JP7454494B2 - 標的化された核酸編集のためのcrispr/cas-アデニンデアミナーゼ系の組成物、系及び方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年6月26日出願の米国仮出願第62/525,181号、2017年7月3日出願の米国仮出願第62/528,391号、2017年7月18日出願の米国仮出願第62/534,016号、2017年9月21日出願の米国仮出願第62/561,638号、2017年10月4日出願の米国仮出願第62/568,304号、2017年10月18日出願の米国仮出願第62/574,158号、2017年11月27日出願の米国仮出願第62/591,187号、及び2017年12月22日出願の米国仮出願第62/610,105号の恩典を主張する。上記で特定した出願の全内容は、全体として参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号MH100706、MH110049、及びHL141201の下で政府の支援を得てなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
2017年7月3日に作成され、サイズが891,043バイトである「Clin_var_pathogenic_SNPS_TC.txt」というタイトルのASCII準拠のテキストファイルは、EFS-WEBを介して本明細書とともに提出され、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
一般的な定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語と技術の定義は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、2nd edition(1989)(Sambrook,Fritsch、及びManiatis);Molecular Cloning:A Laboratory Manual、4th edition(2012)(Green and Sambrook);Current Protocols in Molecular Biology(1987)(F.M.Ausubel et al.eds.);the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(1995)(M.J.MacPherson,B.D.Hames,及びG.R.Taylor eds.):Antibodies,A Laboraotry Manual(1988)(Harlow and Lane,eds.):Antibodies A Laboraotry Manual,2nd edition 2013(E.A.Greenfield ed.);Animal Cell Culture (1987)(R.I.Freshney,ed.);Benjamin Lewin,Genes IX,Jones及びBartletが公開,2008(ISBN 0763752223);Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.が公開,1994(ISBN 0632021829);Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.が公開,1995(ISBN 9780471185710);Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley & Sons(New York,N.Y.1994),March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley & Sons(New York,N.Y.1992);ならびにMarten H. Hofker及びJan van Deursen,Transgenic Mouse Methods and Protocols,2nd edition(2011)に見出され得る。
本明細書に開示される実施形態は、標的塩基編集のための系、構築物、及び方法を提供する。一般に、本明細書で開示される系は、標的化構成要素及び塩基編集構成要素を含む。標的化構成要素は、1つ以上のヌクレオチドが編集される標的ヌクレオチド配列に、塩基編集構成要素を特に標的するように機能する。次に、塩基編集構成要素は、化学反応を触媒して、標的配列内の第1のヌクレオチドを第2のヌクレオチドに変換し得る。例えば、塩基エディターは、細胞の転写または翻訳機構によってグアニンとして読み取られるように、またはその逆になるようにアデニンの変換を触媒する場合がある。同様に、塩基編集構成要素は、シチジンからウラシルへの変換、またはその逆を触媒する場合がある。特定の例示的な実施形態では、アデニンデアミナーゼまたはシトジンデアミナーゼなどの既知の塩基エディターで開始することにより塩基エディターを導出し、指向性進化などの方法を使用して修正して、新しい機能性を導出してもよい。指向性の進化技術は当技術分野で公知であり、WO2015/184016“High-Throughput Assembly of Genetic Permutations”に記載されているものを含み得る。特定の態様における本発明は、それ自体本明細書に記載され、指向性進化を受けているデアミナーゼ、例えば、本明細書の他の場所に記載されている変異デアミナーゼ、ならびにそのようなデアミナーゼをコードするポリヌクレオチド(ベクター及び発現及び/または送達系を含む)、ならびにそのような変異デアミナーゼと標的化構成要素(本明細書の他のいずれかに説明されているポリヌクレオチド結合分子または系)との間の機能に等しく関係する。
「アデノシンデアミナーゼ」または「アデノシンデアミナーゼタンパク質」という用語は、以下に示されるように、アデニン(または分子のアデニン部分)をヒポキサンチン(または分子のヒポキサンチン部分)へと変換する加水分解的脱アミノ化反応を触媒する能力を有するタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質もしくはポリペプチドの1つ以上の機能ドメイン(複数可)を指すために本明細書で使用される。いくつかの実施形態では、アデニン含有分子は、アデノシン(A)であり、ヒポキサンチン含有分子は、イノシン(I)である。アデニン含有分子は、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)であり得る。
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、1つ以上の後生動物種に由来するものであり、こうした後生動物種には、限定されないが、哺乳類、トリ、カエル、イカ、サカナ、ハエ、及び虫が含まれる。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒト、イカ、またはDrosophilaのアデノシンデアミナーゼである。
ある特定の実施形態例では、指向性進化法を使用して、アデニンからヒポキサンチンへの脱アミノ化以外に追加の反応を触媒する能力を有する改変ADARタンパク質を設計してもよい。例えば、改変ADARタンパク質は、シチジンからウラシルへの脱アミノ化を触媒する能力を有し得る。特定の理論によって拘束されないが、CからUへの活性を改善する変異によって、より小さなシチジン塩基への適合性が向上するように結合ポケットの形状が変わり得る。
本発明の方法、ツール、及び組成物は、標的化ドメインと呼ばれ得る標的化構成要素を含むか、または利用する。標的化ドメインは、好ましくは、DNAまたはRNA標的化ドメイン、より具体的にはオリゴヌクレオチド標的化ドメイン、またはDNA及び/もしくはRNA結合活性を保持するその変異体もしくは断片である。オリゴヌクレオチド標的化ドメインは、標的遺伝子座でまたは標的遺伝子座に隣接する目的のRNAまたはDNAの配列、モチーフ、または構造的特徴に結合し得る。構造的特徴としては、ヘアピン、テトラループ、または核酸の他の二次的構造的特徴が含まれ得る。本明細書で使用される「隣接する」とは、アデノシンデアミナーゼがその塩基編集機能を完了し得る標的遺伝子座の距離及び/または方向の内であることを意味する。特定の例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチド結合タンパク質は、RNA結合タンパク質もしくはその機能的ドメイン、またはDNA結合タンパク質もしくはその機能的ドメインであり得る。
特定の例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチド結合ドメインは、RNA認識モチーフを含む、RNA結合タンパク質、またはその機能的ドメインを含むか、またはそれからなってもよい。RNA認識モチーフを含むRNA結合タンパク質の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない、A2BP1;ACF;BOLL;BRUNOL4;BRUNOL5;BRUNOL6;CCBL2;CGI96;CIRBP;CNOT4;CPEB2;CPEB3;CPEB4;CPSF7;CSTF2;CSTF2T;CUGBP1;CUGBP2;D10S102;DAZ1;DAZ2;DAZ3;DAZ4;DAZAP1;DAZL;DNAJC17;DND1;EIF3S4;EIF3S9;EIF4B;EIF4H;ELAVL1;ELAVL2;ELAVL3;ELAVL4;ENOX1;ENOX2;EWSR1;FUS;FUSIP1;G3BP;G3BP1;G3BP2;GRSF1;HNRNPL;HNRPA0;HNRPA1;HNRPA2B1;HNRPA3;HNRPAB;HNRPC;HNRPCL1;HNRPD;HNRPDL;HNRPF;HNRPH1;HNRPH2;HNRPH3;HNRPL;HNRPLL;HNRPM;HNRPR;HRNBP1;HSU53209;HTATSF1;IGF2BP1;IGF2BP2;IGF2BP3;LARP7;MKI67IP;MSI1;MSI2;MSSP2;MTHFSD;MYEF2;NCBP2;NCL;NOL8;NONO;P14;PABPC1;PABPC1L;PABPC3;PABPC4;PABPC5;PABPN1;POLDIP3;PPARGC1;PPARGC1A;PPARGC1B;PPIE;PPIL4;PPRC1;PSPC1;PTBP1;PTBP2;PUF60;RALY;RALYL;RAVER1;RAVER2;RBM10;RBM11;RBM12;RBM12B;RBM14;RBM15;RBM15B;RBM16;RBM17;RBM18;RBM19;RBM22;RBM23;RBM24;RBM25;RBM26;RBM27;RBM28;RBM3;RBM32B;RBM33;RBM34;RBM35A;RBM35B;RBM38;RBM39;RBM4;RBM41;RBM42;RBM44;RBM45;RBM46;RBM47;RBM4B;RBM5;RBM7;RBM8A;RBM9;RBMS1;RBMS2;RBMS3;RBMX;RBMX2;RBMXL2;RBMY1A1;RBMY1B;RBMY1E;RBMY1F;RBMY2FP;RBPMS;RBPMS2;RDBP;RNPC3;RNPC4;RNPS1;ROD1;SAFB;SAFB2;SART3;SETD1A;SF3B14;SF3B4;SFPQ;SFRS1;SFRS10;SFRS11;SFRS12;SFRS15;SFRS2;SFRS2B;SFRS3;SFRS4;SFRS5;SFRS6;SFRS7;SFRS9;SLIRP;SLTM;SNRP70;SNRPA;SNRPB2;SPEN;SR140;SRRP35;SSB;SYNCRIP;TAF15;TARDBP;THOC4;TIA1;TIAL1;TNRC4;TNRC6C;TRA2A;TRSPAP1;TUT1;U1SNRNPBP;U2AF1;U2AF2;UHMK1;ZCRB1;ZNF638;ZRSR1;及びZRSR2。
特定の実施形態では、核酸結合タンパク質は、(改変された)転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)系である。転写活性化因子様エフェクター(Transcription activator-like effectors)(TALEs)は、実際に任意の所望のDNA配列に結合するように設計されてもよい。TALEN系を使用したゲノム編集の例示的な方法は、例えばCermak T.Doyle EL.Christian M.Wang L.Zhang Y.Schmidt C,et al.Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.Nucleic Acids Res.2011;39:e82;Zhang F.Cong L.Lodato S.Kosuri S.Church GM.Arlotta P Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription.Nat Biotechnol.2011;29:149-153ならびに米国特許第8,450,471号、同第8,440,431号、及び同第8,440,432号に見出され得、これらは全て参照により具体的に組み込まれている。さらなるガイダンスにより、そして限定するものではないが、天然に存在するTALEまたは「野生型TALE」とは、プロテオバクテリアの多くの種によって分泌される核酸結合タンパク質である。TALEポリペプチドは、長さが主に33、34または35アミノ酸であり、主にアミノ酸位置12及び13が互いに異なる、高度に保存されたモノマーポリペプチドのタンデムリピートから構成される核酸結合ドメインを含む。有利な実施形態では、この核酸は、DNAである。本明細書で使用される場合「ポリペプチドモノマー」または「TALEモノマー」という用語は、TALE核酸結合ドメイン内の高度に保存された反復ポリペプチド配列を指すために使用され、「反復可変二残基」または「RVD」という用語は、ポリペプチドモノマーの位置12及び13の高度に可変性のアミノ酸を指すために使用される。本開示を通して提供されるように、RVDのアミノ酸残基は、アミノ酸のIUPAC一文字コードを使用して描かれている。DNA結合ドメイン内に含まれるTALEモノマーの一般的な表現は、X1-11-(X12X13)-X14-33もしくは34または35であり、下付き文字はアミノ酸位置を示し、Xは任意のアミノ酸を示す。X12X13は、RVDを示す。いくつかのポリペプチドモノマーでは、13位の可変アミノ酸が欠落しているか存在せず、そのようなポリペプチドモノマーでは、RVDは単一のアミノ酸からなる。そのような場合、RVDは、代替的にX*として表されてもよく、XはX12を表し、(*)はX13がないことを示す。DNA結合ドメインは、TALEモノマーのいくつかの反復を含み、これは、(X1-11-(X12X13)-X14-33または34もしくは35)zとして表されてもよく、有利な実施形態では、zは少なくとも5~40である。さらに有利な実施形態では、zは少なくとも10~26である。TALEモノマーは、そのRVD中のアミノ酸の同一性により決定されるヌクレオチド結合親和性を有する。例えば、NIのRVDを有するポリペプチドモノマーは、アデニン(A)に優先的に結合し、NGのRVDを有するポリペプチドモノマーは、チミン(T)に優先的に結合し、HDのRVDを有するポリペプチドモノマーは、シトシン(C)に優先的に結合し、NNのRVDを有するポリヌクレオチドモノマーは、アデニン(A)とグアニン(G)の両方に優先的に結合する。本発明のさらに別の実施形態では、IGのRVDを有するポリペプチドモノマーは、Tに優先的に結合する。したがって、TALEの核酸結合ドメインにおけるポリペプチドモノマー反復の数及び順序が、その核酸標的特異性を決定する。本発明のなおさらなる実施形態では、NSのRVDを有するポリペプチドモノマーは、4つの塩基対全てを認識し、A、T、GまたはCに結合し得る。TALEの構造及び機能は、例えば、Moscou et al.,Science 326:1501(2009);Boch et al.,Science 326:1509-1512(2009);及びZhang et al.,Nature Biotechnology 29:149~153(2011)にさらに記載されており、これらはそれぞれその全体が参照により組み込まれる。特定の実施形態では、標的化は、TALEN断片に結合するポリ核酸によって達成される。特定の実施形態では、標的化ドメインは、触媒的に不活性なTALENまたはその核酸結合断片を含むか、またはそれからなる。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、(改変された)亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)系を含むか、またはそれからなる。ZFN系は、所望のDNA配列を標的するように操作され得る、ジンクフィンガーDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することにより生成された人工制限酵素を使用する。ZFNを使用したゲノム編集の例示的な方法は、例えば、米国特許第6,534,261号、同第6,607,882号、同第6,746,838号、同第6,794,136号、同第6,824,978号、同第6,866,997号、同第6,933,113号、同第6,979,539号、同第7,013,219号、同第7,030,215号、同第7,220,719号、同第7,241,573号、同第7,241,574号、同第7,585,849、同第7,595,376号、同第6,903,185号及び同第6,479,626号に見出され得、これらは全て参照により具体的に組み込まれる。さらなる手引きにより、そしてこれに限定されないが、人工亜鉛フィンガー(ZF)技術には、ゲノム内の新しいDNA結合部位を標的とするZFモジュールのアレイが含まれる。ZFアレイの各フィンガーモジュールは、3つのDNA塩基を標的とする。個々の亜鉛フィンガードメインのカスタマイズされたアレイは、ZFタンパク質(ZFP)にアセンブルされる。ZFPは機能ドメインを含んでもよい。最初の合成ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、ZFタンパク質をIIS型制限酵素FokIの触媒ドメインに融合することにより開発された。(Kim,Y.G.et al.,1994,Chimeric restriction endonuclease,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91、883-887;Kim,Y.G.et al.,1996,Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions to FokI cleavage domain.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,1156-1160)。それぞれが短いスペーサーで隔てられた異なるヌクレオチド配列を標的とする、対になったZFNヘテロダイマーを使用することにより、オフ標的活性の低下にともなって、切断特異性の増大が達成され得る。(Doyon、Y. et al.,2011,Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures.Nat.Methods 8,74-79)。ZFPは、転写活性化因子及びリプレッサーとして設計されてもよく、広範な種々の生物の多くの遺伝子を標的とするために使用されてきた。特定の実施形態では、標的化ドメインは、核酸結合亜鉛フィンガーヌクレアーゼまたはその核酸結合断片を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼに結合する核酸(その断片)は触媒的に不活性である。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、大きな改変部位(12~40塩基対の二本鎖DNA配列)を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである(改変)メガヌクレアーゼを含む。メガヌクレアーゼを使用するための例示的な方法は、米国特許第8,163,514号、同第8,133,697号;同第8,021,867号;同第8,119,361号;同第8,119,381号;同第8,124,369号;及び同第8,129,134号に見出され得、これらは参照により具体的に組み込まれる。特定の実施形態では、標的化は、ポリ核酸結合メガヌクレアーゼ断片によって達成される。特定の実施形態では、標的化は、触媒的に不活性なメガヌクレアーゼ(断片)に結合するポリ核酸によって達成される。したがって、特定の実施形態では、標的化ドメインは、核酸結合メガヌクレアーゼまたはその核酸結合断片を含むか、またはそれからなる。
特定の実施形態では、標的化ドメインは、(改変された)CRISPR/Cas複合体または系を含む。CRISPR/Cas系、その構成要素、及びそのような構成要素の送達に関する一般情報、例としては、方法、材料、送達媒体、ベクター、粒子、ならびにその作成及び使用(量及び製剤に関してを含む)、ならびに、CRISPR/Cas発現真核細胞、CRISPR/Cas発現真核生物、例えば、マウスは、本明細書の他のいずれかに記載される。特定の実施形態では、標的化は、オリゴ核酸結合CRISPRタンパク質(断片)及び/またはgRNAによって達成される。従って、特定の実施形態では、標的化ドメインは、触媒的に不活性なCRISPRタンパク質(断片)に結合する核酸によって達成される。したがって、特定の実施形態では、標的化ドメインは、CRISPRタンパク質に結合するオリゴ核酸、またはCRISPRタンパク質及び/もしくはgRNAのオリゴ核酸結合断片を含む。
クラス2のV型CRISPR-Casタンパク質のガイド分子またはガイドRNAは、tracr- mate配列(内在性CRISPR系との関連では「ダイレクトリピート配列」を包含する)及びガイド配列(内在性CRISPR系との関連では「スペーサー」とも称される)を含む。実際、タイプIICRISPR-Casタンパク質とは対照的に、Cas13タンパク質は、tracr配列の存在には依存しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のCRISPR-Cas系またはCRISPR-Cas複合体は、(例えば、Casタンパク質がCas13である場合)tracr配列を含まないか、及び/またはtracr配列の存在に依存しない。ある特定の実施形態では、ガイド分子は、ガイド配列またはスペーサー配列に融合または連結されたダイレクトリピート配列を含んでもよいし、当該ダイレクトリピート配列から本質的になってもよいし、または当該ダイレクトリピート配列からなってもよい。
ある特定の実施形態では、本発明のガイドは、天然には存在しない核酸、及び/または天然には存在しないヌクレオチド、及び/またはヌクレオチドアナログ、及び/または化学的改変を含む。天然には存在しない核酸としては、例えば、天然に存在するヌクレオチド、及び天然には存在しないヌクレオチドの混合物が挙げられる。天然には存在しないヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログは、リボース部分、リン酸部分、及び/または塩基部分が改変され得る。本発明のある1つの実施形態では、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。そのような実施形態の1つでは、ガイドは、1つ以上のリボヌクレオチド及び1つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある1つの実施形態では、ガイドは、1つ以上の天然には存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチド、ボラノリン酸連結を有する、リボース環の2(Å≦)と4(Å≦)炭素との間にメチレン架橋を含むロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)、または架橋型核酸(BNA)を含む。改変ヌクレオチドの他の例としては、2’-O-メチルアナログ、2’-デオキシアナログ、2’-チオウリジンアナログ、N6-メチルアデノシンアナログ、または2’-フルオロアナログが挙げられる。改変塩基の追加の例としては、2’位置の化学部分の連結が挙げられ、これには限定されないが、ペプチド、核局在化配列(NLS)、ペプチド核酸(PNA)、ポリエチレングリコール(PEG)、トリエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール(TEG)が挙げられる。改変塩基のさらなるの例としては、限定されないが、2-アミノプリン、5-ブロモ-ウリジン、シュードウリジン(CE(登録商標))、N1-メチルシュードウリジン(melCE(登録商標))、5-メトキシウリジン(5moU)、イノシン、7-メチルグアノシンが挙げられる。ガイドRNAの化学改変の例としては、限定するものではないが、2’-O-メチル(M)、2’-O-メチル3’ホスホロチオエート(MS)、ホスホロチオエート(PS)、S-拘束エチル(cEt)、2’-O-メチル3’チオPACE(MSP)、または2’-O-メチル-3’-ホスホノアセテート(MP)を1つ以上の末端ヌクレオチドに組み込むことが挙げられる。化学的に改変されたそのようなガイドは、オン標的特異性とオフ標的特異性との対比結果は予測不可能であるものの、非改変ガイドと比較して安定性の向上、及び活性の増大を含み得る(2015年6月29日にオンラインで公開されたHendel,2015,Nat Biotechnol.33(9):985-9,doi:10.1038/nbt.3290;Ragdarm et al.,0215,PNAS,E7110-E7111;Allerson et al.,J.Med.Chem.2005,48:901-904;Bramsen et al.,Front.Genet.,2012,3:154;Deng et al.,PNAS,2015,112:11870-11875、Sharma et al.,MedChemComm.,2014,5:1454-1471;Hendel et al.,Nat.Biotechnol.(2015)33(9):985-989;Li et al.,Nature Biomedical Engineering,2017,1,0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066;Ryan et al.,Nucleic Acids Res.(2018)46(2):792-803を参照のこと)。いくつかの実施形態では、ガイドRNAの5’末端及び/または3’末端は、さまざまな機能性部分によって改変され、こうした機能性部分としては、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグが含まれる。(Kelly et al.,2016,J.Biotech.233:74-83を参照のこと)。
ある特定の実施形態では、ガイドは、標的DNAに結合する領域にリボヌクレオチドを含み、Cas9、Cpf1、C2c1またはCas13に結合する領域に1つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログを含む。本発明のある1つの実施形態では、デオキシリボヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログは、操作されたガイド構造、例えば、限定されないが、5’及び/または3’末端、ステムループ領域及びシード領域などに組み込まれる。ある特定の実施形態では、こうした改変は、ステムループ領域の5’ハンドルには存在しない。ガイドのステムループ領域の5’ハンドルを化学的に改変するとガイドの機能が消失し得る(Li,et al.,Nature Biomedical Engineering,2017,1:0066を参照のこと)。ある特定の実施形態では、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、または少なくとも75個のヌクレオチドが化学的に改変される。いくつかの実施形態では、ガイドの3’末端または5’末端のいずれかに位置する3~5ヌクレオチドが化学的に改変される。いくつかの実施形態では、シード領域にごく軽微な改変(2’-F改変など)が導入される。いくつかの実施形態では、ガイドの3’末端に2’-F改変が導入される。ある特定の実施形態では、ガイドの5’末端及び/または3’末端に位置する3~5ヌクレオチドが、2’-O-メチル(M)、2’-O-メチル3’ホスホロチオエート(MS)、S-拘束エチル(cEt)、2’-O-メチル3’-チオPACE(MSP)または2’-O-メチル-3’-ホスホノアセテート(MP)で化学的に改変される。そのような改変によってゲノム編集効率が増進し得る(Hendel et al.,Nat.Biotechnol.(2015)33(9):985-989;Ryan et al.,Nucleic Acids Res.(2018)46(2):792-803を参照のこと)。
ある特定の実施形態では、遺伝子破壊のレベルを増進させるために、ガイドのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート(PS)で置き換えられる。ある特定の実施形態では、ガイドの5’末端及び/または3’末端に位置する5ヌクレオチド超が、2’-O-Me、2’-F、またはS-拘束エチル(cEt)で化学的に改変される。化学的に改変されたそのようなガイドでは、媒介する遺伝子破壊のレベルが増進し得る(Ragdarm et al.,0215,PNAS,E7110-E7111を参照のこと)。本発明のある1つの実施形態では、ガイドは、その3’末端及び/または5’末端に化学的部分を含むように改変される。そのような部分には、限定されないが、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)、ローダミン、ペプチド、核局在化配列(NLS)、ペプチド核酸(PNA)、ポリエチレングリコール(PEG)、トリエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール(TEG)が挙げられる。ある特定の実施形態では、化学部分は、リンカー(アルキル鎖など)によってガイドに結合される。ある特定の実施形態では、改変ガイドの化学的部分は、ガイドを別の分子(DNA、RNA、タンパク質、またはナノ粒子など)に付加するために使用され得る。化学的に改変されたそのようなガイドは、CRISPR系によって一般に編集された細胞の同定または富化に使用され得る(Lee et al.,eLife,2017,6:e25312,DOI:10.7554を参照のこと)。いくつかの実施形態では、3ヌクレオチドは、3’及び5’末端の各々で、化学的に改変される。特定の実施形態では、この改変は、2’-O-メチルまたはホスホロチオエートアナログを含む。特定の実施形態では、テトラループの12ヌクレオチド及びステムループ領域の16ヌクレオチドが、2’-O-メチルアナログで置き換えられている。このような化学改変は、インビボでの編集及び安定性を改善する。(Finn et al.,Cell Reports(2018),22:2227-2235を参照のこと)。いくつかの実施形態では、ガイドの60または70を超えるヌクレオチドが化学的に改変されている。いくつかの実施形態では、この改変は、ヌクレオチドの2’-O-メチルまたは2’-フルオロヌクレオチドアナログによる置換、またはホスホジエステル結合のホスホロチオエート(PS)改変を含む。いくつかの実施形態では、化学改変は、CRISPR複合体が形成される場合のヌクレアーゼタンパク質の外側に延びるガイドヌクレオチドの2’-O-メチルもしくは2’-フルオロ改変、またはガイドの3’末端の20から30以上のヌクレオチドのPS改変を含む。特定の実施形態では、化学改変は、ガイドの5’末端に2’-O-メチルアナログ、またはシード及びテール領域に2’-フルオロアナログをさらに含む。そのような化学改変は、ヌクレアーゼ分解に対する安定性を改善し、ゲノム編集活性または効率を維持または強化するが、全てのヌクレオチドの改変は、ガイドの機能を無効にし得る(Yin et al.,Nat.Biotech.(2018)、35(12):1179-1187を参照のこと)。このような化学改変は、限られた数のヌクレアーゼ及びRNA 2’-OH相互作用の知識を含む、CRISPR複合体の構造の知識によって導かれる場合がある(Yin et al.,Nat.Biotech.(2018),35(12):1179-1187を参照のこと)。
いくつかの実施形態では、1つ以上のガイドRNAヌクレオチドは、DNAヌクレオチドで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、5’末端テール/シードガイド領域の最大2、4、6、8、10、または12個のRNAヌクレオチドがDNAヌクレオチドで置換される。特定の実施形態では、3’末端のガイドRNAヌクレオチドの大部分がDNAヌクレオチドで置換されている。特定の実施形態では、3’末端の16個のガイドRNAヌクレオチドが、DNAヌクレオチドで置換されている。特定の実施形態では、5’末端テール/シード領域の8個のガイドRNAヌクレオチド及び3’末端の16個のRNAヌクレオチドが、DNAヌクレオチドで置換されている。特定の実施形態では、CRISPR複合体が形成されるときにヌクレアーゼタンパク質の外側に延びるガイドRNAヌクレオチドは、DNAヌクレオチドで置換される。複数のRNAヌクレオチドをDNAヌクレオチドでこのように置換すると、オフ標的活性は低下するが、変更されていないガイドと比較して同様のオン標的活性につながる;ただし、3’末端の全てのRNAヌクレオチドを置換すると、ガイドの機能が失われる場合がある(Yin et al.,Nat.Chem.Biol.(2018)14、311-316を参照のこと)。そのような改変は、限られた数のヌクレアーゼ及びRNA 2’-OH相互作用の知識を含む、CRISPR複合体の構造の知識によって導かれ得る(Yin et al.,Nat.Chem.Biol.(2018)14,311-316を参照のこと)。
一態様では、ガイドは、非ホスホジエステル結合を介して化学的に連結または結合されるtracr配列及びtracr mate配列を含む。一態様では、このガイドは、非ヌクレオチドループを介して化学的に連結または結合されたtracr配列及びtracr mate配列を含む。いくつかの実施形態では、tracr及びtracr mate配列は、非ホスホジエステル共有リンカーを介して結合される。共有結合リンカーの例としては、限定するものではないが、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、フルフォン、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、光不安定性結合、C-C結合形成基、例えば、ディールス・アルダー環付加ペアまたは閉環メタセシスペア、及びマイケル反応ペアからなる群より選択される化学基が挙げられる。
第1のアプタマー/RNA結合タンパク質対を有する1つのガイドを、活性化因子に連結または融合してもよいが、第2のアプタマー/RNA結合タンパク質対を有する第2のガイドは、リプレッサーに連結または融合してもよい。ガイドは異なる標的(遺伝子座)のためのものであるため、これにより、1つの遺伝子を活性化し、1つの遺伝子を抑制することが可能になる。例えば、次の模式図はそのようなアプローチを示している。
特定の実施形態では、アダプタータンパク質は、MS2、PP7、Qβ、F2、GA、fr、JP501、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、φCb5、ΦCb8r、φCb12r、φCb23r、7s、PRR1を含む。
本発明者らは、本明細書で定義されるCRISPR酵素が、活性を失うことなく2つ以上のRNAガイドを使用し得ることを示した。これにより、本明細書で定義される単一の酵素、系または複合体を用いて、複数のDNA標的、遺伝子または遺伝子座を標的化するための、本明細書で定義されるCRISPR酵素、系または複合体の使用が可能になる。ガイドRNAは、タンデムに配列されてもよく、任意選択で、本明細書で定義されるダイレクトリピートなどのヌクレオチド配列によって隔てられてもよい。異なるガイドRNAの位置は、タンデムが活性に影響を与えないことである。「CRISPR-Cas系」、「CRISP-Cas複合体」、「CRISPR複合体」及び「CRISPR系」という用語は、互換的に使用されることに注意のこと。「CRISPR酵素」、「Cas酵素」、または「CRISPR-Cas酵素」という用語も互換的に使用され得る。好ましい実施形態では、当該CRISPR酵素、CRISP-Cas酵素またはCas酵素は、Cas13、または本明細書の他のいずれかに記載されているその改変または変異バリアントのいずれか1つである。
I.以下を含む2つ以上のCRISPR-Cas系ポリヌクレオチド配列
(a)ポリヌクレオチド遺伝子座の最初の標的配列にハイブリダイズし得る最初のガイド配列、
(b)ポリヌクレオチド遺伝子座の第2の標的配列にハイブリダイズし得る第2のガイド配列、
(c)ダイレクトリピート配列、
ならびに
II.Cas13酵素またはそれをコードする第2のポリヌクレオチド配列、
ここで、転写されると、第1及び第2のガイド配列は、それぞれ第1及び第2のCas13 CRISPR複合体の第1及び第2の標的配列への配列特異的結合を誘導し、
ここで、この第1のCRISPR複合体は、第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列と複合体化したCas13酵素を含み、
ここで、第2のCRISPR複合体は、第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列と複合体化したCas13酵素を含み、かつ
ここで、第1ガイド配列は、第1標的配列近くのDNA二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、第2ガイド配列は、二本鎖切断を誘発する第2標的配列近くの他方の鎖の切断を指示し、それにより生物または非ヒトまたは非ヒト生物を改変する。同様に、3つ以上のガイドRNAを含む組成物が想定され得、例えば、それぞれが1つの標的に特異的であり、本明細書に記載の組成物またはCRISPR系または複合体にタンデムに配列され得る。
一態様では、本発明は、エスコート型Cas13 CRISPR-Cas系、または複合体、特にエスコート型のCas13 CRISPR-Cas系ガイドを含む系などを提供する。「エスコート型(escorted)」とは、Cpf1 CRISPR-Casの系または複合体またはガイドが、選択された時間に細胞内に送達されるか、または細胞内の選択された場所に送達され、その結果、Cpf1 CRISPR-Casの系または複合体またはガイドの活性が空間的または時間的に制御されることを意味する。例えば、Cas13 CRISPR-Cas系または複合体またはガイドの活性及び目的地は、アプタマーリガンド(細胞表面タンパク質または他の局在化細胞構成要素など)に対する結合親和性を有するエスコートRNAアプタマー配列によって制御され得る。あるいは、エスコートアプタマーは、例えば、一過性エフェクター(特定の時間に細胞に適用される外的エネルギー源など)などの細胞上アプタマーエフェクターまたは細胞内アプタマーエフェクターに応答性であり得る。
細胞内の目的のゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズし得るRNAガイド配列;及び、
エスコートRNAアプタマー配列、ここで、エスコートアプタマーは、細胞上もしくは細胞内のアプタマーリガンドに対して結合親和性を有するか、またはエスコートアプタマーは、細胞上または細胞内の局在化アプタマーエフェクターに応答し、アプタマーリガンドもしくはエフェクターの細胞または細胞内の存在は空間的または時間的に制限されている。
一態様では、本発明の目的は、標的DNAに対するガイドRNAの結合特異性の熱力学的調整により、個々のガイドRNAを与えられたCas13の特異性をさらに高めることである。これは、ゲノムのオフ標的上の標的されたゲノム遺伝子座に、熱力学的な利点を与えるために、ゲノム標的とその潜在的なオフ標的遺伝子座との間で共有される相補塩基対ミスマッチ塩基の数を増減するために、ガイド配列のミスマッチ、伸長または切断を導入するという一般的なアプローチである。
コンピューターシステム、例えば、プロセッサ、データストレージシステム、入力デバイス、及び出力デバイスを含むプログラムされたコンピューターを使用する以下のステップ:
(a)例えば、CRISPR-Cas13系結合ドメインまたは代替として、または追加して、Cas13オルソログの中の変化に基づいて変化するドメイン中で、またはCas13sに関してまたはニッカーゼに関して、または機能的群に関して、任意選択で、CRISPR-Cas13複合体(複数可)からの構造情報を用いて、CRISPR-Cas13結晶構造からの、またはCRISPR-Cas13結晶構造に関連する原子のサブセットの3次元座標を含む当該入力デバイスデータを介してプログラムされたコンピューターに入力し、それによって、データセットを生成すること;
(b)上記プロセッサを使用して、上記データセットを、上記コンピューターデータストレージシステムに記憶された構造のコンピューターデータベース、例えば、CRISPR-Cas13系に結合もしくは推定結合するか、または結合することが望まれる化合物の構造と、またはCas13オルソログ(例えば、Cas13sまたはCas13オルソログ間で異なるドメインまたは領域)またはCRISPR-Cas13結晶構造またはニッカーゼに関してまたは官能基に関して比較すること;
(c)コンピューター手法を使用して、上記のデータベースから、構造-例えば、所望の構造に結合し得るCRISPR-Cas13構造、特定のCRISPR-Cas13構造に結合し得る所望の構造、操作され得るCRISPR-Cas13系の一部(例えば、CRISPR-Cas13結晶構造の他の部分由来、及び/またはCas13オルソログ、切断されたCas13s、新規ニッカーゼもしくは特定の官能基、または官能基もしくは官能基CRISPR-Cas13系を結合するための位置からのデータに基づいて)を選択すること;
(d)選択された構造(複数可)のモデルを、コンピューター法を使用して構築すること;ならびに
(e)選択した構造(複数可)を当該出力デバイスに出力すること;
ならびに任意選択で、選択した構造(複数可)の1つ以上を合成すること;
ならびに、任意選択で、当該合成された選択された構造(複数可)を、CRISPR-Cas13系として、またはCRISPR-Cas13系で、さらに試験すること;
あるいは、当該方法は、CRISPR-Cas13結晶構造の少なくとも2つの原子の座標、例えば、CRISPR-Cas13結晶構造の本明細書の結晶構造表の少なくとも2つの原子の座標、またはCRISPR-Cas13結晶構造の少なくともサブドメインの座標(「選択された座標」)を提供すること、例えば、CRISPR-Cas13結晶構造の他の一部由来、及び/またはCas13オルソログ由来のデータに基づいて、操作され得る結合分子を含む候補の構造またはCRISPR-Cas13系の一部を提供すること、ならびに候補の構造を選択された座標にあてはめて、それによって、所望の構造に結合し得るCRISPR-Cas13構造、特定のCRISPR-Cas13構造に結合し得る所望の構造、操作され得るCRISPR-Cas13系の一部、切断されたCas13、新規ニッカーゼ、または特定の官能基、または官能基または官能基CRISPR-Cas13系に結合するための位置、及びその出力を含む生成物データをその出力を用いて取得すること;及び任意選択で、上記製品データから化合物(複数可)を合成し、さらに、任意選択で、CRISPR-Cas13系として、またはCRISPR-Cas13系内で当該合成化合物(複数可)を試験することを含む。
その未改変形態において、CRISPR-Casタンパク質は触媒活性タンパク質である。これは、核酸標的化複合体(標的配列にハイブリダイズしたガイドRNAを含む)の形成時に、標的配列(例えば、それに由来する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50以上の塩基対)における、またはその近くの一方または両方のDNA鎖が改変される(例えば、開裂される)ことを意味する。本明細書で使用される「目的の標的遺伝子座に関連する配列(複数可)」という用語は、標的配列の近くにある配列を指す(例えば、標的配列が、目的の標的遺伝子座内に含まれる、標的配列から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、またはそれ以上の塩基対内)。非改変触媒活性Cas13タンパク質は、スタッガードカットを生成し、それにより、カット部位は典型的には標的配列内にある、より詳細には、スタッガードカットは、典型的には、PAMから13~23ヌクレオチド遠位である。特定の実施形態では、非標的鎖上の切断は、PAMの下流17ヌクレオチド(すなわち、PAMの下流17ヌクレオチドと18ヌクレオチドとの間)であるが、標的鎖のカット(すなわち、ガイド配列とハイブリダイズする鎖)は、PAMに相補的な配列からさらに4ヌクレオチド離れて発生する。(これは、3’鎖上のPAMの補体の21ヌクレオチド上流、またはPAMの補体の上流21ヌクレオチドと22ヌクレオチドの間である)。
いくつかの実施形態では、AD機能化CRISPR系は、塩基除去修復(BER)阻害剤をさらに含む。いずれの特定の理論によっても拘束されることは望まないが、I:T対形成の存在に対する細胞DNA修復応答は、細胞における核酸塩基編集効率の低下の原因となり得る。アルキルアデニンDNAグリコシラーゼ(DNA-3-メチルアデニングリコシラーゼ、3-アルキルアデニンDNAグリコシラーゼ、またはN-メチルプリンDNAグリコシラーゼとしても知られる)は、細胞におけるDNAからのヒポキサンチンの除去を触媒し、これによって塩基除去修復が始まることによって、結果としてI:T対がA:T対へと復帰し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、目的の標的遺伝子座におけるアデニンを改変することに関し、これによりこの標的遺伝子座は、細胞内に含まれる。本発明の方法において使用されるCRISPR-Casタンパク質及び/またはアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインの核への標的化を改善するためには、これらの構成要素のうちの1つまたは両方を1つ以上の核局在化配列(NLS)とともに提供することが有利であり得る。
特定の実施形態では、直交性の触媒的に不活性な独立したCRISPR-Casタンパク質と組み合わせてCas13ニッカーゼを使用することで、当該Cas13ニッカーゼの効率が向上する(Chen et al.2017,Nature Communications 8:14958;doi:10.1038/ncomms14958に記載されている)。より具体的には、触媒的に不活性なCRISPR-Casタンパク質は、AD機能化CRISPR系において使用されるCas13ニッカーゼとはPAM認識部位が異なることによって特徴付けられ、対応ガイド配列は、AD機能化CRISPR系のCas13ニッカーゼの標的配列付近に位置する標的配列に結合するように選択される。本発明と関連して使用される触媒的に不活性な独立したCRISPR-Casタンパク質は、AD機能化CRISPR系の一部を形成するものではなく、単に、当該Cas13ニッカーゼの効率の向上させるために機能するものにすぎず、当該CRISPR-Casタンパク質について当該技術分野において説明される標準的なガイド分子と組み合わせて使用される。特定の実施形態では、当該直交性の触媒的に不活性なCRISPR-Casタンパク質は、デッドCRISPR-Casタンパク質であり、すなわち、当該CRISPR-Casタンパク質のヌクレアーゼ活性を消失させる1つ以上の変異を含むものである。特定の実施形態では、触媒的に不活性な直交性のCRISPR-Casタンパク質は、Cas13ニッカーゼの標的配列付近に位置する標的配列にハイブリダイズし得る2つ以上のガイド分子とともに提供される。特定の実施形態では、当該触媒的に不活性なCRISPR-Casタンパク質の標的化のために少なくとも2つのガイド分子が使用され、当該少なくとも2つのガイド分子のうちの少なくとも1つのガイド分子は、Cas13ニッカーゼの標的配列の5”側に位置する標的配列にハイブリダイズする能力を有し、当該少なくとも2つのガイド分子のうちの少なくとも1つのガイド分子は、AD機能化CRISPR系のCas13ニッカーゼの標的配列の3’側に位置する標的配列にハイブリダイズする能力を有し、当該1つ以上の標的配列は、Cas13ニッカーゼの標的配列と同じまたは逆のDNA鎖上に存在し得る。特定の実施形態では、直交性の触媒的に不活性なCRISPR-Casタンパク質の1つ以上のガイド分子のためのガイド配列は、AD機能化CRISPRの標的化のため、すなわち、Cas13ニッカーゼの標的化のためのガイド分子の標的配列付近に標的配列が位置するように選択される。特定の実施形態では、直交性の触媒的に不活性な独立したCRISPR-Cas酵素の1つ以上の標的配列はそれぞれ、Cas13ニッカーゼの標的配列と離れており、その分離距離は、5塩基を超えるが、450塩基対には満たない。直交性の触媒的に不活性なCRISPR-Casタンパク質とともに使用するためのガイドの標的配列と、AD機能化CRISPR系の標的配列との間の最適距離は、当業者であれば決定し得る。特定の実施形態では、直交性CRISPR-Casタンパク質は、クラスIIのII型CRISPRタンパク質である。特定の実施形態では、直交性CRISPR-Casタンパク質は、クラスIIのV型CRISPRタンパク質である。特定の実施形態では、触媒的に不活性な独立したCRISPR-Casタンパク質である。特定の実施形態では、触媒的に不活性な独立したCRISPR-Casタンパク質は、本明細書の他のいずれかに記載ように、そのPAM特異性が変化するように改変されている。特定の実施形態では、Cas13タンパク質ニッカーゼは、それ自体によるヒト細胞における活性の制限は有するものの、不活性な直交性CRISPR-Casタンパク質、及び1つ以上の対応する近位ガイドと組み合わせることによって必要ニッカーゼ活性が確保されるニッカーゼである。
本発明は、下記の文献に示されるCRISPR-Casの開発及び使用の態様に基づいてさらに例示及び拡張され得るものであり、このことは、具体的には、細胞及び生物におけるCRISPRタンパク質複合体の送達及びRNAガイド型エンドヌクレアーゼの使用に関する:
・Multiplex genome engineering using CRISPR-Cas systems.Cong,L.,Ran,F.A.,Cox,D.,Lin,S.,Barretto,R.,Habib,N.,Hsu,P.D.,Wu,X.,Jiang,W.,Marraffini,L.A.,& Zhang,F.Science Feb 15;339(6121):819-23(2013);
・RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.Jiang W.,Bikard D.,Cox D.,Zhang F,Marraffini LA.Nat Biotechnol Mar;31(3):233-9(2013);
・One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR-Cas-Mediated Genome Engineering.Wang H.,Yang H.,Shivalila CS.,Dawlaty MM.,Cheng AW.,Zhang F.,Jaenisch R.Cell May 9;153(4):910-8(2013);
・Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.Konermann S,Brigham MD,Trevino AE,Hsu PD,Heidenreich M,Cong L,Platt RJ,Scott DA,Church GM,Zhang F.Nature.Aug 22;500(7463):472-6.doi:10.1038/Nature12466.Epub 2013 Aug 23(2013);
・Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity.Ran,FA.,Hsu,PD.,Lin,CY.,Gootenberg,JS.,Konermann,S.,Trevino,AE.,Scott,DA.,Inoue,A.,Matoba,S.,Zhang,Y.,& Zhang,F.Cell Aug 28.pii:S0092-8674(13)01015-5(2013-A);
・DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.Hsu,P.,Scott,D.,Weinstein,J.,Ran,FA.,Konermann,S.,Agarwala,V.,Li,Y.,Fine,E.,Wu,X.,Shalem,O.,Cradick,TJ.,Marraffini,LA.,Bao,G.,& Zhang,F.Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647(2013);
・Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.Ran,FA.,Hsu,PD.,Wright,J.,Agarwala,V.,Scott,DA.,Zhang,F.Nature Protocols Nov;8(11):2281-308(2013-B);
・Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells.Shalem,O.,Sanjana,NE.,Hartenian,E.,Shi,X.,Scott,DA.,Mikkelson,T.,Heckl,D.,Ebert,BL.,Root,DE.,Doench,JG.,Zhang,F.Science Dec 12.(2013);
・Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA.Nishimasu,H.,Ran,FA.,Hsu,PD.,Konermann,S.,Shehata,SI.,Dohmae,N.,Ishitani,R.,Zhang,F.,Nureki,O.Cell Feb 27,156(5):935-49(2014);
・Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.Wu X.,Scott DA.,Kriz AJ.,Chiu AC.,Hsu PD.,Dadon DB.,Cheng AW.,Trevino AE.,Konermann S.,Chen S.,Jaenisch R.,Zhang F.,Sharp PA.Nat Biotechnol.Apr 20.doi:10.1038/nbt.2889(2014);
・CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling.Platt RJ,Chen S,Zhou Y,Yim MJ,Swiech L,Kempton HR,Dahlman JE,Parnas O,Eisenhaure TM,Jovanovic M,Graham DB,Jhunjhunwala S,Heidenreich M,Xavier RJ,Langer R,Anderson DG,Hacohen N,Regev A,Feng G,Sharp PA,Zhang F.Cell 159(2):440-455 DOI:10.1016/j.cell.2014.09.014(2014);
・Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering,Hsu PD,Lander ES,Zhang F.,Cell.Jun 5;157(6):1262-78(2014);
・Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system,Wang T,Wei JJ,Sabatini DM,Lander ES.,Science.January 3;343(6166):80-84.doi:10.1126/science.1246981(2014);
・Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation,Doench JG,Hartenian E,Graham DB,Tothova Z,Hegde M,Smith I,Sullender M,Ebert BL,Xavier RJ,Root DE.,(2014年9月3日にオンラインで公開)Nat Biotechnol.Dec;32(12):1262-7(2014);
・In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9,Swiech L,Heidenreich M,Banerjee A,Habib N,Li Y,Trombetta J,Sur M,Zhang F.,(2014年10月19日にオンラインで公開)Nat Biotechnol.Jan;33(1):102-6(2015);
・Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex,Konermann S,Brigham MD,Trevino AE,Joung J,Abudayyeh OO,Barcena C,Hsu PD,Habib N,Gootenberg JS,Nishimasu H,Nureki O,Zhang F.,Nature.Jan 29;517(7536):583-8(2015)。
・A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation,Zetsche B,Volz SE,Zhang F.,(2015年2月2日にオンラインで公開)Nat Biotechnol.Feb;33(2):139-42(2015);
・Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis,Chen S,Sanjana NE,Zheng K,Shalem O,Lee K,Shi X,Scott DA,Song J,Pan JQ,Weissleder R,Lee H,Zhang F,Sharp PA.Cell 160,1246-1260,March 12,2015(マウスにおけるマルチプレックススクリーニング)、及び
・In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9,Ran FA,Cong L,Yan WX,Scott DA,Gootenberg JS,Kriz AJ,Zetsche B,Shalem O,Wu X,Makarova KS,Koonin EV,Sharp PA,Zhang F.,(2015年4月1日にオンラインで公開),Nature.Apr 9;520(7546):186-91(2015)。
・Shalem et al.,“High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9,”Nature Reviews Genetics 16,299-311(May 2015)。
・Xu et al.,“Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design,”Genome Research 25,1147-1157(August 2015)。
・Parnas et al.,“A Genome-wide CRISPR Screen in Primary Immune Cells to Dissect Regulatory Networks,”Cell 162,675-686(July 30,2015)。
・Ramanan et al.,CRISPR-Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus,”Scientific Reports 5:10833.doi:10.1038/srep10833(June 2,2015)
・Nishimasu et al.,Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9,”Cell 162,1113-1126(Aug.27,2015)
・BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis,Canver et al.,Nature 527(7577):192-7(Nov.12,2015)doi:10.1038/nature15521.Epub 2015 Sep 16。
・Cas13 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System,Zetsche et al.,Cell 163,759-71(Sep 25,2015)。
・Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems,Shmakov et al.,Molecular Cell,60(3),385-397 doi:10.1016/j.molcel.2015.10.008 Epub October 22,2015。
・Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity,Slaymaker et al.,Science 2016 Jan 1 351(6268):84-88 doi:10.1126/science.aad5227.Epub 2015 Dec 1。
・Gao et al,“Engineered Cas13 Enzymes with Altered PAM Specificities,”bioRxiv 091611;doi:http://dx.doi.org/10.1101/091611(Dec.4,2016)。
これらの文献はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれ、本発明の実施において考慮され得るものであり、以下に簡潔に論じられる:
・Cong et al.は、Streptococcus thermophilusのCas9と、これに加えてStreptococcus pyogenesのCas9と、の両方に基づいて、真核細胞において使用するためにII型CRISPR-Cas系を操作し、短いRNAによってCas9ヌクレアーゼを指示することで、ヒト細胞及びマウス細胞においてDNAの正確な切断を誘導し得ることを示した。著者らの研究では、ニッキング酵素に変換されたCas9を使用することで変異原性活性を最小化しつつ真核細胞における相同組換え修復を促進し得ることがさらに示された。さらに、著者らの研究では、複数のガイド配列を単一のCRISPRアレイにコードすることで、哺乳類ゲノム内の内在性ゲノム遺伝子座におけるいくつかの部位の同時編集が可能になり得ることが示され、これによって、このRNAガイド型ヌクレアーゼ技術が、容易にプログラムでき、幅広い適用可能性を有するものであることが示された。細胞における配列特異的なDNA切断をプログラムするためにRNAを使用するこの能力によって、新たなクラスのゲノム工学ツールが定義された。こうした研究では、他にもCRISPR遺伝子座を哺乳類細胞に移植し得る可能性があり、そうした移植CRISPR遺伝子座が哺乳類ゲノムの切断も媒介し得ることがさらに示された。重要なことは、CRISPR-Cas系の側面のいくつかを、その効率及び汎用性が向上するようにさらに改善し得ることが想定し得るということである。
・Jiang et al.は、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列(CRISPR)関連Cas9エンドヌクレアーゼがデュアルRNAと複合体化したものを使用することで、Streptococcus pneumoniae及びEscherichia coliのゲノムへの正確な変異導入を行った。この手法は、標的ゲノム部位がデュアルRNA:Cas9誘導型の切断を受ける結果、変異が導入されなかった細胞が死滅することに依存しており、この手法では、選択可能マーカーまたは対抗選択系が必要なくなる。この研究では、短いCRISPR RNA(crRNA)の配列を変更することによってデュアルRNA:Cas9の特異性を再プログラムして、編集テンプレートに持たせた単一ヌクレオチドまたは複数ヌクレオチドの変更を施すことが報告された。この試験では、2つのcrRNAを同時使用することで、変異導入のマルチプレックス化が可能になることが示された。さらに、この手法をリコンビニアリングと組み合わせて使用すると、S.pneumoniaeでは、記載の手法を使用して回収された細胞のほぼ100%が所望の変異を含んでおり、E.coliでは、回収された細胞の65%が当該変異を含んでいた。
・複数の遺伝子に変異を保有するマウスは、胚性幹細胞において連続的な組換えを行い、及び/または単一の変異を有するマウスを多大な時間をかけて交雑させることによって、複数段階を経て従来は作成されていたが、Wang et al.(2013)は、当該マウスを一段階で作成するためにCRISPR-Cas系を使用した。CRISPR-Cas系は、機能的に重複する遺伝子及びエピスタシス遺伝子相互作用のインビボの研究を大幅に加速させるであろう。
・DNA結合ドメインベースの、CRISPR Cas9酵素、さらには転写活性化因子様エフェクターについても光学的及び化学的な制御を可能にする汎用的かつ頑健な技術に対するニーズが当該技術分野には存在しており、Konermann et al.(2013)は、このニーズに応えたものである。
・Ran et al.(2013-A)は、標的化された二本鎖切断を導入するために、対をなすガイドRNAとCas9ニッカーゼ変異体を組み合わせた手法について記載した。微生物のCRISPR-Cas系に由来するCas9ヌクレアーゼは、ガイド配列によって特定のゲノム遺伝子座を標的とするものであるが、こうしたCas9ヌクレアーゼは、DNA標的に対するある特定のミスマッチを許容し、それによって望ましくないオフ標的変異導入を促進し得るという問題を有しており、上記の手法は、この問題に対処するものである。ゲノムにおける個々のニックは、高い忠実度で修復されるため、二本鎖切断を生じさせるには、適切に距離をとったガイドRNAを介して同時にニックを入れることが必要であり、こうして同時にニックを入れることで、標的を切断するために特異的に認識される塩基の数が増える。著者らは、ニックを対にして入れることで、細胞株においてオフ標的活性を50~1,500倍低減し、オン標的切断効率を犠牲にすることなく、マウスの接合体にける遺伝子ノックアウトを促進し得ることを示した。この汎用的な方針は、高い特異性が必要となる多種多様なゲノム編集適用を可能にするものである。
・Hsu et al.(2013)は、標的部位の選択に関する知見を広めるとともに、オフ標的効果を回避するために、ヒト細胞におけるSpCas9の標的化特異性を特徴付けた。この研究では、700超のガイドRNAバリアントと、293T細胞及び293FT細胞における100超の予測オフ標的ゲノム遺伝子座にSpCas9によって導入されたインデル変異のレベルと、が評価された。異なる位置におけるガイドRNAと標的DNAとの間のミスマッチが、ミスマッチの数、位置、及び分布に影響を受ける配列依存的な様式でSpCas9によって許容されることが著者らによって示された。SpCas9介在性の切断がDNAメチル化による影響を受けず、SpCas9及びガイドRNAの使用量を設定することでオフ標的改変を最小化し得ることも著者らによってさらに示された。さらに、哺乳類におけるゲノム工学の適用を促進するために、標的配列の選択及び検証、ならびにオフ標的分析を支援するウェブベースのソフトウェアツールを提供することが著者らによって報告された。
・Ran et al.(2013-B)は、哺乳類細胞における非相同末端結合(NHEJ)または相同組換え修復(HDR)を介するCas9介在性のゲノム編集、ならびに下流の機能研究のための改変細胞株の生成、を行うためのツールセットについて記載している。オフ標的切断を最小化するために、対をなすガイドRNAとともにCas9ニッカーゼ変異体を使用してニックを二重に入れる方針について著者らはさらに記載している。標的部位の選択、切断効率の評価、及びオフ標的活性の分析に対する指針が、著者らが提供したプロトコルによって実験的に得られた。この研究では、標的の設計から始まり、早ければ1~2週間以内に遺伝子改変を達成でき、2~3週間以内に改変クローン細胞株を得られ得ることが示された。
・Shalem et al.は、ゲノム規模で遺伝子機能を調べる新たな方法について記載している。著者らの研究では、64,751個の特有のガイド配列を用いて18,080個の遺伝子を標的としたゲノム規模のCRISPR-Cas9ノックアウト(GeCKO)ライブラリーを送達することによって、ヒト細胞における負の選択によるスクリーニングも正の選択によるスクリーニングも可能になることが示された。GeCKOライブラリーを使用することで、がん及び多能性幹細胞における細胞生存能に必要不可欠な遺伝子が同定されることが著者らによって最初に示された。次に、著者らは、消失するとベムラフェニブ(変異キナーゼタンパク質であるBRAFを阻害する治療剤)に対する抵抗性に関与する遺伝子をメラノーマモデルにおいてスクリーニングした。著者らの研究では、最も高く順位付けられる候補には、以前に検証されたNF1遺伝子及びMED12遺伝子に加えて、新規にヒットしたNF2遺伝子、CUL3遺伝子、TADA2B遺伝子、及びTADA1遺伝子が含まれたことが示された。著者らの観察では、同じ遺伝子を標的とする独立したガイドRNAの間に高いレベルの一貫性が存在し、ヒット率が高いことが確認されており、したがって、Cas9を用いたゲノム規模のスクリーニングが有望であることが著者らによって示された。
・Nishimasu et al.は、sgRNA及びその標的DNAと複合体を形成したStreptococcus pyogenesのCas9の結晶構造を2.5Åの分解能で報告した。この結晶構造から、標的認識ローブ及びヌクレアーゼローブという2つのローブから構成される構造様式が存在しており、これら2つのローブによって、それらの界面に位置する正に荷電した溝にsgRNA:DNAnRNA二本鎖が収容されることが明らかとなった。認識ローブは、sgRNA及びDNAへの結合に必要不可欠である一方で、ヌクレアーゼローブは、HNHヌクレアーゼドメイン及びRuvCヌクレアーゼドメインを含んでおり、これらのヌクレアーゼドメインは、それぞれ標的DNAの相補鎖及び非相補鎖を切断するために適切に配置されている。ヌクレアーゼローブは、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)との相互作用を担うカルボキシル末端ドメインも含む。この高分解能構造及び付随する機能解析によって、Cas9がRNAにガイドされてDNAを標的とする分子機構が明らかにされており、これによって、新たな汎用性のゲノム編集技術を合理的に設計するための道が開かれている。
・Wu et al.は、Streptococcus pyogenesに由来する触媒的に不活性なCas9(dCas9)にシングルガイドRNA(sgRNA)を組み込み、マウス胚性幹細胞(mESC)における当該dCas9の結合部位をゲノム規模でマッピングした。試験した4つのsgRNAのそれぞれによって、数十~数千のゲノム部位がdCas9の標的となり、こうしたゲノム部位は、sgRNAにおける5-ヌクレオチドシード領域、及びNGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)によって高頻度で特徴付けられることが著者らによって示された。クロマチンへ接近しにくい場合、シード配列がマッチする他の部位へのdCas9の結合が減少しており、それ故に、オフ標的部位の70%が遺伝子と関連している。触媒的に活性なCas9をトランスフェクションしたmESCにおいて295個のdCas9結合部位を標的としてシークエンシングした結果、バックグラウンドレベルを超えて変異したことが同定された部位は1つのみであったことが著者らによって示された。著者らは、Cas9の結合及び切断についての二状態モデルを提唱しており、このモデルは、シードのマッチによって結合が引き起こされるが、切断が生じるには、標的DNAとの広範な対形成が必要であるというものである。
・Platt et al.は、Cre依存性Cas9ノックインマウスを確立した。神経細胞、免疫細胞、及び内皮細胞におけるガイドRNAのアデノ随伴ウイルス(AAV)介在性の送達、レンチウイルス介在性の送達、または粒子介在性の送達を使用することで、インビボならびにエクスビボでゲノムが編集されることが著者らによって示された。
・Hsu et al.(2014)は、細胞の遺伝子スクリーニングを含めて、ヨーグルトからゲノム編集に至るまでのCRISPR-Cas9の歴史を一般に論じる総説である。
・Wang et al.(2014)は、正の選択にも負の選択にも適したプール型かつ機能喪失型の遺伝子スクリーニング手法に関し、この手法では、ゲノム規模のレンチウイルスシングルガイドRNA(sgRNA)ライブラリーが使用される。
・Doench et al.は、6つの内在性マウス遺伝子及び3つの内在性ヒト遺伝子の一群の可能性のある標的部位を全てカバーするsgRNAのプールを創出し、こうしたsgRNAがその標的遺伝子のヌルアレルを生成する能力を抗体染色及びフローサイトメトリーによって定量的に評価した。著者らによって、PAMを最適化することによって活性が改善することが示され、sgRNAを設計するためのオンラインツールも提供された。
・Swiech et al.は、AAV介在性のSpCas9ゲノム編集によって、脳における遺伝子機能の逆遺伝学的研究が可能になり得ることを示している。
・Konermann et al.(2015)は、リンカーを用いるか、またはリンカーを用いずに、複数のエフェクタードメイン(例えば、転写活性化因子、機能制御因子、及びエピゲノム制御因子)をガイド上の適切な位置(ステムまたはテトラループなど)に付加する能力について論じている。
・Zetsche et al.は、Cas9酵素を2つに分割することができ、したがって、Cas9を活性化させるには、その会合を制御すればよいことを示している。
・Chen et al.は、マルチプレックススクリーニングに関し、このマルチプレックススクリーニングは、マウスにおけるゲノム規模のインビボCRISPR-Cas9スクリーニングによって肺転移制御遺伝子を明らかにすることによって実証されている。
・Ran et al.(2015)は、SaCas9及びそのゲノム編集能力に関し、生化学的アッセイからは推定し得ないものであることを示している。
・Shalem et al.(2015)は、触媒的に不活性なCas9(dCas9)融合体を、発現の合成的な抑制(CRISPRi)または活性化(CRISPRa)に使用する方法について記載しており、アレイ型及びプール型のスクリーニング、ゲノム遺伝子座を不活性化するノックアウト手法、ならびに転写活性を調節する方針を含めて、ゲノム規模のスクリーニングにCas9を使用する利点を示している。
・Xu et al.(2015)は、CRISPRベースのスクリーニングおけるシングルガイドRNA(sgRNA)の効率に寄与するDNA配列特徴を評価した。CRISPR-Cas9によるノックアウトの効率及び切断部位におけるヌクレオチド優先性が著者らによって調べられた。CRISPRi/aに対する配列優先性が、CRISPR-Cas9によるノックアウトのものとは実質的に異なることも著者らによって見出された。
・Parnas et al.(2015)は、ゲノム規模のプール型CRISPR-Cas9ライブラリーを樹状細胞(DC)に導入することで、細菌リポ多糖(LPS)による腫瘍壊死因子(Tnf)の誘導を制御する遺伝子を同定した。Tlr4シグナル伝達の既知の制御因子、及びこれまでは知られていなかった候補制御因子が同定され、LPSに対する標準的な応答に対する作用が異なる3つの機能性モジュールへと分類された。
・Ramanan et al(2015)は、感染細胞においてウイルスエピソームDNA(cccDNA)が切断されることを示した。HBVゲノムは、共有結合閉環状DNA(cccDNA)と呼ばれる3.2kbの二本鎖エピソームDNA種として感染肝細胞の核に存在しており、cccDNAは、HBVの生活環における重要な構成要素であり、現在の治療によってcccDNAの複製は阻害されない。HBVの高度に保存された領域をsgRNAが特異的に標的とすることで、ウイルスの複製が強固に抑制され、cccDNAが枯渇することが著者らによって示された。
・Nishimasu et al.(2015)は、シングルガイドRNA(sgRNA)ならびにその二本鎖DNA標的(5’-TTGAAT-3’PAM及び5’-TTGGGT-3’PAMを含む)と複合体を形成したSaCas9の結晶構造を報告した。SaCas9をSpCas9と構造比較することによって、構造的な保存も相違も明らかにされ、SaCas9とSpCas9とのPAM特異性差異及びオルソロガスsgRNA認識差異が説明された。
・Canver et al.(2015)は、CRISPR-Cas9に基づいて非コードゲノム要素を機能的に調査した。著者らは、プール型CRISPR-Cas9ガイドRNAライブラリーを開発することで、ヒト及びマウスのBCL11Aエンハンサーのインサイチュでの飽和変異導入を実施し、これによって、こうしたエンハンサーの重要な特徴を明らかにした。
・Zetsche et al.(2015)は、Cas13の特徴付けについて報告した。Cas13は、Francisella novicida U112に由来するクラス2のCRISPRヌクレアーゼであり、Cas9とは異なる特徴を有している。Cas13は、tracrRNAを含まないシングルRNAガイド型のエンドヌクレアーゼであり、T含量の高いプロトスペーサー隣接モチーフを利用し、ねじれ型のDNA二本鎖切断を介してDNAを切断する。
・Shmakov et al.(2015)は、クラス2の3つの異なるCRISPR-Cas系について報告した。2つのCRISPR系酵素(C2c1及びC2c3)は、Cas13と遠縁のRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを含む。Cas13とは異なり、C2c1は、DNA切断する上でcrRNAとtracrRNAとの両方に依存する。第3の酵素(C2c2)は、予測HEPN RNaseドメインを2つ含み、tracrRNA依存性である。
・Slaymaker et al(2016)は、構造ガイド型タンパク質工学を使用することによって、Streptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)の特異性が改善することを報告した。著者らは、SpCas9(eSpCas9)の「特異性増進」バリアントを開発し、このバリアントは、強固なオン標的切断を維持しており、そのオフ標的効果は低減されていた。
本出願は、V型CRISPR-Casタンパク質を使用する方法を説明する。これは、本明細書ではCas13を用いて例示され、これによって、多数のオルソログまたはホモログが同定されている。オルソログまたはホモログは追加で同定され得ること、及び、複数のオルソログに由来する断片を含むキメラ酵素を含めて、本明細書に記載の機能性はいずれも、他のオルソログに操作導入され得ることが当業者には明らかであろう。
「オルソログ(オルソログue)」(本明細書では「オルソログ(オルソログ)」とも称される)及び「ホモログ(homologue)」(本明細書では「ホモログ(homolog)」とも称される)という用語は、当該技術分野においてよく知られている。追加のガイダンスとして、本明細書で使用されるタンパク質の「ホモログ」は、ホモログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、同じ種のタンパク質である。相同タンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。本明細書で使用されるタンパク質の「オルソログ」は、オルソログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、異なる種のタンパク質である。オルソロガスタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。ホモログ及びオルソログは、相同性モデリングによって同定され得る。(例えば、Greer,Science vol.228(1985)1055、及びBlundell et al.Eur J Biochem vol 172(1988),513)、または「構造的BLAST」(Dey F,Cliff Zhang Q,Petrey D,Honig B.Toward a“structural BLAST”:using structural relationships to infer function.Protein Sci.2013 Apr;22(4):359-66.doi:10.1002/pro.2225.を参照のこと)。CRISPR-Cas遺伝子座の分野における適用については、Shmakov et al.(2015)も参照のこと。相同タンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。
特定の実施形態では、本明細書で定義される操作されたCas13タンパク質(Cas13など)の利用が目的となり、このタンパク質は、RNAを含む核酸分子と複合体化してCRISPR複合体を形成し、核酸分子が、CRISPR複合体に存在するとき、1つ以上の標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的とし、タンパク質は、非改変Cas13タンパク質と比較して少なくとも1つの改変を含み、改変タンパク質を含むCRISPR複合体は、非改変Cas13タンパク質を含む複合体と比較して活性が変化している。本明細書では、CRISPR「タンパク質」に言及するとき、Cas13タンパク質は、好ましくは、改変CRISPR-Casタンパク質(例えば、限定されないが、Cas13などを含めて、酵素活性が上昇もしくは低下(または皆無)のもの)であることが理解されよう。「CRISPRタンパク質」という用語は、野生型CRISPRタンパク質と比較してCRISPRタンパク質が変化している(酵素活性が上昇もしくは低下している(または皆無である)など)か否かとは無関係に、「CRISPR-Casタンパク質」と互換的に使用され得る。
Cas13タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する場合、Cas13タンパク質は、改変されることでヌクレアーゼ活性が低減され得(例えば、野生型酵素と比較するとヌクレアーゼ活性が少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、もしくは100%低減される)、あるいは換言すれば、Cas13酵素が有するヌクレアーゼ活性は、有利には、非変異型または野生型のCas13酵素またはCRISPR-Casタンパク質のヌクレアーゼ活性の約0%であるか、あるいは非変異型または野生型のCas13酵素(例えば、Francisella novicida U112(FnCas13)、Acidaminococcus属の1種であるBV3L6(AsCas13)、Lachnospiraceae bacterium ND2006(LbCas13)、もしくはMoraxella bovoculi 237(MbCas13)の非変異型もしくは野生型のCas13酵素)またはCRISPR-Casタンパク質のヌクレアーゼ活性の約3%以下または約5%以下または約10%以下である。このことは、Cas13及びそのオルソログのヌクレアーゼドメインに変異を導入することによって可能である。
PAMは、下記のように確実に決定され得る。この実験は、StCas9を異種発現させるためのE.coliにおける同様の研究(Sapranauskas,R.et al.Nucleic Acids Res 39,9275-9282(2011))に密接に通じるものである。出願人らは、PAMと耐性遺伝子との両方を含むプラスミドを異種E.coliに導入し、次に、対応抗生物質上に播種している。プラスミドのDNA切断が生じれば、出願人らが生存コロニーを観察することはない。
エフェクタータンパク質が核酸として投与される場合、本出願は、コドン最適化CRISPR-CasタイプVタンパク質、より具体的にはCas13をコードする核酸配列(及び任意選択でタンパク質配列)の使用を想定している。コドン最適化配列の例は、この例では、真核生物、例えばヒトでの発現に最適化された配列(すなわち、ヒトでの発現に最適化されている)、または本明細書で考察された別の真核生物、動物、または哺乳動物に最適化された配列である;例えば、コドン最適化配列の例としては、WO2014/093622(PCT/US2013/074667)のSaCas9ヒトコドン最適化配列を参照(当技術分野及び本開示の知識、コドン最適化コーディング核酸分子(複数可)、特にエフェクタータンパク質(例えば、Cas13)に関して、当業者の知識から)は、当業者の知識の範囲内である)。これが好ましいが、他の例が可能であり、ヒト以外の宿主種のコドン最適化、または特定の器官のコドン最適化が知られていることが理解されよう。いくつかの実施形態では、DNA/RNA標的化Casタンパク質をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、本明細書で考察されるヒト、または非ヒト真核生物、または動物または哺乳動物を含むがこれらに限定されない特定の生物、例えば植物または哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、犬、家畜、または非ヒト哺乳類または霊長類の細胞であるか、またはそれに由来し得る。いくつかの実施形態では、ヒトの生殖細胞系列の遺伝的同一性を変更するプロセス及び/または人間もしくは動物に実質的な医学的利益なしに、罹患する可能性がある動物の遺伝的同一性を変更するプロセスであって、ならびにまたこのようなプロセスから生じる動物は除外される場合がある。一般に、コドン最適化とは、天然の配列の少なくとも1つのコドン(例えば、約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50またはそれ以上のコドン)を、その天然のアミノ酸配列を維持したままで、その宿主細胞の遺伝子においてさらに頻繁にまたは最も頻繁に用いられるコドンで置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を高めるために核酸配列を改変するプロセスを指す。さまざまな種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス(生物間のコドン使用頻度の違い)は、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率と相関することが多く、これは、同じく、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーRNA(tRNA)分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたtRNAの優位性は、一般的にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、コドン最適化に基づいて、特定の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整してもよい。コドン使用表は、例えばwww.kazusa.orjp/codon/にある「Codon Usage Database」で容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適合され得る。Nakamura、Y.、et al.“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000”Nucl.Acids Res.28:292(2000)を参照のこと。Gene Forge(Aptagen;Jacobus、PA)など、特定の宿主細胞で発現する特定の配列をコドン最適化するコンピューターアルゴリズムも利用ししてもよい。いくつかの実施形態では、DNA/RNA標的化Casタンパク質をコードする配列中の1つ以上のコドン(例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50以上、または全てのコドン)は、特定のアミノ酸で最も頻繁に使用されるコドンに対応する。酵母のコドン使用に関しては、http://www.yeastgenome.org/community/codon_usage.shtmlで利用可能なオンライン酵母ゲノムデータベース、または酵母、Bennetzen及びHall、J Biol Chem.1982 Mar 25;257(6):3026-31のコドン選択を参照のこと。藻類を含む植物でのコドン使用に関しては、高等植物、緑藻、シアノバクテリア、Campbell and Gowri、Plant Physiol.1990 Jan;92(1):1-11でのコドン使用;ならびにCodon usage in plant genes, Murray et al, Nucleic Acids Res. 1989 Jan 25;17(2):477-98;またはSelection on the codon bias of chloroplast and cyanelle genes in different plant and algal lineages,Morton BR,J Mol Evol.1998 Apr;46(4):449-59を参照のこと。
いくつかの態様では、本発明は、1つ以上のポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載の1つ以上のベクター、その1つ以上の転写物、及び/またはそこから転写される1つ以上のタンパク質を、宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。
一般に、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指す。ベクターは、別のDNAセグメントが挿入される結果、当該挿入セグメントの複製が生じ得るレプリコン(プラスミド、ファージ、またはコスミドなど)である。一般に、ベクターは、適切な調節要素と結合されたときに複製能力を有する。ベクターとしては、限定されないが、一本鎖、二本鎖、または部分的二本鎖である核酸分子、1つ以上の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端を含まない(例えば、環状の)核酸分子、DNA、RNA、または両方を含む核酸分子、ならびに当該技術分野において知られる他のさまざまなポリヌクレオチドが挙げられる。1つの型のベクターは、「プラスミド」であり、「プラスミド」は、標準的な分子クローニング技術などによってDNAセグメントを追加挿入し得る環状二本鎖DNAループを指す。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、当該ベクターには、ウイルス(例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)へのパッケージングを生じさせるためのウイルス由来のDNA配列またはRNA配列が存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞にトランスフェクションするためのウイルス保有のポリヌクレオチドも含む。ある特定のベクターは、それが導入される宿主細胞において自己複製する能力を有する(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳類ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳類ベクター)は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それが機能可能なように連結された遺伝子の発現を指示する能力を有する。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。真核細胞における発現のためのベクター及び真核細胞における発現をもたらすベクターは、本明細書では「真核生物発現ベクター」と称され得る。組換えDNA技術において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態をとることが多い。
いくつかの実施形態では、ベクター(例えば、プラスミドまたはウイルスベクター)は、例えば筋肉内注射によって目的の組織に送達されるが、静脈内送達方法、経皮送達方法、鼻腔内送達方法、経口送達方法、粘膜送達方法、または他の送達方法を介して送達される。そのような送達は、単回用量または複数回用量のいずれによるものであってもよい。本明細書の実際の送達用量は、さまざまな因子によって大きく異なり得ることを当業者は理解しており、こうした因子は、ベクターの選択、標的細胞、標的生物、または標的組織、治療すべき対象の全身状態、求められる形質転換/改変の程度、投与経路、投与様式、求められる形質転換/改変の型などである。
特定の実施形態では、RNAベースの送達が使用される。こうした実施形態では、CRISPR-Casタンパク質のmRNA、アデノシンデアミナーゼ(CRISPR-Casタンパク質またはアダプターに融合され得る)のmRNAは、インビトロで転写されたガイドRNAと一緒に送達される。Liang et al.は、RNAベースの送達を使用する効率的なゲノム編集について記載している(Protein Cell.2015 May;6(5):363-372)。いくつかの実施形態では、Cas13及び/またはアデノシンデアミナーゼをコードするmRNA(複数可)を化学的に改変することができ、これによって、プラスミドがコードするCas13及び/またはアデノシンデアミナーゼと比較して活性が改善し得る。例えば、mRNA(複数可)におけるウリジンを、シュードウリジン(Ψ)、N1-メチルシュードウリジン(me1Ψ)、5-メトキシウリジン(5moU)で部分的または完全に置き換えられ得る。Li et al.,Nature Biomedical Engineering 1,0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066(2017)を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、事前に複合体化したガイドRNA、CRISPR-Casタンパク質、及びアデノシンデアミナーゼ(CRISPR-Casタンパク質またはアダプターに融合され得る)がリボ核タンパク質(RNP)として送達される。RNPは、RNA法よりもさらに迅速な編集作用が得られるという利点を有しており、この理由は、このプロセスでは転写の必要性が回避されることによるものである。重要な利点は、RNP送達が一過性であることから、オフ標的効果も毒性問題も低減されるということである。異なる細胞型において効率的にゲノムが編集されることが、Kim et al.(2014,Genome Res.24(6):1012-9)、Paix et al.(2015,Genetics 204(1):47-54)、Chu et al.(2016,BMC Biotechnol.16:4)、及びWang et al.(2013,Cell.9;153(4):910-8)において観察されている。
いくつかの態様または実施形態では、送達粒子製剤を含む組成物が使用され得る。いくつかの態様または実施形態では、製剤は、CRISPR複合体を含み、この複合体は、CRISPRタンパク質と、標的配列に配列特異的に結合するようにCRISPR複合体を誘導するガイドと、を含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質ベースの粒子、任意選択の脂質ナノ粒子、または陽イオン性脂質、及び任意選択の生分解性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、陽イオン性脂質は、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)を含む。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、エチレングリコールまたはポリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、リポタンパク質、好ましくは、コレステロールをさらに含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、直径500nm未満、任意選択で直径250nm未満、任意選択で直径100nm未満、任意選択で直径約35nm~約60nmである。
公開62/485,625号に開示される。
さらに、AD機能化CRISPR系は、ナノクルーを使用して送達され得、ナノクルーによる送達は、例えば、Sun W et al,Cocoon-like self-degradable DNA nanoclew for anticancer drug delivery.,J Am Chem Soc.2014 Oct 22;136(42):14722-5.doi:10.1021/ja5088024.Epub 2014 Oct 13.、またはSun W et al,Self-Assembled DNA Nanoclews for the Efficient Delivery of CRISPR-Cas9 for Genome Editing.,Angew Chem Int Ed Engl.2015 Oct 5;54(41):12029-33.doi:10.1002/anie.201506030.Epub 2015 Aug 27に記載されている。
いくつかの実施形態では、送達は、Cas13のタンパク質形態またはmRNA形態を脂質粒子(LNPなど)に封入することによって行われる。したがって、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子(LNP)が企図される。脂質ナノ粒子に抗トランスサイレチン低分子干渉RNAが封入され、ヒトに送達されており(例えば、Coelho et al.,N Engl J Med 2013;369:819-29を参照のこと)、そのような系は、本発明のCRISPR Cas系に適合し得、当該系に適用され得る。体重kg当たり約0.01~約1mgの静脈内投与量が企図される。注入関連反応のリスクを低減するための薬物が企図され、デキサメタゾン、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミンまたはセチリジン、及びラニチジンなどが企図される。キログラム当たり約0.3mgを4週間ごとに投与し、5回の投与を行う複数回用量も企図される。
式中、R1及びR2はそれぞれ、アルキルを含む群から独立して選択され、nは、1~4の任意の整数であり、R3は、リジル、オルニチル、2,4-ジアミノブチリル、ヒスチジル、及びアシル部分を含む群から選択されるアシルであり、当該アシル部分は、式II:
によるものであり、式中、mは、1~3の任意の整数であり、Y-は、医薬的に許容可能な陰イオンである。いくつかの実施形態では、式Iによる脂質は、少なくとも2つの不斉C原子を含む。いくつかの実施形態では、式Iのエナンチオマーには、限定されないが、R-Rエナンチオマー、S-Sエナンチオマー、R-Sエナンチオマー、及びS-Rエナンチオマーが含まれる。
を有する少なくとも1つの陽イオン性脂質を含み、
式中、nは、1、2、3、または4であり、mは、1、2、または3であり、Y-は、陰イオンであり、R1及びR2はそれぞれ、C12-C18直鎖アルキル及びC12-C18直鎖アルケニル、ステロール化合物(ステロール化合物は、コレステロール及びスチグマステロールからなる群より選択される)、ならびにPEG化脂質(PEG化脂質は、PEG部分を含む)からなる群より個別かつ独立して選択され、PEG化脂質は、
式VII:
のPEG化ホスホエタノールアミン(式中、R3及びR4は、個別かつ独立してC13-C17直鎖アルキルであり、pは、15~130の任意の整数である)、
式VIII:
のPEG化セラミド(式中、R5は、C7-C15直鎖アルキルであり、qは、15~130の任意の数である)、及び
式IX:
のPEG化ジアシルグリセロール(式中、R6及びR7はそれぞれ、個別かつ独立してC11-C17直鎖アルキルであり、rは、15~130の任意の整数である)、
からなる群より選択される。
の化合物である。いくつかの実施形態では、Y-は、ハロゲン化物、アセテート、及びトリフルオロアセテートから選択される。いくつかの実施形態では、陽イオン性脂質は、式III:
のβ-アルギニル-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-パルミチル-N-オレイル-アミド三塩酸塩である。いくつかの実施形態では、陽イオン性脂質は、式IV:
のβ-アルギニル-2,3-ジアミノプロピオン酸-N-ラウリル-N-ミリスチル-アミド三塩酸塩である。いくつかの実施形態では、陽イオン性脂質は、式V:
のβ-アルギニル-リジン-N-ラウリル-N-ミリスチル-アミド三塩酸塩である。
である。いくつかの実施形態では、式VIIのPEG化ホスホエタノールアミンは、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000](アンモニウム塩):
である。いくつかの実施形態では、PEG化脂質は、式VIIIのPEG化セラミドであり、式中、R5は、C7-C15直鎖アルキルであり、qは、18、19、もしくは20、または44、45、もしくは46、または113、114、もしくは115から選択される任意の整数である。いくつかの実施形態では、R5は、C7直鎖アルキルである。いくつかの実施形態では、R5は、C15直鎖アルキルである。いくつかの実施形態では、式VIIIのPEG化セラミドは、N-オクタノイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)2000]}:
である。いくつかの実施形態では、式VIIIのPEG化セラミドは、N-パルミトイル-スフィンゴシン-1-{スクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)2000]}
である。いくつかの実施形態では、PEG化脂質は、式IXのPEG化ジアシルグリセロールであり、式中、R6及びR7はそれぞれ、個別かつ独立してC11-C17直鎖アルキルであり、rは、18、19、もしくは20、または44、45、もしくは46、または113、114、もしくは115から選択される任意の整数である。いくつかの実施形態では、R6とR7とは、同じである。いくつかの実施形態では、R6とR7とは、異なる。いくつかの実施形態では、R6及びR7はそれぞれ、C17直鎖アルキル、C15直鎖アルキル、及びC13直鎖アルキルからなる群より個別かつ独立して選択される。いくつかの実施形態では、式IXのPEG化ジアシルグリセロールは、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロール[メトキシ(ポリエチレングリコール)2000]:
である。いくつかの実施形態では、式IXのPEG化ジアシルグリセロールは、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロール[メトキシ(ポリエチレングリコール)2000]:
である。いくつかの実施形態では、式IXのPEG化ジアシルグリセロールは、
である。いくつかの実施形態では、LNPは、式III、式IV、及び式Vから選択される少なくとも1つの陽イオン性脂質と、コレステロール及びスチグマステリンから選択される少なくとも1つのステロール化合物と、を含み、PEG化脂質は、式XI及び式XIIから選択される少なくとも1つである。いくつかの実施形態では、LNPは、式III、式IV、及び式Vから選択される少なくとも1つの陽イオン性脂質と、コレステロール及びスチグマステリンから選択される少なくとも1つのステロール化合物と、を含み、PEG化脂質は、式XIII及び式XIVから選択される少なくとも1つである。いくつかの実施形態では、LNPは、式III、式IV、及び式Vから選択される少なくとも1つの陽イオン性脂質と、コレステロール及びスチグマステリンから選択される少なくとも1つのステロール化合物と、を含み、PEG化脂質は、式XV及び式XVIから選択される少なくとも1つである。いくつかの実施形態では、LNPは、式IIIの陽イオン性脂質と、ステロール化合物としてのコレステロールと、を含み、PEG化脂質は、式XIのものである。
エクソソームは、RNA及びタンパク質を輸送する内在性のナノ小胞であり、このナノ小胞は、脳及び他の標的臓器にRNAを送達し得る。Alvarez-Erviti et al.(2011,Nat Biotechnol 29:341)は、免疫原性を低減するために、自己由来の樹状細胞をエクソソーム産生に使用した。神経細胞特異的RVGペプチドに融合したLamp2b(エクソソーム膜タンパク質)を発現するように樹状細胞を操作することによって脳への標的化が達成された。精製エクソソームには、電気穿孔によって外来性RNAが組み込まれた。RVGで標的化されたエクソソームが静脈内注射され、このエクソソームによって、脳における神経細胞、ミクログリア、オリゴデンドロサイトにGAPDH siRNAが特異的に送達されることで、特異的な遺伝子ノックダウンが生じた。RVGエクソソームに事前に曝露されてもノックダウンは減弱せず、他の組織への非特異的な取り込みは観察されなかった。アルツハイマー病の治療標的であるBACE1の強力なノックダウンがmRNA(60%)及びタンパク質(62%)で生じたことによってエクソソーム介在性のsiRNA送達の治療潜在力が示された。
本発明による送達または投与は、リポソームを用いて実施し得る。リポソームは、内部の水性コンパートメントを囲む単層または多重層の脂質二重層と、相対的に不透過性な外側の親油性リン脂質二重層と、から構成される球状小胞構造を有する。リポソームは、薬物送達単体として相当な関心を集めており、この理由は、リポソームが生体適合性かつ無毒であり、親水性薬物分子も親油性薬物分子も送達し、血漿中酵素によってそのカーゴが分解されることを阻止し、生体膜及び血液脳関門(BBB)を横切ってその被組み込み物を輸送し得ることによるものである(概説については、例えば、Spuch and Navarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID 469679,12pages,2011.doi:10.1155/2011/469679を参照のこと)。
アミノ脂質2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)などの他の陽イオン性脂質を利用して、CRISPR Casもしくはその構成要素またはそれをコードする核酸分子(複数可)、例えば、SiRNAに類似するものを封入することができ(例えば、Jayaraman,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,8529-8533参照)、したがって、本発明の実施に利用することができる。次の脂質組成物:アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロール及び(R)-2,3-ビス(オクタデシルオキシ)プロピル-1-(メトキシポリ(エチレングリコール)2000)プロピルカルバメート(PEG-脂質)をそれぞれ40/10/40/10の比及び約0.05(w/w)のFVII siRNA/総脂質比で含む予備成形小胞が企図される。70~90nmの範囲の狭い粒径分布及び0.11+0.04(n=56)の小さい多分散指数を確保するために、ガイドRNAを添加する前に、粒子を80nm膜に通して最大3回押し出すことができる。極めて強力なアミノ脂質16を含有する粒子を、4つの脂質構成成分16、DSPC、コレステロール及びPEG脂質のモル比(50/10/38.5/1.5)で使用してもよい。これは、インビボ活性を高めるために、更に最適化され得る。
超荷電タンパク質は、理論上の正または負の正味荷電が異常に高い操作されたまたは天然に生じるタンパク質の1つのクラスであり、AD機能化CRISPR Cas系(複数可)もしくはその構成要素(複数可)またはそれをコードする核酸分子(複数可)の送達に利用することができる。負に過剰に荷電したタンパク質及び正に過剰に荷電したタンパク質はいずれも、熱的または化学的に誘導される凝集に耐える顕著な能力を呈する。正に過剰に荷電したタンパク質はまた、哺乳類細胞に浸透することができる。これらのタンパク質をプラスミドDNA、RNA、または他のタンパク質などのカーゴと結合させると、インビトロ及びインビボの両方における、これらの巨大分子の哺乳類細胞への機能的送達が可能となる。超荷電タンパク質の作製及び特徴付けは、2007年に報告されている(Lawrence et al.,2007,Journal of the American Chemical Society 129,10110-10112)。
更に別の実施形態において、細胞膜透過性ペプチド(CPP)がAD機能化CRISPR Cas系の送達に企図される。CPPは、様々な分子カーゴ(ナノサイズ粒子から化学的小分子及び大きなDNA断片まで)の細胞取り込みを促進する短鎖ペプチドである。本明細書で使用される「カーゴ」という用語は、限定するものではないが、治療剤、診断用プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、粒子、例えば、ナノ粒子、リポソーム、発色団、小分子及び放射性物質からなる群を含む。本発明の態様において、カーゴはまた、AD機能化CRISPR Cas系の任意の構成要素またはAD機能化機能性CRISPR Cas系全体を含み得る。本発明の態様は、所望のカーゴを対象に送達するための方法を更に提供し、この方法は、(a)本発明の細胞膜透過性ペプチド及び所望のカーゴを含む複合体を調製することと、(b)その複合体を、対象に、経口、関節内、腹腔内、髄腔内、動脈内、鼻腔内、実質内、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、直腸、または局所投与することとを含む。カーゴは、共有結合による化学的連結、または非共有結合性の相互作用のいずれかを介して、ペプチドに結合する。
肺疾患の治療を受ける対象は、例えば、自発呼吸下で気管支内送達される薬学的に有効量のエアロゾル化AAVベクター系の経肺投与を受けてもよい。このように、AAV送達の場合、エアロゾル化送達が一般に好ましい。アデノウイルス粒子またはAAV粒子を送達に使用することができる。好適な遺伝子コンストラクトは、それぞれ1つ以上の制御配列に機能可能なように連結しており、送達ベクターにクローニングすることができる。
CRISPR-Casタンパク質及びアデノシンデアミナーゼをコードする核酸分子の発現を促進するために使用されるプロモーターには、AAV ITRが含まれ得、これは、プロモーターとして機能し得る。AAV ITRは、追加のプロモーター要素(ベクター内でスペースを取り得る)の必要性を排除するのに有利である。解放された追加のスペースを使用して、追加の要素(gRNAなど)の発現を促進することができる。また、ITR活性は比較的弱いため、Cas13の過剰発現による潜在的な毒性を低減させるために使用することができる。
標的化ドメイン、アデノシンデアミナーゼ、及び1つ以上のガイドRNAは、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス、アデノウイルス、または他のタイプのプラスミドもしくはウイルスベクターを使用して、特に、例えば、米国特許第8,454,972号(アデノウイルスに関する製剤、用量)、同第8,404,658号(AAVに関する製剤、用量)及び同第5,846,946号(DNAプラスミドに関する製剤、用量)、ならびにレンチウイルス、AAV及びアデノウイルスに関する臨床試験及び当該臨床試験に関する公開物による製剤及び用量を使用して、送達することができる。例えば、AAVの場合、その投与経路、製剤及び用量は、米国特許第8,454,972号及びAAVに関する臨床試験の場合と同様にすることができる。アデノウイルスの場合、その投与経路、製剤及び用量は、米国特許第8,404,658号及びアデノウイルスに関する臨床試験の場合と同様にすることができる。プラスミド送達の場合、その投与経路、製剤及び用量は、米国特許第5,846,946号及びプラスミドに関する臨床研究の場合と同様にすることができる。用量は、平均70kgの個体(例えば、ヒト成人男性)に基づいてもよいし、またはこれに外挿することができ、かつ患者、対象、哺乳類の様々な体重及び種に合わせて調整することができる。投与の頻度は、医学従事者または獣医学従事者(例えば、医師、獣医師)の範囲内であり、患者または対象の年齢、性別、全身の健康、他の状態、及び対処される特定の状態または症状を含む、通常の因子に応じて決まる。ウイルスベクターは、目的の組織に注入され得る。細胞型に特異的なゲノム改変の場合、Cas13及びアデノシンデアミナーゼの発現は、細胞型に特異的なプロモーターによって促進され得る。例えば、肝臓に特異的な発現にはアルブミンプロモーターが使用され得、ニューロンに特異的な発現(例えば、CNS疾患を標的とする場合)にはシナプシンIプロモーターが使用され得る。
レンチウイルスは、有糸分裂細胞及び有糸分裂後細胞の両方に感染して、その遺伝子を発現する能力を有する、複雑なレトロウイルスである。最も一般的に知られているレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)であり、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して、広範な細胞型を標的とする。
AD機能化CRISPR系(複数可)(例えば、単一またはマルチプレックス化)は、作物ゲノミクスにおける近年の進歩と併せて使用することができる。本明細書に記載される系は、効率的かつ費用対効果の高い植物遺伝子またはゲノムの探索または編集または操作を、例えば、植物遺伝子またはゲノムの迅速な調査及び/または選択及び/または探索及び/または比較及び/または操作及び/または形質転換を実施するために使用することができ、例えば、植物(複数可)に対して、形質(複数可)または特徴(複数可)の創出、同定、開発、最適化、もしくは付与をもたらすか、または植物ゲノムを形質転換することができる。したがって、植物の生産の向上、新しい組み合わせの形質もしくは特徴を持った新しい植物、または形質が増強された新しい植物がもたらされ得る。AD機能化CRISPR系は、植物に対して、部位特異的組み込み(SDI)または遺伝子編集(GE)または任意の準逆育種(NRB)または逆育種(RB)の各技術において使用することができる。本明細書に記載されるCas13エフェクタータンパク質系を利用する態様は、植物におけるCRISPR-Cas(例えば、CRISPR-Cas9)系の使用に類似していてよく、アリゾナ大学のウェブサイト「CRISPR-PLANT」(http://www.genome.arizona.edu/crispr/)(Penn State及びAGIの後援による)において言及されている。本発明の実施形態は、植物のゲノム編集、またはRNAiもしくは類似のゲノム編集技術がこれまで使用されてきた場合に使用することができ、例えば、Nekrasov,“Plant genome editing made easy:targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR-Cas system,” Plant Methods 2013,9:39(doi:10.1186/1746-4811-9-39)、Brooks,“Efficient gene editing in tomato in the first generation using the CRISPR-Cas9 system,” Plant Physiology September 2014 pp 114.247577、Shan,“Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system,” Nature Biotechnology 31,686-688(2013)、Feng,“Efficient genome editing in plants using a CRISPR-Cas system,” Cell Research(2013)23:1229-1232.doi:10.1038/cr.2013.114;オンライン公開2013年8月20日、Xie,“RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system,” Mol Plant.2013 Nov;6(6):1975-83.doi:10.1093/mp/sst119.Epub 2013 Aug 17、Xu,“Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice,” Rice 2014,7:5(2014)、Zhou et al.,“Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and Redundancy,” New Phytologist(2015)(Forum)1-4(www.newphytologist.comにてオンラインでのみ入手可能)、Caliando et al,“Targeted DNA degradation using a CRISPR device stably carried in the host genome,NATURE COMMUNICATIONS 6:6989,DOI:10.1038/ncomms7989,www.nature.com/naturecommunications DOI:10.1038/ncomms7989、米国特許第6,603,061号-Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method、米国特許第7,868,149号-Plant Genome Sequences and Uses Thereof and US 2009/0100536-Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traitsを参照されたい。これらの各々の内容及び開示は全て、その全体が参照により本明細書に援用される。本発明の実施に際して、Morrell et al “Crop genomics:advances and applications,” Nat Rev Genet.2011 Dec 29;13(2):85-96の内容及び開示は、本明細書の実施形態が植物に対してどのように使用され得るかについても含め、それぞれが参照により本明細書に援用される。したがって、本明細書における動物細胞への言及は、別途明らかでない限り、必要な変更を加えて、植物細胞にも適用され得、オフターゲット効果が低減された本明細書の酵素及びかかる酵素を利用する系は、本明細書に言及されるものも含め、植物用途に使用することができる。
一般に、「植物」という用語は、細胞分裂によって特徴的に生長し、葉緑体を含有し、セルロースで構成される細胞壁を有する、植物界の任意の様々な光合成生物、真核生物、単細胞生物または多細胞生物に関する。植物という用語は、単子葉植物及び双子葉植物を包含する。具体的には、植物は、限定するものではないが、アカシア、アルファルファ、アマランス、リンゴ、アンズ、チョウセンアザミ、トネリコ、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、ビート、カバノキ、ブナノキ、クロイチゴ、ブルーベリー、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタループ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、ヒマラヤスギ、穀物、セロリ、クリ、サクランボ、ハクサイ、柑橘類、クレメンタイン、クローバー、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、ササゲ、キュウリ、イトスギ、ナス、ニレ、エンダイブ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、アメリカホドイモ、ホオズキ、ガムヘムロック、ヒッコリー、ケール、キーウィフルーツ、コールラビ、カラマツ、レタス、リーキ、レモン、ライム、ニセアカシア、マツ、メイデンヘア、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、キノコ、カラシ、堅果類、オーク、オートムギ、油ヤシ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物または装飾花または観賞樹、パパイヤ、ヤシ、パセリ、パースニップ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、セイヨウナシ、ピート、コショウ、カキ、キマメ、マツ、パイナップル、オオバコ、セイヨウスモモ、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、赤チコリ、ダイコン、ナタネ、キイチゴ、コメ、ライムギ、モロコシ、ベニバナ、サルヤナギ、ダイズ、ホウレンソウ、エゾマツ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、樹木、ライ小麦、芝草、カブ、つる植物、クルミ、オランダガラシ、スイカ、コムギ、ヤムイモ、イチイ、及びズッキーニなどの被子植物及び裸子植物を含むことが意図される。植物という用語は、主に根、葉及び高等植物を特徴付ける他の器官の欠如によってまとめられる、大部分が光独立栄養生物である藻類も包含する。
具体的な実施形態において、AD機能化CRISPR系の構成要素をコードするポリヌクレオチドは、植物細胞のゲノムに安定的に組み込まれるように導入されることが想定される。これらの実施形態において、形質転換ベクターまたは発現系の設計は、ガイドRNA及び/またはアデノシンデアミナーゼとCas13の融合タンパク質が、いつ、どこで、どの条件下で発現するかに応じて調整され得る。
植物細胞における適切な発現を確実にするために、本明細書に記載されるAD機能化CRISPR系の構成要素は、典型的に、植物プロモーター、すなわち、植物細胞において機能可能なプロモーターの制御下に置かれる。異なる種類のプロモーターの使用も想定される。
発現系は、特定の植物細胞小器官への転座及び/または発現のための要素を含み得る。
具体的な実施形態において、葉緑体遺伝子を特異的に改変するために、または葉緑体における発現を確実にするために、AD機能化CRISPR系を使用することが想定される。この目的のために、葉緑体の形質転換方法、またはAD機能化CRISPR構成要素の葉緑体への区画化が使用される。例えば、プラスミドゲノムに遺伝子改変を導入することで、花粉による遺伝子流動などのバイオセーフティーの問題を減らすことができる。
トランスジェニック藻類(またはセイヨウアブラナなどの他の植物)は、植物油またはアルコール(特に、メタノール及びエタノール)などのバイオ燃料または他の生成物の生産に特に有用であり得る。これらは、油またはバイオ燃料産業における使用のために、油またはアルコールを高度に発現または過剰発現するように操作され得る。
具体的な実施形態において、本発明は、酵母細胞のゲノム編集のためのAD機能化CRISPR系の使用に関する。AD機能化CRISPR系構成要素をコードするポリヌクレオチドを導入するために使用され得る酵母細胞の形質変換方法は、Kawai et al.,2010,Bioeng Bugs.2010 Nov-Dec;1(6):395-403)に記載されている。非限定的な例には、酢酸リチウム処理(担体DNA及びPEG処理を更に含み得る)、ボンバードメントまたは電気穿孔による酵母細胞の形質転換が挙げられる。
具体的な実施形態において、ガイドRNA及び/またはCRISPR-Cas遺伝子を植物細胞で一過性に発現させることが想定される。これらの実施形態において、AD機能化CRISPR系は、ガイドRNA、CRISPR-Casタンパク質(例えば、Cas13)、及びアデノシンデアミナーゼ(CRISPR-Casタンパク質またはアプタマー結合アダプタータンパク質に融合され得る)のいずれもが細胞に内に存在する場合にのみ標的遺伝子の改変が確実となり得ることから、ゲノム改変を更に制御することができる。CRISPR-Casタンパク質の発現が一過性であるため、かかる植物細胞から再生する植物は、典型的に、外来DNAを含有しない。具体的な実施形態において、CRISPR-Casタンパク質は植物細胞によって安定的に発現され、ガイド配列は一過性に発現される。
具体的な実施形態において、AD機能化CRISPR系の1つ以上の構成要素を植物細胞に直接送達することが有益である。これは、とりわけ、非トランスジェニック植物の作製に有益である(以下参照)。具体的な実施形態において、AD機能化CRISPR系構成要素のうちの1つ以上は、植物または植物細胞の外で調製され、細胞に送達される。例えば、具体的な実施形態において、CRISPR-Casタンパク質は、インビトロで調製され、その後、植物細胞に導入される。CRISPR-Casタンパク質は、組換え産生を含む、当業者に既知の様々な方法によって調製することができる。発現後、CRISPR-Casタンパク質は、単離され、必要に応じて再度折り畳まれ、精製され、任意選択で、Hisタグなどの任意の精製タグを除去するために処理される。粗製、部分精製、またはより完全に精製されたCRISPR-Casタンパク質が得られたら、そのタンパク質を植物細胞に導入することができる。
具体的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、植物のゲノムに外来DNAが存在しないように、任意の外来遺伝子を、CRISPR構成要素をコードする遺伝子を含め、植物のゲノムに永続的に導入することなく、内因性遺伝子を改変するために、またはその発現を改変するために使用される。これは、非トランスジェニック植物に対する規制要件がさほど厳しくないため、有益である。
具体的な実施形態において、改変ゲノムを有し、かつ本明細書に記載される方法のいずれかによって作製または入手される植物細胞は、培養することで、形質転換または改変された遺伝子型を備え、それゆえ、所望の表現型を有する、完全な植物体を再生することができる。従来の再生技術は、当業者によく知られている。そのような再生技術の具体例は、組織培養生長培地中の特定の植物ホルモンの操作に基づき、典型的には、所望のヌクレオチド配列とともに導入されている殺生物剤及び/または除草剤マーカーに基づく。更なる具体的な実施形態において、植物再生は、培養されたプロトプラスト、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚またはそれらの部分から得られる(例えば、Evans et al.(1983),Handbook of Plant Cell Culture、Klee et al(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.参照)。
本明細書で提供されるAD機能化CRISPR系は、標的化されたA-G変異及びT-C変異を導入するために使用することができる。単一細胞で複数の改変を達成することを目的にした複数の標的化RNAの共発現によって、マルチプレックス化ゲノム改変を確実に行うことができる。この技術は、栄養価の向上、病害に対する抵抗性及び生物的ストレス及び非生物的ストレスに対する抵抗性の強化、ならびに商業的に有用な植物製品または異種化合物の生産性の向上を含む、改善された特徴を有する植物の高精度の操作に使用することができる。
多くの植物は、倍数体であり、これは、植物がそのゲノムの複製コピーを持っていることを意味し、コムギの場合、6個にものぼる。AD機能化CRISPR系を利用する本発明による方法は、遺伝子の全てのコピーに影響を与え、または何十個もの遺伝子を一度に標的とする「マルチプレックス化」が可能である。例えば、具体的な実施形態において、病害に対する防御の抑制に関与する様々な遺伝子の機能喪失型変異を同時に確実にするために、本発明の方法が使用される。具体的な実施形態において、コムギ植物がウドンコ病菌に抵抗性であることを確実にするために、コムギ植物細胞においてTaMLO-Al、TaMLO-Bl及びTaMLO-Dl核酸配列の発現を同時に抑制して、当該細胞からコムギ植物を再生するために、本発明の方法が使用される(WO2015109752も参照)。
具体的な実施形態において、本発明は、以下に列挙するものなどの内因性遺伝子及びその制御要素の標的化されたA-G変異及びT-C変異を伴う方法を包含する。
植物病害抵抗性遺伝子。クローニングした抵抗性遺伝子により植物を形質転換し、特定の病原菌株に対して抵抗性である植物を操作する。例えば、Jones et al.,Science 266:789(1994)(Cladosporium fulvumに対して抵抗性のあるトマトCf-9遺伝子のクローニング)、Martin et al.,Science 262:1432(1993)(Pseudomonas syringae pv.tomatoに対して抵抗性であるトマトPto遺伝子は、プロテインキナーゼをコードする)、Mindrinos et al.,Cell 78:1089(1994)(Arabidopsは、Pseudomonas syringaeに対して抵抗性のあるRSP2遺伝子であり得る)を参照されたい。病原体の感染中に上方制御または下方制御される植物遺伝子を病原体抵抗性について操作することができる。例えば、Thomazella et al.,bioRxiv 064824;doi:https://doi.org/10.1101/064824 Epub.July 23,2016(病原体の感染中に通常上方制御されるSlDMR6-1に欠失を有するトマト植物)を参照されたい。
イネの病害:Magnaporthe grisea、Cochliobolus miyabeanus、Rhizoctonia solani、Gibberella fujikuroi;コムギの病害:Erysiphe graminis、Fusarium graminearum、F.avenaceum、F.culmorum、Microdochium nivale、Puccinia striiformis、P.graminis、P.recondita、Micronectriella nivale、Typhula sp.、Ustilago tritici、Tilletia caries、Pseudocercosporella herpotrichoides、Mycosphaerella graminicola、Stagonospora nodorum、Pyrenophora tritici-repentis;オオムギの病害:Erysiphe graminis、Fusarium graminearum、F.avenaceum、F.culmorum、Microdochium nivale、Puccinia striiformis、P.graminis、P.hordei、Ustilago nuda、Rhynchosporium secalis、Pyrenophora teres、Cochliobolus sativus、Pyrenophora graminea、Rhizoctonia solani;トウモロコシの病害:Ustilago maydis、Cochliobolus heterostrophus、Gloeocercospora sorghi、Puccinia polysora、Cercospora zeae-maydis、Rhizoctonia solani;
アブラナ科野菜の病害:Alternaria japonica、Cercosporella brassicae、Plasmodiophora brassicae、Peronospora parasitica;
生長点または分裂組織を阻害する除草剤に対する抵抗性、例えば、それぞれ、Lee et al.,EMBO J.7:1241(1988)、及びMiki et al.,Theor.Appl.Genet.80:449(1990)によるイミダゾリノンまたはスルホニル尿素など。
WO00/04173またはWO/2006/045633に記載されている、植物細胞または植物のポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)遺伝子の発現及び/または活性を低下させることができる導入遺伝子。
雑種植物は、典型的に、純系植物と比較して有利な農業形質を有する。しかしながら、自家受粉植物の場合、雑種植物の生成は困難であり得る。様々な植物タイプで、植物の稔性、より詳細には、雄性稔性に重要である遺伝子が同定されている。例えば、トウモロコシでは、稔性に重要な少なくとも2つの遺伝子が同定されている(Amitabh Mohanty International Conference on New Plant Breeding Molecular Technologies Technology Development And Regulation,Oct 9-10,2014,Jaipur,India、Svitashev et al.Plant Physiol.2015 Oct;169(2):931-45、Djukanovic et al.Plant J.2013 Dec;76(5):888-99)。本明細書で提供される方法及び系は、雄性稔性に必要な遺伝子を標的とし、それにより、容易に交雑して雑種を生成し得る雄性不稔植物を生成するために使用することができる。具体的な実施形態において、シトクロムP450様遺伝子(MS26)またはメガヌクレアーゼ遺伝子(MS45)の標的化された変異導入のために本明細書で提供されるAD機能化CRISPR系を使用し、それにより、トウモロコシ植物に雄性不稔性を付与する。そのように遺伝子改変されたトウモロコシ植物は、雑種育種計画に使用することができる。
具体的な実施形態において、本明細書で提供される方法及び系は、イネ植物などの植物の稔性期を延長させるために使用される。例えば、Ehd3などのイネ稔性期遺伝子を標的として遺伝子に変異をもたらすことができ、再生植物の延長された稔性期から苗を選択することができる(CN104004782に記載されるとおり)。
作物植物における野生の生殖質及び遺伝子変異の利用可能性は、作物改良計画の鍵であるが、利用可能な作物植物の生殖質の多様性は限られている。本発明は、目的の生殖質に遺伝的変異多様性をもたらす方法を想定する。AD機能化CRISPR系のこの用途において、植物ゲノムの異なる位置を標的とするガイドRNAのライブラリーが提供され、CRISPR-Casタンパク質及びアデノシンデアミナーゼとともに植物細胞に導入される。このように、ゲノム規模の点変異及び遺伝子ノックアウトのコレクションを生成することができる。具体的な実施形態において、方法は、そのようにして得られた細胞から植物部分または植物を生成することと、目的形質について細胞をスクリーニングすることとを含む。標的遺伝子は、コード領域と非コード領域の両方を含み得る。具体的な実施形態において、形質はストレス抵抗性であり、方法はストレス抵抗性作物品種の生成方法である。
熟成は、果実及び野菜の成熟過程における通常の段階である。熟成が始まると、果実及び野菜は、わずか数日で食用に適さなくなる。この過程は、農業従事者と消費者の双方に著しい損失をもたらす。具体的な実施形態において、本発明の方法は、エチレン産生を低下させるために使用される。これは、次のうちの1つ以上を確実にすることによって確保される:a.ACCシンターゼ遺伝子発現の抑制。ACC(1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸)シンターゼは、S-アデノシルメチオニン(SAM)からACCへの変換に関与する酵素であり、エチレン生合成の最後から2番目の段階である。酵素発現は、シンターゼ遺伝子のアンチセンス(「鏡像」)または切断型コピーを植物のゲノムに挿入すると阻害される;b.ACCデアミナーゼ遺伝子の挿入。この酵素をコードする遺伝子は、一般的な非病原性土壌細菌であるPseudomonas chlororaphisから得られる。この酵素は、ACCを別の化合物に変換することから、エチレン産生に利用可能なACC量を低下させる;c.SAM加水分解酵素遺伝子の挿入。この方法は、ACCデアミナーゼと同様のものであり、エチレン産生は、その代謝産物前駆体の量が低下すると阻害される;この場合、SAMは、ホモセリンに変換される。この酵素をコードする遺伝子は、E.coli T3バクテリオファージから得られる。d.ACCオキシダーゼ遺伝子発現の抑制。ACCオキシダーゼは、エチレン生合成経路の最終段階である、ACCのエチレンへの酸化を触媒する酵素である。本明細書に記載される方法を使用して、ACCオキシダーゼ遺伝子を下方制御すると、エチレン産生が抑制され、それにより、果実熟成が遅延する。具体的な実施形態において、上記の改変に加えて、またはそれに代えて、本明細書に記載される方法は、果実が受け取るエチレンシグナルを妨害するために、エチレン受容体を改変するために使用される。具体的な実施形態において、エチレン結合タンパク質をコードするETR1遺伝子の発現が改変され、より詳細には、抑制される。具体的な実施形態において、上記の改変に加えて、またはそれに代えて、本明細書に記載される方法は、植物細胞壁の完全性を維持する物質であるペクチンの分解に関与する酵素のポリガラクツロナーゼ(PG)をコードする遺伝子の発現を改変するために使用される。ペクチンの分解は、熟成過程の開始時に起こり、果実の軟化をもたらす。したがって、具体的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、PG遺伝子に変異を導入することにより、またはPG遺伝子の活性を抑制することにより、PG酵素の産生量を減らして、ペクチン分解を遅らせるために使用される。
具体的な実施形態において、本発明の方法は、植物または植物部分の貯蔵寿命に影響を与える化合物の産生に関与する遺伝子を改変するために使用される。より具体的には、改変は、ジャガイモ塊茎における還元糖の蓄積を防ぐ遺伝子中にある。高温処理を行うと、これらの還元糖は、遊離アミノ酸と反応し、褐色で苦みのある生成物となり、潜在的な発がん性物質であるアクリルアミドの量が上昇する。具体的な実施形態において、本明細書で提供される方法は、スクロースをグルコース及びフルクトースに分解するタンパク質をコードする液胞インベルターゼ遺伝子(VInv)の発現を低下または阻害するために使用される(Clasen et al.DOI:10.1111/pbi.12370)。
具体的な実施形態において、AD機能化CRISPR系は、栄養的に改良された農作物を作製するために使用される。具体的な実施形態において、本明細書で提供される方法は、「機能性食品」、すなわち、食品が含有する従来の栄養素を超えた健康上の利益をもたらし得る改変された食品もしくは食品成分、及び/または「栄養補助食品」、すなわち、食品もしくは食品の一部とみなされ得、疾患の予防及び治療を含む健康上の利益を提供する物質を生成するように適合される。具体的な実施形態において、栄養補助食品は、がん、糖尿病、心臓血管疾患、及び高血圧のうちの1つ以上の予防及び/または治療に有用である。
・カロチノイド、例えば、細胞に損傷を引き起こし得るフリーラジカルを中和する、ニンジンに存在するα-カロチン、またはフリーラジカルを中和する、様々な果実及び野菜に存在するβ-カロチン。
・健全な視力の維持に貢献する、緑色野菜に存在するルテイン。
・前立腺癌のリスクを低下させると考えられている、トマト及びトマト製品に存在するリコピン。
・健全な視力の維持に貢献する、柑橘類及びトウモロコシに存在するゼアキサンチン。
・食物繊維、例えば、乳癌及び/または結腸癌のリスクを低下させ得る、フスマに存在する不溶性繊維、ならびにオートムギに存在するβ-グルカン、心臓血管疾患(CVD)のリスクを低下させ得る、サイリウム及び全粒穀物に存在する可溶性繊維。
・脂肪酸、例えば、CVDのリスクを低下させ、精神機能及び視覚機能を改善し得る、ω-3脂肪酸、身体組成を改善し得、ある種のがんのリスクを低下させ得る、共役リノール酸、ならびにがん及びCVDの炎症リスクを低下させ得、身体組成を改善し得る、GLA。
・フラボノイド、例えば、抗酸化様活性を有し、変性疾患のリスクを低下させ得る、コムギに存在するヒドロキシケイ皮酸、フリーラジカルを中和し、がんのリスクを低下させ得る、果実及び野菜に存在するフラボノール、カテキン及びタンニン。
・グルコシノレート、インドール、イソチオシアナート、例えば、フリーラジカルを中和し、がんのリスクを低下し得る、アブラナ科の野菜(ブロッコリー、ケール)、ホースラディッシュに存在するスルフォラファン。
・フェノール、例えば、変性疾患、心疾患、及びがんのリスクを低下させ得、長寿効果を有し得る、ブドウに存在するスチルベン、ならびに抗酸化様活性を有し、変性疾患、心疾患、及び眼疾患のリスクを低下し得る、野菜及び柑橘類に存在するコーヒー酸及びフェルラ酸、ならびに抗酸化様活性を有し、変性疾患及び心疾患のリスクを低下し得る、カカオに存在するエピカテキン。
・血中コレステロール値を下げることによって冠状動脈性心疾患のリスクを低下させ得る、トウモロコシ、ダイズ、コムギ及び木由来の油に存在する植物スタノール/ステロール。
・胃腸の健康を改善し得る、キクイモ、エシャロット、オニオンパウダーに存在するフルクタン、イヌリン、フラクトオリゴ糖。
・LDLコレステロールを低下させ得る、ダイズに存在するサポニン。
・心疾患のリスクを低下させ得る、ダイズに存在するダイズタンパク質。
・フィトエストロゲン、例えば、ホットフラッシュなどの更年期症状を低減し得、骨粗鬆症及びCVDを低減し得る、ダイズに存在するイソフラボン、ならびに心疾患及びいくつかのがんから保護し得、LDLコレステロール、総コレステロールを低下させ得る、亜麻、ライムギ及び野菜に存在するリグナン。
・硫化物及びチオール、例えば、タマネギ、ニンニク、オリーブ、リーキ及びワケギに存在するジアリルスルフィド、ならびにLDLコレステロールを低下させ得、健全な免疫系を維持するのに役立つ、アブラナ科の野菜に存在するアリルメチルトリスルフィド、ジチオールチオン;ならびに。
・タンニン、例えば、尿路の健康を改善し得、CVD及び高血圧のリスクを低下させ得る、クランベリー、カカオに存在するプロアントシアニジン。
具体的な実施形態において、本明細書で提供される方法は、アレルゲンレベルが低下した植物を生成するために使用され、これにより、植物は、消費者にとってより安全なものとなる。具体的な実施形態において、方法は、植物アレルゲンの産生に関与する1つ以上の遺伝子の発現を改変することを含む。例えば、具体的な実施形態において、方法は、ライグラス植物細胞などの植物細胞のLol p5遺伝子の発現を下方制御することと、当該細胞から植物を再生させて、当該植物の花粉のアレルゲン性を低下させることとを含む(Bhalla et al.1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.96:11676-11680)。
本明細書で提供される方法は、付加される栄養価の構成成分の産生に関与する酵素をコードする価値のある遺伝子または種、門、及び植物界にわたって目的の農業形質に影響を与える一般的な遺伝子の同定を更に可能にする。本明細書に記載されるAD機能化CRISPR系を使用して、例えば、植物の代謝経路の酵素をコードする遺伝子を選択的に標的化することによって、植物のある特定の栄養的側面に関与する遺伝子を特定することができる。同様に、所望の農業形質に影響し得る遺伝子を選択的に標的化することによって、関連する遺伝子を特定することができる。したがって、本発明は、特定の栄養価及び/または農業形質を有する化合物の産生に関与する酵素をコードする遺伝子のスクリーニング方法を包含する。
本明細書で使用される「バイオ燃料」という用語は、植物資源及び植物由来資源から作られる代替燃料である。再生可能なバイオ燃料は、炭素固定プロセスを介してエネルギーを得られる有機物質から抽出することができ、またはバイオマスの使用もしくは変換を介して作られる。このバイオマスは、バイオ燃料に直接使用することができ、または熱的変換、化学的変換、及び生化学的変換によって簡便なエネルギー含有物質に変換することもできる。このバイオマス変換により、固体、液体、または気体の形態の燃料を得ることができる。バイオ燃料には、バイオエタノールとバイオディーゼルの2つの種類がある。バイオエタノールは、大部分がトウモロコシ及びサトウキビに由来するセルロース(デンプン)の糖発酵プロセスによって主に生産される。一方、バイオディーゼルは、ナタネ、ヤシ、及びダイズなどの油料作物から主に生産される。バイオ燃料は、主に輸送に使用される。
具体的な実施形態において、本明細書に記載されるAD機能化CRISPR系を使用する方法は、発酵のための糖をより効率的に放出させる主要な加水分解物質によるアクセスを促進するように、細胞壁の特性を改変するために使用される。具体的な実施形態において、セルロース及び/またはリグニンの生合成が改変される。セルロースは、細胞壁の主な構成成分である。セルロース及びリグニンの生合成は、共制御される。植物におけるリグニンの比率を減らすことによって、セルロースの比率を増やすことができる。具体的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、発酵性炭水化物を増加させるために、植物のリグニン生合成を下方制御するために使用される。より具体的には、本明細書に記載される方法は、WO2008064289A2に開示されるとおり、4-クマル酸3-ヒドロキシラーゼ(C3H)、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)、ケイ皮酸4-ヒドロキシラーゼ(C4H)、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ(HCT)、コーヒー酸O-メチルトランスフェラーゼ(COMT)、カフェオイルCoA3-O-メチルトランスフェラーゼ(CCoAOMT)、フェルラ酸5-ヒドロキシラーゼ(F5H)、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ(CAD)、シンナモイルCoA-レダクターゼ(CCR)、4-クマル酸-CoAリガーゼ(4CL)、モノリグノール-リグニン特異的グリコシルトランスフェラーゼ、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)からなる群から選択される、少なくとも第1のリグニン生合成遺伝子を下方制御するために使用される。
具体的な実施形態において、本明細書で提供されるAD機能化CRISPR系は、組換え微生物によるバイオエタノール生産のために使用される。例えば、AD機能化CRISPR系は、発酵性糖からバイオ燃料またはバイオポリマーを生成し、任意選択で、発酵性糖の供給源である農業廃棄物由来の植物リグノセルロースを分解することができるように、酵母などの微生物を操作するために使用することができる。いくつかの実施形態において、AD機能化CRISPR系は、バイオ燃料生産経路と競合する内因性代謝経路を改変するために使用される。
トランスジェニック藻類またはセイヨウアブラナなどの他の植物は、例えば、植物油またはアルコール(特に、メタノール及びエタノール)などのバイオ燃料の生産に特に有用であり得る。これらは、油またはバイオ燃料産業における使用のために、油またはアルコールを高度に発現または過剰発現するように操作され得る。
具体的な実施形態において、本発明の方法は、脂肪酸メチルエステル(「FAME」)及び脂肪酸エチルエステル(「FAEE」)などの脂肪酸エステルの生産が可能な遺伝子操作された微生物の生成に使用される。
本明細書で提供される方法はまた、有機酸生産、より詳細には、ペントース糖またはヘキソース糖から有機酸生産が可能な微生物を操作するために使用される。具体的な実施形態において、方法は、微生物に外来性LDH遺伝子を導入することを含む。具体的な実施形態において、当該微生物における有機酸生産は、追加的または代替的に、目的の有機酸以外の代謝産物を生産する及び/または内因性代謝経路が有機酸を消費する内因性代謝経路に関与するタンパク質をコードする内因性遺伝子を不活性化することによって、増加する。具体的な実施形態において、改変は、目的の有機酸以外の代謝産物の生産が減少することを確実にする。具体的な実施形態によれば、方法は、有機酸が消費される内因性経路、または目的の有機酸以外の代謝産物を生産する内因性経路に関与する産物をコードする遺伝子の少なくとも1つの操作された遺伝子の欠失及び/または不活性化を導入するために使用される。具体的な実施形態において、少なくとも1つの操作された遺伝子の欠失または不活性化は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(pdc)、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(adh)、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、D-乳酸デヒドロゲナーゼ(d-ldh)、L-乳酸デヒドロゲナーゼ(l-ldh)、乳酸2-モノオキシゲナーゼからなる群から選択される酵素をコードする1つ以上の遺伝子にある。
更なる実施形態において、少なくとも1つの操作された遺伝子の欠失及び/または不活性化は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(pdc)をコードする内因性遺伝子にある。
具体的な実施形態において、AD機能化CRISPR系は、酵母株を利用した改良キシロースまたはセロビオースの選択に適用することができる。エラープローンPCRを使用して、キシロース利用経路またはセロビオース利用経路に関与する1つ(またはそれ以上)の遺伝子を増幅することができる。キシロース利用経路及びセロビオース利用経路に関与する遺伝子の例は、限定するものではないが、Ha,S.J.,et al.(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2):504-9及びGalazka,J.M.,et al.(2010)Science 330(6000):84-6に記載のものを挙げることができる。得られる二本鎖DNA分子ライブラリーは、ランダム変異を当該選択遺伝子にそれぞれ含み、AD機能化CRISPR系の構成要素とともに酵母株(例えば、S288C)に同時形質転換することができ、WO2015138855に記載のように、キシロースまたはセロビオース利用能が増強された株を選択することができる。
Tadas Jakociunasらは、パン酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて、1回の形質転換工程で最大5つの異なる遺伝子座のゲノム工学に対して、マルチプレックスCRISPR-Cas9系の適用が成功したことについて記載しており(Metabolic Engineering Volume 28、March 2015、Pages 213-222)、これにより、工業的に重要なイソプレノイド生合成経路の鍵となる中間体のメバロン酸の生産が高い株が得られる。具体的な実施形態において、AD機能化CRISPR系は、イソプレノイド合成に使用される更なる高生産酵母株を特定するための本明細書に記載のマルチプレックスゲノム工学法に適用することができる。
本発明はまた、本明細書で提供される方法によって得ることができる及び得られる植物及び酵母細胞を提供する。本明細書に記載される方法によって得られる改良植物は、例えば、植物の害虫、除草剤、乾燥、低温または高温、過剰な水などに対する抵抗性を確実にする遺伝子の発現を介した食糧または飼料の生産に有用であり得る。
一態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかによる真核生物宿主細胞を含む、非ヒト真核生物、好ましくは多細胞真核生物を提供する。他の態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかによる真核生物宿主細胞を含む、真核生物、好ましくは多細胞真核生物を提供する。これらの態様のいくつかの実施形態における生物は、動物、例えば、哺乳類であり得る。また、生物は、昆虫などの節足動物であり得る。本発明はまた、例えば、家畜及び生産動物などの他の農業用途に拡張することもできる。例えば、ブタは、特に再生医療における生物医学モデルとして、魅力的な多くの特徴を備える。特に、重症複合免疫不全(SCID)のブタは、再生医療、異種移植(本明細書に別途記載)、及び腫瘍発生の有用なモデルを提供し得、ヒトSCID患者に対する治療法開発の助けとなる。Leeら(Proc Natl Acad Sci USA.2014 May 20;111(20):7260-5)は、レポーター誘導転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)系を利用して、両方のアレルに影響を与えるものを含め、体細胞の組換え活性化遺伝子(RAG)2の標的化改変を高効率で生成した。AD機能化CRISPR系は、類似の系に適用されてもよい。
家畜のウイルス標的には、いくつかの実施形態において、例えば、ブタのマクロファージ上のブタCD163が含まれ得る。CD163は、PRRSv(アルテリウイルスであるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス)による感染に関連する(ウイルスの細胞侵入を介すると考えられている)。PRRSvによる感染、特に、ブタ肺胞マクロファージ(肺に認められる)の感染は、これまで不治であったブタ症候群(「ミステリーブタ病」または「ブルーイヤ病」)を引き起こし、家畜ブタの繁殖障害、体重減少及び高死亡率を含む被害をもたらす。マクロファージ活性が失われることによる免疫不全症に起因して、流行性肺炎、髄膜炎及び耳浮腫などの日和見感染症が見られることが多い。また、抗生物質の使用増加及び金銭的損失による経済的及び環境的影響も著しい(年間推定6億6,000万ドル)。
AD機能化組成物による治療剤標的化
明らかなように、AD機能化CRISPR系を使用して、目的の任意のポリヌクレオチド配列を標的とし得ることが想定される。本発明は、インビボ、エクスビボまたはインビトロで標的細胞を改変するために使用される、非天然もしくは操作の組成物、または当該組成物の構成要素をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、または当該組成物の構成要素をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターもしくは送達系を提供し、一旦改変された後は、CRISPR改変細胞の子孫または細胞株が改変された表現型を維持するように細胞を改変するように実施され得る。改変された細胞及び子孫は、所望の細胞型にCRISPR系をエクスビボまたはインビボで適用した植物または動物などの多細胞生物の一部であってよい。本CRISPR発明は、治療的療法であり得る。治療的療法は、遺伝子もしくはゲノム編集、または遺伝子治療を含み得る。本発明の組成物及び用法を用いて治療され得る追加の疾患は、Clin Varデータベースにさらに開示される(Landrum et al.,Nucleic Acids Res.2016 Jan 1;42(1)D980-5;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK174587/)。
本発明はまた、養子療法用に細胞を改変するための、本明細書に記載されるAD機能化CRISPR系の使用を企図する。したがって、本発明の態様は、腫瘍関連抗原などの選択された抗原に特異的である、T細胞などの免疫系細胞の養子移入を伴う(Maus et al.,2014,Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses,Annual Review of Immunology,Vol.32:189-225、Rosenberg and Restifo,2015,Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer,Science Vol.348 no.6230 pp.62-68、及びRestifo et al.,2015,Adoptive immunotherapy for cancer:harnessing the T cell response.Nat.Rev.Immunol.12(4):269-281、及びJenson and Riddell,2014,Design and implementation of adoptive therapy with chimeric antigen receptor-modified T cells.Immunol Rev.257(1):127-144参照)。例えば、様々な戦略を利用して、例えば、選択されたペプチド特異性を有する新しいTCRα鎖及びβ鎖を導入することによって、T細胞受容体(TCR)の特異性を変更することにより、T細胞を遺伝子的に改変することができる(米国特許第8,697,854号、PCT特許出願公開:WO2003020763、WO2004033685、WO2004044004、WO2005114215、WO2006000830、WO2008038002、WO2008039818、WO2004074322、WO2005113595、WO2006125962、WO2013166321、WO2013039889、WO2014018863、WO2014083173、米国特許第8,088,379号参照)。
がん
本発明の方法及び組成物は、疾患細胞の薬物耐性及び持続性に関連する細胞状態、構成要素、及び機序を特定するために使用され得る。Teraiら(Cancer Research,19-Dec-2017,doi:10.1158/0008-5472.CAN-17-1904)は、エルロチニブ+THZ1(CDK7/12阻害剤)併用療法により処置したEGFR依存性肺癌PC9細胞におけるゲノムワイドCRISPR/Cas9エンハンサー/サプレッサースクリーニングにより、エルロチニブ/THZ1の相乗効果を高める複数の遺伝子、ならびに相乗効果を抑制する構成要素及び経路を特定したことを報告した。Wangら(Cell Rep.2017 Feb 7;18(6):1543-1557.doi:10.1016/j.celrep.2017.01.031.;Krall et al.,Elife.2017 Feb 1;6.pii:e18970.doi:10.7554/eLife.18970)は、ゲノムワイドCRISPR機能喪失スクリーニングを使用して、MAPK阻害剤に対する抵抗性のメディエーターを特定したことを報告した。Donovanら(PLoS One.2017 Jan 24;12(1):e0170445.doi:10.1371/journal.pone.0170445.eCollection 2017)は、CRISPRを介した変異導入のアプローチを使用して、MAPKシグナル伝達経路遺伝子の新規機能獲得アレル及び薬物耐性アレルを特定した。Wangら(Cell.2017 Feb 23;168(5):890-903.e15.doi:10.1016/j.cell.2017.01.013.Epub 2017 Feb 2)は、ゲノムワイドCRISPRスクリーニングを使用して、遺伝子ネットワーク及び発がん性Rasとの合成致死相互作用を特定した。Chowら(Nat Neurosci.2017 Oct;20(10):1329-1341.doi:10.1038/nn.4620.Epub 2017 Aug 14)は、膠芽腫におけるアデノ随伴ウイルス媒介性の自家遺伝子CRISPRスクリーニングを開発して、膠芽腫の機能的サプレッサーを特定した。Xueら(Nature.2014 Oct 16;514(7522):380-4.doi:10.1038/nature13589.Epub 2014 Aug 6)は、マウス肝臓のがん遺伝子に対してCRISPRを介した直接変異を利用した。
本発明の方法及び組成物は、限定するものではないが、家族性高コレステロール血症、血友病、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、遺伝性高チロシン血症I型、及びアルファ-1抗トリプシン欠乏症を含む、肝臓の遺伝性代謝疾患の治療において、従来の遺伝子治療法を超える利点を提供する。Bryson et al.,Yale J.Biol.Med.90(4):553-566,19-Dec-2017を参照されたい。
筋肉
Provenzanoら(Mol Ther Nucleic Acids.9:337-348.15-Dec-2017;.doi:10.1016/j.omtn.2017.10.006.Epub 2017 Oct 14)は、筋強直性ジストロフィー1型患者に由来する筋原細胞における、CRISPR/Cas9を介したCTG伸長の欠失及び正常な表現型への永続的復帰を報告した。本発明の方法及び組成物は、同様に、ヌクレオチド反復障害、限定するものではないが、CTG伸長にも適用可能である。Tabebordbarら(2016 Jan 22;351(6271):407-411.doi:10.1126/science.aad5177.Epub 2015 Dec 31)は、CRISPRを使用して、Dmdエクソン23の遺伝子座を編集し、DMDにおける破壊的変異を修正したことを報告している。Tabebordbarは、プログラム可能なCRISPR複合体を、新生児及び成体マウスの最終分化した骨格筋線維及び心筋細胞、ならびに筋衛星細胞に局所的及び全身的に送達し得、当該複合体は、標的遺伝子の改変を媒介し、ジストロフィン発現を回復し、ジストロフィー筋の機能欠損を部分的に回復したことを示している。また、Nelson et al.,(Science.2016 Jan 22;351(6271):403-7.doi:10.1126/science.aad5143.Epub 2015 Dec 31)を参照されたい。
感染症
Sidikら(Cell.2016 Sep 8;166(6):1423-1435.e12.doi:10.1016/j.cell.2016.08.019.Epub 2016 Sep 2)及びPatelら(Nature.2017 Aug 31;548(7669):537-542.doi:10.1038/nature23477.Epub 2017 Aug 7)は、トキソプラズマ及び駆虫薬介入の拡大におけるCRISPRスクリーニングを記載している。
宿主と病原体の相互作用の根底にある構成要素及びプロセスを特定するためのゲノムワイドCRISPRスクリーニングについては、いくつかの報告がある。例としては、Blondel et al.(Cell Host Microbe.2016 Aug 10;20(2):226-37.doi:10.1016/j.chom.2016.06.010.Epub 2016 Jul 21)、Shapiro et al.(Nat Microbiol.2018 Jan;3(1):73-82.doi:10.1038/s41564-017-0043-0.Epub 2017 Oct 23)及びPark et al.(Nat Genet.2017 Feb;49(2):193-203.doi:10.1038/ng.3741.Epub 2016 Dec 19)が挙げられる。
Maら(Cell Host Microbe.2017 May 10;21(5):580-591.e7.doi:10.1016/j.chom.2017.04.005)は、ゲノムワイドCRISPR機能喪失スクリーニングを利用して、治療介入のためのウイルス形質転換が駆動する合成致死標的を特定した。
心臓血管疾患
CRISPR系は、血管疾患に関連する遺伝子または遺伝子バリアントを同定するツールとして使用し得る。これは、潜在的治療または予防的標的を特定するために有用である。Xuら(Atherosclerosis,2017 Sep.21 pii:S0021-9150(17)31265-0.doi:10.1016/j.atherosclerosis.2017.08.031.[Epub出版前])は、CRISPRを使用して、ANGPTL3遺伝子をノックアウトし、LDL-Cの血漿中濃度調節におけるANGPTL3の役割を確認したことを報告している。Guptaら(Cell.2017 Jul 27;170(3):522-533.e15.doi:10.1016/j.cell.2017.06.049)は、CRISPRを使用して、幹細胞由来内皮細胞を編集し、血管疾患に関連する遺伝子バリアントを特定したことを報告している。Beaudoinら(Arterioscler Thromb Vasc Biol.2015 Jun;35(6):1472-1479.doi:10.1161/ATVBAHA.115.305534.Epub 2015 Apr 2)は、CRISPRゲノム編集を使用して、転写因子MEF2の結合を遺伝子座で破壊したことを報告している。これは、血管内皮におけるPHACTR1機能がどのように冠動脈疾患に影響するかを探索するステージを設定するものである。Pashosら(Cell Stem Cell.2017 Apr 6;20(4):558-570.e10.doi:10.1016/j.stem.2017.03.017.)は、CRISPR技術を使用して、多能性幹細胞及び肝細胞様細胞を標的とし、機能性バリアント及び脂質機能性遺伝子を特定したことを報告している。
神経学的疾患
本発明は、神経系の疾患及び障害を調査及び治療するための方法及び組成物を提供する。Nakayamaら(Am J Hum Genet.2015 May 7;96(5):709-19.doi:10.1016/j.ajhg.2015.03.003.Epub 2015 Apr 9)は、CRISPRを使用して、ヒトCNS発症におけるPYCR2の役割を研究し、小頭症及びミエリン形成減少症の潜在的標的を特定したことを報告している。Swiechら(Nat Biotechnol.2015 Jan;33(1):102-6.doi:10.1038/nbt.3055.Epub 2014 Oct 19)は、インビボで成体マウス脳の単一の遺伝子(Mecp2)及び複数の遺伝子(Dnmt1、Dnmt3a及びDnmt3b)を標的としたCRISPRの使用を報告している。Shinら(Hum Mol Genet.2016 Oct 15;25(20):4566-4576.doi:10.1093/hmg/ddw286)は、CRISPRを使用して、ハンチントン病変異を不活性化したことを記載している。Plattら(Cell Rep.2017 Apr 11;19(2):335-350.doi:10.1016/j.celrep.2017.03.052)は、CRISPRノックインマウスを使用して、自閉症スペクトラム障害におけるChd8の役割を特定したことを報告している。Seoら(J Neurosci.2017 Oct 11;37(41):9917-9924.doi:10.1523/JNEUROSCI.0621-17.2017.Epub 2017 Sep 14)は、CRISPRを使用して、神経変性障害のモデルを生成したことを記載している。Petersenら(Neuron.2017 Dec 6;96(5):1003-1012.e7.doi:10.1016/j.neuron.2017.10.008.Epub 2017 Nov 2)は、希突起膠細胞前駆細胞のアクチビンA受容体I型のCRISPRノックアウトにより、髄鞘再生不全を伴う疾患の潜在的標的を特定したことを示している。本発明の方法及び組成物が、同様に適用可能である。
CRISPR技術の他の用途
Rennevilleら(Blood.2015 Oct 15;126(16):1930-9.doi:10.1182/blood-2015-06-649087.Epub 2015 Aug 28)は、CRISPRを使用して、胎児型ヘモグロビン発現におけるEHMT1及びEMHT2の役割を研究し、SCDの新しい治療標的を特定したことを報告している。
Tothovaら(Cell Stem Cell.2017 Oct 5;21(4):547-555.e8.doi:10.1016/j.stem.2017.07.015)は、造血幹細胞及び前駆細胞においてCRISPRを使用して、ヒト骨髄疾患モデルを生成したことを報告した。
Gianiら(Cell Stem Cell.2016 Jan 7;18(1):73-78.doi:10.1016/j.stem.2015.09.015.Epub 2015 Oct 22)は、ヒト多能性幹細胞でCRISPR/Cas9ゲノム編集によってSH2B3を不活性化すると、分化が維持された赤血球細胞の増殖が向上されたことを報告している。
Wakabayashiら(Proc Natl Acad Sci USA.2016 Apr 19;113(16):4434-9.doi:10.1073/pnas.1521754113.Epub 2016 Apr 4)は、CRISPRを利用して、GATA1転写活性に関する洞察を得、ヒト赤血球障害におけるノンコーディングバリアントの病原性を調査した。
Mandalら(Cell Stem Cell.2014 Nov 6;15(5):643-52.doi:10.1016/j.stem.2014.10.004.Epub 2014 Nov 6)は、初代ヒトCD4+T細胞及びCD34+造血幹細胞及び前駆細胞(HSPC)において臨床的に関係する2つの遺伝子B2M及びCCR5を標的としたCRISPR/Cas9を記載している。
Polfusら(Am J Hum Genet.2016 Sep 1;99(3):785.doi:10.1016/j.ajhg.2016.08.002.Epub 2016 Sep 1)は、CRISPRを使用して、造血細胞株を編集し、初代ヒト造血幹細胞及び前駆細胞で標的化ノックダウン実験を引き続いて行い、ヒト造血におけるGFI1Bバリアントの役割を調査した。
Najmら(Nat Biotechnol.2017 Dec 18.doi:10.1038/nbt.4048.[Epub出版前])は、SaCas9とSpCas9のペアを有するCRISPR複合体の使用により二重標的化を実現し、複雑性の高いプール二重ノックアウトライブラリーを生成して、MAPK経路遺伝子及びアポトーシス遺伝子を含む、複数の細胞型にわたる合成致死及び緩衝遺伝子対を特定したことを報告している。
Mangusoら(Nature.2017 Jul 27;547(7664):413-418.doi:10.1038/nature23270.Epub 2017 Jul 19.)は、CRISPRスクリーニングを使用して、新しい免疫療法標的を特定及び/又は確認したことを報告している。また、Roland et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2017 Jun 20;114(25):6581-6586.doi:10.1073/pnas.1701263114.Epub 2017 Jun 12.);Erb et al.(Nature.2017 Mar 9;543(7644):270-274.doi:10.1038/nature21688.Epub 2017 Mar 1.);Hong et al.,(Nat Commun.2016 Jun 22;7:11987.doi:10.1038/ncomms11987);Fei et al.,(Proc Natl Acad Sci USA.2017 Jun 27;114(26):E5207-E5215.doi:10.1073/pnas.1617467114.Epub 2017 Jun 13.);Zhang et al.,(Cancer Discov.2017 Sep 29.doi:10.1158/2159-8290.CD-17-0532.[Epub出版前])を参照されたい。
Joungら(Nature.2017 Aug 17;548(7667):343-346.doi:10.1038/nature23451.Epub 2017 Aug 9.)は、ゲノムワイドスクリーニングを使用して、長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)を解析したことを報告している。また、Zhu et al.,(Nat Biotechnol.2016 Dec;34(12):1279-1286.doi:10.1038/nbt.3715.Epub 2016 Oct 31);Sanjana et al.,(Science.2016 Sep 30;353(6307):1545-1549)を参照されたい。
Barrowら(Mol Cell.2016 Oct 6;64(1):163-175.doi:10.1016/j.molcel.2016.08.023.Epub 2016 Sep 22.)は、ゲノムワイドCRISPRスクリーニングを使用して、ミトコンドリア病の治療標的を探索したことを報告している;また、Vafai et al.,(PLoS One.2016 Sep 13;11(9):e0162686.doi:10.1371/journal.pone.0162686.eCollection 2016)を参照されたい。
Guoら(Elife.2017 Dec 5;6.pii:e29329.doi:10.7554/eLife.29329)は、ヒト軟骨細胞を標的としたCRISPRを使用して、ヒト成長の生物学的機序を解明したことを報告している。
Ramananら(Sci Rep.2015 Jun 2;5:10833.doi:10.1038/srep10833)は、CRISPRを使用して、HBVゲノムの保存領域を標的とし、切断したことを報告している。
一態様において、本明細書に記載される本発明は、G→AもしくはC→Tの点変異または病原性一塩基多型(SNP)によって引き起こされるまたは引き起こされる可能性が高い疾患状態を治療及び/または予防することを目的として、標的遺伝子座のアデノシン残基を修正するための方法を提供する。
脳及び中枢神経系に影響を及ぼす様々な疾患、例えば、限定するものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、自閉症、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、統合失調症、副腎白質ジストロフィー、エカルディ・グティエール症候群、ファブリー病、レッシュ・ナイハン症候群、及びメンケス病に関連する病原性G→AまたはC→T変異/SNPは、ClinVarデータベースに報告されており、表Aに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、アルツハイマー病に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、PSEN1、PSEN2、及びAPPから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、これには少なくとも以下を含む:
NM_000021.3(PSEN1):c.796G>A(p.Gly266Ser)
NM_000484.3(APP):c.2017G>A(p.Ala673Thr)
NM_000484.3(APP):c.2149G>A(p.Val717Ile)
NM_000484.3(APP):c.2137G>A(p.Ala713Thr)
NM_000484.3(APP):c.2143G>A(p.Val715Met)
NM_000484.3(APP):c.2141C>T(p.Thr714Ile)
NM_000021.3(PSEN1):c.438G>A(p.Met146Ile)
NM_000021.3(PSEN1):c.1229G>A(p.Cys410Tyr)
NM_000021.3(PSEN1):c.487C>T(p.His163Tyr)
NM_000021.3(PSEN1):c.799C>T(p.Pro267Ser)
NM_000021.3(PSEN1):c.236C>T(p.Ala79Val)
NM_000021.3(PSEN1):c.509C>T(p.Ser170Phe)
NM_000447.2(PSEN2):c.1289C>T(p.Thr430Met)
NM_000447.2(PSEN2):c.717G>A(p.Met239Ile)
NM_000447.2(PSEN2):c.254C>T(p.Ala85Val)
NM_000021.3(PSEN1):c.806G>A(p.Arg269His)
NM_000484.3(APP):c.2018C>T(p.Ala673Val)。
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、PSEN1、PSEN2、及びAPPから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、アルツハイマー病を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、パーキンソン病に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、SNCA、PLA2G6、FBXO7、VPS35、EIF4G1、DNAJC6、PRKN、SYNJ1、CHCHD2、PINK1、PARK7、LRRK2、ATP13A2、及びGBAから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000345.3(SNCA):c.157G>A(p.Ala53Thr)
NM_000345.3(SNCA):c.152G>A(p.Gly51Asp)
NM_003560.3(PLA2G6):c.2222G>A(p.Arg741Gln)
NM_003560.3(PLA2G6):c.2239C>T(p.Arg747Trp)
NM_003560.3(PLA2G6):c.1904G>A(p.Arg635Gln)
NM_003560.3(PLA2G6):c.1354C>T(p.Gln452Ter)
NM_012179.3(FBXO7):c.1492C>T(p.Arg498Ter)
NM_012179.3(FBXO7):c.65C>T(p.Thr22Met)
NM_018206.5(VPS35):c.1858G>A(p.Asp620Asn)
NM_198241.2(EIF4G1):c.3614G>A(p.Arg1205His)
NM_198241.2(EIF4G1):c.1505C>T(p.Ala502Val)
NM_001256865.1(DNAJC6):c.2200C>T(p.Gln734Ter)
NM_001256865.1(DNAJC6):c.2326C>T(p.Gln776Ter)
NM_004562.2(PRKN):c.931C>T(p.Gln311Ter)
NM_004562.2(PRKN):c.1358G>A(p.Trp453Ter)
NM_004562.2(PRKN):c.635G>A(p.Cys212Tyr)
NM_203446.2(SYNJ1):c.773G>A(p.Arg258Gln)
NM_001320327.1(CHCHD2):c.182C>T(p.Thr61Ile)
NM_001320327.1(CHCHD2):c.434G>A(p.Arg145Gln)
NM_001320327.1(CHCHD2):c.300+5G>A
NM_032409.2(PINK1):c.926G>A(p.Gly309Asp)
NM_032409.2(PINK1):c.1311G>A(p.Trp437Ter)
NM_032409.2(PINK1):c.736C>T(p.Arg246Ter)
NM_032409.2(PINK1):c.836G>A(p.Arg279His)
NM_032409.2(PINK1):c.938C>T(p.Thr313Met)
NM_032409.2(PINK1):c.1366C>T(p.Gln456Ter)
NM_007262.4(PARK7):c.78G>A(p.Met26Ile)
NM_198578.3(LRRK2):c.4321C>T(p.Arg1441Cys)
NM_198578.3(LRRK2):c.4322G>A(p.Arg1441His)
NM_198578.3(LRRK2):c.1256C>T(p.Ala419Val)
NM_198578.3(LRRK2):c.6055G>A(p.Gly2019Ser)
NM_022089.3(ATP13A2):c.1306+5G>A
NM_022089.3(ATP13A2):c.2629G>A(p.Gly877Arg)
NM_022089.3(ATP13A2):c.490C>T(p.Arg164Trp)
NM_001005741.2(GBA):c.1444G>A(p.Asp482Asn)
m.15950G>A。
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、SNCA、PLA2G6、FBXO7、VPS35、EIF4G1、DNAJC6、PRKN、SYNJ1、CHCHD2、PINK1、PARK7、LRRK2、ATP13A2、及びGBAから選択される少なくとも1つの遺伝子中の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、パーキンソン病を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、自閉症に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、MECP2、NLGN3、SLC9A9、EHMT1、CHD8、NLGN4X、GSPT2、及びPTENから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_001110792.1(MECP2):c.916C>T(p.Arg306Ter)
NM_004992.3(MECP2):c.473C>T(p.Thr158Met)
NM_018977.3(NLGN3):c.1351C>T(p.Arg451Cys)
NM_173653.3(SLC9A9):c.1267C>T(p.Arg423Ter)
NM_024757.4(EHMT1):c.3413G>A(p.Trp1138Ter)
NM_020920.3(CHD8):c.2875C>T(p.Gln959Ter)
NM_020920.3(CHD8):c.3172C>T(p.Arg1058Ter)
NM_181332.2(NLGN4X):c.301C>T(p.Arg101Ter)
NM_018094.4(GSPT2):c.1021G>A(p.Val341Ile)
NM_000314.6(PTEN):c.392C>T(p.Thr131Ile)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、MECP2、NLGN3、SLC9A9、EHMT1、CHD8、NLGN4X、GSPT2、及びPTENから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、自閉症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ALSに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、SOD1、VCP、UBQLN2、ERBB4、HNRNPA1、TUBA4A、SOD1、TARDBP、FIG4、OPTN、SETX、SPG11、FUS、VAPB、ANG、CHCHD10、SQSTM1、及びTBK1から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000454.4(SOD1):c.289G>A(p.Asp97Asn)
NM_007126.3(VCP):c.1774G>A(p.Asp592Asn)
NM_007126.3(VCP):c.464G>A(p.Arg155His)
NM_007126.3(VCP):c.572G>A(p.Arg191Gln)
NM_013444.3(UBQLN2):c.1489C>T(p.Pro497Ser)
NM_013444.3(UBQLN2):c.1525C>T(p.Pro509Ser)
NM_013444.3(UBQLN2):c.1573C>T(p.Pro525Ser)
NM_013444.3(UBQLN2):c.1490C>T(p.Pro497Leu)
NM_005235.2(ERBB4):c.2780G>A(p.Arg927Gln)
NM_005235.2(ERBB4):c.3823C>T(p.Arg1275Trp)
NM_031157.3(HNRNPA1):c.940G>A(p.Asp314Asn)
NM_006000.2(TUBA4A):c.643C>T(p.Arg215Cys)
NM_006000.2(TUBA4A):c.958C>T(p.Arg320Cys)
NM_006000.2(TUBA4A):c.959G>A(p.Arg320His)
NM_006000.2(TUBA4A):c.1220G>A(p.Trp407Ter)
NM_006000.2(TUBA4A):c.1147G>A(p.Ala383Thr)
NM_000454.4(SOD1):c.112G>A(p.Gly38Arg)
NM_000454.4(SOD1):c.124G>A(p.Gly42Ser)
NM_000454.4(SOD1):c.125G>A(p.Gly42Asp)
NM_000454.4(SOD1):c.14C>T(p.Ala5Val)
NM_000454.4(SOD1):c.13G>A(p.Ala5Thr)
NM_000454.4(SOD1):c.436G>A(p.Ala146Thr)
NM_000454.4(SOD1):c.64G>A(p.Glu22Lys)
NM_000454.4(SOD1):c.404G>A(p.Ser135Asn)
NM_000454.4(SOD1):c.49G>A(p.Gly17Ser)
NM_000454.4(SOD1):c.217G>A(p.Gly73Ser)
NM_007375.3(TARDBP):c.892G>A(p.Gly298Ser)
NM_007375.3(TARDBP):c.943G>A(p.Ala315Thr)
NM_007375.3(TARDBP):c.883G>A(p.Gly295Ser)
NM_007375.3(TARDBP):c.*697G>A
NM_007375.3(TARDBP):c.1144G>A(p.Ala382Thr)
NM_007375.3(TARDBP):c.859G>A(p.Gly287Ser)
NM_014845.5(FIG4):c.547C>T(p.Arg183Ter)
NM_001008211.1(OPTN):c.1192C>T(p.Gln398Ter)
NM_015046.5(SETX):c.6407G>A(p.Arg2136His)
NM_015046.5(SETX):c.8C>T(p.Thr3Ile)
NM_025137.3(SPG11):c.118C>T(p.Gln40Ter)
NM_025137.3(SPG11):c.267G>A(p.Trp89Ter)
NM_025137.3(SPG11):c.5974C>T(p.Arg1992Ter)
NM_004960.3(FUS):c.1553G>A(p.Arg518Lys)
NM_004960.3(FUS):c.1561C>T(p.Arg521Cys)
NM_004960.3(FUS):c.1562G>A(p.Arg521His)
NM_004960.3(FUS):c.1520G>A(p.Gly507Asp)
NM_004960.3(FUS):c.1483C>T(p.Arg495Ter)
NM_004960.3(FUS):c.616G>A(p.Gly206Ser)
NM_004960.3(FUS):c.646C>T(p.Arg216Cys)
NM_004738.4(VAPB):c.166C>T(p.Pro56Ser)
NM_004738.4(VAPB):c.137C>T(p.Thr46Ile)
NM_001145.4(ANG):c.164G>A(p.Arg55Lys)
NM_001145.4(ANG):c.155G>A(p.Ser52Asn)
NM_001145.4(ANG):c.407C>T(p.Pro136Leu)
NM_001145.4(ANG):c.409G>A(p.Val137Ile)
NM_001301339.1(CHCHD10):c.239C>T(p.Pro80Leu)
NM_001301339.1(CHCHD10):c.176C>T(p.Ser59Leu)
NM_001142298.1(SQSTM1):c.-47-1924C>T
NM_003900.4(SQSTM1):c.1160C>T(p.Pro387Leu)
NM_003900.4(SQSTM1):c.1175C>T(p.Pro392Leu)
NM_013254.3(TBK1):c.1340+1G>A
NM_013254.3(TBK1):c.2086G>A(p.Glu696Lys)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、SOD1、VCP、UBQLN2、ERBB4、HNRNPA1、TUBA4A、SOD1、TARDBP、FIG4、OPTN、SETX、SPG11、FUS、VAPB、ANG、CHCHD10、SQSTM1、及びTBK1から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、ALSを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、統合失調症に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、PRODH、SETD1A、及びSHANK3から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_016335.4(PRODH):c.1292G>A(p.Arg431His)
NM_016335.4(PRODH):c.1397C>T(p.Thr466Met)
NM_014712.2(SETD1A):c.2209C>T(p.Gln737Ter)
NM_033517.1(SHANK3):c.3349C>T(p.Arg1117Ter)
NM_033517.1(SHANK3):c.1606C>T(p.Arg536Trp)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、PRODH、SETD1A、及びSHANK3から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、統合失調症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、副腎白質ジストロフィーに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともABCD1遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000033.3(ABCD1):c.421G>A(p.Ala141Thr)
NM_000033.3(ABCD1):c.796G>A(p.Gly266Arg)
NM_000033.3(ABCD1):c.1252C>T(p.Arg418Trp)
NM_000033.3(ABCD1):c.1552C>T(p.Arg518Trp)
NM_000033.3(ABCD1):c.1850G>A(p.Arg617His)
NM_000033.3(ABCD1):c.1396C>T(p.Gln466Ter)
NM_000033.3(ABCD1):c.1553G>A(p.Arg518Gln)
NM_000033.3(ABCD1):c.1679C>T(p.Pro560Leu)
NM_000033.3(ABCD1):c.1771C>T(p.Arg591Trp)
NM_000033.3(ABCD1):c.1802G>A(p.Trp601Ter)
NM_000033.3(ABCD1):c.346G>A(p.Gly116Arg)
NM_000033.3(ABCD1):c.406C>T(p.Gln136Ter)
NM_000033.3(ABCD1):c.1661G>A(p.Arg554His)
NM_000033.3(ABCD1):c.1825G>A(p.Glu609Lys)
NM_000033.3(ABCD1):c.1288C>T(p.Gln430Ter)
NM_000033.3(ABCD1):c.1781-1G>A
NM_000033.3(ABCD1):c.529C>T(p.Gln177Ter)
NM_000033.3(ABCD1):c.1866-10G>A
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、少なくともABCD1遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、副腎白質ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、エカルディ・グティエール症候群に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、TREX1、RNASEH2C、ADAR、及びIFIH1から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_016381.5(TREX1):c.794G>A(p.Trp265Ter)
NM_033629.4(TREX1):c.52G>A(p.Asp18Asn)
NM_033629.4(TREX1):c.490C>T(p.Arg164Ter)
NM_032193.3(RNASEH2C):c.205C>T(p.Arg69Trp)
NM_001111.4(ADAR):c.3019G>A(p.Gly1007Arg)
NM_022168.3(IFIH1):c.2336G>A(p.Arg779His)
NM_022168.3(IFIH1):c.2335C>T(p.Arg779Cys)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、TREX1、RNASEH2C、ADAR、及びIFIH1から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、エカルディ・グティエール症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ファブリー病に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともGLA遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000169.2(GLA):c.1024C>T(p.Arg342Ter)
NM_000169.2(GLA):c.1066C>T(p.Arg356Trp)
NM_000169.2(GLA):c.1025G>A(p.Arg342Gln)
NM_000169.2(GLA):c.281G>A(p.Cys94Tyr)
NM_000169.2(GLA):c.677G>A(p.Trp226Ter)
NM_000169.2(GLA):c.734G>A(p.Trp245Ter)
NM_000169.2(GLA):c.748C>T(p.Gln250Ter)
NM_000169.2(GLA):c.658C>T(p.Arg220Ter)
NM_000169.2(GLA):c.730G>A(p.Asp244Asn)
NM_000169.2(GLA):c.369+1G>A
NM_000169.2(GLA):c.335G>A(p.Arg112His)
NM_000169.2(GLA):c.485G>A(p.Trp162Ter)
NM_000169.2(GLA):c.661C>T(p.Gln221Ter)
NM_000169.2(GLA):c.916C>T(p.Gln306Ter)
NM_000169.2(GLA):c.1072G>A(p.Glu358Lys)
NM_000169.2(GLA):c.1087C>T(p.Arg363Cys)
NM_000169.2(GLA):c.1088G>A(p.Arg363His)
NM_000169.2(GLA):c.605G>A(p.Cys202Tyr)
NM_000169.2(GLA):c.830G>A(p.Trp277Ter)
NM_000169.2(GLA):c.979C>T(p.Gln327Ter)
NM_000169.2(GLA):c.422C>T(p.Thr141Ile)
NM_000169.2(GLA):c.285G>A(p.Trp95Ter)
NM_000169.2(GLA):c.735G>A(p.Trp245Ter)
NM_000169.2(GLA):c.639+919G>A
NM_000169.2(GLA):c.680G>A(p.Arg227Gln)
NM_000169.2(GLA):c.679C>T(p.Arg227Ter)
NM_000169.2(GLA):c.242G>A(p.Trp81Ter)
NM_000169.2(GLA):c.901C>T(p.Arg301Ter)
NM_000169.2(GLA):c.974G>A(p.Gly325Asp)
NM_000169.2(GLA):c.847C>T(p.Gln283Ter)
NM_000169.2(GLA):c.469C>T(p.Gln157Ter)
NM_000169.2(GLA):c.1118G>A(p.Gly373Asp)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、少なくともGLA遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、ファブリー病を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、レッシュ・ナイハン症候群に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともHPRT1遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000194.2(HPRT1):c.151C>T(p.Arg51Ter)
NM_000194.2(HPRT1):c.384+1G>A
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、少なくともHPRT1遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、レッシュ・ナイハン症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、メンケス病に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともATP7A遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000052.6(ATP7A):c.601C>T(p.Arg201Ter)
NM_000052.6(ATP7A):c.2938C>T(p.Arg980Ter)
NM_000052.6(ATP7A):c.3056G>A(p.Gly1019Asp)
NM_000052.6(ATP7A):c.598C>T(p.Gln200Ter)
NM_000052.6(ATP7A):c.1225C>T(p.Arg409Ter)
NM_000052.6(ATP7A):c.1544-1G>A
NM_000052.6(ATP7A):c.1639C>T(p.Arg547Ter)
NM_000052.6(ATP7A):c.1933C>T(p.Arg645Ter)
NM_000052.6(ATP7A):c.1946+5G>A
NM_000052.6(ATP7A):c.1950G>A(p.Trp650Ter)
NM_000052.6(ATP7A):c.2179G>A(p.Gly727Arg)
NM_000052.6(ATP7A):c.2187G>A(p.Trp729Ter)
NM_000052.6(ATP7A):c.2383C>T(p.Arg795Ter)
NM_000052.6(ATP7A):c.2499-1G>A
NM_000052.6(ATP7A):c.2555C>T(p.Pro852Leu)
NM_000052.6(ATP7A):c.2956C>T(p.Arg986Ter)
NM_000052.6(ATP7A):c.3112-1G>A
NM_000052.6(ATP7A):c.3466C>T(p.Gln1156Ter)
NM_000052.6(ATP7A):c.3502C>T(p.Gln1168Ter)
NM_000052.6(ATP7A):c.3764G>A(p.Gly1255Glu)
NM_000052.6(ATP7A):c.3943G>A(p.Gly1315Arg)
NM_000052.6(ATP7A):c.4123+1G>A
NM_000052.6(ATP7A):c.4226+5G>A
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、少なくともATP7A遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、メンケス病を治療または予防するための方法に関する。
本発明は、遺伝性及び後天性の網膜眼疾患の効率的な治療を提供する。Holmgaardら(Mol.Ther.Nucleic Acids 9:89-99,15-Dec-2017 doi:10.1016/j.omtn.2017.08.016.Epub 2017 Sep 21)は、Vegfaを標的としたSpCas9をコードするレンチウイルスベクター(LV)によってSpCas9を送達すると、高頻度でインデルが形成され、形質導入細胞でVEGFAの顕著な減少があったことを報告した。Duanら(J Biol Chem.2016 Jul 29;291(31):16339-47.doi:10.1074/jbc.M116.729467.Epub 2016 May 31)は、ヒト初代網膜色素上皮細胞のMDM2ゲノム遺伝子座を標的としたCRISPRの使用を記載している。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、シュタルガルト病に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、ABCA4遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000350.2(ABCA4):c.4429C>T(p.Gln1477Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.6647C>T(p.Ala2216Val)
NM_000350.2(ABCA4):c.5312+1G>A
NM_000350.2(ABCA4):c.5189G>A(p.Trp1730Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.4352+1G>A
NM_000350.2(ABCA4):c.4253+5G>A
NM_000350.2(ABCA4):c.3871C>T(p.Gln1291Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.3813G>A(p.Glu1271=)
NM_000350.2(ABCA4):c.1293G>A(p.Trp431Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.206G>A(p.Trp69Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.3322C>T(p.Arg1108Cys)
NM_000350.2(ABCA4):c.1804C>T(p.Arg602Trp)
NM_000350.2(ABCA4):c.1937+1G>A
NM_000350.2(ABCA4):c.2564G>A(p.Trp855Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.4234C>T(p.Gln1412Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.4457C>T(p.Pro1486Leu)
NM_000350.2(ABCA4):c.4594G>A(p.Asp1532Asn)
NM_000350.2(ABCA4):c.4919G>A(p.Arg1640Gln)
NM_000350.2(ABCA4):c.5196+1G>A
NM_000350.2(ABCA4):c.6316C>T(p.Arg2106Cys)
NM_000350.2(ABCA4):c.3056C>T(p.Thr1019Met)
NM_000350.2(ABCA4):c.52C>T(p.Arg18Trp)
NM_000350.2(ABCA4):c.122G>A(p.Trp41Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.1903C>T(p.Gln635Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.194G>A(p.Gly65Glu)
NM_000350.2(ABCA4):c.3085C>T(p.Gln1029Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.4195G>A(p.Glu1399Lys)
NM_000350.2(ABCA4):c.454C>T(p.Arg152Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.45G>A(p.Trp15Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.4610C>T(p.Thr1537Met)
NM_000350.2(ABCA4):c.6112C>T(p.Arg2038Trp)
NM_000350.2(ABCA4):c.6118C>T(p.Arg2040Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.6342G>A(p.Val2114=)
NM_000350.2(ABCA4):c.6658C>T(p.Gln2220Ter)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、ABCA4遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、シュタルガルト病を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、バルデー・ビードル症候群に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、BBS1、BBS2、BBS7、BBS9、BBS10、BBS12、LZTFL1、及びTRIM32から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_024649.4(BBS1):c.416G>A(p.Trp139Ter)
NM_024649.4(BBS1):c.871C>T(p.Gln291Ter)
NM_198428.2(BBS9):c.263+1G>A
NM_001178007.1(BBS12):c.1704G>A(p.Trp568Ter)
NM_001276378.1(LZTFL1):c.271C>T(p.Arg91Ter)
NM_031885.3(BBS2):c.1864C>T(p.Arg622Ter)
NM_198428.2(BBS9):c.1759C>T(p.Arg587Ter)
NM_198428.2(BBS9):c.1789+1G>A
NM_024649.4(BBS1):c.432+1G>A
NM_176824.2(BBS7):c.632C>T(p.Thr211Ile)
NM_012210.3(TRIM32):c.388C>T(p.Pro130Ser)
NM_031885.3(BBS2):c.823C>T(p.Arg275Ter)
NM_024685.3(BBS10):c.145C>T(p.Arg49Trp)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、BBS1、BBS2、BBS7、BBS9、BBS10、BBS12、LZTFL1、及びTRIM32から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、バルデー・ビードル症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、錐体杆体ジストロフィーに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、RPGRIP1、DRAM2、ABCA4、ADAM9、及びCACNA1Fから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_020366.3(RPGRIP1):c.154C>T(p.Arg52Ter)
NM_178454.5(DRAM2):c.494G>A(p.Trp165Ter)
NM_178454.5(DRAM2):c.131G>A(p.Ser44Asn)
NM_000350.2(ABCA4):c.161G>A(p.Cys54Tyr)
NM_000350.2(ABCA4):c.5714+5G>A
NM_000350.2(ABCA4):c.880C>T(p.Gln294Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.6079C>T(p.Leu2027Phe)
NM_000350.2(ABCA4):c.3113C>T(p.Ala1038Val)
NM_000350.2(ABCA4):c.634C>T(p.Arg212Cys)
NM_003816.2(ADAM9):c.490C>T(p.Arg164Ter)
NM_005183.3(CACNA1F):c.244C>T(p.Arg82Ter)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、RPGRIP1、DRAM2、ABCA4、ADAM9、及びCACNA1Fから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、錐体杆体ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、先天停在性夜盲に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、GRM6、TRPM1、GPR179、及びCACNA1Fから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000843.3(GRM6):c.1462C>T(p.Gln488Ter)
NM_002420.5(TRPM1):c.2998C>T(p.Arg1000Ter)
NM_001004334.3(GPR179):c.673C>T(p.Gln225Ter)
NM_005183.3(CACNA1F):c.2576+1G>A
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、GRM6、TRPM1、GPR179、及びCACNA1Fから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、先天停在性夜盲を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、アッシャー症候群に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、MYO7A、USH1C、CDH23、PCDH15、USH2A、ADGRV1、WHRN、及びCLRN1から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000260.3(MYO7A):c.640G>A(p.Gly214Arg)
NM_000260.3(MYO7A):c.1200+1G>A
NM_000260.3(MYO7A):c.141G>A(p.Trp47Ter)
NM_000260.3(MYO7A):c.1556G>A(p.Gly519Asp)
NM_000260.3(MYO7A):c.1900C>T(p.Arg634Ter)
NM_000260.3(MYO7A):c.1963C>T(p.Gln655Ter)
NM_000260.3(MYO7A):c.2094+1G>A
NM_000260.3(MYO7A):c.4293G>A(p.Trp1431Ter)
NM_000260.3(MYO7A):c.5101C>T(p.Arg1701Ter)
NM_000260.3(MYO7A):c.5617C>T(p.Arg1873Trp)
NM_000260.3(MYO7A):c.5660C>T(p.Pro1887Leu)
NM_000260.3(MYO7A):c.6070C>T(p.Arg2024Ter)
NM_000260.3(MYO7A):c.470+1G>A
NM_000260.3(MYO7A):c.5968C>T(p.Gln1990Ter)
NM_000260.3(MYO7A):c.3719G>A(p.Arg1240Gln)
NM_000260.3(MYO7A):c.494C>T(p.Thr165Met)
NM_000260.3(MYO7A):c.5392C>T(p.Gln1798Ter)
NM_000260.3(MYO7A):c.5648G>A(p.Arg1883Gln)
NM_000260.3(MYO7A):c.448C>T(p.Arg150Ter)
NM_000260.3(MYO7A):c.700C>T(p.Gln234Ter)
NM_000260.3(MYO7A):c.635G>A(p.Arg212His)
NM_000260.3(MYO7A):c.1996C>T(p.Arg666Ter)
NM_005709.3(USH1C):c.216G>A(p.Val72=)
NM_022124.5(CDH23):c.7362+5G>A
NM_022124.5(CDH23):c.3481C>T(p.Arg1161Ter)
NM_022124.5(CDH23):c.3628C>T(p.Gln1210Ter)
NM_022124.5(CDH23):c.5272C>T(p.Gln1758Ter)
NM_022124.5(CDH23):c.5712+1G>A
NM_022124.5(CDH23):c.5712G>A(p.Thr1904=)
NM_022124.5(CDH23):c.5923+1G>A
NM_022124.5(CDH23):c.6049+1G>A
NM_022124.5(CDH23):c.7776G>A(p.Trp2592Ter)
NM_022124.5(CDH23):c.9556C>T(p.Arg3186Ter)
NM_022124.5(CDH23):c.3706C>T(p.Arg1236Ter)
NM_022124.5(CDH23):c.4309C>T(p.Arg1437Ter)
NM_022124.5(CDH23):c.6050-9G>A
NM_033056.3(PCDH15):c.3316C>T(p.Arg1106Ter)
NM_033056.3(PCDH15):c.7C>T(p.Arg3Ter)
NM_033056.3(PCDH15):c.1927C>T(p.Arg643Ter)
NM_001142772.1(PCDH15):c.400C>T(p.Arg134Ter)
NM_033056.3(PCDH15):c.3358C>T(p.Arg1120Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.11048-1G>A
NM_206933.2(USH2A):c.1143+1G>A
NM_206933.2(USH2A):c.11954G>A(p.Trp3985Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.12868C>T(p.Gln4290Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.14180G>A(p.Trp4727Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.14911C>T(p.Arg4971Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.5788C>T(p.Arg1930Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.5858-1G>A
NM_206933.2(USH2A):c.6224G>A(p.Trp2075Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.820C>T(p.Arg274Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.8981G>A(p.Trp2994Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.9304C>T(p.Gln3102Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.13010C>T(p.Thr4337Met)
NM_206933.2(USH2A):c.14248C>T(p.Gln4750Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.6398G>A(p.Trp2133Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.632G>A(p.Trp211Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.6601C>T(p.Gln2201Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.13316C>T(p.Thr4439Ile)
NM_206933.2(USH2A):c.4405C>T(p.Gln1469Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.9570+1G>A
NM_206933.2(USH2A):c.8740C>T(p.Arg2914Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.8681+1G>A
NM_206933.2(USH2A):c.1000C>T(p.Arg334Trp)
NM_206933.2(USH2A):c.14175G>A(p.Trp4725Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.9390G>A(p.Trp3130Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.908G>A(p.Arg303His)
NM_206933.2(USH2A):c.5776+1G>A
NM_206933.2(USH2A):c.11156G>A(p.Arg3719His)
NM_032119.3(ADGRV1):c.2398C>T(p.Arg800Ter)
NM_032119.3(ADGRV1):c.7406G>A(p.Trp2469Ter)
NM_032119.3(ADGRV1):c.12631C>T(p.Arg4211Ter)
NM_032119.3(ADGRV1):c.7129C>T(p.Arg2377Ter)
NM_032119.3(ADGRV1):c.14885G>A(p.Trp4962Ter)
NM_015404.3(WHRN):c.1267C>T(p.Arg423Ter)
NM_174878.2(CLRN1):c.619C>T(p.Arg207Ter)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、MYO7A、USH1C、CDH23、PCDH15、USH2A、ADGRV1、WHRN、及びCLRN1から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、アッシャー増強症候群(Enhanced Usher Syndrome)を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、レーバー先天性黒内障に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、TULP1、RPE65、SPATA7、AIPL1、CRB1、NMNAT1、及びPEX1から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_003322.5(TULP1):c.1495+1G>A
NM_000329.2(RPE65):c.11+5G>A
NM_018418.4(SPATA7):c.322C>T(p.Arg108Ter)
NM_014336.4(AIPL1):c.784G>A(p.Gly262Ser)
NM_201253.2(CRB1):c.1576C>T(p.Arg526Ter)
NM_201253.2(CRB1):c.3307G>A(p.Gly1103Arg)
NM_201253.2(CRB1):c.2843G>A(p.Cys948Tyr)
NM_022787.3(NMNAT1):c.769G>A(p.Glu257Lys)
NM_000466.2(PEX1):c.2528G>A(p.Gly843Asp)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、TULP1、RPE65、SPATA7、AIPL1、CRB1、NMNAT1、及びPEX1から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、レーバー先天性黒内障を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、網膜色素変性に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、CRB1、IFT140、RP1、IMPDH1、PRPF31、RPGR、ABCA4、RPE65、EYS、NRL、FAM161A、NR2E3、USH2A、RHO、PDE6B、KLHL7、PDE6A、CNGB1、BEST1、C2orf71、PRPH2、CA4、CERKL、RPE65、PDE6B、及びADGRV1から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_001257965.1(CRB1):c.2711G>A(p.Cys904Tyr)
NM_014714.3(IFT140):c.3827G>A(p.Gly1276Glu)
NM_006269.1(RP1):c.2029C>T(p.Arg677Ter)
NM_000883.3(IMPDH1):c.931G>A(p.Asp311Asn)
NM_015629.3(PRPF31):c.1273C>T(p.Gln425Ter)
NM_015629.3(PRPF31):c.1073+1G>A
NM_000328.2(RPGR):c.1387C>T(p.Gln463Ter)
NM_000350.2(ABCA4):c.4577C>T(p.Thr1526Met)
NM_000350.2(ABCA4):c.6229C>T(p.Arg2077Trp)
NM_000329.2(RPE65):c.271C>T(p.Arg91Trp)
NM_001142800.1(EYS):c.2194C>T(p.Gln732Ter)
NM_001142800.1(EYS):c.490C>T(p.Arg164Ter)
NM_006177.3(NRL):c.151C>T(p.Pro51Ser)
NM_001201543.1(FAM161A):c.1567C>T(p.Arg523Ter)
NM_014249.3(NR2E3):c.166G>A(p.Gly56Arg)
NM_206933.2(USH2A):c.2209C>T(p.Arg737Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.14803C>T(p.Arg4935Ter)
NM_206933.2(USH2A):c.10073G>A(p.Cys3358Tyr)
NM_000539.3(RHO):c.541G>A(p.Glu181Lys)
NM_000283.3(PDE6B):c.892C>T(p.Gln298Ter)
NM_001031710.2(KLHL7):c.458C>T(p.Ala153Val)
NM_000440.2(PDE6A):c.1926+1G>A
NM_001297.4(CNGB1):c.2128C>T(p.Gln710Ter)
NM_001297.4(CNGB1):c.952C>T(p.Gln318Ter)
NM_004183.3(BEST1):c.682G>A(p.Asp228Asn)
NM_001029883.2(C2orf71):c.1828C>T(p.Gln610Ter)
NM_000322.4(PRPH2):c.647C>T(p.Pro216Leu)
NM_000717.4(CA4):c.40C>T(p.Arg14Trp)
NM_201548.4(CERKL):c.769C>T(p.Arg257Ter)
NM_000329.2(RPE65):c.118G>A(p.Gly40Ser)
NM_000322.4(PRPH2):c.499G>A(p.Gly167Ser)
NM_000539.3(RHO):c.403C>T(p.Arg135Trp)
NM_000283.3(PDE6B):c.2193+1G>A
NM_032119.3(ADGRV1):c.6901C>T(p.Gln2301Ter)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、CRB1、IFT140、RP1、IMPDH1、PRPF31、RPGR、ABCA4、RPE65、EYS、NRL、FAM161A、NR2E3、USH2A、RHO、PDE6B、KLHL7、PDE6A、CNGB1、BEST1、C2orf71、PRPH2、CA4、CERKL、RPE65、PDE6B、及びADGRV1から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、網膜色素変性を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、色覚に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、CNGA3、CNGB3、及びATF6から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_001298.2(CNGA3):c.847C>T(p.Arg283Trp)
NM_001298.2(CNGA3):c.101+1G>A
NM_001298.2(CNGA3):c.1585G>A(p.Val529Met)
NM_019098.4(CNGB3):c.1578+1G>A
NM_019098.4(CNGB3):c.607C>T(p.Arg203Ter)
NM_019098.4(CNGB3):c.1119G>A(p.Trp373Ter)
NM_007348.3(ATF6):c.970C>T(p.Arg324Cys)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、CNGA3、CNGB3、及びATF6から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、色覚を治療または予防するための方法に関する。
聴覚に影響を及ぼす様々な疾患、例えば、限定するものではないが、難聴及び非症候性難聴に関連する病原性G→AまたはC→T変異/SNPは、ClinVarデータベースに報告されており、表Aに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するための方法に関する。
Gaoら(Nature.2017 Dec 20.doi:10.1038/nature25164.[Epub出版前])は、CRISPR-Cas9を使用してマウスのTmc1遺伝子を標的とし、進行性難聴及び難聴を軽減するためのゲノム編集を報告した。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法、系及び組成物を使用して、難聴に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正する。いくつかの実施形態では、病原性の変異/SNPは、FGF3、MYO7A、STRC、ACTG1、SLC17A8、TMC1、GJB2、MYH14、COCH、CDH23、USH1C、GJB2、MYO7A、PCDH15、MYO15A、MYO3A、WHRN、DFNB59、TMC1、LOXHD1、TMPRSS3、OTOGL、OTOF、JAG1、及びMARVELD2から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、これには少なくとも以下が挙げられる:
NM_005247.2(FGF3):c.283C>T(p.Arg95Trp)
NM_000260.3(MYO7A):c.652G>A(p.Asp218Asn)
NM_000260.3(MYO7A):c.689C>T(p.Ala230Val)
NM_153700.2(STRC):c.4057C>T(p.Gln1353Ter)
NM_001614.3(ACTG1):c.721G>A(p.Glu241Lys)
NM_139319.2(SLC17A8):c.632C>T(p.Ala211Val)
NM_138691.2(TMC1):c.1714G>A(p.Asp572Asn)
NM_004004.5(GJB2):c.598G>A(p.Gly200Arg)
NM_004004.5(GJB2):c.71G>A(p.Trp24Ter)
NM_004004.5(GJB2):c.416G>A(p.Ser139Asn)
NM_004004.5(GJB2):c.224G>A(p.Arg75Gln)
NM_004004.5(GJB2):c.95G>A(p.Arg32His)
NM_004004.5(GJB2):c.250G>A(p.Val84Met)
NM_004004.5(GJB2):c.428G>A(p.Arg143Gln)
NM_004004.5(GJB2):c.551G>A(p.Arg184Gln)
NM_004004.5(GJB2):c.223C>T(p.Arg75Trp)
NM_024729.3(MYH14):c.359C>T(p.Ser120Leu)
NM_004086.2(COCH):c.151C>T(p.Pro51Ser)
NM_022124.5(CDH23):c.4021G>A(p.Asp1341Asn)
NM_153700.2(STRC):c.4701+1G>A
NM_153676.3(USH1C):c.496+1G>A
NM_004004.5(GJB2):c.131G>A(p.Trp44Ter)
NM_004004.5(GJB2):c.283G>A(p.Val95Met)
NM_004004.5(GJB2):c.298C>T(p.His100Tyr)
NM_004004.5(GJB2):c.427C>T(p.Arg143Trp)
NM_004004.5(GJB2):c.109G>A(p.Val37Ile)
NM_004004.5(GJB2):c.-23+1G>A
NM_004004.5(GJB2):c.148G>A(p.Asp50Asn)
NM_004004.5(GJB2):c.134G>A(p.Gly45Glu)
NM_004004.5(GJB2):c.370C>T(p.Gln124Ter)
NM_004004.5(GJB2):c.230G>A(p.Trp77Ter)
NM_004004.5(GJB2):c.231G>A(p.Trp77Ter)
NM_000260.3(MYO7A):c.5899C>T(p.Arg1967Ter)
NM_000260.3(MYO7A):c.2005C>T(p.Arg669Ter)
NM_033056.3(PCDH15):c.733C>T(p.Arg245Ter)
NM_016239.3(MYO15A):c.3866+1G>A
NM_016239.3(MYO15A):c.6178-1G>A
NM_016239.3(MYO15A):c.8714-1G>A
NM_017433.4(MYO3A):c.2506-1G>A
NM_015404.3(WHRN):c.1417-1G>A
NM_001042702.3(DFNB59):c.499C>T(p.Arg167Ter)
NM_138691.2(TMC1):c.100C>T(p.Arg34Ter)
NM_138691.2(TMC1):c.1165C>T(p.Arg389Ter)
NM_144612.6(LOXHD1):c.2008C>T(p.Arg670Ter)
NM_144612.6(LOXHD1):c.4714C>T(p.Arg1572Ter)
NM_144612.6(LOXHD1):c.4480C>T(p.Arg1494Ter)
NM_024022.2(TMPRSS3):c.325C>T(p.Arg109Trp)
NM_173591.3(OTOGL):c.3076C>T(p.Gln1026Ter)
NM_194248.2(OTOF):c.4483C>T(p.Arg1495Ter)
NM_194248.2(OTOF):c.2122C>T(p.Arg708Ter)
NM_194248.2(OTOF):c.2485C>T(p.Gln829Ter)
NM_001038603.2(MARVELD2):c.1498C>T(p.Arg500Ter)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、FGF3、MYO7A、STRC、ACTG1、SLC17A8、TMC1、GJB2、MYH14、COCH、CDH23、USH1C、GJB2、MYO7A、PCDH15、MYO15A、MYO3A、WHRN、DFNB59、TMC1、LOXHD1、TMPRSS3、OTOGL、OTOF、JAG1、及びMARVELD2から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、難聴を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、非症候性難聴に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、GJB2、POU3F4、MYO15A、TMPRSS3、LOXHD1、OTOF、MYO6、OTOA、STRC、TRIOBP、MARVELD2、TMC1、TECTA、OTOGL、及びGIPC3から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、これには少なくとも以下が挙げられる:
NM_004004.5(GJB2):c.169C>T(p.Gln57Ter)
NM_000307.4(POU3F4):c.499C>T(p.Arg167Ter)
NM_016239.3(MYO15A):c.8767C>T(p.Arg2923Ter)
NM_024022.2(TMPRSS3):c.323-6G>A
NM_024022.2(TMPRSS3):c.916G>A(p.Ala306Thr)
NM_144612.6(LOXHD1):c.2497C>T(p.Arg833Ter)
NM_194248.2(OTOF):c.2153G>A(p.Trp718Ter)
NM_194248.2(OTOF):c.2818C>T(p.Gln940Ter)
NM_194248.2(OTOF):c.4799+1G>A
NM_004999.3(MYO6):c.826C>T(p.Arg276Ter)
NM_144672.3(OTOA):c.1880+1G>A
NM_153700.2(STRC):c.5188C>T(p.Arg1730Ter)
NM_153700.2(STRC):c.3670C>T(p.Arg1224Ter)
NM_153700.2(STRC):c.4402C>T(p.Arg1468Ter)
NM_024022.2(TMPRSS3):c.1192C>T(p.Gln398Ter)
NM_001039141.2(TRIOBP):c.6598C>T(p.Arg2200Ter)
NM_016239.3(MYO15A):c.7893+1G>A
NM_016239.3(MYO15A):c.5531+1G>A
NM_016239.3(MYO15A):c.6046+1G>A
NM_144612.6(LOXHD1):c.3169C>T(p.Arg1057Ter)
NM_001038603.2(MARVELD2):c.1331+1G>A
NM_138691.2(TMC1):c.1676G>A(p.Trp559Ter)
NM_138691.2(TMC1):c.1677G>A(p.Trp559Ter)
NM_005422.2(TECTA):c.5977C>T(p.Arg1993Ter)
NM_173591.3(OTOGL):c.4987C>T(p.Arg1663Ter)
NM_153700.2(STRC):c.3493C>T(p.Gln1165Ter)
NM_153700.2(STRC):c.3217C>T(p.Arg1073Ter)
NM_016239.3(MYO15A):c.5896C>T(p.Arg1966Ter)
NM_133261.2(GIPC3):c.411+1G>A
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、GJB2、POU3F4、MYO15A、TMPRSS3、LOXHD1、OTOF、MYO6、OTOA、STRC、TRIOBP、MARVELD2、TMC1、TECTA、OTOGL、及びGIPC3から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、非症候性難聴を治療または予防するための方法に関する。
様々な血液障害、例えば、限定するものではないが、ベータ-サラセミア、血友病A、血友病B、血友病C、及びウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する病原性G→AまたはC→T変異/SNPは、ClinVarデータベースに報告されており、表Aに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ベータ-サラセミアに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともHBB遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000518.4(HBB):c.-137C>T
NM_000518.4(HBB):c.-50-88C>T
NM_000518.4(HBB):c.-140C>T
NM_000518.4(HBB):c.316-197C>T
NM_000518.4(HBB):c.93-21G>A
NM_000518.4(HBB):c.114G>A(p.Trp38Ter)
NM_000518.4(HBB):c.118C>T(p.Gln40Ter)
NM_000518.4(HBB):c.92+1G>A
NM_000518.4(HBB):c.315+1G>A
NM_000518.4(HBB):c.92+5G>A
NM_000518.4(HBB):c.-50-101C>T
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、HBB遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、ベータ-サラセミアを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、血友病Aに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともF8遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000132.3(F8):c.3169G>A(p.Glu1057Lys)
NM_000132.3(F8):c.902G>A(p.Arg301His)
NM_000132.3(F8):c.1834C>T(p.Arg612Cys)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、F8遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、血友病Aを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法、システム、及び組成物を使用して、第V因子ライデン突然変異を修正する。この疾患の原因となる単一点変異(G1746→A)は、コーカサス地方の集団における遺伝性多因子性血栓性素因における最も豊富な遺伝的危険因子を表している。点変異により、単一のアミノ酸置換(R534[RIGHTWARDS ARROW]Q)が、血液凝固因子F5のプロテインC依存性タンパク質分解切断部位(R533R534)に現れる。ヘテロ接合体の欠陥は血栓症リスクのわずかな増大(約8倍)しか伴わないのに対し、ホモ接合体の欠陥はより顕著な効果(>80倍のリスク増大)をもたらす。19指向性RNA編集は、RNAレRNAベルでの修復によるこの遺伝的欠陥を補償する可能性がある。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、血友病Bに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともF9遺伝子中に存在し、これには少なくとも以下が挙げられる。
NM_000133.3(F9):c.835G>A(p.Ala279Thr)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、F9遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、血友病Bを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、血友病Cに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともF11遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000128.3(F11):c.400C>T(p.Gln134Ter)
NM_000128.3(F11):c.1432G>A(p.Gly478Arg)
NM_000128.3(F11):c.1288G>A(p.Ala430Thr)
NM_000128.3(F11):c.326-1G>A
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、F11遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、血友病Cを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともWAS遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000377.2(WAS):c.37C>T(p.Arg13Ter)
NM_000377.2(WAS):c.257G>A(p.Arg86His)
NM_000377.2(WAS):c.777+1G>A
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、WAS遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、ウィスコット・アルドリッチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
様々な肝疾患、例えば、限定するものではないが、トランスサイレチンアミロイドーシス、α1-アンチトリプシン欠乏症、ウィルソン病、及びフェニルケトン尿症に関連する病原性G→AまたはC→T変異/SNPは、ClinVarデータベースに報告されており、表Aに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、トランスサイレチンアミロイドーシスに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともTTR遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000371.3(TTR):c.424G>A(p.Val142Ile)
NM_000371.3(TTR):c.148G>A(p.Val50Met)
NM_000371.3(TTR):c.118G>A(p.Val40Ile)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、TTR遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、トランスサイレチンアミロイドーシスを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、α1-アンチトリプシン欠乏症に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともSERPINA1遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000295.4(SERPINA1):c.538C>T(p.Gln180Ter)
NM_001127701.1(SERPINA1):c.1178C>T(p.Pro393Leu)
NM_001127701.1(SERPINA1):c.230C>T(p.Ser77Phe)
NM_001127701.1(SERPINA1):c.1096G>A(p.Glu366Lys)
NM_000295.4(SERPINA1):c.1177C>T(p.Pro393Ser)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、SERPINA1遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、α1-アンチトリプシン欠乏症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ウィルソン病に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともATP7B遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000053.3(ATP7B):c.2293G>A(p.Asp765Asn)
NM_000053.3(ATP7B):c.3955C>T(p.Arg1319Ter)
NM_000053.3(ATP7B):c.2865+1G>A
NM_000053.3(ATP7B):c.3796G>A(p.Gly1266Arg)
NM_000053.3(ATP7B):c.2621C>T(p.Ala874Val)
NM_000053.3(ATP7B):c.2071G>A(p.Gly691Arg)
NM_000053.3(ATP7B):c.2128G>A(p.Gly710Ser)
NM_000053.3(ATP7B):c.2336G>A(p.Trp779Ter)
NM_000053.3(ATP7B):c.4021G>A(p.Gly1341Ser)
NM_000053.3(ATP7B):c.3182G>A(p.Gly1061Glu)
NM_000053.3(ATP7B):c.4114C>T(p.Gln1372Ter)
NM_000053.3(ATP7B):c.1708-1G>A
NM_000053.3(ATP7B):c.865C>T(p.Gln289Ter)
NM_000053.3(ATP7B):c.2930C>T(p.Thr977Met)
NM_000053.3(ATP7B):c.3659C>T(p.Thr1220Met)
NM_000053.3(ATP7B):c.2605G>A(p.Gly869Arg)
NM_000053.3(ATP7B):c.2975C>T(p.Pro992Leu)
NM_000053.3(ATP7B):c.2519C>T(p.Pro840Leu)
NM_000053.3(ATP7B):c.2906G>A(p.Arg969Gln)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、ATP7B遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、ウィルソン病を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、フェニルケトン尿症に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともPAH遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000277.1(PAH):c.1315+1G>A
NM_000277.1(PAH):c.1222C>T(p.Arg408Trp)
NM_000277.1(PAH):c.838G>A(p.Glu280Lys)
NM_000277.1(PAH):c.331C>T(p.Arg111Ter)
NM_000277.1(PAH):c.782G>A(p.Arg261Gln)
NM_000277.1(PAH):c.754C>T(p.Arg252Trp)
NM_000277.1(PAH):c.473G>A(p.Arg158Gln)
NM_000277.1(PAH):c.727C>T(p.Arg243Ter)
NM_000277.1(PAH):c.842C>T(p.Pro281Leu)
NM_000277.1(PAH):c.728G>A(p.Arg243Gln)
NM_000277.1(PAH):c.1066-11G>A
NM_000277.1(PAH):c.781C>T(p.Arg261Ter)
NM_000277.1(PAH):c.1223G>A(p.Arg408Gln)
NM_000277.1(PAH):c.1162G>A(p.Val388Met)
NM_000277.1(PAH):c.1066-3C>T
NM_000277.1(PAH):c.1208C>T(p.Ala403Val)
NM_000277.1(PAH):c.890G>A(p.Arg297His)
NM_000277.1(PAH):c.926C>T(p.Ala309Val)
NM_000277.1(PAH):c.441+1G>A
NM_000277.1(PAH):c.526C>T(p.Arg176Ter)
NM_000277.1(PAH):c.688G>A(p.Val230Ile)
NM_000277.1(PAH):c.721C>T(p.Arg241Cys)
NM_000277.1(PAH):c.745C>T(p.Leu249Phe)
NM_000277.1(PAH):c.442-1G>A
NM_000277.1(PAH):c.842+1G>A
NM_000277.1(PAH):c.776C>T(p.Ala259Val)
NM_000277.1(PAH):c.1200-1G>A
NM_000277.1(PAH):c.912+1G>A
NM_000277.1(PAH):c.1065+1G>A
NM_000277.1(PAH):c.472C>T(p.Arg158Trp)
NM_000277.1(PAH):c.755G>A(p.Arg252Gln)
NM_000277.1(PAH):c.809G>A(p.Arg270Lys)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、PAH遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、フェニルケトン尿症を治療または予防するための方法に関する。
様々な腎疾患、例えば、限定するものではないが、常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患及び腎カルニチン輸送欠乏症に関連する病原性G→AまたはC→T変異/SNPは、ClinVarデータベースに報告されており、表Aに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともPKHD1遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_138694.3(PKHD1):c.10444C>T(p.Arg3482Cys)
NM_138694.3(PKHD1):c.9319C>T(p.Arg3107Ter)
NM_138694.3(PKHD1):c.1480C>T(p.Arg494Ter)
NM_138694.3(PKHD1):c.707+1G>A
NM_138694.3(PKHD1):c.1486C>T(p.Arg496Ter)
NM_138694.3(PKHD1):c.8303-1G>A
NM_138694.3(PKHD1):c.2854G>A(p.Gly952Arg)
NM_138694.3(PKHD1):c.7194G>A(p.Trp2398Ter)
NM_138694.3(PKHD1):c.10219C>T(p.Gln3407Ter)
NM_138694.3(PKHD1):c.107C>T(p.Thr36Met)
NM_138694.3(PKHD1):c.8824C>T(p.Arg2942Ter)
NM_138694.3(PKHD1):c.982C>T(p.Arg328Ter)
NM_138694.3(PKHD1):c.4870C>T(p.Arg1624Trp)
NM_138694.3(PKHD1):c.1602+1G>A
NM_138694.3(PKHD1):c.1694-1G>A
NM_138694.3(PKHD1):c.2341C>T(p.Arg781Ter)
NM_138694.3(PKHD1):c.2407+1G>A
NM_138694.3(PKHD1):c.2452C>T(p.Gln818Ter)
NM_138694.3(PKHD1):c.5236+1G>A
NM_138694.3(PKHD1):c.6499C>T(p.Gln2167Ter)
NM_138694.3(PKHD1):c.2725C>T(p.Arg909Ter)
NM_138694.3(PKHD1):c.370C>T(p.Arg124Ter)
NM_138694.3(PKHD1):c.2810G>A(p.Trp937Ter)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、PKHD1遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、腎カルニチン輸送欠乏症に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともSLC22A5遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_003060.3(SLC22A5):c.760C>T(p.Arg254Ter)
NM_003060.3(SLC22A5):c.396G>A(p.Trp132Ter)
NM_003060.3(SLC22A5):c.844C>T(p.Arg282Ter)
NM_003060.3(SLC22A5):c.505C>T(p.Arg169Trp)
NM_003060.3(SLC22A5):c.1319C>T(p.Thr440Met)
NM_003060.3(SLC22A5):c.1195C>T(p.Arg399Trp)
NM_003060.3(SLC22A5):c.695C>T(p.Thr232Met)
NM_003060.3(SLC22A5):c.845G>A(p.Arg282Gln)
NM_003060.3(SLC22A5):c.1193C>T(p.Pro398Leu)
NM_003060.3(SLC22A5):c.1463G>A(p.Arg488His)
NM_003060.3(SLC22A5):c.338G>A(p.Cys113Tyr)
NM_003060.3(SLC22A5):c.136C>T(p.Pro46Ser)
NM_003060.3(SLC22A5):c.506G>A(p.Arg169Gln)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、SLC22A5遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、腎カルニチン輸送欠乏症を治療または予防するための方法に関する。
本明細書に開示される実施形態は、公知の標的の心血管疾患を治療または予防するために直接使用し得る。Kheraら(Nat Rev Genet.2017 Jun;18(6):331-344.doi:10.1038/nrg.2016.160.Epub 2017 Mar 13)は、原因となる危険因子をさらによく理解することを容易にするために用いられる、約60の遺伝子座と冠状動脈リスクを関連付ける一般的なバリアント関連研究を説明しており、新しい治療薬の生物学的開発の基礎となる。Kheraは、例えば、PCSK9の変異を不活性化すると、循環LDLコレステロールのレベルが低下し、CADのリスクが低下してPCSK9阻害剤の開発に強い関心が寄せられると説明している。さらに、APOC3またはLPAの保護的変異を模倣するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれトリグリセリドレベルが約70%減少し、循環リポタンパク質(a)レベルが80%減少することを示した。さらに、Wangら(Arterioscler Thromb Vasc Biol.2016 May;36(5):783-6.doi:10.1161/ATVBAHA.116.307227.Epub 2016 Mar 3)及びDingら(Circ Res.2014 Aug 15;115(5):488-92.doi:10.1161/CIRCRESAHA.115.304351.Epub 2014 Jun 10.)は、心血管疾患の予防のために遺伝子Pcsk9を標的とするCRISPRの使用を報告している。
様々な筋疾患、例えば、限定するものではないが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリー・ドレーフス型筋ジストロフィー、及び顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーに関連する病原性G→AまたはC→T変異/SNPは、ClinVarデータベースに報告されており、表Aに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともDMD遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_004006.2(DMD):c.2797C>T(p.Gln933Ter)
NM_004006.2(DMD):c.4870C>T(p.Gln1624Ter)
NM_004006.2(DMD):c.5551C>T(p.Gln1851Ter)
NM_004006.2(DMD):c.3188G>A(p.Trp1063Ter)
NM_004006.2(DMD):c.8357G>A(p.Trp2786Ter)
NM_004006.2(DMD):c.7817G>A(p.Trp2606Ter)
NM_004006.2(DMD):c.7755G>A(p.Trp2585Ter)
NM_004006.2(DMD):c.5917C>T(p.Gln1973Ter)
NM_004006.2(DMD):c.5641C>T(p.Gln1881Ter)
NM_004006.2(DMD):c.5131C>T(p.Gln1711Ter)
NM_004006.2(DMD):c.4240C>T(p.Gln1414Ter)
NM_004006.2(DMD):c.3427C>T(p.Gln1143Ter)
NM_004006.2(DMD):c.2407C>T(p.Gln803Ter)
NM_004006.2(DMD):c.2368C>T(p.Gln790Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1683G>A(p.Trp561Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1663C>T(p.Gln555Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1388G>A(p.Trp463Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1331+1G>A
NM_004006.2(DMD):c.1324C>T(p.Gln442Ter)
NM_004006.2(DMD):c.355C>T(p.Gln119Ter)
NM_004006.2(DMD):c.94-1G>A
NM_004006.2(DMD):c.5506C>T(p.Gln1836Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1504C>T(p.Gln502Ter)
NM_004006.2(DMD):c.5032C>T(p.Gln1678Ter)
NM_004006.2(DMD):c.457C>T(p.Gln153Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1594C>T(p.Gln532Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1150-1G>A
NM_004006.2(DMD):c.6223C>T(p.Gln2075Ter)
NM_004006.2(DMD):c.3747G>A(p.Trp1249Ter)
NM_004006.2(DMD):c.2861G>A(p.Trp954Ter)
NM_004006.2(DMD):c.9563+1G>A
NM_004006.2(DMD):c.4483C>T(p.Gln1495Ter)
NM_004006.2(DMD):c.4312C>T(p.Gln1438Ter)
NM_004006.2(DMD):c.8209C>T(p.Gln2737Ter)
NM_004006.2(DMD):c.4071+1G>A
NM_004006.2(DMD):c.2665C>T(p.Arg889Ter)
NM_004006.2(DMD):c.2202G>A(p.Trp734Ter)
NM_004006.2(DMD):c.2077C>T(p.Gln693Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1653G>A(p.Trp551Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1061G>A(p.Trp354Ter)
NM_004006.2(DMD):c.8914C>T(p.Gln2972Ter)
NM_004006.2(DMD):c.6118-1G>A
NM_004006.2(DMD):c.4729C>T(p.Arg1577Ter)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、DMD遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ベッカー型筋ジストロフィーに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともDMD遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_004006.2(DMD):c.3413G>A(p.Trp1138Ter)
NM_004006.2(DMD):c.358-1G>A
NM_004006.2(DMD):c.10108C>T(p.Arg3370Ter)
NM_004006.2(DMD):c.6373C>T(p.Gln2125Ter)
NM_004006.2(DMD):c.9568C>T(p.Arg3190Ter)
NM_004006.2(DMD):c.8713C>T(p.Arg2905Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1615C>T(p.Arg539Ter)
NM_004006.2(DMD):c.3151C>T(p.Arg1051Ter)
NM_004006.2(DMD):c.3432+1G>A
NM_004006.2(DMD):c.5287C>T(p.Arg1763Ter)
NM_004006.2(DMD):c.5530C>T(p.Arg1844Ter)
NM_004006.2(DMD):c.8608C>T(p.Arg2870Ter)
NM_004006.2(DMD):c.8656C>T(p.Gln2886Ter)
NM_004006.2(DMD):c.8944C>T(p.Arg2982Ter)
NM_004006.2(DMD):c.5899C>T(p.Arg1967Ter)
NM_004006.2(DMD):c.10033C>T(p.Arg3345Ter)
NM_004006.2(DMD):c.10086+1G>A
NM_004019.2(DMD):c.1020G>A(p.Thr340=)
NM_004006.2(DMD):c.1261C>T(p.Gln421Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1465C>T(p.Gln489Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1990C>T(p.Gln664Ter)
NM_004006.2(DMD):c.2032C>T(p.Gln678Ter)
NM_004006.2(DMD):c.2332C>T(p.Gln778Ter)
NM_004006.2(DMD):c.2419C>T(p.Gln807Ter)
NM_004006.2(DMD):c.2650C>T(p.Gln884Ter)
NM_004006.2(DMD):c.2804-1G>A
NM_004006.2(DMD):c.3276+1G>A
NM_004006.2(DMD):c.3295C>T(p.Gln1099Ter)
NM_004006.2(DMD):c.336G>A(p.Trp112Ter)
NM_004006.2(DMD):c.3580C>T(p.Gln1194Ter)
NM_004006.2(DMD):c.4117C>T(p.Gln1373Ter)
NM_004006.2(DMD):c.649+1G>A
NM_004006.2(DMD):c.6906G>A(p.Trp2302Ter)
NM_004006.2(DMD):c.7189C>T(p.Gln2397Ter)
NM_004006.2(DMD):c.7309+1G>A
NM_004006.2(DMD):c.7657C>T(p.Arg2553Ter)
NM_004006.2(DMD):c.7682G>A(p.Trp2561Ter)
NM_004006.2(DMD):c.7683G>A(p.Trp2561Ter)
NM_004006.2(DMD):c.7894C>T(p.Gln2632Ter)
NM_004006.2(DMD):c.9361+1G>A
NM_004006.2(DMD):c.9564-1G>A
NM_004006.2(DMD):c.2956C>T(p.Gln986Ter)
NM_004006.2(DMD):c.883C>T(p.Arg295Ter)
NM_004006.2(DMD):c.31+36947G>A
NM_004006.2(DMD):c.10279C>T(p.Gln3427Ter)
NM_004006.2(DMD):c.433C>T(p.Arg145Ter)
NM_004006.2(DMD):c.9G>A(p.Trp3Ter)
NM_004006.2(DMD):c.10171C>T(p.Arg3391Ter)
NM_004006.2(DMD):c.583C>T(p.Arg195Ter)
NM_004006.2(DMD):c.9337C>T(p.Arg3113Ter)
NM_004006.2(DMD):c.8038C>T(p.Arg2680Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1812+1G>A
NM_004006.2(DMD):c.1093C>T(p.Gln365Ter)
NM_004006.2(DMD):c.1704+1G>A
NM_004006.2(DMD):c.1912C>T(p.Gln638Ter)
NM_004006.2(DMD):c.133C>T(p.Gln45Ter)
NM_004006.2(DMD):c.5868G>A(p.Trp1956Ter)
NM_004006.2(DMD):c.565C>T(p.Gln189Ter)
NM_004006.2(DMD):c.5089C>T(p.Gln1697Ter)
NM_004006.2(DMD):c.2512C>T(p.Gln838Ter)
NM_004006.2(DMD):c.10477C>T(p.Gln3493Ter)
NM_004006.2(DMD):c.93+1G>A
NM_004006.2(DMD):c.4174C>T(p.Gln1392Ter)
NM_004006.2(DMD):c.3940C>T(p.Arg1314Ter)表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、DMD遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、ベッカー型筋ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、肢帯型筋ジストロフィーに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、SGCB、MYOT、LMNA、CAPN3、DYSF、SGCA、TTN、ANO5、TRAPPC11、LMNA、POMT1、及びFKRPから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000232.4(SGCB):c.31C>T(p.Gln11Ter)
NM_006790.2(MYOT):c.164C>T(p.Ser55Phe)
NM_006790.2(MYOT):c.170C>T(p.Thr57Ile)
NM_170707.3(LMNA):c.1488+1G>A
NM_170707.3(LMNA):c.1609-1G>A
NM_000070.2(CAPN3):c.1715G>A(p.Arg572Gln)
NM_000070.2(CAPN3):c.2243G>A(p.Arg748Gln)
NM_000070.2(CAPN3):c.145C>T(p.Arg49Cys)
NM_000070.2(CAPN3):c.1319G>A(p.Arg440Gln)
NM_000070.2(CAPN3):c.1343G>A(p.Arg448His)
NM_000070.2(CAPN3):c.1465C>T(p.Arg489Trp)
NM_000070.2(CAPN3):c.1714C>T(p.Arg572Trp)
NM_000070.2(CAPN3):c.2306G>A(p.Arg769Gln)
NM_000070.2(CAPN3):c.133G>A(p.Ala45Thr)
NM_000070.2(CAPN3):c.499-1G>A
NM_000070.2(CAPN3):c.439C>T(p.Arg147Ter)
NM_000070.2(CAPN3):c.1063C>T(p.Arg355Trp)
NM_000070.2(CAPN3):c.1250C>T(p.Thr417Met)
NM_000070.2(CAPN3):c.245C>T(p.Pro82Leu)
NM_000070.2(CAPN3):c.2242C>T(p.Arg748Ter)
NM_000070.2(CAPN3):c.1318C>T(p.Arg440Trp)
NM_000070.2(CAPN3):c.1333G>A(p.Gly445Arg)
NM_000070.2(CAPN3):c.1957C>T(p.Gln653Ter)
NM_000070.2(CAPN3):c.1801-1G>A
NM_000070.2(CAPN3):c.2263+1G>A
NM_000070.2(CAPN3):c.956C>T(p.Pro319Leu)
NM_000070.2(CAPN3):c.1468C>T(p.Arg490Trp)
NM_000070.2(CAPN3):c.802-9G>A
NM_000070.2(CAPN3):c.1342C>T(p.Arg448Cys)
NM_000070.2(CAPN3):c.1303G>A(p.Glu435Lys)
NM_000070.2(CAPN3):c.1993-1G>A
NM_003494.3(DYSF):c.3113G>A(p.Arg1038Gln)
NM_001130987.1(DYSF):c.5174+1G>A
NM_001130987.1(DYSF):c.159G>A(p.Trp53Ter)
NM_001130987.1(DYSF):c.2929C>T(p.Arg977Trp)
NM_001130987.1(DYSF):c.4282C>T(p.Gln1428Ter)
NM_001130987.1(DYSF):c.1577-1G>A
NM_003494.3(DYSF):c.5529G>A(p.Trp1843Ter)
NM_001130987.1(DYSF):c.1576+1G>A
NM_001130987.1(DYSF):c.4462C>T(p.Gln1488Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.5429G>A(p.Arg1810Lys)
NM_003494.3(DYSF):c.5077C>T(p.Arg1693Trp)
NM_001130978.1(DYSF):c.1813C>T(p.Gln605Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.3230G>A(p.Trp1077Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.265C>T(p.Arg89Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.4434G>A(p.Trp1478Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.3478C>T(p.Gln1160Ter)
NM_001130987.1(DYSF):c.1372G>A(p.Gly458Arg)
NM_003494.3(DYSF):c.4090C>T(p.Gln1364Ter)
NM_001130987.1(DYSF):c.2409+1G>A
NM_003494.3(DYSF):c.1708C>T(p.Gln570Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.1956G>A(p.Trp652Ter)
NM_001130987.1(DYSF):c.5004-1G>A
NM_003494.3(DYSF):c.331C>T(p.Gln111Ter)
NM_001130978.1(DYSF):c.5776C>T(p.Arg1926Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.6124C>T(p.Arg2042Cys)
NM_003494.3(DYSF):c.2643+1G>A
NM_003494.3(DYSF):c.4253G>A(p.Gly1418Asp)
NM_003494.3(DYSF):c.610C>T(p.Arg204Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.1834C>T(p.Gln612Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.5668-7G>A
NM_001130978.1(DYSF):c.3137G>A(p.Arg1046His)
NM_003494.3(DYSF):c.1053+1G>A
NM_003494.3(DYSF):c.1398-1G>A
NM_003494.3(DYSF):c.1481-1G>A
NM_003494.3(DYSF):c.2311C>T(p.Gln771Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.2869C>T(p.Gln957Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.4756C>T(p.Arg1586Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.5509G>A(p.Asp1837Asn)
NM_003494.3(DYSF):c.5644C>T(p.Gln1882Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.5946+1G>A
NM_003494.3(DYSF):c.937+1G>A
NM_003494.3(DYSF):c.5266C>T(p.Gln1756Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.3832C>T(p.Gln1278Ter)
NM_003494.3(DYSF):c.5525+1G>A
NM_003494.3(DYSF):c.3112C>T(p.Arg1038Ter)
NM_000023.3(SGCA):c.293G>A(p.Arg98His)
NM_000023.3(SGCA):c.850C>T(p.Arg284Cys)
NM_000023.3(SGCA):c.403C>T(p.Gln135Ter)
NM_000023.3(SGCA):c.409G>A(p.Glu137Lys)
NM_000023.3(SGCA):c.747+1G>A
NM_000023.3(SGCA):c.229C>T(p.Arg77Cys)
NM_000023.3(SGCA):c.101G>A(p.Arg34His)
NM_000023.3(SGCA):c.739G>A(p.Val247Met)
NM_001256850.1(TTN):c.87394C>T(p.Arg29132Ter)
NM_213599.2(ANO5):c.762+1G>A
NM_213599.2(ANO5):c.1213C>T(p.Gln405Ter)
NM_213599.2(ANO5):c.1639C>T(p.Arg547Ter)
NM_213599.2(ANO5):c.1406G>A(p.Trp469Ter)
NM_213599.2(ANO5):c.1210C>T(p.Arg404Ter)
NM_213599.2(ANO5):c.2272C>T(p.Arg758Cys)
NM_213599.2(ANO5):c.41-1G>A
NM_213599.2(ANO5):c.172C>T(p.Arg58Trp)
NM_213599.2(ANO5):c.1898+1G>A
NM_021942.5(TRAPPC11):c.1287+5G>A
NM_170707.3(LMNA):c.1608+1G>A
NM_007171.3(POMT1):c.1864C>T(p.Arg622Ter)
NM_024301.4(FKRP):c.313C>T(p.Gln105Ter)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、SGCB、MYOT、LMNA、CAPN3、DYSF、SGCA、TTN、ANO5、TRAPPC11、LMNA、POMT1、及びFKRPから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、肢帯型筋ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィーに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともEMDまたはSYNE1遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000117.2(EMD):c.3G>A(p.Met1Ile)
NM_033071.3(SYNE1):c.11908C>T(p.Arg3970Ter)
NM_033071.3(SYNE1):c.21721C>T(p.Gln7241Ter)
NM_000117.2(EMD):c.130C>T(p.Gln44Ter)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、EMDまたはSYNE1遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともSMCHD1遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_015295.2(SMCHD1):c.3801+1G>A
NM_015295.2(SMCHD1):c.1843-1G>A
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、SMCHD1遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療または予防するための方法に関する。
様々なIEM、例えば、限定するものではないが、原発性高シュウ酸尿症I型、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症、及びメープルシロップ尿症に関連する病原性G→AまたはC→T変異/SNPは、ClinVarデータベースに報告されており、表Aに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、原発性高シュウ酸尿症I型に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともAGXT遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000030.2(AGXT):c.245G>A(p.Gly82Glu)
NM_000030.2(AGXT):c.698G>A(p.Arg233His)
NM_000030.2(AGXT):c.466G>A(p.Gly156Arg)
NM_000030.2(AGXT):c.106C>T(p.Arg36Cys)
NM_000030.2(AGXT):c.346G>A(p.Gly116Arg)
NM_000030.2(AGXT):c.568G>A(p.Gly190Arg)
NM_000030.2(AGXT):c.653C>T(p.Ser218Leu)
NM_000030.2(AGXT):c.737G>A(p.Trp246Ter)
NM_000030.2(AGXT):c.1049G>A(p.Gly350Asp)
NM_000030.2(AGXT):c.473C>T(p.Ser158Leu)
NM_000030.2(AGXT):c.907C>T(p.Gln303Ter)
NM_000030.2(AGXT):c.996G>A(p.Trp332Ter)
NM_000030.2(AGXT):c.508G>A(p.Gly170Arg)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、AGXT遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、原発性高シュウ酸尿症I型を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともASL遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_001024943.1(ASL):c.1153C>T(p.Arg385Cys)
NM_000048.3(ASL):c.532G>A(p.Val178Met)
NM_000048.3(ASL):c.545G>A(p.Arg182Gln)
NM_000048.3(ASL):c.175G>A(p.Glu59Lys)
NM_000048.3(ASL):c.718+5G>A
NM_000048.3(ASL):c.889C>T(p.Arg297Trp)
NM_000048.3(ASL):c.1360C>T(p.Gln454Ter)
NM_000048.3(ASL):c.1060C>T(p.Gln354Ter)
NM_000048.3(ASL):c.35G>A(p.Arg12Gln)
NM_000048.3(ASL):c.446+1G>A
NM_000048.3(ASL):c.544C>T(p.Arg182Ter)
NM_000048.3(ASL):c.1135C>T(p.Arg379Cys)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、ASL遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともOTC遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000531.5(OTC):c.119G>A(p.Arg40His)
NM_000531.5(OTC):c.422G>A(p.Arg141Gln)
NM_000531.5(OTC):c.829C>T(p.Arg277Trp)
NM_000531.5(OTC):c.674C>T(p.Pro225Leu)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、OTC遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、メープルシロップ尿症に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、BCKDHA、BCKDHB、DBT、及びDLDから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000709.3(BCKDHA):c.476G>A(p.Arg159Gln)
NM_183050.3(BCKDHB):c.3G>A(p.Met1Ile)
NM_183050.3(BCKDHB):c.554C>T(p.Pro185Leu)
NM_001918.3(DBT):c.1033G>A(p.Gly345Arg)
NM_000709.3(BCKDHA):c.940C>T(p.Arg314Ter)
NM_000709.3(BCKDHA):c.793C>T(p.Arg265Trp)
NM_000709.3(BCKDHA):c.868G>A(p.Gly290Arg)
NM_000108.4(DLD):c.1123G>A(p.Glu375Lys)
NM_000709.3(BCKDHA):c.1234G>A(p.Val412Met)
NM_000709.3(BCKDHA):c.288+1G>A
NM_000709.3(BCKDHA):c.979G>A(p.Glu327Lys)
NM_001918.3(DBT):c.901C>T(p.Arg301Cys)
NM_183050.3(BCKDHB):c.509G>A(p.Arg170His)
NM_183050.3(BCKDHB):c.799C>T(p.Gln267Ter)
NM_183050.3(BCKDHB):c.853C>T(p.Arg285Ter)
NM_183050.3(BCKDHB):c.970C>T(p.Arg324Ter)
NM_183050.3(BCKDHB):c.832G>A(p.Gly278Ser)
NM_000709.3(BCKDHA):c.1036C>T(p.Arg346Cys)
NM_000709.3(BCKDHA):c.288+9C>T
NM_000709.3(BCKDHA):c.632C>T(p.Thr211Met)
NM_000709.3(BCKDHA):c.659C>T(p.Ala220Val)
NM_000709.3(BCKDHA):c.964C>T(p.Gln322Ter)
NM_001918.3(DBT):c.1291C>T(p.Arg431Ter)
NM_001918.3(DBT):c.251G>A(p.Trp84Ter)
NM_001918.3(DBT):c.871C>T(p.Arg291Ter)
NM_000056.4(BCKDHB):c.1016C>T(p.Ser339Leu)
NM_000056.4(BCKDHB):c.344-1G>A
NM_000056.4(BCKDHB):c.633+1G>A
NM_000056.4(BCKDHB):c.952-1G>A
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、BCKDHA、BCKDHB、DBT、及びDLDから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、メープルシロップ尿症を治療または予防するための方法に関する。
様々ながん及びがん関連疾患、例えば、限定するものではないが、乳癌卵巣癌及びリンチ症候群に関連する病原性G→AまたはC→T変異/SNPは、ClinVarデータベースに報告されており、表Aに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、乳癌卵巣癌に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともBRCA1またはBRCA2遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_007294.3(BRCA1):c.5095C>T(p.Arg1699Trp)
NM_000059.3(BRCA2):c.7558C>T(p.Arg2520Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.2572C>T(p.Gln858Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3607C>T(p.Arg1203Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5503C>T(p.Arg1835Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.2059C>T(p.Gln687Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4675+1G>A
NM_007294.3(BRCA1):c.5251C>T(p.Arg1751Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5444G>A(p.Trp1815Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9318G>A(p.Trp3106Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9382C>T(p.Arg3128Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.274C>T(p.Gln92Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.6952C>T(p.Arg2318Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1687C>T(p.Gln563Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.2599C>T(p.Gln867Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.784C>T(p.Gln262Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.280C>T(p.Gln94Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5542C>T(p.Gln1848Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5161C>T(p.Gln1721Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4573C>T(p.Gln1525Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4270C>T(p.Gln1424Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4225C>T(p.Gln1409Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4066C>T(p.Gln1356Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3679C>T(p.Gln1227Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1918C>T(p.Gln640Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.963G>A(p.Trp321Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.718C>T(p.Gln240Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9196C>T(p.Gln3066Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9154C>T(p.Arg3052Trp)
NM_007294.3(BRCA1):c.3991C>T(p.Gln1331Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4097-1G>A
NM_007294.3(BRCA1):c.1059G>A(p.Trp353Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1115G>A(p.Trp372Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1138C>T(p.Gln380Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1612C>T(p.Gln538Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1621C>T(p.Gln541Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1630C>T(p.Gln544Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.178C>T(p.Gln60Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1969C>T(p.Gln657Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.2275C>T(p.Gln759Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.2410C>T(p.Gln804Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.2869C>T(p.Gln957Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.2923C>T(p.Gln975Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3268C>T(p.Gln1090Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3430C>T(p.Gln1144Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3544C>T(p.Gln1182Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4075C>T(p.Gln1359Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4201C>T(p.Gln1401Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4399C>T(p.Gln1467Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4552C>T(p.Gln1518Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5054C>T(p.Thr1685Ile)
NM_007294.3(BRCA1):c.514C>T(p.Gln172Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5239C>T(p.Gln1747Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5266C>T(p.Gln1756Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5335C>T(p.Gln1779Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5345G>A(p.Trp1782Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5511G>A(p.Trp1837Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5536C>T(p.Gln1846Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.55C>T(p.Gln19Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.949C>T(p.Gln317Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.928C>T(p.Gln310Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5117G>A(p.Gly1706Glu)
NM_007294.3(BRCA1):c.5136G>A(p.Trp1712Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4327C>T(p.Arg1443Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1471C>T(p.Gln491Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1576C>T(p.Gln526Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.160C>T(p.Gln54Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.2683C>T(p.Gln895Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.2761C>T(p.Gln921Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3895C>T(p.Gln1299Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4339C>T(p.Gln1447Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4372C>T(p.Gln1458Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5153G>A(p.Trp1718Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5445G>A(p.Trp1815Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5510G>A(p.Trp1837Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5346G>A(p.Trp1782Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1116G>A(p.Trp372Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1999C>T(p.Gln667Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4183C>T(p.Gln1395Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4810C>T(p.Gln1604Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.850C>T(p.Gln284Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1058G>A(p.Trp353Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.131G>A(p.Cys44Tyr)
NM_007294.3(BRCA1):c.1600C>T(p.Gln534Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3286C>T(p.Gln1096Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3403C>T(p.Gln1135Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.34C>T(p.Gln12Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4258C>T(p.Gln1420Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4609C>T(p.Gln1537Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5154G>A(p.Trp1718Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5431C>T(p.Gln1811Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.241C>T(p.Gln81Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3331C>T(p.Gln1111Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3967C>T(p.Gln1323Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.415C>T(p.Gln139Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.505C>T(p.Gln169Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5194-12G>A
NM_007294.3(BRCA1):c.5212G>A(p.Gly1738Arg)
NM_007294.3(BRCA1):c.5332+1G>A
NM_007294.3(BRCA1):c.1480C>T(p.Gln494Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.2563C>T(p.Gln855Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1066C>T(p.Gln356Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3718C>T(p.Gln1240Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3817C>T(p.Gln1273Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3937C>T(p.Gln1313Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4357+1G>A
NM_007294.3(BRCA1):c.5074+1G>A
NM_007294.3(BRCA1):c.5277+1G>A
NM_007294.3(BRCA1):c.2338C>T(p.Gln780Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3598C>T(p.Gln1200Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3841C>T(p.Gln1281Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4222C>T(p.Gln1408Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4524G>A(p.Trp1508Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5353C>T(p.Gln1785Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.962G>A(p.Trp321Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.220C>T(p.Gln74Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.2713C>T(p.Gln905Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.2800C>T(p.Gln934Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4612C>T(p.Gln1538Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.3352C>T(p.Gln1118Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4834C>T(p.Gln1612Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4523G>A(p.Trp1508Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.5135G>A(p.Trp1712Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.1155G>A(p.Trp385Ter)
NM_007294.3(BRCA1):c.4987-1G>A
NM_000059.3(BRCA2):c.9573G>A(p.Trp3191Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.1945C>T(p.Gln649Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.217C>T(p.Gln73Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.523C>T(p.Gln175Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.2548C>T(p.Gln850Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.2905C>T(p.Gln969Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.4689G>A(p.Trp1563Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.4972C>T(p.Gln1658Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.1184G>A(p.Trp395Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.2137C>T(p.Gln713Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.3217C>T(p.Gln1073Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.3523C>T(p.Gln1175Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.4783C>T(p.Gln1595Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.5800C>T(p.Gln1934Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.6478C>T(p.Gln2160Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7033C>T(p.Gln2345Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7495C>T(p.Gln2499Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7501C>T(p.Gln2501Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7887G>A(p.Trp2629Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8910G>A(p.Trp2970Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9139C>T(p.Gln3047Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9739C>T(p.Gln3247Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.582G>A(p.Trp194Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7963C>T(p.Gln2655Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8695C>T(p.Gln2899Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8869C>T(p.Gln2957Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.1117C>T(p.Gln373Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.1825C>T(p.Gln609Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.2455C>T(p.Gln819Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.2881C>T(p.Gln961Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.3265C>T(p.Gln1089Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.3283C>T(p.Gln1095Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.3442C>T(p.Gln1148Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.3871C>T(p.Gln1291Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.439C>T(p.Gln147Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.4525C>T(p.Gln1509Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.475+1G>A
NM_000059.3(BRCA2):c.5344C>T(p.Gln1782Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.5404C>T(p.Gln1802Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.5773C>T(p.Gln1925Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.5992C>T(p.Gln1998Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.6469C>T(p.Gln2157Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7261C>T(p.Gln2421Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7303C>T(p.Gln2435Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7471C>T(p.Gln2491Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7681C>T(p.Gln2561Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7738C>T(p.Gln2580Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7886G>A(p.Trp2629Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8140C>T(p.Gln2714Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8363G>A(p.Trp2788Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8572C>T(p.Gln2858Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8773C>T(p.Gln2925Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8821C>T(p.Gln2941Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9109C>T(p.Gln3037Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9317G>A(p.Trp3106Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9466C>T(p.Gln3156Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9572G>A(p.Trp3191Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8490G>A(p.Trp2830Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.5980C>T(p.Gln1994Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7721G>A(p.Trp2574Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.196C>T(p.Gln66Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7618-1G>A
NM_000059.3(BRCA2):c.8489G>A(p.Trp2830Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7857G>A(p.Trp2619Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.1261C>T(p.Gln421Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.1456C>T(p.Gln486Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.3319C>T(p.Gln1107Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.5791C>T(p.Gln1931Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.6070C>T(p.Gln2024Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7024C>T(p.Gln2342Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.961C>T(p.Gln321Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9380G>A(p.Trp3127Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8364G>A(p.Trp2788Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7758G>A(p.Trp2586Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.2224C>T(p.Gln742Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.5101C>T(p.Gln1701Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.5959C>T(p.Gln1987Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7060C>T(p.Gln2354Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9100C>T(p.Gln3034Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9148C>T(p.Gln3050Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9883C>T(p.Gln3295Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.1414C>T(p.Gln472Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.1689G>A(p.Trp563Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.581G>A(p.Trp194Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.6490C>T(p.Gln2164Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7856G>A(p.Trp2619Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8970G>A(p.Trp2990Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.92G>A(p.Trp31Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9376C>T(p.Gln3126Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.93G>A(p.Trp31Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.1189C>T(p.Gln397Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.2818C>T(p.Gln940Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.2979G>A(p.Trp993Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.3166C>T(p.Gln1056Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.4285C>T(p.Gln1429Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.6025C>T(p.Gln2009Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.772C>T(p.Gln258Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7877G>A(p.Trp2626Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.3109C>T(p.Gln1037Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.4222C>T(p.Gln1408Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7480C>T(p.Arg2494Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7878G>A(p.Trp2626Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9076C>T(p.Gln3026Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.1855C>T(p.Gln619Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.4111C>T(p.Gln1371Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.5656C>T(p.Gln1886Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7757G>A(p.Trp2586Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8243G>A(p.Gly2748Asp)
NM_000059.3(BRCA2):c.8878C>T(p.Gln2960Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8487+1G>A
NM_000059.3(BRCA2):c.8677C>T(p.Gln2893Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.250C>T(p.Gln84Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.6124C>T(p.Gln2042Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7617+1G>A
NM_000059.3(BRCA2):c.8575C>T(p.Gln2859Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8174G>A(p.Trp2725Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.3187C>T(p.Gln1063Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9381G>A(p.Trp3127Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.2095C>T(p.Gln699Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.1642C>T(p.Gln548Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8608C>T(p.Gln2870Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.3412C>T(p.Gln1138Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.4246C>T(p.Gln1416Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.6475C>T(p.Gln2159Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7366C>T(p.Gln2456Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7516C>T(p.Gln2506Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.8969G>A(p.Trp2990Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.6487C>T(p.Gln2163Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.2978G>A(p.Trp993Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.7615C>T(p.Gln2539Ter)
NM_000059.3(BRCA2):c.9106C>T(p.Gln3036Ter)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、BRCA1またはBRCA2遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、乳癌卵巣癌を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、リンチ症候群に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、MSH6、MSH2、EPCAM、PMS2、及びMLH1から選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000179.2(MSH6):c.1045C>T(p.Gln349Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1384C>T(p.Gln462Ter)
NM_002354.2(EPCAM):c.133C>T(p.Gln45Ter)
NM_002354.2(EPCAM):c.429G>A(p.Trp143Ter)
NM_002354.2(EPCAM):c.523C>T(p.Gln175Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.2680C>T(p.Gln894Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.350G>A(p.Trp117Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.2735G>A(p.Trp912Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.3556+1G>A
NM_000251.2(MSH2):c.388C>T(p.Gln130Ter)
NM_000535.6(PMS2):c.1912C>T(p.Gln638Ter)
NM_000535.6(PMS2):c.1891C>T(p.Gln631Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.454-1G>A
NM_000251.2(MSH2):c.1030C>T(p.Gln344Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.2330G>A(p.Trp777Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.2191C>T(p.Gln731Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.2764C>T(p.Arg922Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.2815C>T(p.Gln939Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.3020G>A(p.Trp1007Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.3436C>T(p.Gln1146Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.3647-1G>A
NM_000179.2(MSH6):c.3772C>T(p.Gln1258Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.3838C>T(p.Gln1280Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.706C>T(p.Gln236Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.730C>T(p.Gln244Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1171C>T(p.Gln391Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1192C>T(p.Gln398Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1225C>T(p.Gln409Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1276C>T(p.Gln426Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1528C>T(p.Gln510Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1609C>T(p.Gln537Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1613G>A(p.Trp538Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1614G>A(p.Trp538Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1624C>T(p.Gln542Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1684C>T(p.Gln562Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1731+1G>A
NM_000249.3(MLH1):c.1731+5G>A
NM_000249.3(MLH1):c.1732-1G>A
NM_000249.3(MLH1):c.1896G>A(p.Glu632=)
NM_000249.3(MLH1):c.1989+1G>A
NM_000249.3(MLH1):c.1990-1G>A
NM_000249.3(MLH1):c.1998G>A(p.Trp666Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.208-1G>A
NM_000249.3(MLH1):c.2101C>T(p.Gln701Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.2136G>A(p.Trp712Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.2224C>T(p.Gln742Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.230G>A(p.Cys77Tyr)
NM_000249.3(MLH1):c.256C>T(p.Gln86Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.436C>T(p.Gln146Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.445C>T(p.Gln149Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.545G>A(p.Arg182Lys)
NM_000249.3(MLH1):c.731G>A(p.Gly244Asp)
NM_000249.3(MLH1):c.76C>T(p.Gln26Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.842C>T(p.Ala281Val)
NM_000249.3(MLH1):c.882C>T(p.Leu294=)
NM_000249.3(MLH1):c.901C>T(p.Gln301Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1013G>A(p.Gly338Glu)
NM_000251.2(MSH2):c.1034G>A(p.Trp345Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1129C>T(p.Gln377Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1183C>T(p.Gln395Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1189C>T(p.Gln397Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1204C>T(p.Gln402Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1276+1G>A
NM_000251.2(MSH2):c.1528C>T(p.Gln510Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1552C>T(p.Gln518Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1720C>T(p.Gln574Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1777C>T(p.Gln593Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1885C>T(p.Gln629Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.2087C>T(p.Pro696Leu)
NM_000251.2(MSH2):c.2251G>A(p.Gly751Arg)
NM_000251.2(MSH2):c.2291G>A(p.Trp764Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.2292G>A(p.Trp764Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.2446C>T(p.Gln816Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.2470C>T(p.Gln824Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.2536C>T(p.Gln846Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.2581C>T(p.Gln861Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.2634G>A(p.Glu878=)
NM_000251.2(MSH2):c.2635C>T(p.Gln879Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.28C>T(p.Gln10Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.472C>T(p.Gln158Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.478C>T(p.Gln160Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.484G>A(p.Gly162Arg)
NM_000251.2(MSH2):c.490G>A(p.Gly164Arg)
NM_000251.2(MSH2):c.547C>T(p.Gln183Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.577C>T(p.Gln193Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.643C>T(p.Gln215Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.645+1G>A
NM_000251.2(MSH2):c.652C>T(p.Gln218Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.754C>T(p.Gln252Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.792+1G>A
NM_000251.2(MSH2):c.942G>A(p.Gln314=)
NM_000535.6(PMS2):c.949C>T(p.Gln317Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.306+1G>A
NM_000249.3(MLH1):c.62C>T(p.Ala21Val)
NM_000251.2(MSH2):c.1865C>T(p.Pro622Leu)
NM_000179.2(MSH6):c.426G>A(p.Trp142Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.715C>T(p.Gln239Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.350C>T(p.Thr117Met)
NM_000251.2(MSH2):c.1915C>T(p.His639Tyr)
NM_000251.2(MSH2):c.289C>T(p.Gln97Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.2785C>T(p.Arg929Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.131C>T(p.Ser44Phe)
NM_000249.3(MLH1):c.1219C>T(p.Gln407Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.306+5G>A
NM_000251.2(MSH2):c.1801C>T(p.Gln601Ter)
NM_000535.6(PMS2):c.1144+1G>A
NM_000251.2(MSH2):c.1984C>T(p.Gln662Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.381-1G>A
NM_000535.6(PMS2):c.631C>T(p.Arg211Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.790C>T(p.Gln264Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.366+1G>A
NM_000249.3(MLH1):c.298C>T(p.Arg100Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.3013C>T(p.Arg1005Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.694C>T(p.Gln232Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.742C>T(p.Arg248Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1039-1G>A
NM_000249.3(MLH1):c.142C>T(p.Gln48Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1790G>A(p.Trp597Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1961C>T(p.Pro654Leu)
NM_000249.3(MLH1):c.2103+1G>A
NM_000249.3(MLH1):c.2135G>A(p.Trp712Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.588+5G>A
NM_000249.3(MLH1):c.790+1G>A
NM_000251.2(MSH2):c.1035G>A(p.Trp345Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1255C>T(p.Gln419Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1861C>T(p.Arg621Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.226C>T(p.Gln76Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.2653C>T(p.Gln885Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.508C>T(p.Gln170Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.862C>T(p.Gln288Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.892C>T(p.Gln298Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.970C>T(p.Gln324Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.4001G>A(p.Arg1334Gln)
NM_000251.2(MSH2):c.1662-1G>A
NM_000535.6(PMS2):c.1882C>T(p.Arg628Ter)
NM_000535.6(PMS2):c.2174+1G>A
NM_000535.6(PMS2):c.2404C>T(p.Arg802Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.3991C>T(p.Arg1331Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.2503C>T(p.Gln835Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.718C>T(p.Arg240Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1038G>A(p.Gln346=)
NM_000249.3(MLH1):c.245C>T(p.Thr82Ile)
NM_000249.3(MLH1):c.83C>T(p.Pro28Leu)
NM_000249.3(MLH1):c.884G>A(p.Ser295Asn)
NM_000249.3(MLH1):c.982C>T(p.Gln328Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1046C>T(p.Pro349Leu)
NM_000251.2(MSH2):c.1120C>T(p.Gln374Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1285C>T(p.Gln429Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1477C>T(p.Gln493Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.2152C>T(p.Gln718Ter)
NM_000535.6(PMS2):c.703C>T(p.Gln235Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.2141G>A(p.Trp714Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1009C>T(p.Gln337Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1216C>T(p.Arg406Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.3202C>T(p.Arg1068Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.1165C>T(p.Arg389Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1943C>T(p.Pro648Leu)
NM_000249.3(MLH1):c.200G>A(p.Gly67Glu)
NM_000249.3(MLH1):c.793C>T(p.Arg265Cys)
NM_000249.3(MLH1):c.2059C>T(p.Arg687Trp)
NM_000249.3(MLH1):c.677G>A(p.Arg226Gln)
NM_000249.3(MLH1):c.2041G>A(p.Ala681Thr)
NM_000249.3(MLH1):c.1942C>T(p.Pro648Ser)
NM_000249.3(MLH1):c.676C>T(p.Arg226Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.2038C>T(p.Arg680Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.1483C>T(p.Arg495Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.2194C>T(p.Arg732Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.3103C>T(p.Arg1035Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.892C>T(p.Arg298Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1459C>T(p.Arg487Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1731G>A(p.Ser577=)
NM_000249.3(MLH1):c.184C>T(p.Gln62Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.1975C>T(p.Arg659Ter)
NM_000249.3(MLH1):c.199G>A(p.Gly67Arg)
NM_000251.2(MSH2):c.1076+1G>A
NM_000251.2(MSH2):c.1147C>T(p.Arg383Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.181C>T(p.Gln61Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.212-1G>A
NM_000251.2(MSH2):c.2131C>T(p.Arg711Ter)
NM_000535.6(PMS2):c.697C>T(p.Gln233Ter)
NM_000535.6(PMS2):c.1261C>T(p.Arg421Ter)
NM_000251.2(MSH2):c.2047G>A(p.Gly683Arg)
NM_000535.6(PMS2):c.400C>T(p.Arg134Ter)
NM_000535.6(PMS2):c.1927C>T(p.Gln643Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.1444C>T(p.Arg482Ter)
NM_000179.2(MSH6):c.2731C>T(p.Arg911Ter)
NM_000535.6(PMS2):c.943C>T(p.Arg315Ter)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、BCKDHA、BCKDHB、DBT、及びDLDから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、リンチ症候群を治療または予防するための方法に関する。
様々な遺伝性疾患、例えば、限定するものではないが、マルファン症候群、ハーラー症候群、糖原病、及び嚢胞性線維症に関連する病原性G→AまたはC→T変異/SNPは、ClinVarデータベースに報告されており、表Aに開示される。したがって、本発明の一態様は、以下に考察されるように、これらの疾患のいずれかに関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、マルファン症候群に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともFBN1遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000138.4(FBN1):c.1879C>T(p.Arg627Cys)
NM_000138.4(FBN1):c.1051C>T(p.Gln351Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.184C>T(p.Arg62Cys)
NM_000138.4(FBN1):c.2855-1G>A
NM_000138.4(FBN1):c.3164G>A(p.Cys1055Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.368G>A(p.Cys123Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.4955G>A(p.Cys1652Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.7180C>T(p.Arg2394Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.8267G>A(p.Trp2756Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.1496G>A(p.Cys499Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.6886C>T(p.Gln2296Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.3373C>T(p.Arg1125Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.640G>A(p.Gly214Ser)
NM_000138.4(FBN1):c.5038C>T(p.Gln1680Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.434G>A(p.Cys145Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.2563C>T(p.Gln855Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.7466G>A(p.Cys2489Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.2089C>T(p.Gln697Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.592C>T(p.Gln198Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.6695G>A(p.Cys2232Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.6164-1G>A
NM_000138.4(FBN1):c.5627G>A(p.Cys1876Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.4061G>A(p.Trp1354Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.1982G>A(p.Cys661Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.6784C>T(p.Gln2262Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.409C>T(p.Gln137Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.364C>T(p.Arg122Cys)
NM_000138.4(FBN1):c.3217G>A(p.Glu1073Lys)
NM_000138.4(FBN1):c.4460-8G>A
NM_000138.4(FBN1):c.4786C>T(p.Arg1596Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.7806G>A(p.Trp2602Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.247+1G>A
NM_000138.4(FBN1):c.2495G>A(p.Cys832Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.493C>T(p.Arg165Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.5504G>A(p.Cys1835Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.5863C>T(p.Gln1955Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.6658C>T(p.Arg2220Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.7606G>A(p.Gly2536Arg)
NM_000138.4(FBN1):c.7955G>A(p.Cys2652Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.3037G>A(p.Gly1013Arg)
NM_000138.4(FBN1):c.8080C>T(p.Arg2694Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.1633C>T(p.Arg545Cys)
NM_000138.4(FBN1):c.7205-1G>A
NM_000138.4(FBN1):c.4621C>T(p.Arg1541Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.1090C>T(p.Arg364Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.1585C>T(p.Arg529Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.4781G>A(p.Gly1594Asp)
NM_000138.4(FBN1):c.643C>T(p.Arg215Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.3668G>A(p.Cys1223Tyr)
NM_000138.4(FBN1):c.8326C>T(p.Arg2776Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.6354C>T(p.Ile2118=)
NM_000138.4(FBN1):c.1468+5G>A
NM_000138.4(FBN1):c.1546C>T(p.Arg516Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.4615C>T(p.Arg1539Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.5368C>T(p.Arg1790Ter)
NM_000138.4(FBN1):c.1285C>T(p.Arg429Ter)
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、FBN1遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、マルファン症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、ハーラー症候群に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、少なくともIDUA遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000203.4(IDUA):c.972+1G>A
NM_000203.4(IDUA):c.1855C>T(p.Arg619Ter)
NM_000203.4(IDUA):c.152G>A(p.Gly51Asp)
NM_000203.4(IDUA):c.1205G>A(p.Trp402Ter)
NM_000203.4(IDUA):c.208C>T(p.Gln70Ter)
NM_000203.4(IDUA):c.1045G>A(p.Asp349Asn)
NM_000203.4(IDUA):c.1650+5G>A
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、IDUA遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、ハーラー症候群を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、糖原病に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、GAA、AGL、PHKB、PRKAG2、G6PC、PGAM2、GBE1、PYGM、及びPFKMから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000152.4(GAA):c.1927G>A(p.Gly643Arg)
NM_000152.4(GAA):c.2173C>T(p.Arg725Trp)
NM_000642.2(AGL):c.3980G>A(p.Trp1327Ter)
NM_000642.2(AGL):c.16C>T(p.Gln6Ter)
NM_000642.2(AGL):c.2039G>A(p.Trp680Ter)
NM_000293.2(PHKB):c.1546C>T(p.Gln516Ter)
NM_016203.3(PRKAG2):c.1592G>A(p.Arg531Gln)
NM_000151.3(G6PC):c.248G>A(p.Arg83His)
NM_000151.3(G6PC):c.724C>T(p.Gln242Ter)
NM_000151.3(G6PC):c.883C>T(p.Arg295Cys)
NM_000151.3(G6PC):c.247C>T(p.Arg83Cys)
NM_000151.3(G6PC):c.1039C>T(p.Gln347Ter)
NM_000152.4(GAA):c.1561G>A(p.Glu521Lys)
NM_000642.2(AGL):c.2590C>T(p.Arg864Ter)
NM_000642.2(AGL):c.3682C>T(p.Arg1228Ter)
NM_000642.2(AGL):c.118C>T(p.Gln40Ter)
NM_000642.2(AGL):c.256C>T(p.Gln86Ter)
NM_000642.2(AGL):c.2681+1G>A
NM_000642.2(AGL):c.2158-1G>A
NM_000290.3(PGAM2):c.233G>A(p.Trp78Ter)
NM_000152.4(GAA):c.1548G>A(p.Trp516Ter)
NM_000152.4(GAA):c.2014C>T(p.Arg672Trp)
NM_000152.4(GAA):c.546G>A(p.Thr182=)
NM_000152.4(GAA):c.1802C>T(p.Ser601Leu)
NM_000152.4(GAA):c.1754+1G>A
NM_000152.4(GAA):c.1082C>T(p.Pro361Leu)
NM_000152.4(GAA):c.2560C>T(p.Arg854Ter)
NM_000152.4(GAA):c.655G>A(p.Gly219Arg)
NM_000152.4(GAA):c.1933G>A(p.Asp645Asn)
NM_000152.4(GAA):c.1979G>A(p.Arg660His)
NM_000152.4(GAA):c.1465G>A(p.Asp489Asn)
NM_000152.4(GAA):c.2512C>T(p.Gln838Ter)
NM_000158.3(GBE1):c.1543C>T(p.Arg515Cys)
NM_005609.3(PYGM):c.1726C>T(p.Arg576Ter)
NM_005609.3(PYGM):c.1827G>A(p.Lys609=)
NM_005609.3(PYGM):c.148C>T(p.Arg50Ter)
NM_005609.3(PYGM):c.613G>A(p.Gly205Ser)
NM_005609.3(PYGM):c.1366G>A(p.Val456Met)
NM_005609.3(PYGM):c.1768+1G>A
NM_001166686.1(PFKM):c.450+1G>A
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、GAA、AGL、PHKB、PRKAG2、G6PC、PGAM2、GBE1、PYGM、及びPFKMから選択される少なくとも1つの遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、糖原病を治療または予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、系、及び組成物は、嚢胞性線維症に関連する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正するために使用される。いくつかの実施形態において、病原性変異/SNPは、CFTR遺伝子中に存在し、少なくとも以下を含む:
NM_000492.3(CFTR):c.3712C>T(p.Gln1238Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.3484C>T(p.Arg1162Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1766+1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.1477C>T(p.Gln493Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.2538G>A(p.Trp846Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.2551C>T(p.Arg851Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.3472C>T(p.Arg1158Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1475C>T(p.Ser492Phe)
NM_000492.3(CFTR):c.1679G>A(p.Arg560Lys)
NM_000492.3(CFTR):c.3197G>A(p.Arg1066His)
NM_000492.3(CFTR):c.3873+1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.3196C>T(p.Arg1066Cys)
NM_000492.3(CFTR):c.2490+1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.3718-1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.171G>A(p.Trp57Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.3937C>T(p.Gln1313Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.274G>A(p.Glu92Lys)
NM_000492.3(CFTR):c.1013C>T(p.Thr338Ile)
NM_000492.3(CFTR):c.3266G>A(p.Trp1089Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1055G>A(p.Arg352Gln)
NM_000492.3(CFTR):c.1654C>T(p.Gln552Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.2668C>T(p.Gln890Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.3611G>A(p.Trp1204Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1585-8G>A
NM_000492.3(CFTR):c.223C>T(p.Arg75Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1680-1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.349C>T(p.Arg117Cys)
NM_000492.3(CFTR):c.1203G>A(p.Trp401Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1240C>T(p.Gln414Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1202G>A(p.Trp401Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1209+1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.115C>T(p.Gln39Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1116+1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.1393-1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.1573C>T(p.Gln525Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.164+1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.166G>A(p.Glu56Lys)
NM_000492.3(CFTR):c.170G>A(p.Trp57Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.2053C>T(p.Gln685Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.2125C>T(p.Arg709Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.2290C>T(p.Arg764Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.2353C>T(p.Arg785Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.2374C>T(p.Arg792Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.2537G>A(p.Trp846Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.292C>T(p.Gln98Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.2989-1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.3293G>A(p.Trp1098Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.4144C>T(p.Gln1382Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.4231C>T(p.Gln1411Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.4234C>T(p.Gln1412Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.579+5G>A
NM_000492.3(CFTR):c.595C>T(p.His199Tyr)
NM_000492.3(CFTR):c.613C>T(p.Pro205Ser)
NM_000492.3(CFTR):c.658C>T(p.Gln220Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1117-1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.3294G>A(p.Trp1098Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1865G>A(p.Gly622Asp)
NM_000492.3(CFTR):c.743+1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.1679+1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.1657C>T(p.Arg553Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1675G>A(p.Ala559Thr)
NM_000492.3(CFTR):c.165-1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.200C>T(p.Pro67Leu)
NM_000492.3(CFTR):c.2834C>T(p.Ser945Leu)
NM_000492.3(CFTR):c.3846G>A(p.Trp1282Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1652G>A(p.Gly551Asp)
NM_000492.3(CFTR):c.4426C>T(p.Gln1476Ter)
NM_000492.3:c.3718-2477C>T
NM_000492.3(CFTR):c.2988+1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.2657+5G>A
NM_000492.3(CFTR):c.2988G>A(p.Gln996=)
NM_000492.3(CFTR):c.274-1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.3612G>A(p.Trp1204Ter)
NM_000492.3(CFTR):c.1646G>A(p.Ser549Asn)
NM_000492.3(CFTR):c.3752G>A(p.Ser1251Asn)
NM_000492.3(CFTR):c.4046G>A(p.Gly1349Asp)
NM_000492.3(CFTR):c.532G>A(p.Gly178Arg)
NM_000492.3(CFTR):c.3731G>A(p.Gly1244Glu)
NM_000492.3(CFTR):c.1651G>A(p.Gly551Ser)
NM_000492.3(CFTR):c.1585-1G>A
NM_000492.3(CFTR):c.1000C>T(p.Arg334Trp)
NM_000492.3(CFTR):c.254G>A(p.Gly85Glu)
NM_000492.3(CFTR):c.1040G>A(p.Arg347His)
NM_000492.3(CFTR):c.273+1G>A
表Aを参照されたい。したがって、本発明の一態様は、1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、具体的には、CFTR遺伝子中に存在する1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNP、より具体的には、上記の1つ以上の病原性G→AまたはC→T変異/SNPを修正することによって、嚢胞性線維症を治療または予防するための方法に関する。
本発明はまた、リン酸化部位及び他の翻訳後改変(PTM)を改変するための、本明細書に記載のAD機能化CRISPR系の使用を企図する。本明細書に記載のAD機能化CRISPR系は、翻訳後改変に関連する残基を編集し得る(図140A及び図140B)。タンパク質のリン酸化は、複数の細胞プロセスに関与しており、比較的簡単に標的にし得る(Humprey et al.Trends Endocrinol Metab 2015、26(12):676-687)。リン酸化部位または他のPTMを標的とする現在の技術としては、全タンパク質のノックダウンまたはノックアウト、塩基編集、及び低分子が挙げられる。ただし、これらの方法には全て欠点がある。タンパク質標的のノックダウンまたはノックアウトは、PTMだけでなくタンパク質全体を除去し、塩基編集は永続的であるが、低分子も開発が難しく、未知の標的を有する可能性がある。本明細書に記載のAD機能化CRISPR系を使用してリン酸化部位を除去すると、リン酸化の機能の研究が可能になる場合があり、例えば、キナーゼ標的をスクリーニングして表現型への相対的な寄与を決定するか、または潜在的な小分子をトランスクリプトームワイドでスクリーニングするのに使用され得る。AD機能化CRISPR系を使用したPTMの標的化はまた、癌、炎症、代謝、及び分化において治療の可能性も有する場合がある。
特定の実施形態では、本明細書に記載のAD機能化CRISPR系を使用して、低形質変異を作成し得る。低形質変異を操作することは、致死性を伴わずに必須遺伝子の有意な下方制御につながる可能性があり、これにより、低形質変異を含む疾患のモデルを簡単に作成すること、及び治療用途に合わせて特定のタンパク質のレベルを微調整する方式で低下することが可能になる。ポリAトラック挿入は、低形質変異体を作成する既存の技術である。低次変異を導入するためにAD機能化CRISPR系を使用することで、混乱を最小限に抑え、正確であり、微調整し得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載のAD機能化CRISPR系を使用して、タンパク質安定性を調節し得る。特定の実施形態では、AD機能化CRISPR系は、一般的なデグロン(degron)標的化に使用され得る。デグロンは、タンパク質の分解速度の調節に重要なタンパク質の一部である。既知のデグロンには、タンパク質のどこにでもある短いアミノ酸配列、構造モチーフ、及び露出したアミノ酸(多くの場合、リジンまたはアルギニン)が含まれる。一部のタンパク質には、複数のデグロンが含まれる場合がある。多くのタイプの異なるデグロンがあり、これらのグループ内でも高度なばらつきがあるが、デグロンはタンパク質分解速度の調節への関与が全て類似しており、「ユビキチン依存性」または「ユビキチン非依存性」に分類され得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載のAD機能化CRISPR系を使用して、イオンチャネルを標的化し得る。イオンは、心臓の収縮性、神経系の信号伝達、及び肺血管圧の制御など、多くの生理学的プロセスを調節する。ジゴキシン及びリドカインなどのイオンチャネルに影響を与える小分子は、臨床医学で広く使用されている。しかし、これらの小分子には毒性の問題があり、より短時間のスケールでのみ作用するが、心不全または不整脈などの治療対象の疾患はしばしば慢性的である。ノックダウンアプローチも、イオンチャネルが果たす他の生物学的役割に影響を与える可能性があるため、望ましくない。
特定の実施形態では、AD機能化CRISPR系を使用して、TGFベータシグナル伝達を調節し、心臓リモデリングを防止し得る。心筋梗塞後、TGFβシグナル伝達は、心臓の線維化及び心筋細胞のアポトーシスを促進し、心臓組織を治癒し得る炎症反応をブロックする。したがって、TGFベータシグナル伝達をブロックすることにより、負の心臓リモデリングが防がれ得る。タイプII TGFベータ受容体は、Ser213及びSer409での自己リン酸化、ならびに活性のためのThr259、336、及び424を必要とする。AD機能化CRISPR系を使用して、セリンをLeuまたはPheに、またはチロシンをCysに変異し得、これにより、線維芽細胞及び心筋細胞における自己リン酸化及びTGFβ活性化を防げ得る。
特定の実施形態では、AD機能化CRISPR系は、系統追跡において使用され得る。特定の実施形態では、AD機能化CRISPR系は、REPAIR系による検知に使用してもよい。種々のオルソログを誘導し、編集を合成転写物に集中させ得る。特定の実施形態では、AD機能化CRISPR系を、特定のタンパク質の飽和突然変異誘発に使用して、機能的ドメインを特定し得る。特定の実施形態では、AD機能化CRISPR系を使用して、RNA結合タンパク質相互作用を特定し得る。AD機能化CRISPR系を使用して、タンパク質間結合インターフェースをマッピングし得る。飽和変異誘発を、1つのタンパク質に対して実行し、その後、どのガイドRNAがタンパク質間相互作用を破壊するかを決定するために、FRET及びセルソーティングを行う。
アデニンデアミナーゼ(AD)は、二本鎖RNAの特定部位で、アデニンを脱アミン化し得る。
1.NLSタグ付き不活性Cas13を、ADのN末端またはC末端のいずれかに融合する。GSG5などの可塑性リンカーまたはLEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTR(配列番号11)などの低可塑性リンカーを含む、様々なリンカーが使用される。
1.Cas13タンパク質の天然のガイド配列の長さに相当する長さのガイド配列を、目的のRNAを標的とするように設計する。
多数のADを使用すると、そのそれぞれは、様々なレベルの活性を有する。これらのADは、以下である
Cas13a/Cas13b干渉に関するCluc/Glucタイリング
Cas13aとCas13bとの間のノックダウン効率を比較するために、ウミホタルルシフェラーゼ及びガウシアルシフェラーゼ遺伝子を、それぞれ24または96のガイドでタイリングした(図10)。ガイドは、Cas13aとCas13bに関して一致しており、Cas13bのノックダウン効率の増大を示し、各遺伝子のガイド1つを除く全てが高い効率のCas13bを示した。
Cas13b-ADAR2 RNA編集効率は、ルシフェラーゼの発現を妨げる未成熟停止コドンUAGを有するルシフェラーゼレポーターを設計することにより試験した(図11A)。さまざまな長さの7つのガイドを設計し、UAGのAとのCミスマッチを全て含むUAG停止コドンに対して配置した。Cのミスマッチは、ADAR触媒ドメインが好む編集部位にバブルを作成することが知られている。Cas13b-ADAR2によるRNA編集は、UAGをUIG(UGG)に変換し、停止コドンの代わりにトリプトファンを導入し、翻訳を進めることを可能にする。HEK293FT細胞におけるガイド及びCas13b12-ADAR2融合の発現は、ルシフェラーゼ発現をさまざまなレベルに回復させ、ガイド5で最大の回復が生じた(図11B)。一般に、ダイレクトリピートがあり、したがってタンパク質が結合するcrRNAの3’末端から編集部位がさらに移動すると、ガイド1~5からの編集レベルが増大する。これはおそらく、タンパク質によって結合されているcrRNA:標的二重鎖の部分がADAR触媒ドメインにアクセスできないことを示している。ガイド5、6、及び7は、編集部位がDR/タンパク質結合領域から離れたガイドの遠端にあるので、それらのガイドがはるかに長く、ADARに好ましい、より長いRNA二重鎖を生成するので、最大量の活性を示す。編集部位がRNA二重鎖の中央にある場合、ADAR活性は最適である。ルシフェラーゼ活性の相対発現は、非標的ガイド条件に正規化される。
Cas13b12ノックダウンの特異性を決定するために、トランスクリプトームにまたがる全てのmRNAに対して、RNA配列決定を実施した(図13A)。Gluc及びKRASを標的とするガイドのノックダウンを、非標的化ガイドと比較し、Cas13a2及びCas13b12が標的転写物(図13Aの赤い点)の特異的なノックダウンを有し、一方で、shRNAは、分布におけるより大きい分散によって証明されるとおり、多くのオフ標的を有することを見出した。これらの各条件の重要なオフ標的の数を図13Bに示す。重要なオフ標的は、2倍以上または0.8倍未満変化した任意のオフ標的転写物について、FDR補正(p<0.01)を使用したt検定で測定される。Cas13a及びCas13b条件では、shRNA条件で検出された数百のオフ標的と比較して、オフ標的がほとんどなかった。各条件のノックダウン効率を図13Cに示す。
標的アデノシン編集部位の近くのアデノシンにおける標的を減らすために、可能性のあるオフ標的アデノシンに対するGまたはAのミスマッチを有するガイドを設計した(図14及び以下の表)。GまたはAとのミスマッチは、ADAR触媒ドメインによる活性には好ましくない。
ADAR2の触媒ドメインに関する先行研究は、標的Aの反対側の異なる塩基がイノシン編集の量に影響を及ぼし得ることを実証した(Zheng et al.(2017),Nucleic Acid Research,45(6):3369-3377)。具体的には、U及びCは、自然のADAR編集Aの反対側にあるが、G及びAはそうではないことが見出された。編集したAとのA及びGのミスマッチを使用してADAR活性を抑制し得るか否かを試験するために、Cミスマッチで活性であることが既知のガイドを、ルシフェラーゼレポーターアッセイの他の3つの可能な全ての塩基で試験する(図16)。相対活性は、ルシフェラーゼ活性を評価することにより定量化される。以下の表にガイド配列を示す。
Vogel et al.(2014),Angew Chem Int Ed,53:6267-6271,doi:10.1002/anie.201402634)に例示されているように、gRNAを、化学的に改変して、オフ標的活性を減らし、オン標的効率を改善する。2’-O-メチル及びホスホチオエート改変ガイドRNAは一般に、細胞での編集効率を改善する。
ADARは、編集されたAのいずれかの側の隣接ヌクレオチドに対する優先性を示すことが知られている(www.nature.com/nsmb/journal/v23/n5/full/nsmb.3203.html,Matthews et al.(2017),Nature Structural Mol Biol,23(5):426-433)。優先性は、ウミホタル(Cypridina)ルシフェラーゼ転写物を、標的Aを囲む可変塩基で標的化することにより体系的に試験される。(図17)。
好ましくない5’または3’隣接塩基でのRNA編集効率を高めるために、隣接塩基における意図的なミスマッチを導入し、これはインビトロで好ましくないモチーフの編集を可能にすることが実証されている(https://academic.oup.com/nar/article-lookup/doi/10.1093/nar/gku272;Schneider et al(2014),Nucleic Acid Res,42(10):e87);Fukuda et al.(2017),Scienticic Reports,7,doi:10.1038/srep41478)。グアノシン置換などの追加のミスマッチを試験して、それらが自然な優先性を減らすか否かを確認する(図18)。
結果によって、ADARデアミナーゼドメインの標的化ウィンドウ内のAの反対のCが他の塩基よりも優先的に編集されることが示唆される。さらに、標的塩基のいくつかの塩基内でAがUと塩基対を形成すると、Cas13b-ADAR融合による低レベルの編集が示され、酵素が複数のAを編集する可塑性があることが示唆される(図19)。これらの2つの観察結果によって、Cas13b-ADAR融合の活性ウィンドウ内の複数のAを、Cで編集する全てのAをミスマッチにすることで編集用に指定し得ることが示唆されている。これを試験するために、最適化実験から最も有望なガイドを採用し、活性ウィンドウでの複数のA:Cミスマッチが、複数のA:I編集を作成する可能性を試験するように設計されている。この実験の編集率は、NGSを使用して定量化される。活性ウィンドウでのオフ標的編集の可能性を抑制するために、非標的AはAまたはGと対になる(塩基優先性実験の結果に応じて)。
ADARは、長さが>20bpの分子間または分子内RNA二重鎖で自然に機能する(Nishikura et al.(2010),Annu Rev Biochem,79:321-349も参照)。この結果、より長い二重鎖をもたらす、より長いcrRNAが、より高いレベルの活性を有することが示された。RNA編集活性の長さの異なるガイドの活性を体系的に比較するために、ルシフェラーゼレポーターアッセイで停止コドンを補正するように、30、50、70、84塩基のガイドを設計した(図20及び下の表)。本発明者らは、これらのガイドを、編集されたAの位置が、crRNAの特異性決定領域の3’末端に関してmRNA:crRNA二重鎖内で可能な限り全ての距離に存在するように設計した(すなわち、+2、+4など)。
以下の表中の3つの遺伝子は、遺伝子にプレ終結停止部位を導入し、それらを非ヒト細胞株に組み込む病原性G>A突然変異を用いて合成される。Cas13b12-ADAR2が停止コドンUAGをUIG(UGG)に変更することによって転写物を修正し、これによってタンパク質の翻訳を復元する能力を試験する。
効率的かつ正確な核酸編集は、特にRNAのレベルで、疾患に関連する転写物をレスキューして機能性タンパク質産物を得られ得る遺伝子疾患の治療に大きな展望が抱かれる。VI型CRISPR-Cas系には、プログラム可能なシングルエフェクターRNAガイド付きRNase Cas13が含まれている。ここでは、堅牢なノックダウンが可能なCas13オルソログを設計し、触媒的に不活性なCas13(dCas13)を使用してアデノシンデアミナーゼ活性を哺乳動物細胞の転写物に差し向けることによりRNA編集を実証するために、VI型系の多様性をプロファイリングする。ADAR2デアミナーゼドメインをdCas13に融合すること、及びガイドRNAを操作して最適なRNA二重基質を作成することにより、特定の単一アデノシンからイノシン(翻訳中にグアノシンとして読み取られる)を20-40%及び最大89%まで慣用的な範囲の効率で標的編集を達成する。この系は、プログラム可能なA→I置換のRNA編集(RNA Editing for Programmable A to I Replacement)(REPAIR)と呼ばれ、高い特異性を達成するためにさらに設計してもよい。設計されたバリアントREPAIRv2は、堅牢なオン標的A→I編集を維持し、系を最小化してウイルスの送達を容易にしながら、170倍を超える特異性の向上を示す。REPAIRv2を使用して、公知の病原性変異を含む全長転写物を編集し、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターでのパッケージングに適した機能的な切断バージョンを作成する。REPAIRは、研究、治療、バイオテクノロジーに幅広く適用し得る有望なRNA編集プラットフォームである。正確な核酸編集技術は、細胞機能の研究及び新しい治療法として価値がある。Cas9ヌクレアーゼなどの現在の編集ツールは、ゲノム遺伝子座のプログラム可能な変更を実現し得るが、編集は、挿入もしくは欠失に起因して不均一であるか、または正確な編集のためにドナーテンプレートが必要である場合が多い。dCas9-APOBEC融合などの塩基エディターは、二本鎖切断を生成せずに編集することを可能にするが、標的ウィンドウ内のシチジンを編集するシチジンデアミナーゼ活性の性質に起因して、精度が不足する場合がある。さらに、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の要件により、編集可能な部位の数が制限される。ここでは、VI型原核生物クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)(CRISPR)適応免疫系からCas13酵素を標的とするRNAガイド付きRNAを使用した、正確でかつ柔軟なRNA塩基編集ツールの開発について説明する。
細菌構築物の設計及びクローニング
哺乳類のコドンに最適化されたCas13b構築物を、Lacプロモーターの制御下でクロラムフェニコール耐性pACYC184ベクターにクローニングした。次に、BsaI制限部位によって隔てられた2つの対応するダイレクトリピート(DR)配列を、pJ23119プロモーターの制御下でCas13bの下流に挿入した。最後に、T4 PNK(New England Biolabs)を使用して標的スペーサーのオリゴをリン酸化し、T7リガーゼ(Enzymatics)を使用してBsaI消化ベクターにアニーリング及びライゲーションして、標的Cas13bベクターを生成した。使用したガイド配列を表11に示す。
NEB Gibson Assembly(New England Biolabs)を使用してアンピシリン耐性遺伝子blaの開始コドンのすぐ下流の標的部位により隔てられた2つの5’ランダム化ヌクレオチド及び4つの3’ランダム化ヌクレオチドを有するCas13b標的を含むPCR産物を挿入することにより、PFSスクリーニング用のアンピシリン耐性プラスミドをクローニングした。次に、100ngのアンピシリン耐性標的プラスミドを、65~100ngのクロラムフェニコール耐性Cas13bバクテリア標的化プラスミドを用いて、Endura Electrocompetent Cellsにエレクトロポレーションした。プラスミドを細胞に加え、氷上で15分間インキュベートし、製造業者のプロトコルを使用してエレクトロポレーションし、その後、37℃で1時間の増殖の前に、950uLの回収培地を細胞に加えた。成長物をクロラムフェニコール及びアンピシリンの二重選択プレートにプレートした。cfu/ng DNAを推定するために、増殖物の段階希釈を使用した。プレートした16時間後、細胞をプレートから掻き取り、Qiagen Plasmid Plus Maxi Kit(Qiagen)を使用して回収したプラスミドDNAを生存させた。生存しているCas13b標的配列及びその隣接領域をPCRで増幅し、Illumina NextSeqを使用して配列決定した。PFSの優先性を評価するために、元のライブラリーのランダム化されたヌクレオチドを含む位置を抽出し、両方のバイオレプリケートに存在するベクターのみの条件に比べて欠失した配列を、カスタムパイソン(python)スクリプトを使用して抽出した。次に、ベクターのみの対照と比較したCas13b条件でのPFS存在量の比率の-log2を使用して、好ましいモチーフを計算した。具体的には、特定の閾値を超える-log2(資料/ベクター)欠失比を有する全ての配列を使用して、配列モチーフのウェブログ(weblogo.berkeley.edu)を生成した。各Cas13bオルソログのウェブログを生成するために使用される特定の欠失率の値を表9に列挙する。
哺乳動物細胞におけるCas13オルソログを試験するためのベクターを生成するために、哺乳動物コドン最適化Cas13a、Cas13b、及びCas13c遺伝子を、PCR増幅し、EF1アルファプロモーターの制御下で二重のNLS配列及びC末端msfGFPを含む哺乳動物発現ベクターにゴールデンゲートクローニングした。さらに最適化するために、Cas13オルソログは、EF1アルファプロモーターの制御下で異なるC末端局在タグを含む宛先ベクターにゴールデンゲートクローニングした。
デュアルNLS Cas13-msfGFP構築物を、標的化及び非標的化ガイドとともにHEK293FT細胞にトランスフェクトした。GFP蛍光は、プレートリーダーを使用して、非標的ガイド条件でトランスフェクションの48時間後に測定した。
プールされたミスマッチライブラリー標的部位を、PCRにより作成した。標的内の各位置に94%の正しい塩基と2%の各々の間違った塩基の混合物を含むG-ルシフェラーゼの半縮重標的配列を含むオリゴを、1つのプライマーとして使用し、G-ルシフェラーゼの非標的領域に対応するオリゴをPCR反応の第2のプライマーとして使用した。次に、NEB Gibsonアセンブリ(New England Biolabs)を使用して、野生型G-ルシフェラーゼの代わりに、ミスマッチライブラリー標的をデュアルルシフェラーゼレポーターにクローニングした。
HPNNドメインの触媒部位での2つのヒスチジンからアラニンへの変異(H133A/H1058A)を介して、PspCas13bを触媒的に不活性化した(dPspCas13b)。ヒトADAR1及びADAR2のデアミナーゼドメインを合成し、pcDNA-CMVベクター骨格へのギブソンクローニングのためにPCR増幅し、GSまたはGSGGGGS(配列番号296)リンカーを介してC末端でdPspCas13bに融合した。本発明者らが異なるリンカーを試験した実験では、dPspCas13bとADAR2ddの間に以下の追加のリンカーをクローニングした:GGGGSGGGGSGGGGS、EAAAK(配列番号297)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(配列番号298)、及びSGSETPGTSESATPES(配列番号299)(XTEN)。特異性変異体を、dPspCas13b-GSGGGGS骨格に適切な変異をギブソンクローニングすることによって、生成した。
哺乳動物細胞培養実験は、高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、及びGlutaMAX(Thermo Fisher Scientific)を含み、1×ペニシリン-ストレプトマイシン(Thermo Fisher Scientific)及び10%ウシ胎児血清(VWR Seradigm)をさらに補充したダルベッコ変法イーグル培地で増殖させた、HEK293FT系統(American Type Culture Collection(ATCC))で行った。細胞は80%未満のコンフルエンシーで維持された。
レポーター構築物を用いた哺乳動物細胞におけるRNA標的化を評価するために、150ngのCas13構築物を、300ngのガイド発現プラスミド及び12.5ngのノックダウンレポーター構築物で同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、分泌されたルシフェラーゼを含む培地を細胞から除去し、PBSで1:5に希釈し、注入プロトコルを用いて、プレートリーダー(Biotek Synergy Neo2)で、BioLux Cypridinia及びBiolux Gaussiaルシフェラーゼアッセイキット(New England Biolabs)で活性を測定した。実行される全ての複製は生物学的複製である。
6ウェルプレートに播種されたHEK293FT細胞を使用して、ミスマッチ標的ライブラリーを妨害するCas13の能力を試験した。2400ngのCas13ベクター、4800ngのガイド、及び240ngのミスマッチ標的ライブラリーを使用して、約70%コンフルエントな細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、QIAshredder(Qiagen)及びQiagen RNeasy Mini Kitを使用して細胞を回収し、RNAを抽出した。1ugの抽出RNAを、製造業者の遺伝子特異的プライミングプロトコル及びGluc特異的RTプライマーに従って、qScript Flex cDNA合成キット(Quantabio)を使用して逆転写した。次にcDNAを増幅し、Illumina NextSeqで配列決定した。
トランスクリプトームワイドの特異性の測定のために、150ngのCas13構築物、300ngのガイド発現プラスミド及び15ngのノックダウンレポーター構築物を、同時トランスフェクトした;shRNA条件については、300ngのshRNA標的化プラスミド、15ngのノックダウンレポーター構築物、及び150ngのEF1-アルファ駆動mCherry(レポーター負荷のバランスを取るため)を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、RNeasy Plus Miniキット(Qiagen)でRNAを精製し、NEBNext Poly(A)mRNA磁気分離モジュール(New England Biolabs)を使用するためにmRNAを選択し、NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit forイルミナ(New England Biolabs)による配列決定のために調製した。次に、RNA配列決定ライブラリーをNextSeq(Illumina)で配列決定した。
哺乳動物細胞におけるREPAIR活性を評価するために、REPAIRベクター150ng、ガイド発現プラスミド300ng、及びRNA編集レポーター40ngを、トランスフェクトした。48時間後、細胞からRNAを採取し、遺伝子特異的逆転写プライマーを用いて以前に記載された方法(33)を使用して逆転写した。次に、抽出したcDNAを、2回のPCRにかけ、NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix(New England Biolabs)を使用してイルミナアダプター及びサンプルバーコードを追加した。次いで、ライブラリーを、Illumina NextSeqまたはMiSeqで次世代シーケンシングにかけた。次に、配列ウィンドウ内の全てのアデノシンでRNA編集率を評価した。
編集効率に対するPFSの寄与を決定するために、225cm2のフラスコにプレートされたHEK293FT細胞に、625ngのPFS標的ライブラリー、4.7ugのガイド、及び2.35ugのREPAIRを同時トランスフェクトした。プラスミドを、33ulのPLUS試薬(Thermo Fisher Scientific)と混合し、Opti-MEMで533ulにし、5分間インキュベートし、30ulのLipofectamine 2000及び500ulのOpti-MEMと組み合わせ、さらに5分間インキュベートし、次いで細胞にピペッティングした。トランスフェクションの48時間後、RNeasy Plus Miniキット(Qiagen)でRNAを回収し、遺伝子特異的プライマーを使用してqScript Flex(Quantabio)で逆転写し、NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix(New England Biolabs)を使用して2回のPCRで増幅して、Illuminaアダプター及びサンプルバーコードを追加する。ライブラリーは、Illumina NextSeqで配列決定し、標的アデノシンでのRNA編集率を、PFS同一性にマッピングした。カバレッジを増やすために、PFSは計算により4ヌクレオチドに細かくさせた。REPAIRの編集率は、各PFSについて計算し、生物学的複製の平均値から、対応するPFSの非標的化率を差し引く。
トランスクリプトームにまたがるオフ標的RNA編集部位を分析するために、RNeasy Plus Miniprepキット(Qiagen)を使用して、トランスフェクションの48時間後に細胞から全RNAを回収した。次に、NEBNext Poly(A)mRNA Magnetic Isolation Module(NEB)を使用してmRNA画分を濃縮し、次いで、NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina(NEB)を使用してこのRNAを配列決定用に調製する。次いで、このライブラリーを、Illumina NextSeqで配列決定し、サンプルごとに少なくとも500万の読み取りがあるようにロードした。
トランスクリプトームワイドの編集RNA配列決定データの分析は、本発明者らが開発したカスタムワークフロー:https://portal.firecloud.org/#methods/m/rna_editing_final_workflow/rna_editing_final_workflow/1を使用して、FireCloud計算フレームワーク(https://software.broadinstitute.org/firecloud/)で実行した。分析のために、特に明記しない限り、配列ファイルは、ランダムに500万回の読み取りにダウンサンプリングした。Gluc及びCluc配列を追加したRefSeq GRCh38アセンブリを使用してインデックスを生成し、Bowtie/RSEMバージョン1.3.0を使用して読み取りをアライメント及び定量化した。次に、アライメントBAMをソートし、REDitools(35,36)と次のパラメーターを使用してRNA編集部位を分析した:-t 8-e-d-l-U[AGまたはTC]-p-u-m20-T6-0-W-v 1-n 0.0。トランスフェクトされていない条件またはEGFPでトランスフェクトされた条件で見い出された重要な編集は、トランスフェクションのSNPまたはアーティファクトと見なし、オフ標的の分析から除外した。フィッシャーの正確検定でBenjamini Hochberg補正による複数の仮説補正後に0.05未満のp値が得られ、3つの生物学的複製のうち少なくとも2つが編集部位を特定した場合、オフ標的は重要とみなされた。サンプル間の編集の重複は、2つのサンプル間の編集の数が少ないことに相当する、可能な最大の重複に対して計算した。重複する編集部位の割合は、共有編集部位の数を2つのサンプルの最小編集数で割った値に100を掛けて計算した。高カバレッジ配列決定分析では、既知のSNP位置のフィルタリングの追加レイヤーを、SNPを識別するためのKaviar(37)法を使用して実行した。
哺乳類細胞におけるCas13ファミリーメンバーの包括的な特徴付け
哺乳動物ノックダウン用途のために以前にLwaCas13aを開発したが、効率的なノックダウンのためにmsfGFP安定化ドメインが必要であり、特異性は高かったが、ノックダウン効率は一貫して50%未満ではなかった(15)。哺乳類細胞におけるRNAノックダウン活性を評価するために、Cas13ファミリーメンバーの遺伝的に多様なセットを特徴付けることにより、本発明者らは、より堅牢なRNA標的化CRISPR系を特定しようとした(図49A)。本発明者らは、21個のCas13a、15個のCas13b、及び7個のCas13c哺乳類コドン最適化オルソログ(表6)を、N及びC末端核輸出シグナル(NES)配列、ならびにC末端msfGFPを含む発現ベクターにクローニングして、タンパク質の安定性を高めた。哺乳動物細胞の干渉をアッセイするために、直交Gaussiaルシフェラーゼ(Gluc)及びCypridinia(Cluc)ルシフェラーゼを、別々のプロモーター下で発現するデュアルレポーター構築物を設計し、これにより、1つのルシフェラーゼがCas13干渉活性の尺度として機能し、もう1つが内部制御として作用することが可能になる。各オルソログについて、アンピシリン干渉アッセイ(図55;表7)から派生したCas13b PFSモチーフ、及びCas13a活性の以前の報告からの3’H PFS(Gではない)を使用して、PFS互換ガイドRNAを設計した。
PspCas13b及びLwaCas13aの干渉特異性を特徴づけるために、本発明者らは、標的配列及び3つの隣接5’及び3’塩基対全体にわたり単一ミスマッチ及び二重ミスマッチを含むルシフェラーゼ標的のプラスミドライブラリーを設計した(図56C)。本発明者らは、HEK293FT細胞に、LwaCas13aまたはPspCas13bのいずれか、非改変標的配列を標的とする固定ガイドRNA、及び適切な系に対応するミスマッチ標的ライブラリーを、トランスフェクトした。本発明者らは、次に、切断されていない転写物の標的RNA配列決定を実行して、ミスマッチの標的配列の欠失を定量化した。LwaCas13a及びPspCas13bには、単一のミスマッチに比較的不耐性の中央領域があり、PspCas13b標的の塩基対12-26及びLwaCas13a標的の13-24から伸びていることが判明した(図56D)。二重ミスマッチは、単一変異よりも許容度が低く、それぞれの標的でPspCas13bの塩基対12-29及びLwaCas13aの8-27から伸びる大きなウィンドウでほとんどノックダウン活性が観察されなかった(図56E)。さらに、標的配列の5’及び3’末端に隣接する3つのヌクレオチドにミスマッチが含まれているため、Cas13ノックダウン活性に対するPFSの制約を評価し得る。配列決定により、ほとんど全てのPFSの組み合わせが強力なノックダウンを可能にすることが示され、哺乳動物細胞の干渉に対するPFSの制約が、試験したいずれの酵素にも存在しない可能性が高いことが示された。これらの結果、Cas13a及びCas13bが類似の配列制約及びミスマッチに対する感度を示すことが示される。
PspCas13bが哺乳類細胞においてmRNAの一貫性があり堅牢で特異的なノックダウンを達成したことを考えると、プログラム可能なRNA編集のためにADARのデアミナーゼドメイン(ADARDD)をリクルートするRNA結合プラットフォームとして適応し得ると想定した。ヌクレアーゼ活性を欠くPspCas13b(これ以降はdCas13bと呼ばれる、dPspCas13b)を操作するために、HEPNドメインの保存された触媒残基を変異させ、ルシフェラーゼRNAノックダウン活性の消失を観察した(図57A)。本発明者らは、アデノシンを標的とするガイドRNAによってdCas13b-ADARDD融合がリクルートされ、ハイブリダイズされたRNAがADAR活性に必要な二重鎖基質を作成するという仮説を立てた(図50A)。標的アデノシンの脱アミノ化率を高めるために、本発明者らの最初のRNA編集設計に2つの追加の修正を導入した:標的アデノシンの反対側にミスマッチのシチジンを導入し、これは、脱アミノ化の頻度を高めることが以前に報告されており、dCas13bを、過剰活性化変異を含むヒトADAR1またはADAR2のデアミナーゼドメインと融合して、触媒活性を高めた(ADAR1DD(E1008Q)(27)またはADAR2DD(E488Q)(21))。
試験部位で正確なRNA編集を達成し得ることを考えると、トランスクリプトームの任意のRNA標的に対して系をプログラミングするための配列制約を特徴付けたいと考えた。配列の制約は、PFSなどのdCas13b標的化の制限、またはADAR配列優先性から生じ得る(26)。REPAIRv1のPFS制約を調査するために、Cluc転写物の標的部位の5’末端に一連の4つのランダム化ヌクレオチドを保持するプラスミドライブラリーを設計した(図51A)。UAGまたはAACのいずれかのモチーフ内の中央のアデノシンを標的にしたところ、両方のモチーフについて、全てのPFSが検出可能なレベルのRNA編集を示し、PFSの大部分が標的部位で50%を超える編集を示していた(図51B)。次に、ADAR2DDで以前に報告されたように、REPAIRv1のADAR2DDに、標的塩基にすぐ隣接する配列制約があるか否かを判断しようとした(26)。標的アデノシンを直接囲む5’及び3’隣接ヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせを試験し(図51C)、REPAIRv1が全てのモチーフを編集し得ることが判明した(図51D)。最後に、スペーサー配列の標的Aの反対側の塩基の同一性が編集効率に影響するか否かを分析し、A-CミスマッチがREPAIRv1活性を劇的に低下させたA-G、A-U、及びA-Aで最高のルシフェラーゼ回復を示したことが判明した(図57F、図70E)。
哺乳動物細胞におけるRNA編集のためのREPAIRv1系の広範な適用性を実証するために、本発明者らは、2つの疾患関連変異に対するREPAIRv1ガイドを設計した:X連鎖腎性尿崩症における878G>A(AVPR2 W293X)及びファンコーニ貧血における1517G>A(FANCC W506X)。これらの変異を保有する遺伝子のcDNAの発現構築物をHEK293FT細胞にトランスフェクトし、REPAIRv1が変異を修正し得るか否かを試験した。50ntスペーサーを含むガイドRNAを使用して、AVPR2の35%補正及びFANCCの23%補正を達成できた(図52A-D)。次に、REPAIRv1の34の異なる疾患関連G>A変異を修正する能力を試験し(表9)、33の部位で最大28%の編集効率で重要な編集を達成し得ることが見出された(図52E)。本発明者らが選択した変異は、ClinVarデータベースの病原性GからAへの変異(5,739)のほんの一部であり、追加の11,943GからAへのバリアントも含まれている(図52F及び図58)。配列の制約がないため、特に標的モチーフに関係なく重要な編集が観察された場合、REPAIRv1は、これらの疾患関連変異全てを潜在的に編集し得る(図51C及び図52G)。
PspCas13bによるRNAノックダウンは、非常に特異的であったが、本発明者らのルシフェラーゼタイリング実験では、ガイド:標的二重鎖内のオフ標的アデノシン編集が観察された(図50E)。これが広範囲にわたる現象であったか否かを確認するために、本発明者らは、内因性の転写物KRASをタイリングして、標的アデノシン付近のオフ標的編集の程度を測定した(図53A)。KRASの場合、オン標的編集率は23%であったが、標的部位の周囲には検出可能なAからGへの編集もある、多くの部位があった(図53B)。
REPAIRの特異性を改善するために、本発明者らは、ADAR2DD(E488Q)の構造誘導タンパク質工学を採用した。オフ標的のガイド非依存性の性質のため、ADAR2DD(E488Q)-RNA結合を不安定化すると、オフ標的編集が選択的に減少するが、標的部位へのADAR2DD(E488Q)のdCas13bテザリングからの局所濃度の増大に起因してオン標的編集が維持されると本発明者らは、仮定した。本発明者らは、ADAR2DD(E488Q)バックグラウンド上の標的RNAの二重鎖領域に接触することが以前に決定されたADAR2DD(E488Q)残基を変異誘発させた(図54A)(18)。効率及び特異性を評価するために、本発明者らは、検出された非標的化条件でのバックグラウンドのルシフェラーゼの回復が、より広いオフ標的活性を示すという仮定の下で、標的化と非標的化の両方のガイドで17の単一変異体を試験した。選択された残基の変異は、標的化及び非標的化ガイドのルシフェラーゼ活性に大きな影響を与えることが判明した(図54A、図54B、図61A)。変異体の大部分は、標的化ガイドのルシフェラーゼ活性を有意に改善するか、または本発明者らが特異性スコアと命名した、非標的化ガイド活性に対する標的化の比率を増大させた(図54A、B)。本発明者らは、次世代シーケンシングによるトランスクリプトームワイドの特異性プロファイリングのために、これらの変異体のサブセットを選択した(図54B)。予想どおり、トランスクリプトームワイドの配列決定から測定されたオフ標的は、変異体の特異性スコア(図61B)と相関していた。ADAR2DD(E488Q/R455E)を除き、全ての配列決定されたREPAIRv1変異体はレポーター転写物を効果的に編集し得ることが判明し(図54C)、多くの変異体はオフ標的の数の減少を示している(図61C、62)。本発明者らは、特異性変異体のオフ標的の周囲のモチーフをさらに調査し、REPAIRv1及びほとんどの操作された変異体が、特徴づけられたADAR2モチーフと一致して、編集に対して強い3’G優先性を示すことが判明した(図63A)(28)。トランスクリプトームワイドのオフ標的の数が最も少ない4つの変異体の編集率が最も高いため、将来の実験のために、本発明者らは、変異体ADAR2DD(E488Q/T375G)を選択し、REPAIRv2と名付けた。REPAIRv1と比較して、REPAIRv2は、特異性の増大を示し、高カバレッジシーケンシング(125×カバレッジ、10ngのDNAトランスフェクション)により、18,385から20のトランスクリプトームワイドのオフ標的に減少した(図54D)。Clucの標的アデノシンを取り巻く領域では、REPAIRv2がオフ標的編集を減らし、シーケンシングトレースで可視であった(図54E)。次世代シーケンシングから派生したモチーフでは、REPAIRv1は3’Gに強い優先性を示したが、全てのモチーフのオフ標的編集を示した(図63B);対照的に、REPAIRv2は最も強力なオフ標的モチーフのみを編集した(図63C)。転写物の編集の分布は大きく歪んでおり、高度に編集された遺伝子は、60を超える編集を有し(図64A、B)、一方でREPAIRv2は1つの転写物(EEF1A1)を複数回しか編集しなかった(図64D-F)。REPAIRv1のオフ標的編集は、93の発癌性事象(図64D)を伴う1000のミスセンス変異(図64C)を含む、多数のバリアントをもたらすと予測された。対照的に、REPAIRv2には6つのミスセンス変異しかなく(図64E)、発がん性の結果はなかった(図64F)。予測されるオフ標的効果の減少により、REPAIRv2は、他のRNA編集アプローチと区別される。さまざまな用量のガイドRNAを使用した実験では、用量反応がオフ標的活性を低下し得ることが示唆されている(図68)。
出願人はここで、RNA誘導RNA標的化タイプVI-BのエフェクターCas13bが非常に効率的かつ特異的なRNAノックダウンが可能であり、必須遺伝子及び非コードRNAを調べ、同様にトランスクリプトームレベルでの細胞プロセスを制御するための改善されたツールの基礎を提供し得ることを示した。触媒的に不活性なCas13b(dCas13b)は、プログラム可能なRNA結合機能を保持し、ここでは、これを活用して、dCas13bをアデノシンデアミナーゼADAR2と融合させて、REPAIRv1(プログラム可能なA→I置換バージョン1のRNA編集(RNA Editing for Programmable A to I Replacement version 1))と名付けた系である、正確なA→I編集を実現した。この系のさらなる操作により、高レベルのオン標的有効性を維持しながら、前述のRNA編集プラットフォーム(25、29)よりも劇的に特異性が改善された現在の編集プラットフォームに匹敵するかまたは活性が増大した方法であるREPAIRv2が生じた。
REPAIRv3検索
効率及び特異性が増大した追加のADAR変異体を同定するために、ADARデアミナーゼドメインの様々な変異を有するCas13b-ADAR融合物をルシフェラーゼ標的でアッセイした。
C→U脱アミノ化活性を有するADAR変異体を同定するために、ADARデアミナーゼドメインに様々な変異を有するCas13b-ADAR融合物をルシフェラーゼ標的上でアッセイした。
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1.目的の標的RNA配列中のアデニンを改変する方法であって、前記標的RNA対して:
(a)触媒的に不活性な(デッド)Cas13タンパク質;
(b)ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含むガイド分子;及び
(c)アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメイン;
を送達することを含み、
ここで、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、前記デッドCas13タンパク質もしくは前記ガイド分子に共有結合もしくは非共有結合しているか、または送達後にそれに結合するように適合されており;
ここで、ガイド分子は、前記デッドCas13タンパク質と複合体を形成し、目的の前記標的RNA配列に結合するように複合体を誘導し、ここで前記ガイド配列は、前記アデニンを含む標的配列とハイブリダイズしてRNA二重鎖を形成し得、前記ガイド配列は前記アデニンに対応する位置の非対合シトシンを含み、形成されるRNA二重鎖にACミスマッチが生じ;
ここで、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、前記RNA二重鎖中の前記アデニンを脱アミノ化する、前記方法。
2.Cas13タンパク質がCas13a、Cas13bまたはCas13cである、記述1の方法。
3.前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記デッドCas13タンパク質のN末端またはC末端に融合されている、記述1の方法。
4.前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、リンカーによって前記デッドCas13タンパク質に融合される、記述3の方法。
5.前記リンカーが(GGGGS)3-11、GSG5もしくはLEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTRであるか、または前記リンカーがXTENリンカーである、記述4の方法。
6.前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、アダプタータンパク質に連結され、前記ガイド分子または前記デッドCas13タンパク質が、前記アダプタータンパク質に結合し得るアプタマー配列を含む、記述1の方法。
7.前記アダプター配列が、MS2、PP7、Qβ、F2、GA、fr、JP501、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、φCb5、φCb8r、φCb12r、φCb23r、7s及びPRR1から選択される、記述6の方法。
8.前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記デッドCas13タンパク質の内部ループに挿入される、記述1の方法。
9.前記Cas13タンパク質がCas13aタンパク質であり、前記Cas13aが特にLeptotrichia wadeiに由来するCas 13aタンパク質の位置R474及びR1046またはCas13aオルソログのそれに対応するアミノ酸位置で2つのHEPNドメインの1つ以上の変異を含む、記述8の方法。
10.前記Cas13タンパク質がCas13bタンパク質であり、前記Cas13bがBergeyella zoohelcum ATCC 43767に由来するCas13bタンパク質の位置R116、H121、R1177、H1182またはCas13bオルソログのそれに対応するアミノ酸位置のうち1つ以上に変異を含む、記述9の方法。
11.前記変異が、Bergeyella zoohelcum ATCC 43767に由来するCas13bタンパク質のR116A、H121A、R1177A、H1182AまたはCas13bオルソログのそれに対応するアミノ酸位置のうち1つ以上である、記述の方法。
12.前記ガイド配列が、前記標的配列と前記RNA二重鎖を形成し得る、約20~53nt、好ましくは25~53nt、より好ましくは29~53ntの長さを有する、記述1のいずれかの方法。
13.前記ガイド配列が、前記標的配列と前記RNA二重鎖を形成し得る約40~50ntの長さを有する、記述12のいずれかの方法。
14.前記非対合Cと前記ガイド配列の5’末端との間の距離が20~30ヌクレオチドである、記述1の方法。
15.前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、ヒト、頭足類、またはショウジョウバエのアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインである、前述の記述のいずれかの方法。
16.前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、hADAR2-Dアミノ酸配列のグルタミン酸488または相同ADARタンパク質の対応する位置で変異を含むように改変されている、記述1の方法。
17.488位の前記グルタミン酸残基または相同ADARタンパク質の対応する位置がグルタミン残基(E488Q)で置換される、記述16の方法。
18.前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、変異E488Qを含む変異hADAR2dまたは変異E1008Qを含む変異hADAR1dである、記述16または17の方法。
19.前記ガイド配列が標的RNA配列の異なるアデノシン部位に対応する2つ以上のミスマッチを含むか、またはそれぞれ標的RNA配列の異なるアデノシン部位に対応するミスマッチを含む2つのガイド分子が使用される、前記任意の記述の方法。
20.前記Cas13タンパク質及び任意選択で前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、1つ以上の異種核局在化シグナル(複数可)(NLS(複数可))を含む、前記任意の記述の方法。
21.前記方法が、前記目的の標的配列を決定すること、及び前記標的配列に存在する前記アデニンを最も効率的に脱アミノ化する前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを選択することを含む、前記任意の記述の方法。
22.前記触媒的に不活性なCas13タンパク質が、表1、2、3、または4のいずれかに列挙された細菌種からなる群より選択される細菌種に由来するCas13ヌクレアーゼから得られる、前記任意の記述の方法。
23.目的の前記標的RNA配列が細胞内にある、任意の先行する記述の方法。
24.前記細胞が真核細胞である、記述23の方法。
25.前記細胞が非ヒト動物細胞である、記述24の方法。
26.前記細胞がヒト細胞である、記述24の方法。
27.前記細胞が植物細胞である、記述24の方法。
28.前記目的の標的遺伝子座が動物内にある、任意の先行する記述の方法。
29.前記目的の標的遺伝子座が植物内にある、任意の先行する記述の方法。
30.前記目的の標的RNA配列がインビトロでRNAポリヌクレオチドに含まれる、前述の記述のいずれかの方法。
31.前記構成要素(a)、(b)及び(c)が、リボ核タンパク質複合体として前記細胞に送達される、任意の先行する記述の方法。
32.前記構成要素(a)、(b)及び(c)が、1つ以上のポリヌクレオチド分子として前記細胞に送達される、任意の先行する記述の方法。
33.前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が、構成要素(a)及び/または(c)をコードする1つ以上のmRNA分子を含む、記述32の方法。
34.前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が1つ以上のベクター内に含まれる、記述33の方法。
35.前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が、前記Cas13タンパク質、前記ガイド分子、及び前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを発現するように機能可能なように構成された1つ以上の調節要素を含み、任意選択で前記1つ以上の調節性要素は誘導性プロモーターを含む、記載34の方法。
36.前記1つ以上のポリヌクレオチド分子または前記リボ核タンパク質複合体が、粒子、小胞、または1つ以上のウイルスベクターを介して送達される、記述32の方法。
37.前記粒子が、脂質、糖、金属またはタンパク質を含む、記述36の方法。
38.前記粒子が脂質ナノ粒子を含む、記述37の方法。
39.前記小胞がエクソソームまたはリポソームを含む、記述36の方法。
40.前記1つ以上のウイルスベクターが、1つ以上のアデノウイルス、1つ以上のレンチウイルスまたは1つ以上のアデノ随伴ウイルスを含む、記述34の方法。
41.1つ以上の標的RNA配列の操作により細胞、細胞株または生物を改変する、任意の先行する記述の方法。
42.前記目的の標的RNA中の前記アデニンの前記脱アミノ化が、病原性G→AまたはC→T点変異を含む転写物によって引き起こされる疾患を治療する、記述41の方法。
43.前記疾患が、マイヤー・ゴーリン症候群、セッケル症候群4、ジュベール症候群5、レーバー先天性黒内障10;シャルコー・マリー・ツース病、2型;シャルコー・マリー・ツース病、2型;アッシャー症候群、タイプ2C;脊髄小脳性運動失調28;脊髄小脳性運動失調28;脊髄小脳性運動失調28;長QT症候群2;シェーグレン・ラーソン症候群;遺伝性フルクトース尿症;遺伝性フルクトース尿症;神経芽細胞腫;神経芽細胞腫;カルマン症候群1;カルマン症候群1;カルマン症候群1;異染性白質ジストロフィー、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症10型、リー・フラウメニ症候群、または表5に記載されている疾患から選択される、記述42の方法。
44.前記疾患が早期終了疾患である、記述42の方法。
45.前記改変が生物の生殖能力に影響を及ぼす、記述41の方法。
46.前記改変が、前記標的RNA配列のスプライシングに影響を及ぼす、記述41の方法。
47.前記改変が、アミノ酸変化を導入し、がん細胞において新しい抗原の発現を引き起こす転写物に変異を導入する、記述41の方法。
48.前記標的RNAがマイクロRNA内に含まれる、記述41の方法。
49.前記目的の標的RNA中の前記アデニンの前記脱アミノ化が、遺伝子の機能の獲得または機能の喪失を引き起こす、記述41の方法。
50.前記遺伝子が癌細胞により発現される遺伝子である、記述49の方法。
51.前記細胞が、前記方法に供されていない対応する細胞と比較して目的の前記標的RNA中の前記アデニンの代わりにヒポキサンチンまたはグアニンを含む、任意の先行する記述の方法から得られた改変細胞、または前記改変された細胞の子孫。
52.前記細胞が真核細胞である、記述51の改変された細胞またはその子孫。
53.前記細胞が動物細胞である、記述51の改変された細胞またはその子孫。
54.前記細胞がヒト細胞である、記述51の改変された細胞またはその子孫。
55.前記細胞が治療用T細胞である、記述51の改変された細胞またはその子孫。
56.前記細胞が抗体産生B細胞である、記述51の改変された細胞またはその子孫。
57.前記細胞が植物細胞である、記述51の改変された細胞またはその子孫。
58.記述51の前記改変細胞を含む非ヒト動物。
59.記述58の前記改変細胞を含む植物。
60.記述51~55のいずれかの前記改変細胞を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記改変細胞の存在が患者の疾患を治療する、細胞療法のための方法。
61.目的の標的遺伝子座内のアデニンを改変するのに適した、操作された天然には存在しない系であって、
a)ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列、または前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列を含むガイド分子。
b)触媒的に不活性なCas13タンパク質、または前記触媒的に不活性なCas13タンパク質をコードするヌクレオチド配列;
c)アデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメイン、または前記アデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列;
を含み、
ここで、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、前記Cas13タンパク質もしくは前記ガイド分子に共有結合もしくは非共有結合しているか、または送達後にそれに結合するように適合されており;
ここで、前記ガイド配列は、アデニンを含む標的RNA配列とハイブリダイズしてRNA二重鎖を形成し得、前記ガイド配列は、前記アデニンに対応する位置に非対合シトシンを含み、形成されたRNA二重鎖のA-Cミスマッチをもたらす、前記系。
62.記述61のa)、b)及びc)のヌクレオチド配列を含む、目的の標的遺伝子座のアデニンを改変するのに適した、操作された天然には存在しないベクター系。
63.記述62の操作された天然には存在しないベクター系であって:
a)前記ガイド配列を含む前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第1の調節要素、
b)前記触媒的に不活性なCas13タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように連結された第2の調節要素:及び
c)アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、前記第1もしくは第2の調節要素の制御下にあるか、または第3の調節要素に機能可能なように連結されている、前記ヌクレオチド配列
を含む1つ以上のベクターを含み、
ここで、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が第3調節要素に機能可能なように連結されている場合、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、発現後に前記ガイド分子または前記Cas13タンパク質に連結するように適合されており;
ここで、構成要素(a)、(b)、及び(c)が、前記系の同じまたは異なるベクターに配置される、前記ベクター系。
64.記述61~63のいずれかの系を含む、インビトロもしくはエクスビボの宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
65.前記細胞が真核細胞である、記述64の宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
66.前記細胞が動物細胞である、記述64の宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
67.前記細胞がヒト細胞である、記述64の宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
68.前記細胞が植物細胞である、記述64の宿主細胞もしくはその子孫または細胞株もしくはその子孫。
69.前記シトシンが、グアノシンが5’側に隣接していない、記述1に記載の方法。
70.前記アデノシンデアミナーゼがADAR、任意選択でhuADAR、任意選択で(hu)ADAR1または(hu)ADAR2、好ましくはhuADAR2である、記述1に記載の方法。
71.前記Cas13、好ましくはCas13bが切断され、好ましくはC末端が切断され、好ましくは前記Cas13が対応する野生型Cas13の切断された機能的バリアントである、記述1に記載の方法。
72.前記アデノシンデアミナーゼが、RNA中のアデノシンを脱アミノ化し得るか、またはRNA特異的アデノシンデアミナーゼである、記述1に記載の方法。
73.前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、ADARの1つ以上の変異、好ましくは本明細書に記載の変異、例えば図43~47のいずれかで提供される変異、またはADARホモログもしくはオルソログの対応する変異を含むように改変されている、記述1または16に記載の方法。
***
Claims (44)
- 標的化ドメイン及びアデノシンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインを含む、部位特異的塩基編集のための操作された組成物であって、
前記標的化ドメインが、CRISPRエフェクタータンパク質、またはRNA結合能力を保持するその断片、を含むCRISPR系であり、
前記CRISPRエフェクタータンパク質がCas13タンパク質であり、
アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインが、野生型と比較してアデノシンデアミナーゼの機能を改善させる1つ以上の変異を含み、
アデノシンデアミナーゼの機能が、アデノシンデアミナーゼのシチジンを脱アミノ化する能力であり、
アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、オリゴヌクレオチド標的化タンパク質のNまたはC末端に融合されている、
組成物。 - 標的化ドメインがオリゴヌクレオチド結合ドメインである、請求項1に記載の組成物。
- さらにガイド分子を含む、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記CRISPR系が触媒的に不活性である、請求項3に記載の組成物。
- Cas13タンパク質がCas13a、Cas13b、Cas13cまたはCas13dである、請求項1から4の何れか一項に記載の組成物。
- 前記Cas13タンパク質が、
C2c2オルソログC2-2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C2-11、C2-12、C2-13、C2-14、C2-15、またはC2-16;
c2c2-5、c2c2-6、c2c2-7、c2c2-8、c2c2-9、c2c2-10、c2c2-11、c2c2-12、c2c2-13、c2c2-14、c2c2-15、c2c2-16、c2c2-2、c2c2-3、c2c2-4、C2-17、C2-18、C2-19、C2-20、C2-21、C2-22、C2-23、C2-24、C2-25、C2-26、C2-27、C2-28、C2-29、C2-30、C2-31、C2-32、C2-33、またはC2-34;
配列番号67~154の何れかに記載にアミノ酸配列を有するもの;
配列番号155~161の何れかに記載にアミノ酸配列を有するもの;
配列番号762~773の何れかに記載にアミノ酸配列を有するもの;または
Cas13a1、Cas13a2、Cas13a3、Cas13a4、Cas13a5、Cas13a6、Cas13a7、Cas13a8、Cas13a9、Cas13a10、Cas13a11、Cas13a12、Cas13a13、Cas13a14、Cas13a15、Cas13a16、Cas13a17、Cas13a18、Cas13a19、Cas13a20、Cas13a21、Cas13b1、Cas13b2、Cas13b3、Cas13b4、Cas13b5、Cas13b6、Cas13b7、Cas13b8、Cas13b9、Cas13b10、Cas13b11、Cas13b12、Cas13b13、Cas13b14、Cas13b15、Cas13c1、Cas13c2、Cas13c3、Cas13c4、Cas13c5、Cas13c6、またはCas13c7である、請求項5に記載の組成物。 - 前記Cas13タンパク質は、Prevotella sp.P5-125 Cas13b、Porphyromas gulae Cas13b、またはRiemerella anatipestifer Cas13bである、請求項1から5の何れか一項に記載の組成物。
- 前記ガイド分子が、アデニンを含む標的RNA配列とハイブリダイズしてRNA二重鎖を形成し得るガイド配列を含み、前記ガイド配列が、前記アデニンに対応する位置で非対合シトシンを含み、形成されるRNA二重鎖にACミスマッチをもたらす、請求項3又は4に記載の組成物。
- 前記Cas13タンパク質がCas13aタンパク質であり、前記Cas13aが、Leptotrichia wadeiに由来するCas13aタンパク質の位置R474及びR1046、またはCas13aオルソログのそれに対応するアミノ酸位置に2つのHEPNドメインの1つ以上の変異を含むか、または
前記Cas13タンパク質が、Cas13bタンパク質であり、かつ前記Cas13bが、Bargeyella zoohelcum ATCC 43767に由来するCas13bタンパク質のR116、H121、R1177、H1182、またはCas13bオルソログのそれに対応するアミノ酸位置の1つ以上に変異を含むか、または
前記Cas13タンパク質が、Cas13bタンパク質であり、かつ前記Cas13bがPrevotella sp.P5-125に由来するCas13bタンパク質のR128、H133、R1053、H1058、またはCas13bオルソログのそれに対応するアミノ酸位置に変異を含む、請求項1から8の何れか一項に記載の組成物。 - Bargeyella zoohelcum ATCC 43767に由来するCas13bタンパク質のR116、H121、R1177、H1182が、R116A、H121A、R1177A、H1182Aであるか、または
Prevotella sp.P5-125に由来するCas13bタンパク質のH133及びH1058が、H133A及びH1058Aである、
請求項9に記載の組成物。 - 前記Cas13が切断されている、請求項1から10の何れか一項に記載の組成物。
- Cas13bが切断されている、または
Cas13はC末端が切断されている、または
前記Cas13が対応する野生型Cas13の切断された機能的バリアントである、または
前記切断されたCas13bがPrevotella sp.P5-125 Cas13bのnt1-984またはCas13bのオルソログもしくはホモログの対応するntによりコードされる、
請求項11に記載の組成物。 - 前記Cas13が触媒的に不活性なCas13である、請求項1から12の何れか一項に記載の組成物。
- 前記Cas13がCas13b6である、請求項13に記載の組成物。
- 前記ガイド分子が、前記標的配列と前記RNA二重鎖を形成し得る20~53nt、25~53nt、29~53ntもしくは40~50ntの長さを有するか、及び/または前記非対合Cと前記ガイド配列の5’末端との間の距離が20~30ヌクレオチドである、請求項3又は4に記載の組成物。
- 前記ガイド分子が標的RNA配列の異なるアデノシン部位に対応する2つ以上のミスマッチを含むか、または2つのガイド分子が使用され、標的RNA配列の異なるアデノシン部位に対応するミスマッチをそれぞれが含む、請求項15に記載の組成物。
- アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、リンカーによって、前記オリゴヌクレオチド標的化タンパク質のNまたはC末端に融合されている、請求項1から16の何れか一項に記載の組成物。
- 前記リンカーが(GGGGS)3-11、GSG5もしくはLEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTRであるか、または、前記リンカーはXTENリンカーである、請求項17に記載の組成物。
- 前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、デッドCas13タンパク質の内部ループに挿入される、請求項1から18のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインがアダプタータンパク質に連結され、前記ガイド分子または前記デッドCas13タンパク質が、前記アダプタータンパク質に結合し得るアプタマー配列を含む、請求項1から19のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アダプター配列は、MS2、PP7、Qβ、F2、GA、fr、JP501、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、φCb5、φCb8r、φCb12r、φCb23r、7s及びPRR1から選択される、請求項20に記載の組成物。
- RNA中のアデノシンまたはシチジンを脱アミノ化できるアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインが、RNA特異的アデノシンデアミナーゼであるか、及び/または細菌、ヒト、頭足類、またはDrosophilaのアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインである、請求項1から21のいずれか1項に記載の組成物。
- RNA中のアデノシンまたはシチジンを脱アミノ化できるアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインが、TadA、ADAR、huADAR、(hu)ADAR1、(hu)ADAR2、huADAR2またはその触媒ドメインである、請求項22に記載の組成物。
- 前記ADARタンパク質が、変異E488Qを含む変異hADAR2dまたは変異E1008Qを含む変異hADAR1dである、請求項23に記載の組成物。
- 前記標的化ドメイン、または前記標的化ドメインと前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインとが、1つ以上の異種核輸出シグナル(複数可)(NES(複数可))または核局在化シグナル(複数可)(NLS(複数可))を含む、請求項1から24のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的化ドメイン、または前記標的化ドメインと前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインとが、HIV Rev NESもしくはMAPK NESを含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記標的化ドメイン、または前記標的化ドメインと前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインとが、1つ以上の異種核輸出シグナル(複数可)(NES(複数可))または核局在化シグナル(複数可)(NLS(複数可))をC末端に含む、請求項25又は26に記載の組成物。
- 前記目的の標的RNA配列が細胞内にある、請求項1から27のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞が、真核細胞、ヒトもしくは非ヒト動物細胞、または植物細胞である、請求項28に記載の組成物。
- 予防的または治療的処置に使用するための、請求項1から29のいずれか1項に記載の組成物。
- 目的の前記標的遺伝子座がヒトまたは動物内にある、請求項30に記載の組成物。
- 目的の標的RNA配列中のシチジンを改変する方法であって、請求項1~31のいずれか1項に記載の組成物を前記標的RNAに送達することを含む、前記方法;ただし、ヒトを処置する方法を除く。
- 請求項32に記載の方法であって、前記標的化ドメインが請求項1及び4~7の何れか一項に記載のCRISPR系を含み、前記ガイド分子が前記CRISPRエフェクタータンパク質と複合体を形成し、前記複合体に目的の前記標的RNA配列に結合するように指示し、前記ガイド分子は、前記シトシンを含む標的配列とハイブリダイズしてRNA二重鎖を形成し得;前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記RNA二重鎖中のシチジンを脱アミノ化する、前記方法。
- 前記CRISPR系が、請求項1~31のいずれか1項に記載のCas13を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記CRISPR系及び前記アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインが、1つ以上のポリヌクレオチド分子として、リボ核タンパク質複合体として送達される、請求項32または33に記載の方法。
- 前記CRISPR系及び前記アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインが、粒子、小胞または1つ以上のウイルスベクターを介して、送達される、請求項35に記載の方法。
- 病原性G→AまたはC→T点変異を含む転写物によって引き起こされる疾患の治療または予防に使用される、請求項1~31のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項1~31のいずれか1項に記載の組成物を含む、単離かつ改変された細胞であって前記単離かつ改変された細胞は、目的の標的RNA中のアデニンの代わりにヒポキサンチンまたはグアニンを含み、前記単離かつ改変された細胞は、改変されていない対応する細胞と比較して改変されている、単離かつ改変された細胞;又は請求項1~31のいずれか1項に記載の組成物を含む、前記単離かつ改変された細胞の子孫。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項38に記載の細胞または子孫。
- 前記細胞が、ヒトまたは非ヒト動物細胞、治療用T細胞または抗体産生B細胞、または植物細胞である、請求項39に記載の細胞またはその子孫。
- 請求項38から40の何れか一項に記載の細胞またはその子孫を含む非ヒト動物。
- 請求項38に記載の細胞またはその子孫を含む植物。
- 治療に使用するための、請求項38から40の何れか一項に記載の細胞またはその子孫。
- 細胞治療に使用するための、請求項43に記載の細胞またはその子孫。
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