ES2842151T3

ES2842151T3 - Endonucleasa dirigida al gen del factor VIII de coagulación sanguínea y composición para el tratamiento de la hemofilia que comprende el mismo

Info

Publication number: ES2842151T3
Application number: ES16735167T
Authority: ES
Inventors: Dong Wook Kim; Jin Soo Kim; Chul Yong Park; Duk Hyoung Kim; Jung Eun Kim; Ji Yeon Kweon
Original assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University; Institute for Basic Science
Current assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University; Institute for Basic Science
Priority date: 2015-01-06
Filing date: 2016-01-06
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2036-01-06
Also published as: EP3243529A4; EP3498843B1; US11197935B2; US11185596B2; US20180071405A1; JP6603721B2; EP3498843A1; US11202839B2; EP3243529A2; ES2886194T3; EP3243529B1; CN108064280B; WO2016111546A2; CN108064280A; US20180021457A1; JP2018502578A; US20180055951A1; WO2016111546A3; WO2016111546A9

Abstract

Una composición para corregir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo la composición: (a) endonucleasa guiada por ARN o una secuencia de nucleótidos que codifica la endonucleasa guiada por ARN; y (b) ARN guía que reconoce específicamente las siguientes secuencias de nucleótidos o secuencias complementarias de las mismas, o una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN guía, siendo las secuencias de nucleótidos reconocidas específicamente un par de secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en: (i) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1; (ii) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:2; y (iii) una secuencia de nucleótidos de 15 a 25 pb presente en la secuencia de nucleótidos de 562.975 pb entre (i) y (ii) en el intrón 22 del gen F8, en donde (iii) no tiene una secuencia de nucleótidos, que tenga una homología de secuencia de al menos un 80 % con (i) o (ii) en la secuencia de nucleótidos de 562.975 pb entre (i) y (ii), y simultáneamente, de la que la secuencia de nucleótidos 5'-N(G/A)G-3' está unida cadena abajo.

Description

DESCRIPCIÓN

Endonucleasa dirigida al gen del factor VIII de coagulación sanguínea y composición para el tratamiento de la hemofilia que comprende el mismo

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición y a un método in vitro para corregir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea. La invención también se refiere a un método para preparar células madre pluripotentes inducidas que tienen un gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea con inversión corregida y a una composición que comprende estas células madre pluripotentes inducidas como un activo para el tratamiento de la hemofilia A. La invención además se refiere a una composición y un método in vitro para inducir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea.

Antecedentes de la técnica

La hemofilia A es uno de los trastornos hemorrágicos genéticos más comunes, con una incidencia de 1 de cada 5.000 hombres en todo el mundo. Este trastorno está causado por diversas mutaciones genéticas en el gen del factor VIII (F8) de coagulación ligado al cromosoma X. Los síntomas clínicos varían ampliamente en función de los genotipos. La hemofilia A se puede caracterizar como grave (actividad < 1%), moderada (actividad del 1-5 %) o leve (actividad del 5-30 %), dependiendo de la cantidad relativa de actividad F8 en el plasma del paciente (Graw et al., 2005). Aproximadamente el 50 % de los casos de hemofilia A grave están causados por inversiones cromosómicas que incluyen el homólogo del intrón 1 (intlh, aproximadamente el 5 % de la hemofilia A grave) y el homólogo del intrón 22 (int22h, aproximadamente el 40 % de la hemofilia A grave) de F8 en lugar de una mutación puntual. Estas dos inversiones son el resultado de la restauración errónea de roturas de doble hebra de ADN (DSB, por sus siglas en inglés) inducidas por recombinación homóloga a través de recombinación homóloga no alélica (NAHR, por sus siglas en inglés).

Anteriormente, los inventores utilizaron nucleasa de dedos de zinc (ZFN, por sus siglas en inglés) de las líneas celulares humanas de tipo silvestre inmortalizadas y TALEN (nucleasa basada en efectores similar al activador de la transcripción) de iPSC (por sus siglas en inglés, célula madre pluripotente inducida) para obtener segmentos cromosómicos entre dos secuencias int1h idénticas (intlh-1 e intlh-2) que están separados por 140 kpb y tienen una frecuencia de 0,1 % y 1,9 %, respectivamente (Park et al., 2014). Este método induce artificialmente genotipos invertidos que imitan la reparación errónea de DSB. Otras inversiones de 600 kpb que comprenden tres secuencias int22h (int22h-1, -2 y -3) eran 8 veces más frecuentes que la inversión de 140 kbp, pero el tamaño de la región invertida era grande y había tres homólogos en el cromosoma X, lo que dificultaba la recuperación. Asimismo, int22h (10 kpb) es mucho más grande que int1h (1 kpb), por lo que es muy difícil analizar el genotipo de la inversión o reparación de int22h usando PCR convencional porque se debe amplificar todo el int22h de 10 kpb. De hecho, no se ha sabido que el segmento cromosómico de 600 kpb que comprende int22h en células humanas, así como en las iPSC derivadas de pacientes, se puedan restaurar usando nucleasa programable.

Los presentes inventores, como un Cas corto repetido (CRISPR/asociado a CRISPR) que tiene un paquete de tipo II con intervalos regulares, intentaron reparar dos inversiones en iPSC derivadas de pacientes con hemofilia de tipo A utilizando RGEN (nucleasa modificada por ingeniería guiada por ARN) (Cho et al, 2013; Cho et al, 2014).

Además, los inventores han demostrado que las TALEN se pueden utilizar para invertir el segmento cromosómico de 140 kpb en las iPSC humanas para crear líneas celulares modelo de hemofilia A que recapitulan uno de los genotipos más frecuentes de hemofilia A y para cambiar de nuevo la región invertida al estado de tipo silvestre. De manera importante, el ARNm de F8 se expresa en células diferenciadas de iPSC revertidas, es decir, con genoma corregido, pero no en células diferenciadas a partir de las iPSC modelo de hemofilia. Según el conocimiento de los presentes inventores, este informe es la primera demostración de que las nucleasas modificadas por ingeniería pueden usarse para reordenar grandes segmentos genómicos en iPSC y para aislar clones que albergan tales reordenamientos genómicos, proporcionando una demostración preliminar para corregir defectos genéticos causados por reordenamientos del genoma en iPSC.

El documento WO2014/089541 se refiere a la reparación de la mutación del factor VIII y la inducción de tolerancia. Park et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences 111.25 (2014): 9253-9258) se refiere a la inversión y reversión dirigidas del gen del factor 8 de coagulación sanguínea en células iPS humanas utilizando TALEN. Cho et al. (Genome Research 24.1 (2014): 132-141) se refiere al análisis de los efectos inespecíficos de las endonucleasas y nicasas guiadas por ARN derivado de CRISPR/Cas. Park et al. (Cell Stem Cell 17.2 (2015): 213-220) se refiere a la corrección funcional de grandes inversiones cromosómicas del gen del factor VIII en las iPSC derivadas de pacientes con hemofilia A utilizando CRISPR-Cas9.

Descripción detallada de la invención

Problema técnico

Los presentes inventores investigaron y se esforzaron por desarrollar una terapia eficaz y esencial para la hemofilia A que está causada por diversas mutaciones genéticas en el gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea. Como resultado, los presentes inventores encontraron que una inversión del gen F8 podría corregirse con éxito usando el ARN guía que se dirige a una región invertida y la endonucleasa guiada por a Rn que escinde un sitio dirigido por el ARN guía. Además, los presentes inventores encontraron que una inversión del gen F8 podría corregirse con éxito utilizando dominios TAL efectores que se dirigen a una región invertida y un par de endonucleasas que se unen a los dominios, respectivamente, para escindir un sitio génico dirigido por los dominios.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a una composición para corregir una inversión del gen del factor VIII de coagulación sanguínea y un método in vitro para corregir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea.

La presente invención también se refiere a proporcionar un método para preparar células madre pluripotentes inducidas que tienen un gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea con inversión corregida, una composición que comprende células madre pluripotentes inducidas preparadas mediante el método como principio activo para tratar la hemofilia A.

Otras finalidades y ventajas de la presente invención serán más obvios con la siguiente descripción detallada de la invención, las reivindicaciones y los dibujos.

Solución técnica

La invención proporciona una composición para corregir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo la composición:

(a) endonucleasa guiada por ARN o una secuencia de nucleótidos que codifica la endonucleasa guiada por ARN; y

(b) ARN guía que reconoce específicamente las siguientes secuencias de nucleótidos o secuencias complementarias de las mismas, o una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN guía, siendo las secuencias de nucleótidos reconocidas específicamente un par de secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1;

(ii) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:2; y

(iii) una secuencia de nucleótidos de 15 a 25 pb presente en la secuencia de nucleótidos de 562.975 pb entre (i) y (ii) en el intrón 22 del gen F8,

en donde (iii) no tiene una secuencia de nucleótidos, que tenga una homología de secuencia de al menos un 80 % con (i) o (ii) en la secuencia de nucleótidos de 562.975 pb entre (i) y (ii), y simultáneamente, de la que la secuencia de nucleótidos 5'-N(G/A)G-3' está unida cadena abajo.

La invención también proporciona un método in vitro para corregir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo el método poner en contacto células somáticas de un paciente con hemofilia A con la composición de la presente invención o transfectar las células somáticas con un sistema de suministro de genes que tiene la composición insertada en el mismo.

La invención proporciona además un método para preparar células madre pluripotentes inducidas que tienen un gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea con inversión corregida, comprendiendo el método: (a) reprogramar células somáticas aisladas de un paciente con hemofilia A para obtener células madre pluripotentes inducidas; y (b) poner en contacto las células madre pluripotentes inducidas con una composición de la invención, o transfectar las células madre pluripotentes inducidas con un sistema de suministro de genes que tiene la composición insertada en el mismo.

La invención proporciona adicionalmente una composición que comprende las células madre pluripotentes inducidas preparadas mediante un método de la invención como principio activo para tratar la hemofilia A, en donde las células madre pluripotentes inducidas tienen una inversión corregida del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea detectada por amplificación o secuenciación génica, y en donde la composición se introduce en el mismo paciente a partir del cual se originaron las células madre pluripotentes inducidas.

La invención también proporciona una composición para inducir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo la composición: (a) endonucleasa guiada por ARN o una secuencia de nucleótidos que codifica la endonucleasa guiada por ARN; y (b) ARN guía que reconoce específicamente las siguientes secuencias de nucleótidos o secuencias complementarias de las mismas, o una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN guía, siendo las secuencias de nucleótidos reconocidas específicamente un par de secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en: (i) la secuencia de nucleótidos de la s Eq ID NO:1; (ii) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:2; y (iii) una secuencia de nucleótidos de 15 a 25 pb presente en la secuencia de nucleótidos de 562.975 pb entre (i) y (ii) en el intrón 22 del gen F8, en donde (iii) no tiene una secuencia de nucleótidos, que tenga una homología de secuencia de al menos un 80 % con (i) o (ii) en la secuencia de nucleótidos de 562.975 pb entre (i) y (ii), y simultáneamente, de la que la secuencia de nucleótidos 5'-N(G/A)G-3' está unida cadena abajo.

La invención proporciona además un método in vitro para inducir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo el método introducir una composición de la invención en células somáticas aisladas de una persona que carece de dicha inversión.

Se puede guiar un sitio diana usando ARN guía que reconoce específicamente una región invertida de un homólogo del intrón 22 (int22h) del gen F8, y el sitio diana se escindido con precisión por endonucleasa guiada por ARN para escindir un sitio génico que está invertido debido a una inversión. El sitio génico escindido se somete a una nueva inversión a una frecuencia predeterminada, logrando así finalmente una corrección de la inversión.

La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 puede ser la primera secuencia de nucleótidos que aparece entre las secuencias de nucleótidos consecutivas de 20 pb presentes cadena abajo del int22h-1 del gen F8, en donde cada una de las secuencias de nucleótidos no tiene otra secuencia de nucleótidos, que tenga una homología de secuencia de al menos un 80 % en las secuencias de nucleótidos consecutivas de 20 pb y de las cuales la secuencia de nucleótidos 5'-N(G/A)G-3 'está unida directamente cadena abajo, y la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 es la segunda secuencia de nucleótidos que aparece entre las secuencias de nucleótidos consecutivas de 20 pb presentes cadena arriba del int22h-3 del gen F8, en donde cada una de las secuencias de nucleótidos no tiene otra secuencia de nucleótidos, que tenga una homología de secuencia de al menos un 80 % en las secuencias de nucleótidos consecutivas de 20 pb y de las cuales la secuencia de nucleótidos 5'-N(G/A)G-3' está directamente unida cadena arriba. Por lo tanto, cuando las dos secuencias o una secuencia de nucleótidos, que satisface las condiciones descritas anteriormente en (iii) y está presente entre estas dos secuencias, se utiliza como diana, se produce una inversión en el intrón 22 del gen F8, más específicamente, puede corregirse una inversión que se produce entre int22h-1 e int22h-3.

La endonucleasa guiada por ARN puede ser la proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9).

El ARN guía puede reconocer específicamente las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y de la SEQ ID NO: 2 o secuencias complementarias de las mismas.

La endonucleasa guiada por ARN y el ARN guía pueden usarse en formas de una proteína y ARN transcrito, y pueden suministrarse a las células diana mediante transfección con vectores en los que se cargan los ADN que codifican la endonucleasa guiada por ARN y el ARN guía, respectivamente.

También se describe en el presente documento una composición para corregir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo la composición:

(b) ARN guía que reconoce específicamente las siguiente secuencia de nucleótidos o secuencia complementaria de la misma, o una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN guía, siendo la secuencia de nucleótidos reconocida específicamente una secuencia de nucleótidos de 15 a 25 pb incluida en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia de nucleótidos de 5 a 25 pb no tiene una secuencia de nucleótidos, que tenga una homología de secuencia de al menos un 80 % en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4, y al mismo tiempo, de la cual la secuencia de nucleótidos 5'-N(G/A)G-3' está unida cadena abajo.

Si bien una inversión que se produce en el intrón 22 del gen F8 puede corregirse de acuerdo con el aspecto descrito anteriormente, una inversión que se produce en el intrón 1 del gen F8 también puede corregirse usando ARN guía dirigido a una secuencia de la SEQ ID NO: 4 en el intrón 1 del gen F8.

El ARN guía puede reconocer específicamente la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia complementaria de la misma. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 es una secuencia de nucleótidos consecutiva presente tanto en homólogo del intrón 1 (intlh-1) como en intlh-2, y puede corregirse una inversión que se produce entre intlh-1 e intlh-2 utilizando un ARN guía dirigido a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un método para preparar células madre pluripotentes inducidas que tienen un gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea con inversión corregida, comprendiendo el método:

(a) reprogramar células somáticas aisladas de un paciente con hemofilia A para obtener células madre pluripotentes inducidas; y

(b) poner en contacto las células madre pluripotentes inducidas con la composición de la presente invención, o transfectar las células madre pluripotentes inducidas con un sistema de suministro de genes que tiene la composición insertada en el mismo.

Las células madre pluripotentes inducidas obtenidas reprogramando células somáticas aisladas de un paciente con hemofilia A conservan un gen invertido característico del paciente, que puede corregirse in vitro a través del método descrito en el presente documento. Es decir, cuando el ARN guía reconoce específicamente una región invertida después de que se compruebe la región invertida, la inversión se corrige a una frecuencia predeterminada, obteniendo así células madre pluripotentes inducidas personalizadas para el paciente que tienen el mismo genotipo que una de tipo silvestre.

También se describen en el presente documento células madre pluripotentes inducidas preparadas mediante el método descrito en el presente documento.

También se describe en el presente documento una composición que comprende las células madre pluripotentes inducidas descritas en el presente documento como principio activo para tratar la hemofilia A.

Las células madre pluripotentes inducidas descritas en el presente documento pueden ser células obtenidas corrigiendo una inversión genética de un paciente con hemofilia A. Las células madre pluripotentes inducidas se diferencian en células somáticas apropiadas, que después se trasplantan al paciente para expresar el gen corregido, para que las células madre pluripotentes inducidas se puedan utilizar para una composición para terapia celular, que es útil para la hemofilia A correspondiente a una enfermedad incurable. Por lo tanto, la composición descrita en el presente documento puede inducir la diferenciación en células diana in vivo mientras se trasplantan directamente en el cuerpo, o pueden diferenciarse completamente en células diana in vitro y después introducirse en el cuerpo.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona una composición para inducir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo la composición:

(i) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1;

(ii) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:2; y

También se describe en el presente documento una composición para inducir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo la composición:

(b) ARN guía que reconoce específicamente las siguiente secuencia de nucleótidos o secuencia complementaria de la misma, o una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN guía, siendo la secuencia de nucleótidos reconocida específicamente una secuencia de nucleótidos de 15 a 25 pb incluida en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia de nucleótidos de 15 a 25 pb no tiene una secuencia de nucleótidos, que tenga una homología de secuencia de al menos un 80 % en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4, y simultáneamente, de la cual la secuencia de nucleótidos 5'-N(G/A)G-3' está unida cadena abajo.

Debido a que los elementos correspondientes ya se han descrito, se omitirán las descripciones de los mismos para evitar duplicaciones excesivas.

Cuando el método descrito en el presente documento se lleva a cabo utilizando células de paciente invertidas como material de partida, se puede inducir la reaparición de la inversión, es decir, la corrección, pero, por el contrario, se puede inducir una inversión cuando se utilizan células de una persona normal como material de partida. Por lo tanto, esta puede ser una herramienta de investigación útil para obtener de manera eficaz células de hemofilia artificiales mediante el uso de células con genotipos normales como células de partida.

También se describe en el presente documento un método para inducir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, incluyendo el método la introducción de la composición descrita en el presente documento en células somáticas de una persona normal.

Debido a que ya se han descrito las correspondientes composiciones y etapas, se omitirán las descripciones de los mismos para evitar duplicaciones excesivas.

También se describe en el presente documento una composición para corregir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo la composición un polipéptido que incluye lo siguiente o una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido

(a) un par de endonucleasas; y

(b) un par de dominios efectores (TAL) de tipo activador de la transcripción, cada uno de los cuales está unido a cada una de las endonucleasas e incluye una secuencia de aminoácidos que reconoce específicamente una región invertida del gen F8.

También se describe en el presente documento un método para corregir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, incluyendo el método poner en contacto células somáticas de un paciente con hemofilia A con la composición descrita en el presente documento o transfectar las células somáticas con un sistema de suministro de genes que tiene la composición insertada en el mismo.

Un sitio diana se puede guiar utilizando dominios TAL efectores que se unen específicamente a una región invertida del gen F8, y el sitio diana se escinde con precisión por las endonucleasas que se unen a los dominios para escindir ambas regiones terminales del gen, que se invierte debido a una inversión. El sitio génico escindido se somete a una nueva inversión a una frecuencia predeterminada, logrando así finalmente la corrección de la inversión.

Como se usa en el presente documento, la expresión "que reconoce/n específicamente" se refiere al reconocimiento selectivo de una secuencia diana mediante una interacción con la secuencia diana, y la expresión se usa con el mismo significado que la expresión "que se empareja/n específicamente". El efector TAL puede tener un dominio repetido central compuesto por 34 aminoácidos, y los restos de aminoácidos 12° y 13° pueden ser diversos aminoácidos y, por lo tanto, se denominan dipéptidos de repetición variables (RVD). Cada RVD sirve para identificar la base de un ADN particular, y para reconocerla y unirse específicamente (Nl = A, NN = G, NG = T y HD = C) (Boch J, et al. Science 326 (5959):1509-1512 (2009)). Por lo tanto, en presencia de la información de la secuencia de ADN diana, la secuencia de aminoácidos de TAL efectora que se une específicamente a la secuencia de ADN diana se puede determinar en función de estos códigos.

La inversión del gen F8, que se corrige mediante los métodos descritos en el presente documento, puede ser una inversión en el intrón 1 del gen F8; el par de dominios (TAL) efectores de tipo activador de la transcripción se unen específicamente a las secuencias de nucleótidos en las ubicaciones primera y segunda, que están incluidas en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 34, respectivamente; y las secuencias de nucleótidos en las ubicaciones primera y segunda están separadas entre sí por una longitud de 10-20 pb, mientras que tienen una longitud de 15 a 25 pb. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 34 puede ser una secuencia de nucleótidos (aproximadamente 1 kb) del homólogo 1 en el intrón 1 del gen F8. Por lo tanto, un efector TAL izquierdo y un efector TAL derecho se unen a las ubicaciones primera y segunda, respectivamente, y un par de endonucleasas unidas a los efectores TAL izquierdo y derecho escinden con precisión una región de 10 a 20 pb (espaciadora) entre la primera ubicación y la segunda ubicación.

Las secuencias de nucleótidos en las ubicaciones primera y segunda pueden ser las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31, respectivamente.

Más específicamente, la secuencia de aminoácidos que se une específicamente a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 30 puede incluir la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32.

Más específicamente, la secuencia de aminoácidos que se une específicamente a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 31 puede incluir la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33.

La endonucleasa puede ser endonucleasa Fokl.

La endonucleasa y el efector TAL pueden usarse en forma de proteína, y estos pueden suministrarse a una célula diana transfectando la célula diana con vectores que carguen a Dn que codifica las proteínas.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar células madre pluripotentes inducidas que tienen un gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea con inversión corregida, comprendiendo el método:

Las células madre pluripotentes inducidas obtenidas reprogramando células somáticas aisladas de un paciente con hemofilia A conservan un gen invertido característico del paciente, que puede corregirse in vitro a través del método descrito en el presente documento. Es decir, cuando los dominios TAL efectores reconocen específicamente una región invertida después de que se compruebe la región invertida, la inversión se corrige a una frecuencia predeterminada, obteniendo así células madre pluripotentes inducidas personalizadas para el paciente que tienen el mismo genotipo que una de tipo silvestre.

Un par de dominios TAL efectores pueden estar separados entre sí, con una región que se escindirá en el gen F8 entre ellos, por una longitud de 10-20 pb, más específicamente, de 12-16 pb, y más específicamente de 12-14 pb.

La hemofilia A puede estar causada por una inversión que se produce en el intrón 1 del gen F8, y el par de dominios (TAL) efectores de tipo activador de la transcripción incluyen secuencias de aminoácidos que se unen específicamente a las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 30 y Se Q ID NO: 31.

Se pueden preparar células madre pluripotentes inducidas en donde una inversión de la hemofilia A, que está causada por una región invertida en el intrón 1 del gen F8 de los casos de hemofilia A, se corrige, y ya se han descrito los elementos y etapas correspondientes para la misma, por lo que se omitirán las descripciones de los mismos para evitar una duplicación excesiva.

Las células madre pluripotentes inducidas pueden prepararse mediante el método descrito en el presente documento.

También se describe en el presente documento una composición que comprende las células madre pluripotentes inducidas como principio activo para tratar la hemofilia A.

Las células madre pluripotentes inducidas pueden ser células obtenidas corrigiendo una inversión genética de un paciente con hemofilia A. Las células madre pluripotentes inducidas se diferencian en células somáticas apropiadas, que después se trasplantan al paciente para expresar el gen corregido y, por lo tanto, se pueden usar para una composición para terapia celular, que es útil para la hemofilia A correspondiente a una enfermedad incurable. Por lo tanto, la composición puede inducir la diferenciación en células diana in vivo mientras se trasplantan directamente en el cuerpo, o pueden diferenciarse completamente en células diana in vitro y después introducirse en el cuerpo.

También se describe en el presente documento una composición para inducir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo la composición un polipéptido que incluye lo siguiente o una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido:

(a) un par de endonucleasas; y

(b) un dominio (TAL) efector de tipo activador de la transcripción, que está unido a una de (a) e incluye una secuencia de aminoácidos que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos en una primera ubicación en el gen F8; y

(c) un dominio (TAL) efector de tipo activador de la transcripción, que está unido a una de (a) e incluye una secuencia de aminoácidos que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos en una segunda ubicación en el gen F8, o una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio efector, en donde las ubicaciones primera y segunda están separadas entre sí por una longitud de 10-20 pb mientras que tienen una longitud de 15 a 25 pb.

Debido a que los elementos correspondientes utilizados en el presente documento ya se han descrito, se omitirán las descripciones de los mismos para evitar duplicaciones excesivas.

Cuando el método se lleva a cabo utilizando células de paciente invertidas como material de partida, la reaparición de la inversión, es decir, se puede inducir la corrección, pero, por el contrario, se puede inducir una inversión cuando se utilizan células de una persona normal como material de partida. Por lo tanto, la presente invención puede ser una herramienta de investigación útil para obtener de manera eficaz células de hemofilia artificiales mediante el uso de células con genotipos normales como células de partida.

Debido a que ya se han descrito las correspondientes composiciones y etapas utilizadas en el presente documento, se omitirán las descripciones de las mismas para evitar duplicaciones excesivas.

En lo sucesivo en el presente documento, se describirán los aspectos que se aplican comúnmente a los aspectos descritos anteriormente.

Como se usa en el presente documento, el término "nudeótido" se refiere a un desoxirribonucleótido o ribonucleótido que existe en un tipo de hebra simple o de doble hebra, e incluye análogos de nucleótidos de origen natural a menos que se especifique particularmente lo contrario (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nueva York (1980); Uhlman y Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

Como se usa en el presente documento, la expresión "que reconoce/n específicamente" se refiere al reconocimiento selectivo de una secuencia diana basándose en la complementariedad con la secuencia diana descrita en el presente documento, y la expresión se usa en el mismo significado que la expresión "que se empareja/n específicamente". El término "complementario" se refiere a ser suficientemente complementario de modo que el ARN guía pueda hibridar selectivamente con una secuencia de un ácido nucleico diana en condiciones de emparejamiento o hibridación predeterminadas, y la expresión pretende abarcar "sustancialmente complementario" y "perfectamente complementario", y significa preferentemente "perfectamente complementario". Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia sustancialmente complementaria" pretende abarcar una secuencia que es parcialmente no idéntica a la secuencia del sujeto de comparación dentro del intervalo en el que la secuencia se empareja con una secuencia particular, así como con una secuencia perfectamente idéntica.

Como se usa en el presente documento, la expresión "células madre pluripotentes inducidas" se refiere a células derivadas de células diferenciadas para tener la pluripotencialidad a través de un proceso de reprogramación artificial, y también se denomina reprogramación de células madre pluripotentes inducidas. Las células madre pluripotentes inducidas tienen casi las mismas características que las células madre embrionarias. Específicamente, las células madre pluripotentes inducidas tienen una apariencia celular, patrón de expresión de genes y proteínas similares, conservan la pluripotencia in vitro e in vivo, y permite la transmisión de genes de la línea germinal. Las células madre pluripotentes inducidas pueden abarcar la reprogramación de células madre pluripotentes inducidas originadas de todos los mamíferos, incluidos seres humanos, mono, cerdo, caballo, ganado, oveja, perro, gato, ratón y conejo, pero específicamente, las células madre pluripotentes inducidas son células madre pluripotentes inducidas derivadas de seres humanos, y lo más preferentemente, células madre pluripotentes inducidas derivadas de un paciente con hemofilia A.

Como se usa en el presente documento, la expresión "reprogramación" se refiere a un proceso epigenético de reversión en el que las células diferenciadas existentes se devuelven a un estado indiferenciado para permitir la formación de nuevos tejidos diferenciados, y también se denomina proceso de reprogramación, y está basado en la reversibilidad de los cambios epigenéticos del genoma celular. El término "reprogramación" puede abarcar todos los procesos siempre que las células diferenciadas que tienen una potencia de diferenciación del 0 % o más pero menos del 100 % se reviertan a un estado indiferenciado y puede abarcar, por ejemplo, un proceso en el que las células diferenciadas que tienen una potencia de diferenciación del 0 % sean indiferenciadas en células diferenciadas que tienen una potencia de diferenciación del 1 %.

La reprogramación se puede llevar a cabo mediante diversos métodos conocidos en la técnica y es capaz de revertir la potencia de diferenciación de las células ya diferenciadas, y, por ejemplo, la reprogramación se logró mediante la transfección de células somáticas aisladas del paciente con hemofilia A con al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en OCT4, NANOG, SOX2, LIN28, KLF4 y c-MYC.

El medio utilizado para cultivar células somáticas humanas para obtener células madre pluripotentes inducidas abarca cualquier medio habitual. Ejemplos del mismo pueden incluir el MEM de Eagle (medio esencial mínimo de Eagle, Eagle, H. Science 130:432(1959)), a-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), MEM de Iscove (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), medio 199 (Morgan et al., Proc.Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640(Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (modificación de Dulbecco del medio de Eagle, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), una mezcla de d Me M y F12 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), MB752/1 de Waymouth (Waymouth, CJ Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), 5A de McCoy (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115 (1959)) y serie MCDB (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)), pero sin limitarse a los mismos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "sistema de suministro de genes" se refiere a un medio para introducir un gen diana deseado en una célula diana para expresar el gen diana. Un sistema de suministro de genes ideal es inofensivo para el cuerpo o las células humanos y fácil de producir en masa, y debe suministrar un gen de manera eficaz.

Como se usa en el presente documento, la expresión "suministro de genes" se refiere al suministro de un gen en una célula y tiene el mismo significado que la transducción intracelular de un gen. A nivel de tejido, la expresión "suministro de genes" tiene el mismo significado que la propagación de un gen. Por lo tanto, el sistema de suministro de genes puede describirse como un sistema de transducción de genes y un sistema de propagación de genes.

Para producir el sistema de suministro de genes, la secuencia de nucleótidos está presente preferentemente en una construcción de expresión adecuada. En la construcción de expresión, la secuencia de nucleótidos está preferentemente unida operativamente a un promotor. Como se usa en el presente documento, la expresión "unido/a operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia reguladora de la expresión de un ácido nucleico (por ejemplo, un promotor, una secuencia señal o una matriz de sitios de unión a factores de regulación de la transcripción) y otra secuencia de un ácido nucleico y a través del enlace, la secuencia reguladora regula la transcripción y/o la traducción de la otra secuencia del ácido nucleico. El promotor que se une a la secuencia de polinucleótidos es uno que puede regular la transcripción del gen de la relaxina actuando en células animales, preferentemente de mamíferos, y más preferentemente en células humanas, e incluye, por ejemplo, promotores derivados de virus de mamíferos y promotores derivados de genomas de células de mamíferos. Los ejemplos de los mismos se pueden incluir el promotor de citomegalovirus (CMV), promotor tardío de adenovirus, promotor 7,5K del virus vaccinia, promotor de SV40, promotor de U6, promotor de HSV tk, promotor de RSV, promotor de EF1 alfa, promotor de metalotioneína, promotor de beta-actina, promotor del gen de IL-2 humana, promotor del gen de IFN humana, promotor del gen de IL-4 humana, promotor del gen de linfotoxina humana y promotor del gen de GM-CSF humano, pero sin limitarse a los mismos. Lo más preferentemente, el promotor utilizado es el promotor de CMV y/o el promotor U6.

El sistema de suministro de genes puede construirse de diversas formas, y el sistema de suministro de genes puede construirse en forma de: (i) molécula de ADN recombinante desnudo, (ii) plásmido, (iii) vector vírico, y (iv) liposoma o niosoma que incluye la molécula de ADN recombinante desnudo o el plásmido.

La secuencia de nucleótidos se puede aplicar a todos los sistemas de suministro de genes usados en la transfección animal habitual y se puede aplicar preferentemente a plásmidos, adenovirus (Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res.

3:2075-2080(1997)), virus adenoasociados (AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), retrovirus (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), lentivirus (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), virus del herpes simple (Chamber R., et al., Proc. Natl. Act. Sci USA92:1411-1415(1995)), virus vaccinia (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657 (1999)), liposomas (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) o niosomas. De forma más específica, el sistema de suministro de genes puede ser un plásmido.

Cuando el sistema de suministro de genes se construye basándose en un vector vírico, la etapa de contacto se lleva a cabo mediante un método de infección vírica conocido en la técnica. La infección de las células hospedadoras utilizando vectores víricos se describe en los documentos citados anteriormente.

Cuando el sistema de suministro de genes es una molécula de ADN recombinante desnudo o un plásmido, se puede introducir un gen puede en una célula mediante microinyección (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); y Harland & Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), precipitación con fosfato de calcio (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); y Chen & Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), electroporación (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); y Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), transfección mediada por liposomas (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau y Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); y Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), tratamiento con DEAE-dextrano (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)) y bombardeo génico (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)), y más específicamente, se puede utilizar electroporación.

La hemofilia A que se va a tratar puede ser hemofilia A grave. Como se usa en el presente documento, la expresión "hemofilia A grave" significa un caso en el que la actividad del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea es inferior al 1 % en comparación con una persona normal.

Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere a: (a) suprimir el desarrollo de la enfermedad, trastorno o síntoma; (b) reducir la enfermedad, trastorno o síntoma; o (c) eliminar la enfermedad, trastorno o síntoma. La composición puede servir para suprimir, eliminar o reducir el desarrollo de síntomas que se han causado debido a inversiones génicas expresando el gen que se corrige en un sujeto con hemofilia A y es el mismo que el de un tipo silvestre. Por lo tanto, la composición per se puede ser una composición para tratar la hemofilia A, y puede aplicarse como adyuvante del tratamiento para la enfermedad administrándose junto con otro ingrediente farmacéutico. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, la expresión "tratamiento" (o "terapia") o "agente de tratamiento" (o "agente terapéutico") incluye el significado de "ayuda del tratamiento" (o "ayuda de la terapia") o "adyuvante del tratamiento" (o "adyuvante terapéutico").

Como se usa en el presente documento, el término "administración" o "administrar" puede referirse a la aplicación directa de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición a un sujeto, para formar así la misma cantidad de la misma en el cuerpo del sujeto. Por lo tanto, el término "administrar" abarca una inyección o trasplante de células madre pluripotentes inducidas o células adultas obtenidas a partir de la redistribución de células madre pluripotentes inducidas y, por tanto, el término "administrar" se usa con el mismo significado que "inyectar" o "trasplantar".

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" de la composición se refiere al contenido de un extracto, que es suficiente para proporcionar un efecto terapéutico o profiláctico a un sujeto a administrar y, por tanto, la expresión tiene un significado que incluye "cantidad profilácticamente eficaz". Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye, pero sin limitación, ser humano, ratón, rata, cobaya, perro, gato, caballo, vaca, cerdo, mono, chimpancé, babuino o mono rhesus. Específicamente, el sujeto puede ser un ser humano.

En los casos en que la composición se puede preparar en una composición farmacéutica, y la composición farmacéutica puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable que se encuentra en la composición farmacéutica puede ser uno que se usa convencionalmente en la formulación, y ejemplos del mismo pueden incluir, pero sin limitación, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato cálcico, alginato, gelatina, silicato cálcico, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio, aceite mineral, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y medios.

La composición farmacéutica puede contener adicionalmente, además de los ingredientes anteriores, un lubricante, un agente humectante, un agente edulcorante, un agente aromatizante, un emulsionante, un agente de suspensión, un conservante y similares. Los vehículos y agentes farmacéuticamente aceptables adecuados se describen con más detalle en Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995).

La composición farmacéutica se puede administrar por vía parenteral y específicamente, a través de administración intravascular.

Una dosis adecuada de la composición farmacéutica puede variar dependiendo de diversos factores, tales como un método de formulación, manera de administración, edad, peso corporal, género, morbilidad de un paciente, dieta, tiempo de administración, vía de administración, tasa de excreción y sensibilidad de respuesta. La dosis general de la composición farmacéutica puede ser de 102-1010 células por día basándose en un adulto.

La composición farmacéutica se puede formular en forma de dosificación unitaria o se puede preparar en un recipiente multidosis utilizando un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptables de acuerdo con el método que puede realizar fácilmente una persona que tiene habilidad habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. En este caso, la forma de dosificación puede ser una solución en un medio aceitoso o acuoso, una suspensión, un jarabe o una emulsión, un extracto, una pulverización, un polvo, un gránulo, un comprimido o una cápsula y puede incluir adicionalmente un dispersante o un estabilizante.

Efectos ventajosos

Las características y ventajas de la presente divulgación pueden resumirse de la siguiente manera:

(a) Un método para inducir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea normal, un método para corregir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea invertido, y células madre pluripotentes inducidas derivadas de un paciente con hemofilia A con inversión corregida preparadas utilizando los mismos.

(b) El método puede utilizarse favorablemente como herramienta de investigación para la investigación de la patogenia de la hemofilia A y la exploración de agentes terapéuticos mediante la reproducción eficaz de las inversiones del intrón 1 y del intrón 22 del gen F8.

(c) Las células madre pluripotentes inducidas con inversión corregida preparadas por el método pueden permitir una terapia eficaz y esencial para la hemofilia A mediante la reversión del genotipo mutado al mismo estado que en uno de tipo silvestre, no mediante un método restrictivo a través del suministro de genes o proteínas normales.

Breve descripción de los dibujos

Las FIG. 1a a 1f son vistas que muestran los resultados de la corrección del gen F8 parcialmente invertido en las iPSC derivadas de pacientes con hemofilia A. La FIG. 1a muestra resultados en los que se aisló ADN genómico de fibroblastos dérmicos humanos (TS) y células de orina derivadas de pacientes con hemofilia A (Pa1, Pa2 y Pa3) y se sometió a análisis por PCR utilizando cebadores apropiados (Bagnall et al., 2006) para detectar inversiones del intrón 1 (izquierda) o 22 (derecha). La FIG. 1b es una vista esquemática que muestra la inversión y reversión del intrón 22. Se representan tres regiones homólogas como int22h-1, int22h-2 y int22h-3, respectivamente. Las puntas de flecha azules indican cebadores de PCR. Los sitios diana de nucleasas cerca de int22h-1 o int22h-3 están indicados por símbolos claros negros (RGEN 02) o rojos (RGEN 03). La FIG. 1c muestra resultados en los que las mutaciones en los sitios diana de nucleasas en células HeLa se confirmaron mediante el ensayo T7E1. La FIG. 1d muestra los productos de PCR correspondientes a la inversión del segmento cromosómico de 563 kpb en células HeLa. La FIG. 1e muestra los resultados del análisis por PCR para confirmar la corrección de la inversión en los clones de las iPSC. La FIG. 1f muestra secuencias de ADN de uniones de puntos de rotura en los clones de iPSC con inversión corregida. Cada secuencia diana de RGEN está subrayada; la secuencia de PAM se muestra en verde; y los guiones indican bases delecionadas. Las letras minúsculas indican bases insertadas y las flechas azules indican sitios de escisión.

Las FIG. 2a a 2e son vistas que muestran los resultados de la caracterización de clones de iPSC con inversión corregida. La FIG. 2a muestra resultados de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para detectar ARNm de OCT4, SOX2, LIN28 y NANOG endógeno a partir de líneas celulares precursoras y corregidas. El nivel de expresión de cada gen se normalizó mediante GAPDH. La FIG. 2b muestra la diferenciación in vitro de líneas con inversión corregida. Las expresiones de las proteínas marcadoras correspondientes representan la diferenciación en el ectodermo (nestina), mesodermo [a-actina del músculo liso [a-SMA]) y endodermo (a-fetoproteína [AFP]). Barra de escala, 50 mm. La FIG. 2c muestra resultados en los que la expresión de OCT4 y SSEA4, marcadores específicos de ESC humanas, se detectó mediante inmunocitoquímica. Barra de escala, 100 mm. Los cariotipos de las líneas de iPSC se muestran juntos. La FIG. 2d es una vista que muestra la expresión del gen F8 en células diferenciadas de líneas de iPSC con inversión corregida del intrón 1 y 22. Se utilizó RT-PCR (superior) y qPCR (inferior) para detectar la expresión de F8 y un gen marcador de mesodermo (Brachyury) en células derivadas de iPSC de tipo silvestre (TS), iPSC de pacientes (Pa1, Pa2 y Pa3) y Pa1-(Co-1 y Co-2) o Pa2-iPSCs (Co-1, Co-2 y Co-3) con inversión corregida. La expresión de GAPDH se utilizó como control de carga. La FIG. 2e muestra cromatogramas que ilustran el corte y empalme correcto entre los exones 1 y 2 o los exones 22 y 23 en líneas de iPSC con inversión corregida.

Las FIG. 3a a 3f son vistas que muestran la corrección de la inversión del intrón 1 en las iPSC derivadas de pacientes con hemofilia A. La FIG. 3a es un diagrama esquemático que muestra un proceso en el que se corrige la inversión del intrón 1 que se encuentra en un paciente con hemofilia A grave. Las puntas de flecha azules indican cebadores de PCR. La FIG. 3b muestra los resultados en la frecuencia de mutación de los sitios diana de RGEN 01 en el intrón 1 del gen F8 en las células HeLa. La FIG. 3c es una vista que muestra productos de PCR correspondientes al genotipo de inversión de células HeLa. La FIG. 3d es un diagrama que muestra las secuencias de ADN de dos homólogos del intrón 1 (denominados homólogos 1 y 2 de int1) y de las uniones de los puntos de rotura. Se aisló el ADN del genoma de las células HeLa transfectadas con plásmidos que codifican RGEN y se separaron las bandas de PCR específicas de inversión, y a continuación se secuenciaron dos uniones de puntos de rotura. Las secuencias diana de RGEN están subrayadas; las secuencias de PAM se muestran en verde; y los guiones indican bases delecionadas. Las letras minúsculas indican bases insertadas. La FIG. 3e muestra los resultados del análisis de PCR de ADN del genoma de cuatro clones corregidos (Co-1 a Co-4). Se aisló ADN genómico de células derivadas de orina de un paciente con inversión del intrón 1 (Pa1-U) y de iPSC de tipo silvestre (TS), que es un control positivo para el genotipo de inversión o normal. La FIG. 3f muestra las secuencias de ADN de dos homólogos del intrón 1 (denominados homólogos 1 y 2 de int1) y de las uniones de los puntos de rotura. Se aisló ADN genómico de iPSC transfectadas con un plásmido que codifica RGEN. Se separaron las bandas de PCR específicas de reversión y se secuenciaron dos uniones de puntos de rotura. Las secuencias diana de RGEN están subrayadas; las secuencias de PAM se muestran en verde; y los guiones indican bases delecionadas. Las FIG. 4a a 4c muestran inversión y reversión dirigidas en células HeLa o iPCS de pacientes. La FIG. 4a muestra secuencias de ADN de dos uniones de puntos de rotura para la inversión en células HeLa. Las secuencias diana de RGEN están subrayadas; las secuencias de PAM se muestran en verde; y los guiones indican bases delecionadas. Las letras minúsculas indican bases insertadas y las flechas azules indican sitios de escisión. Las FIG. 4b y 4c muestra secuencias de ADN de uniones de puntos de rotura en las regiones del intrón 1 (4b) y del intrón 22 (4c), respectivamente. Se suministró RNP de RGEN directamente a las células con el intrón 1 (Pa1-iPSC) o con el intrón 22 (Pa3-iPSC) invertidos mediante electroporación. El ADN total se aisló de las iPSC y a continuación se secuenció. Las secuencias diana de RGEN están subrayadas; las secuencias de PAM se muestran en verde; y los guiones indican bases delecionadas. Las letras minúsculas indican bases insertadas y las dos flechas azules indican sitios de escisión. El número detectado se indica mediante el número entre paréntesis cuando se detecta la secuencia al menos una.

Las FIG. 5a a 5 g muestran la generación de clones de iPSC a partir de HDF utilizando vectores de reprogramación episómicos. (5a) Morfología de las iPSC humanas expandidas (clon Epi3). (Barra de escala, 200 mm.) (5b) Tinción con fosfatasa alcalina de iPSC (clon Epi3). (Barra de escala, 500 mm.) (5c) Detección de una secuencia de vector episómico (EBNA-1) que permaneció en líneas iPSC establecidas (Epi1-Epi8). El gen de GAPDH se utilizó como control de calidad para el ADN total aislado. El ADN total aislado de las células antes (sin tratamiento previo) y después (día 6) de la electroporación se utilizó como controles negativo y positivo para el ADN del vector episómico. También se analizó como control negativo una línea de iPSC de tipo silvestre derivada de retrovirus (iPSC1). (5d) La expresión de OCT4 y SSEA-4, que son marcadores específicos de ESC humanas, se detectó mediante inmunocitoquímica. Las señales DAPI indican la presencia celular total en la imagen. (Barras de escala, 100 mm.) ^{(5e) Análisis de RT-PCR para determinar los niveles transcripcionales de OCT4,} SOx2, ^{LIN28, NANOG y GAPDH}utilizando cebadores específicos de genes (enumerados en la tabla S3). Los niveles de ARNm se midieron en HDF, línea de ES humanas (H9), una línea de iPSC de tipo silvestre (TS-iPSCEpi3) y clones de inversión (Inv 1 e ^{Inv 2) derivados de la línea TS-iPSCEpi3 (1, HDFs; 2,} h9; ^{3, TS-iPSC; 4, Inv 1; 5, Inv 2). (5f) La cuantificación de}los ARNm de OCT4, SOX2 y LIN28 en las líneas celulares indicadas según se determina por qPCR y normalizados a la expresión de GAPDH. (5 g) Expresión de proteínas marcadoras que representan el ectodermo (Nestina), mesodermo (a-actina del músculo liso; a-SMA) y endodermo (a-fetoproteína; AFP). (Barras de escala, 50 mm.) Las FIG. 6a a 6b muestran la inversión mediada por TALEN del gen F8 en células HEK 293T. (6a) Mecanismo propuesto de inversión cromosómica que se encuentra en pacientes con hemofilia A grave. Las inversiones de segmentos cromosómicos de 140 kpb que abarcan el gen F8 se asocian con dos regiones homólogas orientadas en direcciones opuestas: el homólogo 1 ubicado en el intrón1 del gen F8 y el homólogo 2 ubicado en la región cadena arriba de 140 kpb. Los triángulos de colores muestran los sitios diana de TALEN y las flechas indican los cebadores diseñados para detectar inversiones de 140 kpb. (6b) Resultados del ensayo con T7E1 de los 11 pares de TALEN que diseñaron los presentes inventores. Las posiciones predichas de las bandas de ADN escindidas por T7E1 se indican mediante asteriscos. Las FIG. 7a a 7b muestran la inversión mediada por TALEN del locus F8 en iPSC. (7a) Análisis por PCR del ADN genómico de cuatro clones de inversión. Las muestras de ADN genómico aisladas de células de pacientes con hemofilia A (Pa) o de iPSC de tipo silvestre (TS) sirvieron como controles positivos para los genotipos de inversión o normal, respectivamente. (7b) Secuencias de ADN de uniones de puntos de rotura en clones de inversión. Los sitios de unión a TALEN se muestran en rojo (homólogo 1) o azul (homólogo 2).

Las FIG. 8a a 8c muestran reversiones de la inversión del gen F8. (8a) El análisis por PCR es de ADN genómico de tres clones revertidos. Los ADN genómicos aislados de células de pacientes con hemofilia A (Pa) o de iPSC de tipo silvestre (TS) sirvieron como controles positivos para los genotipos de inversión o normal, respectivamente. (8b) Secuencias de ADN de uniones de puntos de rotura en clones revertidos. Los sitios de unión a TALEN se muestran en rojo (unión 1) o azul (unión 2). Los guiones indican bases eliminadas. (8c) Los cromatogramas muestran las secuencias (del homólogo 1 y 2, respectivamente) entre dos sitios de unión a TALEN en los clones revertidos (clones 1 y 3).

Las FIG. 9a a 9b muestran la caracterización de clones invertidos y revertidos. (9a) Expresión del gen F8 en células derivadas de clones invertidos y revertidos. Se utilizó RT-PCR para detectar la expresión de F8 y de genes marcadores del endodermo (FOXA2 y Sox17) en células derivadas de iPSC de tipo silvestre (TS), de clones de inversión (Inv 1 y 2) y de clones revertidos (Rev 1, 2 y 3). GAPDH sirvió como control de carga. (9b) Expresión de la proteína F8 en células endoteliales diferenciadas a partir de clones invertidos y revertidos. Las células diferenciadas se fijaron y tiñeron con los anticuerpos indicados. Las señales DAPI indican la presencia celular total en la imagen. FVIII, proteína F8; vWF, factor de von Willebrand (una proteína marcadora endotelial madura). (Barras de escala, 100 mm.)

Las FIG. 10a a 10c muestran la caracterización de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) humanas generadas por vectores de reprogramación episómicos. (10a) Se realizaron análisis de cariotipo en cromosomas ^{de líneas TS-iPSC en los pases 10 (Epi3) y 12 (Epi8). (10b) La expresión de Nanog y} TrA-1-60, ^{que son}marcadores de superficie específicos de células madre embrionarias humanas (ESC, por sus siglas en inglés), se detectó mediante inmunocitoquímica. Las señales DAPI indican la presencia celular total en la imagen. (Barras de escala, 100 mm.) (10c) La expresión de proteínas marcadoras que representan ectodermo (Pax6), mesodermo (Brachyury) y endodermo [factor nuclear de hepatocitos 3-p (HNF3p)]. (Barras de escala, 50 mm.)

Las FIG. 11a a 11b muestran frecuencias de inversiones dirigidas. (A) La frecuencia de inversiones dirigidas se estimó mediante PCR digital. Las muestras de ADN genómico aisladas de células transfectadas con plásmidos que codifican nucleasas basadas en efectores similares al activador de la transcripción (TALEN) se diluyeron en serie y se sometieron a análisis por PCR digital. (11b) Frecuencias estimadas de inversiones cromosómicas dirigidas creadas a través de nucleasas con dedos de zinc (ZFN) o TALEN. Z10 es un par ZFN que se dirige al homólogo del intrón1 del gen F8. La frecuencia de los eventos de inversión de 140 kpb se midió mediante análisis con PCR digital. Los límites superior e inferior indican intervalos de confianza del 95 %.

La figura 12 muestra el análisis de los efectos inespecíficos de TALEN. Se realizaron búsquedas in silico en posibles sitios inespecíficos de TALEN diseñados para este estudio. Los tres posibles sitios inespecíficos más similares al sitio diana de TALEN se seleccionaron y se sometieron al análisis con T7E1 para confirmar las actividades de escisión inespecífica en estos sitios.

La FIG. 13 muestra la expresión de marcadores de ES humanas a partir de clones invertidos y revertidos. Los niveles de ARNm de Oct4, Sox2 y Lin28 de la línea de iPSC de tipo silvestre (TS-iPSCEpi3), el clon de inversión (Inv 1) y los clones revertidos (Rev 1, 2 y 3) se cuantificaron mediante PCR cuantitativa (qPCR). Los niveles de ARNm de GAPDH se utilizaron para la normalización.

La FIG 14 muestra la diferenciación in vitro de clones invertidos y revertidos. La expresión de proteínas marcadoras que representan el ectodermo (plll-tubulina), mesodermo [a-actina de músculo liso (a-SMA) y Brachyury], y endodermo [a-fetoproteína (AFP) y HNF3p] en el clon 1 de inversión (superior) y el clon 1 revertido (inferior). (Barras de escala, 50 mm.)

Modo para llevar a cabo la invención

En lo sucesivo en el presente documento, se describirá la presente invención en detalle con referencia a ejemplos. Estos ejemplos son solo para ilustrar la presente invención de manera más específica, y será evidente para los expertos en la materia que el alcance de la presente invención no está limitado por estos ejemplos.

Ejemplo 1: Nucleasa modificada por ingeniaría guiada por ARN (RGEN)

Métodos

Los análisis de las iPSC derivadas de orina de pacientes con hemofilia A se realizaron con la aprobación de la Yonsei University Institutional Review Board (IRB n.° 4-2012-0028). Todos los voluntarios firmaron formularios de consentimiento informado por escrito antes de donar muestras de orina para la generación de iPSC humanas.

Cultivo y transfección celular

Se cultivaron células HeLa (ATCC, CCL-2) en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DEME) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, aminoácidos no esenciales 0,1 mM y antibióticos al 1 %. Para inducir DSB, se transfectaron conjuntamente 1 X 105 células HeLa con el plásmido que codifica Cas9 y el plásmido que codifica ARNgp (0,5 mg cada uno) usando un reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las líneas de ESC humanas (hESC) (H9) obtenidas de WiCell Inc, las iPSC de tipo silvestre derivadas de fibroblastos dérmicos humanos (línea TS-iPSC Epi3) (Park et al., 2014), y las iPSC derivadas de orina se mantuvieron junto con 4 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, PeproTech) en medio hESC [medio DMEM/F12 complementado con reemplazo de suero desactivado al 20 % (Gibco), aminoácidos no esenciales al 1 % y 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Sigma)]. Para inducir reversiones en las iPSC derivadas de la orina, se sometieron a electroporación 1 X 106 células con 5 mg de plásmido que codifica Cas9 y 5 mg de plásmido que codifica ARNgp (5 mg de cada plásmido ARNgp para la inversión del intrón 22) usando un sistema de microporador (Neon; Invitrogen).

Para el suministro directo de proteína Cas9 en las iPSC derivadas de la orina, La transfección se realizó mediante el método indicado anteriormente (Kim et al., 2014) con ligeras modificaciones. La proteína Cas9 (15 mg) se mezcló con 20 mg de ARNgp transcrito (20 mg de cada plásmido de ARNgp para la inversión del intrón 22) y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente para formar ribonucleoproteínas (RNP) de RGEN. Las RNP se transfectaron en 2 X105 iPSC usando un sistema de microporador.

Aislamiento y expansión de células derivadas de orina de pacientes con hemofilia A grave

Se recogieron muestras de orina de 11 pacientes diagnosticados con hemofilia A grave, y este diagnóstico se había confirmado clínicamente por la Korea Hemophilia Foundation Clinic. Las células derivadas de la orina se aislaron mediante el método indicado anteriormente (Zhou et al., 2012). En resumen, las células se recogieron de aproximadamente 100 ml de muestra de orina del chorro medio mediante centrifugación a 400 g durante 10 min. Después de lavar dos veces con PBS, las células se cultivaron en medio DMEM/ F12 de Ham (1:1) (Hyclone) complementado con FBS al 10% (vol/vol), medio de crecimiento de células epiteliales renales (REGM, obtenido del kit SingleQuot (Lonza)) y antibióticos al 1%. Después de cuatro días de cultivo en estas condiciones, las células se cultivaron en REGM (Lonza) para expandir las células. Las células se dividieron en placas de cultivo recubiertas de gelatina con una confluencia del 80-90 %. Para confirmar el genotipo de F8, las muestras de ADN genómico aisladas de células de pacientes derivadas de orina se sometieron a análisis por PCR con conjuntos de cebadores que reconocen las regiones apropiadas cerca de las inversiones del intrón 1 y 22 del locus de F8 (Bagnall et al., 2006; Park et al., 2014.

Composición de RGEN

Los plásmidos que codifican Cas9 se construyeron mediante el método indicado anteriormente (Cho et al., 2013). La proteína Cas9 fusionada con el epítopo HA y se expresó una señal de localización nuclear (NLS, por sus siglas en inglés) bajo el promotor de CMV. El promotor U6 se utilizó en la expresión del ARNgp (Cho et al., 2014). La proteína Cas9 recombinante purificada se adquirió de ToolGen, Inc. Se transcribió el ARN guía in vitro utilizando el kit MEGAshortscript T7 (Ambion) mediante el método indicado anteriormente (Kim et al., 2014). El ARN transcrito se purificó mediante extracción con fenol:cloroformo y se cuantificó utilizando un espectrómetro.

Ensayo con T7E1 y determinación de frecuencias de inversión dirigida

El ensayo con T7E1 se realizó de acuerdo con el método indicado anteriormente (Kim et al., 2009). En resumen, los amplicones de PCR que incluían los sitios diana de RGEN se desnaturalizaron mediante calentamiento y se emparejaron para formar fragmentos de ADN de doble hebra híbrido. A continuación, los fragmentos se trataron con endonucleasa T7 (New England Biolabs) durante 20 min a 37 °C para permitir el corte en sitios desapareados y los productos se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Las frecuencias de las correcciones dirigidas en el locus de F8 se estimaron mediante análisis por PCR digital mediante el método indicado anteriormente (Kim et al., 2010). El ADN genómico aislado de las células se transfectó conjuntamente con RGEN y los plásmidos de ARNgp utilizando el reactivo de transfección lipofectamine 2000 (Invitrogen), se diluyó en serie y las muestras diluidas se sometieron a análisis por PCR. Se determinó la fracción de bandas positivas en cada punto de dilución y los resultados se analizaron utilizando el programa Extreme Limiting Dilution Analysis (Hu y Smyth, 2009).

Validación de la inversión mediada por RGEN del locus de F8 en células HeLa

Para validar las actividades de edición del genoma de los RGEN, cada RGEN se transfectó conjuntamente con un plásmido de expresión de ARNgp en células HeLa. La actividad de RGEN se midió usando el ensayo con T7E1 como se describe anteriormente.

Corrección dirigida, mediada por RGEN del locus de F8 en iPSC derivadas de pacientes

Las iPSC se cultivaron en una capa de soporte de células STO y se recogieron tratándolas con colagenasa de tipo IV. Después de lavar con PBS, las células se disociaron en células sueltas mediante el método indicado anteriormente (Desbordes et al., 2008). Estas células sueltas se mezclaron con plásmidos de RGEN y ARNgp y se pulsaron con un voltaje de 850 durante 30 ms. A continuación, las células se sembraron sobre células de soporte y se dejaron crecer durante 10 días. Para detectar la inversión genómica que se produce en el locus de F8, se lisaron células de colonias individuales y se sometieron a PCR, y se analizaron los productos de PCR. Los cebadores utilizados son los siguientes: 1-D1: 5-AAATCACCCAAG GAAGCACA-3', 1-I1: 5-TGGCATTAACGTATTACTTGGAGA- 3'; 1-D2: 5' -TGCTGAGCT AGCAGGTTT AATG-3', 1-I2: 5' - TGCTGAGCTAGCAGGTTTAATG-3'; 22-D1: 5'TGGGGCTGTGTAAATTTGCT-3', 22-I2: 5'-CAAACGTAGCATTACCTGATTGT-3'; 22-D2: 5' - ACAACCAGAGCA-GAAATCAATGA-3', 22-I2: 5' - TTTCACCACATCCACGCCAA-3'.

Establecimiento y caracterización de poblaciones de células clónales

Para aislar poblaciones clónales de células corregidas, cada colonia que se había identificado por PCR con las modificaciones genómicas deseadas (concretamente, la corrección del genotipo de inversión) se disoció en células sueltas y se volvió a sembrar en una nueva capa de soporte celular. Después de 4 rondas de pasaje, se eligieron diversos clones (4 clones para la corrección del intrón 1, 3 clones para la corrección del intrón 22) para la secuenciación y experimentos adicionales. Para el análisis de secuencia en los puntos de rotura, los productos de PCR amplificados se sometieron a electroforesis y se eluyeron del gel de agarosa.

Aislamiento, RT-PCR y qPCR del ARN

Los ARN totales se purificaron usando reactivo TRIzol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ADNc se sintetizaron a partir de ARN totales (1 mg) utilizando el kit de síntesis de ADNc DiaStarTM (SolGent, Corea). Para confirmar la expresión de Factor VIII, Brachyury, y GAPDH, la PCR se realizó con Ex-Taq (Takara) utilizando los ADNc sintetizados como plantilla. Para la qPCR, se utilizó SYBRPremix Ex-Taq (Takara) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para amplificar el ARNm de F8 a partir de las líneas con el intrón 1 o intrón 22 corregidos, respectivamente, se usó un cebador directo ubicado en el exón 1 (o exón 21 para las líneas con el intrón 22 corregido) junto con un cebador inverso ubicado en el exón 3 (o exón 23 para las líneas con el intrón 22 corregido). Se realizó RT-PCR o qPCR utilizando los siguientes conjuntos de cebadores: GAPDH-D: 5'-CCCCTCAAGGGCATCCTGGGCTA-3', GAPDH-I: 5'-GAGGTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'; OCT4-D: 5'-CCTCACTTCACTGCACTGTA-3', OCT4-I: 5'-CAGGTTTTCTTTCCCTAGCT-3';LIN28-F: 5'-AGCCATATGGTAGCCTCATGTCCGC-3', LIN28-I: 5'- TCAATTCTGTGCCTCCGGGAGCAGGGTAGG-3'; SOX2-D: 5'-TTCACATGTCCCAGCACTACCAGA-3', SOX2-I: 5'- TCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGC-3'; NANOG-D: 5'-TGAACCTCAGCTACAAACAG-3', NANOG-I: 5'-TGGTGGTAGGAAGAGTAAAG-3'; F8-exón1-D: 5'-CTGCTTTAGTGCCACCAGAAGA-3', F8-exón3-I: 5'-GACTGACAGGATGGGAAGCC-3'; F8-exón21-D: 5'-CCGGATCAATCAATGCCTGGAG-3', F8-exón23-I: 5'-ATGAGTTGGGTGCAAACGGATG-3'; Brachyury-D: 5'-ATCACAAAGAGATGATGGAGGAA-3', Brachyury-I: 5'-GGTGAGTTGTCAGAATAGGTTGG-3 ').

Generación y diferenciación in vitro de iPSC derivadas de orina

Después de tres o menos pasajes, las iPSC se generaron a partir de células derivadas de orina. Se utilizaron vectores de reprogramación episómicos o virus Sendai (Invitrogen) para preparar iPSC utilizando células derivadas de orina de acuerdo con el método indicado anteriormente (Okita et al., 2011). Siete colonias de iPSC que parecían similares a las células ES humanas se recogieron mediante un dispositivo mecánico y se cultivaron posteriormente para su caracterización. Las iPSC se diferenciaron en tres capas germinales in vitro mediante un método conocido (Sugii et al., 2010). Las colonias de iPSC se disociaron parcialmente a través de colagenasa de tipo IV (Invitrogen) para inducir la formación de cuerpos embrioides (EB, por sus siglas en inglés). Los EB se transfirieron a placas de Petri (SPL Lifesciences, Corea) y se cultivaron durante 10 días en medio hESC que carecía de bFGF, pero complementado con FBS al 5 %. La diferenciación espontánea de los EB en células que representan las tres capas germinales se detectó mediante inmunotinción usando anticuerpos apropiados. Para inducir la diferenciación de las iPSC en el linaje del mesodermo, se utilizó el método indicado anteriormente con ligeras modificaciones (Yoo et al., 2013). Resumiendo, los EB se transfirieron a placas de Petri y se cultivaron en medio hESC que carecía de bFGF, pero complementado con 20 ng/ml de proteína morfogénica ósea 4 (BMP4, R&D Systems) y 10 ng/ml de activina A (PeproTech). El día 3, los EB se sembraron en placas recubiertas con Matrigel y se cultivaron durante 3 días más en el medio descrito anteriormente. El día 6, las células que se habían diferenciado en el linaje del mesodermo se recogieron para verificar la expresión del gen F8.

Caracterización de iPSC

La actividad fosfatasa alcalina se determinó usando un kit de tinción de fosfatasa alcalina de leucocitos (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para confirmar que las líneas de iPSC se generaron a partir de células derivadas de orina, se analizaron repeticiones cortas en tándem (STR, por sus siglas en inglés). Los locus de STR se amplificaron a partir de muestras de ADN genómico aisladas de líneas de iPSC y sus células precursoras utilizando el sistema de reacción de PCR AmpFISTR (Applied Biosystems). El análisis de las STR basado en PCR se realizó en Human Pass Inc. (Corea). Para el análisis de cariotipo, se realizó análisis de bandas G de los cromosomas de cada línea de iPSC en GenDix Inc. (Corea). La inmunotinción de los marcadores de células ES se llevó a cabo mediante el método indicado anteriormente (Park et al., 2014). Se utilizó DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, Vector Laboratories) para la visualización de núcleos, y las imágenes se capturaron y analizaron utilizando un microscopio Olympus IX71 o un sistema FSX.

Secuenciación profunda dirigida

Los segmentos de ADN genómico que abarcan los sitios diana de nucleasas se amplificaron usando polimerasa Phusion (New England Biolabs). Se sometió una cantidad igual de amplicones de PCR a secuenciación de lectura de extremos emparejados utilizando lllumina MiSeq. Se consideró que I alrededor del sitio de escisión de RGEN (PAMen3bp corriente arriba) eran mutaciones inducidas por RGEN.

Secuenciación del genoma completo

El ADN genómico se purificó mediante el kit DNeasy Tissue (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN genómico (1 mg) se fragmentó usando un sistema Covaris y se generaron extremos romos End Repair Mix. El ADN fragmentado se unió con adaptadores para preparar bibliotecas. Las bibliotecas se sometieron a secuenciación utilizando el secuenciador llluminaHiSeq X Ten en Macrogen (Corea).

Secuenciación del genoma completo y extracción de información de variantes

Los archivos FASTQ obtenidos del secuenciador IlluminaHiSeq X Ten se analizaron a través de un flujo de trabajo Isaac de lllumina, Inc (EE. UU.). En resumen, los archivos FASTQ leídos por extremos emparejados se alinearon usando, de acuerdo con la referencia del genoma (hg19), el software Isaac Genome Alignment (Isaac Aligner). Posteriormente, Isaac Variant Caller identificó polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés) e indels. Entre millones de variantes, los presentes inventores se centraron en indels porque los RGEN rara vez inducen sustituciones. Los filtros bioinformáticos se aplicaron para excluir los indels registrados en la base de datos pública y los indels extraídos de otros genomas. A continuación, los sitios diana de RGEN se compararon con locus de tipo silvestre correspondientes a las ubicaciones de los indels. 31-106 sitios con indel incluían la secuencia 5'-N(G/A)G-3'PAM y mostraban al menos 12 coincidencias de nucleótidos con las correspondientes secuencias específicas. Finalmente, la secuenciación profunda dirigida se realizó en 10 sitios con indel después de descartar los sitios con secuencia repetida.

Examen de posibles sitios inespecíficos

Para examinar si había indels inducidos por nucleasas en muchos posibles sitios inespecíficos en cada secuencia del genoma, se ustilizó Cas-OFFinder se utilizó para identificar todos los posibles sitios inespecíficos que diferían de los sitios específicos hasta en 8 nucleótidos o que diferían hasta en 2 nucleótidos con una protuberancia de ADN o ARN de 5 bases de longitud (Bae et al., 2014). Se utilizó un programa informático interno para hacer una cadena CIGAR consenso que constituían el 20 % de las cadenas CIGAR totales en cada posible sitio inespecífico. A continuación, se compararon las cadenas CIGAR consenso de muchos posibles sitios inespecíficos con las cadenas CIGAR de la secuencia de referencia. Como resultado, se obtuvieron de 83 a 348 posibles sitios inespecíficos. Finalmente, la secuenciación profunda dirigida se realizó en 4 sitios indel que se observaron en los clones independientes y no tenían secuencias repetidas alrededor de los sitios diana.

Resultados

En primer lugar, los presentes inventores analizaron los genotipos de 11 pacientes con hemofilia A grave no relacionados e identificaron un paciente con la inversión int1 y dos pacientes con la inversión int22. Por lo tanto, se eligió un paciente con la inversión int1 (denominado "Pa1") y dos pacientes con la inversión int22 (denominados "Pa2" y "Pa3") para llevar a cabo los experimentos (FIG. 1a). Las iPSC correspondientes se establecieron mediante la introducción de cuatro factores de Yamanaka en las células epiteliales urinarias a través de un vector episómico o virus Sendai, obteniendo así fibroblastos de estos pacientes con trastorno hemorrágico para evitar una biopsia invasiva. Simultáneamente, se examinó si los RGEN, que consistían en la proteína Cas9 y el ARN guía pequeño (ARNgp), tienen actividad para inducir o revertir sus inversiones en células HeLa de tipo silvestre e iPSC de pacientes. RGEN 01 se diseñó para dirigirse a un sitio en int1h (FIG. 3a). RGEN 01 fue muy activo, induciendo pequeñas inserciones y deleciones (indels) a una frecuencia del 34 % en el sitio diana en int1h (FIG. 3b). Además, RGEN 01 indujo la inversión del segmento cromosómico de 140 kpb en las células HeLa, como se muestra por PCR específica de inversión (FIG. 3c). La frecuencia de la inversión osciló entre el 2,2 % y el 3,1 %, medida por PCR digital (Kim et al., 2010; Lee et al., 2010).

Los presentes inventores, como resultado del análisis de las secuencias de ADN de los amplicones de PCR específicos de inversión, encontraron que los indels se indujeron en las dos uniones del punto de rotura de inversión (FIG. 3d). Basándose en la alta frecuencia, los presentes inventores transfectaron conjuntamente plásmidos que codifican la proteína Cas9 y el ARNgp en iPSC derivadas de Pa1 (Pa1-iPSCs) y analizaron colonias de iPSC usando PCR. Ocho colonias (no necesariamente derivadas de células sueltas, 6,7 %) de las 120 colonias produjeron bandas de PCR positivas en un gel de agarosa.

Se cultivaron cuatro colonias adicionalmente para obtener clones derivados de células sueltas. Estos clones produjeron amplicones de PCR correspondientes a las regiones intlh-1 e intlh-2, lo que indica que el segmento cromosómico invertido de 140 kpb en las células Pa1 se revirtió (FIG. 3e).

Por el contrario, no se produjeron amplicones de PCR a partir de iPSC de Pa1 o células urinarias. Los presentes inventores observaron que no se indujeron indels en el sitio diana en tres clones secuenciando los amplicones de PCR. En el otro clon, hubo una deleción de 13 pb en el sitio diana (FIG. 3d).

Después, los presentes inventores también se centraron en la otra inversión de int22h. Para excluir la posibilidad de que las deleciones o inversiones no deseadas que implican a dos o tres homólogos de int22, en lugar de la reversión deseada del segmento invertido de 600 kbp, se utilizaron dos RGEN que se dirigen a sitios fuera de los homólogos (FIG. 1b). Esta estrategia también facilita la detección de la reversión utilizando cebadores de PCR apropiados. Los presentes inventores diseñaron dos RGEN (RGEN 02 y RGEN 03) para dirigirse a sitios cercanos a int22h-1 e int22h-3, y probaron su actividad nucleasa en células HeLa mediante el ensayo con endonucleasa I T7 (T7E1). Estos RGEN fueron muy activos, induciendo indels en cada sitio diana con una frecuencia del 44 % o 32 % (FIG. 1c). A continuación, la inversión del segmento cromosómico de 563 kpb entre los dos sitios diana se detectó mediante PCR. La transfección de RGEN 02 o RGEN 03 solo en células HeLa no produjo amplicones de PCR específicos de inversión. Por el contrario, la transfección conjunta de estos plásmidos RGEN dio lugar a dos amplicones de PCR específicos de inversión (FIG.

1d). La frecuencia de inversión estaba en el intervalo de 1,5 % a 2,2 % (Tabla 1).

T l 11

Como resultado de la determinación de las secuencias de ADN de los amplicones de PCR, se observó que la mayoría de indels acompañaban las dos uniones de puntos de rotura de la inversión, lo que indica que se repararon dos DSB inducidas por los dos RGEN por unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés) propensa a errores (FIG. 4a). Las células HeLa son de tipo silvestre con respecto a la orientación del exón de F8. En células Pa2 y Pa3, los exones de 1 a 22 de F8 están invertidos. Pero aun así, se conservan los dos sitios diana de RGEN, permitiendo la reversión del segmento cromosómico grande.

A continuación, se transfectaron RGEN 02 y 03 en Pa2iPSC mediante electroporación, y se aislaron 135 colonias y se sometieron a análisis por PCR para determinar el ADN genómico de las mismas. Cinco colonias (3,7 %) produjeron amplicones de PCR correspondientes a corrección de inversión (es decir, reversión). Dichos productos de PCR no se obtuvieron en iPSC de Pa2 o iPSC de tipo silvestre. Estas colonias se expandieron adicionalmente para permitir el aislamiento de tres clones independientes derivados de células sueltas. Para confirmar si el segmento cromosómico de 563 kpb entre los dos sitios RGEN se revirtió, se examinaron las secuencias de ADN en las dos uniones de punto de rotura de inversión (FIG. 1f). Como resultado, como en las células HeLa, se observaron indels, que corresponden a la característica de NHEJ propensa a errores, en las dos uniones de punto de rotura en estas iPSC con inversión corregida.

Los presentes inventores investigaron si las iPSC con inversión corregida conservaban la pluripotencia. En primer lugar, como resultado de la investigación de la expresión de marcadores de células madre en las iPSC de Pa1 (inversión intlh) y Pa2 (inversión int22h) con inversión corregida, se encontró que OCT4, SOX2, LIN28 y NANOG, se transcribieron de forma activa (FIG. 2a). Además, estas iPSC con inversión corregida se diferenciaron con éxito en tres capas germinales primarias (FIG. 2b) y, además, mostraron un cariotipo normal (FIG. 2c). Considerados en conjunto, puede observarse que las reversiones cromosómicas macroscópicas inducidas por RGEN no afectan negativamente a la pluripotencia de las iPSC derivadas de pacientes.

Las células endoteliales derivadas del mesodermo son una fuente importante de expresión del gen F8 (Shahani et al., 2010). Los presentes inventores diferenciaron las iPSC de paciente y las iPSC de paciente con inversión corregida en mesodermo, y después midieron los niveles de ARNm de F8 usando RT-PCR. Como cabía esperar, no se detectaron bandas de p Cr correspondientes a los exones 1 y 2 de F8 en células diferenciadas a partir de Pa1-iPSC, lo que indica que F8 no se expresó en células derivadas de pacientes (FIG. 2d). Por el contrario, Se detectaron bandas de PCR correspondientes a estos exones en células diferenciadas de las iPSC de tipo silvestre o las dos Pa1-iPSC con inversión corregida (Co-1 y Co-2). Del mismo modo, los amplicones de PCR correspondientes a los exones 22 y 23 de F8 no se detectaron en células diferenciadas a partir de las iPSC de Pa2 y Pa3, pero se detectaron en células diferenciadas a partir de las tres iPSC con inversión corregida (FIG. 2d).

Se confirmó mediante secuenciación Sanger que los exones 1 y 2 o los exones 22 y 23 se cortaron y empalmaron correctamente en células diferenciadas a partir de las iPSC con inversión corregida (FIG. 2e). Estos resultados demuestran que el gen F8 se corrigió en las iPSC de pacientes que tenían inversiones del intrón 1 y 22.

Para evitar inserciones no deseadas de fragmentos de plásmido en sitios de RGEN específicos e inespecíficos, la proteína Cas9 recombinante purificada después de la expresión en E. coli y el ARNgp (ribonucleoproteínas de RGEN, o RNP) transcrito in vitro se transdujeron en iPSC de dos pacientes (Pa1 y Pa3) teniendo cada uno una inversión del intrón 1 o 22.

Se utilizaron PCR y secuenciación Sanger para confirmar la reversión de los segmentos cromosómicos de 140 kpb o 563 kbp que restauran las funciones genéticas del gen F8 (Figuras 4b y 4c). Debido a que las RNP, a diferencia de los plásmidos, escinden el ADN diana cromosómico inmediatamente después de la transducción y se degradan rápidamente en las células (Kim et al., 2014), los efectos inespecíficos pueden reducirse sin sacrificar la actividad de corrección del genoma en los sitios específicos mediante la transducción de RNP de RGEN.

Los RGEN pueden inducir mutaciones inespecíficas, que son homólogas en secuencia con los sitios específicos (Cho et al., 2014; Cradick et al., 2013; Fu et al., 2013; Hsu et al., 2013; y Pattanayak et al., 2013). Los presentes inventores investigaron si los RGEN usados dejaron algún daño secundario además de las correcciones de inversión en las iPSC de los pacientes usando secuenciación profunda dirigida y secuenciación del genoma completo (WGS, por sus siglas en inglés). En primer lugar, los presentes inventores buscaron posibles sitios inespecíficos que difirieran de los tres sitios específicos de RGEN hasta en tres nucleótidos en el genoma humano usando Cas-OFFinder, un programa basado en la web accesible en (www.rgenome.net, Bae et al. 2014). Se encontraron un total de 12, 6 y 14 sitios en RGEN 01, RGEN 02 y RGEN 03, respectivamente. Para confirmar que las indels no se indujeron en estos sitios en las iPSC con inversión corregida se utilizó secuenciación profunda dirigida (FIG. 2).

T l 21

A continuación, el ADN genómico aislado de las iPSC de pacientes (Pa1 y Pa2) y las correspondientes iPSC con inversión corregida se sometieron a WGS. En primer lugar, se utilizó Isaac, que es un programa de extracción de información de variantes, para identificar indels en relación con el genoma de referencia de hg 19. Los filtros bioinformáticos se utilizaron para excluir las indels registradas en la base de datos pública, las indels extraídas de genomas de pacientes que tienen la inversión de int1h o int22h y los otros genomas con inversión corregida, y las indels que se producen en el homopolímero o secuencias repetidas debido a errores de secuenciación. Como resultado, se obtuvieron de 9.848 a 13.707 indels que eran exclusivas en cada secuencia del genoma con inversión corregida. A continuación, los sitios diana de RGEN se compararon con locus de tipo silvestre correspondientes a las ubicaciones de los indels. Solo de 31 a 106 sitios indel tenían la secuencia 5'-N (G/A)G-3'PAM, y mostraban al menos 12 coincidencias de nucleótidos con las correspondientes secuencias específicas (tabla 2). Posteriormente, se investigaron las secuencias de ADN correspondientes a estas indels en los dos genomas con inversión corregida. Ninguna de las indels se validó mediante secuenciación profunda dirigida. Después, todos los posibles sitios inespecíficos que diferían de los sitios específicos hasta en ocho nucleótidos o que diferían hasta en dos nucleótidos con una protuberancia de ADN o ARN de cinco nucleótidos se identificaron a través del Cas-OFFinder. Posteriormente, como resultado de comparar las lecturas de secuencia alineadas alrededor de 10 de las miles derivadas a partir de posibles sitios inespecíficos con la secuencia de referencia (tabla 2), no se identificaron indels inespecíficas. Estos resultados muestran que los tres RGEN utilizados no indujeron mutaciones inespecíficas en las iPSC de pacientes con inversión corregida. En resumen, los presentes inventores utilizaron RGEN para reparar dos inversiones cromosómicas grandes, recurrentes que proporcionan casi la mitad de todos los casos de hemofilia A grave en iPSC derivadas de pacientes y, por lo tanto, se observó que las células diferenciadas a partir de las iPSC con inversión corregida expresaban los genes F8. Se confirmó mediante secuenciación profunda dirigida y análisis por WGS que las mutaciones inespecíficas no se indujeron en las iPSC con inversión corregida. Esta es la primera demostración de que los grandes reordenamientos genómicos, tales como la inversión cromosómica, puede corregirse usando RGEN u otras tijeras génicas en iPSC de pacientes. Las inversiones cromosómicas están asociadas con otras enfermedades genéticas, tal como el síndrome de Hunter (Bondeson et al., 1995) y el cáncer (Nikiforova et al., 2000). Los reordenamientos genómicos dirigidos que utilizan RGEN en iPSC permiten que las variaciones genómicas estructurales puedan utilizarse favorablemente para que las unidades estudien sus funciones y para la terapia génica y celular de la hemofilia A y otras enfermedades genéticas causadas por grandes reordenamientos cromosómicos.

Ejemplo 2. TALEN (nucleasas basadas en efectores similares al activador de la transcripción)

Métodos

Plásmidos que codifican TALEN

Los plásmidos de TALEN de este estudio se sintetizaron mediante el uso de plásmidos de matriz de efectores TAL construidos para el ensamblaje Golden-Gate de una etapa como se describe (Kim Y, et al. (2013), A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nat Biotechnol 31(3):251-258). Cada plásmido de TALEN codifica los 135 aminoácidos aminoterminales de AvrBs3, una serie de módulos RVD, una de las cuatro medias repeticiones de RVD, y el dominio Sharkey Fokl (Guo J, Gaj T, Barbas CF, 3a (2010) Directed evolution of an enhanced and highly efficient Fokl cleavage domain for zinc finger nucleases. J Mol Biol 400 (1):96-107). Los sitios de TALEN se diseñaron para dirigirse al homólogo del intrón 1 del gen F8; los posibles sitios inespecíficos se identificaron como se describe (Kim Y, et al. (2013) A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nat Biotechnol 31(3):251-258).

Aislamiento de ADN genómico de un paciente con hemofilia A

Se obtuvo la aprobación de la Seoul National University Institutional Review Board para el análisis de células sanguíneas de un paciente con hemofilia A. La muestra de sangre fue proporcionada por la Hemophilia Foundation Clinic de Corea y el ADN genómico se aisló como se describe (Lee HJ, Kweon J, Kim E, Kim S, Kim JS (2012) Targeted chromosomal duplications and inversions in the human genome using zinc finger nucleases. Genome Res 22(3): 539 548).

Medición de las frecuencias de las inversiones dirigidas. Las frecuencias de las inversiones dirigidas se estimaron mediante análisis con PCR digital como se describe (Kim S,

Lee HJ, Kim E, Kim JS (2010) Analysis of targeted chromosomal deletions induced by zinc finger nucleases. Cold Spring Harb Protoc 10.1101/pdb.prot5477). Las muestras de ADN genómico aisladas de células transfectadas con plásmidos de TALEN se diluyeron en serie, y las muestras diluidas se sometieron a PCR anidada utilizando cebadores apropiados (tabla 3). Se contó la fracción de bandas positivas en cada punto de dilución y los resultados se analizaron utilizando el programa Extreme Limiting Dilution Analysis (Hu Y, Smyth GK (2009) ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods 347(1-2):70-78).

T l 1

continuación

Cultivos celulares

Se cultivaron HEK 293T/17 (ATCC; CRL-11268) y HDF de adultos (Invitrogen; C-004-5C) en DMEM complementado con FBS (10 % vol/vol) y antibióticos (1 %). Las líneas de ESC humanas (hESC) (H9) obtenidas de WiCell, las iPSC de tipo silvestre derivadas de retrovirus (iPSC1) y las iPSC generadas en el presente estudio se mantuvieron en medio hESC compuesto de medio DMEM/F12 complementado con reemplazo de suero desactivado al 20 % (vol./vol.) (Invitrogen), 4,5 g/l de L-glutamina, aminoácidos no esenciales al 1 %, 2-mercaptoetanol 0,1 mM y 4 ng/ml de FGF básico (PeproTech) como se describe (Kim DS, et al. (2010) Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev 6(2):270-281).

Validación de TALEN dirigidas al locus de F8 en células HEK 293T

Para validar las actividades de edición del genoma de las TALEN diseñadas para el presente estudio, cada par de TALEN se transfectó en células HEK 293T, y sus actividades se midieron utilizando el ensayo con T7E1 (Kim HJ, Lee HJ, Kim H, Cho SW, Kim JS (2009) Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res 19(7): 1279-1288). Para medir la frecuencia de inversiones dirigidas inducidas por TALEN que se dirigen al locus de F8, las células HEK 293T/17 se sembraron al 80 % de confluencia antes de la transfección y se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) con plásmidos que codifican TALEN. Se aislaron muestras de ADN genómico y se sometieron a análisis por PCR para confirmar la inversión cromosómica como se describe (Kim S, Lee HJ, Kim E, Kim JS (2010) Analysis of targeted chromosomal deletions induced by zinc finger nucleases. Cold Spring Harb Protoc 10.1101/pdb.prot5477).

Generación de iPSC y diferenciación in vitro en tres capas germinales

Se utilizaron vectores episómicos que codifican factores de reprogramación definidos como se indica (Okita K, et al. (2011) A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods 8(5):409-412). En resumen, los HDF cultivados en DMEM complementado con FBS al 10 % se sometieron a electroporación usando un sistema de microporador (Neon; Invitrogen) con mezclas de vectores episómicos (3 mg en total) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de pulsarse tres veces con un voltaje de 1650 durante 10 ms, las células se cultivaron adicionalmente en DMEm (que contenía FBS al 10 %). Siete días después de la transfección, las células se transfirieron a una capa alimentadora.

Las colonias de iPSC que parecían similares a las hESC se recogieron mecánicamente y se cultivaron adicionalmente para su caracterización. La diferenciación in vitro de las iPSC en tres capas germinales se indujo como se describe (Sugii S, et al. (2010) Human and mouse adipose-derived cells support feederindependent induction of pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 107(8): 3558-3563). Los cuerpos embrioides (EB), formados por la disociación parcial de iPSC utilizando colagenasa de tipo IV (Invitrogen), se transfirieron a placas de adherencia ultrabaja (Corning) y se cultivaron en medio DMEM/F12 (1:1) complementado con suero desactivado al 20 % (Invitrogen), 4,5 g/l de L-glutamina, aminoácidos no esenciales al 1 %, 2-mercaptoetanol 0,1 mM y FBS al 5 %. Después de una semana de cultivo en estas condiciones, los EB se unieron a placas de cultivo recubiertas con Matrigel y se cultivaron adicionalmente durante 10 d. La diferenciación espontánea de los EB en células que representan los tres linajes de la capa germinal se detectó mediante inmunotinción con los anticuerpos apropiados.

Diferenciación de iPSC

Para inducir la diferenciación de iPSC en el linaje del endodermo, se utilizó un método descrito (Si-Tayeb K, et al. (2010) Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology 51(1):297-305). En resumen, las colonias de iPSC se cultivaron en medio de crecimiento de hESC mTeSR-1 (StemCell Technology) para cultivo sin alimentador. Se incubaron iPSC indiferenciadas para obtener células endodérmicas definitivas en RPMI/B27 (RPMI-1640 de Sigma; suplemento B27 de Invitrogen) complementado con 100 ng/ml de Activina A (PeproTech) e inhibidor de fosfatidilinositol 3-cinasa 5 mM (LY-294002; Sigma) durante 5 d. Las células que se habían diferenciado en endodermo se recogieron para el aislamiento de los ARN totales, que se utilizaron como plantilla para la síntesis de ADNc.

Para inducir la diferenciación de iPSC en las células endoteliales, se utilizó un método descrito (Yoo CH, et al. (2013) Endothelial progenitor cells from human dental pulp-derived iPS cells as a therapeutic target for ischemic vascular diseases. Biomaterials 34(33):8149-8160) con ligeras modificaciones. En resumen, los EB se cultivaron en medio de hESC complementado con 20 ng/ml de proteína morfogénica ósea 4 (R&D Systems) y 10 ng/ml de Activina A (PeproTech). En el día 3 de formación de los EB, los EB se adhirieron a placas recubiertas con Matrigel y se indujeron a diferenciarse en células endoteliales durante hasta 10 días en medio complementado con 100 ng/ml de VEGF (PeproTech) y 50 ng/ml de FGF básico (R&D Systems).

Transfecciones de TALEN para inducir inversión y reversión en iPSC

Las iPSC cultivadas se recogieron mediante tratamiento con colagenasa de tipo IV. Después de lavar con PBS, las células se trataron adicionalmente con Accutase (Invitrogen) para crear suspensiones de células sueltas como se describe (Desbordes SC, et al. (2008) High-throughput screening assay for the identification of compounds regulating self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 2(6):602-612). Estas células sueltas se mezclaron con 10 mg de plásmidos que codifican TALEN (5 mg de cada plásmido) y se pulsaron con un voltaje de 850 durante 30 ms. A continuación, las células se sembraron en células alimentadoras y se dejaron crecer durante 10 d. Para detectar eventos de inversión o reversión genómica, se lisaron células de colonias individuales en 20 ml de tampón de lisis [tampón 13 Esta (pH 8,0) que contiene proteinasa K] a 56 °C durante 3 h. Después de la inactivación de proteinasa K, se sometieron 2 ml de solución de ADN genómico a PCR usando ADN polimerasa Ex-taq (Takara) y cebadores específicos. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Las secuencias de cebadores de GADPH se muestran en la tabla 5.

Aislamiento de poblaciones clonales de células, análisis por PCR y secuenciación de ADN de puntos de rotura

Para aislar poblaciones clonales de células invertidas (o revertidas), cada colonia que se había identificado por PCR que contenía el evento genómico deseado se disoció en células sueltas usando colagenasa y Accutase como se describió anteriormente y se volvió a sembrar. Después de tres rondas de pases, se eligieron diversos clones (seis clones para inversión, cuatro clones para reversión) para secuenciación y experimentos adicionales. Para determinación de secuencias, los productos de PCR amplificados se sometieron a electroforesis, se eluyeron del gel de agarosa utilizando un kit de extracción en gel (SolGent) y se clonaron en el vector pGEM-T (Promega). Los productos de PCR clonados se secuenciaron utilizando cebadores T7.

Aislamiento de ARN, RT-PCR y qPCR

Los ARN totales se purificaron a partir de células utilizando reactivo TRIzol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ADNc se sintetizaron a partir de ARN totales (1 mg) utilizando el kit de síntesis de ADNc DiaStarTM (SolGent). Para confirmar la expresión del Factor VIII, FOXA2, Sox17 y GAPDH, la PCR se realizó con Ex-Taq (Takara) utilizando los ADNc sintetizados como plantilla. Para la qPCR, se utilizó SYBR Premix Ex-Taq (Takara) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de cebadores específicos utilizadas para RT-PCR o qPCR se muestran en la tabla 5.

Tinción e inmunotinción de fosfatasa alcalina

La actividad fosfatasa alcalina se midió con el kit de tinción de fosfatasa alcalina de leucocitos (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la inmunotinción de marcadores de células madre pluripotentes, las células se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4 % y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 %. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con una solución de PBS que contenía suero de cabra normal al 5 % y BSA al 2 %. A continuación, las células se incubaron con anticuerpos primarios durante 2 h a temperatura ambiente, se lavaron con PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia (Alexa Fluor 488 o 594; Invitrogen) después durante 1 h a temperatura ambiente. Las células se montaron con un medio de montaje antidecoloración que contenía DAPI (Vector Laboratories) para visualización de núcleos. Las imágenes se capturaron y analizaron utilizando un microscopio Olympus IX71 o un sistema FSX.

Análisis de huella de ADN y cariotipo

Para confirmar el origen de los fibroblastos dérmicos de las líneas de iPSC, el análisis de repeticiones cortas en tándem (STR) basado en PCR se llevó a cabo en el Gene-Analysis Institute of Human Pass Inc. En resumen, los locus de STR se amplificaron a partir de muestras de ADN genómico aisladas de líneas de iPSC y sus células precursoras utilizando el sistema de PCR AmpFISTR (Applied Biosystems). Los productos amplificados se analizaron utilizando un analizador genético ABI PRISM 3130XL y Genemapper (Versión 3.2; Applied Biosystems). Para el análisis de cariotipo, los cromosomas se tiñeron con Giemsa para el análisis de bandas G y se analizaron mediante el Sistema de procesamiento de imágenes cromosómicas en GenDix.

Análisis estadístico. Los datos se presentan como las medias ± EEM

Se utilizó la prueba t de Student para el análisis estadístico. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Generación y caracterización de iPSC humanas

Se derivaron iPSC de tipo silvestre a partir de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) utilizando vectores episómicos que codifican los cuatro factores de Yamanaka, que los presentes inventores introdujeron en las células por electroporación. Las colonias similares a células madre embrionarias (ESC) aparecieron 10 días después de volver a sembrar en placas las células transfectadas en una capa de células alimentadoras. Se seleccionó un total de ocho colonias (denominadas Epi1-Epi8) que mostraban actividades fosfatasa alcalina (Fig. 5a y 5b). Para confirmar la ausencia de vectores episómicos en estos clones después de siete u ocho pases, se utilizó PCR con cebadores específicos para la secuencia EBNA-1, que está codificada en los vectores. Solo un clon (Epi1) contenía la secuencia EBNA-1; este clon se excluyó de análisis adicionales (Fig. 5c). A continuación, se comprobaron los cariotipos de dos líneas de iPSC (Epi3 y Epi8). Como se muestra en la Fig. 10a, tenían un cariotipo normal. También se confirmó que estas líneas de iPSC derivaban de HDF precursores usando análisis de huellas de ADN (tabla 4). Después de estas caracterizaciones iniciales, se eligió la línea Epi3 para experimentos adicionales.

T l 41

continuación

Esta línea de iPSC expresó las proteínas marcadoras de ESC habituales tal como OCT4, NANOG, SSEA-4 y TRA-1-60 (Fig. 5d y Fig. 10b). Los análisis de RT-PCR y PCR cuantitativa (qPCR) mostraron que los genes marcadores pluripotentes se expresaban a niveles más altos en esta línea de iPSC que en la línea de ESC humanas H9 (Fig. 5e y 5f). A continuación, se determinó el potencial de diferenciación de la línea Epi3 de iPSC. Los cuerpos embrionarios derivaron y se adhirieron a placas de cultivo recubiertas con gelatina para la diferenciación espontánea en tres capas germinales in vitro. Como cabía esperar, las proteínas marcadoras de los linajes de ectodermo (Nestina y Pax6), mesodermo [a-actina del músculo liso (a-SMA) y Brachyury] y endodermo [a-fetoproteína (AFP) y factor nuclear de hepatocitos 3-p (HNF3p)] se expresaron en las células diferenciadas (Fig. 5 g y Fig. 10c). Estos datos indican que la línea Epi3 derivada de HDF de adultos es pluripotente.

Inversión dirigida del locus de F8 en iPSC mediante un par TALEN

Las variaciones estructurales (SV, por sus siglas en inglés), tales como las inversiones, están asociadas con enfermedades genéticas, incluida la hemofilia A (Feuk L, Carson AR, Scherer SW (2006) Structural variation in the human genome. Nat Rev Genet 7(2):85-97). Casi la mitad de todos los casos de hemofilia A grave están causados por dos tipos de inversiones diferentes que alteran la integridad del gen F8 ligado al cromosoma X. Estas inversiones son el resultado de la HR no alélica (NAHR) que implica secuencias presentes en el intrón 1 (1-4 % de los casos de hemofilia A grave) o intrón 22 (hasta el 50 % de los casos de hemofilia A grave) y sus correspondientes secuencias homólogas ubicadas mucho más cadena arriba del gen F8 (denominadas inversión del intrón 1 o 22, respectivamente) (Lakich D, Kazazian HH, Jr., Antonarakis SE, Gitschier J (1993) Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A. Nat Genet 5(3):236-241). En este estudio, los inventores se centraron en la inversión del intrón 1 y construyeron 11 pares de TALEN que se dirigen al homólogo del intrón 1 (Fig. 6a). Las actividades de edición del genoma de estas TALEN se probaron en células HEK 293T utilizando ensayos de endonucleasa I de T7 (T7E1) (Kim HJ, Lee HJ, Kim H, Cho SW, Kim JS (2009) Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res 19(7): 1279-1288) (Fig. 6b). Se eligió el par de TALEN más activo (denominado TALEN 01) que indujo mutaciones con una frecuencia del 33 % en el sitio diana. De manera importante, esta TALEN indujo la inversión de 140 kb que implica al homólogo del intrón 1 en las células HEK 293T a una frecuencia del 1,9 % (Fig. 11). A continuación, se probó si esta TALEN tenía efectos inespecíficos en sitios altamente homólogos. No se detectaron mutaciones inespecíficas en estos sitios usando ensayos con T7E1 (Fig. 12 y tabla 5).

T l

Después, los inventores utilizaron el mismo par de TALEN para inducir la inversión de 140 kb en las iPSC y para crear una línea celular modelo de hemofilia. Las iPSC de tipo silvestre se sometieron a electroporación con los plásmidos de TALEN y se cultivaron durante 10 d para formar colonias. Las muestras de ADN genómico aisladas de cada colonia se sometieron a PCR utilizando conjuntos de cebadores específicos que detectan el evento de inversión. Seis colonias de 432 (1,4 %, comparable a la de las células HEK 293) mostraron bandas de PCR positivas para las dos uniones de punto de rotura de inversión. Después se cultivaron cuatro colonias adicionalmente para obtener clones de células sueltas. Estos clones produjeron bandas de PCR que son diagnósticas de la inversión de 140 kb pero, de manera importante, no produjeron bandas de PCR que correspondan al genotipo de tipo silvestre (Fig. 7a). A continuación, se clonaron estos productos de PCR y se determinaron sus secuencias de ADN para confirmar el genotipo de inversión. No se encontraron indels en los sitios diana de TALEN (Fig. 7b). Este resultado sugiere que una sola DSB que se indujo por la TALEN en el homólogo 1 o en el homólogo 2 del intrón 1 desencadenó la inversión del ADN a través de NAHR sin errores. Sin embargo, no se puede descartar la posibilidad de que la TALEN produjera dos DSB concurrentes, una en el homólogo 1 y la otra en el homólogo 2 del intrón, y que estas DSB se unieran sin empalmes por NHEJ sin dejar mutaciones secundarias.

Reversión dirigida del segmento invertido en el sistema de iPSC

En el estudio anterior de los presentes inventores, se indujo la inversión cromosómica dirigida que implica al homólogo del intrón 1 en la línea celular HEK 293 usando un par z Fn y clones heterocigotos aislados que albergan la inversión (Lee HJ, Kweon J, Kim E, Kim S, Kim JS (2012) Targeted chromosomal duplications and inversions in the human genome using zinc finger nucleases. Genome Res 22(3): 539-548). Sin embargo, Las células HEK 293 no expresan el gen F8 y no pueden usarse en terapia celular. Asimismo, las células HEK 293 portan tres copias del cromosoma X. Estas limitaciones obstaculizaron los esfuerzos de los presentes inventores por revertir la región invertida de nuevo a la orientación normal para restaurar la expresión del gen F8, una demostración necesaria para aplicaciones terapéuticas.

En la presente solicitud, se investigó si el segmento invertido de 140 kpb en la línea de iPSC del modelo de hemofilia podría corregirse mediante la reversión utilizando el mismo par de TALEN. (Téngase en cuenta que el sitio de TALEN permanece intacto en la línea celular modelo). Los plásmidos de TALEN se transfectaron en dos clones de iPSC que contenían la inversión (denominados en el presente documento "clones de inversión"), y después las muestras de ADN genómico aisladas de varias colonias se sometieron a PCR para identificar las células revertidas. Se obtuvieron dos clones revertidos de cada uno de los clones de iPSC después de explorar un total de 300 colonias. Por lo tanto, la frecuencia de reversión fue del 1,3 % (4 de 300), a la par con la frecuencia de inversión. El análisis de PCR reveló que el genotipo de estos clones revertidos era coherente con una reversión al tipo silvestre: No se detectaron bandas de PCR específicas de inversión en las muestras de estos clones (Fig. 8a). Después, se clonaron y secuenciaron estos productos de PCR que contenían el homólogo 1 o 2. Dos clones no tenían mutaciones adicionales, pero los otros dos clones tenían deleciones de 2 pb en los dos sitios de TALEN en ambos homólogos 1 y 2 (Fig. 8b). Estos resultados muestran que el genotipo de inversión que se encuentra en la hemofilia A grave puede corregirse utilizando el mismo par de TALEN que se utilizó para generar el modelo de enfermedad.

Además, se investigó si tanto los clones de inversión como los clones revertidos seguían siendo pluripotentes comprobando su expresión de genes marcadores de ES humanas y su capacidad para diferenciarse en las tres capas germinales primarias. Estos clones expresaron genes marcadores de células madre a niveles comparables con los de las iPSC de tipo silvestre (Fig. 5f) y se diferenciaron en tres capas germinalesin vitro (Fig. 14). Estos resultados muestran que la modificación por ingeniería del genoma mediada por TALEN no afecta negativamente a la pluripotencia de las iPSC. Expresión del gen F8 en células diferenciadas a partir de las iPSC revertidas. El gen F8 se expresa en hepatocitos y células endoteliales (Zelechowska MG, van Mourik JA, Brodniewicz-Proba T (1985) Ultrastructural localization of factor VIII procoagulant antigen in human liver hepatocytes. Nature 317(6039):729-730; Hollestelle MJ, et al. (2001) Tissue distribution of factor VIII gene expression in vivo; Shahani T, et al. (2010) Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood 115(23):4902-4909), que derivan del endodermo y mesodermo, respectivamente. En primer lugar, se examinó si el gen F8 podría expresarse en células endodérmicas derivadas de los clones de iPSC de tipo silvestre y revertidas. Se diferenciaron las iPSC en el endodermo y se realizó un análisis de RT-PCR para detectar el ARNm de F8. Como cabía esperar, el ARNm de F8 se detectó en células diferenciadas de los clones de iPSC de tipo silvestre y revertidas (Fig. 9a). Por el contrario, no se detectó ARNm de F8 en células derivadas de las iPSC con la inversión, aunque estas células podrían diferenciarse en endodermo tan eficazmente como las iPSC de tipo silvestre y revertidas. A continuación, se examinó la expresión de la proteína F8 en células endoteliales, que son la principal fuente de producción de la proteína F8 (Shahani T, et al. (2010) Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood 115(23):4902-4909). Se diferenciaron las iPSC en células endoteliales y se realizó inmunotinción para detectar la proteína F8. Como cabía esperar, las células diferenciadas de clones de iPSC de tipo silvestre y revertidas expresaron la proteína F8 (Fig. 9b). Sin embargo, la proteína F8 no se detectó en las células diferenciadas del clon de inversión, aunque este clon de iPSC se diferenció con éxito en células endoteliales como lo demuestra la expresión del factor von Willebrand, una proteína marcadora de células endoteliales maduras. Estos resultados demuestran que la integridad del gen F8 se restaura en las iPSC revertidas, que apoya la expresión del gen F8 en células endodérmicas y en células endoteliales derivadas del mesodermo.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation Yonsei University Institute for Basic Science

<120> Endonucleasa para dirigirse al factor 8 de coagulación sanguínea y composición para tratar la hemofilia que comprende la misma

<130> PP160001

<150> KR10-2015-0001392

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> F8-exón3-I

<400> 25

gactgacagg atgggaagcc 20

<210> 26

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> F8-exón21-D

<400> 26

ccggatcaat caatgcctgg ag 22

<210> 27

<211> 22

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> F8-exón23-I

<400> 27

atgagttggg tgcaaacgga tg 22

<210> 28

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Brachyury-D

<400> 28

atcacaaaga gatgatggag gaa 23

<210> 29

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Brachyury-I

<400> 29

ggtgagttgt cagaataggt tgg 23

<210> 30

<211> 20

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 30

taaagtataa tgaaaactgt 20

<210> 31

<211> 20

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 31

gagagactgg ccaatctata 20

<210> 32

<211>650

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> efector TAL izquierdo

<400> 32

Leu Asn Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly 1 5 10 15

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

20 25 30

Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn

35 40 45

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

50 55 60

Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr

Asp Gln Val Val Ala lie Ala 65 70 75 80 Ser Asn lie Gly Gly Lys Gln Ala

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 85 90 95

Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Thr Pro Ala Gln Val Val Ala

100 105 110

lie Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

115 120 125

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val 130 135 140

Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 145 150 155 160 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 165 170 175

Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

180 185 190

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

195 200 205

Pro Glu Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala 210 215 220

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 225 230 235 240 Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys 245 250 255

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp

260 265 270

His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn Asn Gly

275 280 285

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 290 295 300

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala lie Ala Ser His 305 310 315 320 Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 325 330 335 Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala lie Ala

340 345 350

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

355 360 365

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala 370 375 380

lie Ala Ser Asn lie Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 385 390 395 400 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val 405 410 415

Val Ala lie Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

420 425 430

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala

435 440 445

Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 450 455 460

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 465 470 475 480 Pro Asp Gln Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala 485 490 495

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly

500 505 510

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

515 520 525

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 530 535 540

His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly 545 550 555 560 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 565 570 575

Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn

580 585 590

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

595 600 605

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala lie Ala 610 615 620

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Ser lie Val Ala Gln Leu 625 630 635 640 Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu

645 650

<210> 33

<211> 648

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> efector TAL derecho <400> 33

Leu Asn Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly 1 5 10 15

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

20 25 30

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn

35 40 45

lie Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 50 55 60

Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala lie Ala 65 70 75 80 Ser Asn lie Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 85 90 95

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala

100 105 110

lie Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

115 120 125

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val 130 135 140

Val Ala lieAla Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 145 150 155 160 Gln Arg LeuLeu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala 165 170 175

Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

180 185 190

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

195 200 205

Pro Glu Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala 210 215 220

Leu Glu ThrVal Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 225 230 235 240 Leu Thr ProAla Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly Gly Lys 245 250 255

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp

260 265 270

His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly

275 280 285

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 290 295 300

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn 305 310 315 320 Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 325 330 335 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala lie

340 345 350

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

355 360 365

Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala 370 375 380

lie Ala Ser Asn lie Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 385 390 395 400 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val 405 410 415 Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

420 425 430

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala

435 440 445

Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 450 455 460

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr 465 470 475 480 Pro Ala Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn lie Gly Gly Lys Gln Ala 485 490 495 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

500 505 510

Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

515 520 525

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 530 535 540

His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn Gly Gly 545 550 555 560

565 570 575 Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala lie Ala Ser Asn

580 585 590

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

595 600 605

Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala lie Ala 610 615 620

Ser Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Ser lie Val Ala Gln Leu Ser Arg

625 630 635 640

Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu

645

<210> 34

<211> 1041

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 34

cagttgtcag tatgtgaaca atgttggaaa catgttattt tgtctgattt cctttgggag 60 aattcattgc cagctataaa tctgtggaaa cgctgccaca caatcttagc acacaagatt 120 ggcagaaaat cgcttagaaa cactgaaaac atgtgacaaa gtgctttccg tgaaaagggt 180 ggatgcgaag cagtaaggac ccccttcatg aagcacgcgg tcaccctcca gccaccagaa 240 ccagaggaac gctgtggtaa ctgagggaaa acgcatctag gcacacgtca cggtggcacc 300 ttccagcagg tccccggggt tgtgcccctg gagctctgac aaagagtgtg gcccggaaat 360 gtgatgtttg gactgcaagt tttggtgaga aataacaatg catcaggttg cagacaaagc 420 agaccctgct ctgtgcgttt atgggagccg cgcccaacag gaaccacagg gaatgatcga 480 aaggagaggg acggacacaa acagacacac cagagagagg ttctcaggag gaggctctgt 540 ggcctccaga ccacgtcaaa gccaaggcag aaaggatgaa ctgaggaaag gaggaaaatt 600 tccccttaag gaaggtaaaa tccagaaggg atccctaaaa tggtgagcag tttaaaccta 660 gcagttttgc attaattcac ataaagtata atgaaaactg ttggacacac aaggagagac 720 tggccaatct atagtcacag aggaagacct tcacacccct tcacaggatc tcgcagcaga 780 ttggctgaaa agtctccttg aaactgcaga cctctctcaa ggagacccac tgagttgggc 840 aaaggtgggg ccgacttaat tcttgcctcc ctgctctccc acgtagccct gcatttcact 900 ccattccagg gtttctggga cacccgagaa agcacgtagt ccagggagca cgtctgccaa 960 ctgaaggcct tgacaaatga ctttctgtac tggctgaggg ccagggccca gcgtactgat 1020 aaggaagctc ttccagaaaa a 1041

<210> 35

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> homólogo 1-1D

<400> 35

aaatcaccca aggaagcaca 20

<210> 36

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> homólogo 1-1I

<400> 36

tggcattaac gtattacttg gaga 24

<210> 37

<211> 21

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> homólogo 2-2D

<400> 37

ggcagggatc ttgttggtaa a 21

<210> 38

<211> 22

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> homólogo 2-2I

<400> 38

tgctgagcta gcaggtttaa tg 22

<210> 39

<211> 23

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GAPDH-D

<400> 39

cccctcaagg gcatcctggg cta 23

<210> 40

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GAPDH-I

<400> 40

gaggtccacc accctgttgc tgta 24

<210> 41

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oct4-D

<400> 41

cctcacttca ctgcactgta 20

<210> 42

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oct4-I

<400> 42

caggttttct ttccctagct 20 <210> 43

<211> 19

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sox2-D

<400> 43

cccagcagac ttcacatgt 19 <210> 44

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sox2-I

<400> 44

cctcccattt ccctcgtttt 20 <210> 45

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Lin28-D

<400> 45

agccaagcca ctacattc 18 <210> 46

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Lin28-I

<400> 46

agatacgtca ttcgcaca 18 <210> 47

<211> 20

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Nanog-D

<400> 47

tgaacctcag ctacaaacag 20 <210> 48

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Nanog-I

<400> 48

tggtggtagg aagagtaaag 20 <210> 49

<211> 22

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> F8-D

<400> 49

ctgctttagt gccaccagaa ga 22 <210> 50

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> F8-I

<400> 50

gactgacagg atgggaagcc 20 <210> 51

<211> 20

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FOXA2-F

<400> 51

ctacgccaac atgaactcca 20 <210> 52

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> FOXA2-I

<400> 52

aaggggaaga ggtccatgat 20 <210> 53

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Soxl7-D

<400> 53

agcgcccttc acgtgtacta 20 <210> 54

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Soxl7-I

<400> 54

cttgcacacg aagtgcagat 20 <210> 55

<211> 23

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GAPDH-D para generación de iPSC

<400> 55

gaacatcatc cctgcctcta ctg 23 <210> 56

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> GAPDH-I para generación de iPSC

<400> 56

caggaaatga gcttgacaaa gtgg 24 <210> 57

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> EBNA-1-F

<400> 57

atggacgagg acggggaaga 20 <210> 58

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> EBNA-1-R

<400> 58

gccaatgcaa cttggacgtt 20 <210> 59

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 293-F

<400> 59

gagcagggag gcaagaatta 20 <210> 60

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 293-D

<400> 60

tgagggaaaa cgcatctagg 20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para corregir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo la composición:

(i) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1;

(ii) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:2; y

2. La composición de la reivindicación 1, en donde la endonucleasa guiada por ARN es la proteína 9 (Cas9) asociada a CRISPR.

3. La composición de la reivindicación 1, en donde ARN guía reconoce específicamente las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o secuencias complementarias de las mismas.

4. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición corrige una inversión que se produce en el intrón 22 del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea.

5. Un método in vitro para corregir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo el método poner en contacto células somáticas de un paciente con hemofilia A con la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o transfectar las células somáticas con un sistema de suministro de genes que tiene la composición insertada en el mismo.

6. Un método para preparar células madre pluripotentes inducidas que tienen un gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea con inversión corregida, comprendiendo el método:

(b) poner en contacto las células madre pluripotentes inducidas con la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o transfectar las células madre pluripotentes inducidas con un sistema de suministro de genes que tiene la composición insertada en el mismo.

7. El método de la reivindicación 6, en donde en la etapa (a), las células somáticas aisladas del paciente con hemofilia A se transfectan con al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en OCT4, NANOG, SOX2, LIN28, KLF4 y c-MYC.

8. Una composición que comprende las células madre pluripotentes inducidas preparadas por el método de la reivindicación 6 o 7 como principio activo para tratar la hemofilia A,

en donde las células madre pluripotentes inducidas tienen una inversión corregida del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea detectada por amplificación por PCR o secuenciación y

en donde la composición se introduce en el mismo paciente del que se originaron las células madre pluripotentes inducidas.

9. Una composición para inducir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo la composición:

(i) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1;

(ii) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:2; y

10. Un método in vitro para inducir una inversión del gen del factor VIII (F8) de coagulación sanguínea, comprendiendo el método introducir la composición de la reivindicación 9 en células somáticas aisladas de una persona que carece de dicha inversión.