KR101777367B1

KR101777367B1 - Fmr1 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제를 이용한 cgg 반복의 교정

Info

Publication number: KR101777367B1
Application number: KR1020150127904A
Authority: KR
Inventors: 김동욱; 박철용
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2017-09-12
Also published as: KR20170030729A

Abstract

본 발명은 FMR1(Fragile X mental retardation 1) 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제를 이용한 CGG 반복 염기서열 부위의 교정 및 이를 이용한 취약 X 증후군(Fragile X syndrome)의 치료에 관한 것이다. 본 발명의 CGG 반복 염기서열 부위의 교정은 상동재조합을 위한 외인성(exogenous) 기여 서열(donor sequence)의 이용이나 야생형 대립유전자의 이용 없이, 엔도뉴클레아제에 의하여 유도된 NHEJ(non-homologous end joining)를 통한 비정상적인 CGG 반복의 결실-매개 교정(deletion-mediated correction)이다.

Description

FMR1 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제를 이용한 CGG 반복의 교정{Editing CGG triplet repeats using Endonuclease for Targeting Fragile X mental retardation 1}

본 발명은 FMR1(Fragile X mental retardation 1) 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제를 이용한 CGG 반복 염기서열 부위의 교정 및 이를 이용한 취약 X 증후군(Fragile X syndrome)의 치료에 관한 것이다.

취약 X 증후군(Fragile X syndrome, FXS)은 남성에서 3600명 중 한명의 비율로 발생하는 지적장애의 가장 흔한 유전질환으로서, X 염색체에 위치하는 FMR1 유전자의 침묵(silencing)에 의하여 발병한다(1-3). FXS의 원인 돌연변이는 FMR1의 5'-UTR(5'-untranslated region) 내의 트리플 뉴클레오티드 CGG 반복(CGG repeat)의 확대이다(4-5). 정상인은 5 내지 55 카피의 CGG 반복을 갖는 반면, 환자는 200 카피 이상을 가지고 있는 등 완전변이(full mutation)되어 있다(6). 완전 변이를 갖는 환자의 FMR1의 침묵은 비정상적인 DNA 메틸화와 CGG 반복의 후성학적 변화(epigenetic change)와 관련되어 있음이 증명되었다(7-10).

한편, 병에 걸린 사람 유래의 환자 특이적 iPSC(induced pluripotent stem cell)는 원인 돌연변이의 교정을 통한 유전 질환의 치료 및 연구를 위한 유망한 치료자원으로서 제안되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

Crawford, D.C., Acuna, J.M., and Sherman, S.L. (2001). FMR1 and the fragile X syndrome: human genome epidemiology review. Genet. Med. 3, 359-371 O'Donnell, W.T., and Warren, S.T. (2002). A decade of molecular studies of fragile X syndrome. Ann. Rev. Neurosci. 25, 315-338. Penagarikano, O., Mulle, J.G., and Warren, S.T. (2007). The pathophysiology of fragile x syndrome. Ann. Rev.Ggenomics Hum. Genet. 8, 109-129 Fu, Y.H., Kuhl, D.P., Pizzuti, A., Pieretti, M., Sutcliffe, J.S., Richards, S., Verkerk, A.J., Holden, J.J., Fenwick, R.G., Jr., Warren, S.T., and et al. (1991). Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell67,1047-1058 Verkerk, A.J., Pieretti, M., Sutcliffe, J.S., Fu, Y.H., Kuhl, D.P., Pizzuti, A., Reiner, O., Richards, S., Victoria, M.F., Zhang, F.P., and et al. (1991). Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell65,905-914. Pearson, C.E., Nichol Edamura, K., and Cleary, J.D. (2005). Repeat instability: mechanisms of dynamic mutations. Nat. Rev. Genet. 6, 729-742. Urbach, A., Bar-Nur, O., Daley, G.Q., and Benvenisty, N. (2010). Differential modeling of fragile X syndrome by human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell6,407-411. Eiges, R., Urbach, A., Malcov, M., Frumkin, T., Schwartz, T., Amit, A., Yaron, Y., Eden, A., Yanuka, O., Benvenisty, N., and Ben-Yosef, D. (2007). Developmental study of fragile X syndrome using human embryonic stem cells derived from preimplantation genetically diagnosed embryos. Cell Stem Cell1,568-577. Avitzour, M., Mor-Shaked, H., Yanovsky-Dagan, S., Aharoni, S., Altarescu, G., Renbaum, P., Eldar-Geva, T., Schonberger, O., Levy-Lahad, E., Epsztejn-Litman, S., and Eiges, R. (2014). FMR1 epigenetic silencing commonly occurs in undifferentiated fragile X-affected embryonic stem cells. Stem Cell Rep. 3, 699-706 Tabolacci, E., Moscato, U., Zalfa, F., Bagni, C., Chiurazzi, P., and Neri, G. (2008). Epigenetic analysis reveals a euchromatic configuration in the FMR1 unmethylated full mutations. Eur. J. Hum. Genet. 16, 1487-1498

본 발명자들은 FMR1 유전자의 5'-UTR 내 CGG 반복 염기서열 부위에 의해 유발되는 취약 X 증후군에 대한 효율적이고 근원적인 치료방법을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 CGG 반복 염기서열 부위의 위쪽(upstream) 부위를 타겟팅하는 가이드 RNA 및 타겟팅 된 부위를 절단하는 RNA-유도 엔도뉴클레아제를 이용하여 일정 카피수 이상의 CGG 트리뉴클레오티드를 성공적으로 제거할 수 있고, 이러한 CGG 트리뉴클레오티드의 제거가 줄기세포의 능력에는 영향을 미치지 않음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 FMR1 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위의 교정용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 FMR1 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위가 교정된 유도만능 줄기세포의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 FMR1 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위가 교정된 배아줄기세포의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 취약 X 증후군 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 FMR1(fragile X mental retardation 1) 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위의 교정용 조성물을 제공한다:

(a) RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 상기 RNA-유도 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드; 및

(b) 상기 CGG 반복 염기서열 부위의 시작 위치에서부터 위쪽(upstream)에 위치하는 100여개의 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 15-25 bp 길이의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 CGG 반복 염기서열 부위의 끝 위치에서부터 아래쪽(downstream)에 위치하는 50여개의 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 15-25 bp 길이의 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA(guiding RNA), 또는 상기 유도 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드.

본 발명자들은 FMR1 유전자의 5'-UTR 내 CGG 반복 염기서열 부위에 의해 유발되는 취약 X 증후군에 대한 효율적이고 근원적인 치료방법을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 CGG 반복 염기서열 부위의 위쪽(upstream) 부위를 타겟팅하는 가이드 RNA 및 타겟팅 된 부위를 절단하는 RNA-유도 엔도뉴클레아제를 이용하여 일정 카피수 이상의 CGG 트리뉴클레오티드를 성공적으로 제거할 수 있고, 이러한 CGG 트리뉴클레오티드의 제거가 줄기세포의 능력에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

본 발명자들이 확인한 본 발명과 관련된 주요 실험결과는 다음과 같다.

본 발명자들은 RGEN(RNA-guided endonucleases) 시스템을 사용하여 FMR1의 5′-UTR 내에 위치한 CGG 반복부위를 교정하였으며, CGG 반복의 제거가 FXS 환자 유래의 iPSC(FXS-iPSC)에서 억제(silenced)된 FMR1 유전자 발현의 재활성화를 유도할 수 있음을 규명하였다. 또한, 본 발명자들은 CGG 반복이 교정된 FXS 환자의 세포에서 FMR1 프로모터의 완전한 DNA 탈메틸화가 야기되었음을 규명하였으며, 이러한 결과는 FXS-iPSC의 FMR1 프로모터의 DNA 메틸화 상태가 CGG 반복에 의존적이며, CGG 반복의 메틸화 상태에 따라 계속적으로 유지되고 있음을 보여준다. 이상과 같은 연구는, 교정용 주형 DNA의 사용 없이, 환자 특이적 iPSC에서 CGG 반복부위의 완전 변이를 조작된 뉴클레아제를 사용하여 교정시킬 수 있음을 최초로 규명한 연구이다. 이와 같은 전략은 FXS 치료를 위한 세포 치료에 적용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "뉴클레오티드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 사용된 용어, "특이적으로 인식"은 본 발명의 타겟 서열과의 상보성에 기초하여 이를 선택적으로 인식하는 것을 의미하며, 이에 "특이적으로 결합(annealing)"과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 상기 용어, "상보적"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건 하에서 본 발명의 유도 RNA가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가진다.

상기 용어, "실질적으로 상보적"은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링 할 수 있는 범위 내에서, 유도 RNA와 FMR1 유전자의 핵산 서열 사이에 부분적으로 불일치되는 서열이 포함된다는 의미이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "CGG 반복 염기서열 부위"는 FXS의 병인으로 여겨지는 FMR1 유전자의 5'-UTR 내의 CGG 트리뉴클레오티드가 반복적으로 나타나는 부위를 의미한다. FXS 환자는 상기 CGG 반복 염기서열 부위에 200 카피수 이상의 CGG 트리뉴클레오티드를 갖는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에서, 상기 "CGG 반복 염기서열 부위"는 "CGG 반복" 또는 "CGG 반복부위"와 실질적으로 동일한 의미로서, 이들 용어는 서로 혼용되어 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "CGG 반복 염기서열 부위의 교정"은 CGG 반복 염기서열 부위의 위쪽(upstream) 또는 아래쪽(downstream) 뉴클레오티드 서열의 절단에 의한 일정 카피수 이상의 CGG 트리뉴클레오티드(CGG 반복 염기서열 부위에 존재하던)가 제거되는 것을 의미한다. 따라서, 상기 용어 "CGG 반복 염기서열 부위의 교정"은 "CGG 트리뉴클레오티드의 결실(제거)"과 실질적으로 동일한 의미로 볼 수 있다. 이와 같은 일정 카피수의 CGG 트리뉴클레오티드의 결실에 의하여 FXS 환자의 CGG 반복부위에 존재하던, 예를 들어 200 카피수 이상의 CGG 트리뉴클레오티드는 정상인의 범위인 55 카피수 미만으로 교정될 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 CGG 트리뉴클레오티드의 제거에 의하여 FMR1 유전자의 위쪽에 위치하는 CpG 섬(CpG island)의 탈메틸화가 유도된다. 이러한 탈메틸화에 따라 FMR1 유전자의 발현이 가능해진다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 CGG 반복 염기서열 부위의 교정은 CGG 반복 염기서열 부위의 위쪽(upstream) 뉴클레오티드 서열의 절단에 의한 일정 카피수의 CGG 트리뉴클레오티드의 제거이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 일정 카피수의 CGG 트리뉴클레오티드의 제거에 의하여 FMR1 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위에는 5-55 카피수의 CGG 트리뉴클레오티드가 존재하게 된다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 RNA-유도 엔도뉴클레아제는 Cas9(CRISPR associated protein 9)이다.

하기 실시예에서 확인된 바와 같이, FMR1 유전자 내 CGG 반복 염기서열 부위에 인접한 뉴클레오티드 서열의 절단에 의하여 일정 카피수 이상의 CGG 트리뉴클레오티드가 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물에는 (ⅰ) 상기 CGG 반복 염기서열 부위의 시작 위치에서부터 위쪽(upstream)에 위치하는 100여개의 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 15-25 bp 길이의 뉴클레오티드 서열, (ⅱ) 상기 CGG 반복 염기서열 부위의 끝 위치에서부터 아래쪽(downstream)에 위치하는 50여개의 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 15-25 bp 길이의 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA(guiding RNA), 또는 (ⅲ) 상기 유도 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드가 포함된다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 유도 RNA는 CGG 반복 염기서열 부위의 시작 위치에서부터 위쪽(upstream)에 위치하는 서열인 서열목록 제1서열의 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 15-25 bp 길이의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA이다.

보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 유도 RNA는 CGG 반복 염기서열 부위의 시작 위치에서부터 위쪽(upstream)에 위치하는 서열인 서열목록 제2서열의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA이다. 서열목록 제2서열은 서열목록 제1서열에 포함된 서열이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의하여 교정되는 상기 FMR1 유전자는 FXS 환자의 FMR1 유전자이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 FMR1 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위가 교정된 유도만능 줄기세포의 제조방법을 제공한다:

(a) 취약 X 증후군 환자로부터 분리된 체세포를 역분화시켜 유도만능 줄기세포를 수득하는 단계; 및

(b) 상기 유도만능 줄기세포를 본 발명의 조성물과 접촉시키거나, 본 발명의 조성물이 삽입된 유전자 전달체로 형질전환 시키는 단계.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 체외로 분리된 취약 X 증후군 환자 유래의 배아줄기세포를 본 발명의 조성물과 접촉시키거나, 본 발명의 조성물이 삽입된 유전자 전달체로 형질전환 시키는 단계를 포함하는 FMR1 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위가 교정된 배아줄기세포의 제조방법을 제공한다.

FXS 환자로부터 분리된 체세포를 역분화시켜 수득한 유도만능 줄기세포는 환자 고유의 FMR1 유전자 내의 CGG 반복부위를 간직하고 있으며, 이는 상술한 본 발명의 방법을 통해 인 비트로에서 교정될 수 있다. 이와 같이 교정함으로써, 정상범위의 CGG 트리뉴클레오티드 카피수를 갖는 환자 맞춤형 유도만능줄기세포를 수득할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포를 지칭하며, 역분화 유도만능 줄기세포로도 지칭된다. 유도만능 줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로 세포 외형, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하고, 인 비트로 및 인 비보에서 전분화능을 가지며, 테라토마(teratoma)를 형성하고, 유전자의 생식선 전이(germline transmission)가 가능하다. 본 발명의 유도만능 줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 포유류 유래의 역분화 유도만능 줄기세포를 포함하며, 구체적으로는 인간 유래의 유도만능 줄기세포이며, 가장 구체적으로는 FXS 환자로부터 유래한 유도 만능 줄기세포이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "역분화"는 존재하는 분화 세포들을 미분화 상태로 되돌려 새로운 분화 조직 형성이 가능하도록 하는 후성학적인 역행과정을 의미하는 것으로 리프로그래밍 과정이라고도 말하며 세포 유전체의 후성학적인 변형(epigenetic changes)의 가역성에 기초한 것이다. 본 발명에서의 목적에 따라, 상기"역분화"란 0% 이상 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정이라면 모두 이에 포함되고, 예를 들어 0%의 분화능을 가지는 분화된 세포를 1%의 분화능을 가지는 분화된 세포로 미분화시키는 과정도 이에 포함될 수 있다.

상기 역분화는 이미 분화된 세포의 분화능을 회복시킬 수 있는 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 FXS 환자로부터 분리된 체세포에 OCT4, NANOG, SOX2, LIN28, KLF4 및 c-MYC로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 형질전환함으로써 이루어질 수 있다.

유도만능 줄기세포를 얻기 위해 인간 체세포를 배양하는 데에 이용되는 배지는 통상적인 어떠한 배지도 포함한다. 예를 들어, Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM(Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM(Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640(Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12(Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10(Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM(Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1(Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A(McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어, "유전자 전달체"는 원하는 타겟 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 이상적인 유전자 전달체는 인체 또는 세포에 무해하고 대량생산이 용이하며, 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다.

상기 용어, "유전자 전달"은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포 내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.

본 발명의 유전자 전달체를 제조하기 위해, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 상기 용어, "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 유전자 전달체는 다양한 형태로 제작할 수 있는데, 이는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다.

본 발명의 뉴클레오티드 서열은 통상적인 동물 형질전환에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 예를 들어, 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Act . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다.

본 발명에서, 유전자 전달체가 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 상기 접촉시키는 단계는 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시될 수 있다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 문헌에 기재되어 있다.

본 발명에서 유전자 전달체가 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포 내로 도입시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 의하여 제조되어 FMR1 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위가 교정된 유도만능 줄기세포 또는 배아줄기세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 유도만능 줄기세포 또는 배아줄기세포를 유효성분으로 포함하는 FXS 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 유도만능 줄기세포 또는 배아줄기세포는 FXS 환자의 CGG 반복부위가 교정된 세포로서, 적절한 체세포로 분화되어 환자에게 이식되면 교정된 유전자를 발현하기 때문에 난치병인 FXS 대한 유용한 세포 치료용 조성물이 될 수 있다. 본 발명의 조성물은 직접 체내 이식된 채 인 비보에서 목적세포로 분화를 유도할 수도 있고, 혹은 인 비트로에서 목적세포로 분화를 완료한 뒤 체 내에 이식할 수도 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)를 참조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 혈관 내(intravascular) 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 10²-10¹⁰ 세포이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 FMR1 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제를 이용한 CGG 반복 염기서열 부위의 교정 및 이를 이용한 취약 X 증후군의 치료에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명의 CGG 반복 염기서열 부위의 교정은 상동재조합을 위한 외인성(exogenous) 기여 서열(donor sequence)의 이용이나 야생형 대립유전자의 이용 없이, 엔도뉴클레아제에 의하여 유도된 NHEJ(non-homologous end joining)를 통한 비정상적인 CGG 반복의 결실-매개 교정(deletion-mediated correction)이다.

(ⅲ) 본 발명의 엔도뉴클레아제를 이용한 CGG 반복 염기서열 부위의 교정은 줄기세포의 분화능력에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명은 FXS 환자 유래 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1a-1f는 FMR1의 5'-UTR 서열분석 및 오프-타겟 절단 분석 결과를 보여준다. (1a) FMR1 유전자 5'-UTR의 도식도. 전사 시작부위와 엑손 1 내의 CGG 확장 부위를 나타내었다. 파란색 화살표 머리는 PCR 프라이머 결합 부위를 나타내며, 프라이머에 대한 설명은 표 1에 기재되어 있다. (1b) 각 세포로부터 게놈 DNA를 분리하였다. CGG 확장과 이의 인접 영역의 서열을 Sanger 서열분석 방법으로 분석하였다. FMR1 유전자의 참조 서열(Ref Sep)을 NCBI(NM_001185082.1)에서 추출하였다. 밑줄 쳐진 N은 확인되지 않은 서열을 나타낸다. (1c) RGEN 코딩 플라스미드로 트랜스펙션 된 세포로부터 게놈 DNA를 분리하였다. PCR 산물을 분리하고, 서열을 분석하였다. RGEN 표적 서열을 파란색으로 표시하였고, PAM 서열을 빨간색으로 표시하였다. 빨강 삼각형은 절단 부위를 나타내며, -는 결실된 염기를 나타내고, 소문자 이탤릭채는 삽입된 염기를 나타낸다. 삽입되거나 결실된 염기의 수를 오른쪽 란에 나타내었다. (1d) 실험에 사용한 RGEN의 잠재적인 오프-타겟 서열들을 Cas-OFFinder를 사용하여 계산하여 찾았다. 미스매칭 된 염기를 파란색으로 표시하였다. PAM 서열을 빨간색으로 표시하였다. 관련 있는 유전자들의 이름을 오른쪽 란에 나타내었다. (1e) RGEN 표적 부위와 유사성이 높은 4개의 잠재적인 오프-타겟 부위를 PCR로 증폭하였다. 이들 위치에서의 오프-타겟 절단 활성을 확인하기 위하여, T7E1 분석을 실시하였다. (1f) 대립유전자(Allele) 확장 PCR을 FXS-iPSC 및 교정된 FXS-iPSC 클론 E1과 E3에 대하여 실시하였다. 분석 결과, FXS-iPSC는 200카피 이상의 CGG 반복을 가지고 있는 반면, 교정된 FXS 클론들에서는 반복이 검출되지 않았다.
도 2a-2f는 RGEN 유도 돌연변이 및 FMR1의 재활성화를 보여준다. (2a) RGEN 결합 부위를 FMR1 5'-UTR의 모식도에 나타내었다. PAM 서열은 빨간색으로 표시하였다. (2b) RGEN 표적 부위의 돌연변이를 T7E1 분석으로 HEK-293T 세포에서 추정하였다. 별표는 T7E1에 의하여 잘려진 DNA 밴드 상의 예상된 위치를 나타낸다. (2c) 야생형(WT), 환자(FXS) 및 교정된(E) 세포주의 게놈 DNA의 PCR 분석 결과. (2d) 각 유형의 세포로부터 증폭된 PCR 산물의 서열을 분석하였다. 각 RGEN 표적 서열을 각각 밑줄로 나타내었다. PAM 서열을 빨간색으로 표시하고, 절단된 위치를 빨강 삼각형으로 나타내었으며, 결실된 염기를 /로 표시하였으며, 삽입된 염기를 소문자 이탤릭채로 나타내었다. 야생형 세포(WT), FXS 환자 세포(FXS) 및 교정된 클론(E1 내지 E3)의 FMR1 mRNA 발현을 분석하였다. 미분화 세포(2e) 및 소모성(expendable) NPC(2f)에서의 FMR1 유전자의 발현을 검출하기 위하여 qPCR을 사용하였다. GAPDH 발현을 정규화에 사용하였다. 에러 바는 표준 오차(SE)를 나타낸다. n은 세 번의 독립적인 실험.
도 3a-3f는 WT 및 FXS 클론의 신경 로제트 형성과 FMRP 염색을 보여준다. (3a) 듀얼 Smad 억제에 의하여 세포들로부터 분화된 신경 로제트의 명시야상(Bright-field images). 모세포와 교정된 클론 사이에 신경 로제트 형성능에 차이가 없었다. 스케일 바: 200 ㎛. (3b) FXS와 WT iPSC 내 APRT, CRYAA 및 FMR1의 상대적 발현 수준은 WT와 FXS iPSC의 APRT와 CRYAA의 발현 수준이 유사하였고, FXS iPSC에 비하여 WT iPSC의 FMR1 발현 수준이 높았다. (3c) 전분화능 마커들의 qPCR 분석은 WT와 FXS-iPSC의 교정된 클론들(E1 또는 E3)과 교정되지 않은 클론들 사이에 주요한 차이가 없음을 보여준다. GAPDH 발현을 정규화를 위하여 사용하였다. 에러 바는 표준 오차(SE)를 나타낸다. n = 세 번의 독립적인 실험. (3d) 면역화학을 통한 야생형 iPSC(WT), 환자 ESC(FX) 및 교정된 ESC 클론 내 FMRP의 검출. 피더가 없는(feeder-free) 배지에서 자란 미분화 세포들을 고정하고 항체로 염색하였다. DAPI 신호(파랑)는 이미지 내의 전체 세포를 나타낸다. 스케일 바: 50 ㎛. (3e) 글루타메이트 수용체 유전자들의 발현 수준은 FXS 유래의 뉴런에서 교정 후 하향 조절되었다. 교정된 FXS iPSC 막대 위의 숫자는 교정되지 않은 세포의 발현 수준에 비례한 발현 수준의 분수를 나타낸다. (3f) 핵심 신경세포 유전자들의 발현 수준은 FXS 뉴런과 교정된 FXS 뉴런 사이에 유사하였다.
도 4a-4d는 FMR1 프로모터의 메틸화 및 크로마틴 구조(conformation) 분석 결과를 보여준다. (4a) 메틸화 분석에 사용하기 위한 22개의 CpG 부위를 유전자 전사 시작부위로부터 -395 내지 -256 염기쌍의 FMR1 프로모터에 나타내었다. (4b) 교정되거나 교정되지 않은 WT과 FXS-NPC(하단 패널)뿐만 아니라, WT, FXS 및 교정된 FXS-iPSC(상단 패널)에 대하여 FMR1 프로모터의 22개의 CpG에 대한 파이로시퀀싱을 실시하였다. FXS-iPSC는 유전자 교정 전 완전한 메틸화를 보였고, 대부분의 위치에서 교정 후 광범위한 탈메틸화를 보였다(상단 패널). NPC의 경우, WT과 교정된 WT-NPCs는 모든 분석 위치에서 프로모터의 저메틸화를 보였고, FXS-NPCs는 과메틸화를 보였다. FXS-NPC와 반대로, 두 교정된 FXS-NPC 클론들은 WT과 유사한 수준의 메틸화를 보이는 등 현저한 저메틸화를 보였다(하단 패널). (4c) 모든 CpG 부위에서의 메틸화 수준의 정량은 각 유형의 세포들의 평균 메틸화 비율을 보여준다. WT-iPSC는 저메틸화를 보였고, FXS-iPSC는 과메틸화를 보였다. CGG 반복의 교정 후, FXS-iPSC는 WT-iPSC와 유사한 저메틸화를 보였다(왼쪽 그래프). 비슷한 메틸화 비율이 앞서 언급한 세포들로부터 분화된 NPC에서 확인되었다(오른쪽 그래프). (4d) FXS-iPSC 및 교정된 FXS-iPSC에 대하여 크로마틴 면역침강을 실시하였다. 그래프는 크로마틴 마커들에 대한 상대적 강화 정도(relative fold enrichment)를 보여준다. APRT는 열린 크로마틴(open chromatin)을 나타내고, CRYAA는 닫힌 크로마틴(closed chromatin)을 나타내며, FMR1은 APRT 및 CRYAA와 비교하였다. 실험 결과, FXS-iPSC의 FMR1 프로모터는 닫힌 크로마틴 마커와 비슷하였고, 교정 후 상기 프로모터는 열린 크로마틴 마커가 우세하였다. 에러 바는 SE를 나타내며, *p<0.05, **p<0.005(Student's t-test에 의한)이다.
도 5a-5d는 교정된 FXS 세포에서의 FMRP의 회복을 보여준다. (5a) 면역화학을 통한 야생형 iPSC(WT), 환자 유래의 iPSC(FXS) 및 교정된 클론들(E1 및 E3) 내의 FMRP의 검출. 피더가 없는(feeder-free) 배지에서 자란 미분화 세포들을 고정하고 항체로 염색하였다. DAPI 신호(파랑)는 이미지 내의 전체 세포 존재를 나타낸다. 스케일 바: 50 ㎛. (5b) WT, 교정된 WT(E1), FXS 및 교정된 FXS 클론들(E1 및 E3) 내의 FMRP의 면역블랏 분석. GAPDH를 로딩 대조군으로 이용하였다. (5c) 각 유형의 세포들의 NPC 내 FMRP를 면역블랏 분석으로 확인하였다. GAPDH를 로딩 대조군으로 이용하였다. (5d) 면역화학을 통한 야생형(WT), 환자(FXS) 및 교정된 iPSC 클론들(E1 및 E2) 내의 FMRP 검출. 각 세포주로부터 60일 동안 분화된 성숙한 뉴런을 고정하고, 항체로 염색하였다. DAPI 신호(파랑)는 이미지 내의 전체 세포 존재를 나타낸다. 스케일 바: 50 ㎛.
도 6은 FMR1 재활성화 모델을 보여준다. FXS-iPSC에서, FMR1은 CGG 반복의 완전 변이(full mutation)와 이들의 메틸화로 인하여 침묵되고(silenced), 이는 FMR1의 프로모터에 영향을 미친다. RGEN에 의한 CGG 반복의 제거 후, 상기 프로모터는 이의 억압 마커(repressive marker)로부터 방출되고, 완전히 탈메틸화 된다. FMR1 프로모터의 탈메틸화는 상기 유전자가 전사되도록 하며, 이에 따라 FMR1은 재활성화된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

세포 배양

HEK-293T 세포는 10% 소 태아 혈청과 1% 항생제가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's 배지에서 자라게 하였다. 인간 야생형 iPSC(WT-iPSCs Epi3 line)(Park et al., 2014, Proc. Natl Acad. Sci. USA 111, 9253-9258), 야생형 iPSC1(Urbach et al., 2010, Cell Stem Cell 6, 407-411), FXS-유래 iPSC(Urbach et al., 2010, Cell Stem Cell 6, 407-411), 야생형 ESC(Eiges et al., 2007, Cell Stem Cell1, 568-577), FXS-유래 ESC(Eiges et al., 2007, Cell Stem Cell1, 568-577) 및 상기의 세포주로부터 얻어진 교정된 세포주는 4 ng/㎖의 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF; PeproTech)를 포함하는 hESC 배지에서 유지시켰다. NPC를 얻기 위하여, 문헌(Kim et al., 2010, Stem Cell Rev. 6, 270-281)에 기술된 바와 같이, 듀얼 SMAD-억제 프로토콜을 사용하여 iPSC 및 ESC에서 신경 로제트를 유도하였다. 문헌(Kim et al., 2012, PLoS ONE 7, e39715)에 기술된 바에 따라 신경세포(neurons)로 분화시켰다. 피더가 없는 상태에서의 배양(feeder-free culturing)을 위하여, 모든 세포주들을 Essential 8^TM배지(Life Technology)에서 배양하였다.

Cas9 코딩 플라스미드 및 트랜스펙션

Cas9 단백질과 sgRNA를 발현하는 플라스미드를 ToolGen, Inc.(한국)로부터 구입하였다. Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/; Bae et al., 2014a)를 사용하여 잠재적인 오프-타겟 위치를 조사하였다. 7개의 잠재적인 오프-타겟 위치가 조사되었으며, 이중에서 4개는 엑손에 위치하였다. 뉴클레아제 유도 삽입/결손(nuclease-induced indels)을 조사하기 위하여, 상기 4개의 엑손 상의 오프-타겟 위치를 T7E1 어세이로 분석하였다. 돌연변이 유도를 관찰하기 위하여, HEK-293T 세포를 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여, Cas9과 sgRNA를 코딩하는 플라스미드로 공동 트랜스펙션 시켰다. CGG 반복의 교정을 위한, 상기 플라스미드의 iPSC 또는 ESC로의 트랜스펙션을 위하여 microporator 시스템(Neon; Invitrogen)을 사용하였다. STO 세포 피더 층에서 배양된 인간 iPSC 및 ESC를 collagenase type IV를 사용하여 수확하였다. PBS로 세척한 후, 문헌(Desbordes et al., 2008, Cell Stem Cell 2, 602-612)에 따라 세포를 단일세포로 분리하였다. RGEN과 sgRNA 플라스미드를 상기 단일세포들과 혼합한 다음, 30 ms 동안 850 V의 전압을 가하였다. 세포를 피더 층에 재분주한 후 10일간 자라게 하였다. CGG 반복 게놈 교정(CGG repeats genomic editing)을 검출하기 위하여, 세포를 용해시키고, 문헌(Park et al., 2014, Proc. Natl Acad. Sci. USA 111, 9253-9258)에서와 같이 PCR을 실시하였다. 사용한 프라이머 서열을 표 1에 나타내었다.

T7E1 어세이

Cas9과 sgRNA 플라스미드로 공동 트랜스펙션 한 후 4일째에, DNeasy Tissue 키트(Qiagen)를 사용하여 트랜스펙션 된 세포로부터 게놈 DNA를 분리 정제하였다. 이후, 뉴클레아제 타겟 위치가 포함된 DNA 절편을 표 1의 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다. 열을 가하여 증폭된 duplex DNA를 변성시키고 어닐링 하여 heteroduplex DNA 절편을 생성하였다(Guschin et al., 2010, Methods Mol. Biol. 649, 247-256). 이후, 샘플에 T7 엔도뉴클레아제 1을 37℃에서 20분간 처리하여 미스매치 위치를 절단시키고, 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여 절단되지 않은(교정되지 않은) 절편과 절단된 절편의 밴드 강도를 확인하였다. 수학식, "돌연변이 빈도(%) = (1-parental fraction) x 100"을 사용하여 돌연변이 비율을 계산하였다.

단세포(clonal cells)의 분리 및 PCR 분석

교정된 세포들의 단세포 집단(clonal populations)을 분리하기 위하여, CGG 반복에 결실을 갖는 것으로 PCR을 통하여 확인된 각 콜로니를 단일세포로 분리시킨 후, 새로운 피더 층(feeder layer)에 재분주 하였다. 세 번의 계대배양 후, 2 내지 3개의 클론을 서열분석과 추가 실험을 위하여 선택하였다. CGG 반복의 서열을 확인하기 위하여, 업스트림 영역과 다운스트림 영역을 포함하는 게놈 DNA를 Ex-Taq polymerase(Takara)와 표 1의 프라이머를 사용하여 PCR 분석하였다. HEK-293T, WT-iPSC 및 WT-ESC에서의 CGG 반복의 전체 서열을 알아내기 위하여, LA-taq와 GC 버퍼 I(Takara)을 사용하였다. 증폭된 PCR 산물을 전기영동한 후 아기로스 겔로 용출시켰다. PCR 증폭에서 사용한 프라이머를 이용하여 용출된 DNA 절편의 서열을 분석하였다. FXS iPSC 및 교정된 FXS iPSC 클론 E1과 E3의 CGG 반복 길이의 분석을 AmplideX FMR1 PCR 키트(Asuragen)를 사용하여 실시하였다.

RNA 분리, RT-PCR 및 마이크로어레이

전체 RNA를 세포로부터 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 분리하였다. 총 RNA 1 ㎍을 DiaStar^TM cDNA 합성 키트(SolGent, 한국)를 이용한 cDNA 합성에 사용하였다. FMR1 발현을 확인하기 위하여, 합성한 cDNA를 주형으로 사용하여 EmeraldAmp PCR Master Mix(Takara)로 PCR을 실시하였다. FMR1 mRNA의 수준을 정량하기 위하여, SYBR^ⓡPremixEx-Taq(Takara)를 사용하여 qPCR을 실시하였다. FMR1 mRNA의 증폭을 위하여, 엑손 3에 위치하는 정방향 프라이머(FMR1-qF) 및 엑손 4에 위치하는 역방향 프라이머(FMR1-qR)를 사용하였다(Chiurazzi et al., 1999, Hum. Mol. Genet. 8, 2317-2323). qPCR에 사용한 프라이머의 서열은 상기 표 1에 나타내었다.

마이크로어레이 분석을 위하여, 제조사(Affymetrix)의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다. RNA를 Human Gene 1.0 ST 마이크로어레이 플랫폼(Affymetrix) 분석에 이용하였고, 세척과 스캐닝을 제조사의 프로토콜에 따라 실시하였다. 어레이를 Affymetrix Expression Console의 Robust Multichip Analysis(RMA)를 사용하여 분석하였다.

DNA 메틸화 분석

DNA 메틸화 분석을 위하여, NucleoSpin Tissue kit(Macherey-Nagel)를 사용하여 게놈 DNA를 분리 정제하였다. FMR1 프로모터의 22개의 CpG 위치를 타겟팅하는 프라이머 세트를 사용하여 EpigenDx(Hopkinton, MA)에 의뢰하여 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)을 실시하였다.

ChIP (Chromatin immunoprecipitation)

ChIP를 위하여, FXS 및 교정된 FXS-iPSC를 모아 고정하고, 포름알데하이드 용액으로 가교결합 시킨 후 용해한 다음 초음파 처리하였다. 연어 정액 아가로스 비드(Millipore)를 4℃에서 1시간 동안 처리하여 크로마틴이 맑아지게 하였다. 크로마틴의 면역침강을 항-아세틸화 히스톤 H3 항체(Millipore 06599), 항-메틸화 히스톤 H3(at lysine 4) 항체(Millipore 17614) 및 항-메틸화 히스톤 H3(at lysine 9) 항체(Millipore 17648)를 사용하여 하룻밤 동안 실시하였다. 하룻밤 동안의 인큐베이션 후, 가교결합을 되돌렸고(reversed), PCR clean-up kit(Qiagen)를 사용하여 DNA를 회복시켰다. 용출된 DNA 절편을 quantitative PCR 분석에 사용하였으며, 상기 PCR 분석에는 FMR1 프로모터, APRT 프로모터(양성 대조군) 및 CRYAA 프로모터(음성 대조군)에 대한 프라이머를 사용하였다. ChIP qPCR에 사용한 프라이머 서열을 표 1에 나타내었다.

웨스턴 블랏 분석

세포를 단백질분해효소 억제제 혼합물(Roche)이 포함된 RIPA 버퍼를 사용하여 얼음에서 20분간 용해시켰다. Bradford assay(Bio-Rad)를 통하여 단백질의 농도를 측정하였다. 이후, 동량의 단백질을 전기영동으로 분리하고, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막(Millipore)에 옮겼다. PBS에 용해된 5% 비지방 탈지유로 블로킹 한 후, 막을 항-FMRP 항체(AbFrontier, Korea)와 항-GAPDH 항체(Santa Cruz)와 함께 0.05% Tween 20이 함유되어 있는 Tris-buffered saline(20 mM Tris-HCl 및 500 mM NaCl)에서 상온에서 2시간 동안인큐베이션 하였다. Tris-buffered saline/Tween에서 두 번 세척한 후, 막을 호스래디시 페록시다아제-컨쥬게이트 염소 항-마우스 항체와 함께 Tris-buffered saline/Tween에서 상온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 단백질은 enhanced chemiluminescence kit (Amersham Biosciences)를 사용하여 검출하였다.

면역염색

FMRP의 면역염색을 위하여, 세포를 4% 파라포름알데하이드 용액으로 고정한 다음, 0.2% Triton X-100으로 투과화(permeabilization)를 실시하였다. 5% 정상 염소 혈청과 2% 소 혈청 알부민이 함유된 PBS 용액으로 블로킹 한 후, 세포를 항-OCT3/4(Santa Cruz), 항-FMRP(AbFrontier, Korea) 및 항-MAP2(Millipore)로 구성된 군으로부터 선택된 1차 항체 중 하나의 항체와 상온에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. PBS 용액으로 세 번 세척한 후, 세포를 형광-결합(fluorescence-conjugated) 2차 항체(Alexa Fluor 488 or 594; Invitrogen)와 함께 상온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 이후, 0.1% Tween 20이 함유된 PBS 용액으로 세척하고, 핵을 관찰하기 위하여 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole(DAPI; Vector Laboratories)를 포함하는 마운팅 배지(mounting medium)에 올려놓았다. Olympus IX71 현미경 또는 FSX 시스템을 사용하여 이미지를 캡처하고, 분석하였다.

통계 분석

데이터는 평균 ± 표준 오차(SE)로 나타내었다. Student's t test로 데이터의 유의성을 평가하였다. p<0.05를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

실험결과

FMR1 유전자의 5'-UTR 서열 분석

CGG 반복의 결실을 가능하게 할 FMR1 유전자 내 DNA 서열을 찾기 위하여, 야생형(WT)- 및 FXS-iPSC와 ESC의 CGG 반복과 이들의 인접 영역(CGG 반복의 업스트림과 다운스트림)의 서열을 분석하였다. 먼저 FMR1-F 및 FMR1-R 프라이머 세트를 사용하여 WT 세포주로부터 5'-UTR을 증폭하였다(도 1a). FXS-iPSC와 FXS-ESC의 경우에는, FMR1-F/FMR1-R1 및 FMR1-F1/FMR1-R을 각각 사용하여 CGG 반복의 업스트림 영역과 다운스트림 영역을 개별적으로 증폭시켰다(도 1a). 이와 같이 실시한 이유는, 종래의 PCR 방법으로는 FXS 환자에서 발견되는 200 카피 이상의 완전 돌연변이 된 CGG 반복을 증폭시키는 것이 어렵기 때문이다. 실제로, 본 실험에서 사용한 FXS-iPSC가 450 카피 이상의 CGG 반복을 가지고 있으며, 본 실험에서 사용한 FXS-ESC가 200 카피 이상의 CGG 반복을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Gray et al., 2007, Mol. Cell. Biol. 27, 426-437; Eiges et al., 2007, Cell Stem Cell 1, 568-577). 우리의 WT 세포는 하나의 AGG 트리뉴클레오티드와 연결되거나 되지 않은 9-10개의 CGG 트리뉴클레오티드의 반복된 구조를 가지고 있었다(도 1b, 표 2). 흥미롭게도, WT과 환자 유래 세포에서의 인접한 업스트림 및 다운스트림 영역의 서열은 동일하였다(도 1b).

세포	CGG 반복의 카피수
Ref(NCBI # NM_001185082.1)	CGG(10) AGG(1) CGG(9)
HEK-293T	CGG(10) AGG(1) CGG(9) AGG(1) CGG(9)
WT-iPSC	CGG(9) AGG(1) CGG(19)
WT-iPSC1	CGG(9) AGG(1) CGG(10) AGG(1) CGG(9)
WT-ESC	CGG(10) AGG(1) CGG(9) AGG(1) CGG(9)
FXS-iPSC	200 카피수의 반복 이상*
FXS-ESC	200 카피수의 반복 이상**

괄호 안의 숫자는 반복된 서열의 수를 나타낸다.

*FXS-iPSC의 카피수는 문헌 Gray, S.J., et al. An origin of DNA replication in the promoter region of the human fragile X mental retardation (FMR1) gene. Mol. Cell. Biol. 27, 426-437 (2007)에서 분석되었다.

**FXS-ESC의 카피수는 문헌 Eiges, R., et al. Developmental study of fragile X syndrome using human embryonic stem cells derived from preimplantation genetically diagnosed embryos. Cell Stem Cell 1, 568-577 (2007)에서 분석되었다.

HEK-293T 세포에서의 FMR1 유전자 내 RGEN 유도 돌연변이

다음으로, Cas9 뉴클레아제 및 CGG 반복의 업스트림 서열의 말단을 표적으로 하는 sgRNA로 구성된 RGEN을 제조하였다(도 2a). RGEN의 게놈 교정(genome-editing) 활성을 검증하기 위하여, T7 엔도뉴클레아제 1(T7E1) 분석을 HEK-293T 세포에서 실시하였다. RGEN 활성은 상대적으로 높았는데, 표적 위치에서 41%의 빈도로 돌연변이를 유도하였다(도 2b). 후속 서열분석에서, 작은 삽입과 결실(indels)뿐만 아니라, 크게 결실된 서열이 RGEN 표적 위치에서 확인되었다(도 2c). RGEN 시스템을 사용할 때 오프-타겟 돌연변이가 바람직하지 않은 영향을 미칠 수 있음을 고려하여(Fu et al., 2013, Nat. Biotechnol. 31, 822-826; Hsu et al., 2013, Nat. Biotechnol. 31, 827-832; Pattanayak et al., 2013, Nat. Biotechnol. 31, 839-843; Cho et al., 2014, Genome Res. 24, 132-141), 이러한 돌연변이 유형이 본 실험에서 사용한 RGEN 시스템에 의하여 야기된 것인지 여부를 조사하였다. 인간 게놈 내의 온-타겟 위치와 유사한 4개의 잠재적인 오프-타겟 위치를 Cas-OFFinder 프로그램을 사용하여 조사하였다(도 1d). 이후, 본 실험에서 사용한 RGEN 시스템이 이들 위치에서 어떠한 검출 가능한 오프-타겟 돌연변이를 발생시키지 않았음을 T7E1 분석을 통하여 검증하였다(도 1e).

환자의 iPSC와 ESC에서의 CGG 반복의 표적화(Targeted) 게놈 교정

환자 세포에서 FXS를 바로잡기 위하여, 고안한 RGEN을 FXS-iPSC 및 FXS-ESC를 교정하기 위하여 이용하였다. Cas9과 sgRNA 플라스미드를 WT 세포, FXS-iPSC 및 FXS-ESC로 전기천공한 후, 교정된 클론을 스크리닝 하기 위하여 PCR 기반 유전형질 분석(genotyping)을 실시하였다. 모든 교정된 WT-iPSC 및 WT-ESC 중에서 오직 모세포주와 비교하여 약 90 bp의 CGG 반복 결실을 가지고 있는 클론을 후속 실험에 대조군으로 사용하기 위하여 선별하였다(표 2). FXS-iPSC 및 FXS-ESC에서, 오직 90 bp 결실된 WT 세포의 PCR 산물과 유사한 크기의 PCR 산물을 갖는 클론을 선별하였다(도 2c). 스크리닝과 추가적인 계대배양 후, CGG 반복 결실을 갖는 각 세포 유형 유래의 2-3개의 교정된 세포를 약 100개의 콜로니에서 구축하고(2-3% 효율), PCR-기반 유전형질 분석으로 확인하였다(도 2c). 모든 교정된 세포는 FMR1의 5'-UTR에서 CGG 반복 서열의 결실을 보였다(도 2d). 이러한 결과는, CGG 반복의 업스트림의 표적화된(targeted) DSB(DNA double-strand break)가 Cas9 뉴클레아제에 의하여 유도되었고, 비정상적으로 돌연변이된 반복을 크게 결실시킬 수 있음을 보여준다. 끝으로, 선별된 교정된 FXS-iPSC에서의 CGG 반복의 완전한 절제(ablation)를 검증하기 위하여, 교정된 FXS-iPSC 클론 E1과 E3뿐만 아니라 우리의 FXS-iPSC도 AmplideX^ⓡ FMR1 PCR 키트를 사용하여 분석하였다. 분석 결과, 모세포주인 FXS-iPSC가 200개 이상의 CGG 반복을 가지고 있는 반면, 교정된 FXS iPSC 클론에서는 CGG가 검출되지 않았다(도 1f).

교정된 FXS-iPSC 및 FXS-신경전구세포(NPC)에서의 FMR1 유전자 발현의 재개

게놈 DNA 교정 결과를 토대로, CGG 반복의 결실이 FMR1의 재활성화를 초래하는지 여부를 분석하였다. 기능하지 않는(silenced) FMR1 유전자의 재활성화를 평가하기 위하여, WT- 및 FXS-iPSC에서, 교정되거나 교정되지 않은 동질유전자(isogenic) 세포주에서 qPCR 분석을 통하여 mRNA 수준을 측정하였다. FXS 환자의 iPSC 모델과 달리, FXS-ESC에서는 FMR1의 발현이 활성인 상태로 남아 있었고, 사일런싱(silencing)은 성숙한 뉴런으로의 아주 긴 분화 후에만 가끔씩 얻을 수 있었다(Urbach et al., 2010, Cell Stem Cell 6, 407-411). 환자 유래의 iPSC와 ESC 사이의 이러한 차이점 때문에, 우리는 iPSC 모델 시스템에서의 게놈 교정에 의한 FMR1 유전자의 재활성화에 초점을 맞추었다. 흥미롭게도, 교정된 FXS-iPSC (FXS-iPSC 클론 E1 및 E3)에서, 침묵된(silenced) FMR1 mRNA의 재활성화가 CGG 반복의 결실 후에 일어났다. 또한, FMR1 mRNA 수준이 대조군 WT 세포에서 관찰된 수준과 유사하게 회복되었다. 나아가, 상기 결실은 교정되지 않은 모세포주와 비교하여 교정된 WT-iPSCs에서는 FMR1의 전사에 어떠한 주요한 변화를 보여주지 못하였다(도 2e).

iPSC에서 확인된 재활성화가 신경 분화를 통하여 계속 유지되는지 알아보기 위하여, WT, FXS-교정된 및 FXS-교정되지 않은 동질유전자 세포주로부터 신경 로제트를 유도하였다. 그들의 모세포주와 비교할 때, 교정된 iPSC와 ESC 사이에 신경 로제트 형성율에 차이가 없었으며, 이러한 결과는 본 실험에서 사용한 모든 세포주들이 초기 뉴런 세포로 분화할 수 있는 유사한 잠재력을 가지고 있음을 보여준다(도 3a). FMR1 유전자의 전사는 WT-iPSC의 발현 수준과 유사하게, 모든 교정된 FXS-iPSC 세포주(주로, FXS-iPSC E1, E2 및 E3)로부터 분화된 NPC에서 유지되었다(도 2f).

FMR1의 프로모터 부위 내 메틸화 상태 분석

FMR1의 RNA 수준에서의 성공적인 재활성화를 확인한 후, 이러한 mRNA 발현의 변화가 FMR1의 프로모터 부위의 후생적(epigenetic) 변화와 관련되어 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 먼저, CGG 반복의 결실이 프로모터의 업스트림에 위치하는 CpG 아일랜드(CpG island)에 영향을 미치는지 알아보기 위하여, iPSC의 FMR1 프로모터의 메틸화 상태를 분석하였다. 파이로시퀀싱을 이용하여, FMR1 전사 시작부위로부터 -395 ~ -256 bp 사이의 22개의 CpG 부위를 분석하였다(도 4a). 그 결과, RGEN에 의한 FXS-iPSC에서의 CGG 반복의 결실 전, 대부분의 CpG 부위가 100%의 메틸화를 보인바와 같이, 모든 CpG 부위는 과하게 메틸화(hyper methylated)되어 있었다(도 4b). 교정된 FXS-iPSC 클론에서의 FMR1 프로모터의 상기와 동일한 위치의 22개의 CpG 부위를 분석한 결과, 많은 CpG 부위의 메틸화 수준이 WT 세포에서 확인된 메틸화 수준과 유사하여 프로모터의 현저한 탈메틸화가 검출되었다(도 4b). 상기 파이로시퀀싱 결과를 정량한 결과, WT-iPSC 프로모터의 평균 메틸화 수준은 0.4%였으며, FXS-iPSC의 평균 프로모터 메틸화는 97.4%에 달하였다. 교정된 FXS-iPSC를 분석한 결과, FXS-iPSC 클론 E1은 10%였고, FXS-iPSC 클론 E3은 단지 0.8%로 WT-iPSC와 유사한 수준을 나타내어, 프로모터의 평균 메틸화가 현저히 감소하였음을 확인하였다(도 4c).

상기 WT, FXS, 교정된 WT 및 교정된 FXS-iPSC로부터 얻은 NPC의 FMR1 프로모터 메틸화 수준을 분석하였다. iPCS에서 관찰된 것과 마찬가지로, NPC 또한 교정된 FXS 클론과 교정되지 않은 FXS 클론 사이의 프로모터 메틸화 수준의 현저한 변화가 확인되었다. 비록 WT-NPC와 교정된 WT-NPC는 모든 부위가 거의 비메틸화인 저메틸화를 보였으나, FXS-NPC는 대부분 위치가 거의 100%의 메틸화(과메틸화)를 보였다(도 4b). 교정된 클론에서는, 두 FXS-NPC 클론들은 대부분 위치가 거의 메틸화되지 않아 뚜렷한 저메틸화를 보였다(도 4b). 모든 부위를 정량한 결과, WT과 교정된 WT-NPC의 FMR1 프로모터의 평균 메틸화는 각각 0.2%와 0.7%였다(도 4c). FXS-NPC의 평균 프로모터 메틸화 수준은 87.4%에 달하였고, 교정된 FXS-NPC의 평균 프로모터 메틸화 수준은 WT-NPC의 수준과 유사하게 두 클론에서 모두 겨우 0.2%였다(도 4c).

FMR1 유전자의 크로마틴 구조의 변화를 분석하기 위하여, 전사적으로(transcriptionally) 활성인 크로마틴 상태를 보여주는 히스톤 3 테일 아세틸화(histone 3 tail acetylation; H3 Ace) 및 히스톤 3 K4 메틸화(histone 3 K4 methylation; H3 K4meth)에 대한 크로마틴 면역침강, 및 억제된(repressed) 크로마틴 상태를 보여주고 FMR1 사일런싱과 관련된 히스톤 3 K9 메틸화(histone 3 K9 methylation; H3 K9meth)에 대한 크로마틴 면역침강을 실시하였다(Coffee et al., 2002, Am. J. Hum. Genet. 71, 923-932; Coffee et al., 1999, Nat. Genet. 22, 98-101). 활성화된 크로마틴에 대한 두 마커인 H3 Ace 및 H3 K4meth은 CGG 반복의 교정 후에 현저하게 상향 조절되었고, 억제된 크로마틴 마커인 H3 K9meth은 현저히 하향 조절되었다(도 4d). 또한, RT-PCR을 통하여 WT과 FXS-iPSC의 APRT, CRYASA 및 FMR1의 발현 수준을 분석하였다. 상기 발현 분석은 발현과 후생유전적 변경(epigenetic modification) 사이의 상관관계를 확인시켜 주었다(도 3b). 이러한 결과는, CGG 반복의 제거가 FMR1 프로모터의 메틸화 상태와 크로마틴 상태에 대하여 후생유전적 영향을 미침을 보여준다.

교정된 FXS 클론에서의 FMRP 수준의 회복

끝으로, 교정된 iPSC 세포주와 이들의 모세포주를 대상으로 면역세포화학 염색을 통하여 FMR1 단백질(FMRP)의 존재를 확인하고자 하였다. 예상과 같이, WT-iPSC 염색이 FMRP에 대하여 양성인 것과 반대로, 미분화 FXS-iPSC의 염색은 FMRP에 대하여 음성이었다(도 5a). 이상의 결과는 FMRP를 보다 더 민감하게 검출할 수 있는 웨스턴 블랏으로 한 번 더 증명되었다(도 5b). 상기에서 설명한 전사 및 후생유전(epigenetic) 결과와 비슷하게, FMRP 수준이 교정된 FXS-iPSC E1과 E3에서 회복되었다. 모든 교정된 세포주들은 그들의 모세포주와 유사한 OCT4 염색을 보였다(도 5a). 나아가, 다른 전분화능(pluripotency) 마커는, qPCR 분석 결과 두 교정 세포주들과 그들의 모세포주에서 비슷한 발현 수준을 보였다(도 3c). 이러한 결과는, CGG 반복의 결실을 초래하는 절차가 교정된 클론들의 전분화능에는 부정적 영향을 미치지 않음을 보여준다. 교정된 ESC 세포주를 추가 분석한 결과, 그들의 동질유전자형(isogenic)의 모세포주(ESC)와 유사한 FMRP 염색을 보였다(도 4d). 다음으로, FXS-iPSC 클론 E1 및 E3로부터 유래된 NPC를 대상으로 웨스턴 블랏으로 FMRP의 존재를 분석한 결과, 높은 수준의 FMRP가 확인되었다(도 5c).

FMRP의 존재가 교정된 FXS-iPSC 클론으로부터 유래된 성숙한 뉴런에서도 유지되는지 여부를 조사하였다. 이를 위하여, 동질유전자형의 교정된 세포주 뿐만 아니라, 이들의 WT- 및 FXS-iPSC를 성숙한 뉴런으로 분화시켰다(Kim et al., 2010, Stem Cell Rev. 6, 270-281; Kim et al., 2012, PLoS ONE 7, e39715). 이후, 분화된 뉴런을 FMRP 및 성숙한 뉴런 마커인 MAP2(microtubule-associated protein 2)에 대하여 염색하였다. 모든 분화된 세포주들은 MAP2에 대하여 양성 염색되었으며, 이러한 결과는 성숙한 뉴런으로 성공적으로 분화되었음을 보여준다(도 5d). 다행스럽게도, 모세포주인 교정되지 않은 FXS-iPSC로부터 분화된 뉴런과 달리, FXS-iPSC 클론 E1 및 E2로부터 분화된 성숙한 뉴런은 FMRP에 대하여 양성 염색되었다(도 5d). 재활성화된 단백질(FMRP)의 잠재적인 효과를 조사하기 위하여, 교정된 FXS 성숙한 뉴런의 유전자 발현을 그들의 동질유전자형의 모세포주 유래의 뉴런과 비교하였다. 상기 유전자 발현 분석은 교정된 FXS 뉴런과 교정되지 않은 FXS 뉴런 사이에 차별적으로 발현된 약간의 유전자를 확인시켜 주었으며, 이들 유전자에는 서로 다른 글루타메이트 수용체 유전자들이 많이 포함되어 있었다. 몇몇 글루타메이트 수용체 유전자들은 교정 후 2배 이상의 RNA 수준의 감소를 보인 반면(도 3e), 다른 핵심 뉴런 유전자들은 유사한 발현 수준을 보였다(도 3f). 이러한 결과는 FXS 뉴런에서의 글루타메이트 수용체 활성의 조절 이상(dysregulation)을 보여주는 이전의 연구결과(Dolen et al., 2007, Neuron, 56,955-962)와 관련되어 있다.

종합적으로, 상기의 결과들은 비정상적인 반복의 결실을 통한 유전자형의 수정(correction)이 FMR1 유전자의 발현과, FXS-iPSC 및 그들의 신경 파생물들(neural derivatives)에서의 FMRP 수준을 회복시킬 수 있음을 보여준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, Yonsei University <120> Editing CGG triplet repeats using Endonuclease for Targeting Fragile X mental retardation 1 <130> PN150352 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> potential RGEN target site in upstream region of CGG repeat <400> 1 cttccggtgg agggccgcct ctgagcgggc ggcgggccga cggcgagcgc gggcggcggc 60 ggtgacggag gcgccgctgc caggggg 87 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGEN target site in upstream region of CGG repeat <400> 2 tgacggaggc gccgctgcca 20 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMR1-F <400> 3 tcaggcgctc agctccgttt cggtttca 28 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMR1-R <400> 4 aagcgccatt ggagccccgc acttcc 26 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMR1-F1 <400> 5 cggcggcggc tgggcctcga g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMR1-R1 <400> 6 ccgccgccgc gctgccgcac g 21 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDC42BPG-F <400> 7 cctgcgccat ccacgtagat gccagca 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDC42BPG-R <400> 8 gcagacatct tccaggtggg ggagtgc 27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VPS39-F <400> 9 cagggcacaa gatagccagt aatgtcc 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VPS39-R <400> 10 agaattagcc tgaaacctgt tctgatg 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELAVL1-F <400> 11 caggtgtccc tgcaccccct ttgtgac 27 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELAVL1-R <400> 12 gtttccacat cctggaggag gggt 24 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCNT7-F <400> 13 caggagaatc gcttgaaatc aggaggc 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCNT7-R <400> 14 caagacgctg acccatgaat gccacga 27 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F <400> 15 gaacatcatc cctgcctcta ctg 23 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R <400> 16 caggaaatga gcttgacaaa gtgg 24 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F1 <400> 17 cccctcaagg gcatcctggg cta 23 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R1 <400> 18 gaggtccacc accctgttgc tgta 24 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMR1-qF <400> 19 gtatggtacc atttgttttt gtg 23 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMR1-qR <400> 20 catcatcagt cacatagctt ttttc 25 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMR1 promoter F <400> 21 aactgggata accggatcga t 21 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMR1 promoter R <400> 22 ggccagaacg cccatttc 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APRT promoter F <400> 23 gccttgactc gcacttttgt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APRT promoter R <400> 24 taggcgccat cgattttaag 20 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRYAA promoter F <400> 25 ccgtggtacc aaagctga 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRYAA promoter R <400> 26 agccggctgg ggtagaag 18

Claims

다음을 포함하는 FMR1(fragile X mental retardation 1) 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위의 교정용 조성물:
(a) RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 상기 RNA-유도 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드; 및
(b) 상기 CGG 반복 염기서열 부위의 시작 위치에서부터 위쪽(upstream)에 위치하는 100여개의 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 15-25 bp 길이의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 CGG 반복 염기서열 부위의 끝 위치에서부터 아래쪽(downstream)에 위치하는 50여개의 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 15-25 bp 길이의 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA(guiding RNA), 또는 상기 유도 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드;
상기 CGG 반복 염기서열 부위의 교정은 CGG 반복 염기서열 부위의 위쪽(upstream) 또는 아래쪽(downstream) 뉴클레오티드 서열의 절단에 의한 일정 카피수의 CGG 트리뉴클레오티드의 제거이며, 상기 CGG 트리뉴클레오티드의 제거에 의하여 FMR1 유전자의 위쪽(upstream)에 위치하는 CpG 섬(CpG island)에 탈메틸화를 유도하는 FMR1 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위의 교정용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 RNA-유도 엔도뉴클레아제는 Cas9(CRISPR associated protein 9)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 유도 RNA는 CGG 반복 염기서열 부위의 시작 위치에서부터 위쪽(upstream)에 위치하는 서열인 서열목록 제1서열의 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 15-25 bp 길이의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 유도 RNA는 CGG 반복 염기서열 부위의 시작 위치에서부터 위쪽(upstream)에 위치하는 서열인 서열목록 제2서열의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적인 서열을 특이적으로 인식하는 유도 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 FMR1 유전자는 취약 X 증후군(Fragile X syndrome) 환자의 FMR1 유전자인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 일정 카피수의 CGG 트리뉴클레오티드의 제거에 의하여 FMR1 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위에는 5-55 카피수의 CGG 트리뉴클레오티드가 존재하게 된 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
다음 단계를 포함하는 FMR1(fragile X mental retardation 1) 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위가 교정된 유도만능 줄기세포의 제조방법:
(a) 취약 X 증후군 환자로부터 분리된 체세포를 역분화시켜 유도만능 줄기세포를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 유도만능 줄기세포를 제 1 항의 조성물과 접촉시키거나, 상기 조성물이 삽입된 유전자 전달체로 형질전환 시키는 단계.
인간을 제외한 포유동물 중 취약 X 증후군을 보유한 포유동물 유래의 배아줄기세포를 제 1 항의 조성물과 접촉시키거나, 상기 조성물이 삽입된 유전자 전달체로 형질전환 시키는 단계를 포함하는 FMR1(fragile X mental retardation 1) 유전자의 CGG 반복 염기서열 부위가 교정된 배아줄기세포의 제조방법.
제 9 항의 방법에 의하여 제조된 유도만능 줄기세포 또는 제 10 항의 방법에 의하여 제조된 배아줄기세포를 유효성분으로 포함하는 취약 X 증후군 치료용 조성물.