JP7364472B2 - 標的化された核酸編集のための系、方法、及び組成物 - Google Patents

標的化された核酸編集のための系、方法、及び組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP7364472B2
JP7364472B2 JP2019563865A JP2019563865A JP7364472B2 JP 7364472 B2 JP7364472 B2 JP 7364472B2 JP 2019563865 A JP2019563865 A JP 2019563865A JP 2019563865 A JP2019563865 A JP 2019563865A JP 7364472 B2 JP7364472 B2 JP 7364472B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
mutation
adenosine deaminase
sequence
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019563865A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2020520654A5 (ja
JP2020520654A (ja
Inventor
フェン チャン
ディヴィッド ベンジャミン ターイッツ コックス
ジョナサン グーテンバーグ
オマール オー アブデイェー
ベルント ツェッチェ
ジョナサン ストレッカー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Massachusetts Institute of Technology filed Critical Massachusetts Institute of Technology
Publication of JP2020520654A publication Critical patent/JP2020520654A/ja
Publication of JP2020520654A5 publication Critical patent/JP2020520654A5/ja
Priority to JP2023092127A priority Critical patent/JP2023123486A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7364472B2 publication Critical patent/JP7364472B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04004—Adenosine deaminase (3.5.4.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/533—Physical structure partially self-complementary or closed having a mismatch or nick in at least one of the strands
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

関連出願及び参照による組み込み
本出願は、２０１７年５月１８日出願の米国仮出願第６２／５０８，２９３号、２０１７年９月２１日出願の米国仮出願第６２／５６１，６６３号、２０１７年１０月４日出願の米国仮出願第６２／５６８，１３３号、及び２０１７年１２月２２日出願の米国仮出願第６２／６０９，９５７号の優先権を主張し、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
連邦政府の助成を受けた研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって付与された課題番号ＭＨ１００７０６及び課題番号ＭＨ１１００４９の下で政府の支援を得てなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、一般に、核酸を標的とし、編集するための系、方法、及び組成物に関し、具体的には、目的標的遺伝子座におけるアデニンの脱アミノ化をプログラム可能にするための系、方法、及び組成物に関する。
ゲノムシークエンシング技術及び分析方法の最近の進歩によって、さまざまな生物学的機能及び疾患と関連する遺伝因子を分類及びマッピングする能力が飛躍的に向上してきている。合成生物学、バイオテクノロジー、及び医学の応用を進展させることに加えて、個々の遺伝要素への選択的摂動付与を可能にすることによって遺伝的な原因変異の系統的なリバースエンジニアリングを実現するには、正確なゲノム標的化技術が必要である。標的化されたゲノム摂動を付与するためにゲノム編集技術（デザイナージンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼなど）が利用可能ではあるものの、新規の方針及び分子機構を利用しており、かつ経済的に実行可能であり、実施準備が容易であり、スケール調整が可能であり、真核生物ゲノム内の複数位置への標的化に適した新たなゲノム工学技術が依然として必要とされている。こうした技術があれば、ゲノム工学及びバイオテクノロジーにおける新たな応用のための主要な供給源となるであろう。
シトシンの脱アミノ化をプログラムできることが報告されており、Ａ→Ｇ点変異及びＴ→Ｃ点変異の修正に使用することができる。例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５３３：４２０－４２４では、Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体が標的ＤＮＡ鎖に結合することによって置き換えられる非標的ＤＮＡ鎖においてＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼがシトシンを標的として脱アミノ化する結果、シトシンがウラシルに変換されることが報告されている。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１７）３５：３７１－３７６、Ｓｈｉｍａｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１７）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８３３、Ｚｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１７）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８１１、Ｙａｎｇ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ（２０１６）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１３３３０も併せて参照のこと。
しかしながら、既知の病原性ＳＮＰの中でＡ→Ｇ点変異及びＴ→Ｃ点変異が占める割合は約１２％にすぎない一方で、既知の病原性ＳＮＰの中でＧ→Ａ点変異及びＣ→Ｔ点変異が占める割合は約４７％であり、シトシンを脱アミノ化することによってＧ→Ａ点変異及びＣ→Ｔ点変異に対処することは不可能である。こうした点変異及び病原性ＳＮＰを修正するには、新規の系及び方法が必要である。
本発明の少なくとも第１の態様は、目的標的遺伝子座におけるアデニンを改変する方法に関し、この方法は、（ａ）Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質と、（ｂ）直列反復配列（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に連結されたガイド配列を含むガイド分子と、（ｃ）アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインと、を遺伝子座に送達することを含み、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくはガイド分子に共有結合もしくは非共有結合で連結されるか、または送達後にＣｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくはガイド分子に連結されるように適合化され、ガイド分子は、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質との複合体を形成するとともに、目的標的遺伝子座の第１のＤＮＡ鎖に結合するように複合体を誘導し、ガイド配列は、第１のＤＮＡ鎖内にアデニンを含む標的配列とハイブリダイズすることで、アデニンに相対する非対形成シトシンを含むヘテロ二本鎖を形成する能力を有し、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質は、ヘテロ二本鎖の形成によって置き換えられる目的標的遺伝子座の第２のＤＮＡ鎖にニックを入れ、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ヘテロ二本鎖において非対形成シトシンに相対するアデニンを脱アミノ化する。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、リンカーによってＣｐｆ１ニッカーゼタンパク質に融合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３－１１（配列番号１～９）、ＧＳＧ５（配列番号１０）、またはＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）である。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、アダプタータンパク質に連結され、ガイド分子またはＣｐｆ１ニッカーゼタンパク質は、アダプタータンパク質に結合する能力を有するアプタマー配列を含む。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、及びＰＲＲ１から選択される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質の内部ループに挿入される。
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質は、非標的鎖（すなわち、標的配列を含み、ガイド配列とハイブリダイズする鎖に相補的な鎖）にニックを入れるニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質は、Ｎｕｃドメインに変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質は、ＡｓＣｐｆ１におけるＲ１２２６Ａに対応する変異を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ニッカーゼは、除去されるＮｕｃドメインの一部またはすべてを有する。１つの特定の実施形態では、ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸１０７６～１２５８は除去され、リンカー（例えば、ＧＳＧＧリンカーまたはＧＧＳＧＧＳリンカー）で置き換えられる。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣドメインに変異を含む不活性型Ｃｐｆ１（ｄｅａｄ Ｃｐｆ１）である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、不活性型Ｃｐｆ１であり、ＡｓＣｐｆ１におけるＤ９０８ＡまたはＥ９９３Ａに対応する変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性型Ｃｐｆ１は、除去されるＮｕｃドメインの一部またはすべてを有する。１つの特定の実施形態では、ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸１０７６～１２５８は除去され、リンカー（例えば、ＧＳＧＧリンカーまたはＧＧＳＧＧＳリンカー）で置き換えられる。
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、Ｃｐｆ１に結合し、標的配列と約２４ｎｔのヘテロ二本鎖を形成する能力を有する。いくつかの実施形態では、ガイド分子は、Ｃｐｆ１に結合し、標的配列と２４ｎｔ超のヘテロ二本鎖を形成する能力を有する。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒト、イカ、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのアデノシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二本鎖に対する活性が上昇するように改変されている。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８Ｑ変異を含む変異ｈＡＤＡＲ２ｄであるか、またはＥ１００８Ｑ変異を含む変異ｈＡＤＡＲ１ｄである。
いくつかの実施形態では、方法は、目的標的配列を決定すること、及び標的配列に存在するアデニンを最も効率的に脱アミノ化するアデノシンデアミナーゼを選択すること、を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ属の１種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ ｋｕｎｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の１種、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ（Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ） ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の１種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｅｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｐｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｏｒａｌ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃａｎｓｕｌｃｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ属の１種、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ属の１種、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の１種、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｒｕｍｉｎｉｓ、ならびにＰｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ ｓｐｈｅｎｉｓｃｉからなる群から選択される細菌種に由来する。
いくつかの実施形態では、天然のＰＡＭ配列は、ＴＴＮ（Ｎは、Ａ／Ｃ／ＧもしくはＴである）であり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ＦｎＣｐｆ１であるか、またはＰＡＭ配列は、ＴＴＴＶ（Ｖは、Ａ／ＣもしくはＧであり）であり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ＰａＣｐｆ１ｐ、ＬｂＣｐｆ１、もしくはＡｓＣｐｆ１である。
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質は、改変されており、認識するＰＡＭ配列が変わっている。
いくつかの実施形態では、目的標的遺伝子座は、細胞内に含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒト動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、植物細胞である。
いくつかの実施形態では、目的標的遺伝子座は、動物内に含まれる。いくつかの実施形態では、目的標的遺伝子座は、植物内に含まれる。いくつかの実施形態では、目的標的遺伝子座は、インビトロのＤＮＡ分子に含まれる。
いくつかの実施形態では、構成要素（ａ）、構成要素（ｂ）、及び構成要素（ｃ）は、リボ核タンパク質複合体として細胞に送達される。
いくつかの実施形態では、構成要素（ａ）、構成要素（ｂ）、及び構成要素（ｃ）は、１つまたは複数のポリヌクレオチド分子として細胞に送達される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチド分子は、構成要素（ａ）及び／または構成要素（ｃ）をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチド分子は、１つまたは複数のベクター内に含まれる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチド分子は、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質、ガイド分子、及びアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを発現させるために機能可能なように構成された１つまたは複数の制御要素を含み、任意選択で、１つまたは複数の制御要素は、誘導性プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質、及び任意選択でアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、１つまたは複数の異種核局在化シグナル（複数可）（ＮＬＳ（複数可））を含む。
いくつかの実施形態では、１つもしくは複数のポリヌクレオチド分子またはリボ核タンパク質複合体は、粒子、小胞、または１つもしくは複数のウイルスベクターを介して送達される。
いくつかの実施形態では、粒子は、脂質、糖、金属、またはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、脂質ナノ粒子を含む。
いくつかの実施形態では、小胞は、エクソソームまたはリポソームを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のウイルスベクターは、１つもしくは複数のアデノウイルス、１つもしくは複数のレンチウイルス、または１つもしくは複数のアデノ随伴ウイルスを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、目的ゲノム遺伝子座における１つまたは複数の標的配列を操作することによって細胞、細胞株、または生物を改変するものである。
本発明の少なくとも第２の態様は、本明細書に記載の方法を使用して疾患を治療または予防するための方法に関し、この方法では、目的標的遺伝子座におけるアデニンの脱アミノ化によって、Ｇ→Ａ点変異もしくはＣ→Ｔ点変異または病原性ＳＮＰが引き起こす疾患が治療される。いくつかの実施形態では、疾患は、がん、血友病、ベータ－サラセミア、マルファン症候群、及びウィスコット・アルドリッチ症候群から選択される。
本発明の少なくとも第３の態様は、遺伝子またはその制御要素の望ましくない活性をノックアウトまたはノックダウンするための方法に関し、この方法では、目的標的遺伝子座におけるアデニンの脱アミノ化によって、標的遺伝子座における標的遺伝子または標的制御要素が不活性化される。
本発明の少なくとも第４の態様は、上記の方法から得られる改変細胞またはその子孫に関し、細胞は、方法が適用されない対応細胞と比較して、アデニンの代わりにヒポキサンチンまたはグアニンを目的標的遺伝子座に含む。
いくつかの実施形態では、改変細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞は、植物細胞である。
いくつかの実施形態では、改変細胞は、治療用Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞は、抗体産生Ｂ細胞である。
本発明の少なくとも第５の態様は、本明細書に記載の改変細胞を含む非ヒト動物または植物に関する。
本発明の少なくとも第６の態様は、細胞治療のための方法に関し、この方法は、それを必要とする患者に対して本明細書に記載の改変細胞を投与することを含み、改変細胞が存在することで、患者における疾患が治療される。
本発明の少なくとも第７の態様は、目的標的遺伝子座におけるアデニンの改変に適した、操作された非天然起源の系に関し、この系は、直列反復配列に連結されたガイド配列を含むガイド分子、またはガイド分子をコードするヌクレオチド配列と、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質、またはＣｐｆ１ニッカーゼタンパク質をコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列と、アデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、またはアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインをコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列と、を含み、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくはガイド分子に共有結合もしくは非共有結合で連結されるか、または送達後にＣｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくはガイド分子に連結されるように適合化され、ガイド配列は、標的遺伝子座内にアデニンを含む第１のＤＮＡ鎖上の標的配列とハイブリダイズする能力を有するが、アデニンに対応する位置にシトシンを含み、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質は、当該第１のＤＮＡ鎖に相補的な第２のＤＮＡ鎖における非標的配列にニックを入れる能力を有する。したがって、本出願は、本明細書記載のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素を含むキット、または当該構成要素からなるキットを提供する。
本発明の少なくとも第８の態様は、目的標的遺伝子座におけるアデニンの改変に適した、操作された非天然起源のベクター系に関し、このベクター系は、１つまたは複数のベクターを含み、当該１つまたは複数のベクターは、直列反復配列に連結されたガイド配列を含むガイド分子をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第１の制御要素と、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第２の制御要素と、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、第１の制御要素もしくは第２の制御要素の制御下にあるか、または第３の制御要素に機能可能なように連結されたヌクレオチド配列（任意選択）と、を含み、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列が、第３の制御要素に機能可能なように連結されるのであれば、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、発現後にガイド分子またはＣｐｆ１ニッカーゼタンパク質に連結されるように適合化され、ガイド配列は、標的遺伝子座内にアデニンを含む第１のＤＮＡ鎖上の標的配列とハイブリダイズする能力を有するが、アデニンに対応する位置にシトシンを含み、構成要素（ａ）、構成要素（ｂ）、及び構成要素（ｃ）は、系に含まれる同じベクターまたは異なるベクターに位置し、Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質は、当該第１のＤＮＡ鎖に相補的な第２のＤＮＡ鎖における非標的配列にニックを入れる能力を有する。したがって、本出願は、本明細書に記載のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素をコードするベクターを含むキット、または当該ベクターからなるキットを提供する。
本発明の少なくとも第９の態様は、本明細書に記載の操作された非天然起源の系またはベクター系を含むインビトロ、エクスビボ、またはインビボの宿主細胞もしくは細胞株またはその子孫に関する。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、植物細胞である。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に示される。例示の実施形態（本発明の原理が利用される）を示す後述の詳細な説明、及び例示の実施形態の添付の図面を参照することによって本発明の特徴及び利点についての理解が深まるであろう。
目的標的遺伝子座におけるアデニンを標的として脱アミノ化するための、本発明の実施形態例を示す。 Ｃｐｆ１とアデノシンデアミナーゼとの融合タンパク質の実施形態例（ＮＬＳ－ＦＬＡＧ－ＡｓＣｐｆ１－リンカー－ｈＡＤＡＲ２ｄ（野生型））のアミノ酸配列を示す。 Ｃｐｆ１とアデノシンデアミナーゼとの融合タンパク質の実施形態例（ＮＬＳ－ＦＬＡＧ－ＡｓＣｐｆ１（Ｒ１２２６Ａ）－リンカー－ｈＡＤＡＲ２ｄ（Ｅ４８８Ｑ））のアミノ酸配列を示す。 Ｃｐｆ１とアデノシンデアミナーゼとの融合タンパク質の実施形態例（ＮＬＳ－ＦＬＡＧ－ＡｓＣｐｆ１（Ｄ９０８Ａ）－リンカー－ｈＡＤＡＲ２ｄ（Ｅ４８８Ｑ））のアミノ酸配列を示す。 Ｃｐｆ１とアデノシンデアミナーゼとの融合タンパク質の実施形態例（ＮＬＳ－ＦＬＡＧ－ＡｓＣｐｆ１（Ｅ９９３Ａ）－リンカー－ｈＡＤＡＲ２ｄ（Ｅ４８８Ｑ））のアミノ酸配列を示す。 ｈｕＡＤＡＲ２ｄとＳｐＣａｓ９との融合体、ならびにｈｕＡＤＡＲ２ｄとＡｓＣｐｆ１との融合体を示す。ＡからＧへの変換用として、ＡｓＣｐｆ１について４つのコンストラクト、及びＳｐＣａｓ９について４つのコンストラクトを調製した。ＡｓＣｐｆ１のニッカーゼバージョン（Ｒ１２２６Ａ）及びＳｐＣａｓ９のニッカーゼバージョン（Ｎ８６３Ａ）を、ヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメイン（ＡＤＡＲ）のＮ末端またはＣ末端に融合させた。さらに、ＳｐＣａｓ９からＨＮＨドメインを除去するか、またはＡｓＣｐｆ１からＮｕｃドメインを除去することによって欠失コンストラクトを生成させることで、ＡＤＡＲに対する立体障害を低減させた。 ＡＤＡＲ融合体のための欠失コンストラクトを示す。ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸１０７６～１２５８をＧＳＧＧリンカーで置き換え、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸７６９～９１８をＧＧＳＧＧＳリンカーで置き換えた。 ＨＥＫ細胞におけるＡＤＡＲ融合体の発現を示す。異なるＡＤＡＲ融合体コンストラクトまたはＨＮＨ／Ｎｕｃ欠失コンストラクトをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションしてタンパク質発現を確認した。トランスフェクションから２日後に細胞を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液を使用してタンパク質を抽出した。細胞溶解液５ｕｌをウエスタンブロットに使用し、このウエスタンブロットでは、Ｆｌａｇタグ（ＳｐＣａｓ９）またはＨＡタグ（ＡｓＣｐｆ１）に対する抗体を使用した。 ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＲＮＡ標的のＡからＧへの変換をプログラムするためのガイド設計を示す。 ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＲＮＡ標的のＡからＧへの変換をプログラムした結果を示す。 ＨＥＫ２９３細胞におけるヒトＤＮＭＴ１が標的となり、ＡからＧへの塩基編集が生じることを示す。ＡｓＣｐｆ１（Ｒ１２２６Ａ）－ＡＤＡＲ２ｄ融合コンストラクト及びＡｓＣｐｆ１（デルタＮｕｃ）－ＡＤＡＲ２ｄ融合コンストラクトが、ヒトＤＮＭＴ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡと複合体化すると、野生型ＡｓＣｐｆ１対照コンストラクト及びＡＤＡＲ２ｄ対照コンストラクト（配列番号９４及び９５）とは対照的に、ＡからＧへの塩基編集が標的化され、検出可能なレベルで生じることが、それぞれの融合コンストラクトによって示された。
本明細書の図は、例示のみを目的としており、必ずしも縮尺通りには描かれていない。
これより先に、さまざまな実施形態が記載される。特定の実施形態は、本明細書で論じられる幅広い態様に対する網羅的説明または限定を意図するものではないことに留意されたい。特定の実施形態と関連して記載される１つの態様は、必ずしもその実施形態に限定されるものではなく、任意の他の実施形態（複数可）を用いて実施することができる。
アデニンを標的として脱アミノ化するための方法
１つの態様では、本発明は、ＤＮＡにおけるアデニンを標的として脱アミノ化するための方法を提供し、より具体的には、目的遺伝子座におけるアデニンを標的として脱アミノ化するための方法を提供する。本発明の方法によれば、標的配列に特異的に結合することができるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体によって、目的遺伝子座における適切なアデニンへとアデノシンデアミナーゼ（ＡＤ）タンパク質が特異的にリクルートされる。このことを達成するために、アデノシンデアミナーゼタンパク質を共有結合でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素に連結するか、または別のタンパク質としてアデノシンデアミナーゼタンパク質を供給することができるが、後者の場合、アデノシンデアミナーゼタンパク質がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体に確実にリクルートされるようにアデノシンデアミナーゼタンパク質が適合化される。
本発明の方法の特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（Ｃｐｆ１タンパク質）に融合させることによって、アデノシンデアミナーゼが標的遺伝子座に確実にリクルートされる。２つの別々のタンパク質から融合タンパク質を生成させる方法は、当該技術分野において知られており、典型的には、スペーサーまたはリンカーを使用するものである。アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインのＮ末端またはＣ末端にＣｐｆ１タンパク質を融合させることができる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質であり、デアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインのＮ末端に連結される。
融合タンパク質に関して使用される「リンカー」という用語は、タンパク質を連結して融合タンパク質を形成する分子を指す。一般に、そのような分子は、連結以外、またはタンパク質間の何らかの最小距離もしくは他の空間的関係性の保持以外には、特定の生物学的活性を有さない。しかしながら、ある特定の実施形態では、リンカーは、リンカー及び／または融合タンパク質の何らかの特性（リンカーのフォールディング、正味荷電、または疎水性など）に影響を与えるように選択され得る。
本発明の方法において使用するための適切なリンカーは、当業者によく知られており、こうしたリンカーには、限定されないが、直鎖または分岐鎖の炭素リンカー、ヘテロ環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれる。しかしながら、本明細書で使用されるように、リンカーは、共有結合（炭素－炭素結合または炭素－ヘテロ原子結合）でもあり得る。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質とアデノシンデアミナーゼとを、それぞれのタンパク質がその必要機能特性を確実に保持する上で十分な距離をとって分離するためにリンカーが使用される。好ましいペプチドリンカー配列は、可動性の広がった立体構造を取り、秩序だった二次構造を取る傾向を示さないものである。ある特定の実施形態では、リンカーは、単量体、二量体、多量体、またはポリマーであり得る化学的部分であり得る。好ましくは、リンカーは、アミノ酸を含む。可動性リンカーにおける典型的なアミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒが含まれる。したがって、特定の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙアミノ酸、Ａｓｎアミノ酸、及びＳｅｒアミノ酸のうちの１つまたは複数が組み合わさったものを含む。他のほぼ中性のアミノ酸（Ｔｈｒ及びＡｌａなど）もまた、リンカー配列において使用され得る。リンカーの例は、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｇｅｎｅ ４０：３９－４６、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８－６２、米国特許第４，９３５，２３３号、及び米国特許第４，７５１，１８０号に開示されている。例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーであるＧＧＳ、ＧＧＧＳ、またはＧＳＧを使用することができる。適切な長さを得るために、ＧＧＳリンカー、ＧＳＧリンカー、ＧＧＧＳリンカー、またはＧＧＧＧＳリンカーを、３回反復形態（（ＧＧＳ）３（配列番号１２）、（ＧＧＧＧＳ）３など）、または５回反復形態、６回反復形態、７回反復形態、９回反復形態、もしくは１２回以上反復する形態としてさえ使用することができる。特定の実施形態では、リンカー（（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１）など）を使用することが本明細書では好ましい。（ＧＧＧＧＳ）６（配列番号４）、（ＧＧＧＧＳ）９（配列番号７）、または（ＧＧＧＧＳ）１２（配列番号１４）を代替物として使用することも好ましくあり得る。他の好ましい代替物は、（ＧＧＧＧＳ）１（配列番号１５）、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１６）、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号２）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号３）、（ＧＧＧＧＳ）７（配列番号５）、（ＧＧＧＧＳ）８（配列番号６）、（ＧＧＧＧＳ）１０（配列番号８）、または（ＧＧＧＧＳ）１１（配列番号９）である。さらに別の実施形態では、リンカーとしてＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）が使用される。さらに追加の実施形態では、リンカーは、ＸＴＥＮリンカーである。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質であり、ＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）リンカーによってデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインに連結される。別の特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質のＣ末端が、ＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）リンカーによってデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインのＮ末端に連結される。さらに、Ｎ末端及びＣ末端のＮＬＳは、リンカー（例えば、ＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳＳＰＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号１８））としても機能し得る。
本発明の方法の特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、別のタンパク質として、細胞に送達されるか、または細胞内に発現するが、Ｃｐｆ１タンパク質またはガイド分子のいずれかに連結可能なように改変される。バクテリオファージコートタンパク質の多様性の中にはＲＮＡ結合タンパク質またはアダプタータンパク質とアプタマーとの独立した組み合わせが存在しており、特定の実施形態では、こうした組み合わせを使用することによって上記の連結が確保される。そのようなコートタンパク質の例としては、限定されないが、ＭＳ２、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、及びＰＲＲ１が挙げられる。アプタマーは、天然起源のオリゴヌクレオチドであるか、または特定の標的に結合するようにインビトロ選択法もしくはＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）を反復実施することによって操作された合成オリゴヌクレオチドであり得る。
本発明の方法及び系の特定の実施形態では、ガイド分子は、アダプタータンパク質をリクルートすることができる１つまたは複数の異なるＲＮＡループ（複数可）または異なる配列（複数可）とともに提供される。異なるＲＮＡループ（複数可）または異なる配列（複数可）を挿入することによってＣｐｆ１タンパク質と衝突することなくガイド分子が広がることができ、当該異なるＲＮＡループ（複数可）または異なる配列（複数可）は、当該異なるＲＮＡループ（複数可）または異なる配列（複数可）に結合できるアダプタータンパク質をリクルートすることができる。改変ガイドの例、及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体へのエフェクタードメインのリクルートにおける改変ガイド及びその使用例は、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２０１５，５１７（７５３６）：５８３－５８８）に提供されている。特定の実施形態では、アプタマーは、哺乳類細胞において二量体化したＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質に選択的に結合する最小のヘアピンアプタマーであり、ステムループ及び／またはテトラループなどに含まれるようにガイド分子に導入される。こうした実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、ＭＳ２に融合される。その結果、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び対応ガイドＲＮＡと一緒にアデノシンデアミナーゼタンパク質が同時送達される。
本明細書で使用される「ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系」という用語は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、より具体的には、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼであるＣｐｆ１タンパク質と、（ｂ）ガイド配列を含むガイド分子と、（ｃ）アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインと、を含む、核酸を標的とし、編集する系を指し、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もしくはガイド分子に共有結合もしくは非共有結合で連結されるか、または送達後にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もしくはガイド分子に連結されるように適合化され、ガイド配列は、標的配列に実質的に相補的であるが、脱アミノ化の標的となるＡに対応する非対形成Ｃを含むことで、ガイド配列と標的配列とによって形成されるヘテロ二本鎖にＡ－Ｃミスマッチを生じさせる。真核細胞における用途については、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはアデノシンデアミナーゼにＮＬＳタグを付加することが好ましい。
いくつかの実施形態では、構成要素（ａ）、構成要素（ｂ）、及び構成要素（ｃ）は、リボ核タンパク質複合体として細胞に送達される。リボ核タンパク質複合体は、１つまたは複数の脂質ナノ粒子を介して送達することができる。
いくつかの実施形態では、構成要素（ａ）、構成要素（ｂ）、及び構成要素（ｃ）は、１つまたは複数のＲＮＡ分子として細胞に送達され、こうした１つまたは複数のＲＮＡ分子は、１つまたは複数のガイドＲＮＡ、ならびにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、アデノシンデアミナーゼタンパク質、及び任意選択のアダプタータンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡ分子などである。ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の脂質ナノ粒子を介して送達することができる。
いくつかの実施形態では、構成要素（ａ）、構成要素（ｂ）、及び構成要素（ｃ）は、１つまたは複数のＤＮＡ分子として細胞に送達される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＤＮＡ分子は、１つまたは複数のベクター（ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）など）内に含められる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＤＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ガイド分子、及びアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを発現させるために機能可能なように構成された１つまたは複数の制御要素を含み、任意選択で、１つまたは複数の制御要素は、誘導性プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ニッカーゼは、Ｎｕｃドメインに変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ニッカーゼは、標的ＤＮＡ鎖とガイド分子との間でヘテロ二本鎖が形成されることによって置き換えられる目的標的遺伝子座の非標的ＤＮＡ鎖にニックを入れる能力を有する。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の態様に関する詳細は、本明細書の他の箇所で提供される。
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ニッカーゼは、ＡｓＣｐｆ１におけるＲ１２２６Ａに対応する変異を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、不活性型Ｃｐｆ１である。いくつかの実施形態では、不活性型Ｃｐｆ１は、ＲｕｖＣドメインに変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性型Ｃｐｆ１は、ＡｓＣｐｆ１におけるＤ９０８ＡまたはＥ９９３Ａに対応する変異を含む。
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、標的遺伝子座の第１のＤＮＡ鎖内に脱アミノ化対象のアデニンを含む標的配列とハイブリダイズすることで、当該アデニンに相対する非対形成シトシンを含むヘテロ二本鎖を形成する能力を有する。ヘテロ二本鎖が形成されると、ガイド分子は、Ｃｐｆ１タンパク質と複合体を形成し、目的標的遺伝子座の当該第１のＤＮＡ鎖に結合するように複合体を誘導する。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のガイドの態様に関する詳細は、本明細書で以下に提供される。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡとヘテロ二本鎖を形成させるために、標準的な長さ（例えば、ＡｓＣｐｆ１については約２４ｎｔ）を有するＣｐｆ１ガイドＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１－ガイドＲＮＡ－標的ＤＮＡ複合体の外側を含めて標的ＤＮＡとヘテロ二本鎖を形成させるために、標準的な長さを超える長さ（例えば、ＡｓＣｐｆ１については＞２４ｎｔ）を有するＣｐｆ１ガイド分子が使用される。ある特定の実施形態例では、ガイド配列は、当該標的配列とＤＮＡ－ＲＮＡ二本鎖を形成する能力を有する約２０～５３ｎｔ、または約２５～５３ｎｔ、または約２９～５３ｎｔの長さを有する。ある特定の他の実施形態例では、ガイド配列は、当該標的配列とＤＮＡ－ＲＮＡ二本鎖を形成する能力を有する約４０～５０ｎｔの長さを有する。ある特定の実施形態例では、当該非対形成Ｃと当該ガイド配列の５’末端と間の距離は、２０～３０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態例では、当該非対形成Ｃと当該ガイド配列の３’末端と間の距離は、２０～３０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ガイド配列は、標的ＤＮＡ配列における異なるアデノシン部位に対応する複数のミスマッチを含むか、または標的ＲＮＡ配列における異なるアデノシン部位に対応するミスマッチをそれぞれが含む２つのガイド分子が使用される。
少なくとも第１の設計では、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、（ａ）触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質に融合または連結されたアデノシンデアミナーゼと、（ｂ）ガイド配列と標的配列との間で形成されるヘテロ二本鎖にＡ－Ｃミスマッチを導入するように設計されたガイド配列を含むガイド分子と、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはアデノシンデアミナーゼは、Ｎ末端もしくはＣ末端または両末端にＮＬＳタグが付加される。
少なくとも第２の設計では、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、（ａ）触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と、（ｂ）ガイド配列と標的配列との間で形成されるヘテロ二本鎖にＡ－Ｃミスマッチを導入するように設計されたガイド配列を含むとともに、アダプタータンパク質（例えば、ＭＳ２コートタンパク質またはＰＰ７コートタンパク質）に結合する能力を有するアプタマー配列（例えば、ＭＳ２ ＲＮＡモチーフまたはＰＰ７ ＲＮＡモチーフ）を含むガイド分子と、（ｃ）アダプタータンパク質に融合または連結されたアデノシンデアミナーゼと、を含み、アプタマーとアダプタータンパク質とが結合することで、ガイド配列と、Ａ－ＣミスマッチのＡを標的として脱アミノ化する対象である標的配列と、の間に形成されるヘテロ二本鎖にアデノシンデアミナーゼがリクルートされる。いくつかの実施形態では、アダプタータンパク質及び／またはアデノシンデアミナーゼは、Ｎ末端もしくはＣ末端または両末端にＮＬＳタグが付加される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質にＮＬＳタグを付加することもできる。
異なるアプタマー及び対応アダプタータンパク質を使用すると、遺伝子編集を独立して実行することも可能になる。遺伝子編集／脱アミノ化を独立して行うために、シチジンデアミナーゼと組み合わせてアデノシンデアミナーゼが使用される例の１つでは、それぞれＭＳ２－アデノシンデアミナーゼ及びＰＰ７－シチジンデアミナーゼ（またはＰＰ７－アデノシンデアミナーゼ及びＭＳ２－シチジンデアミナーゼ）をリクルートするために、異なる遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡが、異なるＲＮＡループで改変され、その結果、それぞれ目的標的遺伝子座におけるＡまたはＣが独立して脱アミノ化される。ＰＰ７は、バクテリオファージであるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのＲＮＡ結合コートタンパク質である。ＭＳ２と同様に、ＰＰ７は、特定のＲＮＡ配列及び二次構造に結合する。ＰＰ７のＲＮＡ認識モチーフは、ＭＳ２のものとは異なる。結果的に、異なるゲノム遺伝子座に対する異なる作用を同時に媒介するためにＰＰ７及びＭＳ２をマルチプレックス化することができる。例えば、遺伝子座Ａを標的とするｓｇＲＮＡをＭＳ２ループで改変してＭＳ２－アデノシンデアミナーゼをリクルートすることができ、一方で、遺伝子座Ｂを標的とする別のｓｇＲＮＡをＰＰ７ループで改変してＰＰ７－シチジンデアミナーゼをリクルートすることができる。したがって、遺伝子座特異的な改変が、同じ細胞において独立して実現する。この原理は、他の独立したＲＮＡ結合タンパク質の組み込みに拡大適用することができる。
少なくとも第３の設計では、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、（ａ）触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の内部ループまたは非構造化領域に挿入されたアデノシンデアミナーゼと、（ｂ）ガイド配列と標的配列との間で形成されるヘテロ二本鎖にＡ－Ｃミスマッチを導入するように設計されたガイド配列を含むガイド分子と、を含む。
アデノシンデアミナーゼの挿入に適したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の分割部位は、結晶構造を利用して同定することができる。オルソログと、意図されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と、の間に比較的高度の相同性が存在するのであれば、そのオルソログの結晶構造を使用することができる。
分割位置は、領域内またはループ内に位置し得る。好ましくは、アミノ酸配列が中断しても構造特徴（例えば、アルファ－ヘリックスまたはβ－シート）の部分的崩壊または完全崩壊を招かない位置を分割位置とすることが好ましい。非構造化領域（結晶構造に現れなかった領域であり、これは、こうした領域が結晶において「凍結」するに足りるほどには構造化しないことに起因する）は、好ましい選択肢であることが多い。非構造化領域内またはループ外における位置は、上に提供される数そのものでなくてよく、分割位置がループ外の非構造化領域内に依然として入る限り、ループのサイズに応じて、上に提供される位置のいずれかの側へと、例えばアミノ酸１つ分、アミノ酸２つ分、アミノ酸３つ分、アミノ酸４つ分、アミノ酸５つ分、アミノ酸６つ分、アミノ酸７つ分、アミノ酸８つ分、アミノ酸９つ分、またはアミノ酸１０個分でさえ、ずれる可能性がある。
Ｃｐｆ１については、Ｃｐｆ１の一次構造内に非構造化領域が小区間としていくつか存在することが予測されている（ＷＯ２０１６２０５７１１を参照のこと。当該文献の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる）。溶媒に露出しており、異なるＣｐｆ１オルソログ内で保存されていない非構造化領域側の位置が、分割に好ましい。
下記の表は、ＡｓＣｐｆ１内及びＬｂＣｐｆ１内の潜在的な分割領域を示すが、分割領域は、これらの領域に限定されない。そのような領域内に分割部位を定めることが好都合であり得る。
Figure 0007364472000001
ＦｎＣｐｆ１変異体、ＡｓＣｐｆ１変異体、及びＬｂＣｐｆ１変異体について、潜在的な分割部位となる対応位置がどこなのかを、例えば配列アライメントに基づいて、明らかにすることは容易であろう。非Ｆｎ酵素、非Ａｓ酵素、及び非Ｌｂ酵素については、オルソログと、意図されるＣｐｆ１と、の間に比較的高度の相同性が存在するのであれば、そのオルソログの結晶構造を使用することができ、または計算による予測を使用することができる。
本明細書に記載のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用することで、脱アミノ化対象のＤＮＡ配列内の特定のアデニンを標的とすることができる。例えば、ガイド分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と複合体を形成することができ、目的標的遺伝子座における標的配列に結合するように複合体を誘導する。ガイド配列は、非対形成Ｃを有するように設計されるため、ガイド配列と標的配列との間で形成されるヘテロ二本鎖は、Ａ－Ｃミスマッチを含み、このＡ－Ｃミスマッチによって、非対形成Ｃに相対するＡと接触し、当該Ａを脱アミノ化するようにアデノシンデアミナーゼが誘導されることで、当該Ａがイノシン（Ｉ）に変換される。イノシン（Ｉ）は、Ｃと塩基対を形成し、細胞プロセスにおいてＧのように機能するため、本明細書に記載の、Ａを標的とする脱アミノ化は、望ましくないＧ－Ａ変異及びＣ－Ｔ変異の修正、ならびに望ましいＡ－Ｇ変異及びＴ－Ｃ変異の取得に有用である。
いくつかの実施形態では、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、インビトロでＤＮＡ分子における標的化された脱アミノ化を行うために使用される。いくつかの実施形態では、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、細胞内でＤＮＡ分子における標的化された脱アミノ化を行うために使用される。細胞は、真核細胞（動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、または植物細胞など）であり得る。
本発明は、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用する標的化された脱アミノ化によって疾患を治療または予防するための方法にも関し、この方法では、Ａの脱アミノ化によって、目的標的遺伝子座における遺伝子型が健康なものに回復し、これによって、Ｇ→Ａ点変異もしくはＣ→Ｔ点変異または病原性ＳＮＰが引き起こす疾患が治療される。本発明を用いて治療または予防することができる疾患の例としては、がん、血友病、ベータ－サラセミア、マルファン症候群、及びウィスコット・アルドリッチ症候群が挙げられる。
本発明は、遺伝子またはその制御要素の望ましくない活性をノックアウトまたはノックダウンするための方法にも関し、この方法では、目的標的遺伝子座におけるＡの脱アミノ化によって、標的遺伝子座における標的遺伝子または標的制御要素が不活性化される。例えば、１つの実施形態では、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系によって標的化された脱アミノ化によって、内在性遺伝子に未成熟終止コドンを生じさせるナンセンス変異が生じ得る。このことによって、内在性遺伝子が変化し得るとともに、編集された細胞において望ましい形質が生じ得る。別の実施形態では、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系によって標的化された脱アミノ化によって、内在性遺伝子に異なるアミノ酸残基のコードを生じさせる非保存的ミスセンス変異が生じ得る。このことによって、発現する内在性遺伝子の機能が変化し得るとともに、編集された細胞において望ましい形質も生じ得る。
本発明は、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用する標的化された脱アミノ化によって得られる改変細胞またはその子孫にも関し、改変細胞は、標的化された脱アミノ化が行われる前の対応細胞と比較して、Ａの代わりにＩまたはＧを目的標的遺伝子座に含む。改変細胞は、真核細胞（動物細胞、植物細胞、哺乳類細胞、またはヒト細胞など）であり得る。
いくつかの実施形態では、改変細胞は、治療用Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ療法に適したＴ細胞など）である。改変の結果、１つまたは複数の望ましい形質が治療用Ｔ細胞に生じ得、こうした望ましい形質には、限定されないが、免疫チェックポイント受容体（例えば、ＰＤＡ、ＣＴＬＡ４）の発現の減少、ＨＬＡタンパク質（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ）の発現の減少、及び内在性ＴＣＲの発現の減少が含まれる。
いくつかの実施形態では、改変細胞は、抗体産生Ｂ細胞である。改変の結果、１つまたは複数の望ましい形質がＢ細胞に生じ得、こうした望ましい形質には、限定されないが、抗体産生の増進が含まれる。
本発明は、改変非ヒト動物または改変植物にも関する。改変非ヒト動物は、家畜であり得る。改変植物は、農作物であり得る。
本発明は、さらに、細胞治療のための方法にも関し、この方法は、それを必要とする患者に対して本明細書に記載の改変細胞を投与することを含み、改変細胞が存在することで、患者における疾患が治療される。１つの実施形態では、細胞治療のための改変細胞は、腫瘍細胞を認識及び／または攻撃する能力を有するＣＡＲ－Ｔ細胞である。別の実施形態では、細胞治療のための改変細胞は、幹細胞（神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、またはｉＰＳＣ細胞など）である。
本発明は、さらに、目的標的遺伝子座におけるアデニンの改変に適した、操作された非天然起源の系にも関し、この系は、ガイド配列を含むガイド分子、またはガイド分子をコードするヌクレオチド配列と、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列と、アデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、またはアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインをコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列と、を含み、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もしくはガイド分子に共有結合もしくは非共有結合で連結されるか、または送達後にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もしくはガイド分子に連結されるように適合化され、ガイド配列は、標的遺伝子座内にアデニンを含む標的配列とハイブリダイズする能力を有するが、アデニンに対応する位置にシトシンを含む。
本発明は、さらに、目的標的遺伝子座におけるアデニンの改変に適した、操作された非天然起源のベクター系にも関し、このベクター系は、１つまたは複数のベクターを含み、当該１つまたは複数のベクターは、ガイド配列を含むガイド分子をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第１の制御要素と、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第２の制御要素と、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、第１の制御要素もしくは第２の制御要素の制御下にあるか、または第３の制御要素に機能可能なように連結されたヌクレオチド配列（任意選択）と、を含み、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列が、第３の制御要素に機能可能なように連結されるのであれば、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、発現後にガイド分子またはＣｒｉｓｐｒ－Ｃａｓタンパク質に連結されるように適合化され、ガイド配列は、標的遺伝子座内にアデニンを含む標的配列とハイブリダイズする能力を有するが、アデニンに対応する位置にシトシンを含み、構成要素（ａ）、構成要素（ｂ）、及び構成要素（ｃ）は、系に含まれる同じベクターまたは異なるベクターに位置する。
本発明は、さらに、本明細書に記載の操作された非天然起源の系またはベクター系を含むインビトロ、エクスビボ、またはインビボの宿主細胞もしくは細胞株またはその子孫にも関する。宿主細胞は、真核細胞（動物細胞、植物細胞、哺乳類細胞、またはヒト細胞など）であり得る。
アデノシンデアミナーゼ
「アデノシンデアミナーゼ」または「アデノシンデアミナーゼタンパク質」という用語は、以下に示されるように、アデニン（または分子のアデニン部分）をヒポキサンチン（または分子のヒポキサンチン部分）へと変換する加水分解的脱アミノ化反応を触媒する能力を有するタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質もしくはポリペプチドの１つもしくは複数の機能ドメイン（複数可）を指すために本明細書で使用される。いくつかの実施形態では、アデニン含有分子は、アデノシン（Ａ）であり、ヒポキサンチン含有分子は、イノシン（Ｉ）である。アデニン含有分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。
Figure 0007364472000002
本開示によれば、本開示と関連して使用することができるアデノシンデアミナーゼには、限定されないが、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）として知られる酵素ファミリーのメンバー、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）として知られる酵素ファミリーのメンバー、及び他のアデノシンデアミナーゼドメイン含有（ＡＤＡＤ）ファミリーのメンバーが含まれる。本開示によれば、アデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるアデニンを標的とする能力を有する。実際、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１７，４５（６）：３３６９－３３７７）では、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖に対してアデノシンからイノシンへの編集反応をＡＤＡＲが実行できることが示されている。特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、本明細書で以下に詳細が記載されるように、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるＤＮＡを編集するその能力が向上するように改変されている。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、１つまたは複数の後生動物種に由来するものであり、こうした後生動物種には、限定されないが、哺乳類、トリ、カエル、イカ、サカナ、ハエ、及び虫が含まれる。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒト、イカ、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのアデノシンデアミナーゼである。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ３を含む、ヒトのＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＡＤＲ－１及びＡＤＲ－２を含む、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓのＡＤＡＲタンパク質である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｄＡｄａｒを含む、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＡＤＡＲタンパク質である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｓｑＡＤＡＲ２ａ及びｓｑＡＤＡＲ２ｂを含む、イカ（Ｌｏｌｉｇｏ ｐｅａｌｅｉｉ）のＡＤＡＲタンパク質である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒトのＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴＥＮＲ（ｈＡＤＡＤ１）及びＴＥＮＲＬ（ｈＡＤＡＤ２）を含む、ヒトのＡＤＡＤタンパク質である。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡタンパク質（Ｅ．ｃｏｌｉのＴａｄＡなど）である。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：６４０７－６４１６（２００６）、Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２１：３８４１－３８５１（２００２）を参照のこと。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、マウスのＡＤＡである。Ｇｒｕｎｅｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６３０－６３８（２０１３）を参照のこと。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒトのＡＤＡＴ２である。Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２０１０：２６０５１２（２０１０）を参照のこと。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、下記のものから選択される：
Figure 0007364472000003
Figure 0007364472000004
いくつかの実施形態では、二本鎖核酸基質における１つまたは複数の標的アデノシン残基（複数可）をアデノシンデアミナーゼタンパク質が認識し、イノシン残基（複数可）に変換する。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸基質は、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド二本鎖である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖基質上の結合域を認識する。いくつかの実施形態では、結合域は、少なくとも１つの標的アデノシン残基（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、結合域は、約３ｂｐ～約１００ｂｐの範囲内である。いくつかの実施形態では、結合域は、約５ｂｐ～約５０ｂｐの範囲内である。いくつかの実施形態では、結合域は、約１０ｂｐ～約３０ｂｐの範囲内である。いくつかの実施形態では、結合域は、約１ｂｐ、約２ｂｐ、約３ｂｐ、約５ｂｐ、約７ｂｐ、約１０ｂｐ、約１５ｂｐ、約２０ｂｐ、約２５ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約４５ｂｐ、約５０ｂｐ、約５５ｂｐ、約６０ｂｐ、約６５ｂｐ、約７０ｂｐ、約７５ｂｐ、約８０ｂｐ、約８５ｂｐ、約９０ｂｐ、約９５ｂｐ、または約１００ｂｐである。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、１つまたは複数のデアミナーゼドメインを含む。理論によって拘束されることは意図しないが、二本鎖核酸基質に含まれる１つまたは複数の標的アデノシン（Ａ）残基（複数可）をデアミナーゼドメインが認識し、イノシン（Ｉ）残基（複数可）に変換するように機能することが企図される。いくつかの実施形態では、デアミナーゼドメインは、活性中心を含む。いくつかの実施形態では、活性中心は、亜鉛イオンを含む。いくつかの実施形態では、ＡからＩへの編集プロセスの間、標的アデノシン残基における塩基対形成は乱され、二重らせんから標的アデノシン残基が「はじき」出されることで、アデノシンデアミナーゼが接近可能となる。いくつかの実施形態では、活性中心または活性中心付近におけるアミノ酸残基は、標的アデノシン残基に対して５’側に位置する１つまたは複数のヌクレオチド（複数可）と相互作用する。いくつかの実施形態では、活性中心または活性中心付近におけるアミノ酸残基は、標的アデノシン残基に対して３’側に位置する１つまたは複数のヌクレオチド（複数可）と相互作用する。いくつかの実施形態では、活性中心または活性中心付近におけるアミノ酸残基は、標的アデノシン残基に相補的な逆鎖上のヌクレオチドとさらに相互作用する。いくつかの実施形態では、当該アミノ酸残基は、ヌクレオチドの２’ヒドロキシル基と水素結合を形成する。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒトのＡＤＡＲ２の全タンパク質（ｈＡＤＡＲ２）またはそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＤＡＲ２－Ｄ）を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２またはｈＡＤＡＲ２－Ｄに相同的なＡＤＡＲファミリーメンバーである。
具体的には、いくつかの実施形態では、相同ＡＤＡＲタンパク質は、ヒトのＡＤＡＲ１（ｈＡＤＡＲ１）またはそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＤＡＲ１－Ｄ）である。いくつかの実施形態では、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのグリシン１００７は、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのグリシン４８７に対応し、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのグルタミン酸１００８は、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのグルタミン酸４８８に対応する。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄの野生型アミノ酸配列を含む（図２を参照のこと）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄ配列に１つまたは複数の変異を含み、その結果、ｈＡＤＡＲ２－Ｄの編集効率及び／または基質編集優先性が特定の要件に応じて改変される。
ｈＡＤＡＲ１タンパク質及びｈＡＤＡＲ２タンパク質のある特定の変異は、Ｋｕｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．（２０１２）１０９（４８）：Ｅ３２９５－３０４、Ｗａｎｔ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２０１５）１０（１１）：２５１２－９、及びＺｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１７）４５（６）：３３６９－３３７に記載されており、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のグリシン３３６、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、３３６位のグリシン残基は、アスパラギン酸残基によって置き換えられる（Ｇ３３６Ｄ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のグリシン４８７、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、相対的に小さな側鎖を有する非極性アミノ酸残基によって置き換えられる。例えば、いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｇ４８７Ａ）。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、バリン残基によって置き換えられる（Ｇ４８７Ｖ）。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、相対的に大きな側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、アルギニン残基によって置き換えられる（Ｇ４８７Ｒ）。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、リジン残基によって置き換えられる（Ｇ４８７Ｋ）。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、トリプトファン残基によって置き換えられる（Ｇ４８７Ｗ）。いくつかの実施形態では、４８７位のグリシン残基は、チロシン残基によって置き換えられる（Ｇ４８７Ｙ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のグルタミン酸４８８、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、グルタミン残基によって置き換えられる（Ｅ４８８Ｑ）。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、ヒスチジン残基によって置き換えられる（Ｅ４８８Ｈ）。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、アルギニン残基によって置き換えられる（Ｅ４８８Ｒ）。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、リジン残基によって置き換えられる（Ｅ４８８Ｋ）。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、アスパラギン残基によって置き換えられる（Ｅ４８８Ｎ）。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｅ４８８Ａ）。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、メチオニン残基によって置き換えられる（Ｅ４８８Ｍ）。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ｅ４８８Ｓ）。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、フェニルアラニン残基によって置き換えられる（Ｅ４８８Ｆ）。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、リジン残基によって置き換えられる（Ｅ４８８Ｌ）。いくつかの実施形態では、４８８位のグルタミン酸残基は、トリプトファン残基によって置き換えられる（Ｅ４８８Ｗ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のスレオニン４９０、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４９０位のスレオニン残基は、システイン残基によって置き換えられる（Ｔ４９０Ｃ）。いくつかの実施形態では、４９０位のスレオニン残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ｔ４９０Ｓ）。いくつかの実施形態では、４９０位のスレオニン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｔ４９０Ａ）。いくつかの実施形態では、４９０位のスレオニン残基は、フェニルアラニン残基によって置き換えられる（Ｔ４９０Ｆ）。いくつかの実施形態では、４９０位のスレオニン残基は、チロシン残基によって置き換えられる（Ｔ４９０Ｙ）。いくつかの実施形態では、４９０位のスレオニン残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ｔ４９０Ｒ）。いくつかの実施形態では、４９０位のスレオニン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｔ４９０Ｋ）。いくつかの実施形態では、４９０位のスレオニン残基は、フェニルアラニン残基によって置き換えられる（Ｔ４９０Ｐ）。いくつかの実施形態では、４９０位のスレオニン残基は、チロシン残基によって置き換えられる（Ｔ４９０Ｅ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のバリン４９３、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｖ４９３Ａ）。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ｖ４９３Ｓ）。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、スレオニン残基によって置き換えられる（Ｖ４９３Ｔ）。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、アルギニン残基によって置き換えられる（Ｖ４９３Ｒ）。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、アスパラギン酸残基によって置き換えられる（Ｖ４９３Ｄ）。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、プロリン残基によって置き換えられる（Ｖ４９３Ｐ）。いくつかの実施形態では、４９３位のバリン残基は、グリシン残基によって置き換えられる（Ｖ４９３Ｇ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアラニン５８９、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、５８９位のアラニン残基は、バリン残基によって置き換えられる（Ａ５８９Ｖ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアスパラギン５９７、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、リジン残基によって置き換えられる（Ｎ５９７Ｋ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列の５９７位に変異を含み、野生型配列では５９７位にアスパラギン残基を有する。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、アルギニン残基によって置き換えられる（Ｎ５９７Ｒ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列の５９７位に変異を含み、野生型配列では５９７位にアスパラギン残基を有する。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｎ５９７Ａ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列の５９７位に変異を含み、野生型配列では５９７位にアスパラギン残基を有する。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、グルタミン酸残基によって置き換えられる（Ｎ５９７Ｅ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列の５９７位に変異を含み、野生型配列では５９７位にアスパラギン残基を有する。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、ヒスチジン残基によって置き換えられる（Ｎ５９７Ｈ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列の５９７位に変異を含み、野生型配列では５９７位にアスパラギン残基を有する。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、グリシン残基によって置き換えられる（Ｎ５９７Ｇ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列の５９７位に変異を含み、野生型配列では５９７位にアスパラギン残基を有する。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、チロシン残基によって置き換えられる（Ｎ５９７Ｙ）。いくつかの実施形態では、５９７位のアスパラギン残基は、フェニルアラニン残基によって置き換えられる（Ｎ５９７Ｆ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ５９７Ｉ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ５９７Ｌ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ５９７Ｖ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ５９７Ｍ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ５９７Ｃ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ５９７Ｐ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ５９７Ｔ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ５９７Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ５９７Ｗ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ５９７Ｑ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ５９７Ｄ変異を含む。ある特定の実施形態例では、Ｎ５９７における上記の変異は、Ｅ４８８Ｑバックグラウンドがある状態で追加導入される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のセリン５９９、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、５９９位のセリン残基は、スレオニン残基によって置き換えられる（Ｓ５９９Ｔ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアスパラギン６１３、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、６１３位のアスパラギン残基は、リジン残基によって置き換えられる（Ｎ６１３Ｋ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列の６１３位に変異を含み、野生型配列では６１３位にアスパラギン残基を有する。いくつかの実施形態では、６１３位のアスパラギン残基は、アルギニン残基によって置き換えられる（Ｎ６１３Ｒ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列の６１３位に変異を含み、野生型配列では６１３位にアスパラギン残基を有する。いくつかの実施形態では、６１３位のアスパラギン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｎ６１３Ａ）いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列の６１３位に変異を含み、野生型配列では６１３位にアスパラギン残基を有する。いくつかの実施形態では、６１３位のアスパラギン残基は、グルタミン酸残基によって置き換えられる（Ｎ６１３Ｅ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｉ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｌ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｖ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｆ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｍ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｃ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｐ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｔ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｙ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｗ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｑ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｈ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ６１３Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ６１３における上記の変異は、Ｅ４８８Ｑ変異と組み合わせて追加導入される。
いくつかの実施形態では、編集効率を改善するために、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づくＧ３３６Ｄ変異、Ｇ４８７Ａ変異、Ｇ４８７Ｖ変異、Ｅ４８８Ｑ変異、Ｅ４８８Ｈ変異、Ｅ４８８Ｒ変異、Ｅ４８８Ｎ変異、Ｅ４８８Ａ変異、Ｅ４８８Ｓ変異、Ｅ４８８Ｍ変異、Ｔ４９０Ｃ変異、Ｔ４９０Ｓ変異、Ｖ４９３Ｔ変異、Ｖ４９３Ｓ変異、Ｖ４９３Ａ変異、Ｖ４９３Ｒ変異、Ｖ４９３Ｄ変異、Ｖ４９３Ｐ変異、Ｖ４９３Ｇ変異、Ｎ５９７Ｋ変異、Ｎ５９７Ｒ変異、Ｎ５９７Ａ変異、Ｎ５９７Ｅ変異、Ｎ５９７Ｈ変異、Ｎ５９７Ｇ変異、Ｎ５９７Ｙ変異、Ａ５８９Ｖ変異、Ｓ５９９Ｔ変異、Ｎ６１３Ｋ変異、Ｎ６１３Ｒ変異、Ｎ６１３Ａ変異、Ｎ６１３Ｅ変異、及び相同ＡＤＡＲタンパク質における、上記の変異に対応する変異、のうちの１つまたは複数を含み得る。
いくつかの実施形態では、編集効率を低減するために、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づくＥ４８８Ｆ変異、Ｅ４８８Ｌ変異、Ｅ４８８Ｗ変異、Ｔ４９０Ａ変異、Ｔ４９０Ｆ変異、Ｔ４９０Ｙ変異、Ｔ４９０Ｒ変異、Ｔ４９０Ｋ変異、Ｔ４９０Ｐ変異、Ｔ４９０Ｅ変異、Ｎ５９７Ｆ変異、及び相同ＡＤＡＲタンパク質における、上記の変異に対応する変異、のうちの１つまたは複数を含み得る。特定の実施形態では、効率が低減されたアデノシンデアミナーゼ酵素を使用してオフターゲット効果を低減することが目的となり得る。
「編集特異性」及び「編集優先性」という用語は、二本鎖基質における特定のアデノシン部位におけるＡからＩへの編集の程度を指すために本明細書で互換的に使用される。ある実施形態では、基質編集優先性は、標的アデノシン残基の５’側隣接残基及び／または３’側隣接残基によって決定される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、基質の５’側隣接残基に優先性を有し、この優先性は、Ｕ＞Ａ＞Ｃ＞Ｇ（「＞」は、優先性がより高いことを示す）として順位付けられる。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、基質の３’側隣接残基に優先性を有し、この優先性は、Ｇ＞Ｃ～Ａ＞Ｕ（「＞」は、優先性がより高いことを示し、「～」は、優先性が同様であることを示す）として順位付けられる。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、基質の３’側隣接残基に優先性を有し、この優先性は、Ｇ＞Ｃ＞Ｕ～Ａ（「＞」は、優先性がより高いことを示し、「～」は、優先性が同様であることを示す）として順位付けられる。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、基質の３’側隣接残基に優先性を有し、この優先性は、Ｇ＞Ｃ＞Ａ＞Ｕ（「＞」は、優先性がより高いことを示す）として順位付けられる。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、基質の３’側隣接残基に優先性を有し、この優先性は、Ｃ～Ｇ～Ａ＞Ｕ（「＞」は、優先性がより高いことを示し、「～」は、優先性が同様であることを示す）として順位付けられる。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、標的アデノシン残基を含むトリプレット配列に優先性を有し、この優先性は、ＴＡＧ＞ＡＡＧ＞ＣＡＣ＞ＡＡＴ＞ＧＡＡ＞ＧＡＣ（「＞」は、優先性がより高いことを示す）（中央のＡは、標的アデノシン残基である）として順位付けられる。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼの基質編集優先性は、アデノシンデアミナーゼタンパク質における核酸結合ドメインの有無によって影響を受ける。いくつかの実施形態では、基質編集優先性を改変するために、デアミナーゼドメインは、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）または二本鎖ＲＮＡ結合モチーフ（ｄｓＲＢＭ）と連結される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＢＤまたはｄｓＲＢＭは、ＡＤＡＲタンパク質（ｈＡＤＡＲ１またはｈＡＤＡＲ２など）に由来し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｄｓＲＢＤ及び１つのデアミナーゼドメインを含む全長ＡＤＡＲタンパク質が使用される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｄｓＲＢＭまたはｄｓＲＢＤは、デアミナーゼドメインのＮ末端に存在する。他の実施形態では、１つまたは複数のｄｓＲＢＭまたはｄｓＲＢＤは、デアミナーゼドメインのＣ末端に存在する。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼの基質編集優先性は、当該酵素の活性中心付近または活性中心におけるアミノ酸残基によって影響を受ける。いくつかの実施形態では、基質編集優先性を改変するために、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づくＧ３３６Ｄ変異、Ｇ４８７Ｒ変異、Ｇ４８７Ｋ変異、Ｇ４８７Ｗ変異、Ｇ４８７Ｙ変異、Ｅ４８８Ｑ変異、Ｅ４８８Ｎ変異、Ｔ４９０Ａ変異、Ｖ４９３Ａ変異、Ｖ４９３Ｔ変異、Ｖ４９３Ｓ変異、Ｎ５９７Ｋ変異、Ｎ５９７Ｒ変異、Ａ５８９Ｖ変異、Ｓ５９９Ｔ変異、Ｎ６１３Ｋ変異、Ｎ６１３Ｒ変異、及び相同ＡＤＡＲタンパク質における、上記の変異に対応する変異、のうちの１つまたは複数を含み得る。
具体的には、いくつかの実施形態では、編集特異性を低減するために、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づくＥ４８８Ｑ変異、Ｖ４９３Ａ変異、Ｎ５９７Ｋ変異、Ｎ６１３Ｋ変異、及び相同ＡＤＡＲタンパク質における、上記の変異に対応する変異、のうちの１つまたは複数を含み得る。いくつかの実施形態では、編集特異性を向上させるために、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ４９０Ａ変異を含み得る。
いくつかの実施形態では、５’側に隣接するＧを有する標的アデノシン（Ａ）（トリプレット配列ＧＡＣ（中央のＡは、標的アデノシン残基である）を含む基質など）に対する編集優先性を向上させるために、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づくＧ３３６Ｄ変異、Ｅ４８８Ｑ変異、Ｅ４８８Ｎ変異、Ｖ４９３Ｔ変異、Ｖ４９３Ｓ変異、Ｖ４９３Ａ変異、Ａ５８９Ｖ変異、Ｎ５９７Ｋ変異、Ｎ５９７Ｒ変異、Ｓ５９９Ｔ変異、Ｎ６１３Ｋ変異、Ｎ６１３Ｒ変異、及び相同ＡＤＡＲタンパク質における、上記の変異に対応する変異、のうちの１つまたは複数を含み得る。
具体的には、いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＧＡＣ、ＧＡＡ、ＧＡＵ、ＧＡＧ、ＣＡＵ、ＡＡＵ、ＵＡＣというトリプレット配列（中央のＡは、標的アデノシン残基である）を含む基質を編集するために、Ｅ４８８Ｑ変異、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応変異を含む。
いくつかの実施形態では、オフターゲット効果を低減するために、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づくＲ３４８、Ｖ３５１、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｅ３９６、Ｃ４５１、Ｒ４５５、Ｎ４７３、Ｒ４７４、Ｋ４７５、Ｒ４７７、Ｒ４８１、Ｓ４８６、Ｅ４８８、Ｔ４９０、Ｓ４９５、Ｒ５１０における変異、及び相同ＡＤＡＲタンパク質における、上記の変異に対応する変異、のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８に変異を含むとともに、Ｒ３４８、Ｖ３５１、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｅ３９６、Ｃ４５１、Ｒ４５５、Ｎ４７３、Ｒ４７４、Ｋ４７５、Ｒ４７７、Ｒ４８１、Ｓ４８６、Ｔ４９０、Ｓ４９５、Ｒ５１０から選択される１つまたは複数の追加の位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５に変異を含むとともに、１つまたは複数の追加の位置に任意選択で変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ４７３に変異を含むとともに、１つまたは複数の追加の位置に任意選択で変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１に変異を含むとともに、１つまたは複数の追加の位置に任意選択で変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８及びＴ３７５に変異を含むとともに、１つまたは複数の追加の位置に任意選択で変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８及びＮ４７３に変異を含むとともに、１つまたは複数の追加の位置に任意選択で変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８及びＶ３５１に変異を含むとともに、１つまたは複数の追加の位置に任意選択で変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８に変異を含むとともに、Ｔ３７５、Ｎ４７３、及びＶ３５１のうちの１つまたは複数に変異を含む。
いくつかの実施形態では、オフターゲット効果を低減するために、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列位置に基づくＲ３４８Ｅ、Ｖ３５１Ｌ、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｓ、Ｒ４５５Ｇ、Ｒ４５５Ｓ、Ｒ４５５Ｅ、Ｎ４７３Ｄ、Ｒ４７４Ｅ、Ｋ４７５Ｑ、Ｒ４７７Ｅ、Ｒ４８１Ｅ、Ｓ４８６Ｔ、Ｅ４８８Ｑ、Ｔ４９０Ａ、Ｔ４９０Ｓ、Ｓ４９５Ｔ、及びＲ５１０Ｅ、ならびに相同ＡＤＡＲタンパク質における、上記の変異に対応する変異、から選択される変異のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８Ｑ変異を含むとともに、Ｒ３４８Ｅ、Ｖ３５１Ｌ、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｓ、Ｒ４５５Ｇ、Ｒ４５５Ｓ、Ｒ４５５Ｅ、Ｎ４７３Ｄ、Ｒ４７４Ｅ、Ｋ４７５Ｑ、Ｒ４７７Ｅ、Ｒ４８１Ｅ、Ｓ４８６Ｔ、Ｔ４９０Ａ、Ｔ４９０Ｓ、Ｓ４９５Ｔ、及びＲ５１０Ｅから選択される１つまたは複数の追加の変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｇ変異またはＴ３７５Ｓ変異を含むとともに、１つまたは複数の追加の変異を任意選択で含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ４７３Ｄ変異を含むとともに、１つまたは複数の追加の変異を任意選択で含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｌ変異を含むとともに、１つまたは複数の追加の変異を任意選択で含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８Ｑ変異、及びＴ３７５Ｇ変異またはＴ３７５Ｇ変異を含むとともに、１つまたは複数の追加の変異を任意選択で含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８Ｑ変異及びＮ４７３Ｄ変異を含むとともに、１つまたは複数の追加の変異を任意選択で含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８Ｑ変異及びＶ３５１Ｌ変異を含むとともに、１つまたは複数の追加の変異を任意選択で含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８Ｑ変異を含むとともに、Ｔ３７５Ｇ／Ｓ、Ｎ４７３Ｄ、及びＶ３５１Ｌのうちの１つまたは複数を含む。
二本鎖ＲＮＡに結合したヒトＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインの結晶構造から、改変部位の５’側でＲＮＡに結合するタンパク質ループが存在することが明らかとなっている。この５’結合ループは、ＡＤＡＲファミリーのメンバー間の基質特異性差異の一因である。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４（２０）：９８７２－９８８０（２０１６）を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。さらに、ＡＤＡＲ２特異的なＲＮＡ結合ループが酵素活性部位付近で同定された。Ｍａｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３（５）：４２６－３３（２０１６）を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡ結合ループに１つまたは複数の変異を含むことで、編集特異性及び／または編集効率が改善される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアラニン４５４、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４５４位のアラニン残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ａ４５４Ｓ）。いくつかの実施形態では、４５４位のアラニン残基は、システイン残基によって置き換えられる（Ａ４５４Ｃ）。いくつかの実施形態では、４５４位のアラニン残基は、アスパラギン酸残基によって置き換えられる（Ａ４５４Ｄ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアルギニン４５５、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４５５位のアルギニン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｒ４５５Ａ）。いくつかの実施形態では、４５５位のアルギニン残基は、バリン残基によって置き換えられる（Ｒ４５５Ｖ）。いくつかの実施形態では、４５５位のアルギニン残基は、ヒスチジン残基によって置き換えられる（Ｒ４５５Ｈ）。いくつかの実施形態では、４５５位のアルギニン残基は、グリシン残基によって置き換えられる（Ｒ４５５Ｇ）。いくつかの実施形態では、４５５位のアルギニン残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ｒ４５５Ｓ）。いくつかの実施形態では、４５５位のアルギニン残基は、グルタミン酸残基によって置き換えられる（Ｒ４５５Ｅ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｃ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｉ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｋ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｌ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｍ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｎ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｑ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｆ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｗ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｐ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｙ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４５５Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ４５５における上記の変異は、Ｅ４８８Ｑ変異と組み合わせて追加導入される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のイソロイシン４５６、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４５６位のイソロイシン残基は、バリン残基によって置き換えられる（Ｉ４５６Ｖ）。いくつかの実施形態では、４５６位のイソロイシン残基は、ロイシン残基によって置き換えられる（Ｉ４５６Ｌ）。いくつかの実施形態では、４５６位のイソロイシン残基は、アスパラギン酸残基によって置き換えられる（Ｉ４５６Ｄ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のフェニルアラニン４５７、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４５７位のフェニルアラニン残基は、チロシン残基によって置き換えられる（Ｆ４５７Ｙ）。いくつかの実施形態では、４５７位のフェニルアラニン残基は、アルギニン残基によって置き換えられる（Ｆ４５７Ｒ）。いくつかの実施形態では、４５７位のフェニルアラニン残基は、グルタミン酸残基によって置き換えられる（Ｆ４５７Ｅ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のセリン４５８、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４５８位のセリン残基は、バリン残基によって置き換えられる（Ｓ４５８Ｖ）。いくつかの実施形態では、４５８位のセリン残基は、フェニルアラニン残基によって置き換えられる（Ｓ４５８Ｆ）。いくつかの実施形態では、４５８位のセリン残基は、プロリン残基によって置き換えられる（Ｓ４５８Ｐ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｉ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｌ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｍ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｃ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｔ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｙ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｗ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｑ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｎ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｈ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｋ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ４５８における上記の変異は、Ｅ４８８Ｑ変異と組み合わせて追加導入される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のプロリン４５９、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４５９位のプロリン残基は、システイン残基によって置き換えられる（Ｐ４５９Ｃ）。いくつかの実施形態では、４５９位のプロリン残基は、ヒスチジン残基によって置き換えられる（Ｐ４５９Ｈ）。いくつかの実施形態では、４５９位のプロリン残基は、トリプトファン残基によって置き換えられる（Ｐ４５９Ｗ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のヒスチジン４６０、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４６０位のヒスチジン残基は、アルギニン残基によって置き換えられる（Ｈ４６０Ｒ）。いくつかの実施形態では、４６０位のヒスチジン残基は、イソロイシン残基によって置き換えられる（Ｈ４６０Ｉ）。いくつかの実施形態では、４６０位のヒスチジン残基は、プロリン残基によって置き換えられる（Ｈ４６０Ｐ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｌ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｖ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｆ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｍ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｃ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｔ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｙ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｗ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｑ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｎ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ４６０Ｋ変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｈ４６０における上記の変異は、Ｅ４８８Ｑ変異と組み合わせて追加導入される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のプロリン４６２、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４６２位のプロリン残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ｐ４６２Ｓ）。いくつかの実施形態では、４６２位のプロリン残基は、トリプトファン残基によって置き換えられる（Ｐ４６２Ｗ）。いくつかの実施形態では、４６２位のプロリン残基は、グルタミン酸残基によって置き換えられる（Ｐ４６２Ｅ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアスパラギン酸４６９、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４６９位のアスパラギン酸残基は、グルタミン残基によって置き換えられる（Ｄ４６９Ｑ）。いくつかの実施形態では、４６９位のアスパラギン酸残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ｄ４６９Ｓ）。いくつかの実施形態では、４６９位のアスパラギン酸残基は、チロシン残基によって置き換えられる（Ｄ４６９Ｙ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアルギニン４７０、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４７０位のアルギニン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｒ４７０Ａ）。いくつかの実施形態では、４７０位のアルギニン残基は、イソロイシン残基によって置き換えられる（Ｒ４７０Ｉ）。いくつかの実施形態では、４７０位のアルギニン残基は、アスパラギン酸残基によって置き換えられる（Ｒ４７０Ｄ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のヒスチジン４７１、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４７１位のヒスチジン残基は、リジン残基によって置き換えられる（Ｈ４７１Ｋ）。いくつかの実施形態では、４７１位のヒスチジン残基は、スレオニン残基によって置き換えられる（Ｈ４７１Ｔ）。いくつかの実施形態では、４７１位のヒスチジン残基は、バリン残基によって置き換えられる（Ｈ４７１Ｖ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のプロリン４７２、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４７２位のプロリン残基は、リジン残基によって置き換えられる（Ｐ４７２Ｋ）。いくつかの実施形態では、４７２位のプロリン残基は、スレオニン残基によって置き換えられる（Ｐ４７２Ｔ）。いくつかの実施形態では、４７２位のプロリン残基は、アスパラギン酸残基によって置き換えられる（Ｐ４７２Ｄ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアスパラギン４７３、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４７３位のアスパラギン残基は、アルギニン残基によって置き換えられる（Ｎ４７３Ｒ）。いくつかの実施形態では、４７３位のアスパラギン残基は、トリプトファン残基によって置き換えられる（Ｎ４７３Ｗ）。いくつかの実施形態では、４７３位のアスパラギン残基は、プロリン残基によって置き換えられる（Ｎ４７３Ｐ）。いくつかの実施形態では、４７３位のアスパラギン残基は、アスパラギン酸残基によって置き換えられる（Ｎ４７３Ｄ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアルギニン４７４、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４７４位のアルギニン残基は、リジン残基によって置き換えられる（Ｒ４７４Ｋ）。いくつかの実施形態では、４７４位のアルギニン残基は、グリシン残基によって置き換えられる（Ｒ４７４Ｇ）。いくつかの実施形態では、４７４位のアルギニン残基は、アスパラギン酸残基によって置き換えられる（Ｒ４７４Ｄ）。いくつかの実施形態では、４７４位のアルギニン残基は、グルタミン酸残基によって置き換えられる（Ｒ４７４Ｅ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のリジン４７５、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４７５位のリジン残基は、グルタミン残基によって置き換えられる（Ｋ４７５Ｑ）。いくつかの実施形態では、４７５位のリジン残基は、アスパラギン残基によって置き換えられる（Ｋ４７５Ｎ）。いくつかの実施形態では、４７５位のリジン残基は、アスパラギン酸残基によって置き換えられる（Ｋ４７５Ｄ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアラニン４７６、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４７６位のアラニン残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ａ４７６Ｓ）。いくつかの実施形態では、４７６位のアラニン残基は、アルギニン残基によって置き換えられる（Ａ４７６Ｒ）。いくつかの実施形態では、４７６位のアラニン残基は、グルタミン酸残基によって置き換えられる（Ａ４７６Ｅ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアルギニン４７７、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４７７位のアルギニン残基は、リジン残基によって置き換えられる（Ｒ４７７Ｋ）。いくつかの実施形態では、４７７位のアルギニン残基は、スレオニン残基によって置き換えられる（Ｒ４７７Ｔ）。いくつかの実施形態では、４７７位のアルギニン残基は、フェニルアラニン残基によって置き換えられる（Ｒ４７７Ｆ）。いくつかの実施形態では、４７４位のアルギニン残基は、グルタミン酸残基によって置き換えられる（Ｒ４７７Ｅ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のグリシン４７８、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４７８位のグリシン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｇ４７８Ａ）。いくつかの実施形態では、４７８位のグリシン残基は、アルギニン残基によって置き換えられる（Ｇ４７８Ｒ）。いくつかの実施形態では、４７８位のグリシン残基は、チロシン残基によって置き換えられる（Ｇ４７８Ｙ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｉ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｌ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｖ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｆ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｍ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｃ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｐ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｔ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｗ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｑ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｎ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｈ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｋ変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ４７８における上記の変異は、Ｅ４８８Ｑ変異と組み合わせて追加導入される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のグルタミン４７９、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４７９位のグルタミン残基は、アスパラギン残基によって置き換えられる（Ｑ４７９Ｎ）。いくつかの実施形態では、４７９位のグルタミン残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ｑ４７９Ｓ）。いくつかの実施形態では、４７９位のグルタミン残基は、プロリン残基によって置き換えられる（Ｑ４７９Ｐ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアルギニン３４８、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、３４８位のアルギニン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｒ３４８Ａ）。いくつかの実施形態では、３４８位のアルギニン残基は、グルタミン酸残基によって置き換えられる（Ｒ３４８Ｅ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のバリン３５１、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、３５１位のバリン残基は、ロイシン残基によって置き換えられる（Ｖ３５１Ｌ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｙ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｍ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｔ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｆ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｉ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｃ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｈ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｐ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｋ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｎ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｗ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｑ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｖ３５１における上記の変異は、Ｅ４８８Ｑ変異と組み合わせて追加導入される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のスレオニン３７５、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、３７５位のスレオニン残基は、グリシン残基によって置き換えられる（Ｔ３７５Ｇ）。いくつかの実施形態では、３７５位のスレオニン残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ｔ３７５Ｓ）。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｈ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｑ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｃ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｎ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｍ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｗ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｖ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｋ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｆ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｉ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｐ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｌ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｙ変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ３７５における上記の変異は、Ｅ４８８Ｑ変異と組み合わせて追加導入される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアルギニン４８１、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４８１位のアルギニン残基は、グルタミン酸残基によって置き換えられる（Ｒ４８１Ｅ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のセリン４８６、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４８６位のセリン残基は、スレオニン残基によって置き換えられる（Ｓ４８６Ｔ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のスレオニン４９０、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４９０位のスレオニン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｔ４９０Ａ）。いくつかの実施形態では、４９０位のスレオニン残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ｔ４９０Ｓ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のセリン４９５、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、４９５位のセリン残基は、スレオニン残基によって置き換えられる（Ｓ４９５Ｔ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のアルギニン５１０、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、５１０位のアルギニン残基は、グルタミン残基によって置き換えられる（Ｒ５１０Ｑ）。いくつかの実施形態では、５１０位のアルギニン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｒ５１０Ａ）。いくつかの実施形態では、５１０位のアルギニン残基は、グルタミン酸残基によって置き換えられる（Ｒ５１０Ｅ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のグリシン５９３、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、５９３位のグリシン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｇ５９３Ａ）。いくつかの実施形態では、５９３位のグリシン残基は、グルタミン酸残基によって置き換えられる（Ｇ５９３Ｅ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のリジン５９４、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、５９４位のリジン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｋ５９４Ａ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のＡ４５４位、Ｒ４５５位、Ｉ４５６位、Ｆ４５７位、Ｓ４５８位、Ｐ４５９位、Ｈ４６０位、Ｐ４６２位、Ｄ４６９位、Ｒ４７０位、Ｈ４７１位、Ｐ４７２位、Ｎ４７３位、Ｒ４７４位、Ｋ４７５位、Ａ４７６位、Ｒ４７７位、Ｇ４７８位、Ｑ４７９位、Ｒ３４８位、Ｒ５１０位、Ｇ５９３位、Ｋ５９４位、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置、のいずれか１つまたは複数に変異を含む。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のＡ４５４Ｓ変異、Ａ４５４Ｃ変異、Ａ４５４Ｄ変異、Ｒ４５５Ａ変異、Ｒ４５５Ｖ変異、Ｒ４５５Ｈ変異、Ｉ４５６Ｖ変異、Ｉ４５６Ｌ変異、Ｉ４５６Ｄ変異、Ｆ４５７Ｙ変異、Ｆ４５７Ｒ変異、Ｆ４５７Ｅ変異、Ｓ４５８Ｖ変異、Ｓ４５８Ｆ変異、Ｓ４５８Ｐ変異、Ｐ４５９Ｃ変異、Ｐ４５９Ｈ変異、Ｐ４５９Ｗ変異、Ｈ４６０Ｒ変異、Ｈ４６０Ｉ変異、Ｈ４６０Ｐ変異、Ｐ４６２Ｓ変異、Ｐ４６２Ｗ変異、Ｐ４６２Ｅ変異、Ｄ４６９Ｑ変異、Ｄ４６９Ｓ変異、Ｄ４６９Ｙ変異、Ｒ４７０Ａ変異、Ｒ４７０Ｉ変異、Ｒ４７０Ｄ変異、Ｈ４７１Ｋ変異、Ｈ４７１Ｔ変異、Ｈ４７１Ｖ変異、Ｐ４７２Ｋ変異、Ｐ４７２Ｔ変異、Ｐ４７２Ｄ変異、Ｎ４７３Ｒ変異、Ｎ４７３Ｗ変異、Ｎ４７３Ｐ変異、Ｒ４７４Ｋ変異、Ｒ４７４Ｇ変異、Ｒ４７４Ｄ変異、Ｋ４７５Ｑ変異、Ｋ４７５Ｎ変異、Ｋ４７５Ｄ変異、Ａ４７６Ｓ変異、Ａ４７６Ｒ変異、Ａ４７６Ｅ変異、Ｒ４７７Ｋ変異、Ｒ４７７Ｔ変異、Ｒ４７７Ｆ変異、Ｇ４７８Ａ変異、Ｇ４７８Ｒ変異、Ｇ４７８Ｙ変異、Ｑ４７９Ｎ変異、Ｑ４７９Ｓ変異、Ｑ４７９Ｐ変異、Ｒ３４８Ａ変異、Ｒ５１０Ｑ変異、Ｒ５１０Ａ変異、Ｇ５９３Ａ変異、Ｇ５９３Ｅ変異、Ｋ５９４Ａ変異、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置の変異、のいずれか１つまたは複数を含む。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のＴ３７５位、Ｖ３５１位、Ｇ４７８位、Ｓ４５８位、Ｈ４６０位、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置、のいずれか１つもしくは複数に変異を含み、当該変異は、Ｅ４８８における変異と任意選択で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｃ、Ｔ３７５Ｈ、Ｔ３７５Ｑ、Ｖ３５１Ｍ、Ｖ３５１Ｔ、Ｖ３５１Ｙ、Ｇ４７８Ｒ、Ｓ４５８Ｆ、Ｈ４６０Ｉから選択される変異のうちの１つまたは複数を、任意選択でＥ４８８Ｑと組み合わせて含む。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｈ、Ｔ３７５Ｑ、Ｖ３５１Ｍ、Ｖ３５１Ｙ、Ｈ４６０Ｐから選択される変異のうちの１つまたは複数を、任意選択でＥ４８８Ｑと組み合わせて含む。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｓ変異及びＳ４５８Ｆ変異を、任意選択でＥ４８８Ｑと組み合わせて含む。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のＴ３７５位、Ｎ４７３位、Ｒ４７４位、Ｇ４７８位、Ｓ４５８位、Ｐ４５９位、Ｖ３５１位、Ｒ４５５位、Ｒ４５５位、Ｔ４９０位、Ｒ３４８位、Ｑ４７９位、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置、のうちの２つ以上に変異を含み、当該変異は、Ｅ４８８における変異と任意選択で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｓ、Ｎ４７３Ｄ、Ｒ４７４Ｅ、Ｇ４７８Ｒ、Ｓ４５８Ｆ、Ｐ４５９Ｗ、Ｖ３５１Ｌ、Ｒ４５５Ｇ、Ｒ４５５Ｓ、Ｔ４９０Ａ、Ｒ３４８Ｅ、Ｑ４７９Ｐから選択される変異のうちの２つ以上を、任意選択でＥ４８８Ｑと組み合わせて含む。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｇ変異及びＶ３５１Ｌ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｇ変異及びＲ４５５Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｇ変異及びＲ４５５Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｇ変異及びＴ４９０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｇ変異及びＲ３４８Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｓ変異及びＶ３５１Ｌ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｓ変異及びＲ４５５Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｓ変異及びＲ４５５Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｓ変異及びＴ４９０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｓ変異及びＲ３４８Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ４７３Ｄ変異及びＶ３５１Ｌ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ４７３Ｄ変異及びＲ４５５Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ４７３Ｄ変異及びＲ４５５Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ４７３Ｄ変異及びＴ４９０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ４７３Ｄ変異及びＲ３４８Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４７４Ｅ変異及びＶ３５１Ｌ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４７４Ｅ変異及びＲ４５５Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４７４Ｅ変異及びＲ４５５Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４７４Ｅ変異及びＴ４９０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｒ４７４Ｅ変異及びＲ３４８Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｆ変異及びＴ３７５Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｆ変異及びＴ３７５Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｆ変異及びＮ４７３Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｆ変異及びＲ４７４Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｓ４５８Ｆ変異及びＧ４７８Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｒ変異及びＴ３７５Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｒ変異及びＴ３７５Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｒ変異及びＮ４７３Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｇ４７８Ｒ変異及びＲ４７４Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｐ４５９Ｗ変異及びＴ３７５Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｐ４５９Ｗ変異及びＴ３７５Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｐ４５９Ｗ変異及びＮ４７３Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｐ４５９Ｗ変異及びＲ４７４Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｐ４５９Ｗ変異及びＧ４７８Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｐ４５９Ｗ変異及びＳ４５８Ｆ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｑ４７９Ｐ変異及びＴ３７５Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｑ４７９Ｐ変異及びＴ３７５Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｑ４７９Ｐ変異及びＮ４７３Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｑ４７９Ｐ変異及びＲ４７４Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｑ４７９Ｐ変異及びＧ４７８Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｑ４７９Ｐ変異及びＳ４５８Ｆ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｑ４７９Ｐ変異及びＰ４５９Ｗ変異を含む。この項に記載の変異はすべて、Ｅ４８８Ｑ変異と組み合わせて追加導入されることもあり得る。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のＫ４７５位、Ｑ４７９位、Ｐ４５９位、Ｇ４７８位、Ｓ４５８位、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置、のいずれか１つまたは複数に変異を含み、当該変異は、Ｅ４８８における変異と任意選択で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｋ４７５Ｎ、Ｑ４７９Ｎ、Ｐ４５９Ｗ、Ｇ４７８Ｒ、Ｓ４５８Ｐ、Ｓ４５８Ｆから選択される変異のうちの１つまたは複数を、任意選択でＥ４８８Ｑと組み合わせて含む。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のＴ３７５位、Ｖ３５１位、Ｒ４５５位、Ｈ４６０位、Ａ４７６位、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置、のいずれか１つまたは複数に変異を含み、当該変異は、Ｅ４８８における変異と任意選択で組み合わせられる。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｃ、Ｔ３７５Ｈ、Ｔ３７５Ｑ、Ｖ３５１Ｍ、Ｖ３５１Ｔ、Ｖ３５１Ｙ、Ｒ４５５Ｈ、Ｈ４６０Ｐ、Ｈ４６０Ｉ、Ａ４７６Ｅから選択される変異のうちの１つまたは複数を、任意選択でＥ４８８Ｑと組み合わせて含む。
ある特定の実施形態では、編集の改善及びオフターゲット改変の低減は、ｇＲＮＡを化学的に改変することによって達成される。Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ，５３：６２６７－６２７１，ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１４０２６３４（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に例示されるように化学的に改変されたｇＲＮＡでは、オフターゲット活性が低減され、オンターゲット効率が改善する。２’－Ｏ－メチル及びホスホロチオエートによって改変されたガイドＲＮＡでは、一般に、細胞における編集効率が改善する。
ＡＤＡＲは、編集対象のＡのいずれかの側に隣接するヌクレオチドに優先性を示すことが知られている（ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｓｍｂ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ２３／ｎ５／ｆｕｌｌ／ｎｓｍｂ．３２０３．ｈｔｍｌ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２３（５）：４２６－４３３（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。したがって、ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡ、標的、及び／またはＡＤＡＲは、モチーフ優先性が最適化されるように選択される。
ミスマッチを意図的に導入すると、非優先モチーフの編集が可能になることがインビトロで示されている（ｈｔｔｐｓ：／／ａｃａｄｅｍｉｃ．ｏｕｐ．ｃｏｍ／ｎａｒ／ａｒｔｉｃｌｅ－ｌｏｏｋｕｐ／ｄｏｉ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ２７２；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，４２（１０）：ｅ８７）、Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｓｃｉｅｎｔｉｃｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４１４７８（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。したがって、ある特定の実施形態では、５’隣接塩基または３’隣接塩基が非優先的なものである場合、こうした非優先隣接塩基に対するＲＮＡ編集効率を増進させるために、隣接塩基にミスマッチが意図的に導入される。
ＡＤＡＲデアミナーゼドメインの標的域においてＡがＣに相対して存在すると、他の塩基を上回って優先的に当該Ａが編集され得るが、Ｕと塩基対を形成したＡが標的塩基の数塩基以内に存在すると、編集レベルは低くあり得る。したがって、編集対象のすべてのＡをＣとミスマッチさせることによってＣｐｆ１－ＡＤＡＲ系の活性域における複数のＡを編集対象として定めることが可能となり得る。したがって、ある特定の実施形態では、活性域にＡ：Ｃミスマッチが複数生じるように設計することで、複数のＡ：Ｉ編集が創出される。ある特定の実施形態では、活性域における潜在的なオフターゲット編集を抑制するために、標的ではないＡは、ＡまたはＧと対になるようにされる。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄの野生型アミノ酸配列（例えば、ＭＧＳＧＧＧＧＳＥＧＡＰＫＫＫＲＫＶＧＳＳＬＧＴＧＮＲＣＶＫＧＤＳＬＳＬＫＧＥＴＶＮＤＣＨＡＥＩＩＳＲＲＧＦＩＲＦＬＹＳＥＬＭＫＹＮＳＱＴＡＫＤＳＩＦＥＰＡＫＧＧＥＫＬＱＩＫＫＴＶＳＦＨＬＹＩＳＴＡＰＣＧＤＧＡＬＦＤＫＳＣＳＤＲＡＭＥＳＴＥＳＲＨＹＰＶＦＥＮＰＫＱＧＫＬＲＴＫＶＥＮＧＱＧＴＩＰＶＥＳＳＤＩＶＰＴＷＤＧＩＲＬＧＥＲＬＲＴＭＳＣＳＤＫＩＬＲＷＮＶＬＧＬＱＧＡＬＬＴＨＦＬＱＰＩＹＬＫＳＶＴＬＧＹＬＦＳＱＧＨＬＴＲＡＩＣＣＲＶＴＲＤＧＳＡＦＥＤＧＬＲＨＰＦＩＶＮＨＰＫＶＧＲＶＳＩＹＤＳＫＲＱＳＧＫＴＫＥＴＳＶＮＷＣＬＡＤＧＹＤＬＥＩＬＤＧＴＲＧＴＶＤＧＰＲＮＥＬＳＲＶＳＫＫＮＩＦＬＬＦＫＫＬＣＳＦＲＹＲＲＤＬＬＲＬＳＹＧＥＡＫＫＡＡＲＤＹＥＴＡＫＮＹＦＫＫＧＬＫＤＭＧＹＧＮＷＩＳＫＰＱＥＥＫＮＦ＊（配列番号３６））を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄ配列に１つまたは複数の変異を含み、その結果、ｈＡＤＡＲ１－Ｄの編集効率及び／または基質編集優先性が特定の要件に応じて改変される。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのアミノ酸配列のグリシン１００７、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、相対的に小さな側鎖を有する非極性アミノ酸残基によって置き換えられる。例えば、いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｇ１００７Ａ）。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、バリン残基によって置き換えられる（Ｇ１００７Ｖ）。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、相対的に大きな側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、アルギニン残基によって置き換えられる（Ｇ１００７Ｒ）。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、リジン残基によって置き換えられる（Ｇ１００７Ｋ）。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、トリプトファン残基によって置き換えられる（Ｇ１００７Ｗ）。いくつかの実施形態では、１００７位のグリシン残基は、チロシン残基によって置き換えられる（Ｇ１００７Ｙ）。さらに、他の実施形態では、１００７位のグリシン残基は、ロイシン残基によって置き換えられる（Ｇ１００７Ｌ）。他の実施形態では、１００７位のグリシン残基は、スレオニン残基によって置き換えられる（Ｇ１００７Ｔ）。他の実施形態では、１００７位のグリシン残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ｇ１００７Ｓ）。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのアミノ酸配列のグルタミン酸１００８、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、相対的に大きな側鎖を有する極性アミノ酸残基によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、グルタミン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｑ）。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、ヒスチジン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｈ）。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、アルギニン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｒ）。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、リジン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｋ）。いくつかの実施形態では、１００８位にグルタミン酸残基は、非極性アミノ酸残基または小さな極性アミノ酸残基によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、フェニルアラニン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｆ）。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、トリプトファン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｗ）。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、グリシン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｇ）。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、イソロイシン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｉ）。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、バリン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｖ）。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、プロリン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｐ）。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、セリン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｓ）。他の実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、アスパラギン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｎ）。他の実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、アラニン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ａ）。他の実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、メチオニン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｍ）。いくつかの実施形態では、１００８位のグルタミン酸残基は、ロイシン残基によって置き換えられる（Ｅ１００８Ｌ）。
いくつかの実施形態では、編集効率を改善するために、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのアミノ酸配列位置に基づくＥ１００７Ｓ変異、Ｅ１００７Ａ変異、Ｅ１００７Ｖ変異、Ｅ１００８Ｑ変異、Ｅ１００８Ｒ変異、Ｅ１００８Ｈ変異、Ｅ１００８Ｍ変異、Ｅ１００８Ｎ変異、Ｅ１００８Ｋ変異、及び相同ＡＤＡＲタンパク質における、上記の変異に対応する変異、のうちの１つまたは複数を含み得る。
いくつかの実施形態では、編集効率を低減するために、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのアミノ酸配列位置に基づくＥ１００７Ｒ変異、Ｅ１００７Ｋ変異、Ｅ１００７Ｙ変異、Ｅ１００７Ｌ変異、Ｅ１００７Ｔ変異、Ｅ１００８Ｇ変異、Ｅ１００８Ｉ変異、Ｅ１００８Ｐ変異、Ｅ１００８Ｖ変異、Ｅ１００８Ｆ変異、Ｅ１００８Ｗ変異、Ｅ１００８Ｓ変異、Ｅ１００８Ｎ変異、Ｅ１００８Ｋ変異、及び相同ＡＤＡＲタンパク質における、上記の変異に対応する変異、のうちの１つまたは複数を含み得る。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼの基質編集優先性、基質編集効率、及び／または基質編集選択性は、当該酵素の活性中心付近または活性中心におけるアミノ酸残基によって影響を受ける。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１－Ｄ配列のグルタミン酸１００８位、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、Ｅ１００８Ｒであるか、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応変異である。いくつかの実施形態では、Ｅ１００８Ｒ変異体では、逆鎖上にミスマッチＧ残基を有する標的アデノシン残基の編集効率が向上している。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖核酸基質を認識し、それに結合するための１つもしくは複数の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合モチーフ（ｄｓＲＢＭ）もしくは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）をさらに含むか、またはｄｓＲＢＭもしくはｄｓＲＢＤに連結される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼと二本鎖基質との間の相互作用は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳタンパク質因子を含めて、１つまたは複数の追加のタンパク質因子（複数可）によって媒介される。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼと二本鎖基質との間の相互作用は、ガイドＲＮＡを含めて、１つまたは複数の核酸構成要素（複数可）によってさらに媒介される。
本発明によれば、アデノシンデアミナーゼの基質は、ガイド分子がそのＤＮＡ標的に結合すると形成されるＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖であり、当該ガイド分子は、次に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成する。このＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖またはＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖は、本明細書では、「ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド」、「ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド」、または「二本鎖基質」とも称される。ガイド分子及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の特定の特徴は、以下に詳細が記載される。
本明細書で使用される「編集選択性」という用語は、二本鎖基質上のすべての部位のごく一部がアデノシンデアミナーゼによって編集されることを指す。理論によって拘束されないが、アデノシンデアミナーゼの編集選択性は、二本鎖基質の長さ及び二次構造（ミスマッチ塩基、バルジ、及び／または内部ループの存在など）によって影響を受けることが企図される。
いくつかの実施形態では、基質が、完全に塩基対が形成された長さ５０ｂｐ超の二本鎖であるとき、アデノシンデアミナーゼは、その二本鎖内の複数のアデノシン残基（例えば、すべてのアデノシン残基の５０％）を脱アミノ化することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、基質が５０ｂｐより短いとき、アデノシンデアミナーゼの編集選択性は、標的アデノシン部位におけるミスマッチの存在によって影響を受ける。具体的には、いくつかの実施形態では、逆鎖上にミスマッチシチジン（Ｃ）残基を有するアデノシン（Ａ）残基は、高効率で脱アミノ化される。いくつかの実施形態では、逆鎖上にミスマッチグアノシン（Ｇ）残基を有するアデノシン（Ａ）残基は、編集を受けずにスキップされる。
ＣからＵへの脱アミノ化活性を有する改変アデノシンデアミナーゼ
ある特定の実施形態例では、アデニンからヒポキサンチンへの脱アミノ化以外に追加の反応を触媒する能力を有する改変ＡＤＡＲタンパク質を設計するために、指向性進化法が使用され得る。例えば、改変ＡＤＡＲタンパク質は、シチジンからウラシルへの脱アミノ化を触媒する能力を有し得る。特定の理論によって拘束されないが、ＣからＵへの活性を改善する変異によって、より小さなシチジン塩基への適合性が向上するように結合ポケットの形が変わり得る。
いくつかの実施形態では、ＣからＵへの脱アミノ化活性を有する改変アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのアミノ酸配列のＶ３５１位、Ｔ３７５位、Ｒ４５５位、及びＥ４８８位、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応位置、のいずれか１つまたは複数に変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８Ｑ変異を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｖ３５１Ｉ、Ｖ３５１Ｌ、Ｖ３５１Ｆ、Ｖ３５１Ｍ、Ｖ３５１Ｃ、Ｖ３５１Ａ、Ｖ３５１Ｇ、Ｖ３５１Ｐ、Ｖ３５１Ｔ、Ｖ３５１Ｓ、Ｖ３５１Ｙ、Ｖ３５１Ｗ、Ｖ３５１Ｑ、Ｖ３５１Ｎ、Ｖ３５１Ｈ、Ｖ３５１Ｅ、Ｖ３５１Ｄ、Ｖ３５１Ｋ、Ｖ３５１Ｒ、Ｔ３７５Ｉ、Ｔ３７５Ｌ、Ｔ３７５Ｖ、Ｔ３７５Ｆ、Ｔ３７５Ｍ、Ｔ３７５Ｃ、Ｔ３７５Ａ、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｐ、Ｔ３７５Ｓ、Ｔ３７５Ｙ、Ｔ３７５Ｗ、Ｔ３７５Ｑ、Ｔ３７５Ｎ、Ｔ３７５Ｈ、Ｔ３７５Ｅ、Ｔ３７５Ｄ、Ｔ３７５Ｋ、Ｔ３７５Ｒ、Ｒ４５５Ｉ、Ｒ４５５Ｌ、Ｒ４５５Ｖ、Ｒ４５５Ｆ、Ｒ４５５Ｍ、Ｒ４５５Ｃ、Ｒ４５５Ａ、Ｒ４５５Ｇ、Ｒ４５５Ｐ、Ｒ４５５Ｔ、Ｒ４５５Ｓ、Ｒ４５５Ｙ、Ｒ４５５Ｗ、Ｒ４５５Ｑ、Ｒ４５５Ｎ、Ｒ４５５Ｈ、Ｒ４５５Ｅ、Ｒ４５５Ｄ、Ｒ４５５Ｋから選択される変異のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８Ｑ変異を含むとともに、Ｖ３５１Ｉ、Ｖ３５１Ｌ、Ｖ３５１Ｆ、Ｖ３５１Ｍ、Ｖ３５１Ｃ、Ｖ３５１Ａ、Ｖ３５１Ｇ、Ｖ３５１Ｐ、Ｖ３５１Ｔ、Ｖ３５１Ｓ、Ｖ３５１Ｙ、Ｖ３５１Ｗ、Ｖ３５１Ｑ、Ｖ３５１Ｎ、Ｖ３５１Ｈ、Ｖ３５１Ｅ、Ｖ３５１Ｄ、Ｖ３５１Ｋ、Ｖ３５１Ｒ、Ｔ３７５Ｉ、Ｔ３７５Ｌ、Ｔ３７５Ｖ、Ｔ３７５Ｆ、Ｔ３７５Ｍ、Ｔ３７５Ｃ、Ｔ３７５Ａ、Ｔ３７５Ｇ、Ｔ３７５Ｐ、Ｔ３７５Ｓ、Ｔ３７５Ｙ、Ｔ３７５Ｗ、Ｔ３７５Ｑ、Ｔ３７５Ｎ、Ｔ３７５Ｈ、Ｔ３７５Ｅ、Ｔ３７５Ｄ、Ｔ３７５Ｋ、Ｔ３７５Ｒ、Ｒ４５５Ｉ、Ｒ４５５Ｌ、Ｒ４５５Ｖ、Ｒ４５５Ｆ、Ｒ４５５Ｍ、Ｒ４５５Ｃ、Ｒ４５５Ａ、Ｒ４５５Ｇ、Ｒ４５５Ｐ、Ｒ４５５Ｔ、Ｒ４５５Ｓ、Ｒ４５５Ｙ、Ｒ４５５Ｗ、Ｒ４５５Ｑ、Ｒ４５５Ｎ、Ｒ４５５Ｈ、Ｒ４５５Ｅ、Ｒ４５５Ｄ、Ｒ４５５Ｋから選択される変異のうちの１つまたは複数をさらに含む。
ＣからＵへの脱アミノ化活性を有する前述の改変ＡＤＡＲタンパク質との関連では、本明細書に記載の本発明は、目的標的遺伝子座におけるＣを脱アミノ化するための方法にも関し、この方法は、（ａ）Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質または触媒的に不活性なＣｐｆ１タンパク質と、（ｂ）直列反復配列に連結されたガイド配列を含むガイド分子と、（ｃ）ＣからＵへの脱アミノ化活性を有する改変ＡＤＡＲタンパク質またはその触媒ドメインと、を当該目的標的遺伝子座に送達することを含み、
当該改変ＡＤＡＲタンパク質またはその触媒ドメインは、当該Ｃｐｆ１タンパク質もしくは当該ガイド分子に共有結合もしくは非共有結合で連結されるか、または送達後に当該Ｃｐｆ１タンパク質もしくは当該ガイド分子に連結されるように適合化され、
ガイド分子は、当該Ｃｐｆ１タンパク質と複合体を形成し、当該目的標的遺伝子座の第１のＤＮＡ鎖に結合するように当該複合体を誘導し、
当該ガイド配列は、当該第１のＤＮＡ鎖内に当該Ｃを含む標的配列とハイブリダイズしてヘテロ二本鎖を形成する能力を有し、
任意選択で、当該ガイド配列は、当該Ｃに対応する位置に非対形成Ａまたは非対形成Ｕを含むことで、形成ヘテロ二本鎖にミスマッチを生じさせ、
任意選択で、当該Ｃｐｆ１タンパク質は、当該ヘテロ二本鎖の形成によって置き換えられる当該目的標的遺伝子座の第２のＤＮＡ鎖にニックを入れるＣｐｆ１ニッカーゼであり、
当該改変ＡＤＡＲタンパク質またはその触媒ドメインは、当該ＲＮＡヘテロ二本鎖における当該Ｃを脱アミノ化する。
ＣからＵへの脱アミノ化活性を有する前述の改変ＡＤＡＲタンパク質との関連では、本明細書に記載の本発明は、目的標的遺伝子座におけるＣの脱アミノ化に適した、操作された非天然起源の系にも関し、この系は、（ａ）直列反復配列に連結されたガイド配列を含むガイド分子、または当該ガイド分子をコードするヌクレオチド配列と、（ｂ）Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくは触媒的に不活性なＣｐｆ１タンパク質、または当該Ｃｐｆ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｃ）ＣからＵへの脱アミノ化活性を有する改変ＡＤＡＲタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または当該改変ＡＤＡＲタンパク質もしくはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列と、を含み、
当該改変ＡＤＡＲタンパク質またはその触媒ドメインは、当該Ｃｐｆ１タンパク質もしくは当該ガイド分子に共有結合もしくは非共有結合で連結されるか、または送達後に当該Ｃｐｆ１タンパク質もしくは当該ガイド分子に連結されるように適合化され、
当該ガイド配列は、当該標的遺伝子座の第１のＤＮＡ鎖上にＣを含む標的配列とハイブリダイズしてヘテロ二本鎖を形成する能力を有し、
任意選択で、当該ガイド配列は、当該Ｃに対応する位置に非対形成Ａまたは非対形成Ｕを含むことで、形成ヘテロ二本鎖にミスマッチを生じさせ、
任意選択で、当該Ｃｐｆ１タンパク質は、当該第１のＤＮＡ鎖に相補的な第２のＤＮＡ鎖にニックを入れる能力を有するＣｐｆ１ニッカーゼであり、
任意選択で、当該系は、（ａ）当該ガイド配列を含む当該ガイド分子をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第１の制御要素と、（ｂ）当該Ｃｐｆ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第２の制御要素と、（ｃ）ＣからＵへの脱アミノ化活性を有する改変ＡＤＡＲタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、当該第１の制御要素もしくは第２の制御要素の制御下にあるか、または第３の制御要素に機能可能なように連結されたヌクレオチド配列と、を含む１つまたは複数のベクターを含むベクター系であり、
改変ＡＤＡＲタンパク質またはその触媒ドメインをコードする当該ヌクレオチド配列が第３の制御要素に機能可能なように連結されるのであれば、当該改変ＡＤＡＲタンパク質またはその触媒ドメインは、発現後に当該ガイド分子または当該Ｃｐｆ１タンパク質に連結されるように適合化され、
構成要素（ａ）、構成要素（ｂ）、及び構成要素（ｃ）は、当該系に含まれる同じベクターまたは異なるベクターに位置し、任意選択で、当該第１の制御要素、第２の制御要素、及び／または第３の制御要素は、誘導性プロモーターである。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びガイド
本発明の方法及び系では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び対応ガイド分子が使用される。より具体的には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である。ある特定の実施形態では、当該ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系では、特定の配列を標的とするためにカスタマイズされたタンパク質を生成させる必要はなく、特定の核酸標的を認識するガイド分子によって単一のＣａｓタンパク質をプログラムすることができ、換言すれば、当該ガイド分子を使用すれば特定の目的核酸標的遺伝子座にＣａｓ酵素タンパク質をリクルートできるということである。
ガイド分子
クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のガイド分子またはガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ－メイト配列（内在性ＣＲＩＳＰＲ系との関連では「直列反復配列」を包含する）及びガイド配列（内在性ＣＲＩＳＰＲ系との関連では「スペーサー」とも称される）を含む。実際、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質とは対照的に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｃｐｆ１タンパク質は、ｔｒａｃｒ配列の存在には依存しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、（例えば、Ｃａｓタンパク質がＣｐｆ１である場合）ｔｒａｃｒ配列を含まず、及び／またはｔｒａｃｒ配列の存在に依存しない。ある特定の実施形態では、ガイド分子は、ガイド配列またはスペーサー配列に融合または連結された直列反復配列を含むか、当該直列反復配列から本質的になるか、または当該直列反復配列からなり得る。
一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素によって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成との関連では、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的ＤＮＡ配列とガイド配列とがハイブリダイズすることで、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。
「ガイド分子」及び「ガイドＲＮＡ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と複合体を形成する能力を有するとともに、標的核酸配列とハイブリダイズし、複合体が標的核酸配列に配列特異的に結合するように誘導する上で十分な標的核酸配列との相補性を有するガイド配列を含むＲＮＡベースの分子を指すために本明細書で互換的に使用される。ガイド分子またはガイドＲＮＡは、本明細書に記載の１つまたは複数の化学的改変（例えば、２つリボヌクレオチドを化学的に連結することによるもの、または１つもしくは複数のデオキシリボヌクレオチドで１つもしくは複数のリボヌクレオチドを置き換えることによるもの）を有するＲＮＡベースの分子を明確に包含する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と関連して本明細書で使用される「ガイド配列」という用語は、標的核酸配列とハイブリダイズし、核酸標的化複合体が標的核酸配列に配列特異的に結合するように誘導する上で十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。本発明との関連では、標的核酸配列または標的配列は、「標的アデノシン」とも本明細書で称される脱アミノ化対象の標的アデノシンを含む配列である。いくつかの実施形態では、意図されるｄＡ－Ｃミスマッチを除けば、相補度は、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントをとると、約５０％以上、約６０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約９９％以上、またはこれを超える％である。最適なアライメントは、配列のアライメントをとるための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定され得、こうしたアルゴリズムの例としては、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで利用可能）が挙げられる。核酸標的化複合体が標的核酸配列に配列特異的に結合するように誘導するガイド配列（核酸標的化ガイドＲＮＡ内のもの）の能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、試験対象のガイド配列を含めて、核酸標的化複合体の形成に十分な核酸標的化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、核酸標的化複合体の構成要素をコードするベクターのトランスフェクションなどによって対応標的核酸配列を有する宿主細胞に導入された後、標的核酸配列内が優先的に標的となるか（例えば、切断されるか）が、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどによって評価され得る。同様に、標的核酸配列と、試験対象のガイド配列を含む、核酸標的化複合体の構成要素と、試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列と、を提供し、標的配列への結合もしくはその切断率または標的配列の近傍への結合もしくはその切断率を、試験ガイド配列の反応と対照ガイド配列の反応との間で比較することによって、標的核酸配列（またはその近傍の配列）の切断が試験管内で評価され得る。他のアッセイも可能であり、当業者ならそうしたアッセイを想起するであろう。ガイド配列、したがって核酸標的化ガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列が標的となるように選択され得る。
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、標的配列とのミスマッチを少なくとも１つ有するように設計されたガイド配列を含み、その結果、ガイド配列と標的配列との間で形成されるヘテロ二本鎖は、標的配列上の脱アミノ化対象の標的Ａに相対する非対形成Ｃをガイド配列に含む。いくつかの実施形態では、このＡ－Ｃミスマッチを除けば、相補度は、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントをとると、約５０％以上、約６０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約９９％以上、またはこれを超える％である。
ある特定の実施形態では、ガイド分子のガイド配列またはスペーサーの長さは、１５～５０ｎｔである。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサーの長さは、少なくとも１５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、スペーサーの長さは、１５～１７ｎｔ（例えば、１５ｎｔ、１６ｎｔ、もしくは１７ｎｔ）、１７～２０ｎｔ（例えば、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、もしくは２０ｎｔ）、２０～２４ｎｔ（例えば、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、もしくは２４ｎｔ）、２３～２５ｎｔ（例えば、２３ｎｔ、２４ｎｔ、もしくは２５ｎｔ）、２４～２７ｎｔ（例えば、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、もしくは２７ｎｔ）、２７～３０ｎｔ（例えば、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、もしくは３０ｎｔ）、３０～３５ｎｔ（例えば、３０ｎｔ、３１ｎｔ、３２ｎｔ、３３ｎｔ、３４ｎｔ、もしくは３５ｎｔ）、または３５ｎｔ以上である。ある特定の実施形態例では、ガイド配列は、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、３２ｎｔ、３３ｎｔ、３４ｎｔ、３５ｎｔ、３６ｎｔ、３７ｎｔ、３８ｎｔ、３９ｎｔ、４０ｎｔ、４１ｎｔ、４２ｎｔ、４３ｎｔ、４４ｎｔ、４５ｎｔ、４６ｎｔ、４７ｎｔ、４８ｎｔ、４９ｎｔ、５０ｎｔ、５１ｎｔ、５２ｎｔ、５３ｎｔ、５４ｎｔ、５５ｎｔ、５６ｎｔ、５７ｎｔ、５８ｎｔ、５９ｎｔ、６０ｎｔ、６１ｎｔ、６２ｎｔ、６３ｎｔ、６４ｎｔ、６５ｎｔ、６６ｎｔ、６７ｎｔ、６８ｎｔ、６９ｎｔ、７０ｎｔ、７１ｎｔ、７２ｎｔ、７３ｎｔ、７４ｎｔ、７５ｎｔ、７６ｎｔ、７７ｎｔ、７８ｎｔ、７９ｎｔ、８０ｎｔ、８１ｎｔ、８２ｎｔ、８３ｎｔ、８４ｎｔ、８５ｎｔ、８６ｎｔ、８７ｎｔ、８８ｎｔ、８９ｎｔ、９０ｎｔ、９１ｎｔ、９２ｎｔ、９３ｎｔ、９４ｎｔ、９５ｎｔ、９６ｎｔ、９７ｎｔ、９８ｎｔ、９９ｎｔ、または１００ｎｔである。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、長さが１０～５０ｎｔのＲＮＡ配列であるが、より具体的には、長さが約２０～３０ｎｔのＲＮＡ配列であり、有利には、長さが約２０ｎｔ、約２３～２５ｎｔ、または約２４ｎｔのＲＮＡ配列である。ガイド配列は、脱アミノ化対象のアデノシンを含む標的配列に当該ガイド配列が確実にハイブリダイズするように選択される。このことについては、より詳細に以下に記載される。選択は、脱アミノ化の効率及び特異性を向上させる追加の段階を含み得る。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約２０ｎｔ～約３０ｎｔの長さのものであり、標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズすることで、標的アデノシン部位にｄＡ－Ｃミスマッチを有することを除けばほぼ完全にマッチする二本鎖を形成する。具体的には、いくつかの実施形態では、ｄＡ－Ｃミスマッチは、標的配列の中央付近に位置し（したがって、ガイド配列が標的配列にハイブリダイズすると二本鎖の中央に位置する）、それによってアデノシンデアミナーゼが狭い編集域（例えば、幅約４ｂｐ）に制限される。いくつかの実施形態では、標的配列は、脱アミノ化対象の標的アデノシンを複数含み得る。別の実施形態では、標的配列は、標的アデノシン部位の３’側にｄＡ－Ｃミスマッチをさらに１つまたは複数含み得る。いくつかの実施形態では、標的配列における意図されないアデニン部位がオフターゲット編集されることを回避するために、当該意図されないアデニンに対応する位置に非対形成グアニンを含むようにガイド配列を設計してｄＡ－Ｇミスマッチを導入することができ、このｄＡ－Ｇミスマッチは、ある特定のアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２など）には、触媒的に好ましくないものである。Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ７：８４６－８５８（２００１）を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡとヘテロ二本鎖を形成させるために、標準的な長さ（例えば、ＡｓＣｐｆ１については約２４ｎｔ）を有するＣｐｆ１ガイド配列が使用される。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１－ガイドＲＮＡ－標的ＤＮＡ複合体の外側を含めて標的ＤＮＡとヘテロ二本鎖を形成させるために、標準的な長さを超える長さ（例えば、ＡｓＣｐｆ１については＞２４ｎｔ）を有するＣｐｆ１ガイド分子が使用される。ヌクレオチドの所与の区間内の複数のアデニンを脱アミノ化することが目的の場合、上記のことが目的となり得る。代替の実施形態では、標準的なガイド配列長の制限を維持することが目的となる。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、Ｃｐｆ１ガイドの標準的な長さの外側にｄＡ－Ｃミスマッチが導入されるようにガイド配列が設計され、こうすることによって、Ｃｐｆ１による立体障害が低減され、アデノシンデアミナーゼとｄＡ－Ｃミスマッチとの間の接触頻度が上昇し得る。
いくつかの実施形態では、ミスマッチ核酸塩基（例えば、シチジン）の位置は、ＤＮＡ標的上にＰＡＭが存在すると想定される位置から計算される。ある実施形態では、ミスマッチ核酸塩基は、ＰＡＭから１２～２１ｎｔ、またはＰＡＭから１３～２１ｎｔ、またはＰＡＭから１４～２１ｎｔ、またはＰＡＭから１４～２０ｎｔ、またはＰＡＭから１５～２０ｎｔ、またはＰＡＭから１６～２０ｎｔ、またはＰＡＭから１４～１９ｎｔ、またはＰＡＭから１５～１９ｎｔ、またはＰＡＭから１６～１９ｎｔ、またはＰＡＭから１７～１９ｎｔ、またはＰＡＭから約２０ｎｔ、またはＰＡＭから約１９ｎｔ、またはＰＡＭから約１８ｎｔ、またはＰＡＭから約１７ｎｔ、またはＰＡＭから約１６ｎｔ、またはＰＡＭから約１５ｎｔ、またはＰＡＭから約１４ｎｔの位置に存在する。好ましい実施形態では、ミスマッチ核酸塩基は、ＰＡＭから１７～１９ｎｔまたは１８ｎｔの位置に存在する。
ミスマッチ距離は、Ｃｐｆ１スペーサーの３’末端とミスマッチ核酸塩基（例えば、シチジン）との間の塩基の数であり、ミスマッチ塩基は、ミスマッチ距離計算の一部として含められる。ある実施形態では、ミスマッチ距離は、１～１０ｎｔ、または１～９ｎｔ、または１～８ｎｔ、または２～８ｎｔ、または２～７ｎｔ、または２～６ｎｔ、または３～８ｎｔ、または３～７ｎｔ、または３～６ｎｔ、または３～５ｎｔ、または約２ｎｔ、または約３ｎｔ、または約４ｎｔ、または約５ｎｔ、または約６ｎｔ、または約７ｎｔ、または約８ｎｔである。好ましい実施形態では、ミスマッチ距離は、３～５ｎｔまたは４ｎｔである。
ある実施形態では、本明細書に記載のＣｐｆ１－ＡＤＡＲ系の編集域は、ＰＡＭから１２～２１ｎｔ、またはＰＡＭから１３～２１ｎｔ、またはＰＡＭから１４～２１ｎｔ、またはＰＡＭから１４～２０ｎｔ、またはＰＡＭから１５～２０ｎｔ、またはＰＡＭから１６～２０ｎｔ、またはＰＡＭから１４～１９ｎｔ、またはＰＡＭから１５～１９ｎｔ、またはＰＡＭから１６～１９ｎｔ、またはＰＡＭから１７～１９ｎｔ、またはＰＡＭから約２０ｎｔ、またはＰＡＭから約１９ｎｔ、またはＰＡＭから約１８ｎｔ、またはＰＡＭから約１７ｎｔ、またはＰＡＭから約１６ｎｔ、またはＰＡＭから約１５ｎｔ、またはＰＡＭから約１４ｎｔである。ある実施形態では、本明細書に記載のＣｐｆ１－ＡＤＡＲ系の編集域は、Ｃｐｆ１スペーサーの３’末端から１～１０ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から１～９ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から１～８ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から２～８ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から２～７ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から２～６ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から３～８ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から３～７ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から３～６ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から３～５ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から約２ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から約３ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から約４ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から約５ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から約６ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から約７ｎｔ、またはＣｐｆ１スペーサーの３’末端から約８ｎｔである。
いくつかの実施形態では、ガイド分子（直列反復配列及び／またはスペーサー）の配列は、ガイド分子内の二次構造度合いが低減されるように選択される。いくつかの実施形態では、核酸標的化ガイドＲＮＡのヌクレオチドのうち、最適にフォールディングされたときの自己相補的な塩基対形成に関与するヌクレオチドの割合は、約７５％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、またはそれ未満の％である。最適なフォールディングは、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定され得る。いくつかのプログラムは、最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づくものである。そのようなアルゴリズムの１つの例は、ｍＦｏｌｄであり、ｍＦｏｌｄは、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）によって説明されている。フォールディングアルゴリズムの別の例は、重心構造予測アルゴリズムを使用するオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄであり、これは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａで開発されたものである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４、及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１－６２を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ切断（Ｃｐｆ１による切断など）に対するガイド分子の感受性を低減することが目的となる。したがって、特定の実施形態では、ガイド分子は、Ｃｐｆ１による切断または他のＲＮＡ切断酵素による切断を回避するように調整される。
ある特定の実施形態では、ガイド分子は、非天然起源の核酸、及び／または非天然起源のヌクレオチド、及び／またはヌクレオチドアナログ、及び／または化学的改変を含む。好ましくは、こうした非天然起源の核酸及び非天然起源のヌクレオチドは、ガイド配列の外側に位置する。非天然起源の核酸には、例えば、天然起源のヌクレオチドと非天然起源のヌクレオチドとの混合物が含まれ得る。非天然起源のヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、リボース部分、リン酸部分、及び／または塩基部分が改変され得る。本発明のある１つの実施形態では、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。そのような実施形態の１つでは、ガイドは、１つまたは複数のリボヌクレオチド及び１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある１つの実施形態では、ガイドは、１つまたは複数の非天然起源のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ（ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチド、リボース環の２’炭素と４’炭素との間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、または架橋型核酸（ＢＮＡ）など）を含む。改変ヌクレオチドの他の例としては、２’－Ｏ－メチルアナログ、２’－デオキシアナログ、または２’－フルオロアナログが挙げられる。改変塩基の追加の例としては、限定されないが、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、シュードウリジン、イノシン、７－メチルグアノシンが挙げられる。ガイドＲＮＡの化学改変の例としては、限定されないが、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を１つまたは複数の末端ヌクレオチドに組み込むことが挙げられる。化学的に改変されたそのようなガイドでは、オンターゲット特異性とオフターゲット特異性との対比結果は予測不可能であるものの、非改変ガイドと比較して安定性が向上し、活性が上昇し得る（２０１５年６月２９日にオンラインで公開されたＨｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５－９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０、Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０－Ｅ７１１１、Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８：９０１－９０４、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２，３：１５４、Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２：１１８７０－１１８７５、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ．，２０１４，５：１４５４－１４７１、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５－９８９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１，００６６ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１７－００６６を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの５’末端及び／または３’末端は、さまざまな機能性部分によって改変され、こうした機能性部分には、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグが含まれる（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３３：７４－８３を参照のこと）。ある特定の実施形態では、ガイドは、標的ＤＮＡに結合する領域にリボヌクレオチドを含み、Ｃｐｆ１に結合する領域に１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログを含む。本発明のある１つの実施形態では、デオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、操作されたガイド構造（限定されないが、ステムループ領域及びシード領域など）に組み込まれる。Ｃｐｆ１ガイドについては、ある特定の実施形態では、こうした改変は、ステムループ領域の５’ハンドルには存在しない。ガイドのステムループ領域の５’ハンドルを化学的に改変するとガイドの機能が消失し得る（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１：００６６を参照のこと）。ある特定の実施形態では、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、または少なくとも７５個が化学的に改変される。いくつかの実施形態では、ガイドの３’末端または５’末端のいずれかに位置する３～５ヌクレオチドが化学的に改変される。いくつかの実施形態では、シード領域にごく軽微な改変（２’－Ｆ修飾など）が導入される。いくつかの実施形態では、ガイドの３’末端に２’－Ｆ修飾が導入される。ある特定の実施形態では、ガイドの５’末端及び／または３’末端に位置する３～５ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）で化学的に改変される。そのような改変によってゲノム編集効率が増進し得る（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５－９８９を参照のこと）。ある特定の実施形態では、遺伝子破壊のレベルを増進させるために、ガイドのホスホジエステル結合のすべてがホスホロチオエート（ＰＳ）で置き換えられる。ある特定の実施形態では、ガイドの５’末端及び／または３’末端に位置する５ヌクレオチド超が、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、またはＳ－拘束エチル（ｃＥｔ）で化学的に改変される。化学的に改変されたそのようなガイドでは、媒介する遺伝子破壊のレベルが増進し得る（Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０－Ｅ７１１１を参照のこと）。本発明のある１つの実施形態では、ガイドは、その３’末端及び／または５’末端に化学的部分を含むように改変される。そのような部分には、限定されないが、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、またはローダミンが含まれる。ある特定の実施形態では、化学的部分は、リンカー（アルキル鎖など）によってガイドに結合される。ある特定の実施形態では、改変ガイドの化学的部分は、ガイドを別の分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはナノ粒子など）に付加するために使用することができる。化学的に改変されたそのようなガイドは、ＣＲＩＳＰＲ系によって一般に編集された細胞の同定または富化に使用することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ，２０１７，６：ｅ２５３１２，ＤＯＩ：１０．７５５４を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、ガイドは、改変Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡを含み、５’ハンドルと、シード領域をさらに含むガイドセグメントと、３’末端と、を有する。いくつかの実施形態では、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６のＣｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓの亜種であるＮｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７のＣｐｆ１（Ｌｂ３Ｃｐｆ１）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓのＣｐｆ１（ＢｐＣｐｆ１）、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７のＣｐｆ１（ＰｂＣｐｆ１）、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０のＣｐｆ１（ＰｅＣｐｆ１）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉのＣｐｆ１（ＬｉＣｐｆ１）、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ属の１種であるＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７のＣｐｆ１（ＳｓＣｐｆ１）、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０のＣｐｆ１（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓのＣｐｆ１（ＰｃＣｐｆ１）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅのＣｐｆ１（ＰｍＣｐｆ１）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍのＣｐｆ１（ＣＭｔＣｐｆ１）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓのＣｐｆ１（ＥｅＣｐｆ１）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７のＣｐｆ１（ＭｂＣｐｆ１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓのＣｐｆ１（ＰｄＣｐｆ１）、またはＬ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６のＣｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）のいずれか１つのＣｐｆ１とともに改変ガイドを使用することができる。
いくつかの実施形態では、ガイドに対する改変は、化学改変、挿入、欠失、または分割である。いくつかの実施形態では、化学改変には、限定されないが、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）アナログ、２’－デオキシアナログ、２－チオウリジンアナログ、Ｎ６－メチルアデノシンアナログ、２’－フルオロアナログ、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を組み込むことが含まれる。いくつかの実施形態では、ガイドは、ホスホロチオエート修飾のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または２５個が化学的に改変される。ある特定の実施形態では、シード領域におけるヌクレオチドのうちの１つのまたは複数が化学的に改変される。ある特定の実施形態では、３’末端におけるヌクレオチドのうちの１つまたは複数が化学的に改変される。ある特定の実施形態では、５’ハンドルにおけるヌクレオチドはいずれも、化学的に改変されない。いくつかの実施形態では、シード領域における化学改変は、軽微な改変（２’－フルオロアナログの組み込みなど）である。特定の実施形態では、シード領域のヌクレオチドのうちの１つが、２’－フルオロアナログで置き換えられる。いくつかの実施形態では、３’末端におけるヌクレオチドのうちの５～１０個が化学的に改変される。Ｃｐｆ１ ＣｒＲＮＡの３’末端をそのように化学的に改変することで、Ｃｐｆ１の活性が改善し得る（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１：００６６参照のこと）。特定の実施形態では、３’末端におけるヌクレオチドのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個が、２’－フルオロアナログで置き換えられる。特定の実施形態では、３’末端におけるヌクレオチドのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個が、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）アナログで置き換えられる。
いくつかの実施形態では、ガイドの５’ハンドルのループが改変される。いくつかの実施形態では、欠失、挿入、分割、または化学改変を有するように、ガイドの５’ハンドルのループが改変される。ある特定の実施形態では、改変ループは、ヌクレオチドを３つ、４つ、または５つ含む。ある特定の実施形態では、ループは、ＵＣＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＡＵＵ、またはＵＧＵＵという配列を含む。
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、非共有結合で連結された別の配列を有するステムループを形成し、この配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。特定の実施形態では、標準的なホスホロアミダイト合成プロトコルを使用してガイド形成配列が最初に合成される（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌ ２８８，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（２０１２））。いくつかの実施形態では、こうした配列を、当該技術分野において知られる標準的なプロトコルを使用して、ライゲーションに適した官能基を含むように機能化することができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３））。官能基の例としては、限定されないが、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、アルデヒド、カルボニル、クロロカルボニル、イミダゾリルカルボニル、ヒドラジド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオール、マレイミド、ハロアルキル、スルホニル、アリル、プロパルギル、ジエン、アルキン、及びアジドが挙げられる。この配列が官能基を持つと、この配列と直列反復配列との間に化学結合（ｂｏｎｄ）または化学結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を共有結合で形成させることができる。化学結合の例としては、限定されないが、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトアリジン、ヒドロゾン（ｈｙｄｒｏｚｏｎｅ）、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、フルホン（ｆｕｌｆｏｎｅ）、スルホキシド、ウレア、チオウレア、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、感光性結合、Ｃ－Ｃ結合形成基（ディールス・アルダー付加環化のペアまたは閉環メタセシスのペア、及びマイケル反応のペアなど）に基づくものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、こうしたステムループ形成配列を、化学的に合成することができる。いくつかの実施形態では、この化学合成では、２’－アセトキシエチルオルトエステル（２’－ＡＣＥ）化学（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１１８２０－１１８２１、Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３１７：３－１８）、または２’－チオノカルバメート（２’－ＴＣ）化学（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０１１）１３３：１１５４０－１１５４６、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３：９８５－９８９）を利用する自動化固相オリゴヌクレオチド合成機が化学合成に使用される。
ある特定の実施形態では、ガイド分子（Ｃｐｆ１を標的遺伝子座にガイドする能力を有する）は、（１）標的遺伝子座にハイブリダイズする能力を有するガイド配列と、（２）ｔｒａｃｒメイトまたは直列反復配列と、を含み、直列反復配列は、ガイド配列の上流（すなわち、５’側）に位置する。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ガイド配列のシード配列（すなわち、標的遺伝子座における配列を認識及び／または当該配列にハイブリダイズする上で必要不可欠な配列）は、ガイド配列の最初の約１０ヌクレオチド以内に存在する。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１は、ＦｎＣｐｆ１であり、シード配列は、ガイド配列の５’末端上の最初の約５ｎｔ以内に存在する。
特定の実施形態では、ガイド分子は、直列反復配列に連結されたガイド配列を含み、直列反復配列は、１つまたは複数のステムループまたは最適化二次構造を含む。特定の実施形態では、直列反復配列は、１６ｎｔの最小長を有し、単一のステムループを有する。別の実施形態では、直列反復配列は、１６ｎｔ超の長さを有し（好ましくは、１７ｎｔ超の長さを有する）、複数のステムループまたは最適化二次構造を有する。特定の実施形態では、ガイド分子は、天然の直列反復配列のすべてまたは一部に連結されたガイド配列を含むか、または当該ガイド配列からなる。典型的なＶ型Ｃｐｆ１ガイド分子は、ガイド配列、第１の相補区間（「反復配列」）、ループ（典型的には４ヌクレオチドまたは５ヌクレオチドの長さを有する）、第２の相補区間（上記反復配列に相補的な「アンチ反復配列」）、及びポリＡ（ＲＮＡではポリＵであることが多い）尾部（ターミネーター）を（３’から５’の方向で）含む。ある特定の実施形態では、直列反復配列は、その天然の構造様式を保持し、単一のステムループを形成する。特定の実施形態では、ガイドの構造様式のある特定の側面が、例えば特徴の付加、除去、または置換によって、改変され得る一方で、ガイドの構造様式のある特定の他の側面は維持される。操作されるガイド分子の改変（限定されないが、挿入、欠失、及び置換を含む）に好ましい位置には、ガイドの末端と、ガイド分子のうちでＣｐｆ１タンパク質及び／または標的との複合体形成時に露出する領域（例えば、直列反復配列のステムループ）と、が含まれる。
特定の実施形態では、ステムは、相補的なＸ配列及びＹ配列を含む少なくとも４ｂｐを含むが、塩基対の数がより多くの（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２）ステムまたは塩基対の数がより少ない（例えば、３、２）ステムも企図される。したがって、例えば、Ｘ２～１０及びＹ２～１０（Ｘ及びＹは、任意の相補的ヌクレオチドセットを示す）が企図され得る。１つの態様では、Ｘ個のヌクレオチド及びＹ個のヌクレオチドから構成されるステムは、ループと一緒になることで、二次構造全体で完全なヘアピンを形成することになる。このことは、有利であり得、塩基対の量は、完全なヘアピンを形成する任意の量であり得る。１つの態様では、ガイド分子全体の二次構造が保たれる限り、任意の相補的なＸ：Ｙ塩基対形成配列が（例えば、長さに関して）許容される。１つの態様では、Ｘ：Ｙ塩基対から構成されるステムを連結するループは、同じ長さ（例えば、ヌクレオチド数が４もしくは５）の任意の配列であるか、またはガイド分子の二次構造全体を妨害しない、より長い任意の配列であり得る。１つの態様では、ステムループは、例えば、ＭＳ２アプタマーをさらに含み得る。１つの態様では、ステムは、相補的なＸ配列及びＹ配列を含む約５～７ｂｐを含むが、約５～７と比較して塩基対の数が多いか、または少ないステムも企図される。１つの態様では、非ワトソン・クリック塩基対形成が企図され、そのような対形成によって、一般に、ワトソン・クリック塩基対形成以外の機構でステムループの構造様式がその位置に保たれる。
特定の実施形態では、ガイド分子の天然のヘアピン構造またはステムループ構造は、延長されるか、または延長ステムループによって置き換えられる。ステムが延長されると、ガイド分子とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質との結合が増進し得ることが示されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．（２０１３）；１５５（７）：１４７９－１４９１）。特定の実施形態では、ステムループのステムは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくともそれ以上の相補的塩基対によって延長される（すなわち、ガイド分子にヌクレオチドを２つ、４つ、６つ、８つ、１０個、またはそれ以上追加することに相当する）。特定の実施形態では、こうした塩基対は、ステムループのループに隣接してステムの末端に位置する。
特定の実施形態では、ガイド分子の配列に対してその機能に影響を与えない軽微な改変を施すことによって、ＲＮＡｓｅｓまたは発現減少に対するガイド分子の感受性を低減することができる。例えば、特定の実施形態では、ガイド分子配列における推定Ｐｏｌ－ＩＩＩターミネーター（４つの連続Ｕ）を改変することによって、転写の未成熟な終結（Ｕ６ Ｐｏｌ－ＩＩＩによる未成熟な転写など）をなくすことができる。そのような配列改変がガイド分子のステムループに必要な場合、塩基対を反転させることによって実現させることが好ましい。
好ましい実施形態では、１つまたは複数のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含むように直列反復配列が改変され得る。特定の実施形態では、最適化二次構造の一部などとして１つまたは複数のアプタマーが含められ得る。そのようなアプタマーは、本明細書にさらに詳細が記載されるバクテリオファージコートタンパク質に結合する能力を有し得る。
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、編集対象の標的アデノシン残基を少なくとも１つ含む標的ＤＮＡ鎖と二本鎖を形成する。ガイドＲＮＡ分子が標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズすると、二本鎖にアデノシンデアミナーゼが結合し、ＤＮＡ－ＲＮＡ二本鎖内に含まれる１つまたは複数の標的アデノシン残基の脱アミノ化を触媒する。
ガイド配列、したがって核酸標的化ガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列が標的となるように選択され得る。標的配列は、ＤＮＡであり得る。標的配列は、ゲノムＤＮＡであり得る。標的配列は、ミトコンドリアＤＮＡであり得る。
ある特定の実施形態では、標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接（ａｄｊａｃｅｎｔ）モチーフ）またはＰＦＳ（プロトスペーサー隣接（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列もしくはプロトスペーサー隣接（ｆｌａｎｋｉｎｇ）部位）と関連させるべきであり、ＰＡＭまたはＰＦＳは、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の性質に応じて標的配列を選択すべきであり、その結果、ＤＮＡ二本鎖における標的配列の相補配列（本明細書では非標的配列とも称される）は、ＰＡＭの上流または下流に位置する。本発明の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がＣｐｆ１タンパク質である場合、標的配列の相補配列は、ＰＡＭの下流または３’側に位置する。ＰＡＭに対する正確な配列要件及び長さ要件は、使用されるＣｐｆ１タンパク質によって異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２～５塩基対の配列である。本明細書では、異なるＣｐｆ１オルソログの天然のＰＡＭ配列の例が以下に示されているが、当業者なら、所与のＣｐｆ１タンパク質とともに使用するためのＰＡＭ配列を追加同定することができるであろう。
さらに、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを操作することで、ＰＡＭ特異性をプログラムすることが可能となり、標的部位認識忠実度が改善し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の汎用性が向上し得る。このことは、例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ＢＰ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊｕｌ ２３；５２３（７５６１）：４８１－５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４５９２においてＣａｓ９を対象として記載されている。本明細書にさらに詳細が記載されるように、類似的にＣｐｆ１タンパク質を改変し得ることを当業者でなら理解するであろう。
特定の実施形態では、脱アミノ化対象のアデニンに対するデアミナーゼの効率最適化が実現するようにガイド配列が選択される。Ｃｐｆ１ニッカーゼによる切断部位に対する標的鎖でのアデニンの位置が考慮され得る。特定の実施形態では、脱アミノ化対象のアデニンの近傍においてニッカーゼが非標的鎖に確実に作用するようになることが目的となる。例えば、特定の実施形態では、ＰＡＭの１７ヌクレオチド下流（例えば、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１）またはＰＡＭの１８ヌクレオチド下流（例えば、ＦｎＣｐｆ１）で非標的鎖がＣｐｆ１ニッカーゼによって切断される。さらに、対応する非標的鎖の配列におけるニッカーゼ切断部位の上流１０ｂｐ以内または下流１０ｂｐ以内となるように、脱アミノ化対象のアデニンに対応すべきシトシンがガイド配列に位置するガイドを設計することが目的となり得る。
特定の実施形態では、ガイドは、エスコート型ガイドである。「エスコート型」は、Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの系または複合体またはガイドが、選択された時間に細胞内に送達されるか、または細胞内の選択された場所に送達され、その結果、Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの系または複合体またはガイドの活性が空間的または時間的に制御されることを意味する。例えば、Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの系または複合体またはガイドの活性及び目的地は、アプタマーリガンド（細胞表面タンパク質または他の局在化細胞構成要素など）に対する結合親和性を有するエスコートＲＮＡアプタマー配列によって制御され得る。あるいは、エスコートアプタマーは、例えば、一過性エフェクター（特定の時間に細胞に適用される外的エネルギー源など）などの細胞上アプタマーエフェクターまたは細胞内アプタマーエフェクターに応答性であり得る。
エスコート型のＣｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはＣｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、ガイド分子の構造、構造様式、安定性、遺伝的発現、またはそれらの任意の組み合わせが改善するように設計された機能構造を有するガイド分子を有する。そのような構造は、アプタマーを含み得る。
アプタマーは、他のリガンドに堅固に結合するように設計または選択することができる生体分子であり、こうした設計または選択では、例えば、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ；Ｔｕｅｒｋ Ｃ，Ｇｏｌｄ Ｌ：“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＲＮＡ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０，２４９：５０５－５１０）と呼ばれる技術が使用される。核酸アプタマーは、例えば、ランダム配列を有するオリゴヌクレオチドのプールから選択することができ、こうしたオリゴヌクレオチドは、生物医学的に関連する広範な標的に対して高い結合親和性及び特異性を有することから、アプタマーの治療有用性が広範囲にわたることが示唆されている（Ｋｅｅｆｅ，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｄ．，Ｓｕｐｒｉｙａ Ｐａｉ，ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ．“Ａｐｔａｍｅｒｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ９．７（２０１０）：５３７－５５０）。こうした特徴は、薬物送達媒体としてのアプタマーの用途が広範囲にわたることも示唆している（Ｌｅｖｙ－Ｎｉｓｓｅｎｂａｕｍ，Ｅｔｇａｒ，ｅｔ ａｌ．“Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｔａｍｅｒｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６．８（２００８）：４４２－４４９、及びＨｉｃｋｅ ＢＪ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＡＷ．“Ｅｓｃｏｒｔ ａｐｔａｍｅｒｓ：ａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｅｒｖｉｃｅ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０００，１０６：９２３－９２８．）。特性変化による合図に応答することで分子スイッチとして機能するアプタマーを構築することもでき、こうしたアプタマーは、フルオロフォアに結合して緑色蛍光タンパク質の活性を模倣するＲＮＡアプタマーなどである（Ｐａｉｇｅ，Ｊｅｒｅｍｙ Ｓ．，Ｋａｒｅｎ Ｙ．Ｗｕ，ａｎｄ Ｓａｍｉｅ Ｒ．Ｊａｆｆｒｅｙ．“ＲＮＡ ｍｉｍｉｃｓ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３．６０４２（２０１１）：６４２－６４６）。標的化されたｓｉＲＮＡ治療送達系の構成要素としてアプタマーを使用できることも示唆されており、こうしたｓｉＲＮＡ治療送達系では、例えば、細胞表面タンパク質が標的とされる（Ｚｈｏｕ，Ｊｉｅｈｕａ，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｊ．Ｒｏｓｓｉ．“Ａｐｔａｍｅｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．”Ｓｉｌｅｎｃｅ １．１（２０１０）：４）。
したがって、特定の実施形態では、例えば細胞膜を横切る送達を含めて、細胞内コンパートメントまたは核内へのガイド分子の送達が改善するように設計された１つまたは複数アプタマー（複数可）によってガイド分子が改変される。そのような構造は、送達性、誘導性、または選択エフェクターに対する応答性をガイド分子に付与する部分（複数可）を、１つまたは複数のアプタマー（複数可）に加えて、またはそのような１つまたは複数のアプタマー（複数可）は含まずに、含み得る。したがって、本発明は、正常または病的な生理学的条件に応答するガイド分子を包含し、こうした生理学的条件には、限定されないが、ｐＨ、低酸素、Ｏ２濃度、温度、タンパク質濃度、酵素濃度、脂質構造、光に対する曝露、機械的な破砕（例えば、超音波）、磁場、電場、または電磁放射線が含まれる。
誘導系の光応答性は、クリプトクロム－２及びＣＩＢ１の活性化及び結合を介して達成し得る。青色光による刺激によってクリプトクロム－２の立体構造変化の活性化が誘導される結果、その結合パートナーであるＣＩＢ１がリクルートされる。この結合は、迅速かつ可逆的であり、パルス刺激から１５秒未満で飽和に達し、刺激の終了後から１５分未満でベースラインに戻る。こうして結合動力学が迅速であることで、系を時間的に拘束するものは、誘導物質の取り込み及びクリアランスではなく、転写／翻訳及び転写物分解／タンパク質分解の速度のみとなる。クリプトクロム－２の活性化もまた、高度に感受性であることから、刺激に使用する光強度を低くすることを可能にし、光毒性のリスクを軽減する。さらに、インタクトな哺乳類脳などの状況では、刺激する領域のサイズを制御するために強度を変えて光を使用できることで、ベクター送達単体で得られ得るものと比較して高い精度を得ることが可能となり得る。
本発明は、ガイドを誘導するためのエネルギー源（電磁放射線、音エネルギー、または熱エネルギーなど）を企図する。有利なことに、電磁放射線は、可視光の構成要素である。好ましい実施形態では、光は、約４５０～約４９５ｎｍの波長を有する青色光である。特に好ましい実施形態では、波長は、約４８８ｎｍである。別の好ましい実施形態では、光刺激は、パルスを介するものである。光出力は、約０～９ｍＷ／ｃｍ２の範囲であり得る。好ましい実施形態では、刺激系列を、１５秒ごとに０．２５秒という短いものにすれば、活性化が最大化することになる。
化学的感受性またはエネルギー感受性のガイドは、化学源の結合またはエネルギーによって誘導されると立体構造が変化することで、ガイドとして働くことが可能となり、Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはＣｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の機能を有し得る。本発明は、ガイド機能及びＣｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはＣｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の機能を有するように化学源またはエネルギーを適用すること、及びゲノム遺伝子座の発現変化を任意選択でさらに決定すること、を含み得る。
この化学的誘導系には、異なる設計がいくつか存在する：１．アブシジン酸（ＡＢＡ）によって誘導可能なＡＢＩ－ＰＹＬベースの系（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｓｔｋｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ａｂｓｔｒａｃｔ／ｓｉｇｔｒａｎｓ；４／１６４／ｒｓ２を参照のこと）、２．ラパマイシン（またはラパマイシンに基づく関連化学物質）によって誘導可能なＦＫＢＰ－ＦＲＢベースの系（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｍｅｔｈ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ２／ｎ６／ｆｕｌｌ／ｎｍｅｔｈ７６３．ｈｔｍｌを参照のこと）、３．ジベレリン（ＧＡ）によって誘導可能なＧＩＤ１－ＧＡＩベースの系（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｃｈｅｍｂｉｏ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ８／ｎ５／ｆｕｌｌ／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．９２２．ｈｔｍｌを参照のこと）。
化学的誘導系は、４－ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）によって誘導可能なエストロゲン受容体（ＥＲ）ベースの系であり得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０４／３／１０２７．ａｂｓｔｒａｃｔを参照のこと）。エストロゲン受容体の変異リガンド結合ドメイン（ＥＲＴ２と呼ばれる）は、４－ヒドロキシタモキシフェンが結合すると細胞の核に移行する。本発明の別の実施形態では、任意の核内受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、エストロゲン受容体、エストロゲン関連受容体、糖質コルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体の任意の天然起源の誘導体または操作された誘導体が、ＥＲベースの誘導系と類似の誘導系において使用され得る。
別の誘導系は、エネルギー、熱、またはラジオ波によって誘導可能な一過性受容体電位型（ＴＲＰ）イオンチャネルベースの系を使用する設計に基づくものである（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３３６／６０８１／６０４を参照のこと）。ＴＲＰファミリーのこうしたタンパク質は、光及び熱を含めて、異なる刺激に応答する。このタンパク質が光または熱によって活性化されると、イオンチャネルが開口し、細胞膜へのイオン（カルシウムなど）の流入が可能となる。この流入イオンが、ガイドと、Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体またはＣｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の他の構成要素と、を含むポリペプチドに連結された細胞内イオン相互作用パートナーに結合することになり、この結合によってポリペプチドの細胞内局在化の変化が誘導され、ポリペプチド全体が細胞の核に入ることになる。ガイドタンパク質及びＣｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の他の構成要素は、核内に入ると活性となり、細胞における標的遺伝子の発現を調節することになる。
光による活性化は、有利な実施形態となり得る一方で、光が皮膚または他の臓器に浸透し得ないインビボの適用では特に、不利となり得ることもある。この場合、他のエネルギー活性化方法が企図され、具体的には、同様の作用を有する電場エネルギー及び／または超音波が企図される。
電場エネルギーは、インビボ条件の下で約１ボルト／ｃｍ～約１０ｋボルト／ｃｍの１つまたは複数の電気パルスを使用して、当該技術分野において説明されるように実質的に付与することが好ましい。パルスの代わりに、またはパルスに加えて、連続様式で電場が送達され得る。電気パルスは、１μｓ～５００ミリ秒間、好ましくは、１μｓ～１００ミリ秒間印加され得る。電場は、約５分間、連続的に印加されるか、またはパルス様式で印加され得る。
本明細書で使用される「電場エネルギー」は、細胞が曝露される電気エネルギーである。好ましくは、電場は、インビボ条件の下で約１ボルト／ｃｍ～約１０ｋボルト／ｃｍの強度または約１０ｋボルト／ｃｍ超の強度を有する（ＷＯ９７／４９４５０を参照のこと）。
本明細書で使用される「電場」という用語は、静電容量及び電圧が可変である１つまたは複数のパルスを含み、こうしたパルスには、指数波形及び／または方形波形及び／または被変調波形及び／または被変調方形波形のものが含まれる。電場及び電気に対する言及は、細胞の環境における電位差の存在に対する言及を含むと解釈されるべきである。そのような環境は、当該技術分野において知られるように静電気、交流電流（ＡＣ）、直流電流（ＤＣ）などによって構築され得る。電場は、均一、不均一、またはその他の状態にあり得、時間依存的な様式で強度及び／または方向が変わり得る。
電場を単回または複数回印加することも、超音波を単回または複数回印加することも可能であり、こうした印加は、任意の順序かつ任意の組み合わせで行われる。超音波及び／または電場は、単回もしくは複数回の連続印加として送達されるか、またはパルスとして送達（パルス送達）され得る。
電気穿孔は、外来材料を生細胞に導入するためにインビトロの手順でもインビボの手順でも使用されている。インビトロで適用される場合、生細胞の試料は、目的物質と最初に混合され、電極（平行板など）の間に配置される。次に、電極によって細胞／導入物混合物に電場が印加される。インビトロで電気穿孔を実施する系の例としては、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ＥＣＭ６００製品、及びＥｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｐｏｒａｔｏｒ Ｔ８２０が挙げられ、これらは両方とも、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，ＩｎｃのＢＴＸ Ｄｉｖｉｓｉｏｎによって製造されている（米国特許第５，８６９，３２６号を参照のこと）。
既知の電気穿孔技術（インビトロのものとインビボのものとの両方）は、処理領域の周りに配置された電極に高電圧の短パルスを印加することによって機能する。電極間に生じる電場によって細胞膜が一時的に多孔性となり、そこで目的物質の分子が細胞に導入される。既知の電気穿孔用途では、この電場は、持続時間が約１００．ｍｕ．ｓの１０００Ｖ／ｃｍオーダーの単一の方形波パルスを含む。そのようなパルスは、例えば、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｐｏｒａｔｏｒ Ｔ８２０の既知の印加法で発生し得る。
好ましくは、電場は、インビトロ条件の下で約１Ｖ／ｃｍ～約１０ｋＶ／ｃｍの強度を有する。したがって、電場は、１Ｖ／ｃｍ、２Ｖ／ｃｍ、３Ｖ／ｃｍ、４Ｖ／ｃｍ、５Ｖ／ｃｍ、６Ｖ／ｃｍ、７Ｖ／ｃｍ、８Ｖ／ｃｍ、９Ｖ／ｃｍ、１０Ｖ／ｃｍ、２０Ｖ／ｃｍ、５０Ｖ／ｃｍ、１００Ｖ／ｃｍ、２００Ｖ／ｃｍ、３００Ｖ／ｃｍ、４００Ｖ／ｃｍ、５００Ｖ／ｃｍ、６００Ｖ／ｃｍ、７００Ｖ／ｃｍ、８００Ｖ／ｃｍ、９００Ｖ／ｃｍ、１ｋＶ／ｃｍ、２ｋＶ／ｃｍ、５ｋＶ／ｃｍ、１０ｋＶ／ｃｍ、２０ｋＶ／ｃｍ、５０ｋＶ／ｃｍ、または５０ｋＶ／ｃｍ超の強度を有し得る。より好ましくは、インビトロ条件の下で約０．５ｋＶ／ｃｍ～約４．０ｋＶ／ｃｍである。好ましくは、電場は、インビボ条件の下で約１Ｖ／ｃｍ～約１０ｋＶ／ｃｍの強度を有する。しかしながら、標的部位に送達されるパルスの数を増やす場合には、電場の強度が下げられ得る。したがって、電場強度を下げたパルス電場送達が想定される。
好ましくは、電場の印加は、複数パルスの形態をとるものであり、こうした複数パルスの形態は、強度及び静電容量が同じ二重パルスの形態、あるいは強度及び／または静電容量が異なる連続パルスの形態などである。本明細書で使用される「パルス」という用語は、静電容量及び電圧が可変である１つまたは複数の電気パルスを含み、こうした電気パルスには、指数波形及び／または方形波形及び／または被変調波形／被変調方形波形のものが含まれる。
好ましくは、電気パルスは、指数波形、方形波形、被変調波形、及び被変調方形波形から選択される波形として送達される。
好ましい実施形態では、低電圧で直流電流が利用される。したがって、出願人らは、１Ｖ／ｃｍ～２０Ｖ／ｃｍの電場強度で１００ミリ秒間以上、より好ましくは１５分間以上、細胞、組織、または組織塊に印加される電場の使用を開示する。
超音波は、約０．０５Ｗ／ｃｍ２～約１００Ｗ／ｃｍ２の出力レベルで有利に印加される。診断用または治療用の超音波が使用されるか、またはそれらの組み合わせが使用され得る。
本明細書で使用される「超音波」という用語は、ヒトが聞き取れる範囲を超えるほど高い周波数の機械的振動からなる形態のエネルギーを指す。超音波スペクトルの周波数の下限値は、一般に、約２０ｋＨｚとされ得る。超音波の診断用途の多くでは、１～１５ＭＨｚ’の範囲の周波数が利用される（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｐ．Ｎ．Ｔ．Ｗｅｌｌｓ，ｅｄ．，２ｎｄ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌ．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ［Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｌｏｎｄｏｎ ＆ ＮＹ，１９７７］より）。
超音波は、診断用途でも治療用途でも使用されている。診断ツール（「診断用超音波」）として使用されるとき、超音波は、典型的には、最大約１００ｍＷ／ｃｍ２のエネルギー密度範囲（ＦＤＡの推奨範囲）で使用されるが、最大７５０ｍＷ／ｃｍ２のエネルギー密度が使用されている。理学療法では、超音波は、典型的には、最大約３～４Ｗ／ｃｍ２の範囲（ＷＨＯの推奨範囲）でエネルギー源として使用される。他の治療用途では、より高い強度の超音波が利用される可能性があり、例えば、１００Ｗ／ｃｍ～最大１ｋＷ／ｃｍ２のＨＩＦＵ（またはさらに高い強度のもの）が短時間使用される。本明細書で使用される「超音波」という用語は、診断用超音波、治療用超音波、及び集束超音波を包含することが意図される。
集束超音波（ＦＵＳ）は、侵襲性のプローブを使用せずに熱エネルギーを送達することを可能にするものである（Ｍｏｒｏｃｚ ｅｔ ａｌ １９９８ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１，ｐｐ．１３６－１４２を参照のこと）。別の形態の集束超音波は、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）であり、ＨＩＦＵは、Ｍｏｕｓｓａｔｏｖ ｅｔ ａｌ ｉｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ（１９９８）Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．８，ｐｐ．８９３－９００、及びＴｒａｎＨｕｕＨｕｅ ｅｔ ａｌ ｉｎ Ａｃｕｓｔｉｃａ（１９９７）Ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１１０３－１１０６によって概説されている。
好ましくは、診断用超音波と治療量超音波とが組み合わせて利用される。この組み合わせは、限定を意図するものではなく、むしろ、任意のさまざまな組み合わせで超音波が使用され得ることを当業者なら理解するであろう。さらに、エネルギー密度、超音波の周波数、及び曝露時間も異なり得る。
好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約０．０５～約１００Ｗｃｍ－２の出力密度で行われる。さらにより好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約１～約１５Ｗｃｍ－２の出力密度で行われる。
好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約０．０１５～約１０．０ＭＨｚの周波数で行われる。より好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約０．０２～約５．０ＭＨｚまたは約６．０ＭＨｚの周波数で行われる。最も好ましくは、超音波は、３ＭＨｚの周波数で印加される。
好ましくは、曝露時間は、約１０ミリ秒～約６０分である。好ましくは、曝露時間は、約１秒～約５分である。より好ましくは、超音波は、約２分間印加される。しかしながら、特定の破壊対象標的細胞によっては、曝露時間は長くなり得、例えば、１５分間である。
有利には、標的組織は、約０．０１５～約１０ＭＨｚの範囲の周波数を用いて約０．０５Ｗｃｍ－２～約１０Ｗｃｍ－２の音響出力密度で超音波エネルギー源に曝露される（ＷＯ９８／５２６０９を参照のこと）。しかしながら、代替条件も可能であり、例えば、音響出力密度は１００Ｗｃｍ－２超であるが、時間を短くして超音波エネルギー源への曝露が行われ、例えば、時間をミリ秒範囲以下として１０００Ｗｃｍ－２で曝露が行われる。
好ましくは、超音波の印加は、多重パルスの形態で行われ、したがって、連続波とパルス波（超音波のパルス送達）との両方が、任意の組み合わせで利用され得る。例えば、連続波の超音波が印加された後、パルス波の超音波が印加され得、逆もまた同様である。この印加は、任意の順序かつ組み合わせで、任意の回数、反復して行われ得る。連続波の超音波のバックグラウンドに対してパルス波の超音波が印加され得、任意の数のパルスが、任意の数の群で使用され得る。
好ましくは、超音波は、パルス波の超音波を含み得る。非常に好ましい実施形態では、超音波は、０．７Ｗｃｍ－２または１．２５Ｗｃｍ－２の出力密度で連続波として印加される。パルス波の超音波が使用されるのであれば、より高い出力密度が利用され得る。
超音波は、光と同様に、正確に標的に集束し得るため、超音波を使用することは有利である。さらに、超音波は、光とは異なり、組織のより深い部分に集束し得るため、有利である。したがって、全組織（限定されないが、肝葉など）透過または全臓器（限定されないが、全肝臓もしくは全筋肉（心臓など）など）治療に、超音波はより適している。別の重要な利点は、超音波が、多種多様な診断用途及び治療用途で使用される非侵襲性の刺激であるということである。例として、超音波は、医療用造影技術に加えて、整形治療においてもよく認知されている。さらに、対象脊椎動物への超音波の印加に適した機器は広く利用可能であり、その使用は、当該技術分野においてよく知られている。
特定の実施形態では、ガイド分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の特異性を向上させるために二次構造によって改変され、こうした二次構造によってエキソヌクレアーゼ活性から保護され、ガイド配列への５’付加が可能になり得、こうしたガイド配列は、本明細書では、保護されたガイド分子とも称される。
１つの態様では、本発明は、ガイド分子の配列にハイブリダイズする「プロテクターＲＮＡ」を提供し、「プロテクターＲＮＡ」は、ガイド分子の３’末端に相補的であり、それによって部分的に二本鎖のガイドＲＮＡを生成するＲＮＡ鎖である。本発明のある１つの実施形態では、完全に相補的なプロテクター配列でミスマッチ塩基（すなわち、ガイド分子のうちでガイド配列の一部を形成しない塩基）を保護することで、３’末端におけるミスマッチ塩基対に標的ＤＮＡが結合する可能性が低減される。本発明の特定の実施形態では、ガイドがガイド分子内にプロテクター配列を含むように長さが延長された追加の配列もガイド分子内に存在し得る。この「プロテクター配列」によって、「露出配列」（ガイド配列のうちで標的配列にハイブリダイズする部分を含む）に加えて「保護配列」をガイド分子が確実に含むようになる。特定の実施形態では、ガイド分子は、二次構造（ヘアピンなど）を含めるためにプロテクターガイドを存在させることによって改変される。有利には、保護配列、ガイド配列、または両方、に対する相補性を有する３または４～３０以上（例えば、約１０以上）の連続塩基対が存在する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系がその標的と相互作用する熱力学が、保護部分によって妨害されないことが有利である。部分的に二本鎖のガイド分子を含めて、そのような延長を行うことによって、ガイド分子が保護されると考えられ、結果的に、特異的な活性を維持しながらＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の特異的な結合が改善される。
特定の実施形態では、切断型ガイド（ｔｒｕ－ガイド）が使用され、ｔｒｕ－ガイドは、すなわち、標準的なガイド配列長に対して長さが切り詰められたガイド配列を含むガイド分子である。Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１６）４４（２０）：９５５５－９５６４）によって説明されるように、そのようなガイドによって、標的ＤＮＡを切断することなく、触媒的に活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素をその標的に結合させることが可能となり得る。特定の実施形態では、標的の結合を可能にするが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素のニッカーゼ活性のみを残す切断型ガイドが使用される。
Ｃｒｉｓｐｒ－Ｃａｓ酵素
本明細書で提供される方法のある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、触媒活性が低減されるか、または触媒活性を有さない。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がＣｐｆ１タンパク質である場合、変異には、限定されないが、触媒性のＲｕｖＣ様ドメインにおける１つまたは複数の変異が含まれ得、こうした変異は、ＡｓＣｐｆ１における位置を基準にするとＤ９０８ＡまたはＥ９９３Ａなどである。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、変異酵素のＤＮＡ切断活性が、当該酵素の非変異形態のＤＮＡ切断活性の約２５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下、約０．０１％以下、または約０．０１％未満であるとき、実質的にすべてのＤＮＡ切断活性を失っていると考えられ、変異形態のＤＮＡ切断活性が、非変異形態と比較して皆無または無視できる場合を例として挙げることができる。こうした実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、包括的なＤＮＡ結合タンパク質として使用される。変異は、人工的に導入される変異であるか、または機能獲得型もしくは機能喪失型の変異であり得る。
上記の変異に加えて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、さらに改変され得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質に関して本明細書で使用される「改変」という用語は、一般に、その由来元である野生型Ｃａｓタンパク質と比較して１つまたは複数の改変または変異（点変異、切り詰め、挿入、欠失、キメラ、融合タンパク質などを含む）を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を指す。由来は、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという意味において由来酵素の大部分は野生型に基づくものであるが、当業者に知られるか、または本明細書に記載の何らかの方法で由来酵素への変異導入（改変）がなされているということを意味する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を追加改変すると、機能性の変化が生じることも生じないこともあり得る。例として、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質に関しては特に、機能性の変化が生じない改変には、例えば、発現のために特定の宿主向けにコドンを最適化すること、またはヌクレアーゼに特定のマーカーを付加して提供すること（例えば、可視化のために行われる）、が含まれる。機能性の変化が生じ得る改変にもまた、変異が含まれ得、こうした変異には、点変異、挿入、欠失、切り詰め（ヌクレアーゼの分割を含む）などが含まれる。融合タンパク質には、限定されないが、例えば、異種ドメインまたは機能ドメイン（例えば、局在化シグナル、触媒ドメインなど）との融合体が含まれ得る。ある特定の実施形態では、さまざまな異なる改変が組み合わせられ得る（例えば、触媒的に不活性な変異ヌクレアーゼが、例えば、ＤＮＡメチル化または別の核酸改変などを導入するために機能ドメインにさらに融合されることが挙げられ、上記の別の核酸改変には、限定されないが、分断（例えば、異なるヌクレアーゼ（ドメイン）によるもの）、変異、欠失、挿入、置き換え、ライゲーション、消化、切断、または組換えなどが含まれる）。本明細書で使用される「機能性の変化」は、限定されないが、特異性の変化（例えば、標的認識の変化、特異性の向上（例えば、Ｃａｓタンパク質の「増強」）もしくは特異性の低下、またはＰＡＭ認識の変化）、活性の変化（例えば、触媒活性の上昇もしくは低下（触媒的に不活性なヌクレアーゼもしくはニッカーゼを含む））、及び／または安定性の変化（例えば、不安定化ドメインとの融合）を含む。適切な異種ドメインには、限定されないが、ヌクレアーゼ、リガーゼ、修復タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、（ウイルス）インテグラーゼ、リコンビナーゼ、トランスポゼース、アルゴノート、シチジンデアミナーゼ、レトロン、グループＩＩイントロン、ホスファターゼ、ホスホリラーゼ、スルフリラーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼなどが含まれる。当該技術分野では、こうした改変のすべてについて、その例が知られている。本明細書で称される「改変」ヌクレアーゼ、及び具体的には「改変」Ｃａｓまたは「改変」ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系もしくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、好ましくは、（例えば、ガイド分子との複合体の状態で）ポリ核酸と相互作用またはポリ核酸に結合する能力を依然として有することが理解されよう。そのような改変Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載のデアミナーゼタンパク質またはその活性ドメインと組み合わせることができる。
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、活性及び／または特異性が増進する改変を１つまたは複数含み得、こうした改変には、標的鎖または非標的鎖を安定化させる残基への変異導入などが含まれる（例えば、ｅＣａｓ９；“Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５１（６２６８）：８４－８８（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。ある特定の実施形態では、操作されたＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性変化または活性改変は、標的化効率の向上またはオフターゲット結合の低減を含む。ある特定の実施形態では、操作されたＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性の変化は、切断活性の改変を含む。ある特定の実施形態では、活性の変化は、標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関する切断活性の上昇を含む。ある特定の実施形態では、活性の変化は、標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関する切断活性の低下を含む。ある特定の実施形態では、活性の変化は、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座に関する切断活性の低下を含む。ある特定の実施形態では、改変ヌクレアーゼの活性変化または活性改変は、ヘリカーゼ動力学の変化を含む。ある特定の実施形態では、改変ヌクレアーゼは、ＲＮＡを含む核酸分子と当該タンパク質との結合（Ｃａｓタンパク質の場合）、または標的ポリヌクレオチド遺伝子座の鎖と当該タンパク質との結合、またはオフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座の鎖と当該タンパク質との結合、を変化させる改変を含む。本発明のある１つの態様では、操作されたＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を変化させる改変を含む。ある特定の実施形態では、活性の変化は、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座に関する切断活性の上昇を含む。したがって、ある特定の実施形態では、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座と比較して標的ポリヌクレオチド遺伝子座に対する特性が向上する。他の実施形態では、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座と比較して標的ポリヌクレオチド遺伝子座に対する特異性が低下する。ある特定の実施形態では、変異によってオフターゲット効果（例えば、切断または結合の特性、活性、または動力学）が低減され、例えば、Ｃａｓタンパク質などの場合、標的とガイドＲＮＡとの間のミスマッチに対する許容度が低下する。他の変異では、オフターゲット効果（例えば、切断または結合の特性、活性、または動力学）が増加し得る。他の変異では、オンターゲット効果（例えば、切断または結合の特性、活性、または動力学）が増加または減少し得る。ある特定の実施形態では、変異によって機能性ヌクレアーゼ複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体）のヘリカーゼ活性、結合、または形成が変化（例えば、増加または減少）する。ある特定の実施形態では、上記のように、変異によってＰＡＭ認識が変化し、すなわち、非改変Ｃａｓタンパク質と比較して異なるＰＡＭが（付加的または代替的に）認識され得る。特に好ましい変異には、特異性を増進させるために正荷電残基及び／または（進化的に）保存された残基（保存された正荷電残基など）におけるものが含まれる。ある特定の実施形態では、そのような残基は、変異導入が行われて非荷電残基（アラニンなど）とされ得る。
塩基除去修復阻害剤
いくつかの実施形態では、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、塩基除去修復（ＢＥＲ）阻害剤をさらに含む。いずれの特定の理論によっても拘束されることは望まないが、Ｉ：Ｔ対形成の存在に対する細胞ＤＮＡ修復応答は、細胞における核酸塩基編集効率の低下の原因となり得る。アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＤＮＡ－３－メチルアデニングリコシラーゼ、３－アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、またはＮ－メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼとしても知られる）は、細胞におけるＤＮＡからのヒポキサンチンの除去を触媒し、これによって塩基除去修復が始まることによって、結果としてＩ：Ｔ対がＡ：Ｔ対へと復帰し得る。
いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ポリペプチド阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ヒポキサンチンに結合するタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ＤＮＡにおけるヒポキサンチンに結合するタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、触媒的に不活性なアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼタンパク質またはその結合ドメインである。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、ＤＮＡからヒポキサンチンを除去しない触媒的に不活性なアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼタンパク質またはその結合ドメインである。アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害（例えば、立体的に遮断）する能力を有する他の酵素もまた、本開示の範囲に入る。さらに、塩基除去修復を遮断または阻害する任意のタンパク質もまた、本開示の範囲に入る。
いずれの特定の理論によっても拘束されることは望まないが、塩基除去修復は、編集された鎖に結合する分子、編集された塩基を遮断する分子、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼを阻害する分子、塩基除去修復を阻害する分子、編集された塩基を保護する分子、及び／または編集されていない鎖の固定を促進する分子、によって阻害され得る。本明細書に記載のＢＥＲ阻害剤を使用することで、ＡからＩへの変更を触媒する能力を有するアデノシンデアミナーゼの編集効率を向上させることができると考えられる。
したがって、上に論じられるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の第１の設計では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアデノシンデアミナーゼは、ＢＥＲ阻害剤（例えば、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤）に融合または連結され得る。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、下記の構造（ｎＣｐｆ１＝Ｃｐｆ１ニッカーゼ、ｄＣｐｆ１＝不活性型Ｃｐｆ１）のうちの１つに含まれ得る：
［ＡＤ］－［任意選択のリンカー］－［ｎＣｐｆ１／ｄＣｐｆ１］－［任意選択のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］、
［ＡＤ］－［任意選択のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］－［任意選択のリンカー］－［ｎＣｐｆ１／ｄＣｐｆ１］、
［ＢＥＲ阻害剤］－［任意選択のリンカー］－［ＡＤ］－［任意選択のリンカー］－［ｎＣｐｆ１／ｄＣｐｆ１］、
［ＢＥＲ阻害剤］－［任意選択のリンカー］－［ｎＣｐｆ１／ｄＣｐｆ１］－［任意選択のリンカー］－［ＡＤ］、
［ｎＣｐｆ１／ｄＣｐｆ１］－［任意選択のリンカー］－［ＡＤ］－［任意選択のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］、
［ｎＣｐｆ１／ｄＣｐｆ１］－［任意選択のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］－［任意選択のリンカー］－［ＡＤ］。
同様に、上に論じられるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の第２の設計では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、アデノシンデアミナーゼ、またはアダプタータンパク質は、ＢＥＲ阻害剤（例えば、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤）に融合または連結され得る。いくつかの実施形態では、ＢＥＲ阻害剤は、下記の構造（ｎＣｐｆ１＝Ｃｐｆ１ニッカーゼ、ｄＣｐｆ１＝不活性型Ｃｐｆ１）のうちの１つに含まれ得る：
［ｎＣｐｆ１／ｄＣｐｆ１］－［任意選択のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］、
［ＢＥＲ阻害剤］－［任意選択のリンカー］－［ｎＣｐｆ１／ｄＣｐｆ１］、
［ＡＤ］－［任意選択のリンカー］－［アダプター］－［任意選択のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］、
［ＡＤ］－［任意選択のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］－［任意選択のリンカー］－［アダプター］、
［ＢＥＲ阻害剤］－［任意選択のリンカー］－［ＡＤ］－［任意選択のリンカー］－［アダプター］、
［ＢＥＲ阻害剤］－［任意選択のリンカー］－［アダプター］－［任意選択のリンカー］－［ＡＤ］、
［アダプター］－［任意選択のリンカー］－［ＡＤ］－［任意選択のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］、
［アダプター］－［任意選択のリンカー］－［ＢＥＲ阻害剤］－［任意選択のリンカー］－［ＡＤ］。
上に論じられるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の第３の設計では、ＢＥＲ阻害剤は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の内部ループまたは非構造化領域に挿入され得る。
核への標的化
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、目的標的遺伝子座におけるアデニンを改変することに関し、標的遺伝子座は、細胞内に含まれる。本発明の方法において使用されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインの核への標的化を改善するためには、こうした構成要素のうちの１つまたは両方を１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）とともに提供することが有利であり得る。
好ましい実施形態では、本発明と関連して使用されるＮＬＳは、タンパク質に対して異種のものである。ＮＬＳの例としては、限定されないが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３７）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号３８）というアミノ酸配列を有する、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原のＮＬＳと、ヌクレオプラスミンに由来するＮＬＳ（例えば、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３９）という配列を有する、ヌクレオプラスミンの二分ＮＬＳ）と、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号４０）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号４１）というアミノ酸配列を有する、ｃ－ｍｙｃのＮＬＳと、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号４２）という配列を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９のＮＬＳと、インポーチン－アルファに由来するＩＢＢドメインのＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号４３）という配列と、筋腫Ｔタンパク質のＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号４４）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号４５）という配列と、ヒトのｐ５３のＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号４６）という配列と、マウスのｃ－ａｂｌ ＩＶのＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号４７）という配列と、インフルエンザウイルスのＮＳ１のＤＲＬＲＲ（配列番号４８）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号４９）という配列と、肝炎ウイルスのデルタ抗原のＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号５０）という配列と、マウスのＭｘ１タンパク質のＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号５１）という配列と、ヒトのポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼのＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号５２）という配列と、ステロイドホルモン受容体（ヒト）糖質コルチコイドのＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号５３）という配列と、に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、１つまたは複数のＮＬＳは、ＤＮＡ標的化Ｃａｓタンパク質が真核細胞の核に検出可能な量で蓄積するように誘導する上で十分な強度を有するものである。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質におけるＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ（複数可）、またはこうした因子の組み合わせ、に由来し得る。核における蓄積の検出は、任意の適切な技術によって実施され得る。例えば、核局在を検出するための手段（例えば、核に特異的な染色剤（ＤＡＰＩなど））と組み合わせるなどして細胞内の位置を可視化し得るように、検出可能なマーカーが核酸標的化タンパク質に融合され得る。細胞核を細胞から単離することもでき、次いで、核酸標的化タンパク質の含量が、任意の適切なタンパク質検出プロセス（免疫組織化学、ウエスタンブロット、または酵素活性アッセイなど）によって分析され得る。核における蓄積は間接的に決定することもでき、この決定は、標的配列に対する核酸標的化複合体形成の作用に対するアッセイ（例えば、デアミナーゼ活性に対するアッセイ）、あるいはＤＮＡ標的化複合体形成及び／またはＤＮＡ標的化による影響を受ける遺伝子発現活性の変化に対するアッセイなどによって行われ、こうしたアッセイでは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びデアミナーゼタンパク質に曝露されない対照との比較が行われるか、または１つもしくは複数のＮＬＳを含まないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはデアミナーゼタンパク質に曝露された対照との比較が行われる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはアデノシンデアミナーゼタンパク質は、１つまたは複数の異種ＮＬＳ（２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれ以上の異種ＮＬＳなど）とともに提供され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、アミノ末端もしくはアミノ末端付近にＮＬＳを、約１つ以上、約２つ以上、約３つ以上、約４つ以上、約５つ以上、約６つ以上、約７つ以上、約８つ以上、約９つ以上、約１０個以上、もしくはそれ以上含むか、カルボキシ末端もしくはカルボキシ末端付近にＮＬＳを、約１つ以上、約２つ以上、約３つ以上、約４つ以上、約５つ以上、約６つ以上、約７つ以上、約８つ以上、約９つ以上、約１０個以上、もしくはそれ以上含むか、またはこれらの組み合わせを含む（例えば、アミノ末端にＮＬＳを含まないか、またはアミノ末端にＮＬＳを少なくとも１つまたは複数含み、カルボキシ末端にＮＬＳを含まないか、またはカルボキシ末端にＮＬＳを１つまたは複数含む）。ＮＬＳが複数存在するとき、ＮＬＳはそれぞれ、その他のＮＬＳとは独立して選択され得、その結果、単一種のＮＬＳは、複数のコピーが存在し、及び／または１つもしくは複数のコピーが存在する１種もしくは複数種の他のＮＬＳと組み合わせられ得る。いくつかの実施形態では、ＮＬＳのうちでＮ末端またはＣ末端に最も近いアミノ酸が、Ｎ末端またはＣ末端からポリペプチド鎖に沿って数えて約１アミノ酸以内、２アミノ酸以内、３アミノ酸以内、４アミノ酸以内、５アミノ酸以内、１０アミノ酸以内、１５アミノ酸以内、２０アミノ酸以内、２５アミノ酸以内、３０アミノ酸以内、４０アミノ酸以内、５０アミノ酸以内、またはそれ以上の範囲内に存在するとき、ＮＬＳは、Ｎ末端付近またはＣ末端付近に存在すると考えられる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の好ましい実施形態では、タンパク質のＣ末端にＮＬＳが付加される。
本明細書で提供される方法のある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びデアミナーゼタンパク質は、別々のタンパク質として、細胞に送達されるか、または細胞内に発現する。こうした実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びデアミナーゼタンパク質はそれぞれ、本明細書に記載のＮＬＳの１つまたは複数とともに提供され得る。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びデアミナーゼタンパク質は、１つの融合タンパク質として、細胞に送達されるか、または細胞で発現する。こうした実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びデアミナーゼタンパク質のうちの１つまたは両方は、１つまたは複数のＮＬＳとともに提供される。アデノシンデアミナーゼが、上記のアダプタータンパク質（ＭＳ２など）に融合される場合、１つまたは複数のＮＬＳは、アダプタータンパク質に付加されて提供され得るが、但し、これによってアプタマーの結合が妨害されないことが条件である。特定の実施形態では、１つまたは複数のＮＬＳ配列は、アデノシンデアミナーゼとＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質との間のリンカー配列としても機能し得る。
ある特定の実施形態では、本発明のガイドは、アダプタータンパク質に対する特異的な結合部位（例えば、アプタマー）を含み、アダプタータンパク質は、アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインに連結または融合され得る。そのようなガイドが、ＣＲＩＳＰＲ複合体（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がガイド及び標的に結合しているもの）を形成し、アダプタータンパク質が結合すると、アダプタータンパク質と結合しているアデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインは、備わった機能が有効となる上で有利な空間的配向をとるように配置される。
アダプター＋アデノシンデアミナーゼの結合を可能にするが、（例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の三次元構造内の立体障害に起因して）アダプター＋アデノシンデアミナーゼが適切に配置されないガイド改変は、意図されない改変であることを当業者なら理解するであろう。１つまたは複数の改変ガイドは、本明細書に記載のように、テトラループ、ステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３が改変され、好ましくはテトラループまたはステムループ２が改変され、最も好ましくはテトラループとステムループ２との両方が改変され得る。
触媒的に不活性な独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の使用
特定の実施形態では、触媒的に不活性な独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と組み合わせてＣｐｆ１ニッカーゼを使用することで、当該Ｃｐｆ１ニッカーゼの効率が向上する（このことは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８：１４９５８；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４９５８に記載されている）。より具体的には、触媒的に不活性な独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系において使用されるＣｐｆ１ニッカーゼとはＰＡＭ認識部位が異なることによって特徴付けられ、対応ガイド配列は、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系のＣｐｆ１ニッカーゼの標的配列付近に位置する標的配列に結合するように選択される。本発明と関連して使用される触媒的に不活性な独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の一部を形成するものではなく、単に、当該Ｃｐｆ１ニッカーゼの効率の向上させるために機能するものにすぎず、当該ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を対象として当該技術分野において説明される標準的なガイド分子と組み合わせて使用される。特定の実施形態では、当該触媒的に不活性な独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、不活性型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質であり、すなわち、当該ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性を消失させる１つまたは複数の変異を含むものである。特定の実施形態では、触媒的に不活性な独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１ニッカーゼの標的配列付近に位置する標的配列にハイブリダイズする能力を有する２つ以上のガイド分子とともに提供される。特定の実施形態では、当該触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の標的化のために少なくとも２つのガイド分子が使用され、当該少なくとも２つのガイド分子のうちの少なくとも１つのガイド分子は、Ｃｐｆ１ニッカーゼの標的配列の５”側に位置する標的配列にハイブリダイズする能力を有し、当該少なくとも２つのガイド分子のうちの少なくとも１つのガイド分子は、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系のＣｐｆ１ニッカーゼの標的配列の３’側に位置する標的配列にハイブリダイズする能力を有し、当該１つまたは複数の標的配列は、Ｃｐｆ１ニッカーゼの標的配列と同じまたは逆のＤＮＡ鎖上に存在し得る。特定の実施形態では、触媒的に不活性な独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のガイド分子のためのガイド配列は、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲの標的化（すなわち、Ｃｐｆ１ニッカーゼの標的化）のためのガイド分子の標的配列付近に標的配列が位置するように選択される。特定の実施形態では、触媒的に不活性な独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の１つまたは複数の標的配列はそれぞれ、Ｃｐｆ１ニッカーゼの標的配列と離れており、その分離距離は、５塩基を超えるが、４５０塩基対には満たない。触媒的に不活性な独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質とともに使用するためのガイドの標的配列と、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の標的配列と、の間の最適距離を、当業者なら決定することができる。特定の実施形態では、独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、クラスＩＩのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質である。特定の実施形態では、独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、クラスＩＩのＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質である。特定の実施形態では、触媒的に不活性な独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である。特定の実施形態では、触媒的に不活性な独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、本明細書の他の箇所に記載ように、そのＰＡＭ特異性が変化するように改変されている。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質ニッカーゼは、それ自体によるヒト細胞における活性の制限は有するものの、不活性な独立したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、及び１つまたは複数の対応する近位ガイドと組み合わせることによって必要ニッカーゼ活性が確保されるニッカーゼである。
ＣＲＩＳＰＲの開発及び使用
本発明は、下記の文献に示されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの開発及び使用の態様に基づいてさらに例示及び拡張され得るものであり、このことは、具体的には、細胞及び生物におけるＣＲＩＳＰＲタンパク質複合体の送達及びＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼの使用に関する：
・Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９－２３（２０１３）、
・ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊｉａｎｇ Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ Ｄ．，Ｃｏｘ Ｄ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ＬＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｍａｒ；３１（３）：２３３－９（２０１３）、
・Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｗａｎｇ Ｈ．，Ｙａｎｇ Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．Ｃｅｌｌ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０－８（２０１３）、
・Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．Ａｕｇ ２２；５００（７４６３）：４７２－６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ ２３（２０１３）、
・Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ Ａｕｇ ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２－８６７４（１３）０１０１５－５（２０１３－Ａ）、
・ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）、
・Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１－３０８（２０１３－Ｂ）、
・Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）、
・Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ Ｆｅｂ ２７，１５６（５）：９３５－４９（２０１４）、
・Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｗｕ Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ．，Ｋｒｉｚ ＡＪ．，Ｃｈｉｕ ＡＣ．，Ｈｓｕ ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｒ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９（２０１４）、
・ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｙｉｍ ＭＪ，Ｓｗｉｅｃｈ Ｌ，Ｋｅｍｐｔｏｎ ＨＲ，Ｄａｈｌｍａｎ ＪＥ，Ｐａｒｎａｓ Ｏ，Ｅｉｓｅｎｈａｕｒｅ ＴＭ，Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ Ｍ，Ｇｒａｈａｍ ＤＢ，Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ Ｓ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｘａｖｉｅｒ ＲＪ，Ｌａｎｇｅｒ Ｒ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＧ，Ｈａｃｏｈｅｎ Ｎ，Ｒｅｇｅｖ Ａ，Ｆｅｎｇ Ｇ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｃｅｌｌ １５９（２）：４４０－４５５ ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４（２０１４）、
・Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｃｅｌｌ．Ｊｕｎ ５；１５７（６）：１２６２－７８（２０１４）、
・Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｎｇ Ｔ，Ｗｅｉ ＪＪ，Ｓａｂａｔｉｎｉ ＤＭ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｊａｎｕａｒｙ ３；３４３（６１６６）：８０－８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１（２０１４）、
・Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｄｏｅｎｃｈ ＪＧ，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ Ｅ，Ｇｒａｈａｍ ＤＢ，Ｔｏｔｈｏｖａ Ｚ，Ｈｅｇｄｅ Ｍ，Ｓｍｉｔｈ Ｉ，Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒ Ｍ，Ｅｂｅｒｔ ＢＬ，Ｘａｖｉｅｒ ＲＪ，Ｒｏｏｔ ＤＥ．，（２０１４年９月３日にオンラインで公開）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｄｅｃ；３２（１２）：１２６２－７（２０１４）、
・Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９，Ｓｗｉｅｃｈ Ｌ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ａ，Ｈａｂｉｂ Ｎ，Ｌｉ Ｙ，Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ Ｊ，Ｓｕｒ Ｍ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（２０１４年１０月１９日にオンラインで公開）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊａｎ；３３（１）：１０２－６（２０１５）、
・Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｊｏｕｎｇ Ｊ，Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ＯＯ，Ｂａｒｃｅｎａ Ｃ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈａｂｉｂ Ｎ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＳ，Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ Ｈ，Ｎｕｒｅｋｉ Ｏ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｊａｎ ２９；５１７（７５３６）：５８３－８（２０１５）、
・Ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｖｏｌｚ ＳＥ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（２０１５年２月２日にオンラインで公開）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｆｅｂ；３３（２）：１３９－４２（２０１５）、
・Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｓａｎｊａｎａ ＮＥ，Ｚｈｅｎｇ Ｋ，Ｓｈａｌｅｍ Ｏ，Ｌｅｅ Ｋ，Ｓｈｉ Ｘ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｐａｎ ＪＱ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ Ｒ，Ｌｅｅ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｃｅｌｌ １６０，１２４６－１２６０，Ｍａｒｃｈ １２，２０１５（マウスにおけるマルチプレックススクリーニング）、及び
・Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９，Ｒａｎ ＦＡ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｙａｎ ＷＸ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＳ，Ｋｒｉｚ ＡＪ，Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｓｈａｌｅｍ Ｏ，Ｗｕ Ｘ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，（２０１５年４月１日にオンラインで公開），Ｎａｔｕｒｅ．Ａｐｒ ９；５２０（７５４６）：１８６－９１（２０１５）。
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，２９９－３１１（Ｍａｙ ２０１５）。
・Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ，”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５，１１４７－１１５７（Ａｕｇｕｓｔ ２０１５）。
・Ｐａｒｎａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｄｉｓｓｅｃｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ，”Ｃｅｌｌ １６２，６７５－６８６（Ｊｕｌｙ ３０，２０１５）。
・Ｒａｍａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ，”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：１０８３３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０８３３（Ｊｕｎｅ ２，２０１５）
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９，”Ｃｅｌｌ １６２，１１１３－１１２６（Ａｕｇ．２７，２０１５）
・ＢＣＬ１１Ａ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｃａｎｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２７（７５７７）：１９２－７（Ｎｏｖ．１２，２０１５）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１５５２１．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｓｅｐ １６。
・Ｃｐｆ１ Ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３，７５９－７１（Ｓｅｐ ２５，２０１５）。
・Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０（３），３８５－３９７ ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８ Ｅｐｕｂ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２２，２０１５。
・Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６ Ｊａｎ １ ３５１（６２６８）：８４－８８ ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｄｅｃ １。
・Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｐｆ１ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，”ｂｉｏＲｘｉｖ ０９１６１１；ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０９１６１１（Ｄｅｃ．４，２０１６）。
これらの文献はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれ、本発明の実施において考慮され得るものであり、以下に簡潔に論じられる：
・Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９と、これに加えてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９と、の両方に基づいて、真核細胞において使用するためにＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を操作し、短いＲＮＡによってＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導することで、ヒト細胞及びマウス細胞においてＤＮＡの正確な切断を誘導できることを示した。著者らの研究では、ニッキング酵素に変換されたＣａｓ９を使用することで変異原性活性を最小化しつつ真核細胞における相同組換え修復を促進できることがさらに示された。さらに、著者らの研究では、複数のガイド配列を単一のＣＲＩＳＰＲアレイにコードすることで、哺乳類ゲノム内の内在性ゲノム遺伝子座におけるいくつかの部位の同時編集が可能になり得ることが示され、これによって、このＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ技術が、容易にプログラムでき、幅広い適用可能性を有するものであることが示された。細胞における配列特異的なＤＮＡ切断をプログラムするためにＲＮＡを使用するこの能力によって、新たなクラスのゲノム工学ツールが定義された。こうした研究では、他にもＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を哺乳類細胞に移植できる可能性があり、そうした移植ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が哺乳類ゲノムの切断も媒介できることがさらに示された。重要なことは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の側面のいくつかを、その効率及び汎用性が向上するようにさらに改善できることが想定できるということである。
・Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがデュアルＲＮＡと複合体化したものを使用することで、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのゲノムへの正確な変異導入を行った。この手法は、標的ゲノム部位がデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９誘導型の切断を受ける結果、変異が導入されなかった細胞が死滅することに依存しており、この手法では、選択可能マーカーまたは対抗選択系が必要なくなる。この研究では、短いＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の配列を変更することによってデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９の特異性を再プログラムして、編集テンプレートに持たせた単一ヌクレオチドまたは複数ヌクレオチドの変更を施すことが報告された。この試験では、２つのｃｒＲＮＡを同時使用することで、変異導入のマルチプレックス化が可能になることが示された。さらに、この手法をリコンビニアリングと組み合わせて使用すると、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは、記載の手法を使用して回収された細胞のほぼ１００％が所望の変異を含んでおり、Ｅ．ｃｏｌｉでは、回収された細胞の６５％が当該変異を含んでいた。
・複数の遺伝子に変異を保有するマウスは、胚性幹細胞において連続的な組換えを行い、及び／または単一の変異を有するマウスを多大な時間をかけて交雑させることによって、複数段階を経て従来は作成されていたが、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、当該マウスを一段階で作成するためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、機能的に重複する遺伝子及びエピスタシス遺伝子相互作用のインビボの研究を大幅に加速させるであろう。
・ＤＮＡ結合ドメインベースの、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素、さらには転写活性化因子様エフェクターについても光学的及び化学的な制御を可能にする汎用的かつ頑健な技術に対するニーズが当該技術分野には存在しており、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、このニーズに応えたものである。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３－Ａ）は、標的化された二本鎖切断を導入するために、対をなすガイドＲＮＡとＣａｓ９ニッカーゼ変異体を組み合わせた手法について記載した。微生物のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に由来するＣａｓ９ヌクレアーゼは、ガイド配列によって特定のゲノム遺伝子座を標的とするものであるが、こうしたＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的に対するある特定のミスマッチを許容し、それによって望ましくないオフターゲット変異導入を促進し得るという問題を有しており、上記の手法は、この問題に対処するものである。ゲノムにおける個々のニックは、高い忠実度で修復されるため、二本鎖切断を生じさせるには、適切に距離をとったガイドＲＮＡを介して同時にニックを入れることが必要であり、こうして同時にニックを入れることで、標的を切断するために特異的に認識される塩基の数が増える。著者らは、ニックを対にして入れることで、細胞株においてオフターゲット活性を５０～１，５００倍低減し、オンターゲット切断効率を犠牲にすることなく、マウスの接合体にける遺伝子ノックアウトを促進できることを示した。この汎用的な方針は、高い特異性が必要となる多種多様なゲノム編集適用を可能にするものである。
・Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、標的部位の選択に関する知見を広めるとともに、オフターゲット効果を回避するために、ヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９の標的化特異性を特徴付けた。この研究では、７００超のガイドＲＮＡバリアントと、２９３Ｔ細胞及び２９３ＦＴ細胞における１００超の予測オフターゲットゲノム遺伝子座にＳｐＣａｓ９によって導入されたインデル変異のレベルと、が評価された。異なる位置におけるガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチが、ミスマッチの数、位置、及び分布に影響を受ける配列依存的な様式でＳｐＣａｓ９によって許容されることが著者らによって示された。ＳｐＣａｓ９介在性の切断がＤＮＡメチル化による影響を受けず、ＳｐＣａｓ９及びガイドＲＮＡの使用量を設定することでオフターゲット改変を最小化できることも著者らによってさらに示された。さらに、哺乳類におけるゲノム工学の適用を促進するために、標的配列の選択及び検証、ならびにオフターゲット分析を支援するウェブベースのソフトウェアツールを提供することが著者らによって報告された。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３－Ｂ）は、哺乳類細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）を介するＣａｓ９介在性のゲノム編集、ならびに下流の機能研究のための改変細胞株の生成、を行うためのツールセットについて記載している。オフターゲット切断を最小化するために、対をなすガイドＲＮＡとともにＣａｓ９ニッカーゼ変異体を使用してニックを二重に入れる方針について著者らはさらに記載している。標的部位の選択、切断効率の評価、及びオフターゲット活性の分析に対する指針が、著者らが提供したプロトコルによって実験的に得られた。この研究では、標的の設計から始まり、早ければ１～２週間以内に遺伝子改変を達成でき、２～３週間以内に改変クローン細胞株を得ることができることが示された。
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．は、ゲノム規模で遺伝子機能を調べる新たな方法について記載している。著者らの研究では、６４，７５１個の特有のガイド配列を用いて１８，０８０個の遺伝子を標的としたゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリーを送達することによって、ヒト細胞における負の選択によるスクリーニングも正の選択によるスクリーニングも可能になることが示された。ＧｅＣＫＯライブラリーを使用することで、がん及び多能性幹細胞における細胞生存能に必要不可欠な遺伝子が同定されることが著者らによって最初に示された。次に、著者らは、消失するとベムラフェニブ（変異キナーゼタンパク質であるＢＲＡＦを阻害する治療剤）に対する抵抗性に関与する遺伝子をメラノーマモデルにおいてスクリーニングした。著者らの研究では、最も高く順位付けられる候補には、以前に検証されたＮＦ１遺伝子及びＭＥＤ１２遺伝子に加えて、新規にヒットしたＮＦ２遺伝子、ＣＵＬ３遺伝子、ＴＡＤＡ２Ｂ遺伝子、及びＴＡＤＡ１遺伝子が含まれたことが示された。著者らの観察では、同じ遺伝子を標的とする独立したガイドＲＮＡの間に高いレベルの一貫性が存在し、ヒット率が高いことが確認されており、したがって、Ｃａｓ９を用いたゲノム規模のスクリーニングが有望であることが著者らによって示された。
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．は、ｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体を形成したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９の結晶構造を２．５Åの分解能で報告した。この結晶構造から、標的認識ローブ及びヌクレアーゼローブという２つのローブから構成される構造様式が存在しており、これら２つのローブによって、それらの界面に位置する正に荷電した溝にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖が収容されることが明らかとなった。認識ローブは、ｓｇＲＮＡ及びＤＮＡへの結合に必要不可欠である一方で、ヌクレアーゼローブは、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含んでおり、これらのヌクレアーゼドメインは、それぞれ標的ＤＮＡの相補鎖及び非相補鎖を切断するために適切に配置されている。ヌクレアーゼローブは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）との相互作用を担うカルボキシル末端ドメインも含む。この高分解能構造及び付随する機能解析によって、Ｃａｓ９がＲＮＡにガイドされてＤＮＡを標的とする分子機構が明らかにされており、これによって、新たな汎用性のゲノム編集技術を合理的に設計するための道が開かれている。
・Ｗｕ ｅｔ ａｌ．は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）にシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を組み込み、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）における当該ｄＣａｓ９の結合部位をゲノム規模でマッピングした。試験した４つのｓｇＲＮＡのそれぞれによって、数十～数千のゲノム部位がｄＣａｓ９の標的となり、こうしたゲノム部位は、ｓｇＲＮＡにおける５－ヌクレオチドシード領域、及びＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）によって高頻度で特徴付けられることが著者らによって示された。クロマチンへ接近しにくい場合、シード配列がマッチする他の部位へのｄＣａｓ９の結合が減少しており、それ故に、オフターゲット部位の７０％が遺伝子と関連している。触媒的に活性なＣａｓ９をトランスフェクションしたｍＥＳＣにおいて２９５個のｄＣａｓ９結合部位を標的としてシークエンシングした結果、バックグラウンドレベルを超えて変異したことが同定された部位は１つのみであったことが著者らによって示された。著者らは、Ｃａｓ９の結合及び切断についての二状態モデルを提唱しており、このモデルは、シードのマッチによって結合が引き起こされるが、切断が生じるには、標的ＤＮＡとの広範な対形成が必要であるというものである。
・Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．は、Ｃｒｅ依存性Ｃａｓ９ノックインマウスを確立した。神経細胞、免疫細胞、及び内皮細胞におけるガイドＲＮＡのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）介在性の送達、レンチウイルス介在性の送達、または粒子介在性の送達を使用することで、インビボならびにエクスビボでゲノムが編集されることが著者らによって示された。
・Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、細胞の遺伝子スクリーニングを含めて、ヨーグルトからゲノム編集に至るまでのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の歴史を一般に論じる総説である。
・Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、正の選択にも負の選択にも適したプール型かつ機能喪失型の遺伝子スクリーニング手法に関し、この手法では、ゲノム規模のレンチウイルスシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ライブラリーが使用される。
・Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．は、６つの内在性マウス遺伝子及び３つの内在性ヒト遺伝子の一群の可能性のある標的部位をすべてカバーするｓｇＲＮＡのプールを創出し、こうしたｓｇＲＮＡがその標的遺伝子のヌルアレルを生成する能力を抗体染色及びフローサイトメトリーによって定量的に評価した。著者らによって、ＰＡＭを最適化することによって活性が改善することが示され、ｓｇＲＮＡを設計するためのオンラインツールも提供された。
・Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ．は、ＡＡＶ介在性のＳｐＣａｓ９ゲノム編集によって、脳における遺伝子機能の逆遺伝学的研究が可能になり得ることを示している。
・Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、リンカーを用いるか、またはリンカーを用いずに、複数のエフェクタードメイン（例えば、転写活性化因子、機能制御因子、及びエピゲノム制御因子）をガイド上の適切な位置（ステムまたはテトラループなど）に付加する能力について論じている。
・Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．は、Ｃａｓ９酵素を２つに分割することができ、したがって、Ｃａｓ９を活性化させるには、その会合を制御すればよいことを示している。
・Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は、マルチプレックススクリーニングに関し、このマルチプレックススクリーニングは、マウスにおけるゲノム規模のインビボＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９スクリーニングによって肺転移制御遺伝子を明らかにすることによって実証されている。
・Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、ＳａＣａｓ９及びそのゲノム編集能力に関し、生化学的アッセイからは推定し得ないものであることを示している。
・Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）融合体を、発現の合成的な抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）または活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）に使用する方法について記載しており、アレイ型及びプール型のスクリーニング、ゲノム遺伝子座を不活性化するノックアウト手法、ならびに転写活性を調節する方針を含めて、ゲノム規模のスクリーニングにＣａｓ９を使用する利点を示している。
・Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、ＣＲＩＳＰＲベースのスクリーニングおけるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の効率に寄与するＤＮＡ配列特徴を評価した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によるノックアウトの効率及び切断部位におけるヌクレオチド優先性が著者らによって調べられた。ＣＲＩＳＰＲｉ／ａに対する配列優先性が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によるノックアウトのものとは実質的に異なることも著者らによって見出された。
・Ｐａｒｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、ゲノム規模のプール型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ライブラリーを樹状細胞（ＤＣ）に導入することで、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）による腫瘍壊死因子（Ｔｎｆ）の誘導を制御する遺伝子を同定した。Ｔｌｒ４シグナル伝達の既知の制御因子、及びこれまでは知られていなかった候補制御因子が同定され、ＬＰＳに対する標準的な応答に対する作用が異なる３つの機能性モジュールへと分類された。
・Ｒａｍａｎａｎ ｅｔ ａｌ（２０１５）は、感染細胞においてウイルスエピソームＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）が切断されることを示した。ＨＢＶゲノムは、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる３．２ｋｂの二本鎖エピソームＤＮＡ種として感染肝細胞の核に存在しており、ｃｃｃＤＮＡは、ＨＢＶの生活環における重要な構成要素であり、現在の治療によってｃｃｃＤＮＡの複製は阻害されない。ＨＢＶの高度に保存された領域をｓｇＲＮＡが特異的に標的とすることで、ウイルスの複製が強固に抑制され、ｃｃｃＤＮＡが枯渇することが著者らによって示された。
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ならびにその二本鎖ＤＮＡ標的（５’－ＴＴＧＡＡＴ－３’ＰＡＭ及び５’－ＴＴＧＧＧＴ－３’ＰＡＭを含む）と複合体を形成したＳａＣａｓ９の結晶構造を報告した。ＳａＣａｓ９をＳｐＣａｓ９と構造比較することによって、構造的な保存も相違も明らかにされ、ＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９とのＰＡＭ特異性差異及びオルソロガスｓｇＲＮＡ認識差異が説明された。
・Ｃａｎｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に基づいて非コードゲノム要素を機能的に調査した。著者らは、プール型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ガイドＲＮＡライブラリーを開発することで、ヒト及びマウスのＢＣＬ１１Ａエンハンサーのインサイチュでの飽和変異導入を実施し、これによって、こうしたエンハンサーの重要な特徴を明らかにした。
・Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、Ｃｐｆ１の特徴付けについて報告した。Ｃｐｆ１は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２に由来するクラス２のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであり、Ｃａｓ９とは異なる特徴を有している。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含まないシングルＲＮＡガイド型のエンドヌクレアーゼであり、Ｔ含量の高いプロトスペーサー隣接モチーフを利用し、ねじれ型のＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。
・Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、クラス２の３つの異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系について報告した。２つのＣＲＩＳＰＲ系酵素（Ｃ２ｃ１及びＣ２ｃ３）は、Ｃｐｆ１と遠縁のＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含む。Ｃｐｆ１とは異なり、Ｃ２ｃ１は、ＤＮＡ切断する上でｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの両方に依存する。第３の酵素（Ｃ２ｃ２）は、予測ＨＥＰＮ ＲＮａｓｅドメインを２つ含み、ｔｒａｃｒＲＮＡ依存性である。
・Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１６）は、構造ガイド型タンパク質工学を使用することによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の特異性が改善することを報告した。著者らは、ＳｐＣａｓ９（ｅＳｐＣａｓ９）の「特異性増進」バリアントを開発し、このバリアントは、強固なオンターゲット切断を維持しており、そのオフターゲット効果は低減されていた。
本明細書で提供される方法及びツールは、Ｃｐｆ１（ｔｒａｃｒＲＮＡを利用しないＩＩ型ヌクレアーゼ）について例示されている。Ｃｐｆ１のオルソログは、本明細書に記載の異なる細菌種において同定されている。当該技術分野において説明される方法を使用すれば、類似特性を有するＩＩ型ヌクレアーゼをさらに同定することができる（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１５，６０：３８５－３９７、Ａｂｕｄａｙｅｈ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，５；３５３（６２９９））。特定の実施形態では、新規のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を同定するためのそのような方法は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ遺伝子座の存在を同定するシードをコードする配列をデータベースから選択する段階と、シードの１０ｋｂ以内に位置し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む遺伝子座を上記選択配列において同定する段階と、アミノ酸数が７００を超え、既知のＣＲＩＳＰＲエフェクターに対する相同性が９０％以下である新規のＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードするＯＲＦが１つのみであるＯＲＦ含有遺伝子座を上記同定遺伝子座から選択する段階と、を含み得る。特定の実施形態では、シードは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に共通するタンパク質（Ｃａｓ１など）である。別の実施形態では、新たなエフェクタータンパク質を同定するためのシードとしてＣＲＩＳＰＲアレイが使用される。
本発明の実効性は、実証されている。Ｃｐｆ１及びｃｒＲＮＡを含む事前構築された組換えＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１複合体は、例えば電気穿孔によってトランスフェクションされ、その結果、得られる変異導入率は高く、検出可能なオフターゲット変異は存在し得ない。Ｈｕｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｐｆ１ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊｕｎ ６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３５９６。Ｃｐｆ１の特異性は非常に高いことがゲノム規模の解析によって示されている。１つの尺度によれば、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてインビトロで決定されたＣｐｆ１の切断部位の数は、ＳｐＣａｓ９のものと比較してかなり少なかった。Ｋｉｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｐｆ１ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊｕｎ ６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３６０９。Ｃｐｆ１を利用する効率的なマルチプレックス系がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて示されており、この系では、隣接ｔＲＮＡを含むアレイからプロセシングされたｇＲＮＡが利用される。Ｐｏｒｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｔｏｏｌｂｏｘ ｉｎ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｗｉｔｈ ｔＲＮＡ－ｆｌａｎｋｅｄ Ｃａｓ９ ａｎｄ Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡｓ．ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０４６４１７。
また、“Ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ”，Ｓｈｅｎｇｄａｒ Ｑ．Ｔｓａｉ，Ｎｉｃｏｌａｓ Ｗｙｖｅｋｅｎｓ，Ｃｙｄ Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ａ．Ｆｏｄｅｎ，Ｖｉｓｈａｌ Ｔｈａｐａｒ，Ｄｅｅｐａｋ Ｒｅｙｏｎ，Ｍａｔｈｅｗ Ｊ．Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ａｒｙｅｅ，Ｊ．Ｋｅｉｔｈ Ｊｏｕｎｇ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（６）：５６９－７７（２０１４）は、認識する配列が長くなっており、ヒト細胞において高効率で内在性遺伝子を編集できる二量体ＲＮＡガイド型ＦｏｋＩヌクレアーゼに関する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、その構成要素、及びそのような構成要素の送達（方法、材料、送達媒体、ベクター、粒子を含む）、ならびにその調製及び使用（量及び製剤に関するものを含む）、ならびにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ発現真核細胞、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ発現真核生物（マウスなど）、に関する一般的な情報に関しては、米国特許第８，９９９，６４１号、同第８，９９３，２３３号、同第８，６９７，３５９号、同第８，７７１，９４５号、同第８，７９５，９６５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，８７１，４４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８８９，４１８号、同第８，８９５，３０８号、同第８，９０６，６１６号、同第８，９３２，８１４号、及び同第８，９４５，８３９号、米国特許公開ＵＳ２０１４－０３１０８３０（米国出願第１４／１０５，０３１号）、同ＵＳ２０１４－０２８７９３８Ａ１（米国出願第１４／２１３，９９１号）、同ＵＳ２０１４－０２７３２３４Ａ１（米国出願第１４／２９３，６７４号）、同ＵＳ２０１４－０２７３２３２Ａ１（米国出願第１４／２９０，５７５号）、同ＵＳ２０１４－０２７３２３１（米国出願第１４／２５９，４２０号）、同ＵＳ２０１４－０２５６０４６Ａ１（米国出願第１４／２２６，２７４号）、同ＵＳ２０１４－０２４８７０２Ａ１（米国出願第１４／２５８，４５８号）、同ＵＳ２０１４－０２４２７００Ａ１（米国出願第１４／２２２，９３０号）、同ＵＳ２０１４－０２４２６９９Ａ１（米国出願第１４／１８３，５１２号）、同ＵＳ２０１４－０２４２６６４Ａ１（米国出願第１４／１０４，９９０号）、同ＵＳ２０１４－０２３４９７２Ａ１（米国出願第１４／１８３，４７１号）、同ＵＳ２０１４－０２２７７８７Ａ１（米国出願第１４／２５６，９１２号）、同ＵＳ２０１４－０１８９８９６Ａ１（米国出願第１４／１０５，０３５号）、同ＵＳ２０１４－０１８６９５８（米国出願第１４／１０５，０１７号）、同ＵＳ２０１４－０１８６９１９Ａ１（米国出願第１４／１０４，９７７号）、同ＵＳ２０１４－０１８６８４３Ａ１（米国出願第１４／１０４，９００号）、同ＵＳ２０１４－０１７９７７０Ａ１（米国出願第１４／１０４，８３７）、及び同ＵＳ２０１４－０１７９００６Ａ１（米国出願第１４／１８３，４８６号）、同ＵＳ２０１４－０１７０７５３（米国出願第１４／１８３，４２９号）、同ＵＳ２０１５－０１８４１３９（米国出願第１４／３２４，９６０号）、第１４／０５４，４１４号、欧州特許出願ＥＰ ２ ７７１ ４６８（ＥＰ１３８１８５７０．７）、同ＥＰ ２ ７６４ １０３（ＥＰ１３８２４２３２．６）、及び同ＥＰ ２ ７８４ １６２（ＥＰ１４１７０３８３．５）、ならびにＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１４／０９３６６１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３）、同ＷＯ２０１４／０９３６９４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０）、同ＷＯ２０１４／０９３５９５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１）、同ＷＯ２０１４／０９３７１８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５）、同ＷＯ２０１４／０９３７０９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２）、同ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）、同ＷＯ２０１４／０９３６３５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１）、同ＷＯ２０１４／０９３６５５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６）、同ＷＯ２０１４／０９３７１２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９）、同ＷＯ２０１４／０９３７０１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００）、同ＷＯ２０１４／０１８４２３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８）、同ＷＯ２０１４／２０４７２３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１７９０）、同ＷＯ２０１４／２０４７２４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００）、同ＷＯ２０１４／２０４７２５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３）、同ＷＯ２０１４／２０４７２６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４）、同ＷＯ２０１４／２０４７２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６）、同ＷＯ２０１４／２０４７２８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８）、同ＷＯ２０１４／２０４７２９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９）、同ＷＯ２０１５／０８９３５１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９８９７）、同ＷＯ２０１５／０８９３５４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９０２）、同ＷＯ２０１５／０８９３６４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９２５）、同ＷＯ２０１５／０８９４２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００６８）、同ＷＯ２０１５／０８９４６２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１２７）、同ＷＯ２０１５／０８９４１９（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００５７）、同ＷＯ２０１５／０８９４６５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１３５）、同ＷＯ２０１５／０８９４８６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１７５）、同ＷＯ２０１５／０５８０５２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１０７７）、同ＷＯ２０１５／０７００８３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６４６６３）、同ＷＯ２０１５／０８９３５４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９０２）、同ＷＯ２０１５／０８９３５１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９８９７）、同ＷＯ２０１５／０８９３６４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９２５）、同ＷＯ２０１５／０８９４２７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００６８）、同ＷＯ２０１５／０８９４７３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１５２）、同ＷＯ２０１５／０８９４８６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１７５）、同ＷＯ２０１６／０４９２５８（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５１８３０）、同ＷＯ２０１６／０９４８６７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５３８５）、同ＷＯ２０１６／０９４８７２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５３９３）、同ＷＯ２０１６／０９４８７４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５３９６）、同ＷＯ２０１６／１０６２４４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６７１７７）に対する参照がなされる。
２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８０，７０９号（ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ））、２０１４年１２月１２日出願の米国出願第６２／０９１，４５５号（ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ））、２０１４年１２月２４日出願の米国出願第６２／０９６，７０８号（ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ））、２０１４年１２月１２日出願の米国出願第６２／０９１，４６２号、２０１４年１２月２３日出願の米国出願第６２／０９６，３２４号、２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８０，６８１号、及び２０１５年１０月５日出願の米国出願第６２／２３７，４９６号（ＤＥＡＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＳ）、２０１４年１２月１２日出願の米国出願第６２／０９１，４５６号及び２０１５年６月１７日出願第６２／１８０，６９２号（ＥＳＣＯＲＴＥＤ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＩＺＥＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）、２０１４年１２月１２日出願の米国出願第６２／０９１，４６１号（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＧＥＮＯＭＥ ＥＤＩＴＩＮＧ ＡＳ ＴＯ ＨＥＭＡＴＯＰＯＥＴＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ（ＨＳＣｓ））、２０１４年１２月１９日出願の米国出願第６２／０９４，９０３号（ＵＮＢＩＡＳＥＤ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＯＵＢＬＥ－ＳＴＲＡＮＤ ＢＲＥＡＫＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＩＣ ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＭＥＮＴ ＢＹ ＧＥＮＯＭＥ－ＷＩＳＥ ＩＮＳＥＲＴ ＣＡＰＴＵＲＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）、２０１４年１２月２４日出願の米国出願第６２／０９６，７６１号（ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＡＮＤ ＧＵＩＤＥ ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ）、２０１４年１２月３０日出願の米国出願第６２／０９８，０５９号、２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６４１号、及び２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６６７号（ＲＮＡ－ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ）、２０１４年１２月２４日出願の米国出願第６２／０９６，６５６号及び２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８１，１５１号（ＣＲＩＳＰＲ ＨＡＶＩＮＧ ＯＲ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＤＥＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ ＤＯＭＡＩＮＳ）、２０１４年１２月２４日出願の米国出願第６２／０９６，６９７号（ＣＲＩＳＰＲ ＨＡＶＩＮＧ ＯＲ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＡＡＶ）、２０１４年１２月３０日出願の米国出願第６２／０９８，１５８号（ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸ ＩＮＳＥＲＴＩＯＮＡＬ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ）、２０１５年４月２２日出願の米国出願第６２／１５１，０５２号（ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＦＯＲ ＥＸＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＥＸＯＳＯＭＡＬ ＲＥＰＯＲＴＩＮＧ）、２０１４年９月２４日出願の米国出願第６２／０５４，４９０号（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ）、２０１４年２月１２日出願の米国出願第６１／９３９，１５４号（ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）、２０１４年９月２５日出願の米国出願第６２／０５５，４８４号（ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）、２０１４年１２月４日出願の米国出願第６２／０８７，５３７号（ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）、２０１４年９月２４日出願の米国出願第６２／０５４，６５１号（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＡＮＣＥＲ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＶＩＶＯ）、２０１４年１０月２３日出願の米国出願第６２／０６７，８８６号（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＡＮＣＥＲ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＶＩＶＯ）、２０１４年９月２４日出願の米国出願第６２／０５４，６７５号及び２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８１，００２号（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＩＮ ＮＥＵＲＯＮＡＬ ＣＥＬＬＳ／ＴＩＳＳＵＥＳ）、２０１４年９月２４日出願の米国出願第６２／０５４，５２８号（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＥ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＯＲ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ）、２０１４年９月２５日出願の米国出願第６２／０５５，４５４号（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＣＥＬＬ ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＯＮ ＰＥＰＴＩＤＥＳ（ＣＰＰ））、２０１４年９月２５日出願の米国出願第６２／０５５，４６０号（ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ ＡＮＤ／ＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ）、２０１４年１２月４日出願の米国出願第６２／０８７，４７５及び２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６９０号（ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）、２０１４年９月２５日出願の米国出願第６２／０５５，４８７号（ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）、２０１４年１２月４日出願の米国出願第６２／０８７，５４６号及び２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６８７号（ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ ＡＮＤ／ＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ）、ならびに２０１４年１２月３０日出願の米国出願第６２／０９８，２８５号（ＣＲＩＳＰＲ ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＩＮ ＶＩＶＯ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＯＦ ＴＵＭＯＲ ＧＲＯＷＴＨ ＡＮＤ ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ）も挙げられる。
２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６５９号及び２０１５年８月１９日出願の米国出願第６２／２０７，３１８号（ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ，ＥＮＺＹＭＥ ＡＮＤ ＧＵＩＤＥ ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ ＯＦ ＣＡＳ９ ＯＲＴＨＯＬＯＧＳ ＡＮＤ ＶＡＲＩＡＮＴＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ）が挙げられる。２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６６３号及び２０１５年１０月２２日出願の米国出願第６２／２４５，２６４号（ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ）、２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，６７５号、２０１５年１０月２２日出願の米国出願第６２／２８５，３４９号、２０１６年２月１７日出願の米国出願第６２／２９６，５２２号、及び２０１６年４月８日出願の米国出願第６２／３２０，２３１号（ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ）、２０１５年９月２４日出願の米国出願第６２／２３２，０６７号、２０１５年１２月１８日出願の米国出願第１４／９７５，０８５号、欧州出願第１６１５０４２８．７号、２０１５年８月１６日出願の米国出願第６２／２０５，７３３号、２０１５年８月５日出願の米国出願第６２／２０１，５４２号、２０１５年７月１６日出願の米国出願第６２／１９３，５０７号、及び２０１５年６月１８日出願の米国出願第６２／１８１，７３９号（ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳという名称をそれぞれが有する）、ならびに２０１５年１０月２２日出願の米国出願第６２／２４５，２７０号（ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ）が挙げられる。２０１４年２月１２日出願の米国出願第６１／９３９，２５６号及び２０１４年１２月１２日出願のＷＯ２０１５／０８９４７３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１５２）（ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＧＵＩＤＥ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＷＩＴＨ ＮＥＷ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴＵＲＥＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮという名称をそれぞれが有する）も挙げられる。２０１５年８月１５日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４５５０４、２０１５年６月１７日出願の米国出願第６２／１８０，６９９号、及び２０１４年８月１７日出願の米国出願第６２／０３８，３５８号（ＧＥＮＯＭＥ ＥＤＩＴＩＮＧ ＵＳＩＮＧ ＣＡＳ９ ＮＩＣＫＡＳＥＳという名称をそれぞれが有する）も挙げられる。
こうした特許、特許公開、及び出願のそれぞれ、ならびにそこで引用される文書またはその審査の間に生じる文書（「出願引用文書」）のすべて、ならびに出願引用文書において引用または参照される文書のすべてが、そこで言及される任意の製品に対する、またはそこに記載の任意の文書（参照によって本明細書に組み込まれる）における、任意の説明、記載、製品仕様書、及び製品シートと併せて、参照によって本明細書に組み込まれ、本発明の実施の際に利用され得る。文書（例えば、こうした特許、特許公開、及び出願、ならびに出願引用文書）はすべて、個々の文書のそれぞれが参照によって組み込まれることが明確かつ個別に示された場合と同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質
本出願は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を使用する方法を説明する。これは、本明細書ではＣｐｆ１を用いて例示され、Ｃｐｆ１については、オルソログまたはホモログがいくつか同定されている。オルソログまたはホモログは追加で同定することができ、複数のオルソログに由来する断片を含むキメラ酵素を含めて、本明細書に記載の機能性はいずれも、他のオルソログに操作導入され得ることが当業者には明らかであろう。
新規のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座を同定する計算方法は、ＥＰ３００９５１１またはＵＳ２０１６２０８２４３に記載されており、下記の段階を含み得る：Ｃａｓ１タンパク質をコードするコンティグをすべて検出する段階、ｃａｓ１遺伝子の２０ｋＢ以内の予測タンパク質コード遺伝子をすべて同定する段階、同定遺伝子をＣａｓタンパク質特異的プロファイルと比較し、ＣＲＩＳＰＲアレイを予測する段階、アミノ酸数が５００を超える（＞５００アミノ酸）タンパク質を含む未分類の候補ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座を選択する段階、選択候補を、既知のタンパク質ドメインをスクリーニングする方法（ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ及びＨＨＰｒｅｄなど）を使用して解析し、それによってクラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座を新規に同定する段階（Ｓｃｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．６０（３）：３８５－９７も併せて参照のこと）。上述の段階に加えて、追加のホモログをメタゲノミクスデータベースで検索することによって上記候補の追加解析が実施され得る。さらに、または代替的に、非自己のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系にまで検索を広げるために、ＣＲＩＳＰＲアレイをシードとして使用して同じ手順を実施することができる。
１つの態様では、Ｃａｓ１タンパク質をコードするコンティグをすべて検出することは、ＧｅｎｅｍａｒｋＳによって実施され、ＧｅｎｅｍａｒｋＳは、遺伝子予測プログラムであり、このプログラムについては、“ＧｅｎｅＭａｒｋＳ：ａ ｓｅｌｆ－ｔｒａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｔａｒｔｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｊｏｈｎ Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ａｌｅｘａｎｄｒｅ Ｌｏｍｓａｄｚｅ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）２９，ｐｐ ２６０７－２６１８（参照によって本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。
１つの態様では、予測タンパク質コード遺伝子をすべて同定することは、同定遺伝子をＣａｓタンパク質特異的プロファイルと比較し、ＮＣＢＩ保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）に従って同定遺伝子のアノテーションを行うことによって実施される。ＣＤＤは、祖先ドメイン及び全長タンパク質に対して十分なアノテーションが行われた多重配列アライメントモデルがまとまったものからなるタンパク質アノテーションリソースである。こうしたものは、タンパク質配列における保存ドメインをＲＰＳ－ＢＬＡＳＴを介して迅速に同定するための位置特異的スコアマトリックス（ＰＳＳＭ）として利用可能である。ＣＤＤの内容は、ＮＣＢＩによって精選されたドメイン（ドメイン境界を明確に定義する三次元構造情報が使用されており、配列／構造／機能関連性に対する洞察が得られる）と、いくつかの外部ソースデータベース（Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、ＣＯＧ、ＰＲＫ、ＴＩＧＲＦＡＭ）からインポートされたドメインモデルと、を含む。別の態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、ＰＩＬＥＲ－ＣＲプログラムを使用して予測され、このプログラムは、ＣＲＩＳＰＲ反復配列を発見するための公的なドメインソフトウェアであり、“ＰＩＬＥＲ－ＣＲ：ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ｒｅｐｅａｔｓ”，Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｊａｎ ２０；８：１８（２００７）（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。
別の態様では、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（位置特異的繰り返し基本的局所アライメント検索ツール）を使用して個別解析が実施される。ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴでは、タンパク質間ＢＬＡＳＴを使用することで所与のスコア閾値を超えて検出される配列の多重配列アライメントに由来する位置特異的スコア付けマトリックス（ＰＳＳＭ）またはプロファイルが得られる。このＰＳＳＭは、データベースでの新たなマッチの検索にさらに使用され、次の繰り返しに向けて、こうして新たに検出された配列で更新される。このようにして、タンパク質間の離れた関連性を検出する手段がＰＳＩ－ＢＬＡＳＴから得られる。
別の態様では、ＨＨｐｒｅｄを使用して個別解析が実施される。ＨＨｐｒｅｄは、配列データベース検索及び構造予測のための方法であり、この方法は、ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ－ＢＬＡＳＴと同様に使いやすく、それと同時に、離れたホモログの発見精度がはるかに高い。実際、ＨＨｐｒｅｄの精度は、現在利用可能な最も強力な構造予測サーバーとの競合するものである。ＨＨｐｒｅｄは、プロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）のペアワイズ比較に基づく最初のサーバーである。従来の配列検索法のほとんどで、配列データベース（ＵｎｉＰｒｏｔまたはＮＲなど）が検索される一方で、ＨＨｐｒｅｄでは、ＰｆａｍまたはＳＭＡＲＴように、アライメントデータベースが検索される。このことによって、雑多な単一配列の代わりにいくつかの配列ファミリーへとヒットリストが大幅に単純化される。公的に利用可能なプロファイルデータベース及びアライメントデータベースで主要なものはすべて、ＨＨｐｒｅｄを介して利用可能である。ＨＨｐｒｅｄでは、単一のクエリー配列または多重アライメントが入力として受け付けられる。ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴのものと同様の読みやすい形式でわずか数分以内にＨＨｐｒｅｄから検索結果が得られる。検索オプションには、局所アラインメント及び大域アラインメント、及び二次構造類似性のスコア付けが含まれる。ＨＨｐｒｅｄでは、クエリーとテンプレート配列とのペアワイズアライメント、クエリーとテンプレートとのマージされた多重アライメント（例えば、推移的な検索な行うためのもの）、ならびにＭＯＤＥＬＬＥＲソフトウェアによってＨＨｐｒｅｄアライメントから計算される三次元構造モデル、を得ることができる。
Ｃｐｆ１のオルソログ
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称される）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称される）という用語は、当該技術分野においてよく知られている。追加のガイダンスとして、本明細書で使用されるタンパク質の「ホモログ」は、ホモログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、同じ種のタンパク質である。相同タンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。本明細書で使用されるタンパク質の「オルソログ」は、オルソログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、異なる種のタンパク質である。オルソロガスタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。ホモログ及びオルソログは、相同性モデリングによって同定され得る。（例えば、Ｇｒｅｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２２８（１９８５）１０５５、及びＢｌｕｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｖｏｌ １７２（１９８８），５１３）、または「構造的ＢＬＡＳＴ」（Ｄｅｙ Ｆ，Ｃｌｉｆｆ Ｚｈａｎｇ Ｑ，Ｐｅｔｒｅｙ Ｄ，Ｈｏｎｉｇ Ｂ．Ｔｏｗａｒｄ ａ“ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＢＬＡＳＴ”：ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｔｏ ｉｎｆｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１３ Ａｐｒ；２２（４）：３５９－６６．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏ．２２２５．を参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座の分野における適用については、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）も参照のこと。相同タンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。
Ｃｐｆ１遺伝子は、いくつかの多様な細菌ゲノムに見られ、典型的には、ｃａｓ１遺伝子、ｃａｓ２遺伝子、及びｃａｓ４遺伝子、ならびにＣＲＩＳＰＲカセットと同じ遺伝子座（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｃｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｆｘ１のＦＮＦＸ１＿１４３１－ＦＮＦＸ１＿１４２８）に存在する。したがって、この推定の新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の配置は、ＩＩ－Ｂ型のものと同様であると思われる。さらに、Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１タンパク質は、トランスポゾンＯＲＦ－Ｂと相同的である容易に同定可能なＣ末端領域を含むとともに、活性なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼ、アルギニン高含有領域、及びＺｎフィンガー（Ｃａｓ９には存在しない）を含む。しかしながら、Ｃａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成を含まないゲノムのいくつかにも存在しており、Ｃｐｆ１はＯＲＦ－Ｂとの類似性が比較的高いことから、Ｃｐｆ１がトランスポゾン構成要素である可能性が示唆される。これが真のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であるならば、Ｃｐｆ１はＣａｓ９の機能的アナログであり、Ｃｐｆ１が新規のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ型（すなわち、Ｖ型）となることが示唆された（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１１：４７－７５を参照のこと）。しかしながら、本明細書に記載のように、Ｃｐｆ１は、同一のドメイン構造を有さないＣ２ｃ１ｐと区別するためにＶ－Ａ亜型と表記され、したがって、Ｃ２ｃ１ｐは、Ｖ－Ｂ亜型と表記される。
本発明は、Ｖ－Ａ亜型と表記されるＣｐｆ１遺伝子座に由来するＣｐｆ１エフェクタータンパク質の使用を包含する。したがって、そのようなエフェクタータンパク質は、「Ｃｐｆ１ｐ」（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質）とも称される（さらに、Ｃｐｆ１遺伝子座に由来するそのようなエフェクタータンパク質またはＣｐｆ１タンパク質またはタンパク質は、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」とも呼ばれる）。
特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｖｉｂｒｉｏ、Ｐｅｒｉｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ、またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓに含まれる属に由来する生物に由来するＣｐｆ１エフェクタータンパク質である。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｂｕｔｙｖｉｂｒｉｏ、Ｐｅｒｉｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ、またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓから選択される属に由来する生物から選択される。
別の特定の実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ、Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｌ ｉｎａｄａｉ、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｐ．ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐ．ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐ．ｄｉｓｉｅｎｓ、及びＰ．ｍａｃａｃａｅから選択される生物に由来する。
エフェクタータンパク質は、キメラエフェクタータンパク質を含み得、当該キメラエフェクタータンパク質は、第１のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）オルソログに由来する第１の断片と、第２のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）オルソログに由来する第２の断片と、を含み、第１のエフェクタータンパク質オルソログと第２のエフェクタータンパク質オルソログとは、異なるものである。第１のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）オルソログ及び第２のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）オルソログのうちの少なくとも１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｖｉｂｒｉｏ、Ｐｅｒｉｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ、またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓに含まれる生物に由来するエフェクタータンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）を含み得る。例えば、キメラエフェクタータンパク質は、第１の断片及び第２の断片を含み、第１の断片及び第２断片はそれぞれ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｖｉｂｒｉｏ、Ｐｅｒｉｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ、またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓに含まれる生物のＣｐｆ１から選択され、第１の断片と第２の断片とは、同じ細菌に由来しない。例えば、キメラエフェクタータンパク質は、第１の断片及び第２の断片を含み、第１の断片及び第２の断片はそれぞれ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ、Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ属の１種であるＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、のＣｐｆ１から選択され、第１の断片と第２断片とは、同じ細菌に由来しない。
より好ましい実施形態では、Ｃｐｆ１ｐは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ属の１種であるＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ０８＿００２０５、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ１１＿００２０５、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ属の１種であるＮＣ３００５、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ属の１種であるＸＳ５、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅから選択される細菌種に由来する。ある特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ｐは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０から選択される細菌種に由来する。ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １の亜種に由来し、こうした亜種には、限定されないが、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓの亜種であるＮｏｖｉｃｉｄａが含まれる。ある特定の好ましい実施形態では、Ｃｐｆ１ｐは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ０８＿００２０５、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ１１＿００２０５、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ属の１種であるＮＣ３００５、またはＴｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ属の１種であるＸＳ５から選択される細菌種に由来する。
特定の実施形態では、本明細書で称されるＣｐｆ１のホモログまたはオルソログは、Ｃｐｆ１に対して少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％など）の配列相同性または配列同一性を有する。別の実施形態では、本明細書で称されるＣｐｆ１のホモログまたはオルソログは、野生型Ｃｐｆ１に対して少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％など）の配列同一性を有する。Ｃｐｆ１が、１つまたは複数の変異を有する（変異導入されている）場合、本明細書で称される当該Ｃｐｆ１のホモログまたはオルソログは、変異Ｃｐｆ１に対して少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％など）の配列同一性を有する。
ある１つの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパクは、ある１つの属の生物のオルソログであり得、こうした生物には、限定されないが、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉが含まれる。特定の実施形態では、Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、ある１つの種の生物のオルソログであり得、こうした生物には、限定されないが、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７が含まれる。特定の実施形態では、本明細書で称されるＣｐｆ１のホモログまたはオルソログは、本明細書に開示のＣｐｆ１配列のうちの１つまたは複数に対して少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％など）の配列相同性または配列同一性を有する。別の実施形態では、本明細書で称されるＣｐｆのホモログまたはオルソログは、野生型ＦｎＣｐｆ１、野生型ＡｓＣｐｆ１、または野生型ＬｂＣｐｆ１に対して少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％など）の配列同一性を有する。
特定の実施形態では、本発明のＣｐｆ１タンパク質は、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１、またはＬｂＣｐｆ１に対して少なくとも６０％、より具体的には少なくとも７０（少なくとも８０％など）、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％など）の配列相同性または配列同一性を有する。別の実施形態では、本明細書で称されるＣｐｆ１タンパク質は、野生型ＡｓＣｐｆ１または野生型ＬｂＣｐｆ１に対して少なくとも６０％（少なくとも７０％など）、より具体的には少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％など）の配列同一性を有する。特定の実施形態では、本発明のＣｐｆ１タンパク質がＦｎＣｐｆ１に対して有する配列同一性は、６０％未満である。このことには、切断形態のＣｐｆ１タンパク質が含まれ、配列同一性は、切断形態の長さにわたって決定されることを当業者なら理解するであろう。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１酵素は、ＦｎＣｐｆ１ではない。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に由来する生物に由来するＣｐｆ１タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅという細菌種に由来する生物に由来するＣｐｆ１タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０５５２２５１２３．１、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０５５２３７２６０．１、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０５５２７２２０６．１、またはＧｅｎＢａｎｋ識別子ＯＬＡ１６０４９．１に相当する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０５５２２５１２３．１、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０５５２３７２６０．１、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０５５２７２２０６．１、またはＧｅｎＢａｎｋ識別子ＯＬＡ１６０４９．１に対して少なくとも６０％、より具体的には少なくとも７０％（少なくとも８０％など）、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％など）の配列相同性または配列同一性を有する。このことには、切断形態のＣｐｆ１タンパク質が含まれ、配列同一性は、切断形態の長さにわたって決定されることを当業者なら理解するであろう。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクターは、ＴＴＴＮまたはＣＴＴＮというＰＡＭ配列を認識する。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に由来する生物に由来するＣｐｆ１タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅという細菌種に由来する生物に由来するＣｐｆ１タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０５５２２５１２３．１、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０５５２３７２６０．１、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０５５２７２２０６．１、またはＧｅｎＢａｎｋ識別子ＯＬＡ１６０４９．１に相当する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０５５２２５１２３．１、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０５５２３７２６０．１、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０５５２７２２０６．１、またはＧｅｎＢａｎｋ識別子ＯＬＡ１６０４９．１に対して少なくとも６０％、より具体的には少なくとも７０（少なくとも８０％など）、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％など）の配列相同性または配列同一性を有する。このことには、切断形態のＣｐｆ１タンパク質が含まれ、配列同一性は、切断形態の長さにわたって決定されることを当業者なら理解するであろう。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクターは、ＴＴＴＮまたはＣＴＴＮというＰＡＭ配列を認識する。
コドン最適化Ｃｐｆ１配列
エフェクタータンパク質が核酸として投与されることになる場合、本出願は、コドン最適化Ｃｐｆ１配列の使用を想定する。この場合、コドン最適化配列の例は、真核生物における発現向けに最適化された配列（例えば、ヒトの場合、すなわち、ヒトにおける発現向けに最適化された配列）、または本明細書で論じられる別の真核生物、動物、もしくは哺乳類向けに最適化された配列である。例えば、コドン最適化配列の例として、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）に記載の、ヒト向けにコドンが最適化されたＳａＣａｓ９配列を参照のこと（当該技術分野及び本開示における知見から、コード核酸分子（複数可）のコドン最適化（特に、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）に関するもの）は、当業者の能力範囲内である）。このことは好ましい一方で、他の例も可能であり、ヒト以外の宿主種向けのコドン最適化、または特定の臓器向けのコドン最適化が知られていることが理解されよう。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ／ＲＮＡ標的化Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列は、特定の細胞（真核細胞など）における発現向けにコドンが最適化される。真核細胞は、特定の生物のものであるか、または特定の生物に由来するものであり得、こうした生物には、限定されないが、ヒト、または本明細書で論じられる非ヒト真核生物もしくは動物もしくは哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、または非ヒト哺乳類もしくは霊長類）を含む、植物または哺乳類などである。いくつかの実施形態では、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を改変するためのプロセス、及び／または動物の遺伝的同一性を改変するためのプロセスのうちで、ヒトまたは動物、及び同様に、そのようなプロセスから得られる動物、に対していずれの実質的な医学的恩恵ももたされない状態にそうしたヒトまたは動物が陥る可能性があるプロセスは、除外され得る。一般に、コドン最適化は、目的宿主細胞における発現が増進するように核酸配列を改変するプロセスを指し、この改変は、天然のアミノ酸配列を維持しながらその宿主細胞の遺伝子においてより高い頻繁または最も高い頻繁で使用されるコドンで、天然の配列のうちの少なくとも１つのコドン（例えば、約１つ以上、約２つ以上、約３つ以上、約４つ以上、約５つ以上、約１０個以上、約１５個以上、約２０個以上、約２５個以上、約５０個以上、または約５１個以上）を置き換えることによって行われる。さまざまな種において、特定のアミノ酸のある特定のコドンには特定の偏りが見られる。コドンの偏り（生物間のコドン利用差異）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と関連することが多く、このことは、ひいては、数ある中でも特に、翻訳されるコドンの特性、及び特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子による利用能に依存すると考えられる。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高い頻度で使用されるコドンを反映したものである。したがって、コドン最適化に基づいて所与の生物における遺伝子発現が最適化するように遺伝子を仕立て上げることができる。コドン利用表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン利用データベース（Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）」で簡単に利用可能であり、こうした表をいくつかの方法で適用することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照のこと。特定の宿主細胞における発現向けに特定の配列のコドンを最適化するためのコンピューターアルゴリズム（Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）など）も利用可能である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ／ＲＮＡ標的化Ｃａｓタンパク質をコードする配列における１つまたは複数のコドン（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、もしくはそれ以上、またはすべてのコドン）が、特定のアミノ酸に対して最も高い頻度で使用されるコドンに対応する。酵母におけるコドンの利用に関しては、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／ｃｏｄｏｎ＿ｕｓａｇｅ．ｓｈｔｍｌにおいてオンラインで利用可能な酵母ゲノムデータベース、またはＣｏｄｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ，Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８２ Ｍａｒ ２５；２５７（６）：３０２６－３１に対する参照がなされる。藻類を含めて、植物におけるコドン利用に関しては、Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ，ｇｒｅｅｎ ａｌｇａｅ，ａｎｄ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９０ Ｊａｎ；９２（１）：１－１１．、ならびにＣｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｓ，Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９ Ｊａｎ ２５；１７（２）：４７７－９８、またはＳｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ａｎｄ ｃｙａｎｅｌｌｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔ ａｎｄ ａｌｇａｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ，Ｍｏｒｔｏｎ ＢＲ，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ．１９９８ Ａｐｒ；４６（４）：４４９－５９に対する参照がなされる。
下記のある特定のものでは、Ｃｐｆ１アミノ酸の後に、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（イタリック）、グリシン－セリン（ＧＳ）リンカー（下線付き）、及び３ｘＨＡタグ（太字）が位置する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１アミノ酸配列は、ＮＬＳ、ＧＳリンカー、及び３ｘＨＡタグを含まない配列に相当する。
１－Ｆｒａｎｓｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓの亜種であるｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）
Figure 0007364472000005
３－Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７（Ｌｂ３Ｃｐｆ１）
Figure 0007364472000006
４－Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ（ＢｐＣｐｆ１）
Figure 0007364472000007
５－Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０（ＰｅＣｐｆ１）
Figure 0007364472000008
６－Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７（ＰｂＣｐｆ１）
Figure 0007364472000009
７－Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ属の１種であるＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７（ＳｓＣｐｆ１）
Figure 0007364472000010
８－Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）
Figure 0007364472000011
９－Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）
Figure 0007364472000012
１０－Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ（ＣＭｔＣｐｆ１）
Figure 0007364472000013
１１－Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ（ＥｅＣｐｆ１）
Figure 0007364472000014
１２－Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１）
Figure 0007364472000015
１３－Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ（ＬｉＣｐｆ１）
Figure 0007364472000016
１４－Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）
Figure 0007364472000017
１５－Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ（ＰｃＣｐｆ１）
Figure 0007364472000018
１６－Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ（ＰｄＣｐｆ１）
Figure 0007364472000019
１７－Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ（ＰｍＣｐｆ１）
Figure 0007364472000020
１８－Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ属の１種であるＸＳ５（ＴｓＣｐｆ１）
Figure 0007364472000021
１９－Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ０８＿００２０５（Ｍｂ２Ｃｐｆ１）
Figure 0007364472000022
２０－Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ１１＿００２０５（Ｍｂ３Ｃｐｆ１）
Figure 0007364472000023
２１－Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ属の１種であるＮＣ３００５（ＢｓＣｐｆ１）
Figure 0007364472000024
Ｃｐｆ１オルソログには、以下にものがさらに含まれる：
ＮＣＢＩ ＷＰ＿０５５２２５１２３．１
ＭＮＮＧＴＮＮＦＱＮＦＩＧＩＳＳＬＱＫＴＬＲＮＡＬＩＰＴＥＴＴＱＱＦＩＶＫＮＧＩＩＫＥＤＥＬＲＧＥＮＲＱＩＬＫＤＩＭＤＤＹＹＲＧＦＩＳＥＴＬＳＳＩＤＤＩＤＷＴＳＬＦＥＫＭＥＩＱＬＫＮＧＤＮＫＤＴＬＩＫＥＱＴＥＹＲＫＡＩＨＫＫＦＡＮＤＤＲＦＫＮＭＦＳＡＫＬＩＳＤＩＬＰＥＦＶＩＨＮＮＮＹＳＡＳＥＫＥＥＫＴＱＶＩＫＬＦＳＲＦＡＴＳＦＫＤＹＦＫＮＲＡＮＣＦＳＡＤＤＩＳＳＳＳＣＨＲＩＶＮＤＮＡＥＩＦＦＳＮＡＬＶＹＲＲＩＶＫＳＬＳＮＤＤＩＮＫＩＳＧＤＭＫＤＳＬＫＥＭＳＬＥＥＩＹＳＹＥＫＹＧＥＦＩＴＱＥＧＩＳＦＹＮＤＩＣＧＫＶＮＳＦＭＮＬＹＣＱＫＮＫＥＮＫＮＬＹＫＬＱＫＬＨＫＱＩＬＣＩＡＤＴＳＹＥＶＰＹＫＦＥＳＤＥＥＶＹＱＳＶＮＧＦＬＤＮＩＳＳＫＨＩＶＥＲＬＲＫＩＧＤＮＹＮＧＹＮＬＤＫＩＹＩＶＳＫＦＹＥＳＶＳＱＫＴＹＲＤＷＥＴＩＮＴＡＬＥＩＨＹＮＮＩＬＰＧＮＧＫＳＫＡＤＫＶＫＫＡＶＫＮＤＬＱＫＳＩＴＥＩＮＥＬＶＳＮＹＫＬＣＳＤＤＮＩＫＡＥＴＹＩＨＥＩＳＨＩＬＮＮＦＥＡＱＥＬＫＹＮＰＥＩＨＬＶＥＳＥＬＫＡＳＥＬＫＮＶＬＤＶＩＭＮＡＦＨＷＣＳＶＦＭＴＥＥＬＶＤＫＤＮＮＦＹＡＥＬＥＥＩＹＤＥＩＹＰＶＩＳＬＹＮＬＶＲＮＹＶＴＱＫＰＹＳＴＫＫＩＫＬＮＦＧＩＰＴＬＡＤＧＷＳＫＳＫＥＹＳＮＮＡＩＩＬＭＲＤＮＬＹＹＬＧＩＦＮＡＫＮＫＰＤＫＫＩＩＥＧＮＴＳＥＮＫＧＤＹＫＫＭＩＹＮＬＬＰＧＰＮＫＭＩＰＫＶＦＬＳＳＫＴＧＶＥＴＹＫＰＳＡＹＩＬＥＧＹＫＱＮＫＨＩＫＳＳＫＤＦＤＩＴＦＣＨＤＬＩＤＹＦＫＮＣＩＡＩＨＰＥＷＫＮＦＧＦＤＦＳＤＴＳＴＹＥＤＩＳＧＦＹＲＥＶＥＬＱＧＹＫＩＤＷＴＹＩＳＥＫＤＩＤＬＬＱＥＫＧＱＬＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦＳＫＫＳＴＧＮＤＮＬＨＴＭＹＬＫＮＬＦＳＥＥＮＬＫＤＩＶＬＫＬＮＧＥＡＥＩＦＦＲＫＳＳＩＫＮＰＩＩＨＫＫＧＳＩＬＶＮＲＴＹＥＡＥＥＫＤＱＦＧＮＱＩＶＲＫＮＩＰＥＮＩＹＱＥＬＹＫＹＦＮＤＫＳＤＫＥＬＳＤＥＡＡＫＬＫＮＶＶＧＨＨＥＡＡＴＮＩＶＫＤＹＲＹＴＹＤＫＹＦＬＨＭＰＩＴＩＮＦＫＡＮＫＴＧＦＩＮＤＲＩＬＱＹＩＡＫＥＫＤＬＨＶＩＧＩＤＲＧＥＲＮＬＩＹＶＳＶＩＤＴＣＧＮＩＶＥＱＫＳＦＮＩＶＮＧＹＤＹＱＩＫＬＫＱＱＥＧＡＲＱＩＡＲＫＥＷＫＥＩＧＫＩＫＥＩＫＥＧＹＬＳＬＶＩＨＥＩＳＫＭＶＩＫＹＮＡＩＩＡＭＥＤＬＳＹＧＦＫＫＧＲＦＫＶＥＲＱＶＹＱＫＦＥＴＭＬＩＮＫＬＮＹＬＶＦＫＤＩＳＩＴＥＮＧＧＬＬＫＧＹＱＬＴＹＩＰＤＫＬＫＮＶＧＨＱＣＧＣＩＦＹＶＰＡＡＹＴＳＫＩＤＰＴＴＧＦＶＮＩＦＫＦＫＤＬＴＶＤＡＫＲＥＦＩＫＫＦＤＳＩＲＹＤＳＥＫＮＬＦＣＦＴＦＤＹＮＮＦＩＴＱＮＴＶＭＳＫＳＳＷＳＶＹＴＹＧＶＲＩＫＲＲＦＶＮＧＲＦＳＮＥＳＤＴＩＤＩＴＫＤＭＥＫＴＬＥＭＴＤＩＮＷＲＤＧＨＤＬＲＱＤＩＩＤＹＥＩＶＱＨＩＦＥＩＦＲＬＴＶＱＭＲＮＳＬＳＥＬＥＤＲＤＹＤＲＬＩＳＰＶＬＮＥＮＮＩＦＹＤＳＡＫＡＧＤＡＬＰＫＤＡＤＡＮＧＡＹＣＩＡＬＫＧＬＹＥＩＫＱＩＴＥＮＷＫＥＤＧＫＦＳＲＤＫＬＫＩＳＮＫＤＷＦＤＦＩＱＮＫＲＹＬ（配列番号７４）
ＮＣＢＩ ＷＰ＿０５５２３７２６０．１
ＭＮＮＧＴＮＮＦＱＮＦＩＧＩＳＳＬＱＫＴＬＲＮＡＬＩＰＴＥＴＴＱＱＦＩＶＫＮＧＩＩＫＥＤＥＬＲＧＥＮＲＱＩＬＫＤＩＭＤＤＹＹＲＧＦＩＳＥＴＬＳＳＩＤＤＩＤＷＴＳＬＦＥＫＭＥＩＱＬＫＮＧＤＮＫＤＴＬＩＫＥＱＡＥＫＲＫＡＩＹＫＫＦＡＤＤＤＲＦＫＮＭＦＳＡＫＬＩＳＤＩＬＰＥＦＶＩＨＮＮＮＹＳＡＳＥＫＥＥＫＴＱＶＩＫＬＦＳＲＦＡＴＳＦＫＤＹＦＫＮＲＡＮＣＦＳＡＤＤＩＳＳＳＳＣＨＲＩＶＮＤＮＡＥＩＦＦＳＮＡＬＶＹＲＲＩＶＫＮＬＳＮＤＤＩＮＫＩＳＧＤＭＫＤＳＬＫＥＭＳＬＤＥＩＹＳＹＥＫＹＧＥＦＩＴＱＥＧＩＳＦＹＮＤＩＣＧＫＶＮＳＦＭＮＬＹＣＱＫＮＫＥＮＫＮＬＹＫＬＲＫＬＨＫＱＩＬＣＩＡＤＴＳＹＥＶＰＹＫＦＥＳＤＥＥＶＹＱＳＶＮＧＦＬＤＮＩＳＳＫＨＩＶＥＲＬＲＫＩＧＤＮＹＮＧＹＮＬＤＫＩＹＩＶＳＲＦＹＥＳＶＳＱＫＴＹＲＤＷＥＴＩＮＴＡＬＥＩＨＹＮＮＩＬＰＧＮＧＫＳＫＡＤＫＶＫＫＡＶＫＮＤＬＱＫＳＩＴＥＩＮＥＬＶＳＮＹＫＬＣＰＤＤＮＩＫＡＥＴＹＩＨＥＩＳＨＩＬＮＮＦＥＡＱＥＬＫＹＮＰＥＩＨＬＶＥＳＥＬＫＡＳＥＬＫＮＶＬＤＶＩＭＮＡＦＨＷＣＳＶＦＭＴＥＥＬＶＤＫＤＮＮＦＹＡＥＬＥＥＩＹＤＥＩＹＰＶＩＳＬＹＮＬＶＲＮＹＶＴＱＫＰＹＳＴＫＫＩＫＬＮＦＧＩＰＴＬＡＤＧＷＳＫＳＫＥＹＳＮＮＡＩＩＬＭＲＤＮＬＹＹＬＧＩＦＮＡＫＮＫＰＤＫＫＩＩＥＧＮＴＳＥＮＫＧＤＹＫＫＭＩＹＮＬＬＰＧＰＮＫＭＩＰＫＶＦＬＳＳＫＴＧＶＥＴＹＫＰＳＡＹＩＬＥＧＹＫＱＮＫＨＬＫＳＳＫＤＦＤＩＴＦＣＲＤＬＩＤＹＦＫＮＣＩＡＩＨＰＥＷＫＮＦＧＦＤＦＳＤＴＳＴＹＥＤＩＳＧＦＹＲＥＶＥＬＱＧＹＫＩＤＷＴＹＩＳＥＫＤＩＤＬＬＱＥＫＧＱＬＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦＳＫＫＳＴＧＮＤＮＬＨＴＭＹＬＫＮＬＦＳＥＥＮＬＫＤＩＶＬＫＬＮＧＥＡＥＩＦＦＲＫＳＳＩＫＮＰＩＩＨＫＫＧＳＩＬＶＮＲＴＹＥＡＥＥＫＤＱＦＧＮＩＱＩＶＲＫＴＩＰＥＮＩＹＱＥＬＹＫＹＦＮＤＫＳＤＫＥＬＳＤＥＡＡＫＬＫＮＶＶＧＨＨＥＡＡＴＮＩＶＫＤＹＲＹＴＹＤＫＹＦＬＨＭＰＩＴＩＮＦＫＡＮＫＴＳＦＩＮＤＲＩＬＱＹＩＡＫＥＮＤＬＨＶＩＧＩＤＲＧＥＲＮＬＩＹＶＳＶＩＤＴＣＧＮＩＶＥＱＫＳＦＮＩＶＮＧＹＤＹＱＩＫＬＫＱＱＥＧＡＲＱＩＡＲＫＥＷＫＥＩＧＫＩＫＥＩＫＥＧＹＬＳＬＶＩＨＥＩＳＫＭＶＩＫＹＮＡＩＩＡＭＥＤＬＳＹＧＦＫＫＧＲＦＫＶＥＲＱＶＹＱＫＦＥＴＭＬＩＮＫＬＮＹＬＶＦＫＤＩＳＩＴＥＮＧＧＬＬＫＧＹＱＬＴＹＩＰＥＫＬＫＮＶＧＨＱＣＧＣＩＦＹＶＰＡＡＹＴＳＫＩＤＰＴＴＧＦＡＮＩＦＫＦＫＤＬＴＶＤＡＫＲＥＦＩＫＫＦＤＳＩＲＹＤＳＥＫＮＬＦＣＦＴＦＤＹＮＮＦＩＴＱＮＴＶＭＳＫＳＳＷＳＶＹＴＹＧＶＲＩＫＲＲＦＶＮＧＲＦＳＮＥＳＤＴＩＤＩＴＫＤＭＥＫＴＬＥＭＴＤＩＮＷＲＤＧＨＤＬＲＱＤＩＩＤＹＥＩＶＱＨＩＦＥＩＦＫＬＴＶＱＭＲＮＳＬＳＥＬＥＤＲＤＹＤＲＬＩＳＰＶＬＮＥＮＮＩＦＹＤＳＡＫＡＧＤＡＬＰＫＤＡＤＡＮＧＡＹＣＩＡＬＫＧＬＹＥＩＫＱＩＴＥＮＷＫＥＤＧＫＦＳＲＤＫＬＫＩＳＮＫＤＷＦＤＦＩＱＮＫＲＹＬ（配列番号７５）
ＮＣＢＩ ＷＰ＿０５５２７２２０６．１
ＭＮＮＧＴＮＮＦＱＮＦＩＧＩＳＳＬＱＫＴＬＲＮＡＬＴＰＴＥＴＴＱＱＦＩＶＫＮＧＩＩＫＥＤＥＬＲＧＥＮＲＱＩＬＫＤＩＭＤＤＹＹＲＧＦＩＳＥＴＬＳＳＩＤＤＩＤＷＴＳＬＦＥＫＭＥＩＱＬＫＮＧＤＮＫＤＴＬＩＫＥＱＡＥＫＲＫＡＩＹＫＫＦＡＤＤＤＲＦＫＮＭＦＳＡＫＬＩＳＤＩＬＰＥＦＶＩＨＮＮＮＹＳＡＳＥＫＥＥＫＴＱＶＩＫＬＦＳＲＦＡＴＳＦＫＤＹＦＫＮＲＡＮＣＦＳＡＤＤＩＳＳＳＳＣＨＲＩＶＮＤＮＡＥＩＦＦＳＮＡＬＶＹＲＲＩＶＫＮＬＳＮＤＤＩＮＫＩＳＧＤＭＫＤＳＬＫＫＭＳＬＥＫＩＹＳＹＥＫＹＧＥＦＩＴＱＥＧＩＳＦＹＮＤＩＣＧＫＶＮＳＦＭＮＬＹＣＱＫＮＫＥＮＫＮＬＹＫＬＲＫＬＨＫＱＩＬＣＩＡＤＴＳＹＥＶＰＹＫＦＥＳＤＥＥＶＹＱＳＶＮＧＦＬＤＮＩＳＳＫＨＩＶＥＲＬＲＫＩＧＤＮＹＮＧＹＮＬＤＫＩＹＩＶＳＫＦＹＥＳＶＳＱＫＴＹＲＤＷＥＴＩＮＴＡＬＥＩＨＹＮＮＩＬＰＧＮＧＫＳＫＡＤＫＶＫＫＡＶＫＮＤＬＱＫＳＩＴＥＩＮＥＬＶＳＮＹＫＬＣＰＤＤＮＩＫＡＥＴＹＩＨＥＩＳＨＩＬＮＮＦＥＡＱＥＬＫＹＮＰＥＩＨＬＶＥＳＥＬＫＡＳＥＬＫＮＶＬＤＶＩＭＮＡＦＨＷＣＳＶＦＭＴＥＥＬＶＤＫＤＮＮＦＹＡＥＬＥＥＩＹＤＥＩＹＰＶＩＳＬＹＮＬＶＲＮＹＶＴＱＫＰＹＳＴＫＫＩＫＬＮＦＧＩＰＴＬＡＤＧＷＳＫＳＫＥＹＳＮＮＡＩＩＬＭＲＤＮＬＹＹＬＧＩＦＮＡＫＮＫＰＥＫＫＩＩＥＧＮＴＳＥＮＫＧＤＹＫＫＭＩＹＮＬＬＰＧＰＮＫＭＩＰＫＶＦＬＳＳＫＴＧＶＥＴＹＫＰＳＡＹＩＬＥＧＹＫＱＮＫＨＬＫＳＳＫＤＦＤＩＴＦＣＲＤＬＩＤＹＦＫＮＣＩＡＩＨＰＥＷＫＮＦＧＦＤＦＳＤＴＳＴＹＥＤＩＳＧＦＹＲＥＶＥＬＱＧＹＫＩＤＷＴＹＩＳＥＫＤＩＤＬＬＱＥＫＧＱＬＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦＳＫＫＳＴＧＮＤＮＬＨＴＭＹＬＫＮＬＦＳＥＥＮＬＫＤＶＶＬＫＬＮＧＥＡＥＩＦＦＲＫＳＳＩＫＮＰＩＩＨＫＫＧＳＩＬＶＮＲＴＹＥＡＥＥＫＤＱＦＧＮＩＱＩＶＲＫＴＩＰＥＮＩＹＱＥＬＹＫＹＦＮＤＫＳＤＫＥＬＳＤＥＡＡＫＬＫＮＡＶＧＨＨＥＡＡＴＮＩＶＫＤＹＲＹＴＹＤＫＹＦＬＨＭＰＩＴＩＮＦＫＡＮＫＴＳＦＩＮＤＲＩＬＱＹＩＡＫＥＫＤＬＨＶＩＧＩＤＲＧＥＲＮＬＩＹＶＳＶＩＤＴＣＧＮＩＶＥＱＫＳＦＮＩＶＮＧＹＤＹＱＩＫＬＫＱＱＥＧＡＲＱＩＡＲＫＥＷＫＥＩＧＫＩＫＥＩＫＥＧＹＬＳＬＶＩＨＥＩＳＫＭＶＩＫＹＮＡＩＩＡＭＥＤＬＳＹＧＦＫＫＧＲＦＫＶＥＲＱＶＹＱＫＦＥＴＭＬＩＮＫＬＮＹＬＶＦＫＤＩＳＩＴＥＮＧＧＬＬＫＧＹＱＬＴＹＩＰＥＫＬＫＮＶＧＨＱＣＧＣＩＦＹＶＰＡＡＹＴＳＫＩＤＰＴＴＧＦＶＮＩＦＫＦＫＤＬＴＶＤＡＫＲＥＦＩＫＫＦＤＳＩＲＹＤＳＤＫＮＬＦＣＦＴＦＤＹＮＮＦＩＴＱＮＴＶＭＳＫＳＳＷＳＶＹＴＹＧＶＲＩＫＲＲＦＶＮＧＲＦＳＮＥＳＤＴＩＤＩＴＫＤＭＥＫＴＬＥＭＴＤＩＮＷＲＤＧＨＤＬＲＱＤＩＩＤＹＥＩＶＱＨＩＦＥＩＦＫＬＴＶＱＭＲＮＳＬＳＥＬＥＤＲＮＹＤＲＬＩＳＰＶＬＮＥＮＮＩＦＹＤＳＡＫＡＧＤＡＬＰＫＤＡＤＡＮＧＡＹＣＩＡＬＫＧＬＹＥＩＫＱＩＴＥＮＷＫＥＤＧＫＦＳＲＤＫＬＫＩＳＮＫＤＷＦＤＦＩＱＮＫＲＹＬ（配列番号７６）
ＧｅｎＢａｎｋ ＯＬＡ１６０４９．１
ＭＮＮＧＴＮＮＦＱＮＦＩＧＩＳＳＬＱＫＴＬＲＮＡＬＩＰＴＥＴＴＱＱＦＩＶＫＮＧＩＩＫＥＤＥＬＲＧＫＮＲＱＩＬＫＤＩＭＤＤＹＹＲＧＦＩＳＥＴＬＳＳＩＤＤＩＤＷＴＳＬＦＥＫＭＥＩＱＬＫＮＧＤＮＫＤＴＬＩＫＥＱＡＥＫＲＫＡＩＹＫＫＦＡＤＤＤＲＦＫＮＭＦＳＡＫＬＩＳＤＩＬＰＥＦＶＩＨＮＮＮＹＳＡＳＥＫＫＥＫＴＱＶＩＫＬＦＳＲＦＡＴＳＦＫＤＹＦＫＮＲＡＮＣＦＳＡＤＤＩＳＳＳＳＣＨＲＩＶＮＤＮＡＥＩＦＦＳＮＡＬＶＹＲＲＩＶＫＮＬＳＮＤＤＩＮＫＩＳＧＤＭＫＤＳＬＫＥＭＳＬＥＥＩＹＳＹＥＫＹＧＥＦＩＴＱＥＧＩＳＦＹＮＤＩＣＧＫＶＮＳＦＭＮＬＹＣＱＫＮＫＥＮＫＮＬＹＫＬＲＫＬＨＫＱＩＬＣＩＡＤＴＳＹＥＶＰＹＫＦＥＳＤＥＥＶＹＱＳＶＮＧＦＬＤＮＩＳＳＫＨＩＶＥＲＬＲＫＩＧＤＮＹＮＤＹＮＬＤＫＩＹＩＶＳＫＦＹＥＳＶＳＱＫＴＹＲＤＷＥＴＩＮＴＡＬＥＩＨＹＮＮＩＬＰＧＮＧＫＳＫＡＤＫＶＫＫＡＶＫＮＤＬＱＫＳＩＴＥＩＮＥＬＶＳＮＹＫＬＣＳＤＤＮＩＫＡＥＴＹＩＨＥＩＳＨＩＬＮＮＦＥＡＨＥＬＫＹＮＰＥＩＨＬＶＥＳＥＬＫＡＳＥＬＫＮＶＬＤＩＩＭＮＡＦＨＷＣＳＶＦＭＴＥＥＬＶＤＫＤＮＮＦＹＡＥＬＥＥＩＹＤＥＩＹＰＶＩＳＬＹＮＬＶＲＮＹＶＴＱＫＰＹＳＴＫＫＩＫＬＮＦＧＩＰＴＬＡＤＧＷＳＫＳＫＥＹＳＮＮＡＩＩＬＭＲＤＮＬＹＹＬＧＩＦＮＡＫＮＫＰＤＫＫＩＩＥＧＮＴＳＥＮＫＧＤＹＫＫＭＩＹＮＬＬＰＧＰＮＫＭＩＰＫＶＦＬＳＳＫＴＧＶＥＴＹＫＰＳＡＹＩＬＥＧＹＫＱＮＫＨＬＫＳＳＫＤＦＤＩＴＦＣＨＤＬＩＤＹＦＫＮＣＩＡＩＨＰＥＷＫＮＦＧＦＤＦＳＤＴＳＡＹＥＤＩＳＧＦＹＲＥＶＥＬＱＧＹＫＩＤＷＴＹＩＳＥＫＤＩＤＬＬＱＥＫＧＱＬＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦＳＫＫＳＴＧＮＤＮＬＨＴＭＹＬＫＮＬＦＳＥＥＮＬＫＤＩＶＬＫＬＮＧＥＡＥＩＦＦＲＫＳＳＩＫＮＰＩＩＨＫＫＧＳＩＬＶＮＲＴＹＥＡＥＥＫＤＱＦＧＮＩＱＩＶＲＫＴＩＰＥＮＩＹＱＥＬＹＫＹＦＮＤＫＳＤＫＥＬＳＤＥＡＡＫＬＫＮＶＶＧＨＨＥＡＡＴＮＩＶＫＤＹＲＹＴＹＤＫＹＦＬＨＭＰＩＴＩＮＦＫＡＮＫＴＳＦＩＮＤＲＩＬＱＹＩＡＫＥＫＤＬＨＶＩＧＩＤＲＧＥＲＮＬＩＹＶＳＶＩＤＴＣＧＮＩＶＥＱＫＳＦＮＩＶＮＧＹＤＹＱＩＫＬＫＱＱＥＧＡＲＱＩＡＲＫＥＷＫＥＩＧＫＩＫＥＩＫＥＧＹＬＳＬＶＩＨＥＩＳＫＭＶＩＫＹＮＡＩＩＡＭＥＤＬＳＹＧＦＫＫＧＲＦＫＶＥＲＱＶＹＱＫＦＥＴＭＬＩＮＫＬＮＹＬＶＦＫＤＩＳＩＴＥＮＧＧＬＬＫＧＹＱＬＴＹＩＰＤＫＬＫＮＶＧＨＱＣＧＣＩＦＹＶＰＡＡＹＴＳＫＩＤＰＴＴＧＦＶＮＩＦＫＦＫＤＬＴＶＤＡＫＲＥＦＩＫＫＦＤＳＩＲＹＤＳＥＫＮＬＦＣＦＴＦＤＹＮＮＦＩＴＱＮＴＶＭＳＫＳＳＷＳＶＹＴＹＧＶＲＩＫＲＲＦＶＮＧＲＦＳＮＥＳＤＴＩＤＩＴＫＤＭＥＫＴＬＥＭＴＤＩＮＷＲＤＧＨＤＬＲＱＤＩＩＤＹＥＩＶＱＨＩＦＥＩＦＫＬＴＶＱＭＲＮＳＬＳＥＬＥＤＲＤＹＤＲＬＩＳＰＶＬＮＥＮＮＩＦＹＤＳＡＫＡＧＹＡＬＰＫＤＡＤＡＮＧＡＹＣＩＡＬＫＧＬＹＥＩＫＱＩＴＥＮＷＫＥＤＧＫＦＳＲＤＫＬＫＩＳＮＫＤＷＦＤＦＩＱＮＫＲＹＬ（配列番号７７）
改変Ｃｐｆ１酵素
特定の実施形態では、本明細書で定義される操作されたＣｐｆ１タンパク質（Ｃｐｆ１など）の利用が目的となり、タンパク質は、ＲＮＡを含む核酸分子と複合体化してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、核酸分子は、ＣＲＩＳＰＲ複合体に存在するとき、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的とし、タンパク質は、非改変Ｃｐｆ１タンパク質と比較して少なくとも１つの改変を含み、改変タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、非改変Ｃｐｆ１タンパク質を含む複合体と比較して活性が変化している。本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ「タンパク質」に言及するとき、Ｃｐｆ１タンパク質は、好ましくは、改変ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、限定されないが、Ｃｐｆ１などを含めて、酵素活性が上昇もしくは低下（または皆無）のもの）であることが理解されよう。「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」という用語は、野生型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と比較してＣＲＩＳＰＲタンパク質が変化している（酵素活性が上昇もしくは低下している（または皆無である）など）かどうかとは無関係に、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」と互換的に使用され得る。
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの一次構造の計算解析によって、異なる領域が３つ存在することが明らかになっている。第１は、Ｃ末端ＲｕｖＣ様ドメインであり、このドメインは、機能性が唯一特徴付けられたドメインである。第２は、Ｎ末端アルファ－ヘリックス領域であり、第３は、アルファとベータとの混合領域であり、この混合領域は、ＲｕｖＣ様ドメインとアルファ－ヘリックス領域との間に位置する。
Ｃｐｆ１の一次構造内には非構造化領域の小区間がいくつか存在することが予測されている。溶媒に露出しており、異なるＣｐｆ１オルソログ内で保存されていない非構造化領域が存在する側が、小タンパク質配列の分割及び挿入に好ましい。さらに、こうした側を使用することで、Ｃｐｆ１オルソログ間のキメラタンパク質を得ることができる。
上記の情報に基づくと、酵素を不活性させる変異体、または二本鎖ヌクレアーゼ活性をニッカーゼ活性へと改変する変異体、を生成させることができる。代替の実施形態では、この情報を使用することで、オフターゲット効果が低減された酵素が開発される（本明細書の他の箇所に記載される）。
上記のＣｐｆ１酵素のある特定のものでは、酵素は、１つまたは複数の残基（ＲｕｖＣドメインのもの）の変異によって改変され、こうした変異の残基位置には、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６のもの）のアミノ酸位置の番号付けを基準にすると、Ｒ９０９位、Ｒ９１２位、Ｒ９３０位、Ｒ９４７位、Ｋ９４９位、Ｒ９５１位、Ｒ９５５位、Ｋ９６５位、Ｋ９６８位、Ｋ１０００位、Ｋ１００２位、Ｒ１００３位、Ｋ１００９位、Ｋ１０１７位、Ｋ１０２２位、Ｋ１０２９位、Ｋ１０３５位、Ｋ１０５４位、Ｋ１０７２位、Ｋ１０８６位、Ｒ１０９４位、Ｋ１０９５位、Ｋ１１０９位、Ｋ１１１８位、Ｋ１１４２位、Ｋ１１５０位、Ｋ１１５８位、Ｋ１１５９位、Ｒ１２２０位、Ｒ１２２６位、Ｒ１２４２位、及び／またはＲ１２５２位が含まれる。ある特定の実施形態では、当該１つまたは複数の変異を含むＣｐｆ１酵素は改変されており、より好ましくは、標的に対する特異性が向上している。
上記の非天然起源のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のある特定のものでは、酵素は、１つまたは複数の残基（ＲＡＤ５０ドメインのもの）の変異によって改変され、こうした変異の残基位置には、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６のもの）のアミノ酸位置の番号付けを基準にすると、Ｋ３２４位、Ｋ３３５位、Ｋ３３７位、Ｒ３３１位、Ｋ３６９位、Ｋ３７０位、Ｒ３８６位、Ｒ３９２位、Ｒ３９３位、Ｋ４００位、Ｋ４０４位、Ｋ４０６位、Ｋ４０８位、Ｋ４１４位、Ｋ４２９位、Ｋ４３６位、Ｋ４３８位、Ｋ４５９位、Ｋ４６０位、Ｋ４６４位、Ｒ６７０位、Ｋ６７５位、Ｒ６８１位、Ｋ６８６位、Ｋ６８９位、Ｒ６９９位、Ｋ７０５位、Ｒ７２５位、Ｋ７２９位、Ｋ７３９位、Ｋ７４８位、及び／またはＫ７５２位が含まれる。ある特定の実施形態では、当該１つまたは複数の変異を含むＣｐｆ１酵素は改変されており、より好ましくは、標的に対する特異性が向上している。
Ｃｐｆ１酵素のある特定のものでは、酵素は、１つまたは複数の残基の変異によって改変され、こうした変異の残基位置には、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６のもの）のアミノ酸位置の番号付けを基準にすると、Ｒ９１２位、Ｔ９２３位、Ｒ９４７位、Ｋ９４９位、Ｒ９５１位、Ｒ９５５位、Ｋ９６５位、Ｋ９６８位、Ｋ１０００位、Ｒ１００３位、Ｋ１００９位、Ｋ１０１７位、Ｋ１０２２位、Ｋ１０２９位、Ｋ１０７２位、Ｋ１０８６位、Ｆ１１０３位、Ｒ１２２６位、及び／またはＲ１２５２位が含まれる。ある特定の実施形態では、当該１つまたは複数の変異を含むＣｐｆ１酵素は改変されており、より好ましくは、標的に対する特異性が向上している。
ある特定の実施形態では、Ｃｐｆ１酵素は、１つまたは複数の残基の変異によって改変され、こうした変異の残基位置には、限定されないが、ＬｂＣｐｆ１（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６のもの）のアミノ酸位置の番号付けを基準にすると、Ｒ８３３位、Ｒ８３６位、Ｋ８４７位、Ｋ８７９位、Ｋ８８１位、Ｒ８８３位、Ｒ８８７位、Ｋ８９７位、Ｋ９００位、Ｋ９３２位、Ｒ９３５位、Ｋ９４０位、Ｋ９４８位、Ｋ９５３位、Ｋ９６０位、Ｋ９８４位、Ｋ１００３位、Ｋ１０１７位、Ｒ１０３３位、Ｒ１１３８位、Ｒ１１６５位、及び／またはＲ１２５２位が含まれる。ある特定の実施形態では、当該１つまたは複数の変異を含むＣｐｆ１酵素は改変されており、より好ましくは、標的に対する特異性が向上している。
ある特定の実施形態では、Ｃｐｆ１酵素は、１つまたは複数の残基の変異によって改変され、こうした変異の残基位置には、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６のもの）のアミノ酸位置の番号付けを基準にすると、Ｋ１５位、Ｒ１８位、Ｋ２６位、Ｑ３４位、Ｒ４３位、Ｋ４８位、Ｋ５１位、Ｒ５６位、Ｒ８４位、Ｋ８５位、Ｋ８７位、Ｎ９３位、Ｒ１０３位、Ｎ１０４位、Ｔ１１８位、Ｋ１２３位、Ｋ１３４位、Ｒ１７６位、Ｋ１７７位、Ｒ１９２位、Ｋ２００位、Ｋ２２６位、Ｋ２７３位、Ｋ２７５位、Ｔ２９１位、Ｒ３０１位、Ｋ３０７位、Ｋ３６９位、Ｓ４０４位、Ｖ４０９位、Ｋ４１４位、Ｋ４３６位、Ｋ４３８位、Ｋ４６８位、Ｄ４８２位、Ｋ５１６位、Ｒ５１８位、Ｋ５２４位、Ｋ５３０位、Ｋ５３２位、Ｋ５４８位、Ｋ５５９位、Ｋ５７０位、Ｒ５７４位、Ｋ５９２位、Ｄ５９６位、Ｋ６０３位、Ｋ６０７位、Ｋ６１３位、Ｃ６４７位、Ｒ６８１位、Ｋ６８６位、Ｈ７２０位、Ｋ７３９位、Ｋ７４８位、Ｋ７５７位、Ｔ７６６位、Ｋ７８０位、Ｒ７９０位、Ｐ７９１位、Ｋ７９６位、Ｋ８０９位、Ｋ８１５位、Ｔ８１６位、Ｋ８６０位、Ｒ８６２位、Ｒ８６３位、Ｋ８６８位、Ｋ８９７位、Ｒ９０９位、Ｒ９１２位、Ｔ９２３位、Ｒ９４７位、Ｋ９４９位、Ｒ９５１位、Ｒ９５５位、Ｋ９６５位、Ｋ９６８位、Ｋ１０００位、Ｒ１００３位、Ｋ１００９位、Ｋ１０１７位、Ｋ１０２２位、Ｋ１０２９位、Ａ１０５３位、Ｋ１０７２位、Ｋ１０８６位、Ｆ１１０３位、Ｓ１２０９位、Ｒ１２２６位、Ｒ１２５２位、Ｋ１２７３位、Ｋ１２８２位、及び／またはＫ１２８８位が含まれる。ある特定の実施形態では、当該１つまたは複数の変異を含むＣｐｆ１酵素は改変されており、より好ましくは、標的に対する特異性が向上している。
ある特定の実施形態では、酵素は、１つまたは複数の残基の変異によって改変され、こうした変異の残基位置には、限定されないが、ＦｎＣｐｆ１（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２のもの）のアミノ酸位置の番号付けを基準にすると、Ｋ１５位、Ｒ１８位、Ｋ２６位、Ｒ３４位、Ｒ４３位、Ｋ４８位、Ｋ５１位、Ｋ５６位、Ｋ８７位、Ｋ８８位、Ｄ９０位、Ｋ９６位、Ｋ１０６位、Ｋ１０７位、Ｋ１２０位、Ｑ１２５位、Ｋ１４３位、Ｒ１８６位、Ｋ１８７位、Ｒ２０２位、Ｋ２１０位、Ｋ２３５位、Ｋ２９６位、Ｋ２９８位、Ｋ３１４位、Ｋ３２０位、Ｋ３２６位、Ｋ３９７位、Ｋ４４４位、Ｋ４４９位、Ｅ４５４位、Ａ４８３位、Ｅ４９１位、Ｋ５２７位、Ｋ５４１位、Ｋ５８１位、Ｒ５８３位、Ｋ５８９位、Ｋ５９５位、Ｋ５９７位、Ｋ６１３位、Ｋ６２４位、Ｋ６３５位、Ｋ６３９位、Ｋ６５６位、Ｋ６６０位、Ｋ６６７位、Ｋ６７１位、Ｋ６７７位、Ｋ７１９位、Ｋ７２５位、Ｋ７３０位、Ｋ７６３位、Ｋ７８２位、Ｋ７９１位、Ｒ８００位、Ｋ８０９位、Ｋ８２３位、Ｒ８３３位、Ｋ８３４位、Ｋ８３９位、Ｋ８５２位、Ｋ８５８位、Ｋ８５９位、Ｋ８６９位、Ｋ８７１位、Ｒ８７２位、Ｋ８７７位、Ｋ９０５位、Ｒ９１８位、Ｒ９２１位、Ｋ９３２位、Ｉ９６０位、Ｋ９６２位、Ｒ９６４位、Ｒ９６８位、Ｋ９７８位、Ｋ９８１位、Ｋ１０１３位、Ｒ１０１６位、Ｋ１０２１位、Ｋ１０２９位、Ｋ１０３４位、Ｋ１０４１位、Ｋ１０６５位、Ｋ１０８４位、及び／またはＫ１０９８位が含まれる。ある特定の実施形態では、当該１つまたは複数の変異を含むＣｐｆ１酵素は改変されており、より好ましくは、標的に対する特異性が向上している。
ある特定の実施形態では、酵素は、１つまたは複数の残基の変異によって改変され、こうした変異の残基位置には、限定されないが、ＬｂＣｐｆ１（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６のもの）のアミノ酸位置の番号付けを基準にすると、Ｋ１５位、Ｒ１８位、Ｋ２６位、Ｋ３４位、Ｒ４３位、Ｋ４８位、Ｋ５１位、Ｒ５６位、Ｋ８３位、Ｋ８４位、Ｒ８６位、Ｋ９２位、Ｒ１０２位、Ｋ１０３位、Ｋ１１６位、Ｋ１２１位、Ｒ１５８位、Ｅ１５９位、Ｒ１７４位、Ｒ１８２位、Ｋ２０６位、Ｋ２５１位、Ｋ２５３位、Ｋ２６９位、Ｋ２７１位、Ｋ２７８位、Ｐ３４２位、Ｋ３８０位、Ｒ３８５位、Ｋ３９０位、Ｋ４１５位、Ｋ４２１位、Ｋ４５７位、Ｋ４７１位、Ａ５０６位、Ｒ５０８位、Ｋ５１４位、Ｋ５２０位、Ｋ５２２位、Ｋ５３８位、Ｙ５４８位、Ｋ５６０位、Ｋ５６４位、Ｋ５８０位、Ｋ５８４位、Ｋ５９１位、Ｋ５９５位、Ｋ６０１位、Ｋ６３４位、Ｋ６４０位、Ｒ６４５位、Ｋ６７９位、Ｋ６８９位、Ｋ７０７位、Ｔ７１６位、Ｋ７２５位、Ｒ７３７位、Ｒ７４７位、Ｒ７４８位、Ｋ７５３位、Ｋ７６８位、Ｋ７７４位、Ｋ７７５位、Ｋ７８５位、Ｋ７８７位、Ｒ７８８位、Ｑ７９３位、Ｋ８２１位、Ｒ８３３位、Ｒ８３６位、Ｋ８４７位、Ｋ８７９位、Ｋ８８１位、Ｒ８８３位、Ｒ８８７位、Ｋ８９７位、Ｋ９００位、Ｋ９３２位、Ｒ９３５位、Ｋ９４０位、Ｋ９４８位、Ｋ９５３位、Ｋ９６０位、Ｋ９８４位、Ｋ１００３位、Ｋ１０１７位、Ｒ１０３３位、Ｋ１１２１位、Ｒ１１３８位、Ｒ１１６５位、Ｋ１１９０位、Ｋ１１９９位、及び／またはＫ１２０８位が含まれる。ある特定の実施形態では、当該１つまたは複数の変異を含むＣｐｆ１酵素は改変されており、より好ましくは、標的に対する特異性が向上している。
ある特定の実施形態では、酵素は、１つまたは複数の残基の変異によって改変され、こうした変異の残基位置には、限定されないが、ＭｂＣｐｆ１（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７のもの）のアミノ酸位置の番号付けを基準にすると、Ｋ１４位、Ｒ１７位、Ｒ２５位、Ｋ３３位、Ｍ４２位、Ｑ４７位、Ｋ５０位、Ｄ５５位、Ｋ８５位、Ｎ８６位、Ｋ８８位、Ｋ９４位、Ｒ１０４位、Ｋ１０５位、Ｋ１１８位、Ｋ１２３位、Ｋ１３１位、Ｒ１７４位、Ｋ１７５位、Ｒ１９０位、Ｒ１９８位、Ｉ２２１位、Ｋ２６７位、Ｑ２６９位、Ｋ２８５位、Ｋ２９１位、Ｋ２９７位、Ｋ３５７位、Ｋ４０３位、Ｋ４０９位、Ｋ４１４位、Ｋ４４８位、Ｋ４６０位、Ｋ５０１位、Ｋ５１５位、Ｋ５５０位、Ｒ５５２位、Ｋ５５８位、Ｋ５６４位、Ｋ５６６位、Ｋ５８２位、Ｋ５９３位、Ｋ６０４位、Ｋ６０８位、Ｋ６２３位、Ｋ６２７位、Ｋ６３３位、Ｋ６３７位、Ｅ６４３位、Ｋ７８０位、Ｙ７８７位、Ｋ７９２位、Ｋ８３０位、Ｑ８４６位、Ｋ８５８位、Ｋ８６７位、Ｋ８７６位、Ｋ８９０位、Ｒ９００位、Ｋ９０１位、Ｍ９０６位、Ｋ９２１位、Ｋ９２７位、Ｋ９２８位、Ｋ９３７位、Ｋ９３９位、Ｒ９４０位、Ｋ９４５位、Ｑ９７５位、Ｒ９８７位、Ｒ９９０位、Ｋ１００１位、Ｒ１０３４位、Ｉ１０３６位、Ｒ１０３８位、Ｒ１０４２位、Ｋ１０５２位、Ｋ１０５５位、Ｋ１０８７位、Ｒ１０９０位、Ｋ１０９５位、Ｎ１１０３位、Ｋ１１０８位、Ｋ１１１５位、Ｋ１１３９位、Ｋ１１５８位、Ｒ１１７２位、Ｋ１１８８位、Ｋ１２７６位、Ｒ１２９３位、Ａ１３１９位、Ｋ１３４０位、Ｋ１３４９位、及び／またはＫ１３５６位が含まれる。ある特定の実施形態では、当該１つまたは複数の変異を含むＣｐｆ１酵素は改変されており、より好ましくは、標的に対する特異性が向上している。
上記のＣｐｆ１酵素のある特定のものでは、酵素は、１つまたは複数の残基の変異によって改変され、こうした変異の残基位置には、限定されないが、ＦｎＣｐｆ１タンパク質または任意の対応オルソログに基づくと、Ｄ９１７位、Ｅ１００６位、Ｅ１０２８位、Ｄ１２２７位、Ｄ１２５５Ａ位、Ｎ１２５７位が含まれる。ある１つの態様では、本発明は、本明細書で論じられる組成物を提供し、Ｃｐｆ１酵素は、ＦｎＣｐｆ１タンパク質に基づくＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｎ１２５７Ａ、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ、及びＮ１２５７Ａ、またはＣｐｆ１オルソログにおける対応位置の変異、からなる群から選択される１つまたは複数の変異を含む不活性化酵素である。ある１つの態様では、本発明は、本明細書で論じられる組成物を提供し、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＦｎＣｐｆ１タンパク質に基づくＤ９１７、もしくはＥ１００６及びＤ９１７、もしくはＤ９１７及びＤ１２５５、またはＣｐｆ１オルソログにおける対応位置に変異を含む。
１つの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸位置の番号付けを基準とするＳ１２２８における変異（例えば、Ｓ１２２８Ａ）で改変される。Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６５：９４９－９６２（２０１６）を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、非天然のＰＡＭを認識するように改変されており、ＹＣＮ、ＹＣＶ、ＡＹＶ、ＴＹＶ、ＲＹＮ、ＲＣＮ、ＴＧＹＶ、ＮＴＴＮ、ＴＴＮ、ＴＲＴＮ、ＴＹＴＶ、ＴＹＣＴ、ＴＹＣＮ、ＴＲＴＮ、ＮＴＴＮ、ＴＡＣＴ、ＴＹＣＣ、ＴＲＴＣ、ＴＡＴＶ、ＮＴＴＶ、ＴＴＶ、ＴＳＴＧ、ＴＶＴＳ、ＴＹＹＳ、ＴＣＹＳ、ＴＢＹＳ、ＴＣＹＳ、ＴＮＹＳ、ＴＹＹＳ、ＴＮＴＮ、ＴＳＴＧ、ＴＴＣＣ、ＴＣＣＣ、ＴＡＴＣ、ＴＧＴＧ、ＴＣＴＧ、ＴＹＣＶ、またはＴＣＴＣという配列を有するＰＡＭ、または当該配列を含むＰＡＭなどを認識する。特定の実施形態では、当該改変Ｃｐｆ１は、ＡｓＣｐｆ１の１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、３４位、３６位、３９位、４０位、４３位、４６位、４７位、５０位、５４位、５７位、５８位、１１１位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、５３２位、５３３位、５３４位、５３５位、５３６位、５３７位、５３８位、５３９位、５４０位、５４１位、５４２位、５４３位、５４４位、５４５位、５４６位、５４７位、５４８位、５４９位、５５０位、５５１位、５５２位、５５３位、５５４位、５５５位、５５６位、５６５位、５６６位、５６７位、５６８位、５６９位、５７０位、５７１位、５７２位、５７３位、５７４位、５７５位、５９２位、５９３位、５９４位、５９５位、５９６位、５９７位、５９８位、５９９位、６００位、６０１位、６０２位、６０３位、６０４位、６０５位、６０６位、６０７位、６０８位、６０９位、６１０位、６１１位、６１２位、６１３位、６１４位、６１５位、６１６位、６１７位、６１８位、６１９位、６２０位、６２６位、６２７位、６２８位、６２９位、６３０位、６３１位、６３２位、６３３位、６３４位、６３５位、６３６位、６３７位、６３８位、６４２位、６４３位、６４４位、６４５位、６４６位、６４７位、６４８位、６４９位、６５１位、６５２位、６５３位、６５４位、６５５位、６５６位、６７６位、６７９位、６８０位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、６８６位、６８７位、６８８位、６８９位、６９０位、６９１位、６９２位、６９３位、７０７位、７１１位、７１４位、７１５位、７１６位、７１７位、７１８位、７１９位、７２０位、７２１位、７２２位、７３９位、７６５位、７６８位、７６９位、７７３位、７７７位、７７８位、７７９位、７８０位、７８１位、７８２位、７８３位、７８４位、７８５位、７８６位、８７１位、８７２位、８７３位、８７４位、８７５位、８７６位、８７７位、８７８位、８７９位、８８０位、８８１位、８８２位、８８３位、８８４位、もしくは１０４８位、またはＣｐｆ１オルソログにおけるそれに対応する位置、に１つまたは複数の変異アミノ酸残基を含み、好ましくは、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、５３６位、５３７位、５３８位、５３９位、５４０位、５４１位、５４２位、５４３位、５４４位、５４５位、５４６位、５４７位、５４８位、５４９位、５５０位、５５１位、５５２位、５７０位、５７１位、５７２位、５７３位、５９５位、５９６位、５９７位、５９８位、５９９位、６００位、６０１位、６０２位、６０３位、６０４位、６０５位、６０６位、６０７位、６０８位、６０９位、６１０位、６１１位、６１２位、６１３位、６１４位、６１５位、６３０位、６３１位、６３２位、６４６位、６４７位、６４８位、６４９位、６５０位、６５１位、６５２位、６５３位、６８３位、６８４位、６８５位、６８６位、６８７位、６８８位、６８９位、または６９０位に１つまたは複数の変異アミノ酸残基を含む。
ある特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、活性が上昇するように改変され、すなわち、ＰＡＭ特異性が広がるように改変される。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、１つまたは複数の残基の変異によって改変され（こうした変異の残基位置には、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１の５３９位、５４２位、５４７位、５４８位、５５０位、５５１位、５５２位、１６７位、６０４位、及び／または６０７位、あるいはＡｓＣｐｆ１のオルソログ、ホモログ、またはバリアントにおける対応位置が含まれる）、好ましくは、５４２位、もしくは５４２位及び６０７位に変異アミノ酸残基を有し、当該変異は、好ましくは、５４２Ｒ及び６０７Ｒ（Ｓ５４２Ｒ及びＫ６０７Ｒなど）であり、または好ましくは、５４２位及び５４８位（ならびに任意選択で５５２位）に変異アミノ酸残基を有し、当該変異は、好ましくは、５４２Ｒ及び５４８Ｖ（ならびに任意選択で５５２Ｒ）（Ｓ５４２Ｒ及びＫ５４８Ｖ（ならびに任意選択でＮ５５２Ｒ）など）であり、あるいはＬｂＣｐｆ１の５３２位、５３８位、５４２位、及び／または５９５位、あるいはＡｓＣｐｆ１のオルソログ、ホモログ、またはバリアントにおける対応位置であり、好ましくは、５３２位、または５３２位及び５９５位に変異アミノ酸残基を有し、当該変異は、好ましくは、５３２Ｒ及び５９５Ｒ（Ｇ５３２Ｒ及びＫ５９５Ｒなど）であり、または好ましくは、５３２位及び５３８位（ならびに任意選択で５４２位）に変異アミノ酸残基を有し、当該変異は、好ましくは、５３２Ｒ及び５３８Ｖ（ならびに任意選択で５４２Ｒ）（Ｇ５３２Ｒ及びＫ５３８Ｖ（ならびに任意選択でＹ５４２Ｒ）など）であり、最も好ましくは、当該変異は、ＡｓＣｐｆ１のＳ５４２Ｒ及びＫ６０７Ｒ、Ｓ５４２Ｒ及びＫ５４８Ｖ、またはＳ５４２Ｒ、Ｋ５４８Ｖ、及びＮ５５２Ｒである。
非活性化／不活性化Ｃｐｆ１タンパク質
Ｃｐｆ１タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する場合、Ｃｐｆ１タンパク質は、改変されることでヌクレアーゼ活性が低減され得（例えば、野生型酵素と比較するとヌクレアーゼ活性が少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは１００％低減される）、あるいは換言すれば、Ｃｐｆ１酵素が有するヌクレアーゼ活性は、有利には、非変異型または野生型のＣｐｆ１酵素またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性の約０％であるか、あるいは非変異型または野生型のＣｐｆ１酵素（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、もしくはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１）の非変異型もしくは野生型のＣｐｆ１酵素）またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性の約３％以下または約５％以下または約１０％以下である。このことは、Ｃｐｆ１及びそのオルソログのヌクレアーゼドメインに変異を導入することによって可能である。
本発明の好ましい実施形態では、Ｃｐｆ１ニッカーゼであるＣｐｆ１タンパク質が少なくとも１つ使用される。より具体的には、標的鎖は切断しないが、標的鎖に相補的な鎖（すなわち、本明細書ではガイド配列に相補的ではない鎖とも称される非標的ＤＮＡ鎖）のみを切断する能力を有するＣｐｆ１ニッカーゼが使用される。より具体的には、Ｃｐｆ１ニッカーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種に由来するＣｐｆ１のＮｕｃドメインの１２２６Ａ位のアルギニン、またはＣｐｆ１オルソログにおける対応位置に変異を含むＣｐｆ１タンパク質である。別の特定の実施形態では、酵素は、アルギニンからアラニンへの置き換え、またはＲ１２２６Ａ変異を含む。酵素がＡｓＣｐｆ１ではない場合、対応位置の残基に変異が導入され得ることを当業者なら理解するであろう。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１は、ＦｎＣｐｆ１であり、変異は、Ｒ１２１８位のアルギニンを対象とするものである。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１は、ＬｂＣｐｆ１であり、変異は、Ｒ１１３８位のアルギニンを対象とするものである。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１は、ＭｂＣｐｆ１であり、変異は、Ｒ１２９３位のアルギニンを対象とするものである。
ある特定の実施形態では、操作されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が付加的または代替的に使用され、この操作されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を低減または除去する変異を１つまたは複数含み得る。ＦｎＣｐｆ１ｐ ＲｕｖＣドメインにおけるアミノ酸位置には、限定されないが、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｎ１２５７Ａ、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ、及びＮ１２５７Ａが含まれる。出願人らは、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫヌクレアーゼスーパーファミリーに最も類似しており、ＨｉｎｃＩＩエンドヌクレアーゼ様の第２の推定ヌクレアーゼドメインも同定している。ヌクレアーゼ活性を実質的に低減するためにこの推定ヌクレアーゼドメインに導入されるべき点変異には、限定されないが、Ｎ５８０Ａ、Ｎ５８４Ａ、Ｔ５８７Ａ、Ｗ６０９Ａ、Ｄ６１０Ａ、Ｋ６１３Ａ、Ｅ６１４Ａ、Ｄ６１６Ａ、Ｋ６２４Ａ、Ｄ６２５Ａ、Ｋ６２７Ａ、及びＹ６２９Ａが含まれる。好ましい実施形態では、ＦｎＣｐｆ１ｐ ＲｕｖＣドメインにおける変異は、Ｄ９１７ＡまたはＥ１００６Ａであり、Ｄ９１７Ａ変異またはＥ１００６Ａ変異によって、ＦｎＣｐｆ１エフェクタータンパク質のＤＮＡ切断活性が完全に不活性化される。別の実施形態では、ＦｎＣｐｆ１ｐ ＲｕｖＣドメインにおける変異は、Ｄ１２５５Ａであり、変異ＦｎＣｐｆ１エフェクタータンパク質の核酸分解活性は、顕著に低減されている。
より具体的には、不活性化Ｃｐｆ１酵素には、ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸位置であるＡｓ９０８、Ａｓ９９３、Ａｓ１２６３、またはＣｐｆ１オルソログにおける対応位置に変異を有する酵素が含まれる。さらに、不活性化Ｃｐｆ１酵素には、ＬｂＣｐｆ１のアミノ酸位置であるＬｂ８３２、Ｌｂ９２５、Ｌｂ９４７、もしくはＬｂ１１８０、またはＣｐｆ１オルソログにおける対応位置に変異を有する酵素が含まれる。より具体的には、不活性化Ｃｐｆ１酵素には、ＡｓＣｐｆ１のＡｓＤ９０８Ａ変異、ＡｓＥ９９３Ａ変異、ＡｓＤ１２６３Ａ変異、またはＣｐｆ１オルソログにおける対応変異、のうちの１つまたは複数を含む酵素が含まれる。さらに、不活性化Ｃｐｆ１酵素には、ＬｂＣｐｆ１のＬｂＤ８３２Ａ変異、Ｅ９２５Ａ変異、Ｄ９４７Ａ変異、もしくはＤ１１８０Ａ変異、またはＣｐｆ１オルソログにおける対応変異、のうちの１つまたは複数を含む酵素が含まれる。
変異は、付近の残基にも導入され得、例えば、ヌクレアーゼ活性に関与する上記のものの付近のアミノ酸に変異が導入される。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣドメインのみが不活性化され、他の実施形態では、別の推定ヌクレアーゼドメインが不活性化され、エフェクタータンパク質複合体は、ニッカーゼとして機能し、１つのＤＮＡ鎖のみを切断する。好ましい実施形態では、その他の推定ヌクレアーゼドメインは、ＨｉｎｃＩＩ様エンドヌクレアーゼドメインである。
不活性化Ｃｐｆ１またはＣｐｆ１ニッカーゼは、（例えば、タンパク質の融合を介して）結合した１つまたは複数の機能ドメインを有し得、こうした機能ドメインには、例えば、アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインが含まれる。場合によっては、異種ＮＬＳが少なくとも１つ追加で提供されることが有利である。場合によっては、ＮＬＳをＮ末端に配置することが有利である。一般に、不活性化Ｃｐｆ１またはＣｐｆ１ニッカーゼ上の１つまたは複数の機能ドメインの配置は、備わった機能的作用を機能ドメインが標的に及ぼす上で正しい空間的配向を可能にするものである。例えば、機能ドメインが、アデノシンデアミナーゼの触媒ドメインであるとき、アデノシンデアミナーゼの触媒ドメインは、それが標的アデニンと接触し、当該標的アデニンを脱アミノ化することが可能になる空間的配向で配置される。こうした位置には、Ｃｐｆ１のＮ末端／Ｃ末端以外の位置が含まれ得る。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、Ｃｐｆ１の内部ループに挿入される。
ＰＡＭの決定
ＰＡＭは、下記のように確実に決定することができる。この実験は、ＳｔＣａｓ９を異種発現させるためのＥ．ｃｏｌｉにおける同様の研究（Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９，９２７５－９２８２（２０１１））に密接に通じるものである。出願人らは、ＰＡＭと耐性遺伝子との両方を含むプラスミドを異種Ｅ．ｃｏｌｉに導入し、次に、対応抗生物質上に播種している。プラスミドのＤＮＡ切断が生じれば、出願人らが生存コロニーを観察することはない。
さらに詳細に記載すると、このアッセイは、ＤＮＡ標的に対して下記のように行われる。このアッセイでは、Ｅ．ｃｏｌｉ株が２つ使用される。一方の株は、当該細菌株由来の内在性のエフェクタータンパク質遺伝子座をコードするプラスミドを保有する。もう一方の株は、空のプラスミドを保有する（例えば、ｐＡＣＹＣ１８４を保有する対照株）。可能性を有するすべてのＰＡＭ配列（７ｂｐまたは８ｂｐ）を、抗生物質耐性プラスミド（アンピシリン遺伝子を含むｐＵＣ１９）上に存在させる。ＰＡＭは、プロトスペーサー１（内在性のエフェクタータンパク質遺伝子座における第１のスペーサーに対するＤＮＡ標的）の配列の隣に配置する。２つのＰＡＭライブラリーをクローニングした。一方は、ランダムな８ｂｐを上記プロトスペーサーの５’に１つ有する（例えば、異なるＰＡＭ配列の総数６５５３６＝複雑度）。もう一方のライブラリーは、ランダムな７ｂｐを上記プロトスペーサーの３’に１つ有する（例えば、総複雑度は、異なるＰＡＭ数１６３８４である）。可能性を有するＰＡＭ当たり平均５００個のプラスミドを有するように両ライブラリーをクローニングした。別々の形質転換として、５’ＰＡＭライブラリー及び３’ＰＡＭライブラリーで試験株及び対照株を形質転換し、形質転換細胞をアンピシリンプレートに別々に播種した。プラスミドが認識され、次いで切断／干渉を受けると、アンピシリンに対して細胞が脆弱化し、細胞増殖が阻止される。形質転換の約１２時間後に、試験株及び対照株によって形成されたすべてのコロニーを収集し、プラスミドＤＮＡを単離した。ＰＣＲ増幅及びその後のディープシークエンシングのためのテンプレートとしてプラスミドＤＮＡを使用した。非形質転換ライブラリーにおけるすべてのＰＡＭの相当物によって、形質転換細胞におけるＰＡＭの予測相当物を明らかにした。対照株に見られるすべてのＰＡＭの相当物によって、実際の相当物を明らかにした。試験株におけるすべてのＰＡＭの相当物から、酵素によってどのＰＡＭが認識されるかを明らかにした。対照株と比較することによって、枯渇したＰＡＭの配列を抽出することが可能である。
ある特定の野生型Ｃｐｆ１オルソログについては、下記のＰＡＭが同定されている：Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種であるＢＶ３Ｌ６のＣｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６のＣｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）、及びＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ（ＰａＣｐｆ１）は、ＴＴＴＶ ＰＡＭ（Ｖは、Ａ／ＣまたはＧである）の下流に位置する標的部位を切断することができ、ＦｎＣｐｆ１ｐは、ＴＴＮ（Ｎは、Ａ／Ｃ／ＧまたはＴである）の下流に位置する部位を切断することができる。Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ０８＿００２０５、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ１１＿００２０５、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ属の１種であるＮＣ３００５、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ属の１種であるＸＳ５、またはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、のＰＡＭは、５’ＴＴＮ（Ｎは、Ａ／Ｃ／ＧまたはＴである）である。天然のＰＡＭ配列は、ＴＴＴＶまたはＢＴＴＶ（Ｂは、Ｔ／ＣまたはＧであり、Ｖは、Ａ／ＣまたはＧである）であり、エフェクタータンパク質は、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｌａｃｕｎａｔａ Ｃｐｆ１である。
送達
いくつかの実施形態では、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の構成要素は、さまざまな形態（ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡまたはタンパク質ＲＮＡという組み合わせなど）で送達され得る。例えば、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＤＮＡコードポリヌクレオチドもしくはＲＮＡコードポリヌクレオチド、またはタンパク質として送達され得る。ガイドは、ＤＮＡコードポリヌクレオチドまたはＲＮＡとして送達され得る。混合形態の送達を含めて、すべての可能な組み合わせが想定される。
いくつかの態様では、本発明は、１つもしくは複数のポリヌクレオチド（または本明細書に記載の１つもしくは複数のベクターなど）、その１つもしくは複数の転写物、及び／またはそこから転写される１つもしくは複数のタンパク質を、宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。
ベクター
一般に、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指す。ベクターは、別のＤＮＡセグメントが挿入される結果、当該挿入セグメントの複製が生じ得るレプリコン（プラスミド、ファージ、またはコスミドなど）である。一般に、ベクターは、適切な制御要素と結合されたときに複製能力を有する。ベクターには、限定されないが、一本鎖、二本鎖、または部分的二本鎖である核酸分子、１つまたは複数の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端を含まない（例えば、環状の）核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含む核酸分子、ならびに当該技術分野において知られる他のさまざまなポリヌクレオチド、が含まれる。１つの型のベクターは、「プラスミド」であり、「プラスミド」は、標準的な分子クローニング技術などによってＤＮＡセグメントを追加挿入できる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、当該ベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングを生じさせるためのウイルス由来のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞にトランスフェクションするためのウイルス保有のポリヌクレオチドも含む。ある特定のベクターは、それが導入される宿主細胞において自己複製する能力を有する（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それが機能可能なように連結された遺伝子の発現を誘導する能力を有する。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。真核細胞における発現のためのベクター及び真核細胞における発現をもたらすベクターは、本明細書では「真核生物発現ベクター」と称され得る。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態をとることが多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含み得、このことは、組換え発現ベクターが、発現すべき核酸配列に機能可能なように連結された１つまたは複数の制御要素（発現のために使用されるべき宿主細胞に基づいて選択され得る）を含むことを意味する。組換え発現ベクターに関する「機能可能なように連結された」は、目的ヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入されたときに宿主細胞おいて）当該ヌクレオチド配列の発現が可能になる様式で制御要素（複数可）に連結されていることを意味することが意図される。有利なベクターには、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが含まれ、そのようなベクターの型は、特定の型の細胞が標的となるように選択することもできる。
組換え方法及びクローニング方法に関しては、ＵＳ２００４－０１７１１５６Ａ１として２００４年９月２日に公開された米国特許出願１０／８１５，７３０が挙げられ、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
「制御要素」とう用語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御要素（例えば、転写終結シグナル（ポリアデニル化シグナル及びポリ－Ｕ配列など））を含むことが意図される。そのような制御要素は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。制御要素には、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するものと、ある特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（例えば、組織特異的制御配列）と、が含まれる。組織特異的プロモーターは、主に所望の目的組織（筋肉、神経細胞、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）など）または特定の細胞型（例えば、リンパ球）において発現を誘導し得る。制御要素は、時間依存的な様式（細胞周期依存的な様式または発生段階依存的な様式など）での発現も誘導し得、この発現は、組織特異的または細胞型特異的である場合もない場合もあり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つもしくは複数のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つもしくは複数のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つもしくは複数のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、またはそれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、限定されないが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーが付随する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーが付随する）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照のこと］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。「制御要素」という用語は、エンハンサー要素も包含し、こうしたエンハンサー要素は、ＷＰＲＥ、ＣＭＶエンハンサー、ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６－４７２，１９８８）、ＳＶ４０エンハンサー、ならびにウサギβ－グロビンのエクソン２とエクソン３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７－３１，１９８１）などである。発現ベクターの設計は、形質転換対象の宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの因子に依存し得ることを当業者なら理解するであろう。宿主細胞にベクターを導入することによって、融合タンパク質または融合ペプチドを含めて、本明細書に記載の核酸がコードする転写物、タンパク質、またはペプチド（例えば、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、その変異形態、その融合タンパク質など）が産生し得る。制御配列に関しては、米国特許出願１０／４９１，０２６が挙げられ、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。プロモーターに関しては、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８９２９及び米国出願第１２／５１１，９４０号が挙げられ、これらの文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
有利なベクターには、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが含まれ、そのようなベクターの型は、特定の型の細胞が標的となるように選択することもできる。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡと、アデノシンデアミナーゼに融合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（任意選択で改変または変異導入されたもの）と、のためのバイシストロン性ベクターが使用される。ガイドＲＮＡと、アデノシンデアミナーゼに融合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（任意選択で改変または変異導入されたもの）と、のためのバイシストロン性発現ベクターが好ましい。一般に、及び特にこの実施形態では、アデノシンデアミナーゼに融合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（任意選択で改変または変異導入されたもの）は、好ましくは、ＣＢｈプロモーターによって誘導される。ＲＮＡは、好ましくは、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（Ｕ６プロモーターなど）によって誘導され得る。理想的には、これら２つは、組み合わせられる。
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、または酵素）が原核細胞または真核細胞において発現するように設計され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなど）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターが使用される）、酵母細胞、または哺乳類細胞において発現し得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに論じられている。あるいは、組換え発現ベクターは、インビトロで転写及び翻訳され得、これは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して行われる。
ベクターは、原核生物または原核細胞に導入され、そこで数が増やされ得る。いくつかの実施形態では、真核細胞に導入されるべきベクターのコピーを増幅するために原核生物が使用されるか、または真核細胞に導入されるべきベクターの生成における中間ベクターとしてそのコピーを増幅（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅）するために原核生物が使用される。いくつかの実施形態では、ベクターのコピーを増幅するために原核生物が使用され、この原核生物は、１つまたは複数の核酸を発現することで、宿主細胞または宿主生物に送達するための１つまたは複数のタンパク質の供給源となるなどする。原核生物におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を誘導する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに含めて実施されることが最も多い。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に複数のアミノ酸を付加するものであり、組換えタンパク質のアミノ末端などに複数のアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、以下の目的などの１つまたは複数の目的を果たし得る：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させる目的、（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解性を向上させる目的、及び（ｉｉｉ）親和性精製におけるリガンドとして働くことによって組換えタンパク質の精製を支援する目的。多くの場合、融合発現ベクターでは、タンパク質分解性の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との連結部に導入されることで、融合タンパク質を精製した後に、融合部分から組換えタンパク質を切り離すことが可能になる。そのような酵素及びその関連認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例としては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらの融合発現ベクターは、それぞれグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０－８９）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現ベクターを使用すると、昆虫細胞におけるタンパク質の発現がベクターによって誘導される。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が含まれる。
いくつかの実施形態では、哺乳類発現ベクターを使用すると、ベクターは、哺乳類細胞における１つまたは複数の配列の発現を誘導する能力を有する。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５）が挙げられる。哺乳類細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には、１つまたは複数の制御要素によって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、サルウイルス４０、ならびに本明細書に開示される他のもの、及び当該技術分野において知られる他のものに由来する。原核細胞にも真核細胞にも適した他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の１６章及び１７章を参照のこと。
いくつかの実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を誘導する能力を有する（例えば、核酸を発現させるために組織特異的制御要素が使用される）。組織特異的制御要素は、当該技術分野において知られている。適切な組織特異的プロモーターの例としては、限定されないが、アルブミンプロモーター（肝臓特異的なもの；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）（具体的には、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）及び免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８））、神経細胞特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に制御されるプロモーターも包含され、こうしたプロモーターは、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）及びα－フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）である。こうした原核生物ベクター及び真核生物ベクターに関しては、米国特許６，７５０，０５９が挙げられ、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本発明の他の実施形態は、ウイルスベクターの使用に関し得、これに関しては、米国特許出願第１３／０９２，０８５号が挙げられ、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。組織特異的制御要素は、当該技術分野において知られており、これに関しては、米国特許７，７７６，３２１が挙げられ、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、制御要素は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数の要素の発現を誘導するようにＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数の要素に機能可能なように連結される。
いくつかの実施形態では、核酸標的化系の１つまたは複数の要素の発現を誘導する１つまたは複数のベクターが宿主細胞に導入され、その結果、核酸標的化系の要素が発現することによって１つまたは複数の標的部位における核酸標的化複合体の形成が誘導される。例えば、核酸標的化エフェクター酵素及び核酸標的化ガイドＲＮＡはそれぞれ、別々のベクター上の別々の制御要素に機能可能なように連結され得る。核酸標的化エフェクタータンパク質が導入されたトランスジェニック動物またはトランスジェニック哺乳類に対して核酸標的化系のＲＮＡ（複数可）を送達することができ、こうしたトランスジェニック動物またはトランスジェニック哺乳類は、例えば、核酸標的化エフェクタータンパク質を構成的または誘導的または条件的に発現する動物または哺乳類であるか、あるいはその他の様式で核酸標的化エフェクタータンパク質を発現する動物もしくは哺乳類、または核酸標的化エフェクタータンパク質を含む細胞を有する動物もしくは哺乳類であり、こうした動物または哺乳類は、核酸標的化エフェクタータンパク質をコードするか、またはインビボで発現するベクター（複数可）をこうした動物または哺乳類に事前に投与することなどによって作成される。あるいは、同じまたは異なる制御要素から発現する要素のうちの２つ以上が、核酸標的化系のうちで第１のベクターには含まれない任意の構成要素を提供する１つまたは複数の追加のベクターと、単一のベクターにおいて組み合わせられ得る。単一のベクターにおいて組み合わせられる核酸標的化系要素は、任意の適切な配向で配置され得、ある要素は、第２の要素に対して５’側（「上流」）に位置するか、または第２の要素に対して３’側（「下流」）に位置するなどする。ある要素のコード配列は、第２の要素のコード配列と同じ鎖または逆の鎖に位置し、同じまたは逆の向きに配向され得る。いくつかの実施形態では、核酸標的化エフェクタータンパク質及び核酸標的化ガイドＲＮＡをコードする転写物の発現が単一のプロモーターによって誘導され、これらの要素は、１つまたは複数のイントロン配列内に埋め込まれる（例えば、異なるイントロンにそれぞれの要素が埋め込まれるか、少なくとも１つのイントロンに２つ以上の要素が埋め込まれるか、または単一のイントロンにすべての要素が埋め込まれる）。いくつかの実施形態では、核酸標的化エフェクタータンパク質及び核酸標的化ガイドＲＮＡは、同じプロモーターに機能可能なように連結され、当該同じプロモーターから発現し得る。核酸標的化系の１つまたは複数の要素を発現させるための送達媒体、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤、及びその構成要素は、前述の文書（ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）など）において使用されているようなものである。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の挿入部位（制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」）とも称される）など）を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の挿入部位（例えば、約１つ以上、約２つ以上、約３つ以上、約４つ以上、約５つ以上、約６つ以上、約７つ以上、約８つ以上、約９つ以上、約１０個以上、もしくはそれ以上のまたはこれを超える挿入部位）は、１つまたは複数のベクターの１つまたは複数の配列要素の上流及び／または下流に位置する。複数の異なるガイド配列が使用されるとき、細胞内の複数の異なる対応標的配列を核酸標的化活性の標的とするために、単一の発現コンストラクトが使用され得る。例えば、約１つ以上、約２つ以上、約３つ以上、約４つ以上、約５つ以上、約６つ以上、約７つ以上、約８つ以上、約９つ以上、約１０個以上、約１５個以上、約２０個以上、もしくはそれ以上のまたはこれを超えるガイド配列を単一のベクターが含み得る。いくつかの実施形態では、そのようなガイド配列含有ベクターが、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０個、もしくはそれ以上のまたはこれを超えるベクターが提供され、任意選択で細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、核酸標的化エフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列に機能可能なように連結された制御要素を含む。核酸標的化エフェクタータンパク質または核酸標的化ガイドＲＮＡ（複数可）を別々に送達することができ、有利には、こうした要素の少なくとも１つは、粒子複合体を介して送達される。核酸標的化ガイドＲＮＡに先んじて核酸標的化エフェクタータンパク質ｍＲＮＡを送達することで、核酸標的化エフェクタータンパク質が発現する時間をとることができる。核酸標的化エフェクタータンパク質ｍＲＮＡは、核酸標的化ガイドＲＮＡが投与される１～１２時間前（好ましくは、およそ２～６時間前）に投与され得る。あるいは、核酸標的化エフェクタータンパク質ｍＲＮＡと核酸標的化ガイドＲＮＡとを一緒に投与することもできる。有利には、核酸標的化エフェクタータンパク質ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡを最初に投与してから１～１２時間後（好ましくは、およそ２～６時間後）に第２の追加用量のガイドＲＮＡを投与することができる。ゲノム改変の効率レベルを最大化するには、核酸標的化エフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び／またはガイドＲＮＡを追加投与することが有用であり得る。
哺乳類細胞または標的組織に核酸を導入するために、従来のウイルスベースまたは非ウイルスベースの遺伝子導入方法を利用することができる。そのような方法を使用することで、核酸標的化系の構成要素をコードする核酸を培養細胞または宿主生物に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及び送達媒体（リポソームなど）と複合体化した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが含まれ、これらは、細胞への送達後にエピソームとして留まるか、またはゲノムに組み込まれる。遺伝子治療の手順の総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０（１９９２）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９－１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）、及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６（１９９４）を参照のこと。
核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリ陽イオンまたは脂質と核酸との結合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ならびに薬剤増進型のＤＮＡ取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、及び同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性脂質及び中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４に記載のものが含まれる。送達は、細胞への送達（例えば、インビトロもしくはエクスビボの投与）、または標的組織への送達（例えば、インビボの投与）であり得る。
プラスミド送達は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質発現プラスミドへのガイドＲＮＡのクローニングと、細胞培養における当該ＤＮＡのトランスフェクションと、を含む。プラスミド骨格は、市販されており、特別な何かが備わっている必要はない。プラスミド骨格は、モジュール性を有するという利点があり、異なるサイズのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓコード配列（サイズがより大きなタンパク質をコードするものを含む）ならびに選択マーカーを保有する能力を有する。プラスミドは、一過性発現の確保もできるが、持続発現も確保できるという両方の利点を有する。一方で、プラスミドの送達は一筋縄ではいかず、その結果、インビボの効率は低いことが多い。持続発現もまた、オフターゲット編集を助長し得るという点において、不利となり得る。さらに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が過剰に蓄積すると、細胞に毒性が及び得る。最終的に、宿主ゲノムにｄｓＤＮＡがランダムに組み込まれるというリスクがプラスミドには常につきまとい、より具体的には、（オンターゲット及びオフターゲットの）二本鎖切断が生じるということを考慮すると、上記のリスクがプラスミドには常につきまとう。
脂質と核酸との複合体の調製は、標的化リポソーム（免疫脂質複合体など）を含めて、当業者によく知られている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、及び同第４，９４６，７８７号を参照のこと）。これについては、以下により詳細に論じられる。
ＲＮＡウイルスベースの系またはＤＮＡウイルスベースの系を核酸の送達に使用することにおいては、体内の特定の細胞がウイルスの標的となり、ウイルスのペイロードが核に輸送されるように高度に進化したプロセスが利用される。ウイルスベクターを患者に直接的に投与することができ（インビボ）、またはウイルスベクターをインビトロで使用して細胞を処理することができ、改変細胞を任意選択で患者に投与することができる（エクスビボ）。従来のウイルスベースの系には、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及び単純ヘルペスウイルスベクターが含まれ得る。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入方法を用いると可能であり、挿入された導入遺伝子の発現が持続することが多い。さらに、多くの異なる細胞型及び標的組織において高い形質導入効率が観察されている。
外来エンベロープタンパク質を組み込むことによってレトロウイルスの向性を変えることで、標的細胞の潜在的な標的集団を広げることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞への形質導入または感染が可能な、典型的には、高いウイルス力価が得られるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存することになる。レトロウイルスベクターは、最大で６～１０ｋｂの外来配列をパッケージングする能力を有するシス作用性の長い末端反復配列から構成される。このベクターの複製及びパッケージングには最小のシス作用性ＬＴＲで十分であり、次に、このＬＴＲを標的細胞への治療遺伝子の組み込みに使用することで、導入遺伝子の発現が持続するようになる。広く使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）に基づくもの、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）に基づくもの、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に基づくもの、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくもの、及びそれらの組み合わせが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。
一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスベースの系が使用され得る。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い効率で形質導入を行う能力を有しており、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターでは、高い力価及び発現レベルが得られている。このベクターは、比較的簡単な系において大量に得ることができる。標的化核酸での細胞の形質導入には、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも使用され得、例えば、核酸及びペプチドのインビトロでの産生において、ならびにインビボ及びエクスビボの遺伝子治療手順向けに、使用される（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築については、いくつかの刊行物に記載されており、こうした刊行物には、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）、及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）が含まれる。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系をコードする外来性核酸分子を含むＡＡＶ、もしくは当該外来性核酸分子から本質的になるＡＡＶを提供し、当該ＡＡＶは、例えば、プロモーター、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（推定ヌクレアーゼタンパク質もしくは推定ヘリカーゼタンパク質）（例えば、Ｃｐｆ１）をコードする核酸分子、及びターミネーター、を含むか、もしくはこれらの要素から本質的になる第１のカセットと、プロモーター、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子、及びターミネーターを含むか、もしくはこれらの要素から本質的になる１つもしくは複数（有利には、ベクターのパッケージングサイズ限界となる数まで）（例えば、（第１のカセットを含めると）全部で５つ）のカセット（例えば、それぞれのカセットは、プロモーター－ｇＲＮＡ１－ターミネーター、プロモーター－ｇＲＮＡ２－ターミネーター．．．プロモーター－ｇＲＮＡ（Ｎ）－ターミネーターとして模式的に示され、式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界が上限となる挿入可能数である）と、を含むか、もしくはこれらのカセットからなる複数のカセットを含むか、もしくは当該複数のカセットから本質的になるものであり、または本発明は、２つ以上の個別のｒＡＡＶを提供し、それぞれのｒＡＡＶは、ＣＲＩＳＰＲ系のカセットを１つ以上含み、例えば、第１のｒＡＡＶは、プロモーター、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ（Ｃｐｆ１））をコードする核酸分子、及びターミネーターを含むか、もしくはこれらの要素から本質的になる第１のカセットを含み、第２のｒＡＡＶは、プロモーター、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子、及びターミネーターをそれぞれが含むか、もしくはこれらの要素からそれぞれが本質的になる１つもしくは複数のカセットを含む（例えば、それぞれのカセットは、プロモーター－ｇＲＮＡ１－ターミネーター、プロモーター－ｇＲＮＡ２－ターミネーター．．．プロモーター－ｇＲＮＡ（Ｎ）－ターミネーターとして模式的に示され、式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界が上限となる挿入可能数である）。あるいは、Ｃｐｆ１は、それ自体のｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡをプロセシングできるため、マルチプレックス遺伝子編集を行うために単一のｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡアレイを使用できる。したがって、複数のｇＲＮＡを送達するために複数のカセットを含める代わりに、ｒＡＡＶは、プロモーター、複数のｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡ、及びーミネーターを含むか、またはこれらの要素から本質的になる単一のカセットを含み得る（この単一のカセットは、例えば、プロモーター－ｇＲＮＡ１－ｇＲＮＡ２…ｇＲＮＡ（Ｎ）－ターミネーターとして模式的に示され、式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界が上限となる挿入可能数である）。Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３５，３１－３４（２０１７）を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ｒＡＡＶは、ＤＮＡウイルスであるため、ＡＡＶまたはｒＡＡＶに関して本明細書で論じられる核酸分子は、有利には、ＤＮＡである。プロモーターは、いくつかの実施形態では、有利には、ヒトシナプシンＩプロモーター（ｈＳｙｎ）である。核酸を細胞に送達するための方法は、当業者において他にも知られている。例えば、ＵＳ２００３００８７８１７を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、球菌（Ｃｏｃａｌ）ベシクロウイルスのエンベロープでシュードタイプ化されたレトロウイルスベクター粒子が企図される（例えば、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒに付与された米国特許公開第２０１２０１６４１１８号を参照のこと）。球菌ウイルスは、Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ属に分類されており、哺乳類における水疱性口内炎の原因病原体である。球菌ウイルスは、元々は、トリニダードにおいてダニから単離されたものであり（Ｊｏｎｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６－２４２（１９６４））、トリニダード、ブラジル、及びアルゼンチンにおいて昆虫、ウシ、及びウマからの感染が確認されている。哺乳類に感染するベシクロウイルスの多くは、天然に感染した節足動物から単離されており、このことは、ベシクロウイルスがベクター媒介性であることを示唆している。ベシクロウイルスが特有に見られ、検査室獲得感染が生じる農村地域で生活する人々の間では、このウイルスに対する抗体が共通して見られる。ヒトに感染すると、通常、インフルエンザ様の症状が引き起こされる。球菌ウイルスのエンベロープ糖タンパク質は、ＶＳＶ－Ｇインディアナ株とアミノ酸レベルで７１．５％の同一性を共有しており、ベシクロウイルスのエンベロープ遺伝子の系統発生学的な比較から、球菌ウイルスが、血清学的にはＶＳＶ－Ｇインディアナ株と異なるものの、ベシクロウイルスの中ではＶＳＶ－Ｇインディアナ株と最も密接に関連することが示されている。Ｊｏｎｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６－２４２（１９６４）、及びＴｒａｖａｓｓｏｓ ｄａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄ．＆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ３３：９９９－１００６（１９８４）。球菌ベシクロウイルスのエンベロープでシュードタイプ化されたレトロウイルスベクター粒子には、例えば、レトロウイルスのＧａｇ、Ｐｏｌ、及び／または１つもしくは複数のアクセサリータンパク質（複数可）と、球菌ベシクロウイルスのエンベロープタンパク質と、を含み得るレンチウイルスベクター粒子、アルファレトロウイルスベクター粒子、ベータレトロウイルスベクター粒子、ガンマレトロウイルスベクター粒子、デルタレトロウイルスベクター粒子、及びイプシロンレトロウイルスベクター粒子が含まれ得る。こうした実施形態のある特定の態様では、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びアクセサリータンパク質は、レンチウイルス及び／またはガンマレトロウイルスのものである。
いくつかの実施形態では、宿主細胞には、本明細書に記載のベクターの１つまたは複数が一過性または非一過性にトランスフェクションされる。いくつかの実施形態では、細胞は、それが任意選択で再導入されるべき対象において天然に生じるようにトランスフェクションされる。いくつかの実施形態では、トランスフェクションされる細胞は、対象から採取される。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から採取される細胞に由来するもの（細胞株など）である。組織培養のための細胞株は、多種多様なものが当該技術分野において知られている。細胞株の例としては、限定されないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ－３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ－Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ－３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ－２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ－７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ－ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ－Ｋ２、ＷＥＨＩ－２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ－１、ＢＣ－３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ－５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－６、ＣＯＳ－Ｍ６Ａ、ＢＳ－Ｃ－１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３ Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３－Ｌ１、１３２－ｄ５ヒト胎児線維芽細胞、１０．１マウス線維芽細胞、２９３－Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ－５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ－１細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ－２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ－２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ－７、ＣＨＯ－ＩＲ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｋ２、ＣＨＯ－Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ－／－、ＣＯＲ－Ｌ２３、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ－Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ－Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ－７、ＣＯＶ－４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ－６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ－２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ－Ｍｅｌ１－４８、ＭＣ－３８、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－１０Ａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ６、ＭＴＤ－１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＮＡＬＭ－１、ＮＷ－１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ－１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ－５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｓｆ－９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ－４９、Ｘ６３、ＹＡＣ－１、ＹＡＲ、及びそのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞株は、当業者に知られるさまざまな供給元から利用可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）を参照のこと）。
特定の実施形態では、オフターゲット効果の低減などを行うために、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素のうちの１つまたは複数の一過性の発現及び／または存在が目的となり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のベクターの１つまたは複数がトランスフェクションされた細胞が、ベクター由来の配列を１つまたは複数含む新たな細胞株の確立に使用される。いくつかの実施形態では、（１つもしくは複数のベクターの一過性のトランスフェクション、またはＲＮＡのトランスフェクションなどによって）本明細書に記載のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素が一過性にトランスフェクションされ、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を介して改変された細胞が、改変を含むが、いずれの他の外来性配列も含まない細胞を含む新たな細胞株の確立に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のベクターの１つまたは複数が一過性または非一過性にトランスフェクションされた細胞、またはそのような細胞に由来する細胞株が、１つまたは複数の試験化合物の評価において使用される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／またはタンパク質を直接的に宿主細胞に導入することが想定される。例えば、インビトロで転写されたガイドＲＮＡと一緒に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡとして送達することができる。そのような方法では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の作用を確保する時間を低減することができ、さらに、ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素の発現が長期化することが阻止される。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、リポソーム製剤またはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ製剤及び同様のものにおいて送達され、当業者によく知られる方法によって調製することができる。そのような方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号、及び同第５，５８０，８５９号に記載されており、これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。哺乳類細胞へのｓｉＲＮＡの送達の増進及び改善を特に目的とする送達系が開発されており（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１－１１４、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６－１０１０、Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９：２１０－２１６、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７：７６１－７６６、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７－１０８、及びＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００３，３１，１１：２７１７－２７２４を参照のこと）、こうした送達系は、本発明に適用され得る。ｓｉＲＮＡは、霊長類における遺伝子発現の阻害に最近使用され、成功を収めており（例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２４（４）：６６０を参照のこと）、これもまた、本発明に適用され得る。
実際、ＲＮＡ送達は、有用なインビボ送達方法である。リポソームまたはナノ粒子を使用すると、Ｃｐｆ１、アデノシンデアミナーゼ、及びガイドＲＮＡを細胞に送達することが可能である。したがって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（Ｃｐｆ１など）の送達、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もしくはアダプタータンパク質に融合され得る）の送達、及び／または本発明のＲＮＡの送達は、ＲＮＡ形態で行われ、微小胞、リポソーム、または粒子（複数可）を介するものであり得る。例えば、Ｃｐｆ１のｍＲＮＡ、アデノシンデアミナーゼのｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡを、インビボ送達用のリポソーム粒子にパッケージングすることができる。リポソームトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから供給されるｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅなど）及び市場の他の試薬によってＲＮＡ分子を肝臓に効率的に送達することができる。
同様に好ましいＲＮＡ送達手段には、粒子を介するＲＮＡ送達（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：３１１２－３１１８，２０１０）、またはエクソソームを介するＲＮＡ送達（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９－２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）が含まれる。実際、エクソソームは、ｓｉＲＮＡの送達において特に有用であることが示されており、ｓｉＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ系にいくらか通じるものがある系である。例えば、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（“Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２－２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １５．）では、異なる生物学的障壁を超えて薬物を送達する上でエクソソームがいかに有望なツールであるかに加えて、インビトロ及びインビボでのｓｉＲＮＡの送達に利用できることが記載されている。これらの手法は、発現ベクターのトランスフェクションを介して、ペプチドリガンドと融合したエクソソームタンパク質を含む標的化エクソソームを生成させるというものである。次に、エクソソームは、トランスフェクションされた細胞の上清から精製され、特徴付けられた後、ＲＮＡがエクソソームに組み込まれる。本発明による送達及び投与は、エクソソームを用いて実施することができ、具体的には、脳への送達及び投与が行われるが、これに限定されない。ビタミンＥ（α－トコフェロール）がＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓと結合され、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）とともに脳に送達され得る。この送達は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を脳に送達するためにＵｎｏ ｅｔ ａｌ．（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：７１１－７１９（Ｊｕｎｅ ２０１１））によって行われたものと同様の様式で行われる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または遊離ＴｏｃｓｉＢＡＣＥもしくはＴｏｃ－ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬが充填され、脳注入キット３（Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ ３）（Ａｌｚｅｔ）と連結された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を介してマウスへの注入が行われた。背側第３脳室への注入を行うために正中線上のブレグマ後方約０．５ｍｍに脳注入カニューレが留置された。Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．は、わずか３ｎｍｏｌのＴｏｃ－ｓｉＲＮＡをＨＤＬと共存させると、同じＩＣＶ注入法によって得られるものと同等程度に標的の低減が誘導され得ることを見出した。同様の用量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓをα－トコフェロールに結合させ、脳へと標的化されたＨＤＬと同時投与することが、本発明ではヒトを対象として企図され得、例えば、脳へと標的化された約３ｎｍｏｌ～約３μｍｏｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：４６５－４７５（Ａｐｒｉｌ ２０１１））は、ラットの脊髄においてインビボで遺伝子をサイレンシングするためにＰＫＣγを標的とする低分子ヘアピンＲＮＡをレンチウイルス介在性に送達する方法について記載している。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．は、１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスを、くも膜下腔内カテーテルによって投与した。脳へと標的化されたレンチウイルスベクターにおいて同様の用量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを発現させることが、本発明ではヒトを対象として企図され得、例えば、１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルスにおいて脳へと標的化された約１０～５０ｍｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。
ベクターの用量
いくつかの実施形態では、ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）は、例えば筋肉内注射によって目的組織に送達されるが、静脈内送達方法、経皮送達方法、鼻腔内送達方法、経口送達方法、粘膜送達方法、または他の送達方法を介して送達されることもある。そのような送達は、単回用量または複数回用量によるものであり得る。本明細書の実際の送達用量は、さまざまな因子によって大きく異なり得ることを当業者は理解しており、こうした因子は、ベクターの選択、標的細胞、標的生物、または標的組織、治療すべき対象の全身状態、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与様式、求められる形質転換／改変の型などである。
そのような用量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、医薬的に許容可能な担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、医薬的に許容可能な賦形剤、及び／または当該技術分野において知られる他の化合物をさらに含み得る。用量は、１つまたは複数の医薬的に許容可能な塩（例えば、鉱酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）、及び有機酸の塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）をさらに含み得る。さらに、本明細書では、補助物質（湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲルまたはゲル化材料、香味剤、着色剤、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤など）も存在し得る。さらに、１つまたは複数の他の従来医薬成分（保存剤、保水剤、懸濁剤、サーファクタント、抗酸化剤、凝固阻止剤、増量剤、キレート剤、コーティング剤、化学安定剤など）も存在し得、特に剤形が再構成可能な形態であるならば、１つまたは複数の他の従来医薬成分も存在し得る。適切な成分の例としては、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。医薬的に許容可能な賦形剤の完全な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手可能であり、当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の実施形態の１つでは、送達は、アデノウイルスを介するものであり、この送達は、少なくとも１×１０５個の粒子（粒子単位（ｐｕ）とも称される）のアデノウイルスベクターを含む単回追加用量で行われ得る。本明細書に記載の実施形態の１つでは、用量は、好ましくは少なくとも約１×１０６個の粒子（例えば、約１×１０６～１×１０１２個の粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７個の粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８個の粒子（例えば、約１×１０８～１×１０１１個の粒子もしくは約１×１０８～１×１０１２個の粒子）、最も好ましくは少なくとも約１×１００個の粒子（例えば、約１×１０９～１×１０１０個の粒子もしくは約１×１０９～１×１０１２個の粒子）、または少なくとも約１×１０１０個の粒子（例えば、約１×１０１０～１×１０１２個の粒子）のアデノウイルスベクターである。あるいは、用量は、約１×１０１４個以下の粒子、好ましくは約１×１０１３個以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０１２個以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０１１個以下の粒子、最も好ましくは約１×１０１０個以下の粒子（例えば、約１×１０９個以下の粒子）を含む。したがって、用量は、単回用量のアデノウイルスベクター（例えば、約１×１０６粒子単位（ｐｕ）、約２×１０６ｐｕ、約４×１０６ｐｕ、約１×１０７ｐｕ、約２×１０７ｐｕ、約４×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ、約４×１０１０ｐｕ、約１×１０１１ｐｕ、約２×１０１１ｐｕ、約４×１０１１ｐｕ、約１×１０１２ｐｕ、約２×１０１２ｐｕ、または約４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含む）を含み得る。例えば、２０１３年６月４日にＮａｂｅｌ，ｅｔ．ａｌ．に付与された米国特許第８，４５４，９７２号（Ｂ２）（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のアデノウイルスベクター、及び当該文献の縦列番号２９の３６～５８行目の用量を参照のこと。本明細書に記載の実施形態の１つでは、アデノウイルスは、複数回用量を介して送達される。
本明細書に記載の実施形態の１つでは、送達は、ＡＡＶを介するものである。ヒトにＡＡＶをインビボで送達するための治療的に有効な用量は、約１×１０１０～約１×１０１０個の機能性ＡＡＶ／溶液ｍｌを含む生理食塩水約２０～約５０ｍｌの範囲内であると考えられる。用量は、任意の副作用に対して治療利点のバランスが取れるように調整され得る。本明細書に記載の実施形態の１つでは、ＡＡＶ用量は、一般に、ＡＡＶゲノム数約１×１０５～１×１０５０、ＡＡＶゲノム数約１×１０８～１×１０２０、ゲノム数約１×１０１０～約１×１０１６、またはＡＡＶゲノム数約１×１０１１～約１×１０１６の濃度範囲内である。ヒトの用量は、ＡＡＶゲノム数約１×１０１３であり得る。そのような濃度は、約０．００１ｍｌ～約１００ｍｌ、約０．０５～約５０ｍｌ、または約１０～約２５ｍｌの担体溶液において送達され得る。他の有効用量は、用量反応曲線を確立する日常的な試験によって当業者が容易に確立することができる。例えば、２０１３年３月２６日にＨａｊｊａｒ，ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第８，４０４，６５８号（Ｂ２）の縦列番号２７の４５～６０行目を参照のこと。
本明細書に記載の実施形態の１つでは、送達は、プラスミドを介するものである。そのようなプラスミド組成物では、用量は、プラスミドが応答を誘発する上で十分な量とすべきである。例えば、プラスミド組成物におけるプラスミドＤＮＡの適切な量は、７０ｋｇの個体あたり約０．１～約２ｍｇまたは約１μｇ～約１０μｇであり得る。本発明のプラスミドは、一般に、（ｉ）プロモーターと、（ｉｉ）当該プロモーターに機能可能なように連結されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質コード配列と、（ｉｉｉ）選択可能マーカーと、（ｉｖ）複製起点と、（ｖ）（ｉｉ）の下流に位置し、（ｉｉ）に機能可能なように連結された転写ターミネーターと、を含むことになる。プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ要素もコードし得るが、こうしたＲＮＡ要素のうちの１つまたは複数は、異なるベクターに代わりにコードされ得る。
本明細書に記載の用量は、平均体重７０ｋｇの個体に基づく。医学的専門家または獣医学的専門家（例えば、医師、獣医師）または当業者なら、投与頻度を決定することができる。実験に使用されるマウスは、典型的には、約２０ｇであり、マウス実験から７０ｋｇの個体へとスケールアップできることにも留意されたい。
本明細書で提供される組成物に対して使用される用量には、反復投与または反復投薬のための用量が含まれる。特定の実施形態では、投与は、数週間、数ヶ月、または数年という期間内に反復して行われる。適切なアッセイを実施することで、最適な用量レジメンを得ることができる。反復投与を行うことで、用量を下げて使用することが可能になり得、こうすることで、オフターゲット改変に良い影響を与えることができる。
ＲＮＡ送達
特定の実施形態では、ＲＮＡベースの送達が使用される。こうした実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のｍＲＮＡ、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアダプターに融合され得る）のｍＲＮＡは、インビトロで転写されたガイドＲＮＡと一緒に送達される。Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、ＲＮＡベースの送達を使用する効率的なゲノム編集について記載している（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｍａｙ；６（５）：３６３－３７２）。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１及び／またはアデノシンデアミナーゼをコードするｍＲＮＡ（複数可）を化学的に改変することができ、これによって、プラスミドがコードするＣｐｆ１及び／またはアデノシンデアミナーゼと比較して活性が改善し得る。例えば、ｍＲＮＡ（複数可）におけるウリジンを、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）で部分的または完全に置き換えることができる。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １，００６６ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１７－００６６（２０１７）を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ＲＮＰ
特定の実施形態では、事前に複合体化したガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、及びアデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアダプターに融合され得る）がリボ核タンパク質（ＲＮＰ）として送達される。ＲＮＰは、ＲＮＡ法よりもさらに迅速な編集作用が得られるという利点を有しており、この理由は、このプロセスでは転写の必要性が回避されることによるものである。重要な利点は、ＲＮＰ送達が一過性であることから、オフターゲット効果も毒性問題も低減されるということである。異なる細胞型において効率的にゲノムが編集されることが、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１４，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２４（６）：１０１２－９）、Ｐａｉｘ ｅｔ ａｌ．（２０１５，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０４（１）：４７－５４）、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４）、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３，Ｃｅｌｌ．９；１５３（４）：９１０－８）において観察されている。
特定の実施形態では、リボ核タンパク質は、ＷＯ２０１６１６１５１６に記載のポリペプチドベースのシャトル物質によって送達される。ＷＯ２０１６１６１５１６では、細胞透過ドメイン（ＣＰＤ）に機能可能なように連結されたエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）、またはヒスチジン高含有ドメイン及びＣＰＤに機能可能なように連結されたＥＬＤ、を含む合成ペプチドを使用してポリペプチドカーゴを効率的に導入することについて記載されている。同様に、こうしたポリペプチドを、真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－エフェクターベースのＲＮＰの送達に使用することができる。
粒子
いくつかの態様または実施形態では、送達粒子製剤を含む組成物が使用され得る。いくつかの態様または実施形態では、製剤は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を含み、この複合体は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、標的配列に配列特異的に結合するようにＣＲＩＳＰＲ複合体を誘導するガイドと、を含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質ベースの粒子、任意選択の脂質ナノ粒子、または陽イオン性脂質、及び任意選択の生分解性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、陽イオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、エチレングリコールまたはポリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、リポタンパク質、好ましくは、コレステロールをさらに含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、直径５００ｎｍ未満、任意選択で直径２５０ｎｍ未満、任意選択で直径１００ｎｍ未満、任意選択で直径約３５ｎｍ～約６０ｎｍである。
粒子送達系及び／または粒子送達製剤は、多様なスペクトルの生物医学的用途において有用な型がいくつか知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性に関して全体単位として挙動する小さな物体として定義される。粒子は、直径によってさらに分類される。粗粒子は、２，５００～１０，０００ナノメートルの範囲をカバーする。微粒子は、１００～２，５００ナノメートルの径を有する。超微粒子またはナノ粒子は、一般に、１～１００ナノメートルの径を有する。１００ｎｍが境界とされることは、粒子をバルク材料と差別化する新規の特性が生じる限界長さスケールが、典型的には１００ｎｍ未満であるという事実に基づいている。
本明細書で使用されるように、粒子送達系／粒子送達製剤は、本発明による粒子を含む任意の生物学的な送達系／送達製剤として定義される。本発明による粒子は、最大寸法（例えば、直径）が１００ミクロン（μｍ）未満の任意の実体である。いくつかの実施形態では、発明の粒子の最大寸法は、１０μｍ未満である。いくつかの実施形態では、発明の粒子の最大寸法は、２０００ナノメートル（ｎｍ）未満である。いくつかの実施形態では、発明の粒子の最大寸法は、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満である。いくつかの実施形態では、発明の粒子の最大寸法は、９００ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、または１００ｎｍ未満である。典型的には、発明の粒子の最大寸法（例えば、直径）は、５００ｎｍ以下である。いくつかの実施形態では、発明の粒子の最大寸法（例えば、直径）を２５０ｎｍ以下である。いくつかの実施形態では、発明の粒子の最大寸法（例えば、直径）は、２００ｎｍ以下である。いくつかの実施形態では、発明の粒子の最大寸法（例えば、直径）は、１５０ｎｍ以下である。いくつかの実施形態では、発明の粒子の最大寸法（例えば、直径）は、１００ｎｍ以下である。本発明のいくつかの実施形態では、より小さな粒子（例えば、最大寸法が５０ｎｍ以下のもの）が使用される。いくつかの実施形態では、発明の粒子の最大寸法は、２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲である。
本発明に関しては、ＣＲＩＳＰＲ複合体の１つまたは複数の構成要素（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはｍＲＮＡ、あるいはアデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もしくはアダプターに融合され得る）またはｍＲＮＡ、あるいはガイドＲＮＡ）を、ナノ粒子または脂質エンベロープを使用して送達することが好ましい。他の送達系またはベクターもまた、本発明のナノ粒子態様と併用され得る。
一般に、「ナノ粒子」は、直径が１０００ｎｍ未満の任意の粒子を指す。ある特定の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子の最大寸法（例えば、直径）は、５００ｎｍ以下である。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子の最大寸法範囲は、２５ｎｍ～２００ｎｍである。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子の最大寸法は、１００ｎｍ以下である。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子の最大寸法範囲は、３５ｎｍ～６０ｎｍである。粒子またはナノ粒子に対して本明細書でなされる言及は、適切な場合、互換的であり得ることが理解されよう。
粒子径は、その測定時点が粒子への組み込みの前または後であるかによって異なるであろうことが理解されよう。したがって、特定の実施形態では、「ナノ粒子」という用語は、組み込みが行われる前の粒子にのみ適用され得る。
本発明に包含されるナノ粒子は、異なる形態で提供され得、例えば、固形ナノ粒子（（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー）、ナノ粒子の懸濁物、またはそれらの組み合わせとして提供される。金属ナノ粒子、誘電体ナノ粒子、及び半導体ナノ粒子、さらにはハイブリッド構造のナノ粒子（例えば、コア－シェルナノ粒子）が調製され得る。半導体材料から構成されるナノ粒子は、電子エネルギーレベルの量子化が生じる上で十分な小ささ（典型的には１０ｎｍ未満）を有するのであれば、標識化量子ドットにもなり得る。そのようなナノスケール粒子は、薬物担体または造影剤として生物医学的用途で使用されており、本発明における同様の目的に適合し得る。
半固形ナノ粒子及び軟質ナノ粒子が製造されており、こうしたナノ粒子は、本発明の範囲に含まれる。半固形性質を有するプロトタイプのナノ粒子は、リポソームである。現在、抗癌剤及びワクチン向けの送達系としてさまざまな型のリポソームナノ粒子が臨床的に使用される。半分は親水性を有し、もう半分は疎水性を有するナノ粒子は、Ｊａｎｕｓ粒子と呼ばれ、エマルションの安定化に特に有効である。Ｊａｎｕｓ粒子は、水／油界面に自己集合し、固形サーファクタントとして働くことができる。
粒子の特徴付け（例えば、形態、寸法などの特徴付けを含む）は、さまざまな異なる技術を使用して行われる。一般的な技術は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、紫外・可視分光法、二面偏波式干渉計、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。生じたままの粒子（すなわち、組み込み前）またはカーゴの組み込み後の粒子（本明細書では、カーゴは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の１つまたは複数の構成要素（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはｍＲＮＡ、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質もしくはアダプターに融合され得る）またはｍＲＮＡ、あるいはガイドＲＮＡ）、あるいはそれらの任意の組み合わせを指し、追加の担体及び／または賦形剤を含み得る）に対して特徴付け（寸法測定）が行われることで、本発明の任意のインビトロ適用、エクスビボ適用、及び／またはインビボ適用のための送達に最適な径の粒子が得られ得る。ある特定の好ましい実施形態では、粒子寸法（例えば、直径）の特徴付けは、動的レーザー散乱（ＤＬＳ）を使用する測定に基づく。粒子、その調製方法及び使用方法、ならびにその測定に関しては、米国特許第８，７０９，８４３号、米国特許第６，００７，８４５号、米国特許第５，８５５，９１３号、米国特許第５，９８５，３０９号、米国特許第５，５４３，１５８号、及び２０１４年５月１１日にオンラインで公開されたＪａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４による刊行物が挙げられる。
本発明の範囲に含まれる粒子送達系は、任意の形態で提供され得、こうした形態には、限定されないが、固形、半固形、エマルション、またはコロイドの粒子が含まれる。したがって、限定されないが、例えば、脂質ベースの系、リポソーム、ミセル、微小胞、エクソソーム、または遺伝子銃を含めて、本明細書に記載の送達系はいずれも、本発明の範囲に含まれる粒子送達系として提供され得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質ｍＲＮＡ、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアダプターに融合され得る）またはｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡは、粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達され得る。例えば、Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２０１５０８９４１９Ａ２及びそこで引用される文書に記載の粒子（７Ｃ１など）（例えば、２０１４年５月１１日にオンラインで公開されたＪａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照のこと）を介して本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びＲＮＡを（例えば、複合体として）送達することができ、例えば、送達粒子は、脂質またはリピドイド及び親水性ポリマー（例えば、陽イオン性脂質及び親水性ポリマー）を含み、例えば、陽イオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）もしくは１，２－ジテトラデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を含み、及び／または親水性ポリマーは、エチレングリコールもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、及び／または粒子は、コレステロールをさらに含み（例えば、製剤化番号１＝ＤＯＴＡＰ１００，ＤＭＰＣ０，ＰＥＧ０，コレステロール０、製剤化番号２＝ＤＯＴＡＰ９０，ＤＭＰＣ０，ＰＥＧ１０，コレステロール０、製剤化番号３＝ＤＯＴＡＰ９０，ＤＭＰＣ０，ＰＥＧ５，コレステロール５、から得られる粒子）、粒子は、効率的な多段階プロセスを使用して形成され、エフェクタータンパク質とＲＮＡとが最初に一緒に混合され（この混合は、例えば１：１のモル比で、例えば室温で、例えば３０分間、例えばヌクレアーゼ非含有１×滅菌ＰＢＳにおいて行われる）、この混合溶液とは別に、製剤に適用可能なＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ、及びコレステロールがアルコール（例えば、１００％エタノール）に溶解され、これら２つの溶液が一緒に混合されることで、複合体を含む粒子が形成される。
核酸標的化エフェクタータンパク質（例えば、Ｖ型タンパク質（Ｃｐｆ１など））ｍＲＮＡとガイドＲＮＡとは、粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達され得る。適切な粒子の例としては、限定されないが、ＵＳ９，３０１，９２３に記載のものが挙げられる。
例えば、Ｓｕ Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ ＤＪ（“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ－ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐＨ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４－８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ １）では、リン脂質二重層シェルによってエンベロープ化されたポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアを有する生分解性コア－シェル構造化ナノ粒子について記載されている。こうしたナノ粒子は、インビボでのｍＲＮＡ送達向けに開発された。ｐＨ応答性のＰＢＡＥ要素は、エンドソーム破壊が促進されるように選択され、一方、脂質表層は、ポリ陽イオンコアの毒性が最小化するように選択された。したがって、そのようなナノ粒子は、本発明のＲＮＡの送達に好ましい。
１つの実施形態では、自己集合性の生体接着ポリマーに基づく粒子／ナノ粒子が企図され、この粒子／ナノ粒子は、ペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達、及びペプチドの経鼻送達（すべて、脳への送達）に適用され得る。他の実施形態（疎水性薬物の経口吸収及び眼内送達など）も企図される。分子エンベロープ技術は、保護され、かつ疾患部位に送達される操作されたポリマーエンベロープを必要とするものである（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６－１０２６、Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４－２８、Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３－３６、Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５－８０、Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４－７４、Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５－６）：４５８－６８、Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１－６８８、Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ２０１０．７：Ｓ４２３－３３、Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９－４０、Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２－９、及びＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５－１９９を参照のこと）。約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図され、標的組織に応じて、単回用量または複数回用量が採られる。
１つの実施形態では、ＲＮＡをがん細胞に送達して腫瘍増殖を停止させることができる、ＭＩＴのＤａｎ Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室によって開発された粒子／ナノ粒子が、本発明のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に使用され、及び／または適合し得る。具体的には、Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室では、新たな生体材料及びナノ製剤を合成、精製、特徴付け、及び製剤化するための完全に自動化されたコンビナトリアル系が開発された。例えば、Ａｌａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ａｕｇ ６；１１０（３２）：１２８８１－６、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１３ Ｓｅｐ ６；２５（３３）：４６４１－５、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１３ Ｍａｒ １３；１３（３）：１０５９－６４、Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ｏｃｔ ２３；６（１０）：８４８４－７、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ａｕｇ ２８；６（８）：６９２２－９、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ３；７（６）：３８９－９３を参照のこと。
米国特許出願２０１１０２９３７０３は、リピドイド化合物に関し、こうしたリピドイド化合物は、ポリヌクレオチドの投与においても特に有用であり、本発明のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の送達に適用され得る。１つの態様では、細胞または対象に送達されるべき物質とアミノアルコールリピドイド化合物が組み合わせられことで、微小粒子、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルが形成される。粒子、リポソーム、またはミセルによって送達されるべき物質は、気体、液体、または固体の形態を取り得、こうした物質は、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、または小分子であり得る。アミノアルコールリピドイド化合物は、他のアミノアルコールリピドイド化合物、ポリマー（合成または天然のもの）、サーファクタント、コレステロール、糖質、タンパク質、脂質などと組み合わせられることで、粒子を形成し得る。次に、こうした粒子は、医薬賦形剤と任意選択で組み合わせられることで、医薬組成物を形成し得る。
米国特許公開第２０１１０２９３７０３号においても、アミノアルコールリピドイド化合物の調製方法が提供されている。アミンの１つまたは複数の等価形態が、エポキシド末端含有化合物の１つまたは複数の等価形態との反応に、適切な条件の下で供されることで、本発明のアミノアルコールリピドイド化合物が形成される。ある特定の実施形態では、アミンのアミノ基は、エポキシド末端含有化合物とすべてが完全に反応して三級アミンを形成する。他の実施形態では、アミンのアミノ基は、エポキシド末端含有化合物とすべてが完全には反応しない結果、三級アミンを形成せず、それによって、一級アミンまたは二級アミンを含むアミノアルコールリピドイド化合物が得られる。こうした一級アミンまたは二級アミンは、そのまま残されるか、または別の求電子物質（異なるエポキシド末端含有化合物など）との反応に供され得る。当業者なら理解するであろうが、アミンと反応するエポキシド末端含有化合物が過剰に満たなければ、尾部の数が多様な複数の異なるアミノアルコールリピドイド化合物が得られることになる。ある特定のアミンは、２つのエポキシド由来化合物尾部で完全に官能基導入され得るが、他の分子は、エポキシド由来化合物尾部で完全には官能基導入されないことになる。例えば、ジアミンまたはポリアミンは、エポキシド由来化合物尾部が１つ、２つ、３つ、または４つ外れた状態のさまざまなアミノ部分を当該分子中に含む結果、一級アミン、二級アミン、及び三級アミンが生じ得る。ある特定の実施形態では、アミノ基は、すべてが完全には官能基導入されない。ある特定の実施形態では、同一の型のエポキシド末端含有化合物が２つ使用される。他の実施形態では、異なるエポキシド末端含有化合物が２つ以上使用される。アミノアルコールリピドイド化合物の合成は、溶媒ありまたは溶媒なしで実施され、この合成は、３０～１００℃の範囲の高温、好ましくは約５０～９０℃で実施され得る。調製されたアミノアルコールリピドイド化合物は、任意選択で精製され得る。例えば、アミノアルコールリピドイド化合物の混合物が精製されることで、特定数のエポキシド由来化合物尾部を有するアミノアルコールリピドイド化合物が得られ得る。あるいは、混合物が精製されることで、特定の立体異性体または位置異性体が得られ得る。アミノアルコールリピドイド化合物は、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）もしくは他のアルキル化剤を使用してアルキル化されることもあり得、及び／またはアミノアルコールリピドイド化合物は、アシル化され得る。
米国特許公開第２０１１０２９３７０３号においても、発明の方法によって調製されるアミノアルコールリピドイド化合物のライブラリーが提供されている。こうしたアミノアルコールリピドイド化合物は、リキッドハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピューターなどを必要とするハイスループット技術を使用して調製及び／またはスクリーニングされ得る。ある特定の実施形態では、アミノアルコールリピドイド化合物は、それがポリヌクレオチドまたは他の物質（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞にトランスフェクションする能力についてスクリーニングされる。
米国特許公開第２０１３０３０２４０１号は、あるクラスのポリ（ベータ－アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）に関し、このＰＢＡＡは、コンビナトリアル重合を使用して調製されている。発明のＰＢＡＡは、コーティング（医療機器または移植物のためのフィルムまたは多層フィルムのコーティングなど）、添加剤、材料、賦形剤、非生物付着剤、マイクロパターニング剤、及び細胞封入剤として、バイオテクノロジー及び生物医学的用途において使用され得る。こうしたＰＢＡＡは、表面コーティングとして使用されると、その化学構造に応じて、異なるレベルの炎症をインビトロでもインビボでも誘発した。このクラスの材料は、化学的多様性に富んでいるため、マクロファージの活性化をインビトロで抑制するポリマーコーティングを同定することが可能になる。さらに、こうしたコーティングは、炎症細胞のリクルートを低減し、カルボキシル化ポリスチレン微小粒子の皮下移植後に生じる線維化を低減する。こうしたポリマーは、細胞封入のための高分子電解質複合体カプセルの形成に使用され得る。本発明もまた、多くの他の生物学的用途（抗微生物コーティング、ＤＮＡまたはｓｉＲＮＡの送達、及び幹細胞組織工学など）を有し得る。米国特許公開第２０１３０３０２４０１号の教示内容は、本発明のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に適用され得る。
Ｃｐｆ１、アデノシンデアミナーゼ（Ｃｐｆ１またはアダプタータンパク質に融合され得る）、及びガイドＲＮＡを含む事前構築された組換えＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体が、例えば電気穿孔によってトランスフェクションされることで、高い変異率が得られ、検出可能なオフターゲット変異は生じ得ない。Ｈｕｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｐｆ１ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊｕｎ ６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３５９６。
脳への局所送達に関しては、さまざまな方法で当該局所送達を達成することができる。例えば、材料を線条体内へと、例えば注射によって、送達することができる。開頭術を介して注射を定位的に実施することができる。
いくつかの実施形態では、糖ベースの粒子（例えば、ＧａｌＮＡｃ）が使用され得、この使用は、本明細書に記載され、ＷＯ２０１４１１８２７２（参照によって本明細書に組み込まれる）及びＮａｉｒ，ＪＫ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３６（４９），１６９５８－１６９６１）と関連しており、そこに記載の教示内容は、特に送達に関して、別に明記されない限り、すべての粒子に適用される。これは、糖ベースの粒子であると考えてよく、他の粒子送達系及び／または粒子送達製剤に関する詳細については、本明細書でさらに提供される。したがって、ＧａｌＮＡｃは、本明細書に記載のその他の粒子という意味で粒子と考えることができ、その結果、一般的な使用及び他の考慮事項（例えば、当該粒子の送達）がＧａｌＮＡｃ粒子にも適用される。例えば、ＰＦＰ（ペンタフルオロフェニル）エステルとして活性化されたトリアンテナ型ＧａｌＮＡｃクラスター（分子量約２０００）を５’－ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチド（５’－ＨＡ ＡＳＯ、分子量約８０００Ｄａ）に付加するために、液相結合方針が採られ得る（Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１５，２６（８），ｐｐ１４５１－１４５５）。同様に、インビボでの核酸送達向けにポリ（アクリル酸）ポリマーが記載されている（ＷＯ２０１３１５８１４１（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。別の代替の実施形態では、天然起源の血清タンパク質と事前に混合されたＣＲＩＳＰＲナノ粒子（またはタンパク質複合体）が送達改善に使用され得る（Ａｋｉｎｃ Ａ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１８ ｎｏ．７，１３５７－１３６４）。
ナノクルー（Ｎａｎｏｃｌｅｗ）
さらに、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、ナノクルーを使用して送達され得、ナノクルーによる送達は、例えば、Ｓｕｎ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｃｏｏｎ－ｌｉｋｅ ｓｅｌｆ－ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ＤＮＡ ｎａｎｏｃｌｅｗ ｆｏｒ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１４ Ｏｃｔ ２２；１３６（４２）：１４７２２－５．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ５０８８０２４．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｏｃｔ １３．、またはＳｕｎ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ＤＮＡ Ｎａｎｏｃｌｅｗｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１５ Ｏｃｔ ５；５４（４１）：１２０２９－３３．ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１５０６０３０．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ａｕｇ ２７に記載されている。
ＬＮＰ
いくつかの実施形態では、送達は、Ｃｐｆ１のタンパク質形態またはｍＲＮＡ形態を脂質粒子（ＬＮＰなど）に封入することによって行われる。したがって、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が企図される。脂質ナノ粒子に抗トランスサイレチン低分子干渉ＲＮＡが封入され、ヒトに送達されており（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６９：８１９－２９を参照のこと）、そのような系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適合し得、当該系に適用され得る。体重ｋｇ当たり約０．０１～約１ｍｇの静脈内投与量が企図される。注入関連反応のリスクを低減するための薬物が企図され、デキサメタゾン、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミンまたはセチリジン、及びラニチジンなどが企図される。キログラム当たり約０．３ｍｇを４週間ごとに投与し、５回の投与を行う複数回用量も企図される。
ＬＮＰは、肝臓へのｓｉＲＮＡの送達に非常に有効であることが示されており（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ ３６３－４７０を参照のこと）、したがって、ＣＲＩＳＰＲ ＣａｓをコードするＲＮＡの肝臓への送達が企図される。ＬＮＰを２週間ごとに６ｍｇ／ｋｇで約４回投与する用量が企図され得る。０．７ｍｇ／ｋｇで行うＬＮＰ投与の最初の２サイクル後に腫瘍の退縮が観察され、６サイクルが終了するまでに、リンパ節転移の完全な退縮及び肝腫瘍の実質的な縮小を伴う部分奏功が患者で達成されたことがＴａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．によって示された。この患者では、４０回用量が投与された後に完全奏功が得られ、この患者は、寛解を保ち、２６ヶ月にわたる用量投与後に治療を完了している。ＶＥＧＦ経路阻害剤による以前の治療の後に肝外部位（腎臓、肺、及びリンパ節を含む）の疾患が進行した２人のＲＣＣ患者では、約８～１２ヶ月の間、すべての部位で疾患が安定した。ＰＮＥＴ及び肝転移を有する患者では、１８ヶ月間（３６回用量）の延長試験が続けられ、疾患の安定を伴った。
一方で、ＬＮＰは、その電荷が考慮されなくてはならない。これは、陽イオン性脂質を負荷電脂質と組み合わせることで、細胞内送達を促進する非二重層構造が誘導されるためである。荷電ＬＮＰは、静脈内注射後に循環から急速に排出されるため、ｐＫａ値が７未満のイオン化可能な陽イオン性脂質が開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照のこと）。負荷電ポリマー（ＲＮＡなど）は、イオン化可能な脂質が正電荷を有する低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）でＬＮＰに組み込まれ得る。一方で、生理学的ｐＨ値では、ＬＮＰが有する表面電荷は小さいため、適切に循環時間が長期化する。４種のイオン化可能な陽イオン性脂質に焦点が当てられており、それらはすなわち、１，２－ジリネオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－ケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）である。こうした脂質を含むＬＮＰ ｓｉＲＮＡ系は、肝細胞におけるインビボの遺伝子サイレンシング特性が顕著に異なっており、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを利用するとＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰという系列に従って能力が異なることが示されている（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照のこと）。ＬＮＰまたはＬＮＰに含まれるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡもしくはＬＮＰと結合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡの１μｇ／ｍｌ用量が企図され、特に、ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡを含む製剤についてこの用量が企図され得る。
ＬＮＰの調製及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの封入は、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１）に記載のものが使用され、及び／または適合し得る。陽イオン性脂質である１，２－ジリネオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）、（３－ｏ－［２”－（メトキシポリエチレングリコール２０００）スクシノイル］－１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリコール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、及びＲ－３－［（ω－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）は、Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）によって供給されるか、または合成され得る。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入され得る。特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡは、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡを含むＬＮＰ（陽イオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧが４０：１０：４０：１０のモル比のもの）に封入され得る。必要な場合、細胞取り込み、細胞内送達、及び生体内分布を評価するためにＳＰ－ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）が０．２％組み込まれ得る。陽イオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０のモル比）から構成される脂質混合物を、最終脂質濃度が１０ｍｍｏｌ／ｌとなるようにエタノールに溶解することによって封入が実施され得る。脂質を含むこのエタノール溶液を５０ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸（ｐＨ４．０）に滴下して加えて多重層小胞を形成させることで、エタノールの最終濃度が３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に調整され得る。エクストルーダ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して多重層小胞を２枚重ねのＮｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルター（孔径８０ｎｍ）から押し出すことで大型単層小胞が形成され得る。エタノール含量３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のクエン酸（５０ｍｍｏｌ／ｌ）（ｐＨ４．０）に２ｍｇ／ｍｌで溶解したＲＮＡを、押し出しによって事前形成された大型単層小胞に滴下して添加し、３１℃で一定して混合しながら３０分間インキュベートしてＲＮＡ／脂質の最終重量比を０．０６／１（ｗｔ／ｗｔ）とすることによって封入が達成され得る。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ２再生セルロース透析膜を使用してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に対して１６時間透析することによってエタノールの除去及び製剤緩衝液による中和が実施された。ＮＩＣＯＭＰ３７０粒子径分析計を使用する動的光散乱（小胞／強度モードで実施され、ガウシアンフィッティングが行われる）（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）によってナノ粒子径分布が決定され得る。３つのＬＮＰ系のすべてで、粒子径は、直径約７０ｎｍであり得る。透析前後に収集した試料からＶｉｖａＰｕｒｅＤ ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して遊離ＲＮＡを除去することによってＲＮＡ封入効率が決定され得る。溶出されたナノ粒子から封入ＲＮＡが抽出され、２６０ｎｍで定量化され得る。Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）から供給されるコレステロールＥ酵素アッセイを使用して小胞中のコレステロール含量を測定することによって脂質に対するＲＮＡの比が決定された。ここで論じられるＬＮＰ及びＰＥＧ脂質と併せて、ＰＥＧ化されたリポソームまたはＬＮＰもまた同様に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはその構成要素の送達に適するものである。
５０：１０：３８．５のモル比でＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールをエタノールに含めて脂質事前混合溶液（総脂質濃度２０．４ｍｇ／ｍｌ）が調製され得る。この脂質事前混合溶液に対して、０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）のモル比で酢酸ナトリウムが添加され得る。次に、この混合液をその１．８５倍体積のクエン酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と激しく攪拌しながら混合することによって脂質を水和させることで、エタノール含量３５％の水性緩衝液においてリポソームが自発的に形成され得る。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートすることで、粒子径を継時的に増加させることが可能となり得る。インキュベート中にさまざまな時点で一定分量が採取されることで、リポソーム径の変化が動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって調べられ得る。所望の粒子径が達成された時点で、リポソーム混合物に水性ＰＥＧ脂質溶液（ストック＝１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ－ＤＭＧを含む３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール）を添加することで、総脂質に対するＰＥＧの最終モル濃度が３．５％とされ得る。ＰＥＧ－脂質が添加されると、リポソームはその径に留まることになり、径のさらなる増加が効果的に停止される。次に、この空のリポソームに対して、ＲＮＡと総脂質との比が約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）となるようにＲＮＡが添加された後、３７℃で３０分間インキュベートされることで組み込みＬＮＰが形成され得る。次に、この混合物は、ＰＢＳ中で一晩透析され、孔径０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過され得る。
球状核酸（ＳＮＡ（商標））コンストラクト及び他のナノ粒子（具体的には、金ナノ粒子）もまた、意図される標的へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の送達手段として企図される。核酸結合型金ナノ粒子に基づくＡｕｒａＳｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの球状核酸（ＳＮＡ（商標））コンストラクトは有用なものであることが、相当なデータによって示されている。
本明細書の教示内容と併せて利用され得る文献には、以下のものが含まれる：Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１ １３３：９２５４－９２５７、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１ ７：３１５８－３１６２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１ ５：６９６２－６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１３７６－１３９１、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１２ １２：３８６７－７１、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２ １０９：１１９７５－８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ ７：６３５－６３８、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１６４８８－１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９５：Ｓ１４－Ｓ１６、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３ １１０（１９）：７６２５－７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）、及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６－１９２。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位末端にＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドが付加されたものでＰＥＧ化されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いると、ＲＮＡとともに自己集合するナノ粒子が構築され得る。この系は、例えば、インテグリンを発現する腫瘍新生血管系を標的とし、血管内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦ Ｒ２）の発現及びそれによる腫瘍血管新生の達成を阻害するｓｉＲＮＡを送達する手段として使用されている（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照のこと）。陽イオン性ポリマー水溶液と核酸水溶液とを等体積で混合して、リン酸（核酸）に対してイオン化可能な窒素（ポリマー）を２～６倍の範囲で正味モル過剰とすることによってナノプレックス（Ｎａｎｏｐｌｅｘ）が調製され得る。陽イオン性ポリマーと核酸との間に静電相互作用が生じる結果、約１００ｎｍの平均粒子径分布を有する（それ故に、本明細書ではナノプレックスと称される）ポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）が形成される。Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌの自己集合ナノ粒子における送達については、約１００～２００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ用量が想定される。
Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスもまた、本発明に適用され得る。Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．のナノプレックスは、陽イオン性ポリマー水溶液と核酸水溶液とを等体積で混合して、リン酸（核酸）に対してイオン化可能な窒素（ポリマー）を２～６倍の範囲で正味モル過剰とすることによって調製される。陽イオン性ポリマーと核酸との間に静電相互作用が生じる結果、約１００ｎｍの平均粒子径分布を有する（それ故に、本明細書ではナノプレックスと称される）ポリプレックスが形成される。Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．のＤＯＴＡ－ｓｉＲＮＡは、以下のように合成された：１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸モノ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ－ＮＨＳエステル）は、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から調達された。アミン修飾されたＲＮＡセンス鎖が１００倍モル過剰のＤＯＴＡ－ＮＨＳ－エステルとともに炭酸緩衝液（ｐＨ９）に含められ、マイクロ遠心管に添加された。室温で４時間攪拌することによって内容物の反応が行われた。このＤＯＴＡ－ＲＮＡセンス結合体がエタノール沈殿され、水に再懸濁され、非改変アンチセンス鎖にアニーリングされることで、ＤＯＴＡ－ｓｉＲＮＡが得られた。液体はすべて、Ｃｈｅｌｅｘ－１００（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で事前に処理することで、混入微量金属が除去された。シクロデキストリン含有ポリ陽イオンを使用することによってＴｆ標的化ｓｉＲＮＡナノ粒子及び非標的化ｓｉＲＮＡナノ粒子が形成され得る。典型的には、ナノ粒子の形成は、電荷比を３（＋／－）、ｓｉＲＮＡ濃度を０．５ｇ／リットルとして水中で行われた。標的化ナノ粒子の表面上のアダマンタン－ＰＥＧ分子の１パーセントがＴｆで修飾された（アダマンタン－ＰＥＧ－Ｔｆ）。こうしたナノ粒子は、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の注射用グルコース担体溶液に懸濁された。
Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４６４，１５ Ａｐｒｉｌ ２０１０）は、標的化ナノ粒子－送達系を使用するＲＮＡ臨床試験（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）を実施している。標準治療に抵抗性の固形がんを有する患者に対して、２１日サイクルの１日目、３日目、８日目、及び１０日目に３０分間の静脈内注入によって標的化ナノ粒子の用量が投与されている。このナノ粒子は、以下のものを含む合成送達系からなる：（１）シクロデキストリンベースの直鎖ポリマー（ＣＤＰ）、（２）がん細胞の表面上のヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）受容体（ＴＦＲ）に結合させるためにナノ粒子の外面上に提示されたＴＦ標的化リガンド、（３）親水性ポリマー（生体液におけるナノ粒子の安定性を促進させるために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び（４）ＲＲＭ２の発現を低減するように設計されたｓｉＲＮＡ（クリニックで使用される配列は、以前はｓｉＲ２Ｂ＋５と表記されていたものである）。ＴＦＲは、悪性細胞において上方制御を受けることが長い間知られており、ＲＲＭ２は、確立された抗がん標的である。こうしたナノ粒子（ＣＡＬＡＡ－０１と表記される臨床バージョン）は、非ヒト霊長類における複数回投薬試験において忍容性が良好であることが示されている。リポソーム送達によるｓｉＲＮＡの投与は、これまでに１人の慢性骨髄性白血病患者で行われたことはあるものの、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．の臨床試験は、標的化送達系を用いてｓｉＲＮＡを全身性に送達し、固形がん患者を治療するための最初のヒト試験である。ヒト腫瘍に対する機能性ｓｉＲＮＡの効果的な送達を標的化送達系がもたらし得るかどうかを確認するために、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．は、３つの異なる投薬コホートに由来する３人の患者から採取した生検試料を調べた。患者Ａ、患者Ｂ、及び患者Ｃは、そのすべてが転移性メラノーマを有しており、それぞれ１８ｍｇ ｍ－２、２４ｍｇ ｍ－２、及び３０ｍｇ ｍ－２のｓｉＲＮＡとなるＣＡＬＡＡ－０１用量で投与を受けた患者である。同様の用量が、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系についても企図され得る。本発明の送達は、シクロデキストリンベースの直鎖ポリマー（ＣＤＰ）、がん細胞の表面上のヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）受容体（ＴＦＲ）に結合させるためにナノ粒子の外面上に提示されたＴＦタンパク質標的化リガンド、及び／または親水性ポリマー（例えば、生体液におけるナノ粒子の安定性を促進させるために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、を含むナノ粒子を用いて達成され得る。
米国特許第８，７０９，８４３号（参照によって本明細書に組み込まれる）では、組織、細胞、及び細胞内コンパートメントを標的として治療剤含有粒子を送達するための薬物送達系が提供されている。本発明は、サーファクタント、親水性ポリマー、または脂質に結合したポリマーを含む標的化粒子を提供する。米国特許第６，００７，８４５号（参照によって本明細書に組み込まれる）では、多機能化合物を、１つまたは複数の疎水性ポリマー及び１つまたは複数の親水性ポリマーと共有結合で連結することによって形成されたマルチブロックコポリマーのコアを有するとともに、生物学的に活性な材料を含む粒子が提供されている。米国特許第５，８５５，９１３号（参照によって本明細書に組み込まれる）では、５μｍ～３０μｍの平均直径を有し、タップ密度が０．４ｇ／ｃｍ３未満の空気力学的に軽い粒子であって、肺系への薬物送達のためにその表面上にサーファクタントが組み込まれた粒子を有する粒子組成物が提供されている。米国特許第５，９８５，３０９号（参照によって本明細書に組み込まれる）では、肺系に送達するための、サーファクタント、及び／または正荷電もしくは負荷電の治療剤もしくは診断剤と、反対電荷を有する荷電分子と、の親水性複合体もしくは疎水性複合体、が組み込まれた粒子が提供されている。米国特許第５，５４３，１５８号（参照によって本明細書に組み込まれる）では、生物学的に活性な材料を含むとともに、ポリ（アルキレングリコール）部分を表面上に含む生分解性固形コアを有する生分解性の注射用粒子が提供されている。ＷＯ２０１２１３５０２５（ＵＳ２０１２０２５１５６０としても公開されている）（参照によって本明細書に組み込まれる）では、結合型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー及び結合型アザ－大環状分子（まとめて「結合型リポマー（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｐｏｍｅｒ）」または「リポマー（ｌｉｐｏｍｅｒ）と称される」について記載されている。ある特定の実施形態では、そのような結合型リポマーをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と関連させて使用してインビトロ、エクスビボ、及びインビボのゲノム摂動を達成することで、タンパク質発現の調節を含めて、遺伝子発現を改変し得ることが想定され得る。
１つの実施形態では、ナノ粒子は、エポキシド修飾脂質－ポリマーであり得、有利には、７Ｃ１であり得る（例えば、２０１４年５月１１日にオンラインで公開されたＪａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４）。Ｃ７１は、エポキシド末端を有するＣ１５脂質をＰＥＩ６００と１４：１のモル比で反応させることによって合成され、Ｃ１４ＰＥＧ２０００を用いて製剤化されることで、ＰＢＳ溶液中で少なくとも４０日間安定なナノ粒子（直径３５～６０ｎｍ）とされた。
エポキシド修飾脂質－ポリマーは、肺細胞、心血管細胞、または腎細胞へと本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を送達するために利用され得るが、当業者なら、この系を他の標的臓器への送達に適合させることができる。約０．０５～約０．６ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が想定される。数日または数週間にわたる用量も想定され、総用量は約２ｍｇ／ｋｇとされる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子を送達するためのＬＮＰは、当業者に知られる方法によって調製され、こうした方法は、例えば、ＷＯ２００５／１０５１５２（ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４９２０）、ＷＯ２００６／０６９７８２（ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１４０７４）、ＷＯ２００７／１２１９４７（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００３４９６）、及びＷＯ２０１５／０８２０８０（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／００３２７４）（これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどである。哺乳類細胞へのｓｉＲＮＡの送達の増進及び改善を特に目的とするＬＮＰは、例えば、Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６８（２３）：９７８８－９８（Ｄｅｃ．１，２００８）、Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５０（１）：７６－８（Ｊａｎ．２０１２）、Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３２（３６）：４１４１－４８（Ｄｅｃ．２０，２０１４）、及びＦｅｈｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２２（４）：８１１－２０（Ａｐｒ．２２，２０１４）（これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されており、本発明の技術に適用され得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰには、ＷＯ２００５／１０５１５２（ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４９２０）、ＷＯ２００６／０６９７８２（ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１４０７４）、ＷＯ２００７／１２１９４７（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００３４９６）、及びＷＯ２０１５／０８２０８０（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／００３２７４）に開示される任意のＬＮＰが含まれる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式Ｉ：
Figure 0007364472000025
を有する少なくとも１つの脂質を含み、
式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、アルキルを含む群から独立して選択され、ｎは、１～４の任意の整数であり、Ｒ３は、リジル、オルニチル、２，４－ジアミノブチリル、ヒスチジル、及びアシル部分を含む群から選択されるアシルであり、当該アシル部分は、式ＩＩ：
Figure 0007364472000026
によるものであり、式中、ｍは、１～３の任意の整数であり、Ｙ－は、医薬的に許容可能な陰イオンである。いくつかの実施形態では、式Ｉによる脂質は、少なくとも２つの不斉Ｃ原子を含む。いくつかの実施形態では、式Ｉのエナンチオマーには、限定されないが、Ｒ－Ｒエナンチオマー、Ｓ－Ｓエナンチオマー、Ｒ－Ｓエナンチオマー、及びＳ－Ｒエナンチオマーが含まれる。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、ラウリルであり、Ｒ２は、ミリスチルである。別の実施形態では、Ｒ１は、パルミチルであり、Ｒ２は、オレイルである。いくつかの実施形態では、ｍは、１または２である。いくつかの実施形態では、Ｙ－は、ハロゲン化物、アセテート、またはトリフルオロアセテートから選択される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、
□－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミド三塩酸塩（式ＩＩＩ）：
Figure 0007364472000027
□－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－ラウリル－Ｎ－ミリスチル－アミド三塩酸塩（式ＩＶ）：
Figure 0007364472000028
及び
□－アルギニル－リジン－Ｎ－ラウリル－Ｎ－ミリスチル－アミド三塩酸塩（式Ｖ）：
Figure 0007364472000029
から選択される１つまたは複数の脂質を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、構成物質も含む。例として、限定されないが、いくつかの実施形態では、構成物質は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、構成物質は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。いくつかの実施形態では、構成物質は、例えば、リボザイム、アプタマー、ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、またはそれらの組み合わせ、から選択される核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、ガイドＲＮＡ及び／またはｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰの構成物質は、ＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの構成物質は、ＩＩ型ＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓタンパク質またはＶ型ＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの構成物質は、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアダプタータンパク質に融合され得る）をコードするｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰの構成物質は、１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを血管内皮に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを肺内皮に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを肝臓に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを肺に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを心臓に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを脾臓に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを腎臓に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを膵臓に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを脳に送達するように構成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、前述のｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡをマクロファージに送達するように構成される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも１つのヘルパー脂質も含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、リン脂質及びステロイドから選択される。いくつかの実施形態では、リン脂質は、リン酸のジエステル及び／またはモノエステルである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスホグリセリド及び／またはスフィンゴ脂質である。いくつかの実施形態では、ステロイドは、部分的に水素化されたシクロペンタ［ａ］フェナントレンを基礎とする天然起源の化合物及び／または合成化合物である。いくつかの実施形態では、ステロイドは、Ｃ原子を２１～３０個の含む。いくつかの実施形態では、ステロイドは、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）、セラミド、及び１，２－ジオレイルｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヘルパー脂質は、ＰＥＧ部分、ＨＥＧ部分、ポリヒドロキシエチルデンプン（ポリＨＥＳ）部分、及びポリプロピレン部分を含む群から選択される部分を含む。いくつかの実施形態では、部分は、約５００～１０，０００Ｄａまたは約２，０００～５，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３ホスホエタノールアミン、１，２－ジアルキル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、及びセラミド－ＰＥＧから選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約５００～１０，０００Ｄａまたは約２，０００～５，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、２，０００Ｄａの分子量を有する。
いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、組成物の総脂質含量の約２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％を占める。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質成分は、ＬＮＰの総脂質含量の約３５ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％を占める。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、脂質を５０ｍｏｌ％含み、ＬＮＰが含むヘルパー脂質は、ＬＮＰの総脂質含量の５０ｍｏｌ％を占める。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、□－３－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミド三塩酸塩、□－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－ラウリル－Ｎ－ミリスチル－アミド三塩酸塩、または□－アルギニル－リジン－Ｎ－ラウリル－Ｎ－ミリスチル－アミド三塩酸塩、のいずれかをＤＰｈｙＰＥとの組み合わせで含み、ＤＰｈｙＰＥの含量は、ＬＮＰの総脂質含量の約８０ｍｏｌ％、約６５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％、及び約３５ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、□－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミド三塩酸塩（脂質）、及び１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ヘルパー脂質）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、□－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミド三塩酸塩（脂質）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（第１のヘルパー脂質）、及び１，２－ジステロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ＰＥＧ２０００（第２のヘルパー脂質）を含む。
いくつかの実施形態では、第２のヘルパー脂質は、総脂質含量の約０．０５ｍｏｌ％～４．９ｍｏｌ％または約１ｍｏｌ％～３ｍｏｌ％を占める。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、総脂質含量の約４５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％を占める脂質と、総脂質含量の約４５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％に占める第１のヘルパー脂質と、を含むが、但し、総脂質含量の約０．１ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～４ｍｏｌ％、または約２ｍｏｌ％を占めるＰＥＧ化された第２のヘルパー脂質が存在することが条件であり、脂質の含量、第１のヘルパー脂質の含量、及び第２のヘルパー脂質の含量を合計すると、総脂質含量の１００ｍｏｌ％となり、第１のヘルパー脂質及び第２のヘルパー脂質を合計すると、総脂質含量の５０ｍｏｌ％となる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、（ａ）□－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミド三塩酸塩（５０ｍｏｌ％）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（４８ｍｏｌ％）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ＰＥＧ２０００（２ｍｏｌ％）、または（ｂ）□－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミド三塩酸塩（５０ｍｏｌ％）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（４９ｍｏｌ％）、及びＮ（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ３－ホスホエタノールアミン（１ｍｏｌ％）、もしくはそのナトリウム塩、を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、核酸を含み、核酸骨格リン酸と陽イオン性脂質の窒素原子との電荷比は、約１：１．５～７または約１：４である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、遮蔽化合物も含み、この遮蔽化合物は、インビボ条件の下で脂質組成物から除去可能である。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、生物学的に不活性な化合物である。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、その表面上に電荷を全く有さないか、または分子自体に電荷を全く有さない。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルグルコース（ＨＥＧ）ベースのポリマー、ポリヒドロキシエチルデンプン（ポリＨＥＳ）、及びポリプロピレンである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリＨＥＳ、及びポリプロピレンの分子量は、約５００～１０，０００Ｄａまたは約２０００～５０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ＰＥＧ２０００またはＰＥＧ５０００である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも１つの脂質と、第１のヘルパー脂質と、インビボ条件の下で脂質組成物から除去可能な遮蔽化合物と、を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、第２のヘルパー脂質も含む。いくつかの実施形態では、第１のヘルパー脂質は、セラミドである。いくつかの実施形態では、第２のヘルパー脂質は、セラミドである。いくつかの実施形態では、セラミドは、炭素原子数が６～１０の短い炭素鎖置換基を少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態では、セラミドは、８つの炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、セラミドに付加される。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、セラミドに付加される。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、共有結合でセラミドに付加される。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ＬＮＰにおける核酸に付加される。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、共有結合で核酸に付加される。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、リンカーによって核酸に付加される。いくつかの実施形態では、リンカーは、生理学的条件の下で切断される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ペプチド、Ｓ－Ｓ－リンカー、及びｐＨ感受性リンカーから選択される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、核酸のセンス鎖の３’末端に付加される。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分を含む。いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分は、陰イオン性リンカーまたは陰イオン性部分である。いくつかの実施形態では、陰イオン性リンカーまたは陰イオン性部分は、酸性環境では、陰イオン性が低いか、または中性である。いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性リンカーまたはｐＨ感受性部分は、オリゴ（グルタミン酸）、オリゴフェノレート（複数可）、及びジエチレントリアミペンタ酢酸から選択される。
前項に記載のＬＮＰ実施形態のいずれかでは、ＬＮＰは、約５０～６００ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、約２５０～３５０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇ、または約２８０～３２０ｍｏｓｍｏｌｅ／ｋｇの浸透圧を有し得、及び／または脂質及び／または１つもしくは２つのヘルパー脂質と、遮蔽化合物と、によって形成されるＬＮＰは、約２０～２００ｎｍ、約３０～１００ｎｍ、または約４０～８０ｎｍの粒子径を有する。
いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、インビボでの循環時間を延長し、核酸を含むＬＮＰの生体内分布を良好にすることが可能である。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、血清中化合物または他の体液に含まれる化合物または細胞質膜（例えば、ＬＮＰが投与される脈管構造の内膜の細胞質膜）とＬＮＰとの直接的な相互作用を阻止する。さらに、またはあるいは、いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、免疫系の要素がＬＮＰと直接的に相互作用することも阻止する。さらに、またはあるいは、いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、抗オプソニン化化合物として働く。いずれの機構または理論によっても拘束されることは望まないが、いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ＬＮＰがその環境との相互作用に利用可能な表面積を低減するカバーまたはコートを形成する。さらに、またはあるいは、いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ＬＮＰの全体電荷を遮蔽する。
別の実施形態では、ＬＮＰは、式ＶＩ：
Figure 0007364472000030
を有する少なくとも１つの陽イオン性脂質を含み、
式中、ｎは、１、２、３、または４であり、ｍは、１、２、または３であり、Ｙ－は、陰イオンであり、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、Ｃ１２－Ｃ１８直鎖アルキル及びＣ１２－Ｃ１８直鎖アルケニル、ステロール化合物（ステロール化合物は、コレステロール及びスチグマステロールからなる群から選択される）、ならびにＰＥＧ化脂質（ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ部分を含む）からなる群から個別かつ独立して選択され、ＰＥＧ化脂質は、
式ＶＩＩ：
Figure 0007364472000031
のＰＥＧ化ホスホエタノールアミン（式中、Ｒ３及びＲ４は、個別かつ独立してＣ１３－Ｃ１７直鎖アルキルであり、ｐは、１５～１３０の任意の整数である）、
式ＶＩＩＩ：
Figure 0007364472000032
のＰＥＧ化セラミド（式中、Ｒ５は、Ｃ７－Ｃ１５直鎖アルキルであり、ｑは、１５～１３０の任意の数である）、及び
式ＩＸ：
Figure 0007364472000033
のＰＥＧ化ジアシルグリセロール（式中、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ、個別かつ独立してＣ１１－Ｃ１７直鎖アルキルであり、ｒは、１５～１３０の任意の整数である）、
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１とＲ２とは、互いに異なる。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、パルミチルであり、Ｒ２は、オレイルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、ラウリルであり、Ｒ２は、ミリスチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１とＲ２とは、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１６アルケニル、及びＣ１８アルケニルからなる群から個別かつ独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１６アルケニル、及びＣ１８アルケニルはそれぞれ、１つまたは２つの二重結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ１８アルケニルは、Ｃ９とＣ１０との間に二重結合を１つ有するＣ１８アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｃ１８アルケニルは、シス－９－オクタデシルである。
いくつかの実施形態では、陽イオン性脂質は、式Ｘ：
Figure 0007364472000034
の化合物である。いくつかの実施形態では、Ｙ－は、ハロゲン化物、アセテート、及びトリフルオロアセテートから選択される。いくつかの実施形態では、陽イオン性脂質は、式ＩＩＩ：
Figure 0007364472000035
の□－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイル－アミド三塩酸塩である。いくつかの実施形態では、陽イオン性脂質は、式ＩＶ：
Figure 0007364472000036
の□－アルギニル－２，３－ジアミノプロピオン酸－Ｎ－ラウリル－Ｎ－ミリスチル－アミド三塩酸塩である。いくつかの実施形態では、陽イオン性脂質は、式Ｖ：
Figure 0007364472000037
の□－アルギニル－リジン－Ｎ－ラウリル－Ｎ－ミリスチル－アミド三塩酸塩である。
いくつかの実施形態では、ステロール化合物は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ステロール化合物は、スチグマステリンである。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質のＰＥＧ部分は、約８００～５，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質のＰＥＧ部分の分子量は、約８００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質のＰＥＧ部分の分子量は、約２，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質のＰＥＧ部分の分子量は、約５，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、式ＶＩＩのＰＥＧ化ホスホエタノールアミンであり、式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ、個別かつ独立してＣ１３－Ｃ１７直鎖アルキルであり、ｐは、１８、１９、もしくは２０、または４４、４５、もしくは４６、または１１３、１１４、もしくは１１５から選択される任意の整数である。いくつかの実施形態では、Ｒ３とＲ４とは、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ３とＲ４とは、異なる。いくつかの実施形態では、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ、Ｃ１３アルキル、Ｃ１５アルキル、及びＣ１７アルキルからなる群から個別かつ独立して選択される。いくつかの実施形態では、式ＶＩＩのＰＥＧ化ホスホエタノールアミンは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）：
Figure 0007364472000038
である。いくつかの実施形態では、式ＶＩＩのＰＥＧ化ホスホエタノールアミンは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（アンモニウム塩）：
Figure 0007364472000039
である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、式ＶＩＩＩのＰＥＧ化セラミドであり、式中、Ｒ５は、Ｃ７－Ｃ１５直鎖アルキルであり、ｑは、１８、１９、もしくは２０、または４４、４５、もしくは４６、または１１３、１１４、もしくは１１５から選択される任意の整数である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、Ｃ７直鎖アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、Ｃ１５直鎖アルキルである。いくつかの実施形態では、式ＶＩＩＩのＰＥＧ化セラミドは、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝：
Figure 0007364472000040
である。いくつかの実施形態では、式ＶＩＩＩのＰＥＧ化セラミドは、Ｎ－パルミトイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝
Figure 0007364472000041
である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、式ＩＸのＰＥＧ化ジアシルグリセロールであり、式中、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ、個別かつ独立してＣ１１－Ｃ１７直鎖アルキルであり、ｒは、１８、１９、もしくは２０、または４４、４５、もしくは４６、または１１３、１１４、もしくは１１５から選択される任意の整数である。いくつかの実施形態では、Ｒ６とＲ７とは、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ６とＲ７とは、異なる。いくつかの実施形態では、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ、Ｃ１７直鎖アルキル、Ｃ１５直鎖アルキル、及びＣ１３直鎖アルキルからなる群から個別かつ独立して選択される。いくつかの実施形態では、式ＩＸのＰＥＧ化ジアシルグリセロールは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］：
Figure 0007364472000042
である。いくつかの実施形態では、式ＩＸのＰＥＧ化ジアシルグリセロールは、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］：
Figure 0007364472000043
である。いくつかの実施形態では、式ＩＸのＰＥＧ化ジアシルグリセロールは、
Figure 0007364472000044
である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式ＩＩＩ、式ＩＶ、及び式Ｖから選択される少なくとも１つの陽イオン性脂質と、コレステロール及びスチグマステリンから選択される少なくとも１つのステロール化合物と、を含み、ＰＥＧ化脂質は、式ＸＩ及び式ＸＩＩから選択される少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式ＩＩＩ、式ＩＶ、及び式Ｖから選択される少なくとも１つの陽イオン性脂質と、コレステロール及びスチグマステリンから選択される少なくとも１つのステロール化合物と、を含み、ＰＥＧ化脂質は、式ＸＩＩＩ及び式ＸＩＶから選択される少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式ＩＩＩ、式ＩＶ、及び式Ｖから選択される少なくとも１つの陽イオン性脂質と、コレステロール及びスチグマステリンから選択される少なくとも１つのステロール化合物と、を含み、ＰＥＧ化脂質は、式ＸＶ及び式ＸＶＩから選択される少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式ＩＩＩの陽イオン性脂質と、ステロール化合物としてのコレステロールと、を含み、ＰＥＧ化脂質は、式ＸＩのものである。
前項に記載のＬＮＰ実施形態のいずれかでは、陽イオン性脂質組成物の含量は、約６５ｍｏｌｅ％～７５ｍｏｌｅ％であり、ステロール化合物の含量は、約２４ｍｏｌｅ％～３４ｍｏｌｅ％であり、ＰＥＧ化脂質の含量は、約０．５ｍｏｌｅ％～１．５ｍｏｌｅ％であり、脂質組成物に対する陽イオン性脂質含量、ステロール化合物含量、及びＰＥＧ化脂質含量を合計すると、１００ｍｏｌｅ％となる。いくつかの実施形態では、陽イオン性脂質は、約７０ｍｏｌｅ％であり、ステロール化合物の含量は、約２９ｍｏｌｅ％であり、ＰＥＧ化脂質の含量は、約１ｍｏｌｅ％である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、７０ｍｏｌｅ％が式ＩＩＩのものであり、２９ｍｏｌｅ％がコレステロールであり、１ｍｏｌｅ％が式ＸＩのものである。
エクソソーム
エクソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送する内在性のナノ小胞であり、このナノ小胞は、脳及び他の標的臓器にＲＮＡを送達することができる。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：３４１）は、免疫原性を低減するために、自己由来の樹状細胞をエクソソーム産生に使用した。神経細胞特異的ＲＶＧペプチドに融合したＬａｍｐ２ｂ（エクソソーム膜タンパク質）を発現するように樹状細胞を操作することによって脳への標的化が達成された。精製エクソソームには、電気穿孔によって外来性ＲＮＡが組み込まれた。ＲＶＧで標的化されたエクソソームが静脈内注射され、このエクソソームによって、脳における神経細胞、ミクログリア、オリゴデンドロサイトにＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡが特異的に送達されることで、特異的な遺伝子ノックダウンが生じた。ＲＶＧエクソソームに事前に曝露されてもノックダウンは減弱せず、他の組織への非特異的な取り込みは観察されなかった。アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なノックダウンがｍＲＮＡ（６０％）及びタンパク質（６２％）で生じたことによってエクソソーム介在性のｓｉＲＮＡ送達の治療潜在力が示された。
Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、免疫学的に不活性なエクソソームのプールを得るために、同種の主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプを有する近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を収集した。未成熟樹状細胞は、Ｔ細胞活性化因子（ＭＨＣ－ＩＩ及びＣＤ８６など）を欠いたエクソソームを大量に産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、顆粒球／マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）で樹状細胞を７日間選択した。翌日、よく確立された超遠心分離プロトコルを使用して培養上清からエクソソームが精製された。得られたエクソソームは、物理的に均一であり、直径８０ｎｍをピークとするサイズ分布を有しており、これらのことは、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）及び電子顕微鏡法によって決定された。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、１０６個細胞当たり６～１２μｇのエクソソーム（タンパク質濃度に基づいて測定された）を得た。
次に、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ナノスケール用途に適した電気穿孔プロトコルを使用して、改変エクソソームへの外来性カーゴの組み込みの可能性について調べた。ナノメートルスケールの膜粒子に対する電気穿孔は、特徴付けが不十分であるため、非特異的なＣｙ５標識ＲＮＡが、電気穿孔プロトコルの実験的な最適化に使用された。超遠心分離及びエクソソームの溶解を行った後に封入ＲＮＡの量がアッセイされた。４００Ｖ及び１２５μＦで電気穿孔を行うと、ＲＮＡが最も保持されたため、この電気穿孔条件がその後のすべての実験に使用された。
Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、それぞれのＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを１５０μｇのＲＶＧエクソソームに封入したものを正常なＣ５７ＢＬ／６マウスに１５０μｇ投与し、下記の４つの対照とノックダウン効率を比較した：非処理マウス、ＲＶＧエクソソームのみを注射したマウス、インビボ用の陽イオン性リポソーム試薬と複合体化したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを注射したマウス、及びＲＶＧ－９Ｒ（ｓｉＲＮＡに静電的に結合するＤ－アルギニン九量体にＲＶＧペプチドが結合したもの）と複合体化したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを注射したマウス。投与から３日後に皮質組織試料が分析され、ｓｉＲＮＡ－ＲＶＧ－９Ｒで処理したマウスとｓｉＲＮＡＲＶＧエクソソームで処理したマウスとの両方において、ＢＡＣＥ１のｍＲＮＡレベルが有意に減少（それぞれ６６％［±］１５％（Ｐ＜０．００１）及び６１％［±］１３％（Ｐ＜０．０１））した結果、有意なタンパク質ノックダウン（４５％（Ｐ＜０．０５）対６２％（Ｐ＜０．０１））が観察された。さらに、出願人らは、アルツハイマーの病態におけるアミロイド斑の主要な要素である［ベータ］－アミロイド１－４２の総レベルが、ＲＶＧ－エクソソームで処理した動物において有意に減少（５５％、Ｐ＜０．０５）することを示した。観察された減少は、ＢＡＣＥ１阻害剤が脳室内注射された後の正常マウスにおいて示されたβ－アミロイド１－４０の減少と比較して大きいものであった。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ＢＡＣＥ１切断産物に対してｃＤＮＡの５’末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）を実施し、これによって、ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ介在性のノックダウンが生させたという証拠が得られた。
最終的に、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ＩＬ－６、ＩＰ－１０、ＴＮＦα、及びＩＦＮ－αの血清中濃度を評価することによって、ＲＮＡ－ＲＶＧエクソソームがインビボで免疫応答を誘導したかどうかを調べた。エクソソームでの処理後、ｓｉＲＮＡ－トランスフェクション試薬での処理と同様にすべてのサイトカインにおいて有意な変化は検知されず、このことは、ｓｉＲＮＡ－ＲＶＧ－９ＲではＩＬ－６の分泌が強力に刺激されたこととは対照的であり、これによって、エクソソーム処理が免疫学的に不活性なプロファイルを有することが確認された。エクソソームに封入されるｓｉＲＮＡは２０％にすぎないことを考慮すると、ＲＶＧ－エクソソームでの送達は、ＲＶＧ－９Ｒでの送達と比較して、５倍少ないｓｉＲＮＡによってｍＲＮＡを同等にノックダウンし、タンパク質のノックダウンを向上させ、対応するレベルの免疫刺激も伴わなかったことから、より効率的であると思われる。この実験によって、ＲＶＧ－エクソソーム技術の治療潜在力が示され、この技術は、神経変性疾患と関連する遺伝子を長くサイレンシングすることに潜在的に適するものである。Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．のエクソソーム送達系は、治療標的（特に神経変性疾患）への本発明のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の送達に適用され得る。本発明については、約１００～１０００ｍｇのＲＶＧエクソソームにＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが約１００～１０００ｍｇ封入された用量が企図され得る。
Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，２１１２－２１２６（２０１２））は、培養細胞から得られるエクソソームをインビトロ及びインビボでのＲＮＡ送達にどのように利用できるかについて開示している。このプロトコルでは、発現ベクターのトランスフェクションを介して、ペプチドリガンドと融合したエクソソームタンパク質を含む標的化エクソソームを生成させるということが最初に記載されている。次に、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、トランスフェクションされた細胞の上清からエクソソームをどのように精製し、特徴付けるかについて説明している。次に、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、エクソソームへのＲＮＡの組み込みに不可欠な段階について詳細に記載している。最終的に、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、マウスの脳におけるインビトロ及びインビボでＲＮＡを効率的に送達するためにエクソソームをどのように使用するかについて概要を述べている。エクソソーム介在性のＲＮＡ送達が機能性のアッセイ及びイメージングによって評価される際に見込まれる結果の例も提供されている。全プロトコルは、約３週間を要するものである。本発明による送達または投与は、自己由来の樹状細胞から産生するエクソソームを使用して実施され得る。これを、本明細書の教示内容に照らして、本発明の実施の際に利用することができる。
別の実施形態では、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）の血漿中エクソソームが企図される。エクソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マスト細胞、上皮細胞、及び腫瘍細胞を含めて、多くの細胞型によって産生されるナノサイズの小胞（径３０～９０ｎｍ）である。こうした小胞は、後期エンドソームが内向きにくびれることによって形成された後、細胞膜との融合時に細胞外環境へと放出される。エクソソームは、ＲＮＡの細胞間輸送を天然に行うものであるため、この特性は、遺伝子治療において有用であり得、本開示に照らして、本発明の実施の際に利用することができる。
バフィーコートを９００ｇで２０分間遠心分離して血漿を単離した後、３００ｇの遠心分離に１０分間供して細胞を除去することで細胞上清を収集し、さらに１６５００ｇの遠心分離に３０分間供してから孔径０．２２ｍｍのフィルターに通してろ過することによって、血漿からエクソソームを調製することができる。１２００００ｇで超遠心分離を７０分間行うことによってエクソソームの沈降処理が行われる。エクソソームへのｓｉＲＮＡの化学的なトランスフェクションは、ＲＮＡｉ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に付属の製造者の説明書に従って実施される。ｓｉＲＮＡは、最終濃度２ｍｍｏｌ／ｍｌで１００ｍｌのＰＢＳに添加される。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬の添加後に、混合物が室温で１０分間インキュベートされる。過剰なミセルを除去するために、アルデヒド／サルフェートラテックスビーズを使用してエクソソームが再単離される。エクソソームへのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの化学的なトランスフェクションは、ｓｉＲＮＡと同様に実施され得る。エクソソームは、健康なドナーの末梢血から単離された単球及びリンパ球と共培養され得る。したがって、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを含むエクソソームが、ヒトの単球及びリンパ球に導入され、同じヒトに自家的に再導入され得ることが企図され得る。したがって、本発明による送達または投与は、血漿中エクソソームを使用して実施され得る。
リポソーム
本発明による送達または投与は、リポソームを用いて実施することができる。リポソームは、内部の水性コンパートメントを囲む単層または多重層の脂質二重層と、相対的に不透過性な外側の親油性リン脂質二重層と、から構成される球状小胞構造を有する。リポソームは、薬物送達単体として相当な関心を集めており、この理由は、リポソームが生体適合性かつ無毒であり、親水性薬物分子も親油性薬物分子も送達し、血漿中酵素によってそのカーゴが分解されることを阻止し、生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を横切ってその被組み込み物を輸送できることによるものである（概説については、例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
リポソームは、いくつかの異なる型の脂質から調製することができるが、薬物担体としてのリポソームの生成にはリン脂質が最も一般的に使用される。脂質フィルムが水溶液と混合されるとリポソームが自発的に形成されるが、ホモジナイザー、超音波処理器、または押し出し器具を使用することによって振動形態の力を加えることによってもリポソームの形成を促進することができる（概説については、例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
リポソームの構造及び特性を変更するために、いくつかの他の添加剤をリポソームに追加してもよい。例えば、リポソーム構造の安定化を助け、リポソームの内部のカーゴの漏出を防ぐために、コレステロールまたはスフィンゴミエリンのいずれかをリポソーム混合物に添加することができる。更に、リポソームは、水素添加卵ホスファチジルコリンまたは卵ホスファチジルコリン、コレステロール、及びリン酸ジセチルから調製され、その平均小胞径は、約５０～１００ｎｍに調整された（例えば、概論については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９参照）。
リポソーム製剤は、主に、１，２－ジステアロリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン及びモノシアロガングリオシドなどの天然リン脂質及び脂質から構成され得る。この製剤はリン脂質のみから構成されているので、リポソーム製剤は多くの課題に直面し、そのうちの１つは血漿中での不安定性である。これらの課題を克服するために、いくつかの試みがなされており、特に、脂質膜の操作がなされている。これらの試みのうちの１つは、コレステロールの操作に焦点を合わせたものであった。従来の製剤にコレステロールを添加すると、封入された生物活性化合物の血漿中への急速放出が減少し、または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の安定性が高くなる。（例えば、概論については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９参照）。
特に有利な実施形態において、トロイの木馬リポソーム（トロイの木馬分子としても知られる）が望ましく、プロトコルはｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇに見出され得る。これらの粒子は、血管内注射後、導入遺伝子を脳全体に送達することを可能にする。限定による拘束を受けないが、表面に結合した特定の抗体を含む中性脂質粒子は、エンドサイトーシスを介した血液脳関門の通過を可能にすると考えられている。トロイの木馬リポソームを使用すると、血管内注射を介して、ヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲファミリーを脳に送達することができ、これにより、胚操作を必要せずに、全脳トランスジェニック動物が可能となる。リポソームのインビボ投与については、約１～５ｇのＤＮＡまたはＲＮＡが企図され得る。
別の実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系またはその構成要素は、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）などのリポソームで投与され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５参照）。ＳＮＡＬＰを用いた標的化された特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓは、約１、３または５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日の静脈内注射が企図される。毎日の治療は、約３日を超えるものであってよく、次いで、約５週間にわたって毎週行われる。別の実施形態において、約１または２．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射により投与される特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ封入ＳＮＡＬＰ）もまた企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６参照）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３－Ｎ－［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシ－プロピルアミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールを、２：４０：１０：４８のモルパーセント比で含有し得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６参照）。
別の実施形態において、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、血管新生の少ないＨＣＴ－１１６由来肝腫瘍ではなく、血管新生の多いＨｅｐＧ２由来肝腫瘍において、効果的な送達分子であることが証明されている（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５－７８０参照）。ＳＮＡＬＰリポソームは、２５：１の脂質／ｓｉＲＮＡ比及びモル比４８／４０／１０／２のコレステロール／Ｄ－Ｌｉｎ－ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡで、Ｄ－Ｌｉｎ－ＤＭＡ及びＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡを、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及びｓｉＲＮＡと配合することによって、調製され得る。得られるＳＮＡＬＰリポソームは、約８０～１００ｎｍの大きさである。
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、３－Ｎ－［（ｗ－メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミレスチルオキシプロピルアミン、及び陽イオン性１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含み得る。（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１８９６－９０５参照）。例えば、ボーラス静脈内注入として投与される、１回あたり約２ｍｇ／ｋｇの用量の総ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ、及び１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ；Ｎ－ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１－６７３（２００９）参照）。インビボ研究のために使用される製剤は、約９：１の最終的な脂質／ＲＮＡ質量比を有し得る。
ＲＮＡｉナノ製剤の安全性プロファイルは、Ａｌｎｙｌａｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ及びＧｏｌｌｏｂによって概説されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６４（２０１２）１７３０－１７３７参照）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４つの異なる脂質、低ｐＨで陽イオン性のイオン性脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、及び拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質から構成される。粒子は、約８０ｎｍの直径であり、生理学的ｐＨで電荷中性である。製剤化中、イオン性脂質は、粒子形成中に、脂質とアニオン性ＲＮＡとを凝縮する働きをする。イオン性脂質はまた、酸性に傾くエンドソーム条件下で正に帯電すると、ＳＮＡＬＰとエンドソーム膜の融合を媒介し、これにより、ＲＮＡの細胞質への放出が可能となる。ＰＥＧ脂質は、粒子を安定化させ、製剤化中の凝集を低減し、続いて、薬物動態学的特性を改善する中性親水性外面を提供する。
これまでに、ＲＮＡを含むＳＮＡＬＰ製剤を使用した２つの臨床計画が開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、近年、ＬＤＬコレステロールの高い成人志願者におけるＳＮＡＬＰ－ＡｐｏＢの第Ｉ相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは、肝臓及び空腸で主に発現され、ＶＬＤＬ及びＬＤＬの組み込み及び分泌に必須である。１７人の対象がＳＮＡＬＰ－ＡｐｏＢの単回投与を受けた（７つの用量レベルで用量を増加）。肝臓毒性のエビデンスはなかった（前臨床試験に基づくと、用量制限毒性の可能性が予想された）。最高用量の１人（２人中１人）の対象が、免疫系の刺激に一致する流感に似た症状を示し、この試験を終了する決定がなされた。
Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓも同様にＡＬＮ－ＴＴＲ０１を開発しており、これは、上記のＳＮＡＬＰ技術を利用し、変異型と野生型の両方のＴＴＲの肝細胞産生を標的として、ＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を治療するものである。３つのＡＴＴＲ症候群：いずれもＴＴＲの常染色体優性変異によって引き起こされる家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）；ならびに野生型ＴＴＲによって引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）が記載されている。ＡＬＮ－ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回投与用量漸増第Ｉ相試験は、近年、ＡＴＴＲ患者で完了した。ＡＬＮ－ＴＴＲ０１は、０．０１～１．０ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ基準）の用量範囲で、１５分のＩＶ注入として、３１人の患者に投与された（試験薬２３人、プラセボ８人）。治療は、肝機能検査で有意な増加が見られず、良好な忍容性であった。注入関連反応は、０．４ｍｇ／ｋｇ以上で、患者２３人中３人に認められた。全員が注入速度の低下に反応し、全員が試験を続行した。血清サイトカインＩＬ－６、ＩＰ－１０及びＩＬ－１ｒａの最小かつ一時的な上昇が、１ｍｇ／ｋｇの最高用量で、２人の患者に認められた（前臨床試験及びＮＨＰ試験から予測されていたとおり）。予測されたＡＬＮ－ＴＴＲ０１の薬力作用である血清ＴＴＲの低下は、１ｍｇ／ｋｇで観察された。
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、陽イオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ脂質を、それぞれ、例えば、４０：１０：４０：１０のモル比で、例えば、エタノール中で可溶化することによって作製され得る（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２－１７７参照）。この脂質混合物を水性緩衝液（５０ｍＭクエン酸、ｐＨ４）に添加し、混合して、最終エタノール濃度及び脂質濃度をそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び６．１ｍｇ／ｍｌにし、押し出し前に、２２℃で２分間平衡させた。Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、水和させた脂質を、動的光散乱分析によって決定される小胞直径が７０～９０ｎｍになるまで、２２℃で、孔径８０ｎｍの二層フィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）に通して押し出した。これは、一般に、１～３回通すことが必要である。ｓｉＲＮＡ（５０ｍＭクエン酸、ｐＨ４、３０％エタノール含有水溶液に可溶化されたもの）を、予め平衡させた（３５℃）の小胞に、混合しながら、約５ｍｌ／分の速度で添加した。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終的な標的ｓｉＲＮＡ／脂質比に達したら、混合物を３５℃で更に３０分間インキュベートして、小胞の再構築及びｓｉＲＮＡの封入を行った。次いで、エタノールを除去し、透析または十字流ダイアフィルトレーションのいずれかによって、外部緩衝液をＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）で置換した。制御された段階希釈法プロセスを使用して、ｓｉＲＮＡをＳＮＡＬＰ中に封入した。ＫＣ２－ＳＮＡＬＰの脂質成分は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（陽イオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）及びＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡであり、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で使用した。封入粒子が形成されたら、ＳＮＡＬＰをＰＢＳに対して透析し、０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過してから、使用した。平均粒径は７５～８５ｎｍであり、９０～９５％のｓｉＲＮＡが脂質粒子内に封入された。インビボ試験で使用された製剤の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は、約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰ－ｓｉＲＮＡ系を使用の直前に滅菌ＰＢＳで適切な濃度に希釈し、この製剤を１０ｍｌ／ｋｇの総量で側方尾静脈を介して静脈内投与した。この方法及びこれらの送達系を、本発明のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に当てはめることができる。
他の脂質
アミノ脂質２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）などの他の陽イオン性脂質を利用して、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓもしくはその構成要素またはそれをコードする核酸分子（複数可）、例えば、ＳｉＲＮＡに類似するものを封入することができ（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９－８５３３参照）、したがって、本発明の実施に利用することができる。次の脂質組成物：アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及び（Ｒ）－２，３－ビス（オクタデシルオキシ）プロピル－１－（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ－脂質）をそれぞれ４０／１０／４０／１０の比及び約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ／総脂質比で含む予備成形小胞が企図される。７０～９０ｎｍの範囲の狭い粒径分布及び０．１１＋０．０４（ｎ＝５６）の小さい多分散指数を確保するために、ガイドＲＮＡを添加する前に、粒子を８０ｎｍ膜に通して最大３回押し出すことができる。極めて強力なアミノ脂質１６を含有する粒子を、４つの脂質構成成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ脂質のモル比（５０／１０／３８．５／１．５）で使用してもよい。これは、インビボ活性を高めるために、更に最適化され得る。
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｄ Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４－１５７（２０１１））は、ＲＮＡを送達するための脂質エンベロープの使用について記載している。脂質エンベロープの使用もまた、本発明において好ましい。
別の実施形態において、脂質を、本発明のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系もしくはその構成要素（複数可）またはそれをコードする核酸分子（複数可）とともに製剤化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成することができる。脂質には、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ４、Ｃ１２－２００及び共脂質ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールが含まれるが、これらに限定されず、ＰＥＧ－ＤＭＧを、自発的ベシクル形成手順を使用して、ｓｉＲＮＡに代えてＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓとともに製剤化することができる（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３参照）。構成成分のモル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＣ１２－２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ）であり得る。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡ重量比は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ及びＣ１２－２００脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の場合、それぞれ、約１２：１及び９：１であり得る。製剤は、９０％を超える封入効率で約８０ｎｍの平均粒径を有し得る。３ｍｇ／ｋｇの用量が企図され得る。
Ｔｅｋｍｉｒａは、ＬＮＰ及びＬＮＰ製剤の様々な態様に関する米国及び海外の約９５件の特許ファミリーのポトフォリオを有しており（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号、同第７，７９９，５６５号、同第８，０５８，０６９号、同第８，２８３，３３３号、同第７，９０１，７０８号、同第７，７４５，６５１号、同第７，８０３，３９７号、同第８，１０１，７４１号、同第８，１８８，２６３号、同第７，９１５，３９９号、同第８，２３６，９４３号及び同第７，８３８，６５８号ならびに欧州特許第１７６６０３５号、同第１５１９７１４号、同第１７８１５９３号及び同第１６６４３１６号参照）、それらの全てを本発明に使用でき、及び／または適合させることができる。
ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系もしくはその構成要素またはそれをコードする核酸分子（複数可）は、タンパク質、タンパク質前駆体、またはタンパク質もしくはタンパク質前駆体の部分的もしくは全体的加工型をコードし得る修飾核酸分子を含む組成物の製剤化の態様に関する、米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号及び同第２０１３０２４５１０７号及び同第２０１３０２４４２７９号（Ｍｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡）に詳述されているようなＰＬＧＡミクロスフェア中に封入して送達することができる。製剤は、モル比５０：１０：３８．５：１．５～３．０（陽イオン性脂質：融合性脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）を有し得る。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧから選択され得るが、これらに限定されない。融合性脂質は、ＤＳＰＣであり得る。また、Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号を参照されたい。
Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量の疎水性薬物、ペプチド、及び核酸ベースの治療剤（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含む、幅広い治療剤のバイオアベイラビリティ課題に対処している。この技術が明確な利点を示した特定の投与経路には、経口経路、血液脳関門を通過する輸送、固形腫瘍及び眼への送達が含まれる。例えば、Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１３ Ｆｅｂ ２６；７（２）：１０１６－２６、Ｕｃｈｅｇｂｕ ａｎｄ Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５－１０及びＬａｌａｔｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２ Ｊｕｌ ２０；１６１（２）：５２３－３６を参照されたい。
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号は、生物活性分子、例えば、ポリヌクレオチド分子、ペプチド及びポリペプチド、及び／または医薬品を哺乳類の身体に送達するための陽イオン性デンドリマーについて記載している。デンドリマーは、例えば、肝臓、脾臓、肺、腎臓または心臓（または更には脳）への生物活性分子の送達を標的化するのに好適である。デンドリマーは、単純な分岐状モノマー単位から段階的に調製される合成三次元巨大分子であり、その性質及び機能性は、容易に制御及び変更できる。デンドリマーは、多機能コアから（ダイバージェント合成法）、または多機能コアに向けて（コンバージェント合成法）、ビルディングブロックを繰り返し付加することから合成され、ビルディングブロックの三次元シェルを付加するたびに、より高世代のデンドリマーが形成される。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、ジアミノブタンコアから出発し、この第一級アミンに対するアクリロニトリルのダブルマイケル付加反応によって２倍のアミノ基数が付加され、続いて、ニトリルの水素化が行われる。この結果、アミノ基が２倍になる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、１００％プロトン化可能な窒素及び最大６４の末端アミノ基を含有する（世代５、ＤＡＢ６４）。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨで、プロトンを受け取ることができるアミン基である。遺伝子送達剤としてのデンドリマーの使用は、アミン／アミドまたはＮ－－Ｐ（Ｏ２）Ｓの混合物をそれぞれ結合単位として含むポリアミドアミン及びリン含有化合物の使用に概ね焦点を合わせているが、低世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの遺伝子送達としての使用に関する研究は報告されていない。ポリプロピレンイミンデンドリマーはまた、薬物送達用及び末梢アミノ酸基によって化学修飾されたゲスト分子の封入用のｐＨ感受性制御放出系として、研究されている。ポリプロピレンイミンデンドリマーの細胞毒性及びＤＮＡとの相互作用、ならびにＤＡＢ６４のトランスフェクション効率も研究されている。
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号は、以前の報告に反して、ポリプロピレンイミンデンドリマーなどの陽イオン性デンドリマーが、遺伝物質などの生物活性分子の標的化送達の使用において、特異的標的化及び低毒性などの好適な特性を呈するという観察に基づく。加えて、陽イオン性デンドリマーの誘導体もまた、生物活性分子の標的化送達に好適な特性を呈する。また、Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号）も参照されたい。当該特許は、「陽イオン性ポリアミンポリマー及びデンドリマーポリマーを含む様々なポリマーが抗増殖活性を有することを示し、したがって、望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患、例えば、新生物及び腫瘍、炎症性疾患（自己免疫疾患を含む）、乾癬及びアテローム性動脈硬化症の治療に有用であり得る。ポリマーは、単独で、活性剤として、または他の治療剤、例えば、遺伝子治療用の薬物分子または核酸の送達媒体として、使用することができる。かかる場合、ポリマー自体の固有の抗腫瘍活性は、送達される薬剤の活性を補完し得る」ことを開示している。これらの特許公開の開示は、本明細書における教示とともに、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系（複数可）もしくはその構成要素（複数可）またはそれをコードする核酸分子（複数可）の送達に利用することができる、
超荷電タンパク質
超荷電タンパク質は、理論上の正または負の正味荷電が異常に高い操作されたまたは天然に生じるタンパク質の１つのクラスであり、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系（複数可）もしくはその構成要素（複数可）またはそれをコードする核酸分子（複数可）の送達に利用することができる。負に過剰に荷電したタンパク質及び正に過剰に荷電したタンパク質はいずれも、熱的または化学的に誘導される凝集に耐える顕著な能力を呈する。正に過剰に荷電したタンパク質はまた、哺乳類細胞に浸透することができる。これらのタンパク質をプラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のタンパク質などのカーゴと結合させると、インビトロ及びインビボの両方における、これらの巨大分子の哺乳類細胞への機能的送達が可能となる。超荷電タンパク質の作製及び特徴付けは、２００７年に報告されている（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２９，１０１１０－１０１１２）。
ＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの哺乳類細胞への非ウイルス送達は、研究用途及び治療用途の両方に価値がある（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，５６１－５６９）。精製された＋３６ＧＦＰタンパク質（または正に過剰に荷電した他のタンパク質）を適切な無血清培地中でＲＮＡと混合し、複合体を形成させてから、細胞を添加する。この段階で血清が含まれていると、超荷電タンパク質ＲＮＡ複合体の形成が阻害され、治療の有効性が低下する。以下のプロトコルが様々な細胞株に効果的であることがわかっている（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１－６１１６）（しかしながら、特定の細胞株に対する手順を最適化するには、タンパク質及びＲＮＡの量を変えたパイロット実験を実施する必要がある）：（１）処理の１日前に、４８ウェルプレートの各ウェルに１×１０５細胞をプレーティングする。（２）処理の当日に、精製した＋３６ＧＦＰタンパク質を無血清培地中に希釈し、最終濃度２００ｎＭにする。ＲＮＡを５０ｎＭの最終濃度まで添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。（３）インキュベーション中に、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。（４）＋３６ＧＦＰ及びＲＮＡのインキュベーション後、タンパク質ＲＮＡ複合体を細胞に添加する。（５）細胞を複合体とともに３７℃で４時間インキュベートする。（６）インキュベーション後、培地を吸引し、２０Ｕ／ｍＬのヘパリンＰＢＳで３回洗浄する。血清含有培地で細胞を更に４８時間、活性のアッセイに応じては４８時間以上インキュベートする。（７）イムノブロット、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ、または他の適切な方法によって、細胞を分析する。
＋３６ＧＦＰは、様々な細胞で効果的なプラスミド送達試薬であることが更にわかっている。プラスミドＤＮＡは、ｓｉＲＮＡよりも大きなカーゴであるため、効果的にプラスミドを複合体化するためには、その分だけ多い＋３６ＧＦＰタンパク質が必要である。効果的なプラスミド送達のために、出願人らは、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質由来の既知のエンドソーム破壊ペプチドであるＣ末端ＨＡ２ペプチドタグを有する＋３６ＧＦＰのバリアントを開発した。以下のプロトコルは、様々な細胞で効果的であるが、上述のとおり、特定の細胞株及び送達用途に対して、プラスミドＤＮＡ及び超荷電タンパク質の量を最適化することが推奨される。（１）処理の１日前に、４８ウェルプレートの各ウェルに１×１０５をプレーティングする。（２）処理の当日に、精製したｐ３６ＧＦＰタンパク質を無血清培地中に希釈し、最終濃度２ｍＭにする。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。（３）インキュベーション中に、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。（４）ｐ３６ＧＦＰ及びプラスミドＤＮＡのインキュベーション後、タンパク質ＤＮＡ複合体を細胞に静かに添加する。（５）細胞を複合体とともに３７Ｃで４時間インキュベートする。（６）インキュベーション後、培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄する。細胞を血清含有培地中でインキュベートし、更に２４～４８時間インキュベートする。（７）適宜、プラスミド送達を分析する（例えば、プラスミド促進遺伝子発現によって）。
また、例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１－６１１６（２００９）、Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，７４７－７５２（２０１０）、Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，８３３－８３８（２０１１）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０３，２９３－３１９（２０１２）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（７），８３１－８４３（２０１２）を参照されたい。超荷電タンパク質の方法を、本発明のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に使用でき、及び／または適合させることができる。これらの系は、本明細書における教示とともに、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系（複数可）もしくはその構成要素（複数可）またはそれをコードする核酸分子（複数可）の送達に利用することができる。
細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）
更に別の実施形態において、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）がＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に企図される。ＣＰＰは、様々な分子カーゴ（ナノサイズ粒子から化学的小分子及び大きなＤＮＡ断片まで）の細胞取り込みを促進する短鎖ペプチドである。本明細書で使用される「カーゴ」という用語は、限定するものではないが、治療剤、診断用プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、粒子、例えば、ナノ粒子、リポソーム、発色団、小分子及び放射性物質からなる群を含む。本発明の態様において、カーゴはまた、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の任意の構成要素またはＡＤ機能化機能性ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系全体を含み得る。本発明の態様は、所望のカーゴを対象に送達するための方法を更に提供し、この方法は、（ａ）本発明の細胞膜透過性ペプチド及び所望のカーゴを含む複合体を調製することと、（ｂ）その複合体を、対象に、経口、関節内、腹腔内、髄腔内、動脈内、鼻腔内、実質内、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、直腸、または局所投与することとを含む。カーゴは、共有結合による化学的連結、または非共有結合性の相互作用のいずれかを介して、ペプチドに結合する。
ＣＰＰの機能は、カーゴを細胞に送達することであり、一般に、生きている哺乳類細胞のエンドソームにカーゴが送達されるエンドサイトーシスを介して生じるプロセスである。細胞膜透過性ペプチドは、サイズ、アミノ酸配列、及び電荷が様々であるが、ＣＰＰは全て１つの独特な特徴を有し、原形質膜を移行して、様々な分子カーゴの細胞質または細胞小器官への送達を促進する能力がある。ＣＰＰの移行は、主に３つの進入機構：直接的な膜透過、エンドサイトーシスを介した進入、及び一時的な構造を形成することによる移行に分類することができる。ＣＰＰは、がん及びウイルス阻害剤を含む、様々な疾患の治療における薬物送達剤として、ならびに細胞標識用の造影剤として、多数の医学的用途が見出されている。後者の例には、ＧＦＰ、ＭＲＩ造影剤、または量子ドットの担体として機能することが含まれる。ＣＰＰは、研究及び医学で使用するためのインビトロ及びインビボの送達ベクターとして、大きな可能性を秘めている。ＣＰＰは、典型的に、リシンもしくはアルギニンなどの正に荷電したアミノ酸を高い相対存在量で含有するか、極性／荷電アミノ酸と非極性疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有するかのいずれかであるアミノ酸組成を有する。これらの２つのタイプの構造は、それぞれ、ポリ陽イオン性または両親媒性と称される。ＣＰＰの第３のクラスは、疎水性ペプチドであり、正味荷電の低い無極性残基のみを含有するか、または細胞取り込みに重要な疎水性アミノ酸基を有する。発見された最初のＣＰＰの１つは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）由来のトランス活性化型転写活性化因子（Ｔａｔ）であり、培養中の多数の細胞型によって周囲培地から効率的に取り込まれることが見出された。以降、既知のＣＰＰの数は大幅に増えており、より効果的なタンパク質形質導入特性を有する小分子合成アナログが生成されている。ＣＰＰには、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８－６０）、トランスポータン、及び（Ｒ－ＡｈＸ－Ｒ４）（Ａｈｘ＝アミノヘキサノイル）が含まれるが、これらに限定されない。
米国特許第８，３７２，９５１号は、高い細胞膜透過性効率及び低毒性を呈する好酸球陽イオン性タンパク質（ＥＣＰ）由来のＣＰＰを提供している。ＣＰＰ及びそのカーゴを脊椎動物対象に送達する態様も提供されている。ＣＰＰ及びその送達の更なる態様は、米国特許第８，５７５，３０５号、同第８，６１４，１９４号及び同第８，０４４，０１９号に記載されている。ＣＰＰは、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはその構成要素の送達に使用することができる。また、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはその構成要素の送達にＣＰＰを利用できることは、“Ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｂｙ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ”，ｂｙ Ｓｕｒｅｓｈ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ａｂｕ－Ｂｏｎｓｒａｈ Ｋｗａｋｕ Ｄａｄ，Ｊａｇａｄｉｓｈ Ｂｅｌｏｏｒ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ａｐｒ ２にも提供されており、その全体は、参照により援用される。これにより、ＣＰＰコンジュゲート組み換えＣａｓ９タンパク質及びＣＰＰ複合体化ガイドＲＮＡによる処置が、ヒト細胞株において、内因性遺伝子の破壊をもたらすことが実証されている。この論文において、Ｃａｓ９タンパク質は、チオエーテル結合を介してＣＰＰにコンジュゲートされ、一方、ガイドＲＮＡは、ＣＰＰと複合体化され、凝縮された正電荷粒子を形成した。ヒト細胞、例えば、胚幹細胞、皮膚線維芽細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、及び胚性癌腫細胞を改変Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡで同時かつ逐次的に処置すると、プラスミドトランスフェクションと比べて、効率的な遺伝子破壊がもたらされ、オフターゲット変異が低減したことが示された。
エアロゾル送達
肺疾患の治療を受ける対象は、例えば、自発呼吸下で気管支内送達される薬学的に有効量のエアロゾル化ＡＡＶベクター系の経肺投与を受けてもよい。このように、ＡＡＶ送達の場合、エアロゾル化送達が一般に好ましい。アデノウイルス粒子またはＡＡＶ粒子を送達に使用することができる。好適な遺伝子コンストラクトは、それぞれ１つまたは複数の制御配列に機能可能なように連結しており、送達ベクターにクローニングすることができる。
パッケージング及びプロモーター
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びアデノシンデアミナーゼをコードする核酸分子の発現を促進するために使用されるプロモーターには、ＡＡＶ ＩＴＲが含まれ得、これは、プロモーターとして機能し得る。ＡＡＶ ＩＴＲは、追加のプロモーター要素（ベクター内でスペースを取り得る）の必要性を排除するのに有利である。解放された追加のスペースを使用して、追加の要素（ｇＲＮＡなど）の発現を促進することができる。また、ＩＴＲ活性は比較的弱いため、Ｃｐｆ１の過剰発現による潜在的な毒性を低減させるために使用することができる。
偏在的発現の場合、使用することができるプロモーターには、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖または軽鎖などが含まれる。脳または他のＣＮＳ発現の場合、シナプシンＩを全てのニューロンに使用することができ、ＣａＭＫＩＩアルファを興奮性ニューロンに使用することができ、ＧＡＤ６７またはＧＡＤ６５またはＶＧＡＴをＧＡＢＡ作動性ニューロンに使用することができる。肝臓での発現の場合、アルブミンプロモーターを使用することができる。肺での発現の場合、ＳＰ－Ｂを使用することができる。内皮細胞の場合、ＩＣＡＭを使用することができる。造血細胞の場合、ＩＦＮベータまたはＣＤ４５を使用することができる。骨芽細胞の場合、ＯＧ－２を使用することができる。
ガイドＲＮＡを促進するために使用されるプロモーターには、Ｕ６またはＨ１などのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびにガイドＲＮＡを発現させるＰｏｌ ＩＩプロモーター及びイントロンカセットの使用が含まれる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、アデノシンデアミナーゼ、及び１つまたは複数のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、または他のタイプのプラスミドもしくはウイルスベクターを使用して、特に、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号（アデノウイルスに関する製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号（ＡＡＶに関する製剤、用量）及び同第５，８４６，９４６号（ＤＮＡプラスミドに関する製剤、用量）、ならびにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスに関する臨床試験及び当該臨床試験に関する公開物による製剤及び用量を使用して、送達することができる。例えば、ＡＡＶの場合、その投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号及びＡＡＶに関する臨床試験の場合と同様にすることができる。アデノウイルスの場合、その投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号及びアデノウイルスに関する臨床試験の場合と同様にすることができる。プラスミド送達の場合、その投与経路、製剤及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号及びプラスミドに関する臨床研究の場合と同様にすることができる。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、ヒト成人男性）に基づいてもよいし、またはこれに外挿することができ、かつ患者、対象、哺乳類の様々な体重及び種に合わせて調整することができる。投与の頻度は、医学従事者または獣医学従事者（例えば、医師、獣医師）の範囲内であり、患者または対象の年齢、性別、全身の健康、他の状態、及び対処される特定の状態または症状を含む、通常の因子に応じて決まる。ウイルスベクターは、目的の組織に注入され得る。細胞型に特異的なゲノム改変の場合、Ｃｐｆ１及びアデノシンデアミナーゼの発現は、細胞型に特異的なプロモーターによって促進され得る。例えば、肝臓に特異的な発現にはアルブミンプロモーターが使用され得、ニューロンに特異的な発現（例えば、ＣＮＳ疾患を標的とする場合）にはシナプシンＩプロモーターが使用され得る。
インビボ送達に関しては、ＡＡＶは、低毒性であること（これは、免疫応答を活性化させることがある細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製法に起因し得る）；及び宿主ゲノムに組み込まれないので、挿入変異導入を引き起こす可能性が低いことなどのいくつかの理由から、他のウイルスベクターに比べて有利である。
ＡＡＶは、４．５または４．７５Ｋｂのパッケージング制限を有する。これは、Ｃｐｆ１ならびにプロモーター及び転写ターミネーターの全てを同じウイルスベクター内に合わせる必要があることを意味する。４．５または４．７５Ｋｂよりも大きいコンストラクトは、ウイルス産生が大幅に減少する。ＳｐＣａｓ９は極めて大きく、遺伝子自体が４．１Ｋｂを超えるため、ＡＡＶへのパッキングは困難である。したがって、本発明の実施形態は、より短いＣｐｆ１のホモログを利用することを含む。
ＡＡＶついて、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはこれらの任意の組み合わせであり得る。標的とする細胞に関するＡＶＶのＡＶＶを選択することができ、例えば、脳または神経細胞を標的とするには、ＡＡＶ血清型１、２、５、またはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはこれらの任意の組み合わせを選択することができ、心臓組織を標的とするには、ＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。本明細書のプロモーター及びベクターは、それぞれ好ましい。これらの細胞に関する特定のＡＡＶ血清型の表は次のとおりである（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）参照）：
Figure 0007364472000045
レンチウイルス
レンチウイルスは、有糸分裂細胞及び有糸分裂後細胞の両方に感染して、その遺伝子を発現する能力を有する、複雑なレトロウイルスである。最も一般的に知られているレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して、広範な細胞型を標的とする。
レンチウイルスは、次のように調製することができる。ｐＣａｓＥＳ１０（レンチウイルストランスファープラスミド骨格を含有するもの）をクローニングした後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴをＴ－７５フラスコに播種し、１０％ウシ胎児血清を含むが、抗生物質を含まないＤＭＥＭ中で、トランスフェクションの前日に５０％コンフルエンスにした。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞に１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）と、次のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－ｇ偽型）及び７．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）をトランスフェクトした。トランスフェクションは、陽イオン性脂質送達剤（５０ｕＬのリポフェクタミン２０００及び１００ｕｌのＰｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ中で行った。６時間後、培地を、１０％ウシ胎児血清を含む抗生物質不含ＤＭＥＭに交換した。これらの方法は、細胞培養中に血清を使用するが、無血清方法が好ましい。
レンチウイルスは、次のように精製することができる。ウイルス上清を４８時間後に回収した。まず、上清からデブリを取り除き、０．４５ｕｍの低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターに通して濾過した。次いで、これを２４，０００ｒｐｍで２時間、超遠心機にかけた。ウイルスペレットを５０ｕｌのＤＭＥＭ中に４Ｃで一晩再懸濁させた。次いで、これを等分し、－８０℃で急速凍結させた。
別の実施形態において、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースにした最小非霊長類レンチウイルスベクターもまた、特に、眼の遺伝子治療に対して、企図される（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５－２８５参照）。別の実施形態において、網状の加齢黄斑変性を治療するための網膜下注射を介して送達される、血管新生抑制性タンパク質であるエンドスタチン及びアンギオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルス系レンチウイルス遺伝子治療ベクターＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）も企図され（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０－９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２）参照）、このベクターを、本発明のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系用に改変することができる。
別の実施形態において、ＨＩＶ ｔａｔ／ｒｅｖによって共有される共通のエクソンを標的とするｓｉＲＮＡ、核局在化ＴＡＲデコイ、及び抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムを含む、自己不活性化型レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：３６ｒａ４３参照）を、本発明のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に使用でき、及び／または適合させることができる。患者の体重１ｋｇあたり最低２．５×１０６個のＣＤ３４＋細胞を採取し、これを、２μｍｏｌ／Ｌ－グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含有するＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）中、２×１０６細胞／ｍｌの密度で、１６～２０時間、予め刺激することができる。予め刺激した細胞に、フィブロネクチン（２５ｍｇ／ｃｍ２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）をコーティングした７５ｃｍ２の組織培養フラスコ中、多重感染度５で、１６～２４時間、レンチウイルスを形質導入することができる。
レンチウイルスベクターは、パーキンソン病の治療において開示されており、例えば、米国特許出願公開第２０１２０２９５９６０号ならびに米国特許第７３０３９１０号及び同第７３５１５８５号を参照されたい。レンチウイルスベクターはまた、眼疾患の治療についても開示されており、例えば、米国特許出願公開第２００６０２８１１８０号、同第２００９０００７２８４号、同第ＵＳ２０１１０１１７１８９号、同第ＵＳ２００９００１７５４３号、同第ＵＳ２００７００５４９６１号、同第ＵＳ２０１００３１７１０９号を参照されたい。レンチウイルスベクターはまた、脳への送達についても開示されており、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２９３５７１号、同第ＵＳ２０１１０２９３５７１号、同第ＵＳ２００４００１３６４８号、同第ＵＳ２００７００２５９７０号、同第ＵＳ２００９０１１１１０６号及び米国特許第ＵＳ７２５９０１５号を参照されたい。
動物以外の生物における用途
ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系（複数可）（例えば、単一またはマルチプレックス化）は、作物ゲノミクスにおける近年の進歩と併せて使用することができる。本明細書に記載される系は、効率的かつ費用対効果の高い植物遺伝子またはゲノムの探索または編集または操作を、例えば、植物遺伝子またはゲノムの迅速な調査及び／または選択及び／または探索及び／または比較及び／または操作及び／または形質転換を実施するために使用することができ、例えば、植物（複数可）に対して、形質（複数可）または特徴（複数可）の創出、同定、開発、最適化、もしくは付与をもたらすか、または植物ゲノムを形質転換することができる。したがって、植物の生産の向上、新しい組み合わせの形質もしくは特徴を持った新しい植物、または形質が増強された新しい植物がもたらされ得る。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、植物に対して、部位特異的組み込み（ＳＤＩ）または遺伝子編集（ＧＥ）または任意の準逆育種（ＮＲＢ）または逆育種（ＲＢ）の各技術において使用することができる。本明細書に記載されるＣｐｆ１エフェクタータンパク質系を利用する態様は、植物におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）系の使用に類似していてよく、アリゾナ大学のウェブサイト「ＣＲＩＳＰＲ－ＰＬＡＮＴ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｃｒｉｓｐｒ／）（Ｐｅｎｎ Ｓｔａｔｅ及びＡＧＩの後援による）において言及されている。本発明の実施形態は、植物のゲノム編集、またはＲＮＡｉもしくは類似のゲノム編集技術がこれまで使用されてきた場合に使用することができ、例えば、Ｎｅｋｒａｓｏｖ，“Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｍａｄｅ ｅａｓｙ：ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，” Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３，９：３９（ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４６－４８１１－９－３９）、Ｂｒｏｏｋｓ，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，” Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４ ｐｐ １１４．２４７５７７、Ｓｈａｎ，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，６８６－６８８（２０１３）、Ｆｅｎｇ，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，” Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）２３：１２２９－１２３２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１３．１１４；オンライン公開２０１３年８月２０日、Ｘｉｅ，“ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，” Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｎｏｖ；６（６）：１９７５－８３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｐ／ｓｓｔ１１９．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ １７、Ｘｕ，“Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｒｉｃｅ，” Ｒｉｃｅ ２０１４，７：５（２０１４）、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ＳＮＰｓ ｆｏｒ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ ｗｏｏｄｙ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｒｅｖｅａｌｓ ４－ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ ｌｉｇａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ，” Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ（２０１５）（Ｆｏｒｕｍ）１－４（ｗｗｗ．ｎｅｗｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ．ｃｏｍにてオンラインでのみ入手可能）、Ｃａｌｉａｎｄｏ ｅｔ ａｌ，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＤＮＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｖｉｃｅ ｓｔａｂｌｙ ｃａｒｒｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｇｅｎｏｍｅ，ＮＡＴＵＲＥ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ ６：６９８９，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９，ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９、米国特許第６，６０３，０６１号－Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ、米国特許第７，８６８，１４９号－Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ ａｎｄ ＵＳ ２００９／０１００５３６－Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｔｒａｉｔｓを参照されたい。これらの各々の内容及び開示は全て、その全体が参照により本明細書に援用される。本発明の実施に際して、Ｍｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ “Ｃｒｏｐ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ｄｅｃ ２９；１３（２）：８５－９６の内容及び開示は、本明細書の実施形態が植物に対してどのように使用され得るかについても含め、それぞれが参照により本明細書に援用される。したがって、本明細書における動物細胞への言及は、別途明らかでない限り、必要な変更を加えて、植物細胞にも適用され得、オフターゲット効果が低減された本明細書の酵素及びかかる酵素を利用する系は、本明細書に言及されるものも含め、植物用途に使用することができる。
ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の植物及び酵母への応用
一般に、「植物」という用語は、細胞分裂によって特徴的に生長し、葉緑体を含有し、セルロースで構成される細胞壁を有する、植物界の任意の様々な光合成生物、真核生物、単細胞生物または多細胞生物に関する。植物という用語は、単子葉植物及び双子葉植物を包含する。具体的には、植物は、限定するものではないが、アカシア、アルファルファ、アマランス、リンゴ、アンズ、チョウセンアザミ、トネリコ、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、ビート、カバノキ、ブナノキ、クロイチゴ、ブルーベリー、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタループ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、ヒマラヤスギ、穀物、セロリ、クリ、サクランボ、ハクサイ、柑橘類、クレメンタイン、クローバー、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、ササゲ、キュウリ、イトスギ、ナス、ニレ、エンダイブ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、アメリカホドイモ、ホオズキ、ガムヘムロック、ヒッコリー、ケール、キーウィフルーツ、コールラビ、カラマツ、レタス、リーキ、レモン、ライム、ニセアカシア、マツ、メイデンヘア、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、キノコ、カラシ、堅果類、オーク、オートムギ、油ヤシ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物または装飾花または観賞樹、パパイヤ、ヤシ、パセリ、パースニップ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、セイヨウナシ、ピート、コショウ、カキ、キマメ、マツ、パイナップル、オオバコ、セイヨウスモモ、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、赤チコリ、ダイコン、ナタネ、キイチゴ、コメ、ライムギ、モロコシ、ベニバナ、サルヤナギ、ダイズ、ホウレンソウ、エゾマツ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、樹木、ライ小麦、芝草、カブ、つる植物、クルミ、オランダガラシ、スイカ、コムギ、ヤムイモ、イチイ、及びズッキーニなどの被子植物及び裸子植物を含むことが意図される。植物という用語は、主に根、葉及び高等植物を特徴付ける他の器官の欠如によってまとめられる、大部分が光独立栄養生物である藻類も包含する。
本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用したゲノム編集方法を使用すると、本質的にあらゆる植物に所望の形質を付与することができる。本開示の核酸コンストラクト及び上述の様々な形質転換方法を使用して、多種多様な植物及び植物細胞系を、本明細書に記載される所望の生理学的及び農学的特徴について操作することができる。好ましい実施形態において、操作される標的植物及び植物細胞には、穀類作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、キビ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）を含む、作物；顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹及びマツの木（例えば、マツ モミ、トウヒ）；ファイトレメディエーションで使用される植物（例えば、重金属蓄積植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）ならびに実験目的で使用される植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）などの単子葉植物及び双子葉植物が含まれるが、これらに限定されない。したがって、方法及び系は、広範囲の植物にわたって、例えば、Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ、Ｉｌｌｉｃｉａｌｅｓ、Ｌａｕｒａｌｅｓ、Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ、Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ、Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ、Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ、Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ、Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ、Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ、Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ、Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ、Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ、Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ、Ｂａｔａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ、Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ、Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ、Ｔｈｅａｌｅｓ、Ｍａｌｖａｌｅｓ、Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ、Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ、Ｖｉｏｌａｌｅｓ、Ｓａｌｉｃａｌｅｓ、Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ、Ｅｒｉｃａｌｅｓ、Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ、Ｅｂｅｎａｌｅｓ、Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ、Ｒｏｓａｌｅｓ、Ｆａｂａｌｅｓ、Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ、Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ、Ｍｙｒｔａｌｅｓ、Ｃｏｒｎａｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ、Ｓａｎ ｔａｌｅｓ、Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ、Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ、Ｒｈａｍｎａｌｅｓ、Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ、Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ、Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ、Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ、Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ、Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ、Ｌａｍｉａｌｅｓ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ、Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ、Ｒｕｂｉａｌｅｓ、Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ、及びＡｓｔｅｒａｌｅｓの各目に属する双子葉植物などとともに使用することができる。方法及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ、Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ、Ｎａｊａｄａｌｅｓ、Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ、Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ、Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ、Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ、Ｐｏａｌｅｓ、Ｊｕｎｃａｌｅｓ、Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ、Ｔｙｐｈａｌｅｓ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ、Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ、Ａｒｅｃａｌｅｓ、Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ、Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ、Ａｒａｌｅｓ、Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ、及びＯｒｃｈｉｄ ａｌｅｓに属するものなどの単子葉植物、またはＧｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅの各目に属する植物、例えば、Ｐｉｎａｌｅｓ、Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ、Ｃｙｃａｄａｌｅｓ、Ａｒａｕｃａｒｉａｌｅｓ、Ｃｕｐｒｅｓｓａｌｅｓ及びＧｎｅｔａｌｅｓに属するものなどとともに使用することができる。
本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系及び使用方法は、広範囲の植物種にわたって使用することができ、これらには、以下の双子葉植物、単子葉植物または裸子植物の属の非限定的な一覧が含まれる：Ａｔｒｏｐａ、Ａｌｓｅｏｄａｐｈｎｅ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｂｅｉｌｓｃｈｍｉｅｄｉａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃｏｃｃｕｌｕｓ、Ｃｒｏｔｏｎ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ、Ｃｏｃｏｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｄｕｇｕｅｔｉａ、Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ、Ｆｉｃｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇｌａｕｃｉｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｖｅａ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｉｔｓｅａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｍａｌｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｌｅａ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｐａｐａｖｅｒ、Ｐｅｒｓｅａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｔａｃｉａ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｙｒｕｓ、Ｐｒｕｎｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓｉｎｏｍｅｎｉｕｍ、Ｓｔｅｐｈａｎｉａ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｃｉａ、Ｖｉｎｃａ、Ｖｉｌｉｓ、及びＶｉｇｎａ；ならびにＡｌｌｉｕｍ、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ、Ａｒａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｖｅｎａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｆｅｓｔｕｌｏｌｉｕｍ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｌｅｍｎａ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｍｕｓａ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｚｅａ、Ａｂｉｅｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａ、Ｅｐｈｅｄｒａ、Ｐｉｃｅａ、Ｐｉｎｕｓ、及びＰｓｅｕｄｏｔｓｕｇａの各属。
ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系及び使用方法はまた、広範囲の「藻類」または「藻類細胞」にわたって使用することができ、これらには、例えば、Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ（紅藻類）、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ（緑藻類）、Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ（褐藻類）、Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ（珪藻類）、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ及び渦鞭毛藻類を含むいくつかの真核生物の門、ならびに原核生物の門Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（藍藻類）から選択される藻類が含まれる。「藻類」という用語は、例えば、Ａｍｐｈｏｒａ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎｉｋｓｔｒｏｄｅｓｍｉｓ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｅｍｉｌｉａｎａ、Ｅｕｇｌｅｎａ、Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｍｏｎｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎａｎｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｏｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｒｔｏｒｉａ、Ｐａｖｌｏｖａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｐｌａｙｔｍｏｎａｓ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｐｏｒｈｙｒａ、Ｐｓｅｕｄｏａｎａｂａｅｎａ、Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ、Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍから選択される藻類を含む。
植物の一部、すなわち、「植物組織」を本発明の方法に従って処理して、改良された植物を作製してもよい。植物組織はまた、植物細胞を包含する。本明細書で使用される「植物細胞」という用語は、生きている植物の個々の単位を指し、インタクトな完全な植物体であるか、またはインビトロ組織培養で、培地もしくは寒天上で、生長培地もしくは緩衝液中の懸濁液中で、もしくは、例えば、植物組織、植物器官、もしくは完全な植物体などの高度に組織化された単位の一部として生長した単離された形態であるかのいずれかである。
「プロトプラスト」は、保護細胞壁を、例えば、機械的または酵素的手段を使用して、完全にまたは部分的に除去した植物細胞を指し、これにより、適切な生長条件下で細胞壁を修復し、増殖し、完全な植物体へ再生することができる、生きている植物のインタクトな生化学的にコンピテントな単位が得られる。
「形質転換」という用語は、広義には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａまたは様々な化学的もしくは物理的方法のうちの１つを用いたＤＮＡの導入によって、植物宿主が遺伝子改変されるプロセスを指す。本明細書で使用されるとき、「植物宿主」という用語は、植物の任意の細胞、組織、器官、または子孫を含む、植物を指す。多くの好適な植物組織または植物細胞を形質転換することができ、これらには、プロトプラスト、体細胞胚、花粉、葉、実生、茎、カルス、ストロン、マイクロチューバー、及びシュートが含まれるが、これらに限定されない。植物組織はまた、有性生殖的な生成であるか、無性生殖的な生成であるかに関わらず、そのような植物、種子、子孫、ムカゴの任意のクローン、及び挿し木または種子などのこれらのいずれかの後継を指す。
本明細書で使用される「形質転換された」という用語は、コンストラクトなどの外来ＤＮＡ分子が導入された細胞、組織、器官、または生物を指す。導入されたＤＮＡ分子は、レシピエントの細胞、組織、器官、または生物のゲノムＤＮＡに取り込まれ得、それにより、導入されたＤＮＡ分子が後続の子孫に伝達される。これらの実施形態において、「形質転換された」細胞もしくは植物または「トランスジェニック」細胞もしくは植物にはまた、その細胞または植物の子孫、及びそのような形質転換された植物を交配親として利用し、導入されたＤＮＡ分子の存在によって生じる改変された表現型を示す育種計画から生成された子孫も含まれ得る。好ましくは、トランスジェニック植物は、稔性であり、有性生殖を介して、導入されたＤＮＡを子孫に伝達することができる。
トランスジェニック植物の子孫などの「子孫」という用語は、トランスジェニック植物から生まれたもの、それから生じたもの、またはそれに由来するものである。導入されたＤＮＡ分子はまた、レシピエント細胞に一過性に導入されてもよく、そのため、導入されたＤＮＡ分子は、後続の子孫に継承されないことから、「トランスジェニック」とはみなされない。したがって、本明細書で使用されるとき、「非トランスジェニック」植物または植物細胞は、そのゲノムに安定的に組み込まれた外来ＤＮＡを含有しない植物である。
本明細書で使用される「植物プロモーター」という用語は、その起源が植物細胞であるかどうかに関わらず、植物細胞において転写を開始させることができるプロモーターである。例示的な好適な植物プロモーターには、植物、植物ウイルス、及び植物細胞で発現される遺伝子を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＲｈｉｚｏｂｉｕｍなどの細菌から得られるものが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「真菌細胞」は、真菌界内の任意の種類の真核細胞を指す。真菌界内の門には、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、及びＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａが含まれる。真菌細胞には、酵母、カビ、及び糸状菌が含まれ得る。いくつかの実施形態において、真菌細胞は、酵母細胞である。
本明細書で使用されるとき、「酵母細胞」という用語は、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ門及びＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門内の任意の真菌細胞を指す。酵母細胞には、出芽酵母細胞、分裂酵母細胞、及びカビ細胞が含まれ得る。これらの生物に限定されないが、研究室及び工業環境で使用されている多くの種類の酵母は、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ門の一部である。いくつかの実施形態において、酵母細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅ細胞、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ細胞、またはＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ細胞である。他の酵母細胞には、限定するものではないが、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、及びＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、別名Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ及びＣａｎｄｉｄａ ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）が含まれ得る。いくつかの実施形態において、真菌細胞は、糸状真菌細胞である。本明細書で使用されるとき、「糸状真菌細胞」という用語は、糸状体、すなわち、菌糸または菌糸体に生長する任意の種類の真菌細胞を指す。糸状真菌細胞の例には、限定するものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、及びＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）を挙げることができる。
いくつかの実施形態において、真菌細胞は、工業用菌株である。本明細書で使用されるとき、「工業用菌株」は、工業プロセス、例えば、商業的または工業的規模での製品生産に使用されるまたはそれから単離される任意の真菌細胞株を指す。工業用菌株は、工業プロセスに典型的に使用される真菌種を指し得、または非工業目的（例えば、実験研究）にも同様に使用され得る真菌種の分離株を指し得る。工業プロセスの例には、発酵（例えば、食品または飲料製品の製造）、蒸留、バイオ燃料生産、化合物の生産、及びポリペプチドの生産を挙げることができる。工業用菌株の例には、限定するものではないが、ＪＡＹ２７０及びＡＴＣＣ４１２４を挙げることができる。
いくつかの実施形態において、真菌細胞は、倍数体細胞である。本明細書で使用されるとき、「倍数体」細胞は、ゲノムが２コピー以上で存在する任意の細胞を指し得る。倍数体細胞は、天然に倍数体状態で認められる種類の細胞を指し得、または倍数体状態で存在するように誘導された細胞（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の制御、変化、不活性化、活性化、または修飾を介して）を指し得る。倍数体細胞は、ゲノム全体が倍数体である細胞を指し得、または特定の目的ゲノム遺伝子座が倍数体である細胞を指し得る。理論に束縛されることを望むものではないが、倍数体細胞のゲノム工学では、一倍体細胞と比較して、ガイドＲＮＡの存在量が律速要素になり得ることが多いことから、本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用する方法は、特定の真菌細胞型の使用による利点を活かすことができると考えられる。
いくつかの実施形態において、真菌細胞は、二倍体細胞である。本明細書で使用されるとき、「二倍体」細胞は、ゲノムが２コピーで存在する任意の細胞を指し得る。二倍体細胞は、天然に二倍体状態で認められる種類の細胞を指し得、または二倍体状態で存在するように誘導された細胞（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の制御、変化、不活性化、活性化、または修飾を介して）を指し得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２２８Ｃは、一倍体または二倍体状態で維持され得る。二倍体細胞は、ゲノム全体が二倍体である細胞を指し得、または特定の目的ゲノム遺伝子座が二倍体である細胞を指し得る。いくつかの実施形態において、真菌細胞は、一倍体細胞である。本明細書で使用されるとき、「一倍体」細胞は、ゲノムが１コピーで存在する任意の細胞を指し得る。一倍体細胞は、天然に一倍体状態で認められる種類の細胞を指し得、または一倍体状態で存在するように誘導された細胞（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の制御、変化、不活性化、活性化、または修飾を介して）を指し得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２２８Ｃは、一倍体または二倍体状態で維持され得る。一倍体細胞は、ゲノム全体が一倍体である細胞を指し得、または特定の目的ゲノム遺伝子座が一倍体である細胞を指し得る。
本明細書で使用されるとき、「酵母発現ベクター」は、ＲＮＡ及び／またはポリペプチドをコードする１つまたは複数の配列を含有し、更に、核酸（複数可）の発現を制御する任意の所望の要素、ならびに酵母細胞内での発現ベクターの複製及び維持を可能にする任意の要素を含有し得る、核酸を指す。多くの好適な酵母発現ベクター及びその特徴が当該技術分野において知られており、例えば、様々なベクター及び技術がＹｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｘｉａｏ，Ｗ．，ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７）及びＢｕｃｋｈｏｌｚ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｍ．Ａ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９（１１）：１０６７－７２に例示されている。酵母ベクターは、限定するものではないが、セントロメア（ＣＥＮ）配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、目的配列または目的遺伝子に機能可能なように連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターなどのターミネーター、複製起点、及びマーカー遺伝子（例えば、栄養要求性マーカー、抗生物質マーカー、または他の選択マーカー）を含有し得る。酵母に使用される発現ベクターの例には、プラスミド、酵母人工染色体、２μプラスミド、酵母組み込みプラスミド、酵母複製プラスミド、シャトルベクター、及びエピソームプラスミドを挙げることができる。
植物及び植物細胞のゲノムへのＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系構成要素の安定的な組み込み
具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素をコードするポリヌクレオチドは、植物細胞のゲノムに安定的に組み込まれるように導入されることが想定される。これらの実施形態において、形質転換ベクターまたは発現系の設計は、ガイドＲＮＡ及び／またはアデノシンデアミナーゼとＣｐｆ１の融合タンパク質が、いつ、どこで、どの条件下で発現するかに応じて調整され得る。
具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素を植物細胞のゲノムＤＮＡに安定的に導入することが想定される。追加的にまたは代替的に、限定するものではないが、プラスミド、ミトコンドリアまたは葉緑体などの植物細胞小器官のＤＮＡに安定的に組み込まれるように、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素を導入することが想定される。
植物細胞のゲノムへの安定的な組み込みのための発現系は、次の要素：植物細胞においてＲＮＡ及び／またはアデノシンデアミナーゼとＣｐｆ１の融合タンパク質を発現させるために使用され得るプロモーター要素；発現を高める５’非翻訳領域；単子葉植物細胞などの特定の細胞における発現を更に高めるイントロン要素；ガイドＲＮＡ及び／またはアデノシンデアミナーゼとＣｐｆ１コード配列の融合タンパク質及び他の所望の要素を挿入するのに好都合な制限部位を提供するマルチクローニングサイト；ならびに発現された転写物の効率的な終結をもたらす３’非翻訳領域のうちの１つまたは複数を含有し得る。
発現系の各要素は、プラスミドもしくは形質転換ベクターなどの環状のもの、または線状二本鎖ＤＮＡなどの非環状のもののいずれかである、１つまたは複数の発現コンストラクト上にあり得る。
具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ発現系は、少なくとも：植物の標的配列とハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、ガイドＲＮＡは、ガイド配列及び直列反復配列を含む、ヌクレオチド配列と、アデノシンデアミナーゼとＣｐｆ１の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含み、ここで、構成要素（ａ）または（ｂ）は、同じまたは異なるコンストラクト上に位置し、それにより、異なるヌクレオチド配列は、植物細胞において機能可能な同じまたは異なる制御要素の制御下に置かれ得る。
ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素及び適用可能な場合はテンプレート配列を含有するＤＮＡコンストラクト（複数可）は、様々な従来技術によって、植物、植物部分、または植物細胞のゲノムに導入することができる。プロセスは、一般に、好適な宿主細胞または宿主組織を選択する工程と、コンストラクト（複数可）を宿主細胞または宿主組織に導入する工程と、植物細胞または植物を再生させる工程とを含む。
具体的な実施形態において、ＤＮＡコンストラクトは、限定するものではないが、電気穿孔、マイクロインジェクション、植物細胞プロトプラストのエアロゾルビームインジェクションなどの技術を使用して植物細胞に導入することができ、またはＤＮＡコンストラクトは、ＤＮＡパーティクルボンバードメントなどの微粒子銃方法を使用して植物組織に直接導入することもできる（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２０００ Ｆｅｂ；９（１）：１１－９も参照）。パーティクルボンバードメントの基本は、目的遺伝子（複数可）をコーティングした粒子を細胞に向けて加速させることにより、粒子が原形質に侵入し、典型的に安定的にゲノムに組み込まれることである（例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｈ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）、Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）参照）。
具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素を含有するＤＮＡコンストラクトは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換によって、植物に導入することができる。ＤＮＡコンストラクトは、好適なＴ－ＤＮＡ隣接領域と組み合わせて、従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクターに導入され得る。外来ＤＮＡは、植物に感染させることによって、または植物プロトプラストを、１つまたは複数のＴｉ（腫瘍誘発）プラスミドを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌とともにインキュベーションすることによって、植物のゲノムに組み込まれ得る（例えば、Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）及び米国特許第５，５６３，０５５号参照）。
植物プロモーター
植物細胞における適切な発現を確実にするために、本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、典型的に、植物プロモーター、すなわち、植物細胞において機能可能なプロモーターの制御下に置かれる。異なる種類のプロモーターの使用も想定される。
構成的植物プロモーターは、当該プロモーターが制御するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、植物の全てまたはほぼ全ての発達段階において、全てまたはほぼ全ての植物組織で発現させることができるプロモーターである（「構成的発現」とも称される）。構成的プロモーターの非限定的な１つの例は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターである。「制御型プロモーター」は、構成的ではなく、時間的及び／または空間的に制御するように遺伝子発現を誘導するプロモーターを指し、組織特異的プロモーター、組織選択的プロモーター及び誘導性プロモーターが含まれる。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発達段階で、または異なる環境条件に応じて、遺伝子の発現を誘導することができる。具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ構成要素のうちの１つまたは複数は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下で発現され、組織選択的プロモーターを利用して、特定の植物組織内のある特定の細胞型、例えば、葉もしくは根の維管束細胞、または種子の特定の細胞における発現向上を目的にすることができる。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系に使用される特定のプロモーターの例は、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：７９２－８０３、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ １２：２５５－６５、Ｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：２０７－１８、Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９：７５９－７２及びＣａｐａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：６８１－９１に見出される。
デアミナーゼの非特異的活性を回避する限定的な状況下でＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素のうちの１つまたは複数を表現させるには、誘導性プロモーターが有益であり得る。具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数の要素は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。誘導性であり、時空間的に遺伝子編集または遺伝子発現を制御することが可能なプロモーターの例は、ある形態のエネルギーを使用し得る。エネルギーの形態には、音響エネルギー、電磁放射線、化学エネルギー及び／または熱エネルギーが含まれ得るが、これらに限定されない。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ－ＯｎまたはＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化系（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）、または光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、またはクリプトクロム）、例えば、配列特異的に転写活性に変化をもたらす光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が挙げられる。光誘導性系の構成要素は、アデノシンデアミナーゼとＣｐｆ１の融合タンパク質、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）を含み得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、ＵＳ６１／７３６４６５及びＵＳ６１／７２１，２８３に提供されており、その全体は、参照により本明細書に援用される。
具体的な実施形態において、一過性または誘導性発現は、例えば、化学物質制御プロモーターの使用によって達成され得、すなわち、外来性化学物質の添加により、遺伝子発現が誘導される。遺伝子発現の調節はまた、化学物質抑制性プロモーターによって得ることもでき、この場合、化学物質の添加により、遺伝子発現が抑制される。化学物質誘導性プロモーターには、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤によって活性化するトウモロコシｌｎ２－２プロモーター（Ｄｅ Ｖｅｙｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：５６８－７７）、出芽前除草剤として使用される疎水性求電子性化合物によって活性化するトウモロコシＧＳＴプロモーター（ＧＳＴ－ｌｌ－２７、ＷＯ９３／０１２９４）、及びサリチル酸によって活性化するタバコＰＲ－１ａプロモーター（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６８：８０３－７）が含まれるが、これらに限定されない。テトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーターなどの抗生物質によって制御されるプロモーター（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．、（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２７：２２９－３７、米国特許第５，８１４，６１８号及び同第５，７８９，１５６号）もまた、本明細書で使用することができる。
特定の植物細胞小器官への転座及び／または発現
発現系は、特定の植物細胞小器官への転座及び／または発現のための要素を含み得る。
葉緑体標的化
具体的な実施形態において、葉緑体遺伝子を特異的に改変するために、または葉緑体における発現を確実にするために、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用することが想定される。この目的のために、葉緑体の形質転換方法、またはＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ構成要素の葉緑体への区画化が使用される。例えば、プラスミドゲノムに遺伝子改変を導入することで、花粉による遺伝子流動などのバイオセーフティーの問題を減らすことができる。
葉緑体の形質転換方法は、当該技術分野において知られており、これらには、パーティクルボンバードメント、ＰＥＧ処理、及びマイクロインジェクションが含まれる。更に、ＷＯ２０１００６１１８６に記載されているように、核ゲノムからプラスミドへの形質転換カセットの転位を伴う方法を使用することができる。
あるいは、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ構成要素のうちの１つまたは複数を、植物葉緑体に対して標的化することが想定される。これは、アデノシンデアミナーゼとＣｐｆ１の融合タンパク質をコードする配列の５’領域に機能可能なように連結された、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）またはプラスミド輸送ペプチドをコードする配列を、発現コンストラクトに組み込むことによって達成される。ＣＴＰは、葉緑体への転座の際におけるプロセシング段階で除去される。発現タンパク質の葉緑体標的化は、当業者によく知られている（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｔｏ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ，２０１０，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１：１５７－１８０参照）。そのような実施形態において、ガイドＲＮＡを植物葉緑体に対して標的化することも望ましい。葉緑体局在化配列によってガイドＲＮＡを葉緑体に転位させるのに使用され得る方法及びコンストラクトは、例えば、ＵＳ２００４０１４２４７６に記載されており、参照により本明細書に援用される。そのような様々なコンストラクトを本発明の発現系に組み込むことで、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系構成要素を効率的に転位させることができる。
藻類細胞におけるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系をコードするポリヌクレオチドの導入
トランスジェニック藻類（またはセイヨウアブラナなどの他の植物）は、植物油またはアルコール（特に、メタノール及びエタノール）などのバイオ燃料または他の生成物の生産に特に有用であり得る。これらは、油またはバイオ燃料産業における使用のために、油またはアルコールを高度に発現または過剰発現するように操作され得る。
ＵＳ８９４５８３９は、Ｃａｓ９を使用して微小藻類（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ細胞）種）を操作する方法について記載している。同様のツールを使用して、本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の方法をＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ種及び他の藻類に応用することができる。具体的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアプタマー結合アダプタータンパク質に融合され得る）、及びガイドＲＮＡは、Ｈｓｐ７０Ａ－Ｒｂｃ Ｓ２またはベータ２－チューブリンなどの構成的プロモーターの制御下でアデノシンデアミナーゼとＣｐｆ１の融合タンパク質を発現するベクターを使用して、発現を行う藻類に導入される。ガイドＲＮＡは、任意選択で、Ｔ７プロモーター含有ベクターを使用して送達される。あるいは、Ｃｐｆ１ ｍＲＮＡ及びインビトロ転写ガイドＲＮＡを藻類細胞に送達することができる。電気穿孔プロトコルは、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇキットの標準的な推奨プロトコルなどが当業者に利用可能である。
酵母細胞におけるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系構成要素の導入
具体的な実施形態において、本発明は、酵母細胞のゲノム編集のためのＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用に関する。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系構成要素をコードするポリヌクレオチドを導入するために使用され得る酵母細胞の形質変換方法は、Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｕｇｓ．２０１０ Ｎｏｖ－Ｄｅｃ；１（６）：３９５－４０３）に記載されている。非限定的な例には、酢酸リチウム処理（担体ＤＮＡ及びＰＥＧ処理を更に含み得る）、ボンバードメントまたは電気穿孔による酵母細胞の形質転換が挙げられる。
植物及び植物細胞におけるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系構成要素の一過性発現
具体的な実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子を植物細胞で一過性に発現させることが想定される。これらの実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）、及びアデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアプタマー結合アダプタータンパク質に融合され得る）のいずれもが細胞に内に存在する場合にのみ標的遺伝子の改変が確実となり得ることから、ゲノム改変を更に制御することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の発現が一過性であるため、かかる植物細胞から再生する植物は、典型的に、外来ＤＮＡを含有しない。具体的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は植物細胞によって安定的に発現され、ガイド配列は一過性に発現される。
具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系構成要素は、植物ウイルスベクターを使用して植物細胞に導入することができる（Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．１９９６；３４：２９９－３２３）。更なる具体的な実施形態において、当該ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルス由来のベクターである。例えば、ジェミニウイルス（例えば、キャベツ巻葉ウイルス、インゲンマメ黄萎ウイルス、コムギ萎縮ウイルス、トマト巻葉ウイルス、トウモロコシ条斑ウイルス、タバコ巻葉ウイルス、またはトマトゴールデンモザイクウイルス）またはナノウイルス（例えば、ソラマメえそ黄化ウイルス）。他の具体的な実施形態において、当該ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルス由来のベクターである。例えば、トブラウイルス（例えば、タバコ茎えそウイルス、タバコモザイクウイルス）、ポテックスウイルス（例えば、ジャガイモウイルスＸ）、またはホルデイウイルス（例えば、ムギ斑葉モザイクウイルス）。植物ウイルスの複製ゲノムは、非組み込み型ベクターである。
具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の一過性発現に使用されるベクターは、例えば、プロトプラストにおけるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性一過性発現に合わせて調整されるｐＥＡＱベクターである（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２００９ Ｓｅｐ；７（７）：６８２－９３）。ゲノム位置の正確な標的化は、ＣＲＩＳＰＲ酵素を発現する安定したトランスジェニック植物でガイドＲＮＡを発現するように改変したキャベツ巻葉ウイルス（ＣａＬＣｕＶ）ベクターの使用により、実証された（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１４９２６（２０１５），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１４９２６）。
具体的な実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子をコードする二本鎖ＤＮＡ断片は、植物細胞に一過性に導入することができる。そのような実施形態において、導入される二本鎖ＤＮＡ断片は、細胞を改変するのに十分であるが、企図された時間の経過後、または１回また複数回以上の細胞分裂後は存続しない量で提供される。植物においてＤＮＡ移入を誘導する方法は、当業者に知られている（例えば、Ｄａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８９ Ｓｅｐ；１３（３）：２７３－８５参照）。
他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）及び／またはアデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアプタマー結合アダプタータンパク質に融合され得る）をコードするＲＮＡポリヌクレオチドは、細胞を（少なくとも１つのガイドＲＮＡの存在下で）改変するのに十分であるが、企図された時間の経過後、または１回または複数回以上の細胞分裂後は存続しない量で植物細胞に導入され、次いで、タンパク質を生成する宿主細胞によって、翻訳及びプロセシングされる。一過性発現のための植物プロトプラストへのｍＲＮＡ導入方法は、当業者によって知られている（例えば、Ｇａｌｌｉｅ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９３），１３；１１９－１２２参照）。
上に記載される様々な方法の組み合わせも想定される。
ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系構成要素の植物細胞への送達
具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数の構成要素を植物細胞に直接送達することが有益である。これは、とりわけ、非トランスジェニック植物の作製に有益である（以下参照）。具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系構成要素のうちの１つまたは複数は、植物または植物細胞の外で調製され、細胞に送達される。例えば、具体的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、インビトロで調製され、その後、植物細胞に導入される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、組換え産生を含む、当業者に既知の様々な方法によって調製することができる。発現後、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、単離され、必要に応じて再度折り畳まれ、精製され、任意選択で、Ｈｉｓタグなどの任意の精製タグを除去するために処理される。粗製、部分精製、またはより完全に精製されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が得られたら、そのタンパク質を植物細胞に導入することができる。
具体的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、目的遺伝子を標的とするガイドＲＮＡと混合され、予め組み込まれたリボ核タンパク質が形成される。
個々の構成要素または予め組み込まれたリボ核タンパク質は、電気穿孔、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ関連遺伝子産物でコーティングされた粒子のボンバードメント、化学的トランスフェクション、または細胞膜を通過する何らかの他の輸送手段によって、植物細胞に導入することができる。例えば、予め組み込まれたＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質の植物プロトプラストへのトランスフェクションは、確実に植物ゲノムの標的化改変を行うことが実証されている（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３８９に記載のとおり）。
具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系構成要素は、ナノ粒子を使用して、植物細胞に導入される。構成要素は、タンパク質もしくは核酸、またはその組み合わせのいずれの場合も、ナノ粒子にアップロードまたはパッケージングして、植物に適用することができる（例えば、ＷＯ２００８０４２１５６及びＵＳ２０１３０１８５８２３に記載のものなど）。特に、本発明の実施形態は、ＷＯ２０１５０８９４１９に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）をコードするＤＮＡ分子（複数可）、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアプタマー結合アダプタータンパク質に融合し得る）をコードするＤＮＡ分子（複数可）、及びガイドＲＮＡ及び／または単離ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子をアップロードまたはパッケージングしたナノ粒子を含む。
ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数の構成要素を植物細胞に導入する更なる手段は、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を使用することによる。したがって、特に、本発明の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質に連結された細胞膜透過性ペプチドを含む、組成物を含む。本発明の具体的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはガイドＲＮＡは、１つまたは複数のＣＰＰに結合され、植物プロトプラストの内部に効果的に輸送される。Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ（ヒト細胞におけるＣａｓ９については、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ｊｕｎ；２４（６）：１０２０－７）。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子及び／またはガイドＲＮＡは、植物プロトプラスト送達のための１つまたは複数のＣＰＰに結合される、１つまたは複数の環状または非環状ＤＮＡ分子（複数可）によってコードされる。次いで、植物プロトプラストは、植物細胞へ再生し、更に植物となる。ＣＰＰは、一般に、受容体非依存的に細胞膜を越えて生体分子を輸送することができる、タンパク質またはキメラ配列のいずれかに由来する３５アミノ酸よりも少ない短鎖ペプチドとして記載される。ＣＰＰは、陽イオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンに富む抗微生物配列を有するペプチド、及びキメラまたは二分性ペプチドであってよい（Ｐｏｏｇａ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｌ ２００５）。ＣＰＰは、生物学的膜を透過することができ、それにより、様々な生体分子の細胞膜を越えた細胞質への移動を誘発し、細胞内経路を改善し、ひいては、生体分子と標的との相互作用を促進する。ＣＰＰの例には、とりわけ、Ｔａｔ、ＨＩＶ１型のウイルス複製に必要な核内転写活性化因子タンパク質、ペネトラチン、カポジ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリンβ３シグナルペプチド配列；ポリアルギニンペプチドアルギニン配列、グアニンに富む分子輸送体、スイートアローペプチドなどが挙げられる。
遺伝子改変された非トランスジェニック植物を作製するためのＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用
具体的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、植物のゲノムに外来ＤＮＡが存在しないように、任意の外来遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ構成要素をコードする遺伝子を含め、植物のゲノムに永続的に導入することなく、内因性遺伝子を改変するために、またはその発現を改変するために使用される。これは、非トランスジェニック植物に対する規制要件がさほど厳しくないため、有益である。
具体的な実施形態において、これは、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系構成要素の一過性発現によって確実になされる。具体的な実施形態において、構成要素のうちの１つまたは複数は、本明細書に記載される方法による目的遺伝子の安定的な改変を一貫して確実にするのに十分なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、アデノシンデアミナーゼ、及びガイドＲＮＡを産生する１つまたは複数のウイルスベクター上で発現される。
具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系コンストラクトの一過性発現は、植物プロトプラストで確実になされるため、ゲノムに組み込まれることはない。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系が本明細書に記載される標的遺伝子の改変を確実に行うことができるのには、限られた発現域でも十分である。
具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の異なる構成要素は、本明細書に上記されるナノ粒子またはＣＰＰ分子などの粒子状送達分子を利用して、別々にまたは混合物として植物細胞、プロトプラストまたは植物組織に導入される。
ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系構成要素の発現は、アデノシンデアミナーゼのデアミナーゼ活性によるゲノムの標的改変を誘導し得る。本明細書に上記される種々の戦略は、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系構成要素を植物ゲノムに導入する必要なく、ＣＲＩＳＰＲ媒介性標的化ゲノム編集を可能にする。植物細胞に一過性に導入される構成要素は、典型的に、交配時に除去される。
植物培養及び再生
具体的な実施形態において、改変ゲノムを有し、かつ本明細書に記載される方法のいずれかによって作製または入手される植物細胞は、培養することで、形質転換または改変された遺伝子型を備え、それゆえ、所望の表現型を有する、完全な植物体を再生することができる。従来の再生技術は、当業者によく知られている。そのような再生技術の具体例は、組織培養生長培地中の特定の植物ホルモンの操作に基づき、典型的には、所望のヌクレオチド配列とともに導入されている殺生物剤及び／または除草剤マーカーに基づく。更なる具体的な実施形態において、植物再生は、培養されたプロトプラスト、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚またはそれらの部分から得られる（例えば、Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８３），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．参照）。
具体的な実施形態において、本明細書に記載される形質転換されたまたは改良された植物は、自家受粉させて、本発明のホモ接合性改良植物の種子を提供することができ（ＤＮＡ改変についてホモ接合）、または非トランスジェニック植物もしくは異なる改良植物と交配して、ヘテロ接合性植物の種子を提供することができる。組換えＤＮＡが植物細胞に導入される場合、かかる交配により得られる植物は、組換えＤＮＡ分子についてヘテロ接合性である植物である。改良植物からの交配によって得られた、遺伝子改変（組換えＤＮＡであり得る）を含む、そのようなホモ接合及びヘテロ接合植物は、いずれも、本明細書において「子孫」と称される。子孫植物は、元のトランスジェニック植物に由来し、かつ本明細書で提供される方法によって導入されたゲノム改変または組換えＤＮＡ分子を含有する、植物である。あるいは、遺伝子改変植物は、外来ＤＮＡがゲノムに組み込まれない、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用する上記の方法のうちの１つによって得ることができる。更なる育種によって得られたそのような植物の子孫もまた、遺伝子改変を含有し得る。育種は、種々の作物に一般に使用されている任意の育種方法によって実施される（例えば、Ａｌｌａｒｄ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｕ．ｏｆ ＣＡ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ，５０－９８（１９６０）。
向上した農業形質を有する植物の生成
本明細書で提供されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、標的化されたＡ－Ｇ変異及びＴ－Ｃ変異を導入するために使用することができる。単一細胞で複数の改変を達成することを目的にした複数の標的化ＲＮＡの共発現によって、マルチプレックス化ゲノム改変を確実に行うことができる。この技術は、栄養価の向上、病害に対する抵抗性及び生物的ストレス及び非生物的ストレスに対する抵抗性の強化、ならびに商業的に有用な植物製品または異種化合物の生産性の向上を含む、改善された特徴を有する植物の高精度の操作に使用することができる。
具体的な実施形態において、本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、標的のＡ－Ｇ変異及びＴ－Ｃ変異を導入するために使用される。そのような変異は、ナンセンス突然変異（例えば、未成熟終止コドン）またはミスセンス突然変異（例えば、異なるアミノ酸残基をコードするもの）であり得る。これは、特定の内因性遺伝子におけるＡ－Ｇ変異及びＴ－Ｃ変異が所望の形質を付与し、またはそれに寄与することができる場合、有益である。
本明細書に記載される方法は、一般に、野生型植物と比較して１つまたは複数の所望の形質を有するという点で「改良された植物」の生成をもたらす。具体的な実施形態において、得られる植物、植物細胞または植物部分は、トランスジェニック植物であり、植物の細胞の全てまたは部分のゲノムに組み込まれた外来性ＤＮＡ配列を含む。具体的な実施形態において、植物のいずれの植物細胞のゲノムにも外来性ＤＮＡ配列が組み込まれていないという点で非トランスジェニック的に遺伝子改変された植物、植物部分または細胞が得られる。そのような実施形態において、改良された植物は、非トランスジェニックである。内因性遺伝子の改変のみが確実に生じ、外来遺伝子が植物ゲノムに導入も維持もされない場合、得られる遺伝子改変作物は、外来遺伝子を含有せず、そのため、基本的に、非トランスジェニックとみなされ得る。
具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡウイルス（例えば、ジェミニウイルス）またはＲＮＡウイルス（例えば、トブラウイルス）によって細胞に送達される。具体的な実施形態において、導入工程は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、アデノシンデアミナーゼ、及びガイドＲＮＡをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含有するＴ－ＤＮＡを植物細胞に送達することを含み、ここで、送達は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介する。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素をコードするポリヌクレオチド配列は、構成的プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）、または細胞特異的プロモーターもしくは誘導性プロモーターなどのプロモーターに機能可能なように連結され得る。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによって導入される。具体的な実施形態において、方法は、導入工程後に、植物細胞をスクリーニングして、目的遺伝子の発現が改変されたかどうかを決定することを更に含む。具体的な実施形態において、方法は、植物細胞から植物を再生させる工程を含む。更なる実施形態において、方法は、植物を交配育種して、遺伝子的に望ましい植物系統を得ることを含む。
上記方法の具体的な実施形態において、病害抵抗性作物は、罹病性遺伝子または植物防御遺伝子の負の制御因子をコードする遺伝子（例えば、Ｍｌｏ遺伝子）の標的化された変異によって得られる。具体的な実施形態において、除草剤抵抗性作物は、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）及びプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）をコードするものなどの植物遺伝子の特定のヌクレオチドの標的化された置換によって生成される。具体的な実施形態において、非生物的ストレス抵抗性の負の制御因子をコードする遺伝子の標的化された変異による乾燥抵抗性及び塩抵抗性作物、Ｗａｘｙ遺伝子の標的化された変異による低アミロース穀物、アリューロン層の主要なリパーゼ遺伝子の標的化された変異による低酸敗性のイネまたは他の穀物など。具体的な実施形態において、目的の形質をコードする内因性遺伝子の包括的な一覧を以下に記載する。
倍数体植物を改変するためのＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用
多くの植物は、倍数体であり、これは、植物がそのゲノムの複製コピーを持っていることを意味し、コムギの場合、６個にものぼる。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を利用する本発明による方法は、遺伝子の全てのコピーに影響を与え、または何十個もの遺伝子を一度に標的とする「マルチプレックス化」が可能である。例えば、具体的な実施形態において、病害に対する防御の抑制に関与する様々な遺伝子の機能喪失型変異を同時に確実にするために、本発明の方法が使用される。具体的な実施形態において、コムギ植物がウドンコ病菌に抵抗性であることを確実にするために、コムギ植物細胞においてＴａＭＬＯ－Ａｌ、ＴａＭＬＯ－Ｂｌ及びＴａＭＬＯ－Ｄｌ核酸配列の発現を同時に抑制して、当該細胞からコムギ植物を再生するために、本発明の方法が使用される（ＷＯ２０１５１０９７５２も参照）。
農業形質を付与する例示的な遺伝子
具体的な実施形態において、本発明は、以下に列挙するものなどの内因性遺伝子及びその制御要素の標的化されたＡ－Ｇ変異及びＴ－Ｃ変異を伴う方法を包含する。
１．害虫または病害に対する抵抗性を付与する遺伝子：
植物病害抵抗性遺伝子。クローニングした抵抗性遺伝子により植物を形質転換し、特定の病原菌株に対して抵抗性である植物を操作する。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７８９（１９９４）（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍに対して抵抗性のあるトマトＣｆ－９遺伝子のクローニング）、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４３２（１９９３）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔｏｍａｔｏに対して抵抗性であるトマトＰｔｏ遺伝子は、プロテインキナーゼをコードする）、Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７８：１０８９（１９９４）（Ａｒａｂｉｄｏｐｓは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅに対して抵抗性のあるＲＳＰ２遺伝子であり得る）を参照されたい。病原体の感染中に上方制御または下方制御される植物遺伝子を病原体抵抗性について操作することができる。例えば、Ｔｈｏｍａｚｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ０６４８２４；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０６４８２４ Ｅｐｕｂ．Ｊｕｌｙ ２３，２０１６（病原体の感染中に通常上方制御されるＳｌＤＭＲ６－１に欠失を有するトマト植物）を参照されたい。
ダイズシストセンチュウなどの害虫に対して抵抗性を付与する遺伝子。例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９６／３０５１７号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９３／１９１８１号を参照されたい。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓタンパク質は、例えば、Ｇｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４８：１０９（１９８６）を参照されたい。
レクチンは、例えば、Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：２５（１９９４を参照されたい。
アビジンなどのビタミン結合タンパク質は、害虫に対する幼虫駆除剤としてのアビジン及びアビジンホモログの使用を教示する、ＰＣＴ特許出願公開第ＵＳ９３／０６４８７号を参照されたい。
プロテアーゼもしくはプロテアーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤などの酵素阻害剤。例えば、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６７９３（１９８７）、Ｈｕｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：９８５（１９９３））、Ｓｕｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：１２４３（１９９３）及び米国特許第５，４９４，８１３号を参照されたい。
エクジステロイドまたは幼若ホルモン、そのバリアント、それをベースにする模倣体、またはそのアンタゴニストもしくはアゴニストなどの昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン。例えば、Ｈａｍｍｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：４５８（１９９０）を参照されたい。
発現すると、対象となる害虫の生理機能を破壊する昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチド。例えば、Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９（１９９４）及びＰｒａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３：１２４３（１９８９）。また、米国特許第５，２６６，３１７号も参照されたい。
ヘビ、スズメバチ、または任意の他の生物によって天然に生成される昆虫特有の毒液。例えば、Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １１６：１６５（１９９２）を参照されたい。
殺虫活性を有するモノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または別の非タンパク質分子の過剰蓄積に関与する酵素。
翻訳後修飾を含む、生物学的に活性な分子の改変に関与する酵素、例えば、糖分解酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、アミノ基転移酵素、エステラーゼ、加水分解酵素、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ及びグルカナーゼ（天然か合成かに関わらない）。ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９３／０２１９７号，Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３：６９１（１９９３）及びＫａｗａｌｌｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１ ：６７３（１９９３）を参照されたい。
シグナル伝達を刺激する分子。例えば、Ｂｏｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：７５７（１９９４）及びＧｒｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１４６７（１９９４）を参照されたい。
ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。Ｂｅａｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：４５１（１９９０）を参照されたい。
病原体または寄生生物によって天然に生成される発育抑制タンパク質。Ｌａｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４３６（１９９２）及びＴｏｕｂａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：３６７（１９９２）を参照されたい。
植物によって天然に生成される発育抑制タンパク質。例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：３０５（１９９２）。
植物において、病原体は、多くの場合、宿主特異的である。例えば、いくつかのＦｕｓａｒｉｕｍ種は、トマト萎凋病を引き起こすが、攻撃するのはトマトのみであり、他のＦｕｓａｒｉｕｍ種はコムギだけを攻撃する。植物は、ほとんどの病原体に抵抗する既存の誘導防御を有する。植物の世代を超えた変異及び組換えイベントは、特に、病原体のほうが植物よりも高頻度で増殖するため、易罹患性を引き起こす遺伝的変異をもたらす。植物には、非宿主抵抗性、例えば、宿主と病原体が適合しないことがあり、あるいは、病原体の全種に対して部分的な抵抗性があることがあり、これは、多数の遺伝子によって典型的に制御され、及び／または他の種に対する抵抗性はないが病原体の数種に対する完全な抵抗性があることもある。そのような抵抗性は、典型的に、少数の遺伝子によって制御される。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の方法及び構成要素を使用することにより、本明細書で予想される特異的変異を誘導する新規ツールが誕生する。したがって、抵抗性遺伝子の元となるゲノムを分析し、所望の特徴または形質を有する植物において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の方法及び構成要素を使用して、抵抗性遺伝子の増加を誘導することができる。本発明の系は、これまでの突然変異誘発剤よりも高い精度で実施することができ、それにより、植物育種計画を加速させ、改善する。
２．ＷＯ２０１３０４６２４７に列挙されるものなどの植物病害に関与する遺伝子：
イネの病害：Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ；コムギの病害：Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆ．ａｖｅｎａｃｅｕｍ、Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐ．ｒｅｃｏｎｄｉｔａ、Ｍｉｃｒｏｎｅｃｔｒｉｅｌｌａ ｎｉｖａｌｅ、Ｔｙｐｈｕｌａ ｓｐ．、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｎｏｄｏｒｕｍ、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ－ｒｅｐｅｎｔｉｓ；オオムギの病害：Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆ．ａｖｅｎａｃｅｕｍ、Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐ．ｈｏｒｄｅｉ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ、Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｅｒｅｓ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｇｒａｍｉｎｅａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ；トウモロコシの病害：Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ、Ｇｌｏｅｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｏｒｇｈｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｐｏｌｙｓｏｒａ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚｅａｅ－ｍａｙｄｉｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ；
柑橘類の病害：Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｃｉｔｒｉ、Ｅｌｓｉｎｏｅ ｆａｗｃｅｔｔｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ、Ｐ．ｉｔａｌｉｃｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｔｈｏｒａ；リンゴの病害：Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｍａｌｉ、Ｖａｌｓａ ｃｅｒａｔｏｓｐｅｒｍａ、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ ａｐｐｌｅ ｐａｔｈｏｔｙｐｅ、Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ａｃｕｔａｔｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ；
セイヨウナシの病害：Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｎａｓｈｉｃｏｌａ、Ｖ．ｐｉｒｉｎａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐｅａｒ ｐａｔｈｏｔｙｐｅ、Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｈａｒａｅａｎｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ；
モモの病害：Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｓｐ．；
ブドウの病害：Ｅｌｓｉｎｏｅ ａｍｐｅｌｉｎａ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ、Ｕｎｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ａｍｐｅｌｏｐｓｉｄｉｓ、Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ ｂｉｄｗｅｌｌｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ；
カキの病害：Ｇｌｏｅｓｐｏｒｉｕｍ ｋａｋｉ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋａｋｉ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌａ ｎａｗａｅ；
ウリの病害：Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｌｉｇｉｎｅａ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍｅｌｏｎｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐ．、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐ．；
トマトの病害：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．Ｔｏｍａｔｏ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ；Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ナスの病害：Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｖｅｘａｎｓ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ；
アブラナ科野菜の病害：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；
ネギの病害：Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｌｌｉｉ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ；
ダイズの病害：Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋｉｋｕｃｈｉｉ、Ｅｌｓｉｎｏｅ ｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ ｖａｒ．ｓｏｊａｅ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｏｊｉｎａ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｉｉｃｏｌａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ；
インゲンマメの病害：Ｃｏｌｌｅｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｄｅｍｔｈｉａｎｕｍ；
ピーナッツの病害：Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｐｅｒｓｏｎａｔａ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ａｒａｃｈｉｄｉｃｏｌａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ；
エンドウマメの病害エンドウマメ：Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｐｉｓｉ；
ジャガイモの病害：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｅｒｙｔｈｒｏｓｅｐｔｉｃａ、Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ、ｆ．ｓｐ．Ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ；
イチゴの病害：Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｈｕｍｕｌｉ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ；
チャノキの病害：Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ、Ｅｌｓｉｎｏｅ ｌｅｕｃｏｓｐｉｌａ、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｈｅａｅ－ｓｉｎｅｎｓｉｓ；
タバコの病害：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｏｎｇｉｐｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔａｂａｃｕｍ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｔａｂａｃｉｎａ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ；
ナタネの病害：Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ；
ワタの病害：Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ；
ビートの病害：Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｂｅｔｉｃｏｌａ、Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ、Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ、Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ；
バラの病害：Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ ｒｏｓａｅ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｐａｎｎｏｓａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐａｒｓａ；
キク及びキク科植物の病害：Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ－ｉｎｄｉｃｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｏｒｉａｎａ；
様々な植物の病害：Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｂａｒｉａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ；
ダイコンの病害：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ；
シバの病害：Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｅｏｃａｒｐａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ；
バナナの病害：Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍｕｓｉｃｏｌａ；
ヒマワリの病害：Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｈａｌｓｔｅｄｉｉ；
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．、Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．、Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｍａ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐｐ．、Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｓｐｐ．などによって引き起こされる様々な植物の種子の病害または生育初期段階における病害；
Ｐｏｌｙｍｉｘａ ｓｐｐ．、Ｏｌｐｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．などによって媒介される様々な植物のウイルス性病害。
３．除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子の例：
生長点または分裂組織を阻害する除草剤に対する抵抗性、例えば、それぞれ、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．７：１２４１（１９８８）、及びＭｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４４９（１９９０）によるイミダゾリノンまたはスルホニル尿素など。
グリホサート抵抗性（例えば、変異５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子、ａｒｏＡ遺伝子及びグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子によってそれぞれ付与される抵抗性）、またはグルホシネートなどによる他のホスホノ化合物に対する抵抗性（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種由来のホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）、ならびにＡＣＣａｓｅ阻害剤コード遺伝子によるピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキソンに対する抵抗性。例えば、米国特許第４，９４０，８３５号及び米国特許第６，２４８，８７６号、米国特許第４，７６９，０６１号、欧州特許第０３３３０３３号及び米国特許第４，９７５，３７４号を参照されたい。また、欧州特許第０２４２２４６号、ＤｅＧｒｅｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６１（１９８９）、Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：４３５（１９９２）、ＷＯ２００５０１２５１５（Ｃａｓｔｌｅ ｅｔ．ａｌ．）及びＷＯ２００５１０７４３７も参照されたい。
Ｐｒｚｉｂｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１６９（１９９１）、米国特許第４，８１０，６４８号、及びＨａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：１７３（１９９２）における、トリアジン（ｐｓｂＡ及びｇｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）、及びグルタチオンＳ－トランスフェラーゼなどの光合成を阻害する除草剤に対する抵抗性。
除草剤を解毒する酵素または阻害抵抗性の変異グルタミン合成酵素をコードする遺伝子、例えば、米国特許出願公開第１１／７６０，６０２号。あるいは、解毒酵素は、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする酵素である（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種由来のｂａｒまたはｐａｔタンパク質など）。ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼは、例えば、米国特許第５，５６１，２３６号；同第５，６４８，４７７号；同第５，６４６，０２４号；同第５，２７３，８９４号；同第５，６３７，４８９号；同第５，２７６，２６８号；同第５，７３９，０８２号；同第５，９０８，８１０号及び同第７，１１２，６６５号に記載されている。
ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、すなわち、天然のＨＰＰＤ抵抗性酵素、またはＷＯ９６／３８５６７、ＷＯ９９／２４５８５、及びＷＯ９９／２４５８６、ＷＯ２００９／１４４０７９、ＷＯ２００２／０４６３８７、もしくは米国特許第６，７６８，０４４号に記載されている変異もしくはキメラＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子。
４．非生物的ストレス抵抗性に関与する遺伝子の例：
ＷＯ００／０４１７３またはＷＯ／２００６／０４５６３３に記載されている、植物細胞または植物のポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）遺伝子の発現及び／または活性を低下させることができる導入遺伝子。
例えば、ＷＯ２００４／０９０１４０に記載されている、植物または植物細胞のＰＡＲＧコード遺伝子の発現及び／または活性を低下させることができる導入遺伝子。
例えば、ＥＰ０４０７７６２４．７、ＷＯ２００６／１３３８２７、ＰＣＴ／ＥＰ０７／００２，４３３、ＥＰ１９９９２６３、またはＷＯ２００７／１０７３２６に記載されている、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンテターゼまたはニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼを含む、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドサルベージ合成経路の植物機能性酵素をコードする導入遺伝子。
炭水化物生合成に関与する酵素には、例えば、ＥＰ０５７１４２７、ＷＯ９５／０４８２６、ＥＰ０７１９３３８、ＷＯ９６／１５２４８、ＷＯ９６／１９５８１、ＷＯ９６／２７６７４、ＷＯ９７／１１１８８、ＷＯ９７／２６３６２、ＷＯ９７／３２９８５、ＷＯ９７／４２３２８、ＷＯ９７／４４４７２、ＷＯ９７／４５５４５、ＷＯ９８／２７２１２、ＷＯ９８／４０５０３、ＷＯ９９／５８６８８、ＷＯ９９／５８６９０、ＷＯ９９／５８６５４、ＷＯ００／０８１８４、ＷＯ００／０８１８５、ＷＯ００／０８１７５、ＷＯ００／２８０５２、ＷＯ００／７７２２９、ＷＯ０１／１２７８２、ＷＯ０１／１２８２６、ＷＯ０２／１０１０５９、ＷＯ０３／０７１８６０、ＷＯ２００４／０５６９９９、ＷＯ２００５／０３０９４２、ＷＯ２００５／０３０９４１、ＷＯ２００５／０９５６３２、ＷＯ２００５／０９５６１７、ＷＯ２００５／０９５６１９、ＷＯ２００５／０９５６１８、ＷＯ２００５／１２３９２７、ＷＯ２００６／０１８３１９、ＷＯ２００６／１０３１０７、ＷＯ２００６／１０８７０２、ＷＯ２００７／００９８２３、ＷＯ００／２２１４０、ＷＯ２００６／０６３８６２、ＷＯ２００６／０７２６０３、ＷＯ０２／０３４９２３、ＥＰ０６０９０１３４．５、ＥＰ０６０９０２２８．５、ＥＰ０６０９０２２７．７、ＥＰ０７０９０００７．１、ＥＰ０７０９０００９．７、ＷＯ０１／１４５６９、ＷＯ０２／７９４１０、ＷＯ０３／３３５４０、ＷＯ２００４／０７８９８３、ＷＯ０１／１９９７５、ＷＯ９５／２６４０７、ＷＯ９６／３４９６８、ＷＯ９８／２０１４５、ＷＯ９９／１２９５０、ＷＯ９９／６６０５０、ＷＯ９９／５３０７２、米国特許第６，７３４，３４１号、ＷＯ００／１１１９２、ＷＯ９８／２２６０４、ＷＯ９８／３２３２６、ＷＯ０１／９８５０９、ＷＯ０１／９８５０９、ＷＯ２００５／００２３５９、米国特許第５，８２４，７９０号、米国特許第６，０１３，８６１号、ＷＯ９４／０４６９３、ＷＯ９４／０９１４４、ＷＯ９４／１１５２０、ＷＯ９５／３５０２６もしくはＷＯ９７／２０９３６に記載されるものまたはＥＰ０６６３９５６、ＷＯ９６／０１９０４、ＷＯ９６／２１０２３、ＷＯ９８／３９４６０、及びＷＯ９９／２４５９３に記載される、ポリフルクトース、特に、イヌリン型及びレバン型のポリフルクトースの産生、ＷＯ９５／３１５５３、ＵＳ２００２０３１８２６、米国特許第６，２８４，４７９号、米国特許第５，７１２，１０７号、ＷＯ９７／４７８０６、ＷＯ９７／４７８０７、ＷＯ９７／４７８０８及びＷＯ００／１４２４９に開示されるアルファ－１，４－グルカンの産生、ＷＯ００／７３４２２に記載されるアルファ－１，６分岐状アルファ－１，４－グルカンの産生、例えば、ＷＯ００／４７７２７、ＷＯ００／７３４２２、ＥＰ０６０７７３０１．７、米国特許第５，９０８，９７５号及びＥＰ０７２８２１３に開示されるアルテルナンの産生、例えば、ＷＯ２００６／０３２５３８、ＷＯ２００７／０３９３１４、ＷＯ２００７／０３９３１５、ＷＯ２００７／０３９３１６、ＪＰ２００６３０４７７９、及びＷＯ２００５／０１２５２９に開示されるヒアルロナンの産生に関与する酵素が挙げられる。
乾燥抵抗性を改善する遺伝子。例えば、ＷＯ２０１３１２２４７２は、機能性ユビキチンタンパク質リガーゼタンパク質（ＵＰＬ）タンパク質、より詳細には、ＵＰＬ３が存在しないことまたはそのレベルの低下が、当該植物の水欲求の減少または乾燥抵抗性の改善につながることを開示している。乾燥抵抗性が向上したトランスジェニック植物の他の例は、例えば、ＵＳ２００９／０１４４８５０、ＵＳ２００７／０２６６４５３、及びＷＯ２００２／０８３９１１に開示されている。ＵＳ２００９／０１４４８５０は、ＤＲ０２核酸の発現の変化に起因して乾燥抵抗性表現型を呈する植物について記載している。ＵＳ２００７／０２６６４５３は、ＤＲ０３核酸の発現の変化により、乾燥抵抗性表現型を呈する植物を記載しており、ＷＯ２００２／０８３９１１は、孔辺細胞に発現するＡＢＣ輸送体の活性低下に起因して乾燥ストレスに対する抵抗性が増加した植物について記載している。別の例は、Ｋａｓｕｇａ及び共著者ら（１９９９）による研究であり、トランスジェニック植物でＤＲＥＢ１ＡをコードするｃＤＮＡを過剰発現させると、通常な生育条件下で多くのストレス抵抗性遺伝子の発現が活性化され、乾燥、塩負荷、及び凍結に対する抵抗性が改善したことを記載している。しかしながら、ＤＲＥＢ１Ａの発現はまた、通常の生育条件下で重大な生育遅延をもたらした（Ｋａｓｕｇａ（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７（３）２８７－２９１）。
更なる具体的な実施形態において、特定の植物形質に影響を与えることによって作物植物を改良することができる。例えば、農薬抵抗性植物の開発、植物の病害抵抗性の改善、植物昆虫及び線虫抵抗性の改善、寄生雑草に対する植物抵抗性の改善、植物の乾燥抵抗性の改善、植物の栄養価の改善、植物のストレス抵抗性の改善、自家受粉の回避、植物飼料消化性バイオマス、穀物収量などによる。いくつかの具体的な非限定例は、以下に提供される。
単一遺伝子の標的化された変異に加えて、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、植物における複数の遺伝子の標的化された変異、染色体断片の欠失、導入遺伝子の部位特異的組み込み、インビボでの部位特異的変異導入、及び正確な遺伝子置換またはアレルスワッピングが可能となるように設計することができる。したがって、本明細書に記載される方法は、遺伝子の発見及び検証、変異及びシスジェニック育種、及びハイブリッド育種において、幅広い用途を有する。これらの用途により、除草剤抵抗性、病害抵抗性、非生物的ストレス抵抗性、高収量、及び優れた品質などの様々な改善された農業形質を有する、新世代の遺伝子改変作物の生産が促進される。
雄性不稔植物を作出するためのＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用
雑種植物は、典型的に、純系植物と比較して有利な農業形質を有する。しかしながら、自家受粉植物の場合、雑種植物の生成は困難であり得る。様々な植物タイプで、植物の稔性、より詳細には、雄性稔性に重要である遺伝子が同定されている。例えば、トウモロコシでは、稔性に重要な少なくとも２つの遺伝子が同定されている（Ａｍｉｔａｂｈ Ｍｏｈａｎｔｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｎｅｗ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｏｃｔ ９－１０，２０１４，Ｊａｉｐｕｒ，Ｉｎｄｉａ、Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１５ Ｏｃｔ；１６９（２）：９３１－４５、Ｄｊｕｋａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．２０１３ Ｄｅｃ；７６（５）：８８８－９９）。本明細書で提供される方法及び系は、雄性稔性に必要な遺伝子を標的とし、それにより、容易に交雑して雑種を生成し得る雄性不稔植物を生成するために使用することができる。具体的な実施形態において、シトクロムＰ４５０様遺伝子（ＭＳ２６）またはメガヌクレアーゼ遺伝子（ＭＳ４５）の標的化された変異導入のために本明細書で提供されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用し、それにより、トウモロコシ植物に雄性不稔性を付与する。そのように遺伝子改変されたトウモロコシ植物は、雑種育種計画に使用することができる。
植物の稔性期の増加
具体的な実施形態において、本明細書で提供される方法及び系は、イネ植物などの植物の稔性期を延長させるために使用される。例えば、Ｅｈｄ３などのイネ稔性期遺伝子を標的として遺伝子に変異をもたらすことができ、再生植物の延長された稔性期から苗を選択することができる（ＣＮ１０４００４７８２に記載されるとおり）。
目的作物に遺伝的変異をもたらすためのＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用
作物植物における野生の生殖質及び遺伝子変異の利用可能性は、作物改良計画の鍵であるが、利用可能な作物植物の生殖質の多様性は限られている。本発明は、目的の生殖質に遺伝的変異多様性をもたらす方法を想定する。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系のこの用途において、植物ゲノムの異なる位置を標的とするガイドＲＮＡのライブラリーが提供され、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びアデノシンデアミナーゼとともに植物細胞に導入される。このように、ゲノム規模の点変異及び遺伝子ノックアウトのコレクションを生成することができる。具体的な実施形態において、方法は、そのようにして得られた細胞から植物部分または植物を生成することと、目的形質について細胞をスクリーニングすることとを含む。標的遺伝子は、コード領域と非コード領域の両方を含み得る。具体的な実施形態において、形質はストレス抵抗性であり、方法はストレス抵抗性作物品種の生成方法である。
果実熟成に影響を与えるためのＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲの使用
熟成は、果実及び野菜の成熟過程における通常の段階である。熟成が始まると、果実及び野菜は、わずか数日で食用に適さなくなる。この過程は、農業従事者と消費者の双方に著しい損失をもたらす。具体的な実施形態において、本発明の方法は、エチレン産生を低下させるために使用される。これは、次のうちの１つまたは複数を確実にすることによって確保される：ａ．ＡＣＣシンターゼ遺伝子発現の抑制。ＡＣＣ（１－アミノシクロプロパン－１－カルボン酸）シンターゼは、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からＡＣＣへの変換に関与する酵素であり、エチレン生合成の最後から２番目の段階である。酵素発現は、シンターゼ遺伝子のアンチセンス（「鏡像」）または切断型コピーを植物のゲノムに挿入すると阻害される；ｂ．ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の挿入。この酵素をコードする遺伝子は、一般的な非病原性土壌細菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓから得られる。この酵素は、ＡＣＣを別の化合物に変換することから、エチレン産生に利用可能なＡＣＣ量を低下させる；ｃ．ＳＡＭ加水分解酵素遺伝子の挿入。この方法は、ＡＣＣデアミナーゼと同様のものであり、エチレン産生は、その代謝産物前駆体の量が低下すると阻害される；この場合、ＳＡＭは、ホモセリンに変換される。この酵素をコードする遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔ３バクテリオファージから得られる。ｄ．ＡＣＣオキシダーゼ遺伝子発現の抑制。ＡＣＣオキシダーゼは、エチレン生合成経路の最終段階である、ＡＣＣのエチレンへの酸化を触媒する酵素である。本明細書に記載される方法を使用して、ＡＣＣオキシダーゼ遺伝子を下方制御すると、エチレン産生が抑制され、それにより、果実熟成が遅延する。具体的な実施形態において、上記の改変に加えて、またはそれに代えて、本明細書に記載される方法は、果実が受け取るエチレンシグナルを妨害するために、エチレン受容体を改変するために使用される。具体的な実施形態において、エチレン結合タンパク質をコードするＥＴＲ１遺伝子の発現が改変され、より詳細には、抑制される。具体的な実施形態において、上記の改変に加えて、またはそれに代えて、本明細書に記載される方法は、植物細胞壁の完全性を維持する物質であるペクチンの分解に関与する酵素のポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）をコードする遺伝子の発現を改変するために使用される。ペクチンの分解は、熟成過程の開始時に起こり、果実の軟化をもたらす。したがって、具体的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＰＧ遺伝子に変異を導入することにより、またはＰＧ遺伝子の活性を抑制することにより、ＰＧ酵素の産生量を減らして、ペクチン分解を遅らせるために使用される。
したがって、具体的な実施形態において、方法は、上記のものなどの植物細胞のゲノムの１つまたは複数の改変を確実にするためのＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用、及びそれから植物を再生することを含む。具体的な実施形態において、植物は、トマト植物である。
植物の貯蔵寿命の増加
具体的な実施形態において、本発明の方法は、植物または植物部分の貯蔵寿命に影響を与える化合物の産生に関与する遺伝子を改変するために使用される。より具体的には、改変は、ジャガイモ塊茎における還元糖の蓄積を防ぐ遺伝子中にある。高温処理を行うと、これらの還元糖は、遊離アミノ酸と反応し、褐色で苦みのある生成物となり、潜在的な発がん性物質であるアクリルアミドの量が上昇する。具体的な実施形態において、本明細書で提供される方法は、スクロースをグルコース及びフルクトースに分解するタンパク質をコードする液胞インベルターゼ遺伝子（ＶＩｎｖ）の発現を低下または阻害するために使用される（Ｃｌａｓｅｎ ｅｔ ａｌ．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２３７０）。
付加価値のある形質を確実にするためのＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用
具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、栄養的に改良された農作物を作製するために使用される。具体的な実施形態において、本明細書で提供される方法は、「機能性食品」、すなわち、食品が含有する従来の栄養素を超えた健康上の利益をもたらし得る改変された食品もしくは食品成分、及び／または「栄養補助食品」、すなわち、食品もしくは食品の一部とみなされ得、疾患の予防及び治療を含む健康上の利益を提供する物質を生成するように適合される。具体的な実施形態において、栄養補助食品は、がん、糖尿病、心臓血管疾患、及び高血圧のうちの１つまたは複数の予防及び／または治療に有用である。
栄養が改良された作物の例には、以下が挙げられる（Ｎｅｗｅｌｌ－ＭｃＧｌｏｕｇｈｌｉｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌｙ ２００８，Ｖｏｌ．１４７，ｐｐ．９３９－９５３）：
改変されたタンパク質の品質、含有量及び／またはアミノ酸組成、例えば、バヒアグラス（Ｌｕｃｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００５，Ｆｌｏｒｉｄａ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｏｓｔｅｒ）、キャノーラ（Ｒｏｅｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１３ ７５－８１）、トウモロコシ（Ｃｒｏｍｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ，１９６７，１９６９ Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ ２６ １３２５－１３３１、Ｏ’Ｑｕｉｎ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ ７８ ２１４４－２１４９、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ １１ １１－２０、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｐｌａｎｔ Ｊ ３８ ９１０－９２２）、ジャガイモ（Ｙｕ Ｊ ａｎｄ Ａｏ，１９９７ Ａｃｔａ Ｂｏｔ Ｓｉｎ ３９ ３２９－３３４、Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７ ３７２４－３７２９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２００１）Ｃｈｉｎ Ｓｃｉ Ｂｕｌｌ ４６ ４８２－４８４、コメ（Ｋａｔｓｕｂｅ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２０ １０６３－１０７４）、ダイズ（Ｄｉｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｒａｐｐ ２００２，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｐｌａｎｔ ３７ ７４２－７４７）、サツマイモ（Ｅｇｎｉｎ ａｎｄ Ｐｒａｋａｓｈ １９９７，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３３ ５２Ａ）について記載されているもの。
必須アミノ酸の含有量、例えば、キャノーラ（Ｆａｌｃｏ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３ ５７７－５８２）、ハウチワマメ（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｊ Ｓｃｉ Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ ８１ １４７－１５４）、トウモロコシ（Ｌａｉ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，２００２，Ａｇｂｉｏｓ ２００８ ＧＭ ｃｒｏｐ ｄａｔａｂａｓｅ（Ｍａｒｃｈ １１，２００８））、ジャガイモ（Ｚｅｈ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２７ ７９２－８０２）、モロコシ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｐｐ ４１３－４１６）、ダイズ（Ｆａｌｃｏ ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３ ５７７－５８２、Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ２１ １６７－２０４）について記載されているもの。
油及び脂肪酸、例えば、キャノーラ（Ｄｅｈｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｊ ９ １６７－１７２ ［ＰｕｂＭｅｄ］、Ｄｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏ（１９９６）ＩＮＦＯＲＭ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗｓ ｏｎ Ｆａｔｓ，Ｏｉｌｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ７ ２３０－２４３、Ｒｏｅｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１３ ７５－８１［ＰＭＣ無料公開論文］ ［ＰｕｂＭｅｄ］、Ｆｒｏｍａｎ ａｎｄ Ｕｒｓｉｎ（２００２，２００３）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｐａｐｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２２３ Ｕ３５、Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ７７ １１４０－１１４５［ＰｕｂＭｅｄ］、Ａｇｂｉｏｓ（２００８、上掲）、ワタ（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｊ Ａｍ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ７８ ９４１－９４７、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｎｕｔｒ ２１ ２０５Ｓ－２１１Ｓ ［ＰｕｂＭｅｄ］、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（２００７）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈｎｅｗｓ．ｃｏｍ．ａｕ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｉｄ；８６６６９４８１７；ｆｐ；４；ｆｐｉｄ；２（Ｊｕｎｅ １７，２００８）、亜麻仁（Ａｂｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６：２７３４－２７４８）、トウモロコシ（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｌａｎｔ Ｊ ３８ ９１０－９２２）、アブラヤシ（Ｊａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｊ Ａｍ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ７４ １４５１－１４５５、Ｐａｒｖｅｅｚ，２００３，ＡｇＢｉｏｔｅｃｈＮｅｔ １１３ １－８）、コメ（Ａｎａｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２１ ９８８－９９２）、ダイズ（Ｒｅｄｄｙ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，１９９６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４ ６３９－６４２、Ｋｉｎｎｅｙ ａｎｄ Ｋｗｏｌｔｏｎ，１９９８，Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ １９３－２１３）、ヒマワリ（Ａｒｃａｄｉａ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００８）について記載されているもの
炭水化物、例えば、チコリ（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ２ ２８６－２８７、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４００ ３５５－３５８、Ｓｅｖｅｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６ ８４３－８４６）、トウモロコシ（Ｃａｉｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１０ ３５５－３６３）、ジャガイモ（Ｈｅｌｌｗｅｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｐｌａｎｔ Ｊ １２ １０５７－１０６５）、テンサイ（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．１９９７、上掲）について記載されているフルクタン、例えば、ジャガイモ（Ｈｅｌｌｅｗｅｇｅ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７ ８６９９－８７０４）について記載されているイヌリン、例えば、コメ（Ｓｃｈｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８ ５５１－５５４、Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ Ｂｒｅｅｄ １５ １２５－１４３）について記載されているデンプン、
ビタミン及びカロチノイド、例えば、キャノーラ（Ｓｈｉｎｔａｎｉ ａｎｄ ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２ ２０９８－２１００）、トウモロコシ（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｎｕｔｒ ２１ １９１Ｓ－１９８Ｓ、Ｃａｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１ １０８２－１０８７、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００ ３５２５－３５３０）、マスタードシード（Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｊ ２０ ４０１－４１２、ジャガイモ（Ｄｕｃｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ５６ ８１－８９）、コメ（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７ ３０３－３０５、イチゴ（Ａｇｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１ １７７－１８１）、トマト（Ｒｏｓａｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ ２４ ４１３－４１９、Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｓｃｉ Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ ８１ ８２２－８２７、Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０ ６１３－６１８、Ｄｉａｚ ｄｅ ｌａ Ｇａｒｚａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１ １３７２０－１３７２５、Ｅｎｆｉｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ３ １７－２７，ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ（２００７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４ ３６７５－３６７６について記載されているもの。
機能性二次代謝産物、例えば、リンゴ（スチルベン、Ｓｚａｎｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２２：１４１－１４９）、アルファルファ（レスベラトロール、Ｈｉｐｓｋｉｎｄ ａｎｄ Ｐａｉｖａ（２０００）Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ １３ ５５１－５６２）、キウイ（レスベラトロール、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １９ ９０４－９１０）、トウモロコシ及びダイズ（フラボノイド、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２４ ７８１－７９４）、ジャガイモ（アントシアニン及びアルカロイド配糖体、Ｌｕｋａｓｚｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ５２ １５２６－１５３３）、コメ（フラボノイド＆レスベラトロール、Ｓｔａｒｋ－Ｌｏｒｅｎｚｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １６ ６６８－６７３、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ４ ３０３－３１５）、トマト（＋レスベラトロール、クロロゲン酸、フラボノイド、スチルベン、Ｒｏｓａｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）上掲、Ｍｕｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ １９ ４７０－４７４、Ｎｉｇｇｅｗｅｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２ ７４６－７５４、Ｇｉｏｖｉｎａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ３ ５７－６９）、コムギ（コーヒー酸及びフェルラ酸、レスベラトロール；Ｕｎｉｔｅｄ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００２））について記載されているもの、ならびに
ミネラル利用性、例えば、アルファルファ（フィターゼ、Ａｕｓｔｉｎ－Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆａｒｍｉｎｇ．ｃｏｍ／ｎｏｎｍｅｄｉｃａｌ．ｈｔｍｌ）、レタス（鉄、Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ １００ ６５８－６６４）、コメ（鉄、Ｌｕｃｃａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｎｕｔｒ ２１ １８４Ｓ－１９０Ｓ）、トウモロコシ、ダイズ及びコムギ（フィターゼ、Ｄｒａｋａｋａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５９ ８６９－８８０、Ｄｅｎｂｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｏｕｌｔ Ｓｃｉ ７７ ８７８－８８１、Ｂｒｉｎｃｈ－Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ Ｂｒｅｅｄ ６ １９５－２０６）について記載されているもの。
具体的な実施形態において、付加価値のある形質は、植物中に存在する化合物の健康上の予想利益に関する。例えば、具体的な実施形態において、付加価値のある作物は、本発明の方法を使用して、以下の化合物のうちの１つまたは複数の合成の改変または誘導／増加を確実にすることによって得られる。
カロチノイド、例えば、細胞に損傷を引き起こし得るフリーラジカルを中和する、ニンジンに存在するα－カロチン、またはフリーラジカルを中和する、様々な果実及び野菜に存在するβ－カロチン
健全な視力の維持に貢献する、緑色野菜に存在するルテイン
前立腺癌のリスクを低下させると考えられている、トマト及びトマト製品に存在するリコピン
健全な視力の維持に貢献する、柑橘類及びトウモロコシに存在するゼアキサンチン
食物繊維、例えば、乳癌及び／または結腸癌のリスクを低下させ得る、フスマに存在する不溶性繊維、ならびにオートムギに存在するβ－グルカン、心臓血管疾患（ＣＶＤ）のリスクを低下させ得る、サイリウム及び全粒穀物に存在する可溶性繊維
脂肪酸、例えば、ＣＶＤのリスクを低下させ、精神機能及び視覚機能を改善し得る、ω－３脂肪酸、身体組成を改善し得、ある種のがんのリスクを低下させ得る、共役リノール酸、ならびにがん及びＣＶＤの炎症リスクを低下させ得、身体組成を改善し得る、ＧＬＡ
フラボノイド、例えば、抗酸化様活性を有し、変性疾患のリスクを低下させ得る、コムギに存在するヒドロキシケイ皮酸、フリーラジカルを中和し、がんのリスクを低下させ得る、果実及び野菜に存在するフラボノール、カテキン及びタンニン
グルコシノレート、インドール、イソチオシアナート、例えば、フリーラジカルを中和し、がんのリスクを低下し得る、アブラナ科の野菜（ブロッコリー、ケール）、ホースラディッシュに存在するスルフォラファン
フェノール、例えば、変性疾患、心疾患、及びがんのリスクを低下させ得、長寿効果を有し得る、ブドウに存在するスチルベン、ならびに抗酸化様活性を有し、変性疾患、心疾患、及び眼疾患のリスクを低下し得る、野菜及び柑橘類に存在するコーヒー酸及びフェルラ酸、ならびに抗酸化様活性を有し、変性疾患及び心疾患のリスクを低下し得る、カカオに存在するエピカテキン
血中コレステロール値を下げることによって冠状動脈性心疾患のリスクを低下させ得る、トウモロコシ、ダイズ、コムギ及び木由来の油に存在する植物スタノール／ステロール
胃腸の健康を改善し得る、キクイモ、エシャロット、オニオンパウダーに存在するフルクタン、イヌリン、フラクトオリゴ糖
ＬＤＬコレステロールを低下させ得る、ダイズに存在するサポニン
心疾患のリスクを低下させ得る、ダイズに存在するダイズタンパク質
フィトエストロゲン、例えば、ホットフラッシュなどの更年期症状を低減し得、骨粗鬆症及びＣＶＤを低減し得る、ダイズに存在するイソフラボン、ならびに心疾患及びいくつかのがんから保護し得、ＬＤＬコレステロール、総コレステロールを低下させ得る、亜麻、ライムギ及び野菜に存在するリグナン
硫化物及びチオール、例えば、タマネギ、ニンニク、オリーブ、リーキ及びワケギに存在するジアリルスルフィド、ならびにＬＤＬコレステロールを低下させ得、健全な免疫系を維持するのに役立つ、アブラナ科の野菜に存在するアリルメチルトリスルフィド、ジチオールチオン
タンニン、例えば、尿路の健康を改善し得、ＣＶＤ及び高血圧のリスクを低下させ得る、クランベリー、カカオに存在するプロアントシアニジン
加えて、本発明の方法はまた、タンパク質／デンプン機能、貯蔵寿命、味／美しさ、繊維品質、ならびにアレルゲン、栄養分吸収抑制、及び毒素低減の形質を改変することも想定される。
したがって、本発明は、栄養上の付加価値を有する植物を作製するための方法を包含し、当該方法は、本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、付加される栄養価の構成成分の産生に関与する酵素をコードする遺伝子を植物細胞に導入することと、当該植物細胞から植物を再生させることとを含み、当該植物は、付加される栄養価の当該構成成分の発現上昇を特徴とする。具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、これらの化合物の内因性合成を、例えば、当化合物の代謝を制御する１つまたは複数の転写因子を改変することによって、間接的に改変するために使用される。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用して目的遺伝子を植物細胞に導入する方法及び／または内因性遺伝子を改変する方法が本明細書に記載される。
付加価値のある形質を付与するように改変された植物の改変のいくつかの具体例は、例えば、ステアリル－ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子で植物を形質転換して植物のステアリン酸含有量を増加させることによる、脂肪酸代謝が改変された植物である。Ｋｎｕｌｔｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：２６２４（１９９２）を参照されたい。別の例は、フィチン酸含有量を減少させることを伴い、例えば、フィチン酸量が低いことを特徴とするトウモロコシ変異に関与し得る単一アレルに関連するＤＮＡをクローニングし、次いで、再導入することによるものである。Ｒａｂｏｙ ｅｔ ａｌ，Ｍａｙｄｉｃａ ３５：３８３（１９９０）を参照されたい。
同様に、強力なプロモーターの制御下でトウモロコシアリューロン層におけるフラボノイドの産生を制御するトウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）Ｔｆｓ Ｃ１及びＲの発現は、おそらく経路全体の活性化によって、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のアントシアニンの蓄積率を高くした（Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １２：６５－８０）。ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ（Ｗｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ５７：７１１－７３８）は、Ｔｆ ＲＡＰ２．２及びその相互作用パートナーＳＩＮＡＴ２が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉のカロチン生成を増加させることを見出した。Ｔｆ Ｄｏｆ１の発現は、トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける炭素骨格生成のための酵素をコードする遺伝子の上方制御、アミノ酸含有量の大幅な増加、及びＧｌｃレベルの減少を誘導し（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，２００４ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４５：３８６－３９１）、ＤＯＦ ＴｆＡｔＤｏｆ１．１（ＯＢＰ２）は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるグルコシノレート生合成経路の全ての段階を上方制御した（Ｓｋｉｒｙｃｚ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｐｌａｎｔ Ｊ ４７：１０－２４）。
植物のアレルゲンの減少
具体的な実施形態において、本明細書で提供される方法は、アレルゲンレベルが低下した植物を生成するために使用され、これにより、植物は、消費者にとってより安全なものとなる。具体的な実施形態において、方法は、植物アレルゲンの産生に関与する１つまたは複数の遺伝子の発現を改変することを含む。例えば、具体的な実施形態において、方法は、ライグラス植物細胞などの植物細胞のＬｏｌ ｐ５遺伝子の発現を下方制御することと、当該細胞から植物を再生させて、当該植物の花粉のアレルゲン性を低下させることとを含む（Ｂｈａｌｌａ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９６：１１６７６－１１６８０）。
ピーナッツアレルギー及び豆類アレルギーは、概して、現実的かつ重大な健康問題である。本発明のＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、そのような豆類のアレルゲン性タンパク質をコードする遺伝子を同定し、次いで、変異させるために使用することができる。限定するものではないが、そのような遺伝子及びタンパク質に関して、Ｎｉｃｏｌａｏｕらは、ピーナッツ、ダイズ、レンズマメ、エンドウマメ、ハウチワマメ、サヤインゲン、及びリョクトウのアレルゲン性タンパク質を同定している。Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１１（３）：２２２）を参照されたい。
目的内因性遺伝子のスクリーニング方法
本明細書で提供される方法は、付加される栄養価の構成成分の産生に関与する酵素をコードする価値のある遺伝子または種、門、及び植物界にわたって目的の農業形質に影響を与える一般的な遺伝子の同定を更に可能にする。本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、例えば、植物の代謝経路の酵素をコードする遺伝子を選択的に標的化することによって、植物のある特定の栄養的側面に関与する遺伝子を特定することができる。同様に、所望の農業形質に影響し得る遺伝子を選択的に標的化することによって、関連する遺伝子を特定することができる。したがって、本発明は、特定の栄養価及び／または農業形質を有する化合物の産生に関与する酵素をコードする遺伝子のスクリーニング方法を包含する。
植物及び酵母におけるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の更なる用途
バイオ燃料生産におけるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用
本明細書で使用される「バイオ燃料」という用語は、植物資源及び植物由来資源から作られる代替燃料である。再生可能なバイオ燃料は、炭素固定プロセスを介してエネルギーを得られる有機物質から抽出することができ、またはバイオマスの使用もしくは変換を介して作られる。このバイオマスは、バイオ燃料に直接使用することができ、または熱的変換、化学的変換、及び生化学的変換によって簡便なエネルギー含有物質に変換することもできる。このバイオマス変換により、固体、液体、または気体の形態の燃料を得ることができる。バイオ燃料には、バイオエタノールとバイオディーゼルの２つの種類がある。バイオエタノールは、大部分がトウモロコシ及びサトウキビに由来するセルロース（デンプン）の糖発酵プロセスによって主に生産される。一方、バイオディーゼルは、ナタネ、ヤシ、及びダイズなどの油料作物から主に生産される。バイオ燃料は、主に輸送に使用される。
バイオ燃料生産のための植物特性の向上
具体的な実施形態において、本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用する方法は、発酵のための糖をより効率的に放出させる主要な加水分解物質によるアクセスを促進するように、細胞壁の特性を改変するために使用される。具体的な実施形態において、セルロース及び／またはリグニンの生合成が改変される。セルロースは、細胞壁の主な構成成分である。セルロース及びリグニンの生合成は、共制御される。植物におけるリグニンの比率を減らすことによって、セルロースの比率を増やすことができる。具体的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、発酵性炭水化物を増加させるために、植物のリグニン生合成を下方制御するために使用される。より具体的には、本明細書に記載される方法は、ＷＯ２００８０６４２８９Ａ２に開示されるとおり、４－クマル酸３－ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、ケイ皮酸４－ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＨＣＴ）、コーヒー酸Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、カフェオイルＣｏＡ３－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）、フェルラ酸５－ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナモイルＣｏＡ－レダクターゼ（ＣＣＲ）、４－クマル酸－ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、モノリグノール－リグニン特異的グリコシルトランスフェラーゼ、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）からなる群から選択される、少なくとも第１のリグニン生合成遺伝子を下方制御するために使用される。
具体的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、発酵中に生成される酢酸量が少ない植物マスを生産するために使用される（ＷＯ２０１００９６４８８も参照）。より具体的には、本明細書で開示される方法は、ＣａｓｌＬのホモログに変異をもたらし、多糖のアセチル化を減らすために使用される。
バイオ燃料生産のための酵母の改変
具体的な実施形態において、本明細書で提供されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、組換え微生物によるバイオエタノール生産のために使用される。例えば、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、発酵性糖からバイオ燃料またはバイオポリマーを生成し、任意選択で、発酵性糖の供給源である農業廃棄物由来の植物リグノセルロースを分解することができるように、酵母などの微生物を操作するために使用することができる。いくつかの実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、バイオ燃料生産経路と競合する内因性代謝経路を改変するために使用される。
したがって、より具体的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、次のように、微生物を改変するために使用される：当該宿主細胞の代謝経路の酵素をコードする少なくとも１つの核酸を改変し、ここで、当該経路は、ピルビン酸からアセトアルデヒド以外の代謝産物、もしくはアセトアルデヒドからエタノールを生産し、当該改変により、当該代謝産物の生産が減少するか、または当該酵素の阻害剤をコードする少なくとも１つの核酸を導入する。
植物油またはバイオ燃料の生産のための藻類及び植物の改変
トランスジェニック藻類またはセイヨウアブラナなどの他の植物は、例えば、植物油またはアルコール（特に、メタノール及びエタノール）などのバイオ燃料の生産に特に有用であり得る。これらは、油またはバイオ燃料産業における使用のために、油またはアルコールを高度に発現または過剰発現するように操作され得る。
本発明の具体的な実施形態によれば、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、バイオ燃料生産に有用な脂質に富む珪藻類を生成するために使用される。
具体的な実施形態において、藻類細胞によって生産される脂質の量及び／または脂質の品質の改変に関与する遺伝子を特異的に改変することが想定される。脂肪酸合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の例は、例えば、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸シンターゼ、３－ケトアシル＿アシルキャリアタンパク質シンターゼＩＩＩ、グリセロール－３－リン酸デスヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、エノイル－アシルキャリアタンパク質レダクターゼ（エノイル－ＡＣＰ－レダクターゼ）、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼまたはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、脂肪酸チオエステラーゼ、例えば、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、またはリンゴ酸酵素活性を有するタンパク質をコードし得る。更なる実施形態において、脂質蓄積を増加させた珪藻類を生成することが想定される。これにより、脂質異化作用を減少させる遺伝子を標的にすることによって達成することができる。トリアシルグリセロールと遊離脂肪酸の両方の活性化に関与する遺伝子、ならびにアシル－ＣｏＡシンテターゼ、３－ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼ、アシル－ＣｏＡオキシダーゼ活性及びホスホグルコムターゼなどの脂肪酸のβ－酸化に直接関与する遺伝子が本発明の方法の使用に特に有益である。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系及び本明細書に記載される方法は、珪藻類の脂質含有量が増加するように、珪藻類のかかる遺伝子を特異的に活性化させるために使用することができる。
微細藻類などの生物が合成生物学に広く使用されている。Ｓｔｏｖｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．，２０１５；２：１３は、工業生産用のロバストな菌株を効率的に生成するための、工業用酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅのゲノム編集について記載している。Ｓｔｏｖｉｃｅｋは、酵母にコドン最適化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を使用して、内因性遺伝子の両方のアレル破壊と、異種遺伝子のノックインを同時に行った。Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡは、ゲノムまたはエピソームの２μベースベクター位置から発現された。著者らはまた、Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡの発現量を最適化することによって遺伝子の破壊効率を改善できることを示した。Ｈｌａｖｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２０１５）は、ＣＲＩＳＰＲなどの技術を使用して、挿入変異導入及びスクリーニングのために核及び葉緑体の遺伝子を標的とする、微細藻類の種または株の開発について考察している。
ＵＳ８９４５８３９は、Ｃａｓ９を使用して微小藻類（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ細胞）種）を操作する方法について記載している。同様のツールを使用して、本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の方法をＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ種及び他の藻類に応用することができる。具体的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）、アデノシンデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質またはアプタマー結合アダプタータンパク質に融合され得る）、及びガイドＲＮＡは、Ｈｓｐ７０Ａ－Ｒｂｃ Ｓ２またはベータ２－チューブリンなどの構成的プロモーターの制御下でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び任意選択でアデノシンデアミナーゼを発現するベクターを使用して、発現を行う藻類に導入される。ガイドＲＮＡは、Ｔ７プロモーター含有ベクターを使用して送達される。あるいは、ｍＲＮＡ及びインビトロ転写ガイドＲＮＡを藻類細胞に送達することができる。電気穿孔プロトコルは、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇキットの標準的な推奨プロトコルに準ずる。
脂肪酸生産が可能な微生物の生成におけるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用
具体的な実施形態において、本発明の方法は、脂肪酸メチルエステル（「ＦＡＭＥ」）及び脂肪酸エチルエステル（「ＦＡＥＥ」）などの脂肪酸エステルの生産が可能な遺伝子操作された微生物の生成に使用される。
典型的に、宿主細胞は、チオエステラーゼをコードする遺伝子、アシル－ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子、及びエステルシンターゼをコードする遺伝子の発現または過剰発現によって、培地中に存在するアルコールなどの炭素源から脂肪酸エステルを生産するように操作することができる。したがって、本明細書で提供される方法は、チオエステラーゼ遺伝子、アシル－ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子、及びエステルシンターゼをコードする遺伝子を過剰発現または導入するように、微生物を改変するために使用される。具体的な実施形態において、チオエステラーゼ遺伝子は、ｔｅｓＡ、’ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｆａｔＢ、ｆａｔＢ２、ｆａｔＢ３、ｆａｔＡｌ、またはｆａｔＡから選択される。具体的な実施形態において、アシル－ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子は、ｆａｄＤＪａｄＫ、ＢＨ３１０３、ｐｆｌ－４３５４、ＥＡＶ１５０２３、ｆａｄＤｌ、ｆａｄＤ２、ＲＰＣ＿４０７４，ｆａｄＤＤ３５、ｆａｄＤＤ２２、ｆａａ３９、または同じ特性を有する酵素をコードする同定遺伝子から選択される。具体的な実施形態において、エステルシンターゼをコードする遺伝子は、Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ 属．ＡＤＰ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｆｕｎｄｉｂａｃｔｅｒ ｊａｄｅｎｓｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、もしくはＡｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓに由来するシンターゼ／アシル－ＣｏＡ：ジアシルグリセールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子またはそのバリアントである。追加的または代替的に、本明細書で提供される方法は、当該微生物において、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、外膜タンパク質受容体をコードする遺伝子、及び脂肪酸生合成の転写制御因子をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低下させるために使用される。具体的な実施形態において、これらの遺伝子のうちの１つまたは複数は、変異の導入などによって、不活性化される。具体的な実施形態において、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ｆａｄＥである。具体的な実施形態において、脂肪酸生合成の転写制御因子をコードする遺伝子は、ＤＮＡ転写リプレッサー、例えば、ｆａｂＲをコードする。
追加的または代替的に、当該微生物は、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、またはその両方のうちの少なくとも１つの発現が低下するように改変される。具体的な実施形態において、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子は、ｐｆｌＢである。具体的な実施形態において、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ＩｄｈＡである。具体的な実施形態において、これらの遺伝子のうちの１つまたは複数は、変異の導入などによって、不活性化される。
具体的な実施形態において、微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈａｍｏｎａｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの各属から選択される。
有機酸生産が可能な微生物の生成におけるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用
本明細書で提供される方法はまた、有機酸生産、より詳細には、ペントース糖またはヘキソース糖から有機酸生産が可能な微生物を操作するために使用される。具体的な実施形態において、方法は、微生物に外来性ＬＤＨ遺伝子を導入することを含む。具体的な実施形態において、当該微生物における有機酸生産は、追加的または代替的に、目的の有機酸以外の代謝産物を生産する及び／または内因性代謝経路が有機酸を消費する内因性代謝経路に関与するタンパク質をコードする内因性遺伝子を不活性化することによって、増加する。具体的な実施形態において、改変は、目的の有機酸以外の代謝産物の生産が減少することを確実にする。具体的な実施形態によれば、方法は、有機酸が消費される内因性経路、または目的の有機酸以外の代謝産物を生産する内因性経路に関与する産物をコードする遺伝子の少なくとも１つの操作された遺伝子の欠失及び／または不活性化を導入するために使用される。具体的な実施形態において、少なくとも１つの操作された遺伝子の欠失または不活性化は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、Ｄ－乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄ－ｌｄｈ）、Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌ－ｌｄｈ）、乳酸２－モノオキシゲナーゼからなる群から選択される酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子にある。
更なる実施形態において、少なくとも１つの操作された遺伝子の欠失及び／または不活性化は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）をコードする内因性遺伝子にある。
更なる実施形態において、微生物は、乳酸を生産するように操作され、少なくとも１つの操作された遺伝子の欠失及び／または不活性化は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする内因性遺伝子にある。追加的または代替的に、微生物は、シトクロムＢ２依存性Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼなどのシトクロム依存性乳酸デヒドロゲナーゼをコードする内因性遺伝子の少なくとも１つの操作された遺伝子の欠失または不活性化を含む。
酵母株を利用した改良キシロースまたはセロビオースの生成におけるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用
具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、酵母株を利用した改良キシロースまたはセロビオースの選択に適用することができる。エラープローンＰＣＲを使用して、キシロース利用経路またはセロビオース利用経路に関与する１つ（またはそれ以上）の遺伝子を増幅することができる。キシロース利用経路及びセロビオース利用経路に関与する遺伝子の例は、限定するものではないが、Ｈａ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８（２）：５０４－９及びＧａｌａｚｋａ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０（６０００）：８４－６に記載のものを挙げることができる。得られる二本鎖ＤＮＡ分子ライブラリーは、ランダム変異を当該選択遺伝子にそれぞれ含み、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素とともに酵母株（例えば、Ｓ２８８Ｃ）に同時形質転換することができ、ＷＯ２０１５１３８８５５に記載のように、キシロースまたはセロビオース利用能が増強された株を選択することができる。
イソプレノイド生合成に使用される改良酵母株の生成におけるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用
Ｔａｄａｓ Ｊａｋｏｃｉｕｎａｓらは、パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、１回の形質転換工程で最大５つの異なる遺伝子座のゲノム工学に対して、マルチプレックスＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の適用が成功したことについて記載しており（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ ２８、Ｍａｒｃｈ ２０１５、Ｐａｇｅｓ ２１３－２２２）、これにより、工業的に重要なイソプレノイド生合成経路の鍵となる中間体のメバロン酸の生産が高い株が得られる。具体的な実施形態において、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、イソプレノイド合成に使用される更なる高生産酵母株を特定するための本明細書に記載のマルチプレックスゲノム工学法に適用することができる。
改良植物及び酵母細胞
本発明はまた、本明細書で提供される方法によって得ることができる及び得られる植物及び酵母細胞を提供する。本明細書に記載される方法によって得られる改良植物は、例えば、植物の害虫、除草剤、乾燥、低温または高温、過剰な水などに対する抵抗性を確実にする遺伝子の発現を介した食糧または飼料の生産に有用であり得る。
本明細書に記載される方法によって得られる改良植物、特に、作物及び藻類は、例えば、野生型に通常認められるものよりも高いタンパク質、炭水化物、栄養素またはビタミンレベルの発現を介した食糧または飼料の生産に有用であり得る。この点に関して、改良植物は、特に、豆類及び塊茎が好ましい。
改良された藻類またはセイヨウアブラナなどの他の植物は、例えば、植物油またはアルコール（特に、メタノール及びエタノール）などのバイオ燃料の生産に特に有用であり得る。これらは、油またはバイオ燃料産業における使用のために、油またはアルコールを高度に発現または過剰発現するように操作され得る。
本発明はまた、植物の改良された部分を提供する。植物部分には、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、及び花粉が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で想定される植物部分は、生育可能、生育不可能、再生可能、及び／または再生不可能であり得る。
また、本発明の方法に従って生成された植物細胞及び植物を提供することも本明細書に包含される。従来の育種方法によって作製された、遺伝子改変を含む植物の配偶子、種子、接合胚もしくは体細胞胚のいずれかの胚、子孫または雑種も本発明の範囲内に含まれる。そのような植物は、標的配列に挿入されたまたは標的配列に代えて挿入された異種または外来ＤＮＡ配列を含有し得る。あるいは、そのような植物は、１つまたは複数のヌクレオチドに、変化（変異、欠失、挿入、置換）のみを含有する。そのため、そのような植物は、親植物とは特定の改変の存在だけが異なる。
したがって、本発明は、本方法によって作製される植物、動物もしくは細胞、またはその子孫を提供する。子孫は、作製された植物もしくは動物のクローンであり得、または同種の他の個体と交配して更なる所望の形質を子孫に遺伝子移入することによる有性生殖から得てもよい。細胞は、多細胞生物、特に、動物または植物の場合、インビボまたはエクスビボであり得る。
本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用したゲノム編集方法を使用すると、本質的にあらゆる植物、藻類、菌類、酵母などに所望の形質を付与することができる。本開示の核酸コンストラクト及び上述の様々な形質転換方法を使用して、多種多様な植物、藻類、真菌、酵母など、及び植物 藻類、真菌、酵母の細胞または組織系を、本明細書に記載される所望の生理学的及び農学的特徴について操作することができる。
具体的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、植物のゲノムに外来ＤＮＡが存在しないように、任意の外来遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ構成要素をコードする遺伝子を含め、植物、藻類、真菌、酵母などのゲノムに永続的に導入することなく、内因性遺伝子を改変するために、またはその発現を改変するために使用される。これは、非トランスジェニック植物に対する規制要件がさほど厳しくないため、有益であり得る。
本明細書に記載される方法は、一般に、野生型植物と比較して１つまたは複数の所望の形質を有するという点で「改良された植物、藻類、真菌、酵母など」の生成をもたらす。具体的な実施形態において、植物のいずれの細胞のゲノムにも外来性ＤＮＡ配列が組み込まれていないという点で非トランスジェニック的に遺伝子改変された植物、藻類、真菌、酵母など、部分または細胞が得られる。そのような実施形態において、改良された植物、藻類、真菌、酵母などは、非トランスジェニックである。内因性遺伝子の改変のみが確実に生じ、外来遺伝子が植物、藻類、真菌、酵母などのゲノムに導入も維持もされない場合、得られる遺伝子改変作物は、外来遺伝子を含有せず、そのため、基本的に、非トランスジェニックとみなされ得る。植物、藻類、真菌、酵母などのゲノム編集のためのＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の様々な用途には、目的の農業形質を付与する内因性遺伝子の編集が含まれるが、これらに限定されない。農業形質を付与する例示的な遺伝子には、害虫または病害に対する抵抗性を付与する遺伝子；ＷＯ２０１３０４６２４７に列挙されるものなどの植物病害に関与する遺伝子；除草剤、殺真菌剤などに対する抵抗性を付与する遺伝子；（非生物的）ストレス抵抗性に関与する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の使用の他の態様には、（雄性）不稔植物の作出；植物／藻類などの稔性期の増加；目的作物における遺伝的変異の生成；果実熟成への影響；植物／藻類などの貯蔵寿命の増加；植物／藻類などのアレルゲンの減少；付加価値のある形質（例えば、栄養改善）の確保；目的内因性遺伝子のスクリーニング方法；バイオ燃料、脂肪酸、有機酸などの産生が含まれるが、これらに限定されない。
ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、非ヒト生物に使用され得る
一態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかによる真核生物宿主細胞を含む、非ヒト真核生物、好ましくは多細胞真核生物を提供する。他の態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかによる真核生物宿主細胞を含む、真核生物、好ましくは多細胞真核生物を提供する。これらの態様のいくつかの実施形態における生物は、動物、例えば、哺乳類であり得る。また、生物は、昆虫などの節足動物であり得る。本発明はまた、例えば、家畜及び生産動物などの他の農業用途に拡張することもできる。例えば、ブタは、特に再生医療における生物医学モデルとして、魅力的な多くの特徴を備える。特に、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）のブタは、再生医療、異種移植（本明細書に別途記載）、及び腫瘍発生の有用なモデルを提供し得、ヒトＳＣＩＤ患者に対する治療法開発の助けとなる。Ｌｅｅら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１４ Ｍａｙ ２０；１１１（２０）：７２６０－５）は、レポーター誘導転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を利用して、両方のアレルに影響を与えるものを含め、体細胞の組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）２の標的化改変を高効率で生成した。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、類似の系に適用されてもよい。
Ｌｅｅらの方法（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１４ Ｍａｙ ２０；１１１（２０）：７２６０－５）は、次のように同様に適用され得る。胎児線維芽細胞のＲＡＧ２の標的化改変と、それに続くＳＣＮＴ及び胚移植によって、変異ブタを作製する。胎児由来線維芽細胞にＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ及びレポーターをコードするコンストラクトを電気穿孔により導入する。４８時間後、緑色蛍光タンパク質を発現するトランスフェクト細胞を９６ウェルプレートの個々のウェルに１ウェル当たり単一細胞の推定希釈度でソーティングする。ＲＡＧ２の標的化改変は、任意のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ切断部位を挟むゲノムＤＮＡ断片を増幅し、続いてＰＣＲ産物をシークエンシングすることによってスクリーニングする。スクリーニングし、オフサイト変異がないことを確認したら、ＲＡＧ２の標的化改変を有する細胞をＳＣＮＴに使用する。極体を、中期ＩＩプレートを含有すると思われる卵母細胞に隣接する細胞質の一部とともに除去し、ドナー細胞を囲卵腔に置く。次いで、再構成された胚に電気穿孔を行い、ドナー細胞と卵母細胞を融合させ、次いで、化学的に活性化させる。活性化した胚を０．５μＭ Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ（Ｓ７８１７；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）含有Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｚｙｇｏｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ ３（ＰＺＭ３）中で１４～１６時間インキュベートする。次いで、胚を洗浄してＳｃｒｉｐｔａｉｄを除去し、代理ブタの卵管に胚を移すまで、ＰＺＭ３中で培養する。
本発明は、動物、いくつかの実施形態では哺乳類、いくつかの実施形態ではヒトの疾患または障害をモデル化するためのプラットフォームを作製するために使用される。ある特定の実施形態において、そのようなモデル及びプラットフォームは、げっ歯類をベースにし、非限定的な例は、ラットまたはマウスである。そのようなモデル及びプラットフォームは、同系交配したげっ歯類系統間の相違及び比較を利用することができる。ある特定の実施形態において、そのようなモデル及びプラットフォームは、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコまたは鳥ベースであり、例えば、かかる動物の疾患及び障害を直接モデル化するか、またはかかる動物の改変及び／または改良系統を作製する。有利には、ある特定の実施形態において、動物ベースのプラットフォームまたはモデルは、ヒト疾患または障害を再現するために作製される。例えば、ブタとヒトは類似しているので、ブタは、ヒト疾患のモデル化の理想的なプラットフォームである。げっ歯類モデルと比較して、ブタモデルの開発は、費用と時間が極めてかかる。一方、ブタ及び他の動物は、遺伝子学的、解剖学的、生理学的及び病態生理学的に、ヒトにより類似している。本発明は、そのような動物プラットフォーム及びモデルで使用される、標的の遺伝子及びゲノムの編集、遺伝子及びゲノムの改変、ならびに遺伝子及びゲノムの制御を行うための効率の高いプラットフォームを提供する。ヒトモデル、多くの場合、非ヒト霊長類ベースのモデルの開発は、倫理基準により阻まれるが、本発明は、限定するものではないが、細胞培養系、三次元モデル及び系、ならびにヒトの構造、臓器、及び系の遺伝子学、解剖学、生理学及び病態生理学を再現し、モデル化し、調査するためのオルガノイドを含む、インビトロ系で使用される。プラットフォーム及びモデルは、単一または複数の標的の操作を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、Ｓｃｈｏｍｂｅｒｇら（ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ａｐｒｉｌ ２０１６；３０（１）：Ｓｕｐｐｌ ５７１．１）のような疾患モデルに適用可能である。遺伝性疾患の神経線維腫１型（ＮＦ－１）をモデル化するために、Ｓｃｈｏｍｂｅｒｇは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して、ブタ胚にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を細胞質内マイクロインジェクションすることによって、ブタニューロフィブロミン１遺伝子に変異を導入した。ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９による標的切断の遺伝子内にあるエクソンの上流と下流の両方の部位を標的とする領域に対して作製され、修復は、特異的な一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）テンプレートによって媒介され、２５００ｂｐの欠失が導入された。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、特定のＮＦ－１変異または変異クラスターを含むブタを操作するためにも使用され、更に、所与のヒト個体に特異的または代表的な変異を操作するために使用され得る。本発明は、同様に、限定するものではないが、ヒト多遺伝子疾患のブタモデルを含む、動物モデルを開発するために使用される。本発明によれば、マルチプレックス化ガイド及び任意選択で１つまたは複数のテンプレートを使用して、１つの遺伝子または複数の遺伝子の複数の遺伝子座が同時に標的とされる。
本発明はまた、雌ウシなどの他の動物のＳＮＰの改変にも適用される。Ｔａｎら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｏｃｔ ８；１１０（４１）：１６５２６－１６５３１）は、プラスミド、ｒＡＡＶ、及びオリゴヌクレオチドテンプレートを使用して、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びクラスター化された規則的な間隔のある短い回文の繰り返し配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９刺激性相同組換え修復（ＨＤＲ）を含むように、家畜遺伝子編集ツールボックスを拡張した。遺伝子特異的ガイドＲＮＡ配列は、Ｃｈｕｒｃｈ ｌａｂガイドＲＮＡベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：４１８２４）に、その方法に従ってクローニングされた（Ｍａｌｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６）。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｈＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：４１８１５）またはＲＣＩＳｃｒｉｐｔ－ｈＣａｓ９から合成されたｍＲＮＡのコトランスフェクションのいずれかによって提供された。このＲＣＩＳｃｒｉｐｔ－ｈＣａｓ９は、ｈＣａｓ９プラスミドのＸｂａＩ－ＡｇｅＩ断片（ｈＣａｓ９ ｃＤＮＡを包含する）をＲＣＩＳｃｒｉｐｔプラスミドにサブクローニングすることによって、構築された。
Ｈｅｏら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１５ Ｆｅｂ １；２４（３）：３９３－４０２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｓｃｄ．２０１４．０２７８．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｎｏｖ ３）は、ウシ多能性細胞及びクラスター化された規則的な間隔のある短い回文の繰り返し配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用した、ウシゲノムにおける極めて効率的な遺伝子標的化を報告した。最初に、Ｈｅｏらは、山中因子の異所性発現ならびにＧＳＫ３β及びＭＥＫ阻害因子（２ｉ）処理によって、ウシ体細胞線維芽細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する。Ｈｅｏらは、これらのウシｉＰＳＣが、奇形腫における遺伝子発現及び発生能に関して、ナイーブ多能性幹細胞と極めて類似することを観察した。更に、ウシＮＡＮＯＧ遺伝子座に特異的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ウシｉＰＳＣ及び胚のウシゲノムに対し、極めて効率的な編集を示した。
Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）は、枝肉の組成、枝肉の品質、母系及び繁殖形質ならびに１日平均増体重などの経済的に重要な経済的形質の形質を実施及び伝達する、ウシなどの動物のプロファイル解析を提供する。包括的なＩｇｅｎｉｔｙ（登録商標）プロファイルの解析は、ＤＮＡマーカー（ほとんどの場合、一塩基多型またはＳＮＰ）の発見から始まる。Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）プロファイルを支えるマーカーは全て、大学、研究組織、及びＵＳＤＡなどの政府機関を含む研究機関の独立した科学者によって発見された。次いで、検証集団のマーカーがＩｇｅｎｉｔｙ（登録商標）で解析される。Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）は、様々な生産環境及び生物学的タイプを表す複数のリソース集団を使用することから、一般に入手できない表現型を収集するために、牛肉産業の種畜、雌ウシ・仔ウシ、フィードロット及び／または包装セグメントの工業パートナーと協働することも多い。ウシゲノムデータベースは、幅広く利用可能であり、例えば、ＮＡＧＲＰ Ｃａｔｔｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｉｍａｌｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃａｔｔｌｅ／ｍａｐｓ／ｄｂ．ｈｔｍｌ）を参照されたい。したがって、本発明は、ウシＳＮＰの標的化に適用され得る。当業者であれば、例えば、ＳＮＰを標的化するための上記プロトコルを利用して、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．またはＨｅｏ ｅｔ ａｌ．に記載されているように、ウシＳＮＰに適用することができる。
Ｑｉｎｇｊｉａｎ Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅ Ａｃｃｅｓｓ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｃｔｏｂｅｒ １２，２０１５）は、イヌミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子（骨格筋量の負の制御因子）の第１のエクソンを標的とする標的化により、イヌの筋肉量が増加することを実証した。まず、ＭＳＴＮを標的とするｓｇＲＮＡを、Ｃａｓ９ベクターとともにイヌ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）にコトランスフェクションすることを使用して、ｓｇＲＮＡの効率が検証された。その後、正常なモルホロジーの胚に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＭＳＴＮ ｓｇＲＮＡの混合物をマイクロインジェクションし、接合体を同じ雌イヌの卵管に自家移植することによって、ＭＳＴＮ ＫＯイヌが作製された。ノックアウト仔イヌは、その野生型同腹仔と比較して、大腿上に明らかな筋肉表現型を呈した。これは、本明細書で提供されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用して実施することもできる。
家畜－ブタ
家畜のウイルス標的には、いくつかの実施形態において、例えば、ブタのマクロファージ上のブタＣＤ１６３が含まれ得る。ＣＤ１６３は、ＰＲＲＳｖ（アルテリウイルスであるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス）による感染に関連する（ウイルスの細胞侵入を介すると考えられている）。ＰＲＲＳｖによる感染、特に、ブタ肺胞マクロファージ（肺に認められる）の感染は、これまで不治であったブタ症候群（「ミステリーブタ病」または「ブルーイヤ病」）を引き起こし、家畜ブタの繁殖障害、体重減少及び高死亡率を含む被害をもたらす。マクロファージ活性が失われることによる免疫不全症に起因して、流行性肺炎、髄膜炎及び耳浮腫などの日和見感染症が見られることが多い。また、抗生物質の使用増加及び金銭的損失による経済的及び環境的影響も著しい（年間推定６億６，０００万ドル）。
Ｇｅｎｕｓ Ｐｌｃと共同でミズーリ大学のＫｒｉｓｔｉｎ Ｍ Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ及びＤｒ Ｒａｎｄａｌｌ Ｐｒａｔｈｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３４３４、２０１５年１２月７日オンライン公開）が報告したように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用してＣＤ１６３を標的にすると、編集されたブタの子孫は、ＰＲＲＳｖに曝露された場合、抵抗性であった。両頭ともＣＤ１６３のエクソンに変異を有するファウンダーの雄１頭及びファウンダー雌１頭を交配させて子ブタを生ませた。ファウンダーの雄は、一方のアレル上のエクソン７に１１ｂｐの欠失を有していたことから、ドメイン５のアミノ酸４５におけるフレームシフト変異及びミスセンス翻訳が生じ、続いてアミノ酸６４で未成熟終止コドンが生じる。他方のアレルは、エクソン７に２ｂｐの付加と、先行イントロンに３７７ｂｐの欠失を有していたことから、ドメイン５の最初の４９アミノ酸の発現と、それに続くアミノ酸８５での未成熟停止コードが予測された。雌ブタは、一方のアレルに７ｂｐの付加を有し、これは、翻訳されると、ドメイン５の最初の４８アミノ酸の発現と、それに続くアミノ酸７０での未成熟終止コドンが予測された。雌ブタの他方のアレルは、増幅不能であった。選択された子ブタは、ヌル動物（ＣＤ１６３－／－）、すなわち、ＣＤ１６３ノックアウトであることが予想された。
したがって、いくつかの実施形態において、ブタ肺胞マクロファージが、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の標的とされ得る。いくつかの実施形態において、ブタＣＤ１６３が、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の標的とされ得る。いくつかの実施形態において、ブタＣＤ１６３は、ＤＳＢの誘導を介して、または挿入もしくは欠失を介して、例えば、上記のうちの１つまたは複数を含む、エクソン７の欠失もしくは改変、または他の遺伝子領域、例えば、エクソン５の欠失もしくは改変を標的にして、ノックアウトすることができる。
編集されたブタ、例えば、ＣＤ１６３ノックアウトブタ及びその子孫も同様に想定される。これは、家畜、育種またはモデリングの用途（すなわち、ブタモデル）であり得る。遺伝子ノックアウトを含む精液もまた提供される。
ＣＤ１６３は、スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバーである。インビトロ研究に基づくと、当該タンパク質のＳＲＣＲドメイン５は、ウイルスゲノムのアンパッケージング及び放出に関与するドメインである。そのため、ＳＲＣＲスーパーファミリーの他のメンバーもまた、他のウイルスに対する抵抗性を評価するために、標的となり得る。ＰＲＲＳＶはまた、哺乳類アルテリウイルス群のメンバーであり、この群はまた、マウス乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、サル出血熱ウイルス及びウマ動脈炎ウイルスも含まれる。アルテリウイルスは、マクロファージ向性及び重症疾患と持続感染の両方を引き起こす能力を含む、重要な病因特性を共通して持っている。したがって、アルテリウイルス、特に、マウス乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、サル出血熱ウイルス及びウマ動脈炎ウイルスは、例えば、ブタＣＤ１６３または他の種のそのホモログを介して、標的とされ得、マウス、サル及びウマのモデル及びノックアウトもまた提供される。
実際、この手法は、Ｃ型インフルエンザ、及びＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＨ２Ｎ３として知られる亜型のＡ型インフルエンザを含むブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）株、ならびに上記される肺炎、髄膜炎及び浮腫などのヒトに伝染し得る他の家畜疾病を引き起こすウイルスまたは細菌に拡張することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、１つまたは複数のブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子座を不活性化してブタからヒトへの異種移植の臨床用途を容易にするようにブタゲノムを遺伝子改変するために使用することができる。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０（６２６４）：１１０１－１１０４（２０１５）を参照されたい。当該文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、いずれの活性ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子座も含まない遺伝子改変されたブタを作製するために使用することができる。
ＣＲＩＳＰＲ系を使用したスクリーニング／診断／治療
がん
本発明の方法及び組成物は、疾患細胞の薬物耐性及び持続性に関連する細胞状態、構成要素、及び機序を特定するために使用することができる。Ｔｅｒａｉら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９－Ｄｅｃ－２０１７，ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－１７－１９０４）は、エルロチニブ＋ＴＨＺ１（ＣＤＫ７／１２阻害剤）併用療法により処置したＥＧＦＲ依存性肺癌ＰＣ９細胞におけるゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンハンサー／サプレッサースクリーニングにより、エルロチニブ／ＴＨＺ１の相乗効果を高める複数の遺伝子、ならびに相乗効果を抑制する構成要素及び経路を特定したことを報告した。Ｗａｎｇら（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１７ Ｆｅｂ ７；１８（６）：１５４３－１５５７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１７．０１．０３１．、Ｋｒａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１７ Ｆｅｂ １；６．ｐｉｉ：ｅ１８９７０．ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．１８９７０）は、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ機能喪失スクリーニングを使用して、ＭＡＰＫ阻害剤に対する抵抗性のメディエーターを特定したことを報告した。Ｄｏｎｏｖａｎら（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７ Ｊａｎ ２４；１２（１）：ｅ０１７０４４５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１７０４４５．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１７）は、ＣＲＩＳＰＲを介した変異導入法を使用して、ＭＡＰＫシグナル伝達経路遺伝子の新規機能獲得アレル及び薬物耐性アレルを特定した。Ｗａｎｇら（Ｃｅｌｌ．２０１７ Ｆｅｂ ２３；１６８（５）：８９０－９０３．ｅ１５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１７．０１．０１３．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｆｅｂ ２）は、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングを使用して、遺伝子ネットワーク及び発がん性Ｒａｓとの合成致死相互作用を特定した。Ｃｈｏｗら（Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７ Ｏｃｔ；２０（１０）：１３２９－１３４１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．４６２０．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ａｕｇ １４）は、膠芽腫におけるアデノ随伴ウイルスを介した自家遺伝子ＣＲＩＳＰＲスクリーニングを開発して、膠芽腫の機能的サプレッサーを特定した。Ｘｕｅら（Ｎａｔｕｒｅ．２０１４ Ｏｃｔ １６；５１４（７５２２）：３８０－４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５８９．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ａｕｇ ６）は、マウス肝臓のがん遺伝子に対してＣＲＩＳＰＲを介した直接変異を利用した。
Ｃｈｅｎら（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１７ Ｄｅｃ ４．ｐｉｉ：９０７９３．ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ９０７９３．［Ｅｐｕｂ出版前］）は、ＣＲＩＳＰＲをベースにしたスクリーニングを使用して、ＭＹＣＮ増幅型神経芽細胞腫のＥＺＨ２に対する依存性を特定した。ＭＹＣＮ増幅型神経芽細胞腫の患者におけるＥＺＨ２阻害剤の試験を支持する。
Ｖｉｊａｉら（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６ Ｎｏｖ；６（１１）：１２６７－１２７５．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｓｅｐ ２１）は、ＣＲＩＳＰＲを使用して、乳腺上皮細胞株にヘテロ接合性変異を生成し、乳癌のリスクを評価することを報告した。
Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら（Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１７ Ｊｕｌ １２；９（３９８）．ｐｉｉ：ｅａａｌ５２７２．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｌ５２７２）は、ＣＲＩＳＰＲベースのスクリーニングを使用して、明細胞型腎細胞癌を治療するための潜在的標的としてＥＺＨ１を特定した。
代謝性疾患
本発明の方法及び組成物は、限定するものではないが、家族性高コレステロール血症、血友病、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、遺伝性高チロシン血症Ｉ型、及びアルファ－１抗トリプシン欠乏症を含む、肝臓の遺伝性代謝疾患の治療において、従来の遺伝子治療法を超える利点を提供する。Ｂｒｙｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．９０（４）：５５３－５６６，１９－Ｄｅｃ－２０１７を参照されたい。
Ｂｏｍｐａｄａら（Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１６ Ｄｅｃ；８１（Ｐｔ Ａ）：８２－９１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｃｅｌ．２０１６．１０．０２２．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｏｃｔ ２９）は、ヒストンアセチル化がＴＸＮＩＰ遺伝子発現におけるグルコース誘発性増加の重要な制御因子として機能し、それにより糖毒性誘発性アポトーシスが生じることを実証するために、ＣＲＩＳＰＲを使用して膵臓ベータ細胞のヒストンアセチルトランスフェラーゼをノックアウトしたことを記載している。
眼
本発明は、遺伝性及び後天性の網膜眼疾患の効率的な治療を提供する。Ｈｏｌｍｇａａｒｄら（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ９：８９－９９，１５－Ｄｅｃ－２０１７ ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｎ．２０１７．０８．０１６．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｓｅｐ ２１）は、Ｖｅｇｆａを標的としたＳｐＣａｓ９をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）によってＳｐＣａｓ９を送達すると、高頻度でインデルが形成され、形質導入細胞でＶＥＧＦＡの顕著な減少があったことを報告した。Ｄｕａｎら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１６ Ｊｕｌ ２９；２９１（３１）：１６３３９－４７．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１６．７２９４６７．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｍａｙ ３１）は、ヒト初代網膜色素上皮細胞のＭＤＭ２ゲノム遺伝子座を標的としたＣＲＩＳＰＲの使用を記載している。
本発明の方法及び組成物は、同様に、加齢黄斑変性を含む眼疾患の治療にも適用可能である。
Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７ Ｊｕｌ ２４；８（１）：１１２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１７－００１４０－３は、血管新生関連疾患を治療するために、ＣＲＩＳＰＲを利用してＶＥＧＦＲ２を編集した。
聴覚
Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ．２０１７ Ｄｅｃ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２５１６４．［Ｅｐｕｂ出版前］）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用してマウスのＴｍｃ１遺伝子を標的とし、進行性難聴及び難聴を軽減するためのゲノム編集を報告した。
筋肉
Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏら（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．９：３３７－３４８．１５－Ｄｅｃ－２０１７；．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｎ．２０１７．１０．００６．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｏｃｔ １４）は、筋強直性ジストロフィー１型患者に由来する筋原細胞における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＣＴＧ伸長の欠失及び正常な表現型への永続的復帰を報告した。本発明の方法及び組成物は、同様に、ヌクレオチド反復障害、限定するものではないが、ＣＴＧ伸長にも適用可能である。Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒら（２０１６ Ｊａｎ ２２；３５１（６２７１）：４０７－４１１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５１７７．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｄｅｃ ３１）は、ＣＲＩＳＰＲを使用して、Ｄｍｄエクソン２３の遺伝子座を編集し、ＤＭＤにおける破壊的変異を修正したことを報告している。Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒは、プログラム可能なＣＲＩＳＰＲ複合体を、新生児及び成体マウスの最終分化した骨格筋線維及び心筋細胞、ならびに筋衛星細胞に局所的及び全身的に送達することができ、当該複合体は、標的遺伝子の改変を媒介し、ジストロフィン発現を回復し、ジストロフィー筋の機能欠損を部分的に回復したことを示している。また、Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｊａｎ ２２；３５１（６２７１）：４０３－７．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５１４３．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｄｅｃ ３１）を参照されたい。
感染症
Ｓｉｄｉｋら（Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｓｅｐ ８；１６６（６）：１４２３－１４３５．ｅ１２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０８．０１９．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｓｅｐ ２）及びＰａｔｅｌら（Ｎａｔｕｒｅ．２０１７ Ａｕｇ ３１；５４８（７６６９）：５３７－５４２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２３４７７．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ａｕｇ ７）は、トキソプラズマ及び駆虫薬介入の拡大におけるＣＲＩＳＰＲスクリーニングを記載している。
宿主と病原体の相互作用の根底にある構成要素及びプロセスを特定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングについては、いくつかの報告がある。例としては、Ｂｌｏｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ．２０１６ Ａｕｇ １０；２０（２）：２２６－３７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０１６．０６．０１０．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｊｕｌ ２１）、Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１８ Ｊａｎ；３（１）：７３－８２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５６４－０１７－００４３－０．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｏｃｔ ２３）及びＰａｒｋ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０１７ Ｆｅｂ；４９（２）：１９３－２０３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．３７４１．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｄｅｃ １９）が挙げられる。
Ｍａら（Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ．２０１７ Ｍａｙ １０；２１（５）：５８０－５９１．ｅ７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０１７．０４．００５）は、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ機能喪失スクリーニングを利用して、治療介入のためのウイルス形質転換による合成致死標的を特定した。
心臓血管疾患
ＣＲＩＳＰＲ系は、血管疾患に関連する遺伝子または遺伝子バリアントを同定するツールとして使用することができる。これは、潜在的治療または予防的標的を特定するために有用である。Ｘｕら（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２０１７ Ｓｅｐ．２１ ｐｉｉ：Ｓ００２１－９１５０（１７）３１２６５－０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．２０１７．０８．０３１．［Ｅｐｕｂ出版前］）は、ＣＲＩＳＰＲを使用して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子をノックアウトし、ＬＤＬ－Ｃの血漿中濃度制御におけるＡＮＧＰＴＬ３の役割を確認したことを報告している。Ｇｕｐｔａら（Ｃｅｌｌ．２０１７ Ｊｕｌ ２７；１７０（３）：５２２－５３３．ｅ１５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１７．０６．０４９）は、ＣＲＩＳＰＲを使用して、幹細胞由来内皮細胞を編集し、血管疾患に関連する遺伝子バリアントを特定したことを報告している。Ｂｅａｕｄｏｉｎら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２０１５ Ｊｕｎ；３５（６）：１４７２－１４７９．ｄｏｉ：１０．１１６１／ＡＴＶＢＡＨＡ．１１５．３０５５３４．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ａｐｒ ２）は、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集を使用して、転写因子ＭＥＦ２の結合を遺伝子座で破壊したことを報告している。これは、血管内皮におけるＰＨＡＣＴＲ１機能がどのように冠動脈疾患に影響するかを探索するステージを設定するものである。Ｐａｓｈｏｓら（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１７ Ａｐｒ ６；２０（４）：５５８－５７０．ｅ１０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１７．０３．０１７．）は、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、多能性幹細胞及び肝細胞様細胞を標的とし、機能性バリアント及び脂質機能性遺伝子を特定したことを報告している。
標的を特定するためのツールとして使用されることに加えて、ＣＲＩＳＰＲ系は、既知の標的に対して、心臓血管疾患を治療または予防するために直接使用することができる。Ｋｈｅｒａら（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１７ Ｊｕｎ；１８（６）：３３１－３４４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ．２０１６．１６０．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｍａｒ １３）は、一般的バリアント関連研究により、約６０の遺伝子座が冠状動脈リスクと関連づけられ、これを使用することで、原因となる危険因子のより深い理解、基礎となる生物学、新しい治療薬の開発が促進されることを記載している。Ｋｈｅｒａは、例えば、ＰＣＳＫ９の変異を不活性化すると、循環ＬＤＬコレステロール値が低下し、ＣＡＤのリスクが低下することから、ＰＣＳＫ９阻害剤の開発に強い関心が寄せられると説明している。更に、ＡＰＯＣ３またはＬＰＡの保護的変異を再現するようにアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計すると、トリグリセリド値が約７０％低下し、循環リポタンパク質（ａ）値が８０％低下することがそれぞれ示された。加えて、Ｗａｎｇら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２０１６ Ｍａｙ；３６（５）：７８３－６．ｄｏｉ：１０．１１６１／ＡＴＶＢＡＨＡ．１１６．３０７２２７．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｍａｒ ３）及びＤｉｎｇら（Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２０１４ Ａｕｇ １５；１１５（５）：４８８－９２．ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１１５．３０４３５１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｊｕｎ １０．）は、心臓血管疾患の予防のための遺伝子Ｐｃｓｋ９を標的としたＣＲＩＳＰＲの使用を報告している。
本発明は、神経系の疾患及び障害を調査及び治療するための方法及び組成物を提供する。Ｎａｋａｙａｍａら（Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１５ Ｍａｙ ７；９６（５）：７０９－１９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｈｇ．２０１５．０３．００３．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ａｐｒ ９）は、ＣＲＩＳＰＲを使用して、ヒトＣＮＳ発症におけるＰＹＣＲ２の役割を研究し、小頭症及びミエリン形成減少症の潜在的標的を特定したことを報告している。Ｓｗｉｅｃｈら（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｊａｎ；３３（１）：１０２－６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０５５．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｏｃｔ １９）は、インビボで成体マウス脳の単一の遺伝子（Ｍｅｃｐ２）及び複数の遺伝子（Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ３ｂ）を標的としたＣＲＩＳＰＲの使用を報告している。Ｓｈｉｎら（Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１６ Ｏｃｔ １５；２５（２０）：４５６６－４５７６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｗ２８６）は、ＣＲＩＳＰＲを使用して、ハンチントン病変異を不活性化したことを記載している。Ｐｌａｔｔら（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１７ Ａｐｒ １１；１９（２）：３３５－３５０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１７．０３．０５２）は、ＣＲＩＳＰＲノックインマウスを使用して、自閉症スペクトラム障害におけるＣｈｄ８の役割を特定したことを報告している。Ｓｅｏら（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７ Ｏｃｔ １１；３７（４１）：９９１７－９９２４．ｄｏｉ：１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．０６２１－１７．２０１７．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｓｅｐ １４）は、ＣＲＩＳＰＲを使用して、神経変性障害のモデルを生成したことを記載している。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（Ｎｅｕｒｏｎ．２０１７ Ｄｅｃ ６；９６（５）：１００３－１０１２．ｅ７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１７．１０．００８．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｎｏｖ ２）は、希突起膠細胞前駆細胞のアクチビンＡ受容体Ｉ型をＣＲＩＳＰＲノックアウトし、髄鞘再生不全を伴う疾患の潜在的標的を特定したことを示している。本発明の方法及び組成物が、同様に適用可能である。
ＣＲＩＳＰＲ技術の他の用途。
Ｒｅｎｎｅｖｉｌｌｅら（Ｂｌｏｏｄ．２０１５ Ｏｃｔ １５；１２６（１６）：１９３０－９．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１５－０６－６４９０８７．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ａｕｇ ２８）は、ＣＲＩＳＰＲを使用して、胎児型ヘモグロビン発現におけるＥＨＭＴ１及びＥＭＨＴ２の役割を研究し、ＳＣＤの新しい治療標的を特定したことを報告している。
Ｔｏｔｈｏｖａら（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１７ Ｏｃｔ ５；２１（４）：５４７－５５５．ｅ８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１７．０７．０１５）は、造血幹細胞・前駆細胞においてＣＲＩＳＰＲを使用して、ヒト骨髄疾患モデルを生成したことを報告した。
Ｇｉａｎｉら（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｊａｎ ７；１８（１）：７３－７８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０９．０１５．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｏｃｔ ２２）は、ヒト多能性幹細胞でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集によってＳＨ２Ｂ３を不活性化すると、分化が維持された赤血球細胞の増殖が向上されたことを報告している。
Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１６ Ａｐｒ １９；１１３（１６）：４４３４－９．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５２１７５４１１３．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ａｐｒ ４）は、ＣＲＩＳＰＲを利用して、ＧＡＴＡ１転写活性に関する洞察を得、ヒト赤血球障害におけるノンコーディングバリアントの病原性を調査した。
Ｍａｎｄａｌら（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１４ Ｎｏｖ ６；１５（５）：６４３－５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１４．１０．００４．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｎｏｖ ６）は、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ３４＋造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）において臨床的に関係する２つの遺伝子Ｂ２Ｍ及びＣＣＲ５を標的としたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を記載している。
Ｐｏｌｆｕｓら（Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１６ Ｓｅｐ １；９９（３）：７８５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｈｇ．２０１６．０８．００２．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｓｅｐ １）は、ＣＲＩＳＰＲを使用して、造血細胞株を編集し、初代ヒト造血幹細胞・前駆細胞で標的化ノックダウン実験を引き続いて行い、ヒト造血におけるＧＦＩ１Ｂバリアントの役割を調査した。
Ｎａｊｍら（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７ Ｄｅｃ １８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．４０４８．［Ｅｐｕｂ出版前］）は、ＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９のペアを有するＣＲＩＳＰＲ複合体の使用により二重標的化を実現し、複雑性の高いプール二重ノックアウトライブラリーを生成して、ＭＡＰＫ経路遺伝子及びアポトーシス遺伝子を含む、複数の細胞型にわたる合成致死及び緩衝遺伝子ペアを特定したことを報告している。
Ｍａｎｇｕｓｏら（Ｎａｔｕｒｅ．２０１７ Ｊｕｌ ２７；５４７（７６６４）：４１３－４１８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２３２７０．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｊｕｌ １９．）は、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングを使用して、新しい免疫療法標的を特定及び／又は確認したことを報告している。また、Ｒｏｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１７ Ｊｕｎ ２０；１１４（２５）：６５８１－６５８６．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１７０１２６３１１４．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｊｕｎ １２．）、Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ．２０１７ Ｍａｒ ９；５４３（７６４４）：２７０－２７４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２１６８８．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｍａｒ １．）、Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６ Ｊｕｎ ２２；７：１１９８７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１１９８７）、Ｆｅｉ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１７ Ｊｕｎ ２７；１１４（２６）：Ｅ５２０７－Ｅ５２１５．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６１７４６７１１４．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｊｕｎ １３．）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１７ Ｓｅｐ ２９．ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９－８２９０．ＣＤ－１７－０５３２．［Ｅｐｕｂ出版前］）を参照されたい。
Ｊｏｕｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ．２０１７ Ａｕｇ １７；５４８（７６６７）：３４３－３４６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２３４５１．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ａｕｇ ９．）は、ゲノムワイドスクリーニングを使用して、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を解析したことを報告している。また、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｄｅｃ；３４（１２）：１２７９－１２８６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３７１５．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｏｃｔ ３１）、Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｓｅｐ ３０；３５３（６３０７）：１５４５－１５４９）を参照されたい。
Ｂａｒｒｏｗら（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｏｃｔ ６；６４（１）：１６３－１７５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．０８．０２３．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｓｅｐ ２２．）は、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングを使用して、ミトコンドリア病の治療標的を探索したことを報告している。また、Ｖａｆａｉ ｅｔ ａｌ．，（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１６ Ｓｅｐ １３；１１（９）：ｅ０１６２６８６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１６２６８６．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１６）を参照されたい。
Ｇｕｏら（Ｅｌｉｆｅ．２０１７ Ｄｅｃ ５；６．ｐｉｉ：ｅ２９３２９．ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．２９３２９）は、ヒト軟骨細胞を標的としたＣＲＩＳＰＲを使用して、ヒト成長の生物学的機序を解明したことを報告している。
Ｒａｍａｎａｎら（Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５ Ｊｕｎ ２；５：１０８３３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０８３３）は、ＣＲＩＳＰＲを使用して、ＨＢＶゲノムの保存領域を標的とし、切断したことを報告している。
ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を用いた治療標的化
明らかなように、ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、あらゆる目的のポリヌクレオチド配列を標的とし得ることが想定される。本発明は、インビボ、エクスビボまたはインビトロで標的細胞を改変するために使用される、非天然もしくは操作組成物、または当該組成物の構成要素をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、または当該組成物の構成要素をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクターもしくは送達系を提供し、改変された後は、ＣＲＩＳＰＲ改変細胞の子孫または細胞株が改変された表現型を維持するように細胞を改変するように実施され得る。改変された細胞及び子孫は、所望の細胞型にＣＲＩＳＰＲ系をエクスビボまたはインビボで適用した植物または動物などの多細胞生物の一部であってよい。本ＣＲＩＳＰＲ発明は、治療的療法であり得る。治療的療法は、遺伝子もしくはゲノム編集、または遺伝子治療を含み得る。
養子細胞療法
本発明はまた、養子療法用に細胞を改変するための、本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系の使用を企図する。したがって、本発明の態様は、腫瘍関連抗原などの選択された抗原に特異的である、Ｔ細胞などの免疫系細胞の養子移入を伴う（Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３２：１８９－２２５、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ，２０１５，Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｓ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．３４８ ｎｏ．６２３０ ｐｐ．６２－６８、及びＲｅｓｔｉｆｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ：ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（４）：２６９－２８１、及びＪｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｉｄｄｅｌｌ，２０１４，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２５７（１）：１２７－１４４参照）。例えば、様々な戦略を利用して、例えば、選択されたペプチド特異性を有する新しいＴＣＲα鎖及びβ鎖を導入することによって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の特異性を変更することにより、Ｔ細胞を遺伝子的に改変することができる（米国特許第８，６９７，８５４号、ＰＣＴ特許出願公開：ＷＯ２００３０２０７６３、ＷＯ２００４０３３６８５、ＷＯ２００４０４４００４、ＷＯ２００５１１４２１５、ＷＯ２００６０００８３０、ＷＯ２００８０３８００２、ＷＯ２００８０３９８１８、ＷＯ２００４０７４３２２、ＷＯ２００５１１３５９５、ＷＯ２００６１２５９６２、ＷＯ２０１３１６６３２１、ＷＯ２０１３０３９８８９、ＷＯ２０１４０１８８６３、ＷＯ２０１４０８３１７３、米国特許第８，０８８，３７９号参照）。
ＴＣＲ改変に代えて、またはそれに加えて、悪性細胞などの選択された標的に特異的であるＴ細胞などの免疫応答性細胞を生成するために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用してもよく、多種多様な受容体キメラコンストラクトが記載されている（米国特許第５，８４３，７２８号、同第５，８５１，８２８号、同第５，９１２，１７０号、同第６，００４，８１１号、同第６，２８４，２４０号、同第６，３９２，０１３号、同第６，４１０，０１４号、同第６，７５３，１６２号、同第８，２１１，４２２号、及びＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９２１５３２２号参照）。代替的なＣＡＲコンストラクトは、各世代に属するものとして特徴付けることができる。第一世代のＣＡＲは、典型的に、抗原に特異的な抗体の単鎖可変断片、例えば、特異的抗体のＶＨに連結されたＶＬを含み、これが、可動性リンカー、例えば、ＣＤ８αヒンジドメイン及びＣＤ８α膜貫通ドメインによって、ＣＤ３ζまたはＦｃＲγのいずれかの膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結されているものからなる（ｓｃＦｖ－ＣＤ３ζまたはｓｃＦｖ－ＦｃＲγ；米国特許第７，７４１，４６５号、米国特許第５，９１２，１７２号、米国特許第５，９０６，９３６号参照）。第二世代のＣＡＲは、エンドドメイン内のＣＤ２８、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）などの１つまたは複数の共刺激分子の細胞内ドメインが組み込まれている（例えば、ｓｃＦｖ－ＣＤ２８／ＯＸ４０／４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ；米国特許第８，９１１，９９３号、同第８，９１６，３８１号、同第８，９７５，０７１号、同第９，１０１，５８４号、同第９，１０２，７６０号、同第９，１０２，７６１号参照）。第三世代のＣＡＲは、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ９７、ＧＤＩＩａ－ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、またはＣＤ２８シグナル伝達ドメインなどの共刺激エンドドメインの組み合わせを含む（例えば、ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζまたはｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ；米国特許第８，９０６，６８２号、米国特許第８，３９９，６４５号、米国特許第５，６８６，２８１号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１４１３４１６５号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１２０７９０００号参照）。あるいは、共刺激は、例えば、プロフェッショナル抗原提示細胞上の抗原による未変性αβＴＣＲの結合後に活性化され、拡張され、付随する共刺激を伴うように選択されたＣＡＲを抗原特異的Ｔ細胞上に発現させることによって実施されてもよい。加えて、例えば、Ｔ細胞攻撃の標的化を改善し、及び／または副作用を最小限に抑える、更なる操作された受容体が免疫応答性細胞上に提供され得る。
標的の免疫応答性細胞は、プロトプラスト融合、リポフェクション、トランスフェクションまたは電気穿孔などの代替技術を使用して形質転換することができる。レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミドまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンなどのトランスポゾン（米国特許第６，４８９，４５８号、同第７，１４８，２０３号、同第７，１６０，６８２号、同第７，９８５，７３９号、同第８，２２７，４３２号）などの多種多様なベクターを使用することができ、ＣＡＲ、例えば、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８またはＣＤ１３７のいずれかを介してシグナル伝達を行う第二世代の抗原特異的ＣＡＲを導入することができる。ウイルスベクターは、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶをベースにしたベクターを含み得る。
形質転換の標的となる細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）またはリンパ系細胞に分化し得る多能性幹細胞を含み得る。所望のＣＡＲを発現するＴ細胞は、例えば、がん抗原及び共刺激分子を共発現する、γ線を照射した活性化増殖性細胞（ＡａＰＣ）との共培養により選択することができる。操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、例えば、ＩＬ－２及びＩＬ－２１などの可溶性因子の存在下でＡａＰＣ上で共培養することによって、増殖され得る。この増殖は、例えば、メモリーＣＡＲ＋Ｔ細胞を提供するように実施され得る（例えば、非酵素的デジタルアレイ及び／またはマルチパネルフローサイトメトリーによってアッセイされ得る）。このように、抗原担持腫瘍に対して特異的な細胞傷害活性を（任意選択で、インターフェロンγなどの所望のケモカインの産生とともに）有するＣＡＲ Ｔ細胞が提供され得る。この種のＣＡＲ Ｔ細胞は、例えば、腫瘍異種移植を脅かす、例えば、動物モデルで使用することができる。
前述のような手法は、例えば、選択された抗原に結合する抗原認識受容体を含む有効量の免疫応答性細胞を投与することによって、新生組織形成などの疾患を有する対象を治療し、及び／またはその生存を増加させる方法を提供するように適合され得、ここで、結合は、免疫応答性細胞を活性化し、それにより、疾患（新生組織形成、病原体感染、自己免疫障害、または同種移植反応など）を治療または予防する。ＣＡＲ Ｔ細胞療法における投与は、例えば、シクロホスファミドによるリンパ球枯渇クールの有無を問わず、例えば、１０６～１０９細胞／ｋｇの投与を伴い得る。
一実施形態において、治療薬は、免疫抑制治療を受けている患者に投与することができる。細胞または細胞集団は、少なくとも１つの免疫抑制剤に対して抵抗性になり得、これは、そのような免疫抑制剤に対する受容体をコードする遺伝子の不活性化による。理論に拘束されるものではないが、免疫抑制治療は、患者内における、本発明による免疫応答性細胞またはＴ細胞の選択及び増殖の助けとなるはずである。
本発明による細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、植え込みまたは移植によることを含む、任意の簡便な方法で実施され得る。細胞または細胞集団は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ管内注射、または腹腔内に投与され得る。一実施形態において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。
細胞または細胞集団の投与は、１０４～１０９細胞／ｋｇ体重、好ましくは、１０５～１０６細胞／ｋｇ体重の投与からなり得、細胞数は、これらの範囲内にある全ての整数値を含む。ＣＡＲ Ｔ細胞療法における投与は、例えば、シクロホスファミドによるリンパ球枯渇クールの有無を問わず、例えば、１０６～１０９細胞／ｋｇの投与を伴い得る。細胞または細胞集団は、１回または複数回以上の投与で投与することができる。別の実施形態において、有効量の細胞は、単回投与として投与される。別の実施形態において、有効量の細胞は、ある期間にわたって、２回以上の投与として投与される。投与のタイミングは、主治医の判断でなされ、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から得ることができる。個々のニーズは様々であるが、特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の至適範囲の決定は、当業者の技術範囲内である。有効量は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康及び体重、ある場合には、併用治療の種類、治療の頻度及び所望の効果の性質に依存し得る。
別の実施形態において、有効量の細胞または当該細胞を含む組成物は、非経口的に投与される。投与は、静脈内投与であり得る。投与は、腫瘍内への注射によって直接行われてもよい。
起こり得る有害反応を防ぐために、操作された免疫応答性細胞は、特定のシグナルへの曝露に対する細胞の脆弱性を高める導入遺伝子の形態で、トランスジェニック安全スイッチを備え得る。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をこの方法で使用することができ、例えば、幹細胞移植後のドナーリンパ球注入として使用される同種異系Ｔリンパ球にＴＫ遺伝子を導入する（Ｇｒｅｃｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＴＫ－ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５；６：９５）。そのような細胞では、ガンシクロビルまたはアシクロビルなどのヌクレオシドプロドラッグの投与により、細胞死が生じる。代替的な安全スイッチコンストラクトには、誘導性カスパーゼ９が含まれ、これは、例えば、２つの非機能性ｉｃａｓｐ９分子を一緒にして活性酵素を形成する小分子二量体化剤の投与によって誘導される。細胞増殖制御を行うための多種多様な代替的手法が記載されている（米国特許出願公開第２０１３００７１４１４号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１１１４６８６２号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１４０１１９８７号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１３０４０３７１号、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．ＢＬＯＯＤ，２０１４，１２３／２５：３８９５－３９０５、Ｄｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１、；３６５：１６７３－１６８３、Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５：１７３５－１７３、Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２８（６）：１１０７－１５（２０１０）参照）。
養子療法の更なる改良において、本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を用いたゲノム編集を使用し、免疫応答性細胞を代替的な実施方法に合うように調整して、例えば、編集されたＣＡＲ Ｔ細胞を提供し得る（Ｐｏｉｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ “ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ” ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７５（１８）：３８５３参照）。例えば、免疫応答性細胞は、ＨＬＡタイプＩＩ及び／またはタイプＩ分子のクラスのいくつかもしくは全ての発現がなくなるように、または所望の免疫応答を阻害し得るＰＤ１遺伝子などの選択された遺伝子をノックアウトするように編集され得る。
細胞は、本明細書に記載されるＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系を使用して編集され得る。ＡＤ機能化ＣＲＩＳＰＲ系は、本明細書に記載される任意の方法によって免疫細胞に送達され得る。好ましい実施形態において、細胞は、エクスビボで編集され、それを必要とする対象に移入される。免疫応答性細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞または養子細胞移入に使用される細胞が編集され得る。編集は、潜在的なアロ反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の除去、化学療法剤の標的の破壊、免疫チェックポイントの遮断、Ｔ細胞の活性化、及び／または機能的に疲弊したもしくは機能不全のＣＤ８＋Ｔ細胞の分化及び／または増殖の増加が行われるように実施され得る（ＰＣＴ特許出願公開：ＷＯ２０１３１７６９１５、ＷＯ２０１４０５９１７３、ＷＯ２０１４１７２６０６、ＷＯ２０１４１８４７４４、及びＷＯ２０１４１９１１２８参照）。編集は、遺伝子の不活性化をもたらし得る。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原提示に応答したＴ細胞の活性化に関与する、細胞表面受容体である。ＴＣＲは、一般に、α及びβの２つの鎖からなり、これが集合してヘテロ二量体を形成し、ＣＤ３変換サブユニットと結合して、細胞表面上に存在するＴ細胞受容体複合体を形成する。ＴＣＲのα鎖及びβ鎖のそれぞれは、免疫グロブリン様Ｎ末端可変（Ｖ）及び定常（Ｃ）領域、疎水性膜貫通ドメイン、及び短い細胞質領域から構成される。免疫グロブリン分子と同様に、α鎖及びβ鎖の可変領域は、Ｖ（Ｄ）Ｊ再構成によって生成され、Ｔ細胞集団に抗原特異性の大きな多様性を生み出す。しかしながら、インタクトな抗原を認識する免疫グロブリンとは対照的に、Ｔ細胞は、ＭＨＣ分子と結合した処理ペプチド断片によって活性化されるため、Ｔ細胞による抗原認識に余分な要素が入り、これは、ＭＨＣ拘束性として知られている。ドナーとレシピエントとの間のＭＨＣの不一致がＴ細胞受容体により認識されると、Ｔ細胞の増殖及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の潜在的な発生につながる。ＴＣＲαまたはＴＣＲβの不活性化は、Ｔ細胞表面からＴＣＲを排除することになり、それにより、アロ抗原の認識が妨げられ、ひいてはＧＶＨＤも阻止される。しかしながら、ＴＣＲの破壊は、一般に、ＣＤ３シグナル伝達構成要素の排除をもたらし、更なるＴ細胞増殖の手段を変更する。
同種異系細胞は、宿主免疫系によって速やかに拒絶される。非放射線血液製剤中に存在する同種異系白血球は、わずか５～６日間しか生存しないことが実証されている（Ｂｏｎｉ，Ｍｕｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｂｌｏｏｄ １；１１２（１２）：４７４６－５４）。したがって、同種異系細胞の拒絶反応を防ぐには、通常、宿主の免疫系をある程度抑制する必要がある。しかしながら、養子細胞移入の場合、免疫抑制薬剤の使用も、導入される治療用Ｔ細胞に有害な影響を与える。したがって、これらの条件下で養子免疫療法アプローチを効果的に使用するには、導入される細胞は、免疫抑制治療に対して抵抗性である必要がある。そのため、具体的な実施形態において、本発明は、好ましくは、免疫抑制剤の標的をコードする少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって、免疫抑制剤に対して抵抗性になるようにＴ細胞を改変する工程を更に含む。免疫抑制剤は、いくつかの作用機序のうちの１つによって、免疫機能を抑制する剤である。免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシン標的、インターロイキン－２受容体α鎖遮断剤、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、コルチコステロイドまたは免疫抑制性代謝拮抗剤であり得るが、これらに限定されない。本発明は、Ｔ細胞内の免疫抑制剤の標的を不活性化することによって、免疫療法のためのＴ細胞に免疫抑制抵抗性を付与することを可能にする。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、ＣＤ５２、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー及びシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーなどの免疫抑制剤の受容体であり得る。
免疫チェックポイントは、免疫応答を減速または停止させ、免疫細胞の制御不能な活性からの過度の組織損傷を防ぐ抑制経路である。ある特定の実施形態において、標的となる免疫チェックポイントは、プログラム死１（ＰＤ－１またはＣＤ２７９）遺伝子（ＰＤＣＤ１）である。他の実施形態において、標的となる免疫チェックポイントは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ－４）である。追加の実施形態において、標的となる免疫チェックポイントは、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤＬ１またはＫＩＲなどのＣＤ２８及びＣＴＬＡ４ Ｉｇスーパーファミリーの別のメンバーである。更なる追加の実施形態において、標的となる免疫チェックポイントは、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７またはＴＩＭ－３などのＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。
追加の免疫チェックポイントには、Ｓｒｃ相同性２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ－１）が含まれる（Ｗａｔｓｏｎ ＨＡ，ｅｔ ａｌ．，ＳＨＰ－１：ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ？ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２０１６ Ａｐｒ １５；４４（２）：３５６－６２）。ＳＨＰ－１は、広く発現する抑制性タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）である。Ｔ細胞において、抗原依存性活性化及び増殖の負の制御因子である。ＳＨＰ－１は、細胞質タンパク質であるため、抗体媒介療法に適さないが、活性化及び増殖でのその役割は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞などの養子移入戦略における遺伝子操作の魅力的な標的である。免疫チェックポイントにはまた、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ／Ｖｓｔｍ３／ＷＵＣＡＭ／ＶＳＩＧ９）及びＶＩＳＴＡを含むＴ細胞免疫受容体も含まれ得る（Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｂｅｙｏｎｄ ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ＰＤ－１，ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｚ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４１８）。
ＷＯ２０１４１７２６０６は、疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び／または活性を増加させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の疲弊を減少させる（例えば、機能的に疲弊したまたは非応答性のＣＤ８＋免疫細胞を減少させる）ためのＭＴ１及び／またはＭＴ１阻害剤の使用に関する。ある特定の実施形態において、メタロチオネインが、養子移入されるＴ細胞の遺伝子編集の標的とされる。
ある特定の実施形態において、遺伝子編集の標的は、免疫チェックポイントタンパク質の発現に関与する少なくとも１つの標的遺伝子座であり得る。そのような標的には、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＰＤＬ１、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＶＩＳＴＡ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＭＴ１、ＭＴ２、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＳＨＰ－１またはＴＩＭ－３が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４遺伝子の発現に関与する遺伝子座が標的とされる。他の好ましい実施形態において、限定するものではないが、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴなどの遺伝子の組み合わせが標的とされる。
他の実施形態において、少なくとも２つの遺伝子が編集される。遺伝子ペアには、ＰＤ１とＴＣＲα、ＰＤ１とＴＣＲβ、ＣＴＬＡ－４とＴＣＲα、ＣＴＬＡ－４とＴＣＲβ、ＬＡＧ３とＴＣＲα、ＬＡＧ３とＴＣＲβ、Ｔｉｍ３とＴＣＲα、Ｔｉｍ３とＴＣＲβ、ＢＴＬＡとＴＣＲα、ＢＴＬＡとＴＣＲβ、ＢＹ５５とＴＣＲα、ＢＹ５５とＴＣＲβ、ＴＩＧＩＴとＴＣＲα、ＴＩＧＩＴとＴＣＲβ、Ｂ７Ｈ５とＴＣＲα、Ｂ７Ｈ５とＴＣＲβ、ＬＡＩＲ１とＴＣＲα、ＬＡＩＲ１とＴＣＲβ、ＳＩＧＬＥＣ１０とＴＣＲα、ＳＩＧＬＥＣ１０とＴＣＲβ、２Ｂ４とＴＣＲα、２Ｂ４とＴＣＲβが含まれるが、これらに限定されない。
Ｔ細胞の遺伝子改変の前または後にかかわらず、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び同第７，５７２，６３１号に記載されるような方法を一般に使用して、活性化及び増殖させることができる。Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで増殖することができる。
本発明の実施は、当業者の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組換えＤＮＡの分野で公知の技術を利用する。ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）；ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．）、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９８８）（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．）、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．）、及びＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．）を参照されたい。
疾患関連変異及び病原性ＳＮＰの修正
一態様において、本明細書に記載される本発明は、Ｇ→ＡもしくはＣ→Ｔの点変異もしくは病原性一塩基多型（ＳＮＰ）によって引き起こされるまたは引き起こされる可能性が高い疾患状態を治療及び／または予防することを目的として、標的遺伝子座のアデノシン残基を修正するための方法を提供する。
脳及び中枢神経系に影響を及ぼす疾患
脳及び中枢神経系に影響を及ぼす様々な疾患、例えば、限定するものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、自閉症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、統合失調症、副腎白質ジストロフィー、エカルディ・グティエール症候群、ファブリー病、レッシュ・ナイハン症候群、及びメンケス病に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告されており、表Ａに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するための方法に関する。
アルツハイマー病
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、アルツハイマー病に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、及びＡＰＰから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．７９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２６６Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００４８４．３（ＡＰＰ）：ｃ．２０１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ６７３Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００４８４．３（ＡＰＰ）：ｃ．２１４９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ７１７Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００４８４．３（ＡＰＰ）：ｃ．２１３７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ７１３Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００４８４．３（ＡＰＰ）：ｃ．２１４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ７１５Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００４８４．３（ＡＰＰ）：ｃ．２１４１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ７１４Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．４３８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｍｅｔ１４６Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．１２２９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ４１０Ｔｙｒ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．４８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｈｉｓ１６３Ｔｙｒ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．７９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２６７Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．２３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ７９Ｖａｌ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．５０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ１７０Ｐｈｅ）
ＮＭ＿０００４４７．２（ＰＳＥＮ２）：ｃ．１２８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４３０Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００４４７．２（ＰＳＥＮ２）：ｃ．７１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｍｅｔ２３９Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００４４７．２（ＰＳＥＮ２）：ｃ．２５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ８５Ｖａｌ）
ＮＭ＿００００２１．３（ＰＳＥＮ１）：ｃ．８０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２６９Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００４８４．３（ＡＰＰ）：ｃ．２０１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ６７３Ｖａｌ）。
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、及びＡＰＰから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、アルツハイマー病を治療または予防するための方法に関する。
パーキンソン病
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、パーキンソン病に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＳＮＣＡ、ＰＬＡ２Ｇ６、ＦＢＸＯ７、ＶＰＳ３５、ＥＩＦ４Ｇ１、ＤＮＡＪＣ６、ＰＲＫＮ、ＳＹＮＪ１、ＣＨＣＨＤ２、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ７、ＬＲＲＫ２、ＡＴＰ１３Ａ２、及びＧＢＡから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００３４５．３（ＳＮＣＡ）：ｃ．１５７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ５３Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００３４５．３（ＳＮＣＡ）：ｃ．１５２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５１Ａｓｐ）
ＮＭ＿００３５６０．３（ＰＬＡ２Ｇ６）：ｃ．２２２２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ７４１Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００３５６０．３（ＰＬＡ２Ｇ６）：ｃ．２２３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７４７Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００３５６０．３（ＰＬＡ２Ｇ６）：ｃ．１９０４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ６３５Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００３５６０．３（ＰＬＡ２Ｇ６）：ｃ．１３５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４５２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１２１７９．３（ＦＢＸＯ７）：ｃ．１４９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１２１７９．３（ＦＢＸＯ７）：ｃ．６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ２２Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０１８２０６．５（ＶＰＳ３５）：ｃ．１８５８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ６２０Ａｓｎ）
ＮＭ＿１９８２４１．２（ＥＩＦ４Ｇ１）：ｃ．３６１４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１２０５Ｈｉｓ）
ＮＭ＿１９８２４１．２（ＥＩＦ４Ｇ１）：ｃ．１５０５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ５０２Ｖａｌ）
ＮＭ＿００１２５６８６５．１（ＤＮＡＪＣ６）：ｃ．２２００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１２５６８６５．１（ＤＮＡＪＣ６）：ｃ．２３２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４５６２．２（ＰＲＫＮ）：ｃ．９３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４５６２．２（ＰＲＫＮ）：ｃ．１３５８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４５６２．２（ＰＲＫＮ）：ｃ．６３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ２１２Ｔｙｒ）
ＮＭ＿２０３４４６．２（ＳＹＮＪ１）：ｃ．７７３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２５８Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００１３２０３２７．１（ＣＨＣＨＤ２）：ｃ．１８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ６１Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００１３２０３２７．１（ＣＨＣＨＤ２）：ｃ．４３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１４５Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００１３２０３２７．１（ＣＨＣＨＤ２）：ｃ．３００＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０３２４０９．２（ＰＩＮＫ１）：ｃ．９２６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３０９Ａｓｐ）
ＮＭ＿０３２４０９．２（ＰＩＮＫ１）：ｃ．１３１１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２４０９．２（ＰＩＮＫ１）：ｃ．７３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２４０９．２（ＰＩＮＫ１）：ｃ．８３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２７９Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０３２４０９．２（ＰＩＮＫ１）：ｃ．９３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ３１３Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０３２４０９．２（ＰＩＮＫ１）：ｃ．１３６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２６２．４（ＰＡＲＫ７）：ｃ．７８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｍｅｔ２６Ｉｌｅ）
ＮＭ＿１９８５７８．３（ＬＲＲＫ２）：ｃ．４３２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４４１Ｃｙｓ）
ＮＭ＿１９８５７８．３（ＬＲＲＫ２）：ｃ．４３２２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１４４１Ｈｉｓ）
ＮＭ＿１９８５７８．３（ＬＲＲＫ２）：ｃ．１２５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ４１９Ｖａｌ）
ＮＭ＿１９８５７８．３（ＬＲＲＫ２）：ｃ．６０５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２０１９Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０２２０８９．３（ＡＴＰ１３Ａ２）：ｃ．１３０６＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２２０８９．３（ＡＴＰ１３Ａ２）：ｃ．２６２９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ８７７Ａｒｇ）
ＮＭ＿０２２０８９．３（ＡＴＰ１３Ａ２）：ｃ．４９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６４Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００１００５７４１．２（ＧＢＡ）：ｃ．１４４４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ４８２Ａｓｎ）
ｍ．１５９５０Ｇ＞Ａ。
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＳＮＣＡ、ＰＬＡ２Ｇ６、ＦＢＸＯ７、ＶＰＳ３５、ＥＩＦ４Ｇ１、ＤＮＡＪＣ６、ＰＲＫＮ、ＳＹＮＪ１、ＣＨＣＨＤ２、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ７、ＬＲＲＫ２、ＡＴＰ１３Ａ２、及びＧＢＡから選択される少なくとも１つの遺伝子中の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、パーキンソン病を治療または予防するための方法に関する。
自閉症
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、自閉症に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＭＥＣＰ２、ＮＬＧＮ３、ＳＬＣ９Ａ９、ＥＨＭＴ１、ＣＨＤ８、ＮＬＧＮ４Ｘ、ＧＳＰＴ２、及びＰＴＥＮから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００１１１０７９２．１（ＭＥＣＰ２）：ｃ．９１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４９９２．３（ＭＥＣＰ２）：ｃ．４７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１５８Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０１８９７７．３（ＮＬＧＮ３）：ｃ．１３５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４５１Ｃｙｓ）
ＮＭ＿１７３６５３．３（ＳＬＣ９Ａ９）：ｃ．１２６７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４２３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４７５７．４（ＥＨＭＴ１）：ｃ．３４１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１１３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２０９２０．３（ＣＨＤ８）：ｃ．２８７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２０９２０．３（ＣＨＤ８）：ｃ．３１７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１８１３３２．２（ＮＬＧＮ４Ｘ）：ｃ．３０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１８０９４．４（ＧＳＰＴ２）：ｃ．１０２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ３４１Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００３１４．６（ＰＴＥＮ）：ｃ．３９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１３１Ｉｌｅ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＭＥＣＰ２、ＮＬＧＮ３、ＳＬＣ９Ａ９、ＥＨＭＴ１、ＣＨＤ８、ＮＬＧＮ４Ｘ、ＧＳＰＴ２、及びＰＴＥＮから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、自閉症を治療または予防するための方法に関する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ＡＬＳに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＳＯＤ１、ＶＣＰ、ＵＢＱＬＮ２、ＥＲＢＢ４、ＨＮＲＮＰＡ１、ＴＵＢＡ４Ａ、ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＩＧ４、ＯＰＴＮ、ＳＥＴＸ、ＳＰＧ１１、ＦＵＳ、ＶＡＰＢ、ＡＮＧ、ＣＨＣＨＤ１０、ＳＱＳＴＭ１、及びＴＢＫ１から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．２８９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ９７Ａｓｎ）
ＮＭ＿００７１２６．３（ＶＣＰ）：ｃ．１７７４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ５９２Ａｓｎ）
ＮＭ＿００７１２６．３（ＶＣＰ）：ｃ．４６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１５５Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００７１２６．３（ＶＣＰ）：ｃ．５７２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１９１Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０１３４４４．３（ＵＢＱＬＮ２）：ｃ．１４８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ４９７Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０１３４４４．３（ＵＢＱＬＮ２）：ｃ．１５２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ５０９Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０１３４４４．３（ＵＢＱＬＮ２）：ｃ．１５７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ５２５Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０１３４４４．３（ＵＢＱＬＮ２）：ｃ．１４９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ４９７Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００５２３５．２（ＥＲＢＢ４）：ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ９２７Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００５２３５．２（ＥＲＢＢ４）：ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２７５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０３１１５７．３（ＨＮＲＮＰＡ１）：ｃ．９４０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ３１４Ａｓｎ）
ＮＭ＿００６０００．２（ＴＵＢＡ４Ａ）：ｃ．６４３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２１５Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００６０００．２（ＴＵＢＡ４Ａ）：ｃ．９５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３２０Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００６０００．２（ＴＵＢＡ４Ａ）：ｃ．９５９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３２０Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００６０００．２（ＴＵＢＡ４Ａ）：ｃ．１２２０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００６０００．２（ＴＵＢＡ４Ａ）：ｃ．１１４７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３８３Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．１１２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３８Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．１２４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４２Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．１２５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４２Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ５Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ５Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．４３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ１４６Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ２２Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．４０４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ１３５Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．４９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１７Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００４５４．４（ＳＯＤ１）：ｃ．２１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ７３Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００７３７５．３（ＴＡＲＤＢＰ）：ｃ．８９２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２９８Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００７３７５．３（ＴＡＲＤＢＰ）：ｃ．９４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３１５Ｔｈｒ）
ＮＭ＿００７３７５．３（ＴＡＲＤＢＰ）：ｃ．８８３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２９５Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００７３７５．３（ＴＡＲＤＢＰ）：ｃ．＊６９７Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７３７５．３（ＴＡＲＤＢＰ）：ｃ．１１４４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３８２Ｔｈｒ）
ＮＭ＿００７３７５．３（ＴＡＲＤＢＰ）：ｃ．８５９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２８７Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０１４８４５．５（ＦＩＧ４）：ｃ．５４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１８３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１００８２１１．１（ＯＰＴＮ）：ｃ．１１９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１５０４６．５（ＳＥＴＸ）：ｃ．６４０７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２１３６Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０１５０４６．５（ＳＥＴＸ）：ｃ．８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ３Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０２５１３７．３（ＳＰＧ１１）：ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２５１３７．３（ＳＰＧ１１）：ｃ．２６７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２５１３７．３（ＳＰＧ１１）：ｃ．５９７４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９９２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．１５５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５１８Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．１５６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５２１Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．１５６２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５２１Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．１５２０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５０７Ａｓｐ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．１４８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．６１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２０６Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００４９６０．３（ＦＵＳ）：ｃ．６４６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２１６Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００４７３８．４（ＶＡＰＢ）：ｃ．１６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ５６Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００４７３８．４（ＶＡＰＢ）：ｃ．１３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４６Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００１１４５．４（ＡＮＧ）：ｃ．１６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５５Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００１１４５．４（ＡＮＧ）：ｃ．１５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ５２Ａｓｎ）
ＮＭ＿００１１４５．４（ＡＮＧ）：ｃ．４０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ１３６Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００１１４５．４（ＡＮＧ）：ｃ．４０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ１３７Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００１３０１３３９．１（ＣＨＣＨＤ１０）：ｃ．２３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ８０Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００１３０１３３９．１（ＣＨＣＨＤ１０）：ｃ．１７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ５９Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００１１４２２９８．１（ＳＱＳＴＭ１）：ｃ．－４７－１９２４Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿００３９００．４（ＳＱＳＴＭ１）：ｃ．１１６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３８７Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００３９００．４（ＳＱＳＴＭ１）：ｃ．１１７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３９２Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０１３２５４．３（ＴＢＫ１）：ｃ．１３４０＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１３２５４．３（ＴＢＫ１）：ｃ．２０８６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ６９６Ｌｙｓ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＳＯＤ１、ＶＣＰ、ＵＢＱＬＮ２、ＥＲＢＢ４、ＨＮＲＮＰＡ１、ＴＵＢＡ４Ａ、ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＩＧ４、ＯＰＴＮ、ＳＥＴＸ、ＳＰＧ１１、ＦＵＳ、ＶＡＰＢ、ＡＮＧ、ＣＨＣＨＤ１０、ＳＱＳＴＭ１、及びＴＢＫ１から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、ＡＬＳを治療または予防するための方法に関する。
統合失調症
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、統合失調症に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＰＲＯＤＨ、ＳＥＴＤ１Ａ、及びＳＨＡＮＫ３から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０１６３３５．４（ＰＲＯＤＨ）：ｃ．１２９２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４３１Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０１６３３５．４（ＰＲＯＤＨ）：ｃ．１３９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４６６Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０１４７１２．２（ＳＥＴＤ１Ａ）：ｃ．２２０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３５１７．１（ＳＨＡＮＫ３）：ｃ．３３４９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１１７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３５１７．１（ＳＨＡＮＫ３）：ｃ．１６０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５３６Ｔｒｐ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＰＲＯＤＨ、ＳＥＴＤ１Ａ、及びＳＨＡＮＫ３から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、統合失調症を治療または予防するための方法に関する。
副腎白質ジストロフィー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、副腎白質ジストロフィーに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＡＢＣＤ１遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．４２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ１４１Ｔｈｒ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．７９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２６６Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１２５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４１８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１５５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５１８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１８５０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ６１７Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１３９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４６６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１５５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５１８Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１６７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ５６０Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１７７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５９１Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１８０２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ６０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．３４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１１６Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．４０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１６６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５５４Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１８２５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ６０９Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１２８８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１７８１－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．５２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３３．３（ＡＢＣＤ１）：ｃ．１８６６－１０Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、少なくともＡＢＣＤ１遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、副腎白質ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
エカルディ・グティエール症候群
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、エカルディ・グティエール症候群に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＴＲＥＸ１、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、ＡＤＡＲ、及びＩＦＩＨ１から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０１６３８１．５（ＴＲＥＸ１）：ｃ．７９４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３６２９．４（ＴＲＥＸ１）：ｃ．５２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ１８Ａｓｎ）
ＮＭ＿０３３６２９．４（ＴＲＥＸ１）：ｃ．４９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２１９３．３（ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ）：ｃ．２０５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６９Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００１１１１．４（ＡＤＡＲ）：ｃ．３０１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１００７Ａｒｇ）
ＮＭ＿０２２１６８．３（ＩＦＩＨ１）：ｃ．２３３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ７７９Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０２２１６８．３（ＩＦＩＨ１）：ｃ．２３３５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７７９Ｃｙｓ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＴＲＥＸ１、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、ＡＤＡＲ、及びＩＦＩＨ１から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、エカルディ・グティエール症候群を治療または予防するための方法に関する。
ファブリー病
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ファブリー病に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＧＬＡ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１０２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１０６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３５６Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１０２５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３４２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．２８１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ９４Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６７７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．７３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．７４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２２０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．７３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ２４４Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．３６９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．３３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１１２Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．４８５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．９１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１０７２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ３５８Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１０８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３６３Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１０８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３６３Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ２０２Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．８３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．９７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．４２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１４１Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．２８５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．７３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６３９＋９１９Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２２７Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．６７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．２４２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ８１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．９０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．９７４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３２５Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．８４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．４６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１６９．２（ＧＬＡ）：ｃ．１１１８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３７３Ａｓｐ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、少なくともＧＬＡ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、ファブリー病を治療または予防するための方法に関する。
レッシュ・ナイハン症候群
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、レッシュ・ナイハン症候群に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＨＰＲＴ１遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００１９４．２（ＨＰＲＴ１）：ｃ．１５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１９４．２（ＨＰＲＴ１）：ｃ．３８４＋１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、少なくともＨＰＲＴ１遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、レッシュ・ナイハン症候群を治療または予防するための方法に関する。
メンケス病
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、メンケス病に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＡＴＰ７Ａ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．６０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２９３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．３０５６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１０１９Ａｓｐ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．５９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２００Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．１２２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．１５４４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．１６３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．１９３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．１９４６＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．１９５０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ６５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２１７９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ７２７Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２１８７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２３８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２４９９－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２５５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ８５２Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．２９５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．３１１２－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．３４６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．３５０２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１６８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．３７６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１２５５Ｇｌｕ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．３９４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１３１５Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．４１２３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５２．６（ＡＴＰ７Ａ）：ｃ．４２２６＋５Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、少なくともＡＴＰ７Ａ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、メンケス病を治療または予防するための方法に関する。
眼疾患
様々な眼疾患、例えば、限定するものではないが、シュタルガルト病、バルデー・ビードル症候群、錐体杆体ジストロフィー、先天停在性夜盲、アッシャー症候群、レーバー先天性黒内障、網膜色素変性、及び色覚に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告されており、表Ａに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するための方法に関する。
シュタルガルト病
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、シュタルガルト病に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＡＢＣＡ４遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４４２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６６４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２２１６Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．５３１２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．５１８９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４３５２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４２５３＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．３８７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．３８１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ１２７１＝）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１２９３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．２０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．３３２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１０８Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１８０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６０２Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１９３７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．２５６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ８５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４２３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４４５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ１４８６Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４５９４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ１５３２Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４９１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１６４０Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．５１９６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６３１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２１０６Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．３０５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１０１９Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１２２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１９０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１９４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６５Ｇｌｕ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．３０８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４１９５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ１３９９Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４６１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１５３７Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６１１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０３８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６１１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６３４２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ２１１４＝）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６６５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２２０Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＡＢＣＡ４遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、シュタルガルト病を治療または予防するための方法に関する。
バルデー・ビードル症候群
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、バルデー・ビードル症候群に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＢＢＳ１、ＢＢＳ２、ＢＢＳ７、ＢＢＳ９、ＢＢＳ１０、ＢＢＳ１２、ＬＺＴＦＬ１、及びＴＲＩＭ３２から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０２４６４９．４（ＢＢＳ１）：ｃ．４１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４６４９．４（ＢＢＳ１）：ｃ．８７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９８４２８．２（ＢＢＳ９）：ｃ．２６３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１１７８００７．１（ＢＢＳ１２）：ｃ．１７０４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５６８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１２７６３７８．１（ＬＺＴＦＬ１）：ｃ．２７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３１８８５．３（ＢＢＳ２）：ｃ．１８６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６２２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９８４２８．２（ＢＢＳ９）：ｃ．１７５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５８７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９８４２８．２（ＢＢＳ９）：ｃ．１７８９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２４６４９．４（ＢＢＳ１）：ｃ．４３２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１７６８２４．２（ＢＢＳ７）：ｃ．６３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ２１１Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０１２２１０．３（ＴＲＩＭ３２）：ｃ．３８８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ１３０Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０３１８８５．３（ＢＢＳ２）：ｃ．８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４６８５．３（ＢＢＳ１０）：ｃ．１４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９Ｔｒｐ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＢＢＳ１、ＢＢＳ２、ＢＢＳ７、ＢＢＳ９、ＢＢＳ１０、ＢＢＳ１２、ＬＺＴＦＬ１、及びＴＲＩＭ３２から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、バルデー・ビードル症候群を治療または予防するための方法に関する。
錐体杆体ジストロフィー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、錐体杆体ジストロフィーに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＲＰＧＲＩＰ１、ＤＲＡＭ２、ＡＢＣＡ４、ＡＤＡＭ９、及びＣＡＣＮＡ１Ｆから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０２０３６６．３（ＲＰＧＲＩＰ１）：ｃ．１５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１７８４５４．５（ＤＲＡＭ２）：ｃ．４９４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１６５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１７８４５４．５（ＤＲＡＭ２）：ｃ．１３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ４４Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．１６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ５４Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．５７１４＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．８８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６０７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｌｅｕ２０２７Ｐｈｅ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．３１１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ１０３８Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２１２Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００３８１６．２（ＡＤＡＭ９）：ｃ．４９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００５１８３．３（ＣＡＣＮＡ１Ｆ）：ｃ．２４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８２Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＲＰＧＲＩＰ１、ＤＲＡＭ２、ＡＢＣＡ４、ＡＤＡＭ９、及びＣＡＣＮＡ１Ｆから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、錐体杆体ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
先天停在性夜盲
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、先天停在性夜盲に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＧＲＭ６、ＴＲＰＭ１、ＧＰＲ１７９、及びＣＡＣＮＡ１Ｆから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００８４３．３（ＧＲＭ６）：ｃ．１４６２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４８８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００２４２０．５（ＴＲＰＭ１）：ｃ．２９９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０００Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１００４３３４．３（ＧＰＲ１７９）：ｃ．６７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００５１８３．３（ＣＡＣＮＡ１Ｆ）：ｃ．２５７６＋１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＧＲＭ６、ＴＲＰＭ１、ＧＰＲ１７９、及びＣＡＣＮＡ１Ｆから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、先天停在性夜盲を治療または予防するための方法に関する。
アッシャー症候群
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、アッシャー症候群に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨ２Ａ、ＡＤＧＲＶ１、ＷＨＲＮ、及びＣＬＲＮ１から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．６４０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２１４Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．１２００＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．１４１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．１５５６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５１９Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．１９００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．１９６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．２０９４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．４２９３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１４３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５１０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１７０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５６１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１８７３Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５６６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ１８８７Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．６０７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．４７０＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５９６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．３７１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１２４０Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．４９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５３９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５６４８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１８８３Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．４４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．７００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．６３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２１２Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．１９９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６６６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００５７０９．３（ＵＳＨ１Ｃ）：ｃ．２１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ７２＝）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．７３６２＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．３４８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．３６２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．５２７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．５７１２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．５７１２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｈｒ１９０４＝）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．５９２３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．６０４９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．７７７６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５９２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．９５５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．３７０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２３６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．４３０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．６０５０－９Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０３３０５６．３（ＰＣＤＨ１５）：ｃ．３３１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３０５６．３（ＰＣＤＨ１５）：ｃ．７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３０５６．３（ＰＣＤＨ１５）：ｃ．１９２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１４２７７２．１（ＰＣＤＨ１５）：ｃ．４００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３０５６．３（ＰＣＤＨ１５）：ｃ．３３５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１２０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１１０４８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１１４３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１１９５４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１２８６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４２９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１４１８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４７２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１４９１１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９７１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．５７８８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．５８５８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．６２２４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２０７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．８２０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２７４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．８９８１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２９９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．９３０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１３０１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４３３７Ｍｅｔ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１４２４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４７５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．６３９８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２１３３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．６３２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．６６０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１３３１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４４３９Ｉｌｅ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．４４０５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．９５７０＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．８７４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９１４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．８６８１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１０００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３３４Ｔｒｐ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１４１７５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４７２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．９３９０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．９０８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３０３Ｈｉｓ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．５７７６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１１１５６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３７１９Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０３２１１９．３（ＡＤＧＲＶ１）：ｃ．２３９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８００Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２１１９．３（ＡＤＧＲＶ１）：ｃ．７４０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２４６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２１１９．３（ＡＤＧＲＶ１）：ｃ．１２６３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４２１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２１１９．３（ＡＤＧＲＶ１）：ｃ．７１２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２３７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３２１１９．３（ＡＤＧＲＶ１）：ｃ．１４８８５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４９６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１５４０４．３（ＷＨＲＮ）：ｃ．１２６７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４２３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１７４８７８．２（ＣＬＲＮ１）：ｃ．６１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０７Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨ２Ａ、ＡＤＧＲＶ１、ＷＨＲＮ、及びＣＬＲＮ１から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、アッシャー増強症候群（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｕｓｈｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を治療または予防するための方法に関する。
レーバー先天性黒内障
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、レーバー先天性黒内障に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＴＵＬＰ１、ＲＰＥ６５、ＳＰＡＴＡ７、ＡＩＰＬ１、ＣＲＢ１、ＮＭＮＡＴ１、及びＰＥＸ１から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００３３２２．５（ＴＵＬＰ１）：ｃ．１４９５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３２９．２（ＲＰＥ６５）：ｃ．１１＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１８４１８．４（ＳＰＡＴＡ７）：ｃ．３２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１４３３６．４（ＡＩＰＬ１）：ｃ．７８４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２６２Ｓｅｒ）
ＮＭ＿２０１２５３．２（ＣＲＢ１）：ｃ．１５７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０１２５３．２（ＣＲＢ１）：ｃ．３３０７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１１０３Ａｒｇ）
ＮＭ＿２０１２５３．２（ＣＲＢ１）：ｃ．２８４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ９４８Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０２２７８７．３（ＮＭＮＡＴ１）：ｃ．７６９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ２５７Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００４６６．２（ＰＥＸ１）：ｃ．２５２８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ８４３Ａｓｐ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＴＵＬＰ１、ＲＰＥ６５、ＳＰＡＴＡ７、ＡＩＰＬ１、ＣＲＢ１、ＮＭＮＡＴ１、及びＰＥＸ１から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、レーバー先天性黒内障を治療または予防するための方法に関する。
網膜色素変性
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、網膜色素変性に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＣＲＢ１、ＩＦＴ１４０、ＲＰ１、ＩＭＰＤＨ１、ＰＲＰＦ３１、ＲＰＧＲ、ＡＢＣＡ４、ＲＰＥ６５、ＥＹＳ、ＮＲＬ、ＦＡＭ１６１Ａ、ＮＲ２Ｅ３、ＵＳＨ２Ａ、ＲＨＯ、ＰＤＥ６Ｂ、ＫＬＨＬ７、ＰＤＥ６Ａ、ＣＮＧＢ１、ＢＥＳＴ１、Ｃ２ｏｒｆ７１、ＰＲＰＨ２、ＣＡ４、ＣＥＲＫＬ、ＲＰＥ６５、ＰＤＥ６Ｂ、及びＡＤＧＲＶ１から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００１２５７９６５．１（ＣＲＢ１）：ｃ．２７１１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ９０４Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０１４７１４．３（ＩＦＴ１４０）：ｃ．３８２７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１２７６Ｇｌｕ）
ＮＭ＿００６２６９．１（ＲＰ１）：ｃ．２０２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００８８３．３（ＩＭＰＤＨ１）：ｃ．９３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ３１１Ａｓｎ）
ＮＭ＿０１５６２９．３（ＰＲＰＦ３１）：ｃ．１２７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１５６２９．３（ＰＲＰＦ３１）：ｃ．１０７３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００３２８．２（ＲＰＧＲ）：ｃ．１３８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．４５７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１５２６Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００３５０．２（ＡＢＣＡ４）：ｃ．６２２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０７７Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００３２９．２（ＲＰＥ６５）：ｃ．２７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９１Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００１１４２８００．１（ＥＹＳ）：ｃ．２１９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１４２８００．１（ＥＹＳ）：ｃ．４９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００６１７７．３（ＮＲＬ）：ｃ．１５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ５１Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００１２０１５４３．１（ＦＡＭ１６１Ａ）：ｃ．１５６７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５２３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１４２４９．３（ＮＲ２Ｅ３）：ｃ．１６６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５６Ａｒｇ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．２２０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１４８０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）：ｃ．１００７３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ３３５８Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００５３９．３（ＲＨＯ）：ｃ．５４１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ１８１Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００２８３．３（ＰＤＥ６Ｂ）：ｃ．８９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１０３１７１０．２（ＫＬＨＬ７）：ｃ．４５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ１５３Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００４４０．２（ＰＤＥ６Ａ）：ｃ．１９２６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１２９７．４（ＣＮＧＢ１）：ｃ．２１２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１２９７．４（ＣＮＧＢ１）：ｃ．９５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４１８３．３（ＢＥＳＴ１）：ｃ．６８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ２２８Ａｓｎ）
ＮＭ＿００１０２９８８３．２（Ｃ２ｏｒｆ７１）：ｃ．１８２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３２２．４（ＰＲＰＨ２）：ｃ．６４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２１６Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００７１７．４（ＣＡ４）：ｃ．４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４Ｔｒｐ）
ＮＭ＿２０１５４８．４（ＣＥＲＫＬ）：ｃ．７６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３２９．２（ＲＰＥ６５）：ｃ．１１８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４０Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００３２２．４（ＰＲＰＨ２）：ｃ．４９９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１６７Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００５３９．３（ＲＨＯ）：ｃ．４０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２８３．３（ＰＤＥ６Ｂ）：ｃ．２１９３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０３２１１９．３（ＡＤＧＲＶ１）：ｃ．６９０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３０１Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＣＲＢ１、ＩＦＴ１４０、ＲＰ１、ＩＭＰＤＨ１、ＰＲＰＦ３１、ＲＰＧＲ、ＡＢＣＡ４、ＲＰＥ６５、ＥＹＳ、ＮＲＬ、ＦＡＭ１６１Ａ、ＮＲ２Ｅ３、ＵＳＨ２Ａ、ＲＨＯ、ＰＤＥ６Ｂ、ＫＬＨＬ７、ＰＤＥ６Ａ、ＣＮＧＢ１、ＢＥＳＴ１、Ｃ２ｏｒｆ７１、ＰＲＰＨ２、ＣＡ４、ＣＥＲＫＬ、ＲＰＥ６５、ＰＤＥ６Ｂ、及びＡＤＧＲＶ１から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、網膜色素変性を治療または予防するための方法に関する。
色覚
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、色覚に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、及びＡＴＦ６から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００１２９８．２（ＣＮＧＡ３）：ｃ．８４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２８３Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００１２９８．２（ＣＮＧＡ３）：ｃ．１０１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１２９８．２（ＣＮＧＡ３）：ｃ．１５８５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ５２９Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０１９０９８．４（ＣＮＧＢ３）：ｃ．１５７８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１９０９８．４（ＣＮＧＢ３）：ｃ．６０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１９０９８．４（ＣＮＧＢ３）：ｃ．１１１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７３４８．３（ＡＴＦ６）：ｃ．９７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３２４Ｃｙｓ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、及びＡＴＦ６から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、色覚を治療または予防するための方法に関する。
聴覚に影響を及ぼす疾患
聴覚に影響を及ぼす様々な疾患、例えば、限定するものではないが、難聴及び非症候性難聴に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告されており、表Ａに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するための方法に関する。
難聴
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、難聴に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＦＧＦ３、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＣ、ＡＣＴＧ１、ＳＬＣ１７Ａ８、ＴＭＣ１、ＧＪＢ２、ＭＹＨ１４、ＣＯＣＨ、ＣＤＨ２３、ＵＳＨ１Ｃ、ＧＪＢ２、ＭＹＯ７Ａ、ＰＣＤＨ１５、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＷＨＲＮ、ＤＦＮＢ５９、ＴＭＣ１、ＬＯＸＨＤ１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＯＴＯＧＬ、ＯＴＯＦ、ＪＡＧ１、及びＭＡＲＶＥＬＤ２から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００５２４７．２（ＦＧＦ３）：ｃ．２８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．６５２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ２１８Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．６８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２３０Ｖａｌ）
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．４０５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１６１４．３（ＡＣＴＧ１）：ｃ．７２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ２４１Ｌｙｓ）
ＮＭ＿１３９３１９．２（ＳＬＣ１７Ａ８）：ｃ．６３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２１１Ｖａｌ）
ＮＭ＿１３８６９１．２（ＴＭＣ１）：ｃ．１７１４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ５７２Ａｓｎ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．５９８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２００Ａｒｇ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．７１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．４１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ１３９Ａｓｎ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２２４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ７５Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．９５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３２Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２５０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ８４Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．４２８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１４３Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．５５１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１８４Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０２４７２９．３（ＭＹＨ１４）：ｃ．３５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ１２０Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００４０８６．２（ＣＯＣＨ）：ｃ．１５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ５１Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０２２１２４．５（ＣＤＨ２３）：ｃ．４０２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ１３４１Ａｓｎ）
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．４７０１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１５３６７６．３（ＵＳＨ１Ｃ）：ｃ．４９６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．１３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２８３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ９５Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｈｉｓ１００Ｔｙｒ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．４２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４３Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．１０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ３７Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．－２３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．１４８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ５０Ａｓｎ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．１３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４５Ｇｌｕ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．３７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．２３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．５８９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２６０．３（ＭＹＯ７Ａ）：ｃ．２００５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３０５６．３（ＰＣＤＨ１５）：ｃ．７３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．３８６６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．６１７８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．８７１４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１７４３３．４（ＭＹＯ３Ａ）：ｃ．２５０６－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１５４０４．３（ＷＨＲＮ）：ｃ．１４１７－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１０４２７０２．３（ＤＦＮＢ５９）：ｃ．４９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９１．２（ＴＭＣ１）：ｃ．１００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９１．２（ＴＭＣ１）：ｃ．１１６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１４４６１２．６（ＬＯＸＨＤ１）：ｃ．２００８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１４４６１２．６（ＬＯＸＨＤ１）：ｃ．４７１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１４４６１２．６（ＬＯＸＨＤ１）：ｃ．４４８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４０２２．２（ＴＭＰＲＳＳ３）：ｃ．３２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０９Ｔｒｐ）
ＮＭ＿１７３５９１．３（ＯＴＯＧＬ）：ｃ．３０７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９４２４８．２（ＯＴＯＦ）：ｃ．４４８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９４２４８．２（ＯＴＯＦ）：ｃ．２１２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７０８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９４２４８．２（ＯＴＯＦ）：ｃ．２４８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１０３８６０３．２（ＭＡＲＶＥＬＤ２）：ｃ．１４９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５００Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＦＧＦ３、ＭＹＯ７Ａ、ＳＴＲＣ、ＡＣＴＧ１、ＳＬＣ１７Ａ８、ＴＭＣ１、ＧＪＢ２、ＭＹＨ１４、ＣＯＣＨ、ＣＤＨ２３、ＵＳＨ１Ｃ、ＧＪＢ２、ＭＹＯ７Ａ、ＰＣＤＨ１５、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＷＨＲＮ、ＤＦＮＢ５９、ＴＭＣ１、ＬＯＸＨＤ１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＯＴＯＧＬ、ＯＴＯＦ、ＪＡＧ１、及びＭＡＲＶＥＬＤ２から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、難聴を治療または予防するための方法に関する。
非症候性難聴
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、非症候性難聴に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＧＪＢ２、ＰＯＵ３Ｆ４、ＭＹＯ１５Ａ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＬＯＸＨＤ１、ＯＴＯＦ、ＭＹＯ６、ＯＴＯＡ、ＳＴＲＣ、ＴＲＩＯＢＰ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＴＭＣ１、ＴＥＣＴＡ、ＯＴＯＧＬ、及びＧＩＰＣ３から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００４００４．５（ＧＪＢ２）：ｃ．１６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３０７．４（ＰＯＵ３Ｆ４）：ｃ．４９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．８７６７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９２３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４０２２．２（ＴＭＰＲＳＳ３）：ｃ．３２３－６Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２４０２２．２（ＴＭＰＲＳＳ３）：ｃ．９１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３０６Ｔｈｒ）
ＮＭ＿１４４６１２．６（ＬＯＸＨＤ１）：ｃ．２４９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８３３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９４２４８．２（ＯＴＯＦ）：ｃ．２１５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９４２４８．２（ＯＴＯＦ）：ｃ．２８１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１９４２４８．２（ＯＴＯＦ）：ｃ．４７９９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４９９９．３（ＭＹＯ６）：ｃ．８２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１４４６７２．３（ＯＴＯＡ）：ｃ．１８８０＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．５１８８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１７３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．３６７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．４４０２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４６８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４０２２．２（ＴＭＰＲＳＳ３）：ｃ．１１９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１０３９１４１．２（ＴＲＩＯＢＰ）：ｃ．６５９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２２００Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．７８９３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．５５３１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．６０４６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１４４６１２．６（ＬＯＸＨＤ１）：ｃ．３１６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１０３８６０３．２（ＭＡＲＶＥＬＤ２）：ｃ．１３３１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９１．２（ＴＭＣ１）：ｃ．１６７６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９１．２（ＴＭＣ１）：ｃ．１６７７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００５４２２．２（ＴＥＣＴＡ）：ｃ．５９７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１７３５９１．３（ＯＴＯＧＬ）：ｃ．４９８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．３４９３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１６５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１５３７００．２（ＳＴＲＣ）：ｃ．３２１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１６２３９．３（ＭＹＯ１５Ａ）：ｃ．５８９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９６６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３３２６１．２（ＧＩＰＣ３）：ｃ．４１１＋１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＧＪＢ２、ＰＯＵ３Ｆ４、ＭＹＯ１５Ａ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＬＯＸＨＤ１、ＯＴＯＦ、ＭＹＯ６、ＯＴＯＡ、ＳＴＲＣ、ＴＲＩＯＢＰ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＴＭＣ１、ＴＥＣＴＡ、ＯＴＯＧＬ、及びＧＩＰＣ３から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、非症候性難聴を治療または予防するための方法に関する。
血液疾患
様々な血液疾患、例えば、限定するものではないが、ベータ－サラセミア、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、及びウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告されており、表Ａに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するための方法に関する。
ベータ－サラセミア
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ベータ－サラセミアに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＨＢＢ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．－１３７Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．－５０－８８Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．－１４０Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．３１６－１９７Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．９３－２１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．１１４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．９２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．３１５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．９２＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５１８．４（ＨＢＢ）：ｃ．－５０－１０１Ｃ＞Ｔ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＨＢＢ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、ベータ－サラセミアを治療または予防するための方法に関する。
血友病Ａ
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、血友病Ａに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＦ８遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００１３２．３（Ｆ８）：ｃ．３１６９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ１０５７Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００１３２．３（Ｆ８）：ｃ．９０２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３０１Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００１３２．３（Ｆ８）：ｃ．１８３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６１２Ｃｙｓ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、Ｆ８遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、血友病Ａを治療または予防するための方法に関する。
血友病Ｂ
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、血友病Ｂに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＦ９遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００１３３．３（Ｆ９）：ｃ．８３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ２７９Ｔｈｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、Ｆ９遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、血友病Ｂを治療または予防するための方法に関する。
血友病Ｃ
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、血友病Ｃに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＦ１１遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００１２８．３（Ｆ１１）：ｃ．４００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１２８．３（Ｆ１１）：ｃ．１４３２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４７８Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００１２８．３（Ｆ１１）：ｃ．１２８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ４３０Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００１２８．３（Ｆ１１）：ｃ．３２６－１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、Ｆ１１遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、血友病Ｃを治療または予防するための方法に関する。
ウィスコット・アルドリッチ症候群
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＷＡＳ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００３７７．２（ＷＡＳ）：ｃ．３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００３７７．２（ＷＡＳ）：ｃ．２５７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ８６Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００３７７．２（ＷＡＳ）：ｃ．７７７＋１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＷＡＳ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、ウィスコット・アルドリッチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
肝疾患
様々な肝疾患、例えば、限定するものではないが、トランスサイレチンアミロイドーシス、α１－アンチトリプシン欠乏症、ウィルソン病、及びフェニルケトン尿症に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告されており、表Ａに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するための方法に関する。
トランスサイレチンアミロイドーシス
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、トランスサイレチンアミロイドーシスに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＴＴＲ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００３７１．３（ＴＴＲ）：ｃ．４２４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ１４２Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００３７１．３（ＴＴＲ）：ｃ．１４８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ５０Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００３７１．３（ＴＴＲ）：ｃ．１１８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ４０Ｉｌｅ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＴＴＲ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、トランスサイレチンアミロイドーシスを治療または予防するための方法に関する。
α１－アンチトリプシン欠乏症
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、α１－アンチトリプシン欠乏症に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００２９５．４（ＳＥＲＰＩＮＡ１）：ｃ．５３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１２７７０１．１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）：ｃ．１１７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３９３Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００１１２７７０１．１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）：ｃ．２３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ７７Ｐｈｅ）
ＮＭ＿００１１２７７０１．１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）：ｃ．１０９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ３６６Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００２９５．４（ＳＥＲＰＩＮＡ１）：ｃ．１１７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３９３Ｓｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、α１－アンチトリプシン欠乏症を治療または予防するための方法に関する。
ウィルソン病
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ウィルソン病に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＡＴＰ７Ｂ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２２９３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ７６５Ａｓｎ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．３９５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２８６５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．３７９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１２６６Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２６２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ８７４Ｖａｌ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２０７１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６９１Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２１２８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ７１０Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２３３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７７９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．４０２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１３４１Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．３１８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１０６１Ｇｌｕ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．４１１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．１７０８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．８６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２９３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ９７７Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．３６５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１２２０Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２６０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ８６９Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２９７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ９９２Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２５１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ８４０Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００５３．３（ＡＴＰ７Ｂ）：ｃ．２９０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ９６９Ｇｌｎ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、ウィルソン病を治療または予防するための方法に関する。
フェニルケトン尿症
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、フェニルケトン尿症に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＰＡＨ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１３１５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１２２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４０８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．８３８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ２８０Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．３３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２６１Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２５２Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．４７３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１５８Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．８４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２８１Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７２８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２４３Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１０６６－１１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１２２３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４０８Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１１６２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ３８８Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１０６６－３Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１２０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ４０３Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．８９０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２９７Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．９２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ３０９Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．４４１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．５２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．６８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ２３０Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４１Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｌｅｕ２４９Ｐｈｅ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．４４２－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．８４２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２５９Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１２００－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．９１２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．１０６５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．４７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．７５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２５２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２７７．１（ＰＡＨ）：ｃ．８０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２７０Ｌｙｓ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＰＡＨ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、フェニルケトン尿症を治療または予防するための方法に関する。
腎疾患
様々な腎疾患、例えば、限定するものではないが、常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患及び腎カルニチン輸送欠乏症に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告されており、表Ａに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するための方法に関する。
常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＰＫＨＤ１遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１０４４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３４８２Ｃｙｓ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．９３１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１０７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１４８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．７０７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１４８６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．８３０３－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．２８５４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ９５２Ａｒｇ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．７１９４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２３９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１０２１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３４０７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ３６Ｍｅｔ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．８８２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．９８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３２８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．４８７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６２４Ｔｒｐ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１６０２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．１６９４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．２３４１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７８１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．２４０７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．２４５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．５２３６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．６４９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．２７２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．３７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１３８６９４．３（ＰＫＨＤ１）：ｃ．２８１０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ９３７Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＰＫＨＤ１遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患を治療または予防するための方法に関する。
腎カルニチン輸送欠乏症
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、腎カルニチン輸送欠乏症に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＳＬＣ２２Ａ５遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．７６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．３９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．８４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．５０５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６９Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．１３１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４４０Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．１１９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３９９Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．６９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ２３２Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．８４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２８２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．１１９３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３９８Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．１４６３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４８８Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．３３８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１１３Ｔｙｒ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．１３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ４６Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００３０６０．３（ＳＬＣ２２Ａ５）：ｃ．５０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１６９Ｇｌｎ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＳＬＣ２２Ａ５遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、腎カルニチン輸送欠乏症を治療または予防するための方法に関する。
筋疾患
様々な筋疾患、例えば、限定するものではないが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリー・ドレーフス型筋ジストロフィー、及び顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーに関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告されており、表Ａに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するための方法に関する。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＤＭＤ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２７９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９３３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４８７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５５５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３１８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１０６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８３５７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２７８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７８１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７７５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５９１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５６４１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８８１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５１３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４２４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４１４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３４２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２４０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８０３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２３６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１６８３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１６６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１３８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１３３１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１３２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５５０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８３６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１５０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５０３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６７８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１５９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１１５０－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．６２２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２０７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３７４７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１２４９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２８６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ９５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９５６３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４４８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４３１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８２０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２７３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４０７１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２６６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２２０２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２０７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１６５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８９１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．６１１８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４７２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５７７Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＤＭＤ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
ベッカー型筋ジストロフィー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ベッカー型筋ジストロフィーに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＤＭＤ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３４１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１１３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３５８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０１０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３３７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．６３７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９５６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８７１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９０５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１６１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３１５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３４３２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５２８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１７６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５５３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１８４４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８６０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２８７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８６５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８９４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５８９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１００３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３３４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１００８６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４０１９．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０２０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｈｒ３４０＝）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１２６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１４６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１９９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２０３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６７８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２３３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７７８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２４１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８０７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２６５０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８８４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２８０４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３２７６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３２９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０９９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３５８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４１１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．６４９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．６９０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２３０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７１８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７３０９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７６５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２５５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７６８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７６８３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．７８９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２６３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９３６１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９５６４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２９５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３１＋３６９４７Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０２７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３４２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０１７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３３９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９３３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１１３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．８０３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２６８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１８１２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０９３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３６５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１７０４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１９１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５８６８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１９５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．５０８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．２５１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．１０４７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３４９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．９３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．４１７４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３９２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００４００６．２（ＤＭＤ）：ｃ．３９４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３１４Ｔｅｒ）表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＤＭＤ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、ベッカー型筋ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
肢帯型筋ジストロフィー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、肢帯型筋ジストロフィーに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＳＧＣＢ、ＭＹＯＴ、ＬＭＮＡ、ＣＡＰＮ３、ＤＹＳＦ、ＳＧＣＡ、ＴＴＮ、ＡＮＯ５、ＴＲＡＰＰＣ１１、ＬＭＮＡ、ＰＯＭＴ１、及びＦＫＲＰから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００２３２．４（ＳＧＣＢ）：ｃ．３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００６７９０．２（ＭＹＯＴ）：ｃ．１６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ５５Ｐｈｅ）
ＮＭ＿００６７９０．２（ＭＹＯＴ）：ｃ．１７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ５７Ｉｌｅ）
ＮＭ＿１７０７０７．３（ＬＭＮＡ）：ｃ．１４８８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１７０７０７．３（ＬＭＮＡ）：ｃ．１６０９－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１７１５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５７２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．２２４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ７４８Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４４０Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４４８Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１４６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４８９Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１７１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５７２Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．２３０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ７６９Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ４５Ｔｈｒ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．４９９－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．４３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１０６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３５５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１２５０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ４１７Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．２４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ８２Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．２２４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７４８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４４０Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３３３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４４５Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１９５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１８０１－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．２２６３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．９５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３１９Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１４６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９０Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．８０２－９Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４４８Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１３０３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ４３５Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００００７０．２（ＣＡＰＮ３）：ｃ．１９９３－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．３１１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１０３８Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．５１７４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．１５９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．２９２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９７７Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．４２８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４２８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．１５７７－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５５２９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１８４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．１５７６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．４４６２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４８８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５４２９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１８１０Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５０７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６９３Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００１１３０９７８．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．１８１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６０５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．３２３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１０７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．２６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．４４３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１４７８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．３４７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１６０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．１３７２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ４５８Ａｒｇ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．４０９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．２４０９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．１７０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．１９５６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ６５２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９８７．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．５００４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．３３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１１３０９７８．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．５７７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１９２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．６１２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０４２Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．２６４３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．４２５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１４１８Ａｓｐ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．６１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２０４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．１８３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５６６８－７Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１１３０９７８．１（ＤＹＳＦ）：ｃ．３１３７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１０４６Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．１０５３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．１３９８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．１４８１－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．２３１１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７７１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．２８６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．４７５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５５０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ１８３７Ａｓｎ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５６４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５９４６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．９３７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５２６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．３８３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２７８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．５５２５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００３４９４．３（ＤＹＳＦ）：ｃ．３１１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．２９３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ９８Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．８５０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２８４Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．４０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．４０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ１３７Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．７４７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．２２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７７Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．１０１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３４Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００００２３．３（ＳＧＣＡ）：ｃ．７３９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ２４７Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００１２５６８５０．１（ＴＴＮ）：ｃ．８７３９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９１３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．７６２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．１２１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．１６３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．１４０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．１２１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４０４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．２２７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７５８Ｃｙｓ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．４１－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．１７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５８Ｔｒｐ）
ＮＭ＿２１３５９９．２（ＡＮＯ５）：ｃ．１８９８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０２１９４２．５（ＴＲＡＰＰＣ１１）：ｃ．１２８７＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿１７０７０７．３（ＬＭＮＡ）：ｃ．１６０８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７１７１．３（ＰＯＭＴ１）：ｃ．１８６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６２２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０２４３０１．４（ＦＫＲＰ）：ｃ．３１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０５Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＳＧＣＢ、ＭＹＯＴ、ＬＭＮＡ、ＣＡＰＮ３、ＤＹＳＦ、ＳＧＣＡ、ＴＴＮ、ＡＮＯ５、ＴＲＡＰＰＣ１１、ＬＭＮＡ、ＰＯＭＴ１、及びＦＫＲＰから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、肢帯型筋ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィーに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＥＭＤまたはＳＹＮＥ１遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００１１７．２（ＥＭＤ）：ｃ．３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｍｅｔ１Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０３３０７１．３（ＳＹＮＥ１）：ｃ．１１９０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３９７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０３３０７１．３（ＳＹＮＥ１）：ｃ．２１７２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７２４１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１１７．２（ＥＭＤ）：ｃ．１３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４４Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＥＭＤまたはＳＹＮＥ１遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＳＭＣＨＤ１遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０１５２９５．２（ＳＭＣＨＤ１）：ｃ．３８０１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０１５２９５．２（ＳＭＣＨＤ１）：ｃ．１８４３－１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＳＭＣＨＤ１遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
先天性代謝異常症（ＩＥＭ）
様々なＩＥＭ、例えば、限定するものではないが、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症、及びメープルシロップ尿症に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告されており、表Ａに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するための方法に関する。
原発性高シュウ酸尿症Ｉ型
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＡＧＸＴ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．２４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ８２Ｇｌｕ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．６９８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２３３Ｈｉｓ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．４６６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１５６Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．１０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３６Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．３４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１１６Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．５６８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１９０Ａｒｇ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．６５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ２１８Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．７３７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．１０４９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３５０Ａｓｐ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．４７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ１５８Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．９０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．９９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００３０．２（ＡＧＸＴ）：ｃ．５０８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１７０Ａｒｇ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＡＧＸＴ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型を治療または予防するための方法に関する。
アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＡＳＬ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００１０２４９４３．１（ＡＳＬ）：ｃ．１１５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３８５Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．５３２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ１７８Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．５４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１８２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．１７５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ５９Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．７１８＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．８８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９７Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．１３６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．１０６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．４４６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．５４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００４８．３（ＡＳＬ）：ｃ．１１３５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３７９Ｃｙｓ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＡＳＬ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症を治療または予防するための方法に関する。
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＯＴＣ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００５３１．５（ＯＴＣ）：ｃ．１１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４０Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００５３１．５（ＯＴＣ）：ｃ．４２２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１４１Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００５３１．５（ＯＴＣ）：ｃ．８２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２７７Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００５３１．５（ＯＴＣ）：ｃ．６７４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２２５Ｌｅｕ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＯＴＣ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症を治療または予防するための方法に関する。
メープルシロップ尿症
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、メープルシロップ尿症に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＤＢＴ、及びＤＬＤから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．４７６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１５９Ｇｌｎ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｍｅｔ１Ｉｌｅ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．５５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ１８５Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００１９１８．３（ＤＢＴ）：ｃ．１０３３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３４５Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．９４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．７９３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２６５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．８６８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２９０Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００１０８．４（ＤＬＤ）：ｃ．１１２３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ３７５Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．１２３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ４１２Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．２８８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．９７９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ３２７Ｌｙｓ）
ＮＭ＿００１９１８．３（ＤＢＴ）：ｃ．９０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３０１Ｃｙｓ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．５０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１７０Ｈｉｓ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．７９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．８５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．９７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿１８３０５０．３（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．８３２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２７８Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．１０３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３４６Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．２８８＋９Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．６３２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ２１１Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．６５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２２０Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００７０９．３（ＢＣＫＤＨＡ）：ｃ．９６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１９１８．３（ＤＢＴ）：ｃ．１２９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１９１８．３（ＤＢＴ）：ｃ．２５１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ８４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００１９１８．３（ＤＢＴ）：ｃ．８７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５６．４（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．１０１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ３３９Ｌｅｕ）
ＮＭ＿００００５６．４（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．３４４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５６．４（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．６３３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５６．４（ＢＣＫＤＨＢ）：ｃ．９５２－１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＤＢＴ、及びＤＬＤから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、メープルシロップ尿症を治療または予防するための方法に関する。
がん関連疾患
様々ながん及びがん関連疾患、例えば、限定するものではないが、乳癌卵巣癌及びリンチ症候群に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告されており、表Ａに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するための方法に関する。
乳癌卵巣癌
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、乳癌卵巣癌に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５０９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６９９Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７５５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２５２０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２５７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３６０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２０３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５５０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１８３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２０５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６８７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４６７５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５２５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１７５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５４４４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１８１５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３１８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１２８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２７４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６９５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２３１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１６８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２５９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．７８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５５４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８４８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４５７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４２７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４２２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４０６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３６７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１９１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．９６３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．７１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０６６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３０５２Ｔｒｐ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３９９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４０９７－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１０５９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１１１５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１１３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１６１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１６２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５４１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１６３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５４４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１９６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２２７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２４１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８０４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２８６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２９２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３２６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３４３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１４４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３５４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４０７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４２０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４３９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４５５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５０５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１６８５Ｉｌｅ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５２３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５２６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５３３５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７７９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５３４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５５１１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１８３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５５３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．９４９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．９２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１７０６Ｇｌｕ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４３２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１４４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１４７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１５７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２６８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２７６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３８９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２９９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４３３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４３７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５４４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１８１５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５５１０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１８３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５３４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１１１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１９９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６６７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４１８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４８１０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６０４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．８５０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１０５８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ４４Ｔｙｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１６００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３２８６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０９６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３４０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４２５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４２０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４６０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１５４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５４３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２４１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３３３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３９６７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３２３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５０５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１９４－１２Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５２１２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１７３８Ａｒｇ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５３３２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１４８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２５６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１０６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３７１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３８１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３９３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３１３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４３５７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５０７４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５２７７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２３３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３５９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２００Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３８４１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２８１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４２２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４０８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４５２４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１５０８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５３５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．９６２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２２０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２７１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９０５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．２８００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４６１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．３３５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４８３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４５２３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１５０８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．５１３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１７１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．１１５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００７２９４．３（ＢＲＣＡ１）：ｃ．４９８７－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９５７３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１９４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６４９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２５４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２９０５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９６９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４６８９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１５６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４９７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１１８４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２１３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７１３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３２１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３５２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４７８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５８００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６４７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１６０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７０３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７４９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４９９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７５０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７８８７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８９１０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２９７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９７３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７９６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２６５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８６９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８９９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８８６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１１１７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３７３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１８２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２４５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２８８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３２６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３２８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３４４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１４８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３８７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４５２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４７５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５３４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５４０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５７７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５９９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６４６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７２６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７３０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７４７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７６８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７７３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７８８６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８１４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２７１４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８３６３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２７８８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８５７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８７７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８８２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９４１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９４６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９５７２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８４９０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２８３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５９８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７７２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５７４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７６１８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８４８９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２８３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７８５７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１２６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１４５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３３１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１０７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５７９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６０７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２０２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７０２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８３６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２７８８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７７５８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２２２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５１０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５９５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９８７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７０６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９８８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１４１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４７２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１６８９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５８１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６４９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７８５６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８９７０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２９９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１１８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２８１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２９７９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ９９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３１６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４２８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６０２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２００９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７８７７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３１０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４２２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４０８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７４８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７８７８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９０７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１８５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４１１１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３７１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．５６５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７７５７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２５８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８２４３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２７４８Ａｓｐ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８８７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９６０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８４８７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８６７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２５０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６１２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２０４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７６１７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８５７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８１７４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２７２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３１８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９３８１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３１２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２０９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６９９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．１６４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５４８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８６０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．３４１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．４２４６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４１６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６４７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７３６６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７５１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．８９６９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２９９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．６４８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１６３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．２９７８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ９９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．７６１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００００５９．３（ＢＲＣＡ２）：ｃ．９１０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０３６Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、乳癌卵巣癌を治療または予防するための方法に関する。
リンチ症候群
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、リンチ症候群に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＭＳＨ６、ＭＳＨ２、ＥＰＣＡＭ、ＰＭＳ２、及びＭＬＨ１から選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．１０４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３４９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１３８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００２３５４．２（ＥＰＣＡＭ）：ｃ．１３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００２３５４．２（ＥＰＣＡＭ）：ｃ．４２９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００２３５４．２（ＥＰＣＡＭ）：ｃ．５２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２６８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．３５０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１１７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２７３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ９１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３５５６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．３８８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．１９１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．１８９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．４５４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１０３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３４４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２３３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２１９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２７６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９２２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２８１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３０２０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１００７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３４３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１１４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３６４７－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３７７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３８３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．７０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．７３０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１１７１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１１９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１２２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１２７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１５２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１６０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１６１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１６１４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１６２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１６８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１７３１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１７３１＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１７３２－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１８９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ６３２＝）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９８９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９９０－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９９８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ６６６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２０８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２１０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２１３６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２２２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ７７Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．４３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．４４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．５４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１８２Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．７３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２４４Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．８４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２８１Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．８８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｌｅｕ２９４＝）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．９０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１０１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ３３８Ｇｌｕ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１０３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１１２９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３７７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１１８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１１８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１２０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１２７６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１５２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１５５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１７２０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５７４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１７７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１８８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２０８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６９６Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２２５１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ７５１Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２２９１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２２９２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２４４６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８１６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２４７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２５３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２５８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２６３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ８７８＝）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２６３５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８７９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．４７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．４７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．４８４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１６２Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．４９０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１６４Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．５４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１８３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．５７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．６４３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．６４５＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．６５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．７５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２５２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．７９２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．９４２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｎ３１４＝）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．９４９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３１７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．３０６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．６２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｌａ２１Ｖａｌ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１８６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６２２Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．４２６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．７１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．３５０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ１１７Ｍｅｔ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１９１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｈｉｓ６３９Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２７８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ４４Ｐｈｅ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１２１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．３０６＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１８０１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．１１４４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１９８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．３８１－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．６３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．７９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．３６６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１００Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３０１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１００５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．６９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．７４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１０３９－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１７９０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６５４Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２１０３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２１３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．５８８＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．７９０＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１０３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３４５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１２５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２６５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．５０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．８６２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２８８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．８９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．９７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．４００１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１３３４Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１６６２－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．１８８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６２８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．２１７４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．２４０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３９９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３３１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２５０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．７１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１０３８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｎ３４６＝）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２４５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ８２Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２８Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．８８４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ２９５Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．９８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３２８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１０４６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３４９Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１１２０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３７４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１２８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１４７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２１５２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７１８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．７０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２１４１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７１４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１００９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１２１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４０６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３２０２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０６８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１１６５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９４３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６４８Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２００Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６７Ｇｌｕ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．７９３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２６５Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２０５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６８７Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．６７７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ２２６Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．２０４１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ６８１Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６４８Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．６７６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２２６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２０３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．１４８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４９５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２１９４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７３２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．３１０３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０３５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．８９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１４５９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４８７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１７３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ５７７＝）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６５９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２４９．３（ＭＬＨ１）：ｃ．１９９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６７Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１０７６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１１４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３８３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．１８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２１２－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２１３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．６９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２３３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．１２６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４２１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２５１．２（ＭＳＨ２）：ｃ．２０４７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６８３Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．４００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１３４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．１９２７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６４３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．１４４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１７９．２（ＭＳＨ６）：ｃ．２７３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ９１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００５３５．６（ＰＭＳ２）：ｃ．９４３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１５Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＤＢＴ、及びＤＬＤから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、リンチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
他の遺伝性疾患
様々な遺伝性疾患、例えば、限定するものではないが、マルファン症候群、ハーラー症候群、糖原病、及び嚢胞性線維症に関連する病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースに報告されており、表Ａに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するための方法に関する。
マルファン症候群
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、マルファン症候群に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＦＢＮ１遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１８７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６２７Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１０５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６２Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．２８５５－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３１６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１０５５Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３６８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１２３Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４９５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１６５２Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．７１８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２３９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．８２６７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２７５６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１４９６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ４９９Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６８８６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２９６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３３７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６４０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２１４Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．５０３８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１６８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４３４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１４５Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．２５６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．７４６６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ２４８９Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．２０８９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６９７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．５９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６６９５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ２２３２Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６１６４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．５６２７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１８７６Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４０６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１３５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１９８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ６６１Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６７８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４０９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２２Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３２１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ１０７３Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４４６０－８Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４７８６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５９６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．７８０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ２６０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．２４７＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．２４９５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ８３２Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４９３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１６５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．５５０４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１８３５Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．５８６３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１９５５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６６５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２２２０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．７６０６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２５３６Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．７９５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ２６５２Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３０３７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１０１３Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．８０８０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２６９４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１６３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５４５Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．７２０５－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４６２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５４１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１０９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１５８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５２９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４７８１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１５９４Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６４３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２１５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．３６６８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃｙｓ１２２３Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．８３２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２７７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．６３５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｉｌｅ２１１８＝）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１４６８＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１５４６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５１６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．４６１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１５３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．５３６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１７９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１３８．４（ＦＢＮ１）：ｃ．１２８５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ４２９Ｔｅｒ）
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＦＢＮ１遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、マルファン症候群を治療または予防するための方法に関する。
ハーラー症候群
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ハーラー症候群に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、少なくともＩＤＵＡ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．９７２＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．１８５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６１９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．１５２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５１Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．２０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ７０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．１０４５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ３４９Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）：ｃ．１６５０＋５Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＩＤＵＡ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、ハーラー症候群を治療または予防するための方法に関する。
糖原病
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、糖原病に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＧＡＡ、ＡＧＬ、ＰＨＫＢ、ＰＲＫＡＧ２、Ｇ６ＰＣ、ＰＧＡＭ２、ＧＢＥ１、ＰＹＧＭ、及びＰＦＫＭから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１９２７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６４３Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．２１７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７２５Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．３９８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１３２７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．１６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．２０３９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ６８０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００２９３．２（ＰＨＫＢ）：ｃ．１５４６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５１６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０１６２０３．３（ＰＲＫＡＧ２）：ｃ．１５９２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５３１Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００１５１．３（Ｇ６ＰＣ）：ｃ．２４８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ８３Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００１５１．３（Ｇ６ＰＣ）：ｃ．７２４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２４２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１５１．３（Ｇ６ＰＣ）：ｃ．８８３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２９５Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１５１．３（Ｇ６ＰＣ）：ｃ．２４７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８３Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００１５１．３（Ｇ６ＰＣ）：ｃ．１０３９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３４７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１５６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ５２１Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．２５９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．３６８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１２２８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．１１８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．２５６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．２６８１＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００６４２．２（ＡＧＬ）：ｃ．２１５８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００２９０．３（ＰＧＡＭ２）：ｃ．２３３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ７８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１５４８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５１６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．２０１４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ６７２Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．５４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｈｒ１８２＝）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１８０２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ６０１Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１７５４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１０８２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ３６１Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．２５６０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８５４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．６５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２１９Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１９３３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ６４５Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１９７９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ６６０Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．１４６５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｓｐ４８９Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００１５２．４（ＧＡＡ）：ｃ．２５１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００１５８．３（ＧＢＥ１）：ｃ．１５４３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５１５Ｃｙｓ）
ＮＭ＿００５６０９．３（ＰＹＧＭ）：ｃ．１７２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００５６０９．３（ＰＹＧＭ）：ｃ．１８２７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｌｙｓ６０９＝）
ＮＭ＿００５６０９．３（ＰＹＧＭ）：ｃ．１４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿００５６０９．３（ＰＹＧＭ）：ｃ．６１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ２０５Ｓｅｒ）
ＮＭ＿００５６０９．３（ＰＹＧＭ）：ｃ．１３６６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ４５６Ｍｅｔ）
ＮＭ＿００５６０９．３（ＰＹＧＭ）：ｃ．１７６８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿００１１６６６８６．１（ＰＦＫＭ）：ｃ．４５０＋１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＧＡＡ、ＡＧＬ、ＰＨＫＢ、ＰＲＫＡＧ２、Ｇ６ＰＣ、ＰＧＡＭ２、ＧＢＥ１、ＰＹＧＭ、及びＰＦＫＭから選択される少なくとも１つの遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、糖原病を治療または予防するための方法に関する。
嚢胞性線維症
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、嚢胞性線維症に関連する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異／ＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む：
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３７１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１２３８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３４８４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１６２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１７６６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１４７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４９３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２５３８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ８４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２５５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ８５１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３４７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１５８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１４７５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ４９２Ｐｈｅ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６７９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ５６０Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３１９７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ１０６６Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３８７３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３１９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１０６６Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２４９０＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３７１８－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１７１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３９３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３１３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２７４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ９２Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１０１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔｈｒ３３８Ｉｌｅ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３２６６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１０８９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１０５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３５２Ｇｌｎ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６５４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５５２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２６６８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ８９０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３６１１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１２０４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１５８５－８Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６８０－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３４９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ１１７Ｃｙｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１２０３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１２４０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ４１４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１２０２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１２０９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１１５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ３９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１１１６＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１３９３－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１５７３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ５２５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６４＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｕ５６Ｌｙｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１７０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ５７Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２０５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ６８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２１２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７０９Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２２９０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７６４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２３５３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７８５Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２３７４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ７９２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２５３７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ８４６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２９２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２９８９－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３２９３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１０９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．４１４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１３８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．４２３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４１１Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．４２３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４１２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．５７９＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．５９５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｈｉｓ１９９Ｔｙｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．６１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２０５Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．６５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ２２０Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１１１７－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３２９４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１０９８Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１８６５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ６２２Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．７４３＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６７９＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６５７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ５５３Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６７５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ５５９Ｔｈｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６５－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ６７Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２８３４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓｅｒ９４５Ｌｅｕ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３８４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１２８２Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６５２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５５１Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．４４２６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｎ１４７６Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３：ｃ．３７１８－２４７７Ｃ＞Ｔ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２９８８＋１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２６５７＋５Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２９８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｎ９９６＝）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２７４－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３６１２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ１２０４Ｔｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ５４９Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３７５２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｓｅｒ１２５１Ａｓｎ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．４０４６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１３４９Ａｓｐ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．５３２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１７８Ａｒｇ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．３７３１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ１２４４Ｇｌｕ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１６５１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ５５１Ｓｅｒ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１５８５－１Ｇ＞Ａ
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１０００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３３４Ｔｒｐ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２５４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｙ８５Ｇｌｕ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．１０４０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ３４７Ｈｉｓ）
ＮＭ＿０００４９２．３（ＣＦＴＲ）：ｃ．２７３＋１Ｇ＞Ａ
表Ａを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、具体的には、ＣＦＴＲ遺伝子中に存在する１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰ、より具体的には、上記の１つまたは複数の病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ変異／ＳＮＰを修正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性２乳癌卵巣癌に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ２遺伝子中に位置する（ＨＧＶＳ：Ｕ４３７４６．１：ｎ．７８２９＋１Ｇ＞Ａ）。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性２乳癌卵巣癌を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、遺伝性第ＩＸ因子欠乏症に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、Ｆ９遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：ＣｈｒＸ：１３９５３７１４５に位置し、これにより、ＡｒｇからＧｌｎへの置換が生じる。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、遺伝性第ＩＸ因子欠乏症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、β＋サラセミア、βサラセミア、及びベータサラセミアメジャーに関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＨＢＢ遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１１：５２２６８２０に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、β＋サラセミア、βサラセミア、及びベータサラセミアメジャーを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、マルファン症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０００；４５（２）：１１５－８によって報告されているように、ＦＢＮ１遺伝子中に位置する（ＩＶＳ２ＤＳ、Ｇ－Ａ、＋１）。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、マルファン症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、Ｋｗａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）によって報告されているように、ＷＡＳ遺伝子のイントロ６の位置－１に位置する（ＩＶＳ６ＡＳ、Ｇ－Ａ、－１）。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、ウィスコット・アルドリッチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、嚢胞性線維症に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７５９０４４０に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、嚢胞性線維症及び遺伝性膵炎に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７６０６７５４に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、嚢胞性線維症及び遺伝性膵炎を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、嚢胞性線維症に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７５８７７３８に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ターコット症候群及びリンチ症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＳＨ２遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ２：４７４７０９６４に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、ターコット症候群及びリンチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、嚢胞性線維症に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７６４２４３７に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、リンチ症候群ＩＩ及びリンチ症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３７００１０５８に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、リンチ症候群ＩＩ及びリンチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、嚢胞性線維症に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７６４２５９４に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、嚢胞性線維症に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７５９２６５８に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性１乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性癌素因症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０５７０５１に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性１乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性癌素因症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ欠損症、ヒルシュスプルング病１、フルオロウラシル応答、ピリミジンアナログ応答－毒性／ＡＤＲ、カペシタビン応答－毒性／ＡＤＲ、フルオロウラシル応答－毒性／ＡＤＲ、テガフール応答－毒性／ＡＤＲに関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異又はＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＤＰＹＤ遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１：９７４５００５８に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異又はＳＮＰを修正することによって、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ欠損症、ヒルシュスプルング病１、フルオロウラシル応答、ピリミジンアナログ応答－毒性／ＡＤＲ、カペシタビン応答－毒性／ＡＤＲ、フルオロウラシル応答－毒性／ＡＤＲ、テガフール応答－毒性／ＡＤＲを治療又は予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、リンチ症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＳＨ２遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ２：４７４７８５２０に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、リンチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、リンチ症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３７０１１８１９に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、リンチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、リンチ症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３７０１４５４５に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、リンチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、リンチ症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３７０１１８６７に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、リンチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、リンチ症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３７０２５６３６に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、リンチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、リンチ症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３７００４４７５に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、リンチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、リンチ症候群及び遺伝性癌素因症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＳＨ２遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ２：４７４１６４３０に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、リンチ症候群及び遺伝性癌素因症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、リンチ症候群及び遺伝性癌素因症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＳＨ２遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ２：４７４０８４００に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、リンチ症候群及び遺伝性癌素因症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、リンチ症候群及び遺伝性癌素因症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＬＨ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ３：３６９９６７１０に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、リンチ症候群及び遺伝性癌素因症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性１乳癌卵巣癌に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０６７６９６に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性１乳癌卵巣癌を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性２乳癌卵巣癌及び遺伝性乳癌卵巣癌症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ２遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１３：３２３５６６１０に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性２乳癌卵巣癌及び遺伝性乳癌卵巣癌症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、原発性拡張型心筋症及び原発性家族性肥大型心筋症に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＹＨ７遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１４：２３４１９９９３に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、原発性拡張型心筋症及び原発性家族性肥大型心筋症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、原発性家族性肥大型心筋症、前屈症、及び肥大型心筋症に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＹＨ７遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１４：２３４１５２２５に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、原発性家族性肥大型心筋症、前屈症、及び肥大型心筋症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性乳癌、家族性２乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性癌素因症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ２遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１３：３２３５７７４１に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性乳癌、家族性２乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性癌素因症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、原発性拡張型心筋症、肥大型心筋症、心筋症、及び左室緻密化障害に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＭＹＨ７遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１４：２３４３１５８４に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、原発性拡張型心筋症、肥大型心筋症、心筋症、及び左室緻密化障害を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性１乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性癌素因症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０６７６０７に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性１乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性癌素因症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性１乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、遺伝性癌素因症候群、及び乳癌に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０４７６６６に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性１乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、遺伝性癌素因症候群、及び乳癌を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性２乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性癌素因症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ２遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１３：３２３７０５５８に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性２乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性癌素因症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性１乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、遺伝性癌素因症候群、及び乳癌に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０７４３３０に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性１乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、遺伝性癌素因症候群、及び乳癌を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性１乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性癌素因症候群に関連すると考えられる病原性Ａ→Ｇ（Ａ＞Ｇ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０８２４０３に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性１乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性癌素因症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、嚢胞性線維症及び遺伝性膵炎に関連すると考えられる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰは、ＣＦＴＲ遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ７：１１７６３９９６１に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰを修正することによって、嚢胞性線維症及び遺伝性膵炎を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性２乳癌卵巣癌に関連すると考えられる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ２遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１３：３２３３６４９２に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性２乳癌卵巣癌を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性１乳癌卵巣癌に関連すると考えられる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０６３３６５に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性１乳癌卵巣癌を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性１乳癌卵巣癌に関連すると考えられる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０９３６１３に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性１乳癌卵巣癌を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性乳癌、及び家族性１乳癌卵巣癌に関連すると考えられる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ１遺伝子のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１７：４３０９３９３１に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性乳癌、及び家族性１乳癌卵巣癌を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性肥大型心筋症１、原発性家族性肥大型心筋症、及び肥大型心筋症に関連すると考えられる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰは、ＭＹＨ７遺伝子のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１４：２３４２９２７９に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性肥大型心筋症１、原発性家族性肥大型心筋症、及び肥大型心筋症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性２乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性癌素因症候群に関連すると考えられる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰは、ＢＲＣＡ２遺伝子のＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１３：３２３５６４７２に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性２乳癌卵巣癌、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、及び遺伝性癌素因症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、家族性肥大型心筋症１、原発性家族性肥大型心筋症、家族性拘束型心筋症、及び肥大型心筋症に関連すると考えられる病原性Ｃ→Ｔ（Ｃ＞Ｔ）変異またはＳＮＰを修正するために使用され、ここで、病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰは、ＭＹＨ７遺伝子中、ＧＲＣｈ３８：Ｃｈｒ１４：２３４２９００５に位置する。したがって、本発明の追加の態様は、前述の病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰを修正することによって、家族性肥大型心筋症１、原発性家族性肥大型心筋症、家族性拘束型心筋症、及び肥大型心筋症を治療または予防するための方法に関する。
更なる病原性Ａ＞Ｇ変異及びＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースから得られ、ベースに表Ａに列挙される。したがって、本開示の更なる態様は、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、表Ａに列挙される病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰに関連する疾患または状態を治療または予防するための、当該病原性Ａ＞Ｇ変異またはＳＮＰの修正に関する。
更なる病原性Ｃ＞Ｔ変異及びＳＮＰは、ＣｌｉｎＶａｒデータベースから得られ、表Ａにも列挙される。したがって、本開示の更なる態様は、本明細書に記載される方法、系、及び組成物を使用して、表Ａに列挙される病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰに関連する疾患または状態を治療または予防するための、当該病原性Ｃ＞Ｔ変異またはＳＮＰの修正に関する。
Figure 0007364472000046
Figure 0007364472000047
Figure 0007364472000048
Figure 0007364472000049
Figure 0007364472000050
Figure 0007364472000051
Figure 0007364472000052
Figure 0007364472000053
Figure 0007364472000054
Figure 0007364472000055
Figure 0007364472000056
Figure 0007364472000057
Figure 0007364472000058
Figure 0007364472000059
Figure 0007364472000060
Figure 0007364472000061
Figure 0007364472000062
Figure 0007364472000063
Figure 0007364472000064
Figure 0007364472000065
Figure 0007364472000066
Figure 0007364472000067
Figure 0007364472000068
Figure 0007364472000069
Figure 0007364472000070
Figure 0007364472000071
Figure 0007364472000072
Figure 0007364472000073
Figure 0007364472000074
Figure 0007364472000075
Figure 0007364472000076
Figure 0007364472000077
Figure 0007364472000078
Figure 0007364472000079
Figure 0007364472000080
Figure 0007364472000081
Figure 0007364472000082
Figure 0007364472000083
Figure 0007364472000084
Figure 0007364472000085
Figure 0007364472000086
Figure 0007364472000087
Figure 0007364472000088
Figure 0007364472000089
Figure 0007364472000090
Figure 0007364472000091
Figure 0007364472000092
Figure 0007364472000093
Figure 0007364472000094
Figure 0007364472000095
Figure 0007364472000096
Figure 0007364472000097
Figure 0007364472000098
Figure 0007364472000099
Figure 0007364472000100
Figure 0007364472000101
Figure 0007364472000102
Figure 0007364472000103
Figure 0007364472000104
Figure 0007364472000105
Figure 0007364472000106
Figure 0007364472000107
Figure 0007364472000108
Figure 0007364472000109
Figure 0007364472000110
Figure 0007364472000111
Figure 0007364472000112
Figure 0007364472000113
Figure 0007364472000114
Figure 0007364472000115
Figure 0007364472000116
Figure 0007364472000117
Figure 0007364472000118
Figure 0007364472000119
Figure 0007364472000120
Figure 0007364472000121
Figure 0007364472000122
Figure 0007364472000123
Figure 0007364472000124
Figure 0007364472000125
Figure 0007364472000126
Figure 0007364472000127
Figure 0007364472000128
Figure 0007364472000129
Figure 0007364472000130
Figure 0007364472000131
Figure 0007364472000132
Figure 0007364472000133
Figure 0007364472000134
Figure 0007364472000135
Figure 0007364472000136
Figure 0007364472000137
Figure 0007364472000138
Figure 0007364472000139
Figure 0007364472000140
Figure 0007364472000141
Figure 0007364472000142
Figure 0007364472000143
Figure 0007364472000144
Figure 0007364472000145
Figure 0007364472000146
Figure 0007364472000147
Figure 0007364472000148
Figure 0007364472000149
Figure 0007364472000150
Figure 0007364472000151
Figure 0007364472000152
Figure 0007364472000153
Figure 0007364472000154
Figure 0007364472000155
Figure 0007364472000156
Figure 0007364472000157
Figure 0007364472000158
Figure 0007364472000159
Figure 0007364472000160
Figure 0007364472000161
Figure 0007364472000162
Figure 0007364472000163
Figure 0007364472000164
Figure 0007364472000165
Figure 0007364472000166
Figure 0007364472000167
Figure 0007364472000168
Figure 0007364472000169
Figure 0007364472000170
Figure 0007364472000171
Figure 0007364472000172
Figure 0007364472000173
Figure 0007364472000174
Figure 0007364472000175
Figure 0007364472000176
Figure 0007364472000177
Figure 0007364472000178
Figure 0007364472000179
Figure 0007364472000180
Figure 0007364472000181
Figure 0007364472000182
Figure 0007364472000183
Figure 0007364472000184
Figure 0007364472000185
Figure 0007364472000186
Figure 0007364472000187
Figure 0007364472000188
Figure 0007364472000189
Figure 0007364472000190
Figure 0007364472000191
Figure 0007364472000192
Figure 0007364472000193
Figure 0007364472000194
Figure 0007364472000195
Figure 0007364472000196
Figure 0007364472000197
Figure 0007364472000198
Figure 0007364472000199
Figure 0007364472000200
Figure 0007364472000201
Figure 0007364472000202
Figure 0007364472000203
Figure 0007364472000204
Figure 0007364472000205
Figure 0007364472000206
Figure 0007364472000207
Figure 0007364472000208
Figure 0007364472000209
Figure 0007364472000210
Figure 0007364472000211
Figure 0007364472000212
Figure 0007364472000213
Figure 0007364472000214
Figure 0007364472000215
Figure 0007364472000216
Figure 0007364472000217
Figure 0007364472000218
Figure 0007364472000219
Figure 0007364472000220
Figure 0007364472000221
Figure 0007364472000222
Figure 0007364472000223
Figure 0007364472000224
Figure 0007364472000225
Figure 0007364472000226
Figure 0007364472000227
Figure 0007364472000228
Figure 0007364472000229
Figure 0007364472000230
Figure 0007364472000231
Figure 0007364472000232
Figure 0007364472000233
Figure 0007364472000234
Figure 0007364472000235
Figure 0007364472000236
Figure 0007364472000237
Figure 0007364472000238
Figure 0007364472000239
Figure 0007364472000240
Figure 0007364472000241
Figure 0007364472000242
Figure 0007364472000243
Figure 0007364472000244
Figure 0007364472000245
Figure 0007364472000246
Figure 0007364472000247
Figure 0007364472000248
Figure 0007364472000249
Figure 0007364472000250
Figure 0007364472000251
Figure 0007364472000252
Figure 0007364472000253
Figure 0007364472000254
Figure 0007364472000255
Figure 0007364472000256
Figure 0007364472000257
Figure 0007364472000258
Figure 0007364472000259
Figure 0007364472000260
Figure 0007364472000261
Figure 0007364472000262
Figure 0007364472000263
Figure 0007364472000264
Figure 0007364472000265
Figure 0007364472000266
Figure 0007364472000267
Figure 0007364472000268
Figure 0007364472000269
Figure 0007364472000270
Figure 0007364472000271
Figure 0007364472000272
Figure 0007364472000273
Figure 0007364472000274
Figure 0007364472000275
Figure 0007364472000276
Figure 0007364472000277
Figure 0007364472000278
Figure 0007364472000279
Figure 0007364472000280
Figure 0007364472000281
Figure 0007364472000282
Figure 0007364472000283
Figure 0007364472000284
Figure 0007364472000285
Figure 0007364472000286
Figure 0007364472000287
Figure 0007364472000288
Figure 0007364472000289
Figure 0007364472000290
Figure 0007364472000291
Figure 0007364472000292
Figure 0007364472000293
Figure 0007364472000294
Figure 0007364472000295
Figure 0007364472000296
Figure 0007364472000297
Figure 0007364472000298
Figure 0007364472000299
Figure 0007364472000300
Figure 0007364472000301
Figure 0007364472000302
Figure 0007364472000303
Figure 0007364472000304
Figure 0007364472000305
Figure 0007364472000306
Figure 0007364472000307
Figure 0007364472000308
Figure 0007364472000309
Figure 0007364472000310
Figure 0007364472000311
Figure 0007364472000312
Figure 0007364472000313
Figure 0007364472000314
Figure 0007364472000315
Figure 0007364472000316
Figure 0007364472000317
Figure 0007364472000318
Figure 0007364472000319
Figure 0007364472000320
Figure 0007364472000321
Figure 0007364472000322
Figure 0007364472000323
Figure 0007364472000324
Figure 0007364472000325
Figure 0007364472000326
Figure 0007364472000327
Figure 0007364472000328
Figure 0007364472000329
Figure 0007364472000330
Figure 0007364472000331
Figure 0007364472000332
Figure 0007364472000333
Figure 0007364472000334
Figure 0007364472000335
Figure 0007364472000336
Figure 0007364472000337
Figure 0007364472000338
Figure 0007364472000339
Figure 0007364472000340
Figure 0007364472000341
Figure 0007364472000342
Figure 0007364472000343
Figure 0007364472000344
Figure 0007364472000345
Figure 0007364472000346
Figure 0007364472000347
Figure 0007364472000348
Figure 0007364472000349
Figure 0007364472000350
Figure 0007364472000351
Figure 0007364472000352
Figure 0007364472000353
Figure 0007364472000354
Figure 0007364472000355
Figure 0007364472000356
Figure 0007364472000357
Figure 0007364472000358
Figure 0007364472000359
Figure 0007364472000360
Figure 0007364472000361
Figure 0007364472000362
Figure 0007364472000363
Figure 0007364472000364
Figure 0007364472000365
Figure 0007364472000366
Figure 0007364472000367
Figure 0007364472000368
Figure 0007364472000369
Figure 0007364472000370
Figure 0007364472000371
Figure 0007364472000372
Figure 0007364472000373
Figure 0007364472000374
Figure 0007364472000375
Figure 0007364472000376
Figure 0007364472000377
Figure 0007364472000378
Figure 0007364472000379
Figure 0007364472000380
Figure 0007364472000381
Figure 0007364472000382
Figure 0007364472000383
Figure 0007364472000384
Figure 0007364472000385
Figure 0007364472000386
Figure 0007364472000387
Figure 0007364472000388
Figure 0007364472000389
Figure 0007364472000390
Figure 0007364472000391
Figure 0007364472000392
Figure 0007364472000393
追加の実施形態
実施形態１．目的標的遺伝子座のアデニンを改変する方法であって、前記遺伝子座に、（ａ）Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質、（ｂ）直列反復配列に連結されたガイド配列を含むガイド分子、及び（ｃ）アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを送達することを含み、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくは前記ガイド分子に共有結合的もしくは非共有結合的に連結されるか、または前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくは前記ガイド分子に送達後に連結するように適合され、ガイド分子は、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質と複合体を形成し、前記複合体を第１のＤＮＡ鎖に前記目的標的遺伝子座で結合するように誘導し、前記ガイド配列は、前記第１のＤＮＡ鎖内の前記アデニンを含む標的配列とハイブリダイズしてヘテロ二本鎖を形成することができ、前記ガイド配列は、前記アデニンに対応する位置に非対形成シトシンを含み、形成されたヘテロ二本鎖にＡ－Ｃミスマッチをもたらし、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質は、前記ヘテロ二本鎖の形成によってずらされた第２のＤＮＡ鎖に前記目的標的遺伝子座でニックを入れ、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、前記ヘテロ二本鎖の前記アデニンを脱アミノ化する、前記方法。
実施形態２．前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合される、実施形態１に記載の方法。
実施形態３．前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、リンカーによって、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質に融合される、実施形態２に記載の方法。
実施形態４．前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）３～１１（配列番号１～９）、ＧＳＧ５（配列番号１０）またはＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）である、実施形態３に記載の方法。
実施形態５．前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、アダプタータンパク質に連結され、前記ガイド分子または前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、前記アダプタータンパク質に結合することができるアプタマー配列を含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態６．前記アダプター配列が、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１から選択される、実施形態５に記載の方法。
実施形態７．前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質の内部ループに挿入される、実施形態１に記載の方法。
実施形態８．前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、Ｎｕｃドメイン中に変異を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９．前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、ＡｓＣｐｆ１中に、Ｒ１２２６Ａに対応する変異を含む、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０．前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、少なくとも一部が除去されたＮｕｃドメインを有する、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１．前記ガイド分子が、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質に結合し、前記標的配列と約２４ｎｔの前記ヘテロ二本鎖を形成することができる、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２．前記ガイド分子が、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質に結合し、前記標的配列と２４ｎｔ超の前記ヘテロ二本鎖を形成することができる、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３．前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、ヒト、イカまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４．前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二本鎖に対する活性を上昇するように改変されている、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５．前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、Ｅ４８８Ｑ変異を含む変異ｈＡＤＡＲ２ｄまたはＥ１００８Ｑ変異を含む変異ｈＡＤＡＲ１ｄである、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１６．前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、オフターゲット効果を減少するように改変されている、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１７．前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、Ｔ３７５Ｇ／Ｓ変異、Ｎ４７３Ｄ、もしくは両方を含む変異ｈＡＤＡＲ２ｄ、または対応する変異を含む変異ｈＡＤＡＲ１ｄである、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８．前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質及び任意選択により前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、１つまたは複数の異種核局在化シグナル（複数可）（ＮＬＳ（複数可））を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９．前記目的標的配列を決定することと、及び前記標的配列中に存在する前記アデニンを最も効率的に脱アミノ化する前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを選択すること、を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０．前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ ｋｕｎｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ（Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｅｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｐｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｏｒａｌ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃａｎｓｕｌｃｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｒｕｍｉｎｉｓ及びＰｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ ｓｐｈｅｎｉｓｃｉからなる群から選択される細菌種に由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼから得られる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１．前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質がＦｎＣｐｆ１ニッカーゼであり、ＴＴＮ、この時Ｎは、Ａ／Ｃ／ＧもしくはＴである、というＰＡＭ配列を認識するか、または前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質がＰａＣｐｆ１ｐ、ＬｂＣｐｆ１、もしくはＡｓＣｐｆ１ニッカーゼであり、ＴＴＴＶ、この時Ｖは、Ａ／ＣもしくはＧである、というＰＡＭ配列を認識する、実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２．前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、改変されており、認識するＰＡＭ配列が変わっている、実施形態２０に記載の方法。
実施形態２３．前記目的標的遺伝子座が細胞内に含まれる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４．前記細胞が真核細胞である、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５．前記細胞が非ヒト動物細胞である、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２６．前記細胞がヒト細胞である、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２７．前記細胞が植物細胞である、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２８．前記目的標的遺伝子座が動物内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２９．前記目的標的遺伝子座が植物内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０．前記目的標的遺伝子座がインビトロのＤＮＡ分子内に含まれる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１．前記構成要素（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が、リボ核タンパク質複合体として前記細胞に送達される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２．前記構成要素（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が、１つまたは複数のポリヌクレオチド分子として前記細胞に送達される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３．当該１つまたは複数のポリヌクレオチド分子が、構成要素（ａ）及び／または（ｃ）をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡ分子を含む、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３４．前記１つまたは複数のポリヌクレオチド分子が１つまたは複数のベクター内に含まれる、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３５．前記１つまたは複数のポリヌクレオチド分子が、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質、前記ガイド分子、及び前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを発現するように機能可能なように構成された１つまたは複数の制御要素を含み、任意選択で、前記１つまたは複数の制御要素は、誘導性プロモーターを含む、実施形態３４に記載の方法。
実施形態３６．前記１つまたは複数のポリヌクレオチド分子または前記リボ核タンパク質複合体が、粒子、小胞、または１つまたは複数のウイルスベクターを介して送達される、実施形態３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３７．前記粒子が、脂質、糖、金属またはタンパク質を含む、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８．前記粒子が脂質ナノ粒子を含む、実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９．前記小胞がエクソソームまたはリポソームを含む、実施形態３６に記載の方法。
実施形態４０．前記１つまたは複数のウイルスベクターが、１つまたは複数のアデノウイルス、１つまたは複数のレンチウイルスまたは１つまたは複数のアデノ随伴ウイルスを含む、実施形態３６に記載の方法。
実施形態４１．目的ゲノム遺伝子座で１つまたは複数の標的配列を操作することによって、細胞、細胞株または生物を改変する、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４２．前記目的標的遺伝子座での前記アデニンの前記脱アミノ化が、Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔの点変異または病原性ＳＮＰによって引き起こされる疾患を治療する、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３．前記疾患が、がん、血友病、ベータ－サラセミア、マルファン症候群及びウィスコット・アルドリッチ症候群から選択される、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４４．前記目的標的遺伝子座での前記アデニンの前記脱アミノ化が、前記標的遺伝子座で標的遺伝子を不活性化する、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４５．先行実施形態のいずれか１つに記載の方法から得られた改変細胞、または前記改変細胞の子孫であって、前記細胞が、前記方法に供されていない対応する細胞と比較して、前記目的標的遺伝子座の前記アデニンの代わりにヒポキサンチンまたはグアニンを含む、前記改変細胞またはその子孫。
実施形態４６．前記細胞が真核細胞である、実施形態４５に記載の改変細胞またはその子孫。
実施形態４７．前記細胞が動物細胞である、実施形態４５に記載の改変細胞またはその子孫。
実施形態４８．前記細胞がヒト細胞である、実施形態４５に記載の改変細胞またはその子孫。
実施形態４９．前記細胞が治療用Ｔ細胞である、実施形態４５に記載の改変細胞またはその子孫。
実施形態５０．前記細胞が抗体産生Ｂ細胞である、実施形態４５に記載の改変細胞またはその子孫。
実施形態５１．前記細胞が植物細胞である、実施形態４５に記載の改変細胞またはその子孫。
実施形態５２．実施形態４７に記載の前記改変細胞を含む、非ヒト動物。
実施形態５３．実施形態５１に記載の前記改変細胞を含む、植物。
実施形態５４．細胞治療のための方法であって、それを必要とする患者に、実施形態４５～５０のいずれか１つに記載の前記改変細胞を投与することを含み、前記改変細胞の存在は、患者の疾患を治療する、前記方法。
実施形態５５．目的標的遺伝子座のアデニンを改変するのに好適な操作された非天然系であって、直列反復配列に連結されたガイド配列を含むガイド分子、または前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列；Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質、または前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列；アデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記アデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくは前記ガイド分子に共有結合的もしくは非共有結合的に連結されるか、または前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくは前記ガイド分子に送達後に連結するように適合され、前記ガイド配列は、前記標的遺伝子座で第１のＤＮＡ鎖上にアデニンを含む標的配列とハイブリダイズしてヘテロ二本鎖を形成することができ、前記ガイド配列は、前記アデニンに対応する位置に非対形成シトシンを含み、形成されたヘテロ二本鎖にＡ－Ｃミスマッチをもたらし、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質は、前記第１のＤＮＡ鎖に相補的な第２のＤＮＡ鎖にニックを入れることができる、前記操作された非天然系。
実施形態５６．実施形態５５に記載のａ）、ｂ）及びｃ）のヌクレオチド配列を含む、目的標的遺伝子座のアデニンを改変するのに好適な操作された非天然ベクター系。
実施形態５７．前記ガイド配列を含む前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第１の制御要素；前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第２の制御要素；及び前記第１または第２の制御要素の制御下にあるか、第３の制御要素に機能可能なように連結された、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数のベクターを含み、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が第３の制御要素に機能可能なように連結される場合、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、発現後に前記ガイド分子または前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質に連結するように適合され、構成要素（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、前記系の同じまたは異なるベクターに位置する、実施形態５６に記載の操作された非天然ベクター系。
実施形態５８．実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の系を含む、インビトロまたはエクスビボの宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
実施形態５９．前記細胞が真核細胞である、実施形態５８に記載の宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
実施形態６０．前記細胞が動物細胞である、実施形態５８に記載の宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
実施形態６１．前記細胞がヒト細胞である、実施形態５８に記載の宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
実施形態６２．前記細胞が植物細胞である、実施形態５８に記載の宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
実施例１
アデニンデアミナーゼ（ＡＤ）は、典型的に、二本鎖ＲＮＡの特定部位で、アデニンを脱アミン化する。ＡＤの基質選択性をｄｓＲＮＡからｄｓＤＮＡに変更したＡＤを開発する試みに対する努力がこれまでになされ、これにより、進化したＡＤをＣｐｆ１に融合させて、ゲノムＤＮＡ上でのＲＮＡ誘導型アデニン脱アミノ化を達成することができる。
いくつかのＡＤがＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二本鎖上でのアデニン脱アミノ化を達成するという事実（例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１７）は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合中に不活性型Ｃｐｆ１によって形成されるＲループでの、ガイドＲＮＡとその相補性ＤＮＡ標的との間に形成されるヘテロ二本鎖の利点を利用した、ＲＮＡ誘導型ＡＤの開発というユニークな機会を提示している。不活性型Ｃｐｆ１を使用してＡＤをリクルートすると、ＡＤ酵素は、ＲＮＡ－ＤＮＡヘテロ二本鎖のアデニンに対して作用する。
一実施形態において、不活性型ＡｓＣｐｆ１は、次の変異：Ｄ９０８ＡまたはＥ９９３Ａを使用して得られる。ＡＤによる編集効率を高めるために、ニッカーゼＣｐｆ１を使用して、ガイドＲＮＡに相補的でないＤＮＡ鎖にニックを入れることもできる。ＡｓＣｐｆ１の場合、変異は、Ｒ１２２６Ａとなり得る。
特定の遺伝子座へのＡＤリクルートのための設計：
１．ＮＬＳタグ付き不活性型またはニッカーゼＣｐｆ１をＡＤのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合する。ＧＳＧ５などの可動性リンカーまたはＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号７８）などの低可動性リンカーを含む、様々なリンカーが使用される。
２．ガイドＲＮＡスカフォールドを、ＭＳ２結合部位などのアプタマーを用いて改変する（例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１５）。ＮＬＳタグ付きＡＤ－ＭＳ２結合タンパク質融合体を、（ＮＬＳタグ付き不活性型またはニッカーゼＣｐｆ１）及び対応するガイドＲＮＡとともに標的細胞に同時導入する。
３．ＡＤをＮＬＳタグ付き不活性型またはニッカーゼＣｐｆ１の内部ループ内に挿入する。
ＲＮＡガイドの設計：
１．通常の長さのＲＮＡガイド（ＡｓＣｐｆ１の場合２４ｎｔ）を、目的ゲノム遺伝子座を標的とするように設計する。
２．タンパク質－ガイドＲＮＡ－標的ＤＮＡ複合体の外側にヘテロ二本鎖を形成するには、標準的な長さよりも長いＲＮＡガイドを使用する。
これらのＲＮＡガイド設計のそれぞれについて、ＤＮＡ鎖上のアデニンの反対側にあるＲＮＡ上の塩基は、ＵではなくＣと指定される。
ＡＤの選択及び設計：
多数のＡＤを使用すると、そのそれぞれは、様々なレベルの活性を有する。これらのＡＤには、次が挙げられる：
１．ヒトＡＤＡＲ（ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ３）
２．イカＬｏｌｉｇｏ ｐｅａｌｅｉｉ ＡＤＡＲ（ｓｑＡＤＡＲ２ａ、ｓｑＡＤＡＲ２ｂ）
３．ＡＤＡＴ（ヒトＡＤＡＴ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＡＤＡＴ）
また、変異を使用すると、ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二本鎖に対して反応するＡＤＡＲの活性を高めることができる。例えば、ヒトＡＤＡＲ遺伝子の場合、ＤＮＡ－ＲＮＡ標的に対する活性を高めるために、ｈＡＤＡＲ１ｄ（Ｅ１００８Ｑ）またはｈＡＤＡＲ２ｄ（Ｅ４８８Ｑ）変異が使用される。
各ＡＤＡＲは、様々な程度の配列関係要件を有する。例えば、ｈＡＤＡＲ１ｄ（Ｅ１００８Ｑ）の場合、ｔＡｇ及びａＡｇの部位は効率的に脱アミノ化されるが、ａＡｔ及びｃＡｃの編集は効率が低く、ｇＡａ及びｇＡｃの編集は更に効率が低い。しかしながら、関係要件は、種々のＡＤＡＲで異なる。
系の１つのバージョンを示す模式図を図１に記載する。例示的なＣｐｆ１－ＡＤ融合タンパク質のアミノ酸配列を図２～５に記載する。
実施例２
図６は、ｈｕＡＤＡＲ２ｄとのＳｐＣａｓ９融合体＆ＡｓＣｐｆ１融合体を示す。ＡをＧに変換するために、ＡｓＣｐｆ１の４つのコンストラクト及びＳｐＣａｓ９の４つのコンストラクトを作製した。ＡｓＣｐｆ１（Ｒ１２２６Ａ）及びＳｐＣａｓ９（Ｎ８６３Ａ）のニッカーゼバージョンをヒトＡＤＡＲ２（ＡＤＡＲ）のデアミナーゼドメインとＮ末端またはＣ末端で融合した。更に、ＡＤＡＲの立体障害を減らすために、ＳｐＣａｓ９からＨＮＨドメインを、またはＡｓＣｐｆ１からＮｕｃドメインを削除することによって、欠失コンストラクトを生成した。
図７は、ＡＤＡＲ融合体の欠失コンストラクトを示す。ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸１０７６～１２５８をＧＳＧＧリンカーによって置き換え、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸７６９～９１８をＧＧＳＧＧＳリンカーによって置き換えた。
図８は、ＨＥＫ細胞におけるＡＤＡＲ融合体の発現を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に異なるＡＤＡＲ融合体コンストラクトまたはＨＮＨ／Ｎｕｃ欠失コンストラクトをトランスフェクションして、タンパク質発現を確認した。トランスフェクションから２日後に細胞を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液を使用してタンパク質を抽出した。Ｆｌａｇ（ＳｐＣａｓ９）タグまたはＨＡ（ＡｓＣｐｆ１）タグに対する抗体を使用するウェスタンブロットに、５ｕｌの細胞溶解液を使用した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に３つのコンストラクトをトランスフェクションした。１つは、所定の位置にＵＡＧモチーフを有するルシフェラーゼ（Ｃｌｕｃ）ｍＲＮＡ標的を提供するものである（図９左）。ＴＡＧモチーフを２０ｎｔ領域にわたって配置し、ＡＤＡＲ２ｄに対して多かれ少なかれ潜在的に接近できる１０個の標的を得た（配列番号７４～８３）。１０個の標的コンストラクトのそれぞれは、プログラムされたＡ→Ｇ変換を含有する、一致するｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを提供する（図９右）（配列番号８４～９３）。
ＣＴプロトコルに対する細胞を使用して細胞を回収した（Ｊｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１７）。ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅し、ＮＧＳによってシーケンシングした。それぞれのＡＤＡＲ融合体コンストラクトとガイド／標的組み合わせについて、技術的反復を３～６回実施した。
Ｃ末端ＡＤＡＲを有するＡｓＣｐｆ１融合体が最高のパフォーマンスを出し、ＰＡＭがＤＮＡ標的上にある場所から数えてヌクレオチド位置１８のＡ→Ｇ変換は最大約３０％であった（標的／ガイド＃２）（図１０左）。対照的に、ＳｐＣａｓ９ ＡＤＡＲ融合体は、ＡＤＡＲのみの対照を用いて観察されたバックグラウンドを上回るＡ→Ｇ変換をもたらさなかった（図１０右）。
加えて、ＡｓＣｐｆ１－ＡＤＡＲ２ｄコンストラクトによるヒトＤＮＭＴ１遺伝子の標的化Ａ→Ｇ ＤＮＡ塩基編集をＨＥＫ２９３細胞において試験した。図１１に示されるように、ＡｓＣｐｆ１（Ｒ１２２６Ａ）－ＡＤＡＲ２ｄ及びＡｓＣｐｆ１（デルタＮｕｃ）－ＡＤＡＲ２ｄの融合体コンストラクトは、ヒトＤＮＭＴ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡ標的との複合体で、それぞれ検出可能なレベルでの標的化Ａ→Ｇ ＤＮＡ塩基編集を示したが、野生型ＡｓＣｐｆ１及びＡＤＡＲ２ｄ対照コンストラクトは、検出可能なレベルでの標的化Ａ→Ｇ ＤＮＡ塩基編集を生じなかった。
本明細書に例示的に記載される実施形態は、本明細書で具体的に開示されていないいずれかの要素または複数の要素、１つまたは複数の制限がない場合でも好適に実施することができる。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、限定的ではなく、広範に解釈されるものとする。更に、本明細書で使用される用語及び表現は、説明に関して使用されるものであり、限定するものではない。かかる用語及び発現の使用において、示される及び記載される特徴の任意の等価物またはその一部を除外することを意図するものではなく、特許請求される技術の範囲内での様々な修正が可能であることが認識される。更に、「～から本質的になる」という文言は、具体的に列記される要素と、特許請求される技術の基本的及び新規の特徴に実質的に影響しない追加の要素とを含むことが理解される。「～からなる」という文言は、明記されていない任意の要素を除外する。
本開示は、本出願に記載される特定の実施形態に関して限定されるものではない。当業者には明白であるように、本開示の趣旨及び範囲を逸脱することなく、多くの変更及び変形形態を行うことができる。本開示の範囲内にある機能的に同等の方法及び組成物は、本明細書に列挙されるものに加え、当業者には前述の説明から明白であろう。そのような変更及び変形形態は、添付する特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。本開示は、添付する特許請求の範囲によってのみ限定されるものであり、かかる請求項が権利を有する全ての均等物の範囲も含まれる。本開示は、特定の方法、試薬、化合組成物または生物系に限定されず、当然のことながら、変わり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないことが理解される。
加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群で記載されている場合、本開示はまた、当該マーカッシュ群の個々の任意の構成要素または構成要素のサブグループからも記載されることを当業者であれば認識するであろう。
当業者によって理解されるように、あらゆる目的のために、特に書面における説明の提供において、本明細書で開示される全ての範囲はまた、あらゆる可能な部分範囲及びその部分範囲の組み合わせを包含する。列挙される範囲はいずれも、少なくとも等分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分割される同様の範囲を十分に記載及び許容するものと容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で考察される各範囲は、下部３分の１、中間部３分の１及び上部３分の１などに容易に分割することができる。また、当業者によって理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「～を超える」、「未満」などの全ての文言は、列記される数を含み、上記のとおり、部分範囲に引き続き分割できる範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲には、それぞれ個々の構成要素が含まれる。
本明細書に言及される全ての公開物、特許出願、発行済み特許、及び他の文献は、それぞれ個々の公開物、特許出願、発行済み特許、または他の文献の全体が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示されるように、参照により本明細書に援用される。参照により援用される文中に含まれる定義は、本開示の定義と矛盾する限りにおいては、除外される。
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に記載される。

Claims (50)

  1. 目的標的遺伝子座におけるアデニンを改変する方法であって、前記方法が、
    （ａ）Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質と、
    （ｂ）直列反復配列に連結されたガイド配列を含むガイド分子と、
    （ｃ）アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインと、
    を前記遺伝子座にエクスビボで送達することを含み、
    前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくは前記ガイド分子に共有結合もしくは非共有結合で連結されるか、または送達後に前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくは前記ガイド分子に連結されるように適合化され、
    ガイド分子が、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質と複合体を形成し、前記目的標的遺伝子座の第１のＤＮＡ鎖に結合するように前記複合体を誘導し、前記ガイド配列が、前記第１のＤＮＡ鎖内に前記アデニンを含む標的配列とハイブリダイズしてヘテロ二本鎖を形成する能力を有し、前記ガイド配列が、前記アデニンに対応する位置に非対形成シトシンを含むことで、形成されたヘテロ二本鎖にＡ－Ｃミスマッチを生じさせ、
    前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、前記ヘテロ二本鎖の形成によって置き換えられる前記目的標的遺伝子座の第２のＤＮＡ鎖にニックを入れ、
    前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記ヘテロ二本鎖における前記アデニンを脱アミノ化し、
    前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、Ｅ４８８Ｑ変異を含む変異ｈＡＤＡＲ２ｄであるか、またはＥ１００８Ｑ変異を含む変異ｈＡＤＡＲ１ｄである、または前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、Ｔ３７５Ｇ／Ｓ変異、Ｎ４７３Ｄ変異、もしくは両方の変異を含む変異ｈＡＤＡＲ２ｄであるか、または対応変異を含む変異ｈＡＤＡＲ１ｄである、
    前記方法。
  2. 前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、リンカーによって前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質に融合される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）３－１１（配列番号１～９）、ＧＳＧ５（配列番号１０）、またはＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、アダプタータンパク質に連結され、前記ガイド分子または前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、前記アダプタータンパク質に結合する能力を有するアプタマー配列を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、及びＰＲＲ１から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質の内部ループに挿入される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、Ｎｕｃドメインに変異を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、ＡｓＣｐｆ１におけるＲ１２２６Ａに対応する変異を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパクが、除去されるＮｕｃドメインの少なくとも一部を有する、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  11. 前記ガイド分子が、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質に結合し、前記標的配列と２４ｎｔの前記ヘテロ二本鎖を形成する能力を有する、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記ガイド分子が、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質に結合し、前記標的配列と２４ｎｔ超の前記ヘテロ二本鎖を形成する能力を有する、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  13. 前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、ヒト、イカ、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインである、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、１つまたは複数の異種核局在化シグナル（複数可）（ＮＬＳ（複数可））を含む、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、１つまたは複数の異種核局在化シグナル（複数可）（ＮＬＳ（複数可））を含む、請求項１４の記載の方法。
  16. 前記方法が、目的標的配列を決定すること、及び前記標的配列に存在する前記アデニンを最も効率的に脱アミノ化する前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを選択すること、を含む、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ属の１種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属の１種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ ｋｕｎｚｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の１種、Ｍｉｃｒｏｇｅｎｏｍａｔｅｓ（Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ） ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の１種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｅｖｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｐｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｏｒａｌ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃａｎｓｕｌｃｉ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ ｊｏｎｅｓｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｙａｎｔｉｉ、Ａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ属の１種、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ属の１種、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の１種、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｒｕｍｉｎｉｓ、ならびにＰｒｏｔｅｏｃａｔｅｌｌａ ｓｐｈｅｎｉｓｃｉからなる群から選択される細菌種に由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼから得られる、請求項１～１６のいずれかに記載の方法。
  18. 前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、ＦｎＣｐｆ１ニッカーゼであり、ＴＴＮ、この時Ｎは、Ａ／Ｃ／ＧもしくはＴである、というＰＡＭ配列を認識するか、または前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、ＰａＣｐｆ１ｐニッカーゼ、ＬｂＣｐｆ１ニッカーゼ、もしくはＡｓＣｐｆ１ニッカーゼであり、ＴＴＴＶ、この時Ｖは、Ａ／ＣもしくはＧである、というＰＡＭ配列を認識する、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、アミノ酸の変異により改変されており、認識するＰＡＭ配列が変わっている、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記目的標的遺伝子座が、細胞内に含まれる、請求項１～１９のいずれかに記載の方法、ただし、細胞は、ヒトの生殖系列細胞ではない。
  21. 前記細胞が、真核細胞である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記細胞が、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または植物細胞である、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記目的標的遺伝子座が、動物内、植物内、またはインビトロのＤＮＡ分子に含まれる、請求項１～２２のいずれかに記載の方法、ただしヒトを処置する方法を除く。
  24. 構成要素（ａ）、構成要素（ｂ）、及び構成要素（ｃ）が、リボ核タンパク質複合体として前記細胞に送達される、請求項１～２３のいずれかに記載の方法。
  25. 構成要素（ａ）、構成要素（ｂ）、及び構成要素（ｃ）が、１つまたは複数のポリヌクレオチド分子として前記細胞に送達される、請求項１～２４のいずれかに記載の方法。
  26. 前記１つまたは複数のポリヌクレオチド分子が、構成要素（ａ）及び／または構成要素（ｃ）をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡ分子を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記１つまたは複数のポリヌクレオチド分子が、１つまたは複数のベクター内に含まれる、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記１つまたは複数のポリヌクレオチド分子が、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質、前記ガイド分子、及び前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを発現させるために機能可能なように構成された１つまたは複数の制御要素を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記１つまたは複数の制御要素が、誘導性プロモーターを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記１つまたは複数のポリヌクレオチド分子または前記リボ核タンパク質複合体が、粒子、小胞、または１つもしくは複数のウイルスベクターを介して送達される、請求項２４～２９のいずれかに記載の方法。
  31. 前記粒子が、脂質、糖、金属、またはタンパク質を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記粒子が、脂質ナノ粒子を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記小胞が、エクソソームまたはリポソームを含む、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記１つまたは複数のウイルスベクターが、１つもしくは複数のアデノウイルス、１つもしくは複数のレンチウイルス、または１つもしくは複数のアデノ随伴ウイルスを含む、請求項３０に記載の方法。
  35. 前記方法が、目的ゲノム遺伝子座における１つまたは複数の標的配列を操作することによって細胞、細胞株、または生物を改変するものである、請求項１～３４のいずれかに記載の方法、ただしヒトを処置する方法を除く。
  36. 前記目的標的遺伝子座における前記アデニンの前記脱アミノ化によって、Ｇ→Ａ点変異もしくはＣ→Ｔ点変異または病原性ＳＮＰが引き起こす疾患が治療される、請求項３５に記載の方法、ただしヒトを処置する方法を除く。
  37. 前記疾患が、がん、血友病、ベータ－サラセミア、マルファン症候群、及びウィスコット・アルドリッチ症候群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記目的標的遺伝子座における前記アデニンの前記脱アミノ化によって、前記標的遺伝子座における標的遺伝子が不活性化される、請求項３５に記載の方法。
  39. 請求項１～３８のいずれかに記載の方法から得られる改変細胞または前記改変細胞の子孫であって、前記細胞が、前記方法が適用されない対応細胞と比較して、前記アデニンの代わりにヒポキサンチンまたはグアニンを前記目的標的遺伝子座に含む、前記改変細胞または前記改変細胞の子孫。
  40. 前記細胞が、真核細胞である、請求項３９に記載の改変細胞またはその子孫。
  41. 前記細胞が、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または植物細胞である、請求項３９に記載の改変細胞またはその子孫。
  42. 前記細胞が、治療用Ｔ細胞または抗体産生Ｂ細胞である、請求項３９に記載の改変細胞またはその子孫。
  43. 請求項４１に記載の前記改変細胞を含む、非ヒト動物または植物。
  44. 細胞治療のための方法であって、それを必要とする非ヒト動物に対して請求項３９～４２のいずれかに記載の前記改変細胞を投与することを含み、前記改変細胞が存在することで、前記非ヒト動物における疾患が治療される、前記方法。
  45. 請求項３９～４２のいずれかに記載の改変細胞を含む、細胞治療剤。
  46. 目的標的遺伝子座におけるアデニンの改変に適した、操作された非天然起源の系であって、前記操作された非天然起源の系が、
    ａ）直列反復配列に連結されたガイド配列を含むガイド分子、または前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列と、
    ｂ）Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質、または前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
    ｃ）アデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記アデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列と、
    を含み、
    前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくは前記ガイド分子に共有結合もしくは非共有結合で連結されるか、または送達後に前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質もしくは前記ガイド分子に連結されるように適合化され、
    前記ガイド配列が、前記標的遺伝子座の第１のＤＮＡ鎖上にアデニンを含む標的配列とハイブリダイズしてヘテロ二本鎖を形成する能力を有し、前記ガイド配列が、前記アデニンに対応する位置に非対形成シトシンを含むことで、前記形成ヘテロ二本鎖にＡ－Ｃミスマッチを生じさせ、
    前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質が、前記第１のＤＮＡ鎖に相補的な第２のＤＮＡ鎖にニックを入れる能力を有し、
    前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、Ｅ４８８Ｑ変異を含む変異ｈＡＤＡＲ２ｄであるか、またはＥ１００８Ｑ変異を含む変異ｈＡＤＡＲ１ｄである、または前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、Ｔ３７５Ｇ／Ｓ変異、Ｎ４７３Ｄ変異、もしくは両方の変異を含む変異ｈＡＤＡＲ２ｄであるか、または対応変異を含む変異ｈＡＤＡＲ１ｄである、
    前記操作された非天然起源の系。
  47. 目的標的遺伝子座におけるアデニンの改変に適した、操作された非天然起源のベクター系であって、前記操作された非天然起源のベクター系が、請求項４６に記載のａ）のヌクレオチド配列、ｂ）のヌクレオチド配列、及びｃ）のヌクレオチド配列を含む、前記操作された非天然起源のベクター系。
  48. ａ）前記ガイド配列を含む前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第１の制御要素と、
    ｂ）前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第２の制御要素と、
    ｃ）アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、前記第１の制御要素もしくは前記第２の制御要素の制御下にあるか、または第３の制御要素に機能可能なように連結された前記ヌクレオチド配列と、
    を含む１つまたは複数のベクターを含み、
    アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が、第３の制御要素に機能可能なように連結されるのであれば、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、発現後に前記ガイド分子または前記Ｃｐｆ１ニッカーゼタンパク質に連結されるように適合化され、
    構成要素（ａ）、構成要素（ｂ）、及び構成要素（ｃ）が、前記系に含まれる同じベクターまたは異なるベクターに位置する、請求項４７に記載の操作された非天然起源のベクター系。
  49. 請求項４６～４８のいずれかに記載の系を含む、インビトロまたはエクスビボの宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
  50. 前記細胞が、真核細胞である、請求項４９に記載のインビトロまたはエクスビボの宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
JP2019563865A 2017-05-18 2018-05-18 標的化された核酸編集のための系、方法、及び組成物 Active JP7364472B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023092127A JP2023123486A (ja) 2017-05-18 2023-06-05 標的化された核酸編集のための系、方法、及び組成物

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762508293P 2017-05-18 2017-05-18
US62/508,293 2017-05-18
US201762561663P 2017-09-21 2017-09-21
US62/561,663 2017-09-21
US201762568133P 2017-10-04 2017-10-04
US62/568,133 2017-10-04
US201762609957P 2017-12-22 2017-12-22
US62/609,957 2017-12-22
PCT/US2018/033394 WO2018213708A1 (en) 2017-05-18 2018-05-18 Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023092127A Division JP2023123486A (ja) 2017-05-18 2023-06-05 標的化された核酸編集のための系、方法、及び組成物

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2020520654A JP2020520654A (ja) 2020-07-16
JP2020520654A5 JP2020520654A5 (ja) 2021-07-26
JP7364472B2 true JP7364472B2 (ja) 2023-10-18

Family

ID=62705669

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019563865A Active JP7364472B2 (ja) 2017-05-18 2018-05-18 標的化された核酸編集のための系、方法、及び組成物
JP2023092127A Pending JP2023123486A (ja) 2017-05-18 2023-06-05 標的化された核酸編集のための系、方法、及び組成物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023092127A Pending JP2023123486A (ja) 2017-05-18 2023-06-05 標的化された核酸編集のための系、方法、及び組成物

Country Status (7)

Country Link
US (2) US11866697B2 (ja)
EP (1) EP3625343A1 (ja)
JP (2) JP7364472B2 (ja)
CN (1) CN111417727A (ja)
AU (1) AU2018270088B2 (ja)
CA (1) CA3063739A1 (ja)
WO (1) WO2018213708A1 (ja)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2853829C (en) 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
US10648020B2 (en) 2015-06-18 2020-05-12 The Broad Institute, Inc. CRISPR enzymes and systems
EP4269577A3 (en) 2015-10-23 2024-01-17 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
WO2017184786A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 The Broad Institute Inc. Cpf1 complexes with reduced indel activity
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN110214180A (zh) 2016-10-14 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器的aav递送
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11932856B2 (en) 2017-03-03 2024-03-19 The Regents Of The University Of California RNA targeting of mutations via suppressor tRNAs and deaminases
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
CN110914426A (zh) 2017-03-23 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
CA3063739A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
EP3645054A4 (en) * 2017-06-26 2021-03-31 The Broad Institute, Inc. COMPOSITIONS BASED ON CRISPR / CAS-ADENIN-DEAMINASE, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED NUCLEIC ACID EDITING
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
JP2020537516A (ja) * 2017-10-04 2020-12-24 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 標的化された核酸編集のためのシステム、方法、及び組成物
JP2021500036A (ja) 2017-10-16 2021-01-07 ザ ブロード インスティテュート, インコーポレーテッドThe Broad Institute, Inc. アデノシン塩基編集因子の使用
CN110157727A (zh) 2017-12-21 2019-08-23 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物碱基编辑方法
BR112020026246A2 (pt) 2018-06-26 2021-04-20 The Broad Institute Inc. composições, sistemas e métodos de amplificação com base em nickase dupla crispr
SG11202012786RA (en) 2018-06-26 2021-01-28 Massachusetts Inst Technology Crispr effector system based amplification methods, systems, and diagnostics
CN113164623A (zh) 2018-09-18 2021-07-23 维恩维纽克公司 基于arc的衣壳及其用途
WO2020122104A1 (ja) * 2018-12-11 2020-06-18 国立大学法人京都大学 ゲノムｄｎａに欠失を誘導する方法
WO2020124050A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 The Broad Institute, Inc. Tiled assays using crispr-cas based detection
WO2020142739A1 (en) * 2019-01-04 2020-07-09 Mammoth Biosciences, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING MODIFIED NUCLEIC ACIDS AND AMPLIFYING ssDNA
SG11202107045PA (en) 2019-02-13 2021-07-29 Beam Therapeutics Inc Compositions and methods for treating hemoglobinopathies
AU2020223306A1 (en) * 2019-02-13 2021-08-05 Beam Therapeutics Inc. Methods of editing a disease-associated gene using adenosine deaminase base editors, including for the treatment of genetic disease
EP3924480A4 (en) * 2019-02-13 2023-08-02 Beam Therapeutics, Inc. MODIFIED IMMUNE CELLS HAVING ADENOSINE DEAMINASE BASE EDITORS TO MODIFY A NUCLEOBASE IN A TARGET SEQUENCE
AU2020223314A1 (en) * 2019-02-13 2021-08-12 Beam Therapeutics Inc. Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiency
US20220154282A1 (en) 2019-03-12 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells
US20220152115A1 (en) 2019-03-13 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Microglial progenitors for regeneration of functional microglia in the central nervous system and therapeutics uses thereof
US20220154258A1 (en) 2019-03-14 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based multiplex diagnostics
US20220143148A1 (en) 2019-03-14 2022-05-12 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate intestinal innate lymphoid cells
EP3942023A1 (en) 2019-03-18 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating metabolic regulators of t cell pathogenicity
US20220152148A1 (en) 2019-03-18 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Modulation of type 2 immunity by targeting clec-2 signaling
US20220177863A1 (en) 2019-03-18 2022-06-09 The Broad Institute, Inc. Type vii crispr proteins and systems
BR112021018607A2 (pt) 2019-03-19 2021-11-23 Massachusetts Inst Technology Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos
WO2020232271A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for targeting multinucleated cells
US20220251640A1 (en) 2019-05-17 2022-08-11 The Broad Institute, Inc. Methods of determination of genome architecture and epigenetic profile
US20220226464A1 (en) 2019-05-28 2022-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating immune responses
WO2020241869A1 (ja) * 2019-05-30 2020-12-03 国立大学法人東京大学 ２種の核酸塩基変換酵素が融合されたＣａｓタンパク質を利用したゲノム編集システム
JPWO2020241679A1 (ja) * 2019-05-30 2020-12-03
WO2021030627A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 The General Hospital Corporation Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof
US20230056843A1 (en) * 2019-08-19 2023-02-23 Southern Medical University Construction of high-fidelity crispr/ascpf1 mutant and uses thereof
WO2021046257A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based multiplex cancer diagnostics
WO2021056302A1 (en) * 2019-09-26 2021-04-01 Syngenta Crop Protection Ag Methods and compositions for dna base editing
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
US11793787B2 (en) 2019-10-07 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for enhancing anti-tumor immunity by targeting steroidogenesis
BR112022007125A2 (pt) * 2019-10-17 2022-07-05 Pairwise Plants Services Inc Variantes de nucleases cas12a e métodos de produção e uso das mesmas
WO2021081384A1 (en) * 2019-10-25 2021-04-29 Greenvenus, Llc Synthetic nucleases
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
US20220380758A1 (en) * 2019-11-01 2022-12-01 The Broad Institute, Inc. Type i-b crispr-associated transposase systems
US20220403357A1 (en) * 2019-11-12 2022-12-22 The Broad Institute, Inc. Small type ii cas proteins and methods of use thereof
EP4069842A1 (en) 2019-12-02 2022-10-12 Shape Therapeutics Inc. Therapeutic editing
WO2021123397A1 (en) * 2019-12-20 2021-06-24 Biogemma IMPROVING EFFICIENCY OF BASE EDITING USING TypeV CRISPR ENZYMES
CN113265343B (zh) * 2020-02-14 2023-04-07 中国科学院大连化学物理研究所 一种重组多形汉逊酵母的构建方法及其应用
WO2021222318A1 (en) * 2020-04-28 2021-11-04 The Broad Institute, Inc. Targeted base editing of the ush2a gene
CN116096873A (zh) 2020-05-08 2023-05-09 布罗德研究所股份有限公司 同时编辑靶标双链核苷酸序列的两条链的方法和组合物
WO2021231673A1 (en) * 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of leucine rich repeat kinase 2 (lrrk2)
US20230193279A1 (en) * 2020-05-26 2023-06-22 Brian Briggs Compositions and Methods for Modifying Target RNAs
WO2021257997A2 (en) * 2020-06-18 2021-12-23 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof
CN111876418B (zh) * 2020-07-17 2024-02-02 北京希诺因生物科技有限公司 先天性黑蒙模型犬的建立方法
CN112671629B (zh) * 2020-09-24 2023-01-03 紫光云技术有限公司 一种云网络下专线接入的实现方法
CN112111471B (zh) * 2020-09-25 2022-05-03 中国科学院微生物研究所 广谱识别PAM序列的FnCpf1突变体及其应用
KR20230118716A (ko) * 2020-11-08 2023-08-11 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 올리고뉴클레오티드 조성물 및 이의 방법
JP2023550381A (ja) * 2020-11-19 2023-12-01 ウェイク・フォレスト・ユニバーシティ・ヘルス・サイエンシーズ 真核生物遺伝子編集のためのベクター、システムおよび方法
WO2022180153A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Allele-specific genome editing of the nr2e3 mutation g56r
CN114958920A (zh) * 2021-02-25 2022-08-30 北京中因科技有限公司 一种新型CRISPR-Cas9系统载体及其制备方法和应用
WO2022256283A2 (en) * 2021-06-01 2022-12-08 Korro Bio, Inc. Methods for restoring protein function using adar
CN113667734B (zh) * 2021-07-16 2022-05-24 四川大学华西医院 Shank3片段序列甲基化检测试剂在制备精神分裂症诊断试剂盒中的用途
TW202321454A (zh) * 2021-07-26 2023-06-01 美商夏洛克生物科學公司 經改良之ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓ技術
CN113717930A (zh) * 2021-09-07 2021-11-30 复旦大学附属华山医院 携带fbn1突变的颅颈动脉夹层特异诱导多能干细胞系
CA3232965A1 (en) * 2021-09-26 2023-03-30 Christopher Michael ACKER Compositions for editing mecp2 transcripts and methods thereof
WO2023196818A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 The Regents Of The University Of California Genetic complementation compositions and methods
CN114958911A (zh) * 2022-05-13 2022-08-30 吉林大学 利用eAID-Cas9构建的帕金森病兔模型及方法
WO2023225451A1 (en) * 2022-05-14 2023-11-23 The Regents Of The University Of California Genome editing systems for multiplexing point mutation introduction in living cells
CN114934031B (zh) * 2022-05-25 2023-08-01 广州瑞风生物科技有限公司 新型Cas效应蛋白、基因编辑系统及用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016205711A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
JP2017500035A (ja) 2013-12-12 2017-01-05 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子編集用のｃａｓ多様体

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5869326A (en) 1996-09-09 1999-02-09 Genetronics, Inc. Electroporation employing user-configured pulsing scheme
EP3808844A1 (en) 2012-07-25 2021-04-21 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
CN113528577A (zh) 2012-12-12 2021-10-22 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化
US8993233B2 (en) 2012-12-12 2015-03-31 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2932421A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
US20140189896A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP2931897B1 (en) 2012-12-12 2017-11-01 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
AU2013359212B2 (en) 2012-12-12 2017-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
AU2014281027A1 (en) 2013-06-17 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
CN107995927B (zh) 2013-06-17 2021-07-30 布罗德研究所有限公司 用于肝靶向和治疗的crispr-cas系统、载体和组合物的递送与用途
KR20160056869A (ko) 2013-06-17 2016-05-20 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 바이러스 구성성분을 사용하여 장애 및 질환을 표적화하기 위한 crispr-cas 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료 적용
CN106062197A (zh) 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
WO2014204723A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Oncogenic models based on delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions
BR112015031611A2 (pt) 2013-06-17 2017-12-12 Massachusetts Inst Technology aplicação, manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para direcionamento e modelação de doenças e distúrbios de células pós-mitóticas
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US10655173B2 (en) 2013-10-18 2020-05-19 The Broad Institute, Inc. Spatial and cellular mapping of biomolecules in situ by high-throughput sequencing
KR102380245B1 (ko) 2013-11-07 2022-03-30 에디타스 메디신, 인코포레이티드 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
MX2016007325A (es) 2013-12-12 2017-07-19 Broad Inst Inc Composiciones y metodos de uso de sistemas crispr-cas en desordenes debidos a repeticion de nucleotidos.
EP3080259B1 (en) 2013-12-12 2023-02-01 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
CN105899658B (zh) 2013-12-12 2020-02-18 布罗德研究所有限公司 针对hbv和病毒性疾病以及障碍的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
BR112016013213A2 (pt) 2013-12-12 2017-12-05 Massachusetts Inst Technology administração, uso e aplicações terapêuticas dos sistemas crispr-cas e composições para visar distúrbios e doenças usando componentes de administração de partículas
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
EP3080271B1 (en) 2013-12-12 2020-02-12 The Broad Institute, Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
CA2932478A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing
JP2017503485A (ja) 2013-12-12 2017-02-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 遺伝子産物の発現、構造情報、及び誘導性モジュラーｃａｓ酵素を変更するためのｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系並びに方法
DK3180426T3 (da) 2014-08-17 2020-03-30 Broad Inst Inc Genomredigering ved anvendelse af cas9-nickaser
WO2016049163A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder
WO2016049024A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016094880A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
WO2016094872A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
EP3234192B1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 The Broad Institute, Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
WO2016106244A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Crispr having or associated with destabilization domains
WO2016108926A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 The Broad Institute Inc. Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis
AU2017257274B2 (en) 2016-04-19 2023-07-13 Massachusetts Institute Of Technology Novel CRISPR enzymes and systems
CA3063739A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017500035A (ja) 2013-12-12 2017-01-05 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子編集用のｃａｓ多様体
WO2016205711A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Girelli Zubani G. et al.，Pms2 and uracil-DNA glycosylases act jointly in the mismatch repair pathway to generate Ig gene mutations at A-T base pairs，J ExpMed，2017年04月03日，Vol. 214(4)，pp. 1169-1180
Malzahn A. et al.，Plant genome editing with TALEN and CRISPR，Cell Biosci，2017年04月24日，Vol. 7:21，pp. 1-18
Pokharel S. et al.，Matching active site and substrate structures for an RNA editing reaction，J Am Chem Soc，2009年，Vol. 131(33)，pp. 11882-11891
Zheng Y. et al.，DNA editing in DNA/RNA hybrids by adenosine deaminases that act on RNA，Nucleic Acids Res，2017年01月28日，Vol. 45(6)，pp. 3369-3377

Also Published As

Publication number Publication date
CN111417727A (zh) 2020-07-14
EP3625343A1 (en) 2020-03-25
KR20200026804A (ko) 2020-03-11
CA3063739A1 (en) 2018-11-22
US11866697B2 (en) 2024-01-09
WO2018213708A1 (en) 2018-11-22
US20240076651A1 (en) 2024-03-07
US20200283755A1 (en) 2020-09-10
JP2023123486A (ja) 2023-09-05
AU2018270088B2 (en) 2024-05-16
AU2018270088A2 (en) 2020-02-13
AU2018270088A1 (en) 2020-01-16
JP2020520654A (ja) 2020-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7364472B2 (ja) 標的化された核酸編集のための系、方法、及び組成物
JP7454494B2 (ja) 標的化された核酸編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ－アデニンデアミナーゼ系の組成物、系及び方法
US11685916B2 (en) Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
EP3625342B1 (en) Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
US20210009972A1 (en) Systems methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
US20210130800A1 (en) Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
WO2019005886A1 (en) CRISPR / CAS-CYTIDINE DEAMINASE COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED EDITING OF NUCLEIC ACIDS
KR102678809B1 (ko) 표적화된 핵산 편집을 위한 시스템, 방법 및 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210517

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210517

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220628

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220927

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20230207

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230605

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230616

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20230705

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230919

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20231005

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7364472

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150