JP2018518181A - 血液細胞系列の細胞に機能的ポリペプチドを導入するためのCRISPR/Cas9複合体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図10
Description
CRISPR/Cas9で強化された遺伝子置換によるSCIDの修正
JanusファミリーのキナーゼJAK3遺伝子の変異は、重症複合免疫不全症(SCID)の原因となる。ヒトJAK3欠損の特徴は、循環T細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞の不存在と、数は正常だが機能不良であるB細胞(T−B+NK−)である。本明細書で示すように、SCID患者特異的人工多能性幹細胞(iPSC)及びT細胞インビトロ分化システムにより、JAK3欠損細胞の初期のT細胞の発生が完全に阻害されることが明らかになった。CRISPR/Cas9で強化された遺伝子置換による新型JAK3変異の修正により、広範なT細胞受容体(TCR)のレパートリーを有する成熟T細胞集団の生成を含む正常なT細胞発生が回復する。修正済み細胞の全ゲノム配列決定によると、CRISPR/Cas9のオフターゲットの修飾はないことが示されている。したがって、本明細書では、ヒトリンパ球新生を研究する新規のアプローチ、及び免疫不全を有するヒトにおける遺伝子置換療法の方法を提供する。
ヘルシンキ宣言にしたがい機関審査委員会の承認を得た試験に男性患者が登録された。免疫不全に関する家族病歴は陰性であった。この患者は生後8か月の間、体重がなかなか増加せず、下痢をし、再発性細気管支炎もあって、たびたび入院した。生後8か月で重症の呼吸促迫及び鵞口瘡で入院した。気管支肺胞洗浄の気管支鏡検査で、細菌生物(pseudomonas, H flu, S. pneumonia)及びウイルス生物(呼吸器多核体ウイルス)が判明した。免疫評価で重度の低ガンマグロブリン血症が判明し、IgE<3、IgA<4、IgG=29、IgM=26であった。末梢血の免疫表現型決定によると、CD3+T細胞及びNK細胞は完全に不存在だったが、B細胞は存在していた(B細胞の絶対数=875)。マイトジェン検査では、コンカナバリンA、ポークウィード・マイトジェン、及びフィトヘマグルチニンAに対し完全に無応答であることが判明した。遺伝子検査によると、ホモ接合のJAK3遺伝子のエキソン14におけるC>Tヌクレオチド置換により、アミノ酸の613番目の位置でアルギニンコドン(CGA)がストップコドン(TGA)で置換されており、SCIDの診断が裏付けられた。これは、このJAK3バリアント(rs149316157)をSCIDの臨床事例と結びつける初の報告である。この患者は、低強度の条件適合非近縁骨髄移植を受け、現在は治療を中止して2年になるが免疫は完全に再構成され、元気に暮らしている。
iPSC誘導のため、5x104個の初代ケラチノサイトを6ウェルプレートの1つのウェルに播種した。その翌日、ケラチノサイトを1mLのウイルス上清液及び最終濃度4μg/mLのポリブレンを含有する1mLのヒトケラチノサイト培地で形質導入した。このケラチノサイトに800xgで45分間スピンフェクトした(1日目)。この形質導入手順を翌日も繰り返した。3日目に新鮮なヒトケラチノサイト培地に換えて、細胞をさらに2日培養した。5日目にケラチノサイトをトリプシン処理し、マイトマイシンCで処理したマウス胎仔線維芽細胞(MEF)を予め播種した10cmの皿に移し、ヒトケラチノサイト培地で培養した。7日目にヒトES培地に換え、同じ皿で3〜4週間継続して細胞を培養した。ES培地は毎日取り換えた。iPSCコロニーとなるものが2〜3週間で見えてきた。これらのコロニーを個別に選抜してMEFで増殖させて分析した。組み込まれているレンチウイルス配列及び多シストロン配列を除去するために、iPSCをCre発現アデノウイルス(rAd−Cre−IE)に感染させた。個々のコロニーを選抜し、loxPが導入された(floxed)配列がCre媒介によって除去されたかどうかを、プライマーgctaattcactcccaaagaagacaag(配列番号5)及びcttcagcaagccgagtcctg(配列番号6)を用いてPCRで検証した。
手順は以前に説明されている(Chang et al., “Broad T−cell receptor repertoire in T−lymphocytes derived from human induced pluripotent stem cells,” PloS one 9, e97335 (2014))。この方法は、以下の修飾で用いられた。6ウェルプレートの1つのウェル中のhiPSC培養物を、Ohnuki et al(Ohnuki M, “Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol Chapter 4: Unit 4A 2 (2009))で説明されているようにCTK溶液で処理して、小さい細胞塊を作った。次にこの細胞塊を、10%FBS、1Xペニシリン/ストレプトマイシン、及び100μMモノ−チオグリセロールを含有するα−MEMベースの培地中、2日目のOP9細胞を予め播種した10cmプレートに移した。培地は1日おきに取り換え、細胞を継代なしで18日間培養した。共培養18日後、細胞を解離液(α−MEM培地中0.15%コラゲナーゼIV及び0.015%ヒアルロニダーゼ)で約30分かけて処理し、さらに30分0.25%トリプシンで処理して採取した。次いでCD34+細胞を抗CD34+磁気ビーズ(MicroBead Kit;Miltenyi Biotec社、独国ベルギッシュグラートバッハ)で精製した。T細胞に分化させるため、これらのCD34+細胞をOP9−DL4細胞上でプレート培養し、20%FBS、5ng/mL hFlt3−L、5ng/mL hIL−7、及び10ng/mL hSCFを含有するα−MEM培地で培養した。培地は1日おきに取り換え、細胞を4日おきに新しいOP9−DL4プレートに移した。
インビトロでhiPSCから誘導したT細胞をCD3/28ビーズ(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド)と一緒にメーカーのプロトコルにしたがって3日間インキュベーションして刺激した後に、先述されている(Chang et al., 2014)ようにフローサイトメトリー分析した。
細胞を採取し洗ってから、LSRFortessa細胞分析器(BD Bioscience社、カリフォルニア州サンノゼ)で分析した。ヨウ化プロピジウム(PI、Sigma−Aldrich社、ミズーリ州セントルイス)で細胞表面を染色して死細胞を排除した。アポトーシスアッセイは、まず、採取した細胞を細胞表面抗体で30分かけて染色した。1XPBSで一度洗った後、AnnexinV−647(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド)及びPIを含有する100μLのAnnexin Binding Buffer(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド)に細胞を再懸濁させ、15分間インキュベーションした後、PIと一緒に400μLのAnnexin Binding Bufferを加えた。特に断らない限り、抗体はBD Biosciences社から入手したものである:CD3(Percp−Cy5−5、クローンUCHT1)、CD4(PE−Cy7、クローンSK3)、CD7(APC、BV510、クローンM−T701)、CD8(APC−Cy7、クローンSK1)、CD16(PE、クローンB73.1)、CD25(FITC、クローン2A3)、CD34(PE−Cy7、クローンWM59)、CD43(PE、クローン1G10)、CD56−PE(クローンMY31)、CD69(FITC、クローンL78)、NKG2D−PE(クローン1D11)、TCR−αβ(FITC、PE、クローンT10B9.1A−31)、TCR−Vδ1−FITC(Fisher Scientific社、ペンシルバニア州ピッツバーグ、クローンTS8.2)、TCR−Vδ2−PE(クローンB6)、TCRVγ9−FITC(クローンB3)、TNF−α−PE−Cy7(クローンMAB11)、Beta Mark TCR Repertoire Kit(Beckman Coulter社、ジョージア州アトランタ)。
多シストロン性OSKMベクターが以前に説明されている(Chang et al.,”Polycistronic lentiviral vector for “hit and run” reprogramming of adult skin fibroblasts to induced pluripotent stem cells,” Stem cells 27: 1042−1049 (2009))。Lenti−hDL4−mCherryプラスミドが、PCR増幅ヒトDL4 cDNA(Open Biosystems社、コロラド州ラファイエット)、IRES断片(Open Biosystems社)、及びmCherry cDNAを、EF1αプロモーターを含んでいるレンチウイルスベクター(pDL171)にクローニングすることによって作製された。PCR反応はPrimeStarポリメラーゼ(Takara社、マウンテンビュー)を用いて実施した。
iPSCを、1X非必須アミノ酸、1Xペニシリン−ストレプトマイシン、1XL−グルタミン(すべてニューヨーク州コーニングのMediatech社から入手)、20%KnockOut Serum Replacement(Invitrogen社)、2−βME(Sigma社)、及び5〜10ng/mL bFGF(Invitrogen社)が添加されたDMEM F−12からなるES細胞培地中、マイトマイシンCで処理したE14.5 CF−1胚由来MEF上で培養した。ヒト初代ケラチノサイトをDermaLife K Medium Complete Kit(LifeLine Cell Technology社、メリーランド州フレデリック)中で培養した。OP9細胞はATCCから購入し、20%FBS及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むα−MEM培地で増殖させた。hDL4及びmCherryを含むレンチウイルスを用いてOP9細胞に形質導入することによってOP9−DL4細胞を樹立した。
レンチウイルスを調製するために、10μgのレンチウイルスベクター、2.5μgのエンベローププラスミド(pMDG)、及び7.5μgのパッキングプラスミド(pCMBVdR8.9.1)をFugene6(Roche社、ニュージャージー州ナットリー、またはPromega社、ウィスコンシン州マディソン)により5x106個の293T細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクションの2日後、ウイルス含有上清液を回収して0.45μmフィルターを通した。
iPSCを5分間0.25%トリプシンで処理して単一細胞懸濁物を生成した。1XPBSで2回洗った後、100万〜200万個の細胞を5μgのJAK3修復プラスミド及び5μgのpX330−JAK3またはpX335−JAK3プラスミドと混合してヌクレオフェクションし(Human Stem Cell Nucleofector Kit、プログラムA−023、Lonza社、ジョージア州アルファレッタ)、MEF上でプレート培養した。2〜4日後、薬物耐性コロニーを選択するため30μg/mLのG418を含有するhES培地をプレートに加えた。これらのコロニーを3〜4週間後に選抜し、ゲノムDNAを抽出するために増殖させた。PCR遺伝子型解析では、5’プライマーセット(tgctaaagcgcatgctccagact(配列番号24)及びgtcttcatctcagggtcggct(配列番号25)及び3’プライマーセット(cctctctgtgcattatggcag(配列番号26)及びgccttctatcgccttcttg(配列番号27))を用いた。Neo選択マーカーを除去するために、hiPSCをCre発現アデノウイルス(rAd−Cre−IE)に感染させた。
インビトロで誘導した細胞からTrizol試薬(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド)を用いて全RNAを単離した。Superscript First−strand Synthesis System(Invitrogen社)をメーカーの指示にしたがい使用して、0.5〜2μgの全RNAを用いてcDNAを合成した。qPCRは、SYBR Green PCR Master Mix(Life Technologies社、カリフォルニア州カールスバッド)をメーカーの指示にしたがい使用した。qPCRで用いたプライマーセットはGAPDH(F:actcctccacctttgacgct(配列番号28)、R:tcccctcttcaagggtctacatg(配列番号29));PU.1(F:gtgcaaaatggaagggtttc(配列番号30)、R:ggagctccgtgaagttgttc(配列番号31));GATA3(F:tgtttcctttcactggccaca(配列番号32)、R:aacggcaactggtgaacggta(配列番号33));BCL11B(F:ggcgatgccagaatagatgccg(配列番号34)、R:ccaggccacttggctcctctatctccaga(配列番号35));RAG1(F:ccttactgttgagactgcaatatcc(配列番号36)、R:ctgaagtcccagtatatacttcacac(配列番号37));RAG2(F:cccagaagcagtaataatcatcgag(配列番号38)、R:atgtgggatgtagtagatcttgc(配列番号39));pTa(F:gggtcttacctcagcagttac(配列番号40)、R:cctcacacagtgtgacgcag(配列番号41));BCL2(F:gactgagtacctgaaccggc(配列番号42)、R:gggccaaactgagcagagtc(配列番号43));BAX(F:aagaccagggtggttgggac(配列番号44)、R:gtaagaaaaatgcccacgtc(配列番号45));及びJAK3(F:agtcagacgtctggagcttc(配列番号46)、R:gtgagcagtgaaggcatgagtc(配列番号47))であった。全ての値をGAPDH発現に対し標準化した。
iPSCからのDNAをCovaris S2 Focused−ultrasonicatorによりせん断した。マイクロチューブに入れた試料130μLを、周波数掃引モードでデューティーサイクル10%、強度4、200サイクル/バーストで、40秒サイクルに2回供した。Agilent 2100 BioanalyzerによるDNAチップ(DNA 1000 Kit;Agilent Technologies社、カリフォルニア州サンタクララ)の分析によると、平均断片サイズは400bpであった。ライブラリの調製は、NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina(NEB#E7370)を用いて実施し、ライブラリの最終濃度をKAPA Illumina Library Quantification Kit(KK4835;KAPA Biosystems社、マサチューセッツ州ウィルミントン)及びApplied Biosystems ViiA 7 Real−Time PCR System(Life Technologies社)を用いてqPCRで決定した。配列決定クラスターは、Illumina TruSeq PE Cluster Kit v3− cBot− HS(PE−401−3001)及びIllumina cBotを用いてフローセルで生成した。WGSをIllumina TruSeq SBS Kit v3−HS−200サイクル(FC−401−3001)及びIllumina HiSeq 2500アップグレードを用いて実施し、生物情報学的分析用に2x100のシングルインデックスのペアエンドリードを生成した。候補のオフターゲット部位を、EMBOSS fuzznucソフトウェア(v6.6.0.0)(Rice et al., “EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite,” Trends in Genetics : TIG 16: 276−277 (2000))を用いてCRISPR/Cas9ガイド配列をhg19基準ゲノムとアラインメントし、また最大3つのミスマッチを許容することによって、特定した。第1のガイド配列(GTGAGATACAGATACAGACA)(配列番号48)については1193部位を、第2のガイド配列(AATGATTTGCCTGGAATGCC)(配列番号49)については257部位を予測した。各試料についてのWGSの全リードをBWA(v0.7.5a)memアルゴリズム(Li and Durbin, “Fast and accurate long−read alignment with Burrows−Wheeler transform,” Bioinformatics 26: 589−595 (2010))を用いてhg19基準ゲノムにマッピングし、重複リードはPicardツール(v1.100)(http://picard.sourceforge.net)により除去した。部分的(ローカル)リアラインメントと塩基クオリティ再較正はGATK(v2.7−2)(McKenna et al., “The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next−generation DNA sequencing data,” Genome research 20: 1297−1303 (2010))を用いた。GATK HaplotypeCallerを用いてSNVとindelとをコールした。さらに、GATK Best Practicesの説明にしたがいSNVとindelを別々に再較正し、クオリティー・フィルターを適用した。4つのiPSC試料の全てに共通する基準ゲノムからのバリアントはCRISPR/Cas9オフターゲット分析から除外した。除外されなかったバリアントはBedtools(v2.17.0)(Quinlan and Hall, “BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features,” Bioinformatics 26: 841−842 (2010))を用いてスクリーニングして、これらが候補オフターゲット部位に該当するかどうかを決定した。分析によると、これらのバリアントはどれもオフターゲット部位に存在せず、これらの変異はランダムに蓄積したことが示唆された。次に、低アレル頻度(<1%、dbSNP 138)の機能的バリアント全て(除外されたもの及び除外されなかったもの)をANNOVARソフトウェア・パッケージにより注釈付けし、HGMD及びClinVar(v20140902)中の疾患との既知の関連についてスクリーニングした。さらに、高CADDスコア(CADD>=20)でヒットしたもの全てを、GWAS Catalog及びCOSMIC(v70)を用いて複合疾患との関連についてもスクリーニングした。確認されている疾患関連のバリアントは、照会したデータベース内には見当たらなかった。特筆すべきは、JAK3 C1837T(p.R613X)変異も疾患との関連は確認されなかったが、SNP(rs149316157)は、GERPスコアが3.85、CADDスコア(CADD phred様スコア)が38と、かなり有害(deleterius)であると予測されることである。したがって、JAK3 C1837Tバリアントが初めてSCIDの臨床事例と関連づけられた。
WGSデータに関しては、受託番号SRP056149でNCBI SRAデータベースへのアクセスが可能である。
ホモ接合のJAK3遺伝子のエキソン14におけるC>Tヌクレオチド置換を有するSCID患者の皮膚ケラチノサイトからiPSCを生成した(Chang et al., 2009)。この変異により、CGAコドン(613番目のアルギニン)がTGAストップコドン(p.R613X)で置き換えられる。上述したように、生後4か月の患者がT−B+NK−臨床表現型であった。このSCID表現型がインビトロで再現可能かどうかを決定するために、患者特異的iPSCからTリンパ球への2ステップのOP9及びOP9−DL4システム(Chang et al., 2014)を用いての分化を試みた。JAK3欠損iPSCは正常ドナー由来のコントロールiPSCと同等の率で増殖し、これらのiPSCはOP9ストローマ細胞の単層上で高効率でCD34+造血前駆細胞(HP)へと分化した。しかし、JAK3欠損iPSC由来のCD34+HPをOP9−DL4ストローマ単層上でプレート培養すると、T細胞分化はコントロールと比較して不存在であった(図1)。CD3+T細胞もCD3−CD16+CD56+NK細胞も観察されず(図1A)、CD4+CD8+ダブル陽性(DP)、CD4+シングル陽性(SP)、またはCD8+シングル陽性(SP)T細胞も検出されなかった(図1B)。Jak3ノックアウト(KO)マウスは、増殖性TCRの再編成前のCD4−CD8−ダブル陰性(DN)段階で胸腺細胞の分化が阻害されるため胸腺が小さい。ヒトのJAK3変異を原因とする発生障害をさらに理解するために、JAK3欠損細胞のT細胞分化系列決定及び成熟を正常JAK3 WTコントロールと比較して検定した。iPSC由来CD34+細胞をOP9−DL4単層上でプレート培養し、細胞を採取して、T細胞誘導(TD)14日目、21日目、28日目、及び35日目にリンパ球マーカーについて分析した(図4A)。正常コントロールでは、TD14に1〜2X106個のCD34+細胞から1.2X107個のCD7+細胞(リンパ系ゲートで計測した細胞の84%)が生成された。T細胞マーカーCD4、CD8、CD3、及びTCRαβをT細胞成熟後、順次検出した。TD35には集団の50%超がCD8 SP細胞であった。JAK3欠損細胞では、TD14に1〜2X106個のCD34+細胞から生成されたCD7+細胞は4.5X104個だけだった(リンパ系ゲートで計測した細胞の38.9%)。CD7+細胞の数は連続培養の間減少し、T細胞マーカーCD3、CD4、CD8、及びTCRαβの発現は有意ではなかった。初期T細胞前駆細胞(ETP)からCD4−CD8−(DN)段階、CD4+CD8+(DP)段階への移行は、特定の転写因子の正確な活性化及び抑制によって導かれる。コントロール細胞では、PU.1のサイレンシング、ならびにGATA3及びBCL11Bの誘導(図1C)が、これらの細胞が細胞T分化系列決定の開始へと進み(DN2からDN3)、その後TCR再編成が生じることを示唆している。一方、JAK3欠損細胞では、PU.1が蓄積しGATA3及びBCL11Bのレベルが低下する(図1C)。これらのデータから、ヒトJAK3欠損細胞のDN2段階でのまたはその前の停止が示唆されるが、これはJak3 KOマウスでT細胞が死滅する段階と類似している。興味深いことに、ヒトJAK3欠損細胞はTCR再編成を実施するのに十分なRAG1、RAG2、及びPTCRAを発現し得る(図1C)が、この重要な発生段階に至るまで細胞が生存しない。JAK3欠損細胞のリンパ球発生におけるこのような重大な欠陥は、リンパ系前駆細胞の生存及び分化において重要な役割を果たすIL−7シグナル伝達の不在で説明することができる。IL−7/JAK3シグナル伝達は、アポトーシス制御因子のBCL2ファミリーを制御することにより胸腺細胞のホメオスタシスを維持している。Jak3 KOからの胸腺細胞と末梢T細胞は、一部には、アポトーシス促進因子BAXの選択的上昇、及び抗アポトーシス因子BCL2の発現低下により、高アポトーシス指標を有する。同様に、これらの研究では、インビトロで誘導したヒトJAK3欠損細胞のアポトーシスは、コントロールと比較して、TD10(9%対2.2%)及びTD17(7%対1.9%)時点の増加(図2A)。この表現型と同様に、JAK3欠損細胞ではコントロールと比較してBAXレベルが増加し、BCL2レベルが低下した(図2B)。γc欠損マウスでは、強制的にBcl2を発現させるとT細胞は救済されるが、B細胞やNK細胞の発生は救済されない(Kondo et al., Immunity 7: 155−162 (1997))。Jak3 KOマウスにBcl2を発現するJak3 KO骨髄細胞を移植しても末梢T細胞数は改善する(Wen et al., Molecular and cellular biology 21: 678−689 (2001))。BCL2の過剰発現がヒトJAK3欠損細胞のT細胞発生障害を救済するかどうかを決定するために、インビトロで誘導されたJAK3欠損CD34+細胞に、EF1aプロモーターによって誘導されたBCL2−2A−GFP多シストロンを含むレンチウイルスで形質導入した。形質導入後、CD34+細胞をOP9−DL4単層上でプレート培養し、TD28にNK細胞及びT細胞のマーカーを検定した。GFP−細胞(JAK3−;低BCL2)にもGFP+細胞(JAK3−;BCL2+)にもCD3−CD16+CD56+NK細胞は見られなかった(図2C)。これらの知見は、BCL2がJAK3欠損細胞のDN段階で阻害物を放出したことを示唆している。興味深いことに、第2の発生停止がDP段階で明らかになり、GFP+細胞ではCD8+CD4+DP陽性細胞のさらなる分化は観察されなかった(図2C)。要約すると、上述した研究は、ヒトSCID表現型は患者由来iPSCを用いてインビトロで再現できることを実証している。JAK3欠損の結果、DN胸腺細胞で増殖障害が生じる。強制的なBCL2の発現によりDN細胞の生存率が高まり、さらにDP胸腺細胞へと分化する。ところが、DP胸腺細胞は、成熟してSP T細胞になることはできず、IL7/JAK3シグナル伝達の不在がこの障害の原因となっている可能性がある。
JAK3欠損SCID患者の細胞で正常なT細胞発生が回復できるかどうかを決定するために、iPSCにおけるJAK3変異をCRISPR/Cas9で強化された遺伝子置換により修正した。エキソン14の上流及び下流のイントロン内の6つのガイドRNAを、C1837T変異付近のwtCas9またはnCas9を標的とするように設計し、遺伝子置換用に修正テンプレートを用いた(図3A)。iPSCに、D10A Cas9ニッカーゼ及びペアガイドRNAを発現する2つのプラスミド、または野生型Cas9及び単一ガイドRNAを発現する1つのプラスミドを用いてヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクション後、細胞をG418含有培地で2週間培養した。個々のコロニーを選抜し、増殖させ、PCRで遺伝子型を決定した(図3Bの上段)。CRISPR/Cas9が媒介するJAK3遺伝子修正の効率を図3Cに示す。WT Cas9+gRNA#1からの3クローン、WT Cas9+gRNA#2からの3クローン、及びCas9ニッカーゼ+ペアgRNA#1及び#2からの6クローンをSanger配列決定によりさらに検証した。配列決定された12クローンのうち、2つのホモ接合修正済みクローン(Cas9ニッカーゼ+ペアgRNA#1及び#2からの1クローン、ならびにWT Cas9+gRNA#1からの1クローン)及び10のヘテロ接合修正済みクローンについて特定した(図3D)。JAK3遺伝子発現の回復がRT−PCR(JAK3 mRNA)(図3Bの左下パネル)及びウエスターンブロット(JAK3タンパク質)(図3Bの右下)により示された。
オフターゲットなCRISPR/Cas9特異的(directed)ゲノム修飾の可能性が、このアプローチのヒト治療への応用に関する問題となっている。癌細胞株では、Cas9−gRNAによる比較的高レベルのオフターゲットな変異原性が記述されている。ヒトSCID iPSCにおけるCRISPR/Cas9特異的JAK3修正の特異性を決定するために、遺伝子置換の前と後に全ゲノム配列決定を行った。修正済みの2つのヘテロ接合クローン及び1つのホモ接合クローンのゲノム配列を決定した。2つのヘテロ接合クローンはgRNA#2+野生型Cas9を用いて修正され、ホモ接合クローンはgRNA#1+gRNA#2+ニッカーゼCas9(D10A)を用いて修正された。可能なオフターゲット部位を特定するために、20塩基のCRISPRガイド配列をヒト基準ゲノムにマッピングし、最高3つのミスマッチを許容した。次にこれらの部位を、CRISPR/Cas9特異的遺伝子置換後のiPSC試料中のバリエーションについて分析した。修正済みの1つのホモ接合及び2つのヘテロ接合iPSC株のWGS分析によると、予測されたオフターゲット部位には変異は(SNVもindelも)導入されていないことが明らかになり、CRISPR/Cas9特異的遺伝子置換の高い特異性が示唆された。
JAK3遺伝子修正後にT細胞発生が回復するかどうかを決定するために、T細胞の分化系列決定及び成熟について検定した。T細胞分化は、CD34+CD7+T/NK決定(committed)段階、CD7+CD4+CD8−未成熟のSP段階、CD4+CD8+DP段階、そして最終的なCD3+CD8+TCRαβ成熟段階と、インビボで観察される各中間体を順次通過していく。成熟T細胞はポリクローナルであり、増殖し、マイトジェンに応答してサイトカインを分泌する。したがって、JAK3修正済みhiPSCを、OP9単層上で造血前駆細胞へと分化させ、CD34+細胞を抗CD34磁気ビーズで陽性選択した。これらの細胞をOP9−DL4単層上でプレート培養し、被接着細胞のリンパ球マーカーに関してTD14、21、28、及び35に分析した(図4)。TD14に、コントロール細胞と同様、1〜2X106個のCD34+JAK3修正済み細胞は4.7X106個のCD7+細胞へと分化した(リンパ系ゲートで計測した細胞の91%)。さらにTD21、TD28、及びTD35と分化した後、T細胞成熟マーカーCD3、CD4、CD8、及びTCRαβが潤沢に観察された(図4A)。TCR再編成がJAK3修正済みT細胞で再樹立されたかどうかを決定するために、フローサイトメトリーによりTCR Vβタイピングを行った。これを図4Bに要約する。JAK3修正済みT細胞は、発明者らが試験した(25のうち19の)すべてのVβセグメントを発現した。したがって、広範なTCRレパートリーが回復した。最後に、JAK3修正済みT細胞において、T細胞機能の代理となるTCRシグナル伝達経路の完全性を、抗CD3/CD28刺激後の細胞表面活性化マーカーを測定して評価した。刺激後3日目、JAK3修正済みT細胞ではCD3+CD25+CD69+T細胞の割合がコントロール細胞で観察された増加(0.01%から37.6%)と同様に、0.68%から59.7%に増加した(図4C)。これらのデータ及び上述の結果は、インビトロiPSCモデルシステムにおけるCRISPR/Cas9で強化された遺伝子置換によるJAK3 C1837T(p.R613X)変異の修正によって、広範なTCRレパートリーを有する、機能的な成熟T細胞集団を生産する能力のある正常なT細胞発生が回復することを明らかにするものである。
CRISPR/Cas9で強化された遺伝子置換による、鎌状赤血球貧血に関連する変異の修正
ベクターの作製
N末端とC末端両方の核局在配列(nls−Cas9−nls)を有するヒトコドン最適化S.pyogenes Cas9を、px330ベクター(Addgene ID:42230)からN末端にHis6−SUMOタグが付いた修飾済みpET−28b(EMD Biosciences社)ベクターにPCRでクローン化した。短いリンカーペプチド、次いで純電荷+36の超荷電GFP、及び23アミノ酸のインフルエンザウイルスヘマグルチニンHA−2バリアントペプチドINF7(GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG)(配列番号50)を含む遺伝子ブロック・カセットをE. coli用にコドン最適化し、合成し(IDT DNA)、nls−Cas9−nlsのC末端と融合するようにクローン化した。HIV−TATペプチド(YGRKKRRQRRRPPQ))(配列番号51)をコードする配列も合成し(IDT DNA)、nls−Cas9−nlsのN末端と融合するようにクローン化した。
pET−SUMO−scCas9プラスミドをE. coli株Rosetta(商標)2(DE3)細胞(EMD Millipore社、マサチューセッツ州ビレリカ)にLB培地中で形質転換させた。細胞を、37℃で、600nmで光学密度0.6に達するまで増殖させた。タンパク質過剰発現の誘導は、0.5mMイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を加え、シェーカー内で一晩18℃で培養することにより、得られた。採取した細胞をNi結合バッファー(20mM Tris−HCl pH8.0、1.5M NaCl、25mMイミダゾール及び0.2mM TCEP)に再懸濁させ、Emulsiflex C3高圧ホモジナイザー(Avestin社)で溶解させた。最終濃度0.4%のポリエチレンイミン(PEI)を澄んだライセートに加えて、核酸を沈降させた。次いで、遠心分離後の上清液のタンパク質を硫酸アンモニウムで沈降させてPEIを除去し、Ni結合バッファーに再溶解させた。タンパク質はまずHisTrapニッケル親和性カラム(GE Healthcare社)で精製した後、一晩4℃でSUMOプロテアーゼUlp1により消化させた。次に、切断されたHis−SUMOタグを第2のHisTrapカラムにより除去した。しかしscCas9タンパク質を含有するフローはNaClの最終濃度が0.5Mになるまで希釈し、HiTrapヘパリンカラム(GE Healthcare社)で、20mM Tris−HCl pH8.0、2.0M NaCl、及び0.2mM TCEPを含むバッファーを用いて勾配溶出して精製した。溶出したscCas9タンパク質を、サイズ排除カラムSuperdex20016/600(GE Healthcare社)でゲルろ過バッファー(20mM Tris−HCl pH8.0、0.5M NaCl、及び0.2mM TCEP)中さらに精製し、0.22μmフィルターを通して滅菌し、Amicon Centrifugal Unit(EMD Millipore社)により100kDaカットオフで濃縮した。濃縮したタンパク質はUV分光光度計で定量化し、液体窒素で急速冷凍した。
sgRNA転写のテンプレートDNAを、T7プロモーター及びポリA配列を付加したプライマーセットを用いてPCRで生成した。sgRNAは、T7 Ribomax発現システム(Promega社、ウィスコンシン州マディソン)をメーカーの使用説明にしたがって使用して、T7 RNAポリメラーゼによりインビトロで転写された。転写されたRNAをフェノールで精製し、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿の後、MEGAclear(商標)Transcription Clean−Up Kit(Ambion社、テキサス州オースティン)でカラム精製した。精製したgRNAをUV分光光度計で定量化し、−80℃の冷凍庫に保存した。
一本鎖DNA(ssODN)ドナーを、以下に示すようにIDT DNAにより合成した。
ヒト鎌状赤血球貧血患者iPSCを、皮膚線維芽細胞から誘導し、ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するmTeSR(商標)1培地(Stem Cell Technologies社、カナダ、バンクーバー)中、Matrigel(BD)上で維持した。
最終濃度1倍となるように1/10倍体積の10xPBSをsgRNAに加えた。sgRNAをPCRサーモ・サイクラーで、温度を95℃から4℃に徐々に下げながら、アニーリングした。アニーリング後、scCas9タンパク質をsgRNAにタンパク質:RNAのモル比1:1.5で加え、全ての一過的な沈殿物がなくなるまでチューブを軽くはじいて素早く混合した。混合物を室温で10分間、暗所でインキュベートした。次に、1モル比量のssODNをこの混合物に加え、さらに10分間暗所でインキュベートして、scCas9−sgRNA−ssODN複合体を形成した。
scCas9−sgRNA−ssODN複合体をヌクレオフェクションした細胞を、prepGEM組織DNA抽出試薬(ZyGEM社、ニュージーランド国ハミルトン)をメーカーの使用説明にしたがって使用し、水で1:3に希釈して、溶解させた。22μlのddPCR反応物中、11μlの2xddPCR mix(Bio−rad社)を各1ulの5μM アレル特異的FAMまたはVIC Taqmanプローブ(以下に示す)、各0.2μlの100μMのフォワード及びリバースプライマー、ならびに8.6μlの希釈ゲノムDNAと混合した。QX200 Droplet Generator(Bio−rad社、カリフォルニア州ハーキュリーズ)をメーカーの使用説明にしたがって使用して、液滴を生成した。次にこの反応混合物を96ウェルのPCRプレートに移し、標準サーマルサイクラー(Bio−rad社)でPCRを実施した。PCRのプログラムは、ステップ1:95℃で10分;ステップ2:95℃で30秒;ステップ3:55℃で1分;ステップ2〜3を39回繰り返す;ステップ4:98℃で10分;ステップ5:8℃ホールド、であった。PCRが終了すると、プレートをQX200 Droplet Reader(Bio−rad社)で分析した。
配列番号1
TAACGGCAGACTTCTCCAC
配列番号2
GTAACGGCAGACTTCTCCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
配列番号3
Cas9超荷電GFPコンストラクト
mdykdhdgdykdhdidykddddkmapkkkrkvgihgvpaadkkysigldigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggdkrpaatkkagqakkkkgsgsngssgsaskgerlfrgkvpilvelkgdvnghkfsvrgkgkgdatrgkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypkhmkrhdffksampkgyvqertisfkkdgkyktraevkfegrtlvnriklkgrdfkekgnilghklrynfnshkvyitadkrkngikakfkirhnvkdgsvqladhyqqntpigrgpvllprnhylstrsklskdpkekrdhmvllefvtaagikhgrderyk
配列番号4
TAT−Cas9超荷電GFPコンストラクト
ygrkkrrqrrrppqaggsmdykdhdgdykdhdidykddddkmapkkkrkvgihgvpaadkkysigldigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggdkrpaatkkagqakkkkgsgsngssgsaskgerlfrgkvpilvelkgdvnghkfsvrgkgkgdatrgkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypkhmkrhdffksampkgyvqertisfkkdgkyktraevkfegrtlvnriklkgrdfkekgnilghklrynfnshkvyitadkrkngikakfkirhnvkdgsvqladhyqqntpigrgpvllprnhylstrsklskdpkekrdhmvllefvtaagikhgrderykggsggsvdglfeaiegfiengwegmidgwyg
Claims (29)
- 腫瘍特異的T細胞前駆細胞を作製する方法であって、T細胞前駆細胞の集団に、
a.前記T細胞前駆細胞のゲノム内の標的DNAにハイブリダイズする第1のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第2のヌクレオチド配列とを含むガイド(gRNA)と、
b.超荷電タンパク質に機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、前記gRNAの前記第2のヌクレオチド配列と相互作用するRNA結合部分を含み、前記標的DNAに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる、前記組換え部位特異的ヌクレアーゼと、
c.キメラ抗原受容体(CAR)をコードする第3のヌクレオチド配列と、前記標的DNA内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズする第4のヌクレオチド配列とを含むドナー核酸配列とを含む複合体を導入することを含み、
前記複合体は、相同組換え型修復(HDR)及び前記第3のヌクレオチド配列の前記標的DNAへの組込みを許容する条件下で前記T細胞前駆細胞に導入されて、前記CARを発現する修飾済みT細胞前駆細胞を形成する、前記方法。 - 前記細胞は、造血幹細胞及び多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記超荷電タンパク質は、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に機能的に連結されている、請求項1〜請求項3に記載の方法。
- 前記超荷電タンパク質に機能的に連結されている前記組換え部位特異的ヌクレアーゼは、さらに、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に機能的に連結されているトランス活性化転写活性化因子(TAT)ペプチドを含んでいる、請求項1〜請求項4のいずれかに記載の方法。
- 前記超荷電タンパク質は、その対応する未修飾タンパク質よりも大きい全体的に正の電荷を有している、請求項1〜請求項5のいずれかに記載の方法。
- 前記全体的に正の電荷は、約+5〜約+40である、請求項6に記載の方法。
- 前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項1〜請求項7のいずれかに記載の方法。
- 前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する+36GFPである、請求項8に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼはCas9である、請求項1〜請求項9のいずれかに記載の方法。
- gRNAと超荷電タンパク質に機能的に連結された部位特異的ヌクレアーゼとssODNのモル比は、約1:1:1〜約1.5:1:1である、請求項1〜請求項10のいずれかに記載の方法。
- 前記T細胞前駆細胞集団における相同組換え型修復の非相同末端結合に対する割合は、少なくとも約0.5である、請求項1〜請求項11のいずれかに記載の方法。
- 前記複合体は、ヌクレオポレーションにより前記細胞に導入される、請求項1〜請求項12のいずれかに記載の方法。
- 前記T細胞前駆細胞集団の少なくとも5%がHDRにより修飾されて、前記CARを発現する修飾済みT細胞前駆細胞を形成する、請求項1〜請求項13のいずれかに記載の方法。
- さらに、前記修飾済みT細胞前駆細胞を単離することを含んでいる、請求項1〜請求項14のいずれかに記載の方法。
- さらに、前記修飾済みT細胞前駆細胞を培養することを含んでいる、請求項15に記載の方法。
- 前記修飾済みT細胞前駆細胞は、増殖条件下で培養される、請求項16に記載の方法。
- さらに、前記修飾済みT細胞前駆細胞を、前記修飾済みT細胞前駆細胞が前記CARを発現するT細胞へと分化するのを促進するような条件下で培養することを含んでいる、請求項16または請求項17に記載の方法。
- 対象の癌を治療する方法であって、請求項1〜請求項18のいずれかに記載の方法により入手した細胞を前記対象に移植することを含んでいる、前記方法。
- 前記移植は自家移植である、請求項19に記載の方法。
- 腫瘍特異的T細胞前駆細胞を作製するための複合体であって、
a.前記T細胞前駆細胞のゲノム内の標的DNAにハイブリダイズする第1のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第2のヌクレオチド配列とを含むガイド(gRNA)と、
b.超荷電タンパク質に機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、前記gRNAの前記第2のヌクレオチド配列と相互作用するRNA結合部分を含み、前記標的DNAに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる、前記組換え部位特異的ヌクレアーゼと、
c.キメラ抗原受容体(CAR)をコードする第3のヌクレオチド配列と、前記標的DNA内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズする第4のヌクレオチド配列とを含むドナー核酸配列とを含んでいる、前記複合体。 - 前記超荷電タンパク質は、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に機能的に連結されている、請求項21に記載の複合体。
- 前記超荷電タンパク質に機能的に連結されている前記組換え部位特異的ヌクレアーゼは、さらに、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に機能的に連結されているトランス活性化転写活性化因子(TAT)ペプチドを含んでいる、請求項21または請求項22のいずれかに記載の複合体。
- 前記超荷電タンパク質は、その対応する未修飾タンパク質よりも大きい全体的に正の電荷を有している、請求項21〜請求項23のいずれかに記載の複合体。
- 前記全体的に正の電荷は、約+5〜約+40である、請求項24に記載の複合体。
- 前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項21〜請求項25のいずれかに記載の複合体。
- 前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する+36GFPである、請求項26に記載の複合体。
- 前記ヌクレアーゼはCas9である、請求項21〜請求項27のいずれかに記載の複合体。
- gRNAと超荷電タンパク質に機能的に連結された部位特異的ヌクレアーゼとssODNのモル比は、約1:1:1〜約1.5:1:1である、請求項21〜請求項28のいずれかに記載の複合体。
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