CN108064280B - 利用以凝血因子viii基因为靶的核酸内切酶的a型血友病治疗用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供正常凝血因子VIII(F8)基因的反转诱导方法、发生反转的凝血因子VIII基因的反转编辑方法及由此制作的反转被编辑的A型血友病来源于患者的诱导多功能干细胞。本发明的方法有效地重现占重症A型血友病的原因中多数的F8基因的内含子1及内含子22的反转，从而可有效地用作A型血友病的发病机理研究及治疗剂筛选的研究工具。由本发明的方法制造的反转‑编辑诱导多功能干细胞，使发生突变的基因型恢复到与野生型相同的状态，进而可有效且根源性地治疗A型血友病，而不借助传递正常基因或蛋白质的限制性的方法。

Description

利用以凝血因子VIII基因为靶的核酸内切酶的A型血友病治 疗用组合物

技术领域

本发明涉及利用以凝血因子VIII基因为靶的核酸内切酶的A型血友病治疗用组合物。

背景技术

A型血友病(Hemophilia A)是发病率为在全世界范围内以每5000名男性中有一名的常见的遗传性出血性疾病(Bleeding Disorder)中的一种。此疾病由凝血因子VIII(F8)中的多种基因突变引起。根据基因型，临床症状分为轻症(5～30％活性)、普通(1～5％活性)及重症(<1％活性)(Graw et al.，2005)。与点突变相比，重症A型血友病的约一半由包含F81位内含子同源体(int1h，重症A型血友病的约5％)及22位内含子同源体(int22h，重症A型血友病的约40％)的染色体反转而引起的。这两种反转来源于通过非等位同源重组(nonallelic homologous recombination，NAHR)诱导于同源体的DNA双链断裂(DNAdouble-strand break，DSB)的错误的恢复。前不久，本发明者们为了使相距140kbp且分别具有0.1％及1.9％的频率的2个相同的1位内含子同源体序列(以下inth1h-1及inth1h-2)之间的染色体片段反转，在永生化的野生型人体细胞株中利用了定制的锌指核酸酶(zincfinger nuclease，ZFN)，在野生型诱导多功能细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)中利用了转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptional activator-like effectnuclease，TALEN)(Park et al.，2014)。上述方法通过模仿错误的DNA双链断裂恢复来人为地诱导反转基因型。与140-kbp反转相比，包含三种22位内含子同源体序列(22位内含子同源体-1、22位内含子同源体-2及22位内含子同源体-3)的另一600-kbp反转更频繁八倍，但是反转部位大，在X染色体上有三种同源体，因此难于恢复。不仅如此，由于22位内含子同源体(10kbp)更大于1位内含子同源体(1kbp)，很难利用通常的聚合酶链式反应(PCR)分析22位内含子同源体反转或恢复的基因型，这是由于需要使全部10-kbp22位内含子同源体扩增。其实，据知，利用基因剪刀(设计的核酸酶(programmable nuclease))不仅可恢复患者来源诱导性多能干细胞，而且可恢复在人体细胞中包含int22h的600-kbp染色体片段。

本发明者们通过使用作为Ⅱ型的具有多重规则性的间距的短的回归性反复Cas(CRISPR)/CRISPR-相关的)，已知的RGEN(RNA-guided engineered nuclease，RNA-引导工程核酸酶)(Cho et al.，2013；Cho et al.，2014)，在来源于A型血友病患者的诱导性多能干细胞中，使其两种反转恢复成正常的排列。

并且，本发明者们发现，转录激活因子样效应物核酸酶可通过在人诱导性多能干细胞的140-kbp染色体片段中引起反转，制作模仿A型血友病的最常见的基因型的A型血友病模型，来使上述反转部位翻转(flip-flop)从而恢复到野生型。最重要的是，F8 mRNA表达在恢复遗传的(reverted)，即从基因被编辑的诱导性多能干细胞分化的细胞中，而不是从血友病模型诱导性多能干细胞分化的细胞。这是报告基因剪刀重排列诱导性多能干细胞的大基因片段，并可使用于分离含有这些基因重排列的克隆的最初的研究结果，这将提供编辑由诱导性多能干细胞的基因重排列导致的遗传性缺陷的原理证明。

在本说明书全文中，参照了多个论文及专利文献并标记了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容，其整体作为参照插入到本说明书中，以使更加明地确描述本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。

发明内容

技术问题

本发明者们为了开发对由凝血因子VIII(F8)中的多种基因突变诱发的A型血友病的有效且根源性的治疗方法，进行了深入研究及努力。其结果发现，F8基因的反转利用定位反转发生部位的指导RNA及切割由此被定位的部位的RNA-诱导核酸内切酶成功地恢复(correction)，从而完成了本发明。并且，发现F8基因的反转利用分别与定位反转发生部位的转录激活样(TAL)效应结构域及上述结构域相结合，来切割借助上述结构域来被定位的基因部位的一对核酸内切酶成功地恢复，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供凝血因子VIII(F8)基因的反转编辑用组合物及利用其的反转编辑方法。

本发明的再一目的在于，提供凝血因子VIII(F8)基因的反转被编辑的诱导多功能干细胞的制备方法、由此制备的诱导多功能干细胞及其作为有效成分的A型血友病治疗用组合物。

本发明的另一目的及优点通过下述发明的详细说明、发明要求保护范围及附图得以明确。

解决问题的方案

根据本发明的一实施方式，提供一种组合物，作为凝血因子VIII(F8)基因的反转编辑用组合物，其中，包含：

(a)RNA-诱导核酸内切酶或RNA-诱导核酸内切酶的编码核苷酸；以及

(b)特异性识别以下核苷酸序列或它们的互补序列的指导RNA(guiding RNA)或编码上述指导RNA的核苷酸，上述苷酸序列或它们的互补序列作为选自由以下组成的序列组中的一对核苷酸序列，其中，包括：

(i)序列目录第1序列的核苷酸序列；

(ii)序列目录第2序列的核苷酸序列；以及

(iii)存在于F8基因的22位内含子上的上述(i)及上述(ii)之间的长度为562975bp的核苷酸内的15～25bp的核苷酸序列，

上述(iii)在上述(i)及上述(ii)之间的长度为562975bp的核苷酸内，不存在分别与上述(i)或上述(ii)分别具有80％以上的序列同源性(sequence homology)的核苷酸序列，同时在下游连接有5’-N(G/A)G-3’核苷酸。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供编辑凝血因子VIII(F8)基因的反转的方法，包括使A型血友病患者的体细胞与上述组合物相接触或转化为插入有上述组合物的基因载体的步骤。

根据本发明，本发明利用特异性识别F8基因的22位内含子同源体的反转发生部位的指导RNA诱导靶向部位，RNA-诱导核酸内切酶通过正确切割上述部位，来使因反转而被掀翻的基因部位切割。被切割的基因部位以规定频率引起再反转，最终实现反转的编辑。

根据本发明，本发明的序列目录第1序列是在存在于F8基因的22位内含子同源体-1的下游的20bp的连续的核苷酸序列中，不存在具有80％以上的序列同源性的其他核苷酸序列，同时，在与下游直接连接的5’-N(G/A)G-3’核苷酸的序列中最早出现的序列，序列目录第2序列是在存在于F8基因的22位内含子同源体-3的上游的20bp的连续的核苷酸序列中，不存在具有80％以上的序列同源性的其他核苷酸序列，同时，在与上游直接连接的5’-N(G/A)G-3’核苷酸的序列中，在上游侧最早出现的序列。因此，在利用这两个序列或存在于这两个序列之间并满足上述(iii)的条件的核苷酸序列为靶向的情况下，可编辑在F8基因的22位内含子中发生的反转，更具体地可编辑发生在22位内含子同源体-1与22位内含子同源体-3之间的反转。

根据本发明的具体实例，在本发明中所利用的RNA-诱导核酸内切酶为Cas9(CRISPR相关蛋白9)。

根据本发明的具体实例，在本发明中所利用的指导RNA为特异性识别上述序列目录第1序列的核苷酸序列及上述序列目录第2序列的核苷酸序列或它们的互补序列的指导RNA。

根据本发明，本发明的RNA-诱导核酸内切酶及指导RNA可以分别以蛋白质及被转录的RNA的形态来利用，并可通过转化为搭载有分别编码这些的DNA的载体来向目的细胞传递。

本发明的另一实施方式，本发明提供凝血因子VIII(F8)基因的反转编辑用组合物，其中，包含：

(a)RNA-诱导核酸内切酶或RNA-诱导核酸内切酶的编码核苷酸；以及

(b)作为包含在序列目录第4序列的核苷酸序列内的长度为15～25bp的核苷酸序列，在上述序列目录第4序列的核苷酸序列内，不存在具有80％以上的序列同源性的核苷酸序列，同时特异性识别下游连接有5’-N(G/A)G-3’核苷酸的核苷酸序列或它的互补序列的指导RNA或编码上述指导RNA的核苷酸。

根据本发明，本发明可根据所述的发明的实施方式，编辑发生在F8基因的22位内含子中的反转，但是还可通过使用以序列目录第4序列的F8基因的1位内含子内序列为靶向的指导RNA，来编辑发生在F8基因的1位内含子中的反转。

根据本发明的具体实例，在本发明中所利用的指导RNA特异性识别序列目录第3序列的核苷酸序列或它的互补序列。序列目录第3序列作为均存在于1位内含子同源体1及1位内含子同源体2的连续的核苷酸序列，可利用将其作为靶向的指导RNA，编辑发生在inth1h-1及inth1h-2之间的反转。

根据本发明的具体实例，在本发明中所利用的RNA-诱导核酸内切酶为Cas9。

根据本发明的还一实施方式，本发明提供凝血因子VIII(F8)基因的反转被编辑的诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cell)的制备方法，其中，包括：

步骤(a)，通过逆分化从A型血友病患者分离出的体细胞来获取诱导多功能干细胞的；以及

步骤(b)，使上述诱导多功能干细胞与所述的本发明的组合物相接触或转化为插入有上述组合物的基因载体。

通过逆分化从A型血友病患者分离出的体细胞来获取的诱导多功能干细胞具有患者固有的被反转的基因，可通过所述的本发明的方法在体外对其进行编辑。即，调查发生反转的部分后，若利用特异性识别上述反转发生部位的指导RNA，则以规定频率编辑反转，从而可获取具有与野生型相同的基因型的针对患者的诱导多功能干细胞。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供由本发明的方法制备的诱导多功能干细胞。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含本发明的诱导多功能干细胞作为有效成分的A型血友病治疗用组合物。

本发明的诱导多功能干细胞作为对血友病患者的基因反转进行编辑的细胞，之后被分化成适当的体细胞移植给患者后表达为被编辑的基因，进而可成为对作为顽症的A型血友病有用的细胞治疗用组合物。因此，本发明的组合物可以直接移植于体内的状态下，在体内诱导分化为目的细胞，或者也可在体外分化成目的细胞后移植到体内。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供凝血因子VIII(F8)基因的反转诱导用组合物，其中，包含：

(a)RNA-诱导核酸内切酶或RNA-诱导核酸内切酶的编码核苷酸；以及

(b)特异性识别以下苷酸序列或它们的互补序列的指导RNA或编码上述指导RNA的核苷酸，上述苷酸序列或它们的互补序列作为选自由以下组成的序列组中的一对核苷酸序列，其中，包括：

(i)序列目录第1序列的核苷酸序列；

(ii)序列目录第2序列的核苷酸序列；以及

(iii)存在于F8基因的22位内含子上的上述(i)及上述(ii)之间的长度为562975bp的核苷酸内的15～25bp的核苷酸序列，

上述(iii)在上述(i)及上述(ii)之间的长度为562975bp的核苷酸内，不存在分别与上述(i)或上述(ii)具有80％以上的序列同源性的核苷酸序列，同时在下游连接有5’-N(G/A)G-3’核苷酸。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供凝血因子VIII(F8)基因的反转诱导用组合物，包含：

(a)RNA-诱导核酸内切酶或RNA-诱导核酸内切酶的编码核苷酸；以及

(b)作为包含在序列目录第4序列的核苷酸序列内的长度为15～25bp的核苷酸序列，在上述序列目录第4序列的核苷酸序列内，不存在具有80％以上的序列同源性的核苷酸序列，同时特异性识别下游连接有5’-N(G/A)G-3’核苷酸的核苷酸序列或它的互补序列的指导RNA或编码上述指导RNA的核苷酸。

由于已描述了在本发明中所利用的各结构，因此为了避免过度重复省略其记载。

根据本发明，在本发明的方法中，在将发生反转的患者的细胞作为起始物质的情况下，即可诱导编辑，但与此相反，在将正常人的细胞作为起始物质的情况下，可诱导反转。因此，利用具有正常基因型的细胞作为起始细胞，进而本发明可成为有效获取人为的血友病细胞的有用的研究工具(research tool)。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供凝血因子VIII(F8)基因的反转诱导方法，包括将本发明的凝血因子VIII(F8)基因的反转诱导用组合物导入正常人的体细胞中的步骤。

由于已描述了在本发明中所利用的各组合物及步骤，因此为了避免过度重复而省略其记载。

根据本发明的一实施方式，本发明提供包含多肽或编码上述多肽的核苷酸的凝血因子VIII(F8)基因的反转编辑用组合物，其中，包含：

(a)一对核酸内切酶；以及

(b)分别与上述核酸内切酶中的一种相连接，并包含特异性识别F8基因的反转发生部位的氨基酸序列的一对转录激活样(transcription activator-like，TAL)效应结构域。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供编辑凝血因子VIII(F8)基因的反转的方法，包括将A型血友病患者的体细胞与上述组合物相接触或转化为插入有上述组合物的基因载体的步骤。

根据本发明，本发明通过利用特异性识别F8基因的反转发生部位的转录激活样效应结构域来诱导靶向部位，与上述结构域相结合的核酸内切酶正确切割上述部位，进而切割因反转而掀翻的基因部分的两端。被切割的基因部位以规定频率引起再反转，最终实现反转的编辑。

在本发明中，术语“特异性识别”是指借助本发明的靶向序列的相互作用来对其进行选择性识别，由此以与“特异性结合(binding)”相同的意义来使用。在本发明中所利用的转录激活样效应子具有由34个氨基酸构成的中央重复结构域(central repeat domain)，且第12位及第13位氨基酸残基由各种各样的氨基酸组成，因此被称为重复可变双残基(repeat variable diresidue，RVD)。各个重复可变双残基起到识别特定DNA的碱基的作用，识别NI＝A、NN＝G、NG＝T、及HD＝C并与其特异性结合(Boch J，et al.Science 326(5959)：1509-1512(2009))。因此，在具有对靶向DNA序列的信息的情况下，可确定基于这种代码与靶向DNA序列进行特异性结合的转录激活样效应子氨基酸序列。

根据本发明的具体实例，由本发明进行编辑的F8基因的反转为F8基因的1位内含子中的反转，上述一对效应结构域分别与包含在序列目录第34序列的核苷酸序列内的第一位置及第二位置的核苷酸序列特异性结合，上述第一位置及第二位置的核苷酸序列分别具有15～25bp的长度并相距10-20bp。根据本发明，序列目录第34序列的核苷酸序列为F8基因的1位内含子的同源体1的核苷酸序列(约1kb)。因此，第一位置及第二位置分别结合有左侧转录激活样效应子及右侧转录激活样效应子，其中分别连接的一对核酸内切酶正确切割第一位置及第二位置之间的10-20bp(间隔)部分。

根据本发明的具体实例，上述第一位置及第二位置的核苷酸序列分别为序列目录第30序列及第31序列的核苷酸序列。

更具体地，与本发明的序列目录第30序列的核苷酸序列特异性结合的氨基酸序列包含序列目录第32序列的氨基酸序列。

更具体地，与本发明的序列目录第31序列的核苷酸序列特异性结合的氨基酸序列包含序列目录第33序列的氨基酸序列。

根据本发明的具体实例，在本发明中所利用的核酸内切酶为FokI核酸内切酶。

根据本发明，本发明的核酸内切酶及转录激活样效应子可分别以蛋白质的形态利用，且可通过转化为搭载有分别编码它们的DNA载体来向目的细胞传递。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供凝血因子VIII(F8)基因的反转被编辑的诱导多功能干细胞的制备方法，包括：

步骤(a)，通过逆分化从A型血友病患者分理处的体细胞来获取诱导多功能干细胞；以及

步骤(b)，使上述诱导多功能干细胞与根据权利要求18所述的组合物相接触或转化为插入有上述组合物的基因载体。

通过逆分化从A型血友病患者分离出的体细胞来获取的诱导多功能干细胞具有患者固有的被反转的基因，可通过所述的本发明的方法在体外对其进行编辑。即，调查发生反转的部分后，若利用特异性识别上述反转发生部位的指导RNA，则以规定频率编辑反转，从而可获取具有与野生型相同的基因型的针对患者的诱导多功能干细胞。

根据本发明的具体实例，本发明的一对转录激活样效应结构域，分别在F8基因上隔着所要传递的部位相距10～20bp，更具体地相距12～16bp，最具体地相距12～14bp。

根据本发明的具体实例，上述A型血友病为在F8基因的1位内含子中发生反转的A型血友病，上述一对效应结构域包含分别与序列目录第30序列及第31序列的核苷酸序列特异性结合的氨基酸序列。

本实例为用于制作在A型血友病中F8基因的1位内含子中发生反转的A型血友病的反转被编辑的诱导多功能干细胞的实例，由于已描述其结构及步骤，因此为了避免过度重复而省略其记载。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供由本发明的方法制备的诱导多功能干细胞。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含本发明的诱导多功能干细胞作为有效成分的A型血友病治疗用组合物。

本发明的诱导多功能干细胞作为对血友病患者的基因反转进行编辑的细胞，之后被分化成适当的体细胞移植给患者后表达为被编辑的基因，进而可成为对作为顽症的A型血友病有用的细胞治疗用组合物。因此，本发明的组合物可以直接移植于体内的状态下，在体内诱导分化为目的细胞，或者也可在体外分化成目的细胞后移植到体内。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含多肽或编码上述多肽的核苷酸的凝血因子VIII(F8)基因的反转诱导用组合物，其中，包含：

(a)一对核酸内切酶；以及

(b)与上述(a)中的一种相连接，并包含与F8基因上的第一位置的核苷酸序列相特异性结合的氨基酸序列的效应结构域；

(c)与上述(a)中的一种相连接，并作为编码包含与F8基因上的第二位置的核苷酸序列相特异性结合的氨基酸序列的转录激活样效应结构域或上述效应结构域的核苷酸，上述第一位置及第二位置分别具有15～25bp的长度且相距10～20bp。

由于已描述了在本发明中所利用的各结构，因此为了避免过度重复而省略其记载。

根据本发明，在本发明的方法中，在将发生反转的患者的细胞作为起始物质的情况下，即可诱导编辑，但与此相反，在将正常人的细胞作为起始物质的情况下，可诱导反转。因此，利用具有正常基因型的细胞作为起始细胞，进而本发明可成为有效获取人为的血友病细胞的有用的研究工具。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供凝血因子VIII(F8)基因的反转诱导方法，包括将本发明的组合物导入正常人的体细胞中的步骤。

由于已描述了在本发明中所利用的的组合物及步骤，因此为了避免过度重复而省略其记载。

以下，对所述的本发明的共同适用的事项进行说明。

在本发明中，术语“核苷酸”为以单链或双链形态存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，除非特别说明，包含自然的核苷酸的类似物(Scheit，Nucleotide Analogs，JohnWiley，New York(1980)；Uhlman及Peyman，Chemical Reviews，90：543-584(1990))。

在本发明中，术语“特异性识别”是指基于与本发明的靶向序列的互补性来对其进行选择性识别，由此用作与“特异性结合(annealing)”相同的意义。术语“互补性”是指在规定的退火或杂交化条件下，本发明的指导RNA对靶向核酸序列进行选择性杂交程度的充分互补，具有包括实际上互补(substantially complementary)及完全互补(perfectlycomplementary)的意义，具体地指完全互补。在本说明书中，术语“实际上互补”的意义不仅包括完全相一致的序列，而且还包括在可对特定序列进行退火的范围内，与比较对象的序列部分不一致的序列。

在本说明书中，术语“诱导多功能干细胞”是指通过人为的逆分化过程从分化的多个细胞诱导的细胞，以使具有多功能分化能，也被称为逆分化诱导多功能干细胞。诱导多功能干细胞具有与胚胎干细胞基本相同的特性，具体地，细胞外形、基因、蛋白质表达模式类似，在体外及体内具有所有分化能，并形成畸胎瘤(teratoma)，且可进行基因的生殖系传递(germline transmission)。本发明的诱导多功能干细胞包括人、猴、猪、马、牛、羊、狗、猫、鼠、兔等所有哺乳类来源的逆分化诱导多功能干细胞，具体为来源于人的诱导多功能干细胞，最具体为来源于A型血友病患者的诱导多功能干细胞。

在本说明书中，术语“逆分化”是指将存在的多个分化细胞返回到未分化状态，以使可形成新的分化组织的表观遗传学的逆行过程，也称为重排过程，是基于细胞遗传体的表观遗传学性变形(epigenetic changes)的可逆性的。根据本发明的目的，使具有0％以上至小于100％的分化能的所分化的多个细胞返回到未分化状态的过程均包括在上述“逆分化”中，例如，可使具有0％的分化能的所分化的细胞返回到具有1％的分化能的所分化的细胞的未分化过程也包括在其中。

本发明的逆分化可通过已分化的细胞的分化能恢复的本领域公知的多种方法来进行，例如，可通过在从上述A型血友病患者分离出的体细胞中转化选自由OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、KLF4及c-MYC组成的组中的一种以上的基因来进行。

为了得到诱导多功能干细胞而在培养人体细胞中所利用的培养基可包括通常的任何培养基。例如，可利用Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium，Eagle，H.Science 130：432(1959))，α-MEM(Stanner，C.P.et al.，Nat.New Biol.230：52(1971))，Iscove's MEM(Iscove，N.et al.，J.Exp.Med.147：923(1978))，199培养基(Morgan etal.，Proc.Soc.Exp.Bio.Med.，73：1(1950))，CMRL 1066，RPMI 1640(Moore et al.，J.Amer.Med.Assoc.199：519(1967))，F12(Ham，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 53：288(1965))，F10(Ham，R.G.Exp.Cell Res.29：515(1963))，DMEM(Dulbecco's modification of Eagle's medium，Dulbecco，R.et al.，Virology 8：396(1959))，DMEM和F12的混合物(Barnes，D.et al.，Anal.Biochem.102：255(1980))，Way-mouth's MB752/1(Waymouth，C.J.Natl.Cancer Inst.22：1003(1959))，McCoy's 5A(McCoy，T.A.，et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.100：115(1959))及MCDB系列(Ham，R.G.et al.，In Vitro 14：11(1978))等，但并不限定于此。

在本说明书中，术语“基因载体”是指将所期望的靶向基因导入对象细胞来用于表达的媒介。理想的基因载体可对人体或细胞无害，容易进行大量生产并可有效传递基因。

在本说明书中，术语“基因传递”是指向细胞内运输基因，与基因的细胞内渗透(transduction)具有相同的意义。在组织水平中，上述术语基因传递与基因的扩散(spread)具有相同的意义。因此，本发明的基因载体可记载为基因渗透系统及基因扩散系统。

为了制备本发明的基因载体，优选地，本发明的的核苷酸序列存在于表达结构(expression construct)内。优选地，本发明的核苷酸序列与启动子自动连接。在本说明书中，术语“自动结合的”是指核酸表达调节序列(例如：启动子、信号序列或转录因子结合位点的阵列)与其他核酸序列之间的功能性结合，由此上述调节序列将调节上述其他核酸序列的专利和/或解读。在本发明中，与本发明的核苷酸序列相结合的启动子，优选为动物细胞，更优选为作为在哺乳动物细胞中可通过启动调节转录松弛素基因的，包括来源于哺乳动物病毒的启动子及来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子，例如，包括巨细胞病毒(CMV)启动子、腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、U6启动子、单纯疱疹病毒(HSV)的tk启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子，人IL-2基因的启动子、人IFN基因的启动子、人IL-4基因的启动子、人淋巴毒素基因的启动子及人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的启动子，但并不限定于此。最优选地，在本发明中所使用的启动子为巨细胞病毒启动子和/或U6启动子。

可将本发明的基因载体制造成各种各样的形态，但可将其制造成包含(i)裸露(naked)重组DNA分子、(ii)质粒、(iii)病毒载体和(iv)上述裸露重组DNA分子或质粒的脂质体或类脂质体的形态。

本发明的核苷酸序列可适用于利用在通常的动物转化中的所有基因传递系统，优选地，可适用于质粒、腺病毒(Lockett LJ，et al.，Clin.Cancer Res.3：2075-2080(1997))、腺-相关病毒(Adeno-associated viruses：AAV，Lashford LS.，et al.，GeneTherapy Technologies，Applications and Regulations Ed.A.Meager，1999)、逆转录病毒(Gunzburg WH，et al.，Retroviral vectors.Gene Therapy Technologies，Applications and Regulations Ed.A.Meager，1999)、慢病毒(Wang G.et al.，J.Clin.Invest.104(11)：R55-62(1999))、单纯疱疹病毒(Chamber R.，et al.，Proc.Natl.Act.Sci USA 92：1411-1415(1995))、牛痘病毒(Puhlmann M.et al.，HumanGene Therapy 10：649-657(1999))、脂质体(Metho s in Molecular Biology，Vol199，S.C.Basu and M.Basu(Eds.)，Human Press 2002)或类脂质体中。最具体地，本发明的基因载体为质粒。

在本发明中，在基因载体基于病毒载体制作的情况下，上述接触步骤按照本领域公知的病毒感染方法来进行。利用病毒载体的宿主细胞的感染记载于所述的引用文献中。

在本发明中，在基因载体为裸露重组DNA分子或质粒的情况下，可通过显微注入法(Capecchi，M.R.，Cell，22：479(1980)；及Harland和Weintraub，J.Cell Biol.101：1094-1099(1985))、磷酸钙沉淀法(Graham，F.L.et al.，Virology，52：456(1973)；及Chen和Okayama，Mol.Cell.Biol.7：2745-2752(1987))、电穿孔法(Neumann，E.et al.，EMBO J.，1：841(1982)；及Tur-Kaspa et al.，Mol.Cell Biol.，6：716-718(1986))，脂质体-媒介转染法(Wong，T.K.et al.，Gene，10：87(1980)；Nicolau及Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190(1982)；及Nicolau et al.，Methods Enzymol.，149：157-176(1987))、二乙氨乙基(DEAE)-葡萄糖处理法(Gopal，Mol.Cell Biol.，5：1188-1190(1985))及基因基因轰击法(Yang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：9568-9572(1990))来将基因导入细胞内，最具体地可利用电穿孔法。

在本发明中，所要治疗的A型血友病为重症A型血友病。在本说明书中，术语“重症A型血友病(severe hemophilia A)”是指凝血因子VIII(F8)的活性小于正常人的1％的情况。

在本说明书中，术语“治疗”是指(a)疾患、疾病或症状的发展的抑制；(b)疾患、疾病或症状的减轻；或(c)疾患、疾病或症状的去除。本发明的组合物通过在患A型血友病的个体中被编辑，来表达与野生型相同的基因，从而起到抑制被诱发为基因反转的症状的发展或通过去除或减轻其的作用。因此，本发明的组合物其本身可作为治疗A型血友病的治疗组合物，或者可通过与其他药理成分同时给药来用作对上述疾病的治疗辅助剂。为此，在本说明书中，术语“治疗”或“治疗剂”包括“治疗辅助”或“治疗辅助剂”的意义。

在本说明书中，术语“给药”或“进行给药”是指通过向对象体直接给药本发明的组合物的治疗有效量，使得在对象体体内形成相同的量。因此，术语“进行给药”包括注入或移植(transplantation)作为本发明的有效成分的诱导多功能干细胞或再分化其的成体细胞，因此术语“进行给药”用作与“进行注入”或“进行移植”相同的意义。

组合物的“治疗有效量”是指对给药组合物的对象体提供治疗或预防效果的充分的提取物含量，为此是包括“预防有效量”。在本说明书中，术语“对象体”没有限制，包括人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴、黑猩猩、狒狒或猕猴。具体地，本发明的对象体为人。

在将本发明的组合物制备成药学组合物的情况下，本发明的药学组合物包含药学上可接受的载体。包含在本发明的药学组合物的药学上可接受的载体包含制剂时所利用的乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸钠、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、食盐水、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，PBS)或培养基等，但并不限定于此。

本发明的药学组合物除了上述成分以外，还可包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。合适的药学上可接受的载体及制剂详细记载于雷明顿药学科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)(19th ed.，1995)中。

可非口服给药本发明的药学组合物，具体地可在血管内(intravascular)进行给药。

本发明的药学组合物的合适的给药量可根据如制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应感应性要素进行各种各样的处方。本发明的药学组合物的通常的给药量为以成人为基准每日10²～10¹⁰细胞。

根据本发明所属技术领域的普通技术人员可易于实施的方法，利用药学上可接受的载体和/或赋形剂对本发明的药学组合物进行制剂化，从而可制备成单位用量形态或装入多用量容器内。此时，剂型可以是油或水性媒介中的溶液、悬浮液、糖浆剂或乳化液形态或者也可以是提取剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、丸剂或胶囊剂形态，还可包括分散剂或稳定剂。

发明的效果

本发明的特征及优点如下：

(a)本发明提供正常凝血因子VIII(F8)基因的反转诱发方法、发生反转的凝血因子VIII(F8)基因的反转编辑方法及利用其制作的反转被编辑的A型血友病患者来源诱导多功能干细胞。

(b)本发明的方法有效地重现占重症A型血友病的原因中多数的F8基因的内含子1及内含子22的反转，从而可有效地用于作为A型血友病的发病机理研究及治疗剂筛选的研究工具。

(c)由本发明的方法制造的反转-编辑诱导多功能干细胞，使发生突变的基因型恢复到与野生型相同的状态，进而可有效且根源性地治疗A型血友病，而不借助传递正常基因或蛋白质的限制性的方法。

附图说明

图1a～1f为示出从A型血友病患者来源诱导性多能干细胞部分-被反转的F8基因的编辑结果的图。图1a是通过在人皮肤成纤维细胞(WT)及A型血友病患者来源尿细胞(Pa1、Pa2及Pa3)中，分离基因组DNA并用适当的引物(Bagnall et al.，2006)进行聚合酶链式反应分析，来检测内含子1(左侧)或22(右侧)反转的结果。图1b为示出内含子22的反转及恢复的示意图。将3个相同部位分别表示成22位内含子同源体-1、22位内含子同源体-2及22位内含子同源体-3。蓝色箭头表示聚合酶链式反应引物。将22位内含子同源体-1或22位内含子同源体-3附近的核酸酶靶向部位分别表示成黑色(RGEN02)或红色(RGEN03)闪电形状。图1c为在海拉(HeLa)细胞利用T7核酸内切酶I分析核酸酶靶向部位的突变的结果。图1d示出在海拉563-kbp与染色体片段的反转相对应的聚合酶链式反应产物。图1e为在诱导性多能干细胞克隆中确认反转编辑的聚合酶链式反应分析结果。图1f示出反转被编辑的诱导性多能干细胞克隆中的弯曲点连接部DNA序列。用下划线表示各RGEN靶向序列，用绿色表示前间区序列邻近基序序列，且虚线表示被删除的碱基。小写字母表示被插入的序列，蓝色箭头表示切割部位。

图2a～2e为示出分析反转-被编辑的诱导性多能干细胞克隆的特性的结果的图。图2a示出在父母及被编辑的细胞株中用于检测内向性的OCT4、SOX2、LIN28及NANOG mRNA的实时定量聚合酶链式反应(qPCR)结果。各基因的表达水平通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行了标准化。图2b示出反转-被编辑的细胞株的体外分化。各标记蛋白的表达表示分化成外胚叶(巢蛋白)、中胚叶[α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)]及内胚叶[AFP(α-胎蛋白)]。比例尺为50mm。图2c为通过免疫细胞化学来检测作为人ESC特异性标记的OCT4及SSEA4表达的结果。比例尺为100mm。同时还表示了各诱导性多能干细胞细胞株的核型图。图2d为示出在内含子1及内含子22反转-被编辑的诱导性多能干细胞细胞株中分化的细胞中的F8基因表达的图。利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)(上端)及定量聚合酶链式反应(下端)测定来源于野生型诱导性多能干细胞(WT)、患者诱导性多能干细胞(Pa1、Pa2及Pa3)及反转-被编辑的Pa1-iPSC(Co-1及Co-2)或Pa2-iPSC(Co-1、Co-2及Co-3)细胞株中的F8及中胚叶标记(鼠短尾突变体表型(Brachyury))的表达。将甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达用作控制对照组。图2e为在反转被编辑的诱导性多能干细胞细胞株中表示外显子1及2或外显子22及23之间的正确剪接的色谱。

图3a～3f为示出在A型血友病患者-来源诱导性多能干细胞中内含子1反转编辑的图。图3a示出在重症A型血友病患者中发现的内含子1反转被编辑的过程的示意图。蓝色箭头表示聚合酶链式反应引物。图3b示出通过T7核酸内切酶I分析测定在海拉中F8基因的内含子1内RGEN01靶向部位的突变频率的结果。图3b为示出与海拉细胞的反转基因型相对应的聚合酶链式反应产物的图。图3d为示出2个内含子1同源体(命名为int1同源体1及int1同源体2)及弯曲点链接部的DNA序列的图。在转化为RGEN-编码质粒的海拉细胞中分离基因组DNA，并分离反转特异性的聚合酶链式反应带后，分析了弯曲点连接部的序列。用下划线表示RGEN靶向序列，用绿色表示前间区序列邻近基序(PAM)序列，用虚线表示被删除的碱基。小写字母示出被插入的碱基。图3e示出4个被编辑的克隆(Co-1～Co-4)的基因组DNA聚合酶链式反应分析结果。从内含子1反转患者(Pa1-U)的尿来源细胞及反转或作为正常基因型的阳性对照组的的野生型诱导性多能干细胞(WT)中分别分离基因组DNA。图3f示出两个同源体(命名为int1同源体1及int1同源体2)及弯曲点连接部的DNA序列。在转化为RGEN-编码质粒的诱导性多能干细胞中分离基因组DNA。分离恢复特异性聚合酶链式反应带，分析两个弯曲点连接部的序列。用下划线表示RGEN靶向序列，用绿色表示前间区序列邻近基序序列，虚线指被删除的碱基。

图4a～4c为示出在海拉细胞或患者诱导性多能干细胞中的靶向反转及恢复的图。图4a示出在海拉细胞中反转的两个弯曲点连接部的DNA序列。用下划线表示各RGEN靶向序列，用绿色表示前间区序列邻近基序序列，虚线指被删除的碱基，小写字母表示被插入的碱基，蓝色箭头表示切割部位。图4b及4c分别示出各个内含子1(4b)及内含子22(4c)部位中的弯曲点连接部的DNA序列。通过电穿孔向内含子1(Pa1-iPSC)或内含子22(Pa3-iPSC)反转细胞直接传递RGEN核糖核蛋白(RGEN RNP)。在诱导性多能干细胞中，分离所有DNA后进行测序。用下划线表示各RGEN靶向序列，用绿色表示前间区序列邻近基序序列，虚线指被删除的碱基，小写字母表示被插入的碱基，两个蓝色箭头表示切割部位。在检测出一次以上序列的情况下，用括号内的编号表示检测出的次数。

图5a～5g为示出利用附加体重排载体来由人皮肤成纤维细胞(HDF)制作诱导性多能干细胞克隆的结果的图。图5a为示出确定的人诱导性多能干细胞(Epi3克隆)的形态的图(比例尺为200μm)。图5b为与诱导性多能干细胞(Epi3克隆)有关的碱性磷酸酶燃烧结果(比例尺，500μm)。图5c为示出检测在所确立的诱导性多能干细胞细胞株(Epi1tEpi8)中留下的附加体载体(EBNA-1)序列的结果。将甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因用作对所分离的所有DNA的对照组。在进行电穿孔前(na)和后(6天)将从细胞分离的所有DNA分别用作对各个附加体载体DNA的阴性及阳性对照组。逆转录病毒来源野生型诱导性多能干细胞细胞株(iPSCE1)也用作阴性对照进行了分析。图5d为通过免疫细胞化学来检测作为ESC-特异性标记的OCT4及SSEA-4的表达的结果。DAPI信号表示图像内所有细胞(比例尺为100μm)。图5e为示出为了测定OCT4、SOX2、LIN28、NANOG及甘油醛-3-磷酸脱氢酶的转录水平，利用基因特异性引物(表3)进行逆转录聚合酶链式反应分析的结果。在人皮肤成纤维细胞、人ES细胞株(H9)、野生型诱导性多能干细胞细胞株(WT-iPSCEpi3)及WT-iPSCEpi3细胞株(1，人皮肤成纤维细胞；2，H9；3，WT-iPSC；4，Inv1；5，Inv2)来源反转克隆(Inv1及Inv2)来源WT-iPSCEpi3细胞株(1，人皮肤成纤维细胞；2，H9；3，WT-iPSC；4，Inv1；5，Inv2)中测定了mRNA水平。图5f为通过定量聚合酶链式反应对各细胞中的OCT4、SOX2及LIN28 mRNA进行定量化的结果，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达为基准进行了标准化。图5g示出外胚叶(巢蛋白)、中胚叶[α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)及内胚叶[AFP(α-胎蛋白)]标记蛋白的表达(比例尺，50μm)。

图6a及6b为示出HEK 293T细胞中的F8基因的转录激活因子样效应物核酸酶-媒介反转的图。图6a为在A型血友病患者中出现的染色体反转的预期机制。与F8基因相对应的140-kbp染色体片段的反转在与来源于反方向的与两个同源部位(位于F8基因的1位内含子的同源体1及位于140-kbp上游部位的同源体2)有关。红色三角形是为了检测转录激活因子样效应物核酸酶靶向部位、箭头为了检测140-kbp反转而分别设计的引物。图6b为示出11个转录激活因子样效应物核酸酶对的T7核酸内切酶I(T7E1)的分析结果。用箭头表示了被T7核酸内切酶I切割的DNA带的预期位置。

图7a及7b为示出诱导性多能干细胞的F8轨迹的转录激活因子样效应物核酸酶媒介反转的图。图7a示出与4个反转克隆的基因组DNA有关的聚合酶链式反应分析结果。从A型血友病患者细胞(Pa)及野生型诱导性多能干细胞(WT)分离的基因组DNA试样分别用作对反转或正常基因型的阳性对照组。图7b为示出反转克隆的弯曲点连接部(breakpointjunction)的DNA序列的图。用红色(同源体1)或蓝色(同源体2)表示了转录激活因子样效应物核酸酶结合部位。

图8a～8c为示出F8基因反转的恢复(reversion)的图。对从3个反复克隆获取的基因组DNA进行了聚合酶链式反应分析(图8a)。从A型血友病患者细胞(Pa)或野生型诱导性多能干细胞(WT)分离的DNA分别用作用于反转或正常基因型的阳性对照组。图8b为示出反复克隆中的弯曲点连接部(breakpoint junction)DNA序列的图。用红色(连接部1)或蓝色(连接部2)表示了转录激活因子样效应物核酸酶结合部位。虚线表示被删除的碱基。图8c分别示出在反复克隆(克隆1及3)中对两个转录激活因子样效应物核酸酶结合部位之间的序列(分别为同源体1及2)的色谱。

图9a及9b为示出分析反转及反复克隆的特性的结果的图。图9a示出来源于反转及反复克隆的细胞中的F8基因表达。通过聚合酶链式反应检测出来源于人皮肤成纤维细胞(WT)、反转克隆(Inv1及Inv2)及反复克隆(Rev1、Rev2、及Rev3)的细胞中的F8及外胚叶标记基因(FOXA2及Sox17)的表达。将甘油醛-3-磷酸脱氢酶用作控制对照组。图9b为示出从反转及反复克隆被分化出的表皮细胞的F8蛋白质的图。固定被分化的细胞并用指示的抗体进行了染色。DAPI信号示出图像内所有细胞(FVIII，F8蛋白质；vWF，血管性血友病因子(程度表皮标记蛋白)；比例尺，100μm)。

图10a～10c为示出分析利用附加体重排载体制造的人诱导性多能干细胞的特性的结果的图。对10继代(Epi3)及12继代(Epi8)的WT-iPSC胞株的染色体进行了核型分析(图10a)。通过免疫细胞化学分心测定了作为人ESC-特异性表面标记的Nanog及TRA-1-60的表达(图10b)。DAPI信号示出图像内所有细胞(比例尺为100μm)。图10c示出外胚叶(Pax6)、中胚叶(鼠短尾突变体表型)及内胚叶(HNF3β)标记蛋白质的表达(比例尺，50μm)。

图11为示出靶向的反转的频率的图。利用数码聚合酶链式反应测定了靶向的反转的频率(图11a)。通过依次稀释从转化为转录激活因子样效应物核酸酶-编码质粒的细胞中分离的基因组DNA试样，来进行了数码聚合酶链式反应。测定了被诱发为锌指核酸酶(zinc-finger nucleases)或转录激活因子样效应物核酸酶的染色体反转的频率(图11b)。Z10为靶向F8基因的1位内含子同源体的锌指核酸酶对。利用数码聚合酶链式反应测定了140-kbp反转的频率。上限和下限表示置信区间的95％。

图12为示出分析转录激活因子样效应物核酸酶脱靶效应的结果的图。在硅中探索出了在本发明设计的转录激活因子样效应物核酸酶的潜在性的脱靶部位。通过选定与转录激活因子样效应物核酸酶靶向部位最类似的3个潜在性的脱靶部位进行T7核酸内切酶I分析，来确认了是否对它们部位中的脱靶进行切割。

图13为示出反转及反复克隆中的人ES标记的表达的图。利用定量聚合酶链式反应测定了野生型诱导性多能干细胞细胞株(WT-iPSCEpi3)、反转克隆(Inv1)及反复克隆(Rev1、Rev2及Rev3)的Oct4、Sox2及Lin28 mRNA水平。将甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA用在标准化中。

图14为示出反转及反复克隆的体外分化的图。标记蛋白的表达分别示出反转克隆(上端)及反复克隆(下端)中的外胚叶(βⅢ-微管蛋白)、中胚叶[α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)]及内胚叶[AFP(α-胎蛋白)及HNF3β](比例尺，50μm)。

具体实施方式

以下，通过实施例更详细说明本发明。对于本领域普通技术人员而言，这些实施例仅用于进一步具体地说明本发明，而根据本发明的要旨本发明的范围并不限定于这些实施例是显而易见的。

实施例1.RGEN(RNA-引导工程核酸酶)

实验方法

在延世大学研究伦理审议委员会的认可(IRB#4-2012-0028)下，进行了本发明的A型血友病患者的尿来源诱导性多能干细胞的分析。所有自愿者在捐赠用于人诱导性多能干细胞生成的尿试样之前，签署了书面同意书。

细胞培养及转化

在补充有10％的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.1mm的非必需氨基酸及1％的抗生素的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)中培养海拉细胞(ATCC，CCL-2)。为了诱发DNA双链断裂，利用脂质体2000(Lipofectamine 2000)转染试剂(英杰(Invitrogen))，按照制造商的说明书，将1×10⁵海拉细胞共转化为Cas9-编码质粒及sgRNA-编码质粒(分别为0.5mg)。在人胚胎干细胞培养基[补充有20％的基因敲除血清代替物(Gibco)、1％的非必需氨基酸(英杰)及0.1mm的2-巯基乙醇(西格玛(Sigma))的DMEM/F12(Gibco)]中，与4ng/mL的基本的成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，派普泰克(PeproTech))一同保持购自WiCell公司的人ESC(hESC)细胞株(H9)、人皮肤成纤维细胞-来源人皮肤成纤维细胞(WT-iPSCEpi3 line)(Park et al.，2014)及尿来源诱导性多能干细胞。为了在尿来源诱导性多能干细胞中诱发恢复，利用电穿孔系统(Neon；Invitrogen)，在1×10⁶细胞中对5μg的Cas9-编码质粒及5μg的sgRNA-编码质粒(对内含子22反转各5μg的sgRNA质粒)进行电穿孔。

为了向尿来源诱导性多能干细胞直接传递Cas9蛋白质，稍微修改以往报告的方法并进行了转化(Kim et al.，2014)。将Cas9蛋白质(15μg)与20μg的转录的sgRNA(对内含子22反转各sgRNA质粒20μg)进行混合，在常温下孵化10分钟，以便形成核糖核蛋白(RGEN核蛋白)。通过微细穿孔系统将核糖核蛋白转化至2×10⁵诱导性多能干细胞中。

分离及扩大由重症A型血友病患者的尿来源细胞

从被诊断为重症A型血友病的11名患者收集尿试样，上述诊断是由韩国血友病基金会通过临床确认的。利用以往报告的方法分离了尿来源细胞(Zhou et al.，2012)。综上所述，从100ml的中段尿(midstream urine)通过在400g中离心分离10分钟来收集了细胞。利用磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞两次后，在补充有10％的(vol/vol)胎牛血清、REGM(肾脏上皮细胞生长培养基，Single Quot kit(Lonza)中获取)及1％的抗生素的DMEM/Ham's F12(1：1)培养基(Hyclone)中进行了培养。在这种条件下培养4天后，为了扩大细胞，在REGM(Lonza)中培养。在涂敷有明胶的培养皿中，以80～90％汇合分成这些细胞。为了确认F8基因型，利用识别F8轨迹的内含子1及22反转附近的适当的部位的引物对，对从尿来源患者分离的基因组DNA视表进行聚合酶链式反应分析(Bagnall et al.，2006；Park et al.，2014)。

RGEN组合物

利用以往报告的方法构建Cas9-编码质粒(Cho et al.，2013)。CMV启动子下表达融合于HA表位及核定位信号区(nuclear localization signal，NLS)的Cas9蛋白质。在sgRNA表达中使用了U6启动子(Cho et al.，2014)。纯化的重组Cas9蛋白质购自ToolGen公司。利用MEGA short script T7试剂盒(Ambion)以以往报告的方法，在体外转录指导RNA(Kim et al.，2014)。通过苯酚：氯仿提取纯化被转录的RNA，并用分光计进行定量化。

测定T7核酸内切酶I分析及靶向的反转的频率

按照以往报告的方法进行了T7核酸内切酶I分析(Kim et al.，2009)。综上所述，加热包含RGEN靶向部位的聚合酶链式反应扩增子使其变性(denature)，通过退火形成异形接合(heteroduplex)DNA切片。之后，在上述切片中，在37℃下处理T7核酸内切酶(纽英伦生物(New England Biolabs))20分钟，使失配部位被切断后，用琼脂糖凝胶电泳分析生成物。以以往报告的方法通过数码聚合酶链式反应分析测定F8轨迹中的靶向的编辑的频率(Kimet al.，2010)。利用脂质体2000转化试剂(英杰)，依次稀释从共转化为RGEN及sgRNA质粒的细胞中分离的基因组DNA，并对稀释的试样进行聚合酶链式反应分析。确定各稀释点中的阳性带切片，并利用极限稀释分析(Extreme Limiting Dilution Analysis)程序分析其结果(HuandSmyth，2009)。

海拉细胞中F8轨迹的RGEN-媒介反转的确认

为了确认在本发明设计的RGEN的遗传体编辑活性，与sgRNA表达质粒一同向海拉细胞共转化各RGEN。通过T7核酸内切酶I分析测定RGEN活性。

来源于患者的诱导性多能干细胞的F8轨迹中的靶向的RGEN-媒介编辑

在STO细胞支持层培养诱导性多能干细胞，利用Ⅳ型胶原酶处理并进行采集。用磷酸盐缓冲溶液清洗后，利用以往报告的方法分离将细胞分离成单一细胞(Desbordes etal.，2008)。将这些单一细胞与RGEN及sgRNA质粒进行混合，并用850V电压施加脉冲30分钟。之后，将细胞接种到支持细胞上培养了10天。为了检测在F8轨迹发生的基因反转，破碎从各个群体提取的细胞并进行聚合酶链式反应分析，所使用的引物如下：1-F1：5’-AAATCACCCAAGGAAGCACA-3’，1-R1：5’-TGGCATTAACGTATTACTTGGAGA-3’；1-F2：5’-TGCTGAGCTAGCAGGTTTAATG-3’，1-R2：5’-TGCTGAGCTAGCAGGTTTAATG-3’；22-F1：5’-TGGGGCTGTGTAAATTTGCT-3’，22-R2：5’-CAAACGTAGCATTACCTGATTGT-3’；22-F2：5’-ACAACCAGAGCAGAAATCAATGA-3’，22-R2：5’-TTTCACCACATCCACGCCAA-3’。

克隆细胞群的确立及特性分析

为了分离被编辑的细胞的克隆，利用所期待的基因变性(反转基因型的编辑)形成，通过聚合酶链式反应将确定的各群体分离成单一细胞，并接种到新细胞支持层。进行4次继代培养后，选定几个克隆(内含子1被编辑的4个克隆及内含子22被编辑的3个克隆)进行测序并进行额外实验。为了分析弯曲点的序列，通过电泳所扩增的聚合酶链式反应产物来从琼脂糖凝胶中洗脱。

RNA分离、逆转录聚合酶链式反应及定量聚合酶链式反应

利用TRIzol试剂(英杰)按照制造商的说明书纯化总RNA。利用DiaStarTM cDNA合成试剂盒(SolGent，韩国)由总RNA(1μg)合成cDNA。为了确认凝血因子VIII(Factor VIII)、鼠短尾突变体表型(Brachyury)及甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达，以合成的cDNA为模板利用Ex-Taq(宝生(Takara))进行聚合酶链式反应。为了定量聚合酶链式反应，按照制造商的说明书使用SYBRPremix Ex-Taq(宝生)。为了由内含子1或内含子22编辑细胞株分别扩增F8mRNA，一同使用了位于外显子1(或内含子22编辑细胞株中外显子21)正向引物与位于外显子3(或内含子22编辑细胞株中外显子23)的逆向引物。逆转录聚合酶链式反应或定量聚合酶链式反应利用如下引物对：甘油醛-3-磷酸脱氢酶-F：5’-CCCCTCAAGGGCATCCTGGGCTA-3’，甘油醛-3-磷酸脱氢酶-R：5’-GAGGTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；OCT4-F：5’-CCTCACTTCACTGCACTGTA-3’，OCT4-R：5’-CAGGTTTTCTTTCCCTAGCT-3’；LIN28-F：5’-AGCCATATGGTAGCCTCATGTCCGC-3’，LIN28-R：5’-TCAATTCTGTGCCTCCGGGAGCAGGGTAGG-3’；SOX2-F：5’-TTCACATGTCCCAGCACTACCAGA-3’，SOX2-R：5’-TCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGC-3’；NANOG-F：5’-TGAACCTCAGCTACAAACAG-3’，NANOG-R：5’-TGGTGGTAGGAAGAGTAAAG-3’；F8-外显子1-F：5’-CTGCTTTAGTGCCACCAGAAGA-3’，F8-外显子3-R：5’-GACTGACAGGATGGGAAGCC-3’；F8-外显子21-F：5’-CCGGATCAATCAATGCCTGGAG-3’，F8-外显子23-R：5’-ATGAGTTGGGTGCAAACGGATG-3’；鼠短尾突变体表型-F：5’-ATCACAAAGAGATGATGGAGGAA-3’，鼠短尾突变体表型-R：5’-GGTGAGTTGTCAGAATAGGTTGG-3’)。

尿来源诱导性多能干细胞的生成及体外分化

培养3继代以下后，由尿来源细胞生成诱导性多能干细胞。利用附加体重排载体或仙台病毒(英杰，按照以往报告的方法，由尿来源细胞制造诱导性多能干细胞(Okita etal.，2011)。利用机械装置抓起具有与人ES细胞类似的形态的7个诱导性多能干细胞群体并为了特性分析进行了进一步培养。在体外利用公知的方法将诱导性多能干细胞分化成3个胚叶(Sugii et al.，2010)。通过Ⅳ型胶原酶(英杰)部分地分离诱导性多能干细胞来诱导胚体(Embryoid body，EB)形成。将胚体移入培养皿(韩国SPL生命科学(SPL Lifesciences，Korea))，在无基本的成纤维细胞生长因子并补充有5％胎牛血清的人胚胎干细胞培养基中分化10天。通过利用适当的抗体胚体的免疫染色来调查细胞是否自行分化成代表胚叶的细胞。为了使诱导性多能干细胞分化成中胚叶系列，使用了稍微变更以往报告的方法(Yoo etal.，2013)。综上所述，将胚体移入培养皿，在无基本的成纤维细胞生长因子并补充有20ng/mL的骨形态发生蛋白4(bone morphogenic protein-4，BMP4，安迪生物科技(R&DSystems))及10ng/mL的激活素A(派普泰克)的人胚胎干细胞培养基中进行了培养。在第3天，在涂敷有基质胶的皿中摆放胚体，并在所述的培养基中额外培养3天。分化第6天，通过采集利用中胚叶系列分化的细胞来调查F8基因表达。

诱导性多能干细胞的特性分析

利用白细胞碱性磷酸酶染色试剂盒(西格玛)，按照制造商的说明书测定碱性磷酸酶活性。为了确认在尿来源细胞中生成诱导性多能干细胞细胞株，进行短串联重复(Shorttandem repeat，STR)分析。利用AmpFISTR聚合酶链式反应反应系统(AppliedBiosystems)，从诱导性多能干细胞细胞株及父母细胞分离的基因组DNA试样扩增短串联重复轨迹。在Human Pass公司(韩国)下进行基于聚合酶链式反应的短串联重复分析。为了核型分析，在GenDix公司(韩国)进行与各诱导性多能干细胞细胞株来源染色体有关的G-带分析。按照以往报告的方法进行对ES细胞标记免疫染色(Park et al.，2014)。为了核的视觉化，使用DAPI(4’，6-二氨基-2-苯基吲哚，Vector Laboratories)，利用Olympus IX71显微镜或FSX系统剪切图像后进行分析。

靶向的深层测序

利用Phusion聚合酶(纽英伦生物)扩增包含核酸酶靶向部位的基因组DNA片段。利用IlluminaMiSeq对相同量的聚合酶链式反应扩增子进行双端读长(paired-end read)测序。RGEN切割部位附近(PAMen3bp上游)的l当作由RGEN诱发的突变。

所有基因测序

利用DNeasy Tissue试剂盒(凯杰(Qiagen))，按照制造商的说明书纯化基因组DNA。利用Covaris系统对基因组DNA(1μg)进行切片化，通过End Repair Mix来形成钝端(blunt end)。利用适配器使切片的DNA结合制作文库。利用IlluminaHiSeq X TenSequencer在Macrogen(韩国)对文库进行测序。

所有基因测序分析及突变信息提取

在IlluminaHiSeq X Ten Sequencer通过Illumina公司(美国)的Isaac工作流程分析获取的FASTQ文件。综上所述，按照基准基因(hg19)利用Isaac Genome Alignmentsoftware(Isaac Aligner)对准由末端配对被读取的FASTQ文件。之后，利用Isaac VariantCaller鉴别单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)及插入及删除(indels)。在许多突变中，由于本发明者们几乎没有指导RGEN的置换，因此针对插入及删除聚焦。通过适用生物信息过滤器来排除了记录在公共数据库的插入及删除及提取于其他基因插入及删除。然后，将RGEN靶向部位与插入及删除位置相对应的野生型轨迹进行比较。31～106个的插入及删除部位包含5’-N(G/A)G-3’前间区序列邻近基序序列，与各个靶向序列至少与12个核苷酸相一致。最后，排出具有反复序列的部位后，对10个插入及删除部位进行靶向的深层测序。

潜在性的脱靶部位的检查

在各基因序列中，为了调查在许多潜在性的脱靶部位是否存在核酸酶-诱导插入及删除，通过使用Cas-OFF插入及删除鉴别与靶向部位相差8个的核苷酸，或者与5个碱基的DNA或RNA急增(bulge)相差2个的核苷酸的所有潜在性的脱靶部位(Bae et al.，2014)。在各潜在性的脱靶部位中，为了制造由所有CIGAR串的20％组成的保存性CIGAR串，使用了内部电脑程序。然后，比较许多潜在性的脱靶部位的保存性CIGAR串与基准序列的CIGAR串。其结果，获取了83～348个潜在性的脱靶部位。最后，仅在独立克隆中观察到，并在靶向部位周围进行了对不具有反复序列的4个插入及删除部位进行靶向的深层测序。

实验结果

首先，本发明者们分析相互没有亲属关系的11名重症A型血友病患者们的基因型，鉴别具有反转的一名和具有int22反转的2名患者。由此，通过选定具有int1反转的一名患者(命名为“Pa1”)及具有int22反转的两名患者(命名为“Pa2”及“Pa3”)来进行实验(图1a)。通过附加体载体或仙台病毒来向尿内上皮细胞导入4个山中(Yamanaka)因子，从而通过确立各个诱导性多能干细胞，来获取具有初学疾病的这些患者的成纤维细胞，预想避免侵入性活检。同时，由Cas9蛋白质及sgRNA(小引导RNA)构成的RGEN，在野生型海拉细胞及患者诱导性多能干细胞中，调查是否具有诱导或恢复这些反转的活性。以靶向1位内含子同源体内的部位的方式设计RGEN01(图3a)。RGEN01的活性非常高，在1位内含子同源体内的靶向部位中，以34％的频率诱导了小规模插入及删除(insertions and deletions，indels)(图3b)。进一步地，如反转-特异性聚合酶链式反应所示，RGEN01诱导海拉细胞的140-kbp染色体片段反转(图3c)。数码聚合酶链式反应分析结果所示，测定上述反转的频率为2.2％～3.1％(Kim et al.，2010；Lee et al.，2010)。

本发明者们分析反转-特异性聚合酶链式反应扩增子的DNA序列的结果，确认出在2个反转弯曲点连接部(breakpoint junction)中诱导了插入及删除(图3d)。根据这种高的频率，本发明者们向Pa1来源诱导性多能干细胞(Pa1-iPSCs)共转化编码Cas9蛋白质及sgRNA的质粒，利用聚合酶链式反应分析诱导性多能干细胞群体。120个群体中8个群体(必须不是来源于一个细胞)(6.7％)在琼脂糖凝胶上生成阳性聚合酶链式反应带。

进一步培养4个群体，获取单一细胞来源克隆。这些克隆生成与inth1h-1及inth1h-2部位相对应的聚合酶链式反应扩增子，但是由此可知，恢复了Pa1细胞的140-kbp染色体片段中的反转(图3e)。

与此相反，这种聚合酶链式反应扩增子不会由Pa1iPSCs或泌尿科细胞生成。本发明者们通过测序聚合酶链式反应扩增子，来在3个克隆的靶向部位观察到插入及删除没有被诱导。在其他克隆中，在靶向部位检测到3-bp删除(图3f)。

接着，本发明者们也针对其他22位内含子同源体反转聚焦。除了目的的600-kbp片段反转的恢复之外，为了排除包含2个或3个int22同源体的无用的删除或反转的可能性，使用靶向同源体的外部的两种RGEN(图1b)。这种策略还通过使用适当的引物来检测是否恢复。本发明者们为了靶向22位内含子同源体-1及22位内含子同源体-3附近的部位，设计两个RGEN(RGEN02及RGEN03)，通过T7核酸内切酶I(T7 endonuclease I)分析试验海拉细胞中的核酸酶活性。这些RGEN活性非常高，以44％或32％的频率诱导靶向部位的插入及删除(图1c)。然后，利用聚合酶链式反应检测两靶向部位之间的563-kbp染色体片段的反转。在RGEN02或RGEN03的情况下，不会生成反转-特异性聚合酶链式反应扩增子。与此相反，当共转化这些RGEN质粒时，生成两个反转-特异性聚合酶链式反应扩增子(图1d)。反转频率为1.5％～2.2％(表1)。

表1

海拉细胞中的靶向的反转频率

^*上限及下限表示95％的置信区间。

调查聚合酶链式反应扩增子的DNA序列的结果，可知通过观察到插入及删除伴随大部分两个反转弯曲点连接部，由2个RGEN诱发的两个DNA双链断裂借助错误-频发非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)来被恢复(图4a)。在F8外显子的方向海拉细胞为野生型。在Pa2及Pa3细胞中，F8外显子1-22被反转。但是，由于这两个RGEN靶向部位被保存，可恢复大量的染色体片段。

然后，通过电穿孔向Pa2iPSC转化RGEN02及03，分离135个群体后，对其的基因组DNA进行聚合酶链式反应分析。5个群体(3.7％)生成了与反转-编辑(即，恢复)对应的聚合酶链式反应扩增子。在Pa2-iPSCs或野生型诱导性多能干细胞中，未获取这种聚合酶链式反应产物(图1e)。通过确定这些群体来分离3个独立的来源于单一细胞的克隆。为了确认两个RGEN部位之间的563-kbp染色体片段是否恢复，而调查了两个反转弯曲点连接部中的DNA序列(图1f)。其结果，在这些反转-被编辑的诱导性多能干细胞的两弯曲点连接部中，观察到了如海拉细胞的作为错误频发非同源末端连接的特征的插入及删除。

本发明者们调查了反转被编辑的诱导性多能干细胞是否维持多能性。首先，调查反转-被编辑的Pa1(1位内含子同源体反转)及Pa2(22位内含子同源体反转)诱导性多能干细胞中的干细胞标记表达结果，确认到OCT4、SOX2、LIN28及NANOG被活跃地转录(图2a)。并且，这些反转被编辑的诱导性多能干细胞成功分化成3种第一胚叶(图2b)，进一步地，示出这些正常的核型(图2c)。综合上述，借助RGEN的整体的染色体恢复，可能对来源于患者的诱导性多能干细胞的多能性不会有负面影响。

来源于中胚叶的上皮细胞是F8基因表达的主要根源(Shahani et al.，2010)。本发明者们使患者诱导性多能干细胞及反转被编辑的患者诱导性多能干细胞分化成中胚叶后，通过逆转录聚合酶链式反应来测定F8mRNA的水平。不出所料可知，在Pa1-iPSC中，在分化的细胞中检测出与F8外显子1及2对应的的聚合酶链式反应带，从而在来源于患者的细胞中没有表达F8(图2d)。与此相反，在从野生型诱导性多能干细胞或2个反转-被编辑的Pa1-iPSCs(Co-1及Co-2)分化的细胞中，检测出与这些外显子相对应的聚合酶链式反应带。与此类似地，在Pa2-iPSC及Pa3-iPSC中分化的细胞中，未检测出与F8外显子22及23相对应的聚合酶链式反应扩增子，但是在从3个反转-被编辑的诱导性多能干细胞分化的细胞中检测出(图2d)与F8外显子22及23相对应的聚合酶链式反应扩增子。

在从反转被编辑的诱导性多能干细胞分化的细胞中，通过双脱氧测序来确认了外显子1及2或外显子22及23是否正确被剪接(图2e)。这种结果示出具有内含子1及内含子22反转的患者诱导性多能干细胞总中F8基因被编辑。

为了阻止RGEN靶向及脱靶部位中质粒切片的意外插入，向具有内含子1或内含子22反转的2个患者诱导性多能干细胞(Pa1及Pa3)转化大肠埃希氏菌(E.coli)表达后进行纯化的重组Cas9蛋白质及在体外转录的sgRNA(RGEN核蛋白，RNP)。

利用聚合酶链式反应及双脱氧测序，确认恢复F8基因的基因型功能的140-kbp或563-kbp染色体片段的恢复(图4b及4c)。与质粒不同地，转化核糖核蛋白后直接切割染色体靶向DNA，由于快速分解在细胞内(Kim et al.，2014)，还可通过RGEN核糖核蛋白的转化，来减少脱靶效应，而不用牺牲靶向位点的遗传体编辑活性。

RGEN可诱导与靶向部位序列相同的脱靶突变(Cho et al.，2014；Cradick etal.，2013；Fu et al.，2013；Hsu et al.，2013；Pattanayak et al.，2013)。本发明者们利用靶向的深层测序(deep sequencing)及所有基因组测序(whole genome sequencing，WGS)，在本发明所利用的RGEN在患者诱导性多能干细胞中，调查是否除了反转的编辑之外留下二次损害。首先，利用作为基于网程序的Cas-OFFinder(www.RNA-rgenome.net，Bae etal.2014)，在人基因中，探测到3个RGEN靶向部位和至少3个核苷酸不同的潜在性的脱靶部位。在RGEN01、RGEN02及RGEN03中，分别发现总12个、6个及14个部位。在反转被编辑的诱导性多能干细胞中，为了确认未在这些部位诱发插入及删除，利用了靶向的深层测序(表2)。

表2

潜在性的脱靶部位的分析

然后，对从患者(Pa1及Pa2)诱导性多能干细胞中分离的基因组DNA及各个反转-被编辑的诱导性多能干细胞进行所有基因组测序。首先，为了以hg19标准基因为准鉴别插入及删除，使用了作为突变信息的提取程序的Isaac。通过适用生物信息过滤器，来排除记载于公共数据库的插入及删除、具有1位内含子同源体或22位内含子同源体反转及其他反转-被反转的基因的患者基因中提取的插入及删除，及基于测序错误的同聚体或出现在反复序列的插入及删除。其结果，在各个反转-被编辑的基因序列中，获取固有的9848～13707个插入及删除。然后，比较RGEN靶向部位和与插入及删除位置向对应的野生型轨迹。只有31～106个插入及删除部位具有5’-N(G/A)G-3’前间区序列邻近基序序列，且至少与各个靶向序列一致12个核苷酸(表2)。之后，调查了两个反转-被编辑的基因中与这些插入及删除相对应的DNA序列。也未确认到任何插入及删除图靶向的深层测序。然后，所有潜在性的脱靶部位通过Cas-OFFinder，用电脑鉴别靶向部位和8个核苷酸差异，或5个碱基的DNA或RNA急增(bulge)和2个核苷酸差异。之后，比较排列在数千个潜在性的脱靶部位中导出的10个的附近的前导序列与标准序列(表2)，而未鉴别脱靶插入及删除。这种结果表示，在反转-被编辑的患者诱导性多能干细胞中，在本发明中所利用的3个RGEN没有诱发脱靶突变。综上所述，本发明者们为了恢复提供高达重症A型血友病的一半原因的两个大规模染色体反转，在来源于患者的诱导性多能干细胞中使用RGEN，由此观察到从反转被编辑的诱导性多能干细胞中分化的细胞表达F8基因。通过靶向的深层测序及所有基因组测序分析，确认在反转被编辑的诱导性多能干细胞中没有诱发脱靶突变。这是通过利用RGEN或其他基因剪刀，在患者诱导性多能干细胞中示出对染色体反转等的大规模基因重排进行编辑的首例。染色体反转也与其他遗传性疾病如亨特氏综合症(Bondeson et al.，1995)及癌(Nikiforova et al.，2000)有关。利用RGEN的诱导性多能干细胞中的靶向的基因重排以可使基因的结构性变形的方式，可利用于研究这些功能的手段及诱发为包括A型血友病的广范围的染色体重排的多种遗传疾病的基因及细胞治疗方法。

实施例2.转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-likeeffector nucleases)

实验方法

质粒编码转录激活因子样效应物核酸酶

通过利用为了在本发明中所利用的转录激活因子样效应物核酸酶质粒一站式Golden-Gate组件而构建的转录激活样效应阵列质粒，以以往报告的方法进行合成(Kim Y，et al.(2013)A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.NatBiotechnol 31(3)：251-258)。各个转录激活因子样效应物核酸酶质粒编码作为重复可变双残基模型的阵列的AvrBs3的N-末端135氨基酸、4个重复可变双残基halfrepeats中的一种和Sharkey FokI结构域(Guo J，Gaj T，Barbas CF，3rd(2010)Directed evolution ofan enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc fingernucleases.J Mol Biol 400(1)：96-107)。以靶向F8基因的1位内含子同源体的方式设计转录激活因子样效应物核酸酶位点；按照以往报告的方法鉴别潜在性的脱靶位点(Kim Y，etal.(2013)A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.NatBiotechnol 31(3)：251-258)。

从A型血友病患者分离基因组DNA

在首尔大学研究伦理审议委员会承认下，分析A型血友病患者的血液细胞。血液试样由韩国血友基金会提供，以以往报告的方法分离基因组DNA(Lee HJ，Kweon J，Kim E，KimS，Kim JS(2012)Targeted chromosomal duplications and inversions in the humangenome using zinc finger nucleases.Genome Res 22(3)：539-548)。

测定靶向的逆向的频率

通过数码聚合酶链式反应分析，以以往报告的方法测定靶向的反转的频率(KimS，Lee HJ，Kim E，Kim JS(2010)Analysis of targeted chromosomal deletions inducedby zinc finger nucleases.Cold Spring Harb Protoc 10.1101/pdb.prot5477)。利用转录激活因子样效应物核酸酶质粒依次稀释从转化的细胞分离的基因组DNA试样，对稀释的试样使用适当的引物来进行nested聚合酶链式反应(表3)。对各始点中的阳性带的片段进行计数，利用Extreme Limiting Dilution Analysis程序分析其结果(Hu Y，Smyth GK(2009)ELDA：Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted andenriched populations in stem cell and other assays.J Immunol Methods 347(1-2)：70-78)。

表3

在本发明中所使用的引物

细胞培养

在补充有胎牛血清(10％，vol/vol)及抗生素(1％)的DMEM中，培养HEK293T/17(ATCC；CRL-11268)及承认人皮肤成纤维细胞(Invitrogen；C-004-5C)。由补充有20％的(vol/vol)基因敲除血清代替物(英杰)、4.5g/L L-谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸、0.1mm的2-巯基乙醇及4ng/mL的基本的成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，派普泰克)DMEM/F12培养基构成的人胚胎干细胞培养液中，以以往报告的方法保持购自WiCell的人胚胎干细胞(hESC)细胞株(H9)、逆转录病毒来源人皮肤成纤维细胞(iPSC1)及在本发明中制造的诱导性多能干细胞(Kim DS，et al.(2010)Robust enhancement ofneural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innatedifference in differentiation propensity.Stem Cell Rev 6(2)：270-281)。

在HEK 293T细胞中靶向F8轨迹的转录激活因子样效应物核酸酶的确认

为了确认在本发明中所设计的转录激活因子样效应物核酸酶的基因操作活性，向HEK 293T细胞转化各个转录激活因子样效应物核酸酶对，并通过T7核酸内切酶I分析它们的活性(Kim HJ，Lee HJ，Kim H，Cho SW，Kim JS(2009)Targeted genome editing inhuman cells with zinc finger nucleases constructed via modularassembly.Genome Res 19(7)：1279-1288)。为了测定靶向F8轨迹的转录激活因子样效应物核酸酶诱导的反转的频率，以80％的汇合接种HEK293T/17细胞，之后利用脂质体2000(英杰)向转录激活因子样效应物核酸酶-编码质粒进行转化。分离基因组DNA试样并利用以往报告的方进行聚合酶链式反应分析确认染色体反转(Kim S，Lee HJ，Kim E，Kim JS(2010)Analysis of targeted chromosomal deletions induced by zinc fingernucleases.Cold Spring Harb Protoc 10.1101/pdb.prot5477)。

诱导性多能干细胞的制作及向3个胚叶分化

按照报告的方法使用编码特定重排因子的附加体载体(Okita K，et al.(2011)Amore efficient method to generate integration-free human iPS cells.NatMethods 8(5)：409-412)。综上所述，对在补充有10％的胎牛血清的DMEM中长大的人皮肤成纤维细胞，通过微细穿孔系统(Neon；Invitrogen)，按照制造商的说明书电穿孔附加体载体(总3μg)。1650V电压施加脉冲10分钟3次后，细胞在DMEM(包含10％的胎牛血清)中进一步培养细胞。转化7天后，将细胞移入饲养层用机械装置抓起与人胚胎干细胞具有类似的形态的诱导性多能干细胞群体并进行进一步培养，用于特性分析。

利用公知的方法，在体外将诱导性多能干细胞分化成3个胚叶(Sugii S，et al.(2010)Human and mouse adipose-derived cells support feederindependentinduction of pluripotent stem cells.Proc Natl Acad Sci USA 107(8)：3558-3563)。通过Ⅳ型胶原酶(英杰)部分分离诱导性多能干细胞，从而将形成的胚体(Embryoidbodies，EBs)移入超低吸附板((Ultralow attachment plate，Corning)，并在补充有20％(vol/vol)的基因敲除血清(英杰)、4.5g/L的L-谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸、0.1mm的2-巯基乙醇及5％胎牛血清的DMEM/F12(1：1)培养基中进行培养。在上述条件培养1周后，在基质胶-涂敷皿附着胚体并进一步培养10天。通过利用适当的抗体胚体的免疫染色调查是否自行分化为代表3种胚叶的细胞。

诱导性多能干细胞的分化

按照以往报告的方法使诱导性多能干细胞分化为内胚叶系列(Si-Tayeb K，etal.(2010)Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells frominduced pluripotent stem cells.Hepatology 51(1)：297-305)。综上所述，在mTeSR-1人胚胎干细胞成长培养基(StemCell Technology)中以无支持细胞环境(feeder free)培养诱导性多能干细胞群体。为了获取确切的内胚叶细胞，在补充有100ng/mL的激活素A(派普泰克)及5μM的磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂(LY-294002；西格玛)的RPMI/B27(RPMI-1640购自西格玛，B27购自英杰)培养基中培养未分化的诱导性多能干细胞5天。通过采集分化成内胚叶的细胞来分离总RNA，并用作合成cDNA的模板。

变更以往报告的方法使诱导性多能干细胞分化为内胚叶上皮细胞(Yoo CH，etal.(2013)Endothelial progenitor cells from human dental pulp-derived iPScells as a therapeutic target for ischemic vascular diseases.Biomaterials 34(33)：8149-8160)。综上所述，补充有20ng/mL BMP4(bone morphogenic protein 4，安迪生物科技)及10ng/mL激活素A(派普泰克)的人胚胎干细胞中培养胚体，在形成胚体第3天，在基质胶-涂敷皿福州胚体后，在补充有100ng/mL的VEGF(派普泰克)及50ng/mL的基本的成纤维细胞生长因子(安迪生物科技)的培养基中，诱导分化成上皮细胞10天。

用于诱导性多能干细胞的反转及恢复诱导的转录激活因子样效应物核酸酶转化

收集通过处理Ⅳ型胶原来所培养的诱导性多能干细胞。用磷酸盐缓冲溶液清洗后，用Accutase(英杰)进一步处理细胞并生成单一细胞悬浮物(Desbordes SC，et al.(2008)High-throughput screening assay for the identification of compoundsregulating self-renewal and differentiation in human embryonic stemcells.Cell Stem Cell 2(6)：602-612)。混合这些单一细胞与转录激活因子样效应物核酸酶编码质粒(5μg的各个质粒)，并以850V电压施加脉冲30分钟。之后，在饲养细胞接种细胞并培养细胞10天。为了检测基因组反转或恢复，在各个群体得到的细胞在裂解缓冲液[含有蛋白酶K的1x Ex-taq缓冲液(pH8.0)]中，56℃下破碎在各个群体得到的细胞3小时。未活性化蛋白酶K后，利用Ex-taq DNA聚合酶(宝生)及特异性引物对2μL的基因组DNA溶液进行聚合酶链式反应。利用琼脂糖凝胶电泳分析聚合酶链式反应产物，所使用的引物如表5所示。

细胞的克隆种群的分离、聚合酶链式反应分析及弯曲点的DNA测序

为了分离反转(或反复)细胞的克隆种群，通过聚合酶链式反应，通过公知的方法利用鉴别为所期待的基因变形形成的各群体分离成单一细胞，并进行重摆。在进行3继代培养后，选定几个克隆(反转6克隆及恢复4克隆)进行测序及额外实验。为了确定序列，对扩增的聚合酶链式反应产物进行电泳，利用凝胶提取试剂盒(Gel Extraction kit)(SolGent)从琼脂糖凝胶中洗脱，并在pGEM-T载体(Promega)进行克隆。利用T7引物测序克隆的聚合酶链式反应产物。

RNA分离、逆转录聚合酶链式反应及定量聚合酶链式反应

利用TRIzol试剂(英杰)按照制造商的说明书由细胞纯化所有RNA。利用DiaStarcDNA合成试剂盒(SolGent)由总RNA(1μg)合成cDNA。为了确认凝血因子VIII，FOXA2，Sox17及甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达，以合成的cDNA为模板利用Ex-Taq(宝生)进行聚合酶链式反应。为了定量聚合酶链式反应，按照制造商的说明书使用SYBR Premix Ex-Taq(宝生)。将用于逆转录聚合酶链式反应或定量聚合酶链式反应的引物列入表5。

碱性磷酸酶染色及免疫染色

利用白细胞碱性磷酸酶染色试剂盒(西格玛)，按照制造商的说明书测定碱性磷酸酶活性。为了多能性干细胞标记染色，将细胞固定于4％的甲醛溶液，并用0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)进行渗透化。用磷酸盐缓冲溶液清洗后，在包含5％的正常山羊血清及2％的BSA的磷酸盐缓冲溶液溶液中培养细胞。之后，在常温下与第一抗体一同培养2小时，用磷酸盐缓冲溶液清洗后，在肠胃下与荧光结合第二抗体(Alexa Fluor 488or 594；Invitrogen)一同培养。为了视觉化核，在包含DAPI(Vector Laboratories)的抗荧光淬灭封片液准备细胞。剪切图像并通过Olympus IX71显微镜或FSX系统进行分析。

DNA指纹分析及核型分析

为了确认诱导性多能干细胞细胞株的皮肤成纤维细胞起源，在休曼派斯基因分析研究公司(Gene-Analysis Institute of Human Pass Inc.)进行基于聚合酶链式反应的短串联重复(short tandem repeat)分析。综上所述，由诱导性多能干细胞细胞株及它们的父母细胞分离的基因组聚合酶链式反应，利用AmpFISTR聚合酶链式反应系统扩增短串联重复轨迹。利用ABI PRISM 3130XLSTR P分析机及Genemapper(Version 3.2；AppliedBiosystems)分析扩增产物。为了调查核型，通过利用姬姆萨(Giemsa)染色染色体来分析G带，分析使用(Chromosome Image Processing System)。

统计分析

数据用平均±标准差来表示。统计分析适用t检验，在P<0.05的情况下，认为具有统计学显著性。

实验结果

人诱导性多能干细胞的制作及特性分析

通过对编码4种Yamanaka因子的附加体载体进行电穿孔来从人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts，HDFs)获取人皮肤成纤维细胞。在饲养细胞层重摆转化的细胞后，在10天后出现胚胎干细胞(ESC)类似群体。选定具有碱性磷酸酶活性的共8个群体群体(命名为Epi1-Epi8)(图5a及5b)。在7或8继代后，为了确认这些克隆中不存在附加体载体，进行在载体内EBNA-1序列利用特异性引物的聚合酶链式反应。只有一个克隆(Epi1)含有EBNA-1序列，为此，在之后分析排除排出(图5c)。然后，确认到2个诱导性多能干细胞细胞株(Epi3及Epi8)的核型，如图10a所示，它们具有正常的核型。为了确认这些诱导性多能干细胞是否来源于父母HDF，进行DNA指纹分析(表4)。在这种初期特性分析后，本发明者们选定Epi3细胞株为进一步实验的对象。

表4

对iPS细胞株的短串联重复(short tandem repeat)分析

轨迹/细胞株	HDF	Epi3	Epi4	Epi8
					D8S1179	11 15	11 15	11 15	11 15
D21S11	29 30	29 30	29 30	29 30
					D7S820	10 11	10 11	10 11	10 11
CSF1PO	11 13	11 13	11 13	11 13
					D3S1358	16 18	16 18	16 18	16 18
TH01	8 9	8 9	8 9	8 9
					D13S317	8 10	8 10	8 10	8 10
D16S539	9 13	9 13	9 13	9 13
					D2S1338	20 23	20 23	20 23	20 23
D19S433	13 14	13 14	13 14	13 14
					vWA	14 18	14 18	14 18	14 18
TPOX	8 11	8 11	8 11	8 11
					D18S51	14 24	14 24	14 24	14 24
D5S818	12 12	12 12	12 12	12 12
					FGA	23 26	23 26	23 26	23 26

该诱导性多能干细胞细胞株表达典型的胚胎干细胞标记蛋白如OCT4、NANOG、SSEA-4及TRA-1-60(图5d及图10b)。逆转录聚合酶链式反应及定量聚合酶链式反应分析结果，可知与作为人ESC细胞株的H9相比，多能性标记基因高表达在Epi3细胞株中(图5e及5f)。然后，调查Epi3细胞株的分化能力。通过获取胚体来附着在胶原涂敷培养皿，以使在体外体外自行分化成3个胚叶。不出所料，外胚叶(巢蛋白及Pax6)、中胚叶[α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)及鼠短尾突变体表型]及内胚叶[AFP(α-胎蛋白)及HNF3β(肝细胞核因子3-β)]系列的标记蛋白表达在分化的细胞(图5g及图10c)。这些数据表示来源于成人HDF的Epi3细胞株具有多能性。

利用转录激活因子样效应物核酸酶对的诱导性多能干细胞的F8轨迹的靶向的反转

与反转相同的结构突变(Structural variations，SVs)与包括A型血友病的遗传性疾病有关(Feuk L，Carson AR，Scherer SW(2006)Structural variation in the humangenome.Nat Rev Genet 7(2)：85-97)。近一半的重症A型血友病因而诱发损伤X-相关F8基因的2个相互不同的反转而被诱发。由保函1位内含子(重症A型血友病的1～4％)或22位内含子(重症A型血友病的约50％)内的序列的非等位同源重组(nonallelic HR，NAHR)及与这些相对应的同源序列(分别命名为1位或2位内含子反转)产生这些反转(Lakich D，Kazazian HH，Jr.，Antonarakis SE，Gitschier J(1993)Inversions disrupting thefactor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A.Nat Genet 5(3)：236-241)。本发明者们针对1位内含子反转聚焦，构建以1位内含子同源体为靶的11对转录激活因子样效应物核酸酶(图6a)。利用T7核酸内切酶I分析，通过HEK 293T细胞试验这些转录激活因子样效应物核酸酶的基因操作活性(Kim HJ，Lee HJ，Kim H，Cho SW，Kim JS(2009)Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleasesconstructed via modular assembly.Genome Res 19(7)：1279-1288)(图6b)。在靶向部位以33％的频率诱导突变，从而选定活性最高的转录激活因子样效应物核酸酶对(命名为转录激活因子样效应物核酸酶01)。上述转录激活因子样效应物核酸酶在HEK 293T细胞以1.9％的频率诱导包含1位内含子同源体的140-kb反转(图11)。然后，本发明者们在调查上述转录激活因子样效应物核酸酶是否在同源性高的部位具有脱靶效应的结果，确认到通过T7核酸内切酶I分析在这些部位中未检测出脱靶突变(图12及表5)。

表5

转录激活因子样效应物核酸酶01的潜在性的脱靶部位

之后，本发明者们为了制作血友病模型细胞株，利用相同的转录激活因子样效应物核酸酶对在诱导性多能干细胞诱导140-kb反转。向野生型诱导性多能干细胞电穿孔转录激活因子样效应物核酸酶质粒来培养10天，进而形成群体。利用可检测出反转的特异性引物，进行对由各群体中分离的基因组DNA试样的聚合酶链式反应。432个中的6个群体(抵过1.4％，HEK293细胞)在2个反转弯曲点连接部(breakpoint junction)示出阳性聚合酶链式反应带。进一步培养4个群体来制造单一细胞克隆。这些克隆形成作为140-kb反转的诊断基准的聚合酶链式反应带，但是未形成与野生型的基因型相对应的聚合酶链式反应带(图7a)。然后，本发明者们通过克隆这些聚合酶链式反应产物来调查DNA序列，从而确认反转基因型。在转录激活因子样效应物核酸酶的靶向部位未发现插入及删除(图7b)，这暗示1位或2位内含子类似体被转录激活因子样效应物核酸酶诱导的单一DNA双链断裂通过无错误(error-free)NAHR引发DNA反转。但是，转录激活因子样效应物核酸酶在内含子同源体1中生成一个，在同源体2种又生成一个，因此共生成两个DNA双链断裂，并不能排除这些DNA双链断裂借助非同源末端连接来结合在断开之间的可能性而未留下二次突变。

诱导性多能干细胞系统中的反转片段的靶向的反转

在早期的研究中，本发明者们利用锌指核酸酶对诱导包含HEK 293细胞的1位内含子同源体的靶向的染色体反转，来分离具有反转的异形接合克隆(Lee HJ，Kweon J，Kim E，Kim S，Kim JS(2012)Targeted chromosomal duplications and inversions in thehuman genome using zinc finger nucleases.Genome Res 22(3)：539-548)。但是，HEK293细胞不表达F8基因，可能无法使用于细胞治疗。进一步地，HEK 293细胞具有复制的X染色体。这种局限通过恢复反转部位来恢复F8基因的表达，从而成为企图治疗性适用的障碍。

本发明者们调查血友病模型诱导性多能干细胞细胞株等的反转140-kbp片段是否因利用转录激活因子样效应物核酸酶对的恢复(reversion)而被编辑(转录激活因子样效应物核酸酶部位完全保存于在疾病模型细胞株)。在包含反转的2个诱导性多能干细胞克隆(以下“反转克隆”)转化转录激活因子样效应物核酸酶质粒，对从几个群体中分离的基因组DNA试样进行聚合酶链式反应分析，从而鉴别反复细胞。本发明者们筛选共300个群体后，由各个诱导性多能干细胞克隆获取2个反复克隆。因此，恢复频率为1.3％(300中4)，这与反转频率相同。通过聚合酶链式反应分析可知这些反复克隆的基因型与恢复成野生型的基因型相一致。在这些克隆的试样中未检测出反转特异性聚合酶链式反应带(图8a)。之后，可用包含同源体1及2的这些聚合酶链式反应产物并进行测序。两个克隆中没有突变，但在剩下两个克隆中，均在同源体1及2在两转录激活因子样效应物核酸酶部位发生2-bp删除(图8b)。这种结果表示，可利用与生成疾病模型所使用的相同的转录激活因子样效应物核酸酶对，来对在重症A型血友病中出现的反转基因型进行编辑。

不仅如此，本发明者们通过确认是否表达人ES标记及它们是否具有分化成3中一次胚叶的能力，来调查反转克隆及反复克隆是否依然以多能性细胞的方式存在。这些克隆以抵过野生型诱导性多能干细胞的水平表达干细胞标记(图5f)，并在体外分化成3个胚叶(图14)。这种结果示出，转录激活因子样效应物核酸酶-媒介遗传体冲程对诱导性多能干细胞的多能性无负面影响。

由反复诱导性多能干细胞分化的细胞中的F8基因表达

F8基因分别在来源于内胚叶及中胚叶的干细胞及上皮细胞中表达(ZelechowskaMG，van Mourik JA，Brodniewicz-Proba T(1985)Ultrastructural localization offactor VIII procoagulant antigen in human liver hepatocytes.Nature317(6039)：729-730；Hollestelle MJ，et al.(2001)Tissue distribution of factor VIII geneexpression in vivo；Shahani T，et al.(2010)Activation of human endothelialcells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storagepool.Blood 115(23)：4902-4909)。首先，本发明者们调查F8基因是否表达在来源于野生型及反复诱导性多能干细胞克隆的内胚叶细胞。使诱导性多能干细胞分化成内胚叶后，通过逆转录聚合酶链式反应分析测定F8mRNA的结果，不出所料，在由野生型及反复诱导性多能干细胞克隆分化的细胞检测到F8mRNA(图9a)。与此相反，在由具有反转的诱导性多能干细胞分化的细胞中，即使有效分化成野生型及反复诱导性多能干细胞量的内胚叶，也为检测到F8mRNA。然后，调查作为F8蛋白质的主生产原因的上皮细胞中的F8蛋白质表达(ShahaniT，et al.(2010)Activation of human endothelial cells from specific vascularbeds induces the release of a FVIII storage pool.Blood 115(23)：4902-4909)。使诱导性多能干细胞分化成上皮细胞后，进行用于检测F8蛋白质的免疫染色。不出所料，由野生型及反复诱导性多能干细胞克隆分化的细胞表达F8蛋白质(图9b)。但是，即使通过作为成熟上皮细胞标记蛋白质的血管性血友病因子的表达，确认这些诱导性多能干细胞成功地分化为上皮细胞，但由反转克隆分化的细胞未表达F8蛋白质。这种结果证明，在反复诱导性多能干细胞中保持F8基因的保全性。

以上，详细说明了本发明的特定部分，对本领域的普通技术人员而言，要明确的是，这些具体技术只是优选实例，而由此并不限定本发明的范围。因此，本发明的实际范围根据所附的权利要求和同等技术方案来进行定义。

序列表

<110> Industry Academic Cooperation Foundation Yonsei University

Institute for Basic Science

<120> 利用以凝血因子VIII基因为靶的核酸内切酶的A型血友病治疗用组合物

<130> PP160001

<150> KR10-2015-0001392

<151> 2015-01-06

<150> KR10-2015-0001391

<151> 2015-01-06

<160> 60

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

cacaaattct caatatgccc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

tggtaagagt accggtggga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

ggtccccggg gttgtgcccc 20

<210> 4

<211> 1041

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

cagttgtcag tatgtgaaca atgttggaaa catgttattt tgtctgattt cctttgggag 60

aattcattgc cagctataaa tctgtggaaa cgctgccaca caatcttagc acacaagatt 120

ggcagaaaat cgcttagaaa cactgaaaac atgtgacaaa gtgctttccg tgaaaagggt 180

ggatgcgaag cagtaaggac ccccttcatg aagcacgcgg tcaccctcca gccaccagaa 240

ccagaggaac gctgtggtaa ctgagggaaa acgcatctag gcacacgtca cggtggcacc 300

ttccagcagg tccccggggt tgtgcccctg gagctctgac aaagagtgtg gcccggaaat 360

gtgatgtttg gactgcaagt tttggtgaga aataacaatg catcaggttg cagacaaagc 420

agaccctgct ctgtgcgttt atgggagccg cgcccaacag gaaccacagg gaatgatcga 480

aaggagaggg acggacacaa acagacacac cagagagagg ttctcaggag gaggctctgt 540

ggcctccaga ccacgtcaaa gccaaggcag aaaggatgaa ctgaggaaag gaggaaaatt 600

tccccttaag gaaggtaaaa tccagaaggg atccctaaaa tggtgagcag tttaaaccta 660

gcagttttgc attaattcac ataaagtata atgaaaactg ttggacacac aaggagagac 720

tggccaatct atagtcacag aggaagacct tcacacccct tcacaggatc tcgcagcaga 780

ttggctgaaa agtctccttg aaactgcaga cctctctcaa ggagacccac tgagttgggc 840

aaaggtgggg ccgacttaat tcttgcctcc ctgctctccc acgtagccct gcatttcact 900

ccattccagg gtttctggga cacccgagaa agcacgtagt ccagggagca cgtctgccaa 960

ctgaaggcct tgacaaatga ctttctgtac tggctgaggg ccagggccca gcgtactgat 1020

aaggaagctc ttccagaaaa a 1041

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1-F1

<400> 5

aaatcaccca aggaagcaca 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1-R1

<400> 6

tggcattaac gtattacttg gaga 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1-F2

<400> 7

tgctgagcta gcaggtttaa tg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1-R2

<400> 8

tgctgagcta gcaggtttaa tg 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 22-F1

<400> 9

tggggctgtg taaatttgct 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 22-R2

<400> 10

caaacgtagc attacctgat tgt 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 22-F2

<400> 11

acaaccagag cagaaatcaa tga 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 22-R2

<400> 12

tttcaccaca tccacgccaa 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH-F

<400> 13

cccctcaagg gcatcctggg cta 23

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH-R

<400> 14

gaggtccacc accctgttgc tgta 24

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OCT4-F

<400> 15

cctcacttca ctgcactgta 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OCT4-R

<400> 16

caggttttct ttccctagct 20

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LIN28-F

<400> 17

agccatatgg tagcctcatg tccgc 25

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LIN28-R

<400> 18

tcaattctgt gcctccggga gcagggtagg 30

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SOX2-F

<400> 19

ttcacatgtc ccagcactac caga 24

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SOX2-R

<400> 20

tcacatgtgt gagaggggca gtgtgc 26

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NANOG-F

<400> 21

tgaacctcag ctacaaacag 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NANOG-R

<400> 22

tggtggtagg aagagtaaag 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F8-外显子1-F

<400> 23

ctgctttagt gccaccagaa ga 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F8-外显子3-R

<400> 24

ctgctttagt gccaccagaa ga 22

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F8-外显子3-R

<400> 25

gactgacagg atgggaagcc 20

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F8-外显子21-F

<400> 26

ccggatcaat caatgcctgg ag 22

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F8-外显子23-R

<400> 27

atgagttggg tgcaaacgga tg 22

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠短尾突变体表型-F

<400> 28

atcacaaaga gatgatggag gaa 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠短尾突变体表型-R

<400> 29

ggtgagttgt cagaataggt tgg 23

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 30

taaagtataa tgaaaactgt 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 31

gagagactgg ccaatctata 20

<210> 32

<211> 650

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 左TAL效应子

<400> 32

Leu Asn Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

1 5 10 15

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

20 25 30

Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

35 40 45

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

50 55 60

Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala

65 70 75 80

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

85 90 95

Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala

100 105 110

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

115 120 125

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val

130 135 140

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

145 150 155 160

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

165 170 175

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

180 185 190

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

195 200 205

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala

210 215 220

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

225 230 235 240

Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

245 250 255

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp

260 265 270

His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

275 280 285

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

290 295 300

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

305 310 315 320

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

325 330 335

Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala

340 345 350

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

355 360 365

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala

370 375 380

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

385 390 395 400

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val

405 410 415

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

420 425 430

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala

435 440 445

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

450 455 460

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

465 470 475 480

Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

485 490 495

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly

500 505 510

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

515 520 525

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

530 535 540

His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

545 550 555 560

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

565 570 575

Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

580 585 590

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

595 600 605

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

610 615 620

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu

625 630 635 640

Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu

645 650

<210> 33

<211> 648

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 右TAL效应子

<400> 33

Leu Asn Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

1 5 10 15

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

20 25 30

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

35 40 45

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

50 55 60

Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala

65 70 75 80

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

85 90 95

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala

100 105 110

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

115 120 125

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val

130 135 140

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

145 150 155 160

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala

165 170 175

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

180 185 190

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

195 200 205

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala

210 215 220

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

225 230 235 240

Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

245 250 255

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp

260 265 270

His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

275 280 285

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

290 295 300

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

305 310 315 320

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

325 330 335

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala

340 345 350

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

355 360 365

Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala

370 375 380

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

385 390 395 400

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val

405 410 415

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

420 425 430

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala

435 440 445

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

450 455 460

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr

465 470 475 480

Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

485 490 495

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

500 505 510

Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

515 520 525

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

530 535 540

His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

545 550 555 560

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

565 570 575

Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

580 585 590

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

595 600 605

Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

610 615 620

Ser Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg

625 630 635 640

Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu

645

<210> 34

<211> 1041

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 34

cagttgtcag tatgtgaaca atgttggaaa catgttattt tgtctgattt cctttgggag 60

aattcattgc cagctataaa tctgtggaaa cgctgccaca caatcttagc acacaagatt 120

ggcagaaaat cgcttagaaa cactgaaaac atgtgacaaa gtgctttccg tgaaaagggt 180

ggatgcgaag cagtaaggac ccccttcatg aagcacgcgg tcaccctcca gccaccagaa 240

ccagaggaac gctgtggtaa ctgagggaaa acgcatctag gcacacgtca cggtggcacc 300

ttccagcagg tccccggggt tgtgcccctg gagctctgac aaagagtgtg gcccggaaat 360

gtgatgtttg gactgcaagt tttggtgaga aataacaatg catcaggttg cagacaaagc 420

agaccctgct ctgtgcgttt atgggagccg cgcccaacag gaaccacagg gaatgatcga 480

aaggagaggg acggacacaa acagacacac cagagagagg ttctcaggag gaggctctgt 540

ggcctccaga ccacgtcaaa gccaaggcag aaaggatgaa ctgaggaaag gaggaaaatt 600

tccccttaag gaaggtaaaa tccagaaggg atccctaaaa tggtgagcag tttaaaccta 660

gcagttttgc attaattcac ataaagtata atgaaaactg ttggacacac aaggagagac 720

tggccaatct atagtcacag aggaagacct tcacacccct tcacaggatc tcgcagcaga 780

ttggctgaaa agtctccttg aaactgcaga cctctctcaa ggagacccac tgagttgggc 840

aaaggtgggg ccgacttaat tcttgcctcc ctgctctccc acgtagccct gcatttcact 900

ccattccagg gtttctggga cacccgagaa agcacgtagt ccagggagca cgtctgccaa 960

ctgaaggcct tgacaaatga ctttctgtac tggctgaggg ccagggccca gcgtactgat 1020

aaggaagctc ttccagaaaa a 1041

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 同源1-1F

<400> 35

aaatcaccca aggaagcaca 20

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 同源1-1R

<400> 36

tggcattaac gtattacttg gaga 24

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 同源2-2F

<400> 37

ggcagggatc ttgttggtaa a 21

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 同源2-2R

<400> 38

tgctgagcta gcaggtttaa tg 22

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH-F

<400> 39

cccctcaagg gcatcctggg cta 23

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH-R

<400> 40

gaggtccacc accctgttgc tgta 24

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Oct4-F

<400> 41

cctcacttca ctgcactgta 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Oct4-R

<400> 42

caggttttct ttccctagct 20

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sox2-F

<400> 43

cccagcagac ttcacatgt 19

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sox2-R

<400> 44

cctcccattt ccctcgtttt 20

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lin28-F

<400> 45

agccaagcca ctacattc 18

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lin28-R

<400> 46

agatacgtca ttcgcaca 18

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nanog-F

<400> 47

tgaacctcag ctacaaacag 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nanog-R

<400> 48

tggtggtagg aagagtaaag 20

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F8-F

<400> 49

ctgctttagt gccaccagaa ga 22

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F8-R

<400> 50

gactgacagg atgggaagcc 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FOXA2-F

<400> 51

ctacgccaac atgaactcca 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FOXA2-R

<400> 52

aaggggaaga ggtccatgat 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sox17-F

<400> 53

agcgcccttc acgtgtacta 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sox17-R

<400> 54

cttgcacacg aagtgcagat 20

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于iPSC产生的GAPDH-F

<400> 55

gaacatcatc cctgcctcta ctg 23

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于iPSC产生的GAPDH-R

<400> 56

caggaaatga gcttgacaaa gtgg 24

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EBNA-1-F

<400> 57

atggacgagg acggggaaga 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EBNA-1-R

<400> 58

gccaatgcaa cttggacgtt 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 293-F

<400> 59

gagcagggag gcaagaatta 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 293-R

<400> 60

tgagggaaaa cgcatctagg 20

Claims (9)

1.一种组合物，作为凝血因子VIII(F8)基因的反转编辑和/或诱导用组合物，其包含：

(a)RNA-诱导核酸内切酶或RNA-诱导核酸内切酶的编码核苷酸序列；以及

(b)特异性识别以下核苷酸序列的指导RNA或编码上述指导RNA的核苷酸，上述被特异性识别的核苷酸序列作为选自由以下组成的序列组中的一对核苷酸序列：

(i)序列目录第1序列的核苷酸序列；以及

(ii)序列目录第2序列的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA-诱导核酸内切酶为Cas9。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于编辑在凝血因子VIII(F8)基因的22位内含子中发生的反转。

4.一种组合物，作为凝血因子VIII(F8)基因的反转编辑和/或诱导用组合物，其包含：

(a)RNA-诱导核酸内切酶或编码RNA-诱导核酸内切酶的核苷酸序列，其中所述RNA-诱导核酸内切酶为Cas9；以及

(b)特异性识别序列目录第3序列的核苷酸序列的指导RNA或编码上述指导RNA的核苷酸。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述组合物用于编辑在凝血因子VIII(F8)基因的1位内含子中发生的反转。

6.一种编辑凝血因子VIII(F8)基因的反转的体外方法，其包括使A型血友病患者的体细胞与根据权利要求1至5中任一项所述的组合物相接触或向所述体细胞转染插入有上述组合物的基因载体的步骤。

7.一种凝血因子VIII(F8)基因的反转被编辑的诱导多功能干细胞的制备方法，其包括：

步骤(a)，通过逆分化从A型血友病患者分离出的体细胞来获取诱导多功能干细胞；以及

步骤(b)，使上述诱导多功能干细胞与根据权利要求1至5中任一项所述的组合物相接触或向所述体细胞转染插入有上述组合物的基因载体。

8.根据权利要求7所述的凝血因子VIII(F8)基因的反转被编辑的诱导多功能干细胞的制备方法，其中所述步骤(a)通过向从上述A型血友病患者分离出的体细胞转染选自OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、KLF4及c-MYC中的一种以上的基因来进行。

9.一种凝血因子VIII(F8)基因的体外反转诱导方法，其包括使根据权利要求1至5中任一项所述的组合物导入正常人的体细胞的步骤。

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