARS-CoV-2變體RNA病毒分離株之繼代。
本發明之各種實施例提供一種產生經修飾病毒基因體之方法，其包含進行聚合酶連鎖反應(「PCR」)以自編碼來自SARS-CoV-2變體之病毒RNA的cDNA產生且擴增兩個或更多個重疊cDNA片段，其中兩個或更多個重疊cDNA片段共同地編碼SARS-CoV-2變體，其中一或多個重疊cDNA片段包含經修飾序列；進行重疊且擴增PCR以構築經修飾病毒基因體，其中經修飾病毒基因體包含一或多個經修飾序列。
本發明之各種實施例提供一種產生經修飾病毒基因體之方法，其包含進行聚合酶連鎖反應(「PCR」)以自編碼來自SARS-CoV-2變體之病毒RNA的cDNA產生且擴增兩個或更多個重疊cDNA片段，其中兩個或更多個重疊cDNA片段共同地編碼SARS-CoV-2變體；用包含經修飾序列之一或多個重疊cDNA片段取代一或多個對應重疊cDNA片段；進行重疊且擴增PCR以構築經修飾病毒基因體，其中經修飾病毒基因體包含一或多個經修飾序列。
在各種實施例中，進行PCR以自cDNA產生且擴增兩個或更多個重疊cDNA片段包含使用兩個或更多個引子對，各對對重疊cDNA片段中之各者具有特異性。在各種實施例中，進行PCR以自cDNA產生且擴增兩個或更多個重疊cDNA片段包含使用兩個或更多個選自表4之引子對。
在各種實施例中，進行PCR以自cDNA產生且擴增兩個或更多個重疊cDNA片段包含使用5或更多個引子對，各對對重疊cDNA片段中之各者具有特異性。在各種實施例中，來自cDNA之兩個或更多個重疊cDNA片段為5個或更多個重疊cDNA片段，且5個或更多個重疊cDNA片段共同地編碼RNA病毒。在各種實施例中，進行PCR以自cDNA產生且擴增5個或更多個重疊cDNA片段包含使用5個或更多個選自表4之引子對。
在各種實施例中，進行PCR以自cDNA產生且擴增兩個或更多個重疊cDNA片段包含使用10個或更多個引子對，各對對重疊cDNA片段中之各者具有特異性。在各種實施例中，來自cDNA之兩個或更多個重疊cDNA片段為10個或更多個重疊cDNA片段，且10個或更多個重疊cDNA片段共同地編碼RNA病毒。在各種實施例中，進行PCR以自cDNA產生且擴增10個或更多個重疊cDNA片段包含使用10個或更多個選自表4之引子對。
在各種實施例中，進行PCR以自cDNA產生且擴增兩個或更多個重疊cDNA片段包含使用15個或更多個引子對，各對對重疊cDNA片段中之各者具有特異性。在各種實施例中，來自cDNA之兩個或更多個重疊cDNA片段為15個或更多個重疊cDNA片段，且15個或更多個重疊cDNA片段共同地編碼RNA病毒。在各種實施例中，進行PCR以自cDNA產生且擴增15個或更多個重疊cDNA片段包含使用15個或更多個選自表4之引子對。
在各種實施例中，來自cDNA之兩個或更多個重疊cDNA片段為20個或更多個重疊cDNA片段，且20個或更多個重疊cDNA片段共同地編碼RNA病毒。在各種實施例中，進行PCR以自cDNA產生且擴增20個或更多個重疊cDNA片段包含使用20個或更多個引子對，各對對重疊cDNA片段中之各者具有特異性。
在各種實施例中，來自cDNA之兩個或更多個重疊cDNA片段為25個或更多個重疊cDNA片段，且25個或更多個重疊cDNA片段共同地編碼RNA病毒。在各種實施例中，進行PCR以自cDNA產生且擴增25個或更多個重疊cDNA片段包含使用25個或更多個引子對，各對對重疊cDNA片段中之各者具有特異性。
在各種實施例中，來自cDNA之兩個或更多個重疊cDNA片段為19個重疊cDNA片段，且19個重疊cDNA片段共同地編碼SARS-CoV-2變體；例如，如本文所論述之阿爾法、貝塔、德耳塔或伽瑪。在各種實施例中，進行PCR以自第一cDNA產生且擴增19個重疊cDNA片段包含使用全部19個來自表4之引子對。
在各種實施例中，重疊之長度為約40-400 bp。在各種實施例中，重疊之長度為約200 bp。在各種實施例中，重疊之長度為約40-100 bp。在各種實施例中，重疊之長度為約100-200 bp。在各種實施例中，重疊之長度為約100-150 bp。在各種實施例中，重疊之長度為約150-200 bp。在各種實施例中，重疊之長度為約200-250 bp。在各種實施例中，重疊之長度為約200-300 bp。在各種實施例中，重疊之長度為約300-400 bp。
在各種實施例中，引子之長度為約15-55個鹼基對(bp)長。在各種實施例中，引子之長度為約19-55 bp長。在各種實施例中，引子之長度為約10-65 bp長。在各種實施例中，引子之長度為約16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、51-55、56-60或61-65 bp長。
在各種實施例中，進行重疊PCR以構築去優化病毒基因體係同時在兩個或更多個重疊cDNA片段上進行。因此，若存在5個或更多個重疊cDNA片段，則重疊PCR以構築去優化病毒基因體係同時在彼等5個片段上進行。作為其他實例，若存在8個或更多個重疊cDNA片段，則重疊PCR以構築去優化病毒基因體係同時在彼等8個片段上進行；若存在10個或更多個重疊cDNA片段，則重疊PCR以構築去優化病毒基因體係同時在彼等10個片段上進行；若存在15個或更多個重疊cDNA片段，則重疊PCR以構築去優化病毒基因體係同時在彼等15個片段上進行；若存在19個或更多個重疊cDNA片段，則重疊PCR以構築去優化病毒基因體係同時在彼等19個片段上進行；若存在20個或更多個重疊cDNA片段，則重疊PCR以構築去優化病毒基因體係同時在彼等20個片段上進行；若存在25個或更多個重疊cDNA片段，則重疊PCR以構築去優化病毒基因體係同時在彼等25個片段上進行；若存在30個或更多個重疊cDNA片段，則重疊PCR以構築去優化病毒基因體係同時在彼等30個片段上進行。
在各種實施例中，該等方法不使用中間DNA純系，諸如質體、BAC或YAC。在各種實施例中，該等方法不使用選殖宿主。在各種實施例中，該等方法不包括序列中之人工內含子；例如以破壞有問題的序列基因座。 減毒病毒產生
本發明之各種實施例提供一種產生經修飾SARS-CoV-2變體之方法。
在各種實施例中，該方法包含：用包含本發明之病毒基因體的載體轉染細胞群體；使細胞群體在細胞培養物中繼代至少一次；自細胞培養物收集上清液。
在各種實施例中，該方法包含：用本發明之經修飾感染性SARS-CoV-2變體RNA轉染細胞群體；培養細胞群體；且收集包含經修飾SARS-CoV-2變體之感染培養基。在各種實施例中，培養細胞群體包含使細胞群體在細胞培養物中繼代一或多次。
在各種實施例中，該方法進一步包含濃縮上清液或感染培養基。
在各種實施例中，該方法包含使細胞群體繼代2至15次；且自細胞群體之細胞培養物收集上清液。在各種實施例中，該方法包含使細胞群體繼代2至10次；且自細胞群體之細胞培養物收集上清液。在各種實施例中，該方法包含使細胞群體繼代2至7次；且自細胞群體之細胞培養物收集上清液。在各種實施例中，該方法包含使細胞群體繼代2至5次；且自細胞群體之細胞培養物收集上清液。在各種實施例中，該方法包含使細胞群體繼代2、3、4、5、6、7、8或10次；且自細胞群體之細胞培養物收集上清液。在各種實施例中，自細胞培養物收集上清液係在細胞群體之各繼代期間進行。在其他實施例中，自細胞培養物收集上清液係在細胞群體之一或多次繼代期間進行。舉例而言，其可每隔一次繼代；每兩次繼代、每三次繼代等進行。
本發明之各種實施例提供一種產生去優化SARS-CoV-2變體之方法，其包含用一定數量的去優化感染性RNA轉染宿主細胞；培養宿主細胞；且收集包含去優化病毒之感染培養基。
在各種實施例中，該方法包含對來自SARS-CoV-2變體之病毒RNA進行反轉錄聚合酶連鎖反應(「RT-PCR」)以產生cDNA；進行聚合酶連鎖反應(「PCR」)以產生且擴增來自cDNA之兩個或更多個重疊cDNA片段，其中兩個或更多個重疊cDNA片段共同地編碼SARS-CoV-2變體；用包含去優化序列之一或多個重疊cDNA片段取代由病毒RNA產生之一或多個對應重疊cDNA片段；進行重疊且擴增PCR以構築去優化病毒基因體，其中去優化病毒基因體包含一或多個去優化序列；進行去優化病毒基因體之活體外轉錄以產生去優化RNA轉錄物；培養宿主細胞；且收集包含去優化病毒之感染培養基。
在各種實施例中，該方法進一步包含在用該數量之去優化感染性RNA轉染宿主細胞之前，根據本發明之各種實施例產生該數量之去優化感染性RNA。因此，本發明包含進行去優化病毒基因體之活體外轉錄以產生去優化RNA轉錄物；且用一定數量的去優化感染性RNA轉染宿主細胞；培養宿主細胞；且收集包含去優化病毒之感染培養基。
在其他實施例中，該方法包含進行聚合酶連鎖反應(「PCR」)以自編碼來自SARS-CoV-2變體之病毒RNA的cDNA產生且擴增兩個或更多個重疊cDNA片段，其中兩個或更多個重疊cDNA片段共同地編碼SARS-CoV-2變體，其中一或多個重疊cDNA片段包含去優化序列；進行重疊且擴增PCR以構築去優化病毒基因體，其中去優化病毒基因體包含一或多個去優化序列；且進行去優化病毒基因體之活體外轉錄以產生去優化RNA轉錄物；培養宿主細胞；且收集包含去優化病毒之感染培養基。
在其他實施例中，該方法包含進行聚合酶連鎖反應(「PCR」)以自編碼來自SARS-CoV-2變體之病毒RNA的cDNA產生且擴增兩個或更多個重疊cDNA片段，其中兩個或更多個重疊cDNA片段共同地編碼SARS-CoV-2變體；用包含去優化序列之一或多個重疊cDNA片段取代由病毒RNA產生之一或多個對應重疊cDNA片段；進行重疊且擴增PCR以構築去優化病毒基因體，其中去優化病毒基因體包含一或多個去優化序列；且進行去優化病毒基因體之活體外轉錄以產生去優化RNA轉錄物；培養宿主細胞；且收集包含去優化病毒之感染培養基。
在各種實施例中，該方法包含在對來自SARS-CoV-2變體之病毒RNA進行RT-PCR以產生cDNA之前，在容許細胞上進行至少1次野生型RNA病毒分離株之繼代。
在各種實施例中，該方法進一步包含在進行RT-PCR之前自SARS-CoV-2變體提取病毒RNA。
經修飾病毒基因體之特定實施例及產生經修飾病毒基因體之方法如本文所提供且包括於產生此等經修飾SARS-CoV-2變體之此等實施例中。 套組
本發明亦係關於一種向個體接種疫苗、引發免疫反應或引發個體中之保護性免疫反應的套組。套組適用於實踐本發明之引發免疫反應或引發保護性免疫反應之方法。套組為材料或組分之組合，包括本發明組合物中之至少一者。因此，在一些實施例中，套組含有包括本發明之本文所論述之經修飾SARS-CoV-2變體中之任一者、本文所論述之免疫組合物中之任一者或本文所論述之疫苗組合物中之任一者的組合物。因此，在一些實施例中，套組含有統一的單一劑量之組合物，其包括如本文所描述的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體、免疫組合物或疫苗組合物；例如，各小瓶含有足夠劑量之約10 3-10 7PFU之經修飾SARS-CoV-2變體，或更特定言之，10 4-10 6PFU之經修飾SARS-CoV-2變體、10 4PFU之經修飾SARS-CoV-2變體、10 5PFU之經修飾SARS-CoV-2變體或10 6PFU之經修飾SARS-CoV-2變體；或更特定言之，5×10 4-5×10 6PFU之經修飾SARS-CoV-2變體、5×10 4PFU之經修飾SARS-CoV-2變體、5×10 5PFU之經修飾SARS-CoV-2變體或5×10 6PFU之經修飾SARS-CoV-2變體或5×10 7PFU之經修飾SARS-CoV-2變體。在各種實施例中，套組含有多個劑量之組合物，其包括如本文所描述的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體、免疫組合物、疫苗組合物、多價免疫組合物或多價疫苗組合物；例如，若套組每小瓶含有10劑，則各小瓶含有約10×10 3-10 7PFU之經修飾SARS-CoV-2變體，或更特定言之，10×10 4-10 6PFU之經修飾SARS-CoV-2變體、10×10 4PFU之經修飾SARS-CoV-2變體、10×10 5PFU之經修飾SARS-CoV-2變體或10×10 6PFU之經修飾SARS-CoV-2變體，或更特定言之，50×10 4-50×10 6PFU之經修飾SARS-CoV-2變體、50×10 4PFU之經修飾SARS-CoV-2變體、50×10 5PFU之經修飾SARS-CoV-2變體或50×10 6PFU之經修飾SARS-CoV-2變體或50×10 7PFU之經修飾SARS-CoV-2變體。
在本發明套組中經組態之組分之確切性質視其預期目的而定。舉例而言，一些實施例經組態用於向個體接種疫苗、引發免疫反應或引發個體中之保護性免疫反應之目的。在一個實施例中，套組尤其出於防治性治療哺乳動物個體之目的而經組態。在另一實施例中，套組尤其出於防治性治療人類個體之目的而經組態。在其他實施例中，該套組經組態用於獸醫學應用，治療諸如但不限於農畜、家畜及實驗室動物之個體。
套組中可包括使用說明書。「使用說明書」通常包括有形表示，其描述在使用套組之組分以實現所需結果時待採用的技術，諸如向個體接種疫苗、引發免疫反應或引發個體中之保護性免疫反應。舉例而言，對於經鼻投與，使用說明書可包括但不限於指示個體擤鼻涕且使頭部向後傾斜，指示個體改變頭部的位置以避免組合物滴落在鼻子外面或喉嚨下方，指示將約0.25 mL (包含劑量)投與至各鼻孔中；指示個體輕輕地嗅，及/或指示個體在一段時間內不擤鼻涕；例如約60分鐘。其他說明書可包括指示個體不服用任何免疫抑制藥物。
視情況，套組亦含有其他適用組分，諸如稀釋劑、緩衝液、醫藥學上可接受之載劑、注射器、滴管、導管、施加器、吸液或量測工具、綁帶材料或如熟習此項技術者將容易識別之其他適用用品。
可向從業者提供套組中組裝之材料或組分，其以保持其可操作性及效用的任何適宜及適合之方式儲存。舉例而言，組分可呈溶解、脫水或凍乾形式；其可在室溫、冷藏或冷凍溫度下提供。組分典型地容納於適合的封裝材料中。如本文所採用，片語「封裝材料」係指用於容納套組之內含物(諸如本發明組合物及其類似物)之一或多種物理結構。封裝材料係藉由已知方法構築，較佳用以提供無菌、無污染物環境。套組中所採用之封裝材料為通常用於疫苗中之彼等。如本文所用，術語「封裝」係指能夠容納個別套組組分之適合固體基質或材料，諸如玻璃、塑膠、紙、箔及其類似物。因此，舉例而言，封裝可為用於含有適合量之本發明組合物之玻璃小瓶，該本發明組合物含有如本文所描述的本發明之經修飾SARS-CoV-2變體、免疫組合物或疫苗組合物。封裝材料通常具有外部標籤，其指示套組及/或其組分之內含物及/或目的。 序列
SEQ ID NO:1 (參考華盛頓分離株(GenBank：MN985325.1)去優化，在棘蛋白中具有36個核苷酸缺失且不具有polyA尾)。
Figure 02_image011
Figure 02_image013
Figure 02_image015
Figure 02_image017
Figure 02_image019
Figure 02_image021
Figure 02_image023
Figure 02_image025
Figure 02_image027
SEQ ID NO:2 (與USA/WA1/2020野生型棘蛋白相比的經重新編碼之棘蛋白)。
Figure 02_image029
實例
提供以下實例以更好地說明所主張之本發明且不應解釋為限制本發明之範疇。就提及特定材料而言，僅出於說明之目的且不意欲限制本發明。熟習此項技術者可在不履行本發明之能力且在不脫離本發明之範疇的情況下開發等效方式或反應物。 實例 1 合成 SARS-CoV-2 阿爾法變體、貝塔變體及德耳塔變體
除了使用攜載各變體之突變的片段以外，阿爾法變體、貝塔變體及德耳塔變體之合成與針對本文所描述的去優化 SARS-CoV-2、 冠狀病毒病毒株 2019-nCoV/USA-WA1/2020所描述類似。
鑑別棘蛋白基因內各變體之關鍵突變。與吾等之原始WT設計或CDX-005 (在棘蛋白中進行去優化)相比，從GISAID及使用BLASTn之多比對中選擇約6-10個變體序列。
一旦鑑別出核苷酸突變，用來自變體之密碼子置換去優化冠狀病毒病毒株2019-nCoV/USA-WA1/2020設計(本文所描述)之密碼子。若突變引起缺失，則對變體之去優化序列進行相同缺失。
其後，合成攜帶此等突變之DNA片段。將棘蛋白基因分成3個片段，本文中稱為F14、F15及F16。F16含有去優化區域。基於突變之位置，合成此等片段中之2者或所有3者。
簡言之，在藉由PCR/RT-PCR製程獲得所有19個片段之後，進行重疊PCR以構築病毒基因體，隨後進行活體外轉錄及Vero E6轉染。用於合成去優化SARS-CoV-2之相同引子對用於合成去優化SARS-CoV-2變體。 實例 2 合成 SARS-CoV-2 程序 RT-PCR
冠狀病毒病毒株2019-nCoV/USA-WA1/2020 (「WA1」) (BEI Resources NR-52281，批號70034262)係在CDC之Vero (CCL81)上繼代3次且在BEI Resources之Vero E6上繼代一次之後由BEI Resources分佈。4次繼代之後的完整病毒基因體序列係藉由CDC測定且發現與其所衍生之臨床試樣(GenBank寄存編號MN985325)相比，不含有核苷酸差異(Harcourt等人, 2020)，在接受後，WA1及在37℃下在含有2% FBS之DMEM中藉由在Vero E6細胞上再繼代兩次來擴增。
根據標準方案，藉由用Trizol試劑(Thermo Fisher)進行提取，使用第6代WA1病毒來純化病毒基因體RNA。簡言之，用等體積的Trizol提取效價為1×10^7 PFU/ml之0.5 ml病毒樣本。程序先前已在四個獨立實驗中證實以完全滅活SARS-CoV2病毒感染力。在藉由添加0.1 ml氯仿進行相分離之後，用等體積的異丙醇沈澱水相中之RNA。將沈澱之RNA在70%乙醇中洗滌、乾燥且再懸浮於20 μl無RNA酶水中。 病毒 cDNA 產生
使用SuperScript IV第一股合成系統合成野生型cDNA。在各反應中，如下設置1號試管之13 µl之總反應體積： 1. 50 µM寡核苷酸d(T)20：1 µl (替代地，1822號引子(10 µM)：1µl) 2. 50 ng/µl無規六聚物：1 µl 3. 10 mM dNTP：1 µl 4. WT RNA：2-10 µl 5. H 2O：添加至13 µl
將樣本混合且在65℃下培育5分鐘，接著立即置於冰上1分鐘。製備另一試管(2號試管)，總反應體積為7 µl： 1. 5×緩衝液：4 µl 2. 100 mM DTT：1 µl 3. RNA酶抑制劑(40U/µl)：1 µl (視情況) 4. SuperScript IV酶：1 µl
吾等將1號試管及2號試管混合，總反應體積為20 µl，且在23℃下培育10分鐘，隨後在50℃下培育50分鐘，且在80℃下培育10分鐘，以產生cDNA。 重疊聚合酶連鎖反應
Q5高保真2×主混合物(NEB，Ipswich，Massachusetts)用於自cDNA擴增基因體片段。
20 µl反應物含有1 µl新鮮製備的cDNA，0.5 µM濃度之1 µl正向及反向引子(詳述於表4中)，10 µl之2× Q5主混合物及H 2O。反應參數如下：98℃ 30秒以開始反應，隨後30個98℃持續10秒、60℃持續30秒及65℃持續1 min之循環，且在65℃下最終延伸5 min。獲得總計19個基因體片段，除片段19 (約1.2 Kb)外，全部為約1.8Kb，使用特定引子覆蓋整個病毒基因體，其中之任兩者之間具有200bp重疊區(表4)。擴增子係藉由瓊脂糖凝膠電泳驗證且使用QIAquick PCR純化套組(Qiagen)純化。藉由Nanodrop量化溶離物。
Q5®高保真DNA聚合酶(NEB，Ipswich，Massachusetts)用於重構整個COVID-19基因體。
首先，所有19個基因體片段用於重疊反應中以重構完整基因體。簡言之，製備具有30-40 ng之各DNA片段(所有片段之間的莫耳比為1:1)、10 µl 5×反應緩衝液、1 µl 10 mM dNTP、0.5 µl Q5聚合酶及H 2O至最終體積為50 µl的混合物。反應在以下條件下進行：98℃持續30秒，且72℃持續16 min 30秒，持續10個循環。
隨後，將2 µl重疊反應產物與4 µl 5×反應緩衝液、1 µl 10 mM dNTP、1 µl 0.5 µM之各側接引子、0.2 µl Q5聚合酶及H 2O混合至最終體積為20 µl且如下進行PCR：98℃ 30秒以開始反應，隨後15個98℃持續10秒，60℃持續45秒及72℃持續16分鐘30秒之循環，且最終延伸在65℃下持續5 min。為檢查結果，在0.4%瓊脂糖凝膠上觀測到5 µl PCR產物。 表 4
RT-PCR 之引子   
SEQ ID NO: 編號 名稱 寡核苷段序列5'-3'
15 2312 2312-Fr1-T7G-F3 GAtaatacgactcactatagATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC
16 1786 1786-COV-2 GATGCCAAAATAATGGCGATCTC
17 1787 1787-COV-3 GTTGGTTGCCATAACAAGTGTG
18 1788 1788-COV-4 CTAATTGAGGTTGAACCTCAACAATTG
19 1789 1789-COV-5 GAGTATGGTACTGAAGATGATTACCAAG
20 1790 1790-COV-6 CTAGGTGGAATGTGGTAGGATTAC
21 1791 1791-COV-7 GCTGTTACAGCGTATAATGGTTATCTTAC
22 1792 1792-COV-8 GCTGGTTTAAGTATAATGTCTCCTACAAC
23 1793 1793-COV-9 GCACAAAACCAGTTGAAACATCAAATTC
24 1794 1794-COV-10 GCAACTAGTGTTTTGAGTTTTTCCATTG
25 1795 1795-COV-11 GTGAAGAATCATCTGCAAAATCAGC
26 1796 1796-COV-12 CAAATGATATAAGCAATTGTTATCCAGAAAGG
27 1797 1797-COV-13 GCCTTTAATACTTTACTATTCCTTATGTCATTCAC
28 1798 1798-COV-14 CCAGACAAACTAGTATCAACCATATCC
29 1799 1799-COV-15 GCTATGGGTATTATTGCTATGTCTG
30 1800 1800-COV-16 CCTACAAGGTGGTTCCAGTTC
31 1801 1801-COV-17 CGACAGATGTCTTGTGCTG
32 1802 1802-COV-18 GGTATCCAGTTGAAACTACAAATGG
33 1803 1803-COV-19 GATCAGACATACCACCCAAATTG
34 1804 1804-COV-20 CTTATGTATTGTAAGTACAAATGAAAGACATCAG
35 1805 1805-COV-21 GGTGATGATTATGTGTACCTTCCTTAC
36 1806 1806-COV-22 CTGTTAATTGCAGATGAAACATCATGC
37 1807 1807-COV-23 GTGTGTAGACTTATGAAAACTATAGGTCC
38 1808 1808-COV-24 CATACAAACTGCCACCATCAC
39 1809 1809-COV-25 CCTTGTAGTGACAAAGCTTATAAAATAGAAG
40 1810 1810-COV-26 CTGGTGCAACTCCTTTATCAG
41 1811 1811-COV-27 GCAAAGAATGCTATTAGAAAAGTGTGAC
42 1812 1812-COV-28 GATAGATTCCTTTTTCTACAGTGAAGGATTTC
43 1813 1813-COV-29 GACTCCTGGTGATTCTTCTTCAG
44 1814 1814-COV-30 CTCTAGCAGCAATATCACCAAGG
45 1815 1815-COV-31 GCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACAC
46 1816 1816-COV-32 CAAAAGGTGTGAGTAAACTGTTACAAAC
47 1817 1817-COV-33 CTCACTCCCTTTCGGATGG
48 1818 1818-COV-34 GAGGTTTATGATGTAATCAAGATTCCAAATGG
49 1819 1819-COV-35 GCTACAGGATTGGCAACTATAAATTAAAC
50 1820 1820-COV-36 CCATTCTAGCAGGAGAAGTTCC
51 1821 1821-COV-37 GCAATCCTGCTAACAATGCTG
52 1822 1822-COV-38 ttttTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCATTCTCCTAAGAAGCTATTAAAATC
活體外轉錄
自全長PCR擴增之DNA模板係使用習知苯酚/氯仿提取進行純化，隨後在3M乙酸鈉之存在下進行乙醇沈澱，隨後進行RNA操作。根據製造商之說明書，使用HiScribe T7轉譯套組(New England Biolabs)活體外合成RNA轉錄物，進行一些修飾。藉由添加500 ng DNA模板及2.4 µl 50 mM GTP (端帽類似物與GTP之比率為1:1)來建立20 µl反應。將反應物在37℃下培育3小時。接著將RNA沈澱且藉由氯化鋰沈澱純化且用70%乙醇洗滌一次。N基因DNA模板亦使用特定正向引子(2320-N-F：GAAtaatacgactcactataggGACGTTCGTGTTGTTTTAGATTTCATCTAAACG (SEQ ID NO:53)，小寫字母序列表示T7啟動子；帶下劃線的序列表示N基因ORF之5' NTR上游)及反向引子(2130-N-R，tttttttttttttttttttttGTCATTCTCCTAAGAAGCTATTAAAATCACATGG (SEQ ID NO:54))自cDNA藉由PCR來製備。 藉由 RNA 電穿孔轉染 Vero E6 細胞
Vero E6細胞係獲自ATCC (CRL-1586)且維持於補充有10% FBS之DMEM高葡萄糖中。為了轉染病毒RNA，根據製造商說明書，使用Maxcyte ATX系統將10 µg之經純化全長基因體RNA轉錄物與5 μg之封端WA1-N mRNA一起電穿孔至Vero E6細胞中。簡言之，3-4×10 6個Vero E6細胞曾在Maxcyte電穿孔緩衝液中洗滌且再懸浮於100 µl之相同緩衝液中。將細胞懸浮液與RNA樣本輕輕混合，且將RNA/細胞混合物轉移至Maxcyte OC-100加工組裝中。使用經預程式化之Vero細胞電穿孔方案進行電穿孔。在37℃/5% CO 2下回收經轉染細胞30分鐘之後，將細胞再懸浮於溫DMEM/10% FBS中且以各種接種密度(總細胞之1/2、1/3、1/6)分佈於三個T25燒瓶中。將經轉染細胞在37℃/5% CO 2下培育6天或直至出現CPE。在第2天、第4天及第6天收集感染培養基，其中在第2天及第4天完全更換培養基(DMEM/5% FBS)。早在轉染後2天藉由溶菌斑分析可偵測產生之病毒，在第4-6天之間產生病毒峰值。 Vero E6 細胞中儲備病毒之繼代及 SARS-CoV-2 之溶菌斑滴定
在DMEM/2% FBS中製備10倍系列稀釋液。將0.5 ml之各稀釋液添加至80%匯合的Vero E6細胞之12孔中。在37℃下培育1小時之後，移除接種體，且每孔添加2 ml之半固體覆層，其含有1× DMEM、0.3%黃蓍膠、2% FBS及1×青黴素/鏈黴素。在37℃/5% CO 2下培育3天或4天之後，移除覆層，將孔用PBS輕輕沖洗，隨後固定且用結晶紫染色。
獲自活體外轉譯之RNA用於用野生型WA1及CDX-005轉染Vero E6細胞且回收Vero E6細胞中滴定之活病毒。在培育3天之後，對溶菌斑分析進行染色。 多步病毒生長動力學
將Vero細胞(WHO 10-87)在含有1 ml含5%胎牛血清(FBS)之DMEM之12孔盤中生長3天直至其幾乎達至匯合。在感染之前，廢細胞培養基經含有1% FBS及30 PFU之指示病毒(0.0001 MOI)之0.5 ml新製DMEM置換。在33℃或37℃/5% CO 2下進行1小時培育之後，丟棄接種體，用1 ml達爾伯克氏(Dulbecco's) PBS洗滌細胞單層一次，隨後添加含有1% FBS之1 ml DMEM。將感染細胞在33℃或37℃下培育0、6、24、48或72小時。在指示時間點處，收集細胞及上清液(每個時間點一個孔)，在-80℃下冷凍一次且解凍。溶胞物中之感染性病毒效價係在37℃下在Vero E6上藉由溶菌斑分析測定。 結果
個別基因體片段1-19之產生及藉由重疊PCR產生之整個基因體DNA良好，其中在0.4%瓊脂糖凝膠上可見清晰的條帶。
活體外轉錄產生之RNA用於用S-WWW (WT)及S-WWD轉染Vero E6細胞且回收Vero E6細胞中滴定之活病毒。在培育3天之後，對溶菌斑分析進行染色且吾等觀測到在部分棘蛋白去優化S-WWD候選物(圖1)中所觀測到之較小的溶菌斑及最終效價降低40%。 實例 3
CDX-005預主病毒種子(preMVS)係如下研發：自經感染、表徵之Vero E6細胞(ATCC CRL-1586批號70010177)提取SARS-COV-2 BetaCoV/USA/WA1/2020 (GenBank：MN985325.1)之RNA且使用商業上可獲得的試劑及套組藉由RT-PCR轉化成19個重疊DNA片段。重疊PCR用於將19個1.8kb野生型基因體片段與一個去優化棘蛋白基因卡匣縫合在一起。特定言之，棘蛋白ORF之1,272個核苷酸為自基因體位置24115-25387去優化之人類密碼子對，相對於親本WA1/2020病毒，導致283個沈默突變變化。所得全長cDNA經活體外轉錄以製備全長病毒RNA。在石溪大學(Stony Brook University；NY)之新的BSL-3實驗室中進行病毒回收，該實驗室於2020年4月首次投入生產，其中吾等項目為實驗室中唯一出現之項目。接著在經表徵Vero E6細胞(批號70010177)中電穿孔此病毒RNA。此產生CDX-005病毒(圖1)，隨後在Vero E6細胞上再繼代一次以得到第1代P1 (批號1-060820-9-1)。P1材料用於下文所描述之倉鼠研究中。 實例 4 倉鼠研究
WHO關於COVID-19建模之特用專家工作群組得出結論，恆河猴及雪貂兩者似乎再現輕度至中度人類疾病，但最新研究表明，敍利亞金倉鼠可為複製此感染之更嚴重肺部表現之更有用的模型。
三十六隻5-6週齡雄性敍利亞倉鼠(Charles Rivers)用於研究。為了攻擊，倉鼠經由腹膜內注射氯胺酮(100 mg/kg)及甲苯噻嗪(10 mg/kg)進行麻醉且在第0天(12隻/組)用0.05 ml之標稱劑量為5×10 4PFU/ml或5×10 3PFU/ml之野生型WA1 SARS-CoV-2或5×10 4PFU/ml CDX-005鼻內接種。每日兩次觀測動物且每日收集體重直至第8天且接著自第16天至第18天每日收集體重。在第16天，用5×10 4PFU/ml野生型WA1對三隻接種CDX-005之動物進行鼻內攻擊。六隻接種有5×10 4PFU/ml (N=3隻)或5×10 3PFU/ml (N=3隻)之野生型WA1之未處理倉鼠充當對照。吾等將此等兩組組合，因為兩種接種劑量之效價重疊。 體重
使用此等36隻倉鼠及額外58隻(半雌性/半雄性) 5-6週齡敍利亞金倉鼠(Charles Rivers)來研究CDX-005及野生型WA1接種對倉鼠健康狀況之影響，如藉由體重減輕所評定。(此等額外倉鼠目前正針對其他CDX-005及野生型WA1介導之效應進行評估)。每天稱量總計四十份5×10 4PFU CDX-005、四十份5×10 4PFU野生型WA1及十二份5×10 3PFU野生型WA1，持續至多九天。各組中之N隨時間推移降低，因為PI數天之其他終點處死動物。5×10 4PFU CDX-005及5×10 4PFU野生型WA1之最小N為10且5×10 3PFU野生型WA1之最小N為3。 組織 採集
在接種後第2天、第4天、第6天，藉由靜脈內注射150 mg/kg之Beuthanasia對來自各組之三隻倉鼠及第18天來自第16天攻擊之動物的三隻倉鼠進行安樂死。收集左肺用於病毒負荷測定。為了量測病毒負荷，在第18天，在第16天攻擊之動物中，使用組織均質機(全向均質機)在含抗生素之DMEM中以10% w/v對肺進行均質化。吾等嘗試進行鼻洗滌，但在此等小動物中未成功獲得可重複的洗液。 組織病理學
藉由盲化特許獸醫病理學家進行組織病理學。肺、大腦及腎經福馬林固定、脫水、包埋於石蠟中且用蘇木精及曙紅染色。藉由盲化委員會認證之獸醫病理學家進行光學顯微評估。各組織根據多個病理性參數進行分級且切片評分為0=正常，1=極微，2=輕度，3=中度，4=顯著或5=嚴重。所有組織之評估包括細胞浸潤之評定。各器官檢查至少五個切片且對評分求平均值。 病毒負荷
在所採集組織中藉由qPCR及TCID50來量測病毒負荷。為了量測病毒負荷，使用砂磨機均質機(Omni)在含抗生素之DMEM中以10% w/v對組織進行均質化。感染性病毒效價係藉由50%組織培養感染劑量(TCID50)分析對Vero E6細胞上肺組織勻漿之10倍連續稀釋液進行滴定來測定且以log10 TCID50單位/毫升表示。根據製造商方案，使用Quick-RNA病毒套組(Zymo Research)自100 µl之大腦組織勻漿提取RNA。使用iTaq 1-步驟通用探針套組(Bio-Rad)，使用以下PCR循環條件進行qRT-PCR：95℃下15 s，60℃下15 s及72℃下20 s之40個循環。 抗體 - 溶菌斑減少中和效價
將在PI第16天收集之倉鼠血清於56℃下熱滅活30'。以1:5之初始稀釋度開始，在96孔U底盤中，以DMEM/1% FBS進行50 μl兩倍連續稀釋。將含大約30 PFU之SARS-CoV-2 Washington/1/2020之50 μl DMEM/1% FBS添加至血清稀釋液中且混合，使中和孔中之最終體積達至100 μl，且總初始血清稀釋度達至1:10。將稀釋盤在37℃/5% CO 2下培育一小時。
移除含有Vero E6細胞之匯合單層之24孔盤上之細胞生長培養基(在DMEM/5% FBS中接種前一天)，且添加150 μl新鮮DMEM/1% FBS，隨後添加100 μl之各中和反應物。在37℃/5% CO 2下吸附病毒一小時之後，將0.75 ml半固體覆層添加至24孔盤中，最終濃度為1× DMEM、1.75% FBS、0.3%黃蓍膠、1×青黴素+鏈黴素，總體積為1 ml。將24孔盤在37℃下培育48小時以允許溶菌斑形成。藉由固定且用含1%結晶紫之50%甲醇/4%甲醛染色細胞單層來觀測溶菌斑。將溶菌斑減少中和效價(PRNT) 50、80、90確定為最後一個血清稀釋度之倒數，該血清稀釋度將溶菌斑數目相對於未經中和孔(含有未處理倉鼠血清)之溶菌斑數目減少預定截止值(50%、80%、90%)。指定在最低稀釋度(1:10)下未能中和之血清之效價為5，且指定最高測試血清稀釋度(1:1280)下中和之血清之效價≥1280。 抗體 -IgG ELISA
在4℃下，在50 ng/ml BSA/0.05M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液pH 9.6中以30奈克/孔用SARS-CoV-2 (2019-nCoV)棘蛋白S1-His (Sino Biological)塗覆九十六孔盤過夜。將培養盤在37℃下用含10%山羊血清之PBS阻斷2小時，用洗滌緩衝液(含0.1% Tween 20之PBS)洗滌四次，接著用連續稀釋血清(1:10起始稀釋度且其後為兩倍)於含10%山羊血清/0.05% Tween-20之PBS中培育且在37℃下培育1小時。將培養盤用洗滌緩衝液洗滌四次，接著在37℃下用1:10,000辣根過氧化酶(HRP)結合親和力純山羊抗敍利亞倉鼠IgG (H & L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)培育1小時。在培育之後，將培養盤用洗滌緩衝液洗滌四次且添加Thermo Scientific OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)進行比色反應。在25℃下在暗處培育10 min之後，藉由添加50 ml 2.5M硫酸溶液停止反應且在微量盤讀取器上於490 nm下讀取所得吸光度。報告不同組中之相對IgG水準且將其作為OPD比色反應產物之強度達至高於背景(無血清)對照強度五倍時的稀釋度之對數進行比較。 實例 5 CDX-005 特性
CDX-005在棘蛋白基因中相對於野生型WA1病毒含有283個沈默突變。將所得全長野生型WA1及去優化cDNA活體外轉錄以製備電穿孔至Vero E6細胞中之全長病毒RNA。將經轉染細胞培育6天或直至出現CPE。在第2天、第4天及第6天收集感染培養基。藉由Vero E6細胞上之溶菌斑分析確定病毒效價。溶菌斑早在轉染後第2天可見，在第4-6天產生病毒峰值。儘管由CDX-005及CDX-007形成之溶菌斑小於野生型，但兩者在Vero E6細胞中穩固生長，表明其適用於大規模製造。因此，如同吾等其他SAVE疫苗，吾等能夠快速產生具有不同程度減毒之多種疫苗候選物。
在CDX-005中，針對人類細胞對棘蛋白ORF之1,272個核苷酸進行密碼子對去優化，從而產生283個沈默突變。自棘蛋白移除多鹼基弗林蛋白酶裂解位點以增加減毒及安全性。
吾等在吾人之GMP表徵之無動物源(AOF) Vero (WHO-10-87)細胞中進行CDX-005之生長最佳化研究，使得吾等可在2020年第4季度開始大規模疫苗生產。在33℃下生長導致CDX-005及野生型WA1兩者之效價皆高於在觀測到細胞病變效應(CPE)之前37℃下病毒峰值之效價，其中80-90%之病毒為峰值處相關之細胞。儘管動力學不同，但可在0.01 MOI及0.0001 MOI下實現類似病毒效價。
吾等亦研究病毒採集之最佳條件。Vero WHO 10-87細胞在37℃/5% CO 2下於含5%胎牛血清(FBS)之DMEM中生長。在33℃之培養物中用CDX-005感染後48 h，使用描述於圖9中之流程採集細胞及上清液。
資料顯示，在33℃下0.01 MOI感染之後48小時，大部分CDX-005與細胞相關(約80-90%)，但直接自Vero細胞回收病毒。低張性裂解為採集CDX-005之有效方式，且寬裂解窗表明此方法將在其中一些可撓性可為有益的規模化批次中為可實行的。
冷凍/解凍裂解亦為有效的且FBS既不為必需的亦不為有益的。此皆為合乎需要的，因為在感染期間FBS可導致Vero細胞過度生長，降低病毒產率，且FDA偏好無血清生產。亦值得注意的係，當在普通DMEM中冷凍時CDX-005似乎為穩定的，因為FBS至少在兩個冷凍/解凍循環之後幾乎沒有或沒有提供穩定作用。因此，在最佳採集時序之情況下，無論是否在33℃或37℃下生長，常規觀測到2-3 × 10 7PFU/ml之CDX-005的粗主體效價，或約10 6PFU/cm 2生長表面積。
基於此等研究，吾等目前藉由在33℃下以0.01 MOI接種Vero (WHO -10-87)細胞來使CDX-005成長。吾等已選擇且測試含5%蔗糖及5%甘胺酸之DMEM的疫苗調配物以用於吾等在英國之首次人體研究。在此調配物中，CDX-005在-80℃下穩定至少三個冷凍-解凍循環及一個月(迄今最長測試儲存持續時間)。
最後，作為評定CDX-005之基因體穩定性之第一步，吾等對病毒於Vero (WHO 10-87)細胞上繁殖之後的第1-6代病毒進行定序。資料指示病毒極其穩定。第6代之定序揭露無亞群。吾等已生長且採集九代。 實例 6
作為將CDX-005移動至首次用於人體臨床試驗之序言，吾等檢查非人類靈長類動物對疫苗之反應。吾等已對十五隻非洲綠猴，六隻用10 6PFU野生型WA1，六隻用10 6PFU CDX-005及三隻用達爾伯克氏PBS進行鼻內接種。吾等之發現展示，雖然在PI第4天接種野生型WA1及CDX-005之動物之灌洗液中之病毒效價類似，但在野生型WA1中病毒效價保持較高，但在接種CDX-005之猴中直線下降至不可偵測。此等資料進一步顯示CDX-005作為SARS-CoV-2疫苗之潛力。 實例 7 回收 SARS-CoV2 貝塔病毒 CDX.005.1
CDX-005.1係基於先前回收的臨床階段CDX-005 (武漢譜系)之主鏈。CDX-005棘蛋白基因含有藉由Codagenix合成減毒病毒工程改造(SAVE)平台設計的283個同義突變之密碼子對去優化卡匣。棘蛋白基因進一步藉由弗林蛋白酶裂解位點之缺失(36個核苷酸缺失)修飾。儘管不希望受任何特定理論束縛，但吾等咸信不存在弗林蛋白酶裂解位點可有助於攜帶此類突變之SARS-CoV-2之人類宿主的減毒。吾等因此決定使用CDX-005作為吾等CDX-005.1之主鏈。弗林蛋白酶裂解位點缺失位於基因體片段F15中。
為定義SARS-CoV-2貝塔疫苗候選物(CDX-005.1)之序列，選擇GISAID上之各種貝塔變體且藉由NCBI Blastn多重序列比對與CDX-005進行比較。相對於CDX-005棘蛋白，九個關鍵突變存在於吾等評定之大部分貝塔序列之棘蛋白基因中(表5)。 表5. CDX-005棘蛋白產生CDX-005.1棘蛋白之基因修飾之概述
棘蛋白基因中之位置(nt) 原始核苷酸 突變核苷酸 引起胺基酸變化
21614 C T L18 (CTT)變為F (TTT)
21801 A C D80 (GAT)變為A (GCT)
22206 A G D215 (GAT)變為G (GGT)
22286-22294 CTTGCTTTA 缺失 缺失242-244
22813 G T K417 (AAG)變為N (AAT)
23012 G A E484 (GAA)變為K (AAA)
23063 A T N501 (AAT)變為Y (TAT)
23403 A G D614 (GAT)變為G (GGT)
23628 C T A701 (GCA)變為V (GTA)
為構築去優化CDX-005.1基因體，吾等重新合成含有九個經鑑別SARS-CoV-2貝塔突變之新片段F14及F15。自CDX-005 1期臨床試驗材料回收剩餘17個片段(F1-F13及F16-19)。為組裝CDX-005.1之全長合成cDNA基因體，使19個重疊PCR片段在單一重疊PCR反應中組合。
編號 名稱 描述 SEQ ID NO 引子序列5'-3'
2312 2312-Fr1-T7G-F3 片段1之正向引子 (在病毒基因體序列之前添加T7啟動子序列以促進活體外轉錄) 15 GAtaatacgactcactatagATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC
1811 1811-COV-27 片段14之正向引子 41 GCAAAGAATGCTATTAGAAAAGTGTGAC
1812 1812-COV-28 片段14之反向引子 42 GATAGATTCCTTTTTCTACAGTGAAGGATTTC
1813 1813-COV-29 片段15之正向引子 43 GACTCCTGGTGATTCTTCTTCAG
1814 1814-COV-30 片段15之反向引子 44 CTCTAGCAGCAATATCACCAAGG
所得全長PCR組裝之cDNA基因體用作用於使用藉由在F1之5'端處添加T7啟動子驅動之T7 RNA聚合酶進行活體外轉錄的模板。將活體外轉錄之全長基因體RNA以及活體外轉錄之核蛋白(NP)輔助mRNA藉由電穿孔共轉染至Vero WHO 10-87細胞中。將由此轉染產生之病毒命名為CDX-005.1。
將CDX-005 (SIIPL疫苗批號403002)之病毒基因體藉由反轉錄轉化為cDNA且PCR擴增為17個重疊亞基因體DNA片段。此外，吾等重新合成兩種新貝塔特異性片段14及15。各片段與其鄰近片段重疊約200 bp。將經純化之個別CDX-005.1片段F14、F15及CDX-005基因體片段F1-F13及F16-F19彙集在單個試管重疊PCR反應中，其中兩個引子側接病毒基因體。對應於病毒基因體之5'端的正向引子(2312)包括上游T7 RNA聚合酶啟動子。19-片段重疊PCR產生大約30 kb之DNA擴增子，從而表明成功地產生整個基因體cDNA，其中在0.5%瓊脂糖凝膠上可見清晰的條帶。在純化之後，PCR組裝之全長cDNA基因體用作用於在G端帽類似物之存在下藉由活體外轉錄合成感染性病毒RNA的模板。相對於平行運行之DNA梯，所得轉錄物RNA呈現為範圍介於8 kb至1 kb之塗片。
為測試PCR組裝之全長cDNA基因體之完整性，使用具有限制性核酸內切酶 Nhe I之消化物。CDX-005.1基因體cDNA由於設計於棘蛋白之去優化區域中的額外 Nhe I位點而產生獨特且不同的片段圖案。
Nhe I消化之cDNA基因體之片段模式對應於電子雜交預測之DNA片段大小，從而指示正確地組裝病毒cDNA基因體。值得注意的，不遷移至瓊脂糖凝膠中的PCR產物之部分在 Nhe I消化之後消失且轉化為具有預期大小之 Nhe IRFLP片段，從而表明此材料亦對應於正確形成之全長基因體cDNA。
藉由共電穿孔將反向遺傳學來源之合成CDX-005.1病毒挽救至活體外轉錄之基因體RNA以及作為輔助細胞之核蛋白mRNA的Vero 10-87細胞中。遵循經批准之機構生物安全委員會指南(Institutional Biosafety Committee guideline)，CDX-005.1疫苗病毒株之病毒回收係在2級生物安全增強(BSL2+)條件下進行。在電穿孔之後3天，可藉由溶菌斑分析在培養上清液中偵測到感染性CDX-005.1病毒(4.6×10 5PFU/ml)，且6天不斷地增加至約10 7PFU/ml (圖9)。
吾等先前觀測到，原始CDX-005疫苗病毒株對40℃下之溶菌斑形成具有溫度敏感性，此為減毒活疫苗之所需安全特徵，因為其可合理地預測在等效於人體發燒之溫度下的病毒關閉。為測試表型是否延伸CDX-005.1，吾等在容許溫度(37℃)及限制溫度(40℃)下進行CDX-005及CDX-005.1之並列溶菌斑分析。實際上，吾等觀測到兩種病毒之顯著溫度敏感性表型，其中對於CDX-005，溶菌斑形成減少大約1,000倍(確證先前觀測結果)，而CDX-005.1不能在任何稀釋度下形成任何可偵測的溶菌斑(圖10)。
使用吾等藉由重疊PCR建立之冠狀病毒基因體組裝方法，Codagenix在距接收合成序列之3週內回收針對SARS-CoV-2變體貝塔(CDX-005.1)之活疫苗候選物。
CDX-005.1生長至類似效價且顯示與CDX-005類似的溶菌斑形態。CDX-005 (1-5×10 7PFU/mL)在容許溫度(33℃-37℃)下。CDX-005.1在40℃下對生長為重度溫度限制的，此為親本CDX-005之先前觀測到之特徵(武漢譜系)。 實例 8 貝塔 (CDX-005.1) 在 第 1 代時之定序
為定義SARS-CoV-2貝塔疫苗候選物之序列，選擇GISAID上之10-20種貝塔變體且藉由NCBI Blastn多重序列比對與CDX-005進行比較。十(10)個關鍵突變存在於每個所評定貝塔序列之棘蛋白基因中且缺失九(9)個核苷酸。接著原始CDX-005棘蛋白基因中之十(10)個核苷酸經此等所選突變取代以獲得貝塔變體棘蛋白序列。病毒主鏈為CDX-005，其對於弗林蛋白酶裂解位點缺失(36-nt缺失)。
活體外轉錄新構築之全長貝塔病毒基因體，隨後進行RNA純化。接著將經純化之基因體RNA傳染至WHO 10-87 Vero細胞中。採集自第1代回收之病毒且藉由Trizol方案提取病毒RNA。進行標準RT-PCR，且PCR擴增19個PCR片段且進行桑格定序以檢查病毒屬性且鑑別任何假性突變。在Codagenix在BSL2抑制下混合定序反應且提交給Genewiz進行定序。將所得序列與疫苗病毒株CDX-005之主鏈上的COVID貝塔變體之經設計序列比對。
如下列出10個核苷酸突變及9個缺失：
棘蛋白上的位置 原始核苷酸 突變核苷酸 引起胺基酸變化
21614 C U L(CUU)àF(UUU)
21801 A C D(GAU)àA(GCU)
21846 U C I (AUU)-＞ T (ACU)
22206 A G D(GAU)àG(GGU)
22287 U A L (CUU)-＞ H (CAU)
22289-22297 GCTTTACGT 缺失 A、L及R缺失
22813 G U K(AAG)àN(AAU)
23012 G A E(GAA)àK(AAA)
23063 A U N(AAU)àY(UAU)
23403 A G D(GAU)àG(GGU)
23628 C U A(GCA)àV(GUA)
與貝塔疫苗候選物之經設計序列CDX.005.1相比，自第1代獲得之序列具有三個點突變：A1870G、A7917U及G14540U。定序跡線顯示具有突變核苷酸之基因體在病毒複製期間勝過其原始對應物。突變核苷酸在第1代已為主要物種，從而指示其為細胞適應突變。
除A1870G以外，兩個突變引起胺基酸變化。不同於經設計序列之突變列於以下：
突變位點 原始nt 突變nt 胺基酸變化
1870 A G Ala (GCA) à (GCG)，無變化
7917 A U Glu (GAA)à Val (GUA)
14540 G U Ser (AGU) à Ile (AUU)
實例 9 回收 CDX-005.2 ， 德耳塔
藉由Codagenix開發的冠狀病毒(CoV)之反向遺傳學方法來產生經基因修飾之活減毒SARS-CoV-2德耳塔變體疫苗候選物CDX-005.2。吾等方法為完全「基於試管的」且消除中間選殖宿主(諸如大腸桿菌( E. coli)或酵母)基因上操控CoV基因體之需求。此允許吾等回避在傳統的基於細菌或酵母之反向遺傳學系統中常見的CoV基因體之遺傳不穩定性/毒性問題。
CDX-005.2係基於先前在Codagenix回收的臨床階段CDX-005之主鏈(武漢譜系)。根據吾等之合成減毒病毒工程改造平台(SAVE)，CDX-005棘蛋白含有283個同義突變之密碼子對去優化卡匣。此外，棘蛋白藉由弗林蛋白酶裂解位點之12個胺基酸(36個核苷酸)缺失(36個核苷酸缺失)修飾。儘管不希望受任何特定理論束縛，但吾等咸信不存在弗林蛋白酶裂解位點可有助於攜帶此類突變之SARS-CoV-2之人類宿主的減毒。吾等因此決定使用CDX-005作為吾等CDX-005.2之主鏈。弗林蛋白酶裂解位點缺失位於基因體片段F15中。
為定義SARS-CoV-2德耳塔疫苗候選物(CDX-005.2)之序列，選擇GISAID上之各種德耳塔變體且藉由NCBI Blastn多重序列比對與CDX-005進行比較。相對於CDX-005棘蛋白，八個關鍵突變存在於每個所評定德耳塔序列之棘蛋白基因中(表6)。 表6. CDX-005棘蛋白產生CDX-005.2棘蛋白之基因修飾之概述
棘蛋白基因中之位置(nt) 原始核苷酸 突變核苷酸 引起胺基酸變化
21618 C G T(ACA)→R(AGA)
21986 G A G(GGU) →D(GAU)
22029 A G E(GAG) →G(GGA)
22030 G A
22908 U G L(CUG) →R(CGG)
22959 C A T(ACA) →K(AAA)
24368 G A D(GAC) →N(AAU)
24370 C U
為構築去優化CDX-005.2基因體，吾等重新合成含有8種所鑑別SARS-CoV-2德耳塔突變之新片段F14、F15及F16。自CDX-005 1期臨床試驗材料回收剩餘16個片段(F1-F13及F17-19)。為組裝CDX-005.2之全長合成cDNA基因體，使由此回收之19個重疊PCR片段在單一重疊PCR反應中組合。F16-Min DNA模板經設計以含有1213個核苷酸之密碼子對去優化區域，類似於原始CDX-005中所存在之區域。所得全長PCR組裝之cDNA基因體用作用於使用藉由在F1之5'端處添加T7啟動子驅動之T7 RNA聚合酶進行活體外轉錄的模版。將活體外轉錄之全長基因體RNA以及活體外轉錄之核蛋白(NP)輔助mRNA藉由電穿孔共轉染至Vero WHO 10-87細胞中。將由此轉染產生之病毒命名為CDX-005.2。
編號 名稱 描述 SEQ ID NO: 引子序列5'-3'
   2312    2312-Fr1-T7G-F3 片段1之正向引子(在病毒基因體序列之前添加T7啟動子序列以促進活體外轉錄) 15    GAtaatacgactcactata gATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC
1811 1811-COV-27 片段14之正向引子 41 GCAAAGAATGCTATTAGAAAAGTGTGAC
1812 1812-COV-28 片段14之反向引子 42 GATAGATTCCTTTTTCTACAGTGAAGGATTTC
1813 1813-COV-29 片段15之正向引子 43 GACTCCTGGTGATTCTTCTTCAG
1814 1814-COV-30 片段15之反向引子 44 CTCTAGCAGCAATATCACCAAGG
1815 1815-COV-31 片段16之正向引子 45 GCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACAC
1816 1816-COV-32 片段16之反向引子 46 CAAAAGGTGTGAGTAAACTGTTACAAAC
將CDX-005 (SIIPL疫苗批號403002)之病毒基因體藉由反轉錄轉化為cDNA且PCR擴增為16個重疊亞基因體DNA片段。此外，吾等重新合成三個新德耳塔特異性片段14、15及16。各片段與其鄰近片段重疊約200 bp。將經純化之個別CDX-005.2片段14-16及CDX-005基因體片段1-13及17-19彙集在單個試管重疊PCR反應中，其中兩個引子側接病毒基因體。對應於病毒基因體之5'端的正向引子(2312)包括上游T7 RNA聚合酶啟動子。19-片段重疊PCR產生大約30 kb之DNA擴增子，從而表明成功地產生整個基因體cDNA，其中在0.4%瓊脂糖凝膠上可見清晰的條帶。在純化之後，PCR組裝之全長cDNA基因體用作用於在G端帽類似物之存在下藉由活體外轉錄合成感染性病毒RNA的模板。相對於平行運行之DNA梯，所得轉錄物RNA呈現為範圍介於8 kb至1 kb之塗片。
為測試PCR組裝之全長cDNA基因體之完整性，使用具有限制性核酸內切酶 Nhe I之消化物。CDX-005.2基因體cDNA由於設計於棘蛋白之去優化區域中的額外 Nhe I位點而產生獨特且不同的片段圖案。 Nhe I消化之cDNA基因體之片段模式對應於電子雜交預測之DNA片段大小，從而指示正確地組裝病毒cDNA基因體。值得注意的，不遷移至瓊脂糖凝膠中的PCR產物之部分在 Nhe I消化之後消失且轉化為具有預期大小之 Nhe IRFLP片段，從而表明此材料亦對應於正確形成之全長基因體cDNA。
藉由共電穿孔將反向遺傳學來源之合成CDX-005.2病毒挽救至活體外轉錄之基因體RNA以及作為輔助細胞之核蛋白mRNA的Vero 10-87細胞中。遵循經批准之機構生物安全委員會指南，CDX-005.2疫苗病毒株之病毒回收係在2級生物安全增強(BSL2+)條件下進行。在電穿孔之後4天可藉由溶菌斑分析在培養上清液中偵測到感染性CDX-005.2病毒(2.5×10 5PFU/ml)，且7天不斷地增加至約10 7PFU/ml (圖12)。
吾等先前觀測到，原始CDX-005疫苗病毒株對40℃下之溶菌斑形成具有溫度敏感性，此為減毒活疫苗之所需安全特徵，因為其可合理地預測在等效於人體發燒之溫度下的病毒關閉。為測試表型是否延伸CDX-005.2，吾等在容許溫度(37℃)及限制溫度(40℃)下進行CDX-005及CDX-005.2之並列溶菌斑分析。實際上，吾等觀測到兩種病毒之顯著溫度敏感性表型，其中對於CDX-005及CDX-005.2，溶菌斑形成分別減少大約1,000倍及10,000倍(圖13)。
回收之CDX-005.2在40℃下對生長為溫度敏感的，類似於親本CDX-005且具有與CDX-005類似的溶菌斑形態。 實例 10 SARS-CoV-2 德耳塔疫苗候選物 (CDX-005.2) 在第 1 代 及第 2 代時之 定序報告
為定義SARS-CoV-2德耳塔疫苗候選物(CDX-005.2)之序列，選擇GISAID上之10-20種德耳塔變體且藉由NCBI Blastn多重序列比對與CDX-005進行比較。八個關鍵突變存在於每個所評定德耳塔變體序列之棘蛋白基因中。接著原始CDX-005棘蛋白基因中之八個核苷酸經此等所選突變取代以獲得德耳塔變體棘蛋白序列。
在德耳塔突變處於去優化區域中之情況下，去優化密碼子經野生型密碼子置換。病毒主鏈為CDX-005，其含有弗林蛋白酶裂解位點之36個核苷酸缺失。將新構築之全長德耳塔病毒基因體轉錄，隨後進行RNA純化。
接著將經純化之基因體RNA傳染至WHO 10-87 Vero細胞中。採集自第1代及第2代回收之病毒且經由製造商的方案用TRIzol™ (對於第1代)及QiaAmp病毒套組(對於第2代)提取病毒RNA。進行標準RT-PCR，且藉由桑格定序進一步擴增且分解19個PCR片段以確認病毒屬性且鑑別任何假性突變。
在Codagenix在BSL2抑制下建立定序反應且提交給Genewiz Inc (South Plainfield, NJ)及Eurofins Genomics (Louisville, KY)進行定序。所得序列與CDX-005疫苗之主鏈上的COVID德耳塔變體之經設計序列比對。
將11個單一核苷酸變化及一個6個核苷酸缺失引入CDX-005之棘蛋白基因中以便產生在設計時具有與流行的SARS-CoV-2德耳塔變體之胺基酸序列匹配之胺基酸序列的CDX-005.2 (表7)。所有德耳塔特異性序列編輯在第1代( 批號 1 071521-1 )及第2代( 批號 1 073121-1 )在CDX.005.2中得到確認。如存在於CDX-005中之相同12個胺基酸弗林蛋白酶裂解位點缺失實施於CDX-005.2中，且在本文中驗證。第1代及第2代之CDX-005.2之基因體序列相同。在第1代及第2代在CDX-005.2中偵測五個自發的點突變：G1013A、C10833A、A11089G、A12557U及G21668A。在具有突變之各位置處的定序跡線展示一定程度之遺傳異質性，其中該群體之一些部分仍攜帶原始核苷酸。突變核苷酸為第1代之主要物種，但其中四個在額外繼代(第2代)後超過其原始對應物，從而指示其可能為細胞培養物適應突變。C10833A仍為混合物種，其中腺嘌呤在第2代仍然占主導地位。突變中之四者引起胺基酸變化，而A11098G維持相同胺基酸。與設計序列之所有胺基酸差異均在去優化區域之外且可為對細胞培養物之正常病毒適應的結果。
在基因體位置28818處偵測到CDX-005 (Codagenix第2代)與CDX-005.2 (Codagenix第2代)之間的另一序列變化。儘管此位置為CDX-005參考序列中之胞嘧啶核苷(Codagenix第2代)，但其為CDX-005.2中之尿嘧啶，引起N核蛋白中之Ser至Leu胺基酸變化。 表7. CDX-005 (P2，批號1-061920-1)與CDX-005.2-Delta (P2，批號1-073121-1)之間的序列比較
基因體位置   (基因) CDX-005中之核苷酸(P2) CDX-005.2中之核苷酸(P2) 引起胺基酸變化 備註
1013 (nsp2) G A Glu (GAA) → Lys (AAA) 自發的
10833 (nsp5) C A Ala (GCC) → Asp (GAC) 自發的
11089 (nsp6) A G Glu (GAA → GAG)，無變化 自發的
12557 (nsp8) A U Ile (AUC) → Phe (UUC) 自發的
21618 (棘蛋白) C G Thr (ACA) → Arg (AGA) 德耳塔特異性
21668 (棘蛋白) G A Val (GUU) → Ile (AUU) 自發的
21846 (棘蛋白) U* C Ile (AUU) → Thr (ACU) 德耳塔特異性
21987 (棘蛋白) G A Gly (GGU) → Asp (GAU) 德耳塔特異性
22029 (棘蛋白) A (del) G Glu (GAG) → Gly (GGA) 德耳塔特異性
22030 (棘蛋白) G (del) A 德耳塔特異性
22296 (棘蛋白) G* A (22290) Arg (CGU) →His (CAU) 德耳塔特異性
22917 (棘蛋白) U G (22911) Leu (CUG) → Arg (CGG) 德耳塔特異性
22995 (棘蛋白) C A (22989) Thr (ACA) → Lys(AAA) 德耳塔特異性
23403 (棘蛋白) A G (23397) His (CAU) → Arg (CGU) 德耳塔特異性
24201 (棘蛋白) U* C (24195) Val (GUA) → Ala (GCA) 德耳塔特異性
24374 (棘蛋白) G A (24368) Asp (GAC) → Asn (AAU) 德耳塔特異性
24376 (棘蛋白) C U (24370) 德耳塔特異性
28818 (N) C U (22812) Ser (UCA) → Leu (UUA) SIIPL疫苗批號中之U
*CDX-005中恢復為野生型SARS-CoV-2 (德耳塔)-特異性胺基酸之自發突變 實例 11
倉鼠用去優化SARS-CoV2 (CDX.005)或野生型SARS-CoV2 WA/1進行IN疫苗接種。疫苗接種後第27天，倉鼠經SARS-CoV2變體貝塔IN攻擊。經由MN分析針對SARS-CoV2變體貝塔評定中和抗體效價。圖1B展示對B.1.351之交叉中和優於來自WT感染倉鼠之血清。
本發明之各種實施例描述於上文實施方式中。儘管此等描述直接描述以上實施例，但應理解，熟習此項技術者可設想對本文所展示及描述之特定實施例的修改及/或變化。在本說明書之範圍內之任何此類修改或變化亦意欲包括於其中。除非專門指出，否則本發明人之意圖為本說明書及申請專利範圍中之字語及片語給出對一般熟習適用技術者而言一般且慣常之含義。
已呈現本申請人在遞交本申請案時已知之本發明之各種實施例的前述描述且意欲出於說明及描述之目的。本說明書不意欲為詳盡的或將本發明限制於所揭示之精確形式，且鑒於以上教示內容，許多修改及變化為可能的。所描述之實施例用以解釋本發明之原理及其實際應用，且以使熟習此項技術者能夠在各種實施例中利用本發明且各種修改適合於所涵蓋之特定用途。因此，希望本發明不受限於實現本發明所揭示之特定實施例。
儘管已展示且描述本發明之特定實施例，但熟習此項技術者將顯而易見係，基於本文中之教示，可在不背離本發明及其更廣泛態樣之情況下作出變化及修改，且因此，隨附申請專利範圍應在其範疇內涵蓋屬於在本發明之真正精神及範疇內的所有此類變化及修改。熟習此項技術者應理解，一般而言，本文所使用之術語一般預期作為「開放式」術語(例如，術語「包括(including)」應解釋為「包括但不限於(including but not limited to)」，術語「具有」應解釋為「具有至少」，術語「包括(includes)」應解釋為「包括但不限於(includes but is not limited to)」等)。
如本文所使用，術語「包含(comprising/comprises)」係在提及組合物、方法及其各別組分時使用，該等組合物、方法及其各別組分對實施例而言為有用的，而對於未規定的要素之內容而言為開放的，無論其是否為有用的。熟習此項技術者應理解，一般而言，本文所使用之術語一般預期作為「開放式」術語(例如，術語「包括(including)」應解釋為「包括但不限於(including but not limited to)」，術語「具有」應解釋為「具有至少」，術語「包括(includes)」應解釋為「包括但不限於(includes but is not limited to)」等)。儘管本文中使用開放式術語「包含」作為諸如包括、含有或具有之術語的同義詞來描述及主張本發明，但本發明或其實施例可替代地使用諸如「由…組成」或「基本上由…組成」之替代術語來描述。
在參考圖式中說明例示性實施例。本文中所揭示之實施例及圖式意欲視為說明性而非限制性的。
圖1A描繪CDX-005 (去優化SARS-CoV-2「華盛頓分離株(Washington Isolate)」病毒)對溫度敏感，亦即其在較高溫度下更減毒。相同量之CDX-005病毒(諸如100,000/5log稀釋或10,000/4log稀釋)將在37℃下而非在40℃下形成溶菌斑。在40℃下，需要更多病毒(亦即，更低稀釋，諸如100/2log稀釋)來查看任何溶菌斑，且彼等病毒極小。另一方面，野生型病毒似乎不對溫度敏感；其在兩種溫度下表現得同樣良好。
圖1B描繪CDX-005、CDX-005.1 (貝塔變體)之溶菌斑形成。第一列描繪在37℃下進行之CDX-005 3天培育。第二列描繪在40℃下進行之CDX-005 3天培育。第三列描繪在37℃下進行之CDX-005.1 (貝塔變體) 3天培育。第二列描繪在40℃下進行之CDX-005.1 (貝塔變體) 3天培育。此圖亦展示CDX-005及CDX-005.1對溫度敏感，亦即其在較高溫度下更減毒。相同量之CDX-005及CDX-005.1病毒(諸如100,000/5log稀釋或10,000/4log稀釋)將在37℃下而非在40℃下形成溶菌斑。在40℃下，需要更多病毒(亦即，更低稀釋，諸如100/2log稀釋)來查看任何溶菌斑，且彼等病毒極小。此展示CDX-005.1在40℃下對溫度重度敏感。在12孔集群中的相同批次之Vero E6細胞單層上同時進行溶菌斑分析，其在37℃或40℃下進行3天培育之後用結晶紫(Crystal Violet)染色。來自相同病毒稀釋系列之CDX-005 (頂部兩列)及CDX-005.1 (下部兩列)樣本用於在37℃或40℃下進行溶菌斑分析。然而CDX-005及CDX-005.1兩者在37℃下形成類似的溶菌斑，40℃下之CDX-005溶菌斑明顯更小、不規則地成形且數目大大減小(大約1,000倍)。CDX-005.1比CDX-005甚至更重度地溫度受限且在40℃下在任何稀釋下不形成可見的溶菌斑。在高溫下的溫度敏感性表型(人體相當於發燒)一般視為減毒活病毒疫苗之積極安全特徵。另一方面，參看圖1A中之野生型病毒，似乎對溫度不敏感；其在兩種溫度下表現同樣良好。溫度敏感性表型為減毒活疫苗之良好及合乎需要的特徵。其可充當「安全閥(safety valve)」。疫苗在低溫下在疫苗接受者(37℃(正常身體溫度))中充分複製以誘導免疫反應。若事情未按計劃進行，諸如在對疫苗高度敏感之特定個體中，該個體可能會發熱，此將減少病毒複製/活性以防止事情變得糟糕。
圖2描繪敍利亞金倉鼠中在給藥野生型SARS-COV-2及CDX-005之後的體重變化。
圖3描繪Vero細胞中野生型WA1及CDX-005之生長。將Vero細胞用0.01MOI之野生型WA1或CDX-005感染且在33℃或37℃下培養至多96小時。收集上清液以回收病毒。藉由溶菌斑形成分析測定效價且報導為PFU/ml培養基之對數。
圖4A至圖4D描繪倉鼠中之CDX-005之活體內減毒。用5×10 4或5×10 3PFU/ml之野生型WA1、5×10 4PFU/ml CDX-005接種倉鼠。在第2天及第4天，藉由qPCR在4A)嗅球，4B)大腦及4C)肺中PI量測病毒RNA。(N=3隻/組；條形圖=SEM)。4D)藉由TCID 50分析評定接種之倉鼠之左肺組織中的感染性病毒負荷且表示為TCID 50/ml之log 10。CDX-005與野生型WA1治療組之間的差異為顯著的(N=3隻/組；P＜0.001；條形圖=SEM)。水平線指示LOD。
圖5A至圖5C描繪倉鼠中之CDX-005之活體內減毒。用5×10 4或5×10 3PFU/ml之野生型WA1、5×10 4PFU/ml之CDX-005接種倉鼠。5A)每天量測倉鼠之體重，持續九天。CDX-005與野生型WA1治療組(對於CDX-005及野生型WA1 5×10 4，N=10-40隻/組；N=3-12隻/組，野生型WA1 5×10 3；P＜0.001；條形圖=SEM)之間的體重變化明顯不同。5B & 5C)在第2天、第4天及第6天PI檢查蘇木精(Hematoxylin)及曙紅染色之肺切片且對細胞浸潤進行評分。(N=3隻/組)
圖6A至圖6D描繪在倉鼠中之功效。6A)用未治療倉鼠對照血清或在用野生型WA1或5×10 4PFU CDX-005接種後第16天用自倉鼠收集之血清進行Spike-S1 ELISA。亦在第18天(WA1攻擊後兩天)量測經CDX-005接種之倉鼠的棘蛋白S1 IgG。終點IgG效價展示為比背景高5×之稀釋對數。(N=3隻/組；條形圖=SEM) 6B)在接種5×10 4或5×10 3PFU之野生型WA1或5×10 4PFU CDX-005之後16天，在倉鼠血清中測試針對SARS-CoV-2 WA1之溶菌斑還原中和效價(PRNT)。PRNT為最後一次血清稀釋度之倒數，其相對於含有未治療倉鼠血清之孔中之彼等使溶菌斑數目減少了50%、80%或90%。(N=3隻/組；條形圖=SD)；6C)在疫苗接種後第16天經CDX-005疫苗接種之倉鼠及未治療動物用5×10 4PFU之野生型SARS-CoV-2攻擊。在攻擊後第2天採集肺且藉由qPCR量測病毒負荷且表示為qPCR基因體/毫升組織之log 10。(N=3隻/組；條形圖=SD)。6D)用媒劑、5×10 4PFU之野生型WA1或5×10 4CDX-005疫苗接種且接種後27天用5×10 4PFU/ml之野生型WA1經鼻內攻擊之倉鼠。在攻擊當天記錄體重且其後每天記錄體重，持續4天。(N=5-6天0-2，N=3天3-4，條形圖=SEM)。6A)及6B)中之結果係來自兩個單獨的倉鼠研究。
圖7描繪非洲綠猴(African Green Monkey)中之減毒。在用10 6PFU野生型WA1或CDX-005接種後第4天及第6天自猴收集氣管灌洗液。使灌洗液經受RT-qPCR以偵測病毒。N=3隻/組(第4天)或N=2隻/組(第6天)。
圖8描繪非洲綠猴中10 6之野生型SARS-COV2相對於CDX-005鼻內劑量。
圖9描繪自Vero細胞採集之CDX-005之粗主體效價。Vero WHO「10-87」細胞接種有1.8 × 10 4PFU之CDX-005 (約0.01 MOI)，接著生長48小時。使用所展示之不同流程採集病毒。
圖10展示經由反向遺傳學成功挽救CDX-005.1病毒。在2021年5月7日，在用來源於合成基因體DNA之合成基因體RNA轉染Vero WHO 10-87細胞之後3天，藉由對VeroE6細胞進行溶菌斑分析測試細胞上清液之感染性CDX-005.1病毒之存在。在4.6 × 10 5PFU/mL之效價下偵測到感染性CDX-005.1病毒，且溶菌斑大小與CDX-005之彼等溶菌斑大小不可區分。
圖11展示經由反向遺傳學成功挽救CDX-005.2病毒。在用來源於合成基因體DNA之合成基因體RNA轉染Vero WHO 10-87細胞之後4天，藉由對VeroE6細胞進行溶菌斑分析測試細胞上清液之感染性CDX-005.2病毒之存在。在2.5 × 10 5PFU/mL之效價下偵測到感染性CDX-005.2病毒，且溶菌斑大小與CDX-005之彼等溶菌斑大小不可區分。
圖12展示在40℃下對溫度敏感的CDX-005.2。在12孔集群中的相同批次之Vero E6細胞單層上同時進行溶菌斑分析，其在37℃或40℃下進行4天培育之後用結晶紫(Crystal Violet)染色。來自相同稀釋系列之CDX-005.2 (上部列)及CDX-005 (下部列)樣本用於在37℃或40℃下進行溶菌斑分析。在40℃下，相較於37℃之容許溫度，兩種病毒之溶菌斑明顯更小、不規則地成形且數目大大減小(對於CDX-005，大約1,000倍，且對於CDX-005.2，10,000倍)。在高溫下的溫度敏感性表型(人體相當於發燒)一般視為減毒活病毒疫苗之積極安全特徵。
圖13展示去優化SARS-CoV2 (CDX.005)作為針對南非變體B.1.351之疫苗的功效。
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Claims (33)

  1. 一種聚核苷酸，其包含：編碼親本SARS-CoV-2變體之一或多種病毒蛋白或其一或多個片段的聚核苷酸： 其中該聚核苷酸與其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸相比經重新編碼，且 其中由該聚核苷酸編碼的該親本SARS-CoV-2變體之該一或多種病毒蛋白或其一或多個片段之胺基酸序列保持相同，或 其中由該聚核苷酸編碼的該親本SARS-CoV-2變體之該一或多種病毒蛋白或其一或多個片段之胺基酸序列包含至多20個胺基酸取代、添加或缺失， 其中該一或多種病毒蛋白或其一或多個片段包含棘蛋白(spike protein)或其片段。
  2. 如請求項1之聚核苷酸，其中 該親本SARS-CoV-2變體包含SEQ ID NO:1，或 該親本SARS-CoV-2變體包含其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G的SEQ ID NO:1，或 該親本SARS-CoV-2變體包含其中SEQ ID NO:1中存在一或多個突變之SEQ ID NO:1；及 其中SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或其中存在一或多個突變之SEQ ID NO:1中的棘蛋白編碼序列經來自SARS-CoV-2變體的經重新編碼之棘蛋白編碼序列置換。
  3. 如請求項1之聚核苷酸，其中該SARS-CoV-2變體係選自由以下組成之群：英國變體(U.K. variant)、南非變體(South Africa variant)、巴西變體(Brazil variant)、德耳塔變體(Delta variant)及奧密克戎變體(Omicron variant)。
  4. 如請求項1至3中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸係藉由相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸係以減少密碼子對偏好(codon-pair bias；CPB)或減少密碼子使用偏好來重新編碼。
  5. 如請求項1至3中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸係藉由相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸係以增加CpG或UpA二核苷酸之數目來重新編碼。
  6. 如前述請求項中任一項之聚核苷酸，其中該等經重新編碼之一或多種病毒蛋白中之各者或其該等經重新編碼之一或多個片段中之各者具有小於-0.05、小於−0.1、小於−0.2、小於−0.3或小於−0.4的密碼子對偏好。
  7. 如前述請求項中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸係經CPB去優化。
  8. 如前述請求項中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸相較於其親本SARS-CoV-2變體聚核苷酸係經密碼子去優化。
  9. 如請求項7至8中任一項之聚核苷酸，其中該密碼子去優化或該CPB去優化係基於人類中頻繁使用之密碼子或CPB。
  10. 如請求項7至8中任一項之聚核苷酸，其中該密碼子去優化或該CPB去優化係基於冠狀病毒中頻繁使用之密碼子或CPB。
  11. 如請求項7至8中任一項之聚核苷酸，其中該密碼子去優化或該CPB去優化係基於野生型SARS-CoV-2冠狀病毒中頻繁使用之密碼子或CPB。
  12. 如前述請求項中任一項之聚核苷酸，其中弗林蛋白酶裂解位點(furin cleavage site)係經消除。
  13. 一種載體，其包含如請求項1至12中任一項之聚核苷酸。
  14. 一種細胞，其包含如請求項1至12中任一項之聚核苷酸或如請求項13之載體。
  15. 如請求項14之細胞，其中該細胞為Vero細胞或幼倉鼠腎(baby hamster kidney；BHK)細胞。
  16. 一種多肽，其由如請求項1至12中任一項之聚核苷酸編碼。
  17. 一種經修飾SARS-CoV-2變體，其包含如請求項1至12中任一項之聚核苷酸。
  18. 一種經修飾SARS-CoV-2變體，其包含由如請求項1至12中任一項之聚核苷酸編碼的多肽。
  19. 如請求項17至19中任一項之經修飾SARS-CoV-2變體，其中其病毒蛋白中之一或多者之表現與其親本SARS-CoV-2變體相比係經降低的。
  20. 如請求項17至19中任一項之經修飾SARS-CoV-2變體，其中其病毒蛋白中之一或多者之表現的降低係由於重新編碼棘蛋白或其片段而降低。
  21. 一種用於誘導個體中免疫反應之免疫組合物或疫苗組合物，其包含： 如請求項17至20中任一項之一或多種經修飾SARS-CoV-2變體。
  22. 如請求項21之免疫組合物或疫苗組合物，其進一步包含經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒，該經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒包含 具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO:1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的聚核苷酸，其中具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之該聚核苷酸與該經修飾SARS-CoV-2變體中之聚核苷酸不相同，或 由具有SEQ ID NO:1、其中nt 9469自A變為G且nt 26222自T變為G之SEQ ID NO1或含有至多20個突變之SEQ ID NO:1的該聚核苷酸編碼的多肽，其中由具有含有至多20個突變之SEQ ID NO:1之聚核苷酸編碼的該多肽與該經修飾SARS-CoV-2變體中之多肽不相同， 其中該免疫組合物或疫苗組合物為多價免疫組合物或疫苗組合物。
  23. 如請求項21或請求項22之免疫組合物或疫苗組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  24. 一種引發個體中免疫反應之方法，其包含： 向該個體投與一定劑量的： 如請求項17至20中任一項之經修飾SARS-CoV-2變體，或 如請求項21至23中任一項之免疫組合物或疫苗組合物。
  25. 一種引發個體中免疫反應之方法，其包含： 向該個體投與預致敏劑量的如請求項17至20中任一項之經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒，或如請求項21至23中任一項之免疫組合物或疫苗組合物；及 向該個體投與一或多種增強免疫劑量的如請求項17至20中任一項之經修飾SARS-CoV-2冠狀病毒，或如請求項21至23中任一項之免疫組合物或疫苗組合物。
  26. 如請求項24至25中任一項之方法，其中該免疫反應為保護性免疫反應。
  27. 如請求項24至26中任一項之方法，其中該劑量為防治有效或治療有效劑量。
  28. 如請求項24至27中任一項之方法，其中投與係經鼻途徑進行。
  29. 如請求項24至27中任一項之方法，其中投與係經鼻滴劑進行。
  30. 如請求項24至27中任一項之方法，其中投與係經鼻噴霧進行。
  31. 如請求項24至30中任一項之方法，其中該劑量為約10 4-10 6PFU，或該預致敏劑量為約10 4-10 6PFU且該一或多種增強免疫劑量為約10 4-10 6PFU。
  32. 一種製備去優化SARS-CoV-2變體之方法，其包含： 獲得編碼親本SARS-CoV-2變體之一或多種蛋白質或其一或多個片段的核苷酸序列； 重新編碼該核苷酸序列以降低該一或多種蛋白質或其該一或多個片段之蛋白質表現；及 將具有該經重新編碼之核苷酸序列之核酸代入至該親本SARS-CoV-2變體基因體中以製備該去優化SARS-CoV-2變體基因體， 其中相較於親本病毒，該經重新編碼之核苷酸序列之表現降低。
  33. 如請求項32之方法，其中該去優化SARS-CoV-2變體為如請求項17至20中之任一者。
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