KR101930711B1 - 혈우병 ｂ의 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
혈우병 B의 치료를 위한 세포의 게놈에 인자 IX(FIX) 서열의 삽입을 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다.
Description
본 출원은 2010년 10월 12일자 제출된 미국 가 출원 제61/392,333호의 우선권을 주장하며, 그 명세서는 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.
본 명세서는 유전자 변형 및 혈우병 치료 분야에 관한 것이다.
혈우병 B는 관절 및 및 연조직 내 출혈과 외상이나 수술받은 부위의 과도한 출혈을 특징으로 하는 혈액 응고 시스템의 유전자 장애이다. 혈우병 B는 혈우병 A와 임상적으로 구별되지는 않지만, 혈우병 A에서는 인자 VIII(FVIII)가 결핍되거나 부재하고, 혈우병 B 환자는 인자 IX(FIX 또는 F.IX)가 결핍되거나 부재한다. 인자 IX는 응고 시스템과 관련된 세린 프로테아제들 중 하나를 암호화하며, 야생형 인자 IX 단백질의 정상 혈중 수준의 3%만 복구되도 자발적 출혈을 방지할 수 있다고 알려져 있다.
간 지향성 유전자 요법 계획안 및 기능적 FIX 단백질을 암호화하는 플라스미드 및 다른 벡터들(예를 들어, AAV)의 도입을 포함하는 직접 근육내 주사를 포함하는 유전자 요법이 혈우병 B의 치료에 있어서 설명되었다. 예를 들어, 미국특허 제6,936,243호; Lee et al. (2004) Pharm. Res. 7:1229-1232; Graham et al. (2008) Genet Vaccines Ther. 3:6-9를 참조한다. 그러나, 이들 계획안에서 억제성 항-인자 IX(항-FIX) 항체들 및 송달 부형제에 대한 항체들의 형성이 혈우병 B의 FIX 단백질 대체-기반 치료의 주요한 문제로 남아 있다.
미국 특허출원 제12/798,749호는 분리된 줄기세포에 기능적 FIX 단백질의 표적 통합 및 치료가 필요한 환자에게 FIX-생산 줄기세포를 도입함에 의한 혈우병 B의 치료를 설명한다.
그러나, 해당 질환을 가진 대상에서 혈우병 B를 치료하는 추가의 조성물 및 방법의 필요성은 여전하다.
혈우병 B를 치료하기 위한 기능적 FIX 단백질을 암호화하는 서열의 표적 통합을 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 특히, 상기 방법은 해당 질환의 완화를 위하여 세포의 게놈으로 기능적 FIX 단백질을 암호화하는 서열의 표적 삽입을 매개하는 뉴클레아제를 투여하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 게놈 내의 관심 영역(예를 들어, 인자 IX 유전자)에서 표적 부위와 결합하는 DNA 결합 도메인(예를 들어, 징크 핑거 단백질(ZFP) 또는 TALE 단백질)이 본원에 설명되며, 여기서 ZFP는 하나 이상의 유전자 조작된 징크 핑거 결합 도메인을 포함하고, TALE는 하나 이상의 유전자 조작된 TALE DNA-결합 도메인을 포함한다. 일 구체예에서, DNA 결합 도메인은 뉴클레아제이며, 예를 들어 ZFP는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)이고, TALE는 관심의 표적 게놈 영역을 절단하는 TALE 뉴클레아제(TALEN)이며, 여기서 ZFN 또는 TALEN은 하나 이상의 유전자 조작된 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 절단 도메인 또는 절단 하프도메인을 포함한다. 절단 도메인 및 절단 하프도메인은, 예를 들어 여러 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 귀소성 엔도뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 일 구체예에서, 절단 하프도메인은 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, FokI)로부터 유도된다. 특정 구체예에서, 징크 핑거 도메인은 내인성 FD 유전자에 있는 표적 부위, 예를 들어 표 1에 나타낸 징크 핑거 도메인(또는 표 1에 나타낸 표적 부위와 결합하는 징크 핑거 도메인)을 인식한다.
다른 양태에서, 본원에 설명된 하나 이상의 ZFN 및/또는 TALEN를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 설명된다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 mRNA일 수 있다.
다른 양태에서, ZFN 및/또는 TALEN 발현 벡터가 본원에 설명되며, 이것은 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 본원에 설명된 하나 이상의 ZFN 및/또는 TALEN를 암호화하며, 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일 구체예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 일 양태에서, 바이러스 벡터는 조직 특이적 향성을 나타낸다.
다른 양태에서, 하나 이상의 ZFN 및/또는 TALEN 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 설명된다. 숙주 세포는 하나 이상의 ZFP 또는 TALEN 발현 벡터로 안정하게 형질전환되거나 또는 일시적으로 트랜스펙션될 수 있고, 또는 이들의 조합도 가능하다. 일 구체예에서, 숙주 세포는 배아줄기세포이다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 ZFP 및/또는 TALEN 발현 벡터는 숙주 세포에서 하나 이상의 ZFN 및/또는 TALEN을 발현한다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 외래 폴리뉴클레오티드 도너 서열을 더 포함할 수 있다. 본원에 설명된 상기 구체예들 중 어느 것에서, 숙주 세포는 간세포, 근육세포, 줄기세포 또는 배세포를 포함할 수 있다. 세포는 임의의 생물, 예를 들어 사람, 비-사람 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개 또는 다른 포유류의 세포로부터 유래할 수 있다.
다른 양태에서, 치료가 필요한 피험자의 세포에 FIX 단백질을 암호화하는 서열을 통합하는 뉴클레아제를 사용하여 혈우병 B를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, FIX-암호화 서열은 바이러스 벡터, 비바이러스 벡터(예를 들어, 플라스미드) 및/또는 이들의 조합을 사용하여 송달된다. 특정 구체예에서, 벡터는 AAV 벡터, 예를 들어 AAV8을 포함한다. 특정 구체예에서, 뉴클레아제 및/또는 FIX-암호화 서열은 온전한 동물의 간에 정맥내(예를 들어, 간문맥 정맥) 투여를 통해 송달된다.
본원에 설명된 방법들 중 어느 것에서, 뉴클레아제는 하나 이상의 징크 핑거 뉴클레아제, 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제) 및/또는 하나 이상의 TAL-이펙터 도메인 뉴클레아제("TALEN")일 수 있다. 본원에 설명된 뉴클레아제(예를 들어, ZFN 및/또는 TALEN)는 유전자 내의 또는 유전자에 인접한 코딩 또는 비코딩 영역, 예를 들어 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론에 있는, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류의 비전사 영역 내의 관심의 영역과 결합하고/하거나 그것을 절단할 수 있다. 특정 구체예에서, ZFN은 내인성 인자 IX 유전자(돌연변이체 또는 야생형)와 결합하고/하거나 절단한다. 다른 구체예에서, ZFN 및/또는 TALEN은 세이프-하버 유전자(유전자의 교란은 비독성인 유전자, 또는 세포를 교란하는 유전자), 예를 들어 CCR5 유전자, PPP1R12C(AAV S1라고도 한다) 유전자 또는 Rosa 유전자와 결합하고/하거나 절단한다. 예를 들어, 미국 특허공개 20080299580; 20080159996 및 201000218264를 참조한다.
또한, 본원에 설명된 방법들 중 어느 것은 부분적 간절제술 또는 형질도입을 증진시키고/시키거나 간세포가 세포 주기를 겪도록 유도하는 2차 제제에 의한 치료를 포함하는 추가의 단계들을 더 포함할 수 있다. 2차 제제의 예들은 감마선 조사, UV 조사, 삼중수소화된 뉴클레오티드, 예를 들어 티미딘, 시스-플라티늄, 에토포시드, 히드록시유레아, 아피디콜린, 프레드니솔론, 사염화탄소 및/또는 아데노바이러스를 포함한다.
본원에 설명된 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 실시될 수 있다. 특정 구체예에서, 조성물은 살아 있는 온전한 포유류에 도입된다. 포유류는 송달시에 임의의 발생 단계일 수 있으며, 예를 들어 배아, 태아, 신생아, 유아, 소아 또는 성인일 수 있다. 추가로, 표적 세포는 건강한 세포, 또는 질환 세포일 수 있다. 특정 구체예에서, 조성물(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 암호화 뉴클레아제(들) 및/또는 FIX-암호화 서열)은, 예를 들어 간문맥 주사를 통해 살아 있는 동물의 간으로 송달된다. 다른 구체예에서, 조성물들 중 하나 이상이 정맥내(간문맥 정맥이 아닌, 예를 들어 꼬리정맥 주사를 통해), 동맥내, 복강내, 간실질(예를 들어, 주사를 통해), 간동맥(예를 들어, 주사를 통해) 및/또는 담도계(예를 들어, 주사를 통해)를 통해서 송달된다.
조성물을 특정한 종류의 세포, 예를 들어 간세포에 표적화하기 위해서, 투여되는 조성물들 중 하나 이상은 해당 세포의 표면 수용체와 특이적으로 결합하는 귀소성 제제와 관련된다. 예를 들어, 벡터는 특정 간장계 세포가 그에 대한 수용체를 갖는 리간드(예를 들어, 갈락토오스)와 콘쥬게이트될 수 있다. 콘쥬게이션은, 예를 들어 글루타르알데히드와 같은 가교제에 의한 공유 결합, 또는 예를 들어 아비딘화된 리간드와 바이오틴화된 벡터의 결합에 의한 비공유 결합일 수 있다. 공유 결합 콘쥬게이션의 다른 형태는 벡터 스톡의 제조에 사용된 AAV 헬퍼 플라스미드를 유전자 조작하여 암호화된 코팅 단백질들 중 하나 이상이 네이티브 AAV 코팅 단백질과 펩티드 또는 단백질 리간드의 혼성체가 되도록 하여 리간드를 바이러스 입자의 표면에 노출시킴으로써 제공된다.
표적 세포는 사람 세포, 또는 다른 포유류(수의과 동물을 포함하는)의 세포, 특히 비사람 영장류 및 설치목(마우스, 래트, 햄스터), 토끼목(토끼), 식육목(고양이, 개) 및 소목(소, 돼지, 양, 염소, 말)의 포유류일 수 있다. 일부 양태에서, 표적 세포는 조직(간 등)을 포함한다. 일부 양태에서, 표적 세포는 줄기세포(예를 들어, 배아줄기세포, 유도된 다능성 줄기세포, 간줄기세포 등), 또는 본원에 설명된 방법들 중 어느 것에 의한 동물의 배이며, 이후 살아 있는 동물이 탄생되도록 배가 이식된다. 다음에, 이 동물은 성 성숙기까지 사육되어 자손을 생산하게 되며, 이때 자손의 적어도 일부는 게놈 변형을 포함한다.
이들 및 다른 양태들은 전체 명세서에 비추어 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 따라서, 본 명세서는 다음의 실시예들을 포함한다:
1. 유전자 조작된 징크 핑거 단백질 DNA-결합 도메인을 포함하는 단백질로서, 상기 DNA-결합 도메인은 N-말단에서부터 C-말단까지 F1 내지 F4 또는 F1 내지 F5의 순서로 4개 또는 5개의 징크 핑거 인식 영역을 포함하며,
(i) DNA-결합 도메인이 5개의 징크 핑거 인식 영역을 포함할 때, F1 내지 F5는 다음의 아미노산 서열을 포함하고:
F1: QSGDLTR (SEQ ID NO:4)
F2: RSDVLSE (SEQ ID NO:5)
F3: DRSNRIK (SEQ ID NO:6)
F4: RSDNLSE (SEQ ID NO:7)
F5: QNATRIN (SEQ ID NO:8);
(ii) DNA-결합 도메인이 4개의 징크 핑거 인식 영역을 포함할 때, F1 내지 F4는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
F1: RSDSLSV (SEQ ID NO:10)
F2: TSGHLSR (SEQ ID NO:11)
F3: RSDHLSQ (SEQ ID NO:12)
F4: HASTRHC (SEQ ID NO:13).
2. 상기 1에 있어서, 절단 도메인 또는 절단 하프도메인을 더 포함하는 단백질.
3. 상기 2에 있어서, 절단 하프도메인은 야생형 또는 유전자 조작된 FokI 절단 하프도메인인 단백질.
4. 상기 1-3 중 어느 것의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
5. 상기 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 송달 벡터.
6. 상기 1-3 중 어느 것의 단백질 또는 상기 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 세포.
7. 상기 1-3 중 어느 것의 단백질 또는 상기 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 세포.
8. 적어도 하나의 뉴클레아제를 사용하여 세포의 게놈에 기능 인자 IX(FIX) 단백질을 암호화하는 서열을 삽입(예를 들어, 표적 통합을 통해)하는 것을 포함하는, 상기 세포를 포함하는 피험자에서 혈우병 B를 치료하는 방법.
9. 상기 8에 있어서, 서열은 내인성 유전자에 통합되는 방법.
10. 상기 9에 있어서, 내인성 유전자는 FIX 유전자 및 세이프 하버(safe-harbor) 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
11. 상기 8-10 중 어느 것에 있어서, 서열 및/또는 뉴클레아제는 바이러스 벡터, 비바이러스 벡터 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 벡터를 사용하여 세포에 송달되는 방법.
12. 상기 8-11 중 어느 것에 있어서, 세포는 간세포이고, 서열은 무손상 동물의 정맥내 투여(예를 들어, 간으로)에 의해 세포에 송달되는 방법.
13. 상기 8-12 중 어느 것에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제, TALEN 또는 귀소성 엔도뉴클레아제인 방법.
14. 상기 8-13 중 어느 것에 있어서, 피험자에게 부분적 간절제술을 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 방법.
15. 상기 8-14 중 어느 것에 있어서, 피험자를 적어도 하나의 2차 제제로 치료하는 단계를 더 포함하는 방법.
16. 상기 15에 있어서, 2차 제제는 감마선 조사, UV 조사, 삼중 수소화된 뉴클레오티드, 시스-플라티늄, 프레드니솔론, 사염화탄소, 에토포시드, 히드록시유레아, 아피디콜린, 아데노바이러스 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
17. 상기 8-16 중 어느 것에 있어서, 세포는 분리된 세포이고, 방법은 피험자에게 분리된 세포를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
18. 상기 8-17 중 어느 것에 있어서, 피험자는 배, 태아, 신생아, 유아, 소아 또는 성인으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
19. 상기 8-18 중 어느 것에 있어서, 서열을 세포의 표면 수용체와 특이적으로 결합하는 귀소성 제제와 결합시키는 것을 더 포함하는 방법.
20. 상기 19에 있어서, 귀소성 제제는 갈락토오스 또는 AAV 코팅 단백질과 갈락토오스의 혼성체를 포함하는 방법.
21. 상기 8-20 중 어느 것에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포의 표면 수용체와 특이적으로 결합하는 귀소성 제제와 결합시키는 것을 더 포함하는 방법.
22. 상기 21에 있어서, 귀소성 제제는 갈락토오스 또는 AAV 코팅 단백질과 갈락토오스의 혼성체를 포함하는 방법.
23. 상기 8-22 중 어느 것에 있어서, 세포는 사람 세포, 비사람 영장류 세포, 설치목 세포, 토끼목 세포, 식육목 세포 및 소목 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
24. 상기 8-22 중 어느 것에 있어서, 표적 세포는 줄기세포인 방법.
25. 상기 24에 있어서, 줄기세포는 배아줄기세포, 유도된 다능성 줄기세포, 조혈줄기세포, 간세포 또는 간줄기세포인 방법.
26. 상기 8-25 중 어느 것에 있어서, 뉴클레아제는 상기 1 내지 3 중 어느 것에 따른 징크 핑거 뉴클레아제, 상기 4에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 상기 5에 따른 유전자 송달 비히클을 포함하는 방법.
도 1, 패널 A-E는 N2 ZFN이 인자 IX(F9) 인트론 1을 암호화하는 유전자를 효과적으로 절단하고 사람 세포에서 상동성 재조합을 유도하는 것을 나타낸다. 도 1A는 사람 F9 유전자의 인트론 1에서 N2 ZFN 쌍의 표적을 묘사한 모식도를 도시한다. 도 1B는 이중-시스트론 FLAG-택 ZFN 발현 플라스미드를 도시한다. 도 1C는 K562 세포에 N2 ZFN 발현 플라스미드의 트랜스펙션 후 Surveyor® 미스매치 분석(트랜스제노믹스, "Cel-I")의 결과가 나타난 겔을 도시한다. 이 분석은 트랜스펙션 후 제3일째에 hF9 유전자의 인트론 1에서 N2 ZFN에 의해 유도된 DSB의 NHEJ 수선의 결과를 입증한다. ZFN 발현은 α-FLAG 면역블롯팅에 의해 확인되었고, α-NFkB p65 항체를 사용하여 단백질 로딩이 평가되었다. 도 1D는 hF9 유전자로의 NheI 제한 부위 택의 ZFN-매개 표적화의 시간 과정을 상세히 하는 표적 통합(TI) 분석의 모식도를 도시한다. 도 1E는 NheI 택 도너 플라스미드의 양을 증가시키면서(0-4μg) ZFN 발현 플라스미드의 코-트랜스펙션 후 RFLP 분석의 결과가 나타난 겔을 도시한다. 이 데이터는 트랜스펙션 후 제3일 및 제10일째에는 유전자 표적화의 수준은 증가한 반면, NheI 택 도너 단독 트랜스펙션(4μg, '(-)ZFN')은 검출가능한 유전자 표적화를 가져오지 않은 것을 나타낸다. 검은색 화살표는 제3일 및 제10일 양 일째에 TI로부터의 결과인 NheI-민감성 절단 산물을 표시한다. TI PCR은 32P-표지된 뉴클레오티드를 사용한 PCR에 의해 수행되었고, 밴드 강도는 포스포이미저에 의해 정량되었다. ZFN 발현은 α-FLAG 면역블롯팅에 의해 확인되었고, 단백질 로딩은 α-NFkB p65 항체를 사용하여 평가되었다.
도 2, 패널 A-E는 N2 "랜딩 패드"(LP)를 포함하는 마우스에 N2 ZFN의 AAV-매개 송달이 랜딩 패드(LP) 인트론 1의 유효한 절단을 가져온다는 것을 나타낸다. 도 2A는 N2 ZFN이 공개된 HB-유발 돌연변이를 의태하는(Thompson et al, (1994) Hum. Genet. 94:299-302) 사람 F9 미니-유전자(LP)의 인트론 1을 어떻게 표적화하는지를 묘사한 모식도를 도시한다. 도 2B는 LP 구성물이 마우스 ROSA26 유전자좌에 녹인되었음을 나타내는 PCR 분석으로부터의 겔을 도시한다. 도 2C는 순환 혈장 hFIX를 검출하기 위한 ELISA의 결과를 도시한다. 이 데이터는 마우스에 hFIX를 발현하는 바이러스 벡터(꼬리 정맥을 통해 주사된 1e10 바이러스 게놈(v.g.) AAV-hFIX)가 주사되지 않는다면 hFIX-특이적 ELISA를 사용하여 측정했을 때 LP 마우스가 순환 혈장 hFIX를 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 도 2D는 ApoE 인핸서 및 사람 알파1-안티트립신 프로모터에 의해 발현이 제어되는 이중-시스트론 AAV8-N2 ZFN 발현 벡터를 도시한다. 도 2E는 LP 마우스에 1e11 v.g. AAV-N2 발현 벡터의 꼬리 정맥 주사 후 수행된 Cel-1 분석의 결과를 도시하며, 주사 후 제7일째에 간 DNA에서 LP 인트론 1의 절단을 가져온다. Cel-1 분석은 32P-표지된 뉴클레오티드를 사용한 PCR 앰플리콘에 의해 수행되었고, 밴드 강도는 포스포이미저에 의해 정량되었다. ZFN 발현은 전체 간 세포용해물의 α-FLAG 면역블롯팅에 의해 확인되고, 단백질 로딩은 α-NFkB p65 항체를 사용하여 평가되었다.
도 3, 패널 A 및 B는 N2 ZFN이 랜딩 패드 인트론 1로의 야생형 F9 엑손 2-8의 생체내 AAV-매개 표적화를 촉진한다는 것을 나타낸다. 도 3A는 LP 유전자 돌연변이가 hF9 엑손 2-8의 TI에 의해 인트론 1로 어떻게 우회될 수 있는지의 모식도를 도시한다. 표적화된 및 비표적화된 LP 대립형질은 프라이머 P1, P2 및 P3를 사용한 PCR을 통해서 구별될 수 있다. 도 3B는 생존 2일째에 LP/HB 마우스에서 5e10 v.g. AAV8-N2와 2.5e11 v.g. AAV8-도너의 복강내 병용 주사한 경우 성공적인 유전자 표적화를 나타내지만, 5e10 v.g. AAV8-N2만 주사하거나, 또는 5e10 v.g. AAV8-Mock와 2.5e11 v.g. AAV8-도너를 병용 주사한 경우에는 그렇지 않은 것을 나타내는 프라이머 쌍 P1/P2 및 P1/P3을 사용한 PCR 분석의 겔을 도시한다. PCR은 32P-표지된 뉴클레오티드를 사용하여 수행되었고, 생성물 밴드 강도를 포스포이미저에 의해 정량하여 표적화 빈도를 평가했다. 표적화된 샘플에서 프라이머 P1과 P2는 더 적은 생성물을 생성할 것이며, 이는 표적화된 야생형 F9 엑손 2-8의 성공적인 증폭을 시사하지만, 프라이머 P1과 P3은 비표적화된 대립형질보다 더 많은 생성물을 생성할 것이다.
도 4, 패널 A-F는 생체내 간 유전자 보정이 순환 FIX의 치료 수준을 가져온다는 것을 나타낸다. 도 4A는 생존 2일째 5e10 v.g. AAV-N2 단독(n=7 전- 및 후-부분 간절제술(PHx)), 5e10 v.g. AAV-N2 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=7 전- 및 후-PHx), 또는 5e10 v.g. AAV-Mock 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=6 전- 및 후-PHx)를 복강내 주사한 후 LP 마우스에서 혈장 hFIX 수준을 나타내는 그래프이다. PHx의 타이밍은 화살표로 표시된다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 도 4B는 1e12 v.g. AAV-hFIX(에피솜 우선)의 꼬리 정맥 주사와 이어진 PHx 후 야생형 마우스(n=5)에서 혈장 hFIX 수준을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 도 4C는 생존 2일째 5e10 v.g. AAV-N2 단독(n=8 전-PHx, n= 4 후-PHx), 5e10 v.g. AAV-N2 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=9 전-PHx, n= 5 후-PHx), 또는 5e10 v.g. AAV-Mock 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=6 전-PHx, n= 5 후-PHx)를 복강내 주사한 후 야생형 마우스에서 혈장 hFIX 수준을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 도 4D는 생존 2일째 5e10 v.g. AAV-N2 단독(n=10 전-PHx, n=1 후-PHx), 5e10 v.g. AAV-N2 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=9 전-PHx, n=5 후-PHx), 또는 5e10 v.g. AAV-Mock 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=9 전-PHx, n=3 후-PHx)를 복강내 주사한 후 LP/HB 마우스에서 혈장 hFIX 수준의 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 도 4E는 생존 2일째 5e10 v.g. AAV-N2 및 2.5e11 v.g. AAV-도너를 복강내 주사한 LP/HB 마우스에서 생존 20주째에 RT-PCR에 의해 검출된 hFIX RNA의 간-특이적 발현을 나타내는 겔을 도시한다. 도 4F는 생존 2일째 5e10 v.g. AAV-N2 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=5), 또는 5e10 v.g. AAV-Mock 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=3)를 복강내 주사한 마우스에서 생존 14주째에 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 분석에 의해 분석된 시간 대 응혈 형성을 나타낸 그래프이다(2-테일드 스튜던트 t-테스트로부터의 p-값). 야생형(WT) 및 혈우병 B(HB) 마우스의 aPTT가 비교를 위해 도시된다.
도 5, 패널 A 및 B는 생체내 간 유전자 보정이 순환 FIX의 치료 수준의 발현을 가져온다는 것을 나타낸다. 도 5A는 6주령째 1e11v.g./마우스 AAV-N2 단독('ZFN 단독'), 1e11 v.g./마우스 AAV-N2 및 5.5e11 v.g./마우스 AAV-도너('ZFN+Donor'), 또는 1e11 v.g./마우스 AAV-Mock 및 5.5e11 v.g. AAV-도너('Mock+Donor')를 정맥내 주사한 후 성인 LP 마우스에서 혈장 hFIX 수준을 나타내는 그래프이다. 나타낸 데이터는 그룹당 대략 20마리 마우스를 가지고 한 3회 실험을 대표한다. 이들 실험에서 야생형 hFIX 수준은 대략 1000ng/mL였다. 도 5B는 6주령째 1e11 v.g./마우스 AAV-N2 단독('ZFN 단독'), 1e11 v.g./마우스 AAV-N2 및 5.5e11 v.g./마우스 AAV-도너('ZFN+Donor'), 또는 1e11 v.g./마우스 AAV-Mock 및 5.5e11 v.g. AAV-도너('Mock +Donor')를 정맥내 주사한 후 성인 LP 마우스에서 혈장 hFIX 수준을 나타내는 그래프이다. 주사 2일 후 도 5B의 그룹들은 부분 간절제술을 받았다. 나타낸 데이터는 그룹당 대략 20마리 마우스를 가지고 한 3회 실험을 대표한다. 이들 실험에서 야생형 hFIX 수준은 대략 1000ng/mL였다. 이 데이터는 부분 간절제술이 뒤따르든 않든 성인 마우스에 제공되었을 때 hFIX 발현이 안정적임과 성체 동물에서는 게놈 편집을 수행하는 것이 가능함을 입증한다.
도 2, 패널 A-E는 N2 "랜딩 패드"(LP)를 포함하는 마우스에 N2 ZFN의 AAV-매개 송달이 랜딩 패드(LP) 인트론 1의 유효한 절단을 가져온다는 것을 나타낸다. 도 2A는 N2 ZFN이 공개된 HB-유발 돌연변이를 의태하는(Thompson et al, (1994) Hum. Genet. 94:299-302) 사람 F9 미니-유전자(LP)의 인트론 1을 어떻게 표적화하는지를 묘사한 모식도를 도시한다. 도 2B는 LP 구성물이 마우스 ROSA26 유전자좌에 녹인되었음을 나타내는 PCR 분석으로부터의 겔을 도시한다. 도 2C는 순환 혈장 hFIX를 검출하기 위한 ELISA의 결과를 도시한다. 이 데이터는 마우스에 hFIX를 발현하는 바이러스 벡터(꼬리 정맥을 통해 주사된 1e10 바이러스 게놈(v.g.) AAV-hFIX)가 주사되지 않는다면 hFIX-특이적 ELISA를 사용하여 측정했을 때 LP 마우스가 순환 혈장 hFIX를 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 도 2D는 ApoE 인핸서 및 사람 알파1-안티트립신 프로모터에 의해 발현이 제어되는 이중-시스트론 AAV8-N2 ZFN 발현 벡터를 도시한다. 도 2E는 LP 마우스에 1e11 v.g. AAV-N2 발현 벡터의 꼬리 정맥 주사 후 수행된 Cel-1 분석의 결과를 도시하며, 주사 후 제7일째에 간 DNA에서 LP 인트론 1의 절단을 가져온다. Cel-1 분석은 32P-표지된 뉴클레오티드를 사용한 PCR 앰플리콘에 의해 수행되었고, 밴드 강도는 포스포이미저에 의해 정량되었다. ZFN 발현은 전체 간 세포용해물의 α-FLAG 면역블롯팅에 의해 확인되고, 단백질 로딩은 α-NFkB p65 항체를 사용하여 평가되었다.
도 3, 패널 A 및 B는 N2 ZFN이 랜딩 패드 인트론 1로의 야생형 F9 엑손 2-8의 생체내 AAV-매개 표적화를 촉진한다는 것을 나타낸다. 도 3A는 LP 유전자 돌연변이가 hF9 엑손 2-8의 TI에 의해 인트론 1로 어떻게 우회될 수 있는지의 모식도를 도시한다. 표적화된 및 비표적화된 LP 대립형질은 프라이머 P1, P2 및 P3를 사용한 PCR을 통해서 구별될 수 있다. 도 3B는 생존 2일째에 LP/HB 마우스에서 5e10 v.g. AAV8-N2와 2.5e11 v.g. AAV8-도너의 복강내 병용 주사한 경우 성공적인 유전자 표적화를 나타내지만, 5e10 v.g. AAV8-N2만 주사하거나, 또는 5e10 v.g. AAV8-Mock와 2.5e11 v.g. AAV8-도너를 병용 주사한 경우에는 그렇지 않은 것을 나타내는 프라이머 쌍 P1/P2 및 P1/P3을 사용한 PCR 분석의 겔을 도시한다. PCR은 32P-표지된 뉴클레오티드를 사용하여 수행되었고, 생성물 밴드 강도를 포스포이미저에 의해 정량하여 표적화 빈도를 평가했다. 표적화된 샘플에서 프라이머 P1과 P2는 더 적은 생성물을 생성할 것이며, 이는 표적화된 야생형 F9 엑손 2-8의 성공적인 증폭을 시사하지만, 프라이머 P1과 P3은 비표적화된 대립형질보다 더 많은 생성물을 생성할 것이다.
도 4, 패널 A-F는 생체내 간 유전자 보정이 순환 FIX의 치료 수준을 가져온다는 것을 나타낸다. 도 4A는 생존 2일째 5e10 v.g. AAV-N2 단독(n=7 전- 및 후-부분 간절제술(PHx)), 5e10 v.g. AAV-N2 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=7 전- 및 후-PHx), 또는 5e10 v.g. AAV-Mock 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=6 전- 및 후-PHx)를 복강내 주사한 후 LP 마우스에서 혈장 hFIX 수준을 나타내는 그래프이다. PHx의 타이밍은 화살표로 표시된다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 도 4B는 1e12 v.g. AAV-hFIX(에피솜 우선)의 꼬리 정맥 주사와 이어진 PHx 후 야생형 마우스(n=5)에서 혈장 hFIX 수준을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 도 4C는 생존 2일째 5e10 v.g. AAV-N2 단독(n=8 전-PHx, n= 4 후-PHx), 5e10 v.g. AAV-N2 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=9 전-PHx, n= 5 후-PHx), 또는 5e10 v.g. AAV-Mock 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=6 전-PHx, n= 5 후-PHx)를 복강내 주사한 후 야생형 마우스에서 혈장 hFIX 수준을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 도 4D는 생존 2일째 5e10 v.g. AAV-N2 단독(n=10 전-PHx, n=1 후-PHx), 5e10 v.g. AAV-N2 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=9 전-PHx, n=5 후-PHx), 또는 5e10 v.g. AAV-Mock 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=9 전-PHx, n=3 후-PHx)를 복강내 주사한 후 LP/HB 마우스에서 혈장 hFIX 수준의 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 도 4E는 생존 2일째 5e10 v.g. AAV-N2 및 2.5e11 v.g. AAV-도너를 복강내 주사한 LP/HB 마우스에서 생존 20주째에 RT-PCR에 의해 검출된 hFIX RNA의 간-특이적 발현을 나타내는 겔을 도시한다. 도 4F는 생존 2일째 5e10 v.g. AAV-N2 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=5), 또는 5e10 v.g. AAV-Mock 및 2.5e11 v.g. AAV-도너(n=3)를 복강내 주사한 마우스에서 생존 14주째에 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 분석에 의해 분석된 시간 대 응혈 형성을 나타낸 그래프이다(2-테일드 스튜던트 t-테스트로부터의 p-값). 야생형(WT) 및 혈우병 B(HB) 마우스의 aPTT가 비교를 위해 도시된다.
도 5, 패널 A 및 B는 생체내 간 유전자 보정이 순환 FIX의 치료 수준의 발현을 가져온다는 것을 나타낸다. 도 5A는 6주령째 1e11v.g./마우스 AAV-N2 단독('ZFN 단독'), 1e11 v.g./마우스 AAV-N2 및 5.5e11 v.g./마우스 AAV-도너('ZFN+Donor'), 또는 1e11 v.g./마우스 AAV-Mock 및 5.5e11 v.g. AAV-도너('Mock+Donor')를 정맥내 주사한 후 성인 LP 마우스에서 혈장 hFIX 수준을 나타내는 그래프이다. 나타낸 데이터는 그룹당 대략 20마리 마우스를 가지고 한 3회 실험을 대표한다. 이들 실험에서 야생형 hFIX 수준은 대략 1000ng/mL였다. 도 5B는 6주령째 1e11 v.g./마우스 AAV-N2 단독('ZFN 단독'), 1e11 v.g./마우스 AAV-N2 및 5.5e11 v.g./마우스 AAV-도너('ZFN+Donor'), 또는 1e11 v.g./마우스 AAV-Mock 및 5.5e11 v.g. AAV-도너('Mock +Donor')를 정맥내 주사한 후 성인 LP 마우스에서 혈장 hFIX 수준을 나타내는 그래프이다. 주사 2일 후 도 5B의 그룹들은 부분 간절제술을 받았다. 나타낸 데이터는 그룹당 대략 20마리 마우스를 가지고 한 3회 실험을 대표한다. 이들 실험에서 야생형 hFIX 수준은 대략 1000ng/mL였다. 이 데이터는 부분 간절제술이 뒤따르든 않든 성인 마우스에 제공되었을 때 hFIX 발현이 안정적임과 성체 동물에서는 게놈 편집을 수행하는 것이 가능함을 입증한다.
혈우병 B를 지닌 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 특히, 뉴클레아제-변형 표적 통합이 피험자의 하나 이상의 세포의 게놈에 FIX를 암호화하는 서열을 삽입하는데 사용되며(생체내 또는 생체외), 이로써 세포는 FIX를 생체내 생산한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은, 예를 들어 부분 간절제술 및/또는 간세포가 세포 주기를 겪도록 유도하는 하나 이상의 화합물의 투여에 의해 피험자의 세포, 특히 간세포가 증식하도록(세포 주기에 진입하도록) 유도하는 것을 더 포함한다. 피험자는, 제한은 아니지만, 사람, 비사람 영장류, 수의과 동물들, 예를 들어 고양이, 개, 토끼, 래트, 마우스, 기니피그, 소, 돼지, 말, 염소 등을 포함한다.
본원에 설명된 방법은 혈우병 B의 치료를 가져온다. 메가뉴클레아제를 사용한 뉴클레아제-매개 유전자 보정의 생체내 모델에서 이미 설명된 방법들(Gouble et al, (2006) J Gene Med. May;8(5):616-22 참조)과는 달리, 동물 모델에서 FIX 유전자의 뉴클레아제-매개 통합 후 독성이 거의 또는 전혀 관찰되지 않는다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 신생아 및 성체 동물에서도 작용하며, 삽입된 인자 IX 트랜스젠의 기능적 활성을 가져온다.
일반론
상기 방법의 실시는 물론, 본원에 개시된 조성물의 제조 및 사용은 달리 지시되지 않는다면 분자생물학, 생화학, 크로마틴 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양학, 재조합 DNA 및 본 분야에 속하는 관련 분야들에 있어서 종래 기술들을 이용한다. 이들 기술은 문헌에 충분히 설명된다. 예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 및 Third edition, 2001; Ausubel et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 주기적 갱신자료; METHODS IN ENZYMOLOGY 시리즈, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin"(P.M. Wassarman and A.P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols"(P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 교환하여 사용되며, 직선 또는 환형 입체구조의, 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 말한다. 본 명세서의 취지에 있어서, 이들 용어는 중합체의 길이와 관련하여 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 이 용어들은 천연 뉴클레오티드들의 공지된 유사체들은 물론, 염기, 당 및/또는 인산염 부분(예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)이 변형된 뉴클레오티드들도 포함할 수 있다. 일반적으로 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 갖는데, 즉 A의 유사체는 T와 염기쌍을 이룰 것이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환하여 사용되며, 아미노산 잔기들의 중합체를 말한다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 유사체이거나 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.
"결합"은 매크로 분자들 간의(예를 들어, 단백질과 핵산 간의) 서열-특이적, 비공유 상호작용을 말한다. 상호작용이 전체적으로 서열-특이적이라면 결합 상호작용의 모든 성분이 서열-특이적일 필요는 없다(예를 들어, DNA 백본에서 인산염 잔기와의 접촉). 이러한 상호작용은 일반적으로 10-6M-1 이하의 해리 상수(Kd)를 특징으로 한다. "친화력"은 결합 강도를 말한다. 증가된 결합 친화력은 낮은 Kd와 상호관련된다.
"결합 단백질"은 다른 분자와 비공유 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어 DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)와 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 그것은 자신과 결합할 수 있고(호모다이머, 호모트라이머 등을 형성한다), 및/또는 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자와 결합할 수 있다. 결합 단백질은 한 가지 종류를 넘는 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 징크 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 가진다.
"징크 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은 아연 이온의 배위를 통해 그 구조가 안정화된 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해서 서열-특이적 방식으로 DNA와 결합하는 단백질, 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 "징크 핑거 DNA 결합 단백질"은 주로 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 약기된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 이 반복 도메인은 TALE과 그것의 동족 표적 DNA 서열의 결합에 관련된다. 단일 "반복 유닛"("반복부"라고도 한다)은 전형적으로 33-35 아미노산 길이이며, 자연 발생한 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다.
징크 핑거 및 TALE 결합 도메인은, 예를 들어 자연 발생한 징크 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 유전자 조작(하나 이상의 아미노산의 변경)을 통해 정해진 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 "유전자 조작"될 수 있다. 따라서, 유전자 조작된 DNA 결합 단백질(징크 핑거 또는 TALE)은 자연 발생한 것이 아닌 단백질이다. DNA-결합 단백질을 유전자 조작하는 방법의 비제한적 예들은 설계 및 선택이다. 설계된 DNA 결합 단백질은 그 디자인/조성이 주로 합리적 기준에 근거한 결과인 자연에서는 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적 기준은 치환 규칙의 적용 및 기존의 ZFP 및/또는 TALE 디자인 및 결합 데이터에 관한 정보를 저장한 데이터베이스에 있는 정보를 처리하는 컴퓨터 알고리즘을 포함한다. 예를 들어, 미국특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호와 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국출원 제13/068,735호를 참조한다.
"선택된" 징크 핑거 단백질 또는 TALE는 주로 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 혼성체 선택과 같은 실험적 과정의 결과로서 생성되는 자연에서는 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, US 5,789,538; US 5,925,523; US 6,007,988; US 6,013,453; US 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197 및 WO 02/099084를 참조한다.
"재조합"은, 제한은 아니지만, 비상동성 단부 결합(NHEJ) 및 상동성 재조합에 의한 도너 캡처를 포함하는 두 폴리뉴클레오티드 간의 유전 정보의 교환 과정을 말한다. 본 명세서의 취지에 있어서, "상동성 재조합(HR)"은, 예를 들어 상동성-지향 수선 메커니즘을 통해 세포에서 이중-가닥 브레이크를 수선하는 동안 일어나는 이러한 교환의 특수화된 형태를 말한다. 이 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하며, "표적" 분자(즉, 이중-가닥 브레이크를 경험했던 것)의 수선의 주형이 되는 "도너" 분자를 사용하고, 그것이 도너에서 표적으로 유전 정보의 전달을 가져오기 때문에 "비크로스오버 유전자 전환" 또는 "쇼트 트랙 유전자 전환"이라고 여러 가지로 알려져 있다. 특정 이론에 결부시키고 싶지는 않지만, 이러한 전달은 파괴된 표적과 도너 사이에 형성하는 헤테로듀플렉스 DNA의 미스매치 보정, 및/또는 도너를 사용하여 표적의 일부가 될 유전 정보를 재합성하는 "합성-의존적 가닥 어닐링", 및/또는 관련된 과정들을 수반할 수 있다. 이러한 특수화된 HR은 주로 도너 폴리뉴클레오티드의 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오티드에 통합된 표적 분자의 서열의 변경을 가져온다.
본 명세서의 방법에서, 본원에 설명된 하나 이상의 표적화된 뉴클레아제는 정해진 부위에서 표적 서열(예를 들어, 세포 염색질)에 이중-가닥 브레이크를 만들고, 브레이크 영역에 있는 뉴클레오티드 서열에 대해 상동성을 가진 "도너" 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입될 수 있다. 이중-가닥 브레이크의 존재는 도너 서열의 통합을 촉진하는 것으로 나타났다. 도너 서열은 물리적으로 통합될 수 있거나, 또는 도너 폴리뉴클레오티드는 상동성 재조합을 통한 브레이크의 수선을 위한 주형으로서 사용되며, 그 결과 세포 염색질에 도너에서처럼 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부가 도입된다. 따라서, 세포 염색질에 있는 제1 서열이 변경될 수 있고, 특정 구체예에서는 도너 폴리뉴클레오티드에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, 용어 "치환한다" 또는 "치환"의 사용은 한 뉴클레오티드 서열의 다른 것으로의 치환을 나타내는 것으로 이해될 수 있으며(즉, 정보를 지닌 센스에 있는 서열의 치환), 한 폴리뉴클레오티드의 다른 것으로의 물리적 또는 화학적 치환을 반드시 요하는 것은 아니다.
본원에 설명된 방법들 중 어느 것에서, 징크 핑거 단백질 또는 TALEN의 추가의 쌍들이 세포 내의 추가의 표적 부위의 추가의 이중-가닥 절단을 위해 사용될 수 있다.
세포 염색질에서 관심의 영역에 있는 서열의 표적화된 재조합 및/또는 치환 및/또는 변경을 위한 방법의 특정 구체예에서, 염색체 서열은 외래 "도너" 뉴클레오티드 서열과의 상동성 재조합에 의해 변경된다. 이러한 상동성 재조합은 만일 브레이크의 영역에 상동성인 서열이 존재한다면 세포 염색질에 있는 이중-가닥 브레이크의 존재에 의해 자극된다.
본원에 설명된 방법들 중 어느 것에서, 제1 뉴클레오티드 서열("도너 서열")은 관심의 영역에 있는 게놈 서열과 동일하지는 않지만 상동성인 서열을 함유할 수 있으며, 이로써 관심의 영역에 동일하지 않은 서열을 삽입하기 위한 상동성 재조합을 자극한다. 따라서, 특정 구체예에서, 도너 서열의 관심의 영역에 있는 서열들과 상동성인 부분들은 치환될 게놈 서열에 대해 약 80 내지 99%(또는 이들 사이의 임의의 정수)의 서열 동일성을 나타낸다. 다른 구체예에서, 도너와 게놈 서열 사이의 상동성은 99%보다 높으며, 예를 들어 100개 초과 연속 염기쌍들의 도너와 게놈 서열 사이에서 단지 1개의 뉴클레오티드만 상이하다. 특정 사례에서, 도너 서열의 비상동성 부분은 관심의 영역에 존재하지 않는 서열을 함유할 수 있으며, 이로써 새로운 서열이 관심의 영역에 도입된다. 이들 경우, 비상동성 서열은 일반적으로 관심의 영역에 있는 서열들과 상동성이거나 동일한 50-1,000개 염기쌍(또는 이들 사이의 임의의 정수 값)의 서열 또는 1,000개를 넘는 다수의 염기쌍이 측면에 위치된다. 다른 구체예에서, 도너 서열은 제1 서열에 대해 비상동성이며, 비상동성 재조합 메커니즘에 의해 게놈에 삽입된다.
본원에 설명된 방법들 중 어느 것은 관심의 유전자(들)의 발현을 교란하는 도너 서열의 표적화된 통합에 의해 세포에서 하나 이상의 표적 서열의 부분적 또는 완전한 비활성화를 위해 사용될 수 있다. 또한, 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 유전자를 가진 셀라인이 제공된다.
또한, 본원에 설명된 표적 통합 방법은 또한 하나 이상의 외래 서열을 통합하는데도 사용될 수 있다. 외래 핵산 서열은, 예를 들어 하나 이상의 유전자 또는 cDNA 분자, 임의의 종류의 코딩 또는 비코딩 서열, 뿐만 아니라 하나 이상의 제어 요소(예를 들어, 프로모터)를 포함할 수 있다. 게다가, 외래 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 분자(예를 들어, 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 억제성 RNA(RNAis), 마이크로RNA(miRNA) 등)를 생성할 수 있다.
"절단"은 DNA 분자의 공유 결합 백본의 파괴를 말한다. 절단은, 제한은 아니지만, 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하는 여러 가지 방법들에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단과 이중-가닥 절단이 모두 가능하며, 이중-가닥 절단은 두 별개의 단일-가닥 절단 사건의 결과로서 일어날 수 있다. DNA 절단은 블런트(blunt) 단부 또는 스태거드(staggered) 단부의 생성을 가져올 수 있다. 특정 구체예에서, 융합 폴리펩티드가 표적화된 이중-가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 하프도메인"은 제2 폴리펩티드(동일하거나 상이한)와 함께 절단 활성(바람직하게는 이중-가닥 절단 활성)을 가진 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 절단 하프도메인", "+ 및 - 절단 하프도메인" 및 "좌 및 우 절단 하프도메인"은 상호 교환하여 사용되며, 다이머를 형성하는 절단 하프도메인들의 쌍을 말한다.
"유전자 조작된 절단 하프도메인"은 다른 절단 하프도메인(예를 들어, 다른 유전자 조작된 절단 하프도메인)과 무조건 헤테로다이머를 형성하도록 변형된 절단 하프도메인이다. 또한, 미국 특허공개 20050064474, 20070218528 및 20080131962를 참조하며, 이들은 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.
용어 "서열"은 임의의 길이를 가진 뉴클레오티드 서열을 말하며, 이것은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 직선, 환형 또는 분지형일 수 있으며, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 용어 "도너 서열"은 게놈에 삽입될 뉴클레오티드 서열을 말한다. 도너 서열은 임의의 길이를 가질 수 있으며, 약 2 내지 10,000개 뉴클레오티드 길이(또는 이들 사이의 또는 이들 이상의 임의의 정수 값), 바람직하게 약 100 내지 1,000개 뉴클레오티드 길이(또는 이들 사이의 임의의 정수), 더 바람직하게 약 200 내지 500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
"염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포 염색질은 핵산, 주로 DNA와 히스톤 및 비히스톤 염색체 단백질을 포함하는 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵생물 세포 염색질은 뉴클레오솜 형태로 존재하며, 이때 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 각각 2개씩 포함하는 옥타머와 결합된 DNA의 대략 150개 염기쌍을 포함하고, 링커 DNA(생물에 따라 가변적 길이를 가진다)가 뉴클레오솜 코어들 사이에 연장된다. 히스톤 H1의 분자는 일반적으로 링커 DNA와 결합된다. 본 명세서의 취지에 있어서, 용어 "염색질"은 원핵생물과 진핵생물을 불문하고 모든 종류의 세포 핵단백질 포함하는 의미이다. 세포 염색질은 염색체 및 에피솜 염색질을 모두 포함한다.
"염색체"는 세포의 게놈을 전부 또는 일부 포함하는 염색질 복합체이다. 세포의 게놈은 주로 그것의 핵형에 의해 특정되는데, 이것은 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체들의 집합이다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"은 복제성 핵산, 핵단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 일부가 아닌 핵산을 포함하는 다른 구조이다. 에피솜의 예들은 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈을 포함한다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재할 때 결합 분자가 결합하는 핵산의 일부를 한정하는 핵산 서열이다.
"외래" 분자는 세포에 정상적으로 존재하지 않지만, 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법들에 의해 세포에 도입될 수 있는 분자이다. "세포에서 정상적인 존재"는 세포의 특정 발생 단계 및 환경적 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어 근육의 배아 발생 동안에만 존재하는 분자는 다 성장한 근육 세포와 관련해서는 외래 분자이다. 유사하게, 열 충격에 의해 유도된 분자는 비열충격 세포와 관련해서는 외래 분자이다. 외래 분자는, 예를 들어 기능장애 내인성 분자의 기능화 버전 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능장애 버전을 포함할 수 있다.
외래 분자는 특히 소 분자, 예를 들어 조합 화학 과정에 의해 생성된 소 분자, 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지방단백질, 다당, 상기 분자들의 어떤 변형된 유도체, 또는 상기 분자들 중 하나 이상의 포함하는 어떤 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 단일- 또는 이중-가닥일 수 있고, 직선, 분지형 또는 환형일 수 있으며, 임의의 길이를 가질 수 있다. 핵산은 듀플렉스를 형성할 수 있는 것들은 물론, 트리플렉스-형성 핵산도 포함한다. 예를 들어, 미국특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호를 참조한다. 단백질은, 제한은 아니지만, DNA-결합 단백질, 전사인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화된 DNA 결합 단백질, 중합효소, 메틸라아제, 디메틸라아제, 아세틸라아제, 디아세틸라아제, 키나아제, 포스파타아제, 인테그라아제, 재조합효소, 리가아제, 토포이소머라아제, 자이레이즈 및 헬리카아제를 포함한다.
외래 분자는 내인성 분자와 동일한 종류의 분자, 예를 들어 외래 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외래 핵산은 감염성 바이러스 게놈, 세포에 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 세포에 정상적으로 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 세포에 외래 분자를 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 제한은 아니지만, 지질-매개 전달(즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공, 직접 주사, 세포 융합, 입자 포격, 인산칼슘 공-침전, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함한다. 외래 분자는 또한 내인성 분자와 동일한 종류의 분자일 수 있지만, 해당 세포가 유래된 종과는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 사람 핵산 서열이 마우스 또는 햄스터로부터 원래 유래된 셀라인에 도입될 수 있다.
반면에, "내인성" 분자는 특정 환경 조건하에 특정 발생 단계에서 특정 세포에 정상적으로 존재하는 것이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리온의 게놈, 엽록체 또는 다른 세포기관, 또는 자연 발생 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자는 단백질, 예를 들어 전사인자 및 효소를 포함할 수 있다.
"융합" 분자는 둘 이상의 서브유닛 분자들이 바람직하게는 공유 결합된 분자이다. 서브유닛 분자들은 화학적 종류가 동일한 분자일 수 있거나, 또는 화학적 종류가 상이한 분자일 수 있다. 첫 번째 종류의 융합 분자의 예들은, 제한은 아니지만, 융합 단백질(예를 들어, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인과 하나 이상의 활성화 도메인의 융합) 및 융합 핵산(예를 들어, 상기 설명된 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함한다. 두 번째 종류의 융합 분자의 예들은, 제한은 아니지만, 트리플렉스-형성 핵산과 폴리펩티드의 융합 및 마이너 그로브 바인더와 핵산의 융합을 포함한다.
세포에서 융합 단백질의 발현은 세포에 융합 단백질을 송달한 결과일 수 있거나, 또는 세포에 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 송달함으로써 이루어질 수 있으며, 이때 폴리뉴클레오티드는 전사되고, 전사체가 번역되어 융합 단백질을 생성한다. 트랜스-스플라이싱, 폴리펩티드 절단 및 폴리펩티드 리게이션이 또한 세포에서 단백질의 발현에 수반될 수 있다. 세포에 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 송달하는 방법은 본 명세서의 다른 곳에 제시된다.
본 명세서의 취지에 있어서, "유전자"는 유전자 생성물(하기 참조)을 암호화하는 DNA 영역은 물론, 유전자 생성물의 생성을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함하며, 이러한 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 인접해 있는지의 여부는 무관하다. 따라서, 유전자는, 반드시 제한되는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 터미네이터, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위와 같은 번역 조절 서열, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함한다.
"유전자 발현"은 유전자에 함유된 정보의 유전자 생성물로의 전환을 말한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접 전사 생성물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 임의의 다른 종류의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 또한, 유전자 생성물은 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 가공에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 포스포릴화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조정"은 유전자의 활성에 있어서 변화를 말한다. 발현의 조정은, 제한은 아니지만, 유전자 활성화 및 유전자 억압을 포함할 수 있다. 게놈 편집(예를 들어, 절단, 변경, 비활성화, 무작위 돌연변이)이 발현을 조정하기 위해서 사용될 수 있다. 유전자 비활성화는 본원에 설명된 ZFP를 포함하지 않는 세포와 비교하여 유전자 발현에 있어서 어떤 감소를 말한다. 따라서, 유전자 비활성화는 부분적일 수 있거나, 또는 완전할 수 있다.
"관심의 영역"은 세포 염색질의 임의의 영역, 예를 들어 외래 분자와 결합하는 것이 바람직한 유전자 또는 유전자 내의 또는 인접한 비코딩 서열과 같은 영역이다. 결합은 표적 DNA 절단 및/또는 표적 재조합의 목적을 위한 것일 수 있다. 관심의 영역은, 예를 들어 염색체, 에피솜, 세포기관 게놈(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체) 또는 감염성 바이러스 게놈에 존재할 수 있다. 관심의 영역은 유전자의 코딩 영역 내에, 예를 들어 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론과 같은 전사된 비코딩 영역 내에, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류의 전사되지 않은 영역 내에 있을 수 있다. 관심의 영역은 단일 뉴클레오티드 쌍 정도로 작거나, 또는 최대 2,000 뉴클레오티드 쌍의 길이일 수 있거나, 또는 임의의 정수 값의 뉴클레오티드 쌍들일 수 있다.
"진핵생물" 세포는, 제한은 아니지만, 진균 세포(효모 등), 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포 및 사람 세포(예를 들어, T-세포)를 포함한다.
용어 "작동가능한 연결" 및 "작동 가능하게 연결된"(또는 "작동적으로 연결된")은 양 성분들이 정상적으로 기능하여 성분들 중 적어도 하나가 나머지 성분들 중 적어도 하나에 대해 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 성분들이 배열된 둘 이상의 성분들(서열 요소와 같은)의 병렬 배치와 관련하여 상호 교환하여 사용된다. 예를 들면, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은 그 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 유무에 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 제어한다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 전사 조절 서열은 일반적으로 코딩 서열과 시스 형태로 작동 가능하게 연결되지만, 그것에 바로 인접해 있을 필요는 없다. 예를 들어, 이들이 연속되어 있지 않다 해도 인핸서는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 성분들은 다른 성분과 연결된 상태에서 각각 그것이 그렇게 연결되지 않았을 때와 동일한 기능을 수행한다는 사실을 말한다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인이 활성화 도메인과 융합된 융합 폴리펩티드에 있어서, ZFP DNA-결합 도메인과 활성화 도메인은 해당 융합 폴리펩티드에서 ZFP-DNA-결합 도메인 부분이 그것의 표적 부위 및/또는 그것의 결합 부위와 결합할 수 있고, 활성화 도메인이 유전자 발현을 상향조절할 수 있다면 작동가능한 연결 상태이다. ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인과 융합된 융합 폴리펩티드의 경우, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인은 해당 융합 폴리펩티드에서 ZFP DNA-결합 도메인 부분이 그것의 표적 부위 및/또는 그것의 결합 부위와 결합할 수 있고, 절단 도메인이 표적 부위 부근에서 DNA를 절단할 수 있다면 작동가능한 연결 상태이다.
단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 그 서열이 동일하지는 않지만, 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능적 단편은 상응하는 네이티브 분자와 동일한, 더 많은, 또는 더 적은 수의 잔기를 지닐 수 있으며, 및/또는 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능(예를 들어, 코딩 기능, 다른 핵산과 혼성화하는 능력)을 결정하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 유사하게, 단백질 기능을 결정하는 방법도 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 DNA-결합 기능은, 예를 들어 필터-결합, 전기영동 이동도 변화, 또는 면역침전 분석에 의해 결정될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동에 의해 평가될 수 있다. Ausubel et al.(상동)을 참조한다. 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은, 예를 들어 유전적 방법과 생화학적 방법을 불문하고 공-면역침전, 2-혼성체 분석 또는 보상법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; 미국특허 제5,585,245호 및 PCT WO 98/44350을 참조한다.
"벡터"는 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 구성물", "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"는 관심의 유전자의 발현을 지시할 수 있고, 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 구성물을 의미한다. 따라서, 이 용어는 클로닝, 및 발현 비히클, 뿐만 아니라 통합 벡터를 포함한다.
"리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"은 바람직하게는 반드시 일상적인 분석이 아니라도 쉽게 측정되는 단백질 생성물을 생성하는 임의의 서열을 말한다. 적합한 리포터 유전자는, 제한은 아니지만, 항생물질 내성(예를 들어, 암피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 퓨로마이신 내성)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열, 착색 또는 형광 또는 발광 단백질(예를 들어, 녹색형광 단백질, 증진된 녹색형광 단백질, 적색형광 단백질, 루시페라제)을 암호화하는 서열, 및 증진된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질(예를 들어, 디히드로폴레이트 환원효소)을 포함한다. 에피토프 택은, 예를 들어 FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 어떤 검출가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. "발현 택"은 관심의 유전자의 발현을 모니터하기 위해 소정의 유전자 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있는 리포터들을 암호화하는 서열들을 포함한다.
"세이프 하버" 유전자좌는 숙주 세포에 대해 어떤 유해한 효과 없이 유전자가 삽입될 수 있는 게놈 내의 유전자좌이다. 삽입된 유전자 서열의 발현이 이웃 유전자로부터 어떤 리드-스루 발현에 의해 동요되지 않는 세이프 하버 유전자좌가 가장 유익하다. 포유류 세포에서 세이프 하버 유전자좌의 비제한적 예들은 AAVS1 유전자(미국 특허공개 20080299580 참조), CCR5 유전자(미국 특허공개 20080159996 참조) 및/또는 Rosa 유전자좌(WO 2010/065123 참조)이다.
뉴클레아제
혈우병 B를 가진 피험자로부터 얻은 세포의 게놈에 기능적 FIX 단백질을 암호화하는 서열의 통합에 유용한 조성물, 특히 뉴클레아제가 본원에 설명된다. 특정 구체예에서, 뉴클레아제는 자연 발생한다. 다른 구체예에서, 뉴클레아제는 자연 발생한 것이 아니며, 즉 DNA-결합 도메인 및/또는 절단 도메인에서 유전자 조작된다. 예를 들어, 자연 발생 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 선택된 표적 부위와 결합하도록 변경될 수 있다(예를 들어, 동족 결합 부위와는 상이한 부위와 결합하도록 유전자 조작된 메가뉴클레아제). 다른 구체예에서, 뉴클레아제는 이종성 DNA-결합 및 절단 도메인을 포함한다(예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제; TAL-이펙터 도메인 DNA 결합 단백질; 이종성 절단 도메인을 지닌 메가뉴클레아제 DNA 결합 도메인).
A.
DNA
-결합 도메인
특정 구체예에서, 뉴클레아제는 메가뉴클레아제(귀소성 엔도뉴클레아제)다. 자연 발생한 메가뉴클레아제들은 15-40개 염기쌍 절단 부위를 인식하며, 흔히 다음의 4개의 과로 분류된다: LAGLIDADG 과, GIY-YIG 과, His-Cyst 박스 과 및 HNH 과. 예시적인 귀소성 엔도뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceTV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함한다. 이들의 인식 서열들이 알려져 있다. 또한, 미국특허 제5,420,032호; 제6,833,252호; Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin(1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al.(1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs 카탈록을 참조한다.
특정 구체예에서, 뉴클레아제는 유전자 조작된(비자연발생) 귀소성 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제)를 포함한다. I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII와 같은 귀소성 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 인식 서열이 알려져 있다. 또한, 미국특허 제5,420,032호; 제6,833,252호; Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs 카탈록을 참조한다. 또한, 귀소성 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비천연 표적 부위와 결합하도록 유전자 조작될 수 있다. 예를 들어, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al.(2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 미국 특허공개 No. 2007/0117128을 참조한다. 귀소성 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 뉴클레아제의 맥락에서 전체적으로 변경될 수 있거나(즉, 뉴클레아제가 동족 절단 도메인을 포함하도록), 또는 이종성 절단 도메인과 융합될 수 있다.
다른 구체예에서, DNA-결합 도메인은 자연 발생 또는 유전자 조작된(비자연발생) TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 본원에 전문이 참고자료로 포함되는 미국 특허출원 제13/068,735호를 참조한다. 산토모나스 속의 식물의 병원성 박테리아는 중요한 농작물들에 많은 질환을 일으킨다고 알려져 있다. 산토모나스의 병원성은 식물 세포에 25개 이상의 상이한 이펙터 단백질을 주입하는 보존된 타입 III 분비(T3S) 시스템에 의존한다. 이들 주입된 단백질 중에 식물 전사 활성화 인자를 의태하고, 식물 전사체를 조작하는 전사 활성화 인자-유사(TAL) 이펙터가 있다(Kay et al. (2007) Science 318:648-651 참조). 이들 단백질은 DNA-결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 가장 잘 특성화된 TAL 이펙터 중 하나는 Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria로부터의 AvrBs3이다(Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218:127-136 및 WO 2010079430 참조). TAL-이펙터는 탠덤 반복부들의 중앙 집중된 도메인을 함유하며, 각 반복부는 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 중요한 약 34개 아미노산을 함유한다. 또한, 이들은 핵 국지화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다(Schornack S, et al. (2006) J Plant Physiol 163(3):256-272 참조). 추가로, 식물병원성 박테리아인 Ralstonia solanacearum의 brg11 및 hpx17로 지정된 두 유전자는 R. solanacearum 바이오바(biovar) 1 균주 GMI1000 및 바이오바 4 균주 RS1000에서 산토모나스의 AvrBs3 과에 상동성인 것으로 판명되었다Heuer et al. (2007) Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384 참조). 이들 유전자들은 서로 뉴클레오티드 서열이 98.9% 동일하며, hpx17의 반복 도메인에서 1,575bp의 결실만 차이를 나타낸다. 그러나, 양 유전자 생성물은 산토모나스의 AvrBs3 과 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 가진다. 예를 들어, 본원에 전문이 참고자료로 포함되는 미국 특허출원 제13/068,735호를 참조한다.
이들 TAL 이펙터의 특이성은 탠덤 반복부에서 발견되는 서열들에 의존한다. 반복된 서열은 대략 102bp를 포함하며, 반복부들은 전형적으로 서로 91-100% 상동성을 나타낸다(Bonas et al., 상동). 반복부들의 다형성은 일반적으로 12번 및 13번 위치에 위치되며, TAL-이펙터의 표적 서열에서 연속 뉴클레오티드들의 동일성과 12번 및 13번 위치에 있는 초가변성 2개 잔기의 동일성 사이에는 1 대 1 대응이 있는 것으로 보인다(Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501 및 Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512 참조). 실험적으로, 이들 TAL-이펙터의 DNA 인식을 위한 천연 코드는 12번 및 13번 위치에 있는 HD 서열이 시토신(C)과의 결합을 가져오고, NG는 T와 결합하며, NI는 A, C, G 또는 T와 결합하고, NN은 A 또는 G와 결합하고, ING는 T와 결합하도록 결정되었다. 이들 DNA 결합 반복부는 새로운 조합 및 개수의 반복부를 가진 단백질로 조립되었으며, 이로써 새로운 서열과 상호작용하여 식물 세포에서 비내인성 리포터 유전자의 발현을 활성화할 수 있는 인공적 전사 인자가 제조된다(Boch et al., 상동). 유전자 조작된 TAL 단백질은 FokI 절단 하프도메인과 결합되어 효모 리포터 분석(플라스미드 기반 표적)에서 활성을 나타내는 TAL 이펙터 도메인 뉴클레아제 융합체(TALEN)를 제공한다. 예를 들어, 미국 특허출원 제13/068,735호; Christian et al. ((2010)< Genetics epub 10.1534/genetics. 110.120717 참조).
특정 구체예에서, DNA 결합 도메인은 징크 핑거 단백질을 포함한다. 바람직하게, 징크 핑거 단백질은 그것이 선택된 표적 부위와 결합하도록 유전자 조작된다는 점에서 비자연 발생이다. 예를 들어, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al.(2001) Curr Opin Biotechnol 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; 미국특허 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,503,717호; 제6,689,558호; 제7,030,215호; 제6,794,136호; 제7,067,317호; 제7,262,054호; 제7,070,934호; 제7,361,635호; 제7,253,273호는 물론, 미국 특허공개 20050064474; 20070218528; 및 20050267061를 참조하며, 이들은 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.
유전자 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 자연 발생 징크 핑거 단백질과 비교해서 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 유전자 조작 방법은, 제한은 아니지만, 합리적 설계 및 다양한 종류의 선택을 포함한다. 합리적 설계는, 예를 들어 트리플릿(또는 쿼드러플릿) 뉴클레오티드 서열들과 개별 징크 핑거 아미노산 서열들을 포함하는 데이터베이스의 사용을 포함하며, 각 트리플릿 또는 쿼드러플릿 뉴클레오티드 서열은 특정 트리플릿 또는 쿼드러플릿 서열과 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련된다. 예를 들어, 공동 소유의 미국특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조하며, 이들은 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.
파지 디스플레이 및 2-혼성체 시스템을 포함하는 예시적인 선택 방법은 미국특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 제6,242,568호; WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시된다. 또한, 징크 핑거 결합 도메인의 결합 특이성의 증진이, 예를 들어 공동 소유의 WO 02/077227에 설명되었다.
추가로, 이들 및 다른 참고자료들에 개시된 대로, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거의 징크 핑거 단백질은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커들을 포함하는 어떤 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열들에 대해서는 미국특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조한다. 본원에 설명된 단백질은 단백질의 개별 징크 핑거들 사이에 적합한 링커들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
표적 부위의 선택, ZFP 및 융합 단백질(및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구성 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 미국특허 제6,140,081호; 제5,789,538호; 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,200,759호; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496에 상세히 설명된다.
추가로, 이들 및 다른 참고자료들에 개시된 대로, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거의 징크 핑거 단백질은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커들을 포함하는 어떤 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열들에 대해서는 미국특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조한다. 본원에 설명된 단백질은 단백질의 개별 징크 핑거들 사이에 적합한 링커들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
따라서, 뉴클레아제는 FIX 단백질을 암호화하는 서열을 삽입하는 것이 바람직한 어떤 유전자에서 표적 부위와 특이적으로 결합한다는 점에서 DNA-결합 도메인을 포함한다.
B. 절단 도메인
뉴클레아제를 형성하기 위해서 임의의 적합한 절단 도메인이 DNA-결합 도메인에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인이 뉴클레아제 도메인과 융합되어 ZFN이 만들어졌는데, 이것은 유전자 조작된 (ZFP) DNA 결합 도메인을 통해 의도된 핵산 표적을 인식하고, 뉴클레아제 활성을 통해 ZFP 결합 부위 근처에서 DNA가 절단될 수 있도록 하는 기능적 독립체이다. 예를 들어, Kim et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160를 참조한다. 더 최근에 ZFN은 여러 생물에서 게놈 변형에 사용되었다. 예를 들어, 미국 특허공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; 및 국제 공개 WO 07/014275를 참조한다. 마찬가지로, TALE DNA-결합 도메인도 TALEN을 만들기 위해 뉴클레아제 도메인과 융합되었다. 예를 들어, 미국 특허출원 제13/068,735호를 참조한다.
상기 주지된 대로, 절단 도메인은 DNA-결합 도메인에 대해 이종성일 수 있으며, 예를 들어 징크 핑거 DNA-결합 도메인과 뉴클레아제로부터의 절단 도메인, 또는 TALEN DNA-결합 도메인과 절단 도메인, 또는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인과 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제들은, 제한은 아니지만, 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소성 엔도뉴클레아제를 포함한다. 예를 들어, 2002-2003 카탈록, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388를 참조한다. DNA를 절단하는 추가의 효소들도 알려져 있다(예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미구균 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한 Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993 참조). 이들 효소들(또는 이들의 기능적 단편) 중 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 하프도메인의 출처로서 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 하프도메인은 상기 제시된 것과 같은 어떤 뉴클레아제 또는 그것의 일부로부터 유래될 수 있으며, 절단 활성을 위해 다이머 형성을 필요로 한다. 일반적으로 융합 단백질이 절단 하프도메인을 포함한다면 절단에는 2개의 융합 단백질이 필요하다. 또는 달리, 2개의 절단 하프도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 하프도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 그것의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있거나, 또는 각 절단 하프도메인은 상이한 엔도뉴클레아제(또는 그것의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 두 융합 단백질의 표적 부위들은 바람직하게 서로에 대해 두 융합 단백질의 각 표적 부위와의 결합이 절단 하프도메인들을 서로에 대해 절단 하프도메인들이, 예를 들어 다이머 형성에 의해 기능적 절단 도메인을 형성할 수 있도록 하는 공간적 배향으로 위치시키도록 배치된다. 따라서, 특정 구체예에서, 표적 부위들의 가까운 가장자리들은 5-8 뉴클레오티드만큼 또는 15-18 뉴클레오티드만큼 분리된다. 그러나, 임의의 정수의 개수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍들이 두 표적 부위 사이에 개재할 수 있다(예를 들어, 2-50 뉴클레오티드 쌍들 이상). 일반적으로 절단 부위는 표적 부위들 사이에 놓인다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종들에 존재하며, DNA와 서열-특이적 결합을 할 수 있고, 결합 부위에서 또는 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소(예를 들어, 타입 IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하며, 분리될 수 있는 결합 도메인과 절단 도메인을 가진다. 예를 들어, 타입 IIS 효소 FokI는 제1 가닥 상에서는 그것의 인식 부위로부터 9개 뉴클레오티드에서, 제2 가닥 상에서는 그것의 인식부위로부터 13개 뉴클레오티드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국특허 제5,356,802호; 제5,436,150호; 제5,487,994호는 물론, Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al.(1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982를 참조한다. 따라서, 일 구체예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 타입 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 하프도메인)과 유전자 조작될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인과 분리될 수 있는 예시적인 타입 IIS 제한 효소는 FokI다. 이 특정 효소는 다이머일 때 활성이다. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575. 따라서, 본 명세서의 취지에 있어서, 개시된 융합 단백질에 사용된 FokI 효소의 일부는 절단 하프도메인으로 간주된다. 따라서, 징크 핑거-FokI 융합체를 사용한 표적 이중-가닥 절단 및/또는 세포 서열의 표적 치환을 위해서 각각 FokI 절단 하프 도메인을 포함하는 두 융합 단백질을 사용하여 촉매 활성 절단 도메인을 재구성할 수 있다. 또는 달리, 징크 핑거 결합 도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자와 2개의 FokI 절단 하프도메인이 또한 사용될 수 있다. 징크 핑거-FokI 융합체를 사용한 표적 절단 및 표적 서열 변경의 변수들은 본 명세서의 다른 곳에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 하프도메인은 절단 활성을 보유하거나, 또는 기능적 절단 도메인을 형성하도록 멀티머를 형성하는(예를 들어, 다이머를 형성하는) 능력을 보유한 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 타입 IIS 제한 효소는 본원에 전문이 참고자료로 포함되는 국제 공개 WO 07/014275에 설명된다. 추가의 제한 효소도 또한 분리할 수 있는 결합 및 절단 도메인을 함유하며, 이들은 본 명세서에 의해 고려된다. 예를 들어, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420를 참조한다.
특정 구체예에서, 절단 도메인은, 예를 들어 미국 특허공개 20050064474; 20060188987; 20070305346 및 20080131962에 설명된 것과 같은, 호모다이머 형성을 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 유전자 조작된 절단 하프도메인(다이머 형성 도메인 돌연변이체라고도 한다)을 포함하며, 상기 명세서들은 모두 전문이 본원에 참고자료로 포함된다. FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에 있는 아미노산 잔기들은 모두 FokI 절단 하프도메인의 다이머 형성에 영향을 미치기 위한 표적들이다.
무조건 헤테로다이머를 형성하는 FokI의 예시적인 유전자 조작된 절단 하프도메인들은 제1 절단 하프도메인이 FokI의 위치 490 및 538에 있는 아미노산 잔기에 돌연변이를 포함하고, 제2 절단 도메인이 아미노산 잔기 486 및 499에 돌연변이를 포함하는 쌍이다.
따라서, 일 구체예에서, 490번에 있는 돌연변이는 Glu(E)를 Lys(K)로 치환하며; 538번에 있는 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 치환하고; 486번에 있는 돌연변이는 Gin(Q)을 Glu(E)로 치환하고; 499번 위치에 있는 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 치환한다. 구체적으로, 본원에 설명된 유전자 조작된 절단 하프도메인은 제1 절단 하프도메인에서는 위치 490(E→K)과 538(I→K)을 돌연변이시켜 "E490K:I538K"로 지정된 유전자 조작된 절단 하프도메인을 생성하고, 제2 절단 하프도메인에서는 위치 486(Q→E)과 499(I→L)를 돌연변이시켜 "Q486E:I499L"로 지정된 유전자 조작된 절단 하프도메인을 생성함으로써 제조되었다. 본원에 설명된 유전자 조작된 절단 하프도메인은 일탈적인 절단이 최소화되거나 제거된 의무적 헤테로다이머 돌연변이체이다. 예를 들어, 모든 취지에 있어서 본원에 전문이 참고자료로 포함되는 미국 특허공개 No. 2008/0131962를 참조한다. 특정 구체예에서, 유전자 조작된 절단 하프도메인은 위치 486, 499 및 496(야생형 FokI에 대해 넘버링)에 돌연변이를 포함하는데, 예를 들어 위치 486에 있는 야생형 Gin(Q) 잔기를 Glu(E) 잔기로 치환한 돌연변이, 위치 499에 있는 야생형 Iso(I) 잔기를 Leu(L) 잔기로 치환한 돌연변이 및 위치 496에 있는 야생형 Asn(N) 잔기를 Asp(D) 또는 Glu(E) 잔기로 치환한 돌연변이(각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인이라고도 한다)를 포함한다. 다른 구체예에서, 유전자 조작된 절단 하프도메인은 위치 490, 538 및 537(야생형 FokI에 대해 넘버링)에 돌연변이를 포함하는데, 예를 들어 위치 490에 있는 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로 치환한 돌연변이, 위치 538에 있는 야생형 Iso(I) 잔기를 Lys(K) 잔기로 치환한 돌연변이 및 위치 537에 있는 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기로 치환한 돌연변이(각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인이라고도 한다)를 포함한다. 다른 구체예에서, 유전자 조작된 절단 하프도메인은 위치 490 및 537(야생형 FokI에 대해 넘버링)에 돌연변이를 포함하는데, 예를 들어 위치 490에 있는 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로 치환한 돌연변이 및 위치 537에 있는 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기로 치환한 돌연변이(각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인이라고도 한다)를 포함한다(미국 특허공개 No. 2011/0201055 참조). 다른 구체예에서, 유전자 조작된 절단 하프도메인은 "Sharkey" 및/또는 "Sharkey'" 돌연변이를 포함한다(Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107 참조).
본원에 설명된 유전자 조작된 절단 하프도메인은 임의의 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어 미국 특허공개 20050064474; 20080131962; 및 20110201055에 설명된 것과 같은 야생형 절단 하프도메인(FokI)의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.
또는 달리, 뉴클레아제는 소위 말하는 "스플릿-효소" 기법을 사용하여 핵산 표적 부위에서 생체내 조립될 수 있다(예를 들어, 미국 특허공개 No. 2009/0068164 참조). 이러한 스플릿 효소의 성분들은 별도의 발현 구성물들에서 발현될 수 있거나, 또는 개별 성분들이 분리되어 있는 하나의 오픈 리딩 프레임에서, 예를 들어 자가-절단 2A 펩티드 또는 IRES 서열에 의해 연결될 수 있다. 성분들은 개별 징크 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인들일 수 있다.
뉴클레아제는, 예를 들어 WO 2009/042163 및 20090068164에 설명된 것과 같은 효모-기반 염색체 시스템에서 사용 전에 활성에 대해 선별될 수 있다. 뉴클레아제 발현 구성물은 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 쉽게 설계될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허공개 2003/0232410; 2005/0208489; 2005/0026157; 2005/0064474; 2006/0188987; 20060063231; 및 국제 공개 WO 07/014275를 참조한다. 뉴클레아제의 발현은 구성성 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들어 라피노오스 및/또는 갈락토오스의 존재하에 활성화되고(탈억압), 글루코오스의 존재하에 억압되는 갈락토키나아제 프로모터의 제어하에 있을 수 있다.
표적 부위
상기 상세히 설명된 대로, DNA 도메인은, 예를 들어 내인성 FIX 유전자 또는 내인성 또는 삽입된 세이프 하버 유전자에 있는 선택된 임의의 서열과 결합하도록 유전자 조작될 수 있다. 유전자 조작된 DNA-결합 도메인은 자연 발생 DNA-결합 도메인과 비교하여 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 유전자 조작 방법은, 제한은 아니지만, 합리적 설계 및 다양한 종류의 선택을 포함한다. 합리적 설계는, 예를 들어 트리플릿(또는 쿼드러플릿) 뉴클레오티드 서열들과 개별 징크 핑거 아미노산 서열들을 포함하는 데이터베이스의 사용을 포함하며, 여기서 각 트리플릿 또는 쿼드러플릿 뉴클레오티드 서열은 특정 트리플릿 또는 쿼드러플릿 서열과 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련된다. 예를 들어, 공동 소유의 미국특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조하며, 이들은 전문이 본원에 참고자료로 포함된다. 또한, TAL-이펙터 도메인의 합리적 설계가 수행될 수 있다. 예를 들어, 각각 2010년 5월 17일 및 2010년 8월 21일 제출된 미국 가 출원 제61/395,836호 및 제61/401,429호를 참조한다.
파지 디스플레이 및 2-혼성체 시스템을 포함하는 DNA-결합 도메인에 이용가능한 예시적인 선택 방법은 미국특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제 6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 제6,242,568호; 및 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시된다. 또한, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증진은, 예를 들어 공동 소유의 WO 02/077227에 설명되었다.
표적 부위의 선택, 뉴클레아제 및 융합 단백질(및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구성을 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 전문이 본원에 참고자료로 포함되는 미국 특허출원 공개 20050064474 및 20060188987에 설명된다.
또한, 이들 및 다른 참고자료들에 개시된 대로, DNA-결합 도메인(예를 들어, 다중-핑거 징크 핑거 단백질)은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산의 링커들을 포함하는 어떤 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열들에 대해서는 미국특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조한다. 본원에 설명된 단백질은 단백질의 개별 DNA-결합 도메인들 사이에 적합한 링커들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 미국 특허출원 제13/066,735호를 참조한다.
기능적 FIX 단백질을 암호화하는 서열의 표적 삽입을 통한 혈우병 B의 치료를 위해서 피험자의 게놈에서 임의의 바람직한 삽입 부위가 FIX-암호화 서열을 지닌 도너 폴리뉴클레오티드의 표적 삽입을 자극하는 뉴클레아제로 절단된다. 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 게놈에서 임의의 바람직한 부위에 표적화될 수 있다.
특정 구체예에서, 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은, 예를 들어 미국 특허출원 제12/798,749호에 설명된 대로, 내인성 FIX(F9) 유전자에 표적화된다. 표적 부위는 코팅 서열 내의 어느 곳이나, 또는 코딩 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 부위(들)은 코팅 서열의 3' 단부 근처이다.
다른 구체예에서, 뉴클레아제(DNA-결합 도메인 성분)는 "세이프 하버" 유전자좌에 표적화되며, 이것은 예로서만 AAVS1 유전자(미국 특허공개 No. 20080299580 참조), CCR5(미국 특허공개 No. 20080159996 참조) 및/또는 Rosa 유전자좌(WO 2010 /065123 참조)를 포함한다.
도너
서열
혈우병을 치료하기 위해서 도너 서열은 기능적 FIX 단백질, 또는 그것의 일부를 암호화하는 서열을 포함하며, 이로써 도너 통합 후 기능적 FIX 단백질을 암호화하고 발현하는 서열을 가져온다. 이 도너 분자는 내인성 유전자에 삽입될 수 있으며, 이 내인성 유전자는 전부 또는 일부가 발현되거나, 또는 전혀 발현되지 않게 된다. 예를 들어, 본원에 설명된 기능 FIX 서열을 포함하는 트랜스젠은 내인성 FIX 유전자좌에 삽입될 수 있고, 이로써 FIX 트랜스젠과 함께 내인성 FIX의 일부가 발현되거나, 또는 전혀 발현되지 않게 된다(예를 들어, 도너가 야생형 내인성 서열이 발현되도록 돌연변이를 보정할 수 있다). 다른 구체예에서, FIX 트랜스젠은 임의의 내인성 유전자좌, 예를 들어 세이프 하버 유전자좌(내인성 또는 삽입된)에 통합된다. 예를 들어, 미국 특허공개 20080299580; 20080159996 및 201000218264를 참조한다.
FIX 도너 서열은 융합 단백질(들)의 발현 전에, 발현과 동시에, 또는 발현에 이어서 세포에 도입될 수 있다. FIX 도너 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 게놈 서열에 대해 충분한 상동성을 함유하며, 이로써 이 도너와 도너가 상동성을 지닌 게놈 서열 사이에 상동성 재조합(또는 상동성-지향 수선)을 지원할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허공개 2005/0064474; 2007/0134796 및 2009/0263900를 참조한다. 도너 서열은 전형적으로 그것이 치환하는 게놈 서열과 동일하지는 않다는 것이 쉽게 자명할 것이다. 예를 들어, 도너 폴리뉴클레오티드의 서열은 염색체 서열과의 충분한 상동성이 존재하는 한은 게놈 서열과 관련하여 하나 이상의 단일 염기 변화, 삽입, 결실, 도치 또는 재배열을 함유할 수 있다. 또는 달리, 도너 서열은 상동성의 두 영역이 측면에 위치된 비상동성 서열을 함유할 수 있다. 추가로, 도너 서열은 세포 염색질에 있는 관심의 영역에 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 도너 분자는 세포 염색질에 대해 상동성을 가진 몇 개의 비연속 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 관심의 영역에 정상적으로는 존재하지 않는 서열의 표적 삽입을 위해서, 상기 서열은 도너 핵산 분자에 존재할 수 있고, 관심의 영역에 있는 서열에 대해 상동성을 가진 영역들이 측면에 위치될 수 있다.
FIX 도너 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으며, 직선 또는 환형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 직선 형태로 도입될 경우, 도너 서열의 단부들은 당업자에게 공지된 방법에 의해 보호될 수 있다(예를 들어, 외래핵산분해 변성으로부터). 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 직선 분자의 3' 말단에 부가되고, 및/또는 자가-상보성 올리고뉴클레오티드가 한쪽 또는 양쪽 단부에 리게이션된다. 예를 들어, Chang et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al., (1996) Science 272:886-889을 참조한다. 변성으로부터 외래 폴리뉴클레오티드를 보호하는 추가의 방법은, 제한은 아니지만, 말단 아미노기(들)의 부가 및, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 리보오스 또는 데옥시리보오스 잔기들과 같은 변형된 뉴클레오티드간 결합의 사용을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 복제 기원, 프로모터 및 항생물질 내성을 암호화하는 유전자와 같은 추가의 서열을 가진 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 또한, 도너 폴리뉴클레오티드는 리포솜 또는 폴록사머와 같은 제제와 복합체화된 핵산처럼 네이키드 핵산으로서 도입될 수 있거나, 또는 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스)에 의해 송달될 수 있다.
FIX 도너는 일반적으로 그것의 발현이 통합 부위에서 내인성 프로모터에 의해 추진되도록 삽입된다(예를 들어, 도너가 환자의 결핍 FIX(F9) 유전자좌에 삽입될 경우 내인성 FIX 프로모터). 그러나, 도너는 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 통합시 기능 FIX 단백질의 발현을 추진하는 구성성 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적(예를 들어, 간 특이적) 프로모터를 포함할 수 있다는 것이 자명할 것이다.
FIX 도너 서열은 선택된 임의의 표적 부위에 특이적으로 통합될 수 있으며, 이로써 종래의 유전자 요법에서 무작위 통합과 관련된 문제들을 제거한다. 특정 구체예에서, 도너 서열은 혈우병 B를 가진 환자에서 결핍을 보정하기 위해서 내인성 FIX 유전자좌에 통합된다. 다른 구체예에서, FIX 도너 서열은 세이프 하버 유전자좌, 예를 들어 CCR5 유전자좌, AAVS1 유전자좌 등에 통합된다.
또한, 발현에 필요하지는 않지만, 외래 서열은 또한 전사 또는 번역 조절 서열들, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩티드를 암호화하는 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다.
송달
뉴클레아제, 이들 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 도너 폴리뉴클레오티드 및 본원에 설명된 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해서 생체내 또는 생체외 송달될 수 있다.
본원에 설명된 것과 같은 뉴클레아제를 송달하는 방법은, 예를 들어 미국특허 제6,453,242호; 제6,503,717호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,607,882호; 제6,689,558호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호에 설명되며, 이들 명세서는 모두 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.
본원에 설명된 뉴클레아제 및/또는 도너 구성물은 또한 징크 핑거 단백질(들) 중 하나 이상을 암호화하는 서열들을 함유하는 벡터를 사용하여 송달될 수 있다. 임의의 벡터 시스템이 사용될 수 있으며, 이들은 제한은 아니지만, 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭시바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터 등을 포함한다. 또한, 전문이 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호를 참조한다. 또한, 이들 벡터들 중 어느 것은 치료에 필요한 서열들 중 하나 이상을 포함할 수 있음이 자명할 것이다. 따라서, 하나 이상의 뉴클레아제 및 도너 구성물이 세포에 도입될 때, 뉴클레아제 및/또는 도너 폴리펩티드는 동일한 벡터 상에 또는 상이한 벡터 상에 보유될 수 있다. 다수의 벡터가 사용될 경우, 각 벡터는 하나 또는 다수의 뉴클레아제 및/또는 도너 구성물을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
종래의 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법은 세포(예를 들어, 포유류 세포) 및 표적 조직에 뉴클레아제 및 도너 구성물을 암호화하는 핵산을 도입하는데 사용될 수 있다. 비바이러스 벡터 송달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포솜 또는 폴록사머와 같은 송달 부형제와 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 송달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이들은 세포에 송달 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 가진다. 이들 결합 단백질을 포함하는 유전자 조작된 DNA-결합 단백질 및 융합 단백질의 생체내 송달에 관해서는, 예를 들어 Rebar (2004) Expert Opinion Invest. Drugs 13(7):829-839; Rossi et al., (2007) Nature Biotech. 25(12):1444-1454는 물론, 일반적인 유전자 송달 참고자료들로서 Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175(1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154(1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995); Haddada et al., Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfier and Bohm (eds.) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)를 참조한다.
핵산의 비바이러스 송달 방법은 전기천공, 리포펙션, 마이크로인젝션, 바이오리스틱스, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 폴리양이온 또는 지질:핵산 콘쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 제제-증진 흡수를 포함한다. 또한, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용한 소노포레이션이 핵산의 송달에 사용될 수 있다.
추가의 예시적인 핵산 송달 시스템들은 Amaxa Biosystems(Cologne, 독일), Maxcyte, Inc.(Rockville, 메릴랜드), BTX Molecular Delivery Systems(Holliston, 메사츄세츠) 및 Copernicus Therapeutics Inc.에 의해 제공된 것들을 포함한다(예를 들어, US 6008336 참조). 리포펙션은, 예를 들어 미국특허 제5,049,386호; 제4,946,787호; 및 제4,897,355호에 설명되며, 리포펙션 시약은 시중 판매된다(예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오티드의 유효한 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Feigner, WO 91/17424, WO 91/16024의 것들을 포함한다.
면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Crystal, Science 270:404-410(1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); U.S. Pat. Nos. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028 및 4,946,787 참조).
추가의 송달 방법은 EnGeneIC 송달 비히클(EDV)로 송달될 핵산의 포장의 사용을 포함한다. 이들 EDV는 항체의 한쪽 팔은 표적 조직에 대해 특이성을 갖고, 나머지 팔은 EDV에 대해 특이성을 갖는 이중 특이적 항체를 사용하여 표적 조직에 특이적으로 송달된다. 이 항체는 EDV를 표적 세포 표면으로 데려가며, 다음에 EDV는 세포내이입에 의해 세포에 있게 된다. 일단 세포에 있게 되면 그 내용물이 방출된다(MacDiarmid et al., (2009) Nature Biotechnology 27(7):643 참조).
유전자 조작된 ZFP를 암호화하는 핵산의 송달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 체내의 특정 세포에 표적화하고, 이 바이러스 페이로드를 핵에 수송하는 고도로 진화된 과정들을 이용한다. 바이러스 벡터는 환자에 직접 투여될 수 있거나(생체내), 또는 이들은 세포를 시험관내 치료하는데 사용될 수 있으며, 변형된 세포가 환자에 투여된다(생체외). ZFP의 송달을 위한 종래의 바이러스 기반 시스템은, 제한은 아니지만, 유전자 송달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련, 벡시니아 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터들을 포함한다. 숙주 게놈 내에 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스 유전자 송달 방법에 의해 가능하며, 주로 삽입된 트랜스젠의 장기간 발현을 가져온다. 추가로, 많은 상이한 세포 종류와 표적 조직에서 높은 형질도입 효율이 관찰되었다.
레트로바이러스의 향성은 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장시키는 외래 외피 단백질을 통합함으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포들을 감염시키거나 형질도입할 수 있고, 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의존한다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6-10kb의 외래 서열에 대한 포장 용량을 가진 시스 작용하는 긴 말단 반복부들로 이루어진다. 최소한의 시스-작용 LTR이면 벡터의 복제 및 포장에 충분하고, 이어서 이것을 사용하여 표적 세포에 치료 유전자를 통합해서 영구적인 트랜스젠 발현을 제공한다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 및 이들의 조합에 기반한 것들을 포함한다(예를 들어, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176: 58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT US94/05700 참조).
일시적 발현이 바람직한 용도에서, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 종류에서 매우 높은 형질도입 효율이 가능하며, 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 사용하여 높은 발현 역가 및 높은 발현 수준이 얻어졌다. 이 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 다량으로 생성될 수 있다. 또한, 아데노-관련 바이러스("AAV") 벡터는, 예를 들어 핵산 및 펩티드의 시험관내 생성에서, 그리고 생체내 및 생체외 유전자 요법 과정에 있어서 표적 핵산으로 세포를 형질도입하는데 사용된다(예를 들어, West et al., Virology 160:38-47(1987); 미국특허 제4,797,368호; WO9324641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994) 참조). 재조합 AAV 벡터의 구성은 미국특허 제5,173,414호; Tratschin et al., Mol Cell Biol 5:3251-3260 (1985); Tratschin et al., Mol Cell Biol 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)를 포함하는 다수의 간행물에 설명된다.
적어도 여섯 가지의 바이러스 벡터 접근법이 임상 시험에서 유전자 전달을 위해 현재 이용될 수 있으며, 이들은 헬퍼 셀라인에 삽입된 유전자에 의해 결함 벡터를 보상하여 형질도입제를 생성하는 것을 포함하는 접근법을 이용한다.
pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에서 사용되었던 레트로바이러스 벡터의 예들이다(Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN은 유전자 요법 시험에서 사용된 최초의 치료 벡터였다(Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). MFG-S 포장된 벡터에서는 50% 이상의 형질도입 효율이 관찰되었다(Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20(1997); Dranoff et al, Hum. Gene Ther. 1 :111-2 (1997).
재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV)는 결함성 및 비병원성 파보바이러스 아데노-관련 타입 2 바이러스에 기반한 유망한 대안적 유전자 송달 시스템이다. 모든 벡터는 트랜스젠 발현 카세트의 측면에 위치된 AAV 145bp 도치된 말단 반복부들만을 보유한 플라스미드로부터 유래된다. 형질도입된 세포의 게놈에 통합됨으로 인한 효과적인 유전자 전달 및 안정적인 트랜스젠 송달은 이 벡터 시스템의 중요한 특징이다(Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 AAVrh.1O를 포함하는 다른 AAV 혈청혈들 및 임의의 신규 AAV 혈청형이 또한 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
복제-결함 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)는 높은 역가로 생성될 수 있고, 다수의 상이한 세포 종류들을 쉽게 감염시킨다. 대부분의 아데노바이러스 벡터들은 트랜스젠이 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 치환하도록 유전자 조작되며, 이어서 복제-결함 벡터가 결실된 유전자 기능을 트랜스 공급하는 사람 293 세포에서 증식된다. Ad 벡터는 간, 신장 및 근육에서 발견되는 것들과 같은 비분열, 분화된 세포를 포함하여 다수의 종류의 조직을 생체내 형질도입할 수 있다. 종래의 Ad 벡터는 큰 보유 용량을 가진다. 임상 시험에서 Ad 벡터의 사용예는 근육내 주사에 의한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오티드 요법을 수반했다(Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). 임상 시험에서 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 추가의 사용예는 Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)을 포함한다.
포장 세포는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 포장하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 포장하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터들은 일반적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자에 포장하는 프로듀서 셀라인에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 포장 및 숙주에의 후속 통합에 필요한 최소한의 바이러스 서열을 함유하며(적용가능한 경우), 다른 바이러스 서열들은 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트에 의해 치환된다. 빠진 바이러스 기능은 포장 셀라인에 의해 트랜스 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용된 AAV 벡터는 전형적으로 단지 AAV 게놈으로부터 포장 및 숙주 게놈에의 통합에 필요한 도치된 말단 반복부(ITR) 서열만을 지닌다. 바이러스 DNA는 셀라인에 포장되며, 이것은 나머지 AAV 유전자들, 즉 rep 및 cap를 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만, ITR 서열은 결여한다. 이 셀라인은 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 유의한 양으로 포장되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열처리에 의해 감소될 수 있다.
많은 유전자 요법 용도에서, 유전자 요법 벡터는 특정 조직 종류에 대한 높은 특이도로 송달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 바이러스의 외부 표면 상에 바이러스 코팅 단백질과의 융합 단백질로서 리간드를 발현함으로써 주어진 세포 종류에 대해 특이성을 갖도록 변형될 수 있다. 리간드는 관심의 세포 종류 상에 존재한다고 알려진 수용체에 대해 친화력을 갖도록 선택된다. 예를 들어, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751(1995)은 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스가 gp70에 융합된 사람 헤레굴린을 발현하도록 변형될 수 있으며, 이 재조합 바이러스는 사람 내피 성장인자 수용체를 발현하는 특정한 사람 유방암 세포를 감염시킨다는 것을 보고했다. 이 원리는 다른 바이러스-표적 세포 쌍들로 확장될 수 있으며, 표적 세포는 수용체를 발현하고, 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. 예를 들어, 사상형 파지는 사실상 임의의 선택된 세포 수용체에 대해 특이적 결합 친화력을 갖는 항체 단편(예를 들어, FAB 또는 Fv)을 나타내도록 유전자 조작될 수 있다. 상기 설명은 주로 바이러스 벡터에 적용되지만, 동일한 원리가 비바이러스 벡터에도 적용될 수 있다. 이러한 벡터들은 특이적 표적 세포에 의한 흡수를 선호하는 특이적 흡수 서열을 함유하도록 유전자 조작될 수 있다.
유전자 요법 벡터는, 하기 설명된 대로 전형적으로 전신 투여(예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해 개별 환자에 투여함으로써 생체내 송달될 수 있다. 또는 달리, 벡터는 개별 환자로부터 외식된 세포(예를 들어, 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검물) 또는 보편적인 조혈줄기세포와 같은 생체외 세포에 송달될 수 있으며, 이후 벡터가 통합된 세포를 선택한 후에 세포가 환자에 재이식된다.
또한, 뉴클레아제 및/또는 도너 구성물을 함유하는 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포솜 등)는 생체내 세포 형질도입을 위해 생물에 직접 투여될 수 있다. 또는 달리, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 혈액 또는 조직 세포와 궁극적으로 접촉하도록 분자를 도입하는데 통상 사용되는 경로들 중 어느 것에 의하며, 이들은 제한은 아니지만, 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함한다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법들이 이용될 수 있으며, 당업자에게 잘 알려져 있고, 특정 조성물의 투여를 위해 한 가지 이상의 경로가 사용될 수 있지만, 주로 특정 경로가 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본원에 설명된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, FIX-암호화 및/또는 뉴클레아제-암호화)의 도입에 적합한 벡터는 비통합형 렌티바이러스 벡터(IDLV)를 포함한다. 예를 들어, Ory et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al., (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al., (1998) J. Virol. 72: 9873-9880; Follenzi et al., (2000) Nature Genetics 25:217-222; 미국 특허공개 No. 2009/054985를 참조한다.
제약학적으로 허용되는 담체는 투여될 특정 조성물, 및 조성물의 투여에 사용되는 특정 방법에 의해 일부 결정된다. 따라서, 하기 설명된 대로 이용가능한 제약 조성물의 광범한 적합한 제형들이 있다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989 참조).
뉴클레아제-암호화 서열 및 도너 구성물은 동일한 또는 상이한 시스템을 사용하여 송달될 수 있다는 것이 자명할 것이다. 예를 들어, 도너 폴리뉴클레오티드는 플라스미드에 의해 운반될 수 있고, 하나 이상의 뉴클레아제는 AAV 벡터에 의해 운반될 수 있다. 또한, 상이한 벡터들은 동일한 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다(근육내 주사, 꼬리 정맥 주사, 다른 정맥내 주사, 복강내 투여 및/또는 근육내 주사). 벡터들은 동시에 또는 어떤 순차적 순서로 송달될 수 있다.
따라서, 본 명세서는 FIX-암호화 서열의 뉴클레아제-매개 통합을 통한 혈우병 B의 생체내 또는 생체외 치료를 포함한다. 조성물은 혈청, 간 또는 표적 세포에서 치료 FIX 폴리펩티드의 원하는 농도를 얻을 수 있는 유효한 양으로 사람 환자에 투여된다. 투여는 폴리뉴클레오티드가 원하는 표적 세포에 송달되는 임의의 수단에 의해서 행해질 수 있다. 예를 들어, 생체내 및 생체외 방법이 모두 고려된다. 간문맥 정맥에의 정맥내 주사가 바람직한 투여 방법이다. 다른 생체내 투여 방식은, 예를 들어 간엽 또는 담도에 직접 주사 및 간동맥을 통한 것을 포함하는 간 원위부에 정맥내 주사, 간 실질에 직접 주사, 간동맥을 통한 주사, 및/또는 담도를 통한 역방향 주사를 포함한다. 생체외 투여 방식은 절제된 간세포 또는 간의 다른 세포의 시험관내 형질도입 후, 형질도입된 절제된 간세포를 사람 환자의 간문맥 맥관구조, 간 실질 또는 담도에 다시 주입하는 것을 포함한다. 예를 들어, Grossman et al., (1994) Nature Genetics, 6:335-341를 참조한다.
투여될 뉴클레아제(들) 및 FIX 도너의 유효량은 환자마다 그리고 관심의 치료 폴리펩티드에 따라서 변할 것이다. 따라서, 유효량은 조성물을 투여하는 의사에 의해 가잘 잘 결정되며, 적절한 용량이 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 통합 및 발현을 위한 충분한 시간을 허용한 후(전형적으로 예를 들어 4-15일), 치료 폴리펩티드의 혈청 또는 다른 조직 수준의 분석 및 투여 전 초기 수준과의 비교는 투여된 양이 너무 적은지, 올바른 범위 내인지, 또는 너무 높은지 결정할 것이다. 초기 및 후속 투여를 위한 적합한 섭생법도 역시 가변적이지만, 초기 투여 후 필요하다면 후속 투여가 이어지는 것으로 전형화된다. 후속 투여는 일간에서부터 연간 내지는 몇 년마다의 범위에서 다양한 간격으로 투여될 수 있다. 당업자는 적절한 면역억제 기법이 송달 벡터의 면역억제에 의한 형질도입의 저해 또는 차단을 피하기 위해서 권장될 수 있는 것을 인정할 것이다. 예를 들어, Vilquin et al., (l995) Human Gene Ther., 6:1391-1401을 참조한다.
생체외 및 생체내 투여를 위한 제형은 액체 상태의 현탁액 또는 에멀젼화된 액체를 포함한다. 활성 성분들은 주로 제약학적으로 허용되며 활성 성분과 양립되는 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이들의 조합을 포함한다. 또한, 조성물은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정제 또는 제약 조성물의 효능을 증진시키는 다른 시약 등 소량의 보조 물질을 함유할 수 있다.
다음의 실시예들은 뉴클레아제가 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함하는 본 명세서의 예시적인 구체예들에 관한 것이다. 이것은 단지 예시를 위한 것이며, 다른 뉴클레아제들, 예를 들어 유전자 조작된 DNA-결합 도메인을 가진 귀소성 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제) 및/또는 유전자 조작된 귀소성 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제) DNA-결합 도메인과 이종성 절단 도메인 또는 TALEN의 자연 발생한 융합체들도 사용될 수 있다는 것이 인정될 것이다.
실시예
실시예
1
FIX
특이적
ZFN
및 표적 통합을 위한 이들의 사용
유전자 질환을 치료하기 위한 전략으로서 유전자 전달은 다양한 질환의 동물 모델에서 성공적으로 수행되었으며, 최근 인체에도 적용되었다(예를 들어, Aiuti et al, (2009) N. Engl. J. Med. 360: 447-458; Maguire et al, (2009) N. Engl. J. Med. 358: 2240-2248; Carrier et al, (2009) Science 326: 818-823 참조). 유전자 표적화가 세포외 배양된 ES-유사 유도된 다능성 줄기세포를 보정하는데 사용되었지만(Hanna et al., (2007) Science 318:1920-1923), 대부분의 유전자 질환은 생체외 조작이 현재 불가능한 장기 시스템에 미치고 있다. 한 이러한 장기는 간인데, 이것은 혈액 응고 인자를 포함하는 혈장 단백질 합성의 주요 부위이다. 간 유전자 요법을 위한 모델인 유전자 질환은 F9 유전자에 의해 암호화되는 혈액 응고 인자 IX(FIX)의 결핍에 의해 야기되는 혈우병 B이다. F9 인트론 1에 야생형 엑손 2-8의 표적 통합(TI)은 엑손 1에 의한 야생형 코딩 서열의 스플라이싱을 허용하며(도 1a), 이것은 야생형 FIX의 발현 및 대부분의 F9 돌연변이에 의해 야기되는 결함의 구제를 가져온다. 따라서, 우리는 야생형 F9 엑손 2-8을 지닌 표적화 벡터와 조합된 ZFN이 생체내에서 유전자 표적화를 유도하여 간세포의 게놈 내에서 돌연변이된 F9 유전자를 원위치 보정할 수 있는지 조사하기로 했다.
사람 F9 인트론 1을 표적화하는 ZFN 쌍들을 사용하여 특정한 표적 부위에서 DSB를 유도하는 이들 ZFN의 능력을 시험했다. 표적 부위의 PCR-증폭 후 DSB 빈도의 하한 추정을 제공하는 미스매치 검출 효소 Cel-I(Yang et al, (2000) Biochemistry 39, 3533-3541)를 사용해 삽입 및 결실(삽입결실)을 정량하는 Cel-I 분석(Surveyor™, Transgenomics. Perez et al,(2008) Nat. Biotechnol. 26: 808-816 및 Guschin et a\, (2010) Methods Mol Biol. 649:247-56)이 사용되었다. ZFN 발현 벡터의 트랜스펙션 후 3일 뒤에 게놈 DNA를 DNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 K562 세포로부터 분리했다. hF9 인트론1의 Cel-1 분석을 위한 프라이머는 N2 For(TCGGTGAGTGATTT GCTGAG, SEQ ID NO:l) 및 N2 Rev(AACCTCTCACCTGGCCTCAT, SEQ ID NO:2)였다. hF9 유전자의 인트론 1을 표적화하는 최고 활성 ZFN 쌍이 N2로 지정되었고, 하기 표 1에 나타낸다(또한 미국 특허공개 No. 20110027235 참조):
두 ZFN의 코딩 서열들 사이에 Thosea asigna 바이러스로부터의 2A 링커를 삽입하고, 이 카세트를 CMV 프로모터의 하류에 삽입하여 세포 배양물 트랜스펙션을 위한 N2 ZFN 발현 플라스미드를 구성했다. 사람 K562 세포에 N2 ZFN 쌍을 트랜스펙션했을 때 N2 표적 부위 대립형질들의 30%가 절단되었음이 발견되었다(도 1c). DSB를 유도함으로써 상동성 재조합을 자극하는 N2 ZFN의 능력을 시험하기 위해서 우리는 NheI 제한 부위를 삽입하는 표적화 벡터와 함께 K562 세포에 N2 ZFN을 공-트랜스펙션했다(도 1d). PCR에 의해 K562 게놈 DNA로부터의 상동체의 좌우 팔을 증폭하여 NheI 도너 플라스미드를 구성했다. NheI 제한 부위를 함유하는 짧을 서열을 이어서 상동체의 좌우 팔 사이에 도입했다. 트랜스펙션 후 3일 및 10일째에 각각 대립형질들 중 14% 및 12%가 NheI 절단에 민감해졌음이 발견되었으며(도 1e), 이것은 상동성 재조합을 통한 유효한 비율의 표적 통합(TI)을 시사한다.
실시예
2
사람 혈우병의
생체내
뮤린
모델
N2 표적 부위는 hF9 인트론 1에는 존재하지만, 뮤린 F9 유전자에는 존재하지 않는다. 따라서, N2 ZFN을 생체내 시험하기 위해서 우리는 혈우병 B의 인간화된 마우스 모델을 생성했다. 우리는 간-특이적 프로모터의 제어하에 hF9 미니-유전자(도 2a)를 구성했다(Shen et al., (1989) DNA 8: 101-108 및 Miao et al., (2000) Mol. Ther. 1:522-532). hF9 인트론 1의 TI를 위한 프라이머는 N2 TI For(GGCCTTATTTACA CAAAAAGTCTG, SEQ ID NO:14) 및 N2 TI Rev(TTTGCTCTAACTCCTGTTATCCATC, SEQ ID NO: 15)였다.
이 구성물의 인트론 1은 사람 N2 표적 부위를 함유한다(랜딩 패드, LP). 이 LP 구성물에서 F9 서열의 나머지는 이미 확인된 넌센스 돌연변이(Y155stop)를 의태하며(Thompson et al., (1989) Hum. Genet. 94:299-302), FIX 촉매 도메인을 암호화하는 엑손들에 앞선 조숙 중단 코돈이 순환 FIX 단백질의 부재를 가져온다. LP 구성물은 유전자 합성(Genscript)에 의해 구성되었고, pUC57 플라스미드에 리게이션되었다. 다음에, LP 구성물에 SwaI 절단을 수행하고, 재조합효소-매개 카세트 교환(RCME)(Taconic-Artemis)과 상용성인 FLP 재조합효소 부위들 사이의 전용 플라스미드의 SwaI 부위에 리게이션하여 LP KI 플라스미드를 만들었다. LP KI 플라스미드와 FLP 재조합효소 발현 플라스미드(Taconic-Artemis)를 ROSA26 유전자좌에서 RCME에 상용성인 FLP 재조합 부위들을 함유하는 B6S6F1 배아줄기(ES) 세포에 트랜스펙션했다(Zambrowicz et al., (1997) Proc Natl Acad Sci 94:3789-3794). 정확히 표적화된 B6S6F1-LP ES 세포 클론들을 서던 블롯에 의해 확인했고, B6D2F1 배반포에 주사했다. 순수한 ES 세포 유래된 B6S6F1-LP 마우스(G0)를 자연수태에 의해 출산했고, 키메라인 새끼들을 야생형 C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratories)와 5 세대(생체내 절단 실험) 또는 7-10 세대(생체내 TI 실험)까지 역교배시켰다.
LP 마우스들은 프라이머 LP Oligo 1(ACTGTCCTCTCATGCGTTGG, SEQ ID NO:16), LP Oligo 2(GATGTTGGAGGTGGCATGG, SEQ ID NO:17), wtROSA Oligo 1(CATGTCTTTAATCTA CCTCGATGG, SEQ ID NO:18), 및 wtROSA 01igo2(CTCCCTCGTGATCTGCAACTCC, SEQ ID NO: 19)를 사용하여 유전자형화되었다(도 2b). 또한, 우리는 LP 마우스를 뮤린 F9 유전자가 결실된 기존의 마우스 모델(Lin et al, (1997) Blood 90, 3962-3966)과 교배시켜 LP/HB 마우스를 생성했고, N2 ZFN 활성을 생체내 시험했다.
HB 마우스는 C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratories)와 >10 세대까지 역교배되었다. C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratories)를 LP-네가티브 TI 실험에 사용했다. 예상된 대로 LP 마우스는 검출 가능한 순환 hFIX를 갖지 않았다(도 2c). 혈장 hFIX의 정량을 hFIX ELISA 키트(Affinity Biologicals)를 사용하여 수행했으며, 표준 곡선은 모집한 정상 사람 혈장((Trinity Biotech)으로부터 얻었다. 표준 곡선의 마지막 값(15ng/mL) 아래의 모든 값들에는 임의로 검출 한계인 15ng/mL의 값이 주어졌다. hFIX ELISA를 위한 혈장은 헤파린화 모세관 튜브에 후안와 채혈하여 얻었다.
실시예
3
FIX
-특이적
ZFN
의
생체내
표적 송달
N2 ZFN을 FIX 생성의 정상 부위인 간에 송달하기 위해서 우리는 간-특이적 인핸서 및 프로모터로부터 N2 ZFN을 발현하는 혈청형 8(AAV8-N2)인 간친화성 아데노 결합 바이러스 벡터를 생성했다(Shen et al., 상동 및 Miao et al., 상동)(도 2d).
N2 ZFN의 절단 활성을 생체내 시험하기 위해서 우리는 1e11 v.g. AAV8-N2 발현 벡터를 사용하여 LP 마우스에 꼬리 정맥 주사를 수행했고, 주사 후 7일째에 간 DNA를 분리했다. LP의 PCR-증폭 및 Cel-I 분석은 LP 대립형질들 중 34-47%가 절단되었음을 입증했다(도 2e). LP 구성물의 Cel-I를 위한 프라이머는 LP N2 For(CTAGT AGCTGACAGTACC, SEQ ID NO:20) 및 LP N2 Rev(GAAGAACAGAAGCCTAATTATG, SEQ ID NO: 21)였다.
실시예
4
도너
핵산과
FIX
-특이적
ZFN
의
생체내
공-송달
LP 구성물의 인트론 1에 스플라이스 어셉터(SA)가 앞서 있는 야생형 엑손 2-8의 삽입은 엑손 1에 의한 야생형 코딩 서열의 스플라이싱을 허용한다(도 3a). LP 마우스에서 돌연변이된 F9 유전자를 원위치 보정하기 위해서 우리는 유전자 표적화를 위한 AAV 도너 주형 벡터(AAV-도너)를 생성했으며, 상동성의 팔들이 "SA-야생형 hF9 엑손 2-8" 카세트의 측면에 위치한다(도 3a). 이 도너 벡터 생성 플라스미드는 PCR에 의해 LP 마우스 게놈 DNA로부터 상동성의 좌우 팔들을 증폭함으로써 구성했다. "스플라이스 어셉터-엑손 2-8 코딩 서열-소 성장 호르몬 폴리A 신호" 카세트를 pAAV-hFIX16 플라스미드로부터 PCR 증폭에 의해 얻었고(Manno et al., (2006) Nat. Med. 12:342-347), 상동성의 좌우 팔들 사이에 리게이션했다. HR은 세포 주기의 S/G2 기들 동안 선호되므로, 우리는 N2 및 도너 벡터를 빠르게 증식하는 간세포들이 세포 주기 진행 동안 S/G2로 진입하는 신생아 마우스에 송달했다.
우리는 생존 2일째에 AAV-N2(5e10 v.g) 단독(n=1), AAV-N2(5e10 v.g)+AAV-도너(2.5e11 v.g)(n=5) 또는 AAV-Mock(5e10 v.g)+AAV-도너(2.5e11 v.g)(n=5)를 LP/HB 마우스에 주사했다. Mock 벡터에서 N2 ZFN은 레닐라 루시페라제에 의해 치환되었다.
생존 10주째에 마우스를 죽여서 간 DNA를 분리해서 두 가지 별도의 PCR 전략을 사용하여 도너의 TI에 대해 분석했다. 첫 번째 전략은 표적화된 LP 대립형질에 대해서 작은 앰플리콘을 생성하고, 표적화되지 않은 LP 대립형질에 대해서 큰 앰플리콘을 생성하는 프라이머들을 사용한다(도 3a, 프라이머 P1/P2). 두 번째 전략은 표적화된 LP 대립형질에 대해서 큰 앰플리콘을 생성하고, 표적화되지 않은 LP 대립형질에 대해서 작은 앰플리콘을 생성하는 프라이머들을 사용하는 것을 포함한다(도 3a, 프라이머 P1/P3). LP 구성물의 TI를 위한 프라이머는 P1(ACGGTATCGATAAGCTTGAT ATCGAATTCTAG, SEQ ID NO:22), P2(CACTGATCTCCATCAACATACTGC, SEQ ID NO:23), 및 P3(GAATAATTCTTTAGTTTTAGCAA, SEQ ID NO:24)였다.
두 PCR 분석을 수행했을 때 우리는 N2+도너를 받은 마우스에서만 TI의 증거를 발견했다(도 3b). 밴드 강도의 정량은 1-7% TI 빈도를 시사했다(도 3b).
게놈 보정이 순환 hFIX의 생성을 가져오는지 결정하기 위해 우리는 생존 2일째에 LP 마우스에 AAV-N2 단독(n=7), AAV-Mock+AAV-도너(n=6), 또는 AAV-N2+AAV-도너(n=7)를 주사했다(상기와 동일한 벡터 용량). N2 단독 또는 Mock+Donor를 받은 마우스에 대한 혈장 hFIX 수준은 평균 15ng/mL 미만이었고(이 분석의 검출 하한), N2+Donor를 받은 마우스는 평균 116-121ng/mL(정상의 2-3%에 해당)였는데(도 4a), 이것은 N2 단독 및 Mock+Donor를 받은 마우스보다 상당히 더 높은 값이다(모든 시점에서 p<0.006, 2-테일드 티-테스트).
안정적인 게놈 보정을 확인하기 위해서 우리는 부분 간절제술(PHx)을 수행했으며, 이로써 간세포가 간 재생 동안 증식함에 따라 여분의 염색체 에피솜들은 희석되고 상실된다(Nakai et al., (2001) J. Virol. 75:6969-6976)(도 4a, b). 부분 간절제술은 이미 설명된 대로 수행되었고(Mitchell and Willenbring, (2008) Nat. Prot 3:1167-1170), 모든 동물 과정은 Children's Hospital of Philadelphia IACUC에 의해 승인되었다. N2+Donor-치료된 마우스에서 hFIX 수준의 측정값은 간절제술 후 간 재생 후에도 그대로였으며, 이것은 안정적인 보정을 시사한다. N2 단독 또는 Mock+Donor를 받은 대조군 마우스는 간절제술 후에도 여전히 평균 15ng/mL 미만이었고(도 4a), 이것은 N2+Donor를 받은 마우스보다 상당히 더 낮은 값이다(모든 시점에서 p<0.004, 2-테일드 티-테스트). hFIX 발현이 LP-특이적이었고, 게놈에의 무작위 도너 통합의 결과가 아니었음을 보증하기 위해 우리는 생존 2일째에 LP 트랜스젠을 결여한 야생형 마우스에 AAV-N2 단독(n=8), AAV-Mock+AAV-도너(n=6), 또는 AAV-N2+AAV-도너(n=9)를 주사했다(상기와 같은 벡터 용량). N2 단독, Mock+Donor, 및 N2+Donor를 받은 마우스에 대한 혈장 hFIX 수준은 각각 평균 15, 19 및 27ng/mL미만이었으며, 이것은 N2+Donor를 받은 LP 마우스에서 hFIX 발현이 대부분 LP-특이적 보정으로부터 생긴 것이었음을 시사한다(도 4c).
hFIX 수준이 HB 표현형을 보정하기에 충분했는지 결정하기 위해서 우리는 생존 2일째에 LP/HB 마우스에 AAV-N2 단독(n=10), AAV-Mock+AAV-도너(n=9) 또는 AAV-N2+AAV-도너(n=9)(상기와 동일한 벡터 용량)를 주사했다. N2만을 받은 마우스에 대한 혈장 hFIX 수준은 역시 평균 15ng/mL 미만이었다. Mock+Donor를 받은 마우스는 평균 25ng/mL 미만이었고, N2+Donor를 받은 마우스는 hFIX 수준이 상당히 더 높았는데(Mock+Donor와 비교하여 모든 시점에서 p<0.04, 2-테일드 티-테스트), 평균 166-354ng/mL였다(정상 순환 수준의 3-7%)(도 4d). 우리는 hFIX mRNA에 대한 RT-PCR에 의해 간-특이적 hFIX 발현을 확인했다(도 4e). 냉동된 마우스 조직으로부터 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen) 및 RNase-프리 DNase 키트(Qiagen)를 사용하여 분리했다. cDNA 합성을 iSCRIPT 키트(Bio-Rad)를 사용하여 수행했다. hFIX 전사체에 대한 RT-PCR을 프라이머 hFIX Gen1 For(ACCAGCAGTGCCATTTCCA, SEQ ID NO:25) 및 hFLX Genl Rev(GAATTGACCTGGTTTGGCATCT, SEQ ID NO:26)를 사용하여 수행했다.
HB 표현형이 보정되었는지의 여부를 분석하기 위해서 우리는 혈우병에서 현저히 연장되는 피브린 응혈 형성의 반응속도학의 척도인 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)을 측정했다. aPTT는 모집한 HB 사람 혈장과 aPTT 시약을 샘플 혈장과 1:1:1 혼합하여 수행했다. 25mM 염화칼슘을 가하여 응혈 형성을 개시했다. aPTT용 혈장은 시트르산 나트륨에 9:1로 꼬리 채혈하여 얻었다. 야생형 마우스(n=5)와 HB 마우스(n=12)에 대한 평균 aPTT는 각각 36초 및 67초였다(도 4f). Mock+Donor를 받은 마우스(n=3)는 평균 60초였고, N2+Donor를 받은 마우스(n=5)는 aPTT가 상당히 단축되어 평균 44초였다(Mock+Donor와 비교하여 p=0.0014, 2-테일드 티-테스트)(도 4f).
실시예
5
성체 동물에서 유전자 조작된 뉴클레아제와
도너의
생체내
공-송달
다음에, 신생아에 대해 상기 설명된 대로 사람 FIX LP에서 성체 동물에 게놈 편집을 행했다. 성체 LP 마우스를 6주째에 1e11 v.g./마우스 AAV-N2 단독('ZFN 단독'), 1e11 v.g./마우스 AAV-N2 및 5.5e11 v.g./마우스 AAV-도너('ZFN+Donor') 또는 1e11 v.g./마우스 AAV-Mock 및 5.5e11 v.g. AAV-도너('Mock+Donor')를 사용하여 정맥내 주사로 치료했다. 도 5a에 나타낸 데이터는 그룹당 약 20마리 마우스를 가지고 수행한 3회의 실험을 대표한다. 이들 실험에서 야생형 hFIX 수준은 약 1000 ng/mL였다. 유사하게, 도 5b는 6주령째에 1e11 v.g./마우스 AAV-N2 단독('ZFN 단독'), 1e11 v.g./마우스 AAV-N2 및 5.5e11 v.g./마우스 AAV-도너('ZFN+Donor') 또는 1e11 v.g./마우스 AAV-Mock 및 5.5e11 v.g. AAV-도너('Mock+Donor')를 정맥내 주사한 후 성체 LP 마우스에서 혈장 hFIX 수준을 나타낸 그래프이다. 주사 2일 후에 도 5b의 그룹들은 부분 간절제술을 받았다. 나타낸 데이터는 그룹당 약 20마리 마우스를 가지고 수행한 3회의 실험을 대표한다. 이들 실험에서 야생형 hFIX 수준은 약 1000ng/mL였다. 이 데이터는 부분 간절제술이 뒤따르든 아니든 성체 마우스에 제공되었을 때 hFIX 발현이 안정적이라는 것과 성체 동물에서 게놈 편집을 수행하는 것이 가능함을 입증한다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허출원 및 간행물들은 전문이 참고자료로 본원에 포함된다.
본 명세서는 명확한 이해의 목적을 위해 예시 및 예로서 일부 상세히 제공되었지만, 본 명세서의 정신이나 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화 및 변형이 실시될 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 전술한 설명들 및 예들은 제한으로서 해석되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING
<110> THE CHILDREN'S HOSPITAL OF PHILADELPHIA
<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING HEMOPHILIA B
<130> 8325-0083.40
<140> PCT/US2011/056020
<141> 2011-10-12
<150> 61/392,333
<151> 2010-10-12
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 1
tcggtgagtg atttgctgag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 2
aacctctcac ctggcctcat 20
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
tgacacagta cctggcacca tagttgta 28
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 4
Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 5
Arg Ser Asp Val Leu Ser Glu
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 6
Asp Arg Ser Asn Arg Ile Lys
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 7
Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 8
Gln Asn Ala Thr Arg Ile Asn
1 5
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
gtactagggg tatggggata aaccagac 28
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 10
Arg Ser Asp Ser Leu Ser Val
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 11
Thr Ser Gly His Leu Ser Arg
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 12
Arg Ser Asp His Leu Ser Gln
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 13
His Ala Ser Thr Arg His Cys
1 5
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 14
ggccttattt acacaaaaag tctg 24
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 15
tttgctctaa ctcctgttat ccatc 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 16
actgtcctct catgcgttgg 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 17
gatgttggag gtggcatgg 19
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 18
catgtcttta atctacctcg atgg 24
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 19
ctccctcgtg atctgcaact cc 22
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 20
ctagtagctg acagtacc 18
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 21
gaagaacaga agcctaatta tg 22
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 22
acggtatcga taagcttgat atcgaattct ag 32
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 23
cactgatctc catcaacata ctgc 24
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 24
gaataattct ttagttttag caa 23
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 25
accagcagtg ccatttcca 19
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 26
gaattgacct ggtttggcat ct 22
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown: "LAGLIDADG"
family peptide
<400> 27
Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly
1 5
Claims (15)
- 유전자 조작된 징크 핑거 단백질 DNA-결합 도메인을 포함하는 단백질로서, DNA-결합 도메인은 N-말단에서부터 C-말단까지 F1 내지 F4 또는 F1 내지 F5의 순서로 4개 또는 5개의 징크 핑거 인식 영역을 포함하며,
(i) DNA-결합 도메인이 5개의 징크 핑거 인식 영역을 포함할 때, F1 내지 F5는 다음의 아미노산 서열을 포함하고:
F1: QSGDLTR (SEQ ID NO:4)
F2: RSDVLSE (SEQ ID NO:5)
F3: DRSNRIK (SEQ ID NO:6)
F4: RSDNLSE (SEQ ID NO:7)
F5: QNATRIN (SEQ ED NO:8);
(ii) DNA-결합 도메인이 4개의 징크 핑거 인식 영역을 포함할 때, F1 내지 F4는 다음의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
F1: RSDSLSV (SEQ ID NO:10)
F2: TSGHLSR (SEQ ID NO:11)
F3: RSDHLSQ (SEQ ID NO:12)
F4: HASTRHC (SEQ ID NO:13). - 제 1 항에 있어서, 야생형 또는 유전자 조작된 절단 도메인 또는 절단 하프도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 단백질 또는 제 3 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 세포.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 세포의 게놈에 기능 인자 IX(FIX) 단백질을 암호화하는 서열을 통합하여 상기 세포를 포함하는 피험자에서 혈우병 B를 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제 5 항에 있어서, 서열은 내인성 유전자에 통합되는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제 6 항에 있어서, 내인성 유전자는 FIX 유전자 및 세이프 하버 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제 5 항에 있어서, 세포는 간세포이고, 서열은 무손상 동물의 간에 정맥내 투여, 복강내 투여, 간 실질에 직접 주사, 간동맥에 주사, 또는 담도를 통한 역방향 주사에 의해 세포에 송달되는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 5 항에 있어서, 피험자는 배, 태아, 신생아, 유아, 소아 또는 성인으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 삭제
- 삭제
- 제 5 항에 있어서, 세포는 사람 세포, 비사람 영장류 세포, 설치목 세포, 토끼목 세포, 식육목 세포 및 소목 세포, 및 배아줄기세포, 조혈줄기세포, 유도된 다능성 줄기세포, 간세포 또는 간줄기세포와 같은 줄기세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질.
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