ES2598115T3 - Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias - Google Patents

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ES2598115T3 ES15154566.2T ES15154566T ES2598115T3 ES 2598115 T3 ES2598115 T3 ES 2598115T3 ES 15154566 T ES15154566 T ES 15154566T ES 2598115 T3 ES2598115 T3 ES 2598115T3
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Le Cong
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Massachusetts Institute of Technology
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Harvard College
Massachusetts Institute of Technology
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Abstract

Un sistema vector relacionado con Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR)-CRISPR asociado a (Cas) (CRISPR-Cas) de ingeniería, que no está presente en la naturaleza, que comprende uno o más vectores que comprenden: a) un primer elemento regulador unido de manera operable a dos o más secuencias de nucleótidos, que codifican cada una de ellas un ARN guía del sistema CRISPR-Cas que comprende una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia guía, un ARNtracr y una secuencia de emparejamiento tracr, donde cada ARN guía se hibrida con una secuencia objetivo diferente en los sitios de los polinucleótidos en una célula eucariota, b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II, en el que los componentes (a) y (b) están situados en los mismos vectores o diferentes vectores del sistema, en el que el sistema comprende además una o más señales de localización nuclear (las NLS) expresadas con la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cas9, y según lo cual los dos o más ARN guía fijan como objetivo los sitios de polinucleótidos en la célula eucariota y la proteína Cas9 escinde los sitios de polinucleótidos, según lo cual se modifican las secuencias de los sitios de polinucleótidos.

Description

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DESCRIPCION
Ingenierfa de sistemas, metodos y composiciones de gufa optimizadas para manipuladon de secuencias.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere en general a sistemas, metodos y composiciones usados para el control de la expresion de genes que implica fijar como objetivo una secuencia, tal como perturbacion del genoma o edicion de genes, que pueden usar sistemas vector relacionados con Repeticiones Palindromicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR, por sus siglas en ingles) y componentes de los mismos.
Informe en cuanto a investigacion patrocinada federalmente
Esta invencion se realizo con soporte del gobierno otorgado por el Pioneer Award del NIH, Institutos Nacionales de Salud, DP1MH100706. El gobierno tiene ciertos derechos en la invencion.
Antecedentes de la invencion
Los recientes avances en las tecnicas de secuenciacion del genoma y metodos de analisis han acelerado significativamente la capacidad para catalogar y cartografiar factores geneticos asociados a un diverso intervalo de funciones biologicas y enfermedades. Se requieren tecnologfas precisas para fijar como objetivo genoma para permitir la ingenierfa inversa sistematica de variaciones geneticas causales permitiendo la perturbacion selectiva de elementos geneticos individuales, asf como avanzar las aplicaciones de la biologfa sintetica, biotecnologicas y medicas. Aunque estan disponibles tecnicas de edicion de genoma tales como dedos de cinc disenadores, efectores del tipo activador de la transcripcion (los TALE, por sus siglas en ingles) o meganucleasas de migracion para producir perturbaciones del genoma fijado como objetivo, sigue existiendo la necesidad de nuevas tecnologfas de ingenierfa del genoma que tengan un precio asequible, faciles de montar, escalables y susceptibles de fijar como objetivo multiples posiciones dentro del genoma eucariota.
Sumario de la descripcion
Exste una necesidad apremiante de sistemas y tecnicas alternativos y robustos para fijar como objetivo secuencias con una amplia serie de aplicaciones. Esta invencion estudia esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas. El CRISPR/Cas o el sistema CRISPR-Cas (ambos terminos se usan de manera intercambiable por toda esta solicitud) no requiere la generacion de protefnas personalizadas para secuencias especfficas fijadas como objetivo sino mas bien se puede programar una enzima Cas unica mediante una molecula de ARN corta para reconocer un objetivo de ADN especffico, en otras palabras la enzima Cas se puede reclutar para un objetivo de ADN especffico usando dicha molecula de ARN corta. Anadir el sistema CRISPR-Cas al repertorio de tecnicas de secuenciacion del genoma y metodos de analisis puede simplificar de manera significativa la metodologfa y acelerar la capacidad para catalogar y cartografiar factores geneticos asociados a un diverso intervalo de funciones biologicas y enfermedades. Para utilizar el sistema CRISPR-Cas de manera eficaz para editar genoma sin efectos perjudiciales, es crftico comprender aspectos de ingenierfa y optimizacion de estas herramientas de ingenierfa del genoma, que son aspectos de la presente descripcion.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un sistema vector de CRISPR-Cas de ingenierfa, que no esta presente en la naturaleza de acuerdo con la reivindicacion 1. En las reivindicaciones dependientes se describen aspectos adicionales de la invencion. La invencion tambien proporciona los usos del sistema de acuerdo con las reivindicaciones 18 a 20.
En un aspecto, la descripcion proporciona un sistema vector que comprende uno o mas vectores. En algunas realizaciones, el sistema comprende: (a) un primer elemento regulador ligado de manera operable a una secuencia de emparejado tracr y uno o mas sitios de insercion para insertar una o mas secuencias gufa aguas arriba de la secuencia de emparejado tracr, en la que cuando se expresa, la secuencia gufa se dirige a union especffica de secuencias de un complejo CRISPR a una secuencia fijada como objetivo en una celula, por ejemplo, celula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gufa que se hibrida a la secuencia fijada como objetivo y (2) la secuencia de emparejado tracr que se hibrida a la secuencia tracr y (b) un segundo elemento regulador ligado de manera operable a una secuencia codificadora de enzimas que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localizacion nuclear; en el que los componentes (a) y (b) estan situados en los mismos vectores o diferentes del sistema. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende ademas la secuencia tracr aguas abajo de la secuencia de emparejamiento tracr bajo el control del primer elemento regulador. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende ademas dos o mas secuencias gufa ligadas de manera operable al primer elemento regulador, en el que cuando se expresan, cada una de las dos o mas secuencias gufa dirige union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo diferente en una celula eucariota. En algunas realizaciones, el sistema comprende la secuencia tracr bajo el control de un tercer elemento regulador, tal como un activador de polimerasa III. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejado tracr cuando se alinean de manera optima. En algunas realizaciones, el complejo CRISPR comprende una o mas secuencias de localizacion nuclear de suficiente fortaleza para conducir la
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acumulacion de dicho complejo CRISPR en una cantidad detectable en el nucleo de una celula eucariota. Sin desear estar ligados por la teona, se cree que una secuencia de localizacion nuclear no es necesariamente para actividad del complejo CRISPR en eucariotas, sino que incluyendo tales secuencias se mejora la actividad del sistema, especialmente en cuanto a moleculas de acido nucleico fijadas como objetivo en el nucleo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada derivada de estos organismos. La enzima puede ser un homologo u ortologo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es codon-optimizada para expresion en una celula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escision de una o dos hebras en la posicion de la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de actividad de escision de la cadena de ADN. En algunas realizaciones, el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III. En algunas realizaciones, el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II. En algunas realizaciones, la secuencia gma tiene al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleotidos o entre 10-30 o entre 15-25 o entre 15-20 nucleotidos de longitud. En general y por toda esta memoria descriptiva, el termino "vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, moleculas de acido nucleico que son monocatenarias, bicatenarias o parcialmente bicatenarias; moleculas de acido nucleico que comprenden uno o mas extremos libres, ningun extremo libre (por ejemplo, circular); moleculas de acido nucleico que comprenden ADN, ARN o ambos y otras variedades de polinucleotidos conocidos en la tecnica. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en que se pueden insertar segmentos de ADN adicionales, tal como por tecnicas de clonacion molecular clasicas. Otro tipo de vector es un vector vfrico, en el que estan presentes secuencias de ADN o ARN derivadas vfricamente en el vector para empaquetamiento en un virus (por ejemplo, retrovirus, retrovirus de replicacion defectuosa, adenovirus, adenovirus de replicacion defectuosa y virus adenoasociados). Los vectores vfricos tambien incluyen polinucleotidos soportados por un virus para transfeccion a una celula huesped. Algunos vectores son capaces de replicacion autonoma en una celula huesped en que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos con un origen bacteriano de replicacion y vectores de mairufero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mairuferos no episomales) se integran en el genoma de una celula huesped en la introduccion en la celula huesped y se replican de ese modo junto con el genoma huesped. Por otra parte, algunos vectores son capaces de dirigir la expresion de los genes a los que estan unidos de manera operativa. Dichos vectores se refieren en la presente memoria como "vectores de expresion". Los vectores de expresion comunes de utilidad en tecnicas de ADN recombinante estan con frecuencia en la forma de plasmidos.
Los vectores de expresion recombinantes pueden comprender un acido nucleico de la descripcion en una forma adecuada para expresion del acido nucleico en una celula huesped, que significa que los vectores de expresion recombinantes incluyen uno o mas elementos reguladores, que se pueden seleccionar sobre la base de las celulas huesped que se tienen que usar para expresion, que estan unidos de manera operativa a la secuencia de acidos nucleicos que se tiene que expresar. En un vector de expresion recombinante, "unido de manera operable" significa que la secuencia de nucleotidos de interes esta unida al elemento o a los elementos reguladores de una manera que permite la expresion de la secuencia de nucleotidos (por ejemplo, en un sistema de transcripcion/traduccion in vitro o en una celula huesped cuando el vector se introduce en la celula huesped).
Se pretende que el termino "elemento regulador' incluya activadores, potenciadores, sitios de entrada de ribosomas internos (IRES, por sus siglas en ingles) y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de terminacion de la transcripcion, tales como senales de poliadenilacion y secuencias poli-U). Tales elementos reguladores se describen, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1.990). Los elementos reguladores incluyen aquellos que dirigen la expresion constitutive de una secuencia de nucleotidos en muchos tipos de celula huesped y aquellos que dirigen la expresion de la secuencia de nucleotidos solo en ciertas celulas huesped (por ejemplo, secuencias reguladoras espedficas del tejido). Un activador especfico del tejido puede dirigir la expresion principalmente en un tejido deseado de interes, tal como musculo, neurona, hueso, piel, sangre, organos espedficos (por ejemplo, Idgado, pancreas) o tipos de celulas particulares (por ej., linfocitos). Los elementos reguladores tambien pueden dirigir la expresion de una manera dependiente temporal, tal como de una manera dependiente del ciclo celular o dependiente de la fase de desarrollo, que puede ser o no tambien espedfica del tejido o del tipo de celula. En algunas realizaciones, un vector comprende uno o mas activadores de pol III (por ej., 1, 2, 3, 4, 5 o mas activadores de pol III), uno o mas activadores de pol II (por ej., 1, 2, 3, 4, 5 o mas activadores de pol II), uno o mas activadores de pol I (por ej., 1,2, 3, 4, 5 o mas activadores de pol I) o combinaciones de los mismos. Ejemplos de activadores de pol III incluyen, pero no se limitan a, activadores U6 y H1. Ejemplos de activadores de pol II incluyen, pero no se limitan a, el activador LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en ingles) retrovi'rico (opcionalmente con el potenciador de RSV), el activador de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el estimulador de CMV) [vease, por ej., Boshart et al, Cell, 41: 521-530 (1.985)], el activador de SV40, el activador de dihidrofolato reductasa, el activador de p-actina, el activador de fosfoglicerol kinasa (PGK, por sus siglas en ingles) y el activador de EF1a. Tambien estan incluidos en el termino "elemento regulador" los elementos estimuladores, tales como WPRE; estimuladores de CMV; el segmento R-U5' en LTR de HTLV-1 (Mol. Cell. Biol., Vol. 8 (1), pag. 466-472, 1.988); estimulador de SV40 y la secuencia del intron entre los exones 2 y 3 de p-globina de conejo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78 (3), pag. 1.527-31, 1.981). Se apreciara por los expertos en la materia que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped que se tiene que transformar, el
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nivel de expresion deseado, etc. Se puede introducir un vector en celulas huesped para producir de ese modo transcritos, protemas o peptidos, incluyendo protemas o peptidos de fusion, codificados por acidos nucleicos como se describe en la presente memoria (por ejemplo, transcritos de repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), protemas, enzimas, formas mutantes de los mismos, protemas de fusion de los mismos, etc.).
Vectores ventajosos incluyen lentivirus y vrus adenoasociados y tambien se pueden seleccionar tipos de tales vectores para fijar como objetivo tipos particulares de celulas.
En un aspecto, la descripcion proporciona un vector que comprende un elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzimas que codifica una enzima CRISPR que comprende una o mas secuencias de localizacion nucleares. En algunas realizaciones, dicho elemento regulador conduce la transcripcion de la enzima CRISPR en una celula eucariota de manera que dicha enzima CRISPR se acumula en una cantidad detectable en el nucleo de la celula eucariota. En algunas realizaciones, el elemento regulador es un activador de la polimerasa II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada procedente de estos organismos. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es codon-optimizada para expresion en una celula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escision de una o dos hebras en la posicion de la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de actividad de escision de la cadena de ADN.
En un aspecto, la descripcion proporciona una enzima CRISPR que comprende una o mas secuencias de localizacion nuclear de suficiente fortaleza para conducir la acumulacion de dicha enzima CRISPR en una cantidad detectable en el nucleo de una celula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada procedente de estos organismos. La enzima pueden ser un homologo u ortologo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de capacidad para escindir una o mas hebras de una secuencia objetivo a la que se une.
En un aspecto, la descripcion proporciona una celula eucariota huesped que comprende: (a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de emparejamiento tracr y uno o mas sitios de insercion para insertar una o mas secuencias gma aguas arriba de la secuencia de emparejamiento tracr, en la que cuando se expresa, la secuencia gma dirige la union espedfica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo en una celula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gma que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr y/o (b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica a dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localizacion nuclear. En algunas realizaciones, la celula huesped comprende los componentes (a) y (b). En algunas realizaciones, el componente (a), el componente (b) o los componentes (a) y (b) estan integrados de manera estable en un genoma de la celula eucariota huesped. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende ademas la secuencia tracr aguas abajo de la secuencia de emparejamiento tracr bajo el control del primer elemento regulador. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende ademas dos o mas secuencias gma unidas de manera operable al primer elemento regulador, en el que cuando se expresan, cada una de las dos o mas secuencias gma dirige la union espedfica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo diferente en una celula eucariota. En algunas realizaciones, la celula huesped eucariota comprende ademas un tercer elemento regulador, tal como un activador de la polimerasa III, unido de manera operable a una dicha secuencia tracr. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejamiento tracr cuando se alinean de manera optima. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR comprende una o mas secuencias de localizacion nuclear de suficiente fortaleza para conducir la acumulacion de dicha enzima CRISPR en una cantidad detectable en el nucleo de una celula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogeneso S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada procedente de estos organismos. La enzima puede ser un homologo u ortologo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es codon-optimizada para expresion en una celula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escision de una o dos hebras en la posicion de la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de actividad de escision de la hebra de ADN. En algunas realizaciones, el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III. En algunas realizaciones, el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II. En algunas realizaciones, la secuencia gma es al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleotidos o entre 10-30 o entre 15-25 o entre 15-20 nucleotidos de longitud. En un aspecto, la descripcion proporciona un organismo eucariota no humano; preferiblemente un organismo eucariota multicelular, que comprende una celula eucariota huesped segun cualquiera de las realizaciones descritas. En otros aspectos, la descripcion proporciona un organismo eucariota; preferiblemente un organismo eucariota multicelular, que comprende una celula eucariota huesped segun cualquiera de las realizaciones descritas. El organismo en algunas realizaciones de estos aspectos puede ser un animal; por ejemplo un mairufero. Tambien, el organismo puede ser un artropodo tal como un insecto. El organismo puede
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tambien ser una planta. Ademas, el organismo puede ser un hongo.
En un aspecto, la descripcion proporciona un estuche que comprende uno o mas de los componentes descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, el estuche comprende un sistema vector e instrucciones para usar el estuche. En algunas realizaciones, el sistema vector comprende: (a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de emparejamiento tracr y uno o mas sitios de insercion para insertar una o mas secuencias gufa aguas arriba de la secuencia de emparejamiento tracr, en el que cuando se expresan, la secuencia gufa dirige la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia fijada como objetivo en una celula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gufa que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr y/o (b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localizacion nuclear. En algunas realizaciones, el estuche comprende los componentes (a) y (b) situados en los mismos vectores del sistema o diferentes. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende ademas la secuencia tracr aguas abajo de la secuencia de emparejamiento tracr bajo el control del primer elemento regulador. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende ademas dos o mas secuencias gufa unidas de manera operable al primer elemento regulador, en el que cuando se expresan, cada una de las dos o mas secuencias gufa dirige la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo diferente en una celula eucariota. En algunas realizaciones, el sistema comprende ademas un tercer elemento regulador, tal como un activador de la polimerasa III, unido de manera operable a dicha secuencia tracr. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejamiento tracr cuando se alinea de manera optima. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR comprende una o mas secuencias de localizacion nuclear de suficiente fortaleza para conducir la acumulacion de dicha enzima CRISPR en una cantidad detectable en el nucleo de una celula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada procedente de estos organismos. La enzima puede ser un homologo u ortologo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es codon-optimizada para expresion en una celula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escision de una o dos hebras en la posicion de la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de actividad de escision de la hebra de ADN. En algunas realizaciones, el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III. En algunas realizaciones, el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II. En algunas realizaciones, la secuencia gufa es al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleotidos o entre 10-30 o entre 15-25 o entre 15-20 nucleotidos de longitud.
En un aspecto, la descripcion proporciona un metodo para modificar un polinucleotido objetivo en una celula eucariota. En algunas realizaciones, el metodo comprende permitir que se una un complejo CRISPR al polinucleotido objetivo para efectuar la escision de dicho polinucleotido objetivo modificando de ese modo el polinucleotido objetivo, en el que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia gufa se transcribe a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleotido objetivo, en el que dicha secuencia gufa esta ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez se transcribe a una secuencia tracr. En algunas realizaciones, dicha escision comprende escindir una o dos hebras en la posicion de la secuencia objetivo mediante dicha enzima CRISPR. En algunas realizaciones, dicha escision da como resultado la transcripcion disminuida de un gen objetivo. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas reparar dicho polinucleotido objetivo escindido por recombinacion homologa con un polinucleotido exogeno de plantilla, en el que dicha reparacion da como resultado una mutacion que comprende una insercion, supresion o sustitucion de uno o mas nucleotidos de dicho polinucleotido objetivo. En algunas realizaciones, dicha mutacion da como resultado uno o mas cambios de aminoacido en una protefna expresada de un gen que comprende la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas suministrar uno o mas vectores a dicha celula eucariota, en el que uno o mas vectores conducen la expresion de uno o mas de: la enzima CRISPR, la secuencia gufa ligada a la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr. En algunas realizaciones, dichos vectores se suministran a la celula eucariota en un individuo. En algunas realizaciones, dicha modificacion tiene lugar en dicha celula eucariota en un cultivo celular. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas aislar dicha celula eucariota de un individuo antes de dicha modificacion. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas devolver dicha celula y/o celulas eucariotas procedentes de ahf a dicho individuo.
En un aspecto, la descripcion proporciona un metodo para modificar la expresion de un polinucleotido en una celula eucariota. En algunas realizaciones, el metodo comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleotido de manera que dicha union de como resultado la expresion aumentada o disminuida de dicho polinucleotido; en el que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia gufa se transcribe a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleotido, en el que dicha secuencia gufa esta ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez se transcribe a una secuencia tracr. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas suministrar uno o mas vectores a dichas celulas eucariotas, en el que uno o mas vectores conducen la expresion de una o mas de: la enzima CRISPR, la secuencia gufa ligada a la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr.
En un aspecto, la descripcion proporciona un metodo para generar una celula eucariota modelo que comprende un
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gen mutado de la enfermedad. En algunas realizaciones, un gen de la enfermedad es cualquier gen asociado a un aumento del riesgo de tener o desarrollar una enfermedad. En algunas realizaciones, el metodo comprende (a) introducir uno o mas vectores en una celula eucariota, en la que uno o mas vectores conducen la expresion de uno o mas de: una enzima CRISPR, una secuencia gufa ligada a una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr y (b) permitir que un complejo CRISPR se una a un polinucleotido objetivo para efectuar la escision del polinucleotido objetivo dentro de dicho gen de la enfermedad, en el que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gufa que se hibrida a la secuencia objetivo dentro del polinucleotido objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr, generando de ese modo una celula eucariota modelo que comprende un gen mutado de la enfermedad. En algunas realizaciones, dicha escision comprende escindir una o dos hebras en la posicion de la secuencia objetivo mediante dicha enzima CRISPR. En algunas realizaciones, dicha escision da como resultado la transcripcion disminuida de un gen objetivo. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas reparar dicho polinucleotido objetivo escindido por recombinacion homologa con un polinucleotido exogeno de plantilla, en el que dicha reparacion da como resultado una mutacion que comprende una insercion, supresion o sustitucion de uno o mas nucleotidos de dicho polinucleotido objetivo. En algunas realizaciones, dicha mutacion da como resultado uno o mas cambios de aminoacido en una expresion de protefna de un gen que comprende la secuencia objetivo.
En un aspecto, la descripcion proporciona un metodo para desarrollar un agente biologicamente activo que module un caso de senalizacion celular asociado a un gen de la enfermedad. En algunas realizaciones, un gen de la enfermedad es cualquier gen asociado a un aumento del riesgo de tener o desarrollar una enfermedad. En algunas realizaciones, el metodo comprende (a) poner en contacto un compuesto de ensayo con una celula modelo de una cualquiera de las realizaciones descritas y (b) detectar un cambio en una lectura que sea indicativo de una reduccion o un aumento del caso de senalizacion celular asociado a dicha mutacion en dicho gen de la enfermedad, desarrollando de ese modo dicho agente biologicamente activo que module dicho caso de senalizacion celular asociado a dicho gen de la enfermedad.
En un aspecto, la descripcion proporciona un polinucleotido recombinante que comprende una secuencia gufa aguas arriba de una secuencia de emparejamiento tracr, en el que la secuencia gufa cuando se expresa dirige la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a una correspondiente secuencia objetivo presente en una celula eucariota. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo es una secuencia vfrica presente en una celula eucariota. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo es un proto-oncogen o un oncogen.
En un aspecto, la descripcion proporciona un metodo para seleccionar una o mas celulas procariotas por introduccion de una o mas mutaciones en un gen en una o mas celulas procariotas, comprendiendo el metodo: introducir uno o mas vectores en la celula o las celulas procariotas, en las que uno o mas vectores conducen la expresion de uno o mas de: una enzima CRISPR, una secuencia gufa ligada a una secuencia de emparejamiento tracr, una secuencia tracr y una plantilla de edicion; en la que la plantilla de edicion comprende una o mas mutaciones que anula la escision de la enzima CRISPR; permitir la recombinacion homologa de la plantilla de edicion con el polinucleotido objetivo en la celula o las celulas que se tienen que seleccionar; permitir que un complejo CRISPR se una a un polinucleotido objetivo para efectuar la escision del polinucleotido objetivo dentro de dicho gen, en el que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gufa que se hibrida a la secuencia objetivo dentro del polinucleotido objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr, en la que la union del complejo CRISPR al polinucleotido objetivo induce la muerte celular, permitiendo de ese modo que se seleccione una o mas celulas procariotas en que se han introducido una o mas mutaciones. En una realizacion preferida, la enzima CRISPR es Cas9. En otro aspecto de la descripcion, la celula que se tiene que seleccionar puede ser una celula eucariota. Los aspectos de la descripcion permiten la seleccion de celulas especfficas sin que se requiera un marcador de seleccion o un procedimiento de dos etapas que pueda incluir un sistema de contraseleccion.
En algunos aspectos, la descripcion proporciona una composicion que no se encuentra en la naturaleza o de ingenierfa que comprende una secuencia de polinucleotidos de ARN quimerico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en el que la secuencia de polinucleotidos comprende: (a) una secuencia gufa capaz de hibridizar una secuencia fijada como objetivo en una celula eucariota, (b) una secuencia de emparejamiento tracr y (c) una secuencia tracr en la que (a), (b) y (c) se disponen en una orientacion 5' a 3', en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia gufa dirige la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gufa que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr o un sistema de enzima CRISPR, en el que el sistema esta codificado por un sistema vector que comprende uno o mas vectores que comprenden I. un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de polinucleotidos de ARN quimerico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en el que la secuencia de polinucleotidos comprende (a) una o mas secuencias gufa capaces de hibridar una o mas secuencias objetivo en una celula eucariota, (b) una secuencia de emparejamiento tracr y (c) una o mas secuencias tracr y II. un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o mas secuencias de localizacion nuclear, en la que (a), (b) y (c) se disponen en una orientacion 5' a 3', en la que los componentes I y II se situan en los mismos vectores del sistema o diferentes, en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia
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tracr y la secuencia gufa dirige la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gufa que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr o un sistema de enzima CRISPR multiplexado, en la que el sistema se codifica mediante un sistema vector que comprende uno o mas vectores que comprenden I. un primer elemento regulador unido de manera operable a (a) una o mas secuencias gufa capaces de hibridar una secuencia objetivo en una celula y (b) al menos una o mas secuencias de emparejamiento tracr, II. un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR y III. un tercer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia tracr , en la que los componentes I, II y III se situan en los mismos vectores del sistema o diferentes, en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia gufa dirige la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gufa que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr y en la que en el sistema multiplexado se usan multiples secuencias gufa y una secuencia tracr unica y en la que se modifica una o mas de las secuencias gufa, tracr y de emparejamiento tracr, para mejorar la estabil idad.
En aspectos de la descripcion, la modificacion comprende una estructura secundaria de ingenierfa. Por ejemplo, la modificacion puede comprender una reduccion en la region de hibridacion entre la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr. Por ejemplo, la modificacion tambien puede comprender fusionar la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr por un bucle artificial. La modificacion puede comprender la secuencia tracr que tiene una longitud entre 40 y 120 pb. En las realizaciones de la descripcion, la secuencia tracr tiene entre 40 pb y la longitud total de la secuencia tracr. En algunas realizaciones, la longitud de ARNtracr incluye al menos 167 nucleotidos y en algunas realizaciones al menos 1-85 nucleotidos del ARNtracr de tipo natural. En algunas realizaciones, se pueden usar al menos los nucleotidos que corresponden a los nucleotidos 1-67 o 1-85 de ARNtracr de Cas9 de S. pyogenes de tipo natural. En el caso de que el sistema CRISPR use enzimas distintas de Cas9 o distintas de SpCas9, entonces pueden estar presentes los correspondientes nucleotidos en el ARNtracr de tipo natural relevante. En algunas realizaciones, la longitud de ARNtracr incluye no mas de los nucleotidos 1-67 o 1-85 de ARNtracr de tipo natural. La modificacion puede comprender optimizacion de la secuencia. En algunos aspectos, la optimizacion de secuencias puede comprender reducir la incidencia de secuencias poliT en la secuencia tracr y/o de emparejamiento tracr. La optimizacion de secuencias se puede combinar con la reduccion en la region de hibridacion entre la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr; por ejemplo, una secuencia tracr de longitud reducida.
En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o el sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende la reduccion de secuencias poliT en la secuencia tracr y/o de emparejamiento tracr. En algunos aspectos de la descripcion, una o mas T presentes en una secuencia poli-T de la secuencia de tipo natural relevante (esto es, una extension de mas de 3, 4, 5, 6 o mas bases T contiguas; en algunas realizaciones, un tramo de no mas de 10, 9, 8, 7, 6 bases T contiguas) puede ser sustituido con un nucleotido no T, por ej. una A de manera que se rompa la cadena en tramos mas pequenos de T teniendo cada tramo 4 o menos de 4 (por ejemplo 3 o 2) T contiguos. Las bases distintas de A se pueden usar para sustitucion, por ejemplo C o G o nucleotidos que no se encuentran en la naturaleza o nucleotidos modificados. Si la cadena de T esta implicada en la formacion de una horquilla (o tallo-lazo), entonces es ventajoso que la base complementaria para la base no T cambie para complementar el nucleotido no T. Por ejemplo, si la base no T es una A, entonces un complemento se puede cambiar a una T, por ejemplo para conservar o ayudar a la conservacion de estructura secundaria. Por ejemplo, se puede modificar 5'-TTTTT para convertirlo en 5'-TTTAT y se puede cambiar el 5'-AAAAA complementario a 5'- ATAAA.
En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende anadir una secuencia terminadora poliT. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende anadir una secuencia terminadora poliT en secuencias tracr y/o de emparejamiento tracr. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en la que la modificacion comprende anadir una secuencia terminadora poliT en la secuencia gufa. La secuencia terminadora poliT puede comprender 5 bases T contiguas o mas de 5.
En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende modificar lazos y/u horquillas. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende proporcionar un mfnimo de dos horquillas en la secuencia gufa. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende proporcionar una horquilla formada por complementacion entre la secuencia tracr y de emparejamiento tracr (repeticion directa). En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende proporcionar una o mas horquillas adicionales en o hacia el extremo 3' de la secuencia ARNtracr. Por ejemplo, se puede formar una horquilla proporcionando secuencias autocomplementarias dentro de la secuencia de ARNtracr unida por un lazo de manera que se forma una horquilla en autoplegado. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende proporcionar horquillas adicionales anadidas a la 3'
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de la secuencia gufa. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende extender el extremo 5' de la secuencia gufa. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISpR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende proporcionar una o mas horquillas en el extremo 5' de la secuencia gufa. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende agregar la secuencia (5'-AGGACGAAGTCCTAA) al extremo 5' de la secuencia gufa. Otras secuencias adecuadas para formar horquil las seran conocidas para el experto y se pueden usar en ciertos aspectos de la descripcion. En algunos aspectos de la descripcion, se proporcionan al menos 2, 3, 4, 5 o mas horquillas adicionales. En algunos aspectos de la descripcion se proporcionan no mas de 10, 9, 8, 7, 6 horquillas adicionales. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende dos horquillas. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende tres horquillas. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende a lo sumo cinco horquillas.
En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende proporcionar union cruzada o proporcionar uno o mas nucleotidos modificados en la secuencia de polinucleotidos. Los nucleotidos modificados y/o ligados cruzados se pueden proporcionar en cualquiera o en todas las secuencias tracr, de acoplamiento tracr y/o gufa y/o en la secuencia codificadora de enzimas y/o en secuencias de vectores. Las modificaciones pueden incluir la inclusion de al menos un nucleotido que no se encuentra la naturaleza o un nucleotido modificado o analogos de los mismos. Se puede modificar nucleotidos modificados en el resto ribosa, fosfato y/o base. Los nucleotidos modificados pueden incluir 2'-O-metil- analogos, 2'-desoxi-analogos o 2'-fluoro-analogos. La cadena principal de acidos nucleicos se puede modificar, por ejemplo, se puede usar una cadena principal de fosforotioato. El uso de acidos nucleicos bloqueados (LNA por sus siglas en ingles) o acidos nucleicos de puente (BNA por sus siglas en ingles) tambien puede ser posible. Mas ejemplos de bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina, inosina, 7-metilguanosina.
Se entendera que cualquiera o todas las modificaciones anteriores se pueden proporcionar en aislamiento o en combinacion en un sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR determinado. Dicho sistema puede incluir una, dos, tres, cuatro, cinco o mas de dichas modificaciones.
En un aspecto, la invencion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II, por ej., una enzima Cas9. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la enzima CRISPR esta constituida por menos de mil aminoacidos, o menos de cuatro mil aminoacidos. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la enzima Cas9 es StCas9 o StlCas9 o la enzima Cas9 es una enzima Cas9 de un organismo seleccionado del grupo que consiste en el genero Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium o Corynebacter. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la enzima CRISPR es una nucleasa que dirige la escision de ambas cadenas en la posicion de la secuencia objetivo.
En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III. En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II.
En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la secuencia gufa comprende al menos quince nucleotidos.
En un aspecto, la descripcion proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificacion comprende ARN de secuencia tracr optimizada y/o de secuencia gufa optimizada y/o estructura co- plegada de secuencia tracr y/o secuencia o secuencias de acoplamiento tracr y/o estructuras secundarias estabilizantes de secuencia tracr y/o secuencia tracr con una region reducida de emparejamiento de bases y/o elementos de ARN condensados de secuencia tracr y/o en el sistema multiplexado hay dos ARN que comprenden un trazador y que comprenden una pluralidad de gufas o ARN que comprende una pluralidad de quimeras.
En aspectos de la descripcion, la arquitectura de ARN quimerico se optimiza ademas segun los resultados de estudios de mutagenesis. En ARN quimerico con dos o mas horquillas, las mutaciones en la repeticion directa proximal para estabilizar la horquil la pueden dar como resultado ablacion de la actividad del complejo CRISPR. Las mutaciones en la repeticion directa distal para acortar o estabilizar la horquilla pueden no tener efecto sobre la actividad del complejo CRISPR. La aleatorizacion de secuencias en la region de la protuberancia entre las repeticiones proximal y distal puede reducir de manera significativa la actividad del complejo CRISPR. Los cambios en los pares de bases unicos o aleatorizacion de secuencias en la region ligadora entre horquillas pueden dar como resultado la perdida completa de actividad del complejo CRISPR. La estabilizacion de horquillas de las horquillas distales que siguen a la primera horquilla despues de la secuencia gufa puede dar como resultado el mantenimiento o la mejora de la actividad del complejo CRISPR. De acuerdo con esto, en realizaciones preferidas de la descripcion,
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la arquitectura de ARN quimerico se puede optimizar ademas por generacion de un ARN quimerico mas pequeno que puede ser beneficioso para opciones de suministro terapeutico y otros usos y esto se puede conseguir modificando la repeticion directa distal de manera que se acorte o estabilice la horquilla. En realizaciones preferidas adicionales de la descripcion la arquitectura de ARN quimerico se puede optimizar ademas por estabilizacion de una o mas horquillas distales. La estabilizacion de horquillas puede incluir modificar secuencias adecuadas para formar horquillas. En algunos aspectos de la descripcion, se proporcionan al menos 2, 3, 4, 5 o mas horquillas adicionales. En algunos aspectos de la descripcion, se proporcionan no mas de 10, 9, 8, 7, 6 horquillas adicionales. En algunos aspectos de la descripcion, la estabilizacion puede ser union cruzada u otras modificaciones. Las modificaciones pueden incluir la inclusion de al menos un nudeotido que no se encuentre en la naturaleza o un nucleotido modificado o analogos de los mismos. Los nucleotidos modificados se pueden modificar en el resto ribosa, fosfato y/o base. Los nucleotidos modificados pueden incluir 2'-O-metil-analogos, 2'-desoxi-analogos o 2'-fluoro-analogos. Se puede modificar la cadena principal de acidos nucleicos, por ejemplo, se puede usar una cadena principal de fosforotioato. El uso de acidos nucleicos bloqueados (LNA) o acidos nucleicos de puente (BNA) tambien puede ser posible. Mas ejemplos de bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina, inosina, 7-metilguanosina.
En un aspecto, la descripcon proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la enzima cRlSPR es codon-optimizada para expresion en una celula eucariota.
De acuerdo con esto, en algunos aspectos de la descripcion, no se requiere necesariamente que sea fijada la longitud del ARNtracr requerida en una construcaon de la descripcion, por ejemplo, una construccion quimerica, y en algunos aspectos puede tener entre 40 y 120 pb y en algunos aspectos de la descripcion hasta la longitud total de la tracr, por ejemplo, en algunos aspectos de la descripcion hasta el extremo 3' de tracr como se marca por la senal de terminacion de la transcripcion en el genoma bacteriano. En algunas realizaciones, la longitud del ARNtracr incluye al menos 1-67 nucleotidos y en algunas realizaciones al menos 1-85 nucleotidos del ARNtracr de tipo natural. En algunas realizaciones, se pueden usar al menos los nucleotidos que corresponden a los nucleotidos 1-67 o 1-85 de ARNtracr de Cas9 de S. pyogenes de tipo natural. En el caso de que el sistema CRISPR use enzimas distintas de Cas9 u otras distintas de SpCas9, entonces pueden estar presentes los nucleotidos correspondientes en el ARNtracr de tipo natural relevante. En algunas realizaciones, la longitud del ARNtracr incluye no mas de 1-67 o 185 nucleotidos del ARNtracr de tipo natural. Con respecto a la optimizacion de secuencias (por ejemplo, reducaon en las secuenaas poli-T), por ejemplo en cuanto a las cadenas de Ts internas a la secuencia de emparejamiento tracr (repeticion directa) o al ARNtracr, en algunos aspectos de la descripcion, uno o mas Ts presentes en una secuenda poli-T de la secuencia de tipo natural relevante (esto es, un segmento de mas de 3, 4, 5, 6 o mas bases T contiguas; en algunas realizaciones, un segmento de no mas de 10, 9, 8, 7, 6 bases T contiguas) pueden ser sustituidos con un nucleotido no T, por ejemplo, una A, de manera que la cadena se rompa en fragmentos mas pequenos de T teniendo cada fragmento 4, o menos de 4 (por ejemplo, 3 o 2) T contiguas. Si la cadena de T esta implicada en la formacion de una horquilla (o tallo-lazo), entonces es ventajoso que la base complementaria para la base no T se cambie a complemento del nucleotido no T. Por ejemplo, si la base no T es una A, entonces su complemento se puede cambiar a una T, por ejemplo, para conservar o ayudar a la conservacion de estructura secundaria. Por ejemplo, se puede modificar 5'-TTTTT para que se convierta en 5'-TTTAT y se puede cambiar la 5'- AAAAA complementaria a 5'-ATAAA. En cuanto a la presencia de secuencias terminadoras poli-T en transcrito de tracr + emparejamiento tracr, por ejemplo, un terminador poli-T (TTTTT o mas), en algunos aspectos de la descripcon es ventajoso que se anada al extremo del transcrito, si esta en forma de dos ARN (tracr y emparejamiento de tracr) o unico ARN gufa. Con respecto a los lazos y horquillas en los transcritos tracr y de emparejamiento tracr, en algunos aspectos de la descripcion es ventajoso que este presente un mfnimo de dos horquillas en el ARN gufa quimerico. Una primera horquilla puede ser la horquilla formada por complementacion entre la secuenda tracr y la secuenda de emparejamiento tracr (repeticion directa). Una segunda horquilla puede estar en el extremo 3' de la secuencia ARNtracr y esto puede proporcionar estructura secundaria para interaccon con Cas9. Se pueden anadir horquillas adicionales al 3' del ARN gufa, por ejemplo, en algunos aspectos de la descripcion para aumentar la estabilidad del ARN gufa. Adicionalmente, el extremo 5' del ARN gufa, en algunos aspectos de la descripcion, se puede extender. En algunos aspectos de la descripcion, se puede considerar 20 pb en el extremo 5' como una secuencia gufa. Se puede extender la porcion 5'. Se puede proporcionar una o mas horquillas en la porcion 5', por ejemplo, en algunos aspectos de la descripcion, esto tambien puede mejorar la estabilidad del ARN gufa. En algunos aspectos de la descripcion, se puede proporcionar la horquilla especffica adjuntando la secuencia (5'-AGGACGAAGTCCTAA) al extremo 5' de la secuencia gufa y, en algunos aspectos de la descripcion, esto puede ayudar a mejorar la estabilidad. Otras secuencias adecuadas para formar horquillas seran conocidas para el experto y se pueden usar en ciertos aspectos de la descripcion. En algunos aspectos de la descripcion, se proporcionan al menos 2, 3, 4, 5 o mas horquillas adicionales. En algunos aspectos de la descripcion se proporaonan no mas de 10, 9, 8, 7, 6 horquillas adicionales. Lo anterior tambien proporciona aspectos de la descripcion que implican estructura secundaria en secuencias gufa. En algunos aspectos de la descripaon puede haber union cruzada y otras modificaciones, por ejemplo, para mejorar la estabilidad. Las modificaciones pueden incluir incusiones de al menos un nudeotido que no se encuentre en la naturaleza o un nucleotido modificado o analogos de los mismos. Los nucleotidos modificados se pueden modificar en el resto ribosa, fosfato y/o base. Los nucleotidos modificados pueden incluir 2'-O-metil-analogos, 2'-desoxi-analogos o 2'-fluoro-analogos. Se puede modificar la cadena principal del acido nucleico, por ejemplo, se puede usar una cadena principal de fosforotioato. El uso de acidos nucleicos bloqueados (LNA) o acidos nucleicos de puente (BNA) tambien puede ser posible. Mas
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ejemplos de bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina, inosina, 7-metilguanosina. Dichas modificaciones o union cruzada pueden estar presentes en la secuencia gufa u otras secuencias adyacentes a la secuencia gufa.
Breve descripcion de los dibujos
Las caracterfsticas novedosas de esta descripcion se explican particularmente en las reivindicaciones que la acompanan. Se tendra un mejor entendimiento de las caracterfsticas y ventajas de la presente descripcion por referencia a la siguiente descripcion detallada que explica realizaciones ilustrativas, en que se utilizan los pri ncipios de la descripcion, y los dibujos adjuntos de los que:
La Figura 1 muestra un modelo esquematico del sistema CRISPR. La nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (amarillo) se fija como objetivo para ADN genomico por un ARN gufa sintetico (ARNsg) que consiste en una secuencia gufa de 20-nt (azul) y un andamio (rojo). Los pares de bases de la secuencia gufa con el ADN objetivo (azul), directamente aguas arriba de una unidad adyacente protoespaciadora (PAM, por sus siglas en ingles; magenta) 5'-NGG requisito y Cas9 media una doble rotura de cadena (DSB, por sus siglas en ingles) ~3 pb aguas arriba de la PAM (triangulo rojo).
La Figura 2A-F ilustra un sistema CRISPR ejemplar, un posible mecanismo de accion, una adaptacion de ejemplo para la expresion en celulas eucariotas y los resultados de los ensayos que evaluan la localizacion nuclear y la actividad de CRISPR.
La Figura 3A-C ilustra una casete de expresion ejemplar para expresion de elementos del sistema CRISPR en celulas eucariotas, estructuras previstas de secuencias gufa de ejemplo y actividad del sistema CRISPR cuando se mide en celulas eucariotas y procariotas.
La Figura 4A-D ilustra los resultados de una evaluacion de especificidad de SpCas9 para un objetivo de ejemplo.
La Figura 5A-G ilustra un sistema de vectores ejemplar y los resultados para su uso en dirigir recombinacion homologa en celulas eucariotas.
La Figura 6A-C ilustra una comparacion de diferentes transcritos de ARNtracr para fijar como objetivo genes mediados por Cas9.
La Figura 7A-D ilustra un sistema CRISPR ejemplar, una adaptacion de ejemplo para expresion en celulas eucariotas y los resultados de los ensayos que evaluan la actividad de CRISPR.
La Figura 8A-C ilustra manipulaciones ejemplares de un sistema CRISPR para fijar como objetivo sitios genomicos en celulas de mamfferos.
La Figura 9A-B ilustra los resultados de un analisis por el metodo Northern de tratamiento de ARNcr en celulas de mamffero.
La Figura 10A-C ilustra una representacion esquematica de ARN quimericos y los resultados de ensayos SURVEYOR para actividad del sistema CRISPR en celulas eucariotas.
La Figura 11A-B ilustra una representacion grafica de los resultados de ensayos SURVEYOR para actividad del sistema CRISPR en celulas eucariotas.
La Figura 12 ilustra estructuras secundarias previstas para ARN quimericos ejemplares que comprenden una secuencia gufa, secuencia de acoplamiento tracr y secuencia tracr.
La Figura 13 es un arbol filogenetico de genes Cas.
La Figura 14A-F muestra el analisis filogenetico que revelan cinco familias de Cas9s, incluyendo tres grupos de Cas9s grandes (~1.400 aminoacidos) y dos de Cas9s pequenos (~1.100 aminoacidos).
La Figura 15 muestra un grafico que representa la funcion de diferentes ARN gufa optimizados.
La Figura 16 muestra la secuencia y estructura de diferentes ARN quimericos gufa.
La Figura 17 muestra la estructura co-plegada del ARNtracr y repeticion dirigida.
La Figura 18 A y B muestra datos de la optimizacion de ARN gufa quimerico de St1Cas9 in vitro.
La Figura 19A-B muestra la escision de objetivos no metilados o metilados mediante lisado de celulas de SpCas9.
La Figura 20A-G muestra la optimizacion de la arquitectura de ARN gufa para edicion de genomas de mamffero mediada por SpCas9. (a) Esquema de vector de expresion bicistronico (PX330) para ARN gufa unico conducido por activador U6 (ARNsg) y Cas9 de Streptococcus pyogenes codon-optimizada humana conducida por activador CBh
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(hSpCas9) usada para todos los experimented posteriores. El ARNsg consta de una secuencia gufa de 20-nt (azul) y andamio (rojo), truncados en diversas posiciones como se indica. (b) Ensayo SURVEYOR para inserciones o supresiones mediadas por SpCas9 en los sitios EMX1 y PVALB humanos. Las flechas indican los fragmentos SURVEYOR esperados (n = 3). (c) Analisis por el metodo Northern para las cuatro arquitecturas de truncado de ARNsg, con U1 como control de carga. (d) Ambos mutantes de tipo natural (wt, por sus siglas en ingles) o nickase (D10A) de insercion activada por SpCas9 de un sitio Hin dill en el gen EMX1 humano. Se usaron oligonucleotidos monocatenarios (los ssODN, por sus siglas en ingles) orientados en la direccion sentido o antisentido en relacion a la secuencia genomica, como plantillas de recombinacion homologas. (e) Esquema del sitio SERPINB5 humano. Se indican los ARNsg y las PAM mediante barras coloreadas por encima de las secuencias; se resaltan metilcitosina (Me) (rosa) y se enumeran en relacion al sitio de inicio de transcripcion (TSS, +1). (f) Estado de metilacion de SERPINB5 ensayado mediante secuenciacion de bisulfito de 16 clones. Cfrculos rellenos, CpG metilado; cfrculos abiertos, CpG no metilado. (g) Eficacia de modificacion por tres ARNsg fijando como objetivo la region metilada de SERPINB5, ensayada por secuenciacion profunda (n = 2). Las barras de error indican intervalos de Wilson (Metodos Online).
La Figura 21A-B muestra la optimizacion adicional de la arquitectura de ARNsg de CRISPR-Cas. (a) Esquema de cuatro arquitecturas adicionales de ARNsg, I-IV. Cada una consta de una secuencia gufa de 20-nt (azul) unida a la repeticion directa (RD, gris), que hibrida a la ARNtracr (rojo). El hfbrido RD-ARNtracr es truncado en +12 o +22, como se indicaron con un tallo-lazo GAAA artificial. Las posiciones de truncado de ARNtracr se enumeran de acuerdo con el sitio de inicio de la transcripcion indicado previamente para ARNtracr. Las arquitecturas de ARNsg II y IV soportan mutaciones dentro de sus tractos poli-U, que podfan servir como terminadores de transcripcion prematura. (b) Ensayo SURVEYOR para inserciones o supresiones mediadas por SpCas9 en el sitio EMX1 humano para los sitios 1-3 objetivo. Las flechas indican los fragmentos SURVEYOR expresados (n = 3).
La Figura 22 ilustra la visualizacion de algunos sitios objetivo en el genoma humano.
La Figura 23A-B muestra (A) un esquema del ARNsg y (B) el analisis SURVEYOR para cinco variantes de ARNsg para SaCas9 para una arquitectura truncada optima con la mayor eficacia de escision.
Las figuras en la presente memoria son solo para fines ilustrativos y no estan necesariamente dibujadas a escala. Descripcion detallada de la invencion
Los terminos "polinucleotido", "nucleotido", "secuencia de nucleotidos", "acido nucleico" y "oligonucleotido" se usan de forma intercambiable. Se refieren a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud, desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos o analogos de los mismos. Los polinucleotidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier funcion, conocida o desconocida. Los siguientes no son ejemplos limitantes de los polinucleotidos: regiones codificadoras o no codificadoras de un gen o fragmento de gen, sitios (sitio) definidos a partir de analisis de union, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosomico, ARN de interferencia corta (ARNsi), ARN de horquilla corta (ARNsh), micro- ARN (ARNmi), ribozimas, y ADNc, polinucleotidos recombinantes, polinucleotidos ramificados, plasmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de acidos nucleicos y cebadores. Un polinucleotido puede comprender uno o mas nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y analogos de nucleotidos. Si hay, se pueden impartir modificaciones a la estructura del nucleotido antes o despues del ensamblado del polfmero. La secuencia de nudeotidos puede ser interrumpida por componentes no nucleotidos. Un polinucleotido puede ser modificado ademas despues de polimerizacion, tal como por conjugacion con un componente etiquetado.
En aspectos de la invencion, los terminos "ARN quimerico", "ARN gufa quimerico", "ARN gufa", "ARN gufa unico" y "ARN gufa sintetico" se usan de forma intercambiable y se refieren a la secuencia de polinucleotidos que comprende la secuencia gufa, la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr. El termino "secuencia gufa" se refiere a la secuencia de aproximadamente 20 pb dentro del ARN gufa que especfica el sitio objetivo y se puede usar de manera intercambiable con los terminos "gufa" o "espaciador". El termino "secuencia de emparejamiento tracr" tambien se puede usar de forma intercambiable con el termino "repeticion o repeticiones directas".
Como se usa en la presente memoria el termino "de tipo natural" es un termino de la tecnica entendido por los expertos y significa la forma tfpica de un organismo, cepa, gen o caracterfstica como se encuentra en la naturaleza como se distingue de formas mutantes o variantes.
Como se usa en la presente memoria el termino "variante" se deberfa considerar que significa la exhibicion de cualidades que presentan un patron que se desvfa de lo que ocurre en la naturaleza.
Los terminos "que no se encuentra en la naturaleza " o "de ingenierfa " se usan de forma intercambiable e indican la implicacion de la mano del hombre. Los terminos, cuando se refieren a moleculas de acido nudeico o polipeptidos significan que la molecula de acido nucleico o el polipeptido esta al menos sustancialmente exento de al menos otro componente con el que se asodan de manera natural en la naturaleza y como se encuentran en la naturaleza.
"Complementariedad" se refiere a la capacidad de un acido nucleico para formar el enlace o enlaces de hidrogeno
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con otra secuencia de acidos nucleicos por emparejamiento de bases de Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de restos en una molecula de acido nucleico que puede formar enlaces de hidrogeno (por ej., emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de acidos nucleicos (por ej., 5, 6, 7, 8, 9, 10 de un total de 10 siendo la complementariedad del 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100%). "Perfectamente complementario" significa que todos los restos contiguos de una secuencia de acidos nucleicos formaran un enlace de hidrogeno con el mismo numero de restos contiguos en una segunda secuencia de acidos nucleicos. " Sustancialmente complementario" como se usa en la presente memoria se refiere a un grado de complementariedad que es al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% por una region de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas nucleotidos o se refiere a dos acidos nucleicos que se hibridan en condiciones rigurosas.
Como se usa en la presente memoria, "condiciones rigurosas" para hibridacion se refiere a las condiciones en las cuales un acido nucleico que tiene complementariedad a una secuencia objetivo se hibrida predominantemente con la secuencia objetivo y sustancialmente no se hibrida a las secuencias no objetivo. Las condiciones rigurosas son en general dependientes de la secuencia, y varfan dependiendo de una serie de factores. En general, cuanto mas larga la secuencia, mayor la temperatura a la que se hibrida de manera especffica la secuencia a su secuencia objetivo. Se describen con detalle ejemplos no limitantes de condiciones rigurosas en Tijssen (1.993), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Segundo Capftulo "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.
"Hibridacion" se refiere a una reaccion en que uno o mas polinucleotidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza via enlace de hidrogeno entre las bases de los restos de nucleotido. El enlace de hidrogeno puede tener lugar por apareamiento de bases de Watson Crick, union de Hoogstein o de cualquier otra manera especffica de la secuencia. El complejo puede comprender dos hebras que forman una estructura duplex, tres o mas hebras que forman un complejo multicatenario, una sola hebra que se autohibrida o cualquier combinacion de estas. Una reaccion de hibridacion puede constituir una etapa en un procedimiento mas extenso, tal como la iniciacion de PCR o la escision de un polinucleotido mediante una enzima. Una secuencia capaz de hibridacion con una secuencia determinada se refiere como el “complemento” de la secuencia determinada.
Como se usa en la presente memoria, "estabilizacion" o "estabilidad aumentada" con respecto a componentes del sistema CRISPR se refieren a asegurar o estabilizar la estructura de la molecula. Esto se puede llevar a cabo por introduccion de una o mas mutaciones, incluyendo cambios de pares de base unicos o multiples, aumentando el numero de horquillas, union cruzada, rompiendo tramos particulares de nucleotidos y otras modificaciones. Las modificaciones pueden incluir la inclusion de al menos un nucleotido que no se encuentra en la naturaleza o un nucleotido modificado o analogos de los mismos. Se pueden modificar nucleotidos modificados en el resto ribosa, fosfato y/o base. Los nucleotidos modificados pueden incluir 2'-O-metil-analogos, 2'-desoxi-analogos o 2'-fluoro- analogos. La cadena principal de acidos nucleicos se puede modificar, por ejemplo, se puede usar una cadena principal de fosforotioato. El uso de acidos nucleicos bloqueados (LNA, por sus siglas en ingles) o acidos nucleicos de puente (BNA, por sus siglas en ingles) tambien puede ser posible. Mas ejemplos de bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina, inosina, 7-metilguanosina. Estas modificaciones se pueden aplicar a cualquier componente del sistema CRSIPR. En una realizacion preferida estas modificaciones se realizan a los componentes de ARN, por ejemplo, el ARN gufa o secuencia de polinucleotidos quimericos.
Como se usa en la presente memoria, "expresion" se refiere al procedimiento por el que un polinucleotido se transcribe de una plantilla de ADN (tal como en ARNm u otro transcrito de ARN) y/o el procedimiento por el que se traduce con posterioridad un ARNm transcrito en peptidos, polipeptidos o protefnas. Los transcritos y polipeptidos codificados se pueden referir de manera colectiva como “producto genico”. Si el polinucleotido precede de ADN genomico, la expresion puede incluir proceso de corte y empalme del ARNm en una celula eucariota.
Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protefna" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a polfmeros de aminoacidos de cualquier longitud. El polfmero puede ser lineal o ramificado y puede comprender aminoacidos modificados y puede ser interrumpido por no aminoacidos. Los terminos tambien incluyen un polfmero de aminoacidos que ha sido modificado; por ejemplo, formacion de enlace disulfuro, glucosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion o cualquier otra manipulacion, tal como conjugacion con un componente etiquetado. Como se usa en la presente memoria el termino “aminoacido” incluye aminoacidos naturales y/o no naturales o sinteticos, incluyendo glicina y los dos isomeros opticos D o L y analogos de aminoacido y peptidomimeticos.
Los terminos " individuo," "individual" y "paciente" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a un vertebrado, preferiblemente un mamffero, mas preferiblemente un ser humano. Los mamfferos incluyen, pero no estan limitados a, murinos, simios, seres humanos, animales de granja, animales deportivos y mascotas. Los tejidos, las celulas y su progenie de una entidad biologica obtenida in vivo o cultivada in vitro tambien se incluyen. En algunas realizaciones, un individuo puede ser un animal invertebrado, por ejemplo, un insecto o un nematodo; mientras que en otros, un individuo puede ser una planta o un hongo.
Los terminos "agente terapeutico", "agente terapeutico capaz" o "agente de tratamiento" se usan de forma
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intercam biable y se refieren a una molecula o compuesto que confiere algun efecto beneficioso en la administracion a un individuo. El efecto beneficioso incluye permitir determinaciones de diagnostico; alivio de una enfermedad, sfntoma, trastorno o afeccion patologica; reducir o prevenir el comienzo de una enfermedad, sfntoma, trastorno o afeccion y en general contrarrestar una enfermedad, sfntoma, trastorno o afeccion patologica.
Como se usa en la presente memoria, "tratamiento" o " tratar," o "paliar" o "aliviar" se usan de forma intercambiable. Estos terminos se refieren a una propuesta para obtener resultados beneficiosos o deseados incluyendo pero no limitandose a un beneficio terapeutico y/o un beneficio profilactico. Por beneficio terapeutico se quiere decir cualquier mejora terapeuticamente relevante en, o efecto sobre, una o mas enfermedades, afecciones o sfntomas bajo tratamiento. Para beneficio profilactico, las composiciones se pueden administrar a un individuo con riesgo de desarrollar una enfermedad particular, afeccion o sfntoma o a un individuo que indica uno o mas de los sfntomas fisiologicos de una enfermedad, incluso aunque la enfermedad, afeccion o sfntoma pueda no haberse manifestado aun.
El termino "cantidad eficaZ' o "cantidad terapeuticamente eficaZ' se refiere a la cantidad de un agente que es suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados. La cantidad terapeuticamente eficaz puede variar dependiendo de uno o mas de: el individuo y la enfermedad que se esta tratando, el peso y la edad del individuo, la gravedad de la enfermedad, la manera de administracion y similares, que se puede determinar facilmente por un experto en la materia. El termino tambien se aplica a una dosis que proporcionara una imagen para deteccion por uno cualquiera de los metodos de formacion de imagen descritos en la presente memoria. La dosis especffica puede variar dependiendo de uno o mas de: el agente particular elegido, el regimen de dosificacion que se tenga que seguir, si se administra en asociacion con otros compuestos, la sincronizacion de la administracion, el tejido que se tiene que someter a formacion de imagen y el sistema de suministro ffsico en el cual este soportado.
La practica de la presente invencion emplea, a menos que se indique de otro modo, tecnicas convencionales de inmunologfa, bioqufmica, qufmica, biologfa molecular, microbiologfa, biolog fa celular, ADN genomico y recombinante, que estan dentro de la destreza de la tecnica. Vease Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edicion (1.989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1.987)); las series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1.995)), Harlow and Lane, eds. (1.988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL AND ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1.987)).
Varios aspectos de la invencion se refieren a sistemas vector que comprenden uno o mas vectores o vectores como tales. Se pueden disenar vectores para expresion de transcritos CRISPR (por ejemplo, transcritos de acidos nucleicos, protefnas o enzimas) en celulas procariotas o eucariotas. Por ejemplo, se pueden expresar transcritos de CRISPR en celulas bacterianas tales como Escherichia coli, celulas de insecto (usando vectores de expresion de baculovirus), celulas de levaduras o celulas de mamfferos. Las celulas huesped adecuadas se discuten ademas en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego; Calif. (1.990). Como alternative, el vector de expresion recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras de activador T7 y polimerasa T7.
Se pueden introducir vectores y propagar en una procariota. En algunas realizaciones, se uso una procariota para multiplicar copias de un vector que se tiene que introducir en una celula eucariota o como un vector intermedio en la produccion de un vector que se tiene que introducir en una celula eucariota (por ej., multiplicando un plasmido como parte de un sistema de empaquetamiento de vector vfrico). En algunas realizaciones, se usa una procariota para multiplicar copias de un vector y expresar uno o mas acidos nucleicos, tal como para proporcionar una fuente de una o mas protefnas para suministro a una celula huesped u organismo huesped. La expresion de protefnas en procariotas se lleva a cabo lo mas frecuentemente en Escherichia coli con vectores que contienen activadores constitutivos o inducibles que dirigen la expresion de protefnas de fusion o de no fusion. Los vectores de fusion anaden una serie de aminoacidos a una protefna codificada allf, tal como al termino amino de la protefna recombinante. Dichos vectores de fusion pueden servir para uno o mas fines, tales como: (i) para aumentar la expresion de protefna recombinante; (ii) para aumentar la solubilidad de la protefna recombinante y (iii) para ayudar en la purificacion de la protefna recombinante actuando como un ligando de purificacion de afinidad. Con frecuencia, en vectores de expresion de fusion, se introduce un sitio de escision proteolftico en la union del resto de fusion y la protefna recombinante para permitir la separacion de la protefna recombinante del resto de fusion posterior a la purificacion de la protefna de fusion. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento o de origen similar, incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa. Vectores de expresion de fusion de ejemplo incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1.988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J.) que condensan glutationa S-transferasa (GST), protefna de union maltosa E o protefna A, respectivamente, a la protefna recombinante objetivo.
Ejemplos de vectores de expresion E. coli no de fusion, inducibles, adecuados, incluyen pTrc (Amrann et al., (1.988) Gene 69: 301-315) y pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calf. (1.990) 60-89).
En algunas realizaciones, un vector es un vector de expresion de levadura. Ejemplos de vectores para expresion en levadura Saccharomyces cerivisae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al., 1.987. eMbO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan
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and Herskowitz, 1.982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1.987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.).
En algunas realizaciones, un vector conduce la expresion de protefnas en celulas de insecto usando vectores de expresion de baculovirus. Los vectores baculovirus disponibles para expresion de protefnas en celulas de insecto cultivadas (por ej., celulas SF9) incluyen la serie pAc (Smith, et al., 1.983. Mol. Cell. Biol. 3: 2.156-2.165) y la serie pVL (Lucklow and Summers, 1.989. Virology 170: 31-39).
En algunas realizaciones, un vector es capaz de conducir la expresion de una o mas secuencias en celulas de mamffero usando un vector de expresion de mamffero. Ejemplos de vectores de expresion de mamffero incluyen pCDM8 (Seed, 1.987. Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman, et al., 1.987. EMBO J. 6: 187-195). Cuando se usa en celulas de mamffero, las funciones de control del vector de expresion se proporcionan tfpicamente por uno o mas elementos reguladores. Por ejemplo, los activadores usados comunmente proceden de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus 40 de simio y otros descritos en la presente memoria y conocidos en la tecnica. Para otros sistemas de expresion adecuados para ambas celulas procariotas y eucariotas veanse, por ejemplo, los Capftulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1.989.
En algunas realizaciones, el vector de expresion de mamfferos recombinante es capaz de dirigir la expresion del acido nucleico preferentemente en un tipo de celula particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores especfficos del tejido para expresar el acido nucleico). Los elementos reguladores especfficos del tejido son conocidos en la tecnica. Ejemplos no limitantes de activadores especfficos del tejido adecuados incluyen el activador de albumina (especffico del hfgado; Pinkert, et al., 1.987. Genes Dev. 1: 268-277), activadores especfficos linfoides (Calame and Eaton, 1.988. Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular activadores de receptores de las celulas T (winoto and Baltimore, 1.989. EMBO J. 8: 729-733) e inmunoglobulinas (Baneiji, et al., 1.983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1.983. Cell 33 : 741-748), activadores especfficos de las neuronas (por ej., el activador de neurofilamentos; Byrne and Ruddle, 1.989. Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 5.473-5.477), activadores especfficos del pancreas (Edlund, et al., 1.985. Science 230: 912-916) y activadores especfficos de las glandulas mamarias (por ej., activador de suero de leche; Patente de EE.UU. N° 4. 873. 316 y Publicacion de la Solicitud de Patente Europea N° 264.166). Tambien se incluyen activadores regulados por el desarrollo, por ej., los activadores de hox de murina (Kessel and Gruss, 1.990. Science 249: 374-379) y el activador de a-fetoprotefna (Campes and Tilghman, 1.989. Genes Dev. 3: 537-546).
En algunas realizaciones, un elemento regulador se une de manera operable a uno o mas elementos de un sistema CRISPR a fin de conducir la expresion de uno o mas elementos del sistema CRISPR. En general, las CRISPR (Repeticiones Palindromicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas), tambien conocid as como las SPIDR (Repeticiones Directas Intercaladas Separadas, por sus siglas en ingles), constituyen una familia de sitios de ADN que son normalmente especfficos para una especie bacteriana particular. El sitio de CRISPR comprende una clase distinta de repeticiones de secuencias cortas intercaladas (las SSR) que se reconocieron en E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol., 169: 5.429-5.433 [1.987] y Nakata et al., J. Bacteriol., 171: 3.553-3.556 [1.989]) y genes asociados. Las SSR intercaladas similares han sido identificadas en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Vease, Groenen et al., Mol. Microbiol., 10: 1.057-1.065 [1.993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5: 254-263 [1.999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1.307: 26-30 [1.996] y Mojica et al., Mol. Microbiol., 17: 85-93 [1.995]). El sitio de CRISPR difiere tfpicamente de las otras SSR por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones espaciadas regularmente cortas (las SRSR) (Janssen et al. OMICS J. Integ. Biol., 6: 23-33 [2.002] y Mojica et al., Mol. Microbiol., 36: 244-246 [2.000]). En general, las repeticiones son elementos cortos que tienen lugar en agrupaciones que estan regularmente espaciadas por secuencias de intervencion unicas con una longitud sustancialmente constante (Mojica et al., [2.000], supra). Aunque las secuencias de repeticiones se conservan mucho entre cepas, el numero de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones espaciadoras difiere tfpicamente de cepa a cepa (van Embden et al., J. Bacteriol., 182: 2.393-2.401 [2.000]). Se ha identificado el sitio de CRISPR en mas de 40 procariotas (Vease por ej., Jansen et al., Mol. Microbiol., 43: 1.565-1.575 [2.002] y Mojica et al., [2.005]) incluyendo, pero no limitado a Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus. Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacteiium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Theimoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella. Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pastaunella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.
En general, "sistema CRISPR" se refiere colectivamente a transcritos y otros elementos implicados en la expresion de o dirigidos a la actividad de genes asociados a CRISPR ("Cas"), incluyendo secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (CRISPR trans-activante) (por ej., ARNtracr o un ARNtracr parcial activo), una secuencia de emparejamiento tracr (incluyendo una "repeticion dirigida" y una repeticion directa parcial tratada por ARNtracr en el contexto de un sistema CRISPR endogeno), una secuencia gufa (tambien referida como un "espaciador" en el contexto de un sistema CRISPR endogeno) u otras secuencias y transcritos de un sitio CRISPR. En algunas realizaciones, uno o mas elementos de un sistema CRISPR procede de un sistema CRISPR tipo I, tipo II o tipo III. En algunas realizaciones, uno o mas elementos de un sistema CRISPR procede de un organismo particular que
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comprende un sistema CRISPR endogeno, tal como Streptococcus pyogenes. En general, un sistema CRISPR se caracteriza por elementos que activan la formacion de un complejo CRISPR en el sitio de una secuencia objetivo (tambien referido como un protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endogeno). En el contexto de formacion de un complejo CRISPR, "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia para la que se disena que una secuencia gufa presente complementariedad, donde la hibridacion entre una secuencia objetivo y una secuencia gufa active la formacion de un complejo CRISPR. No se requiere necesariamente complementariedad completa, siempre que haya suficiente complementariedad para producir hibridacion y activar la formacion de un complejo CRISPR. Una secuencia objetivo puede comprender cualquier polinucleotido, tal como polinucleotido de ADN o ARN. En algunas realizaciones, se situa una secuencia objetivo en el nucleo o citoplasma de una celula. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo puede estar dentro de un organelo de una celula eucariota, por ejemplo, mitocondria o cloroplasto. Una secuencia o plantilla que se puede usar para recombinacion en el sitio fijado como objetivo que comprende las secuencias objetivo se refiere como “ plantilla de edicion” o “polinucleotido de edicion” o “secuencia de edicion”. En aspectos de la invencion, un polinucleotido de plantilla exogeno se puede referir como una plantilla de edicion. En un aspecto de la invencion la recombinacion es recombinacion homologa.
Tfpicamente, en el contexto de un sistema CRISPR endogeno, la formacion de un complejo CRISPR (que comprende una secuencia gufa hibridada a una secuencia objetivo y complejada con una o mas protefnas Cas) da como resultado la escision de una o mas hebras en o cerca de (por ej., dentro de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 o mas pares de bases de) la secuencia objetivo. Sin desear estar limitados por la teorfa, la secuencia tracr, que puede comprender o constar de toda o una porcion de una secuencia tracr de tipo natural (por ej., aproximadamente o mas de aproximadamente 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 o mas nucleotidos de una secuencia tracr de tipo natural), tambien puede formar parte de un complejo CRISPR, tal como por hibridacion a lo largo de al menos una porcion de la secuencia tracr a toda o una porcion de una secuencia de emparejamiento tracr que este ligada de manera operable a la secuencia gufa. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta suficiente complementariedad a una secuencia de emparejamiento tracr para hibridar y participar en la formacion de un complejo CRISPR. Como con la secuencia objetivo, se cree que no es necesaria la complementariedad completa, siempre que haya suficiente para que sea funcional. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejamiento tracr cuando se alinea de manera optima. En algunas realizaciones, uno o mas vectores que conducen la expresion de uno o mas elementos de un sistema CRISPR se introducen en una celula huesped de manera que la expresion de los elementos del sistema CRISPR dirija la formacion de un complejo CRISPR en uno o mas sitios objetivo. Por ejemplo, una enzima Cas, una secuencia gufa ligada a una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr podfan estar unidas cada una de manera operable a elementos reguladores separados en vectores separados. Como alternative, dos o mas de los elementos expresados de los mismos o diferentes elementos reguladores, se pueden combinar en un vector unico, proporcionando uno o mas vectores adicionales cualquier componente del sistema CRISPR no incluido en el primer vector. Los elementos del sistema CRISPR que se combinan en un unico vector se pueden disponer en cualquier orientaaon adecuada, tal como un elemento situado en 5' con respecto a ("aguas arriba" de) o 3' con respecto a ("aguas abajo" de) un segundo elemento. La secuencia codificadora de un elemento puede estar situada en la misma hebra u opuesta de la secuencia codificadora de un segundo elemento y orientada en la misma direccion u opuesta. En algunas realizaciones, un activador unico conduce la expresion de una transcripcion que codifica una enzima CRISPR y una o mas de la secuencia gufa, la secuencia de emparejamiento tracr (opcionalmente unida de manera operable a la secuencia gufa) y una secuencia tracr embebida dentro de una o mas secuencias intron (por ej., cada una en un intron diferente, dos o mas en al menos un intron o todas en un solo intron). En algunas realizaciones, la enzima CRISPR, secuencia gufa, secuencia de emparejamiento tracr y secuencia tracr se unen de manera operable a y se expresan a partir del mismo activador.
En algunas realizaciones, un vector comprende uno o mas sitios de insercion, tal como una secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restriccion (tambien referido como un “sitio de clonadon”). En algunas realizaciones, uno o mas sitios de insercion (por ej., aproximadamente o mas de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas sitios de insercion) estan situados aguas arriba y/o aguas abajo de uno o mas elementos de secuenca de uno o mas vectores. En algunas realizaciones, un vector comprende un sitio de insercion aguas arriba de una secuencia de emparejamiento tracr y opcionalmente aguas abajo de un elemento regulador unido de manera operable a la secuencia de emparejamiento tracr, de manera que despues de la insercion de una secuencia gufa en el sitio de insercion y en la expresion de la secuencia gufa dirija la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo en una celula eucariota. En algunas realizaciones, un vector comprende dos o mas sitios de insercion, estando situado cada sitio de insercion entre dos secuenaas de emparejamiento tracr de manera que se permita la insercion de una secuencia gufa en cada sitio. En dicha disposicion, dos o mas secuencas gufa pueden comprender dos o mas copias de una secuencia gufa unica, dos o mas secuencias gufa diferentes o combinaciones de estas. Cuando se usan multiples secuencias gufa diferentes, se puede usar una construccion de expresion unica para fijar como objetivo la actividad de CRISPR a multiples secuencias objetivo correspondientes, diferentes, dentro de una celula. Por ejemplo, un solo vector puede comprender aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o mas secuenaas gufa. En algunas realizaciones, se pueden proporcionar aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas de tales vectores que contienen secuencia gufa y se suministran opcionalmente a una celula.
En algunas realizaciones, un vector comprende un elemento regulador unido de manera operable a una secuencia
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codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR, tal como una protefna Cas. Ejemplos no limitantes de protefnas Cas incluyen Cas1, CasIB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (tambien conocidas como Csn1 y Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homologos de las mismas o versiones modificadas de las mismas. Estas enzimas son conocidas; por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de protefna Cas9 de S. pyogenes se puede encontrar en la base de datos SwissProt con el numero de acceso Q99ZW2. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR no modificada presenta actividad de escision de ADN, tal como Cas9. En algunas realizaciones la enzima CRISPR es Cas9 y puede ser Cas9 de S. pyogenes o S. pneumoniae. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escision de una o ambas hebras en la posicion de una secuencia objetivo, tal como dentro de la secuencia objetivo y/o dentro del complemento de la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escision de una o ambas hebras dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 o mas pares de bases del primer o el ultimo nucleotido de una secuencia objetivo. En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que muta con respecto a una enzima de tipo natural correspondiente de manera que la enzima CRISPR mutada carece de la capacidad para escindir una o ambas hebras de un polinucleotido objetivo que contiene una secuencia objetivo. Por ejemplo, una sustitucion de aspartato a alanina (D10A) en el dominio catalftico RuvC I de Cas9 de S. pyogenes convierte Cas9 de una nucleasa que escinde ambas hebras a una nickasa (escinde una unica hebra). Otros ejemplos de mutaciones que hacen Cas9 una nickasa incluyen, sin limitacion, H840A N854A y N863A En algunas realizaciones, se puede usar una nickasa de Cas9 junto con secuencia o secuencias gufa, por ejemplo, dos secuencias gufa, que fijan como objetivo hebras transcrita y complementaria respectivamente del objetivo de ADN. Esta combinacion permite que ambas hebras sean nickeadas y usadas para inducir NHEJ. Los solicitantes han demostrado (datos no mostrados) la eficacia de dos objetivos de nickasa (es decir, los ARNsg fijados como objetivo en la misma posicion pero para diferentes hebras de ADN) en la induccion de NHEJ mutagenico. Una unica nickasa (Cas9-D10A con un unico ARNsg) es incapaz de inducir NHEJ y crear inserciones o supresiones pero los Solicitantes han demostrado en la nickasa doble (Cas9-D10A y dos ARNsg fijados como objetivo a diferentes hebras en la misma posicion) lo puede hacer en celulas madre embrionarias humanas (las hESC). La eficacia es aproximadamente 50% de nucleasa (es decir, Cas9 regular sin mutacion D10) en las hESC.
Como un ejemplo mas, dos o mas dominios catalfticos de Cas9 (RuvC I, RuvC II y RuvC III) pueden mutar para producir un Cas9 mutado que carece sustancialmente de toda actividad de escision de ADN. En algunas realizaciones, una mutacion de D10A se combina con una o mas de las mutaciones H840A N854A o N863A para producir una enzima Cas9 que carece sustancialmente de toda actividad de escision de ADN. En algunas realizaciones, se considera que una enzima CRISPR carece sustancialmente de toda actividad de escision de ADN cuando la actividad de escision de ADN de la enzima mutada es menor que aproximadamente 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% o menor con respecto a su forma no mutada. Pueden ser utiles otras mutaciones; en el caso de que la Cas9 u otra enzima CRISPR sea de una especie distinta de S. pyogenes, se pueden realizar mutaciones en los correspondientes aminoacidos para conseguir efectos similares.
En algunas realizaciones, una secuencia codificadora de enzimas que codifica una enzima CRISPR es codon optimizada para expresion en celulas particulares, tales como celulas eucariotas. Las celulas eucariotas pueden ser aquellas de, o procedentes de, un organismo particular, tal como un mamffero, incluyendo pero no limitado a, ser humano, raton, rata, conejo, perro o primate no ser humano. En general, optimizacion de codon se refiere a un procedimiento para modificar una secuencia de acidos nucleicos para mejorar la expresion en las celulas huesped de interes reemplazando al menos un codon (por ej., aproximadamente o mas de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o mas codones) de la secuencia natural con codones que se usan mas frecuentemente o lo mas frecuentemente en los genes de esa celula huesped al tiempo que se mantiene la secuencia de aminoacidos natural. Diversas especies presentan sesgo particular para ciertos codones de un aminoacido particular. El sesgo de codones (diferencias en el uso de codones entre organismos) con frecuencia se correlaciona con la eficacia de traduccion de ARN mensajero (ARNm), que se cree a su vez que depende de, entre otras cosas, las propiedades de los codones que se estan traduciendo y la disponibilidad de moleculas de ARN de transferencia (ARNt) particulares. La predominancia de los ARNt seleccionados en una celula es en general una reflexion de los codones usados lo mas frecuentemente en sfntesis de peptidos. De acuerdo con esto, se pueden adaptar los genes para expresion optima de los genes en un organismo determinado basandose en optimizacion de codones. Las tablas de utilizacion de codones estan facilmente disponibles, por ejemplo, en la “Base de Datos de Uso de Codones”, y estas tablas se pueden adaptar de una serie de maneras. Vease Nakamura Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28: 292 (2.000). Tambien estan disponibles algoritmos de ordenador para codones optimizando una secuencia particular para expresion en una celula huesped particular, tales como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA). En algunas realizaciones, uno o mas codones (por ej., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o mas o todos los codones) en una secuencia codificando una enzima CRISPR corresponden al codon usado lo mas frecuentemente para un aminoacido particular.
En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que comprende una o mas secuencias de localizacion nuclear (las NLS, por sus siglas en ingles), tales como aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas NLS. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR comprende aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas NLS en o cerca del amino terminal, aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas NLS en o cerca del carboxi terminal o una combinacion
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de estos (por ejemplo, una o mas NLS en el amino terminal y una o mas NLS en el carboxi terminal). Cuando esta presente mas de una NLS, cada una se puede seleccionar independientemente de las otras, de manera que puede estar presente una sola NLS en mas de una copia y/o junto con otra u otras NLS mas presentes en una o mas copias. En una realizacion preferida de la invencion, la enzima CRISPR comprende a lo sumo 6 NLS. En algunas realizaciones, se considera una NLS cerca del N- o C-terminal cuando el aminoacido mas cercano de la NLS esta dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o mas aminoacidos a lo largo de la cadena polipeptfdica del N o C-terminal. Tfpicamente, una NLS consta de una o mas secuencias cortas de lisinas o argininas cargadas positivamente expuestas en la superficie de la protefna, pero se conocen otros tipos de NLS. Ejemplos no limitantes de las NLS incluyen una secuencia de NLS procedente de: la NLS del antfgeno T grande del virus SV40, que tiene la secuencia de aminoacidos PKKKRKV; la NLS de nucleoplasmina (por ej., la NLS bipartita de nucleoplasmina con la secuencia KRPAATKKAGQAKKKK); la NLS de c-myc que tiene la secuencia de aminoacidos PAAKRVKLD o RQRRNELKRSP; la NLS M9 del hRNPA1 que tiene la secuencia NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY; la secuencia
RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV del dominio IBB de importina-alfa; las secuencias VSRKRPRP y PPKKARED de la protefna T de mioma; la secuencia POPKKKPL de p53 humano; la secuencia SALIKKKKKMAP de c-abl IV de raton; las secuencias DRLRR y PKQKKRK del virus de la influenza NS1; la secuencia RKLKKKIKKL del antfgeno delta del virus de la Hepatitis; la secuencia REKKKFLKRR de la protefna Mx1 de raton; la secuencia KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK de la poli(ADP-ribosa) polimerasa humana y la secuencia RKCLQAGMNLEARKTKK del glucocorticoide de receptores de hormonas esteroideas (humano).
En general, una o mas NLS son de suficiente fortaleza para conducir la acumulacion de la enzima CRISPR en una cantidad detectable en el nucleo de una celula eucariota. En general, la fortaleza de actividad de localizacion nuclear puede proceder del numero de las NLS en la enzima CRISPR, la o las NLS particulares usadas o una combinacion de estos factores. La deteccion de acumulacion en el nucleo se puede realizar por cualquier tecnica adecuada. Por ejemplo, se puede condensar un marcador detectable a la enzima CRISPR, de manera que se pueda visualizar la localizacion dentro de una celula, tal como junto con un medio para detectar la localizacion del nucleo (por ejemplo, una mancha especffica para el nucleo tal como DAPI). Ejemplos de marcadores detectables incluyen protefnas fluorescentes (tales como protefnas fluorescentes Verdes o GFP; RFP; CFP) y etiquetas de epftopos (etiqueta HA, etiqueta bandera, etiqueta SNAP). Tambien se pueden aislar los nucleos celulares de las celulas, los contenidos de los cuales se pueden analizar despues por cualquier procedimiento adecuado para detectar protefna, tal como immunohistoqufmica, ensayo de Western o ensayo de actividad enzimatica. La acumulacion en el nucleo tambien se puede determinar de una manera indirecta, tal como por un ensayo para el efecto de la formacion de complejo CRISPR (por ejemplo, ensayo para escision de ADN o mutacion en la secuencia objetivo o ensayo para actividad de expresion de genes modificada afectada por la formacion de complejo CRISPR y/o actividad de la enzima CRISPR), cuando se compara con un control no expuesto a la enzima o complejo CRISPR o expuesto a una enzima CRISPR que carece de una o mas NLS.
En general, una secuencia gufa es cualquier secuencia de polinucleotidos que tiene suficiente complementariedad con una secuencia de polinucleotidos objetivo para hibridacion con la secuencia objetivo y dirigir la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre una secuencia gufa y su correspondiente secuencia objetivo, cuando se alinean de manera optima usando un algoritmo de alineacion adecuado, es aproximadamente o mas de aproximadamente 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o mas. La alineacion optima se puede determinar con el uso de cualquier algoritmo adecuado para alinear secuencias, ejemplo no limitante de lo cual incluye el algoritmo Smith- Waterman, el algoritmo Needleman-Wunsch, los algoritmos basados en la transformacion de Burro ws-Wheeler (por ej., el Alineador de Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn) y Maq (disponible en maq.sourceforge.net). En algunas realizaciones, una secuencia gufa es aproximadamente o mas de aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o mas nucleotidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia gufa es menor que aproximadamente 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 o menos nucleotidos de longitud. La capacidad de una secuencia gufa para dirigir la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo se puede evaluar por cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, los componentes de un sistema CRISPR suficientes para formar un complejo CRISPR, incluyendo la secuencia gufa que se tiene que ensayar, se puede proporcionar a una celula huesped que tenga la correspondiente secuencia objetivo, tal como por transfeccion con vectores que codifiquen los componentes de la secuencia CRISPR, seguido por una evaluacion de la escision preferente dentro de la secuencia objetivo, tal como mediante ensayo Surveyor como se describe en la presente memoria. De manera similar, la escision de una secuencia de polinucleotido objetivo se puede evaluar en un tubo de ensayo proporcionando la secuencia objetivo, los componentes de un complejo CRISPR, incluyendo la secuencia gufa que se tiene que ensayar y una secuencia gufa de control diferente de la secuencia gufa de ensayo y comparando la union o velocidad de escision en la secuencia objetivo entre las reacciones de la secuencia gufa de ensayo y de control. Son posibles otros ensayos, y tendran lugar para los expertos en la materia.
Se puede seleccionar una secuencia gufa para fijar como objetivo cualquier secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo es una secuencia dentro de un genoma de una celula. Las secuencias objetivo ejemplares incluyen aquellas que son unicas en el genoma objetivo. Por ejemplo, para la Cas9 de S. pyogenes, una
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secuencia objetivo unica en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de la forma
MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG donde NNNNNNNNNNNNXGG (N es A G, T o C y X puede ser cualquiera) presenta un solo caso en el genoma. Una unica secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de S. pyogenes de la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG donde NNNNNNNNNNNXGG (N es A G, T o C y X puede ser cualquiera) presenta un solo caso en el genoma. Para la Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus, una unica secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAA W donde NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (N es A G, T o C; X puede ser cualquiera y W es A o T) presenta un solo caso en el genoma. Una unica secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus de la forma
MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW donde NNNNNNNNNNNXXAGAAW (N es A G, T o C; X puede ser cualquiera y W es A o T) presenta un solo caso en el genoma. Para la Cas9 de S. pyogenes, una sola secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG donde NNNNNNNNNNNNXGGXG (N es A G, T o C y X puede ser cualquiera) presenta un solo caso en el genoma. Una unica secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de S. pyogenes de la forma MMMMMMMMNMNNNNNNNNNNXGGXG donde NNNNNNNNNNNXGGXG (N es A G, T o C y X puede ser cualquiera) presenta un unico caso en el genoma. En cada una de estas secuencias "M" puede ser A, G, T o C y requiere que no se considere en la identificacion de una secuencia como unica.
En algunas realizaciones, una secuencia gufa se selecciona para reducir el grado de estructura secundaria dentro de la secuencia gufa. La estructura secundaria se puede determinar por cualquier algoritmo de plegamiento de polinucleotidos adecuado. Algunos programas se basan en calcular la energfa libre minima de Gibbs. Un ejemplo de uno de tales algoritmos es mFold, como se describe por Zuker y Stiegler (Nucleic Acid Res. 9 (1.981), 133-148). Otro algoritmo de plegamiento de ejemplo es el RNAfold Webserver online, desarrollado en el Instituto para Qufmica Teorica de la Universidad de Viena, usando el algoritmo de prediccion de estructura centroide (vease por ej., A. R. Gruber et al., 2.008, Cell 106 (1): 23-24 y PA Carr y GM Church, 2.009, Nature Biotechnology 27 (12): 1.151-62).
En general, una secuencia de emparejamiento tracr incluye cualquier secuencia que presente suficiente complementariedad con una secuencia tracr para activar uno o mas de: (1) escision de una secuencia gufa flanqueada por secuencias de emparejamiento tracr en una celula que contiene la correspondiente secuencia tracr y (2) formacion de un complejo CRlSPR en una secuencia objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende la secuencia de emparejamiento tracr hibridada a la secuencia tracr. En general, el grado de complementariedad es con referencia al alineamiento optimo de la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr, junto con la longitud del acortador de las dos secuencias. El alineamiento optimo se puede determinar por cualquier algoritmo de alineamiento adecuado y puede justificar ademas estructuras secundarias, tal como autocomplementareidad dentro de cualquiera la secuencia tracr o la secuencia de emparejamiento tracr. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr junto con la longitud del acortador de las dos cuando se alinean de manera optima es aproximadamente o mas de aproximadamente 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o mayor. Las ilustraciones de ejemplo de alineacion optima entre una secuencia tracr y una secuencia de emparejamiento tracr se proporcionan en las Figuras 12B y 13B. En algunas realizaciones, la secuencia tracr es aproximadamente o mas de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 o mas nucleotidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia tracr y secuencia de emparejamiento tracr estan contenidas dentro de una transcripcion unica, de manera que la hibridacion entre las dos produce un transcripto con una estructura secundaria, tal como una horquilla. Las secuencias formadoras de lazo preferidas para uso en estructuras de horquilla tienen cuatro nucleotidos de longitud y lo mas preferiblemente tienen la secuencia GAAA. Sin embargo, se pueden usar secuencias de lazo mas largas o mas cortas, como se pueden usar secuencias alternativas. Las secuencias incluyen preferiblemente un triplete nucleotido (por ejemplo, AAA) y un nucleotido adicional (por ejemplo C o G). Ejemplos de secuencias formadoras de lazo incluyen CAAA y AAAG. En una realizacion de la descripcion, el transcripto o secuencia de polinucleotidos transcrita presenta al menos dos o mas horquillas. En realizaciones preferidas, el transcripto presenta dos, tres, cuatro o cinco horquillas. En una realizacion mas de la descripcion, el transcripto presenta a lo sumo cinco horquillas. En algunas realizaciones, el transcripto unico incluye ademas una secuencia de terminacion de la transcripcion; preferiblemente esta es una secuencia poliT, por ejemplo seis nucleotidos T. Una ilustracion de ejemplo de dicha estructura de horquilla se proporciona en la porcion inferior de la Figura 13B, donde la porcion de la secuencia 5' del "N" final y aguas arriba del lazo corresponde a la secuencia de emparejamiento tracr y la porcion de la secuencia 3' del lazo corresponde a la secuencia tracr. Ejemplos no limitantes adicionales de polinucleotidos unicos que comprenden una secuencia gufa, una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr son como sigue (enumerados 5' a 3'), donde "N" representa una base de una secuencia gufa, el primer bloque de letras minusculas representan la secuencia de emparejamiento tracr y el segundo bloque de letras minusculas secuencia representa la secuencia tracr y la secuencia poli-T final representa el terminador de la transcripcion: (1) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggctt catgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT; (2)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT; (3)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT; (4)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaa
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NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaa aaagtgTTTTTTT; y (6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTT TTT. En algunas realizaciones, las secuencias (1) a (3) se usan junto con Cas9 de CRISPR1 S. thermophilus. En algunas realizaciones, las secuencias (4) a (6) se usan junto con Cas9 de S. pyogenes. En algunas realizaciones, la secuencia tracr es un transcrito separado de una transcripcion que comprende la secuencia de emparejamiento tracr (tal como se ilustra en la porcion superior de la Figura 13B).
En algunas realizaciones, tambien se proporciona una plantilla de recombinacion. Una plantilla de recombinacion puede ser un componente de otro vector como se describe en la presente memoria, contenido en un vector separado o proporcionado como un polinucleotido separado. En algunas realizaciones, se disena una plantilla de recombinacion para servir como una plantilla en recombinacion homologa, tal como dentro de o cerca de una secuencia objetivo nickeada o escindida por una enzima CRISPR como parte de un complejo CRISPR. Un polinucleotido de plantilla puede ser de cualquier longitud adecuada, tal como aproximadamente o mas de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1.000 o mas nucleotidos de longitud. En algunas realizaciones, el polinucleotido de plantilla es complementario a una porcion de un polinucleotido que comprende la secuencia objetivo. Cuando se alinea de manera optima, un polinucleotido de plantilla puede solaparse con uno o mas nucleotidos de una secuencia objetivo (por ej., aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mas nucleotidos). En algunas realizaciones, cuando una secuencia de plantilla y un polinucleotido que comprende una secuencia objetivo se alinean de manera optima, el nucleotido mas cercano del polinucleotido de plantilla esta dentro de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1.000, 5.000, 10.000 o mas nucleotidos de la secuencia objetivo.
En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es parte de una protefna de fusion que comprende uno o mas dominios de protefna heterologa (por ej., aproximadamente o mas de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas dominios ademas de la enzima CRISPR). Una protefna de fusion de enzima CRISPR puede comprender cualquier secuencia de protefnas adicional y opcionalmente una secuencia ligadora entre dos dominios cualesquiera. Ejemplos de dominios de protefnas que se pueden condensar a una enzima CRISPR incluyen, sin limitacion, etiquetas de epftopos, secuencias de genes informadores y dominios de protefnas con una o mas de las siguientes actividades: actividad de metilasa, actividad de desmetilasa, actividad de activacion de la transcripcion, actividad de represion de la transcripcion, actividad del factor de liberacion de la transcripcion, actividad de modificacion de histona, actividad de escision de ARN y actividad de union de acidos nucleicos. Ejemplos no limitantes de etiquetas de epftopos incluyen etiquetas de histidina (His), etiquetas V5, etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina de la influenza (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G y etiquetas de tioredoxina (Trx). Los ejemplos de genes informadores incluyen, pero no se limitan a, glutationa-S-transferasa (GST), peroxidasa de rabano (HRP, por sus siglas en ingles), cloramfenicol acetiltransferasa (CAT, por sus siglas en ingles) beta-galactosidasa, beta- glucuronidasa, luciferasa, protefna fluorescente verde (PFV), HcRed, DsRed, protefna fluorescente cian (PFC) protefna fluorescente amarilla (PFAm) y protefnas autofluorescentes incluyendo protefna fluorescente azul (PFA). Una enzima CRISPR se puede condensar a una secuencia de genes que codifique una protefna o un fragmento de una protefna que una moleculas de ADN u otras moleculas celulares, incluyendo pero no limitandose a (por sus siglas en ingles), protefna de union de maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones de dominios de union de ADN Lex A (DBD), fusiones de dominios de union de ADN GAL4 y fusiones de protefnas BP16 de virus del herpes simple (HSV). Los dominios adicionales que pueden formar parte de una protefna de fusion que comprende una enzima CRISPR se describen en la patente de EE.UU. 20110059502. En algunas realizaciones, se usa una enzima CRISPR etiquetada para identificar la posicion de una secuencia objetivo.
En algunos aspectos, la descripcion proporciona metodos que comprenden suministrar uno o mas polinucleotidos, tales como o uno o mas vectores como se describe en la presente memoria, uno o mas transcritos de los mismos y/o una o protefnas transcritas de allf, a una celula huesped. En algunos aspectos, la descripcion proporciona ademas celulas producidas por tales metodos y organismos (tales como animales, plantas u hongos) que comprenden o son producidos de tales celulas. En algunas realizaciones, se suministra una enzima CRISPR junto con (y opcionalmente complejada con) una secuencia gufa a una celula. Se pueden usar metodos de transferencia de genes con base vfrica y no vfrica convencionales para introducir acidos nucleicos en celulas de mamffero o tejidos objetivo. Se pueden usar dichos metodos para administrar componentes que codifican acidos nucleicos de un sistema CRISPR a celulas en cultivo o en un organismo huesped. Los sistemas de suministro de vectores no vfricos incluyen plasmidos de ADN, ARN (por ej., un transcrito de un vector descrito en la presente memoria), acido nucleico desnudo y acido nucleico complejado con un vehfculo de suministro, tal como un liposoma. Los sistemas de suministro de vectores vfricos incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados despues de suministro a la celula. Para una revision de procedimientos de tratamiento de genes, vease Anderson, Science 256: 808-813 (1.992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11: 211-217 (1.993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166
(1.993); Dillon, TIBTECH 11: 167-175 (1.993); Miller, Nature 357: 455-460 (1.992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10): 1.149-1.154 (1.988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36 (1.995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51 (1): 31-44 (1.995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1.995) y Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1.994).
Los metodos de suministro no vfrico de acidos nucleicos incluyen lipofeccion, nucleofeccion, microinyeccion,
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biolfstica, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de polication o Ifpidoiacido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales y absorcion de ADN aumentada por agente. La lipofecion se describe en por ej., Las Patentes de EE.UU. N° 5.049.386, 4.946.787 y 4.897.355) y se venden comercialmente los reactivos de lipofecion (por ej., Transfectam™ y Lipofectin™). Los lfpidos cationicos y neutros que son adecuados para lipofecion de reconocimiento de receptores eficaz de polinucleotidos incluyen aquellos de Felgner, Patente Internacional WO 91/17424; Patente Internacional WO 91/16024. El suministro puede ser a celulas (por ej., administracion in vitro o ex vivo) o tejidos objetivo (por ej., administracion in vivo).
La preparacion de complejos de lfpidoiacido nucleico, incluyendo liposomas fijados como objetivo tales como complejos de inmunolfpidos, es conocida para un experto en la materia (vease, por ej., Crystal, Science 270: 404410 (1.995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1.995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382-389
(1.994) ; Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1.994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1.995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4.817-4.820 (1.992); Patentes de EE.UU. N° 4.186.183; 4.217.344; 4.235.871; 4.261.975; 4.485.054; 4.501.728; 4.774.085; 4.837.028 y 4.946.787).
El uso de sistemas de base vfrica de ARN o ADN para el suministro de acidos nucleicos toma ventaja de los procedimientos altamente desarrollados para fijar como objetivo un virus a celulas especfficas en el cuerpo y traficar la carga util vfrica al nucleo. Se pueden administrar vectores vfricos directamente a pacientes (in vivo) o se pueden usar para tratar celulas in vitro y las celulas modificadas se pueden administrar opcionalmente a los pacientes (ex vivo). Los sistemas con base vfrica convencionales podfan incluir vectores retrovirales, de lentivirus, adenovirales, adenoasociados y del virus del herpes simple para transferencia de genes. La integracion en el genoma huesped es posible con los metodos de transferencia de genes de retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados, dando como resultado con frecuencia expresion a largo plazo del transgen insertado. Adicionalmente, se han observado altas eficacias de transduccion en muchos tipos celulares diferentes y tejidos fijados como objetivo.
El tropismo de un retrovirus se puede modificar por incorporacion de protefnas de sobre extranas, expandiendo la poblacion objetivo potencial de celulas objetivo. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que son capaces de transducir o infectar celulas no de division y tfpicamente producen tftulos vfricos altos. La seleccion de un sistema de transferencia de genes retrovirales dependerfa por lo tanto del tejido objetivo. Los vectores retrovirales estan constituidos por repeticiones terminales largas que actuan en cis con capacidad de empaquetamiento para hasta 610 kb de secuencia extrana. Las mfnimas LTR que actuan en cis son suficientes para la replicacion y empaquetamiento de los vectores, que se usan despues para integrar el gen terapeutico en la celula objetivo para proporcionar expresion de transgenes permanente. Los vectores retrovirales ampliamente usados incluyen los basados en virus de la leucemia murina (MuLV), virus de la leucemia del mono gibon (GaLV), virus de la inmunodeficiencia simia (VIS), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos (vease, por ej., Buchscher et al., J. Virol. 66: 2.731-2.739 (1.992); Johann et al., J. Virol. 66: 1.635-1.640 (1.992); Sommnerfelt et al., Virol. 176: 58-59 (1.990); Wilson et al., J. Virol. 63: 2.374-2.378 (1.989); Miller et al., J. Virol. 65: 2.220-2.224 (1991); Patente de EE.UU. PCT/US94/05700).
En aplicaciones donde se prefiere la expresion transitoria, se pueden usar sistemas a base de adenovirus. Los vectores a base de adenovirus son capaces de una eficacia de transduccion muy alta en muchos tipos de celulas y no requieren division celular. Con tales vectores, se han obtenido altos tftulos y niveles de expresion. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Tambien se pueden usar vectores de virus adenoasociados (“AAV”, por sus siglas en ingles) para transducir celulas con acidos nucleicos objetivo, por ejemplo, en la produccion in vitro de acidos nucleicos y peptidos y para procedimientos de tratamiento con genes in vivo y ex vivo (vease, por ej., West et al., Virology 160: 38-47 (1.987); la Patente de EE.UU. N° 4.797.368; la patente internacional Wo 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801 (1.994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1.351
(1.994) . Se describe la construccion de vectores AAV recombinantes en una serie de publicaciones, incluyendo la Patente de EE.UU. N° 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3.251-3.260 (1.985); Tratschin, et al., Mol. Cell Biol. 4: 2.072-2.081 (1.984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: 6.466-6.470 (1.984) y Samulski et al., J. Virol. 63: 03822-3828 (1.989).
Tfpicamente se usan celulas de empaquetamiento para formar partfculas de virus que sean capaces de infectar una celula huesped. Tales celulas incluyen celulas 293, que empaquetan adenovirus, y celulas ^2 o celulas PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores vfricos usados en terapia genica se generan habitualmente produciendo una estirpe celular que empaqueta un vector de acidos nucleicos en una partfcula vfrica. Los vectores contienen tfpicamente las mfnimas secuencias vfricas requeridas para empaquetamiento y posterior integracion en un huesped, siendo reemplazadas otras secuencias vfricas por una casete de expresion para el polinucleotido o los polinucleotidos que se tienen que expresar. Las funciones vfricas que faltan se suministran tfpicamente en trans por la estirpe celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores AAV usados en terapia genica tfpicamente poseen solo secuencias ITR del genoma AAV que se requieren para empaquetamiento e integracion en el genoma huesped. El ADN vfrico se empaqueta en una estirpe celular, que contiene un plasmido auxiliar que codifica los otros genes AAV, es decir rep y cap, pero carecen de secuencias ITR. La estirpe celular tambien puede infectarse con adenovirus como auxiliar. El virus auxiliar activa la replicacion del vector AAV y la expresion de genes AAV del plasmido auxiliar. El plasmido auxiliar no se empaqueta en cantidades significativas debido a ausencia de secuencias ITR. La contaminacion con adenovirus se puede reducir por, por ejemplo, tratamiento termico al cual es mas sensible el adenovirus que AAV. Los metodos adicionales para el suministro de acidos nucleicos a celulas son
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conocidos para los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 20030087817.
En algunas realizaciones, una celula huesped se transfecta de manera transitoria o de manera no transitoria con uno o mas vectores descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, una celula se transfecta como tiene lugar de manera natural en un individuo. En algunas realizaciones, una celula que se transfecta es tomada de un individuo. En algunas realizaciones, la celula procede de celulas tomadas de un individuo, tales como una estirpe celular. Una amplia variedad de estirpes celulares de cultivos de tejido se conocen en la tecnica. Ejemplos de estirpes celulares incluyen, pero no se limitan a, C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, epitelial de rinon de mono BS-C-1, fibroblasto de embrion de raton BALB/ 3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, fibroblastos fetales humanos 132-d5; fibroblastos de raton 10.1,293-T, 3T3, 721,9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, celulas BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, celulas JY, celulas K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma- Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145 estirpes celulares OPCN / OPCT, Peer, PNT-1A/ PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, celulas Saos-2, Sf- 9, SkBr3, T2, T-47D, T84, estirpe celular THP1, U373, U87, U937, VCaP, celulas Vero, WM39, WT-49, X63 YAC-1, YAR y variedades transgenicas de los mismos. Las estirpes celulares estan disponibles de una variedad de fuentes conocidas por los expertos en la materia (vease, por ej., La Coleccion de Cultivos de Tipo Americano (ATCC, por sus siglas en ingles) (Manassus, Va.)). En algunas realizaciones, una celula transfectada con uno o mas vectores descritos en la presente memoria se usa para establecer una nueva estirpe celular que comprende una o mas secuencias procedentes de vector. En algunas realizaciones, una celula transfectada de manera transitoria con los componentes de un sistema CRISPR como se describe en la presente memoria (tal como por transfeccion transitoria de uno o mas vectores o transfeccion con ARN) y modificada por la actividad de un complejo CRISPR, se usa para establecer una nueva estirpe celular que comprende celulas que contienen la modificacion pero carecen de otra secuencia exogena. En algunas realizaciones, las celulas transfectadas de manera transitoria o de manera no transitoria con uno o mas vectores descritos en la presente memoria o estirpes celulares procedentes de dichas celulas se usan en la valoracion de uno o mas compuestos de ensayo.
En algunas realizaciones, uno o mas vectores descritos en la presente memoria se usan para producir un animal transgenico no humano o planta transgenica. En algunas realizaciones, el animal transgenico es un mamffero, tal como un raton, rata o conejo. En algunas realizaciones, el organismo o individuo es una planta. En algunas realizaciones, el organismo o individuo o planta es un alga. Los metodos para producir plantas y animales transgenicos son conocidos en la tecnica y generalmente empiezan con un metodo de transfeccion de celulas, tal como se describe en la presente memoria. Tambien se proporcionan animales transgenicos como son plantas transgenicas, especialmente cultivos y algas. El animal o la planta transgenicos pueden ser utiles en aplicaciones fuera de proporcionar un modelo de enfermedad. Estas pueden incluir produccion de alimentos o de alimentacion por expresion de, por ejemplo, mayores niveles de protefna, carbohidrato, nutriente o vitaminas que lo que se observarfa normalmente en el tipo natural. Con respecto a esto, se prefieren las plantas transgenicas, especialmente legumbres y tuberculos y animales, especialmente los mamfferos tales como ganado (vacas, ovejas, cabras y cerdos), pero tambien aves de corral e insectos comestibles.
Las algas transgenicas u otras plantas tales como colza pueden ser utiles en particular en la produccion de aceites vegetales o biocombustibles tales como alcoholes (especialmente metanol y etanol), por ejemplo. Estos se pueden conseguir por ingenierfa para expresar o sobreexpresar altos niveles de aceite o alcoholes para uso en las industrias de aceites o biocombustibles.
En un aspecto, la descripcion proporciona metodos para modificar un polinucleotido objetivo en una celula eucariota. En algunas realizaciones, el metodo comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleotido objetivo para efectuar la escision de dicho polinucleotido objetivo modificando de ese modo el polinucleotido objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia gufa hibridada a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleotido objetivo, en el que dicha secuencia gufa esta ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez hfbrida a una secuencia tracr.
En un aspecto, la descripcion proporciona un metodo para modificar la expresion de un polinucleotido en una celula eucariota. En algunas realizaciones, el metodo comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleotido de manera que dicha union de como resultado expresion aumentada o disminuida de dicho polinucleotido; en el que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia gufa hibridada a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleotido, en el que dicha secuencia gufa esta ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez hibrida a una secuencia tracr.
Con los recientes avances en la genomica de cultivos, la capacidad para usar sistemas CRISPR-Cas para realizar
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edicion de genes y manipulacion eficaz y de coste eficaz permitira la rapida seleccion y la comparacion de manipulaciones geneticas unicas y multiplexadas para transformar dichos genomas para produccion mejorada y cebos mejorados. Con respecto a esto se hace referenda a las Patentes y publicaciones de EE.UU.: Patente de EE.UU. N° 6.603.061 - Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method; la Patente de EE.UU. N° 7.868.149 - Plant Genome Sequences and Uses Thereof y la Patente de EE.UU. 2009/0100536 - Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits. En la practica de la descripcion, tambien se hace referenda a los contenidos y la descripaon de Morrell et al "Crop genomics: advances and applications" Nat Rev Genet. 29 de diciembre de 2.011; 13 (2): 85-96. En una realizacion ventajosa de la descripcion, el sistema CRISPR/Cas9 se usa para lograr por ingenierfa micro algas. De acuerdo con esto, la referencia de la presente memoria a celulas de animales puede aplicarse tambien, mutatis mutandis, a celulas de plantas a menos que sea evidente de otro modo.
En un aspecto, la descripcion proporciona metodos para modificar un polinucleotido objetivo en una celula eucariota, que puede ser in vivo, ex vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el metodo comprende muestrear una celula o poblacion de celulas de un animal humano o no humano o planta (incluyendo microalgas) y modificar la celula o celulas. Puede tener lugar cultivo en cualquier fase ex vivo. La celula o las celulas pueden ser introduadas de nuevo incluso en el animal no humano o planta (induyendo microalgas).
En un aspecto, la descripcion proporciona estuches que contienen uno o mas cualesquiera de los elementos descritos en los metodos y composiciones anteriores. En algunas realizaciones, el estuche comprende un sistema vector e instrucciones para usar el estuche. En algunas realizaciones, el sistema vector comprende (a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de emparejamiento tracr y uno o mas sitios de insercion para insertar una secuencia gufa aguas arriba de la secuenaa de emparejamiento tracr, en el que cuando se expresa, la secuencia gufa dirge la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia fijada como objetivo en una celula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gufa que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr y/o (b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuenca codificadora de enzima que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localizacion nuclear. Los elementos se pueden proporconar de manera individual o en combinaciones y se pueden proporcionar en cualquier envase adecuado, tal como un vial, un frasco o un tubo. En algunas realizaciones, el estuche incluye instrucciones en uno o mas idiomas, por ejemplo en mas de un idioma.
En algunas realizaciones, un estuche comprende uno o mas reactivos para uso en un procedimiento utilizando uno o mas de los elementos descritos en la presente memoria. Los reactivos se pueden proporcionar en cualquier envase adecuado. Por ejemplo, un estuche puede proporaonar uno o mas tampones de reaccion o de almacenamiento. Los reactivos se pueden proporcionar en una forma que sea utilizable en un ensayo particular o en una forma que requiera la adicion de otro u otros componentes mas antes de uso (por ejemplo, en forma concentrada o liofilizada). Un tampon puede ser cualquier tampon, incluyendo pero no limitandose a tampon de carbonato de sodio, un tampon de bicarbonato de sodio, un tampon de borato, un tampon de Tris, un tampon de MOPS, un tampon de HEPES y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el tampon es alcalino. En algunas realizaciones, el tampon presenta un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 10. En algunas realizaciones, el estuche comprende uno o mas oligonucleotidos correspondientes a una secuencia gufa para insercion en un vector de manera que se una de manera operable a la secuencia gufa y un elemento regulador. En algunas realizaciones, el estuche comprende un polinucleotido de plantilla de recombinacion homologo.
En un aspecto, la descripcion proporciona metodos para usar uno o mas elementos de un sistema CRISPR. El complejo CRISPR de la descripcion proporciona un medio eficaz para modificar un polinucleotido objetivo. El complejo CRISPR de la descripcion presenta una amplia variedad de utilidad incluyendo modificacion (por ej., supresion, insercion, traslocacion, inactivacion, activacion) de un polinucleotido objetivo en una multiplicidad de tipos de celulas. Como tal el complejo CRISPR de la descripcion presenta un amplio espectro de aplicaciones en, por ej., tratamiento genico, investigaaon de farmacos, diagnostico de enfermedades y prognosis. Un complejo CRISPR ejemplar comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia gufa hibridada a una secuencia fijada como objetivo dentro del polinucleotido objetivo. La secuenaa gufa esta ligada a una secuencia de emparejamiento tracr, que a su vez hibrida a una secuencia tracr.
El polinucleotido objetivo de un complejo CRISPR puede ser cualquier polinucleotido endogeno o exogeno a la celula eucariota. Por ejemplo, el polinucleotido objetivo puede ser un polinucleotido que resida en el nucleo de la celula eucariota. El polinucleotido objetivo puede ser una secuencia que codifique un producto genico (por ej., una protefna) o una secuencia no codificadora (por ej., un polinuceotido regulador o un ADN basura). Sin desear estar limitados por la teorfa, se cree que la secuencia objetivo deberfa estar asoaada a un PAM (unidad adyacente protoespaciadora); esto es, una secuencia corta reconocida por el complejo CRISPR. Los requerimientos de secuenaa y longitud precisos para el PAM difieren dependiendo de la enzima CRISPR usada, pero los PAM son tfpicamente secuencias de 2-5 pares de bases adyacentes al protoespaciador (esto es, la secuencia objetivo) Ejemplos de secuencias PAM se proporcionan en la secaon de ejemplos a continuacion y el experto podra identificar secuencias PAM adicionales para uso con una enzima CRISPR determinada.
El polinucleotido objetivo de un complejo CRISPR puede incluir una serie de genes y polinucleotidos asociados a enfermedades asf como genes y polinucleotidos asoaados a ruta bioqufmica de senalizacion.
Ejemplos de polinudeotidos objetivo incluyen una secuencia asociada a una ruta bioqufmica de senalizacion, por ej., un gen o polinucleotido asodado a una ruta bioqufmica de senalizacion. Ejemplos de polinucleotidos objetivo incluyen un gen o polinucleotido asociado a una enfermedad. Un gen o polinucleotido "asociado a una enfermedad" se refiere a cualquier gen o polinucleotido que este proporcionando productos de transcripcion o traduccion en un 5 nivel anormal o en una forma anormal en las celulas procedentes de tejidos afectados por una enfermedad comparado con tejidos o celulas de un control no de enfermedad. Puede ser un gen que llegue a expresarse a un nivel anormalmente alto; puede ser un gen que llegue a expresarse a un nivel anormalmente bajo, donde la expresion modificada se correlaciona con la apariaon y/o progresion de la enfermedad. Un gen asociado a la enfermedad tambien se refiere a un gen que posee mutacion o mutaciones o variacion genetica que es directamente 10 responsable o esta ligada a desequilibrio con un gen, o genes, que es responsable de la etiologfa de una enfermedad. Los productos transcritos o traducidos pueden ser conocidos o desconocidos y puede ser a un nivel normal o anormal.
Ejemplos de genes y polinucleotidos asociados a una enfermedad estan disponibles en Instituto McKusick-Nathans de Medicina Genetica, Universidad de Johns Hopkins (Baltimore, Md.) y Centro Nacional para Informacion de 15 Biotecnologfa, Biblioteca Nacional de Medicina (Betesda, Md.), disponible en la Red Informatica Mundial.
Ejemplos de genes y polinucleotidos asociados a una enfermedad se enumeran en las Tablas A y B. La informacion especffica de la enfermedad esta disponible en el Instituto McKusick-Nathans de Medicina Genetica, Universidad de Johns Hopkins (Baltimore, Md.) y Centro Nacional para Informacion de Biotecnologfa, Biblioteca Nacional de Medicina (Betesda, Md.), disponible en la Red Informatica Mundial. Ejemplos de genes y polinucleotidos asociados a 20 una ruta bioqufmica de senalizacion se enumeran en la Tabla C.
Las mutaciones en estos genes y rutas pueden dar como resultado la producdon de protefnas inapropiadas o protefnas en cantidades inapropiadas que afecten a la funcion. Tales genes, protefnas y rutas pueden ser el polinucleotido objetivo de un complejo CRISPR.
Tabla A
ENFERMEDAD/TRASTORNOS
GEN (ES)
Neoplasia
PTEN; ATM; ATR; EGFR; ERBB2; ERBB3; ERBB4;
Notchl; Notch2; Notch3; Notch4; AKT; AKT2; AKT3; HIF;
HIF1a; HIF3a; Met; HRG; Bcl2; PPAR alfa; PPAR
gamma; WT1 (Tumor Wilms ); Familia Receptor FGF
miembros (5 miembros: 1,2, 3, 4, 5); CDKN2a; APC; RB
(retinoblastoma); MEN1; VHL; BRCA1; BRCA2; AR
(Receptor Androgenos ); TSG101; IGF; Receptor IGF; Igf1 (4
variantes); Igf2 (3 variantes); Receptor Igf 1; Receptor Igf 2;
Bax; Bcl2; familia caspases (9 miembros:
1,2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12); Kras; Apc
Degeneracion
Abcr; Cc12; Cc2; cp (ceruloplasmina); Timp3; catepsina D;
Macular relacionada con la edad
Vldlr; Ccr2
Esquizofrenia
Neuregulina1 (Nrg1); Erb4 (receptor para Neuregulina);
Complexina1 (Cplx1); Tph1 Triptofano hidroxilasa; Tph2
Triptofano hidroxilasa 2; Neurexina 1; GSK3; GSK3a;
GSK3b
Trastornos
5-HTT (Slc6a4); COMT; DRD (Drd1a); SLC6A3; DAOA
DTNBP1; Dao (Dao1)
Repeticion del trinudeotido
HTT (Huntington's Dx); SBMA/SMAX1/AR (Kennedy's
Trastornos
Dx); FXN/X25 (Friedrich's Ataxia); ATX3 (Machado-
Joseph's Dx); ATXN1 y ATXN2 (ataxia
espinocerebelar); DMPK (distrofia miotonica); Atrophin-1 y Atn1
(DRPLA Dx); CBP (Creb-BP - inestabilidad global); VLDLR
ENFERMEDAD/TRASTORNOS
GEN (ES)
(Alzheimer's); Atxn7; Atxn10
Sfndrome fragil X
FMR2; FXR1; FXR2; mGLUR5
Trastornos
APH-1 (alfa y beta); Presenilina (Psenl); nicastrina
Relacionados con la secretasa
(Ncstn); PEN-2
Otros
Nos1; Parpl; Natl; Nat2
Trastornos relacionados con priones
Prp
ALS
SOD1; ALS2; STEX; FUS; TARDBP; VEGF (VEGF-a;
VEGF-b; VEGF-c)
Drogadiccion
Prkce (alcohol); Drd2; Drd4; ABAT (alcohol); GRIA2;
Grm5; Grin1; Htr1b; Grin2a; Drd3; Pdyn; Gria1 (alcohol)
Autismo
Mecp2; BZRAP1; MDGA2; Sema5A Neurexina 1; Fragil X
(FMR2 (AFF2); FXR1; FXR2; Mglur5)
enfermedad de Alzheimer
E1; CHIP; UCH; UBB; Tau; LRP; PICALM.; Clusterina; PS1;
SORL1; CR1; Vldlr; Uba1; Uba3; CHIP28 (Aqp1,
Aquaporina 1); Uchl1; Uchl3; APP
Inflamacion
IL-10; IL-1 (IL-1 a; IL-1b); IL-13; IL-17 (IL-17a (CTLA8); IL-
17b; IL-17c; IL-17d; IL-17f); II-23; Cx3cr1; ptpn22; TNFa;
NOD2/CARD15 para IBD; IL-6; IL-12 (IL-12a; IL-12b);
CTLA4; Cx3cl1
enfermedad de Parkinson
x-Synuclein; DJ-1; LRRK2; Parkin; PINK1
Tabla B
Enfermedades y trastornos de la sangre y la coagulacion
Anemia (CDAN1, CDA1, RPS19, DBA PKLR, PK1, NT5C3, BUMPH1, PSN1, RHAG, RH50A NRAMP2, SPTB, ALAS2, ANH1, ASB, ABCB7, ABC7, ASAT); sfndrome de linfocito desnudo (TAPBP, TPSN, TAP2, ABCB3, PSF2, RING11, MHC2TA C2TA, RFX5, RFXAP, RFX5), Trastornos de sangrado (TBXA2R, P2RX1, P2X1); Factor H y factor H tipo - 1 (HF1, CFH, HUS); Factor V y factor VIII (MCFD2); deficiencia de Factor VII (F7); deficiencia de Factor X (F10); deficiencia de Factor XI (F11); deficiencia de Factor XII (F12, HAF); deficiencia de Factor XIIIA (F13A1, F13A); deficiencia de Factor XIIIB (F13B); anemia Fanconi (FANCA, FACA FA1, FA FAA FAAP95, FAAP90, FLJ34064, FANCB, FANCC, FACC, BRCA2, FANCD1, FANCD2, FANCD, FACD, FAD, FANCE, FACE, FANCF, XRCC9, FANCG, BRIP1, BACH1, FANCJ, PHF9, FANCL, FANCM, KIAA1596); trastornos Linfohistiocitosis Hemofagocftica (PRF1, HPLH2, UNC13D, MUNC13-4, HPLH3, HLH3, FHL3); Hemofilia A (F8, F8C, HEMA); Hemofilia B (F9, HEMB), trastornos hemorragicos (PI, ATT, F5); deficiencias y trastornos de leucocia (ITGB2, CD18, LCAMB, LAD, EIF2B1, EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B5, LVWM, CACH, CLE, EIF2B4); anemia depranocftica (HBB); Talasemia (HBA2, HBB, HBD, LCRB, HBA1).
Desregulacion celular y enfermedades y trastornos oncologicos
Linfoma no de Hodgkin de celulas B (BCL7A BCL7); Leucemia (TAL1, TCL5, SCL, TAL2, FLT3, NBS1, NBS, ZNFN1A1, IK1, LYF1, HOXD4, HOX4B, BCR, CML, PHL, ALL, ARNT, KRAS2, RASK2, GMPS, AF10, ARHGEF12, LARG, KIAA0382, CALM, CLTH, CEBPA CEBP, CHIC2, BTL, FLT3, KIT, PBT, LPP, NPM1, NUP214, D9S46E, CAN, CAIN, RUNX1, CBFA2, AML1, WHSC1L1, NSD3, FLT3, AF1Q, NPM1, NUMA1, ZNF 145, PLZF, PML, MYL, STAT5B, AF 10, CALM, CLTH, ARL11, ARLTS1, P2RX7, P2X7, BCR, CML, PHL, ALL, GRAF, NF1, VRNF, WSS, NFNS, PTPN11, PTP2C, SHP2, NS1, BCL2, CCND1, PRAD1, BCL1, TCRA GATA1, GF1, ERYF1, NFE1, ABL1, NQO1, DIA4, NMOR1, NUP214, D9S46E, CAN, CAIN).
Inflamacion y enfermedades y trastornos
AIDS (KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB11, KIR3DS1, IFNG, CXCL12, SDF1); sfndrome linfoproliferativo autoinmunitario (TNFRSF6, APT1, FAS, CD95, ALPS1A);
inmunorelacionados
immunodeficiencia combinada, (IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4); HIV-1 (CCL5, SCYA5, D17S136E, TCP228), susceptibilidad o infeccion por VIH (IL10, CSIF, CMKBR2, CCR2, CMKBR5, CCCKR5 (CCR5)); Inmunodeficiencias (CD3E, CD3G, AICDA, AID, HIGM2, TNFRSF5, CD40, UNG, DGU, HIGM4, TNFSF5, CD40LG, HIGM1, IGM, FOXP3, IPEX, AIID, XPID, PIDX, TNFRSF14B, TACI); Inflamacion (IL- 10, IL-1 (IL-1a, IL-1 b), IL-13, IL-17 (IL-17a (CTLA8), IL-17b, IL-17c, IL-17d, IL-17f), II- 23, Cx3cr1, ptpn22, TNFa, NOD2/CARD15 for IBD, IL-6, IL-12 (IL-12a, IL-12b), CTLA4, Cx3cl1); inmunodeficiencias combinadas severas (SCIDs)(JAK3, JAKL, DCLRE1C, ARTEMIS, SCIDA, RAG1, RAG2, ADA PTPRC, CD45, LCA, IL7R, CD3D, T3D, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4).
Enfermedades y trastornos metabolicos, hepaticos, renales y protemicos
Neuropatfa amiloide (TTR, PALB); Amiloidosis (APOA1, APP, AAA CVAP, AD1, GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); Cirrosis (KRT18, KRT8, C1RH1A NAIC, TEX292, K1AA1988); fibrosis qmstica (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); enfermedades de almacenamiento de glucogeno (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); adenoma hepatico, 142330 (TCF1, HNF1A, MODY3), fallo hepatico, comienzo temprano y trastorno neurologico (SCOD1, SCO1), deficiencia de lipasa hepatica(LIPC), Hepatoblastoma, cancer y carcinomas (CTNNB1, PDGFRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1, TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, MCH5; enfermedad del rinon qmstico medular (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); Fenilcetonuria (PAH, PKU1, QDPR, DHPR, PTS); enfermedad renal y hepatica poliqmstica (FCYT, PkHd1 , ARPKD, PKD 1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63).
enfermedades y trastornos musculares / del esqueleto
Distrofia muscular de Becker (DMD, BMD, MYF6), Distrofia muscular de Duchenne (DMD, BMD); Distrofia muscular de Emery-Dreifuss (LMNA LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A, HGPS, LGMD1B, LMNA LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A); Distrofia muscular de Facioscapulohumeral (FSHMD1A FSHD1A); Distrofia muscular (FKRP, MDC1C, LGMD2I, LAMA2, LAMM, LARGE, KIAA0609, MDC1D, FCMD, TTID, MYOT, CAPN3, CANP3, DYSF, LGMD2B, SGCG, LGMD2C, DMDA1, SCG3, SGCA, ADL, DAG2, LGMD2D, DMDA2, SGCB, LGMD2E, SGCD, SGD, LGMD2F, CMD1L, TCAP, LGMD2G, CMD1N, TRIM32, HT2A LGMD2H, FKRP, MDC1C, LGMD21, TTN, CMD1G, TMD, LGMD2J, POMT1, CAV3, LGMD1C, SEPN1, SELN, RSMD1, PLEC1, PLTN, EBS1); Osteopetrosis (LRP5, BMND1, LRP7, LR3, OPPG, VBCH2, CLCN7, CLC7, OPTA2, OSTM1, GL, TCIRG1, TIRC7, OC116, OPTB1); Atrofia muscular (VAPB, VAPC, ALS8, SMN1, SMA1, SMA2, SMA3, SMA4, BSCL2, SPG17, GARS, SMAD1, CMT2D, HEXB, IGHMBP2, SMUBP2, CATF1, SMARD1).
1 1
enfermedades y trastornos neurologicos y neuronales
ALS (SOD1, ALS2, STEX, FUS, TARDBP, VEGF (VEGF-a, VEGF-b, VEGF-c); enfermedad de Alzheimer (APP, AAA CVAP, AD1, APOE, AD2, PSEN2, AD4, STM2, APBB2, FE65L1, NOS3, PLAU, URK, ACE, DCP1, ACE1, MPO, PACIP1, PAXIP1L, PTIP, A2M, BLMH, BMH, PSEN1, AD3); Autismo (Mecp2, BZRAP1, MDGA2, Sema5A Neurexina 1, GLO1, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, NLGN3, NLGN4, KIAA1260, AUTSX2); Smdrome fragil X (FMR2, FXR1, FXR2, mGLUR5); enfermedad de Huntington y trastornos tipo enfermedad (HD, IT15, PRNP, PRIP, JPH3, JP3, HDL2, TBP, SCA17); enfermedad de Parkinson (NR4A2, NURR1, NOT, TINUR, SNCAIP, TBP, SCA17, SNCA NACP, PARK1, PARK4, DJ1, PARK7, LRRK2, PARK8, PINK1, PARK6, UCHL1, PARK5, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, PRKN, PARK2, PDJ, DBH, NDUFV2); smdrome de Rett (MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, CDKL5, STK9, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, x- Synuclein, DJ-1); Esquizofrenia (Neuregulin1 (Nrg1), Erb4 (receptor de Neuregulin), Complexin1 (Cplx1), Tph1 Triptofano hidroxilasa, Tph2, Triptofano hidroxilasa 2, Neurexina 1, GSK3, GSK3a, GSK3b, 5-HTT (Slc6a4), COMT, DRD (Drd1a), SLC6A3, DAOA DTNBP1, Dao (Dao1)); Trastornos Relacionados con la secretasa (APH-1 (alfa y beta), Presenilin (Psen1), nicastrin, (Ncstn), PEN-2, Nos1, Parp1, Nat1, Nat2); Trastornos Repeticion del trinucleotido (HTT (Huntington's Dx), SBMA/SMAX1/AR (Kennedy's Dx), FXN/X25 (Ataxia de Friedrich), ATX3 (Machado- Joseph's Dx), ATXN1 y ATXN2 (ataxias espinocerebelares), DMPK (distrofia miotonica), Atrofina-1 y Atn1 (DRPLADx), CBP (Creb-BP - inestabilidad global), VLDLR (Alzheimer's), Atxn7, Atxn10).
1 1
enfermedades y trastornos oculares
degeneracion macular relacionada con la edad (Abcr, Ccl2, Cc2, cp (ceruloplasmina), Timp3, catepsinaD, Vldlr, Ccr2); Catarata (CRYAA, CRYA1, CRYBB2, CRYB2, PITX3, BFSP2, CP49, CP47, CRYAA, CRYA1, PAX6, AN2, MGDA, CRYBA1,
CRYB1, CRYGC, CRYG3, CCL, LIM2, MP19, CRYGD, CRYG4, BFSP2, CP49,
CP47, HSF4, CTM, HSF4, CTM, MIP, AQP0, CRYAB, CRYA2, CTPP2, CRYBB1, CRYGD, CRYG4, CRYBB2, CRYB2, CRYGC, CRYG3, CCL, CRYAA, CRYA1, GJA8, CX50, CAE1, GJA3, CX46, CZP3, CAE3, CCM1, CAM, KRIT1); distrofia y turbidez de la cornea (APOA1, TGFBI, CSD2, CDGG1, CSD, BIGH3, CDG2, TACSTD2, TROP2, M1S1, VSX1, RINX, PPCD, PPD, KTCN, COL8A2, FECD, PPCD2, PIP5K3, CFD); Cornea plana congenita (KERA CNA2); Glaucoma (MYOC, TIGR, GLC1A, JOAG, GPOA OPTN, GLC1E, FIP2, HYPL, NRP, CYP1B1, GLC3A, OPA1, NTG, NPG, CYP1B1, GLC3A); amaurosis congenita de Leber (CRB1, RP12, CRX, CORD2, CRD, RPGRIP1, LCA3, CORD9, RPE65, RP20, AIPL1, LCA4, GUCY2D, GUC2D, LCA1, CORD6, RDH12, LCA3); distrofia macular (ELOVL4, ADMD, STGD2, STGD3, RDS, RP7, PRPH2, PRPH, AVMD, AOFMD, VMD2).
Tabla C
FUNCION CELULAR
GENES
Senalizacion PI3K/AKT
PRKCE; ITGAM; ITGA5; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2;
PTEN; EIF4E; PRKCZ; GRK6; MAPK1; TSC1; PLK1;
AKT2; IKBKB; PIK3CA; CDK8; CDKN1B; NFKB2; BCL2;
PIK3CB; PPP2R1A MAPK8; BCL2L1; MAPK3; TSC2;
ITGA1; KRAS; EIF4EBP1; RELA PRKCD; NOS3;
PRKAA1; MAPK9; CDK2; PPP2CA; PIM1; ITGB7;
YWHAZ; ILK; TP53; RAF1; IKBKG; RELB; DYRK1A
CDKN1A ITGB1; MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;
CHUK; PDPK1; PPP2R5C; CTNNB1; MAP2K1; NFKB1;
PAK3; ITGB3; CCND1; GSK3A FRAP1; SFN; ITGA2;
TTK; CSNK1A1; BRAF; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;
HSP90AA1; RPS6KB1
Senalizacion ERK/MAPK
PRKCE; ITGAM; ITGA5; HSPB1; IRAK1; PRKAA2;
EIF2AK2; RAC1; RAP1A TLN1; EIF4E; ELK1; GRK6;
MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA CDK8; CREB1;
PRKCI; PTK2; FOS; RPS6KA4; PIK3CB; PPP2R1A
PIK3C3; MAPK8; MAPK3; ITGA1; ETS1; KRAS; MYCN;
EIF4EBP1; PPARG; PRKCD; PRKCA1; MAPK9; SRC;
CDK2; PPP2CA PIM1; PIK3C2A; ITGB7; YWHAZ;
PPP1CC; KSR1; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;
MAP2K2; PAK4; PIK3R1; STAT3; PPP2R5C; MAP2K1;
PAK3; ITGB3; ESR1; ITGA2; MYC; TTK; CSNK1A1;
CRKL; BRAF; ATF4; PRKCA SRF; STAT1; SGK
Senalizacion
RAC1; TAF4B; EP300; SMAD2; TRAF6; PCAF; ELK1;
Receptor Glucocorticoide
MAPK1; SMAD3; AKT2; IKBKB; NCOR2; UBE2I;
PIK3CA CREB1; FOS; HSPA5; NFKB2; BCL2;
MAP3K14; STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPKB; BCL2L1;
MAPK3; TSC22D3; MAPK10; NRIP1; KRAS; MAPK13;
RELA STAT5A; MAPK9; NOS2A PBX1; NR3C1;
PIK3C2A CDKN1C; TRAF2; SERPINE1; NCOA3;
MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG; MAP3K7; CREBBP;
FUNCION CELULAR
GENES
CDKN1A MAP2K2; JAK1; IL8; NCOA2; AKT1; JAK2;
PIK3R1; CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; TGFBR1;
ESR1; SMAD4; CEBPB; JUN; AR; AKT3; CCL2; MMP1; STAT1; IL6; HSP90AA1
Senalizacion Gufa Axonal
PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; ADAM12;
IGF1; RAC1; RAP1A; EIF4E; PRKCZ; NRP1; NTRK2;
ARHGEF7; SMO; ROCK2; MAPK1; PGF; RAC2;
PTPN11; GNAS; AKT2; PIK3CA ERBB2; PRKCI; PTK2;
CFL1; GNAQ; PIK3CB; CXCL 12; PIK3C3; WNT11;
PRKD1; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;
PRKCD; PIK3C2A ITGB7; GLI2; PXN; VASP; RAF1;
FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; ADAM17; AKT1; PIK3R1;
GLI1; WNT5A ADAM10; MAP2K1; PAK3; ITGB3;
CDC42; VEGFA ITGA2; EPHA8; CRKL; RND1; GSK3B;
AKT3; PRKCA
Senalizacion Receptor Ephrin
PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; IRAK1;
PRKAA2; EIF2AK2; RAC I; RAP1A GRK6; ROCK2;
MAPK1; PGF; RAC2; PTPN11; GNAS; PLK1; AKT2;
DOK1; CDK8; CREB1; PTK2; CFL1; GNAQ; MAP3K14;
CXCL12; MAPK8; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1;
KRAS; RHOA PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC; CDK2;
PIM1; ITGB7; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;
MAP2K2; PAK4; AKT1; JAK2; STAT3; ADAM10;
MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; VEGFA ITGA2;
EPHA8; TTK; CSNK1A1; CRKL; BRAF; PTPN13; ATF4;
AKT3; SGK
Senalizacion
ACTN4; PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; IRAK1;
cictoesqueleto de actina
PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; INS; ARHGEF7; GRK6;
ROCK2; MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA CDK8;
PTK2; CFL1; PIK3CB; MYH9; DIAPH1; PIK3C3; MAPK8;
F2R; MAPK3; SLC9A1; ITGA1; KRAS; RHOA PRKCD;
PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A; ITGB7;
PPP1CC; PXN; VIL2; RAF1; GSN; DYRK1 A; ITGB1;
MAP2K2; PAK4; PIP5K1A PIK3R1; MAP2K1; PAK3;
ITGB3; CDC42; APC; ITGA2; TTK; CSNK1A1; CRKL;
BRAF; VAV3; SGK
Senalizacion
PRKCE; IGF1; EP300; RCOR1; PRKCZ; HDAC4; TGM2;
enfermedad de Huntington
MAPK1; CAPNS1; AKT2; EGFR; NCOR2; SP1; CAPN2;
PIK3CA HDAC5; CREB1; PRKCI; HSPA5; REST;
GNAQ; PIK3CB; PIK3C3; MAPKB; IGF1R; PRKD1;
GNB2L1; BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; HDAC2;
FUNCION CELULAR
GENES
HDAC7A PRKCD; HDAC11; MAPK9; HDAC9; PIK3C2A;
HDAC3; TP53; CASP9; CREBBP; AKT1; PIK3R1;
PDPK1; CASP1; APAF1; FRAP1; CASP2; JUN; BAX;
ATF4; AKT3; PRKCA CLTC; SGK; HDAC6; CASP3
Senalizacion de muerte celular programada
PRKCE; ROCK1; BID; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; BAK1;
BIRC4; GRK6; MAPK1; CAPNS1; PLK1; AKT2; IKBKB;
CAPN2; CDK8; FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8;
BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; KRAS; RELA
PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; TP53; TNF;
RAF1; IKBKG; RELB; CASP9; DYRK1A MAP2K2;
CHUK; APAF1; MAP2K1; NFKB1; PAK3; LMNA CASP2;
BIRC2; TTK; CSNK1A1; BRAF; BAX; PRKCA SGK;
CASP3; BIRC3; PARP1
Senalizacion de Receptor de celulas B
RAC1; PTEN; LYN; ELK1; MAPK1; RAC2; PTPN11;
AKT2; IKBKB; PIK3CA; CREB1; SYK; NFKB2; CAMK2A;
MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; BCL2L1; ABL1;
MAPK3; ETS1; KRAS; MAPK13; RELA PTPN6; MAPK9;
EGRI; PIK3C2A; BTK; MAPK14; RAF1; IKBKG; RELB;
MAP3K7; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK; MAP2K1;
NFKB1; CDC42; GSK3A FRAP1; BCL6; BCL10; JUN;
GSK3B; ATF4; AKT3; VAV3; RPS6KB1
Senalizacion de diapedesis
ACTN4; CD44; PRKCE; ITGAM; ROCK1; CXCR4; CYBA;
RAC1; RAP1A PRKCZ; ROCK2; RAC2; PTPN11;
MMP14; PIK3CA PRKCI; PTK2; PIK3CB; CXCL12;
PIK3C3; MAPK8; PRKD1; ABL1; MAPK10; CYBB;
MAPK13; RHOA PRKCD; MAPK9; SRC; PIK3C2A BTK;
MAPK14; NOX1; PXN; VIL2; VASP; TTGB1; MAP2K2;
CTNND1; PIK3R1; CTNNB1; CLDN1; CDC42; F11R; ITK;
CRKL; VAV3; CTTN; PRKCA MMP1; MMP9
Senalizacion de Integrina
ACTN4; ITGAM; ROCK1; ITGA5; RAC1; PTEN; RAP1A
TLN1; ARHGEF7; MAPK1; RAC2; CAPNS1; AKT2;
CAPN2; PIK3CA; PTK2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
CAV1; CAPN1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;
SRC; PIK3C2A ITGB7; PPP1CC; ILK; PXN; VASP;
RAF1; FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; AKT1; PIK3R1;
TNK2; MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; RND3; ITGA2;
CRKL; BRAF; GSK3B; AKT3
Senalizacion
IRAK1; SOD2; MYD88; TRAF6; ELK1; MAPK1; PTPN11;
de Respuesta de fase aguda
AKT2; IKBKB; PIK3CA; FOS; NFKB2; MAP3K14;
PIK3CB; MAPK8; RIPK1; MAPK3; IL6ST; KRAS;
FUNCION CELULAR
GENES
MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1; MAPK9; FTL; NR3C1;
TRAF2; SERPINE1; MAPK14; TNF; RAF1; PDK1;
IKBKG; RELB; MAP3K7; MAP2K2; AKT1; JAK2; PIK3R1;
CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; FRAP1; CEBPB; JUN;
AKT3; IL1R1; IL6
Senalizacion de PTEN
ITGAM; ITGA5; RAC1; PTEN; PRKCZ; BCL2L 11;
MAPK1; RAC2; AKT2; EGFR; IKBKB; CBL; PIK3CA
CDKN1B; PTK2; NFKB2; BCL2; PIK3CB; BCL2L1;
MAPK3; ITGA1; KRAS; ITGB7; ILK; PDGFRB; INSR;
RAF1; IKBKG; CASP9; CDKN1A ITGB1; MAP2K2;
AKT1; PIK3R1; CHUK; PDGFRA; PDPK1; MAP2K1;
NFKB1; ITGB3; CDC42; CCND1; GSK3A; ITGA2;
GSK3B; AKT3; FOXO1; CASP3; RPS6KB1
Senalizacion de p53
PTEN; EP300; BBC3; PCAF; FASN; BRCA1; GADD45A
BIRC5; AKT2; PIK3CA; CHEK1; TP53INP1; BCL2;
PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; THBS1; ATR; BCL2L1; E2F1;
PMAIP1; CHEK2; TNFRSF10B; TP73; RB1; HD AC9;
CDK2; PIK3C2A MAPK14; TP53; LRDD; CDKN1A
HIPK2; AKT1; PIK3R1; RRM2B; APAF1; CTNNB1;
SIRT1; CCND1; PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A JUN;
SNAI2; GSK3B; BAX; AKT3
Senalizacion
HSPB1; EP300; FASN; TGM2; RXRA MAPK1; NQO1;
de Receptor Arilhidrocarbonado
NCOR2; SP1; ARNT; CDKN1B; FOS; CHEK1;
SMARCA4; NFKB2; MAPK8; ALDH1A1; ATR; E2F1;
MAPK3; NRIP1; CHEK2; RELA; TP73; GSTP1; RB1;
SRC; CDK2; AHR; NFE2L2; NCOA3; TP53; TNF;
CDKN I A NCOA2; APAF1; NFKB1; CCND1; ATM; ESR1;
CDKN2A MYC; JUN; ESR2; BAX; IL6; CYP1B1;
HSP90AA1
Senalizacion de
PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; MAPK1; NQO1;
Metabolismo Xenobiotico
NCOR2; PIK3CA ARNT; PRKCI; NFKB2; CAMK2A
PIK3CB; PPP2R1A PIK3C3; MAPK8; PRKD1;
ALDH1A1; MAPK3; NRIP1; KRAS; MAPK13; PRKCD;
GSTP1; MAPK9; NOS2A ABCB1; AHR; PPP2CA; FTL;
NFE2L2; PIK3C2A PPARGC1A MAPK14; TNF; RAF1;
CREBBP; MAP2K2; PIK3R1; PPP2R5C; MAP2K1;
NFKB1; KEAP1; PRKCA EIF2AK3; IL6; CYP1B1;
HSP90AA1
Senalizacion de SAPK/JNK
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; RAC I ; ELK1;
GRK6; MAPK1; GADD45A RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA
FUNCION CELULAR
GENES
FADD; CDK8; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; R1PK1;
GNB2L1; IRS1; MAPK3; MAPK10; DAXX; KRAS;
PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A
TRAF2; TP53; LCK; MAP3K7; DYRK1A; MAP2K2;
PIK3R1; MAP2K1; PAK3; CDC42; JUN; TTK; CSNK1A1;
CRKL; BRAF; SGK
Senalizacion de PPAr/RXR
PRKAA2; EP300; INS; SMAD2; TRAF6; PPARA; FASN;
RXRA; MAPK1; SMAD3; GNAS; IKBKB; NCOR2;
ABCA1; GNAQ; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK8;
IRS1; MAPK3; KRAS; RELA; PRKAA1; PPARGC1 A
NCOA3; MAPK14; INSR; RAF1; IKBKG; RELB; MAP3K7;
CREBBP; MAP2K2; JAK2; CHUK; MAP2K1; NFKB 1;
TGFBR1; SMAD4; JUN; IL1R1; PRKCA IL6; HSP90AA1; ADIPOQ
Senalizacion de NF-KB
IRAK1; EIF2AK2; EP300; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6;
TBK1; AKT2; EGFR; IKBKB; PIK3CA BTRC; NFKB2;
MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; RIPK1; HDAC2;
KRAS; RELA PIK3C2A; TRAF2; TLR4; PDGFRB; TNF;
INSR; LCK; IKBKG; RELB; MAP3K7; CREBBP; AKT1;
PIK3R1; CHUK; PDGFRA NFKB1; TLR2; BCL10;
GSK3B; AKT3; TNFAIP3; IL1R1
Senalizacion de Neuregulina
ERBB4; PRKCE; ITGAM; ITGA5; PTEN; PRKCZ; ELK1;
MAPK1; PTPN11; AKT2; EGFR; ERBB2; PRKCI;
CDKN1B; STAT5B; PRKD1; MAPK3; ITGA1; KRAS;
PRKCD; STAT5A SRC; ITGB7; RAF1; ITGB1; MAP2K2;
ADAM17; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; ITGB3;
EREG; FRAP1; PSEN1; ITGA2; MYC; NRG1; CRKL;
AKT3; PRKCA HSP90AA1; RPS6KB1
Senalizacion de
CD44; EP300; LRP6; DVL3; CSNK1E; GJA1; SMO;
catenina Wnt y Beta
AKT2; PIN1; CDH1; BTRC; GNAQ; MARK2; PPP2R1A
WNT11; SRC; DKK1; PPP2CA SOX6; SFRP2; ILK;
LEF1; SOX9; TP53; MAP3K7; CREBBP; TCF7L2; AKT1;
PPP2R5C; WNT5A LRP5; CTNNB1; TGFBR1; CCND1;
GSK3A DVL1; APC; CDKN2A MYC; CSNK1A1; GSK3B;
AKT3; SOX2
Senalizacion de Receptor de Insulina
PTEN; INS; EIF4E; PTPN1; PRKCZ; MAPK1; TSC1;
PTPN11; AKT2; CBL; PIK3CA; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3;
MAPK8; IRS1; MAPK3; TSC2; KRAS; EIF4EBP1;
SLC2A4; PIK3C2A PPP1CC; INSR; RAF1; FYN;
MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;
GSK3A FRAP1; CRKL; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;
FUNCION CELULAR
GENES
RPS6KB1
Senalizacion de IL-6
HSPB1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; MAPK1; PTPN11;
IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK3;
MAPK10; IL6ST; KRAS; MAPK13; IL6R; RELA SOCS1;
MAPK9; ABCB1; TRAF2; MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG;
RELB; MAP3K7; MAP2K2; IL8; JAK2; CHUK; STAT3;
MAP2K1; NFKB1; CEBPB; JUN; IL1R1; SRF; IL6
Colestasis Hepatica
PRKCE; IRAK1; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6; PPARA
RXRA; IKBKB; PRKCI; NFKB2; MAP3K14; MAPK8;
PRKD1; MAPK10; RELA PRKCD; MAPK9; ABCB1;
TRAF2; TLR4; TNF; INSR; IKBKG; RELB; MAP3K7; IL8;
CHUK; NR1H2; TJP2; NFKB1; ESR1; SREBF1; FGFR4;
JUN; IL1R1; PRKCA IL6
Senalizacion de IGF-1
IGF 1; PRKCZ; ELK1; MAPK1; PTPN11; NEDD4; AKT2;
PIK3CA PRKCI; PTK2; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
IGF1R; IRS1; MAPK3; IGFBP7; KRAS; PIK3C2A
YWHAZ; PXN; RAF1; CASP9; MAP2K2; AKT1; PIK3R1;
PDPK1; MAP2K1; IGFBP2; SFN; JUN; CYR61; AKT3;
FOXO1; SRF; CTGF; RPS6KB1
Respuesta de Estres
PRKCE; EP300; SOD2; PRKCZ; MAPK1; SQSTM1;
Oxidativo mediado por NRF2
NQO1; PIK3CA; PRKCI; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; GSTP1; MAPK9; FTL;
NFE2L2; PIK3C2A MAPK14; RAF1; MAP3K7; CREBBP;
MAP2K2; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; PPIB; JUN; KEAP1;
GSK3B; ATF4; PRKCA EIF2AK3; HSP90AA1
Fibrosis Hepatica /
EDN1; 1GF1; KDR; FLT1; SMAD2; FGFR1; MET; PGF;
Activacion de celulas estelares hepaticas
SMAD3; EGFR; FAS; CSF1; NFKB2; BCL2; MYH9;
IGF1R; IL6R; RELA; TLR4; PDGFRB; TNF; RELB; IL8;
PDGFRA NFKB1; TGFBR1; SMAD4; VEGFA BAX;
IL1R1; CCL2; HGF; MMP1; STAT1; IL6; CTGF; MMP9
Senalizacion de PPAR
EP300; INS; TRAF6; PPARA RXRA MAPK1; IKBKB;
NCOR2; FOS; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK3;
NRIP1; KRAS; PPARG; RELA; STAT5A TRAF2;
PPARGC1A; PDGFRB; TNF; INSR; RAF1; IKBKG;
RELB; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2; CHUK; PDGFRA
MAP2K1; NFKB1; JUN; IL1R1; HSP90AA1
Senalizacion de Fc Epsilon RI
PRKCE; RAC1; PRKCZ; LYN; MAPK1; RAC2; PTPN11;
AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
PRKD1; MAPK3; MAPK10; KRAS; MAPK13; PRKCD;
MAPK9; PIK3C2A BTK; MAPK14; TNF; RAF1; FYN;
FUNCION CELULAR
GENES
MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; AKT3;
VAV3; PRKCA
Senalizacion de Receptor
PRKCE; RAP1A; RGS16; MAPK1; GNAS; AKT2; IKBKB;
Acoplado a protema G
PIK3CA CREB1; GNAQ; NFKB2; CAMK2A PIK3CB;
PIK3C3; MAPK3; KRAS; RELA SRC; PIK3C2A; RAF1;
IKBKG; RELB; FYN; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK;
PDPK1; STAT3; MAP2K1; NFKB1; BRAF; ATF4; AKT3;
PRKCA
Metabolismo de
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; PTEN; GRK6;
Inositol fosfato
MAPK1; PLK1; AKT2; PIK3CA CDK8; PIK3CB; PIK3C3;
MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2;
PIM1; PIK3C2A DYRK1A MAP2K2; PIP5K1A; PIK3R1;
MAP2K1; PAK3; ATM; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK
Senalizacion de PDGF
EIF2AK2; ELK1; ABL2; MAPK1; PIK3CA FOS; PIK3CB;
PIK3C3; MAPK8; CAV1; ABL1; MAPK3; KRAS; SRC;
PIK3C2A PDGFRB; RAF1; MAP2K2; JAK1; JAK2;
PIK3R1; PDGFRA STAT3; SPHK1; MAP2K1; MYC;
JUN; CRKL; PRKCA SRF; STAT1; SPHK2
Senalizacion de VEGF
ACTN4; ROCK1; KDR; FLT1; ROCK2; MAPK1; PGF;
AKT2; PIK3CA; ARNT; PTK2; BCL2; PIK3CB; PIK3C3;
BCL2L1; MAPK3; KRAS; HIF1A NOS3; PIK3C2A; PXN;
RAF1; MAP2K2; ELAVL1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; SFN;
VEGFA; AKT3; FOXO1; PRKCA
Senalizacion de celulas
PRKCE; RAC1; PRKCZ; MAPK1; RAC2; PTPN11;
aniquilantes naturales
KIR2DL3; AKT2; PIK3CA SYK; PRKCI; PIK3CB;
PIK3C3; PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; PTPN6;
PIK3C2A LCK; RAF1; FYN; MAP2K2; PAK4; AKT1;
PIK3R1; MAP2K1; PAK3; AKT3; VAV3; PRKCA
Ciclo celular: G1/S
HDAC4; SMAD3; SUV39H1; HDAC5; CDKN1B; BTRC;
Regulacion de control
ATR; ABL1; E2F1; HDAC2; HDAC7A RB1; HDAC11;
HDAC9; CDK2; E2F2; HDAC3; TP53; CDKN1A CCND1;
E2F4; ATM; RBL2; SMAD4; CDKN2A; MYC; NRG1;
GSK3B; RBL1; HDAC6
Senalizacion de Receptor de celulas T
RAC1; ELK1; MAPK1; IKBKB; CBL; PIK3CA FOS;
NFKB2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;
RELA PIK3C2A; BTK; LCK; RAF1; IKBKG; RELB; FYN;
MAP2K2; PIK3R1; CHUK; MAP2K1; NFKB1; ITK; BCL10;
JUN; VAV3
Senalizacion de Receptor de la muerte
CRADD; HSPB1; BID; BIRC4; TBK1; IKBKB; FADD;
FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8; RIPK1; CASP8;
FUNCION CELULAR
GENES
DAXX TNFRSF10B; RELA TRAF2; TNF; IKBKG; RELB;
CASP9; CHUK; APAF1; NFKB1; CASP2; BIRC2; CASP3;
BIRC3
Senalizacion de FGF
RAC1; FGFR1; MET; MAPKAPK2; MAPK1; PTPN11;
AKT2; PIK3CA; CREB1; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
MAPK3; MAPK13; PTPN6; PIK3C2A; MAPK14; RAF1;
AKT1; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FGFR4; CRKL; ATF4;
AKT3; PRKCA HGF
Senalizacion de GM-CSF
LYN; ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA CAMK2A
STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; GNB2L1; BCL2L1; MAPK3;
ETS1; KRAS; RUNX1; PIM1; PIK3C2A RAF1; MAP2K2;
AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; CCND1; AKT3;
STAT1
Senalizacion de esclerosis
BID; IGF1; RAC1; BIRC4; PGF; CAPNS1; CAPN2;
lateral amiotrofica
PIK3CA BCL2; PIK3CB; PIK3C3; BCL2L1; CAPN1;
PIK3C2A TP53; CASP9; PIK3R1; RAB5A CASP1;
APAF1; VEGFA; BIRC2; BAX; AKT3; CASP3; BIRC3
Senalizacion de JAK/Stat
PTPN1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; STAT5B;
PIK3CB; PIK3C3; MAPK3; KRAS; SOCS1; STAT5A
PTPN6; PIK3C2A RAF1; CDKN1A MAP2K2; JAK1;
AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FRAP1; AKT3;
STAT1
Metabolismo de
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; GRK6; MAPK1;
Nicotinato y
Nicotinamida
PLK1; AKT2; CDK8; MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1;
PBEF1; MAPK9; CDK2; PIM1; DYRK1A MAP2K2;
MAP2K1; PAK3; NT5E; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK
Senalizacion de quimiocinas
CXCR4; ROCK2; MAPK1; PTK2; FOS; CFL1; GNAQ;
CAMK2A; CXCL12; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK13;
RHOA CCR3; SRC; PPP1CC; MAPK14; NOX1; RAF1;
MAP2K2; MAP2K1; FLAN; CCL2; PRKCA
Senalizacion de IL-2
ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA SYK; FOS;
STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;
SOCS1; STAT5A PIK3C2A LCK; RAF1; MAP2K2;
JAK1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; JUN; AKT3
Depresion sinaptica
PRKCE; IGF1; PRKCZ; PRDX6; LYN; MAPK1; GNAS;
a largo lazo
PRKCI; GNAQ; PPP2R1A; IGF1R; PRKD1; MAPK3;
KRAS; GRN; PRKCD; NOS3; NOS2A; PPP2CA
YWHAZ; RAF1; MAP2K2; PPP2R5C; MAP2K1; PRKCA
Senalizacion de
TAF4B; EP300; CARM1; PCAF; MAPK1; NCOR2;
FUNCION CELULAR
GENES
Receptor de Estrogenos
SMARCA4; MAPK3; NRIP1; KRAS; SRC; NR3C1;
HDAC3; PPARGC1A RBM9; NCOA3; RAF1; CREBBP;
MAP2K2; NCOA2; MAP2K1; PRKDC; ESR1; ESR2
Ruta de
TRAF6; SMURF1; BIRC4; BRCA1; UCHL1; NEDD4;
Ubiquitinacion de protefnas
CBL; UBE2I; BTRC; HSPA5; USP7; USP10; FBXW7;
USP9X; STUB1; USP22; B2M; BIRC2; PARK2; USP8;
USP1; VHL; HSP90AA1; BIRC3
Senalizacion de IL-10
TRAF6; CCR1; ELK1; IKBKB; SP1; FOS; NFKB2;
MAP3K14; MAPK8; MAPK13; RELA MAPK14; TNF;
IKBKG; RELB; MAP3K7; JAK1; CHUK; STAT3; NFKB1;
JUN; IL1R1; IL6
Activacion de VDR/RXR
PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; GADD45A; HES1;
NCOR2; SP1; PRKCI; CDKN1B; PRKD1; PRKCD;
RUNX2; KLF4; YY1; NCOA3; CDKN1A NCOA2; SPP1;
LRP5; CEBPB; FOXO1; PRKCA
Senalizacion de TGF-beta
EP300; SMAD2; SMURF1; MAPK1; SMAD3; SMAD1;
FOS; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK9; RUNX2;
SERPINE1; RAF1; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2;
MAP2K1; TGFBR1; SMAD4; JUN; SMAD5
Senalizacion de Receptor tipo Toll
IRAK1; EIF2AK2; MYD88; TRAF6; PPARA; ELK1;
IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK13;
RELA TLR4; MAPK14; IKBKG; RELB; MAP3K7; CHUK;
NFKB1; TLR2; JUN
Senalizacion de p38 MAPK
HSPB1; IRAK1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; FADD; FAS;
CREB1; DDIT3; RPS6KA4; DAXX; MAPK13; TRAF2;
MAPK14; TNF; MAP3K7; TGFBR1; MYC; ATF4; IL1R1;
SRF; STAT1
Senalizacion de Neurotrofina/TRK
NTRK2; MAPK1; PTPN11; PIK3CA CREB1; FOS;
PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS; PIK3C2A
RAF1; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;
CDC42; JUN; ATF4
Activacion de FXR/RXR
INS; PPARA; FASN; RXRA AKT2; SDC1; MAPK8;
APOB; MAPK10; PPARG; MTTP; MAPK9; PPARGC1A
TNF; CREBBP; AKT1; SREBF1; FGFR4; AKT3; FOXO1
Potenciacion sinaptica
PRKCE; RAP1A; EP300; PRKCZ; MAPK1; CREB1;
a largo plazo
PRKCI; GNAQ; CAMK2A PRKD1; MAPK3; KRAS;
PRKCD; PPP1CC; RAF1; CREBBP; MAP2K2; MAP2K1;
ATF4; PRKCA
Senalizacion de calcio
RAP1A; EP300; HDAC4; MAPK1; HDAC5; CREB1;
CAMK2A; MYH9; MAPK3; HDAC2; HDAC7A HDAC11;
FUNCION CELULAR
GENES
HDAC9; HDAC3; CREBBP; CALR; CAMKK2; ATF4;
HDAC6
Senalizacion de EGF
ELK1; MAPK1; EGFR; PIK3CA FOS; PIK3CB; PIK3C3;
MAPK8; MAPK3; PIK3C2A RAF1; JAK1; PIK3R1;
STAT3; MAP2K1; JUN; PRKCA; SRF; STAT1
Senalizacion de Hipoxia en el
EDN1; PTEN; EP300; NQO1; UBE2I; CREB1; ARNT;
Sistema Cardiovascular
HIF1A SLC2A4; NOS3; TP53; LDHA AKT1; ATM;
VEGFA JUN; ATF4; VHL; HSP90AA1
Inhibicion mediada por LPS/IL-1
IRAK1; MYD88; TRAF6; PPARA; RXRA; ABCA1;
de funcion RXR
MAPK8; ALDH1A1; GSTP1; MAPK9; ABCB1; TRAF2;
TLR4; TNF; MAP3K7; NR1H2; SREBF1; JUN; IL1R1
Activacion de LXR/RXR
FASN; RXRA NCOR2; ABCA1; NFKB2; IRF3; RELA
NOS2A TLR4; TNF; RELB; LDLR; NR1H2; NFKB1;
SREBF1; IL1R1; CCL2; IL6; MMP9
Proceso amiloide
PRKCE; CSNK1E; MAPK1; CAPNS 1; AKT2; CAPN2;
CAPN1; MAPK3; MAPK13; MAPT; MAPK14; AKT1;
PSEN1; CSNK1A1; GSK3B; AKT3; APP
Senalizacion de IL-4
AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3; IRS1; KRAS; SOCKS1;
PTPN6; NR3C1; PIK3C2A JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;
FRAP1; AKT3; RPS6KB1
Regulacion
EP300; PCAF; BRCA1; GADD45A PLK1; BTRC;
Control de dano
CHEK1; ATR; CHEK2; YWHAZ; TP53; CDKN1A;
Ciclo celular: ADN G2/M
PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A
Senalizacion de oxido nftrico en el
KDR; FLT1; PGF; AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3;
Sistema Cardiovascular
CAV1; PRKCD; NOS3; PIK3C2A; AKT1; PIK3R1;
VEGFA; AKT3; HSP90AA1
Metabolismo de Purina
NME2; SMARCA4; MYH9; RRM2; ADAR; EIF2AK4;
PKM2; ENTPD1; RAD51; RRM2B; TJP2; RAD51C;
NT5E; POLD1; NME1
Senalizacion mediada por cAMP
RAP1A; MAPK1; GNAS; CREB1; CAMK2A; MAPK3 ;
SRC; RAF1; MAP2K2; STAT3; MAP2K1; BRAF; ATF4
Dis funcion mitocondrial
SOD2; MAPK8; CASP8; MAPK10; MAPK9; CASP9;
PARK7; PSEN1; PARK2; APP; CASP3
Senalizacion de Notch
HES1; JAG1; NUMB; NOTCH4; ADAM 17; NOTCH2;
PSEN1; NOTCH3; NOTCH1; DLL4
Ruta del estres del
HSPA5; MAPK8; XBP1; TRAF2; ATF6; CASP9; ATF4;
Retfculo endoplasmatico
EIF2AK3; CASP3
Metabolismo de pirimidina
NME2; AICDA RRM2; EIF2AK4; ENTPD1; RRM2B;
NT5E; POLD1; NME1
Senalizacion de Parkinson
UCHL1; MAPK8; MAPK13; MAPK14; CASP9; PARK7;
FUNCION CELULAR
GENES
PARK2; CASP3
Senalizacion
GNAS; GNAQ; PPP2R1A GNB2L1; PPP2CA PPP1CC;
Cardfaca y beta adrenergica
PPP2R5C
Glucolisis/Gluconeogenesis
HK2; GCK; GPI; ALDH1A1; PKM2; LDHA HK1
Senalizacion de interferon
IRF1; SOCS1; JAK1; JAK2; IFITM1; STAT1; IFIT3
Senalizacion Sonic Hedgehog
ARRB2; SMO; GLI2; DYRK1A; GLI1; GSK3B; DYRK1B
Metabolismo
PLD1; GRN; GPAM; YWHAZ; SPHK1; SPHK2
Glicerofosfolfpidos
Degradacion de fosfolfpidos
PRDX6; PLD1; GRN; YWHAZ; SPHK1; SPHK2
Metabolismo de triptofano
SIAH2; PRMT5; NEDD4; ALDH1A1; CYP1B1; SIAH1
Degradacion de lisina
SUV39H1; EHMT2; NSD1; SETD7; PPP2R5C
Ruta
ERCC5; ERCC4; XPA XPC; ERCC1
Reparacion escision de nucleotidos
Metabolismo de
UCHL1; HK2; GCK; GPI; HK1
Almidon y sacarosa
Metabolismo de aminoazucares
NQO1; HK2; GCK; HK1
Metabolismo de
PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1
Acido araquidonico
Senalizacion de ritmo circadiano
CSNK1E; CREB1; ATF4; NR1D1
Sistema de coagulacion
BDKRB1; F2R; SERPINE1; F3
Receptor de Dopamina
PPP2R1A PPP2CA PPP1CC; PPP2R5C
Senalizacion
Metabolismo de glutationa
IDH2; GSTP1; ANPEP; IDH1
Metabolismo de glicerolfpidos
ALDH1A1; GPAM; SPHK1; SPHK2
Metabolismo de acido linoleico
PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1
Metabolismo de Metionina
DNMT1; DNMT3B; AHCY; DNMT3A
Metabolismo de piruvato
GLO1; ALDH1A1; PKM2; LDHA
Metabolismo de
ALDH1A1; NOS3; NOS2A
Arginina y Prolina
Senalizacion Eicosanoide
PRDX6; GRN; YWHAZ
metabolismo de
HK2; GCK; HK I
Fructosa y Manosa
Metabolismo de Galactosa
HK2; GCK; HK1
Biosfntesis de estilbeno,
PRDX6; PRDX1; TYR
cumarina y lignina
Ruta de
CALR; B2M
Presentacion de antfgenos
Biosfntesis de esteroides
NQO1; DHCR7
Metabolismo de Butanoato
ALDH1A1; NLGN1
Ciclo del Citrato
IDH2; IDH1
FUNCION CELULAR
GENES
Metabolismo de acidos grasos
ALDH1A1; CYP1B1
Metabolismo de
PRDX6; CHKA
Glicerofosfolfpidos
Metabolismo de Histidina
PRMT5; ALDH1A1
Metabolismo de Inositol
ERO1L; APEX1
Metabolismo de xenobioticos
GSTP1; CYP1B1
por citocromo p450
Metabolismo de metano
PRDX6; PRDX1
Metabolismo de fenilalanina
PRDX6; PRDX1
Metabolismo de Propanoato
ALDH1A1; LDHA
Metabolismo de
PRMT5; AHCY
Selenoaminoacido
Metabolismo de esfingolfpidos
SPHK1; SPHK2
Aminofosfonato
PRMT5
Metabolismo
Androgenos y estrogenos
PRMT5
Metabolismo de
Ascorbato y Aldarato
ALDH1A1
Metabolismo de
Biosfnteis de acidos biliares
ALDH1A1
Metabolismo de cistefna
LDHA
Biosfnteis de acidos grasos
FASN
Receptor de Glutamato
GNB2L1
Senalizacion de
Respuesta de estres
PRDX1
Oxidativa mediada por NRF2
Ruta de
GPI
Pentosa fosfato
Interconversiones de
UCHL1
Pentosa y Glucuronato
Metabolismo de Retinol
ALDH1A1
Metabolismo de Riboflavina
TYR
Metabolismo de tirosina
PRMT5, TYR
Biosfntesis de Ubiquinona
PRMT5
Degradacion de Valina, Leucina e
ALDH1A1
Isoleucina
Metabolismo de Glicina, Serina y
CHKA
Treonina
Degradacion de lisina
ALDH1A1
dolor/sabor
TRPM5; TRPA1
5
10
15
20
25
30
35
40
FUNCION CELULAR
GENES
dolor
TRPM7; TRPC5; TRPC6; TRPC1; Cnr1; cnr2; Grk2;
Trpa1; Pomc; Cgrp; Crf; Pka; Era; Nr2b; TRPM5; Prkaca;
Prkacb; Prkar1a; Prkar2a
Funcion mitocondrial
AIF; CytC; SMAC (Diablo); Aifm-1; Aifm-2
Neurologfa de desarrollo
BMP-4; Chordin (Chrd); Noggin (Nog); WNT (Wnt2;
Wnt2b; Wnt3a; Wnt4; Wnt5a; Wnt6; Wnt7b; Wnt8b;
Wnt9a; Wnt9b; Wnt10a; Wnt10b; Wnt16); beta-catenin;
Dkk-1; protefnas relacionadas con Frizzled; Otx-2; Gbx2; FGF-8;
Reelin; Dab1; unc-86 (Pou4f1 or Brn3a); Numb; Reln
Las realizaciones de la descripcion tambien se refieren a metodos y composiciones relacionadas con eliminadon de genes, la multiplicacion de genes y reparacion de mutaciones particulares asociadas a la inestabilidad de repeticiones de ADN y trastornos neurologicos (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Segunda Edicion, Academic Press 13 de octubre de 2.011-Medical). Aspectos especfficos de secuencias de repeticion en tandem se han encontrado responsable de mas de veinte enfermedades humanas (Nuevos conocimientos en la inestabilidad de la repeticion: funcion de hfbridos de ARNADN. Mclvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. Sep-Oct 2.010; 7 (5): 551-8). El sistema CRISPR-Cas puede ser aprovechado para corregir estos defectos de inestabilidad genomica.
Un aspecto mas de la descripcion se refiere a la utilizacion del sistema CRISPR-Cas para corregir defectos en los genes EMP2A y EMP2B que se ha identificado que estan asociados a la enfermedad Lafora. La enfermedad de Lafora es un trastorno autosomico recesivo que se caracteriza por epilepsia mioclonica progresiva que puede empezar como ataques epilepticos en la adolescencia. Algunos casos de la enfermedad pueden estar causados por mutaciones en genes que se tienen que identificar sin embargo. La enfermedad produce ataques, espasmos musculares, dificultad para caminar, demencia y eventualmente la muerte. En la actualidad no hay tratamiento que se haya demostrado eficaz contra el progreso de la enfermedad. Otras anormalidades geneticas asociadas a la epilepsia tambien pueden ser fijadas como objetivo mediante el sistema CRISPR-Cas y la genetica subyacente se describe ademas en Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, editado por Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology: 20; 2.009).
En otro aspecto mas de la descripcion, el sistema CRISPR-Cas puede ser usado para corregir defectos oculares que surgen de mutaciones geneticas diversas descritas ademas en Genetic Diseases of the Eye, Segunda Edicion , editado por Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2.012.
Diversos aspectos adicionales de la descripcion se refiere a corregir defectos asociados a un amplio intervalo de enfermedades geneticas que se describen ademas en la pagina web del Instituto Nacional para la Salud bajo la subseccion topica Trastornos Geneticos. Las enfermedades cerebrales geneticas pueden incluir pero no se limitan a, Adrenoleucodistrofia, Angenesia del Cuerpo Calloso, Sfndrome de Aicardi, Enfermedad de Alper, Enfermedad de Alzheimer, Sfndrome de Barth, Enfermedad de Batten, CADASIL, Degeneracion Cerebelar, Enfermedad de Fabry, Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Enfermedad de Huntington y otros Trastornos de Triple Repeticion, Enfermedad de Leigh, Sfndrome de Lesch-Nyhan, Enfermedad de Menkes, Miopatfas Mitocondriales y Colpocefalia de NINDS (por sus siglas en ingles). Estas enfermedades se describen ademas en la pagina web del Instituto Nacional de la Salud bajo la subseccion Trastornos Cerebrales Geneticos.
En algunas realizaciones, la afeccion puede ser neoplasia. En algunas realizaciones, donde la afeccion es neoplasia, los genes que se tienen que fijar como objetivo son cualquiera de los enumerados en la Tabla A (en este caso PTEN etc). En algunas realizaciones, la afeccion puede ser Degeneracion Macular Relacionada con la Edad. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser un Trastorno Esquizofrenico. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser un trastorno de Repeticion del Trinucleotido. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser Sfndrome de Fragil X En algunas realizaciones, la afeccion puede ser un Trastorno Relacionado con la Secretasa. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser un trastorno relacionado con el Prion. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser ALS (por sus siglas en ingles). En algunas realizaciones, la afeccion puede ser una drogadiccion. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser Autismo. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser Enfermedad de Alzheimer. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser inflamacion. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser Enfermedad de Parkinson.
Ejemplos de protefnas asociadas a la enfermedad de Parkinson incluyen pero no se limitan a a-sinuclefna, DJ-1, LRRK2, PINK1, Parkin, UCHL1, Synphilin-1 y NURR1.
Ejemplos de protefnas relacionadas con la adiccion pueden incluir ABAT por ejemplo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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Ejemplos de protefnas relacionadas con la inflamacion pueden induir la protefna quimioatrayente de monocitos -1 (MCP1) codificada por el gen Ccr2, el receptor de quimiocina C-C tipo 5 (CCR5) codificada por el gen Ccr5, el receptor IIB de IgG (FCGR2b, tambien denominado CD32) codificada por el gen Fcgr2b o la protefna de R1g Fc epsilon (FCER1g) codificada por el gen Fcer1g, por ejemplo.
Ejemplos de protefnas asociadas a enfermedades cardiovasculares pueden incluir IL1B (interleucina 1, beta), XDH (xantina deshidrogenasa), TP53 (protefna tumoral p53), PTGIS (prostaglandina I2 (prostaciclina) sintasa), MB (mioglobina), IL4 (interleucina 4), ANGPT1 (angiopoyetina 1), ABCG8 (casete de union a ATP, sub-familia G (WHITE), miembro 8) o CTSK (catepsina K), por ejemplo.
Ejemplos de protefnas asociadas a la enfermedad de Alzheimer pueden incluir la protefna receptora de lipoprotefna de densidad muy baja (VLDLR, por sus siglas en ingles) codificada por el gen VLDLR, la enzima activadora de modificador de tipo ubiquitina 1 (UBA1) codificada por el gen UBA1 o la protefna de subunidad catalftica de enzima E1 activadora de NEDD8 (UBE1C) codificada por el gen UBA3, por ejemplo.
Ejemplos de protefnas asociadas a Trastorno por Espectro Autista pueden incluir la protefna 1 asociada a receptor de benzodiazapina (periferica) (BZRAP1) codificada por el gen BZRAP1, la protefna del miembro 2 de la familia AF4/FMR2 (AFF2) codificada por el gen AFF2 (tambien denominado MFR2), la protefna de homologo 1 autosomico de retraso mental fragil X (FXR1) codificada por el gen FXR1 o la protefna de homologo 2 autosomico del retraso mental fragil X (FXR2) codificada por el gen FXR2, por ejemplo.
Los ejemplos de protefnas asociadas a Degeneracion Macular pueden incluir la casete de union de ATP, protefna del miembro 4 (ABCA4) de la sub-familia A (ABC 1) codificada por el gen ABCR, la protefna apolipoprotefna E (APOE) codificada por el gen APOE o la protefna de Ligando 2 (CCL2) de quimiocina (unidad C-C) codificada por el gen CCL2, por ejemplo.
Ejemplos de protefnas asociadas a Esquizofrenia pueden incluir NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSk3a BDnF, DISC1, GSK3B y combinaciones de las mismas.
Ejemplos de protefnas implicadas en la supresion de tumores pueden incluir ATM (ataxia telangiectasia mutada), ATR (ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3), EGFR (receptor de factor de crecimiento epidermico), ERBB2 (homologo 2 de oncogen v'rico de leucemia eritroblastica v-erb-b2), ERBB3 (homologo 3 de oncogen vfrico de leucemia eritroblastica v-erb-b2), ERBB4 (homologo 4 de oncogen v'rico de leucemia eritroblastica v-erb-b2), Notch 1, Notch2, Notch 3 o Notch 4, por ejemplo.
Ejemplos de protefnas asociadas a trastorno de la secretas pueden incluir PSENEN (homologo de estimulador 2 de presenilina (C. elegans)), CTSB (catepsina B), PSEN1 (presenilina 1), APP (protefna precursora de amiloide beta (A4)), APH1B (homologo B defectuoso 1 anterior de la faringe (C. elegans)), PSEN2 (presenilina 2 (enfermedad de Alzheimer 4)) o BACE1 (enzima 1 de escision de APP de sitio beta), por ejemplo.
Los ejemplos de protefnas asociadas a Esclerosis Lateral Amiotrofica pueden incluir SOD1 (superoxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrofica 2), FUS (fusionado en sarcoma), TARDBP (protefna de union de ADN TAR), VAGFA (factor A de crecimiento endotelial vascular), VAGFB (factor B de crecimiento endotelial vascular) y VAGFC (factor C de crecimiento endotelial vascular) y cualquier combinacion de los mismos.
Ejemplos de protefnas asociadas a enfermedades por priones pueden incluir SOD1 (superoxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrofica 2), FUS (fusionado en sarcoma), TARDBP (protefna de union de ADN TAR), VAGFA (factor A de crecimiento endotelial vascular), VAGFB (factor B de crecimiento endotelial vascular) y VAGFC (factor C de crecimiento endotelial vascular) y cualquier combinacion de los mismos.
Los ejemplos de protefnas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas en trastornos por priones pueden incluir A2M (Alfa-2-Macroglobulina), AATF (Factor de transcripcion de antagonizacion de muerte celular programada), ACPP (fosfatasa acida prostatica), ACTA2 (Actina alfa 2 de musculo liso aorta), ADAM22 (dominio de la metalopeptidasa ADAM), ADORA3 (Receptor de adenosina A3) o ADRA1D (Receptor adrenergico Alfa-1D para adrenoreceptor Alfa-1 D), por ejemplo.
Los ejemplos de protefnas asociadas a Inmunodeficiencia pueden incluir A2M [alfa-2-macroglobulina]; AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferasa]; ABCA1 [casete de union a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 1]; ABCA2 [casete de union a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 2] o ABCA3 [casete de union a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 3]; por ejemplo.
Ejemplos de protefnas asociadas a Trastornos de Repeticion del Trinucleotido incluyen AR (receptor de androgeno), FMR1 (retraso mental 1 fragil X), HTT (huntingtina) o DMPK (distrofia miotonica-protefna cinasa), FXN (frataxina), ATXN2 (ataxina 2), por ejemplo.
Ejemplos de protefnas asociadas a Trastornos de Neurotransmision incluyen SST (somatostatina), NOS1 (oxido nftrico sintasa 1 (neuronal)), ADRA2A (receptor alfa-2A- adrenergico), ADRA2C (receptor alfa-2C- adrenergico), TACR1 (receptor de taquicinina 1) o HTR2c (receptor 2C de 5-hidroxitriptamina (serotonina)), por ejemplo.
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Ejemplos de secuencias asociadas al neurodesarrollo incluyen A2BP1 [protefna 1 de union de ataxina 2], AADAT [aminoadipato aminotransferasa], AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferasa], ABAT [4-aminobutirato aminotransferasa], ABCA1 [casete de union a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 1] o ABCA13 [casete de union a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 13], por ejemplo.
Mas ejemplos de trastornos preferidos tratables con el presente sistema se pueden seleccionar de: Sfndrome de Aicardi-Goutieres; Enfermedad de Alexander; Sfndrome de Allan-Herndon-Dudley Trastornos Relacionados con POLG; Alfa-Manosidosis (Tipo II y III); Sfndrome de Alstrom; Angelman; Sfndrome; Ataxia-Telangiectasia; Lipofuscinosis Ceroide Neuronal; Beta-Talasemia; Atrofia Optica Bilateral y Atrofia Optica (Infantil) Tipo 1; Retinoblastoma (bilateral); Enfermedad de Canavan; Sfndrome 1 Cerebroculofaaoesqueletico [COFS1]; Xantomatosis Cerebrotendinosa; Sfndrome de Cornelia de Lange; Trastornos Relacionados con MAPT; Enfermedades Geneticas por Priones; Sfndrome de Dravet; Enfermedad de Alzheimer Familiar de Comienzo Temprano; Ataxia de Friedreich [FRDa]; Sfndrome de Fryns; Fucosidosis; Distrofia Muscular Congenita de Fukuyama; Galactosialidosis; Enfermedad de Gaucher; Acidemias Organicas; Linfohistiocitosis Hemofagocftica; Sfndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidosis II; Enfermedad de Almacenamiento de Acido Sialico Libre Infantil; Neurodegeneracion Asociada a PLA2G6; Sfndrome de Jervell y Lange-Nielsen; Epidermolisis Bullosa sobre las Articulaciones; Enfermedad de Huntington; Enfermedad de Krabbe (Infantil); Sfndrome de Leigh Asociado al ADN Mitocondrial y NARP; Sfndrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalia Asociada a LIS1; Sfndrome de Lowe; Enfermedad Urinaria de Jarabe de Maple; Sfndrome de Duplicacion de MECP2; Trastornos de Transporte de Cobre Relacionado con ATP7A; Distrofia Muscular Relacionada con LAMA2; Deficiencia de Arilsulfatasa A Mucopolisacaridosis Tipos I, II o III; Trastornos de la Biogenesis del Peroxisoma, Espectro del Sfndrome de Zellweger; Neurodegeneracion con Trastornos de Acumulacion de Hierro en el Cerebro; Deficiencia de Esfingomielinasa Acida; Enfermedad de Niemann-Pick Tipo C; Encefalopatfa por Glicina; Trastornos Relacionados con ARX; Trastornos del Ciclo de la Urea; Osteogenesis Imperfecta Relacionada con COL1A1/2; Sfndrome de Supresion de ADN Mitocondrial; Trastornos Relacionados con PLP1; Sfndrome de Perry; Sfndrome de Phelan- McDermid; Enfermedad de Almacenamiento de Glucogeno Tipo II (Enfermedad de Pompe) (Infantil); Trastornos Relacionados con MAPT; Trastornos Relacionados con MECP2; Condrodisplasia Punctata Rizomelica Tipo 1; Sfndrome de Roberts; Enfermedad de Sandhoff; Enfermedad de Schindler - Tipo 1; Deficiencia de Adenosina Deaminasa; Sfndrome de Smith-Lemli-Opitz; Atrofia Muscular Espinal; Ataxia Espinocerebelar de Comienzo Infantil; Deficiencia de Hexosaminidasa A Displasia Tanatoforica de Tipo 1; Trastornos Relacionados con el Colageno Tipo VI; Sfndrome de Usher Tipo I; Distrofia Muscular Congenita; Sfndrome de Wolf-Hirschhorn; Deficiencia de Lipasa Acida Lisosomal y Xerodermia Pigmentosa.
La administracion cronica de terapeutica protefnica puede provocar respuestas inmunitarias inaceptables a la protefna especffica. La inmunogenicidad de farmacos de protefnas puede ser atribuida a algunos epftopos de linfocitos de auxiliar T inmunodominante (HTL, por sus siglas en ingles). Reducir la afinidad de union de MHC de estos epftopos HTL contenidos dentro de estas protefnas puede generar farmacos con inmunogenicidad menor (Tangri S, et al. ("Rationally engineered therapeutic proteins with reduced immunogenicity" J Immunol. 15 de marzo de 2.005; 174( 6): 3.187-96.) En la presente descripcion, la inmunogenicidad de la enzima CRISPR en particular se puede reducir siguiendo la propuesta explicada primero en Tangri et al con respecto a eritropoyetina y desarrollada con posterioridad. De acuerdo con esto, se puede usar la evolucion directa o el diseno racional para reducir la inmunogenicidad de la enzima CRISPR (por ejemplo una Cas9) en la especie huesped (ser humano u otras especies).
En las plantas, los patogenos son con frecuencia especfficos del huesped. Por ejemplo, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici produce marchitamiento del tomate pero ataca solo al tomate y F. oxysporum f. dianthii Puccinia graminis f sp. tritici ataca solo al trigo. Las plantas tienen defensas existentes e inducidas para resistir a la mayorfa de los patogenos. Las mutaciones y casos de recombinacion a lo largo de las generaciones de plantas conducen a variabilidad genetica que da lugar a susceptibilidad, especialmente cuando se reproducen los patogenos con mas frecuencia que las plantas. En las plantas puede haber resistencia al no huesped, por ejemplo, el huesped y el patogeno son incompatibles. Tambien puede ser Resistencia Horizontal, por ejemplo, resistencia parcial contra todas las razas de un patogeno, controlado tfpicamente por muchos genes y Resistencia Vertical, por ejemplo, resistencia completa a algunas razas de un patogeno pero no a las demas razas, tfpicamente controlado por algunos genes. En un nivel gen por gen, las plantas y los patogenos evolucionan juntos y los cambios geneticos en uno equilibran los cambios en otro. De acuerdo con esto, usando Variabilidad Natural, los criadores combinan la mayorfa de los genes utiles para Rendimiento, Calidad, Uniformidad, Dureza, Resistencia. Las fuentes de genes de la resistencia incluyen Variedades naturales o extranas, Variedades Heirloom, Mutaciones Relativas a las Plantas Silvestres e Inducidas, por ej., tratando material vegetal con agentes mutagenicos. Usando la presente divulgacion, se proporciona a los criadores de plantas una nueva herramienta para inducir mutaciones. De acuerdo con esto, un experto en la materia puede analizar el genoma de fuentes de genes de resistencia y en Variedades con caracterfsticas o rasgos deseados emplea la presente divulgacion para inducir el aumento de genes de resistencia, con mas precision que los agentes mutagenicos previos y por lo tanto acelera y mejora los programas de cultivo.
Como sera evidente, se preve que el presente sistema se pueda usar para fijar como objetivo cualquier secuencia de polinucleotidos de interes. Algunos ejemplos de afecciones o enfermedades que se podfan tratar positivamente usando el presente sistema se incluyen en las Tablas anteriores y tambien se proporcionan allf ejemplos de genes
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asociados en la actualidad a esas enfermedades. Sin embargo, los genes ejemplificados no son exhaustivos. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos de diversas realizaciones de la invencion y no estan destinados a limitar la presente invencion de ningun modo. Los presentes ejemplos, junto con los metodos descritos en la presente memoria son representativos en el momento presente de realizaciones preferidas, son ejemplares, y no se destinan a limitar el alcance de la invencion.
Ejemplo 1: Actividad del complejo CRISPR en el nucleo de una celula eucariota.
Un sistema CRISPR de ejemplo de tipo II es el sitio CRISPR de tipo II de Streptococcus pyogenes SF370, que contiene una agrupacion de cuatro genes Cas9, Cas1, Cas2 y Csn1, asf como dos elementos de ARN no codificante, ARNtracr y una serie caracterfstica de secuencias repetitivas (repeticiones directas) inter espaciadas por tramos cortos de secuencias no repetitivas (espaciadores, aproximadamente 30 pb cada uno). En este sistema, se genera rotura de doble cadena (RDC) de ADN fijado como objetivo en cuatro etapas secuenciales (Figura 2A). Primero, dos ARN no codificantes, la serie pre- ARNcr y ARNtracr, se transcriben del sitio CRISPR. Segundo, ARNtracr se hibrida a las repeticiones directas de pre- ARNcr, que se tratan despues en ARNcr maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales. Tercero, el complejo ARNcr:ARNtracr maduro dirige Cas9 al aDn objetivo que consiste en el protoespaciador y la correspondiente PAM via la formacion de heteroduplex entre la region espaciadora del ARNcr y el ADN protoespaciador. Finalmente, Cas9 media la escision de ADN objetivo aguas arriba de PAM para crear una RDC dentro del protoespaciador (Figura 2A). Este ejemplo describe un procedimiento de ejemplo para adaptar este sistema de nucleasa programable de ARN para dirigir la actividad del complejo CRISPR en el nucleo de las celulas eucariotas.
Para mejorar la expresion de los componentes CRISPR en celulas de mamffero, se codon-optimizaron dos genes del sitio 1 de SF370 de Streptococcus pyogenes (S. pyogenes), Cas9 (SpCas9) y RNasa III (SpRNasa III). Para facilitar la localizacion nuclear, se incluyo una senal de localizacion nuclear en el termino (N) amino o (C) carboxilo de ambas SpCas9 y SpRNasa III (Figura 2B). Para facilitar la visualizacion de la expresion de protefnas, tambien se incluyo un marcador de protefna fluorescente en el N- o C-terminal de ambas protefnas (Figura 2B). Tambien se genera una version de SpCas9 con un NLS unido a ambos N- y C-terminal (2xNLS-SpCas9). Se transfectaron construcciones que contenfan SpCas9 NLS-fusionada y SpRNasa III en celulas de rinon embrionico humano (HEK, por sus siglas en ingles) 293FT y se encontro el posicionamiento relativo de la NLS a SpCas9 y SpRNasa III para afectar a su eficacia de localizacion nuclear. Mientras la NLS C-terminal fue suficiente para fijar como objetivo SpRNasa III para los nucleos, la union de una sola copia de estas NLS particulares en cualquiera de los N- o C- terminal de SpCas9 no pudo conseguir la localizacion nuclear adecuada en este sistema. En este ejemplo, la NLS C- terminal fue la de nucleoplasmina (KRPAATKKAGQAKKKK) y la NLS C-terminal fue la del antfgeno T grande SV40 (PKKKRKV). De las versiones de SpCas9 ensayadas, solo 2xNLS-SpCas9 presento localizacion nuclear (Figura 2B).
La secuencia ARNtracr del sitio CRISPR de S. pyogenes SF370 presenta dos sitios de comienzo transcripcional, dando lugar a dos transcritos de 89 nucleotidos (nt) y 171 nt que se tratan con posterioridad en ARNtracr maduros de 75 nt identicos. Se selecciono el ARNtracr de 89 nt mas corto para expresion en celulas de mamffero (construcciones de expresion ilustradas en la Figura 6, con funcionalidad cuando se determina por los resultados del ensayo de Surveryor mostrado en la Figura 6B). Los sitios de comienzo de la transcripcion se senalan como +1 y el terminador de la transcripcion y la secuencia probada por el ensayo de northern se indican tambien. La expresion de ARNtracr tratado tambien se confirmo por ensayo de Northern. La Figura 7C muestra los resultados de un ensayo de Northern de ARN total extrafdo de celulas 293FT transfectadas con construcciones de expresion U6 que soportan ARNtracr largo o corto, asf como SpCas9 y DR-EMX1(1 )-DR. Los paneles izquierdo y derecho son de celulas 293FT transfectadas sin o con SpRNasa III, respectivamente. U6 indica control de carga representado graficamente con una sonda que fija como objetivo ARNsn U6 humano. La transfeccion de la construccion de expresion de ARNtracr corto conduce a niveles abundantes de la forma tratada de ARNtracr (~75 pb). Se detectan cantidades muy bajas de ARNtracr largo en el analisis de Northern.
Para activar la iniciacion precisa transcripcional, se selecciono el activador de U6 basado en ARN polimerasa III para conducir la expresion de ARNtracr (Figura 2C). De manera similar, se desarrollo una construccion a base de activador U6 para expresar una serie pre-ARNcr que consiste en un unico espaciador flanqueado por dos repeticiones directas (las RD, tambien incluida por el termino "secuencias de emparejamiento tracr"; Figura 2C). Se diseno el espaciador inicial para fijar como objetivo un sitio objetivo de 33 pares de bases (pb) (protoespaciador de 30 pb mas una secuencia de unidad (PAM) CRISPR de 3 pb que satisface la unidad de reconocimiento NGG de Cas9) en el sitio EMX1 humano (Figura 2C), un gen clave en el desarrollo de la corteza cerebral.
Para ensayar si la expresion heterologa del sistema CRISPR (SpCas9, SpRNasa III, ARNtracr y pre-ARNcr) en celulas de mamffero puede conseguir la escision fijada como objetivo de cromosomas de mamffero, se transfectaron celulas HEK 293FT con combinaciones de componentes CRISPR. Puesto que las RDC en nucleos de mamffero se reparan parcialmente por la ruta de union de extremos no homologos (NHEJ, por sus siglas en ingles), que conduce a la formacion de inserciones o supresiones, se uso el ensayo Surveyor para detectar potencial actividad de escision
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en el sitio EMX1 objetivo (vease por ej., Guschin et al., 2.010, Methods Mol Biol 649: 247). La transfeccion conjunta de los cuatro componentes CRISPR pudo inducir una escision hasta del 5,0% en el protoespaciador (vease la Figura 2D). La transfeccion conjunta de todos los componentes CRISPR menos SpRNasa III tambien indujo hasta 4,7% de insercion o supresion en el protoespaciador, que sugiere que puede haber Rnasas de mamffero endogenas que son capaces de ayudar a la maduracion de ARNcr, tal como por ejemplo las enzimas Dicer y Drosha relacionadas. Retirar cualquiera de los tres componentes restantes anula la actividad de escision del genoma del sistema CRISPR (Figura 2D). La secuenciacion Sanger de amplicones que contiene el sitio fijado como objetivo verifico la actividad de escision: en 43 clones secuenciados, se encontraron 5 alelos mutados (11,6%). Experimentos similares usando una variedad de secuencias gufa produjeron porcentajes de insercion o supresion tan altos como 29% (veanse las Figuras 4-8, 10 y 11). Estos resultados definen un sistema de tres componentes para modificacion de genomas mediada por CRISPR eficaz en celulas de mamffero.
Para optimizar la eficacia de escision, los solicitantes tambien ensayaron si diferentes isoformas de ARNtracr afectaban a la eficacia de la escision y encontraron que, en este sistema de ejemplo, solo la forma transcrita corta (89 pb) era capaz de mediar la escision del sitio genomico EMX1 humano. La Figura 9 proporciona un analisis de Northern adicional de tratamiento de ARNcr en celulas de mamffero. La Figura 9A ilustra un esquema que muestra el vector de expresion para un unico espaciador flanqueado por dos repeticiones directas (RD-EMX1(1)- RD). El espaciador de 30 pb que fija como objetivo el protoespaciador 1 del sitio EMX1 humano y las secuencias de repeticion directa se muestran en la secuencia debajo de la Figura 9A La lfnea indica la region cuya secuencia de complemento inverso se uso para generar sondas de Northern para deteccion de ARNcr de EMX1(1). La Figura 9B muestra un analisis Northern de ARN total extrafdo de celulas 293FT transfectadas con construcciones de expresion U6 que soportan RD-EMX1(1)- RD. Los paneles izquierdo y derecho son de celulas 293FT transfectadas sin o con SpRNasa III respectivamente. Se trato RD-EMX1(1)- RD en ARNcr maduros solo en presencia de SpCas9 y ARNtracr corto y no fue dependiente de la presencia de SpRNasa III. El ARNcr maduro detectado de ARN total de 293FT transfectado es ~33 pb y es mas corto que el ARNcr maduro de 39-42 pb de S. pyogenes. Estos resultados demuestran que un sistema CRISPR se puede trasplantar en celulas eucariotas y reprogramar para facilitar la escision de polinucleotidos objetivo de mamfferos endogenos.
La Figura 2 ilustra el sistema CRISPR bacteriano descrito en este ejemplo. La Figura 2A ilustra un esquema que muestra el sitio 1 de CRISPR de Streptoooccus pyogenes SF370 y un mecanismo propuesto de escision de aDn mediada por CRISPR por este sistema. El ARNcr maduro tratado de la sene repeticion directa - espaciador dirige Cas9 a objetivos genomicos que constan de protoespaciadores complementario y una unidad adyacente al protoespaciador (PAM). En el emparejamiento de base objetivo-espaciador, Cas9 media una rotura de doble cadena en el ADN objetivo. La Figura 2B ilustra el logro de Cas9 de S. pyogenes (SpCas9) y RNasa III (SpRNasa III) con senales de localizacion nuclear (las NLS) para permitir la importacion al nucleo del mamffero. La Figura 2C ilustra la expresion de mamffero de SpCas9 y SpRNasa III conducida por el activador EF1a constitutive y ARNtracr y la serie pre-ARNcr (RD-Espaciador-RD) conducidos por el activador U6 de ARN Pol3 para activar iniciacion y terminacion de transcripcion precisa. Un protoespaciador del sitio EMX1 humano con una secuencia PAM satisfactoria se usa como el espaciador en la serie pre-ARNcr. La Figura 2D ilustra ensayo de la nucleasa surveyor para inserciones y supresiones minoritarias mediadas por SpCas9. SpCas9 se expreso con y sin SpRNasa III, ARNtracr y una serie pre-ARNcr que soporta el espaciador objetivo EMX1. La Figura 2E ilustra una representacion esquematica de emparejamiento de bases entre el sitio objetivo y ARNcr que fija como objetivo EMX1, asf como un cromatograma de ejemplo que muestra una microsupresion adyacente al sitio de escision de SpCas9. La Figura 2F ilustra alelos mutados identificados de analisis de secuenciacion de 43 amplicones clonales que muestran una variedad de microinserciones y supresiones. Las lfneas discontinuas indican bases suprimidas y bases no alineadas o desajustadas indican inserciones o mutaciones. Barra de escala = 10 pm.
Para simplificar ademas el sistema de tres componentes, se adapto un diseno hfbrido de ARNcr-ARNtracr quimerico, donde un ARNcr maduro (que comprende una secuencia gufa) se fusiona a un ARNtracr parcial via un tallo-lazo para imitar el duplex ARNcr:ARNtracr natural (Figura 3A).
Las secuencias gufa se pueden insertar entre sitios BbsI usando oligonudeotidos hibridados. Los protoespaciadores en las hebras transcrita y complementaria se indican por encima y por debajo de las secuencias de ADN, respectivamente. Se consiguio una tasa de modificacion de 6,3% y 0,75% para los sitios PVALB humano y Th de raton, respectivamente, que demuestra la amplia aplicabilidad del sistema CRISPR en la modificacion de diferentes sitios a traves de multiples organismos. Aunque la escision solo se detecto con uno de tres espaciadores para cada sitio usando las construcciones quimericas, todas las secuencias objetivo se escindieron con eficacia de produccion de insercion o supresion que alcanzo el 27% cuando se uso la disposicion de pre-ARNcr expresada conjuntamente (Figuras 4 y 5).
La Figura 5 proporciona una ilustracion mas de que SpCas9 puede ser reprogramado para fijar como objetivo multiples sitios genomicos en celulas de mamffero. La Figura 5A proporciona un esquema del sitio EMX1 humano que muestra la posicion de cinco protoespaaadores, indicado por las secuenaas subrayadas. La Figura 5B proporciona un esquema del complejo pre-ARNcr/ARNtrcr que muestra la hibridacion entre la region de repeticion directa del pre-ARNcr y ARNtracr (parte superior) y un esquema de un diseno de ARN quimerico que comprende una secuencia gufa de 20 pb y secuencias de emparejamiento tracr y tracr que consisten en secuencias de repeticion directa parcial y ARNtracr hibridadas segun la estructura de horquilla (fondo). Los resultados de un ensayo
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Surveyor comparando la eficacia de escision mediada por Cas9 en cinco protoespaciadores en el sitio EMX1 humano se ilustra en la Figura 5C. Cada protoespaciador se fija como objetivo usando complejo pre- ARNcr/ARNtracr tratado (ARNcr) o ARN quimerico (ARNqui).
Puesto que la estructura secundaria de ARN puede ser crucial para interacciones intermoleculares, se uso un conjunto de algoritmo de prediccion de estructuras basado en energfa libre minima y estructura pesada de Boltzmann para comparar la estructura secundaria putativa de todas las secuencias guia usadas en nuestro experimento de fijacion como objetivo de genoma (Figura 3B) (vease por ej., Gruber et al., 2.008, Nucleic Acids Research, 36: W70). El analisis revelo que en la mayoria de los casos, las secuencias guia eficaces en el contexto de ARNcr quimerico estaban sustancialmente exentas de unidades de estructura secundaria, mientras las secuencias guia ineficaces era mas probable que formaran estructuras secundarias internas que podfan evitar el emparejamiento de bases con el ADN de protoespaciador objetivo. Asf es posible que la variabilidad en la estructura secundaria del espaciador puede impactar en la eficacia de la interferencia mediada por CRISPR cuando se usa un ARNcr quimerico.
La Figura 3 ilustra vectores de expresion de ejemplo. La Figura 3A proporciona un esquema de un vector bi- cistronico para conducir la expresion de una quimera ARNcr-ARNtracr sintetica (ARN quimerico) asf como SpCas9. El ARN guia quimerico contiene una secuencia guia de 20 pb correspondiendo al protoespaciador en el sitio objetivo genomico. La Figura 3B proporciona un esquema que muestra secuencias guia que fijan como objetivo los sitios EMX1, PVALB humano y Th de raton, asf como sus estructuras secundarias previstas. La eficacia de la modificacion en cada sitio objetivo se indica debajo del dibujo de la estructura secundaria del ARN (EMX1, n = 216 lecturas de secuenciacion de amplicones; PVALB, n = 224 lecturas; Th, n = 265 lecturas). El algoritmo de plegamiento produjo una salida con cada base coloreada de acuerdo con su probabilidad de asumir la estructura secundaria prevista, como se indica por una escala en arco iris que se reproduce en la Figura 3B en escala de grises. Mas disenos de vectores para SpCas9 se presentan en la Figura 3A, incluyendo vectores unicos de expresion que incorporan un activador U6 ligado a un sitio de insercion para un oligo guia y un activador Cbh ligado a secuencia de codificacion SpCas9.
Para ensayar si los espaciadores que contienen estructuras secundarias son capaces de funcionar en celulas procariotas en las cuales los CRISPR operan de manera natural, se ensayo interferencia de transformacion de plasmidos que soportan protoespaciadores en una cepa E. coli que expresa de manera heterologa el sitio 1 CRISPR SF370 de S. pyogenes (Figura 3C). Se clono el sitio CRISPR en un vector de expresion E. coli de copia baja y se reemplazo la serie ARNcr con un espaciador unico flanqueado por un par de las RD (pCRISPR). Se transformaron cepas E. coli que albergaban diferentes plasmidos pCRISPR con plasmidos cuestionados conteniendo el correspondiente protoespaciador y secuencias PAM (Figura 3C). En el ensayo de bacterias, todos los espaciadores facilitaron interferencia de CRISPR eficaz (Figura 3C). Estos resultados sugieren que puede haber factores adicionales que afecten a la eficacia de la actividad de CRISPR en celulas de mamffero.
Para investigar la especificidad de la escision mediada por CRISPR, se analizo el efecto de mutaciones de unico nucleotido en la secuencia guia sobre la escision del protoespaciador en el genoma de mamffero usando una serie de ARNcr quimericos que fijan como objetivo EMX1 con mutacion de puntos unicos (Figura 4A). La Figura 4B ilustra los resultados de un ensayo de nucleasa Surveyor comparando la eficacia de la escision de Cas9 cuando se empareja con diferentes ARN quimericos mutantes. El desajuste de bases unicas hasta 12 pb 5' de la PAM sustancialmente anulo la escision genomica por SpCas9, mientras los espaciadores con mutaciones en posiciones aguas arriba mas lejos retuvieron la actividad frente al objetivo del protoespaciador original (Figura 4B). Ademas de la PAM, SpCas9 presenta especificidad de base unica dentro de los ultimos 12 pb del espaciador. Ademas, CRISPR es capaz de mediar la escision genomica tan eficazmente como un par de nucleasas TALE (TALEN) fijando como objetivo el mismo protoespaciador EMX1. La Figura 4C proporciona un esquema que muestra el diseno de las TALEN que fijan como objetivo EMX1 y la Figura 4D muestra un gel Surveyor comparando la eficacia de TALEN y Cas9 (n=3).
Teniendo establecida una serie de componentes para conseguir edicion de genes mediada por CRISPR en celulas de mamffero a traves del mecanismo NHEJ con predisposicion a errores, se ensayo la capacidad de CRISPR para estimular la recombinacion homologa (RH), una ruta de reparacion de genes de alta fidelidad para preparar mediciones precisas en el genoma. SpCas9 de tipo natural es capaz de mediar las RDC especfficas del sitio, que se pueden reparar a traves de tanto NHEJ como RH. Ademas, se logro una sustitucion de aspartato a alanina (D10A) en el dominio catalftico RuvC I de SpCas9 para convertir la nucleasa en una nickasa (SpCas9n; ilustrado en la Figura 5A) (vease por ej., Sapranausaks et al., 2.011, Cucleic Acis Research, 39: 9.275; Gasiunas et al., 2.012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109: E2579), de manera que el ADN genomico nickeado experimenta la reparacion dirigida por homologfa de alta fidelidad (HDR, por sus siglas en ingles). El ensayo Surveyor confirmo que SpCas9n no generaba inserciones o supresiones en el objetivo del protoespaciador EMX1. Como se ilustra en la Figura 5B, la expresion conjunta de ARNcr quimerico que fija como objetivo EMX1 con SpCas9 produjo inserciones o supresiones en el sitio fijado como objetivo, mientras la expresion conjunta con SpCas9n no lo hizo (n=3). Por otra parte, la secuenciacion de 327 amplicones no detecto ninguna insercion o supresion inducida por SpCas9n. Se selecciono el mismo sitio para ensayar RH mediada por CRISPR por transfeccion conjunta de celulas HEK 293FT con el ARN quimerico que fija como objetivo EMX1, hSpCas9 o hSpCas9n, asf como una plantilla de RH para introducir un par de sitios de restriccion (HindIII y NheI) cerca del protoespaciador. La Figura 5C proporciona una ilustracion en esquema de la
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estrategia de la RH, con posiciones relativas de puntos de recombinacion y secuencias de hibridacion de cebadores (flechas). SpCas9 y SpCas9n por supuesto catalizaron la integracion de la plantilla de RH en el sitio EMX1. La multiplicacion por PCR de la region fijada como objetivo seguida por digestion de restriccion con Hind\\\ revelo productos de escision correspondiendo a tamanos de fragmentos esperados (flechas en analisis de gel de polimorfismo de longitud del fragmento de restriccion mostrado en la Figura 5D), mediando SpCas9 y SpCas9n niveles similares de eficacias de la RH. Los solicitantes verificaron ademas RH usando secuenciacion de Sanger de amplicones genomicos (La Figura 5E). Estos resultados demuestran la utilidad de CRISPR para facilitar la insercion de genes fijados como objetivo en el genoma del mamffero. Dada la especificidad objetivo de 14 pb (12 pb del espaciador y 2 pb de la PAM) de SpCas9 de tipo natural, la disponibilidad de una nickasa puede reducir significativamente la probabilidad de modificaciones fuera de lo proyectado, puesto que las roturas de hebra unica no son sustratos para la ruta NHEJ con predisposicion a errores.
Las construcciones de expresion que imitan la arquitectura natural de sitios CRISPR con espaciadores formados (Figura 2A) se construyeron para ensayar la posibilidad de fijar como objetivo secuencias multiplexadas. Usando una unica serie CRISPR codificando un par de espaciadores que fijan como objetivo EMX1 y PVALB, se detecto la escision eficaz en ambos sitios (Figura 4F, que muestra tanto un diseno esquematico de la serie ARNcr como un analisis Surveyor mostrando la mediacion eficaz de la escision). La supresion fijada como objetivo de regiones genomicas mayores a traves de las RDC usando espaciadores frente a dos objetivos dentro de EMX1 espaciado por 119 pb tambien se ensayo y se detecto una eficacia de la supresion del 1,6% (3 de un total de 182 amplicones; Figura 5G). Esto demuestra que el sistema CRISPR puede mediar la edicion multiplexada dentro de un unico genoma.
Ejemplo 2: Modificaciones y alternativas del sistema CRISPR.
La capacidad para usar ARN para programar escision de ADN especffica de la secuencia define una nueva clase de herramientas de ingenierfa del genoma para una variedad de aplicaciones de investigacion e industriales. Diversos aspectos del sistema CRISPR se pueden mejorar ademas para aumentar la eficacia y la versatilidad de la fijaci on como objetivo de CRISPR. La actividad optima de Cas9 puede depender de la disponibilidad de Mg2+ libre en niveles mayores que los presentes en el nucleo de los mamfferos (vease por ej., Jinek et al., 2.012, Science, 337: 816) y la preferencia para una unidad de NGG inmediatamente aguas abajo del protoespaciador restringe la capacidad para fijar como objetivo de promedio cada 12 pb en el genoma humano. Algunas de estas restricciones se pueden superar explorando la diversidad de los sitios CRISPR a traves del metagenoma microbiano (vease por ej., Makarova et al., 2.011, Nat Rev Microbiol, 9: 467). Otros sitios CRISPR pueden ser trasplantados en el medio celular de los mamfferos mediante un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1. La eficacia de la modificacion en cada sitio fijado como objetivo se indica debajo de las estructuras secundarias de ARN. El algoritmo que genera las estructuras colorea cada base de acuerdo con su probabilidad de asumir la estructura secundaria prevista. Los espaciadores 1 y 2 gufa de ARN indujeron 14% y 6,4%, respectivamente. El analisis estadfstico de la actividad de escision a traves de replicas biologicas en estos dos sitios del protoespaciador se proporciona tambien en la Figura 7.
Ejemplo 3: Algoritmo de seleccion de secuencias objetivo de muestra.
Se disena un programa informatico para identificar secuencias objetivo de CRISPR candidato en ambas cadenas de una secuencia de ADN de entrada basada en longitud deseada de secuencias gufa y una secuencia de unidad CRISPR (PAM) para una enzima CRISPR especificada. Por ejemplo, los sitios objetivo para Cas9 de S. pyogenes, con secuencias NGG de PAM, se pueden identificar por investigacion para 5'-Nx-NGG-3' ambas en la secuencia de entrada y en el complemento inverso de la entrada. Asimismo los sitios objetivo para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus, con secuencia NNAGAAW de PAM, se pueden identificar por investigacion para 5'-Nx-NNAGAAW-3' ambos en la secuencia de entrada y en el complemento inverso de la entrada. Asimismo, los sitios objetivo para Cas9 de CRISPR3 de S. thermophilus, con secuencia NGGNG de PAM, se pueden identificar por investigacion para 5'-Nx-NGGNG-3' ambos en la secuencia de entrada y en el complemento inverso de la entrada. El valor "x" en Nx puede ser fijado por el programa o especificado por el usuario, tal como 20.
Puesto que multiples apariciones en el genoma del sitio objetivo de ADN pueden conducir a edicion de genoma no especifica, despues de identificar todos los sitios potenciales, el programa filtra secuencias basadas en el numero de veces que aparecen en el genoma de referenda relevante. Para esas enzimas CRISPR para las cuales se determina la especificidad de secuencia mediante una secuencia "simiente", tal como la 5' de 11-12 pb de la secuenaa PAM, incluyendo la propia secuencia PAM, la etapa de filtracion puede estar basada en la secuencia simiente. Asf, para evitar la edicion en sitios genomicos adicionales, los resultados se filtran basandose en el numero de apariciones de la secuenaa simiente:PAM en el genoma relevante. Se puede permitir que el usuario elija la longitud de la secuencia simiente. Tambien se puede permitir que el usuario especifique el numero de apariciones de la secuencia simiente:PAM en un genoma para fines de pase del filtro. El defecto es investigar secuencias unicas. El nivel de filtracion se modifica cambiando tanto la longitud de la secuenda simiente como el numero de apariciones de la secuencia en el genoma. El programa puede proporcionar ademas o como alternativa la secuencia de una secuencia gufa complementaria a la secuencia o secuencias objetivo indicadas proporcionando el complemento inverso de la secuencia o secuencias objetivo identificadas.
Ejemplo 4: Evaluacion de hfbridos ARNcr-ARNtracr quimericos multiples.
Este ejemplo describe los resultados obtenidos para los ARN quimericos (los ARNqui; que comprenden una secuencia gufa, una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr en un transcrito unico) que tienen secuencias tracr que incorporan diferentes longitudes de secuencia ARNtracr de tipo natural. La Figura 18a ilustra 5 un esquema de un vector bicistronico de expresion para ARN quimerico y Cas9. Cas9 es conducido por el activador CBh y el ARN quimerico es conducido por un activador U6. El ARN gufa quimerico consta de una secuencia gufa de 20 pb (Ns) unida a la secuencia tracr (barriendo desde la primera "U" de la hebra menor al extremo del transcrito), que se trunca en diversas posiciones como se indica. Las secuencias gufa y tracr se separan mediante la secuencia de emparejamiento tracr GUUUUAGAGCUA seguido por la secuencia lazo GAAA. Los resultados de los ensayos 10 SURVEYOR para inserciones o supresiones mediadas por Cas9 en los sitios EMX1 y PVALB humanos se ilustran en la Figura 18b y 18c, respectivamente. Las flechas indican los fragmentos SURVEYOR esperados. Los ARNqui se indican por su designacion "+n" y ARNcr se refiere a un ARN hfbrido donde las secuencias gufa y tracr se expresan como transcritos separados. La cuantificacion de estos resultados, realizados por triplicado, se ilustran por histograma en las Figuras 11a y 11b, que corresponden a las Figuras 10b y 10c, respectivamente ("N. D." indica no 15 inserciones o supresiones detectadas). Los iD del protoespaciador y su correspondiente objetivo genomico, secuencia del protoes paciador, secuencia PAM y posicion de la cadena se proporcionan en la Tabla D. Las secuencias gufa se disenan para que sean complementarias a la secuencia completa del protoespaciador en el caso de transcritos separados en el sistema hfbrido o solo a la porcion subrayada en el caso de ARN quimericos.
Tabla D:
ID del protoespaciador
objetivo genomico secuencia del protoespaciador (5' a 3') PAM Hebra
1
EMX1 GGACATCGATGTCACCTCCAATGACTAG GG TGG +
2
EMX1 CATTGGAGGTGACATCGATGTCCTCCCC AT TGG -
3
EMX1 GGAAGGGCCTGAGTCCGAGCAGAAGAA GAA GGG +
4
PVALB GGTGGCGAGAGGGGCCGAGATTGGGT GT TC AGG +
5
PVALB ATGCAGGAGGGT GGCGAGAGGGGCCGA GAT TGG +
20 Cultivo celular y transfeccion
Se mantuvo la estirpe celular 293FT (Life Technologies) de rinon embrionico humano (HEK, por sus siglas en ingles) en Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) enriquecido con suero fetal bovino al 10% (HyClone), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina a 37°C con incubacion en CO2 al 5%. Se sembraron celulas 293FT en placas de 24 pozos (Corning) 24 horas previamente a transfeccion a una densidad 25 de 150.000 celulas por pozo. Se transfectaron las celulas usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Para cada pozo de una placa de 24 pozos, se uso un total de 500 ng de plasmido.
Ensayo SURVEYOR para modificacion de genomas
Se transfectaron celulas 293FT con ADN de plasmido como se describio anteriormente. Se incubaron las celulas a 30 37°C durante 72 horas post-transfeccion previamente a extraccion de ADN genomico. Se extrajo ADN genomico
usando la solucion de extraccion de ADN QuickExtract (Epicentre) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se volvieron a suspender las celulas del boton en solucion QuickExtract y se incubaron a 65 °C durante 15 minutos y 98 °C durante 10 minutos. La region genomica que flanquea el sitio objetivo de CRISPR para cada gen se multiplico por PCR (cebadores enumerados en la Tabla E) y se purificaron los productos usando una columna de QiaQuick 35 Spin (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se mezclaron 400 ng totales de los productos PCR purificados con 2 pl 10X de tampon PCR ADN Taq Polimerasa (Enzymatics) y agua ultra pura a un volumen final de 20 pl y se sometieron a un procedimiento de rehibridacion para permitir la formacion de heteroduplex: 95°C durante 10 min, 95°C a 85°C descendiendo a -2°C/s, 85°C a 25°C a - 0,25°C& y 25°C mantenidos durante 1 minuto. Despues de rehibridacion, se trataron los productos con nucleasa SURVEYOR y estimulador S SURVEYOR (Transgenomics) 40 siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante y se analizaron sobre geles de poliacrilamida Novex TBE al 420% (Life Technologies). Se tineron los geles con tincion de ADN SYBR Gold (Life Technologies) durante 30 minutos y se formaron imagenes con un sistema de formacion de imagenes de gel Gel Doc (Bio-rad). La cuantificacion estuvo basada en intensidades de banda relativas.
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Tabla E:
nombre del cebador
objetivo genomico secuenaa del cebador (5' a 3')
Sp-EMX1-F
EMX1 AAAACCACCCTTCTCTCTGGC
Sp-EMX1-R
EMX1 GGAGATTGGAGACACGGAGA G
Sp-PVALB-F
PVALB CTGGAAAGCCAATGCCTGAC
Sp-PVALB-R
PVALB GGCAGCAAACTCCTT GTCCT
Identificacion computacional de sitios fijados como objetivo de CRISPR unicos
Para identificar sitios fijados como objetivo unicos para la enzima SF370 Cas9 (SpCas9) de S. pyogenes en genoma de ser humano, raton, rata, pez cebra, mosca de la fruta y C. elegans, se desarrollo un paquete informatico para escanear ambas hebras de una secuencia de ADN e identificar todos los posibles sitios objetivo de SpCas9. Para este ejemplo, cada sitio objetivo SpCas9 se definio operacionalmente como una secuencia de 20 pb seguido por una secuencia de unidad adyacente del protoespaciador (PAM) de NGG y se identificaron todas las secuencias que satisfacfan esta definicion de 5'-N20-NGG-3' en todos los cromosomas. Para evitar la edicion de genoma no especffica, despues de identificar todos los sitios potenciales, se filtraron todos los sitios objetivo basandose en el numero de veces que aparecfan en el genoma de referenda relevante. Para sacar provecho de la especificidad de la secuenaa de la actividad de Cas9 conferida por una secuencia "simiente", que puede ser, por ejemplo, secuencia 5' de aproximadamente 11-12 pb de la secuencia PAM, se seleccionaron secuencias 5'-NNNNNNNNNN-NGG-3' para que fueran unicas en el genoma relevante. Todas las secuencias genomicas se descargaron de UCSC Genome Browser (genoma humano hg19, genoma de raton mm9, genoma de rata m5, genoma de pez cebra danRer7, genoma dm4 de D. melanogaster y genoma ce10 de C. elegans). Los resultados de la investigacion completa estan disponibles para navegar usando la informacion de UCSC Genome Browser. Una visualizacion de ejemplo de algunos sitios objetivo en el genoma humano se proporciona en la Figura 22.
Inicialmente, se fijaron como objetivo tres sitios dentro del sitio de EMX1 en celulas HEK 293FT humanas. Se evaluo la eficacia de la modificacion del genoma de cada ARNqui usando el ensayo de la nucleasa SURVEYOR, que detecta mutaciones que resultan de las roturas de la doble cadena de ADN (las RDC) y su posterior reparacion por la ruta de reparacion de danos de ADN de union del extremo no homologo (NHEJ). Las construcciones designadas ARNqui(+n) indican que hasta el nucleotido +n de ARNtracr de tipo natural se incluye en la construccion de ARN quimerico, con valores de 48, 54, 67 y 85 usados para n. Los ARN quimericos que contienen fragmentos mayores de ARNtracr de tipo natural (ARNqui (+67) y ARNqui (+85)) mediaron la escision de ADN en los tres sitios objetivo de EMX1, demostrando ARNqui (+85) en particular niveles significativamente mayores de escision de ADN que los correspondientes hfbridos ARNcr/ARNtracr que expresaron secuencias gufa y tracr en transcritos separados (Figuras 10b y 10a). Tambien se fijaron como objetivo dos sitios en el sitio PVALB que no proporcionaron escision detectable usando el sistema hfbrido (secuencia gufa y secuencia tracr expresadas como transcritos separados) usando ARNquis. ARNqui(+67) y ARNqui(+85) fueron capaces de mediar escision significativa en los dos protoespaciadores PVALB (Figuras 10c y 10b).
Para los cinco objetivos en los EMX1 y PVALB, se observo un incremento consistente en la eficacia de modificacion del genoma con longitud creciente de la secuencia tracr. Sin desear estar limitados por ninguna teorfa, la estructura secundaria formada por el extremo 3' de la ARNtracr puede desempenar una funcion en la activacion de la tasa de formadon de complejo CRISPR. Una ilustracion de las estructuras secundarias previstas para cada uno de los ARN quimericos usados en este ejemplo se proporciona en la Figura 21. Se predijo la estructura secundaria usando ARNfold (
http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) usando energfa libre minima y algoritmo de funcion de particion. El pseudocolor para cada base (reproducido en escala de grises) indica la probabilidad de emparejamiento. Debido a que los ARNquis con secuencias tracr mas largas eran capaces de escindir objetivos que no eran escndidos por hfbridos ARNcr/ARNtracr de CRISPR naturales, es posible que se pueda cargar ARN quimerico en Cas9 mas eficazmente que su contrapartida hfbrida natural. Para facilitar la aplicacion de Cas9 para edicion de genoma especffica del sitio en celulas y organismos eucariotas, todos los sitios objetivo unicos previstos para la Cas9 de S. pyogenes se identificaron de manera computacional en los genomas del ser humano, raton, rata, pez cebra, C. elegansy D. melanogaster. Se pueden disenar ARN quimericos para enzimas Cas9 de otros microbios para expandir el espacio fijado como objetivo de las nucleasas programables de ARN de CRISPR.
Las Figuras 11 y 21 ilustran vectores de expresion bicistronicos ejemplares para expresion de ARN quimerico incluyendo hasta el nucleotido +85 de secuencia de ARNtracr de tipo natural y SpCas9 con secuencias de localizacion nuclear. SpCas9 se expresa a partir de un activador CBh y termina con la senal poliA bGH (bGH pA). La
secuencia expandida ilustrada inmediatamente debajo del esquema corresponde a la region que rodea al sitio de insercion de la secuencia gufa e incluye, desde 5' a 3', la porcion 3' del activador U6 (primera region sombreada), sitios de escision BbsI (flechas), repeticion directa parcial (secuencia de emparejamiento tracr GTTTTAGAGCTA, subrayada), secuencia lazo GAAA y secuencia tracr +85 (secuencia subrayada despues de la secuencia lazo). Un 5 inserto de la secuencia gufa ejemplar se ilustra debajo del sitio de la insercion de la secuencia gufa, con nucleotidos de la secuencia gufa para un objetivo seleccionado representado por una "N".
Las secuencias descritas en los ejemplos anteriores son como sigue (las secuencias de polinucleotidos son 5' a 3'): ARNtracr corto U6 (Streptococcus pyogenes SF370):
GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGA GAG AT AATTGG AATT AATTT G ACT GT AAAC AC AAAG ATATTAGTAC AAAATACGTG ACGT AG AAAGT AAT AATTTCTT GGGT AGTTT GC AGTTTT AAAATT AT GTTTT AAAAT GGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATC TTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAGTTAAAAT AAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT (negrita = secuencia ARNtracr; subrayado = secuencia terminadora)
ARNtracr largo U6 (Streptoooccus pyogenes SF370):
GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGA
GAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTG
ACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT AAAATT ATGTTTTAAAAT
GGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATC
TTGTGGAAAGGACGAAACACCGGTAGTATTAAGTATTGTTTTATGGCTGATAAATTT
CTTTGAATTTCTCCTTGATTATTTGTTATAAAAGTTATAAAATAATCTTGTTGGAACC
ATT C AAAAC A G C AT AG C AA G TT AAAAT AAG GCTAGTCC GTT AT C A ACTTG A AAAAG
TGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
15 U6-DR-Bbsl cadena principal-RD (Streptococcus pyogenes SF370):
GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGA
GAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTG
ACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT AAAATT ATGTTTTAAAAT
GGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATC
TTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAA
ACGGGTCTTCGAGAAGACGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAAC
U6-ARN quimerico-Cadena principal BbsI (Streptococcus pyogenes SF370)
GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGA
GAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTG
ACGT A G AAAGT AATAATTT CTT GG GTAGTTT G C AGTTTTAAAATT AT GTTTT AAAAT
GGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATC
TTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAGAGCTAGAAAT
AGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
NLS-SpCas9-EGFP:
MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAADKKYSIGLDIGTNSVG
WAVrTDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRK
NRICYLQEJFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYH
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ENP1NASGVDAKA1LSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDL
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FDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKATVDLLFKTN
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NRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYH
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AEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDA1LLSD1LRVNTE1TKAPLS
ASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIK
PILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGS1PHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNR
EK1EK1LTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEWDKGASAQSFIERMTN
FDKNLPNEKVLPKHSLL YEYFTVYNELTKVKYVTEG MRKPAFLSG EQKKATVDLL FKTN
RKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVE1SGVEDRFNASLGTYHDLLK11KDKDFLDNEENED1LE
DjVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSG
KTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEH1ANLAGSPAIKKG
ILQTVKWDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQJ
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IGKATAKYFFYSNMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLS
MPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKL1ARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLW
AKVEKGKSKKLKSVKELLG1TMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELE
NGRKRMLASAGELQKGNELALPSRYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKH
YLDEIIEQJSEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENI]HLFTLTNLGAPAAFKY
FDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRJDLSQLGGDAAAVSKGEELFTGVVPILV
ELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYP
DHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKED
GNiLGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGiKVNFKJRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGP
VLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKKRPAATKKAGQA
KKKK
NLS-SpCas9-NLS:
MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGWAADKKYSIGLDIGTNSVG
WAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRK
NRJCYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGN1VDEVAYHEKYPTIYH
LRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFE
ENP1MASGVDAKAILSARLSKSRRLENL1AQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDL
AEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQ1GDQYADLFLAAKNLSDAILLSDTLRVNTEITKAPLS
ASM1KRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKE1FFDQSK.NGYAGY1DGGASQEEFYKFIK
P1LEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSTPHQIHLGELHA1LRRQEDFYPFLKDNR
EKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETTTPWNFEEWDKGASAQSF1ERMTN
FDKNLPNEKVLPKFISLLYEYFTVYNELTKVKYYTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTN
RKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKmCDKDFLDNEENEDILE
DIVLTLTLFEDREM1EERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLJNGIRDKQSG
KT1LDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHTANLAGSPAIKKG
ILQTVKWDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGTJCELGSQI
LKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSID
NK.VLTRSDKNRGKSDNYPSEEWKKMK.NYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSE
LDtCAGFIKRQLVETRQTTKFTVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVrrLKSKLVSDFRKDF
QFYKVREINNYHHAHDAYLNAWGTALiKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQE
IGKATAKYFFYSNIMNFFKTE1TLANGEIRKRPLIETNGETGE1VWDK.GRDFATVRKVLS
MPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKiCYGGFDSPTVAYSVLW
AKVEKGKSK.KLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLI1KLPKYSLFELE
NGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKH
YLDE1IEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPTREQAEN1IHLFTLTNLGAPAAFKY
FDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDKRPAATKKAGQAKKKK
NLS-mCherry-SpRNasa3:
MFLFLSLTSFLSSSRTLVSKGEED'NMAlfKEFMRFKVFIMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYE
GTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVM
NFEDGGWTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPED
GALKGEK.QRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVE
QYERAEGRHSTGGMDELYKGSKQLEELLSTSFDIQFNDLTLLETAFTHTSYANEHRLLN
VSHNERLEFLGDAVLQLIISEYLFAKYPKKTEGDMSKLRSMIVREESLAGFSRFCSFDAYl
KLGKGEEKSGGRRRDTILGDLFEAFLGALLLDKGIDAVRRFLKQVMIPQVEK.GNFERVK
DYKTCLQEFLQTKGDVAJDYQVISEKGPAHAKQFEVSIWNGAVLSKGLGKSKKLAEQD
AAKNALAQLSEV
SpRNasa3-mCherry-NLS:
MKQLEELLSTSFDTQFNDLTLLETAFTHTSYANEHRLLNVSHNERLEFLGDAVLQLIISEY
LFAKYPKKTEGDMSKLRSMIVREESLAGFSRFCSFDAYIKLGKGEEKSGGRRRDTILGDL
FEAFLGALLLDKGIDAVRRFLKQVM1PQVEKGNFERVKDYKTCLQEFLQTKGDVAIDYQ
V1SEKGPAHAKQFEVSIWNGAVLSKGLGKSKKLAEQDAAKNALAQLSEVGSVSKGEE
DNMAJIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDIL
SPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGWTVTQDSSLQDGEFT
YKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAE
VKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLD1TSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKKRP
AATKKAGQAKKKK
NLS-SpCas9n-NLS (la mutaaon de nickasa D10A es
minuscula):
MDYKDHDGDYKDHDJDYKDDDDKMAPKFCKRKVGIHGVPAADKKYSTGLalGTNSVGW
A VITDE YK VPSKKFKVLGNT DRH SIKKN LIG ALLFDSGET AEATRLKRT ARRRYTRRKN
RTCYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHRIFGNTVDEVAYHEKYPTTYHL
RKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEE
NPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLJAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLA
EDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAJLLSDlLRVNTErTKAPLSA
SMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKP1
LEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSTPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREK
IEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEWDKGASAQSFIERMTNFD
KNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKATVDLLFKTNR
KVTVKQLKEDYFKK1ECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLK1JKDKDFLDNEENEDILE
DIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSG
KTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKED1QKAQVSGQGDSLHEH1ANLAGSPA1KKG
ILQTVKWDELVKVMGRHKPEN1VIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRJEEGIKELGSQI
LKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSID
NKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEWKKMRNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSE
LDKAGF1KRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKV]TLKSKLVSDFRKDF
QFYKVREMNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKM1AKSEQE
TGKATAKYFFYSNJMNFFKTE1TLANGETRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLS
MPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLW
AKVEKGKSKKLKSVKELLGITJMERSSFEKNP1DFLEAKGYKEVKKDLIJKLPKYSLFELE
NGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKH
YLDE1IEQISEFSKRV1LADANLDKVLSAYNKHRDKP1REQAENEHLFTLTNLGAPAAFRY
FDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETR]DLSQLGGDKRPAATKKAGQAKKKK
hEMX1-Plantilla RH-Hindll-Nhel:
GAATGCTGCCCTCAGACCCGCTTCCTCCCTGTCCTTGTCTGTCCAAGGAGAATGAGG
TCTCACTGGTGGATTTCGGACTACCCTGAGGAGCTGGCACCTGAGGGACAAGGCCC
CCCACCTGCCCAGCTCCAGCCTCTGATGAGGGGTGGGAGAGAGCTACATGAGGTTG
CTAAGAAAGCCTCCCCTGAAGGAGACCACACAGTGTGTGAGGTTGGAGTCTCTAGC
AGCGGGTTCTGTGCCCCCAGGGATAGTCTGGCTGTCCAGGCACTGCTCTTGATATAA
ACACCACCTCCTAGTTATGAAACCATGCCCATTCTGCCTCTCTGTATGGAAAAGAGC
ATGGGGCTGGCCCGTGGGGTGGTGTCCACTTTAGGCCCTGTGGGAGATCATGGGAA
CCCACGCAGTGGGTCATAGGCTCTCTCATTTACTACTCACATCCACTCTGTGAAGAA
GCGATTATGATCTCTCCTCTAGAAACTCGTAGAGTCCCATGTCTGCCGGCTTCCAGA
GCCTGCACTCCTCCACCTTGGCTTGGCTTTGCTGGGGCTAGAGGAGCTAGGATGCAC
AGCAGCTCTGTGACCCTTTGTTTGAGAGGAACAGGAAAACCACCCTTCTCTCTGGCC
CACTGTGTCCTCTTCCTGCCCTGCCATCCCCTTCTGTGAATGTTAGACCCATGGGAGC
AGCTGGTCAGAGGGGACCCCGGCCTGGGGCCCCTAACCCTATGTAGCCTCAGTCTTC
CCATCAGGCTCTCAGCTCAGCCTGAGTGTTGAGGCCCCAGTGGCTGCTCTGGGGGCC
TCCTGAGTTTCTCATCTGTGCCCCTCCCTCCCTGGCCCAGGTGAAGGTGTGGTTCCAG
AACCGGAGGACAAAGTACAAACGGCAGAAGCTGGAGGAGGAAGGGCCTGAGTCCG
AGCAGAAGAAGAAGGGCTCCCATCACATCAACCGGTGGCGCATTGCCACGAAGCAG
GCCAATGGGGAGGACATCGATGTCACCTCCAATGACaagcttgctagcGGTGGGCAACCAC
AAACCCACGAGGGCAGAGTGCTGCTTGCTGCTGGCCAGGCCCCTGCGTGGGCCCAA
GCTGGACTCTGGCCACTCCCTGGCCAGGCTTTGGGGAGGCCTGGAGTCATGGCCCCA
CAGGGCTTGAAGCCCGGGGCCGCCATTGACAGAGGGACAAGCAATGGGCTGGCTGA
GGCCTGGGACCACTTGGCCTTCTCCTCGGAGAGCCTGCCTGCCTGGGCGGGCCCGCC
CGCCACCGCAGCCTCCCAGCTGCTCTCCGTGTCTCCAATCTCCCTTTTGTTTTGATGC
ATTTCTGTTTTAATTTATTTTCCAGGCACCACTGTAGTTTAGTGATCCCCAGTGTCCC
CCTTCCCTATGGGAATAATAAAAGTCTCTCTCTTAATGACACGGGCATCCAGCTCCA
GCCCCAGAGCCTGGGGTGGTAGATTCCGGCTCTGAGGGCCAGTGGGGGCTGGTAGA
GCAAACGCGTTCAGGGCCTGGGAGCCTGGGGTGGGGTACTGGTGGAGGGGGTCAAG
GGTAATTCATTAACTCCTCTCTTTTGTTGGGGGACCCTGGTCTCTACCTCCAGCTCCA
CAGCAGGAGAAACAGGCTAGACATAGGGAAGGGCCATCCTGTATCTTGAGGGAGGA
CAGGCCCAGGTCTTTCTTAACGTATTGAGAGGTGGGAATCAGGCCCAGGTAGTTCAA
TGGGAGAGGGAGAGTGCTTCCCTCTGCCTAGAGACTCTGGTGGCTTCTCCAGTTGAG
GAGAAACCAGAGGAAAGGGGAGGATTGGGGTCTGGGGGAGGGAACACCATTCACA
AAGGCTGACGGTTCCAGTCCGAAGTCGTGGGCCCACCAGGATGCTCACCTGTCCTTG
GAG AACCGCTGGGC AGGTTG AG ACTGCAGAG ACAGGGCTT AAGGCTG AGCCTGC AA
CCAGTCCCCAGTGACTCAGGGCCTCCTCAGCCCAAGAAAGAGCAACGTGCCAGGGC
CCGCT GAGCTCTTGTGTTCACCTG
NLS-StCsnl-NLS:
5
10
15
MKRPAATKKAGQAKKKKSDLVLGLDIGIGSVGVG1LNKVTGEIJHKNSRJFPAAQAENN
LVRRTNRQGRRLARRKKHRRVRLNRLFEESGLITDFTKISrNLNPYQLRVKGLTDELSNE
ELFIALKNMVKHRGISYLDDASDDGNSSVGDYAQIVKENSKQLETKTPGQIQLERYQTY
GQLRGDFTVEKDGKKHRLINWPTSAYRSEALRILQTQQEFNPQITDEFrNRYLEILTGKR
KYYHGPGNEKSRTDYGRYRTSGETLDNIFG1LIGKCTFYPDEFRAAKASYTAQEFNLLND
LNNLTVPTETKKLSKEQKNQIINYVKNEKAMGPAKLFKYIAKLLSCDVADIKGYRIDKS
GKAE1HTFEAYRKMKTLETLDIEQMDRETLDKLAYVLTLNTEREGIQEALEHEFADGSFS
QKQVDELVQFRKANSSFGKGWHNFSVKLMMEL1PELYETSEEQMTILTRLGKQKTTSS
SNKTKYDEKLLTEEIYNPWAKSVRQAIKJVNAAlKEYGDFDNrVIEMARETNEDDEKK
A1QKTQKANKDEKDAAMLKAANQYNGKAELPHSVFHGHKQLATKJRLWHQQGERCLY
TGKTIS1HDLINNSNQFEVDHILPLSITFDDSLANKVLVYATANQEKGQRTPYQALDSMD
DAWSFRELKAFVRESKTLSNKKKEYLLTEEDISKFDVRKXFIERNLVDTRYASRWLMA
LQEHFRAHK1DTKVSVVRGQFTSQLRRHWG1EK.TRDTYHHHAVDAL1IAASSQLNLWKK
QKNTLVSYSEDQLLDIETGELISDDEYfCESVFKAPYQHFVDTLKSKEFEDSILFSYQVDSK
FNRKISDAT1YATRQAKVGKDKADETYVLGKJKDIYTQDGYDAFMKIYKKDKSKFLMY
RHDPQTFEKV7EPILENYPNKQINEKGKEVPCNPFLKYKEEHGYIRKYSK.KGNGPE1KSLK.
YYDSKLGNHrDrrPKDSNNKWLQSVSPWRADVYFNKTTGKYElLGLKYADLQFERGT
GTYK1SQEKYNDIKKKEGVDSDSEFKFTLYKNDLLLVKDTETKEQQLFRFLSRTMPKQK
HYVELKPYDKQKFEGGEALIKVLGNVANSGQCKKGLGKSNISIYKVRTDVLGNQHIIKN
EG DKPKLDFKRPAATKRAGQAKKKK
U6-St_ARNtracr(7-97):
GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGA
GAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTG
ACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAAT
GGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATC
TTGTGGAAAGGACGAAACACCGTTACTTAAATCTTGCAGAAGCTACAAAGATAAGG
CTTCATGCCGAAATCAACACCCTGTCATTTTATGGCAGGGTGTTTTCGTTATTTAA
U6-RD-espaciador-RD(S. pyogenes SF370)
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatat
tagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaalggactatcatatgcttaccglaactt
gaaagtattlcgatttcttgectttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccegiittttagagctatgctgttttgaatggtcccaaaacNNN
imagen1
(subrayado minusculas = repeticion directa; N = secuencia gufa; negrita = terminador)
ARN quimerico que contiene +48 ARNtracr (S. pyogenes SF370)
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatat tagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaactt gaaagtatttcgafftettggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttaga gctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgTTTTTTT (N = secuencia gufa; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
ARN quimerico que contiene +54 ARNtracr (S. pyogenes SF370)
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatat tagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaactt gaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttaga gctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTTTTT (N = secuencia gufa; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
ARN quimerico que contiene +67 ARNtracr (S. pyogenes SF370)
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatat tagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaactt gaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttaga 5 gctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT (N = secuencia gma; primer subrayado =
secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
ARN quimerico que contiene +85 ARNtracr (S. pyogenes SF370)
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatat tagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaactt 10 gaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttaga
gctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTTT (N = secuencia gma; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
CBh-NLS-SpCas9-NLS
CGTT ACAT AACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCC ATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTG ACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTA
tcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggca
TTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTA
GTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCT
CCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCG
ATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAG
GGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGC
TCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGA
AGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCG
CCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGA
GCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCTGAGCAAGAGGTAAGGG
TTT AAGGG ATGGTT GGTT GGT GGGGT ATT AAT GTTT AATT ACCT GG AGCACCTGCCT
GAAATCACTFriTI'ICAGGTTGGaccgEtgccaccATGGACTATAAGGACCACGACGGAGA
CTACAAGGATCATGATATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCCCCAAAGA
AGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATC
GGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAA
GGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGA
AGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGG
CTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCT
GCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGAC
TGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTC
GGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCT
GAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGGCOACCTGCGGCTGATCTATCTGG
CCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACC
CCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAG
CTGTTCGAGGAAAAGCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTC
TGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCGAGCTGCCCGGCG
AGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCC
AACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGA
CACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCG
ACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGA
GAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATAC
GACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTOCTOAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCC
TGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCOACCAOAOC.AAGAACGGCTACGCCGGCTACA
TTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAA
AAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCG
GAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGC
TGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGG
AAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCA
GGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCC
CTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGC
GGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGC
CTGCT GT ACG AGT ACTTCACCGTGT ATAACGAGCTGACCAAAGTG AAAT ACGT GACC
GAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGG
ACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTAC
TTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTC
AACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAOGACTT
CCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACAC
TGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTC
GACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGC
TGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTG
GATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGAC
GACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGA
T AGCCTGC ACG AGC AC ATTGCCAATCT GGCCGGCAGCCGGGCC ATT A AG AAGGGCA
TCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAG
CCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGAC
AGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGG
CAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAG
CTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGA
CATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTOAA
GGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAG
AGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCA
GCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCG
AGAGAGGCGGCCTGAOCGAACTGGATAAGGCCGGCTTrATCAAGAGACAGCTGGTG G A A A CCCGGCA G ATC A CAAAG CACG TC GCA CAGATCGTGG A GTC CCGG ATG A A C A C TAAGTACGACGAGA ATG AC A AGrTGATCCGGCAAGTGAAAGTGATCAGGrTGAAGT
gg a a gctggtgtccg atttccg g aagg atttgg a gttttac a a agtgcgcg AG ATC a AC A A CT A CC ACC ACG CCC ACG ACG CC TA CCTG A A CGCCGTCGTGG G A ACCG CCCTG atcaaaaagtaccctaagctggaaag cg agttcgtgta CGGCGACTACAAGGTGTA
A A GT A CTTCTTCT AC AG CAA CATCATG AA( :TTTTTC AAGACCGAGATTACCCTGGCC AAGGGGGAGAT CCGGAAG CGG CCTCTG ATCG AG AGAAACGGCGAAA CCGG G G AG A TCGTGTG GCi ATA AGGGCCGG GATTTTG CC ACCGT GCGG A A A GTGCTG AGC ATGCCC C AAGTG A ATATCOTG AAAA AGACCGAG GTGCAG AC A GG CGG CTTC AG CAAAGAGTC TATC CTGCCCAAGAGGAACAGCG AT A AGGTG ATGGGG AG AA AG AA G GACTGGGACC CTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAG CCCC ACGGTGG CCTT ATTCTGTGCTGGTG GTG G CCA AAGTG G AA A AGG G C AAGTCC AA G AA A CTG AAG A GTGTG A A AG A GCTGCTG GG G ATC ACC ATC ATGG AAA G A AG GAG C1TCG AG A A G A ATCCC A TCGACTTTCTG G AAG CC A A GGGCT A C A A A G A A GTG AAA AAGG ACCTG ATG A TC A A GCTGCCT A AG TACTCC CTGTTCG AGCTG G A A AACGGCCG G AAG AG A ATGCTTG GGGTGTGCCGGCG AACJ GCA G AAGGG AA A(.GAA CTGG CCCTGCCCTCC AA AT ATGTC; AACTTGCTGTACCTGG CCA GCCACT ATGAGAAGCTGAAGGCCTCG GCCG AGG ATAATG AG C AG A A A GAGCTGTTT GTG G AA CAG CA CAA GC ACTAGCTOG ACG AG ATC ATCG AG G AG ATC AG CG A G rrc re C AAG AG AGTG ATCCTGG CGG A CG CT AATCTGG AC A AAGTGt TTGTCCG GCTA C AA C A AGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCA GCCCG AG AAT ATC ATCC ACCTGTTTACC CTG ACC AATCTG GG AGCCCCTGCCGCCTTC A AGTA CTTTG AC ACC ACC ATCG A CCGG AAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCAT C ACCGGCC1 GT ACG A G AC ACGG ATCG ACCTGTCTC AGCTGG G AGG CG A CTTTCTTTT TCTT AGCTTG ACC AGC TTTCTTAGT A GCACCAGGACGCTTrAA (subrayado = NLS- hSpCas9-NLS)
ARN quimerico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNatttttatactctcaaaatttaGAAAtaaatcttacaaaaactacaaaaataaaactt cataccaaaatcaacaccctatcattttataacaaaatattttcattatttaaTTTTTT (N = secuencia auia; primer subrayado = secuencia 5 de emparejamiento tracr; seaundo subrayado = secuencia tracr; nearita = terminador)
ARN quimerico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNatttttatactctcaGAAAtacaaaaactacaaaaataaaacttcataccaaaatca acaccctatcattttataacaaaatattttcattatttaaTTTTTT (N = secuencia auia; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; seaundo subrayado = secuencia tracr; nearita = terminador)
10 ARN quimerico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNatttttatactctcaGAAAtacaaaaactacaaaaataaaacttcataccaaaatca acaccctatcattttataacaaaatatTTTTTT (N = secuencia auia; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; seaundo subrayado = secuencia tracr; nearita = terminador)
ARN quimerico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW) 15 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNattattatactctcaaaatttaGAAAtaaatcttacaaaaactacaaaaataaaactt
cataccaaaatcaacaccctatcattttataacaaaatattttcattatttaaTTTTTT (N = secuencia auia; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; seaundo subrayado = secuencia tracr; nearita = terminador)
5
10
15
20
25
ARN quimerico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNattattatactctcaGAAAtacaaaaectacaaaaataaaacttcataccaaaatc aacaccctatcattttataacaaaatattttcattatttaaTTTTTT (N = secuencia aufa; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; seaundo subrayado = secuencia tracr; nearita = terminador)
ARN quimerico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNattattatactctcaGAAAtacaaaaactacaaaaataaaacttcataccaaaatc aacaccctatcattttataacaaaatatTTTTTT (N = secuencia auia; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; seaundo subrayado = secuencia tracr; nearita = terminador)
ARN quimerico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNattattatactctcaaaatttaGAAAtaaatcttacaaaaactacaataataaaactt cataccaaaatcaacaccctatcattttataacaaaatattttcattatttaaTTTTTT (N = secuencia auia; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; seaundo subrayado = secuencia tracr; nearita = terminador)
ARN quimerico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNattattatactctcaGAAAtacaaaaactacaataataaaacttcataccaaaatca acaccctatcattttataacaaaatattttcattatttaaTTTTTT (N = secuencia auia; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; seaundo subrayado = secuencia tracr; nearita = terminador)
ARN quimerico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNattattatactctcaGAAAtacaaaaactacaataataasscttcataccaaaatca acaccctatcattttataacaaaatatTTTTTT (N = secuencia auia; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; seaundo subrayado = secuencia tracr; nearita = terminador)
ARN quimerico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR3 Cas9 (con PAM de NGGNG) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNattttaaaactataGAAAcacaacaaattaaaataaaacttaatccatactcaactt aaaaaaataacaccaattcaatatTTTTTT (N = secuencia auia; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; seaundo subrayado = secuencia tracr; nearita = terminador)
Version codon-optimizada de Cas9 de sitio CRISPR3 LMD-9 de S. thermophilus (con una NLS en ambos extremos 5' y 3')
ATGAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGACCA
AGCCCTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAATAGCGTGGGCTGGGCCGTGACC
ACCGACAACTACAAGGTGCCCAGCAAGAAAATGAAGGTGCTGGGCAACACCTCCAA
gaagtacatcaagaaaaacctgctgggcgtgctgctgttcgacagcggcattacag
CCGAGGGCAGACGGCTGAAGAGAACCGCCAGACGGCGGTACACCCGGCGGAGAAA
CAGAATCCTGTATCTGCAAGAGATCTTCAGCACCGAGATGGCTACCCTGGACGACG
CCTTCTTCCAGCGGCTGGACGACAGCTTCCTGGTGCCCGACGACAAGCGGGACAGC
AAGTACCCCATCTTCGGCAACCTGGTGG AAG AG AAGGCCT ACCACG ACGAGTTCCC
CACCATCTACCACCTGAGAAAGTACCTGGCCGACAGCACCAAGAAGGCCGACCTGA
GACTGGTGTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTACCGGGGCCACTTCCTGATCG
AGGGCGAGTTCAACAGCAAGAACAACGACATCCAGAAGAACTTCCAGGACTTCCTG
GACACCTACAACGCCATCTTCGAGAGCGACCTGTCCCTGGAAAACAGCAAGCAGCT
GGAAGAGATCGTGAAGGACAAGATCAGCAAGCTGGAAAAGAAGGACCGCATCCTG
AAGCTGTTCCCCGGCGAGAAGAACAGCGGAATCTTCAGCGAGTTTCTGAAGCTGAT
CGTGGGCAACCAGGCCGACTTCAGAAAGTGCTTCAACCTGGACGAGAAAGCCAGCC
TGCACTTCAGCAAAGAGAGCTACGACGAGGACCTGGAAACCCTGCTGGGATATATC
GGCGACGACTACAGCGACGTGTTCCTGAAGGCCAAGAAGCTGTACGACGCTATCCT
GCTGAGCGGCTTCCTGACCGTGACCGACAACGAGACAGAGGCCCCACTGAGCAGCG
CC ATG ATTAAGCGGTACAACG AGCACAAAGAGG AT CTGGCTCT GCT GAAAGAGT AC
ATCCGGAACATCAGCCTGAAAACCTACAATGAGGTGTTCAAGGACGACACCAAGAA
CGGCT ACGCCGGCT AC ATCG ACGGCAAGACC AACCA GG AAG ATTTCTAT GT GT ACC
TGAAGAAGCTGCTGGCCGAGTTCGAGGGGGCCGACTACTTTCTGGAAAAAATCGAC
CGCGAGGATTTCCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCTACCA
GATCCATCTGCAGGAAATGCGGGCCATCCTGGACAAGCAGGCCAAGTTCTACCCAT
TCCTGGCCAAGAACAAAGAGCGGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCTTACT
ACGTGGGCCCCCTGGCCAGAGGCAACAGCGATTTTGCCTGGTCCATCCGGAAGCGC
AATGAGAAGATCACCCCCTGGAACTTCGAGGACGTGATCGACAAAGAGTCCAGCGC
CGAGGCCTTCATCAACCGGATGACCAGCTTCGACCTGTACCTGCCCGAGGAAAAGG
TGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGACATTCAATGTGTATAACGAGCTGACCA
AAGTGCGGTTTATCGCCGAGTCTATGCGGGACTACCAGTTCCTGGACTCCAAGCAGA
AAAAGGACATCGTGCGGCTGTACTTCAAGGACAAGCGGAAAGTGACCGATAAGGAC
ATCATCGAGTACCTGCACGCCATCTACGGCTACGATGGCATCGAGCTGAAGGGCAT
CGAGAAGCAGTTCAACTCCAGCCTGAGCACATACCACGACCTGCTGAACATTATCA
ACGACAAAGAATTTCTGGACGACTCCAGCAACGAGGCCATCATCGAAGAGATCATC
CACACCCTGACCATCTTTGAGGACCGCGAGATGATCAAGCAGCGGCTGAGCAAGTT
CGAGAACATCTTCGACAAGAGCGTGCTGAAAAAGCTGAGCAGACGGCACTACACCG
GCTGGGGCAAGCTGAGCGCCAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACGAGAAGTCCGGC
AACACAATCCTGGACTACCTGATCGACGACGGCATCAGCAACCGGAACTTCATGCA
GCTGATCCACGACGACGCCCTGAGCTTCAAGAAGAAGATCCAGAAGGCCCAGATCA
TCGGGGACGAGGACAAGGGCAACATCAAAGAAGTCGTGAAGTCCCTGCCCGGCAGC
CCCGCCATCAAGAAGGGAATCCTGCAGAGCATCAAGATCGTGGACGAGCTCGTGAA
AGTGATGGGCGGCAGAAAGCCCGAGAGCATCGTGGTGGAAATGGCTAGAGAGAAC
cagtacaccaatcagggcaagagcaacagccagcagagactgaagagactggaaa
AGTCCCTGAAAGAGCTGGGCAGCAAGATTCTGAAAGAGAATATCCCTGCCAAGCTG
TCCAAGATCGACAACAACGCCCTGCAGAACGACCGGCTGTACCTGTACTACCTGCA
GAATGGCAAGGACATGTATACAGGCGACGACCTGGATATCGACCGCCTGAGCAACT
ACGACATCGACCATATTATCCCCCAGGCCTTCCTGAAAGACAACAGCATTGACAAC
AAAGTGCTGGTGTCCTCCGCCAGCAACCGCGGCAAGTCCGATGATGTGCCCAGCCT
GGAAGTCGTGAAAAAGAGAAAGACCTTCTGGTATCAGCTGCTGAAAAGCAAGCTGA
TTAGCCAGAGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCCCT
GAAGATAAGGCCGGCTTCATCCAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACCAA
GCACGTGGCCAGACTGCTGGATGAGAAGTTTAACAACAAGAAGGACGAGAACAACC
GGGCCGTGCGGACCGTGAAGATCATCACCCTGAAGTCCACCCTGGTGTCCCAGTTCC
GGAAGGACTTCGAGCTGTATAAAGTGCGCGAGATCAATGACTTTCACCACGCCCAC
GACGCCTACCTGAATGCCGTGGTGGCTTCCGCCCTGCTGAAGAAGTACCCTAAGCTG
gaacccgagttcgtgtacggcgactaccccaagtacaactccttcagagagcggaa
GTCCGCCACCGAGAAGGTGTACTTCTACTCCAACATCATGAATATCTTTAAGAAGTC
CATCTCCCTGGCCGATGGCAGAGTGATCGAGCGGCCCCTGATCGAAGTGAACGAAG
AGACAGGCGAGAGCGTGTGGAACAAAGAAAGCGACCTGGCCACCGTGCGGCGGGT
GCTGAGTTATCCTCAAGTGAATGTCGTGAAGAAGGTGGAAGAACAGAACCACGGCC
TGGATCGGGGCAAGCCCAAGGGCCTGTTCAACGCCAACCTGTCCAGCAAGCCTAAG
CCCAACTCCAACGAGAATCTCGTGGGGGCCAAAGAGTACCTGGACCCTAAGAAGTA
CGGCGGATACGCCGGCATCTCCAATAGCTTCACCGTGCTCGTGAAGGGCACAATCG
AGAAGGGCGCTAAGAAAAAGATCACAAACGTGCTGGAATTTCAGGGGATCTCTATC
CTGGACCGG ATCAACTACCGGAAGG ATAAGCT GAACTTTCTGCTGG AA AAAGGCT A
CAAGGACATTGAGCTGATTATCGAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAACTGAGCGA
CGGCTCCAGACGGATGCTGGCCTCCATCCTGTCCACCAACAACAAGCGGGGCGAGA
TCCACAAGGGAAACCAGATCTTCCTGAGCCAGAAATTTGTGAAACTGCTGTACCACG
CCAAGCGGATCTCCAACACCATCAATGAGAACCACCGGAAATACGTGGAAAACCAC
AAGAAAGAGTTTGAGGAACTGTTCTACTACATCCTGGAGTTCAACGAGAACTATGTG
GGAGCCAAGAAGAACGGCAAACTGCTGAACTCCGCCTTCCAGAGCTGGCAGAACCA
CAGCATCGACGAGCTGTGCAGCTCCTTCATCGGCCCTACCGGCAGCGAGCGGAAGG
GACTGTTTGAGCTGACCTCCAGAGGCTCTGCCGCCGACTTTGAGTTCCTGGGAGTGA
AGATCCCCCGGTACAGAGACTACACCCCCTCTAGTCTGCTGAAGGACGCCACCCTGA
TCCACCAGAGCGTGACCGGCCTGTACGAAACCCGGATCGACCTGGCTAAGCTGGGC
GAGGGAAAGCGTCCTGCTGCTACTAAGAAAGCTGGTCAAGCTAAGAAAAAGAAATA
A
Ejemplo 5: Optimizacion del ARN gufa para Cas9 de Streptococcus pyogenes (referido como SpCas9).
5 Los solicitantes mutaron las secuencias ARNtracr y de repeticion directa o mutaron el ARN gufa quimerico para activar los ARN en las celulas.
La optimizacion se basa en la observacion de que hay tramos de timinas (Ts) en la ARNtracr y ARN gufa, que podia conducir a terminacion de la transcripcion temprana por el activador Pol 3. Por lo tanto los Solicitantes generaron las siguientes secuencias optimizadas. ARNtracr optimizada y la repeticion directa optimizada correspondiente se 10 presentan en parejas.
ARNtracr optimizado 1 (mutacion subrayada):
GGAACCATTCAtAACAGCAT AGCAAGTT AtAAT AAGGCT AGTCCGTT ATCAACTTGAA
AAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT Repeticion directa optimizada 1 (mutacion subrayada): GTTaTAGAGCTATGCTGTTaTGAATGGTCCCAAAAC 5 ARNtracr optimizado 2 (mutacion subrayada):
GGAACCATTCAAtACAGCAT AGCAAGTT AAtAT AAGGCT AGTCCGTT ATCAACTTGAA AAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT
Repeticion directa optimizada 2 (mutacion subrayada): GTaTTAGAGCTATGCTGTaTTGAATGGTCCCAAAAC
10 Los solicitantes tambien optimizaron el ARN gufa quimerico para actividad optima en celulas eucariotas. ARN gufa original :
imagen2
Secuencia de ARN gufa quimerico optimizado 1:
imagen3
15 Secuencia de ARN gufa quimerico optimizado 2:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGGAAACAAAACAGCA TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT ATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCG GTGCTTTTTTT
Secuencia de ARN gufa quimerico optimizado 3:
imagen4
Los solicitantes mostraron que el ARN gufa quimerico optimizado funciona mejor como se indica en la Figura 9. El 20 experimento se realizo por co-transfeccion de celulas 293FT con Cas9 y una casete de ADN ARN gufa U6 para expresar una de las cuatro formas de ARN mostradas anteriormente. El objetivo del ARN gufa es el mismo sitio objetivo en el lugar Emx1 humano: "GTCACCTCCAATGACTAGGG"
Ejemplo 6: Optimizacion de Cas9 CRISPR1 LMD-9 de Streptococcus thermophilus (referido como StlCas9).
Los solicitantes disenaron los ARN quimericos gufa como se muestra en la Figura 12.
25 Los ARN gufa de StlCas9 pueden experimentar el mismo tipo de optimizacion que para los ARN gufa SpCas9, por rotura de los tramos de poli timinas (Ts).
Ejemplo 7: Mejora del sistema Cas9 para aplicacion in vivo
Los solicitantes realizaron una busqueda Metagenomica para un Cas9 con un peso molecular pequeno. La mayorfa de los homologos de Cas9 fue bastante grande. Por ejemplo el SpCas9 tiene alrededor de 1368aa de largo, que es 30 demasiado largo para ser empaquetado facilmente en vectores vfricos para suministro. Algunas de las secuencias puede que se hayan desanotado y por lo tanto la frecuencia exacta para cada longitud puede no ser necesariamente precisa. Sin embargo, proporciona un atisbo de la distribucion de protefnas Cas9 y sugiere que hay homologos de Cas9 mas cortos.
5
10
15
20
25
Por analisis computacional, los solicitantes encontraron que en la cepa bacteriana Campylobacter, hay dos proteinas Cas9 con menos de 1.000 aminoacidos. La secuencia para una Cas9 de Campylobacter jejuni se presenta a continuacion. A esta longitud, CjCas9 se puede empaquetar facilmente en AAV, lentivirus, Adenovirus, y otros vectores vfricos para suministro robusto en celulas primarias e in vivo en modelos de animales.
Cas9 de Campylobacter jejuni (CjCas9)
MARILAFDIGISSIGWAFSENDELKDCGVRIFTKVENPKTGESLALPRRLARSARKRLARR
KARLNHLKHLIANEFKLNYEDYQSFDESLAKAYKGSLISPYELRFRALNELLSKQDFAR
VILHIAKRRGYDDIKNSDDKEKGAILKAIKQNEEKLANYQSVGEYLYKEYFQKFKENSK
EFTN VRNKKES YERCIAQSFLKDELKLIFKKQREF GFSFSKKFEEEVL SVAFYKRALKDFS
HLVGNCSFFTDEKRAPKNSPLAFMFVALTRIINLLNNLKNTEGILYTKDDLNALLNEVLK
NGTLTYKQTKKLLGLSDDYEFKGEKGTYFIEFKKYKEFIKALGEHNLSQDDLNEIAKDrr
LIKDEIKLKKALAKYDLNQNQIDSLSKLEFKDHLNISFKALKLVTPLMLEGKKYDEACNE
LNLKVAJNEDKKDFLPAFNETYYKDEVTNPWLRAIKEYRKVLNALLKKYGKVHKINIE
L AREV GKNHSQRAKIEKEQNENYKAKKD AELECEKLGLKJN SKNILKLRLFKEQKEF CA
YSGEKIKISDLQDEKMLE1DHIYPYSRSFDDSYMNKVLVFTKQNQEKLNQTPFEAFGNDS
AKWQKJEVLAKNLPTKKQKRILDKNYKDKEQKNFKDRNLNDTRYIARLVLNYTKDYL
DFLPLSDDENTKLNDTQKGSKVHVEAKSGMLTSALRHTWGFSAKDRNNHLHHAIDAVI
IAYANNSIYKAFSDFKKEQESNSAELYAKKISELDYBvNKRKFFEPFSGFRQKVLDKIDEIF
VSKPERKKPSGALHEETFRKEEEFYQSYGGKEGVLBCALELGKIRKVNGK1VKNGDMFR
VDIFKHKKTNKFYAVPIYTMDFALKVLPNKAVARSKKGEIKDW1LMDENYEFCFSLYK
DSLILIQTKDMQEPEFVYYNAFTSSTVSLIVSKHDNKFETLSKNQKILFKNANEKEVIAKS
IGIQNLKVFEKYIVSALGEVTKAEFRQREDFKK.
El elemento de ARNtracr putativo para esta CjCas9 es:
T AT AAT CT CAT AAG AAATTTAAAAAGGG ACT AAAAT AAAG AGTTTGCGGG ACT CT G CGGGGTTACAATCCCCTAAAACCGCTTTTAAAATT
La secuencia de repeticion directa es:
imagen5
La estructura co-plegada del ARNtracr y repeticion directa se proporciona en la Figura 6.
Un ejemplo de un ARN gufa quimerico para CjCas9 es:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUCCCGAAAGGGACUAAAAUAAAGAGUU
UGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU
Los solicitantes tambien optimizaron ARN gufa de Cas9 usando metodos in vitro. La Figura 18 muestra datos de la optimizacion de ARN gufa quimerico St1Cas9 in vitro.
Aunque se han presentado realizaciones preferidas de la presente invencion y se han descrito en la presents memoria, sera evidente para los expertos en la materia que tales realizaciones se proporcionan como ejemplo solamente. Ahora tendran lugar numerosas variaciones, cambios y sustituciones para los expertos en la materia sin apartarse de la invencion. Se deberfa entender que se pueden emplear en la practica de la invencion diversas alternativas a las realizaciones de la invencion descritas en la presente memoria. Se desea que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invencion y que los metodos y las estructuras dentro del alcance de las reivindicaciones y sus equivalentes esten cubiertos de ese modo.
Ejemplo 8: Optimizacion de ARNsg Sa
Los solicitantes disenaron cinco variantes de ARNsg para SaCas9 para una arquitectura truncada optima con la mayor eficacia de escision. Ademas, se ensayo el sistema duplex tracr:repeticion directa natural junto a los ARNsg. Se transfectaron conjuntamente gufas con longitudes indicadas con SaCas9 y se ensayaron en celulas HEK 293FT para la actividad. Se transfectaron conjuntamente un total de 100 ng de amplicon U6-PCR de ARNsg (o 50 ng de repeticion directa y 50 ng de ARNtracr) y 400 ng de plasmido de SaCas9 en 200.000 hepatocitos de raton Hepa1-6 y se recogio el ADN en 72 horas post -transfeccion para analisis SURVEYOR. Los resultados se presentan en la Fig.
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Aunque se han presentado realizaciones preferidas de la presente invencion y se han descrito en la presente memoria, sera evdente para los expertos en la materia que tales realizaciones se proporcionan como ejemplo solamente. Ahora tendran lugar numerosas variaciones, cambios y sustituciones para los expertos en la materia sin 5 apartarse de la invencion. Se deberia entender que se pueden emplear diversas alternativas a las realizaciones de la invencion descritas en la presente memoria en la practica de la invencion.
Se definen aspectos adicionales de la descripcion en las siguientes clausulas numeradas.
1. Una composicion que no esta presente en la naturaleza o de ingenieria que comprende:
A) una secuencia de polinucleotidos de ARN quimerico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en el que la secuencia 10 de polinucleotidos comprende
(a) una secuencia guia capaz de hibridizar una secuencia fijada como objetivo en una celula eucariota,
(b) una secuencia de emparejamiento tracr y
(c) una secuencia tracr
en la que (a), (b) y (c) se disponen en una orientacion 51 a 3’,
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en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia gufa dirige la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo,
en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gufa que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr,
o
B) un sistema de enzima CRISPR, en el que el sistema esta codificado por un sistema vector que comprende uno o mas vectores que comprenden
I. un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de polinucleotidos de ARN quimerico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en el que la secuencia de polinucleotidos comprende
(a) una o mas secuencias gufa capaces de hibridar una o mas secuencias objetivo en una celula eucariota,
(b) una secuencia de emparejamiento tracr y
(c) una o mas secuencias tracr y
II. un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o mas secuencias de localizacion nuclear,
en la que (a), (b) y (c) se disponen en una orientacion 5' a 3',
en la que los componentes I y II se situan en los mismos vectores del sistema o diferentes,
en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia gufa dirige la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo,
en la que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gufa que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr,
o
C) un sistema de enzima CRISPR multiplexado, en la que el sistema se codifica mediante un sistema vector que comprende uno o mas vectores que comprenden
I. un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de polinucleotidos de ARN quimerico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en el que la secuencia de polinucleotidos comprende
(a) una o mas secuencias gufa capaces de hibridar una o mas secuencias objetivo en una celula eucariota,
(b) una secuencia de emparejamiento tracr, y
(c) una o mas secuencias tracr, y
II. un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o mas secuencias de localizacion nuclear,
en la que (a), (b) y (c) se disponen en una orientacion 5' a 3',
en la que los componentes I y II se situan en los mismos vectores del sistema o diferentes,
en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia gufa dirige la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo,
en la que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gufa que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr,
en la que se utilizan secuencias de polinucleotidos de ARNqui en el sistema multiplexado
o
D) un sistema de enzima CRISPR multiplexado, en la que el sistema se codifica mediante un sistema vector que comprende uno o mas vectores que comprenden
I. un primer elemento regulador unido de manera operable a
(a) una o mas secuencias gufa capaces de hibridar una secuencia objetivo en una celula y
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(b) al menos una o mas secuencias de emparejamiento tracr,
II. un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR y
III. un tercer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia tracr,
en la que los componentes I, II y III se situan en los mismos vectores del sistema o diferentes,
en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia gufa dirige la union especffica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo,
en la que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia gufa que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr y
en la que en el sistema multiplexado se usan multiples secuencias gufa y una secuencia tracr unica;
y
en la que, en la secuencia del polinucleotido de A), o en el sistema de B), C) o D), se modifican una o mas de las secuencias gufa, tracr y de emparejamiento tracr, para mejorar la estabilidad.
2. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 1, en el que la modificacion comprende una estructura secundaria de ingenierfa.
3. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 1 o la clausula 2, en el que la modificacion comprende una reduccion en una region de hibridacion entre la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr.
4. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente en el que la modificacion comprende condensar la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr mediante un lazo artificial.
5. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente en el que la modificacion comprende que la secuencia tracr tenga una longitud comprendida entre 40 y 120 pb.
6. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente en el que la secuencia tracr esta comprendida entre 40 pb y la longitud completa de tracr.
7. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la secuencia tracr incluye al menos los nucleotidos 1-67 del ARNtracr de tipo natural correspondiente.
8. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la secuencia tracr incluye al menos los nucleotidos 1-85 del ARNtracr de tipo natural correspondiente.
9. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la secuencia tracr comprende los nucleotidos correspondientes a los nucleotidos 1-67 del ARNtracr de Cas9 de S. pyogenes de tipo natural.
10. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la secuencia tracr comprende los nucleotidos correspondientes a los nucleotidos 1-85 del ARNtracr de Cas9 de S. pyogenes de tipo natural.
11. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 9, en el que la secuencia tracr consiste esencialmente en los nucleotidos correspondientes a los nucleotidos 1-67 del ARNtracr de Cas9 de S. pyogenes de tipo natural.
12. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 10, en el que la secuencia tracr consiste esencialmente en los nucleotidos correspondientes a los nucleotidos 1-85 del ARNtracr de Cas9 de S. pyogenes de tipo natural.
13. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la modificacion comprende la optimizacion de la secuencia.
14. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 13, en el que la modificacion comprende la reduccion en las secuencias de poliT en la secuencia tracr y/o de emparejamiento tracr.
15. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 14, en el que una o mas T presentes en una secuencia de poliT de la secuencia de tipo natural relevante se han sustituido con un nucleotido que no es T.
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16. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 13,14 o 15, en el que la secuencia modificada no comprende ninguna secuencia de poliT que tenga mas de cuatro T contiguas.
17 . El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la modificacion comprende anadir una secuencia terminadora de poliT.
18. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 17, en el que la modificacion comprende anadir una secuencia terminadora de poliT en las secuencias tracr y/o de emparejamiento tracr.
19. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 17 o 18, en el que la modificacion comprende anadir una secuencia terminadora de poliT en la secuencia gufa.
20. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la modificacion comprende alterar lazos y/u horquillas.
21. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 20, en el que la modificacion comprende proporcionar como mfnimo dos horquillas en la secuencia gufa.
22. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 20 o 21, en el que la modificacion comprende proporcionar una horquilla formada mediante la complementacion entre la secuencia tracr y de emparejamiento de tracr.
23. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 20 o 22, donde la modificacion comprende proporcionar una o mas horquillas adicionales en el extremo 3' de la secuencia de ARNtracr.
24. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 20-23, en el que la modificacion comprende proporcionar una o mas horquillas adicionales anadidas a la parte 3' de la secuencia gufa.
25. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la modificacion comprende extender el extremo 5' de la secuencia gufa.
26. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 25, en el que la modificacion comprende proporcionar una o mas horquillas en el extremo 5' de la secuencia gufa.
27. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 25 o 26, donde la modificacion comprende unir la secuencia (5'-AGGACGAAGTCCTAA) al extremo 5' de la secuencia gufa.
28. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la modificacion comprende proporcionar union cruzada o proporcionar uno o mas nucleotidos modificados en la secuencia de polinucleotidos.
29. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la reivindicacion 28, en el que los nucleotidos modificados se proporcionan en cualquiera o en todas las secuencias tracr, de emparejamiento tracr y/o gufa y/o en la secuencia codificadora de enzimas y/o en secuencias de vectores.
30. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 28 o 29, en el que proporcionar nucleotidos modificados comprende la inclusion de al menos un nucleotido que no se encuentra en la naturaleza o un nucleotido modificado o analogos de los mismos.
31. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 30, en el que los nucleotidos modificados se modifican en el resto ribosa, fosfato y/o base.
32. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 30, en el que el nucleotido modificado se selecciona del grupo constituido por 2'-O-metil-analogos, 2'-desoxi-analogos o 2'-fluoro-analogos.
33. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la clausula 30, en el que el nucleotido modificado se selecciona del grupo constituido por 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina, inosina, 7- metilguanosina.
34. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la modificacion comprende dos horquillas.
35. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la modificacion comprende tres horquillas.
36. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la modificacion comprende como mucho cinco horquillas.
37. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II.
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38. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la enzima CRISPR es una enzima Cas9.
39. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la enzima CRISPR comprende menos de mil aminoacidos.
40. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquiera de las clausulas 1-38, en el que la enzima CRISPR comprende menos de cuatro mil aminoacidos.
41. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente en el que la enzima Cas9 es StCas9 o St1Cas9.
42. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la enzima Cas9 es una enzima Cas9 procedente de un organismo seleccionado del grupo que comprende los generos Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium o Corynebacter.
43. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la enzima CRISPR es una nucleasa que dirige la escision de ambas hebras en la posicion de la secuencia objetivo.
44. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III.
45. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II.
46. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la secuencia gufa comprende al menos quince nucleotidos.
47. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente, en el que la modificacion comprende ARN de secuencia tracr optimizada y/o de secuencia gufa optimizada y/o estructura co- plegada de secuencia tracr y/o secuencia o secuencias de emparejamiento tracr y/o estructuras secundarias estabilizantes de secuencia tracr y/o secuencia tracr con una region reducida de emparejamiento de bases y/o elementos de ARN condensados de secuencia tracr; y/o en el sistema multiplexado hay dos ARN que comprenden un trazador y que comprenden una pluralidad de gufas o ARN que comprende una pluralidad de quimeras.
48. El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquiera de las clausulas 1-47, en el que la enzima CRISPR es codon-optimizada para la expresion en una celula eucariota.
49. La composicion de cualquier clausula precedente, en la que la composicion comprende una secuencia de polinucleotidos del ARN quimerico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas.
50. La composicion de la clausula 49, en la que la composicion comprende ademas una secuencia de polinucleotidos que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o mas secuencias de localizacion nuclear.
51. El sistema de enzima CRISPR de cualquier clausula precedente.
52. El sistema de enzima CRISPR multiplexado de cualquier clausula precedente.
53. El producto de la transcripcion o traduccion de la composicion de la clausula 49 o 50, el sistema de enzima CRISPR de la clausula 51 o el sistema de enzima CRISPR multiplexado de la clausula 52.

Claims (19)

  1. 5
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    1. Un sistema vector relacionado con Repeticiones Palindromicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR)-CRISPR asociado a (Cas) (CRISPR-Cas) de ingeniena, que no esta presente en la naturaleza, que comprende uno o mas vectores que comprenden:
    a) un primer elemento regulador unido de manera operable a dos o mas secuencias de nucleotidos, que codifican cada una de ellas un ARN gma del sistema CRISPR-Cas que comprende una secuencia de polinucleotidos que comprende una secuencia gma, un ARNtracr y una secuencia de emparejamiento tracr, donde cada ARN gma se hibrida con una secuencia objetivo diferente en los sitios de los polinucleotidos en una celula eucariota,
    b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a la secuencia de nucleotidos que codifica una protema Cas9 de Tipo II,
    en el que los componentes (a) y (b) estan situados en los mismos vectores o diferentes vectores del sistema,
    en el que el sistema comprende ademas una o mas senales de localizacion nuclear (las NLS) expresadas con la secuencia de nucleotidos que codifica la protema Cas9, y
    segun lo cual los dos o mas ARN gma fijan como objetivo los sitios de polinucleotidos en la celula eucariota y la protema Cas9 escinde los sitios de polinucleotidos, segun lo cual se modifican las secuencias de los sitios de polinucleotidos.
  2. 2. Un sistema vector CRISPR-Cas de tipo II de ingeniena, que no esta presente en la naturaleza de acuerdo con la reivindicacion 1,
    en el que la protema Cas9 esta mutada con respecto a la protema Cas9 de tipo natural correspondiente de manera que la protema mutada es una nickasa que carece de capacidad para escindir una hebra de un polinucleotido objetivo,
    segun lo cual los dos o mas ARN gma fijan como objetivo los sitios de polinucleotidos en una celula eucariota y la protema Cas9 solo escinde una hebra de los sitios de polinucleotidos, segun lo cual se modifican las secuencias de los sitios de polinucleotidos.
  3. 3. El sistema de la reivindicacion 2, en el que la protema Cas9 comprende una o mas mutaciones en los dominios catalfticos RuvC I, RuvC II o RuvC III.
  4. 4. El sistema de la reivindicacion 2, en el que la protema Cas9 comprende una mutacion seleccionada del grupo que consiste en D10A H840A N854A y N863A con referenda a la numeracion de la posicion de una protema Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9).
  5. 5. El sistema de cualquier reivindicacion precedente, en el que el sistema CRISPR-Cas comprende dos o mas senales de localizacion nuclear expresadas con la secuencia de nucleotidos que codifica la protema Cas9.
  6. 6. El sistema de la reivindicacion 5, en el que al menos una NLS esta en o cerca del termino amino de la protema Cas9 y/o al menos una NLS esta en o cerca del termino carboxi de la protema Cas9.
  7. 7. El sistema de la reivindicacion 6, en el que al menos una NLS esta en o cerca del termino amino de Cas9 y al menos una NLS esta en o cerca del termino carboxi de la protema Cas9.
  8. 8. El sistema de cualquier reivindicacion precedente, en el que al menos uno de dichos ARN gma comprende una secuenaa gma condensada con una secuencia cr de activacion trans (tracr).
  9. 9. El sistema de cualquier reivindicaaon precedente, en el que al menos uno de dichos ARN gma
    es un ARN quimerico que comprende la secuencia gma, la secuencia tracr y una secuencia de emparejamiento tracr.
  10. 10. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el componente (a) comprende el primer elemento regulador unido de manera operable a un polinucleotido que comprende una primera secuencia de emparejamiento tracr, un primer ARN gma, una segunda secuencia de emparejamiento tracr y un segundo ARN gma.
  11. 11. El sistema de cualquier reivindicaaon precedente, en el que la celula eucariota es una celula de mairufero o una celula humana.
  12. 12. El sistema de cualquier reivindicacion precedente, en el que la secuencia de nudeotidos que codifica la protema Cas9 es codon-optimizada para la expresion en una celula eucariota.
  13. 13. El sistema de cualquier reivindicacion precedente, en el que los vectores son vectores virales.
  14. 14. El sistema de la reivindicacion 13, en el que los vectores virales comprenden vectores retrovirales, de lentivirus, adenovirales, adenoasociados y del virus del herpes simple.
  15. 15. El sistema de cualquier reivindicacion precedente, en el que al menos uno de dichos ARN gufa incluye una 5 secuencia tracr que comprende 50 o mas nucleotidos de longitud.
  16. 16. El sistema de cualquier reivindicacion precedente, en el que los componentes (a) y (b) son componentes del mismo vector.
  17. 17. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que los componentes (a) y (b) estan en vectores diferentes.
    10 18. El uso del sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para la ingenierfa de genomas, siempre que el uso
    no comprenda un procedimiento para modificar la identidad genetica de la lfnea germinal de seres humanos y siempre que dicho uso no sea un metodo para tratamiento del cuerpo humano o de un animal por cirugfa o terapia.
  18. 19. El uso de la reivindicacion 18, en el que el uso comprende ademas reparar dicho polinudeotido objetivo esandido por recombinacion homologa con un polinucleotido exogeno de plantilla, en el que dicha reparacion da
    15 como resultado una mutacion que comprende una insercion, supresion o sustitucion de uno o mas nucleotidos de dicho polinucleotido objetivo.
  19. 20. El uso del sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-17 en la produccion de un animal transgenico no humano o una planta transgenica.
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