CN113355357A - 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于操纵序列和/或靶序列的活性的系统、方法、和组合物的工程化和优化。提供了涉及具体地包括Cas直向同源物酶的CRISPR复合物的组分的组合物以及方法。

Description

对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程 化和优化
本申请是申请日为2013年12月12日、申请号为201380072821.X、发明名称 为“对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化”的发明 专利申请的分案申请。
相关应用和引用参考
本申请要求于2013年6月17日提交的标题为用于序列操纵的系统、方法和酶 组合物的工程化和优化(ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF IMPROVED SYSTEMS,METHODS ANDENZYME COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION)的美国临时专利申请61/836,101的优先权。本申请还要求美国 临时专利申请61/758,468；61/769,046；61/802,174；61/806,375；61/814,263； 61/819,803以及61/828,130的优先权，每个的标题为对用于序列操纵的系统、方法 以及组合物进行的工程化和优化，分别提交于2013年1月30日；2013年2月25日；2013年3月15日；2013年3月28日；2013年4月20日；2013年5月6日 以及2013年5月28日。本申请还要求分别于2012年12月12日和2013年1月2 日提交的标题均为“用于序列操纵的系统、方法和组合物(SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCEMANIPULATION)”的美国临时专利申 请61/736,527和61/748,427的优先权。还要求分别提交于2013年3月15日和2013 年6月17日的美国临时专利申请61/791,409和61/835,931的优先权。
参考了美国临时专利申请61/836,127、61/835,936、61/836,080、61/836,123以及61/835,973，每个提交于2013年6月17日。
前述申请、以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文献或(“申请引 用文献”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文献、以及在本文中引用 或参考的所有文献(“本文引用的文献”)、在本文中引用的文献中引用或参考的 所有文献，连同针对在本文中提及或通过引用结合在本文中的任何文献中的任何产 品的任何制造商的说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用并入本文， 并且可以在本发明的实践中采用。更具体地说，所有参考的文献均通过引用并入本 文，其程度如同每个单独的文献被确切地并单独地指明通过引用而并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物 的工程化和优化，该序列靶向例如涉及规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR) 及其组分的基因组干扰或基因编辑。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院颁发的NIH先锋奖(Pioneer Award)(1DP1MH100706)的政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
发明背景
在基因组测序技术和分析方法中的最新进展显著加速了对与范围广泛的生物 功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。精确的基因组靶向技术对于 通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的统性逆向工程成为 可能、以及推进合成生物学、生物技术应用、和医学应用是需要的。虽然基因组编 辑技术，如设计师锌指、转录激活子样效应因子(TALE)、或归巢大范围核酸酶 (homing meganuclease)对于产生靶向的基因组干扰是可得的，但是仍然需要负担 得起的、易于建立的、可扩展的、并且便于靶向真核基因组内的多个位置的新的基 因组工程技术。
发明概述
CRISPR/Cas或CRISPR-Cas系统(两个术语在本申请通篇可互换地使用)不 要求产生靶向特异性序列的定制蛋白，而是通过一个短RNA分子识别一个特异性 DNA靶标，可以对单个Cas酶进行程序设计，换句话说可以使用所述短RNA分子 将Cas酶募集到一个特异性DNA靶标。将该CRISPR-Cas系统添加到基因组测序 技术和分析方法的组库中可以显著使该方法论简化并且提高对与范围广泛的生物 功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。为了有效而无有害作用地利 用CRISPR-Cas系统用于基因组编辑，了解这些基因组工程工具的工程化和优化方 面是至关重要的，这些方面是请求保护的本发明的方面。
因此，对于用于一系列广泛的应用的序列靶向的替代性的稳健的系统和技术存在着迫切需要。本发明的多个方面着手解决这种需要并且提供了相关优点。一种示 例性CRISPR复合物包括与杂交到靶多核苷酸内的一个靶序列的一种指导序列复合 的一种CRISPR酶，其中该CRISPR酶是以下属的一种Cas直向同源物，例如一种 Cas9直向同源物，该属包括但不限于棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺 旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、类杆 菌属、Flaviivola、黄质菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌 属、罗氏菌属、细小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体 属以及弯曲杆菌属。该指导序列与一种tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而 与一种tracr序列杂交。
在一个方面，本发明提供了用于使用CRISPR系统的一个或多个元件的方法。 本发明的CRISPR复合物提供了用于修饰靶多核苷酸的有效手段。本发明的 CRISPR复合物具有多种多样的实用性，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失 活、激活、阻抑、改变甲基化、转移特定部分)多种细胞类型中的靶多核苷酸。正 因为如此，本发明的CRISPR复合物在例如基因或基因组编辑、基因调节、基因治 疗、药物发现、药物筛选、疾病诊断、以及预后中具有广阔的应用谱。在本发明的 优选方面，该CRISPR复合物包括一种Cas酶，优选地以下属的一种Cas9直向同 源物，该属包括但不限于棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线 菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、类杆菌属、Flaviivola、 黄质菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细 小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以及弯曲杆菌属。
本发明的方面涉及具有优化功能的CRISPR酶。至于是一种Cas酶的CRISPR 酶，本发明的优选实施例涉及在一种CRISPR-Cas9系统中具有改进的靶特异性的 Cas9直向同源物。这可通过以下途径达到，这些途径包括但不限于设计并且制备 具有最佳活性的指导RNA，选择具有特定长度的Cas9酶，截短该Cas9酶使得它 在长度上比通过截短编码它的核酸分子而对应的野生型Cas9酶更小并且产生嵌合 的Cas9酶，其中该酶的不同部分在不同直向同源物之间被调换或交换以得到具有 定制的特异性的嵌合酶。本发明的方面也涉及改进Cas9直向同源物酶的靶特异性 或设计CRISPR-Cas9系统的方法，所述方法包括设计或制备具有优化活性的指导 RNA和/或选择或制备具有比对应的野生型Cas9更小的尺寸或长度的Cas9直向同 源物酶，由此将编码它的核酸包装到高级的递送载体(因为在该递送载体中它的编 码序列少于对应的野生型Cas9)中，和/或产生嵌合Cas9酶。
还提供了本发明的序列、载体、酶或系统在医学中的用途。还提供了它们用于 基因或基因组编辑中。也提供了其在用于基因或基因组编辑的一种药剂的制造中的 用途，例如通过基因或基因组编辑进行治疗。还提供了用于在治疗中使用的本发明 的序列、载体、酶或系统。
在本发明的另外方面，一种CRISPR酶，例如Cas9酶，可以包含一个或多个 突变，并且可以用作具有或不具有与功能结构域融合或与其可操作地连接的通用 DNA结合蛋白。该突变可以是人工引入的突变并且可包括但不限于催化结构域中 的一个或多个突变。关于Cas9酶的催化结构域的实例可包括但不限于RuvC I、RuvC II、RuvC III以及HNH域。适合突变的优选实例是Cas9的N-端RuvC I结构域中 的一个或多个催化性残基或内部HNH结构域中的一个或多个催化性残基。在一些 实施例中，该Cas9是(或衍生自)化脓链球菌Cas9(SpCas9)。在这样的实施例中， 优选的突变是在SpCas9的任何或所有的10、762、840、854、863和/或986位置 或在其他Cas9直向同源物的关于SpCas9的位置编号的相应位置(其可以例如通过 标准序列比较工具进行确定，例如通过Lasergene 10套件的ClustalW或MegAlign)。 具体地说，在SpCas9中的任何或所有下列突变是优选的：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A；并且还设想了这些置换氨基酸的任何一种的保守性 取代。在其他Cas9直向同源物中的关于SpCas9的位置编号的相应位置处的相同突 变(或这些突变的保守性取代)也是优选的。特别优选的是在SpCas9中的D10和 H840。然而，在其他Cas9中，相应于SpCas9 D10和H840的残基也是优选的。当 单独突变时这些是有利的，他们提供切口酶活性并且当存在两个突变时，该Cas9 被转化至有用于一般DNA结合的一种催化上的无效突变体中。已经鉴定和表征了 其他的突变。本发明的其他方面涉及融合到结构域上或与其可操作连接的突变的 Cas 9酶，这些结构域包括但不限于，转录激活剂、转录阻抑物、重组酶、转座酶、 组蛋白重塑剂(histone remodeler)、DNA甲基转移酶、隐花色素、光可诱导/可控制结构域或化学可诱导/可控制结构域。
本发明的另一个方面提供嵌合的Cas9蛋白以及产生嵌合的Cas9蛋白的方法。 嵌合的Cas9蛋白是包括如下片段的蛋白质，所述片段起源于不同的Cas9直向同源 物。例如，一种第一Cas9直向同源物的N-末端可与一种第二Cas9直向同源物的 C-末端融合，以产生一种生成的Cas9嵌合蛋白。比较于个体Cas9酶(该嵌合蛋白 是从其产生的)中任一种的原始特异性或效率，这些嵌合的Cas9蛋白可具有更高 特异性或更高效率。这些嵌合蛋白也可包括一个或多个突变或可连接至一个或多个 功能结构域。因此，本发明的方面涉及一种嵌合Cas酶，其中该酶包括来自一种第 一Cas直向同源物的一个或多个片段以及来自一种第二Cas直向同源物的一个或多 个片段。在本发明的一个实施例中，该第一Cas直向同源物或第二Cas直向同源物 的一个或多个片段是来自该第一Cas直向同源物或第二Cas直向同源物的C-末端 或N-末端。在另外一个实施例中，该第一Cas直向同源物或第二Cas直向同源物是选自属于以下组的一个属，该组由以下各项组成：棒状杆菌属、萨特氏菌属、军 团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟 杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟 菌属、罗氏菌属、细小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原 体属以及弯曲杆菌属。
在另一个实施例中，本发明提供用以产生包括一种Cas酶(例如Cas9直向同 源物)的CRISPR复合物的突变体组分的方法。这些突变体组分可包括但不限于突 变体tracrRNA和允许增强这些RNA在细胞中的性能的tracr匹配序列或突变体嵌 合指导序列。也提供了本发明的组合物或酶在制备用于修饰靶序列的一种药物中的 用途。
本发明在又另一个方面提供了涉及一种非天然存在的或工程化组合物的多种 组合物以及方法，该组合物包括：
A)-I.一种CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列，其中该多 核苷酸序列包含：
(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，
(b)一种tracr配对序列，和
(c)一种tracr序列，以及
II.对包含至少一个或多个核定位序列的CRISPR酶进行编码的多核苷酸序列，
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂 交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且编码CRISPR酶的多 核苷酸序列是DNA或RNA，
或者
(B)I.多核苷酸，其包含：
(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到原核细胞中的靶序列上，和
(b)至少一个或多个tracr配对序列，
II.一种编码CRISPR酶的多核苷酸序列，以及
III.一种包含tracr序列的多核苷酸序列
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂 交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且编码CRISPR酶的多 核苷酸序列是DNA或RNA，并且
其中该CRISPR酶是属于以下组的一个属的一种Cas9直向同源物，该组由以 下各项组成：棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆 菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、 Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细小棒菌属 (Parvibaculum)、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以及弯曲杆菌属。
本发明在又另一个方面提供：(A)一种非天然存在的或工程化的组合物，该 组合物包含一种载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包 含：
I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一个CRISPR-Cas系统 嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含(a)一个能够杂 交到真核细胞中的靶序列上的指导序列，(b)一种tracr配对序列，和(c)一种 tracr序列，以及II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码 CRISPR酶的酶编码序列上，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列，其中 (a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中组分I和II位于该系统的相同或不同 载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列 引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包 含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中该CRISPR酶是属于以下组的一个属的一种Cas9 直向同源物，该组由以下各项组成：棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋 体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、 黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细 小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以及弯曲杆菌属， 或者(B)一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含一种载体系统，该 载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含I.一种第一调节元件，该 第一调节元件可操作地连接到(a)能够杂交到原核细胞中的靶序列上的指导序列、 和(b)至少一个或多个tracr配对序列，II.一种第二调节元件，该第二调节元件 可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，以及III.一种第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接到tracr序列上，其中组分I、II和III位于该系统的相 同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该 指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR 复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上 的tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中该CRISPR酶是属于以下组的一个属的 一种Cas9直向同源物，该组由以下各项组成：棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌 属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌 属、Flaviivola、黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、 罗氏菌属、细小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以 及弯曲杆菌属，并且其中：适用以下标准中的至少一个。
这些标准如下并且应理解这些中的任意数目可适用，优选地1个或更多，优选 地2个或更多，并且优选地3个或更多，4个或更多，或5个或更多，或所有都可 适用：
-该CRISPR酶具有所选择的特定尺寸并且具有以下长度：至少500个氨基酸， 至少800-899个氨基酸，至少900-999个氨基酸，至少1000-1099个氨基酸，至少 1100-1199个氨基酸，至少1200-1299个氨基酸，至少1300-1399个氨基酸，至少 1400-1499个氨基酸，至少1500-1599个氨基酸，至少1600-1699个氨基酸或至少 2000个氨基酸；
-和/或相比于对应的野生型CRISPR酶，该CRISPR酶是截短的；
-和/或该CRISPR酶是引导在该靶序列的位置处的两条链的切割的一种核酸 酶，或该CRISPR酶是引导在该靶序列的位置处的一条链的切割的一种切口酶；
-和/或该指导序列包括至少10、至少15或至少20个核苷酸；
-和/或该CRISPR酶是密码子优化的或经密码子优化以表达于真核细胞中；
-和/或该CRISPR酶包括一个或多个突变；
-和/或该CRISPR酶包括嵌合CRISPR酶；
-和/或该CRISPR酶具有此处讨论的一个或多个其他属性。
在一些实施例中，该CRISPR酶相比于一种野生型CRISPR酶是截短的或该 CRISPR酶是由以下组成：至少500个氨基酸，至少800-899个氨基酸，至少900-999 个氨基酸，至少1000-1099个氨基酸，至少1100-1199个氨基酸，至少1200-1299 个氨基酸，至少1300-1399个氨基酸，至少1400-1499个氨基酸，至少1500-1599 个氨基酸，至少1600-1699个氨基酸或至少2000个氨基酸。在优选实施例中，该 CRISPR酶是Cas酶，例如Cas9直向同源物。
在一些实施例中，该CRISPR酶是引导在该靶序列的位置处的两条链的切割的 一种核酸酶，或该CRISPR酶是引导在该靶序列的位置处的一条链的切割的一种切 口酶。在另外的实施例中，该CRISPR酶是一种催化上的无效突变体，其是一种通 用DNA结合蛋白质。在优选实施例中，该CRISPR酶是Cas酶，例如Cas9直向同 源物。
在一些实施例中，该指导序列包括至少十五个核苷酸。在一些实施例中，该CRISPR酶是密码子优化的或经密码子优化以表达于真核细胞中。在一些实施例中， 该CRISPR酶包括一个或多个突变。在一些实施例中，该CRISPR酶包括嵌合 CRISPR酶。在一些实施例中，该CRISPR酶具有此处讨论的一个或多个其他属性。 在优选实施例中，该CRISPR酶是Cas酶，例如Cas9直向同源物。
在某些实施例中，该CRISPR酶包括一个或多个突变。该一个或多个突变可以 处于该酶的一个具体结构域中。在一个优选的实施例中，该一个或多个突变可以处 于一个催化结构域中。在另一个优选实施例中，该催化结构域是RuvC I、RuvC II、 RuvC III或HNH结构域。在一个更优选实施例中，该一个或多个突变处于该CRISPR 酶的RuvC1或HNH结构域中。在另一个优选实施例中，该CRISPR酶是Cas酶， 例如Cas9直向同源物，并且该突变可处于包括但不限于如下位置的一个或多个位 置，所述位置关于SpCas9的位置编号对应于D10A、E762A、H840A、N854A、 N863A或D986A，和/或是如此处另外讨论的一种突变。在一些实施例中，该CRISPR 酶具有在该酶的一个具体结构域中的一个或多个突变，其中在转录时，该tracr配 对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该酶进一步包含一个功能结构域。该功能结构域可包括 但不限于，转录激活剂、转录阻抑物、重组酶、转座酶、组蛋白重塑剂(histone remodeler)、DNA甲基转移酶、隐花色素、光可诱导/可控制结构域或化学可诱导 /可控制结构域。
在一些实施例中，该功能结构域是转录激活剂结构域VP64。在一些实施例中， 该功能结构域是转录阻抑物结构域KRAB。在一些实施例中，该转录阻抑物结构域 是SID、或SID的多联体(即SID4X)。在一些实施例中，提供了一种表观遗传修 饰酶，例如一种组蛋白修饰蛋白或一种表观遗传染色质修饰蛋白。在一些实施例中， 提供了一个激活剂结构域，其可以是P65激活剂结构域。
本发明的另一个方面包括修饰感兴趣的两个或更多个基因组座位的方法。在本发明的一个优选实施例中，通过利用一种或多种CRISPR酶(例如两种或更多种 Cas9直向同源物，每个直向同源物可操作地连接到一个或多个功能结构域)，两 个或更多个基因组座位被区别地调节。在一个方面，本发明提供了在真核细胞中修 饰两个或更多个基因组座位的方法。因此，本发明的方面提供了用于在生物体中调 节感兴趣的两个或更多个基因组座位的表达的方法，该方法包括递送一种非天然存 在的或工程化的组合物，该组合物包含一种载体系统，该载体系统包含一种或多种 载体，该一种或多种载体包含
I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种第一CRISPR-Cas 系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该第一多核苷酸序列包含：
(i)一种第一指导序列，该第一指导序列能够杂交至该生物体的细胞中的一 个第一基因组座位处的一个第一靶序列，
(ii)一种第一tracr配对序列，和
(iii)一种第一tracr序列，和
II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到一种第二CRISPR-Cas 系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该第二多核苷酸序列包含
(i)一种第二指导序列，该第二指导序列能够杂交至该生物体的细胞中的一 个第二基因组座位处的一个第二靶序列，
(ii)一种第二tracr配对序列，和
(iii)一种第二tracr序列，和
III.一种第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接到编码一种第一 CRISPR酶的酶编码序列上，该第一CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列并 且可操作地连接到一个第一功能结构域，
IV.一种第四调节元件，该第四调节元件可操作地连接到编码一种第二 CRISPR酶的酶编码序列上，该第二CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列并 且可操作地连接到一个第二功能结构域，其中I和II中的(i)、(ii)和(ii)以5’ 到3’方向排列，其中组分I、II、III和IV位于该系统的相同或不同载体上，其中在 转录时，每个tracr配对序列杂交到其相应的tracr序列上，并且该第一指导序列和 第二指导序列引导该第一CRISPR复合物和第二CRISPR复合物与该第一靶序列和 第二靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序 列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶， 并且其中该CRISPR酶的表达提供对该靶序列的操纵，其中该第一CRISPR酶和第 二CRISPR酶各自包括两个或更多个突变，其中该第一CRISPR酶和第二CRISPR 酶是属于以下组的一个属的一种Cas9直向同源物，该组由以下各项组成：棒状杆 菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳 杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、 葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、Nitratifractor、 支原体属以及弯曲杆菌属，并且其中该第一基因组座位是通过该第一功能结构域的 活性来调节，并且该第二基因组座位是通过该第二功能结构域的活性来调节。在另 一个实施例中，该第一功能结构域是选自下组，该组由以下各项组成：转录激活剂、 转录阻抑物、重组酶、转座酶、组蛋白重塑剂、DNA甲基转移酶、隐花色素、以 及光可诱导/可控制结构域或化学可诱导/可控制结构域。在另一个实施例中，该第 二功能结构域是选自下组，该组由以下各项组成：转录激活剂、转录阻抑物、重组 酶、转座酶、组蛋白重塑剂、DNA甲基转移酶、隐花色素、以及光可诱导/可控制 结构域或化学可诱导/可控制结构域。在优选实施例中，该第一CRISPR酶或第二 CRISPR酶是沃兹沃思萨特氏菌Cas9、龈沟产线菌(Filifactor alocis)Cas9、约氏 乳杆菌Cas9、红嘴鸥弯曲杆菌Cas9、白喉棒状杆菌Cas9、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)Cas9、鸡毒支原体Cas9、金黄色葡萄球菌金黄色 亚种Cas9、巴黎嗜肺军团菌Cas9、齿垢密螺旋体Cas9、伪中间型葡萄球菌Cas9、 灰色奈瑟菌Cas9。
在一些实施例中，该CRISPR酶是I型、II型或III型CRISPR酶，优选II型 CRISPR酶。这种II型CRISPR酶可以是任何Cas酶。一种Cas酶可以被鉴定为 Cas9，因为这可以是指与来自II型CRISPR系统的具有多个核酸酶结构域的最大核 酸酶共享同源性的酶的通用类别。最优选地，该Cas9酶来自或衍生自SpCas9或金 黄色葡萄球菌金黄色亚种SaCas9。关于衍生，意指该衍生的酶在很大程度上是基 于与野生型酶具有高度序列同源性的含义，但是如本文所述它在某些方面已经被突 变(修饰)。
应当理解的是，术语Cas和CRISPR酶在本文中通常可互换地使用，除非另外 说明。如上提及的，在本文中使用的许多残基编号是指来自化脓链球菌中的II型 CRISPR位点的Cas9酶。然而，应当理解的是，本发明包括更多的来自其他微生物 物种的Cas9s，例如属于以下属的那些，棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密 螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、 Flaviivola、黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗 氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属或弯曲杆菌属，例如 SpCas9、SaCas9、St1Cas9、St3Cas9等等，其中St是嗜热链球菌。
本文中提供了在这种情形下针对人类进行优化(即，针对在人类中表达进行优化)的密码子优化序列的实例，参见SaCas9人类密码子优化序列。在这被优化的 同时，应当理解其他实例是可能的并且针对宿主物种的密码子优化是已知的。
本发明的其他方面涉及改进的切割特异性，优化的tracr序列，优化的嵌合的 指导RNA，tracrRNA以及tracr配对序列的共折叠结构，稳定tracr RNA的二级结 构，具有缩短的碱基配对区域的tracrRNA，具有融合的RNA元件的tracrRNA，简 化的克隆以及递送，减少的毒性和/或可诱导的系统。本发明的另一个方面涉及嵌 合的RNA和/或CRISPR复合物的指导序列以及或其一个部分的稳定化，其中该 CRISPR酶是一种CRISPR直向同源物，其中该嵌合的RNA和/或指导序列以及或 其一个部分是通过合成的或化学修饰的核苷酸(例如LNA/BNA：硫醇修饰， 2’/3’-OH交联修饰)稳定的，被修饰以成为耐受降解/水解的，并且已向其添加了 结构稳定性的元件。
本发明在某些实施例中进一步包括一种通过操纵在感兴趣的基因组座位中的 靶序列来修饰一种生物或非人类生物的方法，该方法包括递送一种包含含有一种或 多种载体的载体系统的非天然存在的或工程化的组合物，该一种或多种载体可操作 地编码此处讨论的组合物以用于对该组合物进行表达。优选地，该载体可以是病毒 载体，如慢病毒或杆状病毒或优选地腺病毒/腺病毒相关病毒载体，但是其他递送 手段也是已知的(如酵母系统、微囊泡、基因枪/将载体附接到金纳米粒子上的手 段)并且被提供。
本文描述了各种递送手段，并且进一步在这个部分中进行论述。
病毒递送：该CRISPR酶，例如Cas9，和/或任何本发明的RNA，例如指导 RNA，可以使用腺相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒或其他病毒载体类型、或 其组合进行递送。Cas9以及一种或多种指导RNA可以包装到一种或多种病毒载体 中。在一些实施例中，病毒载体可以，例如，通过肌肉注射递送到感兴趣组织中， 而有时经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行病毒递送。这 样的递送可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待递 送的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如载体选择、靶细胞、生 物、或组织、有待治疗的受试者的一般状况、所寻求的转化/修饰的程度、给药途 径、给药方式、所寻求的转化/修饰的类型，等等。
这样的剂量可以进一步含有，例如，载体(水、盐水、乙醇、甘油、乳糖、蔗 糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油，等等)、稀释剂、药 学上可接受的载体(例如，磷酸盐缓冲盐水)、药学上可接受的赋形剂、增强抗原 性的佐剂、免疫刺激化合物或分子、和/或本领域已知的其他化合物。本文的佐剂 可以含有抗原被吸附到其上的矿物质(明矾、氢氧化铝、磷酸铝)的悬浮液；或油 包水乳剂，其中抗原溶液被乳化在油中(MF-59，弗氏不完全佐剂)，有时包含有 杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性(抑制抗原的降解和/或引 起巨噬细胞的移入)。佐剂还包括免疫刺激分子，如细胞因子、共刺激分子，例如， 免疫刺激DNA或RNA分子，如CpG寡核苷酸。这样一种剂量配方可由本领域技 术人员容易地确定。该剂型可以进一步含有一种或多种药学上可接受的盐，例如像， 无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、等等；以及有机酸盐，如乙酸盐、 丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。另外，也可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化 剂、pH缓冲物质、凝胶或胶凝材料、调味剂、着色剂、微球体、聚合物、悬浮剂 等等。另外，也可以存在一种或多种其他常规药用成分，如防腐剂、保湿剂、悬浮 剂、表面活性剂、抗氧化剂、抗结剂、填充剂、螯合剂、包衣剂、化学稳定剂等等， 尤其是该剂型是可复原形式时。适合的示例性成分包括微晶纤维素、羧甲基纤维素 钠、聚山梨酯80、苯乙醇、三氯叔丁醇、山梨酸钾、抗坏血酸、二氧化硫、没食 子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚、对氯酚、明胶、白蛋白和 它们的组合。药学上可接受的赋形剂的彻底论述可获自《雷明顿药物科学》 (REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES)(马克出版公司，纽约，1991)， 通过引用将其并入本文。
在本文的一个实施例中，递送是经由腺病毒进行的，其可以是含有至少1×105个腺病毒载体粒子(也称为粒子单位，pu)的单次加强剂量。在本文的一个实施例 中，该剂量优选地是该腺病毒载体的至少约1×106个粒子(例如，约1×106-1×1012个粒子)，更优选至少约1×107个粒子，更优选至少约1×108个粒子(例如，约 1×108-1×1011个粒子或约1×108-1×1012个粒子)，并且最优选至少约1×100个 粒子(例如，约1*×109-1×1010个粒子或约1×109-1×1012个粒子)，或者甚至 至少约1×1010个粒子(例如，约1×1010-1×1012个粒子)。可替代地，该剂量包 含不多于约1×1014个粒子，优选不多于约1×1013个粒子，甚至更优选不多于约1 ×1012个粒子，甚至更优选不多于约1×1011个粒子，并且最优选不多于约1×1010个粒子(例如，不多于约1×109个粒子)。因此，该剂量可以含有单剂量的腺病 毒载体，其具有例如、约1×106粒子单位(pu)、约2×106pu、约4×106pu、约 1×107pu、约2×107pu、约4×107pu、约1×108pu、约2×108pu、约4×108pu、 约1×109pu、约2×109pu、约4×109pu、约1×1010pu、约2×1010pu、约4×1010 pu、约1×1011pu、约2×1011pu、约4×1011pu、约1×1012pu、约2×1012pu、 或约4×1012pu的腺病毒载体。参见，例如，在2013年6月4日授权的授予纳贝 尔(Nabel)等人的美国专利号8,454,972B2中的腺病毒载体(通过引用并入本文)以及在其第29栏第36-58行的剂型。在本文的一个实施例中，该腺病毒是经由多 剂量递送的。
在本文的一个实施例中，该递送是经由AAV进行的。用于针对人类的AAV 的体内递送的治疗有效剂量被认为处于含有从约1×1010到约1×1010个功能 AAV/ml溶液的从约20到约50ml的盐水溶液的范围内。该剂量可以调整以便使治 疗益处相对于任何副作用的平衡。在本文的一个实施例中，AAV剂量大致处于从 约1×105到1×1050个基因组AAV、从约1×108到1×1020个基因组AAV、从约 1×1010到约1×1016个基因组、或约1×1011到约1×1016个基因组AAV的浓度范 围内。人类剂量可以是约1×1013个基因组AAV。这样的浓度能以从约0.001ml 到约100ml、约0.05到约50ml、或约10到约25ml的载体溶液进行递送。通过建 立剂量反应曲线的常规试验，本领域普通技术人员可以容易地确立其他有效剂量。 参见，例如，2013年3月26日授权的授予哈加(Hajjar)等人的美国专利号8,404,658 B2，在第27栏第45-60行。
在本文的一个实施例中，该递送是经由质粒进行的。在这样的质粒组合物中， 该剂量应当是足以引出反应的质粒的量。例如，在质粒组合物中的质粒DNA的适 当量可以是从约0.1到约2mg，或从约1μg到约10μg。
本文的剂量是基于平均70kg的个体。给药频率在医学或兽医学从业者(例如 医师、兽医师)或本领域熟练的科学家的范围之内。
可以将病毒载体注射到感兴趣的组织中。对于细胞类型特异性基因组修饰， Cas9的表达可以由细胞类型特异性启动子驱动。例如，肝脏特异性表达可以使用 白蛋白启动子，而神经元特异性表达可以使用突触蛋白I启动子。
RNA递送：该CRISPR酶，例如Cas9，和/或任何本发明的RNA，例如指导 RNA，也可以按RNA的形式递送。可以使用体外转录产生Cas9 mRNA。例如，可 以使用含有下列元件的PCR盒来合成Cas9 mRNA：来自β珠蛋白-polyA尾(一串 120个或更多的腺嘌呤)的T7_启动子-科扎克(kozak)序列(GCCACC)-Cas9-3’ UTR。该盒可以用于经由T7聚合酶的转录。也可以使用体外转录从含有T7_启动 子-GG-指导RNA序列的盒来转录指导RNA。
为了增强表达并且降低毒性，可以使用假-U或5-甲基-C修饰该CRISPR酶和/ 或指导RNA。
可以使用纳米粒子或脂质包膜同时递送CRISPR酶mRNA和指导RNA。
例如，苏X(Su X)、弗里克J(Fricke J)、卡瓦纳DG(Kavanagh DG)、 欧文DJ(IrvineDJ)(“使用脂质包封的pH响应性聚合物纳米粒子的体外和体内 mRNA递送”(“In vitro andin vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymernanoparticles”)《分子药理学》(Mol Pharm.)2011年6月 6；8(3):774-87.doi:10.1021/mp100390w。2011年4月1日电子版描述了生物可 降解的核-壳结构纳米粒子，其具有由磷脂双层壳包封的聚(β-氨基酯)(PBAE) 核。这些被开发为用于体内mRNA递送。该pH响应性PBAE被选择为促进内体破 裂，而该脂质表面层被选择为将聚阳离子核的毒性降低到最低限度。因此，这些对 于递送本发明的RNA是优选的。
此外，迈克尔S D科尔曼(Michael S D Kormann)等人(“在小鼠中递送化学 修饰的mRNA之后治疗蛋白的表达”("Expression of therapeutic proteins after deliveryof chemically modified mRNA in mice):《自然生物技术》(Nature Biotechnology)，第29卷，第154–157页，(2011)2011年1月9日在线公开) 描述了脂质包膜用于递送RNA的用途。脂质包膜的用途在本发明中也是优选的。
mRNA递送方法用于当前的肝脏递送是特别有希望的。
也可以单独递送CRISPR酶mRNA和指导RNA。可以在该指导RNA在给出 时间以待CRISPR酶表达之前递送CRISPR酶mRNA。可以在给予指导RNA之前 1-12小时(优选约2-6小时)给予CRISPR酶mRNA。
可替代地，可以一起给予CRISPR酶mRNA和指导RNA。有利地，可以在初 始给予CRISPR酶mRNA+指导RNA之后1-12小时(优选约2-6小时)给予指导 RNA的第二加强剂量。
为了实现基因组修饰的最有效水平，另外给予CRISPR酶mRNA和/或指导 RNA可以是有用的。
为了将毒性和脱靶效应降低到最低限度，重要的是控制所递送的CRISPR酶 mRNA和指导RNA的浓度。CRISPR酶mRNA和指导RNA的最佳浓度可以通过 在细胞或动物模型中测试不同的浓度并且使用深度测序分析在潜在的脱靶基因组 座位处的修饰的范围而确定。例如，对于靶向人类基因组的EMX1基因中的 5’-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3’的指导序列，可以使用深度测序来评定在下 列两个脱靶位点处的修饰水平，1：5’-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3’和2： 5’-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3’。对于体内递送，应当选择产生最高的中靶 修饰水平同时将脱靶修饰水平降低到最低限度的浓度。
可替代地，为了将毒性水平和脱靶效应降低到最低限度，可以用一对靶向感兴 趣部位的指导RNA来递送CRISPR酶切口酶mRNA(例如，具有D10A修饰的化 脓链球菌Cas9)。这两个指导RNA需要如下间隔开。分别处于红色(单下划线) 和蓝色(双下划线)的指导序列(这些实例是基于化脓链球菌Cas9需要的PAM)。
Figure BDA0003056817240000131
Figure BDA0003056817240000141
该系统的进一步询问向申请人提供了5’突出端的证据(参见，例如，拉恩(Ran) 等人，《细胞》(Cell)2013年9月12日；154(6):1380-9和2013年8月28日 提交的美国临时专利申请序列号61/871,301)。申请人进一步鉴定了涉及当与两种 指导RNA结合时通过Cas9切口酶突变体的有效切割的参数，并且这些参数包括但 不限于该5’突出端的长度。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至多200个碱基 对、优选至多100个碱基对、或更优选至多50个碱基对。在本发明的实施例中， 该5’突出端具有至少26个碱基对、优选至少30个碱基对、或更优选34-50个碱基 对或1-34个碱基对。在本发明的其他优选方法中，指导邻近该第一靶序列的DNA 双链体的一条链的切割的第一指导序列以及指导邻近该第二靶序列的另一条链的 切割的第二指导序列产生一个钝切口或一个3’突出端。在本发明的实施例中，该3’突出端具有至多150、100或25个碱基对，或至少15、10或1个碱基对。在优选 的实施例中，该3’突出端具有1-100个碱基对。
本发明的方面涉及被减少的基因产物或被进一步引入到编码基因产物的DNA 分子中的模板多核苷酸或通过允许两个5’突出端重新退火并连接而被精确切断的 间插序列的表达、或被改变的基因产物的活性或功能、或被增加的基因产物的表达。 在本发明的一个实施例中，该基因产物是一种蛋白质。
只有产生在这些指导序列(大于-8bp的偏移)之间具有小于8bp重叠的5’突 出端的sgRNA对才能介导可检测的插入缺失(indel)信息。重要的是，当与野生 型Cas9配对时，在这些分析中使用的每个指导对于有效诱导indel是重要的，表明 这些指导对的相对位置在预测双切割活性中是最重要的参数。
由于Cas9n和Cas9H840A切割DNA的相对链，对于一个给定的sgRNA对而 言，用Cas9H840A取代Cas9n会导致该突出端类型的倒转。例如，将产生具有Cas9n 的5’突出端的一对sgRNA原则上会相反地产生相应的3’突出端。因此，导致具有 Cas9n的3’突出端产生的sgRNA对可以与Cas9H840A一起使用，以产生一个5’突 出端。出人意料地，申请人利用被设计为产生5’和3’突出端两者(偏移范围从–278 到+58bp)的一组sgRNA对测试了Cas9H840A，但是不能观察indel信息。可能需 要进一步的工作来鉴定用于sgRNA配对的必要的设计规则，以允许经由 Cas9H840A进行双切割。
用于脑的额外的递送选项包括将处于DNA或RNA形式的CRISPR酶和指导RNA封装到脂质体中并且结合到用于跨血脑屏障(BBB)递送的分子特洛伊木马 上。分子特洛伊木马已经显示对于将B-gal表达载体递送到非人类灵长动物的脑中 是有效的。可以使用相同的途径来递送含有CRISPR酶和指导RNA的递送载体。 例如，夏CF(Xia CF)和博阿多RJ(BoadoRJ)、帕德瑞吉WM(Pardridge WM) “使用亲和素-生物素技术经由人胰岛素受体的siRNA的抗体介导的靶向” ("Antibody-mediated targeting of siRNA via the human insulinreceptor using avidin-biotin technology."《分子药理学》(Mol Pharm.)2009年5月-6月；6(3):747-51. doi:10.1021/mp800194)描述了如何将短干扰RNA(siRNA)递送到培养物中以及 体内的细胞，并且可以与受体特异性单克隆抗体(mAb)和亲和素-生物素技术联 合使用。作者还报道，就亲和素-生物素技术而言，由于在靶向mAb与siRNA之间 的键是稳定的，在静脉给予该靶向的siRNA之后，体内观察到在远处部位(例如 脑)的RNAi效应。
张(Zhang)Y，斯库拉彻兹凯(Schlachetzki)F，巴德里智(Pardridge)WM. (“在静脉内给药之后向灵长类大脑进行全局非病毒基因转移(Global non-viral gene transferto the primate brain following intravenous administration).”2003年1月； 7(1):11-8.)描述了编码报道分子如萤光素酶的表达质粒如何被包封在一种“人工病 毒”的内部，该“人工病毒”包含85nm的聚乙二醇化的免疫脂质体，其在体内与 一种针对人胰岛素受体(HIR)的单克隆抗体(MAb)一起靶向到恒河猴脑。该 HIRMAb使得携带外源基因的脂质体在静脉注射之后经历跨血脑屏障的转胞吞作 用和跨神经元质膜的胞吞作用。与大鼠比较，在恒河猴的脑中的萤光素酶基因表达 水平高50倍。通过组织化学和共聚焦显微镜检查都证明了β-半乳糖苷酶基因在灵 长动物脑中的广泛神经元表达。作者指明，这种途径使得在24小时内的可逆成年 转基因可行。因此，免疫脂质体的使用是优选的。这些可以与抗体结合靶向特定的 组织或细胞表面蛋白。
其他递送手段或RNA也是优选的，如经由纳米粒子(卓(Cho)S.、金伯格(Goldberg)M.、松(Son)S.、许(Xu)Q.、杨(Yang)F.、梅(Mei)Y.、博加 特廖夫(Bogatyrev)S.、朗格(Langer)R.和安德森(Anderson)D.，“用于将小 干扰RNA递送到内皮细胞的脂质样纳米粒子”(Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery toendothelial cells)，《先进功能材料》(Advanced Functional Materials)，19:3112-3118，2010)或外泌体(施罗德(Schroeder)A.、 莱文斯(Levins)C.、科特斯(Cortez)C.、朗格(Langer)R.、和安德森(Anderson) D.，“用于siRNA递送的基于脂质的纳米治疗剂”(Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery)，《内科学杂志》(Journal ofInternal Medicine)，267:9-21，2010， PMID:20059641)。事实上，已经表明外泌体在递送siRNA中特别有用，其为与 CRISPR系统有一些相似之处的系统。例如，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人 “外泌体诱导的体外和体内siRNA递送”(“Exosome-mediated deliveryof siRNA in vitro and in vivo.”)《自然-实验手册》(Nat Protoc.)2012Dec；7(12):2112-26. doi:10.1038/nprot.2012.131。电子版2012年11月15日描述了外泌体对于跨不同的 生物屏障的药物递送是有希望的工具并且可以用于体外和体内递送siRNA。其途径在于通过转染一种包含与肽配体融合的外泌体蛋白的表达载体产生靶向外泌体。然 后将这些外泌体纯化并且从转染的细胞上清液中表征，然后将siRNA加载到外泌 体中。
操纵靶序列的一个方面也指靶序列的表观遗传操纵。这可以是靶序列的染色质状态的操纵，如借助于修饰靶序列的甲基化状态(即，甲基化或甲基化模式或CpG 岛的添加或去除)、组蛋白修饰，从而增加或降低靶序列的可及性，或者借助于促 进或减少3D折叠。
一种载体可能不仅是指病毒或酵母系统(例如，在感兴趣的核酸可被可操作地 连接到一个启动子上并且在其控制下(就表达而言，从而最终提供加工的RNA) 的情况下)，而且引导核酸递送到宿主细胞中。
本发明在某些实施例中也包含一种治疗或抑制由在对其有需要的受试者或非 人类受试者中的感兴趣基因组座位内的靶序列的缺陷引起的病症的方法，该方法包 括通过操纵该靶序列来修正该受试者或非人类受试者，并且其中该病症对于通过操 纵该靶序列的治疗或抑制是敏感的，该方法包括提供包括以下项的治疗：递送一种 非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含一种载体系统，该载体系统包含一 种或多种载体，该一种或多种载体包括可操作地编码此处讨论的组合物以对该组合 物进行表达，其中在表达时，该靶序列是通过该组合物操纵的。
在此处的方法的某些实施例中，该方法可包括诱导表达，其可以是诱导该 CRISPR酶的表达和/或诱导该指导序列、tracr或tracr配对序列的表达。在此处的 方法的某些实施例中，该生物或受试者是真核生物或非人类真核生物。在此处的方 法的某些实施例中，该生物或受试者是植物。在此处的方法的某些实施例中，该生 物或受试者是哺乳动物或非人类哺乳动物。在此处的方法的某些实施例中，该生物 或受试者是藻类。
虽然在本文的方法中该载体可以是病毒载体并且AAV在这里是有利的，但是 可以采用如本文论述的其他病毒载体。例如，杆状病毒可以用于昆虫细胞中的表达。 这些昆虫细胞进而可用于产生大量的其他载体，如适合于本发明递送的AAV载体。
还设想了一种递送本发明CRISPR酶的方法，该方法包括向细胞递送编码该CRISPR酶的mRNA。应理解该CRISPR酶是截短的，具有如此处所述的特定大小， 是一种核酸酶或切口酶或通用DNA结合蛋白，是经密码子优化的，包含一个或多 个突变，和/或包含嵌合CRISPR酶，或如本文论述的其他选项。
也设想了制备用于递送本发明的组合物或CRISPR酶以及用于在本发明方法中 使用的载体的一种方法。
AAV病毒载体是优选的。因此，在另一个方面，提供了一种制备AAV病毒载 体的方法，该方法包括将含有或其基本组成为编码AAV的一种或多种核酸分子的 一种或多种质粒转染到感染AAV的细胞中，并且提供对于AAV的复制和包装而 言必需的AAV rep和/或cap。在此方面，应理解该CRISPR酶被截短，由少于一千 个氨基酸或少于四千个氨基酸组成，是一种核酸酶或切口酶，是经密码子优化的， 包含一个或多个突变，和/或包含嵌合CRISPR酶，如本文论述的。在一些实施例 中，对于AAV的复制和包装而言必需的AAV rep和/或cap是通过用一种或多种辅 助质粒或一种或多种辅助病毒转染这些细胞而提供的。在一些实施例中，该辅助病 毒是痘病毒、腺病毒、疱疹病毒或杆状病毒。在一些实施例中，该痘病毒是牛痘病 毒。在一些实施例中，这些细胞是哺乳动物细胞。并且在一些实施例中，这些细胞是昆虫细胞，并且该辅助病毒是杆状病毒。
本发明在某些实施例中进一步包含一种经修饰的CRISPR酶。与野生型 CRISPR酶的差异可包括：该经修饰的CRISPR酶相比于一种野生型CRISPR酶是 截短的，或该CRISPR酶具有特定大小，例如至少500个氨基酸，至少800-899个 氨基酸，至少900-999个氨基酸，至少1000-1099个氨基酸，至少1100-1199个氨 基酸，至少1200-1299个氨基酸，至少1300-1399个氨基酸，至少1400-1499个氨 基酸，至少1500-1599个氨基酸，至少1600-1699个氨基酸或至少2000个氨基酸； 和/或该CRISPR酶是引导在该靶序列的位置处的两条链的切割的一种核酸酶，或 该CRISPR酶是引导在该靶序列的位置处的一条链的切割的一种切口酶，或该 CRISPR酶是起作用为DNA结合蛋白质的一种催化上的无效突变体；和/或该 CRISPR酶是密码子优化的或经密码子优化以表达于真核细胞中，和/或该CRISPR 酶包括一个或多个突变，和/或该CRISPR酶包括嵌合CRISPR酶，和/或该CRISPR 酶具有此处讨论的一个或多个其他属性。因此，在某些实施例中，该CRISPR酶在 催化性残基诸如spCa9 D10A、E762A、H840A、N854A、N863A或D986A或在其 他Cas酶中关于SpCas9的位置编号与其对应的那些(如此处所述的)中包括一个 或多个突变，和/或具有处于该CRISPR酶的RuvC I、RuvC II、RuvC III、HNH或 此处所述的其他结构域中的一个或多个突变，和/或该CRISPR酶具有一个或多个 在催化结构域中的突变，其中在转录时，tracr配对序列杂交到tracr序列上，并且 指导序列引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合，并且其中该酶进一步包 含一个功能结构域。该功能结构域可包括但不限于，转录激活剂、转录阻抑物、重 组酶、转座酶、组蛋白重塑剂(histone remodeler)、DNA甲基转移酶、隐花色素、 光可诱导/可控制结构域或化学可诱导/可控制结构域。在某些实施例中，该CRISPR 酶可具有为转录激活剂结构域(例如VP64)的功能结构域。在一些实施例中，一 个转录阻抑物结构域是KRAB。在一些实施例中，一个转录阻抑物结构域是SID、 或SID的多联体(即SID4X)。在一些实施例中，提供了一种表观遗传修饰酶。
在优选实施例中，该CRSIPR酶是Cas酶，例如Cas9直向同源物。
本发明的方面也包含鉴定CRISPR酶的新颖的直向同源物。鉴定CRISPR酶的 新颖的直向同源物的方法可涉及鉴定感兴趣的基因组中的tracr序列。鉴定tracr序 列可涉及以下步骤：在一个数据库中搜索这些同向重复或tracr配对序列以鉴定包 括一种CRISPR酶的一个CRISPR区域，例如图18。在该CRISPR酶有义和反义两 个方向的侧翼的CRISPR区域中搜索同源序列。寻找转录终止子以及二级结构。将 不是一个同向重复或一种tracr配对序列但与tracr配对序列的同向重复具有超过 50％一致性的任何序列鉴定为一个可能的tracr序列。取该可能的tracr序列并且分 析与其相关的转录终止子序列。
本发明在某些实施例中包含在医药中使用如此处所述的一种组合物或一种CRISPR酶。本发明在某些实施例中进一步包含在本发明的方法中使用的本发明的 一种组合物或CRISPR酶。本发明还在某些实施例中包含在优选地离体基因或基因 组编辑中，或优选地一种离体基因或基因组编辑方法中使用本发明的一种组合物或 一种CRISPR酶。因此本发明也在某些实施例中包含在用于离体基因或基因组编辑 或用于在如此处讨论的一种方法中使用的一种药剂的制造中使用本发明的一种组 合物或一种CRISPR酶。
此外，本发明在某些实施例中包含本发明的一种组合物或一种CRISPR酶，其 中该靶序列在其3’端的侧翼或下游为适合于CRISPR酶(典型地Cas，并且特别是 Cas9)的PAM。此PAM序列对于每个Cas9是特异性的但可容易地由此处描述的 方法确定。
例如，适合的PAM是分别针对SpCas9或SaCas9酶(或衍生的酶)的5'-NRG 或5'-NNGRR。应理解此处提及了金黄色葡萄球菌，优选地包括金黄色葡萄球菌金 黄色亚种。
因此，本发明的目的在于，在本发明中不涵盖任何先前已知的产品、制造该产 品的过程、或使用该产品的方法，使得申请人保留和特此公开放弃任何先前已知的 产品、过程、或方法的权利。进一步指出的是，在本发明的范围之内，本发明并不 旨在涵盖任何产品、过程、或该产品的制造或使用该产品的方法，其不符合USPTO (35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC的第83条)的书面说明和可实施性要求， 使得申请人保留和特此公开放弃任何先前描述的产品、制造该产品的过程、或使用 该产品的方法的权利。
应当指出的是，在本披露中尤其是在权利要求书和/或段落中，术语如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等等可具有在 美国专利法中属于它的含义；例如，它们可以表示“包括(includes)”、“包括 (included)”、“包括(including)”等等；并且这些术语如“基本上由……组 成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)” 具有在美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未被清楚叙述的要素，但是 排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新颖特征的要素。
这些和其他实施例披露于以下详细说明中，或者据其显而易见并且由其涵盖。
本发明还涉及以下项目：
1.(A)一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含一种载体系统， 该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含
I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含
(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，
(b)一种tracr配对序列，和
(c)一种tracr序列，以及
II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶 编码序列上，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列，
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂 交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，
或者
(B)一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含一种载体系统，该 载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含：
I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至
(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，和
(b)至少一个或多个tracr配对序列，
II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码CRISPR酶的酶 编码序列，以及
III.一种第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至一种tracr序列，
其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂 交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且
其中在(A)或(B)中，该CRISPR酶是属于以下组的一个属的一种Cas9直 向同源物，该组由以下各项组成：棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体 属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、 黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细 小棒菌属、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以及弯曲杆菌属。
2.一种经修饰的CRISPR酶，其中该酶是属于以下组的一个属的一种Cas9直向 同源物，该组由以下各项组成：棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、 产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄 杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细小 棒菌属、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以及弯曲杆菌属，并且其中与对应 的野生型CRISPR酶的差异包括：
该经修饰的CRISPR酶相比于一种野生型CRISPR酶是截短的，或
该CRISPR酶具有以下长度：至少500个氨基酸，至少800-899个氨基酸，至 少900-999个氨基酸，至少1000-1099个氨基酸，至少1100-1199个氨基酸，至少 1200-1299个氨基酸，至少1300-1399个氨基酸，至少1400-1499个氨基酸，至少 1500-1599个氨基酸，至少1600-1699个氨基酸或至少2000个氨基酸，和/或
该CRISPR酶是指导在该靶序列的位置处的两条链的切割的一种核酸酶，或该CRISPR酶是指导在该靶序列的位置处的一条链的切割的一种切口酶，和/或
该CRISPR酶是密码子优化的或经密码子优化以表达于真核细胞中，和/或
该CRISPR酶包括一个或多个突变，和/或
该CRISPR酶包括嵌合CRISPR酶。
3.根据项目1所述的组合物，或根据项目2所述的酶，其中该CRISPR酶在该 酶的任何结构域中具有一个或多个突变。
4.根据任一前述项目所述的组合物或酶，其中该CRISPR酶在一个催化结构域 中具有一个或多个突变。
5.根据项目3或4所述的组合物或酶，其中该一个或多个突变是处于该CRISPR 酶的RuvC I、RuvC II、RuvC III或HNH结构域中。
6.根据项目4或5所述的组合物或酶，其中该CRISPR酶对应于SpCas9的位 置编号在位置D10A、E762A、H840A、N854A、N863A或D986A包括一个或多个 突变。
7.根据任一前述项目所述的组合物或酶，其中该酶进一步包括一个功能结构 域。
8.根据项目7所述的组合物或酶，其中该功能结构域是一个转录激活剂结构域。
9.根据项目8所述的组合物或酶，其中该转录激活剂结构域是VP64。
10.根据项目7至9所述的组合物或酶，其中该功能结构域是一个转录阻抑物 结构域。
11.根据项目10所述的组合物或酶，其中该转录阻抑物结构域是KRAB、SID 或SID4X。
12.一种通过操纵在感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰一种生物或非人类生物的方法，该方法包括：
递送一种包括载体系统的非天然存在的或工程化的组合物，该载体系统可操作地编码如任一前述项目所述的组合物以用于对该组合物进行表达。
13.根据项目12所述的方法，其中递送是通过一个或多个病毒载体进行的。
14.一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含一种载体系统，该载 体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含
I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种第一CRISPR-Cas 系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该第一多核苷酸序列包含：
(i)一种第一指导序列，该第一指导序列能够杂交至该生物体的细胞中的一 个第一基因组座位处的一个第一靶序列，
(ii)一种第一tracr配对序列，和
(iii)一种第一tracr序列，和
II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到一种第二CRISPR-Cas 系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该第二多核苷酸序列包含
(i)一种第二指导序列，该第二指导序列能够杂交至该生物体的细胞中的一 个第二基因组座位处的一个第二靶序列，
(ii)一种第二tracr配对序列，和
(iii)一种第二tracr序列，和
III.一种第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接到编码一种第一 CRISPR酶的酶编码序列上，该第一CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列并 且可操作地连接到一个第一功能结构域，
IV.一种第四调节元件，该第四调节元件可操作地连接到编码一种第二 CRISPR酶的酶编码序列上，该第二CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列并 且可操作地连接到一个第二功能结构域，
其中I和II中的(i)、(ii)和(iii)以5’到3’方向排列，
其中组分I、II、III和IV位于该系统的相同或不同载体上，
其中在转录时，每个tracr配对序列杂交到其相应的tracr序列上，并且该第一 指导序列和第二指导序列引导该第一CRISPR复合物和第二CRISPR复合物与该第 一靶序列和第二靶序列的序列特异性结合，
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂 交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且其中该CRISPR酶的 表达提供对该靶序列的操纵，
其中该第一CRISPR酶和第二CRISPR酶各自包括两个或更多个突变，并且
其中该第一CRISPR酶和第二CRISPR酶是属于以下组的一个属的一种Cas9 直向同源物，该组由以下各项组成：棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋 体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、 黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细 小棒菌属、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以及弯曲杆菌属。
15.一种调节在生物体中感兴趣的两个或更多个基因组座位的表达的方法，该 方法包括
递送一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含一种载体系统，该载 体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含
I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种第一CRISPR-Cas 系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该第一多核苷酸序列包含：
(i)一种第一指导序列，该第一指导序列能够杂交至该生物体的细胞中的一 个第一基因组座位处的一个第一靶序列，
(ii)一种第一tracr配对序列，和
(iii)一种第一tracr序列，和
II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到一种第二CRISPR-Cas 系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该第二多核苷酸序列包含
(i)一种第二指导序列，该第二指导序列能够杂交至该生物体的细胞中的一 个第二基因组座位处的一个第二靶序列，
(ii)一种第二tracr配对序列，和
(iii)一种第二tracr序列，和
III.一种第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接到编码一种第一 CRISPR酶的酶编码序列上，该第一CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列并 且可操作地连接到一个第一功能结构域，
IV.一种第四调节元件，该第四调节元件可操作地连接到编码一种第二 CRISPR酶的酶编码序列上，该第二CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列并 且可操作地连接到一个第二功能结构域，
其中I和II中的(i)、(ii)和(iii)以5’到3’方向排列，
其中组分I、II、III和IV位于该系统的相同或不同载体上，
其中在转录时，每个tracr配对序列杂交到其相应的tracr序列上，并且该第一 指导序列和第二指导序列引导该第一CRISPR复合物和第二CRISPR复合物与该第 一靶序列和第二靶序列的序列特异性结合，
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂 交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且其中该CRISPR酶的 表达提供对该靶序列的操纵，
其中该第一CRISPR酶和第二CRISPR酶各自包括两个或更多个突变，
其中该第一CRISPR酶和第二CRISPR酶是属于以下组的一个属的一种Cas9 直向同源物，该组由以下各项组成：棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋 体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、 黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细 小棒菌属、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以及弯曲杆菌属，并且
其中该第一基因组座位是通过该第一功能结构域的活性来调节，并且该第二基因组座位是通过该第二功能结构域的活性来调节。
16.根根据项目14所述的组合物，或根据项目15所述的方法，其中该第一功 能结构域是选自下组，该组由以下各项组成：转录激活剂、转录阻抑物、重组酶、 转座酶、组蛋白重塑剂、DNA甲基转移酶、隐花色素以及光可诱导/可控制结构域 或化学可诱导/可控制结构域。
17.根据项目14或16所述的组合物，或根据项目15或16所述的方法，其中 该第二功能结构域是选自下组，该组由以下各项组成：转录激活剂、转录阻抑物、 重组酶、转座酶、组蛋白重塑剂、DNA甲基转移酶、隐花色素以及光可诱导/可控 制结构域或化学可诱导/可控制结构域。
18.根据项目16或17所述的组合物或方法，其中该第一功能结构域或第二功 能结构域是一个转录激活剂结构域。
19.根据项目47所述的组合物或方法，其中该转录激活剂结构域是VP64。
20.根据项目16或17所述的组合物或方法，其中该第一功能结构域或第二功 能结构域是一个转录阻抑物结构域。
21.根据项目20所述的组合物或方法，其中该转录阻抑物结构域是KRAB、SID 或SID4X。
22.根据项目14至21中任一项所述的组合物或方法，其中该第一CRISPR酶或 第二CRISPR酶是一种沃兹沃思萨特氏菌Cas9。
23.根据项目14至21中任一项所述的组合物或方法，其中该第一CRISPR酶或 第二CRISPR酶是一种龈沟产线菌Cas9。
24.根据项目14至21中任一项所述的组合物或方法，其中该第一CRISPR酶或 第二CRISPR酶是一种约氏乳杆菌Cas9。
25.根据项目14至21中任一项所述的组合物或方法，其中该第一CRISPR酶或 第二CRISPR酶是一种红嘴鸥弯曲杆菌Cas9。
26.根据项目14至21中任一项所述的组合物或方法，其中该第一CRISPR酶或 第二CRISPR酶是一种白喉棒状杆菌Cas9。
27.根据项目14至21中任一项所述的组合物或方法，其中该第一CRISPR酶或 第二CRISPR酶是一种食清洁剂细小棒菌Cas9。
28.根据项目14至21中任一项所述的组合物或方法，其中该第一CRISPR酶或 第二CRISPR酶是一种鸡毒支原体Cas9。
29.根据项目14至21中任一项所述的组合物或方法，其中该第一CRISPR酶或 第二CRISPR酶是一种金黄色葡萄球菌金黄色亚种Cas9。
30.根据项目14至21中任一项所述的组合物或方法，其中该第一CRISPR酶或 第二CRISPR酶是一种巴黎嗜肺军团菌Cas9。
31.根据项目14至21中任一项所述的组合物或方法，其中该第一CRISPR酶或 第二CRISPR酶是一种齿垢密螺旋体Cas9。
32.根据项目14至21中任一项所述的组合物或方法，其中该第一CRISPR酶或 第二CRISPR酶是一种伪中间型葡萄球菌Cas9。
33.根据项目14至21中任一项所述的组合物或方法，其中该第一CRISPR酶或 第二CRISPR酶是一种灰色奈瑟菌Cas9。
34.一种在对其有需要的受试者或非人类受试者中治疗或抑制由感兴趣基因组座位内的靶序列的缺陷引起的病症的方法，该方法包括通过操纵该靶序列来修饰该 受试者或非人类受试者，并且其中该病症对于通过操纵该靶序列的治疗或抑制是敏 感的，该方法包括提供包括以下项的治疗：
递送一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含一种AAV载体系统， 该AAV载体系统包含一个或多个AAV载体，该一个或多个AAV载体包括可操作 地编码如项目1或3至11中任一项所述的组合物以用于对该组合物进行表达，其 中在表达时，该靶序列是通过该组合物操纵的。
35.如项目34所述的方法，该方法包括诱导表达。
36.如项目34或35所述的方法，其中该生物或受试者是真核生物或非人类真 核生物。
37.如项目34至36中任一项所述的方法，其中该生物或受试者是植物。
38.如项目34至36中任一项所述的方法，其中该生物或受试者是一种哺乳动 物或非人类哺乳动物。
39.如项目34至37中任一项所述的方法，其中该生物或受试者是藻类。
40.如项目34至39中任一项所述的方法，其中该病毒载体是AAV。
41.根据项目1-11、14、或16-33中任一项所述的的组合物或酶，用于在药物中 使用或用于在治疗中使用。
42.根据项目1-11、14、或16-33中任一项所述的组合物或酶，用于在根据项目 12、13、或15-40中任一项所述的方法中使用。
43.根据项目1-11、14、或16-33中任一项所述的组合物或酶在离体基因或基因 组编辑中的用途。
44.根据项目1-11、14、或16-33中任一项所述的组合物或酶在用于离体基因或 基因组编辑的一种药剂的制造中或用于在根据项目12、13、或15-40中任一项所述 的方法中使用的用途。
45.根据项目1-11、14、或16-33中任一项所述的组合物或酶，其中该靶序列在 其3’端的侧翼为5’-NRG(其中N是任何核苷酸)，尤其其中该Cas9是(或源自于) 化脓链球菌或金黄色葡萄球菌Cas9。
46.一种制备用于递送根据项目1-11、14、或16-33中任一项所述的组合物或酶 的AAV的方法，该方法包括将含有或其基本组成为编码AAV的一种或多种核酸 分子的一种或多种质粒转染到感染AAV的细胞中，并且提供对于该AAV的复制 和包装而言必需的AAV rep和/或cap。
47.如项目46所述的方法，其中对于该AAV的复制和包装而言必需的该AAV rep和/或cap是通过用一种或多种辅助质粒或一种或多种辅助病毒转染这些细胞而 提供的。
48.如项目47所述的方法，其中该辅助病毒是痘病毒、腺病毒、疱疹病毒或杆 状病毒。
49.如项目48所述的方法，其中该痘病毒是牛痘病毒。
50.如项目46至49中任一项所述的方法，其中：
-这些细胞是哺乳动物细胞；或
这些细胞是昆虫细胞，并且该辅助病毒是杆状病毒。
51.一种递送如项目2-11中任一项所述的CRISPR酶的方法，该方法包括向一 种细胞递送编码该CRISPR酶的mRNA。
52.一种嵌合Cas酶，其中该酶包括来自一种第一Cas直向同源物的一个或多 个片段以及来自一种第二Cas直向同源物的一个或多个片段。
53.根据项目52所述的酶，其中该第一Cas直向同源物或第二Cas直向同源物 的该一个或多个片段是来自该第一Cas直向同源物或第二Cas直向同源物的C-末 端或N-末端。
54.根据项目52或53所述的酶，其中该第一Cas直向同源物或第二Cas直向 同源物是选自属于以下组的一个属，该组由以下各项组成：棒状杆菌属、萨特氏菌 属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体 属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、 奈瑟菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以及弯 曲杆菌属。
55.根据项目1-11、14、16-33、或52-54中任一项所述的组合物或酶在制备一 种用于修饰靶序列的药物中的用途。
56.根据项目1至11中任一项所述的组合物，其中该CRISPR酶相比于一种野 生型CRISPR酶是截短的，或该CRISPR酶是由500-2000个氨基酸组成。
57.根据项目1至11或56中任一项所述的组合物，其中该CRISPR酶是指导在 该靶序列的位置处的两条链的切割的一种核酸酶，或该CRISPR酶是指导在该靶序 列的位置处的一条链的切割的一种切口酶。
58.根据项目1至11或56-57中任一项所述的组合物，其中该指导序列包括至 少十五个核苷酸。
59.根据项目1至11或56-58中任一项所述的组合物，其中该CRISPR酶是密 码子优化的或经密码子优化以表达于真核细胞中。
60.根据项目1至11或56-59中任一项所述的组合物，其中该CRISPR酶包括 一个或多个突变。
61.根据项目1至11或56-60中任一项所述的组合物，其中该CRISPR酶包括 嵌合CRISPR酶。
62.一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：
A)-I.一种CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列，其中该多 核苷酸序列包含：
(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，
(b)一种tracr配对序列，和
(c)一种tracr序列，以及
II.对包含至少一个或多个核定位序列的CRISPR酶进行编码的多核苷酸序列，
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂 交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且编码CRISPR酶的该 多核苷酸序列是DNA或RNA，
或者
(B)I.多核苷酸，其包含：
(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到原核细胞中的靶序列上，和
(b)至少一个或多个tracr配对序列，
II.一种编码CRISPR酶的多核苷酸序列，以及
III.一种包含tracr序列的多核苷酸序列
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂 交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且编码CRISPR酶的该 多核苷酸序列是DNA或RNA，并且
其中该CRISPR酶是属于以下组的一个属的一种Cas9直向同源物，该组由以 下各项组成：棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆 菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、 Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、 葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以及弯曲杆菌属。
63.A一种通过操纵在感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰一种生物或非人 类生物的方法，该方法包括：递送一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物 包含：
A)-I.一种CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列，其中该多 核苷酸序列包含：
(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，
(b)一种tracr配对序列，和
(c)一种tracr序列，以及
II.对包含至少一个或多个核定位序列的CRISPR酶进行编码的多核苷酸序列，
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂 交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且编码CRISPR酶的多 核苷酸序列是DNA或RNA，
或者
(B)I.多核苷酸，其包含：
(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到原核细胞中的靶序列上，和
(b)至少一个或多个tracr配对序列，
II.一种编码CRISPR酶的多核苷酸序列，以及
III.一种包含tracr序列的多核苷酸序列，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂 交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且编码CRISPR酶的该 多核苷酸序列是DNA或RNA，并且
其中该CRISPR酶是属于以下组的一个属的一种Cas9直向同源物，该组由以 下各项组成：棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆 菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、 Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、 葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以及弯曲杆菌属。
64.根据项目62所述的组合物，或根据项目63所述的方法，其中该CRISPR 酶相比于一种野生型CRISPR酶是截短的，或该CRISPR酶是由500-2000个氨基 酸组成。
65.根据项目62-64所述的组合物或方法，其中该CRISPR酶是引导在该靶序列 的位置处的两条链的切割的一种核酸酶，或该CRISPR酶是引导在该靶序列的位置 处的一条链的切割的一种切口酶。
66.根据项目62-65所述的组合物或方法，其中该指导序列包括至少十五个核苷酸。
67.根据项目62-66所述的组合物或方法，其中该CRISPR酶是密码子优化的或 经密码子优化以表达于真核细胞中。
68.根据项目62-67所述的组合物或方法，其中该CRISPR酶包括一个或多个突 变。
69.根据项目62-68所述的组合物或方法，其中该CRISPR酶包括嵌合CRISPR 酶。
附图简要说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体提出。通过参考提出说明性实施例的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用 了本发明的原理，并且在这些附图中：
图1显示RNA指导的Cas9核酸酶的示意图。来自化脓链球菌的Cas9核酸酶 经由合成的指导RNA(sgRNA)而靶向基因组DNA，该指导RNA由一个20个nt 的指导序列和一个支架组成。具有DNA靶的指导序列碱基对，直接地在必要的 5’-NGG原型间隔子邻近基序(PAM)的上游，并且Cas9在该PAM(由三角形指 示)的上游约3bp介导了双链断裂(DSB)。
图2A-F显示了一个示例性CRISPR系统、以及一个可能的作用机制(A)、 一个用于在真核细胞中的表达的示例性适应、以及评估核定位和CRISPR活性的测 试的结果(B-F)。
图3显示AAV体内递送质粒利用反向末端重复(ITR)序列和指导嵌合RNA 以优选地辅助由AAV或AAV相关系统进行的递送的示意表示。
图4A-D显示了揭示五个Cas9家族的系统发生分析的环状描绘，这五个家族 包括三组大的Cas9(约1400个氨基酸)和两组小的Cas9(约1100个氨基酸)。
图5A-F显示了揭示五个Cas9家族的系统发生分析的线性描绘，这五个家族包 括三组大的Cas9(约1400个氨基酸)和两组小的Cas9(约1100个氨基酸)。
图6显示了代表Cas9直向同源物的长度分布的图。
图7显示作为反向互补序列的这些Cas9直向同源物的PAM的序列图标的表 示。
图8A-J显示在缩短碱基配对区域并且通过一个人工环融合这两个RNA元件时 保留该tracr配对：tracr序列双链体的序列和二级结构的18个嵌合RNA结构。
图9A-O显示以与图8A-J中提供的嵌合的指导RNA配对的人密码子优化的 Cas9序列的清单。
图10A-M显示了在突变点位于SpCas9基因内的情况下的序列。
图11显示不同生物体中的II型CRISPR座位。
图12显示对应于不同生物体中的CRISPR座位的指导RNA序列。
图13A-II显示列出了Cas9直向同源物及其对应PAM序列的一个表。
图14显示金黄色葡萄球菌金黄色亚种Cas9的PAM是NNGRR。
图15A-D显示了用于SpCas9的单个和多个载体设计。
图16显示用于切割存在于一个基于pUC19的文库中的两个候选靶标的Cas9 直向同源物以及各自的sgRNA的一种载体设计和凝胶图像。
图17显示通过SpCas9、St3Cas9、Sp_St3嵌合体以及St3_Sp嵌合体进行的体 外切割。针对St3Cas9以及St3_Sp嵌合Cas9的PAM是NGG。
图18显示该CRISPR网络服务器的图像。
图19A-L显示12种Cas9直向同源物的多重序列比对。高亮了两个催化性残 基。高亮的第一残基是处于RuvCI结构域中的催化性Asp残基，并且高亮的第二 残基是处于HNH结构域中的催化性His残基。总有一个残基突变为Ala可将Cas9 转化为一种切口酶。两个残基的突变将Cas9转化为一种催化上的无效突变体–有 用于一般DNA结合。
图20显示一种western印迹，该western印迹显示Cas9直向同源物表达于HEK293FT细胞中；编码Cas9直向同源物的DNA质粒被转染至HEK 293FT细胞中并 且收获细胞裂解物用于western印迹。对于Cas9直向同源物#8没有转染DNA。
图21显示通过10种Cas9直向同源物在pUC19质粒上对候选靶标进行体外切 割。通过序列图标预测共有PAM(图7)，pUC19上的候选靶标是基于这些序列 图标选择的。测试的9种新的Cas9直向同源物中7种已成功切割至少一个pUC19 靶标。SpCas9也可在体外切割NGA。
图22显示代表性Surveyor凝胶，其显示由SaCas9进行的基因组切割。
图23显示PAM序列(所有靶标)的基因组切割效率。
图24显示PAM序列(切割的靶标)的基因组切割效率。
图25显示PAM序列(所有靶标，放弃低效率和孤立靶标)的基因组切割效率。
图26显示PAM序列(切割的靶标，放弃低效率和孤立靶标)的基因组切割效 率。
图27显示操作切割的间隔子&PAM的序列图标(新的内源基因组测试显示T 不被需要)。
本文的这些图仅仅是出于说明性的目的，并且不一定是按比例绘制的。
本发明的详细说明
本发明涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物的工程 化和优化，该序列靶向例如涉及CRISPR-Cas系统及其组分的基因组干扰或基因编 辑。在有利的实施例中，该CRISPR酶是Cas酶，例如Cas9直向同源物。
本发明使用核酸来结合靶TDNA序列。这是有利的，因为产生核酸比产生例 如肽容易且价廉得多，并且特异性可以根据其中寻求同源性的拉伸长度而变化。例 如多指的复杂3-D复杂定位是不需要的。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸” 可互换地使用。它们是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核糖核苷酸或 核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未 知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编 码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA (mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、 micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。该术 语还涵盖具有合成骨架的核酸样结构，参见，例如，埃克斯坦(Eckstein)，1991； 巴塞加(Baserga)等人，1992；米利根(Milligan)，1993；WO 97/03211；WO 96/39154； 马塔(Mata)，1997；施特劳斯-绍库普(Strauss-Soukup)，1997；和扎姆斯塔(Samstag)， 1996。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸 类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸 的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀 合来进一步修饰。
在本发明的多个方面，术语“嵌合RNA”、“嵌合指导RNA”、“指导RNA”、 “单个指导RNA”以及“合成指导RNA”是可互换地使用的并且是指包括指导序 列、tracr序列以及tracr配对序列的多核苷酸序列。术语“指导序列”是指在指定 靶位点的指导RNA内约20bp的序列，并且可与术语“指导”或“间隔子”互换地 使用。术语“tracr配对序列”也可与术语“(一个或多个)同向重复”互换地使用。
如本文所用的术语“野生型”是本领域技术人员所理解的术语，并且表示生物、 菌株、基因的典型形式或者当它在自然界存在时区别于突变体或变体形式的特征。
如本文所用的术语“变体”应当被理解为表示具有衍生自在自然界中存在的模 式的性质的展示。
术语“非天然存在的”或“工程化的”可互换地使用并且表面人工的参与。这 些术语，当指核酸分子或多肽时，表示该核酸分子或多肽至少基本上从它们在自然 界中或如发现于自然界中的与其结合的至少另一种组分游离出来。
“互补性”是指核酸与另一个核酸序列借助于传统的沃森-克里克碱基配对或 其他非传统类型形成一个或多个氢键的能力。互补百分比表示一个核酸分子中可与 一个第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例 如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、80％、90％、和100％ 互补)。“完全互补”表示一个核酸序列的所有连续残基与一个第二核酸序列中的 相同数目的连续残基形成氢键。如本文使用的“基本上互补”是指在一个具有8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、 35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互补程度，或者是指在严格条件 下杂交的两个核酸。
如本文使用的对于杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的一个核酸主 要地与该靶序列杂交并且基本上不杂交到非靶序列上的条件。严格条件通常是序列 依赖性的，并且取决于许多因素而变化。一般而言，该序列越长，则该序列特异性 地杂交到其靶序列上的温度就越高。严格条件的非限制性实例描述于蒂森(Tijssen) (1993)的《生物化学和分子生物学中的实验室技术-核酸探针杂交》(Laboratory Techniques InBiochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes)，第I部分，第二章，“杂交原理概述和核酸探针分析策略”(“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”)，爱思唯尔(Elsevier)，纽约。在提及一个多核苷酸序列时，那么也设想了互补的或部分互 补的序列。能够在高严格条件下杂交到参考序列上的这些序列是优选的。通常，为 了使杂交率最大化，选择了相对低严格性的杂交条件：低于热熔点(Tm)约20到 25℃。Tm是50％的特异性靶序列在具有规定的离子强度和pH的溶液中杂交到完 全互补的探针上的温度。通常，为了要求杂交序列的至少约85％的核苷酸互补性， 高严格洗涤条件被选择为低于Tm约5到15℃。为了要求杂交序列的至少约70％ 的核苷酸互补性，中等严格洗涤条件被选择为低于Tm约15到30℃。高容许(极 低严格性)洗涤条件可以低至在Tm之下50℃，从而允许在杂交序列之间的高水 平错配。本领域技术人员将认识到，在杂交和洗涤阶段中的其他物理和化学参数也 可以改变，从而影响来自在靶序列与探针序列之间的特定同源性水平的可检测杂交 信号的结果。优选的高严格条件包括在50％甲酰胺、5×SSC、和1％SDS中在42℃ 孵育，或者在5×SSC和1％SDS中在65℃孵育，在0.2×SSC和0.1％SDS中在65℃ 洗涤。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成一种复合物的反应，该复合物 经由这些核苷酸残基之间的碱基的氢键键合而稳定化。氢键键合可以借助于沃森- 克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式而发生。该复合物 可包含形成一个双链体的两条链、形成多链复合物的三条或多条链、单个自我杂交 链、或这些的任何组合。杂交反应可以构成一个更广泛的过程(如PCR的开始、 或经由一种酶的多核苷酸的切割)中的一个步骤。能够与一个给定序列杂交的序列 被称为该给定序列的“互补物”。
如本文使用的，术语“基因组座位(locus)”或“座位(locus)”(复数是 座位(loci))是在一个染色体上的一个基因或DNA序列的特定位置。“基因”是 指编码多肽或RNA链的DNA或RNA的段(stretch)，其在生物中发挥功能作用 并且因此是活生物体遗传的分子单元。出于本发明的目的，可以考虑包括调节基因 产物的产生的区域的基因，而不论这样的调节序列是否接近编码和/或转录的序列。 因此，基因包括而不必限于，启动子序列、终止子、翻译调节序列(如核糖体结合 位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、隔离子、边界元件、复制起点、 核基质附着位点和座位控制区。
如本文使用的“基因组座位的表达”或“基因表达”是藉此在功能性基因产物 的合成中使用来自基因的信息的过程。基因表达的产物常常是蛋白质，但是在非蛋 白质编码基因如rRNA基因或tRNA基因中，产物是功能性RNA。基因表达的过程 由所有已知的生物利用-产生功能性产物以便存活的真核生物(包括多细胞生 物)、原核生物(细菌和古细菌)以及病毒。如本文使用的基因或核酸的“表达” 不仅涵盖细胞基因表达，而且涵盖在克隆系统中或在任何其他背景下的一个或多个 核酸的转录和翻译。如本文使用的“表达”是指藉此从DNA模板转录成多核苷酸 (如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后藉此翻译 成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换地使用，是指具有任何长度 的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基 酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物；这 些修饰例如二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其 他操纵，如与标记组分的结合。如本文使用的术语“氨基酸”包括天然的和/或非 天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似 物和肽模拟物。
如本文使用的，术语“结构域”或“蛋白质结构域”是指可以独立于该蛋白质 链的其余部分而存在并且起作用的蛋白质序列的一部分。
正如在本发明的多个方面中所描述，序列一致性与序列同源性有关。可以通过 肉眼、更通常地借助于可得的序列比较程序来进行同源性比较。这些可商购的计算 机程序可以计算在两个或更多个序列之间的同源性的百分比(％)并且还可以计算 由两个或更多个氨基酸或核酸序列共享的序列一致性。可以通过本领域已知的许多 计算机程序(例如BLAST或FASTA等等)来生成序列同源性。用于进行这样的 比对的适合的计算机程序是GCG威斯康星Bestfit软件包(美国威斯康星大学；德 弗罗(Devereux)等人，1984，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)12:387)。 可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于，BLAST软件包(参见奥苏贝 尔(Ausubel)等人，1999，出处同上–第18章)、FASTA(阿尔丘尔(Atschul) 等人，1990，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，403-410)以及GENEWORKS 系列比较工具。BLAST和FASTA均可用于离线和在线搜索(参见奥苏贝尔 (Ausubel)等人，1999，出处同上，7-58页到7-60页)。然而，优选使用GCG Bestfit 程序。
可以计算在连续序列上的同源性％，即，将一个序列与另一个序列比对，并且 将一个序列中的每个氨基酸或核苷酸与另一个序列中的相应氨基酸或核苷酸直接 进行比较，一次比较一个残基。这被称为“无空位”比对。典型地，这样的无空位 比对仅仅在较少数目的残基上进行。
虽然这是一种非常简单和一致的方法，但是它未能考虑的是，例如，在其他方 面完全相同的序列对中，一个插入或缺失可以引起随后的氨基酸残基被排除在比对 之外，因此当进行全局比对时可能导致在同源性％上的大幅降低。因此，大多数序 列比较方法被设计为产生考虑到可能的插入和缺失的优化比对，而没有过度地使总 体同源性或一致性评分不利。这是通过在序列比对中插入“空位”来实现的，以便 试图将局部同源性或一致性最大化。
然而，这些更复杂的方法向出现在该比对中的每个空位分配“空位罚分”，从 而对于相同数目的一致的氨基酸而言，具有尽可能少的空位的序列比对-反映了 在这两个比较的序列之间的更高关联性-可以比具有许多空位者实现更高的分 数。“亲合空位成本”(“Affinity gap costs”)典型地用于对空位的存在要求相对 高的成本并对空位中的每个后续残基施加较小的罚分。这是最常用的空位评分系 统。高空位罚分当然将产生具有更少空位的最佳比对。大多数比对程序允许修改空 位罚分。然而，当使用这种序列比较软件时优选使用默认值。例如当使用GCG威 斯康星Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分为对于每个空位的-12，以及 对于每个延伸的-4。
因此计算最大同源性％首先要求产生最佳比对，考虑空位罚分。用于进行这样 的比对的适合的计算机程序是GCG威斯康星Bestfit软件包(德弗罗(Devereux) 等人，1984，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)12p387)。可以进行序列比 较的其他软件的实例包括但不限于，BLAST软件包(参见奥苏贝尔(Ausubel)等 人，1999《精编分子生物学实验指南》(Short Protocols in Molecular Biology)，第4次编辑–第18章)、FASTA(阿尔丘尔(Altschul)等人，1990《分子生物学 杂志》(J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA均可用于离线和在线搜索(参 见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999，《精编分子生物学实验指南》(ShortProtocols in Molecular Biology)，7-58页到7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用GCGBestfit程序。一种新的工具，称为BLAST 2序列，也可用于比较蛋白质和核苷酸 序列(参见《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》(FEMS Microbiol Lett)(FEMS Microbiol Lett.)1999 174(2):247-50；《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》 (FEMS Microbiol Lett)1999 177(1):187-8以及在国立卫生研究院的网址的国家生 物技术信息中心的网址)。
虽然最终同源性％可以按照一致性进行测量，但是比对过程自身典型地不是基于全或无配对比较(all-or-nothing pair comparison)。相反，通常使用尺度相似性 评分矩阵(scaled similarity score matrix)，基于化学相似性或进化距离对各个成对比 较评分。通常使用的这种矩阵的实例为BLOSUM62矩阵-BLAST系列程序的默认 矩阵。GCG威斯康星程序通常使用公开的默认值或自定义符号比较表(更多细节 详见用户手册)。对于一些应用，优选使用GCG软件包的公共默认值，或在其他 软件情况下的默认矩阵，如BLOSUM62。
可替代地，可以基于类似于CLUSTAL(希金斯DG(Higgins DG)和夏普PM (SharpPM)(1988)，《基因》(Gene)73(1)，237-244)的一种算法，使 用在DNASISTM(日立软件公司(Hitachi Software))中的多重比对特征来计算同 源性百分比。一旦软件已经产生最佳比对，就有可能计算同源性％，优选序列一致 性％。软件典型地这样进行，作为序列比较的一部分，并且产生数字结果。
这些序列也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默变化并生成 功能上等同的物质。可以基于氨基酸特性(如残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、 亲水性、和/或两亲性)的相似性做出有意氨基酸取代，并且因此它在将氨基酸集 合成官能团中是有用的。可以仅仅基于氨基酸的侧链特性将它们集合在一起。然而， 包括突变数据同样是更有用的。出于结构原因，如此衍生的氨基酸的集合很有可 能是保守性的。这些集合可以被描述为文氏图形式(Venn diagram)(利文斯敦C.D. (Livingstone C.D.)和巴顿G.J.(BartonG.J.)(1993)“蛋白质序列比对：用于残基 保守些的分级分析的策略”(“Protein sequencealignments:a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation”)《生物科学计算应用》 (Comput.Appl.Biosci).9:745-756)(泰勒(Taylor)W.R.(1986)“氨基酸保守性的 分类”(“The classification of amino acid conservation”)《理论生物学杂志》(J. Theor.Biol.)119；205-218)。例如可以根据下表做出保守性取代，该表描述了普 遍接受的氨基酸的文氏图分组。
Figure BDA0003056817240000331
Figure BDA0003056817240000341
本发明的实施例包括可包含同源取代(本文使用取代和置换两者来表示现有氨基酸残基或核苷酸与替代残基和核苷酸之间的互换)的序列(多核苷酸或多肽两 者)，该同源取代，即，在氨基酸的情况下发生同类取代(like-for-like substitution)， 如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性。也可以发生非同源取代，即，从一类残 基到另一类残基，或者可替代地涉及包含非天然氨基酸如鸟氨酸(在下文称为Z)、 二氨基丁酸鸟氨酸(在下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(在下文称为O)、吡啶基 丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
变体氨基酸序列可以包括适合的可插入在该序列的任何两个氨基酸残基之间 的间隔基团，包括除了氨基酸间隔物(如甘氨酸或-丙氨酸)之外的烷基基团， 如甲基、乙基或丙基基团。一个另外的变化形式，其涉及处于类肽形式的一个或多 个氨基酸残基的存在，也是本领域技术人员熟知的。为避免疑义，“该类肽形式” 用来指代变体氨基酸残基，其中该-碳取代基在该残基的氮原子上，而不是在该 -碳上。用于制备处于该类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如西蒙RJ(Simon RJ)等人，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和豪威尔DC(Horwell DC)，《生 物技术趋势》(Trends Biotechnol.)(1995)13(4)，132-134。
除非另有说明，本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微 生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技能之 内。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)， 《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等 人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学 术出版公司)：《PCR 2:实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J. 麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor) 编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手 册》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
在一个方面，本发明提供了在CRISPR-Cas系统的工程化和优化中使用的载体。
如本文使用的，“载体”是一种允许或促进一个实体从一个环境转移到另一个 环境中的工具。它是一种复制子，如质粒、噬菌体、或粘粒，另一个DNA片段可 以插入其中，从而引起该插入的片段的复制。通常，当与适当的控制元件关联时， 一种载体能够复制。一般而言，术语“载体”是指一种核酸分子，其能够运送与其 连接的另一种核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子； 包括一个或多个自由端、无自由端(例如环状的)的核酸分子；包括DNA、RNA、 或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。一种类型的载体 是“质粒”，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段的 环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、 复制缺陷型腺病毒、以及腺相关病毒)的载体中。病毒载体还包含由用于转染到一 种宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌 载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。其他载体 (例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到该宿主细胞的基因组中， 并且由此与该宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基 因的表达。这样的载体在此被称为“表达载体”。在重组DNA技术中使用的普通 表达栽体通常是质粒形式。本文提供了对载体的进一步讨论。
重组表达载体可包含处于适合于在宿主细胞中的核酸表达的形式的本发明的 核酸，这意味着这些重组表达载体包含基于待用于表达的宿主细胞而选择的一种或 多种调节元件，所述调节元件可操作地连接至待表达的核酸序列。在重组表达载体 内，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表 达的方式被连接至该一个或多个调节元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中 或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。关于重组和克隆方法， 提及2004年9月2日以US 2004-0171156 A1公开的美国专利申请10/815,730，该 专利的内容通过引用以其全文并入本文。
本发明的多个方面和多个实施例涉及用于嵌合的RNA与Cas9或Cas9直向同 源物的双顺反子载体。在一些实施例中，由CBh启动子驱动该Cas9。在一些实施 例中，由一个U6启动子驱动该嵌合的RNA。优选地，在该Cas9由CBh启动子驱 动并且嵌合RNA由U6启动子驱动的意义上该CBh以及U6是一起使用的。在一 些实施例中，嵌合的指导RNA由接合到tracr序列的20bp指导序列(N)组成(从 下链的第一个“U”到该转录本的结尾)，其在如指示的各位置被截短。指导序列 和tracr序列优选地被该tracr配对序列隔开。tracr配对序列的一个优选实例是 GUUUUAGAGCUA。优选地这后面跟随一个环序列。该环优选地是GAAA，但是 并并限于这个序列或者实际上在长度上仅仅为4bp。实际上，用于在发夹结构中使 用的优选环形成序列在长度上为四个核苷酸，并且最优选地具有序列GAAA。然而， 可以使用更长或更短的环序列，正如可替代的序列。这些序列优选地包括三联体(例 如，AAA)、和另外的核苷酸(例如C或G)。环形成序列的实例包括CAAA和 AAAG。贯穿本申请，嵌合RNA也可以被称为单指导、或合成指导RNA(sgRNA)。
例如，如在实例2中特别详细描述的，嵌合的指导RNA可如图8中所示设计。 这些家族中的一些中的CRISPR座位描绘于图11中。对应的指导RNA序列在图12 中示出。我们分析该Cas9蛋白约2kb内的基因组DNA序列，并且鉴定范围从35bp 至50bp的同向重复，其具有范围从29bp至35bp的间插间隔子。基于该同向重复序 列，我们以以下标准搜索tracrRNA候选序列：在该crRNA阵列外部但与同向重复包 含高程度的同源性(如针对同向重复:tracrRNA碱基配对所要求的；自定义计算分 析)，在这些蛋白组分的编码区外部，在与同向重复具有同源性的区域的下游约 60bp-120bp包含不依赖Rho的转录终止信号，并且与同向重复共折叠以形成一种双 链体，随后在tracrRNA序列的远端形成两个或更多个发夹结构。基于这些预测标准， 我们选择一个初始集的18种Cas9蛋白，并且其独特相关的同向重复以及tracrRNA 跨全部五个Cas9家族分布。申请人进一步产生在缩短碱基配对区域并且通过一个人 工环融合这两个RNA元件时保留该天然同向重复:tracrRNA双链体的序列和二级结构的一组18个嵌合RNA结构(图8A-8J)。
术语“调节元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、 和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。 这样的调节序列例如描述于戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社 (Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(1990)中。调节元 件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以 及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节 序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例 如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细 胞类型(例如淋巴细胞)。调节元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性 或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特 异性的。在一些实施例中，一个载体包含一个或多个pol III启动子(例如1、2、3、 4、5、或更多个pol III启动子)、一个或多个pol II启动子(例如1、2、3、4、5、 或更多个pol II启动子)、一个或多个polI启动子(例如1、2、3、4、5、或更多 个pol I启动子)、或其组合。pol III启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。 pol II启动子的实例包括但不限于逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选 地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见，例如，波沙特(Boshart)等人，《细胞》(Cell)41:521-530(1985)]、SV40 启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动 子、和EF1α启动子。还被术语“调节元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV 增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.， 第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子 2与3之间的内含子序列(《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)， 第78(3)卷，第1527-31页，1981)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计 可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。一种载体可以 被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的核酸 编码的融合蛋白或肽(例如，规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)转录物、 蛋白质、酶、其突变体形式、其融合蛋白，等等)。关于调节序列，提及美国专利 申请10/491,026，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。关于启动子，提及PCT 公开WO2011/028929和美国申请12/511,940，这些专利的内容通过引用以其全文 并入本文。
载体可以被设计为用于在原核或真核细胞中表达CRISPR转录物(例如核酸转 录物、蛋白质、或酶)。例如，CRISPR转录物可表达于例如大肠杆菌的细菌细胞、 昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞、或哺乳动物细胞中。适合的宿主 细胞进一步讨论于Goeddel(戈德尔)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY)185，学术出版社 (Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年) 中。可替代地，重组表达载体可在体外例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶 来转录和翻译。
载体可以被引入原核生物或原核细胞中并且在其中增殖。在一些实施例中，原 核生物用来扩增有待引入真核细胞中的载体的多个拷贝，或者作为有待引入真核细 胞中的载体的产生中的中间载体(例如，扩增质粒作为病毒载体包装系统的一部 分)。在一些实施例中，原核生物用来扩增一个载体的多个拷贝并且表达一种或多 种核酸，如提供用于递送到宿主细胞或宿主生物中的一种或多种蛋白质的来源。蛋 白质在原核生物中的表达最经常在大肠杆菌中用含有指导融合或非融合蛋白的表 达的组成型或诱导型启动子的载体来进行。融合载体将多个氨基酸添加到在其中编 码的蛋白质上，如该重组蛋白的氨基端上。这样的融合载体可以用于一个或多个目 的，如：(i)增加重组蛋白的表达；(ii)增加重组蛋白的溶解性；以及(iii)通过在 亲和纯化中充当配体来辅助重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，将蛋白切 割位点引入至融合部分与重组蛋白的接合处以使得能够在纯化融合蛋白之后将重 组蛋白与融合部分分离。这类酶以及它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶以 及肠激酶。示例性融合表达载体包括pGEX(发玛西亚生物技术有限公司(PharmaciaBiotech Inc)；史密斯和约翰逊，1988.《基因》(Gene)67:31-40)、pMAL(纽 英伦生物技术公司(New England Biolabs)，贝弗利(Beverly)，马萨诸塞州(Mass.)) 以及pRIT5(发玛西亚公司，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州(N.J.))，它 们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合至靶重组 蛋白。
适合的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann(阿姆兰) 等人，(1988年)《基因》(Gene)69:301-315)以及pET 11d(Studier(斯图迪尔) 等人，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年)60-89。
在一些实施例中，载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒中表达的载体的实例 包括pYepSec1(巴尔戴利(Baldari)等人，1987.《欧洲分子生物学学会杂志》 (EMBO J)6:229-234)、pMFa(库尔坚(Kurjan)和赫斯库伍特兹(Herskowitz)， 1982.《细胞》(Cell)30:933-943)、pJRY88(舒尔茨(Schultz)等人，1987.《基 因》(Gene)54:113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation(英杰公司)，San Diego (圣地亚哥)，Calif(加利福尼亚州))、以及picZ(Invitrogen Corp(英杰公司)， San Diego(圣地亚哥)，Calif(加利福尼亚州))。
在一些实施例中，使用杆状病毒载体，载体驱动昆虫细胞中的蛋白质表达。可 用于在培养的昆虫细胞(例如，SF9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc 系列(史密斯(Smith)等人，1983.《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)3:2156-2165) 和pVL系列(拉克瑙(Lucklow)和萨莫斯(Summers)，1989.《病毒学》(Virology) 170:31-39)。
在一些实施例中，使用哺乳动物表达载体，载体能够驱动一种或多种序列在哺 乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(锡德(Seed)，1987. 《自然》(Nature)329:840)和pMT2PC(考夫曼(Kaufman)等人，1987.《欧 洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表 达载体的控制功能典型地由一个或多个调节元件提供。例如，常用的启动子来源于 多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒、猴病毒40、以及本文所述和本领域已知的其他病毒。 对于用于原核细胞和真核细胞两者的其他适合的表达系统参见例如萨姆布鲁克 (Sambrook)等人的《分子克隆实验指南》(MolecularCloning：A Laboratory Manual.)(第2版)的第16和第17章，冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉 港(Cold Spring Harbor)，纽约，1989。
在一些实施例中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异型调节元件来表达核酸)。组织特异型调节元件是本领 域中已知的。适合的组织特异型启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特 异性的；平克特(Pinkert)等人，1987.《基因发育》(Genes Dev.)1:268-277)， 淋巴特异性启动子(卡里曼(Calame)和伊顿(Eaton)，1988.《免疫学进展》(Adv. Immunol)43:235-275)，特别是T细胞受体的启动子(维纳图(Winoto)和巴尔 迪莫(Baltimore)，1989.《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)8:729-733) 和免疫球蛋白(巴纳吉(Baneiji)等人，1983.《细胞》(Cell)33:729-740；奎恩 (Queen)和巴尔迪莫(Baltimore)，1983.《细胞》(Cell)33:741-748)，神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；伯恩(Byrne)和鲁德尔(Ruddle)，1989. 《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)86:5473-5477)，胰腺特异性启 动子(艾德兰德(Edlund)等人，1985.《科学》(Science)230:912-916)，以及 乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育型调节启动子，例如，鼠科动物同源框蛋白(hox)启动子 凯赛尔((Kessel)和格鲁斯(Gruss)，1990.《科学》(Science)249:374-379) 和α-甲胎蛋白启动子(卡姆皮斯(Campes)和蒂尔曼(Tilghman)，1989.《基因 发育》(Genes Dev.)3:537-546)。关于这些原核和真核载体，提及美国专利 6,750,059，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。本发明的其他实施例可涉及 病毒载体的使用，关于它提及美国专利申请13/092,085，该专利的内容通过引用以 其全文并入本文。组织特异型调节元件是本领域中已知的，并且在这个方面提及美 国专利7,776,321，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，调节元件可操作地连接至CRISPR系统的一个或多个元件， 从而驱动该CRISPR系统的该一个或多个元件的表达。一般而言，CRISPR(规律 间隔成簇短回文重复序列)，也称为SPIDR(SPacer间隔开的同向重复)，构成通 常对于特定细菌物种而言特异性的DNA基因座的家族。该CRISPR座位包含在大 肠杆菌中被识别的间隔开的短序列重复(SSR)的一个不同类(石野(Ishino)等 人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，169:5429-5433；和中田(Nakata)等人， 《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，171:3553-3556)、以及相关基因。类似的间隔 开的SSR已经鉴定于地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)、化脓链球菌、鱼腥 藻属、和结核分枝杆菌中(参见，格鲁恩(Groenen)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，10:1057-1065；霍(Hoe)等人，《新发感染性疾病》(Emerg.Infect.Dis.)，5:254-263；马斯波尔(Masepohl)等人，《生物化学与生 物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)1307:26-30；以及莫吉卡(Mojica)等人， 《分子微生物学》，17:85-93)。这些CRISPR座位典型地不同于其他SSR的重 复结构，这些重复已被称为规律间隔的短重复(SRSR)(詹森(Janssen)等人， 《OMICS:整合生物学杂志》(OMICSJ.Integ.Biol.)，6:23-33；以及莫吉卡(Mojica) 等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，36:244-246)。一般而言，这些重 复是以簇存在的短元件，其被具有基本上恒定长度的独特间插序列规律地间隔开 (莫吉卡(Mojica)等人，，同上)。虽然重复序列在菌株之间是高度保守的，许 多间隔开的重复和这些间隔区的序列一般在菌株与菌株之间不同(冯·埃姆登(van Embden)等人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，182:2393-2401)。已经在40 种以上的原核生物中鉴定出CRISPR座位(参见，例如，詹森(Janssen)等人，《分 子微生物学》(Mol.Microbiol.)，43:1565-1575；以及莫吉卡(Mojica)等人，)， 包括但不限于：气火菌属(Aeropyrum)、热棒菌属(Pyrobaculum)、硫化叶菌属 (Sulfolobus)、古球菌属(Archaeoglobus)、盐盒菌属(Halocarcula)、甲烷杆 菌属(Methanobacterium)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷八叠球菌属 (Methanosarcina)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、焦球菌属(Pyrococcus)、嗜 酸菌属(Picrophilus)、热原体属(Thermoplasma)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、 分枝杆菌属(Mycobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、产水菌属(Aquifex)、 紫单胞菌属(Porphyromonas)、绿菌属(Chlorobium)、栖热菌属(Thermus)、 芽孢杆菌属(Bacillus)、利斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、 梭菌属(Clostridium)、好热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、支原体属 (Mycoplasma)、梭杆菌属(Fusobacterium)、固氮弓菌属(Azarcus)、色杆菌 属(Chromobacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、 脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、地杆菌属(Geobacter)、粘球菌属(Myxococcus)、 弯曲杆菌属(Campylobacter)、类杆菌属(Wolinella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、 欧文菌属(Erwinia)、埃希菌属(Escherichia)、军团杆菌属(Legionella)、甲基 球菌属(Methylococcus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、发光细菌属(Photobacterium)、 沙门菌属(Salmonella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、耶尔森菌属(Yersinia)、 密螺旋体属(Treponema)、和栖热袍菌属(Thermotoga)。
一般而言，“CRISPR系统”统称为转录物和涉及CRISPR相关(“Cas”)基 因的表达或指导其活性的其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活 CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(涵盖“同 向重复”和在内源CRISPR系统背景下的tracrRNA加工的部分同向重复)、指导 序列(在内源CRISPR系统背景下也称为“spacer”)、或来自CRISPR座位的其 他序列和转录物。在一些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于I型、 II型、或III型CRISPR系统。在一些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元件来 源于包含内源CRISPR系统的特殊生物，如化脓链球菌。一般而言，CRISPR系统的特征为促进在靶序列的位点处的CRISPR复合物(在内源CRISPR系统的背景下 也称为原型间隔子)的形成的元件。在CRISPR复合物形成的背景下，“靶序列” 是指一种指导序列被设计为对其具有互补性的序列，其中在靶序列与指导序列之间 的杂交促进CRISPR复合物的形成。一个靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA 或RNA多核苷酸。在一些实施例中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。
在本发明的优选实施例中，该CRISPR系统是一个II型CRISPR系统，并且该 Cas酶是Cas9，其催化DNA切割。通过来源于化脓链球菌的Cas9或任何密切相关 的Cas9的酶促作用，产生了在靶位点序列处的双链断裂，所述靶位点序列杂交到 该指导序列的20个核苷酸上并且具有在该靶序列的20个核苷酸之后的原型间隔子 相邻基序(PAM)序列NGG/NRG(例如，如别处讨论的，针对SpCas9或SaCas9 酶(或衍生的酶)的一个适合的PAM对应地是5'-NRG或5'-NNGRR)。经由Cas9 的对于位点特异性DNA识别和切割的CRISPR活性是由该指导序列、部分杂交到 该指导序列上的tracr序列以及该PAM序列定义的。该CRISPR系统的更多方面描 述于卡吉诺夫(Karginov)和汉农(Hannon)的“CRISPR系统：在细菌和古细菌 中的小RNA指导的防御”(The CRISPR system:small RNA-guided defence in bacteria andarchaea)，《分子细胞学杂志》(Mole Cell)2010，1月15日；37(1):7。
II型CRISPR座位来自化脓链球菌SF370，该座位含有四个基因Cas9、Cas1、 Cas2和Csn1的聚簇以及两个非编码RNA元件tracrRNA和由非重复序列的短段(间 隔子，每个约30bp)间隔开的重复序列(同向重复)的特征性阵列。在此系统中， 以四个连续步骤产生靶向的DNA双链断裂(DSB)(图2A)。第一步，从CRISPR 座位转录两个非编码RNA前-crRNA阵列和tracrRNA。第二步，将tracrRNA杂交 到pre-crRNA的同向重复上，然后将其加工成含有单独的间隔子序列的成熟 crRNA。第三步，该成熟crRNA:tracrRNA复合物经由在crRNA的间隔子区与原型 间隔子DNA之间形成异源双链体而将Cas9指向由原型间隔子和对应的PAM组成的DNA靶标。最后，Cas9介导PAM上游的靶DNA的切割，以在原型间隔子内 产生一个DSB(图2A)。图2B证明了该密码子优化的Cas9的核定位。为了促进 转录精确起始，选择基于RNA聚合酶III的U6启动子，以驱动tracrRNA的表达 (图2C)。类似地，研发基于U6启动子的构建体，以表达由单个间隔子组成的前 -crRNA阵列，该单个间隔子侧翼为两个同向重复(DR，还被术语“tracr配对序列” 所涵盖；图2C)。将起始间隔子设计成靶向人EMX1座位(图2C)中的33-碱基 对(bp)靶位点(满足Cas9的NGG识别基序的30-bp原型间隔子加3-bp CRISPR 基序(PAM)序列)，该座位是大脑皮层的发育中的一个关键基因。
图16显示Cas9直向同源物以及各自的sgRNA被用于切割存在于一个基于 pUC19的文库中的两个候选靶标。靶标1后跟随包含7个简并碱基 (5'-NNNNNNN-3')的一个随机化PAM，并且包含与靶标1相同的靶序列的靶标 1'后跟随一个固定的PAM(5'-TGGAGAAT-3')。每种Cas9直向同源物的sgRNA 包含针对靶标1或靶标1'的指导序列。凝胶图像显示通过20种Cas9直向同源物进 行的成功切割，表明这些sgRNA设计对于其各自的Cas9酶是功能性的。
在一些实施例中，同向重复或tracr配对序列是从CRISPR数据库下载的或在 计算机上通过搜索重复基序鉴定的，这些重复基序是1.在该II型CRISPR座位侧翼 的基因组序列的2kb窗中发现的，2.跨过20至50bp，并且3.由20至50bp间隔开。 在一些实施例中，可以使用这些标准中的2条，例如1和2、2和3、或1和3。在 一些实施例中，可以使用所有这3条标准。
在一些实施例中，候选tracrRNA是随后通过以下预测的：1.与同向重复(Geneious中具有高达18-bp错配的基序搜索)的序列同源性，2.在转录方向上一 种预测的不依赖Rho的转录终止子的存在，以及3.tracrRNA和同向重复之间的稳 定发夹二级结构。在一些实施例中，可以使用这些标准中的2条，例如1和2、2 和3、或1和3。在一些实施例中，可以使用所有这3条标准。在一些实施例中， 嵌合的合成指导RNA(sgRNA)设计在同向重复与tracrRNA之间掺入至少8bp的 双链体结构。
可以进一步改善CRISPR系统的若干方面，以增加CRISPR靶向的效率和通用 性。优化的Cas9活性可以依赖于处于比存在于哺乳动物细胞核中的游离Mg2+高的 水平的游离Mg2+的可获得性(参见例如季聂克(Jinek)等人，2012，《科学》 (Science)，337:816)，并且对恰好位于原型间隔子的下游的NGG/NRG基序的 偏好限制靶向人类基因组中的平均每12-bp的能力。
典型地，在内源CRISPR系统的背景下，CRISPR复合物(包含杂交到靶序列 上并且与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致在该靶序列中或其附近 (例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、或更多个碱基对之内)的一 条链或两条链的切割。不希望受到理论的束缚，该tracr序列(其可以包含或其组 成为野生型tracr序列的全部或部分(例如野生型tracr序列的约或多于约20、26、 32、45、48、54、63、67、85个、或更多个核苷酸))也可以形成CRISPR复合 物的一部分，如通过沿着该tracr序列的至少一部分杂交到与该指导序列可操作地 连接的tracr配对序列的全部或部分上。在一些实施例中，将驱动CRISPR系统的 一个或多个元件的表达的一种或多种载体引入到宿主细胞中，使得该CRISPR系统 的这些元件的表达在一个或多个靶位点引导CRISPR复合物的形成。例如，Cas酶、 连接到tracr配对序列上的指导序列、以及tracr序列可以各自可操作地连接到在分 开的载体上的分开的调节元件上。可替代地，从相同或不同调节元件表达的二个或 更多个元件可以结合在单个载体中，其中提供该CRISPR系统的任何组分的一个或 多个另外的载体不包括在第一载体中。结合在单个载体中的CRISPR系统元件可以 按照任何适合的取向排列，如一个元件相对于第二元件位于5’(“上游”)或3’(“下 游”)。一个元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的同一条链或相对链上， 并且取向为相同或相对的方向。在一些实施例中，单个启动子驱动编码CRISPR酶 的转录物以及该指导序列、tracr配对序列(任选地可操作地连接到该指导序列上)、 和嵌入在一个或多个内含子序列之内(例如，各自在不同的内含子中，两个或更多 个在至少一个内含子中，或者全部都在单个内含子中)的tracr序列中的一者或多 者的表达。在一些实施例中，该CRISPR酶、指导序列、tracr配对序列、和tracr 序列可操作地连接到相同的启动子上并且从其表达。
在一些实施例中，一个载体包含一个或多个插入位点，如限制性核酸内切酶识 别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施例中，一个或多个插入位点(例如， 约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个插入位点)位于一种或 多种载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。在一些实施例中，一个载体包 含在tracr配对序列的上游、并且任选地在可操作地连接到该tracr配对序列上的调 节元件的下游的插入位点，使得在将指导序列插入到该插入位点中之后并且在表达 时该指导序列引导CRISPR复合物与真核细胞中的靶序列的序列特异性结合。在一 些实施例中，一个载体包含一个或多个插入位点，每个插入位点位于两个tracr配 对序列之间，从而允许在每个位点插入指导序列。在这样一种安排中，两个或更多 个指导序列可以包含两个或更多个拷贝的单指导序列、两个或更多个不同的指导序 列、或这些的组合。当使用多个不同的指导序列时，可以使用单个表达构建体使CRISPR活性靶向到细胞内的多个不同的相应靶序列。例如，单个载体可以包含约 或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个、或更多个指导序列。在一 些实施例中，可以提供约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个 这样的含有靶序列的载体，并且任选地将其递送到细胞中。
在一些实施例中，一个载体包含可操作地连接到编码CRISPR酶(如Cas蛋白) 的酶编码序列上的调节元件。Cas蛋白的非限制性实例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、 Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8，Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、 Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、 Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、 Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其 同源物、或其修饰形式。在一些实施例中，未修饰的CRISPR酶如Cas9具有DNA 切割活性。在一些实施例中，该CRISPR酶引导在靶序列位置处(例如在该靶序列 之内和/或在该靶序列的互补物之内)的一条链或两条链的切割。在一些实施例中， 该CRISPR酶引导距离靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个、或更多个碱基对之内的一条链或 两条链的切割。在一些实施例中，一个载体编码相对于相应的野生型酶被突变的 CRISPR酶，使得该突变的CRISPR酶缺乏切割含有一个靶序列的靶多核苷酸的一 条链和两条链的能力。例如，在来自化脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的 天冬氨酸到丙氨酸取代(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化成切口酶(切 割单条链)。致使Cas9为切口酶的其他突变实例包括而不限于SpCas9中的H840A、 N854A、和N863A。如此处讨论的，参考SpCas9的位置编号，对应的位置可以在 其他Cas9中，即，在来自或源自于其他细菌物种的Cas9直向同源物中是保守的。 (图19)显示12种Cas9直向同源物的多重序列比对，并且指明该RuvC I结构域 中的保守的催化性Asp残基以及该HNH结构域中的保守的催化性His残基。总有 一个残基突变为Ala可将该Cas9直向同源物转化为一种切口酶。两个残基的突变 可将该Cas9直向同源物转化为一种催化上的无效突变体–有用于一般DNA结合。 作为一个另外的实例，Cas9的两个或更多个催化结构域(RuvC I、RuvC II、和RuvC III或该HNH结构域)可以被突变为产生实质上缺乏所有DNA切割活性的突变的Cas9直向同源物。在一些实施例中，D10A突变与H840A、N854A、或N863A突 变的一者或多者相组合，以便产生实质上缺乏所有DNA切割活性的Cas9酶。在一 些实施例中，当该突变的CRISPR酶的DNA切割活性比它的非突变形式低约25％、 10％、5％、1％、0.1％、0.01％、或更少时，则该酶被考虑为实质上缺乏所有DNA 切割活性。
另外，将SpCas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸取代(D10A) 工程化，以将核酸酶转化为切口酶(参见例如萨普拉诺萨克斯(Sapranauskas)等 人，2011，《核酸研究》(Nucleic Acis Research)，39:9275；加索纳斯(Gasiunas) 等人，2012，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，109:E2579)， 这样使得带切口的基因组DNA经历高保真同源定向修复(HDR)。申请人使用 SURVEYOR测定以证实，SpCas9n在EMX1原型间隔子靶标处不产生indel。可见 靶向EMX1的嵌合crRNA(同样具有tracrRNA组分)与SpCas9的共表达在靶位 点中产生indel，而与SpCas9n的共表达则不然(n＝3)。此外，327个扩增子的测 序未检测到由SpCas9n诱导的任何indel。选择相同的座位，以通过用靶向EMX1、hSpCas9或hSpCas9n的嵌合的RNA以及用于在原型间隔子附近引入一对限制酶切 位点(HindIII和NheI)的HR模板共转染HEK 293FT细胞而测试CRISPR介导的 HR。SpCas9和SpCas9n的确催化将HR模板整合进EMX1座位中。PCR扩增靶区 域，随后用HindIII进行限制酶切消化揭示了对应于期望片段尺寸的切割产物，其 中SpCas9和SpCas9n介导类似水平的HR效率。申请人进一步使用基因组的扩增 子的Sanger测序验证HR，并且证明了CRISPR用于促进将靶定的基因插入该哺乳 动物基因组中的实用性。鉴于14-bp(来自间隔子的12-bp和来自PAM的2-bp)特 异地靶向野生型SpCas9，切口酶的可获得性可以显著减少脱靶修饰的可能性，因 为单链断裂不是易错NHEJ途径的底物。图10A-M提供一种方案，该方案表明 SpCas9以及Cas9直向同源物中的突变的位置典型地共享3-4个RuvC结构域和一 个HNH结构域的通用结构。最5'的RuvC结构域切割非互补链，而HNH结构域切 割互补链。
在5'RuvC结构域中的催化残基是通过感兴趣的Cas9与其他Cas9直向同源物 (来自化脓链球菌II型CRISPR座位、嗜热链球菌CRISPR座位1、嗜热链球菌 CRISPR座位3以及凶手弗朗西斯菌(Franciscilla novicida)II型CRISPR座位)的 同源性比较而鉴定的，并且保守性Asp残基被突变为丙氨酸以将Cas9转化成互补 链切口酶。类似地，在HNH结构域中的保守性His和Asn残基被突变为丙氨酸以 将Cas9转化为非互补链切口酶。
在一些实施例中，编码CRISPR酶的酶编码序列经密码子优化，以便在特定的 细胞如真核细胞中表达。这些真核细胞可以是特定生物的那些或来源于特定生物， 如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、或非人类哺乳动物(包括非 人类灵长动物)。在一些实施例中，对于人类或动物而言很可能使得他们(它们) 受苦而没有任何实质性医学益处的用于修饰人类的种系遗传同一性的方法和/或用 于修饰动物的遗传同一性的方法、以及还有作为这样的方法的结果的动物，可以被 排除在外。
一般而言，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、 10、15、20、25、50个、或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰一个 核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于具有特定氨 基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的 差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖 于(除其他之外)被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用 性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可 以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可 以容易地获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/(2002年7月9日访问)上可获得 的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些表可以通过不同的 方式调整适用。参见，中村Y.(Nakamura Y.)等人，“从国际DNA序列数据库 中制表的密码子使用：2000年的状态。”(“Codon usage tabulated from the international DNA sequencedatabases:status for the year 2000.)”《核酸研究》(Nucl.Acids Res.) 28：292(2000年)。用于密码子优化特定的数列以便在特定的宿主细胞中表达的 计算机算法也是可得的，如基因制造(Gene Forge)(Aptagen公司；雅各布斯 (Jacobus)，PA)，也是可得的。在一些实施例中，在编码CRISPR酶的序列中 的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个、 或所有密码子)相应于对于特定氨基酸最频繁使用的密码子。
在一些实施例中，一种载体编码包含一个或多个核定位序列(NLS)如约或多 于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个NLS的CRISPR酶。在一些 实施例中，该CRISPR酶包含在或接近于氨基端的约或多于约1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10个、或更多个NLS，在或接近于羧基端约或多于约1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10个、或更多个NLS，或这些的组合(例如在氨基端的一个或多个NLS 以及在羧基端的一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，每一个可以被选择为不依赖于其他NLS，使得在多于一个拷贝中可以存在单个NLS和/或与在一个或 多个拷贝中存在一个或多个其他NLS相组合。在本发明的一个优选实施例中，该 CRISPR酶包含至多6个NLS。在一些实施例中，当NLS的最近的氨基酸是在从N 端或C端沿着该多肽链的约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个、 或更多个氨基酸之内时，NLS可以被视为接近该N端或C端。NLS的非限制性实 例包括来源于以下项的NLS序列：SV40病毒大T抗原的NLS，其具有氨基酸序列 PKKKRKV；来自核质蛋白的NLS(例如，具有序列KRPAATKKAGQAKKKK的 核质蛋白二分NLS)；c-myc NLS，其具有氨基酸序列PAAKRVKLD或 RQRRNELKRSP；hRNPA1 M9 NLS，其具有序列 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY；来自输入蛋白-α的 IBB结构域的序列 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV；肌瘤T蛋白的序 列VSRKRPRP和PPKKARED；人p53的序列POPKKKPL；小鼠c-abl IV的序列 SALIKKKKKMAP；流感病毒NS1的序列DRLRR和PKQKKRK；肝炎病毒δ抗原 的序列RKLKKKIKKL；小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR；人聚(ADP-核糖) 聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK；以及类固醇激素受体(人)糖皮 质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK。
一般而言，该一个或多个NLS具有足够的强度，以便在真核细胞的核中驱动 该CRISPR复合物以可检测到的量积聚。一般而言，核定位活性的强度可以驱动在 该CRISPR酶中的NLS的数目、所使用的一个或多个特定的NLS、或这些因素的 组合。可以通过任何适合的技术进行细胞核中积聚的检测。例如，一种检测标记可 以融合到CRISPR酶上，使得细胞内的位置可以被可视化，如与检测细胞核的位置 的手段(例如，对于细胞核特异的染料，如DAPI)相结合。还可以将细胞核从细 胞中分离出来，然后可以通过任何适合的用于检测蛋白质的方法分析其内容物，如 免疫组织化学、western印迹或酶活性测定。如通过测定CRISPR复合物形成的作 用(例如，测定在靶序列处的DNA切割或突变、或测定由于CRISPR复合物形成 和/或CRISPR酶活性的影响而改变的基因表达活性)，与没有暴露于CRISPR酶或复合物、或暴露于缺乏该一个或多个NLS的CRISPR酶的对照相比较，还可以间 接地确定细胞核中的积聚。
一般而言，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一 些实施例中，当使用适合的比对算法进行最佳比对是，在指导序列与其相应的靶序 列之间的互补程度是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、 99％、或更多。可以使用用于比对序列的任何适合的算法来确定最佳比对，其非限 制性实例包括史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法、尼德曼-翁施 (Needleman-Wunsch)算法、基于伯罗斯-惠勒变换(Burrows-Wheeler Transform) 的算法(例如伯罗斯-惠勒比对工具(Burrows WheelerAligner))、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft技术公司；在www.novocraft.com可获得)、ELAND (亿明达公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、SOAP(在soap.genomics.org.cn 可获得)、以及Maq(在maq.sourceforge.net可获得)。在一些实施例中，一种指 导序列在长度上为约或多于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个、或更多个 核苷酸。在一些实施例中，一种指导序列在长度上为少于约75、50、45、40、35、 30、25、20、15、12个、或更少的核苷酸。可以通过任何适合的测定法来评估指 导序列引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力。例如，足以形成 CRISPR复合物的CRISPR系统的组分，包括有待测试的指导序列在内，可以例如 通过用编码该CRISPR序列的组分的载体进行转染而被提供到具有相应靶序列的宿 主细胞中，随后通过如本文所述的Surveyor测定来评估在该靶序列之内的优先切 割。类似地，通过提供该靶序列、包括有待测试的指导序列在内的CRISPR复合物的组分、和不同于该测试指导序列的对照指导序列，并且比较在该测试指导序列与 该对照指导序列反应之间的靶序列处的结合或切割率，可以在一个试管中评估靶多 核苷酸序列的切割。其他测定法是可能的，并且将由本领域技术人员想到。
多元切口酶(Multiplexed Nickase)：也可以使用在本申请中详细说明的Cas9 的优化和教导的方面产生Cas9切口酶。Cas9切口酶可有利地与指导RNA对组合， 以产生具有限定的突出端的DNA双链断裂。当使用两对指导RNA时，可能的是 切除间插DNA片段。如果外源DNA段被这两对指导RNA切割以产生可与基因组 DNA相容的突出端，则可以将该外源DNA片段连接进该基因组DNA中，以替换 被切除的片段。例如，可以将其用于除去亨廷顿蛋白(huntingtin)(HTT)基因中 的三核苷酸重复扩展，以治疗亨廷顿病。
可以将Cas9及其嵌合的指导RNA或tracrRNA和crRNA的组合作为DNA或 RNA而递送。递送均作为RNA(正常的或包含碱基或骨架修饰)分子的Cas9和 指导RNA可以用来减少Cas9蛋白在细胞中坚持的时间量。这可以减少靶细胞中的 脱靶切割活性的水平。由于递送作为mRNA的Cas9花费时间翻译成蛋白质，所以 可能有利的是在递送Cas9 mRNA后若干小时递送指导RNA，以使可供与Cas9蛋 白相互作用的指导RNA的水平最大化。
在指导RNA量有限的情况下，可以令人希望的是引入作为mRNA的Cas9和 呈DNA表达盒形式的指导RNA，用驱动指导RNA的表达的启动子。以此方式， 可获得的指导RNA的量将经由转录而放大。
可以引入多种递送系统，以向宿主细胞中引入Cas9(DNA或RNA)和指导 RNA(DNA或RNA)。这些递送系统包括使用脂质体、病毒载体、电穿孔、纳米 粒子、纳米线(沙莱克(Shalek)等人，《纳米快报》(Nano Letters)，2012)、 外来体。可以使用分子特洛伊木马脂质体(巴德里智(Pardridge)等人，《冷泉港 草案》(Cold Spring Harb Protoc)；2010；doi:10.1101/pdb.prot5407)地递送Cas9 和指导RNA跨过血脑屏障。
对针对直向同源物的指导RNA的讨论：在一些实施例中，指导RNA被选择 为降低在该指导RNA内的二级结构程度。在一些实施例中，在最佳地折叠时，该 指导RNA的大约或少于约75％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、 1％、或更少的核苷酸参与自我互补碱基配对。可以通过任何适合的多核苷酸折叠 算法来确定最佳折叠。一些算法是基于计算最小吉布斯(Gibbs)自由能。一种这 样的算法的实例是mFold，正如祖克(Zuker)和施蒂格勒(Stiegler)《核酸研究》 (Nucleic Acids Res.)9(1981)，133-148)所描述。折叠算法的另一个实例是使 用由维也纳大学(University of Vienna)的理论化学研究所(Institute for Theoretical Chemistry)研发的在线网络服务器RNAfold(参见例如A.R.格鲁伯(A.R.Gruber) 等人，2008，《细胞》(Cell)106(1):23-24；以及PA卡尔(PA Carr)和GM丘 奇(GM Church)，2009，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)27(12):1151-62)。 优化一种Cas9直向同源物的指导RNA的方法包括断开该指导RNA中的PolyU束 (tract)。可断开的polyU束可包括一系列的4、5、6、7、8、9或10个U。
一般而言，tracr配对序列包括与tracr序列具有足够互补性以促进下列一项或多项的任何序列：(1)在含有相应tracr序列的细胞中的侧翼为tracr配对序列的指 导序列的切除；以及(2)在靶序列处的CRISPR复合物的形成，其中该CRISPR 复合物包含杂交到tracr序列上的tracr配对序列。通常，互补程度是就tracr配对序 列与tracr序列沿着这两个序列的较短者的长度的最佳比对而言。可以通过任何适 合的比对算法来确定最佳比对，并且可以可以进一步对二级结构做出解释，如在该 tracr序列或tracr配对序列之内的自我互补性。在一些实施例中，在进行最佳比对 时，在该tracr序列与tracr配对序列之间沿着这两者的较短者的长度的互补程度是 约或多于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、 或更高。在一些实施例中，该tracr序列在长度上为约或多于约5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个、或更多个核苷酸。在一些实施例中，该tracr序列和tracr配对序列被包含在单个转录物中，使得 在这两者之间的杂交产生具有二级结构(如发夹)的转录物。在本发明的一个实施 例中，该转录物或转录的多核苷酸序列具有至少两个或更多个发夹。在优选的实施 例中，该转录物具有两个、三个、四个或五个发夹。在本发明的一个另外的实施例 中，该转录物具有至多五个发夹。在一个发夹结构中，在该环的最终“N”和上游 的序列5’的部分相应于该tracr配对序列，并且该环的序列3’的部分相应于该tracr 序列。另外的包含指导序列、tracr配对序列、和tracr序列的单个多核苷酸的非限 制性实例如下(列出为5’到3’)，其中“N”代表指导序列的碱基，小写字体的第 一区代表tracr配对序列，且小写字体的第二区代表tracr序列，并且该最后的poly-T 序列代表转录终止子：(1) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaaga taaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT；(2) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgc cgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT；(3) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgc cgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT；(4) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaa cttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT；(5) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT；以及(6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatca TTTTTTTT。在一些实施例中，序列(1)到(3)与来自嗜热链球菌CRISPR1的 Cas9结合使用。在一些实施例中，序列(4)到(6)与来自化脓链球菌CRISPR1 的Cas9结合使用。在一些实施例中，该tracr序列是一个与包含该tracr配对序列的 转录物分开的转录物。
对直向同源物的tracr配对的讨论：在一些实施例中，还提供了重组模板。重 组模板可以是如本文所述的另一个载体的组分，其被包含在一个分开的载体中，或 者被提供为一个分开的多核苷酸。在一些实施例中，重组模板被设计为用作在同源 重组中的模板，如在被作为CRISPR复合物的一部分的CRISPR酶切开或切割的靶 序列之内或在其附近。模板多核苷酸可以具有任何适合的长度，如约或多于约10、 15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000个、或更多个核苷酸长度。在 一些实施例中，该模板多核苷酸与包含该靶序列的多核苷酸的一部分互补。当进行 最佳比对时，模板多核苷酸可能与靶序列的一个或多个核苷酸(例如约或多于约1、 5、10、15、20个、或更多个核苷酸)重叠。在一些实施例中，当一个模板序列与 包含靶序列的多核苷酸进行最佳比对时，该模板多核苷酸的最近的核苷酸在距离该 靶序列的约1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、 5000、10000个、或更多个核苷酸之内。
在一些实施例中，该CRISPR酶是包含一个或多个异源蛋白结构域(例如除了 该CRISPR酶之外的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个结 构域)的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何其他蛋白质，以及 任选地在任何两个结构域之间的连接序列。可以融合到CRISPR酶上的蛋白质结构 域的实例包括但不限于，表位标签、报告基因序列、以及具有下列活性的一者或多 者的蛋白质结构域：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻抑活性、 转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签 的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感病毒血凝素 (HA)标签、Myc标签、VSV-G标签、和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的 实例包括，但不限于，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯 霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、绿色荧 光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、 以包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自发荧光蛋白。CRISPR酶可以融合到编码一种蛋 白质或蛋白质片段的基因序列上，所述蛋白质或蛋白质片段结合DNA分子或结合 其他细胞分子，其包括，但不限于，麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-tag、Lex A DNA 结合结构域(DBD)融合物、GAL4 DNA结合结构域融合物、以及单纯疱疹病毒 (HSV)BP16蛋白融合物。可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的另外 的结构域描述于US20110059502中，通过引用将其并入本文。在一些实施例中， 使用标记的CRISPR酶来鉴定靶序列的位置。
在一些实施例中，CRISPR酶可以形成可诱导系统的组分。该系统的诱导性质 将允许该系统利用一种能量形式对基因编辑或基因表达进行时空控制。该能量形式 可以包括但不限于，电磁辐射、声能、化学能和热能。可诱导系统的实例包括四环 素诱导型启动子(Tet-On或Tet-Off)、小分子双杂交体转录激活系统(FKBP、ABA 等))或光可诱导系统(光敏素、LOV结构域或隐花色素)。在一个实施例中，该 CRISPR酶可以是以序列特异性方式指导转录活性的变化的光诱导的转录效应因子 (LITE)的一部分。光的组分可以包括CRISPR酶、光响应细胞色素异二聚体(例 如，来自拟南芥)、以及转录激活/抑制结构域。诱导型DNA结合蛋白和关于使用 它们的方法的其他实例提供在US 61/736465和US 61/721,283中，特此通过引用以 其全文并入。
在一些方面，本发明提供了以下方法，这些方法包括向宿主细胞递送一种或多 种多核苷酸，如或如在此描述的一种或多种载体、其一种或多种转录本和/或一种 或多种自其转录的蛋白。在一些方面，本发明进一步提供了通过这样的方法产生的 细胞以及包括这样的细胞或由这样的细胞产生的动物。在一些实施例中，将与(并 且任选地与其复合)指导序列组合的CRISPR酶递送至细胞。可以使用常规的病毒 和非病毒基的基因转移方法将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。可以使用这样的 方法向培养物中或宿主生物中的细胞给予编码CRISPR系统的组分的核酸。非病毒 载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如在此描述的载体的转录本)、裸核酸以 及与递送赋形剂(如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA 病毒，在被递送至细胞后它们具有游离型或整合型基因组。关于基因疗法程序的综 述，参见安德森(Anderson)，《科学》(Science)256:808-813(1992)；纳贝尔(Nabel) &费尔格纳(Felgner)，TIBTECH 11:211-217(1993)；三谷(Mitani)&卡斯基(Caskey)，TIBTECH 11:162-166(1993)；狄龙(Dillon)，TIBTECH 11:167-175 (1993)；米勒(Miller)，《自然》(Nature)357:455-460(1992)；范·布朗特(Van Brunt)，《生物技术》(Biotechnology)6(10):1149-1154(1988)；维涅(Vigne)， 《恢复神经学和神经科学》(Restorative Neurology and Neuroscience)8:35-36 (1995)；克雷默(Kremer)&佩里科德特(Perricaudet)，《英国医学公报》(British Medical Bulletin)51(1):31-44(1995)；哈嗒嗒(Haddada)等人，在《微生物学和免 疫学当前主题》(Current Topics inMicrobiology and Immunology)中多尔夫勒 (Doerfler)和博姆
Figure BDA0003056817240000501
(编辑)(1995)；以及余(Yu)等人，《基因疗法》 (Gene Therapy)1:13-26(1994)。
核酸的非病毒递送方法包括脂转染、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、 免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸共轭物、裸DNA、人工病毒体以及DNA的试 剂增强的摄取。脂转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355中 并且脂转染试剂是市售的(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。适于多核苷酸 的有效的受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括Felgner(费尔格纳)，WO 91/17424；WO 91/16024的那些。递送可以针对细胞(例如体外或离体给予)或靶 组织(例如体内给予)。
脂质:核酸复合物(包括靶向的脂质体，如免疫脂质复合物)的制备是本领域 的技术人员熟知的(参见例如，克丽丝特尔(Crystal)，《科学》(Science)270:404-410 (1995)；布莱泽(Blaese)等人，《癌症基因疗法》(Cancer Gene Ther.)2:291-297 (1995)；贝尔(Behr)等人，《生物共轭化学》(Bioconjugate Chem.)5:382-389(1994)； 雷米(Remy)等人，《生物共轭化学》5:647-654(1994)；高(Gao)等人，《基因 疗法》(Gene Therapy)2:710-722(1995)；艾哈迈德(Ahmad)等人，《癌症研究》 (Cancer Res.)52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、 4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028以及4,946,787)。
使用RNA或DNA病毒基的系统递送核酸利用将病毒靶向体内的特定细胞并 将病毒有效负荷(payload)运至细胞核中的高度进化的过程。可以将病毒载体直接 给予至患者(体内)或可以使用它们在体外处理细胞，并且任选地，可以将修饰的 细胞给予至患者(离体)。常规的病毒基的系统可以包括用于基因转移的逆转录病 毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。用逆 转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法整合进宿主基因组中是可能的，这通 常导致插入转基因的长期表达。另外，已经在不同细胞类型和靶组织中观察到高转 导效率。
可以通过掺入外源包膜蛋白，扩展靶细胞的潜在靶群而改变逆转录病毒的向 性。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并典型地产生较高病毒效价的逆转录 病毒载体。因此，逆转录病毒基因转移系统的选择将依赖于靶组织。逆转录病毒载 体由顺式作用长末端重复组成，这些长末端重复具有包装多达6-10kb的外源序列 的能力。最低量的顺式作用LTR对于载体的复制和包装而言是足够的，然后使用 这些载体将治疗基因整合进靶细胞中，以提供永久的转基因表达。广泛使用的逆转 录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猴 免疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些(参见例如， 布赫谢尔(Buchscher)等人，《病毒学杂志》(J.Virol.)66:2731-2739(1992)；约 翰(Johann)等人，《病毒学杂志》66:1635-1640(1992)；佐姆内尔费尔特(Sommnerfelt)等人，《病毒学》(Virol.)176:58-59(1990)；威尔逊(Wilson) 等人，《病毒学杂志》63:2374-2378(1989)；米勒(Miller)等人，《病毒学杂志》 65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。
在瞬时表达是优选的应用中，可以使用腺病毒基系统。腺病毒基载体在许多细 胞类型中能够具有非常高的转导效并且无需细胞分裂。用这样的载体，已经获得了 较高的效价和表达水平。可以在相对简单的系统中大量地产生此载体。
还可以使用腺相关病毒(“AAV”)载体转导具有靶核酸的细胞，例如，在体 外产生核酸和肽，以及用于体内和离体基因疗法程序(参见例如，韦斯特(West) 等人，《病毒学》(Virology)160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；WO 93/24641； 科丁(Kotin)，《人类基因疗法》(Human Gene Therapy)5:793-801(1994)；缪 斯科斯卡(Muzyczka)，《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)94:1351(1994))。重 组AAV载体的构建描述于多个出版物中，包括美国专利号5,173,414；特拉特斯金 (Tratschin)等人，《分子与细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)5:3251-3260(1985)； 特拉特斯金等人，《分子与细胞生物学》4:2072-2081(1984)；埃尔莫奈特(Hermonat) &缪斯科斯卡(Muzyczka)，《美国国家科学院院刊》(PNAS)81:6466-6470(1984)； 以及萨穆尔斯基(Samulski)等人，《病毒学杂志》(J.Virol.)63:03822-3828(1989)。
典型地使用包装细胞形成能够感染宿主细胞的病毒粒子。这样的细胞包括包装腺病毒的293细胞和包含逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。在基因疗法中使用 的病毒载体通常由将核酸载体包装进病毒粒子的细胞系产生。这些载体典型地包含 包装并且随后整合进宿主所需的最低量序列，其他病毒序列由用于有待表达的一个 或多个多核苷酸的表达盒替换。失去的病毒功能典型地由包装细胞系反式地提供。 例如，在基因疗法中使用的AAV载体典型地仅具有来自AAV基因组的ITR序列， 这些序列为包装并整合进宿主基因组所需。将病毒DNA包装进以下细胞系中，该 细胞系包含编码辅助质粒的其他AAV基因，即rep和cap，但缺少ITR序列。该细 胞系还可以被作为辅助者的腺病毒感染。该辅助病毒促进AAV载体的复制和从辅 助质粒表达AAV基因。由于缺少ITR序列，未以显著的量包装该辅助质粒。可以 通过例如与AAV相比腺病毒更加敏感的热处理减少腺病毒的污染。用于将核酸递送至细胞的另外的方法是本领域的技术人员已知的。参见例如通过引用结合在此的 US20030087817。
因此，AAV被认为是用作转导载体的理想候选物。这样的AAV转导载体可以 包括足够的顺式作用功能，以在反式地提供的腺病毒或疱疹病毒或痘病毒(例如， 牛痘病毒)辅助功能的存在下进行复制。可以使用重组AAV(rAAV)将外源基因 携带进多种谱系的细胞中。在这些载体中，将AAV cap和/或rep基因从病毒基因 组中缺失并且用选择的DNA区段置换。当前的AAV载体可以容纳多达插入DNA 的4300个碱基。
存在多种产生rAAV的方式，并且本发明提供了rAAV以及用于制备rAAV的 方法。例如，一个或多个质粒包含或基本包含希望的病毒构建体，将其转染进AAV 感染的细胞中。此外，将第二或另外的辅助质粒共转染进这些细胞中，以提供重组 病毒构建体的复制和包装必需的AAV rep和/或cap基因。在这些条件下，AAV的 rep和/或cap蛋白反式地作用，以刺激rAAV构建体的复制和包装。转染后两至三 天，收获rAAV。传统地，从细胞中收获rAAV连同腺病毒。然后，通过热处理使 污染的腺病毒失活。在本发明中，有利地不从细胞自身收获rAAV，而是从细胞上 清液收获rAAV。因此，在初始方面，本发明提供了制备rAAV，并且除前述内容 之外，可以通过以下方法制备rAAV，该方法包括或基本由以下组成：用包含外源DNA(包括供表达的DNA)和辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒、痘病毒如牛 痘病毒)的rAAV感染易感细胞，其中该rAAV缺少功能性cap和/或rep(以及提 供该rAAV缺少的cap和/或rev功能的辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒、痘病 毒如牛痘病毒))；或用包含外源DNA(包括供表达的DNA)的rAAV感染易感 细胞，其中该重组体缺少功能性cap和/或rep，并且用提供该rAAV缺少的cap和/ 或rep功能的质粒转染所述细胞；或用包含外源DNA(包括供表达的DNA)的rAAV 感染易感细胞，其中该重组体缺少功能性cap和/或rep，其中所述细胞提供该重组 体缺少的cap和/或rep功能；或用缺少功能性cap和/或rep的AAV和用于将外源 DNA插入该重组体中这样使得由该重组体表达该外源DNA并且用于提供rep和/ 或cap功能的质粒转染易感细胞，由此转染产生包含该外源DNA(包括供表达的 DNA)的缺少功能性cap和/或rep的rAAV。
该rAAV可以来自如在此描述的AAV，并且有利地可以是rAAV1、rAAV2、 AAV5或具有杂交体或衣壳的rAAV，该rAAV可以包括AAV1、AAV2、AAV5 或其任何组合。人们可以就将要被rAAV靶向的细胞来选择rAAV的AAV；例如， 人们可以选择用于靶向脑或神经元细胞的AAV血清型1、2、5或杂种或衣壳AAV1、 AAV2、AAV5或其任何组合；并且人们可以选择用于靶向心脏组织的AAV4、靶 向肝组织的AAV8。
除293细胞之外，可以在本发明的实践中使用的其他细胞以及这些细胞的某些 体外AAV血清型的相对感染性(参见格林，D.(Grimm，D.)等人，《病毒学杂 志》(J.Virol.)82:5887-5911(2008))如下：
Figure BDA0003056817240000521
Figure BDA0003056817240000531
本发明提供了包含或基本上由编码CRISPR(规律间隔成簇短回文重复)系统 的外源核酸分子组成的rAAV，例如，多个盒，该多个盒包括或包含第一盒，该第 一盒包括或基本上由一个启动子、一个编码CRISPR相关(Cas)蛋白(假定的核 酸酶或解旋酶蛋白)(例如，Cas9)的核酸分子和一个终止子组成，以及两个或更 多个，有利地直到载体的包装尺寸极限，例如总共(包括第一盒)五个盒，这些盒 包括或基本上由一个启动子、一个编码指导RNA(gRNA)的核酸分子和一个终止 子组成(例如，每个盒示意性地由启动子-gRNA1-终止子、启动子-gRNA2-终止子... 启动子-gRNA(N)-终止子表示(其中N是可以插入的处于载体的包装尺寸极限的上 限的数目))，或两个或更多个单独的rAAV，每个rAAV包含一个或多于一个CRISPR系统盒，例如，第一rAAV包含第一盒，该第一盒包括或基本上由一个启 动子、一个编码Cas(例如，Cas9)的核酸分子和一个终止子组成，并且第二rAAV 包含多个，四个，盒，这些盒包括或基本上由一个启动子、编码指导RNA(gRNA) 的核酸分子和一个终止子组成(例如，每个盒示意性地由启动子-gRNA1-终止子、 启动子-gRNA2-终止子...启动子-gRNA(N)-终止子表示(其中N是可以插入的处 于载体的包装尺寸极限的上限的数目))。由于rAAV是一种DNA病毒，因此涉 及AAV或rAAV的在此讨论中的核酸分子有利地是DNA。在一些实施例中，启动 子有利地是人类突触蛋白I启动子(hSyn)。
介导体内基因组修饰的、将Cas9编码核酸分子例如DNA包装到病毒载体中的 两种方式是优选的：
为了实现NHEJ介导的基因敲除：
单病毒载体：
含有两个或更多个表达盒的载体：
启动子-Cas9编码核酸分子-终止子
启动子-gRNA1-终止子
启动子-gRNA2-终止子
启动子-gRNA(N)-终止子(一直到载体的大小限制)
双病毒载体：
含有一个用于驱动Cas9表达的表达盒的载体1
启动子-Cas9编码核酸分子-终止子
含有一个或多个用于驱动一个或多个指导RNA表达的表达盒的载体2
启动子-gRNA1-终止子
启动子-gRNA(N)-终止子(一直到载体的大小限制)
为了介导同源定向修复。除了上述单和双病毒载体途径之外，另外的载体可以 用来递送同源定向修复模板。
用来驱动Cas9编码核酸分子表达的启动子包括：
AAV ITR可以用作一种启动子：这对于消除另外的启动子元件(可在载体中 占用空间)的需要是有利的。空出来的另外的空间可以用来驱动另外的元件的表达 (gRNA，等等)。同样，ITR活性是较弱的，因此可以用来降低由于Cas9的过表 达所致的毒性。
对于遍存表达，可以使用启动子：CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、铁蛋白 重链或轻链，等等。
对于脑表达，可以使用启动子：用于所有神经元的突触蛋白I、用于兴奋性神 经元的CaMKIIα、用于GABA能神经元的GAD67或GAD65或VGAT，等等。
对于肝脏表达，可以使用白蛋白启动子。
对于肺表达，可以使用SP-B。
对于内皮细胞，可以使用ICAM。
对于造血细胞，可以使用IFNβ或CD45。
对于成骨细胞，可以使用OG-2。
用来驱动指导RNA的启动子可以包括：
Pol III启动子，如U6或H1
使用Pol II启动子和内含子盒来表达gRNA
关于AAV，AAV可以是AAV1、AAV2、AAV5或任何其组合。人们可以就 将要被靶向的细胞来选择AAV的AAV；例如，人们可以选择用于靶向脑或神经元 细胞的AAV血清型1、2、5或杂种或衣壳AAV1、AAV2、AAV5或任何其组合； 并且人们可以选择用于靶向心脏组织的AAV4。AAV8可用于递送到肝脏。以上启 动子和载体是单独优选的。
用于将核酸递送至细胞的另外的方法是本领域的技术人员已知的。参见例如通过引用结合在此的US 20030087817。
在一些实施例中，用一个或多个在此描述的载体瞬时地或非瞬时地转染宿主细胞。在一些实施例中，当细胞天然地出现在受试者体内时将其转染。在一些实施例 中，被转染的细胞取自受试者。在一些实施例中，该细胞来源于取自受试者的细胞， 如细胞系。用于组织培养的多种多样的细胞系在本领域是已知的。细胞系的实例包 括但不限于，C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLa-S3、Huh1、 Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panc1、PC-3、TF1、 CTLL-2、C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH-77、Calu1、 SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388D1、SEM-K2、WEHI-231、HB56、 TIB55、Jurkat、J45.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、 NRK-52E、MRC5、MEF、HepG2、海拉B、海拉T4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、 BS-C-1猴肾上皮细胞、BALB/3T3小鼠胚胎成纤维细胞、3T3 Swiss、3T3-L1、132-d5 人类胎儿成纤维细胞；10.1小鼠成纤维细胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、 A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1 细胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C3H-10T1/2、C6/36、Cal-27、 CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-K1、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr-/-、COR-L23、 COR-L23/CPR、COR-L23/5010、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CML T1、CMT、 CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、 FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepa1c1c7、HL-60、 HMEC、HT-29、Jurkat、JY细胞、K562细胞、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、 MDA-MB-435、MDCKII、MDCK II、MOR/0.2R、MONO-MAC 6、MTD-1A、MyEnd、 NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、 NW-145、OPCN/OPCT细胞系、Peer、PNT-1A/PNT2、RenCa、RIN-5F、 RMA/RMAS、Saos-2细胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1细胞系、U373、U87、U937、VCaP、维洛(Vero)细胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR及 其转基因变种。细胞系可获得自本领域的技术人员已知的多种来源(参见例如，美 国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(马纳萨斯 (Manassus)，弗吉尼亚州))。在一些实施例中，使用用一个或多个在此描述的 载体转染的细胞建立新的细胞系，该新的细胞系包括一种或多种载体来源的序列。 在一些实施例中，使用用如在此描述的CRISPR系统的组分转染(如通过用一种或 多种载体进行瞬时转染或用RNA进行转染)且通过CRISPR复合物的活性修饰的 细胞建立新的细胞系，该新的细胞系包括以下细胞，这些细胞包含吸水但是缺少任 何其他外源序列。在一些实施例中，在评估一种或多种测试化合物中使用用一个或 多个在此描述的载体瞬时或非瞬时转染的细胞或来源于这样的细胞的细胞系。
在一些实施例中，使用一个或多个在此描述的载体产生非人转基因动物或转基因植物。在一些实施例中，该转基因动物是一种哺乳动物，如小鼠、大鼠或兔。用 于产生转基因植物和动物的方法在本领域是已知的，并且通常以如在此描述的细胞 转染方法开始。
随着作物基因组学的最新进展，使用CRISPR-Cas系统进行有效且符合成本效 益的基因编辑和操纵的能力将允许快速选择并比较单个和多元遗传操作，以转化这 样的基因组，以便改善生产并增强性状。在此方面，参考美国专利和出版物：美国 专利号6,603,061-农杆菌介导的植物转化法(Agrobacterium-Mediated Plant TransformationMethod)；美国专利号7,868,149-植物基因组序列及其用途(Plant Genome Sequences andUses Thereof)以及US 2009/0100536-转具有增强的农艺性 状的基因植物(TransgenicPlants with Enhanced Agronomic Traits)，将每者的所有 内容和披露通过引用以其全文结合在此。在本发明的实践中，莫雷尔(Morrell)等 人“作物基因组学：进展与应用(Cropgenomics:advances and applications)”《遗 传学自然评论》(Nat Rev Genet.)2011年12月29日；13(2):85-96的内容和披露 也通过引用以其全文结合在此。在本发明的一个有利实施例中，该CRSIPR/Cas9 系统被用以工程化微藻类(实例7)。因此，加上必要的变更，此处对动物细胞的 提及也可适用植物细胞，除非另外是显然的。
在一个方面，本发明提供了修饰真核细胞中的靶多核苷酸的方法，这些方法可 以在体内、离体或在体外。在一些实施例中，该方法包括从人或非人动物或植物(包 括微藻)取样细胞或细胞群，并且修饰该细胞或这些细胞。培养可以发生在离体的 任何阶段。该细胞或这些细胞甚至可以被重新引入该非人动物或植物(包括微藻) 中。对于重新引入的细胞，特别优选的是这些细胞是干细胞。
在一些实施例中，该方法包括允许一种CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上 以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包 括与杂交到在所述靶多核苷酸内的一个靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其 中所述指导序列连接到一种tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到一种tracr 序列上。
在一个方面，本发明提供了修饰一种多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。在 一些实施例中，该方法包括允许一种CRISPR复合物结合到该多核苷酸上，使得所 述结合导致所述多核苷酸表达增加或减少；其中该CRISPR复合物包含与杂交到在 所述靶多核苷酸内的一个靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序 列连接到一种tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到一种tracr序列上。类 似的考虑因素适用如上文针对修饰靶多核苷酸的方法。事实上，这些取样、培养和 重新引入选择跨本发明的多个方面而适用。
在一个方面，本发明提供了以下试剂盒，这些试剂盒包含披露于以上方法和组 合物中的元件中的任何一个或多个。元件可以单独地或组合地提供，并且可以提供 于任何适合的容器中，如小瓶、瓶子或管。在一些实施例中，该试剂盒包括一种或 多种语言，例如多于一种语言的说明书。
在一些实施例中，试剂盒包括一种或多种用于在利用在此描述的元件中的一种或多种的方法中使用的试剂。试剂可以被提供于任何适合的容器中。例如，试剂盒 可以提供一种或多种反应或存储缓冲液。可以按在具体测定中可用的形式或按在使 用之前需要添加一种或多种其他组分的形式(例如按浓缩或冻干形式)提供试剂。 缓冲液可以是任何缓冲液，包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐 缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液及其组合。在一些实施例中， 该缓冲液是碱性的。在一些实施例中，该缓冲液具有从约7至约10的pH。在一些 实施例中，该试剂盒包括一个或多个寡核苷酸，该一个或多个寡核苷酸对应于一个 用于插入进载体中的指导序列，以便可操作地连接该指导序列和一个调节元件。在 一些实施例中，该试剂盒包括一个同源重组模板多核苷酸。
在一个方面，本发明提供了用于使用CRISPR系统的一个或多个元件的方法。 本发明的CRISPR复合物提供了用于修饰靶多核苷酸的有效手段。本发明的 CRISPR复合物具有多种多样的实用性，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失 活、激活)多种细胞类型中的靶多核苷酸。正因为如此，本发明的CRISPR复合物 在例如基因疗法、药物筛选、疾病诊断以及预后中具有广阔的应用谱。示例性 CRISPR复合物包括与一种指导序列复合的CRISPR酶，该指导序列与靶多核苷酸 内的靶序列杂交。该指导序列与一种tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而与 一种tracr序列杂交。
在一个实施例中，本发明提供了一种切割靶多核苷酸的方法。该方法包括使用 一种CRISPR复合物修饰靶多核苷酸，该CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上并 且实施所述靶多核苷酸的切割。典型地，当被引入进细胞中时，本发明的CRISPR 复合物在基因组序列中产生一个断裂(例如，单链或双链断裂)。例如，可以使用 该方法切割细胞中的疾病基因。
由该CRISPR复合物产生的断裂可以通过修复过程进行修复，如易出错的非同 源末端连接(NHEJ)途径或高保真同源定向修复(HDR)。在这些修复过程期间， 可以将一个外源多核苷酸模板引入进基因组序列中。在一些方法中，该HDR过程 被用于修饰基因组序列。例如，将一个外源多核苷酸模板引入进细胞中，该外源多 核苷酸模板包括一个有待整合的侧翼为一个上游序列和一个下游序列的序列。上游 和下游序列与染色体中的整合位点的任一侧都具有序列相似性。
在希望的情况下，供体多核苷酸可以是DNA，例如DNA质粒、细菌人工染色 体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、病毒载体、一段线性DNA、PCR片段、 裸核酸或与递送赋形剂(如脂质体或泊洛沙姆)复合的核酸。
该外源多核苷酸模板包括一个有待整合的序列(例如，突变的基因)。供整合 的序列可以是一个对细胞而言内源或外源的序列。有待整合的序列的实例包括编码 蛋白质的多核苷酸或非编码RNA(例如，微小RNA)。因此，供整合的序列可以 可操作地连接到一个或多个适当的控制序列上。可替代地，有待整合的序列可以提 供一种调节功能。
选择外源多核苷酸模板中的上游和下游序列，以促进感兴趣的染色体序列与供体多核苷酸之间的重组。该上游序列是一个与供整合的靶向位点的上游的基因组序 列具有序列相似性的核酸序列。类似地，该下游序列是一个与供整合的靶向位点的 染色体序列下游具有序列相似性的核酸序列。外源多核苷酸模板中的上游和下游序 列与靶向的基因组序列可以具有75％、80％、85％、90％、95％或100％序列一致性。 优选地，外源多核苷酸模板中的上游和下游序列与靶向的基因组序列具有约95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。在一些方法中，外源多核苷酸模板中 的上游和下游序列与靶向的基因组序列具有约99％或100％序列一致性。
上游或下游序列可以包括从约20bp至约2500bp，例如约50、100、200、300、 400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、 1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500bp。在一些方法中， 示例性上游或下游序列具有约200bp至约2000bp、约600bp至约1000bp或更具 体地约700bp至约1000bp。
在一些方法中，该外源多核苷酸模板可以进一步包括一种标记。这样的一种标 记使得容易地筛选靶向的整合。适合的标记的实例包括限制性位点、荧光蛋白或选 择性标记。可以使用重组技术构建本发明的外源多核苷酸模板(参见例如，萨姆布 鲁克(Sambrook)等人，2001和奥苏贝尔(Ausubel)等人，1996)。
在一种用于通过整合外源多核苷酸模板而修饰靶多核苷酸的示例性方法中，通过CRISPR复合物将双链断裂引入进基因组序列中，经由同源重组一个外源多核苷 酸模板而修复该断裂，这样使得将该模板整合进基因组中。双链断裂的存在促进模 板的整合。
在其他实施例中，本发明提供了一种修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方 法。该方法包括通过使用结合到多核苷酸上的CRISPR复合物增加或降低靶多核苷 酸的表达。
在一些方法中，可以使靶多核苷酸失活以实施细胞中的表达的修饰。例如，当CRISPR复合物结合到细胞中的一个靶序列上时，该靶多核苷酸失活，这样使得该 序列不被转录，该编码蛋白不被产生，或者该序列不会像野生型序列一样起作用。 例如，可以使蛋白质或微小RNA编码序列失活，这样使得该蛋白质不被产生。
在一些方法中，可以使控制序列失活，这样使得它不再作为控制序列起作用。 如在此使用，“控制序列”是指影响核酸序列的转录、翻译或可及性的任何核酸序 列。控制序列的实例包括启动子、转录终止子和增强子，它们是控制序列。
失活的靶序列可以包括缺失突变(即，缺失一个或多个核苷酸)、插入突变(即， 插入一个或多个核苷酸)或无义突变(即，用另一个核苷酸取代一个单核苷酸，这 样使得引入终止密码子)。在一些方法中，靶序列的失活导致该靶序列的“敲除 (knock-out)”。
可以通过当将测试模型细胞和对照细胞与候选试剂接触时，测定它们之间的对应的基因的mRNA水平差异而确定一个或多个与信号传导生化途径相关的基因组 序列的改变的表达。可替代地，通过检测编码的多肽或基因产物的水平差异而确定 与信号传导生化途径相关的序列的差异表达。
为了在mRNA转录本或对应的多核苷酸水平上测定试剂诱导的变化，首先根 据本领域的标准方法提取包含在样品中的核酸。例如，可以根据陈述于萨姆布鲁克 (Sambrook)等人(1989)中的程序使用各种水解酶分离mRNA或遵循由制造商 提供的随附说明书通过核酸结合树脂提取mRNA。然后，根据本领域广泛已知的方 法或基于在此示例的方法，通过扩增程序或常规的杂交测定(例如Northern印迹分 析)检测包含在提取的核酸样品中的mRNA。
出于本发明的目的，扩增意指利用引物和聚合酶的能够以合理的保真度复制靶序列的任何方法。可以通过天然或重组DNA聚合酶，如TaqGoldTM、T7 DNA聚 合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段以及逆转录酶进行扩增。一种优选的 扩增方法是PCR。具体而言，可以使分离的RNA经受逆转录测定，该测定与定量 聚合酶链式反应(RT-PCR)耦合，以便定量与信号传导生化途径相关的序列的表 达水平。
在扩增测定中可以实时地执行基因表达水平的检测。在一个方面，可以用荧光DNA结合剂直接使扩增产物可视化，这些荧光DNA结合剂包括但不限于DNA嵌 入剂和DNA沟结合剂。因为掺入进双链DNA分子中的嵌入剂的量典型地与扩增 DNA产物的量成比例，可以常规地通过使用本领域的常规光学系统定量嵌入的染 料的荧光而确定扩增产物的量。适于本申请的DNA结合染料包括SYBR绿、SYBR 蓝、DAPI、碘化丙锭、Hoeste、SYBR金、溴化乙锭、吖啶、原黄素、吖啶橙、吖 啶黄、氟香豆素(fluorcoumanin)、玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色 霉素、乙菲啶(homidium)、光辉霉素、多吡啶钌、安曲霉素等。
在另一个方面，可以在扩增反应中利用其他荧光标记物(如序列特异的探针)， 以促进扩增产物的检测和定量。基于探针的定量扩增依赖于希望的扩增产物的序列 特异的检测。它利用荧光的靶标特异的探针(例如，
Figure BDA0003056817240000591
探针)，从而导致增 加的特异性和敏感性。用于进行基于探针的定量扩增的方法本领域是确立的并且教 导于美国专利号5,210,015中。
在又另一个方面，可以使用与以下序列具有序列同源性的杂交探针进行常规的杂交测定，这些序列与信号传导生化途径相关。典型地，在杂交反应中，允许探针 和与信号传导生化途径相关的序列形成稳定的复合物，这些序列被包含在来源于测 试受试者的生物样品内。本领域的技术人员应该意识到的是，在将反义核酸用作探 针核酸的情况下，提供于样品中的靶多核苷酸被选择为与该反义核酸的序列互补。 相反地，在核苷酸探针是有义核酸的情况下，该靶多核苷酸被选择为与该有义核酸 的序列互补。
可以在不同严格度条件下进行杂交，例如如此处所述的。用于实践本发明的适 合的杂交条件是这样的，使得探针和与信号传导生化途径相关的序列之间的识别相 互作用既是充分特异的又是充分稳定的。增加杂交反应的严格度的条件在本领域是 广泛已知且公开的。参见例如，(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，(1989)；非放 射性原位杂交应用手册(Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual)， 宝灵曼公司(Boehringer Mannheim)，第二版)。可以使用固定在任何固体支持物 上的探针进行杂交测定，所述固体支持物包括但不限于硝化纤维、玻璃、硅以及多 种基因阵列。如描述于美国专利号5,445,934中，在高密度基因芯片上执行优选的 杂交测定。
对于在杂交测定过程中形成的探针-靶标复合物的常规检测，将核苷酸探针络 合至可检测标记物上。适于在本发明中使用的可检测标记物包括通过光化学、生物 化学、光谱学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何组合物。多种多样 的适当的可检测标记物在本领域是已知的，包括荧光或化学发光标记物、放射性同 位素标记物、酶或其他配体。在优选的实施例中，可能希望的是利用荧光标记物或 酶标签，如地高辛、β-半乳糖苷酶、脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶、亲和素/生物 素复合物。
用于检测或定量杂交强度的检测方法将典型地取决于以上选择的标记物。例 如，可以使用照相底片或感光成像仪检测放射性标记物。可以使用检测发射光的光 检测器检测并定量荧光标记物。典型地通过为酶提供底物并测量由酶对底物的作用 而产生的反应产物来检测酶标记物；并且最后，通过简单地使着色的标记物可视化 而检测比色标记物。
还可以通过检查对应的基因产物确定与信号传导生化途径相关的序列的试剂 诱导的表达变化。确定蛋白质水平典型地涉及a)使包含在生物样品中的蛋白质与 特异性结合到与信号传导生化途径相关的蛋白质上的试剂接触；并且(b)鉴定这样 形成的任何试剂:蛋白质复合物。在此实施例的一个方面，特异性结合与信号传导 生化途径相关的蛋白质的该试剂是一种抗体，优选单克隆抗体。
通过在将允许在该试剂和与信号传导生化途径相关的蛋白质之间形成复合物 的条件下，通过使该试剂与来源于测试样品的与信号传导生化途径相关的蛋白质的 样品接触而进行该反应。可以根据本领域中的标准程序直接地或间接地检测复合物 的形成。在直接检测方法中，这些试剂提供有可检测的标记物并且未反应的试剂可 以从复合物中除去；由此剩余的标记物的量指示形成的复合物的量。对于这样的方 法，优选的是选择即使在严格洗涤条件过程中仍附接至这些试剂上的标记物。优选 的是，该标记物不干扰结合反应。在替代方案中，间接检测程序可以使用包含用化 学方法或酶方法引入的标记物的试剂。令人希望的标记物通常不干扰所得的试剂: 多肽复合物的结合或稳定性。然而，标记物典型地被设计成是用于有效结合并且因 此产生可检测的信号的抗体可及的。
适于检测蛋白质水平的多种多样的标记物在本领域是已知的。非限制性实例包括放射性同位素、酶、胶体金属、荧光化合物、生物发光化合物以及化学发光化合 物。
可以通过标准定量测定定量在结合反应过程中形成的试剂:多肽复合物的量。 如上所示，可以通过仍留在结合位点处的标记物的量直接测量试剂:多肽复合物的 形成。在一个替代方案中，测试与信号传导生化途径相关的蛋白质与标记的类似物 结合特定试剂上的位点的竞争能力。在此竞争测定中，捕获的标记物的量与存在于 测试样品中的与信号传导生化途径相关的蛋白质序列的量成反比。
多种用于蛋白质分析的基于以上概括的总则的技术在本领域是可获得的。它们包括但不限于放射免疫测定、ELISA(酶联免疫放射测定)、“夹层免疫测定、免 疫放射测定、原位免疫测定(使用例如，胶体金、酶或放射性同位素标记物)、 western印迹分析、免疫沉淀测定、免疫荧光测定以及SDS-PAGE。
特异性识别或结合到与信号传导生化途径相关的蛋白质上的抗体对于执行前 述蛋白质分析而言是优选的。在希望的情况下，可以使用识别特定类型的翻译后修 饰(例如，信号传导生化途径诱导的修饰)的抗体。翻译后修饰包括但不限于糖基 化、脂化、乙酰化以及磷酸化。这些抗体可以购自商业供应商。例如，特异性识别 酪氨酸磷酸化蛋白质的抗磷酸酪氨酸抗体可以获得自多个供应商，包括英杰公司和 珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)。抗磷酸酪氨酸抗体在检测响应于ER应激而在其 酪氨酸残基上存在差异磷酸化的蛋白质中是特别有用的。这样的蛋白质包括但不限 于真核翻译起始因子2α(eIF-2α)。可替代地，可以通过用展示出希望的翻译后修 饰的靶蛋白免疫宿主动物或抗体产生细胞而使用常规的多克隆或单克隆抗体技术 产生这些抗体。
在实践主题方法中，可以令人希望的是，在不同身体组织中、在不同细胞类型 中和/或在不同亚细胞结构中辨别与信号传导生化途径相关的蛋白质的表达谱。可 以通过使用能够结合到优先表达于某些组织、细胞类型或亚细胞结构中的蛋白质标 记的组织特异的、细胞特异的或亚细胞结构特异的抗体进行这些研究。
还可以通过检查基因产物相对于对照细胞的活性变化而确定与信号传导生化 途径相关的基因的改变的表达。与信号传导生化途径相关的蛋白质的试剂诱导的活 性变化的测定将取决于处于研究之下的生物活性和/或信号传导途径。例如，在该 蛋白质是一种激酶的情况下，可以通过本领域已知的多种测定确定它磷酸化一种或 多种下游底物的能力的变化。代表性测定包括但不限于用抗体进行免疫印迹和免疫 沉淀，这些抗体是如识别磷酸化蛋白质的抗磷酸酪氨酸抗体。此外，可以通过高通 量化学发光测定检测激酶活性，如AlphaScreenTM(可获得自珀金埃尔默公司)和 eTagTM测定(陈-辉(Chan-Hui)等人(2003)《临床免疫学》(Clinical Immunology) 111:162-174)。
在与信号传导生化途径相关的蛋白质是使得细胞内pH条件波动的信号传导级 联的一部分的情况下，可以将pH敏感的分子(如荧光pH染料)用作报道分子。 在与信号传导生化途径相关的蛋白质是一种离子通道的另一个实例中，可以监测膜 电位和/或细胞内离子浓度的波动。多种商业试剂盒和高通量装置特别适于快速且 稳健地筛选离子通道调节剂。代表性仪器包括FLIPRTM(分子设备公司(Molecular Devices,Inc.))和VIPR(奥罗拉生物科学公司(Aurora Biosciences)))。这些仪 器能够同时检测微板的1000多个样品孔中的反应，并且能够提供一秒内或甚至一 毫秒内的实时测量和功能数据。
在实践在此披露的任何方法中，可以经由本领域已知的一种或多种方法将适合的载体引入进细胞或胚胎中，这些方法包括但不限于，显微注射、电穿孔、声致穿 孔、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树枝状聚合物转染、 热休克转染、核转染、磁转染、脂转染、刺穿转染(impalefection)、光学转染、 专有剂增强的核酸摄取以及经由脂质体、免疫脂质体、病毒颗粒或人工病毒体进行 递送。在一些方法中，通过显微注射将该载体引入进胚胎中。可以将这个或这些载 体显微注射进胚胎的细胞核或细胞质中。在一些方法中，通过核转染将这个或这些 载体引入进细胞中。
CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是对真核细胞而言内源或外源的任何多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种驻留在真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶 多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例 如，调节多核苷酸或无用DNA)。
靶多核苷酸的实例包括与信号传导生化途径相关的序列，例如信号传导生化途径相关基因或多核苷酸。靶多核苷酸的实例包括疾病相关基因或多核苷酸。“疾病 相关”基因或多核苷酸是指与非疾病对照的组织或细胞相比，在来源于疾病影响的 组织的细胞中以异常水平或以异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷 酸。在改变的表达与疾病的出现和/或进展相关的情况下，它可以是一个以异常高 的水平被表达的基因；它可以是一个以异常低的水平被表达的基因。疾病相关基因 还指具有一个或多个突变或直接负责或与一个或多个负责疾病的病因学的基因连 锁不平衡的遗传变异的基因。转录的或翻译的产物可以是已知的或未知的，并且可 以处于正常或异常水平。
CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是对真核细胞而言内源或外源的任何多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种驻留在真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶 多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例 如，调节多核苷酸或无用DNA)。
CRISPR复合物的靶多核苷酸可以包括多个疾病相关基因和多核苷酸以及信号 传导生化途径相基因和多核苷酸，如分别提交于2012年12月12日和2013年1月 2日、标题均为用于序列操纵的系统方法和组合物(SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCEMANIPULATION)的分别具有博德参考号 BI-2011/008/WSGR案卷号44063-701.101和BI-2011/008/WSGR案卷号 44063-701.102的美国临时专利申请61/736,527和61/748,427中所列举，将所有这 些申请的内容通过引用以其全文结合在此。
靶多核苷酸的实例包括与信号传导生化途径相关的序列，例如信号传导生化途径相关基因或多核苷酸。靶多核苷酸的实例包括疾病相关基因或多核苷酸。“疾病 相关”基因或多核苷酸是指与非疾病对照的组织或细胞相比，在来源于疾病影响的 组织的细胞中以异常水平或以异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷 酸。在改变的表达与疾病的出现和/或进展相关的情况下，它可以是一个以异常高 的水平被表达的基因；它可以是一个以异常低的水平被表达的基因。疾病相关基因 还指具有一个或多个突变或直接负责或与一个或多个负责疾病的病因学的基因连 锁不平衡的遗传变异的基因。转录的或翻译的产物可以是已知的或未知的，并且可 以处于正常或异常水平。
疾病相关基因和多核苷酸的实例可获得自约翰斯·霍普金斯大学的麦考斯克-纳森遗传医学研究所(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns HopkinsUniversity)(巴尔的摩，马里兰州)和国立医学图书馆的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine)(贝 塞斯达，马里兰州)。
疾病相关基因和多核苷酸的实例列于表A和B中。在万维网上可获得的疾病 具体信息可获得自约翰斯·霍普金斯大学的麦考斯克-纳森遗传医学研究所 (McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns Hopkins University)(巴尔 的摩，马里兰州)和国立医学图书馆的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information,National Library of Medicine)(贝塞斯达，马里兰州)。信号传导生化途径相关基因和多核苷酸的实例列于表C中。
这些基因和途径的突变可以导致产生不当的蛋白质或以不当的量影响功能的 蛋白质。通过引用而特此结合来自于2012年12月12日提交的美国临时申请 61/736,527和2013年1月2日提交的61/748,427的基因、疾病和蛋白质的另外的 实例。这样的基因、蛋白质和途径可以是CRISPR复合物的靶多核苷酸。
表A
Figure BDA0003056817240000631
Figure BDA0003056817240000641
表B：
Figure BDA0003056817240000651
Figure BDA0003056817240000661
Figure BDA0003056817240000671
Figure BDA0003056817240000681
表C：
Figure BDA0003056817240000682
Figure BDA0003056817240000691
Figure BDA0003056817240000701
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Figure BDA0003056817240000791
Figure BDA0003056817240000801
本发明的实施例还涉及与敲除基因、扩增基因以及修复与DNA重复不稳定性 和神经障碍相关的具体突变有关的方法和组合物(罗伯特D.·威尔斯(Robert D. Wells)、芦沢哲夫(Tetsuo Ashizawa)，遗传不稳定性与神经疾病(Genetic Instabilities andNeurological Diseases)，第二版，学术出版社(Academic Press)，2011年10 月13日–《医学》(Medical))。已经发现串联重复序列的特定方面对超过二 十种人类疾病负责(重复不稳定新见：RNA·DNA杂交体的作用(New insights into repeat instability:role ofRNA·DNA hybrids).麦基弗EI(McIvor EI)、波拉克U (Polak U)、纳皮尔拉拉M(NapieralaM).《RNA生物学》(RNA Biol.)2010 年9月-10月；7(5):551-8)。可以利用CRISPR-Cas系统修正基因组不稳定性缺陷。
本发明的一个另外的方面涉及利用CRISPR-Cas系统修正EMP2A和EMP2B 基因缺陷，这些基因已经被鉴定为与拉福拉病(Lafora disease)相关。拉福拉病是 一种由可以作为青年期的癫痫发作而开始的进行性肌阵挛性癫痫表征的常染色体 隐性病症。该疾病的少数病可以由尚未鉴定的基因的突变引起。该疾病引起发作、 肌肉痉挛、行走困难、痴呆，并且最终引起死亡。当前没有疗法被证明有效对抗疾 病进展。与癫痫相关的其他遗传异常还可以靶向CRISPR-Cas系统并且基础遗传学 进一步描述于由朱利亚诺阿文济尼(Giuliano Avanzini)、杰弗里L.诺贝尔斯 (Jeffrey L.Noebels)编辑的《癫痫与遗传癫痫遗传学》(Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies)，马里亚尼儿科神经学基金会(Mariani Foundation Paediatric Neurology):20；2009)中。
在本发明的又另一个方面，该CRISPR-Cas系统可以用来矫正几种基因突变引 起的眼部缺陷，其进一步描述于《眼的遗传疾病》(Genetic Diseases of the Eye)， 第二次编辑，由伊莱亚斯(Elias)I.特拉布勒西(Traboulsi)编辑，牛津大学出版 社，2012年。
本发明的若干另外的方面涉及修正与范围广泛的遗传性疾病相关的缺陷，这些遗传性疾病在专题小节遗传性障碍(Genetic Disorders)下被进一步描述于国立卫 生研究院的网站(网址为health.nih.gov/topic/GeneticDisorders)。遗传性脑病可以 包括但不限于，肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不全、艾卡尔迪综合征(Aicardi Syndrome)、阿尔佩斯病(Alpers'Disease)、阿尔茨海默病、巴特综合征(Barth Syndrome)、巴藤病(Batten Disease)、CADASIL、小脑变性、费波瑞病(Fabry's Disease)、格斯特曼-施特劳斯纳病(Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease)、亨 廷顿病以及其他三联体重复障碍、莱氏病(Leigh's Disease)、莱施-奈恩综合征、 门克斯病、线粒体肌病以及NINDS空洞脑(Colpocephaly)。这些疾病在小节遗传 性脑部障碍(Genetic Brain Disorders)下被进一步描述于国立卫生研究院的网站。
在一些实施例中，该病症可以是瘤形成。在一些实施例中，在该病症是瘤形成 的情况下，有待被靶向的基因是列于表A中的那些基因中的任一种(在这种情况 下是PTEN等)。在一些实施例中，该病症可以是年龄相关性黄斑变性。在一些实 施例中，该病症可以是一种精神分裂症障碍。在一些实施例中，该病症可以是一种 三核苷酸重复障碍。在一些实施例中，该病症可以是脆性X综合征。在一些实施 例中，该病症可以是一种分泌酶相关障碍。在一些实施例中，该病症可以是一种朊 病毒相关障碍。在一些实施例中，该病症可以是ALS。在一些实施例中，该病症可 以是一种药物成瘾。在一些实施例中，该病症可以是自闭症。在一些实施例中，该 病症可以是阿尔茨海默病。在一些实施例中，该病症可以是炎症。在一些实施例中， 该病症可以是帕金森病。
与帕金森病相关的蛋白质的实例包括但不限于α-突触核蛋白、DJ-1、LRRK2、PINK1、帕金蛋白、UCHL1、Synphilin-1以及NURR1。
成瘾相关的蛋白质的实例可以包括例如ABAT。
炎症相关蛋白的实例可以包括例如由Ccr2基因编码的单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)、由Ccr5基因编码的C-C趋化因子受体类型5(CCR5)、由Fcgr2b基 因编码的IgG受体IIB(FCGR2b，亦称CD32)或由Fcer1g基因编码的FcεR1g (FCER1g)蛋白。
心血管疾病相关蛋白的实例可以包括例如IL1B(白介素1，β)、XDH(黄嘌 呤脱氢酶)、TP53(肿瘤蛋白p53)、PTGIS(前列腺素I2(前列腺环素)合酶)、 MB(肌红蛋白)、IL4(白介素4)、ANGPT1(血管生成素1)、ABCG8(ATP- 结合盒，亚家族G(WHITE)，成员8)或CTSK(组织蛋白酶K)。
阿尔茨海默病相关蛋白的实例可以包括例如由VLDLR基因编码的极低密度脂 蛋白受体蛋白(VLDLR)、由UBA1基因编码的泛素样改性剂激活酶1(UBA1) 或由UBA3基因编码的NEDD8-激活酶E1催化亚基蛋白(UBE1C)。
自闭症谱系障碍相关蛋白的实例可以包括例如由BZRAP1基因编码的苯二氮 卓受体(外周)相关蛋白1(BZRAP1)、由AFF2基因编码的AF4/FMR2家族成 员2蛋白(AFF2)(亦称MFR2)、由FXR1基因编码的脆性X智力迟钝常染色 体同系物1蛋白(FXR1)或由FXR2基因编码的脆性X智力迟钝常染色体同系物 2蛋白(FXR2)。
黄斑变性相关蛋白的实例可以包括例如由ABCR基因编码的ATP-结合盒，亚 家族A(ABC1)成员4蛋白(ABCA4)、由APOE基因编码的载脂蛋白E蛋白(APOE) 或由CCL2基因编码的趋化因子(C-C基序)配体2蛋白(CCL2)。
精神分裂症相关蛋白的实例可以包括NRG1、ErbB4、CPLX1、TPH1、TPH2、 NRXN1、GSK3A、BDNF、DISC1、GSK3B及其组合。
涉及肿瘤抑制的蛋白质的实例可以包括例如ATM(共济失调性毛细血管扩张 突变的)、ATR(共济失调性毛细血管扩张和Rad3相关的)、EGFR(表皮生长因 子受体)、ERBB2(v-erb-b2红白血病病毒癌基因同系物2)、ERBB3(v-erb-b2 红白血病病毒癌基因同系物3)、ERBB4(v-erb-b2红白血病病毒癌基因同系物4)、 Notch 1、Notch2、Notch 3或Notch 4。
与分泌酶障碍相关的蛋白质的实例可以包括例如PSENEN(早老素增强子2同 系物(秀丽隐杆线虫))、CTSB(组织蛋白酶B)、PSEN1(早老素1)、APP(淀 粉样蛋白β(A4)前体蛋白)、APH1B(前咽缺陷1同系物B(秀丽隐杆线虫))、 PSEN2(早老素2(阿尔茨海默病4))或BACE1(β-位点APP-切割酶1)。
与肌萎缩性侧索硬化相关的蛋白质的实例可以包括SOD1(超氧化物歧化酶 1)、ALS2(肌萎缩性侧索硬化2)、FUS(融合在肉瘤中)、TARDBP(TAR DNA 结合蛋白)、VAGFA(血管内皮生长因子A)、VAGFB(血管内皮生长因子B) 以及VAGFC(血管内皮生长因子C)及其任何组合。
与朊病毒病相关的蛋白质的实例可以包括SOD1(超氧化物歧化酶1)、ALS2 (肌萎缩性侧索硬化2)、FUS(融合在肉瘤中)、TARDBP(TAR DNA结合蛋 白)、VAGFA(血管内皮生长因子A)、VAGFB(血管内皮生长因子B)以及 VAGFC(血管内皮生长因子C)及其任何组合。
与朊病毒病症中的神经退行性疾病相关的蛋白质的实例可以包括例如A2M (α-2-巨球蛋白)、AATF(凋亡拮抗转录因子)、ACPP(前列腺的酸性磷酸酶)、 ACTA2(肌动蛋白α2平滑肌主动脉)、ADAM22(ADAM金属肽酶结构域)、 ADORA3(腺苷A3受体)或ADRA1D(α-1D肾上腺素能受体(Alpha-1D adrenergic receptor或Alpha-1D adrenoreceptor))。
与免疫缺陷相关的蛋白质的实例可以包括例如A2M[α-2-巨球蛋白]；AANAT [芳烷基胺N-乙酰转移酶]；ABCA1[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员1]； ABCA2[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员2]；或ABCA3[ATP-结合盒，亚 家族A(ABC1)，成员3]。
与三核苷酸重复障碍相关的蛋白质的实例包括例如AR(雄激素受体)、FMR1 (脆性X智力迟钝1)、HTT(亨廷顿蛋白)或DMPK(强直性肌营养不良蛋白激 酶)、FXN(弗氏共济失调蛋白(frataxin))、ATXN2(共济失调蛋白2)。
与神经传递障碍相关的蛋白质的实例包括例如SST(生长抑素)、NOS1(一 氧化氮合酶1(神经元的))、ADRA2A(肾上腺素能的，α-2A-，受体)、ADRA2C (肾上腺素能的，α-2C-，受体)、TACR1(速激肽受体1)或HTR2c(5-羟色胺 (血清素)受体2C)。
神经发育相关序列的实例包括例如A2BP1[共济失调蛋白2-结合蛋白1]、 AADAT[氨基己二酸氨基转移酶]，AANAT[芳烷基胺N-乙酰转移酶]、ABAT[4-氨 基丁酸氨基转移酶]、ABCA1[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员1]或 ABCA13[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员13]。
可用本发明系统治疗的优选病症的另外的实例可以选自：艾卡迪-古铁雷斯综 合征(Aicardi-Goutières Syndrome)；亚历山大病；阿伦-赫恩登-达德利综合征 (Allan-Herndon-Dudley Syndrome)；POLG相关障碍；α-甘露糖苷贮积症(II和 III型)；阿尔斯特伦综合征(
Figure BDA0003056817240000831
Syndrome)；安格曼；综合征；共济失调- 毛细血管扩张；神经元蜡样-脂褐质沉积；β-地中海贫血；双侧视神经萎缩和1型(婴 儿)视神经萎缩；视网膜母细胞瘤(双侧的)；卡纳万病(Canavan Disease)；脑 -眼-面-骨骼综合征(CerebrooculofacioskeletalSyndrome)1[COFS1]；脑腱黄瘤病； 科尼利亚迪兰吉综合征(Cornelia de LangeSyndrome)；MAPT相关障碍；遗传性 朊病毒病；德拉韦综合征(Dravet Syndrome)；早期发病家族性阿尔茨海默病；弗 里德赖希共济失调[FRDA]；多发性畸形；岩藻糖苷贮积症；福山(Fukuyama)先 天性肌营养不良；半乳糖唾液酸贮积症；戈谢病(Gaucher Disease)；有机酸血症； 噬血细胞淋巴组织细胞增生症；早衰症；粘脂贮积症II；婴儿游离唾液酸贮积病；PLA2G6相关神经变性；耶韦尔和朗格-尼尔森综合征(Jervell and Lange-NielsenSyndrome)；结合性大疱性表皮松解；亨廷顿病；克拉伯病(Krabbe Disease)(婴 儿的)；线粒体DNA相关雷吉综合征(Mitochondrial DNA-Associated Leigh Syndrome)和NARP；莱施-奈恩综合征；LIS1相关无脑回；洛氏综合征(Lowe Syndrome)；槭糖尿病；MECP2复制综合征；ATP7A相关铜转运障碍；LAMA2 相关肌营养不良；芳基硫酸酯酶A缺乏；I、II或III型粘多糖贮积症；过氧化物酶 体生物发生障碍，齐薇格谱系综合征(Zellweger SyndromeSpectrum)；伴随脑铁 累积障碍的神经变性；酸性鞘磷脂酶缺乏；C型尼曼-皮克病；甘氨酸脑病；ARX 相关障碍；尿素循环障碍；COL1A1/2相关成骨不全；线粒体DNA缺失综合征；PLP1相关障碍；佩里综合征(Perry Syndrome)；费伦-麦克德米德综合征 (Phelan-McDermidSyndrome)；II型糖原贮积症(蓬佩病(Pompe Disease))(婴 儿的)；MAPT相关障碍；MECP2相关障碍；1型肢近端型点状软骨发育不全 (Rhizomelic Chondrodysplasia Punctata Type1)；罗伯茨综合征(Roberts Syndrome)；桑德霍夫病(Sandhoff Disease)；辛德勒病(Schindler Disease)-1 型；腺苷脱氨酶缺乏；史-伦-奥三氏综合征；脊髓性肌萎缩；婴儿发病脊髓小脑性 共济失调；己糖胺酶A缺乏；1型致死性发育不良；胶原VI型相关障碍；I型乌谢 尔综合征(Usher Syndrome)；先天性肌营养不良；沃尔夫-赫奇霍恩综合征 (Wolf-Hirschhorn Syndrome)；溶酶体酸脂酶缺乏；以及着色性干皮病。
如将是显而易见的，设想的是可以使用本发明系统靶向任何感兴趣的多核苷酸序列。使用本发明系统进行治疗可能是有用的病症或疾病的一些实例被包括在上表 中并且当前与那些病症相关的基因的实例也被提供于此。然而，示例的基因并不是 穷尽性的。
实例
以下实例出于说明本发明的不同实施例的目的而给出并且并不意在以任何方 式限制本发明。本发明实例连同在此描述的方法目前代表优选的实施例，是示例性 的，并且并不旨在限制本发明的范围。涵盖在如由权利要求书的范围所定义的本发 明的精神内的在此的变化以及其他用途是本领域普通技术人员可以想到的。
实例1：Cas9系统用于体内应用的改进
申请人执行了具有小分子量的Cas9的宏基因组检索。大多数Cas9直向同源物 相当大。许多已知的Cas9直向同源物是大的并且包含多于1300个氨基酸。例如， SpCas9的长度为1368aa左右，这对于容易包装进供递送的病毒载体中而言太大。 表示Cas9同系物的长度分布的图像示于图6中：该图像是从GenBank中保藏的序 列产生的。一些序列可能已经被错误注释并且因此每个长度的准确频率不一定是精 确的。尽管如此，但是它提供了对Cas9蛋白分布的模糊认识并且表明存在较短的 Cas9同系物。
通过计算分析，申请人发现在细菌菌株弯曲杆菌属中，存在两个具有少于1000 个氨基酸的Cas9蛋白。下文呈现了来自空肠弯曲杆菌的一种Cas9的序列。以此长 度，CjCas9可以被容易地包装进AAV、慢病毒、腺病毒以及其他用于稳健地递送 进原代细胞和递送进动物模型体内的病毒载体中。在本发明的一个优选实施例中， 使用来自金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白。
空肠弯曲杆菌Cas9(CjCas9)
MARILAFDIGISSIGWAFSENDELKDCGVRIFTKVENPKTGESLALPRRLARSARK RLARRKARLNHLKHLIANEFKLNYEDYQSFDESLAKAYKGSLISPYELRFRALN ELLSKQDFARVILHIAKRRGYDDIKNSDDKEKGAILKAIKQNEEKLANYQSVGE YLYKEYFQKFKENSKEFTNVRNKKESYERCIAQSFLKDELKLIFKKQREFGFSFS KKFEEEVLSVAFYKRALKDFSHLVGNCSFFTDEKRAPKNSPLAFMFVALTRIINL LNNLKNTEGILYTKDDLNALLNEVLKNGTLTYKQTKKLLGLSDDYEFKGEKGT YFIEFKKYKEFIKALGEHNLSQDDLNEIAKDITLIKDEIKLKKALAKYDLNQNQID SLSKLEFKDHLNISFKALKLVTPLMLEGKKYDEACNELNLKVAINEDKKDFLPA FNETYYKDEVTNPVVLRAIKEYRKVLNALLKKYGKVHKINIELAREVGKNHSQ RAKIEKEQNENYKAKKDAELECEKLGLKINSKNILKLRLFKEQKEFCAYSGEKIK ISDLQDEKMLEIDHIYPYSRSFDDSYMNKVLVFTKQNQEKLNQTPFEAFGNDSA KWQKIEVLAKNLPTKKQKRILDKNYKDKEQKNFKDRNLNDTRYIARLVLNYTK DYLDFLPLSDDENTKLNDTQKGSKVHVEAKSGMLTSALRHTWGFSAKDRNNH LHHAIDAVIIAYANNSIVKAFSDFKKEQESNSAELYAKKISELDYKNKRKFFEPFS GFRQKVLDKIDEIFVSKPERKKPSGALHEETFRKEEEFYQSYGGKEGVLKALELGKIRKVNGKIVKNGDMFRVDIFKHKKTNKFYAVPIYTMDFALKVLPNKAVARSK KGEIKDWILMDENYEFCFSLYKDSLILIQTKDMQEPEFVYYNAFTSSTVSLIVSK HDNKFETLSKNQKILFKNANEKEVIAKSIGIQNLKVFEKYIVSALGEVTKAEFRQ REDFKK。
此CjCas9的假定的tracrRNA元件是：
TATAATCTCATAAGAAATTTAAAAAGGGACTAAAATAAAGAGTTTGCGGGA CTCTGCGGGGTTACAATCCCCTAAAACCGCTTTTAAAATT
同向重复序列是：
GTTTTAGTCCCTTTTTAAATTTCTTTATGGTAAAAT
CjCas9的嵌合的指导RNA的一个实例是：
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUCCCGAAAGGGACUAAAAUAAA GAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU
实例2：Cas9多样性和嵌合的RNA
野生型CRISPR-Cas系统是一种由跨细菌和古生菌的相异物种利用的针对侵入 型外源DNA的获得性免疫机制。II型CRISPR-Cas系统由一套编码负责将外源DNA “捕获”进CRISPR座位中的蛋白质的基因以及一套编码负责“执行”DNA切割 机制的蛋白质的基因组成；这些包括DNA核酸酶(Cas9)、非编码反式激活cr-RNA (tracrRNA)以及侧翼为同向重复的外源DNA衍生的间隔子阵列(crRNA)。当 被Cas9成熟后，tracRNA和crRNA双链体指导Cas9核酸酶到由间隔子指导序列 规定的靶DNA序列，并且在靶DNA中介导短序列基序附近的DNA中的双链断裂， 该导短序列基序为切割所需并且对于每种CRISPR-Cas系统而言是特异的。II型 CRISPR-Cas系统发现在整个细菌界中并且在用于靶标切割的Cas9蛋白序列和尺 寸、tracrRNA和crRNA同向重复序列、这些元件的基因组组织以及基序要求方面 高度相异。一个物种可以具有多种相异的CRISPR-Cas系统。
申请人评价了来自基于与已知Cas9的序列同源性和与已知亚结构域直向同源 的结构鉴定的细菌物种的207个假定的Cas9，这些亚结构域包括HNH内切核酸酶 结构域和RuvC内切核酸酶结构域[信息来自尤金库宁(Eugene Koonin)和基拉马 卡洛娃(KiraMakarova)]。基于此套的蛋白质序列保守的系统发生分析揭示了五 个Cas9家族，包括三组大的Cas9(约1400个氨基酸)和两组小的Cas9(约1100 个氨基酸)(参见图4和5A-F)。
在一些实施例中，这些tracr配对序列或这些同向重复是从CRISPR数据库下 载的或在计算机上通过搜索重复基序鉴定的，这些重复基序是1.在该II型CRISPR 座位侧翼的基因组序列的2kb窗中发现的，2.跨过20至50bp，并且3.由20至50bp 间隔开。在一些实施例中，可以使用这些标准中的2条，例如1和2、2和3、或1 和3。在一些实施例中，可以使用所有这3条标准。在一些实施例中，候选tracrRNA 是随后通过以下预测的：1.与同向重复(Geneious中具有高达18-bp错配的基序搜 索)的序列同源性，2.在转录方向上一种预测的不依赖Rho的转录终止子的存在， 以及3.tracrRNA和同向重复之间的稳定发夹二级结构。在一些实施例中，可以使用 这些标准中的2条，例如1和2、2和3、或1和3。在一些实施例中，可以使用所 有这3条标准。在一些实施例中，嵌合的合成指导RNA(sgRNA)设计在同向重 复与tracrRNA之间掺入至少12bp的双链体结构。
图9A-O提供了用以与图8A-J中提供的嵌合RNA配对的人密码子优化的Cas9 直向同源物序列的清单。申请人也已示出这些Cas9直向同源物可在体外切割测定 中切割其靶标(图16)。这些家族中的一些中的CRISPR座位描绘于图11中。对 应的指导RNA序列在图12中示出。申请人使用自定义计算机分析代码系统地分析 了该Cas9蛋白约2kb内的基因组DNA序列，并且鉴定范围从35bp至50bp的同向 重复，其具有范围从29bp至35bp的间插间隔子。基于该同向重复序列，申请人按 以下标准经计算搜索tracrRNA候选序列：在该crRNA阵列外部但与同向重复包含 高程度的同源性(如针对同向重复:tracrRNA碱基配对所要求的；自定义计算分 析)，在这些蛋白组分的编码区外部，在与同向重复具有同源性的区域的下游约 60bp-120bp包含不依赖Rho的转录终止信号，并且与同向重复共折叠以形成一种双链体，随后在tracrRNA序列的远端形成两个或更多个发夹结构。基于这些预测 标准，申请人选择一个初始集的18种Cas9蛋白，并且独特相关的同向重复以及 tracrRNA跨全部五个Cas9家族分布。申请人进一步产生在缩短碱基配对区域并且 通过一个人工环融合这两个RNA元件时保留该天然同向重复:tracrRNA双链体的序 列和二级结构的一组18个嵌合RNA结构(图8A-J)。
实例3：Cas9直向同源物
申请人已产生了密码子优化的Cas9直向同源物以推进在真核细胞中的表达。
人类密码子优化序列(即针对在人类中的表达而优化的)序列的实例：下面提 供了SaCas9：
ACCGGTGCCACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGCCGAAGA AAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCATGAAAAGGAACTACATTCTGGGGCTGG ACATCGGGATTACAAGCGTGGGGTATGGGATTATTGACTATGAAACAAGGG ACGTGATCGACGCAGGCGTCAGACTGTTCAAGGAGGCCAACGTGGAAAACA ATGAGGGACGGAGAAGCAAGAGGGGAGCCAGGCGCCTGAAACGACGGAGA AGGCACAGAATCCAGAGGGTGAAGAAACTGCTGTTCGATTACAACCTGCTG ACCGACCATTCTGAGCTGAGTGGAATTAATCCTTATGAAGCCAGGGTGAAA GGCCTGAGTCAGAAGCTGTCAGAGGAAGAGTTTTCCGCAGCTCTGCTGCACC TGGCTAAGCGCCGAGGAGTGCATAACGTCAATGAGGTGGAAGAGGACACCG GCAACGAGCTGTCTACAAAGGAACAGATCTCACGCAATAGCAAAGCTCTGG AAGAGAAGTATGTCGCAGAGCTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGATGGCG AGGTGAGAGGGTCAATTAATAGGTTCAAGACAAGCGACTACGTCAAAGAAG CCAAGCAGCTGCTGAAAGTGCAGAAGGCTTACCACCAGCTGGATCAGAGCTTCATCGATACTTATATCGACCTGCTGGAGACTCGGAGAACCTACTATGAGGG ACCAGGAGAAGGGAGCCCCTTCGGATGGAAAGACATCAAGGAATGGTACGA GATGCTGATGGGACATTGCACCTATTTTCCAGAAGAGCTGAGAAGCGTCAA GTACGCTTATAACGCAGATCTGTACAACGCCCTGAATGACCTGAACAACCTG GTCATCACCAGGGATGAAAACGAGAAACTGGAATACTATGAGAAGTTCCAG ATCATCGAAAACGTGTTTAAGCAGAAGAAAAAGCCTACACTGAAACAGATT GCTAAGGAGATCCTGGTCAACGAAGAGGACATCAAGGGCTACCGGGTGACA AGCACTGGAAAACCAGAGTTCACCAATCTGAAAGTGTATCACGATATTAAG GACATCACAGCACGGAAAGAAATCATTGAGAACGCCGAACTGCTGGATCAG ATTGCTAAGATCCTGACTATCTACCAGAGCTCCGAGGACATCCAGGAAGAG CTGACTAACCTGAACAGCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAACAGATTAGT AATCTGAAGGGGTACACCGGAACACACAACCTGTCCCTGAAAGCTATCAAT CTGATTCTGGATGAGCTGTGGCATACAAACGACAATCAGATTGCAATCTTTA ACCGGCTGAAGCTGGTCCCAAAAAAGGTGGACCTGAGTCAGCAGAAAGAGA TCCCAACCACACTGGTGGACGATTTCATTCTGTCACCCGTGGTCAAGCGGAG CTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAATGATATCATTATCGAGCTGGCTAGGGAGAAGAACAGCAAGGACGCA CAGAAGATGATCAATGAGATGCAGAAACGAAACCGGCAGACCAATGAACG CATTGAAGAGATTATCCGAACTACCGGGAAAGAGAACGCAAAGTACCTGAT TGAAAAAATCAAGCTGCACGATATGCAGGAGGGAAAGTGTCTGTATTCTCT GGAGGCCATCCCCCTGGAGGACCTGCTGAACAATCCATTCAACTACGAGGTC GATCATATTATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAATTCCTTTAACAACAAGG TGCTGGTCAAGCAGGAAGAGAACTCTAAAAAGGGCAATAGGACTCCTTTCC AGTACCTGTCTAGTTCAGATTCCAAGATCTCTTACGAAACCTTTAAAAAGCA CATTCTGAATCTGGCCAAAGGAAAGGGCCGCATCAGCAAGACCAAAAAGGA GTACCTGCTGGAAGAGCGGGACATCAACAGATTCTCCGTCCAGAAGGATTTT ATTAACCGGAATCTGGTGGACACAAGATACGCTACTCGCGGCCTGATGAATC TGCTGCGATCCTATTTCCGGGTGAACAATCTGGATGTGAAAGTCAAGTCCAT CAACGGCGGGTTCACATCTTTTCTGAGGCGCAAATGGAAGTTTAAAAAGGA GCGCAACAAAGGGTACAAGCACCATGCCGAAGATGCTCTGATTATCGCAAA TGCCGACTTCATCTTTAAGGAGTGGAAAAAGCTGGACAAAGCCAAGAAAGT GATGGAGAACCAGATGTTCGAAGAGAAGCAGGCCGAATCTATGCCCGAAATCGAGACAGAACAGGAGTACAAGGAGATTTTCATCACTCCTCACCAGATCAA GCATATCAAGGATTTCAAGGACTACAAGTACTCTCACCGGGTGGATAAAAA GCCCAACAGAGAGCTGATCAATGACACCCTGTATAGTACAAGAAAAGACGA TAAGGGGAATACCCTGATTGTGAACAATCTGAACGGACTGTACGACAAAGA TAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAAAGTCCCGAGAAGCTGCTGAT GTACCACCATGATCCTCAGACATATCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAGCA GTACGGCGACGAGAAGAACCCACTGTATAAGTACTATGAAGAGACTGGGAA CTACCTGACCAAGTATAGCAAAAAGGATAATGGCCCCGTGATCAAGAAGAT CAAGTACTATGGGAACAAGCTGAATGCCCATCTGGACATCACAGACGATTA CCCTAACAGTCGCAACAAGGTGGTCAAGCTGTCACTGAAGCCATACAGATTC GATGTCTATCTGGACAACGGCGTGTATAAATTTGTGACTGTCAAGAATCTGG ATGTCATCAAAAAGGAGAACTACTATGAAGTGAATAGCAAGTGCTACGAAG AGGCTAAAAAGCTGAAAAAGATTAGCAACCAGGCAGAGTTCATCGCCTCCT TTTACAACAACGACCTGATTAAGATCAATGGCGAACTGTATAGGGTCATCGG GGTGAACAATGATCTGCTGAACCGCATTGAAGTGAATATGATTGACATCACT TACCGAGAGTATCTGGAAAACATGAATGATAAGCGCCCCCCTCGAATTATCAAAACAATTGCCTCTAAGACTCAGAGTATCAAAAAGTACTCAACCGACATTCT GGGAAACCTGTATGAGGTGAAGAGCAAAAAGCACCCTCAGATTATCAAAAA GGGCTAAGAATTC
申请人分析了Cas9直向同源物，以鉴定相关的PAM序列和对应的嵌合的指导 RNA，如在图13A-II中指出的。这一套展开的PAM提供了跨基因组的更广泛的靶 向并且还显著增加独特靶位点的数目并且提供了在基因组中鉴定具有增加水平的 特异性的新颖的Cas9的潜力。申请人确定金黄色葡萄球菌金黄色亚种Cas9的PAM 是NNGRR(图14)。金黄色葡萄球菌金黄色亚种Cas9也被称为SaCas9。图15a-d 提供SaCas9单个或多个载体设计。
图7显示推测的PAM的序列图标，如通过反向互补序列表明的。Cas9直向同 源物及其各自的sgRNA被用于切割具有一种随机化PAM(恰在该靶序列的3'的 7-bp序列)的靶标的文库。分离切割的产物并且深度测序以产生7-bp候选序列， 这些候选序列允许针对每个Cas9直向同源物的切割。对于每个Cas9直向同源物， 共有PAM是通过比对所有7-bp候选序列确定的。(图7和21)。
检查sgRNA-DNA双链体的热力学和体内稳定性的进一步的工作很可能产生 对脱靶活性的额外的预测能力，而对SpCas9突变体以及直向同源物的探索可产生 具有改进的特异性的新颖变体。可以通过测试每种Cas9容忍指导RNA及其DNA 靶标之间的错配的能力来进一步评价Cas9直向同源物的特异性。
实例4：Cas9突变
在此实例中，申请人显示以下突变可以将SpCas9转化为切口酶：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A、D986A。
申请人提供了显示出序列突变点位于SpCas9基因内何处的序列(图10A-M)。 申请人还显示，这些切口酶仍能够介导同源重组。此外，具有这些突变(单独地) 的SpCas9降低双链断裂的水平。所有Cas9直向同源物共享3-4个RuvC结构域和 一个HNH结构域的通用结构(图19)。最5'的RuvC结构域切割非互补链，而HNH 结构域切割互补链。所有符号都是就指导序列而言的。
在5'RuvC结构域中的催化残基是通过感兴趣的Cas9与其他Cas9直向同源物 (来自化脓链球菌II型CRISPR座位、嗜热链球菌CRISPR座位1、嗜热链球菌 CRISPR座位3以及凶手弗朗西斯菌(Franciscilla novicida)II型CRISPR座位)的 同源性比较而鉴定的，并且保守性Asp残基被突变为丙氨酸以将Cas9转化成互补 链切口酶。类似地，在HNH结构域中的保守性His和Asn残基被突变为丙氨酸以 将Cas9转化为非互补链切口酶。
实例5：Cas9功能优化
用于增强功能或用于开发新的功能，申请人通过组合来自不同Cas9直向同源 物的片段而产生了嵌合的Cas9蛋白。
例如，申请人将St1Cas9(来自此蛋白的片段为粗体)的N-末端与SpCas9(来 自此蛋白的片段被加下划线)的N-末端融合。
>St1(N)Sp(C)Cas9
Figure BDA0003056817240000891
Figure BDA0003056817240000901
申请人也已产生Sp_St3嵌合蛋白并且已显示通过SpCas9、St3Cas9、Sp_St3 嵌合体以及St3_Sp嵌合体进行的体外切割(图17)。
制备嵌合的Cas9的益处包括：
a.减少毒性
b.改善在真核细胞中的表达
c.增强特异性
d.减少蛋白质的分子量，通过组合来自不同Cas9同系物的最小结构域使得蛋 白质更小。
e.改变PAM序列要求
实例6：使用AAV粒子或载体进行Cas9体内递送
体内递送–AAV方法
AAV相比于其他病毒载体是有利的，这是由于两个原因：
ο低毒性(这可以是由于纯化方法不需要细胞粒子的超速离心所致，而超速离 心可能激活免疫反应)
ο引起插入诱变的低概率，原因在于它未整合到宿主基因组中。
而某些当前AAV载体可容纳高达4300个碱基的插入DNA，因为上限或或包 装限制，AAV可具有4.5或4.75KB插入DNA。这意味着编码Cas9酶的DNA以 及启动子和转录终止子必须都配合在同一个病毒载体中。大于4.5或4.75KB的构 建体将导致病毒产生的显著降低。SpCas9是相当大的，其基因自身超过4.1kb，使 其难于包装到AAV中。因此本发明的实施例包括利用更短的Cas9直向同源物。例 如：
Figure BDA0003056817240000902
Figure BDA0003056817240000911
图3提供可用于本发明的方法以及组合物的AAV载体的示意表示。以上讨论 了包装。
实例7：使用Cas9工程化微藻
递送Cas9的方法
方法1：申请人使用在组成型启动子(如Hsp70A-Rbc S2或β2-微管蛋白)的 控制之下表达Cas9的载体递送Cas9和指导RNA。
方法2：申请人使用在组成型启动子(如Hsp70A-Rbc S2或β2-微管蛋白)的 控制之下表达Cas9和T7聚合酶的载体递送Cas9和T7聚合酶。将使用包含驱动 指导RNA的T7启动子的载体递送该指导RNA。
方法3：申请人将Cas9 mRNA和体外转录的指导RNA递送到藻类细胞中。RNA 可以在体外转录。Cas9 mRNA将由Cas9的编码区以及来自的Cop1的3’UTR组成， 以保证Cas9 mRNA的稳定。
用于同源重组，申请人提供了一个另外的同源定向修复模板。
在位于Cop1的3’UTR之后的β-2微管蛋白启动子的控制之下驱动Cas9的表 达的盒的序列。
TCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACG GCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCC TTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAA TAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATT CAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCG CACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAA CATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAA GGTCGAAGCGTCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAA CTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAA ATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAA GAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCT GCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCA CAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCA CCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCC ACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGAC CTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACT TCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGT TCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAA CGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAG CAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGG CCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAG AGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACC TACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCC GACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACA TCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGT GCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAA GAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTA CAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCT CGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAA CGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGG CGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAG AAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAA ACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCT GGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCG AGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCA AGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGT GAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCA GAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGT GAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGT GGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAAC GAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGA GAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAA GTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGC CGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTG GATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCC ACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCG GCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCG CCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGA AAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAG AGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAG CGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACAC CCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTG CAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTG TCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACT CCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGC GACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGG CAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACC AAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTG GACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAA GTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATT TCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGC CTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTG GAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATG ATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTC TACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCG AGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCG TGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGC CCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCA AAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGA AGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCT ATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGA AGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCG AGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGG CCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACT GGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAG AAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAA CAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCC AAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTAC AACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCAC CTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACA CCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCA CCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTC TCAGCTGGGAGGCGACAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCT AAGGATCCGGCAAGACTGGCCCCGCTTGGCAACGCAACAGTGAGCCCCTCC CTAGTGTGTTTGGGGATGTGACTATGTATTCGTGTGTTGGCCAACGGGTCAA CCCGAACAGATTGATACCCGCCTTGGCATTTCCTGTCAGAATGTAACGTCAG TTGATGGTACT
在位于Cop1的3’UTR之后的β-2微管蛋白启动子的控制之下驱动T7聚合酶 的表达的盒的序列：
TCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACG GCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCC TTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAA TAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATT CAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCG CACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAA Catgcctaagaagaagaggaaggttaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgtt caacactctggctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagc acgcttccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactacccta ctccctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagtt cctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaac cgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagc acttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggct gacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgca tcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcga actcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgtagtt cctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagta agaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaa atcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcg tgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgt accgcaaggacaaggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccataagg ccatctggttcccttacaacatggactggcgcggtcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaa ggactgcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcggg tgtcgacaaggttccgttccctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactg gagaacacttggtgggctgagcaagattctccgttctgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggtacagcaccacggcct gagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtag gtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaaccgttcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctacaa gcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagct gggcactaaggcactggctggtcaatggctggcttacggtgttactcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggcttac gggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtctgatgttca ctcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatctgtgagcgtgacggtggtagctgcggttgaagcaa tgaactggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgc tgtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcg gtcagttccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaa ctttgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactg attcacgactccttcggtacgattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggcta aaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaaGGATCCGGCAAGACTGGCC CCGCTTGGCAACGCAACAGTGAGCCCCTCCCTAGTGTGTTTGGGGATGTGAC TATGTATTCGTGTGTTGGCCAACGGGTCAACCCGAACAGATTGATACCCGCC TTGGCATTTCCTGTCAGAATGTAACGTCAGTTGATGGTACT
由T7启动子驱动的指导RNA的序列(T7启动子，N表示靶向序列)：
Figure BDA0003056817240000941
基因递送：
来自衣藻资源中心(Chlamydomonas Resource Center)的莱茵衣藻株CC-124 和CC-125将被用于电穿孔。电穿孔方案遵循来自GeneArt Chlamydomonas Engineering试剂盒的标准推荐方案。(网站信息在 tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/geneart_chlamy_kits_man.pdf)。
而且，申请人产生组成性地表达Cas9的莱茵衣藻系。这可以通过使用pChlamy1(使用PvuI线性化)并选择潮霉素抗性菌落而完成。以下是包含Cas9的pChlamy1 的序列。以此方式实现基因敲除，简单地需要递送指导RNA的RNA。对于同源重 组，申请人递送了指导RNA以及线性化同源重组模板。
pChlamy1-Cas9：
TGCGGTATTTCACACCGCATCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGA ACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG ATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTT AAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCT TAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTT GCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTG GCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGC AACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTA AGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCA TCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAA CGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCT CCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACT CATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGA TGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTA TGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCC ACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGA AAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTC GTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGA GCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACG GAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATC AGGGTTATTGTCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGA GCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTC TGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGT TTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTC AGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCC ACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCT GTTACCAGTGGCTGTTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGAC TCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGT TCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCG GACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGA GCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCAC CTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCC TTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTA 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对于所有修饰的莱茵衣藻细胞而言，申请人使用了PCR、SURVEYOR核酸酶 测定和DNA测序，以验证成功的修饰。
实例8：用于体内应用的SaCas9以及PAM识别
这个项目开始是因为在鉴定作为哺乳动物细胞中的功能性基因组工程工具的 化脓链球菌(Sp)以及嗜热链球菌(St)CRISPR/Cas系统之后，申请人想进一步 探索II型CRISPR/Cas系统的多样性。
通过定义用于在哺乳动物细胞中应用的新的功能性II型CRISPR/Cas系统，申 请人将潜在地能够发现：
(1)具有更高效率和/或特异性的CRISPR/Cas系统
(2)具有允许靶向更宽范围的基因组座位的不同原型间隔子邻近基序(PAM) 的CRISPR/Cas系统
(3)具有更小尺寸的CRISPR/Cas系统，这样申请人可在一种单载体中用具 有包装尺寸限制(当前Sp或St系统超过这个4.7kb的限制)的哺乳动物病毒递送 系统诸如腺病毒伴随病毒(AAV)载体对它们进行体内递送
以及其他希望的性状。
用于体内应用的Sa CRISPR/Cas系统的鉴定和设计。申请人在金黄色葡萄球 菌(Sa)中测试了一种新的II型CRISPR/Cas系统，其在dsDNA切割测定中在体 外起作用，并且鉴定NNGRRT的推测的PAM。此系统的组分是来自Sa的一种Cas9 蛋白，具有来自Sa的同向重复(DR)的一种指导CRISPR RNA，其将形成具有来 自Sa的tracrRNA的一种功能性指导RNA复合体。这种三组分系统类似于所有其 他II型CRISPR/Cas系统。因此，申请人设计一种两组分系统，其中申请人通过一 种短茎环融合该Sa tracrRNA至该Sa指导CRISPR RNA中以形成一种嵌合指导 RNA，如申请人采用化脓链球菌(Sp)CRISPR/Cas系统时精确。此嵌合指导RNA能够支持对dsDNA的体外切割。因此，申请人决定将完整的两组分系统：cas9以 及该嵌合的指导RNA，克隆至一个AAV载体中以测试其在生物机体中的功能性。
申请人选择该AAV系统是因为它是一种非整合、基于ssDNA的、非免疫原哺 乳动物病毒，其在不同组织/器官中依赖于血清型具有广谱取向，已显示对于体内 应用是安全的，并且也支持生物机体中转基因的长期表达。
初始AAV载体的设计具有(1)驱动具有单个NLS以及HA表位标签的SaCas9 蛋白的CMV启动子。(2)驱动该嵌合RNA的人U6启动子。这些被放置在来自 进行了最好研究的AAV血清型2的两个反向末端重复(ITR)之间，这些反向末 端重复充当病毒包装信号。
在内源哺乳动物基因组上的PAM序列测试如下：SaCas9靶间隔子是横跨多个 基因选择的以覆盖不同的潜在PAM序列。不同间隔子被克隆至U6-sgRNA(单个- 指导RNA)表达dsDNA盒中，将U6-sgRNA表达dsDNA盒共转染至哺乳动物细 胞系中(针对人靶标是293FT，针对小鼠靶标是N2a和Hepa)。转染后72小时， 将所有基因组DNA进行提取并且经受surveyor核酸酶测定。在TBE Page凝胶上 跑胶以检测基因组切割。定量基因组DNA切割效率并且绘图。
所有测试靶标的基因组切割效率以及其他统计学的汇总
Figure BDA0003056817240001001
所有测试靶标的基因组切割效率以及其他统计学的汇总(整理好的)
Figure BDA0003056817240001002
来自该PAM测试的结果示于图22-27。在100个靶标上进行的全面测试鉴定 了针对SaCas9的PAM可以描述为NNGRR(而不是前文指出的NNGRRT)。
PAM测试汇总：(1)NNGRR，用于通用的SaCas9的PAM-有助于设计新 的靶标，(2)用新的靶标测试双切口酶，(3)NNGRG可以是更有力的PAM。
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***
虽然已经在此示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见是这样的实施例仅以举例方式提供。在不偏离本发明的情况下 众多变化、改变和取代现在将被本领域的普通技术人员想到。应该理解的是，在实 践本发明中可以采用在此描述的本发明的实施例的不同替代方案。

Claims (60)

1.一种工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas系统，其包括：
(a)Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的多核苷酸；
(b)CRISPR-Cas系统嵌合RNA，其包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR-Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列，能够与tracr序列杂交的tracr配对序列，和tracr序列。
2.一种工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas系统，其包括：
(a)Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的多核苷酸；
(b)CRISPR-Cas系统crRNA，其包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR-Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列和能够与tracr序列杂交的tracr配对序列；和
(c)包含tracr序列的tracrRNA。
3.一种工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas载体系统，其包括一个或多个载体，所述载体包含：
(a)编码Cas9蛋白的多核苷酸；
(b)编码CRISPR-Cas系统嵌合RNA的多核苷酸，其中所述嵌合RNA包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR-Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列，能够与tracr序列杂交的tracr配对序列，和tracr序列。
4.一种工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas载体系统，其包括一个或多个载体，所述载体包含：
(a)编码Cas9蛋白的多核苷酸；
(b)编码CRISPR-Cas系统crRNA的多核苷酸，其中所述crRNA包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR-Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列，能够与tracr序列杂交的tracr配对序列；和
(c)编码tracrRNA的多核苷酸，其中所述tracrRNA包含tracr序列。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白是选自棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属或弯曲杆菌属的属的Cas9直向同源物。
6.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白选自：沃兹沃思萨特氏菌Cas9、龈沟产线菌Cas9、约氏乳杆菌Cas9、红嘴鸥弯曲杆菌Cas9、白喉棒状杆菌Cas9、食清洁剂细小棒菌Cas9、鸡毒支原体Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、巴黎嗜肺军团菌Cas9、齿垢密螺旋体Cas9、伪中间型葡萄球菌Cas9、或灰色奈瑟菌Cas9。
7.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白的长度为500-1000个氨基酸。
8.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述tracr序列的长度为至少30个核苷酸。
9.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述tracr序列的长度为至少40个核苷酸。
10.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述tracr序列的长度为至少50个核苷酸。
11.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述指导序列的长度为15-30个核苷酸。
12.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白是能够切割两条DNA链的核酸酶。
13.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白的至少一个催化结构域被突变，使得所述Cas9蛋白是缺乏切割一条DNA链的能力的切口酶。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述Cas9蛋白包含对应于化脓链球菌Cas9的D10A，H840A，N854A或N863A的突变。
15.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白的至少两个催化结构域被突变，使得所述Cas9蛋白基本上缺乏DNA切割活性。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述Cas9蛋白包含对应于化脓链球菌Cas9的D10A的突变和对应于化脓链球菌Cas9的H840A，N854A或N863A的突变。
17.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白是金黄色葡萄球菌Cas9。
18.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白与至少一个核定位信号(NLS)连接。
19.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白与至少两个NLS连接。
20.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白与至少一个N末端NLS和至少一个C末端NLS连接。
21.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白与至少一个异源蛋白质结构域连接。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述异源蛋白质结构域具有以下活性中的一种或多种：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻抑活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。
23.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中编码所述Cas9蛋白的所述多核苷酸被密码子优化以在哺乳动物细胞或人细胞中表达。
24.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述系统包括编码所述Cas9蛋白的mRNA。
25.根据权利要求3或4所述的系统，其中所述一个或多个载体是病毒载体，任选地其中组分(a)和(b)位于同一载体上。
26.根据权利要求25所述的系统，其中所述一个或多个载体是腺相关病毒(AAV)载体。
27.根据权利要求1、2、3或4所述的系统在制造用于基因疗法的药物中的用途。
28.根据权利要求1、2、3或4所述的系统用于离体或体外修饰真核细胞的用途。
29.一种真核细胞，其包含根据权利要求1、2、3或4所述的系统。
30.一种非人类生物，其包含权利要求29所述的真核细胞，其中所述非人类生物不是动物或植物品种。
31.一种用于产生修饰的真核细胞的离体或体外方法，其包括将工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas系统引入真核细胞，所述系统包括：
(a)Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的多核苷酸；
(b)CRISPR-Cas系统嵌合RNA，其包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR-Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列，能够与tracr序列杂交的tracr配对序列，和tracr序列，
从而获得修饰的真核细胞，其中所述真核细胞不是人生殖细胞。
32.一种用于产生修饰的真核细胞的离体或体外方法，其包括将工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas系统引入真核细胞，所述系统包括：
(a)Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的多核苷酸；
(b)CRISPR-Cas系统crRNA，其包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR-Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列和能够与tracr序列杂交的tracr配对序列；和
(c)包含tracr序列的tracrRNA，
从而获得修饰的真核细胞，其中所述真核细胞不是人生殖细胞。
33.一种用于产生修饰的真核细胞的离体或体外方法，其包括将工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas载体系统引入真核细胞，所述CRISPR-Cas载体系统包括一个或多个载体，所述载体包含：
(a)编码Cas9蛋白的多核苷酸；
(b)编码CRISPR-Cas系统嵌合RNA的多核苷酸，其中所述嵌合RNA包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR-Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列，能够与tracr序列杂交的tracr配对序列，和tracr序列，
从而获得修饰的真核细胞，其中所述真核细胞不是人生殖细胞。
34.一种用于产生修饰的真核细胞的离体或体外方法，其包括将工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas载体系统引入真核细胞，所述CRISPR-Cas载体系统包括一个或多个载体，所述载体包含：
(a)编码Cas9蛋白的多核苷酸；
(b)编码CRISPR-Cas系统crRNA的多核苷酸，其中所述crRNA包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR-Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列和能够与tracr序列杂交的tracr配对序列；和
(c)编码tracrRNA的多核苷酸，其中所述tracrRNA包含tracr序列，
从而获得修饰的真核细胞，其中所述真核细胞不是人生殖细胞。
35.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述Cas9蛋白是选自棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属或弯曲杆菌属的属的Cas9直向同源物。
36.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述Cas9蛋白选自：沃兹沃思萨特氏菌Cas9、龈沟产线菌Cas9、约氏乳杆菌Cas9、红嘴鸥弯曲杆菌Cas9、白喉棒状杆菌Cas9、食清洁剂细小棒菌Cas9、鸡毒支原体Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、巴黎嗜肺军团菌Cas9、齿垢密螺旋体Cas9、伪中间型葡萄球菌Cas9、或灰色奈瑟菌Cas9。
37.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述Cas9蛋白的长度为500-1000个氨基酸。
38.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述tracr序列的长度为至少30个核苷酸。
39.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述tracr序列的长度为至少40个核苷酸。
40.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述tracr序列的长度为至少50个核苷酸。
41.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述指导序列的长度为15-30个核苷酸。
42.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述Cas9蛋白是能够切割两条DNA链的核酸酶。
43.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述Cas9蛋白的至少一个催化结构域被突变，使得所述Cas9蛋白是缺乏切割一条DNA链的能力的切口酶。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述Cas9蛋白包含对应于化脓链球菌Cas9的D10A，H840A，N854A或N863A的突变。
45.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述Cas9蛋白的至少两个催化结构域被突变，使得所述Cas9蛋白基本上缺乏DNA切割活性。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述Cas9蛋白包含对应于化脓链球菌Cas9的D10A的突变和对应于化脓链球菌Cas9的H840A，N854A或N863A的突变。
47.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述Cas9蛋白是金黄色葡萄球菌Cas9。
48.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述Cas9蛋白与至少一个核定位信号(NLS)连接。
49.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述Cas9蛋白与至少两个NLS连接。
50.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述Cas9蛋白与至少一个N末端NLS和至少一个C末端NLS连接。
51.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述Cas9蛋白与至少一个异源蛋白质结构域连接。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述异源蛋白质结构域具有以下活性中的一种或多种：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻抑活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。
53.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中编码所述Cas9蛋白的所述多核苷酸被密码子优化以在哺乳动物细胞或人细胞中表达。
54.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述系统包括编码所述Cas9蛋白的mRNA。
55.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述一个或多个载体是病毒载体，任选地其中组分(a)和(b)位于同一载体中。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述一个或多个载体是腺相关病毒(AAV)载体。
57.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
58.根据权利要求31、32、33或34所述的方法，其进一步包括从所述修饰的真核细胞或其后代产生基因修饰的非人类动物或植物。
59.通过根据权利要求31、32、33或34所述的方法产生的修饰的真核细胞或其后代，其中所述修饰的真核细胞或其后代包含靶基因组基因座中与相应的野生型细胞相比的一个或多个核苷酸的插入，缺失或置换。
60.通过根据权利要求58所述的方法生产的基因修饰的非人类动物或植物，其中所述非人类动物或植物不是动物或植物品种，并且其中所述修饰的真核细胞或其后代包含靶基因组基因座中与相应的野生型细胞相比的一个或多个核苷酸的插入，缺失或置换。
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