KR20220005019A - 알킬 곁사슬을 갖는 양이온성 폴리머 - Google Patents

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KR20220005019A
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polymer
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nucleic acid
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이근우
산타누 마이티
프랑코 두아르테
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진에딧 인코포레이티드
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Abstract

가수분해성 폴리머 백본을 포함하는 폴리머로서, 상기 폴리머 백본은 (i) 소수성 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위; (ii) 올리고아민 또는 폴리아민을 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위; 및 선택적으로, (iii) 이온화 가능한 기(ionizable group)를 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위를 포함하는 것인 폴리머, 및 상기 폴리머를 제조하는 방법, 및 상기 폴리머를 이용하여 핵산 및/또는 폴리펩티드를 세포에 전달하는 방법이 제공된다.

Description

알킬 곁사슬을 갖는 양이온성 폴리머
관련 출원에 대한 교차 참조
본 특허 출원은 2019년 4월 28일에 제출된 미국 임시 특허 출원 62/837,658 및 2019년 5월 28일에 제출된 미국 임시 특허 출원 62/853,658에 대한 우선권을 주장하고, 이들 출원의 전체 개시가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
펩티드, 단백질, 및 핵산 기반 기술은 질병을 예방, 치유, 및 치료하기 위한 수많은 응용을 갖는다. 그러나, 큰 분자(예를 들면, 폴리펩티드 및 핵산)의 그들의 표적 부위로의 안전하고 효과적인 전달은 미결로 남아있다. 따라서, 치료 분자들을 전달하기 위해 유용한 신규한 조성물 및 방법에 대한 요구가 지속적으로 존재한다.
가수분해성 폴리머 백본을 포함하는 폴리머로서, 상기 폴리머 백본은 (i) 소수성 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위(monomer unit); (ii) 올리고아민 또는 폴리아민을 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위; 및 선택적으로, (iii) 선택적으로 7 미만의 pKa를 갖는, 이온화 가능한 기(ionizable group)를 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위를 포함하는 것인 폴리머가 본 명세서에서 제공된다.
또한, 하기 식 1의 구조를 포함하는 폴리머로서:
Figure pct00001
식 중에서:
m1 + m2 + m3 + m4 의 합은 5보다 크다는 조건 하에, m1, m2, m3, 및 m4 각각은 0 내지 1000의 정수이고;
n1 + n2 의 합은 2보다 크다는 조건 하에, n1 및 n2 각각은 0 내지 1000의 정수이며;
심볼 "/"는 그에 의해 분리된 단위들이 무작위로 또는 임의의 순서로 연결된다는 것을 나타내고;
각각의 R3a 은 독립적으로 메틸렌기 또는 에틸렌기이며;
각각의 R3b 은 독립적으로 메틸렌기 또는 에틸렌기이고;
각 X1는 독립적으로 ―C(O)O―, ―C(O)NR13―, ―C(O)―, ―S(O)(O)―, 또는 결합이며;
각각의 R13 은 독립적으로 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, 알킬렌기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기이고; 이들은 선택적으로 하나 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있으며;
각각의 X2는 독립적으로, C1-C12 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 선택적으로 하나 이상의 1차 아민, 2차 아민, 또는 3차 아민을 포함하고; 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있으며;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 식
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2 2]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2R2}; 또는
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2 2]2}2의 기이고,
B1 및 B2는 각각 독립적으로
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R4-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R4-R5]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R4-R5};
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R4-R5]2}2;
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-CH2-CHOH-R5]2}2;
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R5]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R5};
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R5]2}2;
―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R4-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2;
―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2,
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R5; 또는
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R4-R5의 기이며,
식 중에서, p1 내지 p4, q1 내지 q6, r1 및 r2, 및 s1 내지 s4 는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; 각각의 R2은 독립적으로 수소, 또는 C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기이거나, 또는 R2은 제2 R2와 결합되어 헤테로고리기를 형성하고; 각각의 R4은 독립적으로 -C(O)O-, -C(O)NH-, -C-O-C(O)-O-C-, -O-, 또는 -S(O)(O)-이며; 각각의 R5은 독립적으로 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 선택적으로 2개 내지 8개의 3차 아민, 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티(targeting moiety)를 포함하는 치환기를 포함하는 것인 폴리머가 제공된다.
전술된 식 1의 폴리머는 이온화 가능한 기를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 이온화 가능한 기는 식 1의 R5에 의해 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 폴리머는 이온화 가능한 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체를 더 포함한다.
본 개시는 또한 식 1의 구조를 포함하는 폴리머 및 핵산 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 식 1의 구조를 포함하는 폴리머를 제조하는 방법, 및 상기 폴리머, 및 이를 포함하는 조성물을 이용하는 방법, 예를 들면, 핵산 또는 단백질을 세포에 전달하기 위해 상기 폴리머, 및 이를 포함하는 조성물을 이용하는 방법이 제공된다.
본 발명은 가수분해성 폴리머 백본을 포함하는 폴리머로서, 상기 폴리머 백본은 (i) 소수성 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위; (ii) 올리고아민 또는 폴리아민을 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위; 및 선택적으로, (iii) 선택적으로 7 미만의 pKa를 갖는, 이온화 가능한 기(ionizable group)를 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위를 포함하는 것인 폴리머를 제공한다.
본 명세서에서 사용된, 문구(phrase) 가수분해성 폴리머 백본(hydrolysable polymer backbone)은 생리적 조건(예를 들면, 생리적 pH, 생리적 온도, 또는 주어진 인 비보 조직, 예를 들면, 혈액, 혈청, 등)에서 천연 인자들(예를 들면, 효소) 때문에 절단에 취약한 결합을 갖는 폴리머 백본을 의미한다. 일반적으로, 가수분해성 폴리머 백본은 폴리아미드, 폴리-N-알킬아미드, 폴리에스테르, 폴리카르보네이트, 폴리카르바메이트, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정한 구체예에서, 가수분해성 폴리머 백본은 폴리아미드를 포함한다.
소수성 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위(monomer unit)는 임의의 소수성 기를 포함할 수 있다. 소수성 기의 예는 예를 들면, C1-C12 (예를 들면, C2-C12, C2-C10, C2-C8, C2-C6, C3-C12, C3-C10, C3-C8, C3-C6, C4-C12, C4-C10, C4-C8, C4-C6, C6-C12, C6-C8, C8-C12, C8-C10,) 알킬기, C2-C12 (예를 들면, C2-C6, C3-C12, C3-C10, C3-C8, C3-C6, C4-C12, C4-C10, C4-C8, C4-C6, C6-C12, C6-C8, C8-C12, C8-C10,) 알케닐기, 또는 C3-C12 (C3-C10, C3-C8, C3-C6, C4-C12, C4-C10, C4-C8, C4-C6, C6-C12, C6-C8, C8-C12, C8-C10,) 시클로알킬기 또는 시클로알케닐기를 포함한다. 특정한 구체예에서, 소수성 기는 C4-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기를 포함한다. 일부 구체예에서, 소수성 기는 8개 미만의 탄소 또는 6개 미만의 탄소를 포함한다. 예를 들면, 소수성 기는 C2-C8 또는 C2-C6 (예를 들면, C3-C8 또는 C3-C6) 알킬기를 포함할 수 있다. 알킬 또는 알케닐기는 분지쇄 또는 직쇄일 수 있다. 전술된 구체예에서, 소수성 기는 상기 폴리머 백본에 직접적으로 또는 결합(linkage)을 통해, 예를 들면, 선택적으로 알킬렌 링커(예를 들면, 메틸렌 또는 에틸렌 링커)를 더 포함하는, 에스테르, 아미드, 또는 에테르기를 포함한 결합을 통해 연결된다.
상기 폴리머는 또한 올리고아민 또는 폴리아민을 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "올리고아민(oligoamine)"은 2개 또는 3개의 아민기를 갖는 화학적 모이어티(chemical moiety)를 의미하고, 용어 "폴리아민(polyamine)"은 4개 이상 (예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 등)의 아민기를 갖는 화학적 모이어티를 의미한다. 아민기는 일차 아민기, 이차 아민기, 삼차 아민기, 또는 이들의 조합일 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 올리고아민 또는 폴리아민은 하기 식을 갖고:
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2 2]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2R2};
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2 2]2}2,
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R4-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R4-R5]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R4-R5};
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R4-R5]2}2;
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-CH2-CHOH-R5]2}2;
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R5]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R5};
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R5]2}2;
―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R4-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2;
―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2,
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R5; 또는
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R4-R5,
식 중에서, p1 내지 p4, q1 내지 q6, r1 및 r2, 및 s1 내지 s4는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; 각각의 R2 은 독립적으로 수소, 또는 C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기이거나, 또는 R2은 제2 R2와 결합되어 헤테로고리기를 형성하고; 각각의 R4은 독립적으로 -C(O)O-, -C(O)NH-, -O-, -C-O-C(O)-C-O-, 또는 -S(O)(O)-이며; 각각의 R5은 독립적으로 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 선택적으로 2개 내지 8개의 3차 아민 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티를 포함하는 치환기를 포함하는 것인 폴리머가 제공된다.
일부 구체예에서, 상기 올리고아민 또는 폴리아민은 하기 식을 갖고:
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2 2]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2R2}; 또는
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2 2]2}2,
식 중에서, p1 내지 p4, q1 내지 q6, 및 r1 및 r2는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수(예를 들면, 1, 2, 또는 3)이고; 각각의 R2은 독립적으로 수소 또는 C1-C12 (예를 들면, C1-C6, C1-C3, C2, 또는 C1) 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기이거나, 또는 R2은 제2 R2와 결합되어 헤테로고리기를 형성한다. 알케닐기는 2개 이상의 탄소 (예를 들면, C2-C12, C2-C6, 등)를 가져야 하고, 시클로알킬 및 시클로알케닐기는 3개 이상의 탄소 (예를 들면, C3-C12, C3-C6, 등)를 가져야 하는 것으로 이해된다. 일부 구체예에서, 폴리아민은 ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2이고, 선택적으로 R2은 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬 (예를 들면, 메틸 또는 에틸)이다.
일부 구체예에서, 폴리머는 이온화 가능한 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체를 더 포함한다. 본 명세서에서 사용된 문구, "이온화 가능한 기(ionizable group)"는 용이하게 하전된 종으로 전환될 수 있는 치환기를 갖는 임의의 화학적 모이어티를 의미한다. 예를 들면, 이온화 가능한 기는 양성자-공여체 또는 양성자-수용체(proton-acceptor)인 작용기(group)일 수 있다. 상기 기는 생리적 조건 하에서 양성자화되거나 또는 탈양성자화될 수 있다. 특정한 구체예에서, 이온화 가능한 기는 (25℃에서 물 중) 7 미만의 pKa를 갖는다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 이온화 가능한 기는 6 미만의 pKa, 5미만의 pKa, 4 미만의 pKa, 3 미만의 pKa, 2 미만의 pKa, 또는 1 미만의 pKa를 가질 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 본 명세서에 기재된 이온화 가능한 기는 -2보다 큰 pKa, -1보다 큰 pKa, 0보다 큰 pKa, 1보다 큰 pKa, 2보다 큰 pKa, 3보다 큰 pKa, 4보다 큰 pKa, 5보다 큰 pKa, 또는 6보다 큰 pKa를 가질 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 이온화 가능한 기는 -2 내지 7의 pKa, 예를 들면, -1 내지 7의 pKa, 0 내지 7의 pKa, 1 내지 7의 pKa, 2 내지 7의 pKa, 3내지 7의 pKa, 4 내지 7의 pKa, 5 내지 7의 pKa, 6 내지 7의 pKa, 0 내지 6의 pKa, 2 내지 6의 pKa, 4 내지 6의 pKa, 0 내지 5의 pKa, 2 내지 5의 pKa, 또는 4 내지 5의 pKa를 가질 수 있다. 이온화 가능한 기의 예는 예를 들면, 술폰산, 술폰아미드, 카르복시산, 티올, 페놀, 아민 염, 이미드, 및 아미드 기를 포함한다.
일부 구체예에서, 폴리머는 (25℃에서 물 중) 7 미만의 전체 pKa 를 갖는다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 폴리머는 6 미만의 pKa, 5미만의 pKa, 4 미만의 pKa, 3 미만의 pKa, 2 미만의 pKa, 또는 1 미만의 pKa를 가질 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 본 명세서에 기재된 폴리머는 -2보다 큰 pKa, -1보다 큰 pKa, 0보다 큰 pKa, 1보다 큰 pKa, 2보다 큰 pKa, 3보다 큰 pKa, 4보다 큰 pKa, 5보다 큰 pKa, 또는 6보다 큰 pKa를 가질 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 폴리머는 -2 내지 7의 pKa, 예를 들면, -1 내지 7의 pKa, 0 내지 7의 pKa, 1 내지 7의 pKa, 2 내지 7의 pKa, 3내지 7의 pKa, 4 내지 7의 pKa, 5 내지 7의 pKa, 6 내지 7의 pKa, 0 내지 6의 pKa, 2 내지 6의 pKa, 4 내지 6의 pKa, 0 내지 5의 pKa, 2 내지 5의 pKa, 또는 4 내지 5의 pKa를 가질 수 있다.
폴리머는 소수성 기를 포함하는 곁사슬을 가진 단량체 단위, 올리고아민 또는 폴리아민을 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위, 및 존재하는 경우, 이온화 가능한 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위의 적절한 개수 또는 양 (예를 들면, 중량 또는 수 퍼센트 조성물(weight or number percent composition))을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리머는 약 1 내지 약 80 mol% (예를 들면, 약 5 내지 약 80 mol%, 약 10 내지 약 80 mol%, 약 20 내지 약 80 mol%, 약 40 내지 약 80 mol%, 약 1 내지 약 60 mol%, 약 1 내지 약 40 mol%, 약 1 내지 약 20 mol%, 또는 약 1 내지 약 10 mol%)의 소수성 기를 갖는 단량체 단위, 약 1 내지 약 80 mol% (예를 들면, 약 5 내지 약 80 mol%, 약 10 내지 약 80 mol%, 약 20 내지 약 80 mol%, 약 40 내지 약 80 mol%, 약 1 내지 약 60 mol%, 약 1 내지 약 40 mol%, 약 1 내지 약 20 mol%, 또는 약 1 내지 약 10 mol%)의 올리고아민 또는 폴리아민을 갖는 단량체 단위, 및 0 내지 약 80 mol% (예를 들면, 약 5 내지 약 80 mol%, 약 10 내지 약 80 mol%, 약 20 내지 약 80 mol%, 약 40 내지 약 80 mol%, 약 1 내지 약 60 mol%, 약 1 내지 약 40 mol%, 약 1 내지 약 20 mol%, 또는 약 1 내지 약 10 mol%)의 이온화 가능한 기를 갖는 단량체 단위를 포함한다.
하기 식 1의 구조를 포함하는 폴리머로서:
Figure pct00002
식 중에서,
m1, m2, m3, 및 m4 각각은 0 내지 1000의 정수이고, 단, m1 + m2 + m3 + m4 의 합은 5보다 크며;
n1 및 n2 각각은 0 내지 1000의 정수이고, 단, n1 + n2 의 합은 2보다 크며;
심볼 "/"는 그에 의해 분리된 단위들이 무작위로 또는 임의의 순서로 연결된다는 것을 나타내고;
각각의 R3a은 독립적으로 메틸렌기 또는 에틸렌기이며;
각각의 R3b은 독립적으로 메틸렌기 또는 에틸렌기이고;
각 X1는 독립적으로 ―C(O)O―, ―C(O)NR13―, ―C(O)―, ―S(O)(O)―, 또는 결합이며;
각각의 R13 은 독립적으로 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알킬기, 또는 C3-C12 시클로알케닐기이고, 선택적으로 하나 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있으며;
각각의 X2 는 독립적으로, C1-C12 알킬기 또는 헤테로알킬기, C3-C12 시클로알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 하나 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있으며;
A1 및 A2는 각각 독립적으로
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2 2]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2R2}; 또는
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2 2]2}2의 기이고,
B1 및 B2는 각각 독립적으로
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R4-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R4-R5]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R4-R5};
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R4-R5]2}2;
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-CH2-CHOH-R5]2}2;
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R5]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R5};
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R5]2}2;
―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R4-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2;
―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2,
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R5; 또는
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R4-R5의 기이며,
식 중에서, p1 내지 p4, q1 내지 q6, r1 및 r2, 및 s1 내지 s4 는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; 각각의 R2 은 독립적으로 수소, 또는 C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기이거나, 또는 R2은 제2 R2와 결합되어 헤테로고리기를 형성하고; 각각의 R4은 독립적으로 -C(O)O-, -C(O)NH-, -O-, -C-O-C(O)-O-C-, 또는 -S(O)(O)-이며; 각각의 R5은 독립적으로 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 이들은 선택적으로 2개 내지 8개의 3차 아민 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티(targeting moiety)를 포함하는 치환기를 포함하는 것인 폴리머가 제공된다.
본 명세서에서 사용된, "알킬(alkyl)" 또는 "알킬렌(alkylene)"은 치환 또는 비치환 탄화수소 사슬을 의미한다. 알킬기는 임의의 개수의 탄소 원자를 가질 수 있다(예를 들면, C1-C100 알킬, C1-C50 알킬, C1-C12 알킬, C1-C8 알킬, C1-C6 알킬, C1-C4 알킬, C1-C2 알킬, 등). 알킬 또는 알킬렌은 포화될 수 있거나, 또는 (예를 들면, 알케닐 또는 알키닐을 제공하기 위해) 불포화될 수 있고, 직쇄형, 분지쇄형, 또는 고리형(예를 들면, 시클로알킬 또는 시클로알케닐), 또는 이들의 조합일 수 있다. 고리형 기는 단일고리형(monocyclic)이거나, 융합되어 이고리(bicyclic) 기 또는 삼고리(tricyclic) 기를 형성하거나, 결합에 의해 연결되거나 스피로고리(spirocyclic)일 수 있다. 일부 구체예에서, 알킬 치환기가 하나 이상의 헤테로원자(예를 들면, 산소, 질소, 및 황)에 의해 중단되어, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 또는 헤테로시클릴(즉, 헤테로고리기)을 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 알킬은 하나 이상의 치환기에 의해 치환된다.
용어 "아릴(aryl)"은 임의의 적절한 개수의 고리 원자 및 임의의 적절한 개수의 고리를 갖는 방향족 고리계(aromatic ring system)를 의미한다. 아릴기는 예를 들면, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 고리 원자, 및 6개 내지 10개, 6개 내지 12개, 또는 6개 내지 14개 고리원(ring member)을 가질 수 있다. 아릴기는 단일고리형일 수 있거나, 융합되어 이고리기 또는 삼고리기를 형성할 수 있거나, 또는 결합에 의해 연결되어 비아릴기(biaryl group)를 형성할 수 있다. 대표적인 아릴기는 페닐, 나프틸, 및 비페닐을 포함한다. 일부 구체예에서, 아릴기는 아릴알킬기(예를 들면, 벤질기)를 형성하기 위해 알킬렌 연결기(linking group)를 포함한다. 일부 아릴기, 예를 들면, 페닐, 나프틸, 또는 비페닐은 6개 내지 12개 고리원을 갖는다. 기타 아릴기, 예를 들면, 페닐 또는 나프틸은 6개 내지 10개의 고리원을 갖는다. 일부 구체예에서, 아릴 치환기는 하나 이상의 헤테로원자(예를 들면, 산소, 질소, 및 황)에 의해 중단되어, 헤테로고리기(즉, 헤테로고리기 또는 헤테로아릴기)를 제공한다. 일부 구체예에서, 아릴기는 하나 이상의 치환기에 의해 치환된다.
용어 "헤테로고리(heterocyclyl)" 또는 "헤테로고리기(heterocyclic group)"는 고리형 기, 예를 들면, 고리기가 하나 이상의 헤테로 원자 (예를 들면, 산소, 질소, 및 황)를 포함하는 것인 방향족(예를 들면, 헤테로아릴) 또는 비-방향족 고리기를 의미한다. 일부 구체예에서, 헤테로고리 또는 헤테로고리기 (즉, 고리기(cyclic group), 예를 들면, 고리기가 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 것인 방향족(예를 들면, 헤테로아릴) 또는 비-방향족 고리)가 1개 이상의 치환기로 치환된다.
본 명세서에 사용된 용어 "치환된(substituted)"은 지정된 원자의 정상 원자가가 초과되지 않는 한 지정된 원자 또는 기 (예를 들어, 치환된 알킬기)상의 하나 이상의 수소가 다른 기로 대체됨을 의미할 수 있다. 예를 들어, 치환기가 옥소 (즉,
Figure pct00003
) 인 경우, 원자에 있는 두 개의 수소가 대체된다. 치환기는 하나 이상의 히드록시, 아미노(예를 들면, 일차, 이차, 또는 삼차), 알데히드, 카르복시산, 에스테르, 아미드, 케톤, 니트로, 우레아, 구아니딘, 시아노, 플루오로알킬 (예를 들어, 트리플루오로메탄), 할로 (예를 들어, 플루오로), 아릴 (예를 들어, 페닐), 헤테로시클릴 또는 헤테로시클릭기 (즉, 시클릭기, 예를 들어, 시클릭기가 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 방향족 (예를 들어, 헤테로아릴) 또는 비-방향족), 옥소, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 치환기 및/또는 변수의 조합은 치환이 화합물의 합성 또는 사용에 중대하게 유해한 영향을 미치지 않는 한 허용된다.
식 1에 따라, 각각의 m1, m2, m3, 및 m4는 0 내지 1000(예를 들면, 0 내지 500, 0 내지 200, 0 내지 100, 또는 0 내지 50)의 정수이고, 단, m1 + m2 + m3 + m4 는 5보다 크고, 예를 들면, 5-5000, 5-2000, 5-1000, 5-500, 5-100, 또는 5-50이다. 일부 구체예에서, m1 + m2 + m3 + m4의 합은 is 10보다 크거나 또는 20보다 크다(예를 들면, 10-5000, 10-2000, 10-1000, 10-500, 10-100, 또는 10-50; 또는 20-5000, 20-2000, 20-1000, 20-500, 20-100, 또는 20-50). 또한, n1 및 n2 각각은 0 내지 1000 (예를 들면, 0 내지 500, 0 내지 200, 0 내지 100, 0 내지 50, 또는 0 내지 25)의 정수이고, 단, n1 + n2의 합은 2보다 크다 (예를 들면, 2-2000, 2-1000, 2-500, 2-200, 2-100, 2-50, 또는 2-25). 일부 구체예에서, n1 + n2의 합은 5보다 크거나 또는 10보다 크다 (예를 들면, 5-2000, 5-1000, 5-500, 5-200, 5-100, 5-50, 또는 5-25; 또는 10-2000, 10-1000, 10-500, 10-200, 10-100, 10-50, 또는 10-25). 즉, 폴리머는 본 명세서에서 전체적으로 각각 "A 단량체" 및 "B 단량체"로 지칭되는, A1, A2, B1, 및/또는 B2 기를 포함하는 단량체 단위를 적어도 일부 포함한다. 유사하게, 폴리머는 본 명세서에서 전체적으로 "X 단량체"로 지칭되는, X1 및/또는 X2기를 포함하는 단량체 단위를 적어도 일부 포함한다. 일부 구체예에서, m1 및 m2는 0이어서, 폴리머는 A1 기나 A2 기를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, m3 및 m4는 0이어서, 폴리머는 B1 기나 B2 기를 포함하지 않는다.
폴리머는 A 및 B 단량체 대 X 단량체의 적절한 비를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리머는 약 25 이하 및 선택적으로 약 1 이상의 A 및 B 단량체 대 X 단량체의 비 (예를 들면, (m1+m2+m3+m4)/(n1+n2)의 비)를 포함한다. 예를 들면, A 및 B 단량체 대 X 단량체의 비는 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 5, 약 5 내지 약 25, 약 10 내지 약 25, 또는 약 15 내지 약 25일 수 있다.
폴리머가 A 단량체 및 B 단량체 모두를 포함하는 구체예에서, 상기 폴리머는 A 단량체 대 B 단량체의 적절한 비를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, A 단량체 대 B 단량체의 비 (예를 들면, (m1+m2)/(m3+m4))는 약 20 이하 (예를 들면, 약 10 이하, 약 5 이하, 약 2 이하, 또는 심지어 약 1 이하)일 수 있다. 일부 구체예에서, (m1+m2)/(m3+m4)의 비는 약 0.2 이상, 예를 들면, 약 0.5 이상일 수 있다.
폴리머는 임의의 적합한 구조 유형으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 폴리머는 교대 폴리머(alternating polymer), 랜덤 폴리머, 블록 폴리머, 그래프트(graft) 폴리머, 선형 폴리머, 분지형 폴리머, 환형(cyclic) 폴리머, 또는 이들의 조합으로 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리머는 랜덤 폴리머, 블록 폴리머, 그래프트 폴리머, 또는 이들의 조합이다.
따라서, 식 1의 구조에서, (그들의 개별적인 곁사슬 A1, A2, B1, B2, X1, 및 X2에 의해 지칭될 수 있는) 단량체는 무작위로 또는 임의의 순서로 배열될 수 있다. 정수 m1, m2, m3, m4, n1, 및 n2은 단지 사슬 전체에서 나타나는 개별적인 단량체의 개수를 표시하고, 일부 구체예에서, 주어진 단량체의 블록(block) 또는 영역(stretch)이 존재할 수 있으나, 반드시 단량체의 특정한 순서 또는 블록을 암시하거나 나타내는 것은 아니다. 예를 들면, 식 1의 구조는 -A1-A2-B1-B2-, -A2-A1-B2-B1-, -A1-B1-A2-B2-, 등의 순서로 단량체를 포함할 수 있다. 또한, 폴리머는 A 및/또는 B 폴리머의 블록(예를 들면, 임의의 순서로 [A 단량체]m1+m2-[B 단량체]m3+m4)을 포함할 수 있다. 폴리머는 A 및 B 단량체가 점재된(interspersed) 개별적인 X 단량체를 포함할 수 있거나(예를 들면, -A-X-B-, -A-B-X-, -B-X-A, 등), 폴리머는 상기 폴리머의 일 말단 또는 양 말단에서 하나 이상의 X 단량체(예를 들면, X 단량체의 블록)에 의해 "캡핑(capped)"될 수 있다. 마찬가지로, 폴리머가 A 및/또는 B 단량체의 블록을 포함하는 경우, 상기 폴리머는 A 및/또는 B 단량체의 블록 사이에 점재된 X 단량체의 블록을 포함할 수 있거나, 상기 폴리머는 상기 폴리머의 일 말단 또는 양 말단에서 하나 이상의 X 단량체(예를 들면, X 단량체의 블록)에 의해 "캡핑"될 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드(예를 들면, 폴리아스파라트아미드) 백본은 알파/베타 배치(configuration)로 배열되어, "1" 및 "2" 단량체가 교대될 것이고(예를 들면, -A1-A2-B1-B2-, -A2-A1-B2-B1-, -A1-B2-B1-A2-, -A2-B1-B2-A1-, -B1-A2-B1-A2-, 등), 상기 폴리머는 X 단량체에 의해 캡핑되거나 또는 상기 X 단량체가 전체적으로 점재된다. 그러나, "A" 및 "B" 곁사슬 (예를 들면, A1/A2 및 B1/B2)은 폴리머 백본 전체에 무작위로 점재될 수 있다.
폴리머 구조에서, R3a 및 R3b은 각각 독립적으로 메틸렌기 또는 에틸렌기이다. 일부 구체예에서, R3a은 에틸렌기이고, R3b은 메틸렌기이거나; 또는 R3a은 메틸렌기이고, R3b은 에틸렌기이다. 특정한 구체예에서, R3a 및 R3b은 각각 에틸렌기이다. 일부 구체예에서, R3a 및 R3b은 각각 메틸렌기이다.
본 명세서에 기재된 폴리머에서, 각각의 X1기는 독립적으로 ―C(O)O―, ―C(O)NR13―, ―C(O)―, ―S(O)(O)―, 또는 결합이다. 각각의 X1기는 상호간에 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 일부 구체예에서, X1기는 ―C(O)NR13―이다. 일부 구체예에서, X1기는 ―C(O)O―이다.
각각의 R13은 독립적으로 수소, 또는 C1-C12 (예를 들면, C1-C8, C1-C6, 또는 C1-C3) 알킬기, C2-C12 (예를 들면, C2-C8, C2-C6, 또는 C2-C3) 알케닐기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알킬기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알케닐기, 아릴기, 또는 헤테로고리기 (예를 들면, 1개, 2개, 또는 3개의 헤테로 원자를 포함하는 3-12, 3-10, 3-8, 또는 3-6원 헤테로고리기)이고, 이들은 1개 또는 그 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, R13은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는, C1-C12 알킬기 (예를 들면, C1-C10 알킬기; C1-C8 알킬기; C1-C6 알킬기; C1-C4 알킬기, C1-C3 알킬기, 또는 C1 또는 C2 알킬기)이다. 특정한 구체예에서, 각각의 R13은 메틸 또는 수소이다. 일부 구체예에서, R13은 메틸이고; 다른 구체예에서, R13은 수소이다. 각각의 R13은 독립적으로 선택되고, 동일하거나 또는 상이할 수 있다; 그러나, 일부 구체예에서, 각각의 R13은 동일하다 (예를 들면, 모두 메틸이거나 또는 모두 수소임).
각각의 X2는 독립적으로 C1-C12 (예를 들면, C1-C8, C1-C6, 또는 C1-C3) 알킬기, C2-C12 (예를 들면, C2-C8, C2-C6, 또는 C2-C3) 알케닐기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알킬기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알케닐기, 아릴기, 또는 헤테로고리기 (예를 들면, 1개, 2개, 또는 3개의 헤테로 원자를 포함하는 3-12, 3-10, 3-8, 또는 3-6원 헤테로고리기) 또는 이들의 조합이고, 이들은 1개 또는 그 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, X2는 선택적으로 1개 이상의 일차 아민, 이차 아민, 또는 삼차 아민을 포함할 수 있다. 따라서, 각 X2는 독립적으로 선택되고, 따라서, 상호 간에 동일하거나 또는 다를 수 있다. 특정한 구체예에서, 각각의 X2는 독립적으로 C1-C12 (예를 들면, C1-C8, C1-C6, 또는 C1-C3) 알킬기, C2-C12 (예를 들면, C2-C8, C2-C6, 또는 C2-C3) 알케닐기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알킬기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알케닐기, 또는 이들의 조합이고, 이들은 선택적으로 1개 이상의 일차 아민, 이차 아민, 또는 삼차 아민을 포함한다. 일부 구체예에서, 1개 또는 그 이상의 (또는 모든) X2기는 독립적으로 C2-C12 (예를 들면, C3-C12, C3-C8, C3-C6, C4-C12, C4-C6, C6-C12, 또는 C8-C12) 알킬기 또는 알케닐기, 또는 C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, C4-C12, C4-C6, C6-C12, 또는 C8-C12) 시클로알케닐기일 수 있다. 다른 구체예에서, 1개 또는 그 이상의 (또는 모든) X2기는 독립적으로 C1-C8 (예를 들면, C1-C6, C1-C4, C1-C3, C2-C8, 또는 C2-C6) 알킬기일 수 있다. 전술된 알킬 또는 알케닐기은 선형(linear) 또는 분지형일 수 있다.
A1 및 A2기는 독립적으로 선택되고, 따라서, 상호 간에 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 유사하게, B1 및 B2기는 독립적으로 선택되고, 따라서, 상호 간에 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 그러나, 일부 구체예에서, A1과 A2는 동일하고 및/또는 B1 과 B2는 동일하다.
A1, A2, B1, 및 B2 기에서, 정수 p1 내지 p4 (즉, p1, p2, p3, 및 p4), q1 내지 q6 (즉, q1, q2, q3, q4, q5, 및 q6), r1, r2, 및 s1 내지 s4 (즉, s1, s2, s3, 및 s4)는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 또는 5). 일부 구체예에서, p1 내지 p4 (즉, p1, p2, p3, 및 p4), q1 내지 q6 (즉, q1, q2, q3, q4, q5, 및 q6), r1, r2, 및/또는 s1 내지 s4는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수(예를 들면, 1, 2, 또는 3)이다. 특정한 구체예에서, p1 내지 p4 (즉, p1, p2, p3, 및 p4), q1 내지 q6 (즉, q1, q2, q3, q4, q5, 및 q6), 및/또는 s1 내지 s4 (즉, s1, s2, s3, 및 s4)는 각각 2이다. 일부 구체예에서, p1 내지 p4 (즉, p1, p2, p3, 및 p4) 및/또는 q1 내지 q6 (즉, q1, q2, q3, q4, q5, 및 q6)는 각각 2이고, r1, r2, 및 s1 내지 s4 (즉, s1, s2, s3, 및 s4)는 각각 1이다.
각각의 R2은 수소 또는 C1-C12 (예를 들면, C1-C8, C1-C6, 또는 C1-C3) 알킬기, C2-C12 (예를 들면, C2-C8, C2-C6, 또는 C2-C3) 알케닐기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알킬기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알케닐기이거나, 또는 R2은 또 다른 R2와 결합하여 헤테로고리기를 형성한다. 일부 구체예에서, R2은 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는 C1-C12 알킬 (예를 들면, C1-C10 알킬기; C1-C8 알킬기; C1-C6 알킬기; C1-C4 알킬기, C1-C3 알킬기, 또는 C1 또는 C2 알킬기)이다. 특정한 구체예에서, R2은 메틸이다. 다른 구체예에서, R2은 수소일 수 있다. 각 R2은 독립적으로 선택되고 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 일부 구체예에서, 주어진 각 R2은 동일하다(예를 들면, 모두 메틸이거나 또는 모두 수소이다).
각각의 R4은 독립적으로 ―C(O)O―, ―C(O)NH―, 또는 ―S(O)(O)―이다. 일부 구체예에서, 각각의 R4은 독립적으로 ―C(O)O― 또는 ―C(O)NH―이다. 특정한 구체예에서, 각각의 R4은 ―C(O)O―이다. 특정한 구체예에서, 각각의 R4은 ―C(O)NH―이다.
각각의 R5은 독립적으로 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 선택적으로 2개 내지 8개의 3차 아민 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티를 포함하는 치환기를 포함한다. R5은 약 2개 내지 약 50개의 탄소 원자 (예를 들면, 약 2개 내지 약 40개의 탄소 원자, 약 2개 내지 약 30개의 탄소 원자, 약 2개 내지 약 20개의 탄소 원자, 약 2개 내지 약 16개의 탄소 원자, 약 2개 내지 약 12개의 탄소 원자, 약 2개 내지 약 10개의 탄소 원자, 또는 약 2개 내지 약 8개의 탄소 원자)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, R5은 2개 내지 8개(즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개)의 삼차 아민을 포함하는 헤테로알킬기이다. 삼차 아민은 헤테로알킬 백본의 일부(즉, 헤테로알킬기 중 원자의 가장 긴 연속 사슬), 또는 펜던트 치환기(pendant substituent)일 수 있다. 따라서, 예를 들면, 상기 삼차 아민을 포함하는 헤테로알킬기는 2개 내지 8개의 삼차 아민을 포함하는 알킬아미노기, 아미노알킬기, 알킬아미노알킬기, 아미노알킬아미노기, 또는 등가물을 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 각 R5은 독립적으로:
Figure pct00004
;
Figure pct00005
;
Figure pct00006
;
Figure pct00007
;
Figure pct00008
;
Figure pct00009
;
Figure pct00010
;
Figure pct00011
;
Figure pct00012
;
Figure pct00013
;
Figure pct00014
; 및
Figure pct00015
로부터 선택되고,
식 중에서,
각각의 R2은 전술된 바와 같고;
R7은, 선택적으로 하나 이상의 아민에 의해 치환된, C1-C50 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기이고;
z는 1 내지 5의 정수이며;
c는 0 내지 50의 정수이고;
Y는 선택적으로 존재하고 절단가능한 링커이며;
n은 0 내지 50의 정수이고; 및
R8은 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티이다.
R7은 선택적으로 하나 이상의 아민으로 치환된 C1-C50 (예를 들어, C1-C40, C1-C30, C1-C20, C1-C10, C4-C12, 또는 C6-C8) 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기일 수 있다. 일부 구체예에서, R7은 선택적으로 하나 이상의 아민으로 치환된, C4-C12, 예를 들면, C6-C8 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐 기이다. 일부 구체예에서, R7은 하나 이상의 아민으로 치환된다. 특정한 구체예에서, R7은 2 내지 8개 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개)의 삼차 아민으로 치환된다. 상기 삼차 아민은 알킬기의 일부 (즉, 알킬기 백본에 포함됨) 또는 펜던트 치환기일 수 있다.
각각의 Y는 선택적으로 존재한다. 본 명세서에서 사용된, 문구 "선택적으로 존재하는(optionally present)"은 선택적으로 존재하는 것으로 지정된 치환기가 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 그 치환기가 존재하지 않는 경우, 인접한 치환기가 서로 직접 결합된다는 것을 의미한다. Y가 존재하는 경우, Y는 절단 가능한 링커이다. 본 명세서에 사용된, 문구 "절단 가능한 링커(cleavable linker)"는 두 종을 분리하기 위해 절단될 수 있는 두 종을 연결하는 임의의 화학적 요소(chemical element)를 의미한다. 예를 들어, 절단 가능한 링커는 가수분해 공정, 광화학 공정, 라디칼 공정, 효소 공정, 전기 화학 공정, 또는 이들의 조합에 의해 절단될 수 있다. 예시적인 절단 가능한 링커는 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
Figure pct00016
;
Figure pct00017
;
Figure pct00018
; 및
Figure pct00019
,
식 중에서, R14의 각 경우는 독립적으로 C1-C4 알킬기이고, R15의 각 경우는 독립적으로 수소, 아릴기, 헤테로고리기 (예를 들어, 방향족 또는 비-방향족), C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기이고, R16은 하나 이상의 -OCH3, -NHCH3, -N (CH3)2, -SCH3, -OH, 또는 이들의 조합으로 선택적으로 치환된 6-원 방향족 또는 헤테로방향족 기이다.
일부 구체예에서, A1 및 A2 각각은 독립적으로 식 ―(CH2)p1―[NH―(CH2)q1―]r1NH2 또는 ―(CH2)p1―[NH―(CH2)q1―]r1NHCH3의 기, 또는 -(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2 또는 -(CH2)2-NH-(CH2)2-NHCH3 또는 -(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2의 기이다. 일부 구체예에서, A1 및 A2 각각은 독립적으로 식 ―(CH2)p1―[N(R2))―(CH2)q1―]r1N(R2)2 또는 ―(CH2)p1―[N(R2)―(CH2)q1―]r1NH(R2)의 기이고, 식 중에서, R2은 메틸 또는 에틸이거나; 또는 -(CH2)2-N(CH3)-(CH2)2-NH2, 또는 -(CH2)2-N(CH3)-(CH2)2-NHCH3, 또는 -(CH2)2-N(CH3)-(CH2)2-N(CH3)2의 기이다.
추가적으로, 또는 대안적으로, B1 및 B2 각각은 식 ―(CH2)p1―[NH―(CH2)q1―]r1NH-(CH2)2-R4-R5의 기, 예를 들면, -(CH2)2-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-R4-R5 기, 또는 -(CH2)2-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-C(O)-O-R5 기이고, 식 중에서, R4 및 R5은 전술된 바와 같다.
일부 구체예에서, 식 1의 폴리머는 B 단량체를 갖지 않는다(예를 들면, m3 및 m4는 모두 0이다). 따라서, 하기 식 4의 구조를 갖는 폴리머가 또한 제공되고:
Figure pct00020
식 4
식 중에서:
각각의 m1 및 m2 는 0 내지 1000(예를 들면, 0 내지 500, 0 내지 200, 0 내지 100, 또는 0 내지 50)의 정수이고, 단, m1 + m2 의 합은 5보다 크다(예를 들면, 5-2000, 5-1000, 5-500, 5-100, 또는 5-50). 일부 구체예에서, m1 + m2 의 합은 10보다 크거나 또는 20보다 크다(예를 들면, 10-5000, 10-2000, 10-1000, 10-500, 10-100, 또는 10-50; 또는 20-5000, 20-2000, 20-1000, 20-500, 20-100, 또는 20-50). 또한, 각각의 n1 및 n2은 0 내지 1000(예를 들면, 0 내지 500, 0 내지 200, 0 내지 100, 0 내지 50, 또는 0-25)의 정수이고, 단, n1 + n2 의 합은 2보다 크다(예를 들면, 2-2000, 2-1000, 2-500, 2-200, 2-100, 2-50, 또는 2-25). 일부 구체예에서, n1 + n2 의 합은 5보다 크거나 또는 10보다 크다(예를 들면, 5-2000, 5-1000, 5-500, 5-200, 5-100, 5-50, 또는 5-25; 또는 10-2000, 10-1000, 10-500, 10-200, 10-100, 10-50, 또는 10-25).
식 4의 폴리머의 일부 구체예에서, A1 및 A2은 각각 독립적으로 식
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2 2]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2R2}; 또는
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2 2]2}2의 기이고,
식 중에서, p1 내지 p4, q1 내지 q6, 및 r1 및 r2은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수(예를 들면, 1-3의 정수)이고; 각각의 R2은 독립적으로 수소 또는 C1-C12 (예를 들면, C1-C8, C1-C6, 또는 C1-C3) 알킬기, C2-C12 (예를 들면, C2-C8, C2-C6, 또는 C2-C3) 알케닐기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알킬기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알케닐기이다. 일부 구체예에서, 삼차 아민은 일차, 이차, 또는 삼차 아민이거나, 일부 구체예에서 이차 또는 삼차 아민일 수 있다는 것을 제외하고 일부 구체예에서, R2 치환기를 포함하는 A1 및 A2 기 중 각각의 질소는 삼차 아민이다. 추가적인 예시로서, A1 및 A2 각각은 -(CH2)2-NR2-(CH2)2-NR2 2일 수 있고, 각각의 R2은 독립적으로, 전술된 바와 같이 수소, 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기이고, 구체적으로 알킬기, 예를 들면, 메틸 또는 에틸이며, 선택적으로 각 아민은 삼차 아민이고, 예외적으로 상기 삼차 아민은 이차 또는 삼차 아민이다.
A1 및 A2기의 특정한 비-한정적 예는 -NH-CH2-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2; -N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2; -NH-CH2-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2; -N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2; -NH-CH2-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-NH(CH3); -N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-NH(CH3); -NH-CH2-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-NH(CH3); -N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-NH(CH3)을 포함한다.
식 4의 폴리머의 모든 다른 양태는 식 4의 치환기와 관련한 모든 구체예를 포함하여, 식 1에 대해 기재된 것과 동일하다. 따라서, 예를 들면, 식 4의 일부 구체예에서, 각각의 R13은, R13이 수소 또는 메틸인 특정한 구체예를 포함하여, 식 1에 대해 기재된 임의의 기일 수 있고, 각각의 R3a 및 R3b은, R3a 및 R3b이 메틸렌 또는 에틸렌인 특정한 구체예를 포함하여, 식 1에 대해 기재된 임의의 기일 수 있다. 유사하게, X1 및 X2는, X1은 ―C(O)NR13― 또는 ―C(O)O―이고 및/또는 1개 이상(또는 모든) X2 기가 독립적으로 C1-C8 (예를 들면, C1-C6, C1-C4, C1-C3, C2-C8, 또는 C2-C6) 알킬기일 수 있는 구체예를 포함하여, 식 1에 대해 기재된 임의의 기일 수 있다.
일부 구체예에서, 폴리머는 식 1A의 구조를 갖고:
Figure pct00021
식 중에서,
Q는 식:
Figure pct00022
이고
c는 0 내지 50의 정수이며;
Y는 선택적으로 존재하고 절단가능한 링커이고;
각각의 m1, m2, m3, 및 m4은 0 내지 1000의 정수이고, 단, m1 + m2 + m3 + m4의 합은 5보다 크며;
각각의 n1 및 n2은 0 내지 1000의 정수이고, 단, n1 + n2의 합은 2보다 크고;
심볼 "/"는 그에 의해 분리된 단위들이 무작위로 또는 임의의 순서로 연결된다는 것을 나타내고;
R1은 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 (예를 들면, C1-C8, C1-C6, 또는 C1-C3) 알킬 또는 헤테로알킬기, C2-C12 (예를 들면, C2-C8, C2-C6, 또는 C2-C3) 알케닐기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알킬기, 또는 C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알케닐기이며, 선택적으로 1개 이상의 치환기에 의해 치환되고; 및
R6은 수소, 아미노기, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 (예를 들면, C1-C8, C1-C6, 또는 C1-C3) 알킬 또는 헤테로알킬기, C2-C12 (예를 들면, C2-C8, C2-C6, 또는 C2-C3) 알케닐기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알킬기, 또는 C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알케닐기로서, 선택적으로 1개 이상의 아민에 의해 치환되거나; 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티이다.
식 1A의 모든 다른 양태는 그의 모든 구체예를 포함하여, 식 1에 대해 기재된 것과 동일하다.
일부 구체예에서, 폴리머는 식 1B의 구조를 갖고:
Figure pct00023
식 중에서,
c는 0 내지 50의 정수이며;
Y는 선택적으로 존재하고 절단가능한 링커이고;
각각의 m1 및 m2은 0 내지 1000의 정수이고, 단, m1 + m2 의 합은 5보다 크며;
각각의 n1 및 n2은 0 내지 1000의 정수이고, 단, n1 + n2의 합은 2보다 크고;
심볼 "/"는 그에 의해 분리된 단위들이 무작위로 또는 임의의 순서로 연결된다는 것을 나타내고;
R1은 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 (예를 들면, C1-C8, C1-C6, 또는 C1-C3) 알킬 또는 헤테로알킬기, C2-C12 (예를 들면, C2-C8, C2-C6, 또는 C2-C3) 알케닐기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알킬기, 또는 C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알케닐기이며, 선택적으로 1개 이상의 치환기에 의해 치환되고; 및
R6은 수소, 아미노기, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 (예를 들면, C1-C8, C1-C6, 또는 C1-C3) 알킬 또는 헤테로알킬기, C2-C12 (예를 들면, C2-C8, C2-C6, 또는 C2-C3) 알케닐기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알킬기, 또는 C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알케닐기로서, 선택적으로 1개 이상의 아민에 의해 치환되거나; 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티이다.
식 1B의 모든 다른 양태는 그의 모든 구체예를 포함하여, 식 1 및 식 4에 대해 기재된 것과 동일하다.
일부 구체예에서, 폴리머는 식 1C의 구조를 갖고:
Figure pct00024
식 중에서,
각각의 m1 및 m2은 0 내지 1000의 정수이고, 단, m1 + m2 의 합은 5보다 크며;
각각의 n1 및 n2은 0 내지 1000의 정수이고, 단, n1 + n2의 합은 2보다 크고;
심볼 "/"는 그에 의해 분리된 단위들이 무작위로 또는 임의의 순서로 연결된다는 것을 나타내고;
R1은 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 (예를 들면, C1-C8, C1-C6, 또는 C1-C3) 알킬 또는 헤테로알킬기, C2-C12 (예를 들면, C2-C8, C2-C6, 또는 C2-C3) 알케닐기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알킬기, 또는 C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알케닐기이며, 선택적으로 1개 이상의 치환기에 의해 치환되고; 및
R6은 수소, 아미노기, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 (예를 들면, C1-C8, C1-C6, 또는 C1-C3) 알킬 또는 헤테로알킬기, C2-C12 (예를 들면, C2-C8, C2-C6, 또는 C2-C3) 알케닐기, C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알킬기, 또는 C3-C12 (예를 들면, C3-C8, C3-C6, 또는 C3-C5) 시클로알케닐기로서, 선택적으로 1개 이상의 아민에 의해 치환되거나; 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티이다.
식 1C의 모든 다른 양태는 그의 모든 구체예를 포함하여, 식 1 및 식 4에 대해 기재된 것과 동일하다.
일부 구체예에서, R1 및/또는 R6은 C1-C12 알킬 (예를 들면, C1-C10 알킬기; C1-C8 알킬기; C1-C6 알킬기; C1-C4 알킬기, C1-C3 알킬기, 또는 C1 또는 C2 알킬기)이고, 이들은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 선택적으로 1개 이상의 치환기에 의해 치환된다. 특정한 구체예에서, 헤테로알킬 또는 알킬기는 1개 이상의 아민, 예를 들면, 2개 내지 8개(즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개)의 삼차 아민을 포함하거나, 그에 의해 치환된다. 삼차 아민은 헤테로알킬 백본 사슬의 일부 또는 펜던트 치환기일 수 있다.
상기 폴리머는, 폴리머가 전술된 폴리머 구조를 포함하는 한, 임의의 적합한 폴리머일 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리머는 식 1의 구조를 갖는 폴리머 블록, 및 하나 이상의 다른 폴리머 블록 (예를 들어, 에틸렌 옥사이드 서브유닛, 또는 프로필렌 옥사이드 서브유닛)을 포함하는 블록 코폴리머이다. 다른 구체예에서, 식 1의 구조는 폴리머의 유일한 폴리머 단위이며, 이는 적합한 말단 기를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리머는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티를 포함하는 치환기를 더로 포함한다.
일부 구체예에서, 폴리머는 식 5A의 구조를 갖고:
Figure pct00025
식 중에서,
Q는 식:
Figure pct00026
이고,
c는 2 내지 200 (예를 들면, 2 내지 150, 2 내지 100, 2 내지 50, 10 내지 200, 10 내지 150, 10 내지 100, 10 내지 50, 25 내지 200, 25 내지 150, 25 내지 100, 25 내지 50, 50 내지 200, 50 내지 150, 또는 50 내지 100)의 정수이며;
Y는 선택적으로 존재하고 절단가능한 링커이고;
모든 다른 치환기는 그들의 모든 구체예를 포함하여, 식 1, 1A 내지 1C, 및 4에 대해 기재된 바와 같다.
일부 구체예에서, 폴리머는 식 5B의 구조를 갖고:
Figure pct00027
식 중에서,
c는 2 내지 200 (예를 들면, 2 내지 150, 2 내지 100, 2 내지 50, 10 내지 200, 10 내지 150, 10 내지 100, 10 내지 50, 25 내지 200, 25 내지 150, 25 내지 100, 25 내지 50, 50 내지 200, 50 내지 150, 또는 50 내지 100)의 정수이고;
Y는 선택적으로 존재하고 절단가능한 링커이며;
모든 다른 치환기는 그들의 모든 구체예를 포함하여, 식 1, 1A 내지 1C, 및 4에 대해 기재된 바와 같다.
본 명세서에서 제공되는 폴리머의 비-한정적 예는 예를 들면, 하기를 포함하고:
Figure pct00028
폴리머 1,
Figure pct00029
폴리머 2,
Figure pct00030
폴리머 3,
Figure pct00031
폴리머 4,
Figure pct00032
폴리머 5,
Figure pct00033
폴리머 6,
Figure pct00034
폴리머 7,
Figure pct00035
폴리머 8,
Figure pct00036
폴리머 9,
Figure pct00037
폴리머 10,
Figure pct00038
폴리머 11,
Figure pct00039
폴리머 12,
Figure pct00040
폴리머 13,
Figure pct00041
폴리머 14,
Figure pct00042
폴리머 15,
Figure pct00043
폴리머 16,
Figure pct00044
폴리머 17,
Figure pct00045
폴리머 18,
Figure pct00046
폴리머 19,
Figure pct00047
폴리머 20,
Figure pct00048
폴리머 21,
Figure pct00049
폴리머 22,
Figure pct00050
폴리머 23,
Figure pct00051
폴리머 24,
Figure pct00052
폴리머 25,
Figure pct00053
폴리머 26,
Figure pct00054
폴리머 27,
Figure pct00055
폴리머 28,
Figure pct00056
폴리머 29,
Figure pct00057
폴리머 30,
Figure pct00058
폴리머 31,
Figure pct00059
폴리머 32,
Figure pct00060
폴리머 33,
Figure pct00061
폴리머 34,
Figure pct00062
폴리머 35,
Figure pct00063
폴리머 36,
식 중에서, (a+b)는 약 5 내지 약 65 (예를 들면, 약 5 내지 약 50, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 30, 약 5 내지 약 20, 또는 약 5 내지 약 10)이고 (c+d)는 약 2 내지 약 60 (예를 들면, 약 2 내지 약 50, 약 2 내지 약 40, 약 2 내지 약 30, 약 2 내지 약 20, 또는 약 2 내지 약 10)이다. 다른 구체예에서, (a+b)는 약 45이고 (c+d)는 약 20이다. 다시, 이들 예시적인 폴리머에서 단위의 개수 ("a", "b", "c" 및 "d")의 표시가 블록 공폴리머 구조를 의미하지는 않는다; 오히려 이 숫자는 전체 단위의 개수를 나타내며, 단위들은 식에서 심볼 "/"로 표시된 바대로 무작위로 배열될 수 있다.
본 개시에 의해 제공되는 폴리머(예를 들면, 이온성 기 또는 이온화 가능한 기를 갖는 폴리머)의 추가적인 특정한 예는 하기를 더 포함한다:
Figure pct00064
폴리머 37,
Figure pct00065
폴리머 38,
Figure pct00066
폴리머 39,
Figure pct00067
폴리머 40,
Figure pct00068
폴리머 41,
Figure pct00069
폴리머 42,
Figure pct00070
폴리머 43,
Figure pct00071
폴리머 44,
Figure pct00072
폴리머 45,
Figure pct00073
폴리머 46,
Figure pct00074
폴리머 47,
Figure pct00075
폴리머 48,
Figure pct00076
폴리머 49,
Figure pct00077
폴리머 50,
Figure pct00078
폴리머 51,
Figure pct00079
폴리머 52,
Figure pct00080
폴리머 53,
Figure pct00081
폴리머 54,
Figure pct00082
폴리머 55,
Figure pct00083
폴리머 56,
Figure pct00084
폴리머 57,
Figure pct00085
폴리머 58,
Figure pct00086
폴리머 59,
Figure pct00087
폴리머 60,
Figure pct00088
폴리머 61,
Figure pct00089
폴리머 62,
Figure pct00090
폴리머 63,
Figure pct00091
폴리머 64,
Figure pct00092
폴리머 65,
Figure pct00093
폴리머 66,
Figure pct00094
폴리머 67.
PEG 말단기를 포함하는, 본 명세서에서 제공되는 폴리머의 추가적 예는 하기와 같다:
Figure pct00095
폴리머 68, 또는
Figure pct00096
폴리머 69.
이러한 예시적 폴리머에서 단위의 개수의 표시 ("a", "b", "c", 및 "d")는 블록 코-폴리머 구조를 의미하지 않고; 오히려, 이러한 숫자는 특정한 단량체 단위의 총 개수를 나타내고, 단량체의 블록 또는 폴리머 전체에 무작위로 배열된 단량체들을 포함한 이들 단위는 임의의 순서로 배열될 수 있다. 전부는 아니나, 일부 경우에, 이는 추가적으로 식 중에서 "/" 심볼에 의해 표시되고; 그러나, "/"의 부재가 폴리머가 특정한 순서로 연결된다는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 안된다. 전술된 폴리머 1 내지 69의 일부 구체예에서, 괄호 및 정수("a", "b", "c", 또는 "d")로 표시된 단량체는 무작위로 배열되거나 또는 폴리머 전체에 점재된다.
전술된 폴리머에서, (a+b)는 약 5 내지 약 65(예를 들면, 약 5 내지 약 50, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 30, 약 5 내지 약 20, 또는 약 5 내지 약 10)이고, (c+d)는 약 2 내지 약 60 (예를 들면, 약 2 내지 약 50, 약 2 내지 약 40, 약 2 내지 약 30, 약 2 내지 약 20, 또는 약 2 내지 약 10)이다. 특정한 구체예에서, (a+b)는 약 55이고, (c+d)는 약 10이다. 다른 구체예에서, (a+b)는 약 45이고, (c+d)는 약 20이다. 특정한 구체예에서, (a+b+c+d)는 약 10-500, 예를 들면, 약 10-400, 약 10-200, 또는 약 10-100 (예를 들면, 약 25-100 또는 약 50-75)이다.
폴리머는 (a+b) 대 (c+d)의 적절한 비율을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (a+b)는 폴리머 단위의 총 개수(a+b+c+d)의 10-95% (예를 들면, 10-75%, 10-65%, 10-50%, 20-95%, 20-75%, 20-65%, 20-50%, 30-95%, 30-75%, 30-65%, 또는 30-50%)의 범위이다. 다른 구체예에서, (c+d)는 폴리머 단위의 총 개수(a+b+c+d)의 5-90% (예를 들면, 5-75%, 5-65%, 5-50%, 5-40%, 5-30%, 10-90%, 10-75%, 10-65%, 10-50%, 10-40%, 또는 10-30%)의 범위이다. 또 다른 구체예에서, (a+b):(c+d)의 비는 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 5, 약 5 내지 약 25, 약 10 내지 약 25, 또는 약 15 내지 약 25일 수 있다.
전술된 폴리머의 일부는 이온화 가능한 곁사슬을 갖는 단량체 "e" 및 "f"를 포함하고, 이 경우, a, b, c, 및 d는 전술된 바와 같고, (e+f)는 약 2 내지 약 60 (예를 들면, 약 2 내지 약 50, 약 2 내지 약 40, 약 2 내지 약 30, 약 2 내지 약 20, 또는 약 2 내지 약 10)이다. 또한, 각 경우의 p는 독립적으로 2 내지 200 (예를 들면, 2 내지 150, 2 내지 100, 2 내지 50, 10 내지 200, 10 내지 150, 10 내지 100, 10 내지 50, 25 내지 200, 25 내지 150, 25 내지 100, 25 내지 50, 50 내지 200, 50 내지 150, 또는 50 내지 100)의 정수이다. 또한, (a+b+c+d+e+f)는 약 10-500, 예를 들면, 약 10-400, 약 10-200, 또는 약 10-100 (예를 들면, 약 25-100 또는 약 50-75)이다. 다시, 이러한 예시적 폴리머에서 단위의 개수의 표시("a", "b", "c", "d," "e," 및 "f")는 블록 코-폴리머 구조를 의미하지 않고; 오히려, 이러한 숫자는 단위의 총 개수를 나타내고, 단위들은 무작위로 배열될 수 있다.
본 개시에 의해 제공되는 폴리머의 전술된 특정한 예들 중 일부는 특정한 말단기(예를 들면, 알킬아미노, 수소, 또는 PEG)를 갖는 것으로 표현되나; 전술된 특정한 구조들은 상이한 말단기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 전술된 구조들은 폴리머 백본의 일 말단 또는 양 말단에 본 명세서에 기재된 R1, R6, 또는 Q 기를 포함한다.
전술된 폴리머는 모두 기재된 식에 표시된 위치에 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티를 포함할 수 있거나, 또는 상기 폴리머는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티를 포함도록 달리 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 모이어티가 폴리머의 말단에 첨가되거나, 또는 A1, A2, B1, 및/또는 B2 기의 말단 아민이 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티를 부착하기 위해 (예를 들면, 마이클 부가 반응, 에폭시드 개환, 치환 반응, 또는 기타 적절한 기법에 의해) 변형될 수 있다. 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티는 임의의 소분자, 단백질 (예를 들어, 항체 또는 항원), 아미노산 서열, 당, 올리고뉴클레오티드, 금속 기반 나노입자, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 주어진 표적 조직 또는 세포를 인식할(예를 들어, 특이적으로 결합할) 수 있다 (예를 들어, 표적 조직 또는 세포와 기타 비표적 조직 또는 세포를 표적화 모이어티가 구별할 수 있게 하는 특정 리간드, 수용체, 또는 다른 단백질 또는 분자에 특이적으로 결합함). 일부 구체예에서, 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티는 리간드에 대한 수용체이다. 일부 구체예에서, 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티는 수용체에 대한 리간드이다.
조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티는 임의의 원하는 조직 또는 세포 유형을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티는 폴리머를 개체의 말초 신경계, 중추 신경계, 간, 근육 (예를 들어, 심장 근육), 폐, 뼈 (예를 들어, 조혈 세포), 또는 눈의 조직에 국재화시킨다. 특정 구체예에서, 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티는 폴리머를 종양 세포에 국재화시킨다. 예를 들어, 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티는 특정된 조직 또는 세포의 수용체에 결합하는 당일 수 있다.
일부 구체예에서, 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티는:
Figure pct00097
;
Figure pct00098
;
Figure pct00099
;
Figure pct00100
;
Figure pct00101
;
Figure pct00102
; 또는
Figure pct00103
이고,
식 중에서, 각각의 R9, R10, R11, 및 R12은 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C4 알킬, 또는 C1-C4 알콕시이고, 선택적으로 1개 이상의 아미노기에 의해 치환된다. 특정된 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티는 본 명세서에 기재된 조직에 폴리머를 국재화시키기 위해 선택될 수 있다. 예를 들면, 알파-d-만노오스는 폴리머를 말초신경계, 중추신경계 또는 면역 세포로 국재화시키기 위해 사용될 수 있고, 알파-d-갈락토오스 및 N-아세틸갈락토사민은 폴리머를 간의 간세포에 국재화시키기 위해 사용될 수 있으며, 폴산은 폴리머를 종양 세포에 국재화시키기 위해 사용될 수 있다.
전형적으로는 폴리머는 양이온성 (즉, pH 7 및 23℃에서 양으로 하전됨)이다. 본 명세서에 사용된, "양이온성(cationic)" 폴리머는 폴리머가 양이온성 단량체 단위만을 포함하거나 양이온성 단량체 단위와 비이온성 또는 음이온성 단량체 단위의 조합을 포함하는지 여부에 관계 없이 전체 순 양전하를 갖는 폴리머를 지칭한다.
특정 구체예에서, 폴리머는 약 5 kDa 내지 약 2000 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는다. 폴리머는 약 2,000 kDa 이하, 예를 들어 약 1,800 kDa 이하, 약 1,600 kDa 이하, 약 1,400 kDa 이하, 약 1,200 kDa 이하, 약 1,000 kDa 이하, 약 900 kDa 이하, 약 800 kDa 이하, 약 700 kDa 이하, 약 600 kDa 이하, 약 500 kDa 이하, 약 100 kDa 이하, 또는 약 50 kDa 이하의 중량 평균 분자량을 갖는다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 폴리머는 약 10 kDa 이상, 예를 들어 약 50 kDa 이상, 약 100 kDa 이상, 약 200 kDa 이상, 약 300 kDa 이상, 또는 약 400 kDa 이상의 중량 평균 분자량을 갖는다. 따라서, 폴리머는 전술한 종점 중 임의의 2 개에 의해 한정되는 중량 평균 분자량을 가질 수 있다. 예를 들어, 폴리머는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 약 10 kDa 내지 약 50 kDa, 약 10 kDa 내지 약 100 kDa, 약 10 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 약 300 kDa 내지 약 500 kDa, 약 400 kDa 내지 약 500 kDa, 약 400 kDa 내지 약 600 kDa, 약 400 kDa 내지 약 700 kDa, 약 400 kDa 내지 약 800 kDa, 약 400 kDa 내지 약 900 kDa, 약 400 kDa 내지 약 1,000 kDa, 약 400 kDa 내지 약 1,200 kDa, 약 400 kDa 내지 약 1,400 kDa, 약 400 kDa 내지 약 1,600 kDa, 약 400 kDa 내지 약 1,800 kDa, 약 400 kDa 내지 약 2,000 kDa, 약 200 kDa 내지 약 2,000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 2,000 kDa, 또는 약 800 kDa 내지 약 2,000 kDa의 중량 평균 분자량을 가질 수 있다.
중량 평균 분자량은 임의의 적절한 기법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 중량 평균 분자량은 TSKgel Guard, GMPW, GMPW, G1000PW 및 Waters 2414 (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) 굴절지수 검출기에서 선택된, 컬럼이 장착된 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 또한 중량 평균 분자량은 150-875,000 달톤 범위의 폴리에틸렌 옥사이드/폴리에틸렌 글리콜 표준을 이용한 보정(calibration)으로부터 결정된다.
제조 방법
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 폴리머를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하기 식 4의 폴리머를:
Figure pct00104
식 4
하기 식 2 또는 식 3의 구조를 포함하는 폴리머로부터 제조하는 단계를 포함하고:
Figure pct00105
Figure pct00106
식 2 또는 식 3
식 중에서,
p1는 1 내지 2000(예를 들면, 1 내지 1000, 1 내지 500, 1 내지 200, 1 내지 100, 5 내지 2000, 5 내지 1000, 5 내지 500, 5 내지 200, 또는 5 내지 100)의 정수이고;
p2는 1 내지 2000(예를 들면, 1 내지 1000, 1 내지 500, 1 내지 200, 1 내지 100, 2 내지 2000, 2 내지 1000, 2 내지 500, 2 내지 200, 또는 2 내지 100)의 정수이며;
각 R3은 독립적으로 메틸렌 또는 에틸렌기이고;
X1 및 X2는 식 1, 1A 내지 1C, 및 4의 폴리머에 대해 전술된 바와 같다. 따라서, 예를 들면, 각 X1은 독립적으로 ―C(O)O―, ―C(O)NR13―, ―C(O)―, ―S(O)(O)―, 또는 결합이고; 각각의 X2는 독립적으로 C1-C12 알킬 또는 헤테로알킬기, C3-C12 시클로알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 선택적으로 하나 이상의 치환기에 의해 치환된다. 식 1, 1A 내지 1C, 및 4에 대해 전술된 X1 및 X2의 모든 다른 구체예가 식 2 및 식 3의 X1 및 X2에도 적용된다.
상기 방법은 식 2 또는 식 3의 구조를 식 HNR13A1 및/또는 HNR13A2의 화합물 및 선택적으로 식 H2NX2 또는 HOX2의 화합물과 조합시키는 단계를 포함한다. 보다 구체적으로, 식 2의 구조를 (a) 식 HNR13A1 및/또는 HNR13A2의 화합물 및 (b) 식 H2NX2 또는 HOX2의 화합물과 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 조합하여(반응시켜) 식 4의 화합물을 제공할 수 있다. 유사하게, 식 4의 화합물을 제공하기 위해, 이미 X2 기를 포함하는 식 3의 화합물을 식 HNR13A1 및/또는 HNR13A2의 화합물과 조합할(반응시킬) 수 있다.
HNR13A1 및/또는 HNR13A2의 화합물에서, 각각의 R13은, 그의 모든 구체예를 포함하여, 식 1, 1A-1C, 및 4의 폴리머에 대해 전술된 바와 같다. 따라서, 예를 들면, 각각의 R13은 독립적으로 수소, 아릴기, 헤테로고리기, 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기일 수 있고, 이들은 선택적으로 1개 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있다.
유사하게, A1 및 A2는 식 1, 1A 내지 1C, 및 4의 폴리머에 대해 전술된 바와 같다. 따라서, 예를 들면, A1 및 A2는 각각 독립적으로 식:
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2 2]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2R2}; 또는
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2 2]2}2의 기이고,
식 중에서, p1 내지 p4, q1 내지 q6, r1 및 r2, 및 s1 내지 s4 는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; 각각의 R2 은 독립적으로 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기, 또는 1개 이상의 치환기에 의해 치환된 C1-C12 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이거나, 또는 R2은 또 다른 R2와 결합되어 헤테로고리기를 형성한다. 일부 구체예에서, A1와 A2는 동일하다.
식 H2NX2 또는 HOX2의 화합물의 X2기는 그의 모든 구체예를 포함하여, 식 1, 1A-1C, 3, 및 4에 대해 기재된 것과 같다.
식 2, 3, 및 4의 모든 다른 치환기 및 양태는 그의 모든 구체예를 포함하여, 본 발명의 폴리머(예를 들면, 식 1, 1A, 1B, 1C, 및 4)에 대해 본 명세서에 기재된 것과 같다.
HNR13A1 및/또는 HNR13A2 및 식 H2NX2 또는 HOX2의 화합물을 원하는 치환도에 따라 적절한 방식 및 양으로 식 2 또는 3의 화합물에 첨가할 수 있다. 일부 구체예에서, 약 1-400 당량(equivalents) (예를 들면, 약 1-350, 1-300, 1-250, 1-200, 1-150, 1-100, 1-50, 10-400, 10-350, 10-300, 10-250, 10-200, 10-150, 10-100, 10-50, 20-400, 20-350, 20-300, 20-250, 20-200, 20-150, 20-100, 20-50, 30-400, 30-350, 30-300, 30-250, 30-200, 30-150, 30-100, 30-50, 40-400, 40-350, 40-300, 40-250, 40-200, 40-150, 40-100, 40-50, 50-400, 50-350, 50-300, 50-250, 50-200, 50-150, 또는 50-100 당량)의 식 H2NX2 또는 HOX2의 화합물을 식 2의 폴리머에 첨가한다. 일부 구체예에서, 약 1-400 당량 (예를 들면, 약 1-350, 1-300, 1-250, 1-200, 1-150, 1-100, 1-50, 10-400, 10-350, 10-300, 10-250, 10-200, 10-150, 10-100, 10-50, 20-400, 20-350, 20-300, 20-250, 20-200, 20-150, 20-100, 20-50, 30-400, 30-350, 30-300, 30-250, 30-200, 30-150, 30-100, 30-50, 40-400, 40-350, 40-300, 40-250, 40-200, 40-150, 40-100, 40-50, 50-400, 50-350, 50-300, 50-250, 50-200, 50-150, 또는 50-100 당량)의 식 HNR13A1 및/또는 HNR13A2의 화합물을 식 2 또는 식 3의 폴리머에 첨가한다.
상기 방법이 식 HNR13A1 및/또는 HNR13A2의 화합물 및 식 H2NX2 또는 HOX2의 화합물을 식 2의 폴리머에 첨가하는 단계를 포함하는 것인 구체예에서, 식 HNR13A1 및/또는 HNR13A2의 화합물 및 식 H2NX2 또는 HOX2의 화합물은 임의의 적절한 비율로 반응 혼합물에 존재할 수 있다. 예를 들면, 식 HNR13A1 및/또는 HNR13A2의 화합물 및 식 H2NX2 또는 HOX2의 화합물은 약 150:1 내지 약 1:150의 몰비로 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 약 150:1 내지 약 1:1, 예를 들면, 약 50:1 내지 약 1:1 (예를 들면, 약 25:1 내지 약 1:1, 약 10:1 내지 약 1:1, 약 5:1 내지 약 1:1, 또는 약 2.5:1 내지 약 1:1)의 비가 이용된다. 다른 구체예에서, 상기 비는 약 1:150 내지 약 1:1, 예를 들면, 약 1:50 내지 약 1:1 (예를 들면, 약 1:25 내지 약 1:1, 약 1:10 내지 약 1:1, 약 1:5 내지 약 1:1, 또는 약 1:2.5 내지 약 1:1)이다. 또 다른 구체예에서, 상기 비는 약 1:10 내지 약 1:150, 약 1:40 내지 약 1:150, 또는 약 1:80 내지 약 1:150이다.
일부 구체예에서, 식 2 또는 식 3의 구조를 포함하는 폴리머는 각각 하기 식 2A 또는 식 3A의 폴리머이고:
Figure pct00107
식 2A 또는
Figure pct00108
식 3A ;
식 중에서, c, Y, R1, 및 R6은 그의 모든 구체예를 포함하여, 식 1A 및 1B의 폴리머에 대해 전술된 바와 같고; p1, p2, R3, X1, 및 X2는 식 2 및 3에 대해 전술된 바와 같다. 따라서, 예를 들면:
p1는 1 내지 2000의 정수이고;
p2는 1 내지 2000의 정수이며;
각 R3은 독립적으로 메틸렌 또는 에틸렌기이고;
각 X1은 독립적으로 ―C(O)O―, ―C(O)NR13―, ―C(O)―, ―S(O)(O)―, 또는 결합이고;
각 X2는 독립적으로 C1-C12 알킬 또는 헤테로알킬기, C3-C12 시클로알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합으로, 선택적으로 1개 이상의 치환기에 의해 치환되거나, X1 및 X2의 다른 구체예는 식 1, 1A-1C, 2, 3, 및 4에 대해 전술된 바와 같으며;
심볼 "/"는 그에 의해 분리된 단위들이 무작위로 또는 임의의 순서로 연결된다는 것을 나타내고;
c는 0 내지 50의 정수이며;
Y는 선택적으로 존재하고, 절단가능한 링커이고;
R1은 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기, 또는 1개 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된, C1-C12 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이며; 및
R6은 수소, 아미노기, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, C1-C12 헤테로알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기, 1개 이상의 아민에 의해 선택적을 치환된 C1-C12 직쇄 또는 분지쇄 알킬기; 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티이다. 식 2A 및 3A의 모든 양태는 그 외에 본 발명의 폴리머(예를 들면, 식 1, 2, 1A, 1B, 1C, 3, 및 4)에 대해 기재된 바와 같다.
특정한 구체예에서, 식 2 또는 식 3의 구조를 포함하는 폴리머는 각각 하기 식 2B 또는 식 3B의 폴리머이고:
Figure pct00109
식 2B 또는
Figure pct00110
식 3B ;
식 중에서, p1, p2, R3, X1, 및 X2는 식 2, 2A, 3, 및 3A에 대해 전술된 바와 같다. 따라서, 예를 들면,
p1는 1 내지 2000의 정수이고;
p2는 1 내지 2000의 정수이며;
각 R3은 독립적으로 메틸렌 또는 에틸렌기이고;
각 X1은 독립적으로 ―C(O)O―, ―C(O)NR13―, ―C(O)―, ―S(O)(O)―, 또는 결합이고;
각 X2는 독립적으로 C1-C12 알킬 또는 헤테로알킬기, C3-C12 시클로알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합으로, 선택적으로 1개 이상의 치환기에 의해 치환되거나, X1 및 X2의 다른 구체예는 식 1, 1A-1C, 2, 3, 및 4에 대해 전술된 바와 같으며;
심볼 "/"는 그에 의해 분리된 단위들이 무작위로 또는 임의의 순서로 연결된다는 것을 나타낸다. 식 2B 및 3B의 모든 양태는 그 외에 본 발명의 폴리머(예를 들면, 식 1, 1A, 1B, 1C, 2, 2A, 3, 3A, 및 4)에 대해 기재된 바와 같다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 식 1의 폴리머를 제조하는 방법으로서, 하기 식 4의 구조를 포함하는 폴리머의 A1 및/또는 A2 기의 적어도 일부를 변형시켜:
Figure pct00111
식 4
하기 식 1의 구조를 포함하는 폴리머를 제조하는 것을 포함하는 방법을 제공한다:
Figure pct00112
.
식 1 및 4의 폴리머의 모든 양태는 본 명세서에서 전술된 바와 같다. 따라서, 예를 들면,
각각의 m1, m2, m3, 및 m4는 0 내지 1000의 정수이고, 단, m1 + m2 + m3 + m4 는 5보다 크고;
각각의 n1 및 n2은 0 내지 1000의 정수이고, 단, n1 + n2의 합은 2보다 크며;
심볼 "/"는 그에 의해 분리된 단위들이 무작위로 또는 임의의 순서로 연결된다는 것을 나타내고;
각각의 R3a은 독립적으로 메틸렌 또는 에틸렌기이고;
각각의 R3b은 독립적으로 메틸렌 또는 에틸렌기이며;
각 X1는 독립적으로 ―C(O)O―, ―C(O)NR13―, ―C(O)―, ―S(O)(O)―, 또는 결합이고;
각각의 R13은 독립적으로 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기일 수 있고, 이들은 선택적으로 1개 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있으며;
각각의 X2는 독립적으로 C1-C12 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 이들의 조합이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 식:
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2 2]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2R2}; 또는
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2 2]2}2의 기이며,
B1 및 B2는 각각 독립적으로
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R4-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R4-R5]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R4-R5};
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R4-R5]2}2;
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-CH2-CHOH-R5]2}2;
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R5]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R5};
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R5]2}2;
―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R4-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2;
―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2,
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R5; 또는
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R4-R5이고,
식 중에서, p1 내지 p4, q1 내지 q6, r1 및 r2, 및 s1 내지 s4 는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; 각각의 R2은 독립적으로 수소, 또는 C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기이거나, 또는 R2은 또 다른 R2와 결합되어 헤테로고리기를 형성하고; 각각의 R4은 독립적으로 -C(O)O-, -C(O)NH-, -O-C(O)O-, 또는 -S(O)(O)-이며; 각각의 R5은 독립적으로 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 선택적으로 2 내지 8개의 삼차 아민, 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티를 포함하는 치환기를 포함한다. 식 1, 1A-1C, 및 4의 모든 양태는 달리, 본 명세서에 기재된 식 1, 1A-1C, 및 4의 구조의 모든 구체예를 포함하여, 본 발명의 폴리머에 대해 본 명세서에 기재된 바와 같다.
식 1 또는 식 4의 구조를 갖는 폴리머는 본 발명의 폴리머와 관련하여 기재된 그의 모든 구체예 및 식 1A, 1B, 및 1C를 포함한, 본 명세서에 기재된 폴리머일 수 있다.
식 4의 폴리머의 A1 및/또는 A2로 표시된 기는 B1 및/또는 B2로 표시된 기를 생성하기 위해 임의의 적절한 수단에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, A1 및/또는 A2로 표시된 기가 마이클 부가 반응(Michael addition reaction), 에폭시드 개환(epoxide opening), 또는 치환(displacement) 반응에 의해 변형될 수 있다. 바람직한 구체예에서, A1 및/또는 A2로 표시된 기가 마이클 부가 반응에 의해 변형될 수 있다.
일 구체예에서, 식 4의 구조를 포함하는 폴리머의 A1 및/또는 A2 기기 식 4의 구조를 포함하는 폴리머와 α,β-불포화 카르보닐 화합물 간의 마이클 부가 반응에 의해 변형된다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "마이클 부가(Michael addition)"는 α,β-불포화 카르보닐 화합물에 폴리머의 친핵체(nucelophile)(예를 들면, 탄소 음이온(carbanion), 산소 음이온, 질소 음이온, 산소 원자, 질소 원자, 또는 이들의 조합)를 부가하는 친핵성 부가(nucelophilic addition)를 의미한다. 따라서, 마이클 부가 반응은 식 4의 구조를 포함하는 폴리머와 α,β-불포화 카르보닐 화합물 간 반응이다. 일부 구체예에서, 상기 폴리머의 친핵체는 질소 음이온, 질소 원자, 또는 이들의 조합이다.
α,β-불포화 카르보닐 화합물은 친핵체로부터 마이클 부가를 수용할 수 있는 임의의 α,β-불포화 카르보닐 화합물일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 α,β-불포화 카르보닐 화합물은 아크릴레이트, 아크릴아미드, 비닐 술폰, 또는 이들의 조합이다. 따라서, 마이클 부가 반응은 식 4의 구조를 포함하는 폴리머와 아크릴레이트, 아크릴아미드, 비닐 술폰 또는 이들의 조합 간의 반응이다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 방법은 식 4의 구조를 포함하는 폴리머와 아크릴레이트를 접촉시키는 단계; 상기 식 4의 구조를 포함하는 폴리머와 아크릴아미드를 접촉시키는 단계; 또는 식 4의 구조를 포함하는 폴리머와 비닐 술폰을 접촉시키는 단계를 포함한다.
A1 및/또는 A2로 표시된 기가 마이클 부가 반응에 의해 변형되는 것인 구체예에서, 그들은 하기 식의 B1 및/또는 B2로 표시된 기를 생성하고:
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R4-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R4-R5]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R4-R5};
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R4-R5]2}2; 또는
―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R4-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2;
식 중에서, p1 내지 p4, q1 내지 q6, r1 및 r2, 및 s1 내지 s4 는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; 각각의 R2은 독립적으로 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기, 또는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된, C1-C12 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이거나, R2은 또 다른 R2와 결합되어 헤테로고리기를 형성하고; 각각의 R4은 독립적으로 -C(O)O-, -C(O)NH-, -O-C(O)O-, 또는 -S(O)(O)-이며; 각각의 R5은 독립적으로 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 2 내지 8개의 삼차 아민, 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티를 포함하는 치환기를 선택적으로 포함한다.
사용하기에 적합한 아크릴레이트, 아크릴아미드, 및 비닐 술폰의 예는 하기 식의 아크릴레이트를 포함하고:
Figure pct00113
,
Figure pct00114
, 및
Figure pct00115
식 중에서, R5은 식 1, 1A, 1B, 또는 1C에 대해 기술된 바와 같다.
일부 구체예에서, 마이클 부가 반응은 산 및/또는 염기에 의해 촉진된다. 상기 산 및/또는 염기는 적절한 pKa를 갖는 임의의 적절한 산 및/또는 염기일 수 있다. 상기 산 및/또는 염기는 유기 산 (예를 들면, p-톨루엔술폰산), 유기 염기 (예를 들면, 트리에틸아민), 무기 산 (예를 들면, 사염화 티타늄), 무기 염기 (예를 들면, 탄산칼륨), 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구체예에서, 마이클 부가 반응은 산에 의해 촉진된다. 산은 브뢴스테드 산(Brønsted acid) 또는 루이스 산(Lewis acid)일 수 있다. 산이 브뢴스테드 산인 구체예에서, 상기 산은 약산 (즉, 약 4 내지 약 7의 pKa) 또는 강산 (즉, 약 -2 내지 약 4의 pKa)일 수 있다. 일반적으로, 상기 산은 약산이다. 특정한 구체예에서, 상기 산은 루이스 산이다. 예를 들면, 상기 산은 비스(트리플루오로메탄술폰)이미드 또는 p-톨루엔술폰산일 수 있다.
일부 구체예에서, 마이클 부가 반응은 염기에 의해 촉진된다. 상기 염기는 약 염기(즉, 즉, 약 7 내지 약 12의 pKa) 또는 강 염기(즉, 즉, 약 12 내지 약 50의 pKa)일 수 있다. 일반적으로, 상기 염기는 약 염기이다. 예를 들면, 상기 염기는 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 피리딘, N-메틸 모르폴린, 또는 N,N-디메틸-피페라진, 또는 그의 유도체일 수 있다.
일부 구체예에서, 마이클 부가 반응은 용매에서 수행된다. 상기 용매는 반응할 폴리머와 α,β-불포화 카르보닐 화합물을 가용화시킬 수 있는 임의의 적합한 용매, 또는 용매의 혼합물일 수 있다. 예를 들면, 상기 용매는 물, 양성자성 유기 용매, 및/또는 비양성자성(aprotic) 유기 용매를 포함할 수 있다. 용매의 예시적 목록은 물, 디클로로메탄, 디에틸 에테르, 디메틸 술폭시드, 아세토니트릴, 메탄올, 및 에탄올을 포함한다.
일 구체예에서, 폴리머의 A1 및/또는 A2기는 상기 폴리머와 에폭시드 화합물 간의 에폭시드 개환 반응에 의해 변형된다. 본 명세서에서 사용된, "에폭시드 개환(epoxide opening)"은 폴리머의 친핵체(예를 들면, 탄소 음이온, 산소 음이온, 질소 음이온, 산소 원자, 질소 원자, 또는 이들의 조합)를 에폭시드 화합물에 부가하여, 상기 에폭시드를 개환시키는 친핵성 부가를 의미한다. 따라서, 에폭시드 개환 반응은 상기 폴리머와 에폭시드 화합물 간에 일어난다. 일부 구체예에서, 상기 폴리머의 친핵체는 질소 음이온, 질소 원자, 또는 이들의 조합이다.
A1 및/또는 A2로 표시된 기가 에폭시드 개환 반응에 의해 변형되는 구체예에서, 그들은 하기 식의 B1 및/또는 B2로 표시된 기를 생성하고:
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2-CH2-CHOH-R5;
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-CH2-CHOH-R5]2}2;
식 중에서, p1 내지 p4, q1 내지 q6, r1 및 r2, 및 s1 내지 s4 는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; 각각의 R2은 독립적으로 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기, 또는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된, C1-C12 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이거나, R2은 또 다른 R2와 결합되어 헤테로고리기를 형성하고; 각각의 R5은 독립적으로 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 2 내지 8개의 삼차 아민, 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티를 포함하는 치환기를 선택적으로 포함한다.
사용하기에 적합한 에폭시드의 예는 하기 식의 에폭시드를 포함하고:
Figure pct00116
,
식 중에서, R5은 식 1, 1A, 1B, 또는 1C에 대해 기술된 바와 같다.
일부 구체예에서, 에폭시드 개환 반응은 산 및/또는 염기에 의해 촉진된다. 산 및/또는 염기는 임의의 적합한 pKa를 갖는 임의의 적합한 산 및/또는 염기일 수 있다. 산 및/또는 염기는 유기산 (예를 들어, p-톨루엔술폰산), 유기 염기 (예를 들어, 트리에틸아민), 무기산 (예를 들어, 티타늄 사염화물), 무기 염기 (예를 들어, 탄산 칼륨), 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구체예에서, 에폭시드 개환 반응은 산에 의해 촉진된다. 산은 브뢴스테드산 또는 루이스 산일 수 있다. 산이 브뢴스테드산인 구체예에서, 산은 약산 (즉, 약 4 내지 약 7의 pKa) 또는 강산 (즉, 약 -2 내지 약 4의 pKa) 일 수 있다. 전형적으로는 산은 약산이다. 특정 구체예에서, 산은 루이스 산이다. 예를 들어, 산은 비스(트리플루오로메탄술폰)이미드 또는 p-톨루엔술폰산일 수 있다.
일부 구체예에서, 에폭시드 개환 반응은 염기에 의해 촉진된다. 염기는 약 염기 (즉, 약 7 내지 약 12의 pKa) 또는 강염기 (즉, 약 12 내지 약 50의 pKa) 일 수 있다. 일반적으로 염기는 약염기이다. 예를 들어, 염기는 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 피리딘, N-메틸 모르폴린, 또는 N,N-디메틸-피페라진, 또는 이들의 유도체일 수 있다.
일부 구체예에서, 에폭시드 개환 반응은 용매 내에서 수행된다. 용매는 반응 할 폴리머 및 에폭시드 화합물을 가용화할 수 있는, 임의의 적합한 용매 또는 용매의 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 용매는 물, 양성자성 유기 용매 및/또는 비양성자성 유기 용매를 포함할 수 있다. 용매의 예시적 목록에는 물, 디클로로메탄, 디에틸 에테르, 디메틸 술폭시드, 아세토니트릴, 메탄올, 및 에탄올이 포함된다.
일 구체예에서, 폴리머의 A1 및/또는 A2기는 폴리머와 이탈기를 포함하는 화합물 (예를 들어, 염화물 원자, 브롬화물 원자, 요오드화물 원자, 토실레이트, 트리플레이트, 메실레이트 등) 사이의 치환 반응에 의해 개질된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "치환(displacement)"은 폴리머의 친핵체(예를 들어, 탄소 음이온, 산소 음이온, 질소 음이온, 산소 원자, 질소 원자 또는 이들의 조합)를 이탈기를 포함하는 화합물에 부가하는 친핵성 부가를 의미한다. 따라서, 치환 반응은 폴리머와 이탈기를 포함하는 화합물 사이에 일어난다. 일부 구체예에서, 폴리머의 친핵체는 질소 음이온, 질소 원자, 또는 이들의 조합이다.
A1 및/또는 A2로 표시된 기가 치환(displacement) 반응에 의해 변형되는 구체예에서, 그들은 하기 식의 B1 및/또는 B2로 표시된 기를 생성하고:
―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R5;
―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R5]2;
―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R5};
―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R5]2}2; 또는
―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2,
식 중에서, p1 내지 p4, q1 내지 q6, r1 및 r2, 및 s1 내지 s4 는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; 각각의 R2은 독립적으로 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기, 또는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된, C1-C12 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이거나, R2은 또 다른 R2와 결합되어 헤테로고리기를 형성하고; 각각의 R5은 독립적으로 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 2 내지 8개의 삼차 아민, 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티를 포함하는 치환기를 선택적으로 포함한다.
사용하기에 적합한 이탈기의 예는 하기 식의 화합물을 포함하고:
Figure pct00117
,
식 중에서, LG는 이탈기(예를 들면, 염화물 원자, 브롬화물 원자, 요오드화물 원자, 토실레이트, 트리플레이트, 메실레이트, 등)이고, R5은 식 1, 1A, 1B, 또는 1C에 대해 기재된 바와 같다.
일부 구체예에서, 치환 반응은 산 및/또는 염기에 의해 촉진된다. 산 및/또는 염기는 임의의 적합한 pKa를 갖는 임의의 적합한 산 및/또는 염기일 수 있다. 산 및/또는 염기는 유기산 (예를 들어, p-톨루엔술폰산), 유기 염기 (예를 들어, 트리에틸아민), 무기산 (예를 들어, 티타늄 사염화물), 무기 염기 (예를 들어, 탄산 칼륨), 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구체예에서, 치환 반응은 산에 의해 촉진된다. 산은 브뢴스테드산 또는 루이스 산일 수 있다. 산이 브뢴스테드산인 구체예에서, 상기 산은 약산 (즉, 약 4 내지 약 7의 pKa) 또는 강산 (즉, 약 -2 내지 약 4의 pKa) 일 수 있다. 일반적으로, 산은 약산이다. 특정 구체예에서, 산은 루이스 산이다. 예를 들어, 산은 비스(트리플루오로메탄술폰)이미드 또는 p-톨루엔술폰산일 수 있다.
일부 구체예에서, 치환 반응은 염기에 의해 촉진된다. 염기는 약 염기 (즉, 약 7 내지 약 12의 pKa) 또는 강염기 (즉, 약 12 내지 약 50의 pKa) 일 수 있다. 일반적으로 염기는 약염기이다. 예를 들어, 염기는 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 피리딘, N-메틸 모르폴린, 또는 N,N-디메틸-피페라진, 또는 이들의 유도체일 수 있다.
일부 구체예에서, 치환 반응은 용매에서 수행된다. 상기 용매는 상기 화합물 및 반응할 이탈기를 포함하는 화합물을 가용화시킬 수 있는, 임의의 적절한 용매, 또는 용매의 혼합물일 수 있다. 예를 들면, 상기 용매는 물, 양성자성 유기 용매, 및/또는 비양성자성(aprotic) 유기 용매를 포함할 수 있다. 용매의 예시적 목록은 물, 디클로로메탄, 디에틸 에테르, 디메틸 술폭시드, 아세토니트릴, 메탄올 및 에탄올을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 식 1의 구조를 포함하는 폴리머를 단리하는 단계를 더 포함한다. 상기 식 1의 구조를 포함하는 폴리머는 적절한 수단에 의해 단리될 수 있다. 예를 들면, 상기 식 1의 구조를 포함하는 폴리머는 추출, 결정화, 재결정화, 컬럼 크로마토그래피, 여과, 또는 이들의 조합에 의해 단리될 수 있다.
조성물
본 명세서에서 제공되는 폴리머는 임의의 목적으로 사용될 수 있다. 그러나, 상기 폴리머는 핵산 및/또는 폴리펩티드 (예를 들어, 단백질)를 세포에 전달하는데에 특히 유용한 것으로 여겨진다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리머 및 핵산 및/또는 폴리펩티드 (예를 들어, 단백질)를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공된다.
일부 구체예에서, 상기 조성물은 핵산을 포함한다. 임의의 핵산을 사용할 수 있다. 핵산의 예시적 목록은 CRISPR 시스템의 가이드 및/또는 공여체 핵산, siRNA, microRNA, 간섭 RNA 또는 RNAi, dsRNA, mRNA, DNA 벡터, 리보자임, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 및 siRNA, microRNA, dsRNA, 리보자임 또는 안티센스 핵산을 코딩하는 DNA 발현 카세트가 포함한다. SiRNA는 전형적으로 15-50개 염기쌍, 바람직하게는 19-25개 염기쌍을 포함하고 세포 내에서 발현된 표적 유전자 또는 RNA와 동일하거나 거의 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 이중 가닥 구조를 포함한다. siRNA는 두 개의 어닐링된 폴리뉴클레오티드 또는 헤어핀 구조를 형성하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. MicroRNA (miRNA)는 mRNA 표적의 파괴 또는 번역 억제를 지시하는 약 22 개 뉴클레오티드 길이의 작은 비코딩 폴리뉴클레오티드이다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 유전자 또는 mRNA에 상보적인 서열을 포함한다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 모르폴리노(morpholinos), 2'-O-메틸 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 기반 발현 억제제는 인 비트로에서 중합되고, 재조합될 수 있으며, 키메라 서열, 또는 이들의 유도체를 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드-기반 발현 억제제는 표적 RNA 및/또는 유전자가 억제되도록 하는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드, 또는 임의의 적합한 조합을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 또한 핵산에 더하여 또는 핵산 대신에 전달을 위한 임의의 단백질을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 임의의 적합한 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제 ("TALEN"), 재조합효소(recombinase), 데아미나아제(deaminase), 엔도뉴클레아제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 RNA-유도 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 폴리펩티드, Cpf1 폴리펩티드, 또는 이들의 변이체) 또는 DNA 재조합효소 (예를 들어, Cre 폴리펩티드)이다.
본 명세서에서 제공되는 폴리머는 CRISPR 시스템의 하나 이상의 성분을 전달하는 데에 특히 유용하다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 조성물은 가이드 RNA, RNA-가이드 엔도뉴클레아제(RNA-guided endonuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산, 및/또는 공여체 핵산을 포함한다. 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 폴리머와 함께 1 개, 2 개 또는 3 개의 성분 모두를 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 복수의 가이드 RNA, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 이를 인코딩하는 핵산, 및/또는 공여체 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상이한 표적 부위에 대한 다수의 상이한 가이드 RNA가 포함될 수 있고, 선택적으로 다수의 상이한 공여체 핵산 및 심지어 다수의 상이한 RNA 가이드 엔도뉴클레아제 또는 이를 코딩하는 핵산과 함께 포함될 수 있다.
또한, CRISPR 시스템의 성분은 (복수의 성분이 존재할 때) 상호간에 및 폴리머와 특정 방식 또는 순서로 조합될 수 있다. 일부 구체예에서, 가이드 RNA는 폴리머와 조합되기 전에 RNA 엔도뉴클레아제와 복합체화된다. 추가적으로 또는 대신, 가이드 RNA는 폴리머와 조합하기 전에 공여체 핵산에 (공유적으로 또는 비공유적으로) 연결될 수 있다.
조성물은 임의의 특정 CRISPR 시스템 (즉, 임의의 특정 가이드 RNA, RNA-가이드 엔도뉴클레아제, 또는 공여체 핵산)에 대해 제한되지 않고, 이들 중 다수가 알려져 있다. 그럼에도 불구하고 추가적인 설명을 위해 이러한 시스템의 성분들이 하기에 설명된다.
공여체 핵산
공여체 핵산 (또는 "공여체 서열" 또는 "공여체 폴리뉴클레오티드" 또는 "공여체 DNA")은 RNA-유도 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 폴리펩티드 또는 Cpf1 폴리펩티드)에 의해 유도된 절단 부위에 삽입되는 핵산 서열이다. 공여체 폴리뉴클레오티드는 그와 상동성을 갖는 게놈 서열 사이의 상동성-유도 복구를 지원하기 위해 절단 부위에서 표적 서열, 예를 들면, 절단 부위를 플랭킹(flaking)하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 절단 부위의 약 50개 이하 염기, 예를 들면, 약 30개 이하 염기, 약 15개 이하 염기, 약 10개 이하 염기, 약 5개 이하 염기, 또는 절단 부위 바로 옆에 있는 뉴클레오티드 서열과 충분한 상동성, 예를 들어 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 상동성을 포함할 것이다. 공여체와 게놈 서열 사이의 서열 상동성은 약 25개, 50개, 100개, 또는 200개 뉴클레오티드, 또는 200개 이상 (또는 10개 내지 200개 뉴클레오티드 이상의 임의의 정수값)의 뉴클레오티드가 상동성-유도 복구(homology-directed repair)를 지원한다. 공여체 서열은 임의의 길이, 예를 들어 10개 이상의 뉴클레오티드, 50개 이상의 뉴클레오티드, 100개 이상의 뉴클레오티드, 250개 이상의 뉴클레오티드, 500개 이상의 뉴클레오티드, 1000개 이상의 뉴클레오티드, 5000개 이상의 뉴클레오티드 등일 수 있다.
공여체 서열은 일반적으로 그것이 대체하는 게놈 서열과 동일하지 않다. 오히려, 공여체 서열은 상동성-지향성 복구를 지원하기에 충분한 상동성이 존재하는 한 게놈 서열에 대해 하나 이상의 단일 염기 변경, 삽입, 결실, 역전 또는 재배열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 공여체 서열은 표적 DNA 영역과 2 개의 플래킹 서열 사이의 상동성-유도 복구가 표적 영역에서 비-상동성 서열의 삽입을 초래하도록 2 개의 상동성 영역을 플랭킹하는 비-상동성 서열을 포함한다. 공여체 서열은 또한 목적 DNA 영역과 상동성이 없고 목적 DNA 영역으로의 삽입을 의도하지 않는 서열을 포함하는 벡터 주골격을 포함할 수 있다. 일반적으로, 공여체 서열의 상동성 영역 (들)은 재조합이 요구되는 게놈 서열에 적어도 50% 서열 동일성을 가질 것이다. 특정 구체예에서, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9% 서열 동일성이 존재한다. 공여체 폴리뉴클레오티드의 길이에 따라 1% 내지 100% 서열 동일성 사이의 임의의 값이 존재할 수 있다.
공여체 서열은 게놈 서열과 비교하여 특정 서열 차이, 예를 들어 제한효소 인식 부위(restriction site), 뉴클레오티드 다형성, 선택성 마커 (예를 들어, 약물 내성 유전자, 형광 단백질, 효소 등) 등을 포함할 수 있으며, 이는 절단 부위에 공여체 서열의 삽입이 성공적인지 평가하는 데 사용될 수 있거나, 또는 일부 구체예에서 다른 목적을 위해(예를 들어, 표적화된 게놈 유전자좌에서의 발현을 나타내기 위해) 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 코딩 영역에 위치하는 경우, 이러한 뉴클레오티드 서열 차이는 아미노산 서열을 변경하지 않거나 침묵 아미노산 변경 (즉, 단백질의 구조 또는 기능에 영향을 미치지 않는 변경)을 초래할 것이다. 대안적으로, 이러한 서열 차이는 마커 서열의 제거를 위해 나중에 활성화될 수 있는, FLP, loxP 서열 등과 같은 측면(플랭킹) 재조합 서열을 포함할 수 있다.
공여체 서열은 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 DNA, 또는 이중 가닥 RNA로서 세포에 제공될 수 있다. 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여체 서열의 말단은 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 핵산말단분해에 의한 분해(exonucleolytic degradation)로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드(didexoynucleotide) 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 추가되고 및/또는 자기 상보성 올리고뉴클레오티드가 일 말단 또는 양 말단에 라이게이션된다. 예를 들어, Chang et al. (1987)proc. Natl. Acad Sci USA 84: 4959-4963; Nehls et al. (1996)science272: 886-889 참조. RCA(rolling circule amplification)와 같은 증폭 절차도 본 명세서에서 예시된 바와 같이 유리하게 사용될 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드를 분해로부터 보호하기 위한 추가적인 방법은 말단 아미노기 (들)의 첨가 및 개질된 뉴클레오티드간 결합(internucleotide linkage), 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
선형 공여체 서열의 말단을 보호하는 대안으로서, 재조합에 영향을 주지 않으면서, 분해될 수 있는 상동성 영역 외부에 추가적인 길이의 서열이 포함될 수 있다. 공여체 서열은 예를 들어 복제 원점, 프로모터 및 항생제 내성을 코딩하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 또한, Cas9 가이드 RNA 및/또는 Cas9 융합 폴리펩티드 및/또는 공여체 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산에 대해 본 명세서에 기재된 바와 같이, 공여체 서열은 노출된(naked) 핵산으로서, 리포솜 또는 폴리머와 같은 제제와 복합된 핵산으로서 도입될 수 있거나 또는 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, AAV)에 의해 전달될 수 있다.
가이드 핵산
일부 구체예에서, 조성물은 가이드 핵산을 포함한다. 본 개시의 조성물에 포함시키기에 적합한 가이드 핵산은 단일 분자 가이드 RNA ("단일 가이드(single-guide) RNA"/"sgRNA") 및 이중 분자 가이드 핵산 ("이중-가이드(dual-guide) RNA"/"dgRNA")을 포함한다.
본 개시의 복합체에 포함시키기에 적합한 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 폴리펩티드)의 활성을 표적 핵산 내의 특정 표적 서열로 유도한다. 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은: 제 1 세그먼트 (본 명세서에서 "핵산 표적화 세그먼트" 또는 단순히 "표적화 세그먼트(targeting sement)"라고도 지칭됨); 및 제 2 세그먼트 (본 명세서에서 "단백질-결합 세그먼트(protein-binding segment)"라고도 함)를 포함한다. 용어 "제 1(first)" 및 "제 2(second)"는 가이드 RNA에서 세그먼트가 나타나는 순서를 의미하지 않는다. 서로에 대한 요소의 순서는 사용되는 특정 RNA-가이드된 폴리펩티드에 따라 다르다. 예를 들어, Cas9에 대한 가이드 RNA는 일반적으로 표적화 세그먼트의 3'에 위치한 단백질-결합 세그먼트를 갖는 반면, Cpf1에 대한 가이드 RNA는 일반적으로 표적화 세그먼트의 5'에 위치한 단백질-결합 세그먼트를 갖는다.
가이드 RNA는 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우, 가이드 RNA의 말단은 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 핵산말단분해적인 분해로부터) 보호될 수 있다. RCA와 같은 증폭 절차도 본 명세서에서 예시된 바와 같이 유리하게 사용될 수 있다.
제 1 세그먼트: 표적화 세그먼트
가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)의 제 1 세그먼트는 표적 핵산의 서열 (표적 부위)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 즉, 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)의 표적화 세그먼트는 혼성화(즉, 염기쌍 형성)를 통해 서열 특이적 방식으로 표적 핵산 (예를 들어, RNA, DNA, 이중 가닥 DNA)과 상호작용할 수 있다. 따라서, 표적화 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 다양할 수 있고 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA) 및 표적 핵산이 상호 작용할 표적 핵산 내의 위치를 결정할 수 있다. 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)의 표적화 세그먼트는 표적 핵산 내의 임의의 원하는 서열 (표적 부위)에 혼성화되도록 (예를 들어, 유전 공학에 의해) 변형될 수 있다.
표적화 세그먼트는 12 개 뉴클레오티드 내지 100개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 (표적 부위)에 상보적인 표적화 세그먼트의 뉴클레오티드 서열 (표적화 서열, 가이드 서열이라고도 함)은 12 nt 이상의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산의 표적 부위에 상보적인 표적화 세그먼트의 표적화 서열은 12 nt 이상, 15 nt 이상, 17 nt 이상, 18 nt 이상, 19 nt 또는 이상, 20 nt 이상, 25 nt 이상, 30 nt 이상, 35 nt 이상 또는 40 nt의 길이를 가질 수 있다.
표적화 세그먼트의 표적화 서열 (즉, 가이드 서열)과 표적 핵산의 표적 부위 간의 퍼센트 상보성(percent complementarity)은 60% 이상 (예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%)일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적화 세그먼트의 표적화 서열과 표적 핵산의 표적 부위 사이의 퍼센트 상보성은 표적 핵산의 표적 부위의 5'에 가장 인접한 7개의 연속된 뉴클레오티드에 대해 100%이다. 일부 구체예에서, 표적화 세그먼트의 표적화 서열과 표적 핵산의 표적 부위 사이의 퍼센트 상보성은 20 개의 연속 뉴클레오티드에 걸쳐 60% 이상이다. 일부 구체예에서, 표적화 세그먼트의 표적화 서열과 표적 핵산의 표적 부위 사이의 퍼센트 상보성은 표적 핵산의 표적 부위의 5'에 가장 인접한 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속된 뉴클레오티드(5'-most)에 걸쳐 100%이며 나머지에 대해서는 0%까지 낮다. 그러한 경우, 표적화 서열은 각각 길이가 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오티드로 간주될 수 있다.
제 2 세그먼트: 단백질-결합 세그먼트
가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)의 단백질-결합 세그먼트는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제와 상호작용(결합)한다. 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 결합된 엔도뉴클레아제를 전술된 표적화 세그먼트/표적화 서열/가이드 서열을 통해 표적 핵산 (표적 부위) 내의 특정 뉴클레오티드 서열로 유도한다. 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)의 단백질-결합 세그먼트는 서로 상보적인 두 개의 뉴클레오티드의 영역(stretch)을 포함한다. 단백질-결합 세그먼트의 상보적 뉴클레오티드는 혼성화하여 이중 가닥 RNA 듀플렉스(duplex) (dsRNA)를 형성한다.
단일 및 이중 가이드 핵산
이중 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 두 개의 개별 핵산 분자를 포함한다. 특정한 이중 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)의 두 분자 각각은 두 분자의 상보적 뉴클레오티드가 혼성화하여 단백질-결합 세그멘트의 이중 가닥 RNA 듀플렉스를 형성하도록 서로 상보적인 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다.
일부 구체예에서, 활성자(activator)의 듀플렉스-형성 세그먼트는 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에 기재된 활성자(tracrRNA) 분자 중 하나, 또는 그의 상보체(complement)와 8개 이상의 연속 뉴클레오티드 (예를 들어, 8개 이상의 연속 뉴클레오티드, 10개 이상의 연속 뉴클레오티드, 12개 이상의 연속 뉴클레오티드, 15개 이상의 연속 뉴클레오티드, 또는 20개 이상의 연속 뉴클레오티드)의 영역에 걸쳐 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상 동일하거나 100% 동일하다.
일부 구체예에서, 표적자(targeter)의 듀플렉스 형성-세그먼트는 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에 기재된 표적자(crRNA) 서열 중 하나 또는 그의 상보체와 8개 이상의 연속 뉴클레오티드 (예를 들어, 8개 이상의 연속 뉴클레오티드, 10개 이상의 연속 뉴클레오티드, 12개 이상의 연속 뉴클레오티드, 15개 이상의 연속 뉴클레오티드, 또는 20개 이상의 연속 뉴클레오티드)의 영역에 걸쳐 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상 동일하거나 100% 동일하다.
이중 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 표적자와 활성자의 제어된 (즉, 조건부) 결합을 가능하게 하도록 설계될 수 있다. 이중 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 활성자 및 표적자가 모두 Cas9와 기능적 복합체로 결합되지 않는 한 기능적이지 않기 때문에, 활성제와 표적자 사이의 결합을 유도될 수 있도록 하는 것에 의해, 이중 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)이 유도성일 수 있다 (예를 들어, 약물 유도성). 하나의 비-한정적 예로서, RNA 압타머가 표적자와 활성자의 결합을 조절(즉, 제어)하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 활성자 및/또는 표적자는 RNA 압타머 서열을 포함할 수 있다.
압타머 (예를 들어, RNA 압타머)는 당해 분야에서 알려져 있으며 일반적으로 리보스위치(riboswitch)의 합성 버전이다. 용어 "RNA 압타머(RNA aptamer)" 및 "리보스위치(riboswitch)"는 그들이 그 일부인 핵산 분자 (예를 들어, RNA, DNA/RNA 하이브리드 등)의 구조 (및 따라서 특이적 서열의 이용 가능성)의 유도성 조절을 제공하는 합성 및 천연 핵산 서열을 모두 포함하기 위해 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. RNA 압타머는 일반적으로 특정 약물 (예를 들어, 소분자)에 특이적으로 결합하는 특정 구조 (예를 들어, 헤어핀)로 폴딩되는 서열을 포함한다. 약물의 결합은 RNA의 폴딩에 구조적 변화를 일으켜 압타머가 일부인 핵산의 특징을 변화시킨다. 비-한정적 예로서: (i) 압타머를 갖는 활성자는 압타머가 적절한 약물에 의해 결합되지 않는 한 동족(cognate) 표적자에 결합할 수 없고; (ii) 압타머를 갖는 표적자는 압타머가 적절한 약물에 의해 결합되지 않는 한 동족 활성자에 결합할 수 없으며, 및 (iii) 각각 상이한 약물에 결합하는 상이한 압타머를 포함하는 표적자 및 활성자는 두 약물이 모두 존재하지 않는 한 서로 결합할 수 없다. 이들 예에 의해 예시된 바와 같이, 이중 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 유도성으로 설계될 수 있다.
압타머 및 리보스위치의 예는 예를 들어 Nakamura et al., Genes Cells. 2012 May;17(5):344-64; Vavalle et al., Future Cardiol. 2012 May;8(3):371-82; Citartan et al., Biosens Bioelectron. 2012 Apr 15;34(1):1-11; 및 Liberman et al., Wiley Interdiscip Rev RNA. 2012 May-Jun;3(3):369-84에서 찾을 수 있고, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참조로서 포함된다.
이중 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)에 포함될 수 있는 뉴클레오티드 서열의 비-한정적 예는 국제특허출원 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에 포함되거나 또는 혼성화하여 단백질-결합 세그먼트를 형성할 수 있는 그의 상보체이다.
특정한(subject) 단일 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 서로 상보적이고, 혼성화하여 단백질-결합 세그먼트의 이중 가닥 RNA 듀플렉스 (dsRNA 듀플렉스)를 형성하고(따라서 스템-루프 구조를 생성함), 개재(intervening) 뉴클레오티드 ("링커" 또는 "링커 뉴클레오티드")에 의해 공유적으로 연결되는, 2 개의 뉴클레오티드 영역(stretch) (이중 가이드 핵산의 "표적자" 및 "활성자"와 매우 유사함)를 포함한다. 따라서, 특정한 단일 가이드 핵산 (예를 들어, 단일 가이드 RNA)은 표적자 및 활성자를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 듀플렉스-형성 세그먼트를 가지며, 표적자 및 활성자의 듀플렉스-형성 세그먼트는 서로 혼성화하여 dsRNA 듀플렉스를 형성한다. 표적자와 활성자는 표적자의 3' 말단과 활성자의 5' 말단을 통해 공유결합에 의해 연결될 수 있다. 대안적으로, 표적자와 활성자는 표적자의 5' 말단 및 활성자의 3' 말단을 통해 공유결합에 의해 연결될 수 있다.
단일 가이드 핵산의 링커는 3개 뉴클레오티드 내지 100개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)의 링커는 4 nt이다.
예시적인 단일 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 dsRNA 듀플렉스를 형성하기 위해 혼성화하는 2 개의 상보적 뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 단일 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA) (또는 영역(stretch)을 코딩하는 DNA)의 뉴클레오티드의 2 개의 상보적 영역 중 하나는 국제특허출원 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에 기재된 활성자(tracrRNA) 분자 중 하나, 또는 그의 상보체와 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드 (예를 들어, 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드, 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드, 12개 이상의 연속된 뉴클레오티드, 15개 이상의 연속된 뉴클레오티드, 또는 20개 이상의 연속된 뉴클레오티드)에 걸쳐 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상 동일하거나 100% 동일하다.
일부 구체예에서, 단일 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA) (또는 영역을 코딩하는 DNA)의 뉴클레오티드의 2개의 상보적 영역 중 하나는 국제특허출원 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에 기재된 표적자(crRNA) 서열 중 하나, 또는 그의 상보체와 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드 (예를 들어, 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드, 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드, 12개 이상의 연속된 뉴클레오티드, 15개 이상의 연속된 뉴클레오티드, 또는 20개 이상의 연속된 뉴클레오티드)에 걸쳐 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상 동일하거나 100% 동일하다.
일부 구체예에서, 단일 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA) (또는 영역(stretch)을 코딩하는 DNA)의 뉴클레오티드의 2 개의 상보적 영역 중 하나는 국제특허출원 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에 기재된 표적자 (crRNA) 서열 또는 활성자 (tracrRNA) 서열 중 하나, 또는 그의 상보체와 8개 이상의 인접한 뉴클레오티드 (예를 들어, 8개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 10개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 12개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 15개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 또는 20개 이상의 인접한 뉴클레오티드)에 걸쳐 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상 동일하거나 100% 동일하다.
표적자 및 활성자의 적절한 동족 쌍(cognate pairs)은 종명(species name) 및 염기쌍 형성 (단백질-결합 도메인의 dsRNA 듀플렉스의 경우)을 고려하여 일상적으로 결정될 수 있다. 임의의 활성자/표적자 쌍이 이중 가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)의 일부로서 또는 단일 가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)의 일부로서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 이중 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA) (예를 들어, 이중 가이드 RNA) 또는 단일 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 핵산) (예를 들어, 단일 가이드 RNA)의 활성자 (예를 들어, trRNA, trRNA-유사 분자 등)는 국제특허출원 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에 기재된 활성자 (tracrRNA) 분자, 또는 그의 상보체와 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드의 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 이중 가이드 핵산 (예를 들어, 이중 가이드 RNA) 또는 단일 가이드 핵산 (예를 들어, 단일 가이드 RNA)의 활성자 (예를 들어, trRNA, trRNA-유사 분자 등)는 30개 이상의 뉴클레오티드 (nt) (예를 들어, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 75개 이상의 nt)를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중 가이드 핵산 (예를 들어, 이중 가이드 RNA) 또는 단일 가이드 핵산 (예를 들어, 단일 가이드 RNA)의 활성자 (예를 들어, trRNA, trRNA-유사 분자 등)는 30 내지 200개 뉴클레오티드 (nt) 범위의 길이를 갖는다.
단백질-결합 세그먼트는 10개 뉴클레오티드 내지 100개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
또한 특정한 단일 가이드 핵산 (예를 들어, 단일 가이드 RNA) 및 특정한 이중 가이드 핵산 (예를 들어, 이중 가이드 RNA) 둘 다와 관련하여, 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스는 6 bp(base pair) 내지 50bp 의 길이를 가질 수 있다. 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스를 형성하기 위해 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 간의 퍼센트 상보성은 60% 이상일 수 있다. 예를 들어, 혼성화하여 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스를 형성하는 뉴클레오티드 서열 간의 퍼센트 상보성은 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상일 수 있으며, 예를 들어, 일부 구체예에서, 혼성화하지 않고 따라서 dsRNA 이중체 내에 돌출부(bulge(를 생성하는 일부 뉴클레오티드가 있다. 일부 구체예에서, 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스를 형성하기 위해 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 상보성은 100%이다.
하이브리드 가이드 핵산
일부 구체예에서, 가이드 핵산은 2 개의 RNA 분자 (이중 가이드 RNA)이다. 일부 구체예에서, 가이드 핵산은 하나의 RNA 분자 (단일 가이드 RNA)이다. 일부 구체예에서, 가이드 핵산은 DNA/RNA 하이브리드 분자이다. 이러한 구체예에서, 가이드 핵산의 단백질-결합 세그먼트는 RNA이고 RNA 듀플렉스를 형성한다. 따라서 활성자와 표적자의 듀플렉스-형성 세그먼트는 RNA이다. 그러나 가이드 핵산의 표적화 세그먼트는 DNA일 수 있다. 따라서, DNA/RNA 하이브리드 가이드 핵산이 이중 가이드 핵산 인 경우, "표적자" 분자는 하이브리드 분자일 수 있다 (예를 들어, 표적화 세그먼트는 DNA일 수 있고 듀플렉스-형성 세그먼트는 RNA일 수 있음). 이러한 구체예에서, (예를 들어, 표적자 분자의 듀플렉스-형성 세그먼트를 갖는 RNA-듀플렉스를 형성하기 위해) "활성자" 분자의 듀플렉스-형성 세그먼트는 RNA일 수 있는 반면, 듀플렉스-형성 세그먼트의 외부에 있는 "활성자" 분자의 뉴클레오티드는 DNA (활성자 분자가 하이브리드 DNA/RNA 분자인 경우)이거나 RNA (활성자 분자가 RNA인 경우)일 수 있다. DNA/RNA 하이브리드 가이드 핵산이 단일 가이드 핵산인 경우, 표적화 세그먼트는 DNA일 수 있고, 듀플렉스-형성 세그먼트 (단일 가이드 핵산의 단백질-결합 세그먼트를 구성함)는 RNA일 수 있으며, 표적화 및 이중체-형성 세그먼트 외부의 뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA일 수 있다.
DNA/RNA 하이브리드 가이드 핵산은 일부 구체예에서, 예를 들어 표적 핵산이 RNA인 경우, 유용할 수 있다. Cas9은 통상 표적 DNA와 혼성화하는 가이드 RNA와 결합하여 표적 부위에서 DNA-RNA 듀플렉스를 형성한다. 따라서, 표적 핵산이 RNA 인 경우, RNA 대신 DNA인 (가이드 핵산의) 표적화 세그먼트를 이용하여 표적 부위에서 DNA-RNA 듀플렉스를 재현시키는(recapitulate) 것이 때때로 유리하다. 그러나 가이드 핵산의 단백질-결합 세그먼트는 RNA-듀플렉스이기 때문에 표적자 분자는 표적화 세그먼트에서는 DNA이고 듀플렉스-형성 세그먼트에서는 RNA이다. 하이브리드 가이드 핵산은 이중 가닥 표적 핵산에 비해 단일 가닥 표적 핵산에 Cas9 결합을 편향시킬 수 있다.
예시적인 가이드 핵산
임의의 가이드 핵산을 사용할 수 있다. 다수의 상이한 유형의 가이드 핵산이 당해 분야에서 알려져 있다. 선택된 가이드 핵산은 사용되는 특정 CRISPR 시스템(예를 들어, 특정한 RNA 가이드 엔도뉴클레아제가 사용됨)에 적절하게 조합될 것이다(paired). 따라서, 가이드 핵산은 예를 들어 본 명세서에 기술되거나 당해 분야에서 공지된 임의의 RNA 가이드 엔도뉴클레아제에 상응하는 가이드 핵산일 수 있다. 가이드 핵산 및 RNA 가이드 엔도뉴클레아제는 예를 들어 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에 기재된다.
일부 구체예에서, 적합한 가이드 핵산은 2개의 개별 RNA 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 2개의 분리된 RNA 폴리뉴클레오티드 분자 중 제 1 분자(활성자)는 국제특허출원 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 하나, 또는 그의 상보체와 8개 이상의 인접한 뉴클레오티드 (예를 들어, 8개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 10개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 12개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 15개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 또는 20개 이상의 인접한 뉴클레오티드)의 영역에 걸쳐 60% 이상(예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%) 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 2개의 개별 RNA 폴리뉴클레오티드 분자 중 제 2 분자(표적자)는 국제특허출원 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 하나, 또는 그의 상보체와 8개 이상의 인접한 뉴클레오티드 (예를 들어, 8개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 10개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 12개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 15개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 또는 20개 이상의 인접한 뉴클레오티드)의 영역에 걸쳐 60% 이상(예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%) 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 적합한 가이드 핵산은 단일 RNA 폴리뉴클레오티드이고 국제특허출원 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, 또는 그의 상보체와 8개 이상의 인접한 뉴클레오티드 (예를 들어, 8개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 10개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 12개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 15개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 또는 20개 이상의 인접한 뉴클레오티드)의 영역에 걸쳐 60% 이상(예를들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%) 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 가이드 RNA는 Cpf1 및/또는 Cas9 가이드 RNA이다. Cpf1 및/또는 Cas9 가이드 RNA는 30개 뉴클레오티드(nt) 내지 100 nt, 예를 들어 30 nt 내지 40 nt, 40 nt 내지 45 nt, 45 nt 내지 50 nt, 50 nt 내지 60 nt, 60 nt 내지 70 nt, 70 nt 내지 80 nt, 80 nt 내지 90 nt, 또는 90 nt 내지 100 nt의 총 길이를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, Cpf1 및/또는 Cas9 가이드 RNA는 35 nt, 36 nt, 37 nt, 38 nt, 39 nt, 40 nt, 41 nt, 42 nt, 43 nt, 44 nt, 45 nt, 46 nt, 47 nt, 48 nt, 49 nt, 또는 50 nt의 총 길이를 갖는다. Cpf1 및/또는 Cas9 가이드 RNA는 표적 핵산-결합 세그먼트 및 듀플렉스-형성 세그먼트를 포함할 수 있다.
Cpf1 및/또는 Cas9 가이드 RNA의 표적 핵산 결합 세그먼트는 15 nt 내지 30 nt, 예를 들어 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt, 26 nt, 27 nt, 28 nt, 29 nt, 또는 30 nt의 길이를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 핵산-결합 세그먼트는 23 nt의 길이를 갖는다. 일부 구체예에서, 표적 핵산-결합 세그먼트는 24 nt의 길이를 갖는다. 일부 구체예에서, 표적 핵산-결합 세그먼트는 25 nt의 길이를 갖는다.
Cpf1 및/또는 Cas9 가이드 RNA의 표적 핵산-결합 세그먼트는 표적 핵산 서열의 상응하는 길이와 100% 상보성을 가질 수 있다. 표적화 세그먼트는 표적 핵산 서열의 상응하는 길이와 100% 미만의 상보성을 가질 수 있다. 예를 들어, Cpf1 및/또는 Cas9 가이드 RNA의 표적 핵산 결합 세그먼트는 표적 핵산 서열에 상보적이 지 않은 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산-결합 세그먼트가 25 개의 뉴클레오티드 길이를 갖고, 표적 핵산 서열이 25 개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 일부 구체예에서, 일부 구체예에서는 표적 핵산-결합 세그먼트는 표적 핵산 서열에 100% 상보성을 갖는다. 또 다른 예로서, 표적 핵산-결합 세그먼트가 25 개 뉴클레오티드의 길이를 갖고 표적 핵산 서열이 25 개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 일부 구체예에서, 일부 구체예에서 표적 핵산-결합 세그먼트는 표적 핵산 서열과 1 개의 비-상보적 뉴클레오티드 및 24개의 상보적 뉴클레오티드를 갖는다.
Cpf1 및/또는 Cas9 가이드 RNA의 듀플렉스-형성 세그먼트는 15 nt내지 25 nt, 예를 들어 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 또는 25 nt의 길이를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, Cpf1 가이드 RNA의 듀플렉스-형성 세그먼트는 뉴클레오티드 서열 5'-AAUUUCUACUGUUGUAGAU-3'를 포함할 수 있다.
추가적인 요소
일부 구체예에서, 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)은 추가적인 하나의 세그먼트 또는 세그먼트들 (일부 구체예에서 5' 말단, 일부 구체예에서 3' 말단, 일부 구체예에서 5' 또는 3' 말단, 일부 실시예에서는 서열 내에 내장되고(embedded)(즉, 5' 및/또는 3' 말단이 아님), 일부 실시예에서는 5' 말단과 3' 말단 모두에, 일부 실시예에서는 내장되고, 5' 말단 및/또는 3' 말단에 존재함)을 포함한다. 예를 들어, 적합한 추가적인 세그먼트는 5'캡 (예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡 (m7G)); 3' 폴리아데닐화 테일 (즉, 3' 폴리 (A) 테일); 리보자임 서열 (예를 들어, 가이드 핵산 또는 가이드 핵산의 성분, 예를 들어 표적자, 활성자 등의 자가 절단을 허용하기 위해); 리보스위치 서열 (예를 들어, 조절된 안정성 및/또는 단백질 및 단백질 복합체에 의한 조절된 접근성을 허용하기 위해); dsRNA 듀플렉스(즉, 헤어핀)를 형성하는 서열; RNA를 세포내(subcellular) 위치 (예를 들어, 핵, 미토콘드리아, 엽록체 등)로 표적화하는 서열; 추적을 제공하는 변형 또는 서열 (예를 들어, 형광 분자 (즉, 형광 염료), 형광 검출을 용이하게하는 서열 또는 기타 모이어티와 같은 표지); 단백질(예를 들어, 전사 활성자, 전사 억제자, DNA 메틸기전이효소, DNA 탈메틸화 효소, 히스톤 아세틸기 전이효소, 히스톤 탈아세틸화 효소, RNA에 결합하는 단백질 (예를 들어, RNA 압타머), 표지된 단백질, 형광표지된 단백질 등을 포함한, DNA에 작용하는 단백질)에 대한 결합 부위를 제공하는 서열 또는 기타 변형; 증가된, 감소된 및/또는 제어가능한 안정성을 제공하는 변형 또는 서열; 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
RNA-가이드 엔도뉴클레아제(RNA-Guided Endonuclease)
가이드 핵산에 추가하여 또는 대신에, 조성물은 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 (예를 들어, mRNA 또는 벡터)을 포함할 수 있다. 임의의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 사용할 수 있다. 사용되는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제의 선택은 사용되는 CRISPR 시스템의 의도된 최종 용도에 적어도 부분적으로 의존적일 것이다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 Cas 9 폴리펩티드이다. 본 개시의 조성물에 포함시키기에 적합한 Cas9 폴리펩티드는 천연(naturally-occurring) Cas9 폴리펩티드 (예를 들어, 박테리아 및/또는 고세균 세포에서 자연적으로 발생함), 또는 하기에 기재된 바와 같은 비-천연 Cas9 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9 폴리펩티드는 변이체 Cas9 폴리펩티드, 하기에서 논의되는 키메라 폴리펩티드 등)를 포함한다. 일부 구체예에서, 통상의 기술자는 본 명세서에 개시된 Cas9 폴리펩티드가 임의의 출처로부터 유래되거나 단리된 임의의 변이체일 수 있음을 이해할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 개시의 Cas9 펩티드는 문헌에 기재된 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 하기 문헌에 기재된 기능적 돌연변이를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: Fonfara et al. Nucleic Acids Res. 2014 Feb;42(4):2577-90; Nishimasu H. et al. Cell. 2014 Feb 27;156(5):935-49; Jinek M. et al. Science. 2012 337:816-21; 및 Jinek M. et al. Science. 2014 Mar 14;343(6176); 또한, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 2013년 3월 15일에 출원된 미국특허출원 13/842,859를 참조하고; 또한, 참조에 의해 모두 본 명세어세 포함된, 미국특허 8,697,359; 8,771,945; 8,795,965; 8,865,406; 8,871,445; 8,889,356; 8,895,308; 8,906,616; 8,932,814; 8,945,839; 8,993,233; 및 8,999,641를 참조한다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 이중 가닥 뉴클레아제 활성을 갖는 야생형 Cas9 단백질, 단일 가닥 닉카아제(nickase)로서 작용하는 Cas9 돌연변이체, 또는 변형된 뉴클레아제 활성을 갖는 다른 돌연변이체와 함께 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 개시의 조성물에 포함시키기에 적합한 Cas9 폴리펩티드는 효소적으로 활성인 Cas9 폴리펩티드일 수 있으며, 예를 들어 표적 핵산에서 단일- 또는 이중-가닥 절단을 만들 수 있거나, 대안적으로는 야생형 Cas9 폴리펩티드에 비하여 감소된 효소 활성을 가질 수 있다.
천연 Cas9 폴리펩티드는 가이드 핵산에 결합하여 표적 핵산 내의 특이적 서열(표적 부위)로 유도되고, 표적 핵산을 절단한다 (예를 들어, 이중 가닥 절단 생성을 위한 dsDNA 절단, ssDNA 절단, ssRNA 절단 등). 특정한 Cas9 폴리펩티드는 RNA-결합 부분과 활성 부분의 두 부분을 포함한다. RNA-결합 부분은 개체 가이드 핵산과 상호 작용하고, 활성 부분은 부위-지정(site-directed) 효소 활성 (예를 들어, 뉴클레아제 활성, DNA 및/또는 RNA 메틸화 활성, DNA 및/또는 RNA 절단 활성, 히스톤 아세틸화 활성, 히스톤 메틸화 활성, RNA 변형 활성, RNA-결합 활성, RNA 스플라이싱 활성 등)을 보인다. 일부 구체예에서 활성 부분은 야생형 Cas9 폴리펩티드의 상응하는 부분에 비해 감소된 뉴클레아제 활성을 보인다. 일부 구체예에서, 활성 부분은 효소적으로 불활성이다.
단백질이 특정한 가이드 핵산과 상호 작용하는 RNA-결합 부분을 갖는지 여부를 결정하는 분석은 단백질과 핵산 사이의 결합을 테스트하는 임의의 편리한 결합 분석일 수 있다. 예시적인 결합 분석은 가이드 핵산 및 Cas9 폴리펩티드를 표적 핵산에 첨가하는 것을 포함하는 결합 분석 (예를 들어, 겔 이동(gel shift) 분석)을 포함한다.
단백질이 활성 부분을 갖는지 여부를 결정하기 위한 (예를 들어, 폴리펩티드가 표적 핵산을 절단하는 뉴클레아제 활성을 갖는지를 결정하기 위한) 분석은 핵산 절단을 테스트하는 임의의 편리한 핵산 절단 분석일 수 있다. 예시적인 절단 분석은 표적 핵산에 가이드 핵산 및 Cas9 폴리펩티드를 첨가하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시의 조성물에 포함시키기에 적합한 Cas9 폴리펩티드는 표적 핵산을 변형시키는 효소 활성 (예를 들어, 뉴클레아제 활성, 메틸기 전이효소 활성, 탈메틸화 효소 활성, DNA 복구 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 디스뮤타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화(depurination) 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 재조합효소 활성, 중합 효소 활성, 리가아제 활성, 헬리카제 활성, 광분해 효소(photolyase) 활성 또는 글리코실라제 활성)을 갖는다.
다른 구체예에서, 본 개시의 조성물에 포함시키기에 적합한 Cas9 폴리펩티드는 표적 핵산과 관련된 폴리펩티드(예를 들어, 히스톤)를 변형시키는 효소 활성 (예를 들어, 메틸기 전이효소 활성, 탈메틸화 효소 활성, 아세틸기 전이효소 활성, 탈아세틸화 효소 활성, 키나아제 활성, 포스파타아제 활성, 유비퀴틴 리가아제 활성, 탈유비퀴틴화(deubiquitinating) 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, SUMOyl화 활성, 탈SUMOyl화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성 또는 탈미리스토일화 활성)을 갖는다.
다양한 종으로부터 유래된 다수의 Cas9 오르톨로그(orthologue)가 확인되었으며 일부 구체예에서 단백질은 단지 수 개의 동일한 아미노산을 공유한다. 확인된 모든 Cas9 오르톨로그는 중앙 HNH 엔도뉴클레아제 도메인 및 분할(split) RuvC/RNaseH 도메인이 있는 동일한 도메인 아키텍쳐(architecture)를 가지고 있다. Cas9 단백질은 보존된 아키텍쳐로 4 가지 주요 모티프를 공유한다. 모티프 1, 2 및 4는 RuvC 유사 모티프이고 모티프 3은 HNH-모티프이다.
일부 구체예에서, 적합한 Cas9 폴리펩티드는 4 개의 모티프를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 각각의 모티프 1-4는 도 1 (서열번호 1)에 도시된 Cas9 아미노산 서열; 또는 대안적으로 하기 표 1에 도시된 Cas9 아미노산 서열의 모티프 1-4 (서열번호 1의 모티프 1-4는 아래 표 1에 제시된 바와 같이 각각 서열번호 3-6 임); 또는 대안적으로 도 1(서열번호 1)에 도시된 Cas9 아미노산 서열의 아미노산 7-166 또는 731-1003에 대해 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, Cas9 폴리펩티드는 도 1에 도시되고 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열에 대해 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열 대비 N497, R661, Q695, 및 Q926의 아미노산 치환을 포함하거나; 또는 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대한 K855의 아미노산 치환을 포함하거나; 또는 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 대비 K810, K1003, 및 R1060의 아미노산 치환을 포함하거나; 또는 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 대비 K848, K1003, 및 R1060의 아미노산 치환을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "Cas9 폴리펩티드"는 용어 "변이체 Cas9 폴리펩티드"를 포함하고; 용어 "변이체 Cas9 폴리펩티드(variant Cas9 polypeptide)"는 용어 "키메라 Cas9 폴리펩티드(chimeric Cas9 polypeptide)"를 포함한다.
변이체 Cas9 폴리펩티드
본 개시의 조성물에 포함시키기에 적합한 Cas9 폴리펩티드는 변이체 Cas9 폴리펩티드를 포함한다. 변이체 Cas9 폴리펩티드는 야생형 Cas9 폴리펩티드(예를 들어, 전술된 바와 같은, 천연 Cas9 폴리펩티드)의 아미노산 서열과 비교할 때 하나의 아미노산이 다른 (예를 들어, 결실, 삽입, 치환, 융합을 가짐) (즉, 하나 이상의 아미노산이 다른) 아미노산 서열을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 Cas9 폴리펩티드의 뉴클레아제 활성을 감소시키는 아미노산 변화 (예를 들어, 결실, 삽입, 또는 치환)를 갖는다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 상응하는 야생형 Cas9 폴리펩티드의 뉴클레아제 활성의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 실질적인 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다. Cas9 폴리펩티드가 실질적인 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 변이체 Cas9 폴리펩티드인 경우 "dCas9"으로 지칭될 수 있다.
일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는다. 예를 들어, 본 개시의 결합 방법에 사용하기에 적합한 변이체 Cas9 폴리펩티드는 야생형 Cas9 폴리펩티드, 예를 들어 도 1에 도시된 아미노산 서열(서열번호 1)을 포함하는 야생형 Cas9 폴리펩티드의 엔도뉴클레아제 활성의 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.1% 미만을 보인다.
일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 표적 핵산의 상보적 가닥을 절단할 수 있지만 이중 가닥 표적 핵산의 비-상보적 가닥을 절단하는 능력의 감소를 갖는다. 예를 들어, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 RuvC 도메인 (예를 들어, 도 1의 "도메인 1")의 기능을 감소시키는 돌연변이(아미노산 치환)를 가질 수 있다. 비-한정적 예로서, 일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 D10A 돌연변이 (예를 들어, 서열번호 1의 위치 10에 상응하는 아미노산 위치에서 아스파테이트의 알라닌으로의 돌연변이)를 갖고, 따라서 이중 가닥 표적 핵산의 상보적 가닥을 절단할 수 있지만 이중 가닥 표적 핵산의 비-상보적 가닥을 절단하는 능력의 감소를 갖는다 (따라서. 변이체 Cas9 폴리펩티드가 이중 가닥 핵산을 절단할 때 이중 가닥 절단 (DSB) 대신 단일 가닥 절단 (SSB)을 초래한다)(예를 들어, Jinek et al., Science. 2012 Aug 17; 337 (6096): 816-21참조).
일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 이중 가닥 표적 핵산의 비-상보적 가닥을 절단할 수 있지만 표적 핵산의 상보적 가닥을 절단하는 능력의 감소를 갖는다. 예를 들어, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 HNH 도메인 (RuvC/HNH/RuvC 도메인 모티프, 도 1의"도메인 2")의 기능을 감소시키는 돌연변이 (아미노산 치환)를 가질 수 있다. 비한정적 예로서, 일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 H840A 돌연변이 (예를 들어, 서열번호 1의 위치 840에 상응하는 아미노산 위치에서 히스티딘으로부터 알라닌으로의 돌연변이) (도 1)를 가질 수 있으며, 따라서 표적 핵산의 비-상보적 가닥을 절단하지만 표적 핵산의 상보적 가닥을 절단하는 능력이 감소했다 (따라서 변이체 Cas9 폴리펩티드가 이중 가닥 표적 핵산을 절단할 때 DSB 대신 SSB가 생성됨). 이러한 Cas9 폴리펩티드는 표적 핵산 (예를 들어, 단일 가닥 표적 핵산)을 절단하는 능력이 감소되었지만 표적 핵산 (예를 들어, 단일 가닥 또는 이중 가닥 표적 핵산)에 결합하는 능력은 유지한다.
일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 이중 가닥 표적 핵산의 상보적 및 비-상보적 가닥 둘 모두를 절단하는 능력의 감소를 갖는다. 비한정적인 예로서, 일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 D10A 및 H840A 돌연변이 (예를 들어, RuvC 도메인 및 HNH 도메인 모두에서의 돌연변이) 모두를 보유하여, 상기 폴리펩티드가 이중 가닥 표적 핵산의 상보적 및 비-상보적 가닥 모두를 절단하는 능력의 감소를 갖는다. 이러한 Cas9 폴리펩티드는 표적 핵산 (예를 들어, 단일-가닥 표적 핵산 또는 이중-가닥 표적 핵산)을 절단하는 능력이 감소되지만 표적 핵산 (예를 들어, 단일-가닥 표적 핵산 또는 이중-가닥 표적 핵산)에 결합하는 능력은 유지한다.
또 다른 비한정적 예로서, 일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 W476A 및 W1126A 돌연변이를 가져서, 상기 폴리펩티드가 표적 핵산을 절단하는 능력의 감소를 갖는다. 이러한 Cas9 폴리펩티드는 표적 핵산을 절단하는 능력의 감소를 가지나, 표적 핵산에 결합하는 능력은 유지한다.
또 다른 비한정적 예로서, 일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A 및 D1127A 돌연변이를 가져서 상기 폴리펩티드가 표적 핵산을 절단하는 능력의 감소를 갖는다. 이러한 Cas9 폴리펩티드는 표적 핵산을 절단하는 능력의 감소를 가지나, 표적 핵산에 결합하는 능력은 유지한다.
또 다른 비한정적 예로서, 일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 H840A, W476A 및 W1126A 돌연변이를 가져서 상기 폴리펩티드가 표적 핵산을 절단하는 능력의 감소를 갖는다. 이러한 Cas9 폴리펩티드는 표적 핵산을 절단하는 능력의 감소를 가지나, 표적 핵산에 결합하는 능력은 유지한다.
또 다른 비한정적 예로서, 일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 H840A, D10A, W476A, 및 W1126A를 돌연변이를 가져서 상기 폴리펩티드가 표적 핵산을 절단하는 능력의 감소를 갖는다. 이러한 Cas9 폴리펩티드는 표적 핵산을 절단하는 능력의 감소를 가지나, 표적 핵산에 결합하는 능력은 유지한다.
또 다른 비한정적 예로서, 일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A 및 D1127A 돌연변이를 가져서 상기 폴리펩티드가 표적 핵산을 절단하는 능력의 감소를 갖는다. 이러한 Cas9 폴리펩티드는 표적 핵산을 절단하는 능력의 감소를 가지나, 표적 핵산에 결합하는 능력은 유지한다.
또 다른 비한정적 예로서, 일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 D10A, H840A, P475A, W476A, N477A, D1125A, W1126A, 및 D1127A 돌연변이를 가져서 상기 폴리펩티드가 표적 핵산을 절단하는 능력의 감소를 갖는다. 이러한 Cas9 폴리펩티드는 표적 핵산을 절단하는 능력의 감소를 가지나, 표적 핵산에 결합하는 능력은 유지한다.
전술된 효과(즉, 하나 또는 나머지 뉴클레아제 부분을 비활성화시키는 효과)를 달성하기 위해 다른 잔기를 돌연변이시킬 수 있다. 비한정적 예로서, 잔기 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 및/또는 A987이 변경 (즉, 치환) 될 수 있다 (Cas9 아미노산 잔기의 보존에 관한 추가적인 정보에 대해 표 1 참조). 또한, 알라닌 치환 이외의 돌연변이가 적합하다.
일부 구체예에서, 감소된 촉매 활성을 갖는 변이체 Cas9 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9 단백질이 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 및/또는 A987 돌연변이를 갖는 경우, 예를 들어, D10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A 및/또는 D986A), 상기 변이체 Cas9 폴리펩티드는 가이드 핵산과 상호 작용할 수 있는 능력을 유지하는 한 (왜냐하면 가이드 핵산에 의해 표적 핵산 서열로 안내되기 때문) 여전히 부위-특이적 방식으로 표적 핵산에 결합할 수 있다.
표 1. 표 1은 다양한 종의 Cas9 서열에 존재하는 4 개의 모티프를 열거한다. 여기에 열거된 아미노산은 S. pyogenes 로부터의 Cas9(서열번호 1)이다.
모티프 모티프 아미노산 (잔기 #) 보존된 잔기
1 RuvC IGLDIGTNSVGWAVI (7-21)
(서열번호 3)		 D10, G12, G17
2 RuvC IVIEMARE (759-766) (서열번호 4) E762
3 HNH-모티프 DVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKN (837-863)
(서열번호 5)		 H840, N854, N863
4 RuvC HHAHDAYL (982-989) (서열번호 6) H982, H983, A984, D986, A987
전술된 것에 추가하여, 변이체 Cas9 단백질은 Cas9 폴리펩티드에 대해 전술된 바와 같이 서열 동일성에 대해 동일한 파라미터를 가질 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 적합한 변이체 Cas9 폴리펩티드는 4 개의 모티프를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 각각의 모티프 1-4는 도 1에 도시된 Cas9 아미노산 서열(서열번호 1)에 대해, 또는 대안적으로 모티프 1-4(서열번호 1의 모티프 1-4는 표 1에 나타낸 바와 같이 각각 서열번호 3-6 임); 또는 대안적으로 도 1에 도시된 Cas9 아미노산 서열(서열번호 1)의 아미노산 7-166 또는 731-1003에 대해60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 국제특허출원 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에서 구체적으로 언급된 것들을 포함한, 앞서 정의된 바와 같은 임의의 Cas9 단백질은 본 개시의 조성물에 Cas9 폴리펩티드로서, 또는 키메라 Cas9 폴리펩티드의 일부로서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 적합한 변이체 Cas9 폴리펩티드는 도 1에 도시된 Cas9 아미노산 서열(서열번호 1)에 대해 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 정의된 바와 같은 임의의 Cas9 단백질은 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/052690 및 PCT/US2017/062617에서 특별히 언급된 것들을 포함하여 본 개시 내용의 조성물에 변이체 Cas9 폴리펩티드로서, 또는 키메라 변이체 Cas9 폴리펩티드의 일부로서 사용될 수 있다.
키메라 폴리펩티드 (융합 폴리펩티드)
일부 구체예에서, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 키메라 Cas9 폴리펩티드 (본 명세서에서 융합 폴리펩티드, 예를 들어"Cas9 융합 폴리펩티드"라고도 함)이다. Cas9 융합 폴리펩티드는 표적 핵산 (예를 들어, 절단, 메틸화, 탈메틸화 등) 및/또는 표적 핵산과 관련된 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤 테일의 메틸화, 아세틸화 등)에 결합하고 및/또는 변형시킬 수 있다.
Cas9 융합 폴리펩티드는 야생형 Cas9 폴리펩티드 (예를 들어, 천연 Cas9 폴리펩티드)와 서열이 상이하다는 점에서 변이체 Cas9 폴리펩티드이다. Cas9 융합 폴리펩티드는 공유결합에 의해 연결된 이종 폴리펩티드 ("융합 파트너(fusion partner)"로도 언급됨)에 융합된 Cas9 폴리펩티드 (예를 들면, 야생형 Cas9 폴리펩티드, 변이체 Cas9 폴리펩티드, (전술된 바와 같은) 뉴클레아제 활성이 감소된 변이체 Cas9 폴리펩티드 등)이다. 일부 구체예에서, Cas9 융합 폴리펩티드는 공유결합에 의해 연결된 이종 폴리펩티드에 융합된 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는 변이체 Cas9 폴리펩티드(예를 들어, dCas9)이다. 일부 구체예에서, 이종 폴리펩티드는 Cas9 융합 폴리펩티드에 의해 또한 나타날 활성 (예를 들어, 효소 활성) (예를 들어, 메틸기 전이효소 활성, 아세틸기 전이효소 활성, 키나아제 활성, 유비퀴틴화 활성 등)을 나타낸다(따라서 제공한다). 이러한 일부 구체예에서, 예를 들어 Cas9 폴리펩티드가 표적 핵산을 변형시키는 활성(예를 들어, 효소 활성)을 갖는 융합 파트너를 갖는(즉, 이종 폴리펩티드를 갖는) 변이체 Cas9 폴리펩티드인 것인 결합하는 방법은 또한 표적 핵산을 변형시키는 방법으로도 간주할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 핵산 (예를 들어, 단일 가닥 표적 핵산)에 결합하는 방법은 표적 핵산의 변형을 초래할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 표적 핵산 (예를 들어, 단일 가닥 표적 핵산)에 결합하는 방법은 표적 핵산을 변형시키는 방법일 수 있다.
일부 구체예에서, 이종 서열은 세포내 국재화(subcellular localization)를 제공하고, 즉, 이종 서열은 세포내 국재화 서열 (예를 들어, 핵으로의 표적화를 위한 핵 국재화 신호 (NLS), 융합 단백질을 핵의 외부에 유지하기 위한 서열, 예를 들어, 핵 방출 서열 (NES: Nuclear Export Sequence), 융합 단백질을 세포질에 유지하기 위한 서열, 미토콘드리아로의 표적화를 위한 미토콘드리아 국재화 신호, 엽록체로의 표적화를 위한 엽록체 국재화 신호, 소포체 (ER) 유지 신호 등)이다. 일부 구체예에서, 변이체 Cas9는 NLS를 포함하지 않으므로 그 단백질은 핵으로 표적화되지 않는다 (예를 들어, 표적 핵산이 세포질에 존재하는 RNA인 경우 유리할 수 있음). 일부 구체예에서, 이종 서열은 추적 및/또는 정제의 용이성을 위해 태그(tag) (즉, 이종 서열이 검출 가능한 표지임)를 제공할 수 있다(예를 들어, 형광 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato 등; 히스티딘 태그, 예를 들어, 6XHis 태그; 헤마글루티닌 (HA) 태그; FLAG 태그; Myc 태그; 등). 일부 구체예에서, 이종 서열은 증가된 또는 감소된 안정성을 제공할 수 있다 (즉, 이종 서열이 안정성 제어 펩티드, 예를 들어, 일부 구체예에서 제어 가능한 데그론(degron)이다 (예를 들어, 온도 민감성 또는 약물 제어 가능한 데그론 서열, 하기 참조)). 일부 구체예에서, 이종 서열은 표적 핵산으로부터 증가된 또는 감소된 전사를 제공할 수 있다 (즉, 이종 서열이 전사 조절 서열, 예를 들어, 전사 인자/활성자 또는 이의 단편, 전사 인자/활성자 또는 이의 단편을 동원하는 단백질 또는 단편, 전사 억제자 또는 이의 단편, 전사 억제자를 동원하는 단백질 또는 이의 단편, 소분자/약물-반응성 전사 조절자 등). 일부 구체예에서, 이종 서열은 결합 도메인을 제공할 수 있다 (즉, 이종 서열이 단백질 결합 서열, 예를 들어 Cas9 융합 폴리펩티드가 다른 목적 단백질, 예를 들어 DNA 또는 히스톤 변형 단백질, 전사 인자 또는 전사 억제자, 동원 단백질, RNA 변형 효소, RNA-결합 단백질, 번역 개시 인자, RNA 스플라이싱 인자 등에 결합하는 능력을 제공하기 위한 단백질 결합 서열임). 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전 공학에 의해) 다른 핵산 서열에 연결되어 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 키메라 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다.
특정한 Cas9 융합 폴리펩티드 (Cas9 융합 단백질)는 전술된 임의의 조합으로 복수 개(1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 등)의 융합 파트너를 가질 수 있다. 예시적인 예로서, Cas9 융합 단백질은 활성 (예를 들어, 전사 조절, 표적 개질, 표적 핵산과 관련된 단백질의 개질 등을 위한 활성)을 제공하는 이종 서열을 가질 수 있고 또한 세포내 국재화 서열을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 Cas9 융합 단백질은 또한 추적 및/또는 정제의 용이성을 위한 태그 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato 등; 히스티딘 태그, 예를 들어, 6XHis 태그; 헤마글루티닌 (HA) 태그, FLAG 태그, Myc 태그 등)를 가질 수 있다. 또 다른 예시적인 예로서, Cas9 단백질은 하나 이상의 NLS (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 NLS)를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 파트너 (또는 복수의 융합 파트너) (예를 들어, NLS, 태그, 활성을 제공하는 융합 파트너 등)는 Cas9의 C-말단에 또는 그 근처에 위치한다. 일부 구체예에서 융합 파트너 (또는 복수의 융합 파트너) (예를 들어, NLS, 태그, 활성을 제공하는 융합 파트너 등)는 Cas9의 N- 말단에 위치한다. 일부 구체예에서 Cas9는 N- 말단 및 C- 말단 모두에 융합 파트너 (또는 복수의 융합 파트너) (예를 들어, NLS, 태그, 활성을 제공하는 융합 파트너 등)를 갖는다.
증가된 또는 감소된 안정성을 제공하는 적합한 융합 파트너는 데그론(degron) 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 데그론은 그들이 일부를 구성하는 단백질의 안정성을 조절하는 아미노산 서열인 것으로 통상의 기술자에 의해 쉽게 이해된다. 예를 들어, 데그론 서열을 포함하는 단백질의 안정성은 데그론 서열에 의해 부분적으로 조절된다. 일부 구체예에서, 적합한 데그론은 데그론이 실험 대조군과 무관하게 단백질 안정성에 영향을 미치도록 항시적(constitutive)이다 (즉, 데그론은 약물 유도성, 온도 유도성 등이 아님). 일부 구체예에서, 데그론은 변이체 Cas9 폴리펩티드에 조절가능한 안정성을 제공하여, 상기 변이체 Cas9 폴리펩티드가 원하는 조건에 따라 "작동(on)"(즉, 안정) 또는 "무작동(off)"(즉, 불안정, 분해)일 수 있다. 예를 들어, 데그론이 온도 민감성 데그론인 경우, 변이체 Cas9 폴리펩티드는 역치 온도 (예를 들어, 42℃, 41℃, 40℃, 39℃, 38℃, 37℃, 36℃, 35℃, 34℃, 33℃, 32℃, 31℃, 30℃ 등) 미만에서 기능적 (즉, "작동(on)", 안정)이지만 역치 온도 초과에서는 비기능적 (즉, "무작동(off)" , 분해)일 수 있다. 또 다른 예로서, 데그론이 약물 유도성 데그론인 경우, 약물의 존재 또는 부재는 단백질을 "비작동(off)"(즉, 불안정) 상태에서 "작동(on)"(즉, 안정) 상태로 또는 그 반대로 전환시킬 수 있다. 예시적인 약물 유도성 데그론은 FKBP12 단백질에서 유래한다. 데그론의 안정성은 데그론에 결합하는 소분자의 존재 또는 부재에 의해 조절된다.
적합한 데그론의 예는 Shield-1, DHFR, 옥신 및/또는 온도에 의해 제어되는 데그론을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 데그론의 비한정적 예가 당해 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, Dohmen et al., Science, 1994. 263(5151): p. 1273-1276: Heat-inducible degron: a method for constructing temperature-sensitive mutants; Schoeber et al., Am J Physiol Renal Physiol. 2009 Jan;296(1):F204-11 : Conditional fast expression and function of multimeric TRPV5 channels using Shield-1; Chu et al., Bioorg Med Chem Lett. 2008 Nov 15;18(22):5941-4: Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains; Kanemaki, Pflugers Arch. 2012 Dec 28: Frontiers of protein expression control with conditional degrons; Yang et al., Mol Cell. 2012 Nov 30;48(4):487-8: Titivated for destruction: the methyl degron; Barbour et al., Biosci Rep. 2013 Jan 18;33(1).: Characterization of the bipartite degron that regulates ubiquitin-independent degradation of thymidylate synthase; 및 Greussing et al., J Vis Exp. 2012 Nov 10;(69): Monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a Degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (GFP)-based reporter protein; 이들 모두는 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다).
예시적인 데그론 서열은 세포와 동물 모두에서 잘 규명되고 테스트되었다. 따라서, Cas9 (예를 들어, 야생형 Cas9; 변이체 Cas9; 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는 변이체 Cas9, 예를 들어 dCas9 등)를 데그론 서열에 융합하면 "조정 가능한(tunable)" 및 "유도 가능한(inducible)" Cas9 폴리펩티드가 생성된다. 본 명세서에 기재된 임의의 융합 파트너가 바람직한 조합으로 사용될 수 있다. 이 점을 설명하기 위한 비한정적인 예로서, Cas9 융합 단백질 (즉, 키메라 Cas9 폴리펩티드)은 검출을 위한 YFP 서열, 안정성을 위한 데그론 서열, 및 표적 핵산의 전사를 증가시키기 위한 전사 활성자 서열을 포함할 수 있다. Cas9 폴리펩티드 (예를 들어, 야생형 Cas9, 변이체 Cas9, 뉴클레아제 기능이 감소된 변이체 Cas9 등)에 대한 융합 파트너로서 사용하기에 적합한 리포터 단백질은 하기의 예시적인 단백질 (또는 이들의 기능적 단편)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: his3, β-갈락토시다아제, 형광 단백질 (예를 들어, GFP, RFP, YFP, cherry, tomato 등, 및 이들의 다양한 유도체), 루시퍼라아제, β-글루쿠로니다아제, 및 알칼리성 포스파타아제. 또한 Cas9 융합 단백질에서 사용할 수 있는 융합 파트너의 개수는 무제한이다. 일부 구체예에서, Cas9 융합 단백질은 하나 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상)의 이종 서열을 포함한다.
적합한 융합 파트너는 메틸기 전이효소 활성, 탈메틸화 효소 활성, 아세틸기 전이효소 활성, 탈아세틸화 효소 활성, 키나아제 활성, 포스파타아제 활성, 유비퀴틴 리가아제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, SUMOyl화(SUMOylating) 활성, 탈SUMOyl화(deSUMOylating) 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 또는 탈미리스토일화 활성을 제공하는 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않고, 이들은 핵산을 직접 변형시키거나(예를 들어, DNA 또는 RNA의 메틸화) 핵산 관련 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤, DNA 결합 단백질 및 RNA 결합 단백질 등)를 변형시키는 것으로 유도될 수 있다. 더욱 적합한 융합 파트너는 경계 요소(boundary element) (예를 들어, CTCF), 주변 동원(periphery recruitment)을 제공하는 단백질 및 이의 단편 (예를 들어, Lamin A, Lamin B 등) 및 단백질 도킹 요소(protein docking element)(예를 들어, FKBP/FRB, Pil1/Aby1 등)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
특정한 변이체 Cas9 폴리펩티드에 대한 다양한 추가적인 적합한 융합 파트너 (또는 이의 단편)의 예는 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, PCT 특허 출원 WO2010/075303, WO2012/068627 및 WO2013/155555에 기재된 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
적합한 융합 파트너는 표적 핵산 또는 표적 핵산과 관련된 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤, DNA-결합 단백질, RNA-결합 단백질, RNA 편집 단백질 등)에 직접 작용하여 전사를 간접적으로 증가시키는 활성을 제공하는 폴리펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적합한 융합 파트너는 메틸기 전이효소 활성, 탈메틸화 효소 활성, 아세틸기 전이효소 활성, 탈아세틸화 효소 활성, 키나아제 활성, 포스파타아제 활성, 유비퀴틴 리가아제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, SUMOyl화 활성, 탈SUMOyl화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 또는 탈미리스토일화 활성을 제공하는 폴리펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
추가적인 적합한 융합 파트너는 표적 핵산의 증가된 전사 및/또는 번역을 직접 제공하는 폴리펩티드 (예를 들어, 전사 활성자 또는 이의 단편, 전사 활성자를 동원하는 단백질 또는 이의 단편, 소분자/약물-반응성 전사 및/또는 번역 조절제, 번역-조절 단백질 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
증가된 또는 감소된 전사를 달성하기 위한 융합 파트너의 비한정적 예는 전사 활성자 및 전사 억제자 도메인 (예를 들어, Kruppel 연관 박스 (KRAB 또는 SKD); Mad mSIN3 상호 작용 도메인 (SID); ERF 억제자 도메인 (ERD) 등)을 포함한다. 일부 이러한 구체예에서, Cas9 융합 단백질은 가이드 핵산에 의해 표적 핵산의 특정 위치 (즉, 서열)로 표적화되고, 프로모터에 대한 RNA 중합 효소의 결합 차단( 전사 활성자 기능을 선택적으로 저해함) 및/또는 국소 염색질 상태의 변형(예를 들어, 표적 핵산을 개질하거나 표적 핵산과 관련된 폴리펩티드를 변형시키는 융합 서열이 사용되는 경우)과 같은 유전자좌-특이적 조절을 발휘한다. 일부 구체예에서, 변화는 일시적이다(예를 들어, 전사 억제 또는 활성화). 일부 구체예에서, 변화는 유전성(inheritable)이다 (예를 들어, 표적 핵산 또는 표적 핵산과 연관된 단백질, 예를 들어 뉴클레오솜 히스톤에 후성적 변형(epigenetic modifications)이 이루어지는 경우).
ssRNA 표적 핵산을 표적화할 때 사용하기 위한 융합 파트너의 비한정적 예는 하기를 포함한다(다만 이에 한정되지 않음): 스플라이싱 인자 (예를 들어, RS 도메인); 단백질 번역 성분 (예를 들어, 번역 개시, 신장 및/또는 방출 인자, 예를 들어 eIF4G); RNA 메틸라아제; RNA 편집 효소 (예를 들어, RNA 데아미나아제, 예를 들어 RNA (ADAR)에 작용하는 아데노신 데아미나아제, A에서 I 및/또는 C에서 U로의 편집 효소 포함); heliembodiments; RNA-결합 단백질; 등. 융합 파트너는 전체 단백질을 포함할 수 있거나 일부 구체예에서 단백질의 단편 (예를 들어, 기능적 도메인)을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
일부 구체예에서, 이종 서열은 Cas9 폴리펩티드의 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, 이종 서열은 Cas9 폴리펩티드의 N-말단에 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, 이종 서열은 Cas9 폴리펩티드의 내부 부분 (즉, N- 또는 C-말단 이외의 부분)에 융합될 수 있다.
또한, 키메라 Cas9 폴리펩티드의 융합 파트너는 일시적이거나 비가역적이거나, 또는 직접적이거나 또는 간접적인지 여부에 관계 없이, ssRNA와 상호작용할 수 있는 임의의 도메인일 수 있고(이는 본 개시의 목적을 위해, 분자내 및/또는 분자간 이차 구조, 예를 들어 헤어핀, 스템-루프(stem-loop)와 같은 이중 가닥 RNA 듀플렉스를 포함함), 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 이펙터(effector) 도메인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 엔도뉴클레아제 (예를 들어, RNase I, CRR22 DYW 도메인, Dicer 및 SMG5 및 SMG6와 같은 단백질의 PIN (PilT N-말단) 도메인); RNA 절단을 촉진하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, CPSF, CstF, CFIm 및 CFIIm); 엑소뉴클레아제 (예를 들어, XRN-1 또는 엑소뉴클레아제 T); 데아데닐라아제 (예를 들어, HNT3); 넌센스 매개 RNA 붕괴(nonsense mediated RNA decay)를 담당하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, UPF1, UPF2, UPF3, UPF3b, RNP S1, Y14, DEK, REF2, 및 SRm160); RNA 안정화를 담당하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, PABP); 번역 억제를 담당하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, Ago2 및 Ago4); 번역을 촉진하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, Staufen); 번역을 조절하는 (예를 들어, 조절할 수 있는) 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, 개시 인자, 신장 인자, 방출 인자 등과 같은 번역 인자 등, 예를 들어 eIF4G); RNA의 폴리아데닐화를 담당하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, PAP1, GLD-2 및 Star-PAP); RNA의 폴리유리디닐화(polyuridinylation)를 담당하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, CI D1 및 말단 유리딜레이트 전이효소); RNA 국재화를 담당하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, IMP1, ZBP1, She2p, She3p, 및 Bicaudal-D); RNA의 핵 유지(nuclear retension)를 담당하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, Rrp6); RNA의 핵 방출(nuclear export)을 담당하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, TAP, NXF1, THO, TREX, REF 및 Aly); RNA 스플라이싱 억제를 담당하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, PTB, Sam68 및 hnRNP A1); RNA 스플라이싱의 촉진을 담당하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, 세린 /아르기닌-풍부(SR) 도메인); 전사 효율을 감소시키는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, FUS (TLS)); 및 전사 촉진을 담당하는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, CDK7 및 HIV Tat). 대안적으로, 이펙터 도메인은 하기를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다; 엔도뉴클레아제; RNA 절단을 촉진할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; 엑소뉴클레아제; 데아데닐라아제; 넌센스 매개 RNA 붕괴 활성을 갖는 단백질 및 단백질 도메인; RNA를 안정화할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; 번역을 억제 할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; 번역을 촉진할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; 번역을 조절할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인 (예를 들어, 개시 인자, 신장 인자, 방출 인자 등과 같은 번역 인자 등, 예를 들어 eIF4G); RNA의 폴리아데닐화를 수행할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; RNA의 폴리유리디닐화를 수행할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; RNA 국소화 활성을 갖는 단백질 및 단백질 도메인; RNA의 핵 유지를 수행할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; RNA 핵 방출 활성을 갖는 단백질 및 단백질 도메인; RNA 스플라이싱을 억제할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; RNA 스플라이싱을 촉진할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; 전사 효율을 감소시킬 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; 및 전사를 촉진할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인. 또 다른 적합한 융합 파트너는 PUF RNA-결합 도메인이고, 이는 WO2012068627에 보다 상세하게 기재된다.
Cas9 폴리펩티드에 대한 융합 파트너로서 (전체 또는 이의 단편으로) 사용될 수 있는 일부 RNA 스플라이싱 인자는 별개의 서열-특이적 RNA 결합 모듈 및 스플라이싱 이펙터 도메인을 갖는, 모듈 구조(modular organization)을 갖는다. 예를 들어, 세린/아르기닌-풍부 (SR) 단백질 패밀리의 구성원은 엑손 내포(exon inclusion)를 촉진하는 pre-mRNA 및 C-말단 RS 도메인에서 ESE(exonic splicing enhancer)에 결합하는 N-말단 RNA 인식 모티프 (RRM)를 포함한다. 또 다른 예로서, hnRNP 단백질 hnRNP Al은 RRM 도메인을 통해 ESS(exon splicing silencer)에 결합하고 C-말단 글리신-풍부 도메인을 통해 엑손 내포를 억제한다. 일부 스플라이싱 인자는 두 개의 대안적인 부위 사이의 조절 서열에 결합하여 스플라이스 부위 (ss)의 대안적인 사용을 조절할 수 있다. 예를 들어, ASF/SF2는 ESE를 인식하고 인트론 근위 부위(intron proximal site)의 사용을 촉진할 수 있고, hnRNP Al은 ESS에 결합하고 스플라이싱을 인트론 원위 부위(intron distal site)의 사용으로 전환시킬 수 있다. 이러한 인자에 대한 한 가지 응용은 내인성 유전자, 특히 질병 관련 유전자의 대안적 스플라이싱을 조절하는 ESF를 생성하는 것이다. 예를 들어, Bcl-x pre-mRNA는 반대 기능의 단백질을 코딩하기 위해 2개의 대안적 5' 스플라이스 부위를 가진 두 개의 스플라이싱 이소형(isoform)을 생성한다. 긴 스플라이싱 이소형 Bcl-xL은 장수한 유사분열후 세포에서 발현되는 강력한 아폽토시스 억제제이며 많은 암세포에서 상향 조절되어 아폽토시스 신호로부터 세포를 보호한다. 짧은 이소형 Bcl-xS는 아폽토시스-촉진성 이소형(pro-apoptosis isoform)이며 높은 교체율 (turnover rate)을 가진 세포 (예를 들어, 발생 림프구)에서 높은 수준으로 발현된다. 2 개의 Bcl-x 스플라이싱 이소형의 비율은 코어 엑손 영역 또는 엑손 확장 영역 (즉, 두 개의 대안적 5' 스플라이스 부위 사이)에 위치한 여러 cω'- 요소에 의해 조절된다. 더 많은 예는 WO2010075303을 참조한다.
일부 구체예에서, Cas9 폴리펩티드 (예를 들어, 야생형 Cas9, 변이체 Cas9, 뉴클레아제 활성이 감소된 변이체 Cas9 등)는 펩티드 스페이서를 통해 융합 파트너에 결합될 수 있다.
일부 구체예에서, Cas9 폴리펩티드는 지질 이중층, 미셀, 세포막, 소기관 막 또는, 소포 막을 통과하는 것을 용이하게 하는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 또는 유기 또는 무기 화합물을 지칭할 수 있는 "단백질 전달 도메인(Protein Transduction Domain)" 또는 PTD (CPP-세포 투과성 펩티드(cell penetrating peptide)로도 알려져 있음)를 포함한다. 작은 극성 분자에서부터 큰 거대 분자 및/또는 나노입자일 수 있는, 또 다른 분자에 부착된 PTD는 예를 들어 세포외 공간으로부터 세포내 공간으로 이동하거나 세포질로부터 세포 소기관 내로 이동하는 것과 같이 분자가 막을 통과하는 것을 용이하게 한다. 일부 구체예에서, 또 다른 분자에 부착된 PTD는 분자의 핵으로의 진입을 용이하게 한다(예를 들어, 일부 구체예에서, PTD는 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함한다). 일부 구체예에서, Cas9 폴리펩티드는 2 개 이상의 NLS, 예를 들어 2 개 이상의 NLS를 나란히(in tandem) 포함한다. 일부 구체예에서, PTD는 Cas9 폴리펩티드의 아미노 말단에 공유결합에 의해 연결된다. 일부 구체예에서, PTD는 Cas9 폴리펩티드의 카르복실 말단에 공유결합에 의해 연결된다. 일부 구체예에서, PTD는 Cas9 폴리펩티드의 아미노 말단 및 카르복실 말단에 공유결합에 의해 연결된다. 일부 구체예에서, PTD는 핵산 (예를 들어, 가이드 핵산, 가이드 핵산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Cas9 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 등)에 공유결합에 의해 연결된다. 예시적인 PTD는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 최소 운데카펩티드 단백질 전달 도메인(minimal undecapeptide protein transduction domain) (YGRKKRRQRRR(서열번호 7)을 포함하는 HIV-1 TAT의 잔기 47-57에 상응함); 세포로의 진입을 지시하기에 충분한 다수의 아르기닌을 포함하는 폴리아르기닌 서열(예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10-50개 아르기닌); VP22 도메인 (Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9 (6): 489-96); 초파리 안테나페디아 단백질 전달 도메인(Drosophila Antennapedia protein transduction domain) (Noguchi et al. (2003) Diabetes 52 (7): 1732-1737); 절단된 인간 칼시토닌 펩티드 (Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21: 1248-1256); 폴리라이신 (Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 13003-13008); RRQRRTSKLMKR (서열번호 8); 트랜스포르탄(Transportan) GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열번호 9); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (서열번호 10); 및 RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 11). 예시적인 PTD는 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: YGRKKRRQRRR (서열번호 12), RKKRRQRRR (서열번호 13); 3개의 아르기닌 잔기 내지 50개의 아르기닌 잔기의 아르기닌 호모폴리머; 예시적인 PTD 도메인 아미노산 서열은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: YGRKKRRQRRR (서열번호 14); RKKRRQRR (서열번호 15); YARAAARQARA (서열번호 16); THRLPRRRRRR (서열번호 17); 및 GGRRARRRRRR (서열번호 18). 일부 구체예에서, PTD는 활성화가능한(activatable) CPP (ACPP)이다 (Aguilera et al. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1 (5-6): 371-381). ACPP는 절단 가능한 링커를 통해 매칭되는 다가 음이온 (예를 들어, Glu9 또는 "E9")에 연결된 다가 양이온성 CPP (예를 들어, Arg9 또는"R9")를 포함하고, 이는 순전하를 거의 0으로 감소시켜 세포로의 부착 및 흡수를 억제한다. 링커가 절단되면 다가 음이온이 방출되어 폴리아르기닌과 그 고유의 접착성을 국소적으로 노출시키고, 따라서 막을 관통하도록 ACPP를 "활성화"한다.
일부 구체예에서, 조성물은 Cpf1 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있으며, 그 예는 도 2, 16, 또는 17에 제공된다. Cpf1 RNA-가이드 엔도뉴클레아제의 또 다른 이름은 Cas12a이다. 본 개시의 Cpf1 CRISPR 시스템은 i) 단일 엔도뉴클레아제 단백질, 및 ii) crRNA를 포함하고, crRNA의 3' 말단의 부분은 표적 핵산에 상보적인 가이드 서열을 함유한다. 이 시스템에서 Cpf1 뉴클레아제는 crRNA에 의해 표적 DNA에 직접 동원된다. 일부 구체예에서, Cpf1에 대한 가이드 서열은 검출 가능한 DNA 절단을 달성하기 위해 적어도 12nt, 13nt, 14nt, 15nt 또는 16nt이어야하고, 효율적인 DNA 절단을 달성하기 위해 최소 14nt, 15nt, 16nt, 17nt, 또는 18nt이어야한다.
본 개시의 Cpf1 시스템은 다양한 방식에서 Cas9와 상이하다. 첫째, Cas9와 달리 Cpf1은 절단을 위해 별도의 tracrRNA를 요구하지 않는다. 일부 구체예에서, Cpf1 crRNA는 약 42-44개 염기 길이만큼 짧을 수 있으며, 이 중 23-25 nt는 가이드 서열이고 19 nt는 구성적 직접 반복 서열이다. 대조적으로, 결합된 Cas9 tracrRNA 및 crRNA 합성 서열은 약 100개 염기 길이일 수 있다.
둘째, Cpf1은 표적의 5' 상류에 위치한 "TTN" PAM 모티프를 선호한다. 이것은 Cas9 시스템에 대한 표적 DNA의 3'에 위치한 "NGG" PAM 모티프와 대조적이다. 일부 구체예에서, 가이드 서열 바로 앞의 우라실 염기는 치환될 수 없다 (Zetsche, B. et al. 2015."Cpf1 Is A Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System", Cell 163, 759-771, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨).
셋째, Cpf1를 위한 절단 부위는 약 3-5 개의 염기가 엇갈리게 되어(staggered) "점착성 말단(sticky ends)"을 생성한다(Kim et al., "Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells", 2016년 6월 6일 온라인 공개). 3-5 bp 오버행(overhang)을 갖는 이러한 점착성 말단은 NHEJ-매개-라이게이션을 촉진하고 매칭되는 말단을 갖는 DNA 단편의 유전자 편집을 개선하는 것으로 생각된다. 절단 부위는 PAM이 있는 5' 말단에서 먼, 표적 DNA의 3' 말단에 있다. 절단 위치는 통상적으로 비-혼성화된 가닥의 18 번째 염기와 crRNA에 혼성화된 상보적 가닥의 상응하는 23 번째 염기 다음이다.
넷째, Cpf1 복합체에서, "시드(seed)" 영역은 가이드 서열의 최초 5nt 내에 위치한다. Cpf1 crRNA 시드 영역은 돌연변이에 매우 민감하며 이 영역의 단일 염기 치환조차도 절단 활성을 크게 감소시킬 수 있다 (Zetsche B. et al. 2015 "Cpf1 Is A Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System" Cell 163, 759-771 참조). 중요하게, Cas9 CRISPR 표적과 달리, Cpf1 시스템의 절단 부위와 시드 영역는 중첩되지 않는다. 올리고를 표적화하는 Cpf1 crRNA 설계에 대한 추가 지침은 (Zetsche B. et al. 2015. "Cpf1 Is A Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System" Cell 163, 759-771)에서 확보할 수 있다.
통상의 기술자는 본 명세서에 개시된 Cpf1이 임의의 출처로부터 유래되거나 단리된 임의의 변이체일 수 있으며, 이들 중 다수는 당해 분야에 공지되어 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본 개시의 Cpf1 펩티드는 도 2에 제시된 FnCPF1 (예를 들어, 서열번호 2), AsCpf1 (예를 들어, 도 14), LbCpf1 (예를 들어, 도 15) 또는 다양한 다른 미생물 종으로부터의 다수의 공지된 Cpf1 단백질, 및 이들의 합성 변이체를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 Cpf1 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, Cpf1 폴리펩티드는 효소적으로 활성이고, 예를 들어 Cpf1 폴리펩티드는 가이드 RNA에 결합되면, 표적 핵산을 절단한다. 일부 구체예에서, Cpf1 폴리펩티드는 야생형 Cpf1 폴리펩티드(예를 들어, 도 2, 16, 또는 17에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 Cpf1 폴리펩티드에 비해)에 비해 감소된 효소 활성을 나타내고, DNA 결합 활성을 유지한다.
일부 구체예에서, Cpf1 폴리펩티드는 도 2, 16, 또는 17에 도시된 아미노산 서열에 대해 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Cpf1 폴리펩티드는 도 2, 16, 또는 17에 도시된 아미노산 서열의 100 개의 아미노산 내지 200 개의 아미노산 (aa), 200 aa 내지 400 aa, 400 aa 내지 600 aa, 600 aa 내지 800 aa, 800 aa 내지 1000 aa, 1000 aa 내지 1100 aa, 1100 aa 내지 1200 aa, 또는 1200 aa 내지 1300 aa의 연속적인 영역(stretch)에 대해 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 90% 이상 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, Cpf1 폴리펩티드는 도 2, 16, 또는 17에 도시된 아미노산 서열의 Cpf1 폴리펩티드의 RuvCI 도메인에 대해 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Cpf1 폴리펩티드는 도 2, 16, 또는 17에 도시된 아미노산 서열의 Cpf1 폴리펩티드의 RuvCII 도메인에 대해 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, Cpf1 폴리펩티드는 도 2, 16, 또는 17에 도시된 아미노산 서열의 Cpf1 폴리펩티드의 RuvCIII 도메인에 대해 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, Cpf1 폴리펩티드는 야생형 Cpf1 폴리펩티드에 비해 (예를 들어, 도 2, 16 또는 17에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 Cpf1 폴리펩티드에 비해) 감소된 효소 활성을 나타내고, DNA 결합 활성을 유지한다. 일부 구체예에서, Cpf1 폴리펩티드는 도 2, 16, 또는 17에 도시된 아미노산 서열에 대해 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 도 2, 16, 또는 17에 도시된 아미노산 서열의 917번 아미노산에 상응하는 아미노산 잔기에서 하나의 아미노산 치환 (예를 들어, D → A 치환)을 포함한다. 일부 구체예에서, Cpf1 폴리펩티드는 도 2, 16, 또는 17에 도시된 아미노산 서열에 대해 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 도 2, 16, 또는 17에 도시된 아미노산 서열의 1006번 아미노산에 상응하는 아미노산 잔기에서 하나의 아미노산 치환 (예를 들어, E → A 치환)을 포함한다. 일부 구체예에서, Cpf1 폴리펩티드는 도 2, 16, 또는 17에 도시된 아미노산 서열에 대해 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 도 2, 16, 또는 17에 도시된 아미노산 서열의 1255번 아미노산에 상응하는 아미노산 잔기에서 하나의 아미노산 치환 (예를 들어, D → A 치환)을 포함한다.
일부 구체예에서, Cpf1 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이며, 예를 들어, Cpf1 융합 폴리펩티드는 a) Cpf1 폴리펩티드; 및 b) 이종 융합 파트너를 포함한다. 일부 구체예에서, 이종 융합 파트너는 Cpf1 폴리펩티드의 N-말단에 융합된다. 일부 구체예에서, 이종 융합 파트너는 Cpf1 폴리펩티드의 C-말단에 융합된다. 일부 구체예에서, 이종 융합 파트너는 Cpf1 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구체예에서, 이종 융합 파트너는 Cpf1 폴리펩티드 내에 내부적으로 삽입된다.
적합한 이종 융합 파트너는 NLS, 에피토프 태그, 형광 폴리펩티드 등을 포함한다.
연결된 가이드 RNA와 공여체 핵산
일 양상에서, 본 발명은 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 폴리펩티드), 가이드 RNA 및 공여체 폴리뉴클레오티드를 포함하는 CRISPR 시스템을 포함하는 복합체를 제공하며, 상기 가이드 RNA와 상기 공여체 폴리뉴클레오티드는 연결된다. 본 명세서에서 예시되는 바와 같이, 가이드 RNA 및 공여체 폴리뉴클레오티드는 공유 또는 비공유적으로 연결될 수 있다. 일 구체예에서, 가이드 RNA와 공여체 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 라이게이션된다. 또 다른 구체예에서, 가이드 RNA와 공여체 폴리뉴클레오티드는 효소적으로 라이게이션된다. 일 구체예에서, 가이드 RNA와 공여체 폴리뉴클레오티드는 서로 혼성화한다. 또 다른 구체예에서, 가이드 RNA와 공여체 폴리뉴클레오티드는 모두 브릿지 서열(bridge sequence)에 혼성화한다. 이러한 혼성화 방식이 얼마든지 가능하다.
데아미나아제(Deaminase)
일부 구체예에서, 상기 복합체 또는 조성물은 데아미나아제 (예를 들어, 아데닌 염기 편집기(adenine base editor))를 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어, "데아미나아제(deaminase)" 또는 "데아미나아제 도메인(deaminase domain)"은 분자로부터 아민기의 제거 또는 탈아민화(deamination)를 촉매하는 효소를 의미한다. 일부 구체예에서, 데아미나아제는 시티딘 데아미나아제이며, 시티딘 또는 데옥시시티딘의 각각 유리딘 또는 데옥시유리딘으로의 가수 분해적 탈아민화를 촉매한다. 일부 구체예에서, 데아미나아제는 시토신 데아미나아제이며, 시토신의 (예를 들어, RNA 중)유라실 또는 (예를 들어, DNA 중)티민으로의 가수 분해적 탈아민화를 촉매한다.
일부 구체예에서, 데아미나아제는 아데닌 또는 아데노신의 가수분해적 탈아민화를 촉매하는 아데노신 데아미나아제다. 일부 구체예에서, 데아미나아제 또는 데아미나아제 도메인은 아데노신 또는 데옥시아데노신의 각각 이노신 또는 데옥시이노신으로의 가수분해성 탈아민화를 촉매하는 아데노신 데아미나아제다. 일부 구체예에서, 아데노신 데아미나아제는 데옥시리보핵산(DNA)에서 아데닌 또는 아데노신의 가수분해적 탈아민화를 촉매한다. 본 명세서에서 제공되는 아데노신 데아미나아제 (예를 들어, 조작된 아데노신 데아미나제, 진화된 아데노신 데아미나제)는 박테리아와 같은 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, 데아미나아제 또는 데아미나아제 도메인은 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 랫트 또는 마우스와 같은 유기체로부터의 천연 데아미나아제의 변이체이다.
일부 구체예에서, 데아미나아제 또는 데아미나아제 도메인은 자연에서 발생하지 않는다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 데아미나아제 또는 데아미나아제 도메인은 천연 데아미나아제에 대해 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하다. 일부 구체예에서, 아데노신 데아미나아제는 E. coli, S. aureus, S. typhi, S. putrefaciens, H. influenzae, 또는 C. crescentus 와 같은 박테리아에서 유래한다. 일부 구체예에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 데아미나아제이다. 일부 구체예에서, TadA 데아미나아제는 E. coli TadA 데아미나아제 (ecTadA)이다. 일부 구체예에서, TadA 데아미나아제는 절단된 E. coli TadA 데아미나아제다. 예를 들어, 절단된 ecTadA는 전장 ecTadA에 비해 하나 이상의 N-말단 아미노산이 소실될 수 있다. 일부 구체예에서, 절단된 ecTadA는 전장 ecTadA에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20개 N-말단 아미노산 잔기가 소실될 수 있다. 일부 구체예에서, 절단된 ecTadA는 전장 ecTadA에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20개 C-말단 아미노산 잔기가 소실될 수 있다. 일부 구체예에서, ecTadA 데아미나아제는 N-말단 메티오닌을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 데아미나아제는 APOBEC1 또는 그의 변이체이다.
데아미나아제는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 CRISPR 요소와 함께(conjugation) 사용될 수 있거나(즉, 조성물로서), 또는 데아미나아제는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 CRISPR 요소(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)에 융합될 수 있다(즉, 복합체로서). 특정 구체예에서, 데아미나아제는 Cas9, Cpf1, 또는 그의 변이체에 융합된다.
기타 성분
조성물은 핵산 또는 단백질 전달 제형에서 전형적으로 사용되는 임의의 다른 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 지질, 지단백질 (예를 들어, 콜레스테롤 및 유도체), 인지질, 폴리머, 또는 리포좀 또는 미셀 전달 비히클의 기타 성분을 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 또한 세포 또는 숙주, 예를 들면, 포유 동물 또는 인간에 투여하기에 적합한 용매 또는 담체를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 조성물은 1종 이상의 계면활성제를 더 포함한다. 계면활성제는 비-이온성 계면활성제 및/또는 양쪽이온성 계면활성제일 수 있다. 일부 구체예에서, 계면활성제는 에틸렌 옥시드(EO), 프로필렌 옥시드(PO), 부틸렌 옥시드(BO), 글리콜산(GA), 락트산(LA), 또는 이들의 조합의 폴리머 또는 코폴리머이다. 예를 들면, 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 예시적인 계면 활성제의 목록은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면 활성제 (통상 Tween으로 지칭됨), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; DOWFAX™ 상품명으로 판매되는, 에틸렌 옥시드 (EO), 프로필렌 옥시드 (PO) 및/또는 부틸렌 옥시드 (BO)의 코폴리머, 예를 들면, 선형 EO/PO 블록 코폴리머; 반복되는 에톡시(옥시-1,2-에탄디일) 기의 개수가 다양할 수 있는, 옥톡시놀, 특히 주목되는 옥톡시놀-9 (Triton X-100, 또는 t-옥틸 페녹시폴리에톡시에탄올); (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-6301NP-40); 포스파티딜콜린(레시틴)과 같은 인지질; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알코올로부터 유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르 (Brij 계면 활성제로 알려짐), 예를 들면, 트리에틸렌글리콜 모노라우릴에테르(Brij 30); 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 소르비탄 에스테르(일반적으로 Spans이라고 함), 예를 들면, 소르비탄 트리올레이트(Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트. 일부 구체예에서, 계면 활성제는 항응고제 (예를 들어, 헤파린 등)이다. 일부 구체예에서, 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 더 포함한다.
일부의 경우에, 성분 (예를 들어, 핵산 성분 (예를 들어, 가이드 핵산 등); 단백질 성분 (예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 폴리펩티드, 변이체 Cas9 또는 Cpf1 폴리펩티드); 등)은 표지 모이어티를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "표지(label)", "검출 가능한 표지(detectable label)" 또는 "표지 모이어티(label moiety)"는 신호 검출을 제공하는 임의의 모이어티를 의미하고 분석의 구체적 특성에 따라 크게 달라질 수 있다. 목적 표지 모이어티는 직접적으로 감지 가능한 표지 (직접 표지) (예를 들어, 형광 표지) 및 간접적으로 감지 가능한 표지 (간접 표지) (예를 들어, 결합 쌍 구성원(binding pair member))를 모두 포함한다. 형광 표지는 임의의 형광 표지 (예를 들어, 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인, 텍사스 레드, 로다민, ALEXAFLUOR® 표지, 등)), 형광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), 강화 GFP (EGFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 시안 형광 단백질 (CFP), cherry, tomato, tangerine, 및 이의 임의의 형광 유도체, 등)일 수 있다. 본 명세서 방법에서 사용하기에 적합한 (직접적으로 또는 간접적으로) 검출 가능한 표지 모이어티는 분광, 광화학, 생화학, 면역 화학, 전기, 광학, 화학, 또는 기타 수단에 의해 검출될 수 있는 임의의 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 적절한 간접 표지는 비오틴 (결합 쌍 구성원)을 포함하고, 이는 스트렙타비딘 (그 자체가 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있음)에 의해 결합될 수 있는 것이다. 표지는 또한 하기를 포함할 수 있다: 방사성 표지 (직접 표지) (예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P); 효소 (간접 표지) (예를 들어, 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타아제, 갈락토시다아제, 루시페라아제, 글루코스 산화효소, 등); 형광 단백질 (직접 표지) (예를 들어, 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 및 이의 임의의 편리한 유도체); 금속 표지 (직접 표지); 비색(colorimetric) 표지; 결합 쌍 구성원; 등. "결합 쌍의 파트너(partner of a binding pair)" 또는 "결합 쌍 구성원(binding pair member)"은 제 1 및 제 2 모이어티 중 하나를 의미하며, 제 1 및 제 2 모이어티는 서로에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는다. 적합한 결합 쌍은 하기를 포함하나 이에 한정되지는 않는다: 항원/항체 (예를 들어, 디곡시게닌/항-디곡시게닌, 디니트로페닐(DNP)/항-DNP, 단실(dansyl)-X-항-단실, 플루오레세인/항-플루오레세인, 루시퍼 옐로우/항-루시퍼 옐로우 및 로다민 항-로다민), 비오틴/아비딘(또는 비오틴/스트렙타비딘) 및 칼모듈린 결합 단백질(CBP)/칼모듈린. 임의의 결합 쌍 구성원이 간접적으로 검출가능한 표지 모이어티로서 사용하기에 적합할 수 있다.
임의의 주어진 성분, 또는 성분들의 조합은 표지되지 않거나, 또는 표지 모이어티로 검출 가능하게 표지될 수 있다. 일부 구체예에서, 2 개 이상의 성분이 표지될 때, 이들은 서로 구별될 수 있는 표지 모이어티로 표지될 수 있다.
캡슐화(encapsulation) 및 나노입자
조성물의 일부 구체예에서, 폴리머는 핵산 및/또는 폴리펩티드와 조합되고 핵산 및/또는 폴리펩티드를 부분적으로 또는 완전히 캡슐화한다. 조성물은 일부 제형에서는 폴리머 및 핵산 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 나노입자를 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 폴리머 및 핵산 또는 폴리펩티드 외에 코어 나노입자를 포함할 수 있다. 금속 (예를 들어, 금) 나노입자 또는 폴리머 나노입자를 포함한, 임의의 적합한 나노입자가 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 폴리머 및 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA, 공여체 폴리뉴클레오티드, 또는 둘 다) 또는 폴리펩티드는 나노입자 표면에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 폴리머 및 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA, 공여체 폴리뉴클레오티드, 또는 둘 다) 또는 폴리펩티드는 나노입자의 표면에 직접적으로 또는 개재 링커(intervening linker)를 통해 간접적으로 접합될 수 있다.
모든 유형의 분자를 링커로 사용할 수 있다. 예를 들어, 링커는 2 개 이상의 탄소 원자 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상의 탄소 원자)를 포함하는 지방족 사슬일 수 있으며, 케톤, 에테르, 에스테르, 아미드, 알코올, 아민, 우레아, 티오우레아, 술폭시드, 술폰, 술폰 아미드, 및 이황화 작용기를 포함한, 하나 이상의 작용기로 치환될 수 있다. 나노입자가 금을 포함하는 구체예에서, 링커는 임의의 티올-함유 분자일 수 있다. 티올기와 금의 반응은 공유 술피드(-S-) 결합을 생성한다. 링커 설계 및 합성은 당해 분야에서 잘 알려져있다.
일부 구체예에서, 나노입자에 접합된 핵산은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 요소 (예를 들어, Cas9 폴리펩티드, 및 가이드 RNA, 공여체 폴리뉴클레오티드, 및 Cpf1 폴리펩티드)를 비공유 결합에 의해 나노입자-핵산 접합체에 결합시키는 작용을 하는 링커 핵산이다. 예를 들어, 링커 핵산은 가이드 RNA 또는 공여체 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 서열을 가질 수 있다.
나노입자(예를 들어, 콜로이드 금속 (예를 들어, 금) 나노입자; 생체 적합성 폴리머를 포함하는 나노입자)에 접합된 핵산은 임의의 적절한 길이를 가질 수 있다. 핵산이 가이드 RNA 또는 공여체 폴리뉴클레오티드인 경우, 그 길이는 본 명세서에서 논의되고 당해 분야에서 공지된 바와 같이 이러한 분자에 적합할 것이다. 핵산이 링커 핵산인 경우, 그것은 링커에 적합한 임의의 길이, 예를 들어 10 nt(nucleotide) 내지 1000 nt, 예를 들어 약 1 nt 내지 약 25 nt, 약 25 nt 내지 약 50 nt, 약 50 nt 내지 약 100 nt, 약 100 nt 내지 약 250 nt, 약 250 nt 내지 약 500 nt, 또는 약 500 nt 내지 약 1000 nt의 길이를 가질 수 있다. 일부의 경우에, 나노입자 (예를 들어, 콜로이드성 금속 (예를 들어, 금) 나노입자; 생체 적합성 폴리머를 포함하는 나노입자)에 접합된 핵산은 1000 nt보다 긴 길이를 가질 수 있다.
나노입자에 연결된 (예를 들어, 공유결합에 의해 연결된; 비-공유결합에 의해 연결된) 핵산이 본 개시의 복합체에 존재하는 가이드 RNA 또는 공여체 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 상기 핵산은 혼성화를 촉진하기에 충분한 가이드 RNA 또는 공여체 폴리뉴클레오티드 서열의 상보체(complement)의 영역에 대한 서열 동일성의 영역을 갖는다. 일부 구체예에서, 본 개시의 복합체에서 나노입자에 연결된 핵산은 복합체 내에 존재하는 가이드 RNA 또는 공여체 폴리뉴클레오티드의 10 개 내지 50 개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 10 개 뉴클레오티드 (nt) 내지 15 nt, 15 nt 내지 20 nt, 20 nt 내지 25 nt, 25 nt 내지 30 nt, 30 nt 내지 40 nt, 또는 40 nt 내지 50 nt)에 대해 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, 나노입자에 연결된 (예를 들어, 공유결합에 의해 연결된; 비-공유결합에 의해 연결된) 핵산은 공여체 폴리뉴클레오티드거나, 또는 공여체 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 나노입자에 연결된 (예를 들어, 공유결합에 의해 연결된; 비-공유결합에 의해 연결된) 핵산은 공여체 DNA 주형에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
사용 방법
또한 핵산 및/또는 폴리펩티드를 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 세포는 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)일 수 있는 것인 방법이 제공된다. 다. 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 폴리머 및 핵산 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 세포 또는 세포를 포함하는 개체에 투여하는 것을 포함한다. 이 방법은 임의의 유형의 세포 또는 개체에 대해 이용될 수 있지만, 특히 포유류 세포 (예를 들어, 인간 세포)에 유용하다. 일부 구체예에서, 폴리머는 핵산 및/또는 폴리펩티드가 표적 세포 또는 조직 (예를 들어, 말초 신경계, 중추 신경계, 개체의 눈, 간, 근육, 폐, 뼈의 의 세포 또는 조직(예를 들어, 조혈 세포), 또는 종양 세포 또는 조직)에 주로 또는 전적으로 전달되도록 표적화제(targeting agent)를 포함한다.
개체 중 세포에 (즉, 인 비보) 단백질 또는 핵산을 전달하기 위해 사용되는 경우, 폴리머가 혈청에서 안정한 것이 바람직하다. 혈청 중 안정성은 폴리머가 (예를 들면, in vitro 또는 in vivo) 혈청 중 세포에 단백질 또는 핵산 페이로드(payload)를 전달하는 효율성의 함수로서 평가될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 폴리머는 동일한 조건에서 pAsp[DET]보다 더 높은 효율로 혈청 중 세포에 주어진 단백질 또는 핵산을 전달한다.
CRISPR 시스템의 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물과 함께 사용될 때, 본 방법은 표적 핵산 또는 유전자를 편집하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 핵산을 변형시키는 방법은 HDR(homology-directed repair)을 포함한다. 일부 구체예에서, HDR을 수행하기 위한 본 개시 내용의 복합체의 사용은 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 또는 25% 초과의 HDR의 효율을 제공한다. 일부 구체예에서, 표적 핵산을 변형시키는 방법은 NHEJ(non-homologous end joining)를 포함한다. 일부 구체예에서, HDR을 수행하기 위한 본 개시의 복합체의 사용은 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 또는 25% 초과의 NHEJ의 효율을 제공한다.
도 1은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogene)로부터의 Cas9의 아미노산 서열 (서열번호 1)을 제공한다.
도 2는 프란시셀라 툴라렌시스 아종 노비시다(Francisella tularensis subsp. Novicida) U112로부터의 Cpf1의 아미노산 서열 (서열번호 2)을 제공한다.
도 3은 반응 혼합물에 첨가된 소수성 모이어티의 등가물(equivalents)의 개수의 결과로서 폴리머 A의 소수성 모이어티의 치환도(degree of substitution)를 보여주는 그래프이다.
도 4는 반응 혼합물에 첨가된 소수성 모이어티의 등가물의 개수의 결과로서 폴리머 B의 소수성 모이어티의 치환도를 보여주는 그래프이다.
도 5는 실시예 3에 기재된 바와 같이, RFP 형광의 함수로서 HEK293T 세포에서 폴리머 A 나노입자의 형질감염(transfection) 효율을 보여주는 그래프이다.
도 6은 실시예 4에 기재된 바와 같이, RFP 형광의 함수로서 HEK293T 세포에서 폴리머 A 나노입자의 형질감염 효율을 보여주는 그래프이다.
도 7은 실시예 4에 기재된 바와 같이, RFP 형광의 함수로서 HepG2 세포에서 폴리머 A 나노입자의 형질감염 효율을 보여주는 그래프이다.
도 8은 실시예 4에 기재된 바와 같이, RFP 형광의 함수로서 일차 근원세포(primary myoblast)에서 폴리머 A 나노입자의 형질감염 효율을 보여주는 그래프이다.
도 9는 실시예 4에 기재된 바와 같이, RFP 형광의 함수로서 HEK293T 세포에서 폴리머 B 나노입자의 형질감염 효율을 보여주는 그래프이다.
도 10은 실시예 5에 기재된 바와 같이, GFP 넉-아웃(knock-out)의 함수로서 HEK293T 세포에서 Cas9을 함유하는 폴리머 A 및 폴리머 B 나노입자의 형질감염 효율을 보여주는 그래프이다.
도 11은 실시예 5에 기재된 바와 같이, GFP 넉-아웃의 함수로서 HEK293T 세포에서 Cpf1을 함유하는 폴리머 A 및 폴리머 B 나노입자의 형질감염 효율을 보여주는 그래프이다.
도 12는 실시예 6에 기재된 바와 같이, RFP 형광의 함수로서 HEK293T 세포에서 폴리머 A 나노입자의 형질감염 효율을 보여주는 그래프이다.
도 13은 실시예 7에 기재된 바와 같이, 폴리머 A 나노입자에 의한 세포의 처리 후에, Hep3B 세포의 세포 생존력을 보여주는 그래프이다.
도 14는 AsCpf1의 서열 (서열번호19)을 제공한다.
도15는 LbCpf1의 서열 (서열번호20)을 제공한다.
도16은 실시예 9에 기재된 바와 같이, mCherry mRNA 및 폴리머 H27N을 함유하는 입자들의 동적 광산란(dynamic light scattering)을 보여준다.
도 18은 실시예 12에 기재된 바와 같이, RFP 형광의 함수로서 HEK293T 세포에서 폴리머 H27N 나노입자의 형질감염 효율을 보여주는 그래프이다.
도 19는 실시예 13에 기재된 바와 같이, NHEJ(nonhomologous end joining) 효율의 함수로서 Hep3B 세포에서 폴리머 H27N 나노입자의 형질감염 효율을 보여주는 그래프이다.
도 20은 실시예 14에 기재된 바와 같이, NHEJ(nonhomologous end joining) 효율의 함수로서 Hep3B 세포에서 폴리머 H27N 나노입자의 형질감염 효율을 보여주는 그래프이다.
도 21은 마우스 Loxp-루시퍼라아제 리포터 기능의 개략도이다.
도 22a 내지 22c는 실시예 15에 기재된 바와 같이, 조성물로 처리된 루시퍼라아제 발현 마우스의 생물발광 이미징을 보여준다.
도 23은 마우스 ai9 리포터 기능의 개략도이다.
도 24는 실시예 17에 기재된 바와 같이 조성물로 처리된 루시퍼라아제 발현 마우스의 문측(rostral) 절편과 미추(caudal) 절편으로의 Cre mRNA 전달의 생물발광 이미징을 보여준다.
도 25는 실시예 23에 기재된 바와 같이, RFP 형광의 함수로서 폴리머 나노입자의 형질감염 효율성을 보여주는 그래프이다.
하기 실시예는 본 발명을 더 설명하나, 물론 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
본 실시예는 본 명세서에 기재된 폴리머의 합성을 위한 지침을 제공한다. 합성은 PBLA를 아민 및 N-(2-아미노에틸)에탄-1,2-디아민 ("DET")으로 변형시키는 단계를 포함한다. 예시적 절차는 하기와 같다.
도식(Scheme) 1.
Figure pct00118
Figure pct00119
폴리머 A
동결건조된 PBLA (50 mg, 0.0037 mMol)를 플라스크에 넣고 테트라히드라퓨란/N-메틸-2-피롤리딘 (각각 1 mL)에 용해시켰다. 수득된 투명한(clear) 용액에 n-헥실아민 (58.8 ㎕, 0.44 mMol, 120 당량)을 첨가하고, 투명한 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 약 24시간 후에, 디에틸렌트리아민 (PBLA 세그먼트의 벤질기에 대한 50 당량, 1.0 g)을 약한(mild) 무수 조건 하에서 상기 투명한 반응 혼합물에 첨가했다. 실온에서 약 18시간 후에, 반응 혼합물을 디에틸 에테르(10-12X 부피, 35 mL) 내로 침전시켰다. 그 후, 백색 침전물을 원심분리시키고, 디에틸 에테르로 2회 세척했다. 백색 폴리머를 1 M HCl (3 mL)에 용해시키고, 3.5 - 5 KD 컷-오프(cut-off) 막에서 과량의 탈이온수로 투석시켰다. 용액의 pH가 5 내지 6인 경우, 투석을 중단하고, 용액을 동결건조시켜, 약 60 mg의 폴리머 산물을 수득했다. 폴리머 A1-A6을 제공하기 위해, PBLA에 대한 n-헥실아민의 상이한 비율을 이용하여 유사한 절차를 수행했다. 농도 비 및 그로부터 유래된 폴리머가 표 2에 표시되고, x 값 및 y 값은 평균으로 보고되었다. 치환도는 1H NMR 분광분석에 의해 확인했다. 결과가 또한 도 3에 도시된다.
폴리머 PBLA에 대한 헥산-1-아민의 당량 x y
폴리머 A1 20 62 3
폴리머 A2 30 58 7
폴리머 A3 40 55 10
폴리머 A4 80 45 20
폴리머 A5 120 39.5 25.5
폴리머 A6 160 38 27
표 2 및 도 3에 의해 확인된 바와 같이, 소수성 모이어티의 치환도는 반응 혼합물에 첨가된 소수성 모이어티의 당량에 의해 조절할 수 있다.
실시예 2
본 실시예는 본 명세서에 기재된 폴리머의 합성을 위한 지침을 제공한다. 합성은 PBLA를 아민 및 N-(2-아미노에틸)에탄-1,2-디아민 ("DET")으로 변형시 단계를 포함한다. 예시적 절차는 하기와 같다.
도식 2.
Figure pct00120
Figure pct00121
동결건조된 PBLA (50 mg, 0.0037 mMol)를 플라스크에 넣고 테트라히드라퓨란/N-메틸-2-피롤리딘 (각각 1 mL)에 용해시켰다. 수득된 투명한 용액에 1-(4-부틸시클로헥실)메탄아민 (75 mg, 0.44 mMol, 120 당량)을 첨가하고, 투명한 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 약 24시간 후에, 디에틸렌트리아민 (PBLA 세그먼트의 벤질기에 대한 50 당량)을 약한 무수 조건 하에서 상기 투명한 반응 혼합물에 첨가했다. 실온에서 약 18시간 후에, 반응 혼합물을 디에틸 에테르(10-12X 부피, 35 mL) 내로 침전시켰다. 그 후, 백색 침전물을 원심분리시키고, 디에틸 에테르로 2회 세척했다. 백색 폴리머를 1 M HCl (3 mL)에 용해시키고, 3.5 - 5 KD 컷-오프 막에서 과량의 탈이온수로 투석시켰다. 용액의 pH가 5 내지 6인 경우, 투석을 중단하고, 용액을 동결건조시켜, 약 60 mg의 폴리머 산물을 수득했다. 폴리머 B1-B3을 제공하기 위해, PBLA에 대한 1-(4-부틸시클로헥실)메탄아민의 상이한 비율을 이용하여 유사한 절차를 수행했다. 농도 비 및 그로부터 유래된 폴리머가 표 3에 표시되고, x 값 및 y 값은 평균으로 보고되었다. 치환도는 1H NMR 분광분석에 의해 확인했다. 결과가 또한 도 4에 도시된다.
폴리머 PBLA에 대한 (4-부틸시클로옥실)메탄아민의 당량 X Y
폴리머 B1 80 52 13
폴리머 B2 100 49 16
폴리머 B3 120 47 18
표 3 및 도 4에 의해 확인된 바와 같이, 소수성 모이어티의 치환도는 반응 혼합물에 첨가된 소수성 모이어티의 당량에 의해 조절할 수 있다.
실시예 3
하기 실시예는 본 명세서에 기재된 폴리머에 소수성 곁사슬 치환을 증가시키는 것이 mRNA의 세포로의 전달에 갖는 효과를 보여준다.
실시예 1의 폴리머 A1, A2, 및 A3을 RFP(Red Fluorescent Protein)를 코딩하는 mRNA와 함께 제형화하고, 혈청 조건 및 무혈청 조건에서 HEK293T 세포와 함께 배양시켰다. pAsp[DET]를 양성 대조군으로 이용했다. 결과 (도 5)는 모든 무혈청 시료에서 일부 형질감염(transfection)을 보여주고, 더 높은 헥실아민 치환도를 갖는 폴리머를 이용할 수록, 형질감염 효율이 증가되었다. 폴리머 A3를 이용한 경우 훨씬 더 높은 형질감염을 관찰했다.
실시예 4
하기 실시예는 다양한 세포에 mRNA를 전달하기 위한 본 발명의 폴리머의 용도를 보여준다.
실시예 1의 폴리머 A4 및 A5를 mCherry를 코딩하는 mRNA와 함께 제형화하고 혈청 조건 및 무혈청 조건에서 HEK293T 및 HepG2와 배양하고, 혈청 조건에서 Mdx 마우스로부터의 근원세포(myoblast)와 배양했다. 결과가 도 6 내지 8에 제시되고, 이들은 모든 시료에서 우수한 형질감염을 보여준다. 가장 높은 형질감염 수준은 더 높은 수준의 헥실아민 치환을 갖는 폴리머 A5를 이용하여 수득했다.
실시예 1의 폴리머 A5(헥실아민 치환) 및 실시예 2의 폴리머 B3((4-부틸시클로헥실)메탄아민 치환)을 mCherry mRNA와 함께 제형화하고 HEK293T 세포와 배양했다. 결과가 도 9에 제시된다. 두 폴리머는 모두 탁월한 형질감염 효율을 보였다.
실시예 5
하기 실시예는 CRISPR RNP(ribonucleoprotein) 및 sgRNA(single guide RNA)를 세포에 전달하기 위한 본 발명의 폴리머의 용도를 보여준다.
본 실험을 위해 실시예 1의 폴리머 A4 및 A5(헥실아민 치환)와 실시예 2의 폴리머 B3((4-부틸시클로헥실)메탄아민 치환)을 사용했다. 각 폴리머를 (a) GFP-표적화 sgRNA (600 ng) 및 Cas9 (3 ㎍), 또는 (b) GFP-표적화 crRNA (300 ng) 및 Cpf1 (3 ㎍)와 혼합하여 로딩된(loaded) 폴리머 나노입자를 제공했다. 혈청에 20,000개 세포 밀도로 접종된 GFP 발현 HEK293T 세포 (GFP-HEK 세포)를 로딩된 폴리머 나노입자로 처리하고, 형질감염 후 2일차에 독시사이클린(doxycycline) 유도를 수행했다.유도 후 48시간 차에 유동 세포분석을 수행하고 GFP-인 세포 비율을 정량했다. 결과가 도 10 (Cas9 로딩된 폴리머; n=3 및 오류 막대(error bar)=SEM) 및 도 11(Cpf1 로딩된 폴리머; n=3 및 오류 막대=SEM)에 제시된다. 3종의 폴리머 모두 Cas9 또는 Cpf1을 이용하여 상당한 GFP 넉-아웃을 보였다.
실시예 6
하기 실시예는 본 발명의 폴리머를 포함하는 나노입자의 안정성을 보여준다.
로딩된 나노입자를 제공하기 위해 mCherry mRNA를 실시예 1의 폴리머 A5와 혼합하였다. 나노입자의 하나의 시료를 실온에서 1분 내지 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 나노입자의 또 다른 시료를 4℃에서 2시간 동안 보관했다. 제3 시료를 -80℃에서 2시간 동안 동결시켰다. 나노입자를 사용하여 HEK293T 세포를 처리하고, 유동 세포분석법에 의해 mCherry 발현을 정량했다. 결과가 도 12에 제시된다((n=2, 오류 막대=SEM). 도시된 바와 같이, 나노입자는 거의 모든 형질감염 효율을 유지하여, 나노입자가 테스트 조건에서 안정했다는 것을 보여주었다.
실시예 7
하기 실시예는 mRNA를 세포에 전달하기 위해 페길화(PEGylated) 폴리머와 병용-혼합된 본 명세서에서 제공된 폴리머의 용도를 보여준다.
실시예 1의 폴리머 A5를 증가되는 양(즉, 총 조성물의 10 wt.%, 20 wt.%, 40 wt.% 및 60 wt.%)의 GalNAc-PEG-PAsp 또는 GalNAc-PEG-PAsp-C6와 혼합하고 mCherry mRNA를 Hep3B 세포에 전달하기 위해 사용했다.
Figure pct00122
CCK-8(Cell counting kit-8) 분석을 이용하여 세포 생존력을 측정하고, 유동 세포분석법으로 RFP+ 퍼센트를 측정했다. 결과가 도 13에 제시된다(n=2, 오류 막대=SEM). GalNAc-PEG-PAsp 또는 GalNAc-PEG-PAsp-C6와 혼합된 실시예 1의 폴리머 A5는 총 조성물의 10 wt.%, 20 wt.%, 40 wt.% 및 60 wt.%의 양으로 GalNAc-PEG-PAsp 또는 GalNAc-PEG-PAsp-C6을 포함하는 조성물에 대해 매우 효율적인 전달을 보였다. GalNAc-PEG-PAsp 및 GalNAc-PEG-PAsp-C6은 총 조성물의 40 wt.%로부터 60 wt.%로 변화될 때, 형질감염 효율의 약간의 감소를 보였고, 이는 예상된 것이었다. PEG의 높은 조성이 세포로의 흡수(cellular uptake)를 저해한다는 것이 알려져 있다. CCK-8 분석은 테스트된 폴리머가 사용된 용량에 의해 세포 독성을 유발하지 않았다는 것을 보여주었다. 60%를 초과하는 mRNA 형질감염을 산출한 용량에서, 세포독성이 관찰되지 않았다.
형질감염 효율 및 세포 생존력 결과는 모두 본 명세서에서 제공된 폴리머가 PEG-폴리머와 함께 병용-제형화될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 8
폴리머 H27N을 제조하고 본 명세서에서 제공된 실시예 9, 10, 12-14, 16-21 및 23에서 사용했다:
Figure pct00123
(H27N:괄호는 블록 공중합체 구조를 의미하지 않음)
H27N은 PBLA를 N1-(2-아미노에틸)-N1,N2,N2-트리메틸에탄-1,2-디아민 및 헥실아민에 의해 변형시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 예시적인 절차는 하기와 같다.
도식 3.
Figure pct00124
동결건조된 PBLA (50 mg, 0.0037 mmol; 중합도(degree of polymerization) ("DP") 65)를 플라스크에 넣고 테트라히드라퓨란/N-메틸-2-피롤리딘 (각각 1 mL)에 용해시켰다. 수득된 투명한 용액에 n-헥실아민 (160 당량)을 첨가하고, 투명한 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 약 24시간 후에, N1-(2-아미노에틸)-N1,N2,N2-트리메틸에탄-1,2-디아민(PBLA 세그먼트의 벤질기에 대한 50 당량)을 약한 무수 조건 하에서 상기 투명한 반응 혼합물에 첨가했다. 실온에서 약 18시간 후에, 반응 혼합물을 디에틸 에테르(10-12X 부피, 35 mL) 내로 침전시켰다. 그 후, 침전물을 원심분리시키고, 디에틸 에테르로 2회 세척했다. 폴리머를 1 M HCl (3 mL)에 용해시키고, 3.5 - 5 KD 컷-오프 막에서 과량의 탈이온수로 투석시켰다. 용액의 pH가 5 내지 6인 경우, 투석을 중단하고, 용액을 동결건조시켜, 폴리머 산물을 수득했다.
실시예 9
하기 실시예는 실시예 8의 폴리머 H27N이 mCherry mRNA와 조합되어 나노입자를 형성하는 능력을 보여준다.
폴리머 H27N을 mCherry mRNA와 조합하고, 결과적으로 수득된 혼합물을 동적 광산란(dynamic light scattering)을 이용하여 분석했다. 결과가 도 16에 도시된다.
도 16의 동적 광 산란도에 의해 나타난 바와 같이, H27N과 mCherry mRNA의 조합은 투명한(clear) 나노입자 형성을 가져왔다. 결과적으로 수득된 나노입자는 195 nm의 평균 직경 및 0.16의 다분산 지수(polydispersity index)를 가졌다.
실시예 10
하기 실시예는 실시예 8의 폴리머 H27N이 Cas9 RNP와 조합되어 나노입자를 형성하는 능력을 보여준다.
폴리머 H27N을 Cas9 RNPA와 조합하고, 결과적으로 수득된 혼합물을 동적 광산란을 이용하여 분석했다. 결과가 도 17에 도시된다.
도 17의 동적 광 산란도에 의해 나타난 바와 같이, H27N과 Cas9 RNP의 조합은 투명한 나노입자 형성을 가져왔다. 결과적으로 수득된 나노입자는 92 nm의 평균 직경 및 0.21의 다분산 지수를 가졌다.
실시예 11
실시예 8에 기재된 것과 유사한 합성 절차를 이용하여 4종의 폴리머를 제조했다. 결과적으로 수득된 폴리머를 본 명세서에서 제공된 실시예 12-14에서 사용했다. 제조 방법으로부터 명확한 바와 같이, 하기에 기재된 구조에서 괄호(bracketing)는 블록 코폴리머 구조를 나타내지 않는다.
Figure pct00125
실시예 12
하기 실시예는 mRNA를 HEK293T 세포에 전달하기 위한, 폴리머 H27N과 PEG-폴리머 2-4의 용도를 보여준다.
RFP mRNA를 H27N, 및 H27N과 PEG-폴리머 2-4의 병용-혼합물(PEG-폴리머 대 H27N의 20:80 또는 40:60 wt.% 비율)과 함께 전달했다. H27N과 PEG-폴리머 2-4의 병용-혼합물(PEG-폴리머 대 H27N의 20:80 또는 40:60 wt.% 비율)은 RFP mRNA의 첨가 전에 제조했다. 결과적으로 수득된 나노입자로 HEK293T 세포를 처리하고, 형질감염 후 24시간에 유동 세포분석법을 이용하여 RFP+ 세포를 정량했다. 결과가 도 18에 도시된다.
도 18에 나타난 바와 같이, 폴리머 H27N은 단독으로 및 PEG-폴리머 2-4와 조합되어 HEK293T 세포에서 mRNA를 전달하는데 효율적이었고, 조합은 HEK293T 세포에서 유사하거나 또는 약간 감소된 형질감염 효율을 보였다.
실시예 13
하기 실시예는 PEG-폴리머 1-3이 폴리머 H27N이 Cas9 RNP를 Hep3B 세포에 전달하는 능력에 미치는 효과를 보여준다.
Hep3B 세포를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 및 10% FBS(fetal bovine serum)으로 구성된 배양 배지 중에 50,000개 세포/웰로 접종하여 40 pmol Cas9 RNP를 형성했다. SERPINA1 유전자를 표적화하는 sgRNA를 제조하고, Cas9 단백질을 서서히 첨가하고, 피펫팅에 의해 완전히 혼합했다. 별도로, H27N 폴리머와 PEG-폴리머 1-3을 포함하는 조성물을 1:1 비율로 준비했다. 결과적으로 수득된 조성물을 폴리머 대 sgRNA의 4:1의 질량 비(mass ratio)로 sgRNA와 혼합하여 나노입자를 형성시켰다. 결과적으로 수득된 나노입자를 Hep3B 세포에서 처리하고 형질감염 72시간 후에 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Protocol을 이용하여 gDNA(genomic DNA)를 추출했다. 실험을 생물학적 중복(biological duplicate) 및 분석 중복(assay duplicate)으로 수행하고, ddPCR을 이용하여 NHEJ(nonhomologous end joining) 효율을 정량했다. 결과가 도 19에 도시된다.
도 19에 나타난 바와 같이, 폴리머 H27N 단독은 Hep3B 세포에서 유전자 편집에 효율적이었다. PEG-폴리머 1-3은 Hep3B 세포에서 유사하거나 또는 약간 감소된 유전자 편집 효율을 보였다.
실시예 14
하기 실시예는 PEG-폴리머 1-3이 폴리머 H27N이 Cas9 RNP를 Hep3B 세포에 전달하는 능력에 미치는 효과를 보여준다.
Hep3B 세포를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 및 10% FBS(fetal bovine serum)으로 구성된 배양 배지 중에 50,000개 세포/웰로 접종하여 40 pmol Cas9 RNP를 형성했다. SERPINA1 유전자를 표적화하는 sgRNA를 제조하고, Cas9 단백질을 서서히 첨가하고, 피펫팅에 의해 완전히 혼합했다. 별도로, H27N 폴리머와 PEG-폴리머 1-3을 포함하는 조성물을 1:1 비율로 준비했다. 결과적으로 수득된 조성물을 폴리머 대 sgRNA의 8:1의 질량 비로 sgRNA와 혼합하여 나노입자를 형성시켰다. 결과적으로 수득된 나노입자를 Hep3B 세포에서 처리하고 형질감염 72시간 후에 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Protocol을 이용하여 gDNA를 추출했다. 실험을 생물학적 중복 및 분석 중복으로 수행하고, ddPCR을 이용하여 NHEJ(nonhomologous end joining) 효율을 정량했다. 결과가 도 20에 도시된다.
도 20에 나타난 바와 같이, 폴리머 H27N 단독은 Hep3B 세포에서 유전자 편집에 효율적이었다. PEG-폴리머 1-3은 Hep3B 세포에서 유사하거나 또는 약간 감소된 유전자 편집 효율을 보였다.
실시예 15
하기 실시예는 Loxp-루시퍼라아제 마우스에 의해 보여진 바와 같이, 마우스에 Cre mRNA를 전달하기 위한 본 발명의 폴리머의 용도를 보여준다.
도 21에 표시된 리포터 서열을 갖는 Loxp-루시퍼라아제 마우스를 H27N 및 Cre mRNA로 제형화된 나노입자로 처리했다. 대조군(control)은 처리되지 않은 마우스를 나타낸다. 투여는 척수내(intrathecal)(IT) 주사를 통해 이루어졌다. 생물발광을 통해 Cre mRNA 전달을 평가하였고, 결과 이미지가 도 22a 내지 22c에 표시된다.
나노입자 조성물로 처리된 마우스는 Cre mRNA의 마우스로의 상당한 전달을 보였다.
실시예 16
폴리머 C는 PBLA를 N1-(2-아미노에틸)-N1,N2,N2-트리메틸에탄-1,2-디아민 및 4-메틸펜탄-1-아민에 의해 변형시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 예시적인 절차는 하기와 같다.
도식 4.
Figure pct00126
Figure pct00127
폴리머 C
동결건조된 PBLA (50 mg, 0.0037 mmol)를 플라스크에 넣고 테트라히드라퓨란/N-메틸-2-피롤리딘 (각각 1 mL)에 용해시켰다. 수득된 투명한 용액에 4-메틸펜탄-1-아민(160 당량)을 첨가하고, 투명한 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 약 24시간 후에, N1-(2-아미노에틸)-N1,N2,N2-트리메틸에탄-1,2-디아민(PBLA 세그먼트의 벤질기에 대한 50 당량)을 약한 무수 조건 하에서 상기 투명한 반응 혼합물에 첨가했다. 실온에서 약 18시간 후에, 반응 혼합물을 디에틸 에테르(10-12X 부피, 35 mL) 내로 침전시켰다. 그 후, 침전물을 원심분리시키고, 디에틸 에테르로 2회 세척했다. 폴리머를 1 M HCl (3 mL)에 용해시키고, 3.5 - 5 KD 컷-오프 막에서 과량의 탈이온수로 투석시켰다. 용액의 pH가 5 내지 6인 경우, 투석을 중단하고, 용액을 동결건조시켜, 폴리머 산물을 수득했다.
실시예 17
하기 실시예는 ai9 마우스에 의해 보여진 바와 같이, 마우스에 Cre mRNA를 전달하기 위한 본 발명의 폴리머의 용도를 보여준다.
도 23에 도시된 것과 동일한 리포터 구조체를 갖는 ai9 마우스를 2종의 나노입자 조성물 중 하나로 처리했다: (i) H27N과 PGA-PEG의 혼합물 및 Cre mRNA로 PGA-PEG:mRNA의 4:1 비율로 제형화된 나노입자("H27N + PGA-PEG ("4:1 PGA-PEG:mRNA ratio") 및 (ii) H27N과 PGA-PEG의 혼합물 및 Cre mRNA로 PGA-PEG:mRNA의 6:1 비율로 제형화된 나노입자("H27N + PGA-PEG ("6:1 PGA-PEG:mRNA ratio"). 대조군은 처리되지 않은 미처리 마우스를 나타낸다. 나노입자 특성이 표 4에 요약된다.
표 4. PEG-PGA 나노입자 특성.
동결건조-전 동결건조-후
입자 직경 (nm) 제타-전위 PDI 직경 (nm) 제타-전위 PDI
H27N + 4X PGA-PEG 79 nm -2.5 mV 0.19 92.5 -2.5 mV 0.18
H27N + 6X PGA-PEG 80 nm -2 mV 0.29 80 nm -2 mV 범위(range)
결과적으로 수득된 나노입자 제제를 척수내(IT) 주사를 통해 마우스에 투여했다. 처리 후 10일차에, 마우스를 CO2 질식을 통해 희생시키고 혈액을 제거하기 위해 1% 헤파린처리 식염수(heparinized saline)로 관류시키고, 뒤이어 PBS로 관류시켰다. 그 후, 뇌 및 척수를 채취했다. 마우스 뇌를 관상면(coronal plane)에서 100 ㎛ 두께로 절편화하고, 2개마다 1개의 절편(every other section)을 수집하고 이미징했다.
생물발광을 통해 뇌의 문측(rostral) 절편과 미추(caudal) 절편에 대해 인 비보 Cre mRNA 전달을 평가했고, 결과적으로 수득된 이미지가 도 24에 표시된다.
도 24에서, 나노입자 조성물 (i) 및 (ii) 각각은 미처리 마우스(음성 대조군) 대비, 뇌간 및 소뇌의 미추 절편(즉, 뇌척수액(CSF)에 의해 둘러싸인 뇌의 영역)으로의 Cre mRNA의 증가된 전달을 보였다. 또한, PGA-PEG를 포함하는 나노입자 조성물 (i) 및 (ii)는 정성적으로 유의성 있게 가시적인 RFP 발현을 보여서, PGA-PEG 나노입자가 뇌의 미추 영역의 뇌간 주위에서 형질감염시키는 증가된 능력을 갖는다는 것을 시사했다.
실시예 18
본 실시예는 본 명세서에 기재된 폴리머 D의 합성을 위한 지침을 제공한다. 합성은 PBLA를 헥실 아민 및 아민 화합물 10으로 변형시키는 단계를 포함한다. 예시적 절차는 하기와 같다.
도식 5: 아민 화합물 10의 합성
Figure pct00128
아민 화합물 10은 도식 5에 표시된 프로토콜을 이용하여 합성했다.
도식 6: 폴리머 D의 합성
Figure pct00129
PBLA (25 mg, 0.0018 mmol)를 500 ㎕ NMP와 500 ㎕ THF의 혼합물에 용해시켰다. 그 후, 이 반응 혼합물에 헥실 아민(21.85 mg, 0.216 mmol)을 첨가하고, 수득된 반응 혼합물을 실온에서 23시간 동안 교반시켰다. 그 후, 이 용액에 500 ㎕ NMP, 500 ㎕ THF 및 500 ㎕ 트리에틸아민에 용해된 유리 아민 형태로 아민 화합물 10 (607 mg, 2.34 mmol)을 첨가했다. 결과적으로 수득된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시키고, 조 반응 혼합물(crude reaction mixture)을 디에틸 에테르 (40 mL) 내로 침전시켜 조 폴리머를 생성시켰다. 조 폴리머를 2 mL 1N HCl 용액에 용해시키고, 3.5-5 KD 컷-오프 막 투석 백을 이용하여 4℃에서 48시간 동안 투석시켰다. 정제된 폴리머를 동결건조시켜서 백색 고체로서 폴리머 D (17 mg)를 생성시켰다. 1H NMR (D2O): 4.53 (65 H), 3.63-2.29 (m), 2.17-2.00 (s), 1.41-0.52 (m).
실시예 19
본 실시예는 본 명세서에 기재된 폴리머 E의 합성을 위한 지침을 제공한다. 합성은 PBLA를 헥실 아민 및 아민 화합물 13으로 변형시키는 단계를 포함한다. 예시적 절차는 하기와 같다.
도식 7: 아민 화합물 13의 합성
Figure pct00130
아민 화합물 13은 도식 7에 표시된 프로토콜을 이용하여 합성했다.
도식 8: 폴리머 E의 합성
Figure pct00131
PBLA (25 mg, 0.0018 mmol)를 500 ㎕ NMP와 500 ㎕ THF의 혼합물에 용해시켰다. 그 후, 이 반응 혼합물에 헥실 아민(21.85 mg, 0.216 mmol)을 첨가하고, 수득된 반응 혼합물을 실온에서 23시간 동안 교반시켰다. 그 후, 이 용액에 500 ㎕ NMP, 500 ㎕ THF 및 500 ㎕ 트리에틸아민에 용해된 유리 아민 형태로 아민 화합물 13 (371.71 mg, 2.34 mmol)을 첨가했다. 결과적으로 수득된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시키고, 조 반응 혼합물을 디에틸 에테르 (40 mL) 내로 침전시켜 조 폴리머를 생성시켰다. 조 폴리머를 2 mL 1N HCl 용액에 용해시키고, 3.5-5 KD 컷-오프 막 투석 백을 이용하여 4℃에서 48시간 동안 투석시켰다. 정제된 폴리머를 동결건조시켜서 백색 고체로서 폴리머 E (20 mg)를 생성시켰다. 1H NMR (D2O): 4.53 (br s), 3.63-2.29 (m), 2.17-2.00 (s), 1.54 (m), 1.41-0.52 (m).
실시예 20
본 실시예는 본 명세서에 기재된 폴리머 F의 합성을 위한 지침을 제공한다. 합성은 PBLA를 시클로헥실 에틸 아민 및 아민 화합물 13으로 변형시키는 단계를 포함한다. 예시적 절차는 하기와 같다.
아민 화합물 13은 실시예 9의 도식 7에 표시된 프로토콜을 이용하여 합성했다.
도식 9: 폴리머 F의 합성
Figure pct00132
PBLA (25 mg, 0.0018 mmol)를 500 ㎕ NMP와 500 ㎕ THF의 혼합물에 용해시켰다. 그 후, 이 반응 혼합물에 시클로헥실 에틸 아민(27.48 mg, 0.216 mmol)을 첨가하고, 수득된 반응 혼합물을 실온에서 23시간 동안 교반시켰다. 그 후, 이 용액에 500 ㎕ NMP, 500 ㎕ THF 및 500 ㎕ 트리에틸아민에 용해된 유리 아민 형태로 아민 화합물 13 (371.71 mg, 2.34 mmol)을 첨가했다. 결과적으로 수득된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시키고, 조 반응 혼합물을 디에틸 에테르 (40 mL) 내로 침전시켜 조 폴리머를 생성시켰다. 조 폴리머를 2 mL 1N HCl 용액에 용해시키고, 3.5-5 KD 컷-오프 막 투석 백을 이용하여 4℃에서 48시간 동안 투석시켰다. 정제된 폴리머를 동결건조시켜서 백색 고체로서 폴리머 F (20 mg)를 생성시켰다. 1H NMR (D2O): 4.53 (br s), 3.63-2.29 (m), 2.17-2.00 (s), 1.55-1.15 (m).
실시예 21
본 실시예는 본 명세서에 기재된 폴리머 G의 합성을 위한 지침을 제공한다. 합성은 PBLA를 헥실 아민 및 아민 화합물 20으로 변형시키는 단계를 포함한다. 예시적 절차는 하기와 같다.
도식 10: 아민 화합물 20의 합성
Figure pct00133
아민 화합물 20은 도식 10에 표시된 프로토콜을 이용하여 합성했다.
도식 11: 폴리머 G의 합성
Figure pct00134
PBLA (25 mg, 0.0018 mmol)를 500 ㎕ NMP와 500 ㎕ THF의 혼합물에 용해시켰다. 그 후, 이 반응 혼합물에 헥실 아민(21.85 mg, 0.216 mmol)을 첨가하고, 수득된 반응 혼합물을 실온에서 23시간 동안 교반시켰다. 그 후, 이 용액에 500 ㎕ NMP, 500 ㎕ THF 및 500 ㎕ 트리에틸아민에 용해된 유리 아민 형태로 아민 화합물 20 (407.8 mg, 2.34 mmol)을 첨가했다. 결과적으로 수득된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시키고, 조 반응 혼합물을 디에틸 에테르 (40 mL) 내로 침전시켜 조 폴리머를 생성시켰다. 조 폴리머를 2 mL 1N HCl 용액에 용해시키고, 3.5-5 KD 컷-오프 막 투석 백을 이용하여 4℃에서 48시간 동안 투석시켰다. 정제된 폴리머를 동결건조시켜서 백색 고체로서 폴리머 G (20 mg)를 생성시켰다. 1H NMR (D2O): 4.53 (br s), 3.63-2.29 (m), 2.17-2.00 (s), 1.54 (m), 1.41-0.52 (m).
실시예 22
본 실시예는 본 명세서에 기재된 폴리머 H의 합성을 위한 지침을 제공한다. 합성은 PBLA를 헥실 아민 및 아민 화합물 22로 변형시키는 단계를 포함한다. 예시적 절차는 하기와 같다.
도식 12: 아민 화합물 22의 합성
Figure pct00135
아민 화합물 22는 도식 12에 표시된 프로토콜을 이용하여 합성했다.
도식 13: 폴리머 H의 합성
Figure pct00136
PBLA (25 mg, 0.0018 mmol)를 500 ㎕ NMP와 500 ㎕ THF의 혼합물에 용해시켰다. 그 후, 이 반응 혼합물에 헥실 아민(21.85 mg, 0.216 mmol)을 첨가하고, 수득된 반응 혼합물을 실온에서 23시간 동안 교반시켰다. 그 후, 이 용액에 500 ㎕ NMP, 500 ㎕ THF 및 500 ㎕ 트리에틸아민에 용해된 유리 아민 형태로 아민 화합물 22 (541.5 mg, 2.34 mmol)를 첨가했다. 결과적으로 수득된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시키고, 조 반응 혼합물을 디에틸 에테르 (40 mL) 내로 침전시켜 조 폴리머를 생성시켰다. 조 폴리머를 2 mL 1N HCl 용액에 용해시키고, 3.5-5 KD 컷-오프 막 투석 백을 이용하여 4℃에서 48시간 동안 투석시켰다. 정제된 폴리머를 동결건조시켜서 백색 고체로서 폴리머 H (20 mg)를 생성시켰다. 1H NMR (D2O): 4.53 (br s), 3.63-2.29 (m), 2.17-2.00 (s), 1.54 (m), 1.41-0.52 (m).
실시예 23
하기 실시예는 본 발명의 폴리머를 포함하는 나노입자가 mCherry mRNA를 HEK293T 세포 및 Hep3B 세포에 전달하는 능력을 보여준다.
로딩된 나노입자를 제공하기 위해 mCherry mRNA를 폴리머 D 내지 H 각각과 혼합하였다. 결과적으로 수득된 나노입자를 사용하여 HEK293T 세포 및 Hep3B 세포를 처리하고, 유동 세포분석법에 의해 mCherry 발현을 정량했다. 결과가 도 25에 제시된다((n=2, 오류 막대=SEM).
도 25에 도시된 바와 같이, 폴리머 E, F, 및 G로부터 형성된 나노입자에 의한 HEK293T 세포 및 Hep3B 세포의 처리는 폴리머 D 및 H로부터 형성된 나노입자에 비해 상대적으로 높은 형질감염 효율을 가져왔다.
실시예 24
본 실시예는 본 명세서에 기재된 폴리머 I의 합성을 위한 지침을 제공한다. 합성은 PBLA를 헥실 아민 및 아민 화합물 15로 변형시키는 단계를 포함한다. 예시적 절차는 하기와 같다.
도식 14: 아민 화합물 15의 합성
Figure pct00137
아민 화합물 15는 도식 14에 표시된 프로토콜을 이용하여 합성했다.
도식 15: 폴리머 I의 합성
Figure pct00138
PBLA (25 mg, 0.0018 mmol)를 500 ㎕ NMP와 500 ㎕ THF의 혼합물에 용해시켰다. 그 후, 이 반응 혼합물에 헥실 아민(21.85 mg, 0.216 mmol)을 첨가하고, 수득된 반응 혼합물을 실온에서 23시간 동안 교반시켰다. 그 후, 이 용액에 500 ㎕ NMP, 500 ㎕ THF 및 500 ㎕ 트리에틸아민에 용해된 유리 아민 형태로 아민 화합물 15 (473.5 mg, 2.34 mmol)를 첨가했다. 결과적으로 수득된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시키고, 조 반응 혼합물을 디에틸 에테르 (40 mL) 내로 침전시켜 조 폴리머를 생성시켰다. 조 폴리머를 2 mL 1N HCl 용액에 용해시키고, 3.5-5 KD 컷-오프 막 투석 백을 이용하여 4℃에서 48시간 동안 투석시켰다. 정제된 폴리머를 동결건조시켜서 백색 고체로서 폴리머 I를 생성시켰다.
실시예 25
본 실시예는 본 명세서에 기재된 폴리머 J의 합성을 위한 지침을 제공한다. 합성은 PBLA를 헥실 아민 및 아민 화합물 18로 변형시키는 단계를 포함한다. 예시적 절차는 하기와 같다.
도식 16: 아민 화합물 18의 합성
Figure pct00139
아민 화합물 18은 도식 16에 표시된 프로토콜을 이용하여 합성했다.
도식 17: 폴리머 J의 합성
Figure pct00140
PBLA (25 mg, 0.0018 mmol)를 500 ㎕ NMP와 500 ㎕ THF의 혼합물에 용해시켰다. 그 후, 이 반응 혼합물에 헥실 아민(21.85 mg, 0.216 mmol)을 첨가하고, 수득된 반응 혼합물을 실온에서 23시간 동안 교반시켰다. 그 후, 이 용액에 500 ㎕ NMP, 500 ㎕ THF 및 500 ㎕ 트리에틸아민에 용해된 유리 아민 형태로 아민 화합물 18 (607 mg, 2.34 mmol)을 첨가했다. 결과적으로 수득된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시키고, 조 반응 혼합물을 디에틸 에테르 (40 mL) 내로 침전시켜 조 폴리머를 생성시켰다. 조 폴리머를 2 mL 1N HCl 용액에 용해시키고, 3.5-5 KD 컷-오프 막 투석 백을 이용하여 4℃에서 48시간 동안 투석시켰다. 정제된 폴리머를 동결건조시켜서 백색 고체로서 폴리머 J를 생성시켰다.
본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최상의 모드를 포함하여 본 발명의 바람직한 구체예가 본 명세서에 기술된다. 이러한 바람직한 구체예의 변형은 전술한 설명을 읽은 후 통상의 기술자에게 자명해질 수 있다. 본 발명자들은 숙련된 기술자가 이러한 변형을 적절한 것으로 채택할 것으로 기대하고, 본 발명자들은 본 발명이 본 명세서에 구체적으로 설명된 것과 다르게 실시될 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률에 의해 허용되는 바와 같이 본 명세서에 첨부된 청구범위에 기재된 발명(subject matter)의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 또한, 모든 가능한 변형에서 전술한 요소의 임의의 조합은 본 명세서에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 달리 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 명확하게 달리 명시하지 않는 한, 해당 범위의 상한과 하한 사이에 있는, 각각의 개재 값(intervening value), 하한 단위의 10 분의 1까지, 및 기재된 범위 내에 있는 기타 기재된 값 또는 개재 값은 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 기재된 범위에서 명시적으로 제외된 한계를 고려하여, 본 발명에 포함된다. 기재된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 물질이 이하에서 기술된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 본 명세서에 간행물이 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야한다. 따라서, 예를 들어, "복합체(complex)"에 대한 지칭은 다수의 그러한 복합체를 포함하고 "Cas9 폴리펩티드(Cas9 polypeptide)"에 대한 지칭은 하나 이상의 Cas9 폴리펩티드 및 통상의 기술자에게 공지된 그의 균등물에 대한 지칭을 포함한다. 청구항은 임의의 선택적(optional) 요소를 배제하도록 작성될 수 있다는 것에 유의한다. 따라서, 이러한 진술은 청구항 구성요소의 기재와 관련하여, "단독으로(solely)", "단지(only)" 등과 같은 배타적 용어의 사용, 또는 "부정적" 한정의 사용에 대한 선행적 근거(antecedent basis)로 의도된다.
명확성을 위해 별개의 구체예의 맥락에서 설명된 본 발명의 특정한 특징들은 또한 단일 구체예에서 조합되어 제공될 수도 있는 것으로 이해된다. 반대로, 간결성을 위해 단일 구체예의 맥락에서 설명된 본 발명의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 제공될 수 있다. 본 발명에 속하는 구체예의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며 각각의 모든 조합이 개별적으로 및 명시적으로 개시된 것처럼 본 명세서에 개시된다. 또한, 다양한 구체예 및 그의 요소의 모든 하위 조합도 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며, 각각의 모든 하위 조합이 개별적으로 및 명시적으로 본 명세서에 개시된 것처럼 본 명세서에 개시된다.
본 명세서에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그의 개시를 위해서만 제공된다. 본 명세서의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명이라는 이유로 그러한 간행물보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한 제공되는 발행일은 개별적으로 확인이 필요한 실제 발행일과 다를 수 있다.
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Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln 690 695 700 Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu 705 710 715 720 His Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln 725 730 735 Ile Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu 740 745 750 Lys Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn 755 760 765 Lys Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val 770 775 780 Tyr Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro 785 790 795 800 Ile Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu 805 810 815 Val Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile 820 825 830 Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys 835 840 845 Gly Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe 850 855 860 Asn Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys 865 870 875 880 Glu Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn 885 890 895 Ile Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile 900 905 910 Cys Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu 915 920 925 Asn Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr 930 935 940 Gln Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp 945 950 955 960 Lys Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln 965 970 975 Ile Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly 980 985 990 Phe Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser 995 1000 1005 Thr Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala 1010 1015 1020 Asp Ser Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val 1025 1030 1035 Pro Glu Glu Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe 1040 1045 1050 Ser Arg Thr Asp Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser 1055 1060 1065 Tyr Gly Asn Arg Ile Arg Ile Phe Ala Ala Ala Lys Lys Asn Asn 1070 1075 1080 Val Phe Ala Trp Glu Glu Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu 1085 1090 1095 Leu Phe Asn Lys Tyr Gly Ile Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg 1100 1105 1110 Ala Leu Leu Cys Glu Gln Ser Asp Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe 1115 1120 1125 Met Ala Leu Met Ser Leu Met Leu Gln Met Arg Asn Ser Ile Thr 1130 1135 1140 Gly Arg Thr Asp Val Asp Phe Leu Ile Ser Pro Val Lys Asn Ser 1145 1150 1155 Asp Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Glu Ala Gln Glu Asn 1160 1165 1170 Ala Ile Leu Pro Lys Asn Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Ile 1175 1180 1185 Ala Arg Lys Val Leu Trp Ala Ile Gly Gln Phe Lys Lys Ala Glu 1190 1195 1200 Asp Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys Glu 1205 1210 1215 Trp Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys 1220 1225

Claims (47)

  1. 가수분해성 폴리머 백본을 포함하는 폴리머로서, 상기 폴리머 백본은:
    (i) 소수성 기를 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위;
    (ii) 올리고아민 또는 폴리아민을 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위; 및 선택적으로,
    (iii) 선택적으로 7 미만의 pKa를 갖는, 이온화 가능한 기(ionizable group)를 포함하는 곁사슬을 갖는 단량체 단위를 포함하는 것인 폴리머.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 소수성 기는 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기를 포함하는 것인 폴리머.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 소수성 기는 C3-C12 직쇄 또는 분지쇄 알킬기, 선택적으로 C3-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬기를 포함하는 것인 폴리머.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고아민 또는 폴리아민은:
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2;
    ―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2 2]2;
    ―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2R2};
    ―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2 2]2}2;
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R4-R5;
    ―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R4-R5]2;
    ―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R4-R5};
    ―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R4-R5]2}2;
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH2-CHOH-R5;
    ―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-CH2-CHOH-R5;
    ―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2-CH2-CHOH-R5;
    ―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-CH2-CHOH-R5]2}2;
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R5;
    ―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R5]2;
    ―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R5};
    ―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R5]2}2;
    ―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R4-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2;
    ―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2,
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R5; 또는
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R4-R5의 기이고,
    식 중에서, p1 내지 p4, q1 내지 q6, r1 및 r2, 및 s1 내지 s4는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; 각각의 R2 은 독립적으로 수소 또는 C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기이거나, 또는 R2은 제2 R2 와 결합되어 헤테로고리기를 형성하고; 각각의 R4은 독립적으로 -C(O)O-, -C(O)NH-, 또는 -S(O)(O)-이고; 및 각각의 R5은 독립적으로 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 선택적으로 2개 내지 8개의 3차 아민 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티(targeting moiety)를 포함하는 치환기를 포함하는 것인 폴리머.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머는
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2;
    ―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2 2]2;
    ―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2R2}; 또는
    ―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2 2]2}2;를 포함하고,
    각각의 R2은 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬기이며;
    선택적으로, 상기 폴리아민은
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2을 포함하는 것인 폴리머.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가수분해성 폴리머 백본은 약 1 내지 약 80 mol%의 소수성 기를 갖는 단량체 단위, 약 1 내지 약 80 mol%의 올리고아민 또는 폴리아민을 갖는 단량체 단위, 및 0 내지 약 80 mol%의 이온화 가능한 기를 갖는 단량체 단위를 포함하는 것인 폴리머.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가수분해성 폴리머 백본은 7 미만의 pKa를 갖는 이온화 가능한 기를 포함하는 결사슬을 갖는 단량체 단위를 포함하는 것인 폴리머.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가수분해성 폴리머 백본은 폴리아미드, 폴리-N-알킬아미드, 폴리에스테르, 폴리카르보네이트, 폴리카르바메이트, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 폴리머.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 가수분해성 폴리머 백본은 폴리아미드를 포함하는 것인 폴리머.
  10. 청구항 1에 있어서, 하기 식 I의 구조를 포함하고:
    Figure pct00141

    m1, m2, m3, 및 m4 각각은 0 내지 1000의 정수이고, 단, m1 + m2 + m3 + m4 의 합은 5보다 크며;
    n1 및 n2 각각은 0 내지 1000의 정수이고, 단, n1 + n2 의 합은 2보다 크며;
    심볼 "/"는 그에 의해 분리된 단위들이 무작위로 또는 임의의 순서로 연결된다는 것을 나타내고;
    각각의 R3a은 독립적으로 메틸렌기 또는 에틸렌기이며;
    각각의 R3b은 독립적으로 메틸렌기 또는 에틸렌기이고;
    각 X1는 독립적으로 ―C(O)O―, ―C(O)NR13―, ―C(O)―, ―S(O)(O)―, 또는 결합이며;
    각각의 R13 은 독립적으로 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알킬기, 또는 C3-C12 시클로알케닐기이고, 선택적으로 하나 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있으며;
    각각의 X2 는 독립적으로, C1-C12 알킬기 또는 헤테로알킬기, C3-C12 시클로알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 하나 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있으며;
    A1 및 A2는 각각 독립적으로
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2;
    ―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2 2]2;
    ―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2R2}; 또는
    ―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2 2]2}2의 기이고,
    B1 및 B2는 각각 독립적으로
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R4-R5;
    ―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R4-R5]2;
    ―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R4-R5};
    ―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R4-R5]2}2;
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH2-CHOH-R5;
    ―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-CH2-CHOH-R5;
    ―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2-CH2-CHOH-R5;
    ―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-CH2-CHOH-R5]2}2;
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R5;
    ―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R5]2;
    ―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R5};
    ―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R5]2}2;
    ―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R4-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2;
    ―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2,
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R5; 또는
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R4-R5의 기이며,
    식 중에서, p1 내지 p4, q1 내지 q6, r1 및 r2, 및 s1 내지 s4 는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; 각각의 R2은 독립적으로 수소, 또는 C1-C12 알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알킬기, 또는 C3-C12 시클로알케닐기이거나, 또는 R2은 제2 R2와 결합되어 헤테로고리기를 형성하고; 각각의 R4은 독립적으로 -C(O)O-, -C(O)NH-, -O-C(O)O-, 또는 -S(O)(O)-이며; 각각의 R5은 독립적으로 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 선택적으로 2개 내지 8개의 3차 아민 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티(targeting moiety)를 포함하는치환기를 포함하는 것인 폴리머.
  11. 청구항 10에 있어서, 하기 식 1A의 구조를 갖고:
    Figure pct00142

    식 중에서,
    Q는 식
    Figure pct00143
    이고;
    c는 0 내지 50의 정수이며;
    Y는 선택적으로 존재하고, 절단가능한 링커이고;
    R1은 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기, 또는 선택적으로 하나 이상의 치환기에 의해 치환된 C1-C12 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이며;
    R6은 수소, 아미노기, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, C1-C12 헤테로알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기, 선택적으로 하나 이상의 아민에 의해 치환된, C1-C12 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이거나; 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티이고;
    m1, m2, m3, m4, n1, n2, R3a , R3b , R13, X1 , X2, A1, A2, B1, 및 B2는 청구항 10에 정의된 바와 같은 것인 폴리머.
  12. 청구항 10 또는 11에 있어서, B1 및 B2 각각은 식 -(CH2)2-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-R4-R5의 기인 것인 폴리머.
  13. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 각 R5은 독립적으로:
    Figure pct00144
    ;
    Figure pct00145
    ;
    Figure pct00146
    ;
    Figure pct00147
    ;
    Figure pct00148
    ;
    Figure pct00149
    ;
    Figure pct00150
    ;
    Figure pct00151
    ;
    Figure pct00152
    ;
    Figure pct00153
    ;
    Figure pct00154
    ; 및
    Figure pct00155
    이고,
    식 중에서,
    각각의 R2은 독립적으로 수소, 또는 a C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기이거나, R2은 제2의 R2와 조합되어 헤테로고리기를 형성하고;
    R7은 C1-C50 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기이고, 선택적으로 하나 이상의 아민에 의해 치환되며;
    z는 1 내지 5의 정수이고;
    c는 0 내지 50의 정수이며;
    Y는 선택적으로 존재하고, 절단가능한 링커이고;
    n은 0 내지 50의 정수이며; 및
    R8은 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티인 것인 폴리머.
  14. 청구항 10 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, R4은 -C(O)-O-인 것인 폴리머.
  15. 청구항 10 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, R5은
    Figure pct00156
    또는
    Figure pct00157
    인 것인 폴리머.
  16. 청구항 10 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, (m1+m2+m3+m4)/(n1+n2)의 비는 약 25 이하, 및 선택적으로 약 1 이상인 것인 폴리머.
  17. 청구항 10 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티는:
    Figure pct00158
    ;
    Figure pct00159
    ;
    Figure pct00160
    ;
    Figure pct00161
    ;
    Figure pct00162
    ;
    Figure pct00163
    ; 또는
    Figure pct00164
    ,
    식 중에서, 각각의 R9, R10, R11, 및 R12은 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C4 알킬, 또는 C1-C4 알콕시이고, 선택적으로 하나 이상의 아미노기에 의해 치환된 것인 폴리머.
  18. 청구항 10에 있어서, 하기 식 4의 구조를 갖고:
    Figure pct00165

    식 4
    식 중에서, m1, m2, n1, n2, R3a, R3b, R13, X1, X2, A1, 및 A2는 청구항 10에 정의된 바와 같은 것인 폴리머.
  19. 청구항 10에 있어서, 하기 식 1B의 구조를 갖고:
    Figure pct00166

    식 중에서,
    c는 0 내지 50의 정수이고;
    Y는 선택적으로 존재하고, 절단가능한 링커이며;
    R1은 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알킬기, 또는 C3-C12 시클로알케닐기이고, 선택적으로 하나 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있으며;
    각각의 R2은 독립적으로 수소 또는 C1-C12 알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알킬기, 또는 C3-C12 시클로알케닐기이고; 및
    R6은 수소, 아미노기, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, C1-C12 헤테로알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알킬기, 또는 C3-C12 시클로알케닐기이고, 이들은 선택적으로 하나 이상의 아민에 의해 치환되거나; 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티이고;
    m1, m2, n1, n2, R3a, R3b, R13, X1, X2, A1, 및 A2는 청구항 10에 정의된 바와 같은 것인 폴리머.
  20. 청구항 10에 있어서, 식 1C의 구조를 갖고:
    Figure pct00167

    식 중에서.
    R1은 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알킬기, 또는 C3-C12 시클로알케닐기이고, 선택적으로 하나 이상의 치환기에 의해 치환되고; 및
    R6은 수소, 아미노기, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, C1-C12 헤테로알킬기, C2-C12 알케닐기, C3-C12 시클로알킬기, 또는 C3-C12 시클로알케닐기이고, 선택적으로 하나 이상의 아민에 의해 치환되거나; 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티이고; 및
    m1, m2, n1, n2, R3a, R3b, R13, X1, X2, A1, 및 A2는 청구항 8에 정의된 바와 같은 것인 폴리머.
  21. 청구항 10에 있어서, 하기 식을 갖고:
    Figure pct00168

    폴리머 1,
    Figure pct00169

    폴리머 2,
    Figure pct00170

    폴리머 3,
    Figure pct00171

    폴리머 4,
    Figure pct00172

    폴리머 5,
    Figure pct00173

    폴리머 6,
    Figure pct00174

    폴리머 7,
    Figure pct00175

    폴리머 8,
    Figure pct00176

    폴리머 9,
    Figure pct00177

    폴리머 10,
    Figure pct00178

    폴리머 11,
    Figure pct00179

    폴리머 12,
    Figure pct00180

    폴리머 13,
    Figure pct00181

    폴리머 14,
    Figure pct00182

    폴리머 15,
    Figure pct00183

    폴리머 16,
    Figure pct00184

    폴리머 17,
    Figure pct00185

    폴리머 18,
    Figure pct00186

    폴리머 19,
    Figure pct00187

    폴리머 20,
    Figure pct00188

    폴리머 21,
    Figure pct00189

    폴리머 22,
    Figure pct00190

    폴리머 23,
    Figure pct00191

    폴리머 24,
    Figure pct00192

    폴리머 25,
    Figure pct00193

    폴리머 26,
    Figure pct00194

    폴리머 27,
    Figure pct00195

    폴리머 28,
    Figure pct00196

    폴리머 29,
    Figure pct00197

    폴리머 30,
    Figure pct00198

    폴리머 31,
    Figure pct00199

    폴리머 32,
    Figure pct00200

    폴리머 33,
    Figure pct00201

    폴리머 34,
    Figure pct00202

    폴리머 35,
    Figure pct00203

    폴리머 36,

    Figure pct00204

    폴리머 37,
    Figure pct00205

    폴리머 38,
    Figure pct00206

    폴리머 39,
    Figure pct00207

    폴리머 40,
    Figure pct00208

    폴리머 41,
    Figure pct00209

    폴리머 42,
    Figure pct00210

    폴리머 43,
    Figure pct00211

    폴리머 44,
    Figure pct00212

    폴리머 45,
    Figure pct00213

    폴리머 46,
    Figure pct00214

    폴리머 47,
    Figure pct00215

    폴리머 48,
    Figure pct00216

    폴리머 49,
    Figure pct00217

    폴리머 50,
    Figure pct00218

    폴리머 51,
    Figure pct00219

    폴리머 52,
    Figure pct00220

    폴리머 53,
    Figure pct00221

    폴리머 54,
    Figure pct00222

    폴리머 55,
    Figure pct00223

    폴리머 56,
    Figure pct00224

    폴리머 57,
    Figure pct00225

    폴리머 58,
    Figure pct00226

    폴리머 59,
    Figure pct00227

    폴리머 60,
    Figure pct00228

    폴리머 61,
    Figure pct00229

    폴리머 62,
    Figure pct00230

    폴리머 63,
    Figure pct00231

    폴리머 64,
    Figure pct00232

    폴리머 65,
    Figure pct00233

    폴리머 66, 또는
    Figure pct00234

    폴리머 67,
    식 중에서, (a+b)는 약 5 내지 약 65이고, (c+d)는 약 2 내지 약 60이며, (e+f)는 약 2 내지 약 60인 것인 폴리머
  22. 청구항 10에 있어서, 상기 폴리머는:
    Figure pct00235

    폴리머 68, 또는
    Figure pct00236

    폴리머 69의 식을 갖고,
    식 중에서, (a+b)는 약 5 내지 약 65이고, (c+d)는 약 2 내지 약 60이며, 각각의 p는 2 내지 200의 정수인 것인 폴리머.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머는 양이온성 폴리머인 것인 폴리머.
  24. 청구항 10에 따른 식 1의 폴리머를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 하기 식 4의 폴리머를 제공하는 단계:
    Figure pct00237

    식 4
    및
    (b) 식 4의 폴리머의 A1 및/또는 A2 기의 부분을 변형시켜 하기 식 1의 폴리머를 제공하는 단계:
    Figure pct00238
    를 포함하고,
    식 1 및 4의 m1, m2, m3, m4, n1, n2 R3a, R3b, R13, X1, X2, A1, A2, B1, 및 B2는 청구항 10에 정의된 바와 같은 것인 방법.
  25. 청구항 21에 있어서, 식 4의 폴리머의 A1 및/또는 A2기의 부분을 변형시키는 단계는 상기 기의 부분을 하기 구조:
    Figure pct00239
    ,
    Figure pct00240
    , 또는
    Figure pct00241

    를 갖는 화합물과 반응시켜 식 1의 폴리머를 제공하는 것을 포함하고,
    A1 및 A2는 각각 독립적으로
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2;
    ―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2 2]2;
    ―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2R2}; 또는
    ―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2 2]2}2의 기를 갖고,
    식 중에서, B1 및 B2는:
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R4-R5;
    ―(CH2)p2―N[―(CH2)q2―NR2-(CH2)s2-R4-R5]2;
    ―(CH2)p3―N{[―(CH2)q3―NR2 2][―(CH2)q4―NR2―]r2(CH2)s3-R4-R5};
    ―(CH2)p4―N{―(CH2)q5―N[―(CH2)q6―NR2-(CH2)s4-R4-R5]2}2;
    ―(CH2)p1―[N{(CH2)s1-R4-R5}―(CH2)q1―]r1NR2 2; 또는
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-CH(CONH2)-(CH2)s1-R4-R5인 것인 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, A1 및 A2는 모두:
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2 2이고;
    B1 및 B2는 모두:
    ―(CH2)p1―[NR2―(CH2)q1―]r1NR2-(CH2)s1-R4-R5인 것인 방법.
  27. 청구항 18에 따른 식 4의 폴리머를 제조하는 방법으로서:
    Figure pct00242

    식 4
    상기 방법은:
    (I) 하기 식 2:
    Figure pct00243

    식 2
    의 폴리머를 (a) 식 HNR13A1 및/또는 HNR13A2의 화합물; 및 (b) 식 H2NX2 또는 HOX2의 화합물과 동시에 또는 임의의 순차적 순서로 반응시키는 단계; 또는
    (II) 하기 식 3:
    Figure pct00244

    식 3
    의 폴리머를 식 HNR13A1 및/또는 HNR13A2의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하고,
    식 중에서,
    p1는 1 내지 2000의 정수이고;
    p2는 1 내지 2000의 정수이며;
    각각의 R3은 독립적으로 메틸렌기 또는 에틸렌기이고;
    m1, m2, n1, n2, R3a , R3b , R13, X1 , X2, A1, 및 A2는 청구항 10에 정의된 바와 같은 것인 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 식 2 또는 식 3의 구조를 포함하는 폴리머는 각각 하기 식 2A 또는 식 3A의 폴리머이고:
    Figure pct00245

    식 2A 또는
    Figure pct00246

    식 3A ;
    식 중에서,
    p1는 1 내지 2000의 정수이고;
    p2는 1 내지 2000의 정수이며;
    각각의 R3은 독립적으로 메틸렌기 또는 에틸렌기이고;
    각각의 X1는 독립적으로 ―C(O)O―, ―C(O)NR13―, ―C(O)―, ―S(O)(O)―, 또는 결합이며;
    각각의 X2는 독립적으로 C1-C12 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로알킬기, 헤테로고리기, 또는 이들의 조합이고, 선택적으로 하나 이상의 일차 아민, 이차 아민, 또는 삼차 아민을 포함하며; 하나 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있고;
    c는 0 내지 50의 정수이며;
    Y는 선택적으로 존재하고, 절단가능한 링커이며;
    R1은 수소, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기, 또는 선택적으로 하나 이상의 치환기에 의해 치환된 C1-C12 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이고; 및
    R6은 수소, 아미노기, 아릴기, 헤테로고리기, C1-C12 알킬기, C1-C12 헤테로알킬기, 알케닐기, 시클로알킬기, 또는 시클로알케닐기, 선택적으로 하나 이상의 아민으로 치환된, C1-C12 직쇄 또는 분지쇄 알킬기; 또는 조직-특이적 또는 세포-특이적 표적화 모이어티이며; 및
    p1, p2, R3, X1, 및 X2는 청구항 27에 정의된 바와 같은 것인 방법.
  29. 청구항 27에 있어서, 식 2 또는 식 3의 구조를 포함하는 폴리머는 각각 하기 식 2B 또는 식 3B의 폴리머이고:
    Figure pct00247

    식 2B 또는
    Figure pct00248

    식 3B;
    식 중에서,
    p1, p2, R3, X1, 및 X2는 청구항 27에 정의된 바와 같은 것인 방법.
  30. 청구항 27에 있어서, 식 2의 화합물을 (a) HNR13A1 및/또는 HNR13A2의 화합물 및 (b) 식 H2NX2 또는 HOX2의 화합물과 조합하는 단계를 포함하고 상기 (a) 및 (b)는 약 1:10 내지 약 1:150, 선택적으로 약 1:40 내지 약 1:150, 또는 약 1:80 내지 약 1:150의 몰비로 존재하는 것인 방법.
  31. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항의 폴리머 및 핵산 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 조성물은 가이드 핵산 및/또는 공여체(donor) 핵산을 포함하는 것인 조성물.
  33. 청구항 31 또는 32에 있어서, 상기 조성물은 엔도뉴클라아제를 포함하는 것인 조성물.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 조성물은 RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 RNA-유도 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cpf1, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  36. 청구항 31 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 DNA 재조합효소(DNA recombinase)를 포함하는 것인 조성물.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 DNA 재조합효소는 Cre 재조합효소인 것인 조성물.
  38. 청구항 31 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 ZFN(zinc finger nuclease)을 포함하는 것인 조성물.
  39. 청구항 31 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 TALEN(transcription activator-like effector nuclease)을 포함하는 것인 조성물.
  40. 청구항 31 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항의 폴리머 및 핵산 또는 폴리펩티드를 나노입자를 포함하는 것인 조성물.
  41. 청구항 31 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 폴리에틸렌 옥시드를 포함하는 제2 폴리머를 포함하는 것인 조성물.
  42. 세포에 핵산 및/또는 폴리펩티드를 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 31 내지 41 중 어느 한 항의 조성물을 상기 세포에 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 세포는 개체 내에 있고, 청구항 30 내지 40 중 어느 한 항의 조성물이 상기 개체에 투여되는 것인 방법.
  44. 청구항 42 또는 43에 있어서, 상기 폴리머는 상기 개체의 말초신경계, 중추신경계, 간, 근육, 폐, 뼈, 또는 눈의 조직에 상기 폴리머를 국재화시키는 조직-특이적 표적화 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 폴리머는 종양 세포에 우선적으로 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  46. 청구항 42 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 RNA-유도 엔도뉴클레아제 또는 이를 코딩하는 핵산, 가이드 핵산, 및 공여체 핵산 중 하나 이상을 포함하고, 상기 조성물은 상기 세포에서 표적 유전자의 편집을 촉진하는 것인 방법.
  47. 청구항 42 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 숙주, 선택적으로 인간 내에 있고, 상기 조성물은 상기 조성물을 상기 숙주에게 투여하는 것에 의해 상기 세포에 전달되는 것인 방법.
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