CN117545839A

CN117545839A - 工程化CRISPR-Cas13f系统及其用途

Info

Publication number: CN117545839A
Application number: CN202380012150.1A
Authority: CN
Inventors: 王兴
Original assignee: Huida Shanghai Biotechnology Co ltd; Huida Gene Therapy Singapore Private Ltd
Current assignee: Huida Shanghai Biotechnology Co ltd; Huida Gene Therapy Singapore Private Ltd
Priority date: 2022-03-28
Filing date: 2023-03-28
Publication date: 2024-02-09
Also published as: WO2023185878A1

Abstract

本公开提供工程化Cas13f多肽、包含其的系统或组合物、以及使用其的方法。

Description

工程化CRISPR-Cas13f系统及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2022年3月28日提交的标题为“ENGINEERED CRISPR/CAS13SYSTEMAND USES THEREOF”的国际专利申请号PCT/CN2022/083461和于2022年9月29日提交的标题为“ENGINEERED CRISPR-CAS13F SYSTEM AND USES THEREOF”的国际专利申请号PCT/CN2022/122833的权益和优先权，将其(包括任何序列表和附图)通过引用以其全文并入本文。

电子序列表的引用

本公开含有电子序列表(“HGP020PCT2.xml”，由软件“WIPOSequence”根据WIPO标准ST.26于2023年3月26日创建)，其通过引用以其全文并入本文。在序列是RNA序列的情况下，该序列中的T应被视为U。

背景技术

成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)基因(统称为CRISPR-Cas或CRISPR/Cas系统)是古菌和细菌中保护特定物种免受外来遗传元件侵害的适应性免疫系统。

在本公开中对任何文献的引用或标识均不是承认该文献可作为本公开的现有技术获得。

发明内容

针对上述背景，本公开提供优于现有技术的某些优点。尽管本文的公开内容不限于特定优点，但在一方面，本公开提供工程化Cas13f多肽，其中所述工程化Cas13f多肽：

(1)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.6％、99.7％或99.8％)且小于100％的序列同一性；

(2)包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸序列的双突变Y666A和Y677A的所述双突变；并且

(3)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有增加的间隔序列特异性切割活性和/或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有降低的间隔序列非依赖性旁切活性。

在另一方面，本公开提供多核苷酸，所述多核苷酸编码本公开的工程化Cas13f多肽。

在又另一方面，本公开提供CRISPR-Cas13f系统，所述CRISPR-Cas13f系统包含：

a)本公开的工程化Cas13f多肽或编码所述工程化Cas13f多肽的多核苷酸(例如，DNA、RNA)；以及

b)指导核酸或编码所述指导核酸的多核苷酸(例如，DNA或RNA)，所述指导核酸包含：

i.能够与所述工程化Cas13f多肽形成复合物的同向重复(DR)序列；和

ii.能够与靶RNA杂交，由此将所述复合物引导至所述靶RNA的间隔序列。

在又另一方面，本公开提供载体，所述载体包含本公开的多核苷酸。

在又另一方面，本公开提供递送系统，所述递送系统包含(1)递送媒介物(vehicle)，和(2)本公开的工程化Cas13f多肽、本公开的多核苷酸、本公开的CRISPR-Cas13f系统、或本公开的载体。

在又另一方面，本公开提供修饰靶RNA的方法，所述方法包括使所述靶RNA与本公开的CRISPR-Cas13f系统、本公开的载体、或本公开的递送系统接触，由此修饰所述靶RNA。

在又另一方面，本公开提供在有需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的CRISPR-Cas13f系统，其中所述疾病与靶RNA关联，其中所述CRISPR-Cas13f系统修饰所述靶RNA，并且其中对所述靶RNA的修饰治疗所述疾病。

上文大体描述了本公开，本公开的各个方面的更详细描述在下文的单独部分中提供。然而，应理解，为了简洁和减少冗余，本公开的某些实施方式仅在一个部分下描述或仅在权利要求或实施例中描述。因此，还应理解，本公开的任何一个实施方式，包括仅在一个方面、部分下或仅在权利要求或实施例中描述的那些实施方式，可以与本公开的任何其他实施方式组合，除非特别否认或组合不当。

本公开的一个或多个实施方式的细节在以下说明书中描述。根据以下附图和几个实施方式的详细描述并且还根据所附权利要求，本公开的其他特征和优点将变得明显。

定义

本公开将对具体实施方式进行描述，但本公开不限于此，而仅受权利要求书的限制。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另有说明，如下文所述的术语通常以其通常含义进行理解。

概述

II类、VII型CRISPR相关(Cas)蛋白(Cas13)，作为核酸可编程RNA核酸酶(napRNAn)，包括Cas13a(C2c2)、Cas13b(如Cas13b1、Cas13b2)、Cas13c、Cas13d、Cas13e和Cas13f多肽，能够在包含靶向靶RNA的指导序列的指导核酸(例如，指导RNA)的指导下切割所述靶RNA。在一些实施方式中，所述靶RNA是真核的。

不希望受理论束缚，在一些实施方式中，指导核酸包含负责与Cas13形成复合物的支架序列，以及经有意设计为负责与靶RNA的靶序列杂交的指导序列，由此将包含Cas13和指导核酸的复合物引导至靶RNA。

参考图7，示例性dsRNA被描述为包含5’至3’单个DNA链和3’至5’单个DNA链。根据常规转录过程，示例性RNA转录物可以使用3'至5'单个DNA链作为合成模板进行转录，因此3'至5'单个DNA链被称为“模板链”或“反义链”。如此转录的RNA转录物与5'至3'单个DNA链具有相同的一级序列(除了T被U替换外)，因此5'至3'单个DNA链被称为“编码链”或“有义链”。

示例性指导核酸被描述为包含指导序列和支架序列。指导序列被设计为与RNA转录物(靶RNA)的一部分杂交，因此指导序列“靶向”所述部分。因此，指导序列设计所基于的靶RNA的部分以及指导序列可以与之杂交的部分称为“靶序列”。在一些实施方式中，指导序列与靶序列100％(完全)反向互补。在一些其他实施方式中，指导序列与靶序列反向互补，并且含有与所述靶序列的错配(如图8中例示的)。

通常，dsDNA的双链序列可以用其5’至3’单个DNA链的序列来表示，并且常规地，以5’至3’方向/取向书写。通常，核酸序列(例如，DNA序列、RNA序列)以5’至3’的方向/取向书写。

例如，对于具有5'-ATGC-3'的5'至3'单个DNA链和3'-TACG-5'的3'至5'单个DNA链的dsDNA，dsDNA可以简单地表示为5'-ATGC-3'。正常地，从dsDNA转录的RNA转录物(靶RNA)则具有5'-AUGC-3'的序列。

为了与靶RNA杂交，在一个实施方式中，指导核酸的指导序列被设计为具有与靶RNA完全反向互补的5’-GCAU-3’序列。根据WIPO的电子序列表标准ST.26，符号“t”用于表示DNA中的T和RNA中的U两者(参见“表1：核苷酸符号列表”，符号“t”的定义是“DNA中的胸腺嘧啶/RNA中的尿嘧啶(t/u)”)。因此，在根据ST.26的序列表中，这样的指导序列将在GCAT中列出，但标记为RNA序列。

术语

如本文所用，如果DNA序列，例如5’-ATGC-3’被转录成RNA序列(例如5'-AUGC-3')，其中用U(尿苷)替换一级序列中的每个dT(脱氧胸苷，或简称“T”)，并且分别用A(腺苷)、G(鸟苷)和C(胞苷)替换其他dA(脱氧腺苷，或简称为“A”)、dG(脱氧鸟苷，或简称为“G”)和dC(脱氧胞苷，或简称为“C”)，它在本公开中是说，DNA序列“编码”RNA序列。

如本文所用，术语“活性”是指生物活性。在一些实施方式中，活性包括酶活性，例如，效应子的催化能力。例如，活性可以包括核酸酶活性，例如RNA核酸酶活性、RNA内切核酸酶活性。

如本文所用，术语“复合物”是指两个或更多个分子的分组。在一些实施方式中，复合物包含多肽和核酸，所述多肽和核酸彼此相互作用(例如，结合、接触、粘附)。如本文所用，术语“复合物”可以是指指导核酸和多肽(例如，napRNAn，如Cas13多肽)的分组。如本文所用，术语“复合物”可以是指指导核酸、多肽和靶序列的分组。如本文所用，术语“复合物”可以是指靶向靶RNA的指导核酸、napRNAn和任选地靶RNA的分组。

如本文所用，术语“指导核酸”是指有助于将napRNAn(例如，Cas13多肽)靶向靶序列(例如，靶RNA的序列)的任何核酸。指导核酸可以被设计为包括与特定核酸序列(例如，靶RNA的序列)互补的序列。指导核酸可以包含有助于将napRNAn引导至靶RNA的支架序列。在一些实施方式中，指导核酸是指导RNA。

如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互换地用于指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其组合、及其类似物或修饰。

如在CRISPR-Cas技术(例如，CRISPR-Cas13技术)的上下文中所使用的，术语“指导RNA”与术语“CRISPR RNA(crRNA)”、“单个指导RNA(sgRNA)”或“RNA指导物”可互换地使用，术语“指导序列”与术语“间隔序列”可互换地使用，并且术语“支架序列”与术语“同向重复序列”可互换地使用。

如本文所述，指导序列被这样设计以能够与靶序列杂交。如本文所用，术语“杂交(hybridize、hybridizing或hybridization)”是指其中一个或多个多核苷酸序列反应形成复合物的反应，所述复合物经由多核苷酸序列的碱基之间的氢键而稳定。氢键可通过沃森克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。能够与给定多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列称为给定多核苷酸序列的“互补序列”。如本文所用，指导序列和靶序列的杂交是如此稳定，以允许与包含指导序列的核酸复合的效应多肽(例如，napRNAn)或与所述效应多肽相关联(例如，融合)的功能结构域对靶序列或其互补序列(例如，靶RNA的序列或其互补序列)起作用(例如，切割、脱氨基)。

出于杂交的目的，在一些实施方式中，指导序列与靶序列互补或反向互补。如本文所用，术语“互补”是指第一多核苷酸序列(如指导序列)的核碱基通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与第二多核苷酸序列(如靶序列)的核碱基碱基配对的能力。两个互补的多核苷酸序列能够在适当的温度和溶液离子强度条件下非共价结合。在一些实施方式中，第一多核苷酸序列(例如，指导序列)与第二核酸(例如，靶序列)包含100％(完全)的互补性。在一些实施方式中，如果第一多核苷酸序列与第二核酸包含至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的互补性，则第一多核苷酸序列(例如，指导序列)与第二多核苷酸序列(例如，靶序列)互补。如本文所用，术语“基本上互补”是指多核苷酸序列(例如，指导序列)与第二多核苷酸序列(例如，靶序列)具有一定程度的互补性。在一些实施方式中，互补性水平使得第一多核苷酸序列(例如，指导序列)能够以足够的亲和力与第二多核苷酸序列(如，靶序列)杂交，以允许与第一多核苷酸序列或包含第一多核苷酸序列的核酸复合的效应多肽(例如，napRNAn)或与所述效应多肽相关联(例如，融合)的功能结构域对靶序列或其互补序列(例如，靶RNA的序列或其互补序列)起作用(例如，切割、脱氨基)。在一些实施方式中，与靶序列基本上互补的指导序列与所述靶序列具有小于100％的互补性。在一些实施方式中，与靶序列基本上互补的指导序列与所述靶序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的互补性。

如本文所用，术语“序列同一性”与序列同源性相关。同源性比较可以通过眼睛，或者更通常地借助于容易获得的序列比较程序进行。这些可商购的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的同源性百分比(％)，并且也可以计算两个或更多个氨基酸或核酸序列共有的序列同一性。

序列同源性可以通过本领域已知的多种计算机程序中的任一种生成，例如BLAST或FASTA等。用于执行这样的比对的合适计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit包(美国威斯康星大学；Devereux等人,1984,Nucleic Acids Research[核酸研究]12:387)。可进行序列比较的其它软件的实施例包括，但不限于，BLAST包(参见Ausubel等人,1999同上-第18章)、FASTA(Atschul等人,1990,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA两者均可以用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人,1999同上,第7-58页至第7-60页)。可以在连续序列上计算序列同源性百分比(％)，即将一个序列与其他序列进行比对，并将一个序列中的每个氨基酸或核苷酸与其他序列中的相应氨基酸或核苷酸直接比较，一次一个残基。这被称为“无空位(ungapped)”比对。典型地，此类无空位比对仅在相对短数目的多个残基上进行。尽管这是十分简单和可靠的方法，但其没有考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失可以引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而当进行全局比对时可能导致％同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法被设计来产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失，从而不会不当地减损整体同源性或同一性得分。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性或同一性最大化来实现。然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋予“空位罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对-反映两个比较序列之间更高的相关性-可以获得比具有许多空位的序列比对更高的得分。典型地使用“亲和力空位成本(affine gapcost)”，其对空位的存在索取相对高的成本，而对空位中每一个后续的残基索取较小的罚分。这是最常用的空位评分系统。当然，高空位罚分可以产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许待修饰的空位罚分。然而，优选的是当使用这样的软件进行序列比较时使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit包时，用对于氨基酸序列的默认空位罚分为：空位-12，每个空位延伸-4。因此最大％同源性的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。一种称为BLAST 2序列的新工具，也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett.[FEMS微生物通讯]1999 174(2):247-50；FEMS MicrobiolLett.[FEMS微生物通讯]1999 177(1):187-8和美国国立卫生研究院网站上的国家生物技术信息中心网站)。尽管最终同源性％可以按照同一性来度量，但比对过程本身典型地不是基于全或无配对比较。相反，通常使用标度化相似性打分矩阵(scaled similarity scorematrix)，该矩阵基于化学相似性或进化距离对每一成对比较赋予分值。通常使用的这样的矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公用默认值或定制符号比较表(如果提供的话)(进一步的细节请参见用户手册)。对于一些应用，优选使用GCG软件包的公用默认值，或者在其他软件的情形中，使用默认矩阵，如BLOSUM62。可替代地，基于类似于CLUSTAL的算法，使用在DNASIS^TM(Hitachi软件)中的多重比对特征来计算同源性百分比(Higgins D G和Sharp P M(1988),Gene[基因]73(1),237-244)。一旦软件已经产生最佳比对就可以计算％同源性，优选％序列同一性。典型地，作为序列比较的一部分，软件进行此计算，并且生成数值结果。序列还可以具有产生沉默改变并产生功能上等价的物质的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可以基于氨基酸特性(如残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性质)的相似性来进行有意的氨基酸取代，并且因此将氨基酸以官能团分组在一起是有用的。氨基酸可以仅仅基于它们的侧链特性而分组在一起。然而，包括突变数据也会更有用。出于结构的原因，因此衍生的几组氨基酸可能是保守的。可以维恩图(Livingstone C.D.和Barton G.J.(1993)“Protein sequencealignments:a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation[蛋白质序列比对：用于分层分析残基保守性的策略]”Comput.Appl.Biosci.[生物科学中的计算机应用]9:745-756)(Taylor W.R.(1986)“The classification of amino acidconservation[氨基酸保守性分类]”J.Theor.Biol.[理论生物学杂志]119；205-218)的形式描述这些组。可以例如根据下表进行保守性取代，该表描述了普遍接受的氨基酸维恩图分组。

如本文所用，术语“多肽”和“肽”在本文中可互换地使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。蛋白可具有一种或多种多肽。所述术语还涵盖已修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如与标记组分缀合。

如本文所用，“变体”被解释为意指分别与参考多核苷酸或多肽不同但保留基本特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型变体在核酸序列上不同于另一参考多核苷酸。变体的核酸序列的变化可以改变或不改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下文的讨论，核苷酸变化可导致参考序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。多肽的典型变体在氨基酸序列上不同于另一参考多肽。通常，差异是有限的，因此参考多肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域中是相同的。变体和参考多肽在氨基酸序列上可以因任何组合的一个或多个取代、添加、缺失而不同。取代或插入的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或者它可以是已知不是天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术、通过直接合成和通过本领域技术人员已知的其他重组方法制备。

如本文所用，术语“上游”和“下游”是指核酸中单个核苷酸(例如，DNA)序列内的相对位置。通常，第一序列在第二序列“上游”意指所述第一序列在所述第二序列的5'，而第一序列在第二序列“下游”意指所述第一序列在所述第二序列的3'。

如本文所用，术语“野生型”具有本领域技术人员通常理解的含义，意指当它存在于自然界中时，将其与突变体或变体区分开的、典型形式的生物、菌株、基因或特征。它可以从自然界中的来源分离而未被有意修饰。

如本文所用，术语“非天然存在”和“工程化的”可互换地使用，是指人工参与。当这些术语用于描述核酸或多肽时，意指所述核酸或多肽至少基本上不含其在自然界中关联的或在自然界中发现的至少一种其他组分。

如本文所用，“细胞”理解为不仅指特定的单个细胞，而且指所述细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可在后代中由于突变或环境影响而发生，这样的子代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在术语范围内。

如本文所用，术语“体内”是指生物的体内，而术语“离体”或“体外”是指生物的体外。

如本文所用，术语“治疗(treat、treatment或treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本公开的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：减轻由疾病引起的一种或多种症状、减少疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的传播(例如，转移)、预防或延迟疾病的复发、降低疾病的复发率、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病进展、增加生活质量和/或延长存活。“治疗”还涵盖减少疾病(例如癌症)的病理结果。本公开的方法涵盖治疗的这些治疗方面中的任何一个或多个。

如本文所用，术语“疾病”包括术语“障碍”和“病症”，且不限于医学上明确定义的术语。

如本文所用，对“不是”值或参数的提及通常意指并描述“不同于”值或参数。例如，方法不是用于治疗X型癌症，意指该方法可以用于治疗不同于X型的癌症。

如本文所用，单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。

如本文所用，短语例如“A和/或B”中的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，短语例如“A、B和/或C”中的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方式中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

如本文所用，当术语“约”位于一系列数字之前时(例如，约1、2、3)，应当理解，该一系列数字中的每一个都由术语“约”修饰(即，约1、约2、约3)。本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。

应当理解，本文所述的本公开的实施方式包括“由实施方式组成”和/或“基本上由实施方式组成”。

还需注意的是，权利要求书可以经撰写而排除任何任选的要素。因此，该陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。

附图说明

通过参考下面的详细描述和附图，将获得对本公开的某些特征和优点的理解，下面的详细描述阐述了说明性实施方式，其中可以利用本公开的原理，并且在这些附图中：

图1显示了以条带表示的SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽的预测3D结构(通过I-TASSER)的视图。两个HEPN结构域的RXXXXH基序是催化位点。

图2是用于检测Cas13f突变体的切割和旁切活性的示例性单质粒哺乳动物双荧光报告系统的示意图。

图3显示了经选择用于诱变的SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽的HEPN1、HEPN2、IDL和Hel1-3结构域的20个区段，其中每个区段跨越9或17个氨基酸。

图4是用于检测Cas13f突变体的切割和旁切活性的示例性两质粒哺乳动物双荧光报告系统的示意图。

图5显示了hfCas13f的功能性结构域结构。与SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽相比，以红色标记的四个氨基酸突变是hfCas13f的突变。

图6是用于检测Cas13f突变体的切割活性的示例性两质粒哺乳动物双荧光报告系统的示意图。

图7是显示示例性dsDNA、从dsDNA转录的示例性RNA转录物、示例性指导核酸和示例性Cas13的示意图，其中指导序列与靶序列反向互补。

图8是显示示例性dsDNA、从dsDNA转录的示例性RNA转录物、示例性指导核酸和示例性Cas13的示意图，其中指导序列与靶序列反向互补并且含有与该靶序列的错配。

本文的附图仅是出于说明目的，并且不一定按比例绘制。

具体实施方式

概述

本公开提供了所希望的具有高切割活性和/或低旁切活性的工程化Cas13f多肽及其用途。

存在2类VI型CRISPR-相关(Cas)蛋白的几种亚型，包括至少VI-A(Cas13a/C2c2)、VI-B(Cas13b1和Cas13b2)、VI-C(Cas13c)、VI-D(Cas13d、CasRx)、VI-E(Cas13e)和VI-F(Cas13f)亚型。Cas13亚型通常共享非常低的序列同一性/相似性，但基于两个保守的HEPN样RNA酶结构域的存在，可以全部分类为2类VI型Cas蛋白(例如，本文通常称为“Cas13”)。Cas13为基因疗法敲低靶基因产物(例如，mRNA)提供了巨大的机会，但另一方面，这种使用可能受到其切割活性和/或所谓的旁切活性的限制，这会带来显著的细胞毒性风险。

对于后者，在2类VI型系统中，在靶RNA结合后，Cas13中的高等真核生物和原核生物核苷酸结合(HEPN)结构域赋予指导序列非特异性(非依赖性)RNA切割，称为“旁切活性”。与结合的gRNA互补的同源靶RNA的结合导致Cas13发生实质性的构象变化，从而导致形成单一的复合催化位点，用于指导序列非特异性“旁切”RNA切割，从而将Cas13转化为指导序列非特异性RNA核酸酶。这个新形成的高度可及的活性位点不仅会以顺式降解靶RNA(如果所述靶RNA足够长，能够到达这个新的活性位点)，而且还会基于这种混杂的RNA酶活性以反式降解非靶RNA。大多数RNA似乎容易受到Cas13这种混杂的RNase酶活性的影响，并且大多数(如果不是全部)Cas13具有这种旁切活性。最近已证明，Cas13介导的敲低带来的旁切效应存在于哺乳动物细胞和动物中，这表明Cas13介导的靶RNA敲低的临床应用在这种旁切效应存在的情况下将面临重大挑战。

Cas13f已被鉴定为一种分子量很小的Cas13亚型，使得它特别适合于例如通过rAAV颗粒递送。为了在基因疗法中利用其递送优势，期望基本上保持或提高其切割活性和/或基本上降低或消除其旁切活性，以防止不必要的自发性细胞毒性。使用本公开的报告系统，发现已经通过诱变开发了Cas13f突变体，以实现切割活性和旁切活性的至少一方面，甚至两方面的改进。

在一些实施方式中，本公开的野生型Cas13f多肽可以是：(i)本公开的SEQ ID NO:1(Cas13f.1)、PCT/CN2020/077211的SEQ ID NO:2-7(分别为Cas13f.2、Cas13f.3、Cas13f.4和Cas13f.5)中的任何一个、或PCT/CN2022/101884的SEQ ID NO:9-10(分别为Cas13f.6和Cas13f.7)中的任何一个，如本公开的SEQ ID NO:1；(ii)本公开的SEQ ID NO:1(Cas13f.1)的天然存在的直系同源物、旁系同源物、同源物，PCT/CN2020/077211的SEQ ID NO:2-7(分别为Cas13f.2、Cas13f.3、Cas13f.4和Cas13f.5)中的任何一个的天然存在的直系同源物、旁系同源物、同源物，或PCT/CN2022/101884的SEQ ID NO:9-10(分别为Cas13f.6和Cas13f.7)中的任何一个的天然存在的直系同源物、旁系同源物、同源物；或(iii)与本公开的SEQ ID NO:1(Cas13f.1)中的任何一个、PCT/CN2020/077211的SEQ ID NO:2-7(分别为Cas13f.2、Cas13f.3、Cas13f.4和Cas13f.5)中的任何一个、PCT/CN2022/101884的SEQ IDNO:9-10(分别为Cas13f.6和Cas13f.7)中的任何一个、或上述任何一个天然存在的直系同源物、旁系同源物或同源物相比，具有至少约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的野生型Cas13多肽。

代表性工程化Cas13f多肽

在一方面，本公开提供工程化Cas13f多肽，其中所述工程化Cas13f多肽：

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，具有至少约70％(例如，至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％)的间隔序列特异性切割活性。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，具有最多约120％(例如，最多约120％、115％、110％、105％、100％、95％、90％、85％、80％、75％或70％)的间隔序列非依赖性旁切活性。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽(1)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，具有至少约75％的间隔序列特异性切割活性，以及(2)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，具有最多约90％的间隔序列非依赖性旁切活性。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽(1)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，具有至少约100％的间隔序列特异性切割活性，以及(2)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，具有最多约90％的间隔序列非依赖性旁切活性。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽(1)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，具有至少约130％的间隔序列特异性切割活性，以及(2)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，具有最多约110％的间隔序列非依赖性旁切活性。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽(1)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，具有至少约130％的间隔序列特异性切割活性，以及(2)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，具有最多约100％的间隔序列非依赖性旁切活性。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽(1)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，具有至少约130％的间隔序列特异性切割活性，以及(2)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，具有最多约90％的间隔序列非依赖性旁切活性。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的以下位置的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代：160、161、183、189、200、202、204、205、213、214、222、233、239、240、241、258、259、276、282、283、298、299、300、314、320、329、338、339、345、353、361、383、410、433、451、455、497、508、509、518、520、526、574、595、598、599、601、631、634、638、641、642、647、667、670、762、763及其组合。

在一些实施方式中，所述氨基酸取代是用非极性氨基酸残基(如甘氨酸(Gly/G)、丙氨酸(Ala/A)、缬氨酸(Val/V)、半胱氨酸(Cys/C)、脯氨酸(Pro/P)、亮氨酸(Leu/L)、异亮氨酸(Ile/I)、蛋氨酸(Met/M)、色氨酸(Trp/W)、苯丙氨酸(Phe/F)，或带正电荷的氨基酸残基(如赖氨酸(Lys/K)、精氨酸(Arg/R)、组氨酸(His/H))进行的取代。

在一些实施方式中，所述氨基酸取代是用精氨酸(Arg/R)残基取代非精氨酸(Arg/R)残基。

在一些实施方式中，所述氨基酸取代是用丙氨酸(Ala/A)残基取代非丙氨酸(Ala/A)残基。

在一些实施方式中，所述氨基酸取代是用缬氨酸(Val/V)残基取代丙氨酸(Ala/A)残基。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的以下位置的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代：160、161、631、634、638、641、642、647、667、670、762、763及其组合。

在一些实施方式中，所述氨基酸取代是用丙氨酸(Ala/A)残基取代非丙氨酸(Ala/A)残基或用缬氨酸(Val/V)残基取代丙氨酸(Ala/A)残基。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置D160、H638、D642及其组合的位置的一个或多个位置处用丙氨酸(Ala/A)残基进行的氨基酸取代。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸序列的以下位置的一个或多个位置处用丙氨酸(Ala/A)残基进行的氨基酸取代：

1)位置D160、

2)位置H638、

3)位置D642、

4)位置D160和H638、

5)位置D160和D642、

6)位置H638和D642、或

7)位置D160和L631。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的位置D160、D642、Y666和Y677的位置处用丙氨酸(Ala/A)残基进行的四重氨基酸取代。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的以下位置的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代：183、189、200、202、204、205、213、214、222、233、239、240、241、258、259、276、282、283、298、299、300、314、320、329、338、339、345、353、361、383、410、433、451、455、497、508、509、518、520、526、574、595、598、599、601及其组合。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比具有增加的间隔序列特异性切割活性。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比，具有至少约105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％的间隔序列特异性切割活性。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置G282、F314、Y338、E410、Q520、L526、F598及其组合的位置的一个或多个位置处用精氨酸(Arg/R)残基进行的氨基酸取代。

指导核酸

本公开的工程化Cas13f多肽可与指导核酸组合使用并由指导核酸引导至靶RNA，以在靶RNA上发挥作用。

在另一方面，本公开提供指导核酸，所述指导核酸包含：

(1)能够与本公开的工程化Cas13f多肽形成复合物的DR序列，以及

(2)能够与靶RNA杂交，由此将所述复合物引导至所述靶RNA的间隔序列。

在一些实施方式中，所述间隔序列能够与所述靶RNA的靶序列杂交。

在一些实施方式中，所述指导核酸是RNA。在一些实施方式中，所述指导核酸包含crRNA。在一些实施方式中，所述指导核酸不包含tracrRNA。

指导核酸的结构

在一些实施方式中，所述指导核酸包含在所述间隔序列5’或3’的DR序列。在一些实施方式中，所述指导核酸包含在所述间隔序列3’的DR序列。在一些实施方式中，所述DR序列在没有接头的情况下与间隔序列融合。

在一些实施方式中，所述指导核酸从5’至3’包含一个间隔序列和一个DR序列。

在一些实施方式中，所述指导核酸从5’至3’包含一个DR序列、一个间隔序列和一个DR序列，其中这些DR序列相同或不同。

在一些实施方式中，所述指导核酸从5’至3’包含一个DR序列、一个间隔序列、一个DR序列和一个间隔序列，其中这些DR序列相同或不同，并且其中这些间隔序列相同或不同。

在一些实施方式中，所述指导核酸从5’至3’包含一个DR序列、一个间隔序列、一个DR序列、一个间隔序列和一个DR序列，其中这些DR序列相同或不同，并且其中这些间隔序列相同或不同。

在一些实施方式中，所述指导核酸从5’至3’包含一个DR序列、一个间隔序列、一个DR序列、一个间隔序列、一个DR序列和一个间隔序列，其中这些DR序列相同或不同，并且其中这些间隔序列相同或不同。

靶RNA

所述靶RNA可以是任何感兴趣的RNA分子，包括天然存在的和工程化的RNA分子。所述靶RNA可以是mRNA、tRNA、核糖体RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、非编码RNA、长非编码(lnc)RNA、核RNA、干扰RNA(iRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核酶、核糖开关、卫星RNA、微开关、微酶(microzyme)或病毒RNA。在一些实施方式中，所述靶RNA是真核RNA。在一些实施方式中，所述靶RNA由真核DNA编码。在一些实施方式中，所述真核DNA是哺乳动物DNA，如非人哺乳动物DNA、非人灵长类动物DNA、人DNA、植物DNA、昆虫DNA、鸟DNA、爬行动物DNA、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)DNA、鱼DNA、线虫DNA、或酵母DNA。

在一些实施方式中，所述靶RNA与疾病(例如，感染性疾病、遗传疾病、或癌症)相关。因此，在一些实施方式中，本公开的系统可用于通过靶向所述靶RNA来治疗疾病。例如，与疾病相关的靶RNA可以是在患病细胞(例如，癌细胞或肿瘤细胞)中过表达的RNA。所述靶RNA也可以是毒性RNA和/或突变的RNA(例如，具有剪接缺陷或突变的mRNA分子)。所述靶RNA还可以是对特定微生物(例如，致病性细菌)具有特异性的RNA。

靶序列

在一些实施方式中，所述靶序列的长度为至少约14个核苷酸，例如长度为约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或更多个核苷酸，或者长度在任何两个前述值之间的数值范围，例如，长度为约16至约50个核苷酸。在一些实施方式中，所述靶序列的长度为约30个核苷酸。

在一些实施方式中，所述靶序列包含靶RNA的至少约14个连续核苷酸(例如，靶RNA的约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或更多个连续核苷酸，或者在任何两个前述值之间的数值范围，例如，靶RNA的约14至约50个连续核苷酸)、基本上由其组成或由其组成。在一些实施方式中，所述靶序列包含靶RNA的约30个连续核苷酸、基本上由其组成或由其组成。

间隔序列

间隔序列被设计为能够与所述靶RNA杂交，更特别地，能够与所述靶RNA的靶序列杂交。为此目的，所述间隔序列的一级序列被设计为与所述靶序列的一级序列互补。假如所述间隔序列和所述靶序列之间的互补性足以使所述间隔序列与所述靶序列发生杂交，并且所述杂交足够稳定以通过杂交将所述工程化Cas13f多肽引导到所述指导RNA，则可以不需要100％的互补性。

在一些实施方式中，所述间隔序列与所述靶序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(完全)、任选地约100％(完全)互补；或其中所述间隔序列在所述间隔序列的5’端处的前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个核苷酸中不包含与所述靶序列的错配。通常认为，对于本公开的napRNAn(例如，Cas13)，可以容忍所述间隔序列和所述靶序列之间的至少2个错配，而不显著降低切割活性。在一些实施方式中，所述间隔序列与所述靶序列是100％(完全)互补。

典型地，所述间隔序列具有与所述靶序列相同的长度。在一些实施方式中，所述间隔序列的长度为至少约14个核苷酸，例如长度约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或更多个核苷酸，或者长度在任何两个前述值之间的数值范围，例如，长度为约16至约50个核苷酸。在一些实施方式中，所述间隔序列的长度为约30个核苷酸。

DR序列

出于本公开的目的，所述DR序列与本公开的工程化Cas13f多肽相容，并且能够与所述工程化Cas13f多肽复合。所述DR序列可以是与所述工程化Cas13f多肽一起鉴定的天然存在的DR序列，或其保持与所述工程化Cas13f多肽复合的能力的变体。通常，只要所述变体的二级结构与所述天然存在的DR序列的二级结构基本相同，就保持了与所述工程化Cas13f多肽复合的能力。所述DR序列的一级序列中的核苷酸缺失、插入或取代可能不一定会改变所述DR序列的二级结构(例如，所述DR序列的茎、凸起和环的相对位置和/或大小不显著偏离原始茎、凸起或环的相对位置和/或大小)。例如，所述核苷酸缺失、插入或取代可以在所述DR序列的凸起或环区中，使得所述凸起的总体对称性以及由此的二级结构大致保持相同。所述核苷酸缺失、插入或取代也可以在所述DR序列的茎中，使得所述茎的长度不显著偏离原始茎的长度(例如，在两个茎的每一个中添加或缺失一个碱基对对应于总共4个碱基变化)。

在一些实施方式中，所述DR序列具有与SEQ ID NO:2的DR序列的二级结构基本上相同的二级结构。

在一些实施方式中，所述DR序列包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列，或与SEQ ID NO:2的序列相比，具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸差异的序列(无论是否连续)、基本上由其组成或由其组成。

在一些实施方式中，所述DR序列包含SEQ ID NO:2的序列。

指导核酸的修饰

在一些实施方式中，所述指导核酸包含修饰。在一些实施方式中，所述指导核酸是未经修饰的RNA或经修饰的RNA。在一些实施方式中，所述指导核酸是含有经修饰的核糖核苷酸的经修饰的RNA。在一些实施方式中，所述指导核酸是含有脱氧核糖核苷酸的经修饰的RNA。在一些实施方式中，所述指导核酸是含有经修饰的脱氧核糖核苷酸的经修饰的RNA。在一些实施方式中，所述指导核酸包含经修饰的或未经修饰的脱氧核糖核苷酸以及经修饰的或未经修饰的核糖核苷酸。

化学修饰可以应用于所述指导核酸的磷酸骨架、糖和/或碱基。骨架修饰(如硫代磷酸酯)修饰磷酸骨架上的电荷并有助于寡核苷酸的递送和核酸酶抗性(参见例如，Eckstein,“Phosphorothioates,essential components of therapeuticoligonucleotides[硫代磷酸酯：治疗性寡核苷酸的必要组分],”Nucl.Acid Ther.[核酸疗法],24,第374-387页,2014)；糖的修饰(如2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-F和锁核酸(LNA))增强碱基配对和核酸酶抗性两者(参见例如，Allerson等人“Fully 2’-modifiedoligonucleotide duplexes with improved in vitro potency and stabilitycompared to unmodified small interfering RNA[与未经修饰的小干扰RNA相比，完全2'修饰的寡核苷酸双链体具有改善的体外效力和稳定性]”,J.Med.Chem.[药物化学杂志]48.4:901-904,2005)。化学修饰的碱基(如2-硫代尿苷或N6-甲基腺苷等)可允许更强或更弱的碱基配对(参见例如，Bramsen等人,“Development of therapeutic-grade smallinterfering RNAs by chemical engineering[通过化学工程开发治疗级小干扰RNA]”,Front.Genet.[遗传学前沿],2012年8月20日；3:154)。另外，所述指导核酸适于5’端和3’端两者与多种功能性部分(包括荧光染料、聚乙二醇或蛋白)缀合。

可以对化学合成的指导核酸应用多种修饰。例如，用2'-OMe修饰指导核酸以改善核酸酶抗性可以改变沃森-克里克碱基配对的结合能。此外，2'-OMe修饰可以影响指导核酸与转染试剂、蛋白或细胞中任何其他分子相互作用的方式。这些修饰的效果可以通过经验测试来确定。

指导核酸化学修饰的实施例包括但不限于在一个或多个末端核苷酸处掺入2'-O-甲基(M)、2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯(MS)、或2'-O-甲基3'-硫基PACE(MSP)。与未经修饰的指导核酸相比，这样的化学修饰的指导核酸可以具有增加的稳定性和/或增加的活性，尽管中靶相对于脱靶特异性是不可预测的。参见Hendel,Nat Biotechnol.[自然生物技术]33(9):985-9,2015，将所述文献通过引用并入。化学修饰的指导核酸可进一步包含但不限于具有硫代磷酸酯键和锁核酸(LNA)核苷酸的核酸，所述锁核酸(LNA)核苷酸包含在核糖环的2'与4'碳之间的亚甲基桥。

在一些实施方式中，所述指导核酸包含一个或多个硫代磷酸酯修饰。在一些实施方式中，所述指导核酸包含用于增强碱基配对和/或增加核酸酶抗性目的的一个或多个锁核酸核苷酸。

这些化学修饰的汇总可见于例如Kelley等人,“Versatility of chemicallysynthesized guide RNAs for CRISPR-Cas9 genome editing[用于CRISPR-Cas9基因组编辑的化学合成的指导RNA的多功能性],”J.Biotechnol.[生物技术杂志]233:74-83,2016；WO 2016205764；和美国专利号8,795,965B2中；将所述文献通过引用以其全文并入。

多核苷酸

在又另一方面，本公开提供多核苷酸，所述多核苷酸编码本公开的工程化Cas13f多肽。

在一些实施方式中，所述多核苷酸经密码子优化以在真核生物、哺乳动物如非人哺乳动物、非人灵长类动物、人、植物、昆虫、鸟、爬行动物、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)、鱼、线虫或酵母中表达。

在一些实施方式中，所述多核苷酸是合成多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸是DNA。在一些实施方式中，所述多核苷酸是RNA(例如，编码所述工程化Cas13f多肽的mRNA)。在一些实施方式中，将所述mRNA加帽、聚腺苷酸化、用5-甲基胞苷取代、用假尿苷取代、或其组合。

CRISPR-Cas13f系统

在一些实施方式中，所述系统是包含与所述指导核酸复合的工程化Cas13f多肽的复合物。在一些实施方式中，所述复合物进一步包含与所述靶序列杂交的靶RNA。

本公开的系统可以包含一种指导核酸或多于一种核酸，例如，出于提高对靶RNA的切割效率的目的。

在一些实施方式中，所述系统进一步包含第二指导核酸，所述第二指导核酸包含：

(1)能够与napRNAn形成复合物的DR序列或所述DR序列，以及

(2)能够与靶RNA的第二靶序列杂交，由此将所述复合物引导至所述靶RNA的第二间隔序列。

在一些实施方式中，所述系统进一步包含第三指导核酸，所述第三指导核酸包含：

(1)能够与napRNAn形成复合物的DR序列或所述DR序列，以及

(2)能够与靶RNA的第三靶序列杂交，由此将所述复合物引导至所述靶RNA的第三间隔序列。

在一些实施方式中，所述系统进一步包含第四指导核酸，所述第四指导核酸包含：

(1)能够与napRNAn形成复合物的DR序列或所述DR序列，以及

(2)能够与靶RNA的第四靶序列杂交，由此将所述复合物引导至所述靶RNA的第四间隔序列。

在一些实施方式中，所述系统进一步包含第五指导核酸、第六指导核酸、第七指导核酸等。

在一些实施方式中，所述多于一种的指导核酸的DR序列可以相同或稍有不同(例如，相差不超过5、4、3、2或1个核苷酸)，以与所述工程化Cas13f多肽相容。

所述多种指导核酸的指导序列可以相同以提高对同一靶RNA的切割活性，或者不同以一次性靶向不同靶RNA。

工程化Cas13f多肽的调控

在一些实施方式中，编码本公开的工程化Cas13f多肽的多核苷酸(例如，DNA)与调节元件(例如，启动子)可操作地连接以控制所述多核苷酸的表达。

在一些实施方式中，启动子是广谱启动子、组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子、组成型启动子或诱导型启动子。

合适的启动子是本领域已知的并且包括例如Cbh启动子、Cba启动子、pol I启动子、pol II启动子、pol III启动子、T7启动子、U6启动子、H1启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、延伸因子1α短(EFS)启动子、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即早期(Ie)增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或其衍生物如CAG启动子、CB启动子、(人)延伸因子1α-亚基(EF1α)启动子、泛素C(UBC)启动子、朊病毒启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、血小板衍生生长因子(PDGF)启动子、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)启动子、突触蛋白(Syn)启动子、突触蛋白1(Syn1)启动子、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)启动子、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、β-珠蛋白小基因nβ2启动子、前脑啡肽原(PPE)启动子、脑啡肽(Enk)启动子、兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子、HTT启动子、GRK1启动子、CRX启动子、NRL启动子、和RCVRN启动子。

在一些实施方式中，所述多核苷酸进一步包含在编码所述工程化Cas13多肽的序列的5’的第一核定位序列(例如，SV40 NLS、bpSV40 NLS、npNLS)或核输出信号(NES)的第一编码序列、和/或在编码所述工程化Cas13多肽的序列的3’的第二NLS(例如，SV40 NLS、bpSV40 NLS、npNLS)或NES的第二编码序列。

指导核酸的调控

在一些实施方式中，编码所述指导核酸的多核苷酸(例如，DNA)与调节元件(例如，启动子)可操作地连接以控制所述多核苷酸的表达。

合适的启动子是本领域已知的并且包括例如Cbh启动子、Cba启动子、pol I启动子、pol II启动子、pol III启动子、T7启动子、U6启动子、H1启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、延伸因子1α短(EFS)启动子、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即早(Ie)增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或其衍生物如CAG启动子、CB启动子、(人)延伸因子1α-亚基(EF1α)启动子、泛素C(UBC)启动子、朊病毒启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、血小板衍生生长因子(PDGF)启动子、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)启动子、突触蛋白(Syn)启动子、突触蛋白1(Syn1)启动子、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)启动子、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、β-珠蛋白小基因nβ2启动子、前脑啡肽原(PPE)启动子、脑啡肽(Enk)启动子、兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、和髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子。在一些实施方式中，所述启动子是U6启动子。

使用方法

包含本公开的工程化Cas13f多肽的本公开的CRISPR-Cas13f系统具有多种类似那些野生型CRISPR-Cas13系统的效用，包括在多种细胞类型中修饰(例如，切割、缺失、插入、易位、灭活或激活)靶RNA。所述CRISPR-Cas13f系统具有广泛的应用，例如，药物筛选、疾病诊断和预后、以及治疗各种遗传障碍，所述应用需要高切割活性和低旁切活性。

在又另一方面，本公开提供在有需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的CRISPR-Cas13f系统或本公开的rAAV颗粒，其中所述疾病与靶RNA关联，其中所述CRISPR-Cas13f系统修饰所述靶RNA，并且其中对所述靶RNA的修饰治疗所述疾病。

在一些实施方式中，所述靶RNA是mRNA、tRNA、核糖体RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、非编码RNA、长非编码(lnc)RNA、核RNA、干扰RNA(iRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核酶、核糖开关、卫星RNA、微开关、微酶或病毒RNA。

在一些实施方式中，所述靶RNA由真核DNA编码。

在一些实施方式中，所述真核DNA是哺乳动物DNA，如非人哺乳动物DNA、非人灵长类动物DNA、人DNA、植物DNA、昆虫DNA、鸟DNA、爬行动物DNA、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)DNA、鱼DNA、线虫DNA、或酵母DNA。

本公开的CRISPR-Cas13f系统可以具有各种治疗性应用。这样的应用可以基于归因于所述工程化Cas13f多肽的高切割活性的以下一种或多种体外和体内能力：切割或降解靶RNA、减少或增加转录、减少或增加翻译、抑制或激活表达、诱导或抑制细胞衰老、诱导或抑制细胞周期停滞、诱导或抑制细胞生长和/或增殖、诱导或抑制细胞凋亡、诱导或抑制坏死等。

在一些实施方式中，所述CRISPR-Cas13f系统可用于治疗各种疾病，例如，遗传障碍(例如，单基因疾病)、可通过RNA核酸酶活性(例如，Pcsk9靶向、杜氏肌营养不良(DMD)靶向、BCL11a靶向)治疗的疾病、以及多种癌症等。

在一个方面，所述CRISPR-Cas13f系统可用于治疗由RNA、毒性RNA和/或突变RNA(例如，剪接缺陷或截短)的过表达引起的疾病。例如，毒性RNA的表达可以与核包涵体的形成以及脑、心脏或骨骼肌的迟发型退行性变化相关。例如，在一些实施方式中，所述疾病是强直性肌营养不良。在强直性肌营养不良中，所述毒性RNA的主要致病作用是隔离(sequester)结合蛋白并损害可变剪接的调节(参见例如，Osborne等人,“RNA-dominantdiseases[RNA显性疾病],”Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学],2009年4月15日；18(8):1471-81)。遗传学家对强直性肌营养不良(营养不良性肌强直(DM))特别感兴趣，因为它产生极其广泛的临床特征。DM的经典形式(现在称为1型DM(DM1))由编码细胞溶质蛋白激酶的基因DMPK的3'-非翻译区(UTR)中CTG重复序列的扩增引起。如本文所述的CRISPR系统可以靶向过表达的RNA或毒性RNA，例如DMPK基因或DM1骨骼肌、心脏或脑中的任一错误调节的可变剪接。

CRISPR-Cas13f系统还可以靶向影响RNA依赖性功能的反式作用突变，所述突变导致多种疾病，例如像普拉德-威利综合征(Prader Willi syndrome)、脊髓性肌萎缩(SMA)和先天性角化不良。可以使用CRISPR-Cas13f系统治疗的疾病列表汇总于Cooper等人,“RNAand disease[RNA和疾病],”Cell[细胞],136.4(2009):777-793和WO 2016/205764A1中，将所述两个文献通过引用以全文并入本文。本领域的技术人员将理解如何使用CRISPR-Cas13f系统治疗这些疾病。

CRISPR-Cas13f系统还可用于治疗各种tau蛋白病，包括例如原发性和继发性tau蛋白病，如原发性年龄相关性tau蛋白病(PART)/神经原纤维缠结(NFT)优势型老年性痴呆(其中NFT类似于在阿尔茨海默病(AD)中见到的那些，但没有斑块)、拳击性痴呆(慢性创伤性脑病)和进行性核上性麻痹。tau蛋白病的可用列表和治疗这些疾病的方法描述于例如WO2016205764中，将所述文献通过引用以其全文并入本文。

CRISPR-Cas13f系统还可用于靶向破坏顺式作用剪接代码的突变，所述突变可导致剪接缺陷和疾病。这些疾病包括例如，由SMN1基因的缺失导致的运动神经元退行性疾病(例如，脊髓性肌萎缩)、杜氏肌营养不良(DMD)、17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、以及囊性纤维化。

CRISPR-Cas13f系统还可用于抗病毒活性，特别是抗RNA病毒。例如，所述CRISPR-Cas13f系统可以用靶向与所述RNA病毒相关的RNA分子的指导核酸编程，以防止所述RNA病毒的繁殖和/或使所述RNA病毒的活性灭活。

所述CRISPR-Cas13f系统还可用于在受试者(例如，人受试者)中治疗癌症。例如，所述CRISPR-Cas13f系统可以用靶向RNA分子的指导核酸编程，所述RNA分子是异常的(例如，包含点突变或者经可变剪接)并见于癌细胞中，以诱导癌细胞的细胞死亡(例如，经由细胞凋亡)。

所述CRISPR-Cas13f系统还可用于在受试者(例如，人受试者)中治疗自身免疫疾病或障碍。例如，所述CRISPR-Cas13f系统可以用靶向RNA分子的指导核酸编程，所述RNA分子是异常的(例如，包含点突变或者经可变剪接)并见于导致自身免疫疾病或障碍的细胞中。

所述CRISPR-Cas13f系统还可用于在受试者中治疗感染性疾病。例如，所述CRISPR-Cas13f系统可以用靶向RNA分子的指导核酸编程，所述RNA分子由感染原(例如，细菌、病毒、寄生物或原生动物)表达，以靶向并诱导含感染原细胞中的细胞死亡。所述CRISPR-Cas13f系统还可用于治疗细胞内感染原感染宿主受试者细胞的疾病。通过对所述CRISPR-Cas13f系统进行编程以靶向由感染原基因编码的RNA分子，可以靶向受感染原感染的细胞并诱导细胞死亡。

本文描述的CRISPR-Cas13系统的治疗性应用的详细描述可见于例如美国专利号8,795,965、EP 3009511、WO 2016205764和WO 2017070605中；将各个文献通过引用以其全文并入本文。

在一些实施方式中，所述靶RNA是与眼睛疾病或障碍相关的靶基因的转录物(例如，mRNA)。

在一些实施方式中，所述眼睛疾病或障碍是阿米巴角膜炎、真菌性角膜炎、细菌性角膜炎、病毒性角膜炎、盘尾丝虫性角膜炎、角膜结膜炎、细菌性角膜结膜炎、病毒性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎、角膜营养不良性疾病、富克斯内皮营养不良、干燥综合征、史-约综合征、自身免疫性干眼病、环境性干眼病、角膜新生血管形成疾病、角膜移植后排斥反应的预防和治疗、自身免疫性葡萄膜炎、感染性葡萄膜炎、非感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎、后葡萄膜炎(包括弓形虫病)、泛葡萄膜炎、玻璃体或视网膜的炎性疾病、眼内炎的预防和治疗、黄斑水肿、黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、干性年龄相关性黄斑变性(干性AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、过敏性结膜炎、增殖性和非增殖性糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变、视网膜的自身免疫疾病、原发性和转移性眼内黑素瘤、其他眼内转移性肿瘤、开角型青光眼、斯特格氏病、眼底黄色斑点症、闭角型青光眼、色素性青光眼、视网膜色素变性(RP)、莱伯氏先天性黑矇(LCA)、厄舍综合征、无脉络膜、视杆-视锥细胞或视锥-视杆细胞营养不良、纤毛病、线粒体障碍、进行性视网膜萎缩、退行性视网膜疾病、地图状萎缩、家族性或获得性黄斑病变、视网膜光感受器疾病、基于视网膜色素上皮的疾病、黄斑囊样水肿、视网膜脱离、外伤性视网膜损伤、医源性视网膜损伤、黄斑裂孔、黄斑毛细血管扩张、神经节细胞疾病、视神经细胞疾病、视神经病变、缺血性视网膜疾病、早产儿视网膜病变、视网膜血管阻塞、家族性大动脉瘤、视网膜血管疾病、眼血管疾病、血管疾病、缺血性视神经病变疾病、糖尿病性视网膜水肿、由视网膜下新生血管形成引起的老年性黄斑变性、近视性视网膜病变、视网膜缺血、脉络膜血管功能不全、脉络膜血栓形成和由颈动脉缺血引起的新生血管性视网膜病变、角膜新生血管形成、伴有渗出性或炎性组分的角膜疾病或混浊、弥漫性板层角膜炎、由于眼睛穿透伤或挫伤性眼损伤导致的新生血管形成、红斑虹膜炎、富克斯异色性虹膜睫状体炎、慢性葡萄膜炎、前葡萄膜炎、由手术如LASIK、LASEK、屈光手术、IOL植入引起的炎性病症；作为白内障手术并发症的不可逆角膜水肿、损伤或外伤引起的水肿、炎症、感染性和非感染性结膜炎、虹膜睫状体炎、虹膜炎、巩膜炎、巩膜外层炎、浅表点状角膜炎、圆锥角膜、后部多形性营养不良、富克斯营养不良、无晶状体性和假晶状体性大泡性角膜病变、角膜水肿、巩膜疾病、眼瘢痕性类天疱疮、睫状体扁平部炎、青光眼睫状体炎综合征、白塞病、福格特-小柳-原田综合征、超敏性反应、眼表障碍、结膜水肿、弓形虫病脉络膜视网膜炎、眼眶炎性假瘤、球结膜水肿、结膜静脉充血、眶周蜂窝组织炎、急性泪囊炎、非特异性血管炎、结节病、巨细胞病毒感染、及其组合。

在一些实施方式中，所述靶基因选自血管内皮生长因子A(VEGFA)、补体因子H(CFH)、年龄相关性黄斑病变易感因子2(ARMS2)、HtrA丝氨酸肽酶1(HTRA1)、ATP结合盒亚家族A成员4(ABCA4)、外周蛋白2(PRPH2)、腓骨蛋白-5(FBLN5)、ERCC切除修复6染色质重塑因子(ERCC6)、视网膜和前神经折叠同源框2(RAX2)、补体C3(C3)、Toll样受体4(TLR4)、胱抑素C(CST3)、CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)、补体因子I(CFI)、补体C2(C2)、补体因子B(CFB)、补体C9(C9)、线粒体编码的TRNA亮氨酸1(UUA/G)(MT-TL-1)、补体因子H相关蛋白1(CFHR1)、补体因子H相关蛋白3(CFHR3)、睫状神经营养因子(CNTF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、视杆细胞衍生的视锥细胞活力因子(RdCVF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、肌球蛋白VIIA(MYO7A)；中心体蛋白290(CEP290)、钙粘蛋白相关蛋白23(CDH23)、闭眼同源物(EYS)、Usherin蛋白(USH2A)、粘附G蛋白偶联受体V1(ADGRV1)、ALMS1中心体和基底体相关蛋白(ALMS1)、类视黄醇异构水解酶65kDa(RPE65)、芳基-烃相互作用蛋白样1(AIPL1)、鸟苷酸环化酶2D、视网膜(GUCY2D)、莱伯氏先天性黑矇5蛋白(LCA5)、视锥-视杆细胞同源框(CRX)、Clarin蛋白(CLRN1)、ATP结合盒亚家族A成员4(ABCA4)、视黄醇脱氢酶12(RDH12)、肌苷一磷酸脱氢酶1(IMPDH1)、碎屑细胞极性复合物组分1(CRB1)、卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)、烟酰胺核苷酸腺苷酰基转移酶1(NMNAT1)、TUB样蛋白1(TULP1)、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、色素性视网膜炎GTP酶调节剂(RPGR)、ARL3 GTP酶的RP2激活剂(RP2)、X连锁色素性视网膜炎GTP酶调节剂相互作用蛋白1(RPGRIP)、环状核苷酸门控通道亚基α3(CNGA3)、环状核苷酸门控通道亚基β3(CNGB3)、G蛋白亚基α转导素2(GNAT2)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、促红细胞生成素(EPO)、BCL2细胞凋亡调节剂(BCL2)、BCL2样1(BCL2L1)、核因子κB(NFκB)、内皮抑素、血管抑素、fms样酪氨酸激酶受体(sFlt)、色素分散因子受体(Pdfr)、白细胞介素10(IL10)、可溶性白细胞介素17(sIL17R)、白细胞介素1受体拮抗剂(IL1-ra)、TNF受体超家族成员1A(TNFRSF1A)、TNF受体超家族成员1B(TNFRSF1B)、和白细胞介素4(IL4)。

在一些实施方式中，所述靶RNA是与神经退行性疾病或障碍相关的靶基因的转录物(例如，mRNA)。

在一些实施方式中，所述神经退行性疾病或障碍是酒精中毒、亚历山大病、阿尔珀斯病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、共济失调毛细血管扩张症、神经元蜡样质脂褐质沉积症、巴滕病、牛海绵状脑病(BSE)、海绵状白质脑病、脑性瘫痪、科凯恩综合征、皮质基底节变性、克罗伊茨费尔特-雅各布病、额颞叶变性、亨廷顿病、HIV相关性痴呆、肯尼迪病、路易体痴呆、神经疏螺旋体病、原发性年龄相关性tau蛋白病(PART)/神经原纤维缠结优势型老年性痴呆、马查多-约瑟夫病、多系统萎缩、多发性硬化、多发性硫酸酯酶缺乏症、粘脂贮积病、发作性睡病、尼曼皮克病、帕金森病、皮克病、庞贝病、原发性侧索硬化、朊病毒病、神经元丧失、认知缺陷、运动神经元疾病、杜氏肌营养不良(DMD)、额颞叶痴呆、17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征、Lytico-Bodig病(关岛帕金森-痴呆复合征)、神经轴索营养不良、雷夫叙姆病、希德氏病、继发于恶性贫血的亚急性脊髓联合变性、斯皮尔梅伊尔-沃格特-肖格伦-巴滕病、17号染色体相关的帕金森综合征(FTDP-17)、普拉德-威利综合征、强直性肌营养不良、慢性创伤性脑病包括拳击性痴呆、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、斯蒂尔-理查森-奥尔谢夫斯基病、脊髓痨、C型尼曼皮克病(NPC1和/或NPC2缺陷)、史-莱-奥综合征(SLOS)、先天性胆固醇合成障碍、丹吉尔病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、神经元蜡样质脂褐质沉积症、原发性鞘糖脂沉积症、法伯病或多发性硫酸酯酶缺乏症、戈谢病、法布里病、GM1神经节苷脂沉积症、GM2神经节苷脂沉积症、克拉伯病、异染性脑白质营养不良(MLD)、NPC、GM1神经节苷脂沉积症、法布里病、神经退行性粘多糖贮积症、MPS I、MPS IH、MPS IS、MPS II、MPS III、MPS IIIA、MPS IIIB、MPS IIIC、MPS HID、MPS、IV、MPS IV A、MPSIV B、MPS VI、MPS VII、MPS IX、继发性溶酶体受累疾病、SLOS、丹吉尔病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、脑炎后帕金森综合征、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化、哈勒沃登-施帕茨病、脂褐质沉积症、小脑性共济失调、帕金森综合征、路-巴综合征、多系统萎缩、额颞叶痴呆或下肢帕金森综合征、尼曼皮克病、C型尼曼皮克病、A型尼曼皮克病、泰-萨克斯病、小脑型多系统性萎缩(MSA-C)、伴有帕金森综合征的额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、小脑下跳性眼震、桑霍夫病或II型粘脂沉积症、或其组合。

在一些实施方式中，所述靶RNA是与癌症相关的靶基因的转录物(例如，mRNA)。

在一些实施方式中，所述癌症是癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和混合型肿瘤。可以通过本文描述的方法和组合物治疗的癌症的非限制性实例包括来自以下的癌细胞：膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌、或子宫。此外，所述癌症可以特别地属于以下组织学类型，但不限于这些：赘瘤，恶性；癌；癌，未分化；巨大及梭细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛发基质(pilomatrix)癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；肝细胞癌合并胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡(branchiolo-alveolar)腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附器癌；顶浆(apocrine)腺癌；皮脂腺癌；耵聍(ceruminous)腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞癌；伴有鳞状化生的腺癌；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤(thecoma)，恶性；粒层细胞瘤，恶性；及成纤维细胞瘤，恶性；支持细胞癌；睾丸间质细胞(leydig cell)瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒氏混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；骨旁骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质性星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质瘤；原始神经外胚叶肿瘤；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡型恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓系肉瘤；浆细胞瘤、结直肠癌、直肠癌和毛细胞白血病。

在一些实施方式中，所述靶RNA是与选自以下疾病相关的转录物(例如，mRNA)：(以“疾病或障碍-因果关系基因或转录物”的格式显示)

神经元的：

雷特综合征-MECP2、

MDS-MECP2、

Angles综合征-UBE3A-ATS、

AADC缺乏症-AADC、

海绵状白质脑病-ASPA、

婴儿后期神经元蜡样质脂褐质沉积症(Late infantile neuronal ceroidlipofuscinosis)-CLN2(也称为TPP1)、

弗里德赖希共济失调-FRDA(也称为FXN)、

巨轴突神经病-GAN、

莱伯遗传性视神经病变-ND1/ND4；

眼的：

全色盲-CNGA3、

莱伯氏先天性黑矇10蛋白-CEP290、

视网膜色素变性-RHO；

肌肉的：

dysferlin肌病-DYSF、

达农病(Danon Disease)-LAMP2、

1型强直性肌营养不良(DM1)-DMPK；

耳的：

彭德莱综合征-SLC26A4、

Wolfram综合征-WFS1、

斯蒂克勒综合征(Stickler syndrome)-COL11A2、

非综合征型耳聋-GJB2/OTOF/Myo6/STRC/KCNQ4/TECTA；

肝的：

纯合子家族性高胆固醇血症-LDLR/PCSK9、

α-1抗胰蛋白酶缺乏症-SERPINA1；

其他：

苯丙酮尿症-苯丙氨酸羟化酶(PAH)、

克里格勒-纳贾尔综合征(Crigler-Najjar Syndrome)-UGT1A1、

鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)缺乏症-OTC、

糖原贮积症IA型-G6Pase。

在一些实施方式中，所述疾病选自青光眼，与年龄相关的RGC丧失，视神经损伤，视网膜缺血，莱伯遗传性视神经病变，与RGC神经元退化相关的神经病症，与有需要的受试者的纹状体中功能性神经元退化相关的神经病症，帕金森病，阿尔茨海默病，亨廷顿病，精神分裂症，抑郁症，药物成瘾，运动障碍如舞蹈病、舞蹈徐动症和动作障碍，双相障碍，自闭症谱系障碍(ASD)，功能失调，MECP2重复综合征(MDS)，天使综合征，年龄相关性黄斑变性(AMD)和肌萎缩侧索硬化(ALS)。

在一些实施方式中，所述施用包含局部施用或全身施用。

在一些实施方式中，所述施用包含鞘内施用、肌内施用、静脉内施用、经皮施用、鼻内施用、口服施用、粘膜施用、腹膜内施用、颅内施用、脑室内施用或立体定向施用。

在一些实施方式中，通过注射进行所述施用。

在一些实施方式中，所述受试者是人。

用于治疗所述疾病的rAAV颗粒的剂量可以是单剂量的，也可以是多剂量的。本领域技术人员应理解，实际剂量可取决于多种因素而大幅变化，如载体选择、靶细胞、生物、组织、待治疗受试者的一般状况、所寻求的转化/修饰的程度、施用途径、施用模式、所寻求的转化/修饰的类型等。

在一些实施方式中，所述rAAV颗粒以治疗有效剂量施用。例如，所述rAAV颗粒的治疗有效剂量可为约1.0E+8、2.0E+8、3.0E+8、4.0E+8、6.0E+8、8.0E+8、1.0E+9、2.0E+9、3.0E+9、4.0E+9、6.0E+9、8.0E+9、1.0E+10、2.0E+10、3.0E+10、4.0E+10、6.0E+10、8.0E+10、1.0E+11、2.0E+11、3.0E+11、4.0E+11、6.0E+11、8.0E+11、1.0E+12、2.0E+12、3.0E+12、4.0E+12、6.0E+12、8.0E+12、1.0E+13、2.0E+13、3.0E+13、4.0E+13、6.0E+13、8.0E+13、1.0E+14、2.0E+14、3.0E+14、4.0E+14、6.0E+14、8.0E+14、1.0E+15、2.0E+15、3.0E+15、4.0E+15、6.0E+15、8.0E+15、1.0E+16、2.0E+16、3.0E+16、4.0E+16、6.0E+16、8.0E+16或1.0E+17vg，或在那些点值的任意两个范围内。vg代表用于施用的rAAV颗粒的载体基因组。

在又另一方面，本公开提供药物组合物，所述药物组合物包含本公开的系统或本公开的rAAV颗粒、以及药学上可接受的赋形剂。

在一些实施方式中，所述药物组合物包含rAAV颗粒，所述rAAV颗粒的浓度选自约1×10¹⁰vg/mL、2×10¹⁰vg/mL、3×10¹⁰vg/mL、4×10¹⁰vg/mL、5×10¹⁰vg/mL、6×10¹⁰vg/mL、7×10¹⁰vg/mL、8×10¹⁰vg/mL、9×10¹⁰vg/mL、1×10¹¹vg/mL、2×10¹¹vg/mL、3×10¹¹vg/mL、4×10¹¹vg/mL、5×10¹¹vg/mL、6×10¹¹vg/mL、7×10¹¹vg/mL、8×10¹¹vg/mL、9×10¹¹vg/mL、1×10¹²vg/mL、2×10¹²vg/mL、3×10¹²vg/mL、4×10¹²vg/mL、5×10¹²vg/mL、6×10¹²vg/mL、7×10¹²vg/mL、8×10¹²vg/mL、9×10¹²vg/mL、1×10¹³vg/mL、或者浓度在任何两个前述值之间的数值范围，例如，浓度为从约9×10¹⁰vg/mL至约8×10¹¹vg/mL。

在一些实施方式中，所述药物组合物是注射剂。

在一些实施方式中，所述注射的体积选自约1微升、10微升、50微升、100微升、150微升、200微升、250微升、300微升、350微升、400微升、450微升、500微升、550微升、600微升、650微升、700微升、750微升、800微升，850微升、900微升、950微升、1000微升，以及在任何两个前述值之间的数值范围的体积，例如，浓度为约10微升至约750微升。

递送

通过本公开和本领域的知识，本公开的CRISPR-Cas13f系统可以使用本领域的任何合适的手段通过各种递送系统(如载体，例如质粒、病毒载体、脂质纳米颗粒(LNP))递送。这样的方法包括但不限于电穿孔、脂质转染、显微注射、转染、超声、基因枪等。

本公开的CRISPR-Cas13f系统的一个或多个组分，例如，所述工程化Cas13f多肽或编码所述工程化Cas13f多肽的多核苷酸(例如，DNA、mRNA)、所述指导核酸(例如，gRNA)或编码所述指导核酸的多核苷酸，可以使用一种或多种合适的载体，例如质粒、病毒载体、LNP，如腺相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒载体、和其他病毒载体，或其组合递送。可以将一种或多种组分包装或编码到一种或多种载体(例如，质粒、病毒载体、LNP)中。

所述载体可以是克隆载体或表达载体。所述载体可以是质粒、噬菌粒、粘粒等。所述载体可以包括一个或多个允许所述载体在感兴趣的细胞(例如，细菌细胞或哺乳动物细胞)中繁殖的调节元件。在一些实施方式中，所述载体包含编码本文所述的系统的单个组分的多核苷酸。在一些实施方式中，所述载体包括多个多核苷酸，每个多核苷酸编码本文所述的系统的单个组分。

在一些实施方式中，所述多核苷酸与启动子可操作地连接。在一些实施方式中，所述多核苷酸与增强子可操作地连接。在一些实施方式中，所述启动子是组成型启动子，诱导型启动子，广谱启动子(ubiquitous promoter)，或者细胞、组织或器官特异性启动子，如本文所述。

在一些实施方式中，所述载体包含编码本公开的工程化Cas13f多肽的第一多核苷酸和编码本公开的指导核酸的第二多核苷酸。在一些实施方式中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接到所述同一启动子或分开的启动子。

在一些实施方式中，所述载体是质粒。在一些实施方式中，所述递送经由质粒进行，例如用于在体外细胞转染中使用。所述剂量可以是足够数量的质粒以引发响应。在一些情况下，质粒组合物中质粒DNA的合适量可以是从约0.1至约2mg。质粒通常包括(i)启动子；(ii)编码与(i)可操作地连接的工程化Cas13多肽的序列；(iii)可选择标志物；(iv)复制起点；以及(v)位于(ii)的下游并与其可操作地连接的转录终止子。所述质粒可以进一步编码所述CRISPR-Cas13f系统的指导核酸，所述指导核酸可以与另一个启动子可操作地连接，以产生多合一质粒。

在一些实施方式中，所述载体是逆转录病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、AAV载体或慢病毒载体。

在一些实施方式中，其中所述AAV载体为包含衣壳的重组AAV颗粒，所述衣壳的血清型为AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAV.PHP.eB、AAV1-AAV13中的任一者所属的进化枝的成员、或其功能变体(例如，功能截短物)。

在一些实施方式中，所述AAV载体是包封RNA的AAV颗粒。

在又另一方面，本公开提供重组腺相关病毒(rAAV)载体基因组，所述rAAV载体基因组包含：

(a)第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列包含编码指导核酸的序列，所述指导核酸包含：

(2)能够与靶RNA的靶序列杂交，由此将所述复合物引导至所述靶RNA的间隔序列；和

(b)第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列包含编码所述工程化Cas13f多肽的序列，

其中所述rAAV载体基因组适于包封到重组AAV颗粒中。

腺相关病毒(AAV)，当被工程化以递送例如，感兴趣的蛋白质编码序列时，可以称为(r)AAV载体、(r)AAV载体颗粒、或(r)AAV颗粒，其中“r”代表“重组”。被包装在AAV载体中用于递送的基因组可以称为(r)AAV载体基因组、载体基因组或简称vg，而病毒基因组可以指天然AAV的原始病毒基因组。

rAAV颗粒衣壳的血清型可以与靶细胞的类型相匹配。例如，WO 2018002719 A1的表2列出了可以被指定的AAV血清型转导的示例性细胞类型(通过引用并入本文)。

在一些实施方式中，所述rAAV颗粒包含具有适合递送到神经细胞(例如，神经元)中的血清型的衣壳。在一些实施方式中，所述rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳的血清型为AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、或AAV.PHP.eB、AAV1-AAV13中的任一者所属的进化枝的成员、或其功能变体(例如，功能截短物)，包封所述rAAV载体基因组。在一些实施方式中，所述衣壳的血清型是AAV9或AAV.PHP.eB或其突变体。

rAAV颗粒生产的一般原理是本领域已知的。在一些实施方式中，可以使用三重转染方法(在美国专利号6,001,650中详细描述)产生rAAV颗粒。

载体滴度通常表示为载体基因组/ml(vg/ml)。在一些实施方式中，载体滴度高于1×10⁹、高于5×10¹⁰、高于1×10¹¹、高于5×10¹¹、高于1×10¹²、高于5×10¹²、或高于1×10¹³vg/ml。

作为将单链(ss)DNA序列包装为rAAV颗粒的载体基因组的替代，最近开发了将RNA序列作为载体基因组包装到rAAV颗粒中的系统和方法，并可应用于本文。参见PCT/CN2022/075366，将所述文献通过引用以其全文并入本文。

当载体基因组为例如PCT/CN2022/075366中的RNA时，为了进行简单描述和声明，本文中描述的用于DNA载体基因组的序列元件，当存在于RNA载体基因组中时，通常应认为适用于RNA载体基因组，除了DNA序列中的脱氧核糖核苷酸是RNA序列中相应的核糖核苷酸(例如dT相当于U，并且dA相当于A)和/或DNA序列中的元件被替换为在RNA序列中具有相应功能的相应元件，或因其功能在RNA序列中不需要而被省略，和/或引入RNA载体基因组所必需的另外的元件。

如本文所用，编码序列(例如，作为本文中rAAV载体基因组的序列元件)被解释、理解和认为覆盖并涵盖DNA编码序列和RNA编码序列两者。当它是DNA编码序列时，可以从DNA编码序列转录RNA序列，并且任选地可以根据需要进一步从转录的RNA序列翻译蛋白质。当它是RNA编码序列时，RNA编码序列本身可以是供使用的功能RNA序列，或者RNA序列可以例如通过RNA加工由RNA编码序列产生，或者可以从RNA编码序列翻译蛋白质。

例如，编码Cas13多肽的Cas13编码序列覆盖Cas13多肽从其表达(经由转录和翻译间接地)的Cas13 DNA编码序列或Cas13多肽从其翻译(直接地)的Cas13 RNA编码序列。

例如，编码gRNA的gRNA编码序列覆盖了gRNA从其转录的gRNA DNA编码序列、或gRNA RNA编码序列((1)其本身是供使用的功能gRNA或(2)通过例如RNA加工从其产生gRNA)。

在rAAV RNA载体基因组的一些实施方式中，5'-ITR和/或3'-ITR作为DNA包装信号可以是不必要的并且可以至少将其部分省略，但是可以引入RNA包装信号。

在rAAV RNA载体基因组的一些实施方式中，驱动DNA序列转录的启动子可以是不必要的，并且可以至少将其部分省略。

在rAAV RNA载体基因组的一些实施方式中，编码polyA信号的序列可以是不必要的并且可以至少将其部分省略，但是可以引入polyA尾巴。

类似地，可以将rAAV DNA载体基因组的其他DNA元件省略或替换为相应的RNA元件和/或可以引入另外的RNA元件，以适应由rAAV颗粒递送RNA载体基因组的策略。

在一些实施方式中，通过例如肌内注射、静脉内施用、经皮施用、鼻内施用、口服施用或粘膜施用将所述载体(例如，质粒或病毒载体)递送至感兴趣的组织。这样的递送可以经由单剂量或多剂量进行。本领域技术人员应理解，本文待递送的实际剂量可取决于多种因素而大幅变化，如载体选择、靶细胞、生物、组织、待治疗受试者的一般状况、所寻求的转化/修饰的程度、施用途径、施用模式、所寻求的转化/修饰的类型等。

在一些实施方式中，所述递送经由腺病毒进行，其可以是含有至少1×10⁵个颗粒(也称为颗粒单位，pu)的腺病毒的单剂量。在一些实施方式中，所述剂量优选地是至少约1×10⁶个颗粒、至少约1×10⁷个颗粒、至少约1×10⁸个颗粒、和至少约1×10⁹个颗粒的腺病毒。所述递送方法和所述剂量描述于例如WO 2016205764 A1和美国专利号8,454,972B2中，将所述两个文献通过引用以全文并入本文。

在另一实施方式中，所述递送经由脂质体或脂质转染配制品等进行，并且可以通过本领域技术人员已知的方法制备。这样的方法描述于例如WO 2016205764和美国专利号5,593,972、5,589,466、和5,580,859中，将各个文献通过引用以其全文并入本文。

在一些实施方式中，所述递送经由纳米颗粒或外泌体进行。例如，已表明外泌体在递送RNA方面特别有用。

用于CRISPR-Cas13系统的各种递送方法还描述于例如美国专利号8,795,965、EP3009511、WO 2016205764和WO 2017070605中；将各个文献通过引用以其全文并入本文。

在又另一方面，本公开提供递送系统，所述递送系统包含(1)递送媒介物，和(2)本公开的工程化Cas13f多肽、本公开的多核苷酸、本公开的CRISPR-Cas13f系统、或本公开的载体。

在一些实施方式中，所述递送媒介物是纳米颗粒(例如，LNP)、脂质体、外泌体、微泡或基因枪。

细胞

本公开的方法和/或系统可以用于修饰细胞的一种或多种RNA产物的翻译和/或转录。例如，所述修饰可导致RNA产物的转录/翻译/表达增加。在其他实施方式中，所述修饰可导致RNA产物的转录/翻译/表达降低。

本公开的方法可用于将本文描述的系统引入细胞中，并引起所述细胞和/或其后代改变一种或多种细胞产物(如抗体、淀粉、乙醇、或任何其他所希望的产物)的产生。这样的细胞及其后代在本公开的范围内。

在又另一方面，本公开提供细胞或其后代，所述细胞或其后代包含本公开的工程化Cas13f多肽、或本公开的系统。在一些实施方式中，所述细胞是真核生物。在一些实施方式中，所述细胞是人细胞。

在又另一方面，本公开提供细胞或其后代，所述细胞或其后代由本公开的系统或本公开的方法修饰。在一些实施方式中，所述细胞是真核生物。在一些实施方式中，所述细胞是人细胞。在一些实施方式中，所述细胞在体外、体内或离体修饰。

在一些实施方式中，所述细胞是干细胞。在一些实施方式中，所述细胞不是人胚胎干细胞。在一些实施方式中，所述细胞不是人生殖细胞。

在一些实施方式中，所述细胞是原核细胞。

在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞，如哺乳动物细胞，包括人细胞(原代人细胞或已建立的人细胞系)。在一些实施方式中，所述细胞是非人哺乳动物细胞，如来自非人灵长类动物(例如，猴)、母牛/公牛/牛、绵羊、山羊、猪、马、狗、猫、啮齿动物(如兔子、小鼠、大鼠、仓鼠等)的细胞。在一些实施方式中，所述细胞来自鱼(如鲑鱼)、鸟(如禽鸟，包括鸡、鸭、鹅)、爬行动物、贝类(例如，牡蛎、蛤蜊、龙虾、对虾)、昆虫、蠕虫、酵母等。在一些实施方式中，所述细胞来自植物，例如单子叶植物或双子叶植物。在某些实施方式中，所述植物是粮食作物，如大麦、木薯、棉花、落花生或花生、玉蜀黍、小米、油棕果、马铃薯、干豆、油菜籽或低芥酸菜籽(canola)、稻、黑麦、高粱、大豆、甘蔗、甜菜、向日葵和小麦。在某些实施方式中，所述植物是谷类(大麦、玉蜀黍、小米、稻、黑麦、高粱和小麦)。在某些实施方式中，所述植物是块茎(木薯和马铃薯)。在某些实施方式中，所述植物是糖料作物(甜菜和甘蔗)。在某些实施方式中，所述植物是含油作物(大豆、落花生或花生、油菜籽或低芥酸菜籽、向日葵和油棕果)。在某些实施方式中，所述植物是纤维作物(棉花)。在某些实施方式中，所述植物是树木(如桃树或油桃树、苹果树或梨树、坚果树(如杏仁树或核桃树或开心果树)、或柑橘树(例如，橙树、葡萄柚树或柠檬树))、草、蔬菜、水果或藻类。在某些实施方式中，所述植物是茄属植物；芸苔属(Brassica)植物；莴苣属(Lactuca)植物；菠菜属(Spinacia)植物；辣椒属(Capsicum)植物；棉花、烟草、芦笋、胡萝卜、卷心菜、西兰花、花椰菜、番茄、茄子、胡椒、生菜、菠菜、草莓、蓝莓、覆盆子、黑莓、葡萄、咖啡、可可等。

试剂盒

在又另一方面，本公开提供试剂盒，所述试剂盒包含本公开的工程化Cas13f多肽、本公开的CRISPR-Cas13f系统、本公开的载体、或本公开的递送系统。

在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含使用其中含有的组分的说明，和/或与可在别处获得或必需的另外的组分组合的说明。

在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含一种或多种缓冲液，所述缓冲液可用于溶解其中含有的任一组分和/或为一种或多种所述组分提供合适的反应条件。这样的缓冲液可以包括以下中的一种或多种：PBS、HEPES、Tris、MOPS、Na₂CO₃、NaHCO₃、NaB、或其组合。在一些实施方式中，所述反应条件包括适当的pH，如碱性pH。在一些实施方式中，所述pH在7-10之间。

在一些实施方式中，任一种或多种所述试剂盒组分可以存储在合适的容器中或在合适的温度下，例如4摄氏度。

进一步的实施方式在以下实施例中进行了说明，这些实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本公开的范围。

本公开提供了以下另外的实施方式。

本公开的一个方面提供工程化Cas13f多肽，其中所述工程化Cas13f多肽：

(1)包含在空间上接近以下的区域中的突变：a)(例如，SEQ ID NO:1的)参考Cas13f多肽的N-末端内切核酸酶催化RXXXXH基序(例如，N-末端内切核酸酶催化RNFYSH基序)，和/或b)所述(例如，SEQ ID NO:1的)参考Cas13f多肽的C-末端内切核酸酶催化RXXXXH基序(例如，C-末端内切核酸酶催化RNKALH基序)；

(2)基本上保留(例如，具有至少约50％、60％、70％、72.5％、75％、77.5％、80％、82.5％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的)所述(例如，SEQID NO:1的)参考Cas13f多肽对与间隔序列互补的靶RNA的间隔序列特异性切割活性；并且

(3)基本上缺乏(例如，具有不超过约50％、45％、40％、35％、30％、27.5％、25％、22.5％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％或更少的)所述(例如，SEQ ID NO:1的)参考Cas13f多肽对不与所述间隔序列结合的非靶RNA的间隔序列非依赖性旁切活性。

在一些实施方式中，所述区域包括距离所述N-末端内切核酸酶催化RXXXXH基序或所述C-末端内切核酸酶催化RXXXXH基序的任何残基在140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个氨基酸以内的残基。

在一些实施方式中，所述区域包括距离所述N-末端内切核酸酶催化RXXXXH基序或所述C-末端内切核酸酶催化RXXXXH基序的任何残基在100、110、120或130个残基以外，但在空间上在所述N-末端内切核酸酶催化RXXXXH基序或所述C-末端内切核酸酶催化RXXXXH基序的任何残基的约1埃至约10埃以内或约5埃的残基。

在一些实施方式中，所述区域包含对应于SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽的以下结构域的残基、基本上由其组成、或由其组成：HEPN1结构域(例如，残基1-168)、IDL结构域(例如，残基168-185)、Helical1结构域(例如，Helical1-1(Hel1-1)结构域(例如，残基185-234)、Helical1-2(Hel1-2)结构域(例如，残基281-346)、Helical1-3(Hel1-3)结构域(例如，残基477-644))、Helical2结构域(例如，残基346-477)、或HEPN2结构域(例如，残基644-790)。

在一些实施方式中，所述突变包含在所述区域内的一段约8个至约20个(例如，约9个或约17个)连续氨基酸内的以下、基本上由其组成、或由其组成：

(a)一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)非Ala(A)残基至Ala(A)残基的取代；

(b)一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)带电荷的残基、含氮侧链基团的残基、大的(如F或Y)残基、脂肪族残基、和/或极性残基至电荷中性的短链脂肪族残基(如A、V或I)的取代；

(c)一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)Ile(I)和/或Leu(L)残基至Ala(A)残基的取代；和/或

(d)一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)Ala(A)残基至Val(V)残基的取代。

在一些实施方式中，所述一个或多个非Ala残基和/或所述一个或多个带电荷的或极性残基包含N、Q、R、K、H、D、E、Y、S、T、L残基或其组合。

在一些实施方式中，所述一个或多个非Ala残基和/或所述一个或多个带电荷的或极性残基包含N、Q、R、K、H、D、Y、L残基或其组合。

在一些实施方式中，所述一段内的一个或多个Y残基被取代。

在一些实施方式中，所述一个或多个Y残基对应于SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽的Y666和/或Y677。

在一些实施方式中，所述一段内的一个或多个D残基被取代。

在一些实施方式中，所述一个或多个D残基对应于SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽的D160和/或D642。

在一些实施方式中，所述电荷中性的短链脂肪族残基是Ala(A)。

在一些实施方式中，所述突变包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：

(a)在所述区域内的一段约8个至约20个(例如，约9个或约17个)连续氨基酸中的1、2、3、4或5个所述段内的取代；

(b)对应于以下突变(例如，表1-4中的任何一个)或其组合的突变，所述突变导致工程化Cas13f多肽具有至少约75％的间隔序列特异性切割活性和不超过约25％的间隔序列非依赖性旁切活性；和/或

(c)对应于表1-4中的F7V2、F10V1、F10V4、F40V4、F40S22、F40S26、F40S36、F10S21、F10S24、F10S26、F10S27、F10S33、F10S34、F10S35、F10S36、F10S45、F10S46、F10S48、F10S49、F40S23、或F40S27突变，或其组合的突变。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽保留SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽对所述靶RNA的间隔序列特异性切割活性的至少约50％、60％、70％、72.5％、75％、77.5％、80％、82.5％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽具有SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽对所述非靶RNA的间隔序列非依赖性旁切活性的不超过50％、45％、40％、35％、30％、27.5％、25％、22.5％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％或更少。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽具有SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽对所述靶RNA的间隔序列特异性切割活性的至少约80％，以及SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽对所述非靶RNA的间隔序列非依赖性旁切活性的不超过约40％。

在一些实施方式中，所述突变是F40S23(即，Y666A/Y677A双突变)。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽进一步包含对应于表5中任何一个、两个或更多个(例如，3、4或5个以上)突变(如，D160A、D642A和/或L641A)的组合的突变。

在一些实施方式中，所述突变是表5中任何一个、两个或更多个(例如，3、4或5个以上)单一突变(如，D160A、D642A和/或L641A)与F40S23(即，Y666A/Y677A双突变)的组合。

在一些实施方式中，所述突变是Y666A/Y677A双突变与选自D160A、L641A和D642A的1、2或3个突变的组合。

在一些实施方式中，所述突变是表6-11中的任何组合突变。

在一些实施方式中，所述突变是D160A/D642A/Y666A/Y677A四重突变。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的工程化Cas13f多肽相比具有增加的间隔序列特异性切割活性。

在一些实施方式中，所述突变是对应于表12-15中的突变与D160A/D642A/Y666A/Y677A突变的组合的突变。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽进一步包含非碱性氨基酸残基至Arg(R)残基的氨基酸取代。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽进一步包含对应于表12-15中任何一个、两个或更多个(例如，3、4或5个以上)单一突变的组合的突变。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:4的工程化Cas13f多肽相比具有增加的间隔序列特异性切割活性。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％且小于100％的序列同一性。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽进一步包含核定位信号(NLS)序列或核输出信号(NES)。

在一些实施方式中，所述工程化Cas13f多肽进一步包含N-末端和/或C-末端NLS。

本公开的另一方面提供多核苷酸，所述多核苷酸编码本公开的工程化Cas13f多肽。

在一些实施方式中，所述多核苷酸经密码子优化以在真核生物、哺乳动物如人或非人哺乳动物、植物、昆虫、鸟、爬行动物、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)、鱼、蠕虫/线虫或酵母中表达。

本公开的另一方面提供CRISPR-Cas13f系统，所述CRISPR-Cas13f系统包含：

a)本公开的工程化Cas13f多肽或其多核苷酸编码序列(例如，DNA编码序列或RNA编码序列)；以及

b)指导RNA(gRNA)或其多核苷酸编码序列(例如，DNA编码序列或RNA编码序列)，所述gRNA包含：

ii.能够与靶RNA杂交并将所述复合物引导或募集至所述靶RNA的间隔序列。

在一些实施方式中，所述DR序列具有与SEQ ID NO:2的二级结构基本上相同的二级结构。

在一些实施方式中，所述间隔序列的长度为至少15个核苷酸。在一些实施方式中，所述间隔序列的长度为30个核苷酸。

本公开的另一方面提供载体，所述载体包含本公开的多核苷酸。

在一些实施方式中，所述多核苷酸与启动子可操作地连接。在一些实施方式中，所述多核苷酸与增强子可操作地连接。

在一些实施方式中，所述启动子是组成型启动子，诱导型启动子，广谱启动子，或者细胞、组织或器官特异性启动子。

在一些实施方式中，所述载体是质粒。

在一些实施方式中，所述AAV载体是血清型为AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12、AAV 13、AAV.PHP.eB或AAV-DJ的重组AAV载体。

在一些实施方式中，所述AAV载体是包封RNA的AAV载体。

本公开的另一方面提供递送系统，所述递送系统包含(1)递送媒介物，和(2)本公开的工程化Cas13f多肽、本公开的多核苷酸、本公开的CRISPR-Cas13f系统、或本公开的载体。

本公开的另一方面提供细胞或其后代，所述细胞或其后代包含本公开的工程化Cas13f多肽、本公开的多核苷酸、本公开的CRISPR-Cas13f系统、本公开的载体、或本公开的递送系统。

在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞(例如，非人哺乳动物细胞、人细胞或植物细胞)或原核细胞(例如，细菌细胞)。

本公开的另一方面提供非人多细胞真核生物，所述非人多细胞真核生物包含本公开的细胞或后代。

在一些实施方式中，所述非人多细胞真核生物是针对人遗传障碍的动物(例如，啮齿动物或灵长类动物)模型。

本公开的另一方面提供修饰靶RNA的方法，所述方法包括使靶RNA与本公开的CRISPR-Cas13f系统、本公开的载体、本公开的递送系统、或本公开的细胞或后代接触。

在一些实施方式中，通过由所述工程化Cas13f多肽进行切割来修饰所述靶RNA。

在一些实施方式中，所述靶RNA是mRNA、tRNA、rRNA、非编码RNA、lncRNA或核RNA。

在一些实施方式中，在所述工程化Cas13f多肽和所述指导RNA的复合物与所述靶RNA结合后，所述工程化Cas13f多肽不会表现出实质性的(或可检测的)间隔序列非依赖性旁切活性。

在一些实施方式中，所述靶RNA在细胞内。

在一些实施方式中，所述细胞是癌细胞。

在一些实施方式中，所述细胞受感染原感染。

在一些实施方式中，所述感染原是病毒、朊病毒、原生动物、真菌或寄生物。

在一些实施方式中，所述细胞是神经元细胞(例如，星形胶质细胞、神经胶质细胞(例如，穆勒神经胶质细胞(Muller glia cell)、少突胶质细胞、室管膜细胞、施万细胞(Schwan cell)、NG2细胞或卫星细胞))。

在一些实施方式中，所述CRISPR-Cas13f系统由以下编码：编码所述工程化Cas13f多肽的第一多核苷酸，以及包含或编码所述指导RNA的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸被引入所述细胞中。

在一些实施方式中，通过同一个载体将所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸引入所述细胞中。

在一些实施方式中，所述接触导致以下中的一项或多项：(i)体外或体内诱导细胞衰老；(ii)体外或体内细胞周期停滞；(iii)体外或体内细胞生长抑制；(iv)体外或体内诱导无能；(v)体外或体内诱导细胞凋亡；以及(vi)体外或体内诱导坏死。

本公开的另一方面提供在有需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下的组合物：本公开的CRISPR-Cas13f系统、本公开的载体、本公开的递送系统、或本公开的细胞或后代；其中，在施用后，所述工程化Cas13f多肽切割所述靶RNA，由此治疗所述受试者的疾病。

在一些实施方式中，所述疾病是神经病症、癌症、感染性疾病或遗传障碍。

在一些实施方式中，所述癌症是威尔姆斯肿瘤、尤因肉瘤、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、皮肤癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、胆道癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或膀胱癌。

在一些实施方式中，所述神经病症是青光眼，与年龄相关的RGC丧失，视神经损伤，视网膜缺血，莱伯遗传性视神经病变，与RGC神经元退化相关的神经病症，与有需要的受试者的纹状体中功能性神经元退化相关的神经病症，帕金森病，阿尔茨海默病，亨廷顿病，精神分裂症，抑郁症，药物成瘾，运动障碍如舞蹈病、舞蹈徐动症和动作障碍，双相障碍，自闭症谱系障碍(ASD)或功能失调。

在一些实施方式中，所述方法是体外方法、体内方法或离体方法。

本公开的另一方面提供CRISPR-Cas13f复合物，所述CRISPR-Cas13f复合物包含本公开的工程化Cas13f多肽以及包含DR序列和间隔序列的指导RNA，所述DR序列与所述工程化Cas13f多肽结合，所述间隔序列能够与靶RNA杂交并且将所述复合物引导或募集至所述靶RNA。

在一些实施方式中，所述靶RNA由真核DNA编码。

在一些实施方式中，所述真核DNA是非人哺乳动物DNA、非人灵长类动物DNA、人DNA、植物DNA、昆虫DNA、鸟DNA、爬行动物DNA、啮齿动物DNA、鱼DNA、蠕虫/线虫DNA、或酵母DNA。

在一些实施方式中，所述靶RNA是mRNA。

在一些实施方式中，所述CRISPR-Cas13f复合物进一步包含靶RNA，所述靶RNA包含能够与所述间隔序列杂交的序列。

实施例

提供以下实施例以进一步说明本公开的一些实施方式但不旨在限制本发明的范围；通过它们的示例性性质将理解，可以可替代地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。

实施例1针对旁切活性对参考Cas13f多肽的工程化

本实施例证明，通过引入一个或多个氨基酸取代，可以基本上降低参考Cas13f多肽(野生型，“WT”，SEQ ID NO:1)的间隔序列非依赖性旁切活性(“旁切活性”，“脱靶切割活性”)，所述参考Cas13f多肽的(“切割活性”，“中靶切割活性”)。

设计和构建：

使用了公开可获得的在线工具TASSER预测参考Cas13f多肽(SEQ ID NO:1)的3D结构，并且如图1中所示，使用PyMOL对预测结构进行了可视化，以预测3D中各个结构性结构域的位置。

构建了如图2中所示的单质粒哺乳动物双荧光报告系统，以检测基于参考Cas13f多肽设计的Cas13f突变体的旁切活性。

所述质粒包含(1)在CAG启动子和poly A序列的调控下侧接5’和3’SV40 NLS(SEQID NO:5)编码序列两者的Cas13f突变体编码序列、(2)在SV40启动子和poly A序列的调控下的EGFP绿色荧光报告基因(其RNA转录物作为Cas13f突变体的切割活性的RNA靶标)、(3)在SV40启动子和poly A序列的调控下的mCherry红色荧光报告基因(其RNA转录物作为Cas13f突变体的旁切活性的RNA靶标)、以及(4)在U6启动子的调控下编码由5'-DR序列(SEQID NO:2)-EGFP靶向间隔序列(SEQ ID NO:6)-DR序列(SEQ ID NO:2)-3'组成的EGFP靶向指导RNA(SEQ ID NO:15)的序列。

选择了参考Cas13f多肽的HEPN1、HEPN2、IDL和Hel1-3结构域来生成Cas13f诱变文库。在那些结构域(F1-F10和F38-F47，图3)上选择了20个小区段，除了F45V1和F45V2(每个具有9个残基)之外，其余每个小区段具有17个残基。

为了设计Cas13f突变体，在几个版本中，将每个区段的非Ala(A)残基(如果存在)用Ala(A)残基取代，并且在几个版本中，将每个区段的Ala(A)残基(如果存在)用Val(V)残基取代。例如，对于F1区段，设计了F1V1-F1V4突变体。在每个版本中，将大约4-5个总突变引入每个区段中以生成Cas13f突变体。如此产生的Cas13f突变体和突变区段的氨基酸序列在下表1中提供，并且每个Cas13f突变体的其他部分与SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽相同。

表1.Cas13f突变体的设计

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转染和检测：

根据标准方法将HEK293T细胞在24孔组织培养板中培养12小时，然后使用标准聚乙烯亚胺(PEI)转染将质粒转染到细胞中。然后将经转染的细胞在37℃在5％的CO₂下培养约48小时。然后通过流式细胞术分析培养的细胞。

使用无切割和旁切活性的死Cas13f(“dCas13f”，“死”)(在SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽的HEPN结构域中具有R77A、H82A、R764A和H769A突变的Cas13f突变体)作为阴性对照(“NT”)。

每个测试的Cas13f突变体的切割活性与EGFP阳性细胞的百分比比例(％EGFP⁺)呈负相关。％EGFP⁺越低，切割活性就越高。因此，Cas13f突变体相对于SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽(“WT”)的切割活性显示为Cas13f突变体的％EGFP⁺相对于WT的％EGFP⁺的倒数。

相对于WT的切割活性＝1/(Cas13f突变体的％EGFP⁺/WT的％EGFP⁺)。

每个测试的Cas13f突变体的旁切活性与mCherry阳性细胞的百分比比例(％mCherry⁺)呈负相关。％mCherry⁺越高，旁切活性就越低。因此，Cas13f突变体相对于SEQ IDNO:1的参考Cas13f多肽(“WT”)的旁切活性显示为Cas13f突变体的％mCherry⁺相对于WT的％mCherry⁺的倒数。

相对于WT的旁切活性＝1/(Cas13f突变体的％mCherry⁺/WT的％mCherry⁺)。

结果：

流式细胞术结果(表2)显示了Cas13f突变体的切割和旁切活性。

表2.表1中Cas13f突变体的平均切割和旁切活性(n＝3)

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Cas13f突变体在表2中以相对于WT的低到高的旁切活性的顺序排列。注意到，在那些相对于WT具有低于70％旁切活性的Cas13f突变体中(以灰色突出显示)，Cas13f突变体F7V2、F10V1、F10V4、F40V2和F40V4具有相对于WT最高的5种高切割活性(以灰色突出显示)。

通过生成多种具有单个或多个(例如，双重、三重或四重)突变的另外的Cas13f突变体，在这些Cas13f突变体的经选择的区域中或附近进行了第二轮诱变研究。如此产生的Cas13f突变体和突变区段的氨基酸序列在下表3中提供，并且每个Cas13f突变体的其他部分与SEQ ID NO:1的参考Cas13f多肽相同。下表4中列出了它们的切割和旁切活性。

表3.Cas13f突变体的设计

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表4.表3中Cas13f突变体的平均切割和旁切活性(n＝3)

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Cas13f突变体在表4中以相对于WT的低到高的旁切活性的顺序排列。注意到，在那些相对于WT具有低于40％旁切活性的Cas13f突变体中(以灰色突出显示)，Cas13f突变体F10S48、F10S49、F40S23、F10S33和F40S26具有相对于WT最高的5种高切割活性(以灰色突出显示)。

选择Cas13f突变体F40S23(Cas13f-Y666A、Y677A、SEQ ID NO:3)用于进一步的工程化。

实施例2针对增加的切割活性对突变体F40S23的工程化

在实施例1中，已针对低间隔序列非依赖性旁切活性(“旁切活性”，“脱靶切割活性”)对Cas13f突变体进行筛选。为了提高间隔序列特异性切割活性(“切割活性”，“中靶切割活性”)，同时保持低旁切活性，将表5中所示的从实施例1中鉴定的一种或多种突变进一步引入到Cas13f突变体F40S23中。

本实施例证明，通过引入一个或多个氨基酸取代，F40S23的切割活性可以显著增加，并且旁切活性可以基本保持甚至降低。

表5.用于引入突变体F40S23的可用突变

突变	实施例1中对应的突变体
		D160A	F10S6
T161A	F10S7
		L631A	F38S1
L634A	F38S4
		H638A	F38S8
L641A	F38S11
		D642A	F38S12
T647A	F38S17
		P667A	F40S3
V670A	F40S6
		D762A	F46S6
A763V	F46S7

设计和构建：

构建了包含报告质粒和表达质粒的两质粒哺乳动物荧光报告系统(图4)，用于检测基于F40S23进一步工程化的Cas13f突变体的切割和旁切活性。

报告质粒包含ATXN2 cDNA编码序列(其RNA转录物作为Cas13f突变体的切割活性的RNA靶标)，随后是在SV40启动子和poly A序列的调控下的p2A(自切割肽)和EGFP报告基因(SEQ ID NO:7)。EGFP mRNA与来自报告质粒的ATXN2RNA转录物一起转录以形成嵌合转录物。当作为嵌合转录物的一部分的ATXN2 RNA转录物由ATXN2靶向gRNA(SEQ ID NO:16)指导的Cas13f突变体切割时，作为嵌合转录物的另一部分的EGFR mRNA也会由于例如总RNA不稳定性而逐渐降解，导致EGFP(绿色)的荧光强度降低。

表达质粒包含(1)在Cbh启动子和poly A序列的调控下侧接5’和3’SV40 NLS(SEQID NO:5)编码序列两者的Cas13f突变体编码序列、(2)在U6启动子的调控下编码由5’-DR序列(SEQ ID NO:2)-AXTN2靶向间隔序列(SEQ ID NO:8)-DR序列(SEQ ID NO:2)-3’组成的ATXN2靶向gRNA(SEQ ID NO:16)的序列、以及(3)在SV40启动子和poly A序列的调控下的mCherry报告基因(其RNA转录物作为Cas13f突变体的旁切活性的RNA靶标)。在Cas13f突变体保留基本旁切活性的情况下，mCherry RNA转录物可能被切割，导致mCherry(红色)的荧光强度降低。

用RHO cDNA编码序列，随后是p2A(自切割肽)和EGFP报告基因(SEQ ID NO:10)以及RHO靶向间隔序列(SEQ ID NO:11)以相同方式构建了一对类似的报告和表达质粒，用于另外评估Cas13f突变体的切割和旁切活性。由5’-DR序列(SEQ ID NO:2)-RHO靶向间隔序列(SEQ ID NO:11)-DR序列(SEQ ID NO:2)-3’组成的RHO靶向指导RNA在SEQ ID NO:17中示出。

转染和检测：

根据标准细胞培养方法，使HEK293T细胞在24孔组织培养板中生长至合适的密度，然后使用PEI转染试剂用两种质粒转染细胞。将经转染的细胞在37℃在5％的CO₂下在培养箱中培养约72小时，然后用FACS测量所述细胞中的EGFP和mCherry荧光信号。低EGFP平均荧光强度(MFI)指示所希望的高切割活性。高mCherry MFI指示所希望的低旁切活性。

作为阴性对照(“NT”)，将编码F40S23的表达质粒和包含非靶向间隔序列(SEQ IDNO:9)而不是靶向间隔序列的gRNA与报告质粒一起用于转染。由于旁切仅由中靶切割触发，理论上，当使用非靶向间隔序列时，不应发生旁切或中靶切割。因此，Cas13f突变体的所有MFI结果(平均值±SD)均相对于阴性对照归一化。

作为阳性对照(“PT”或“F40S23”)，将编码F40S23的表达质粒和包含靶向间隔序列的gRNA与报告质粒一起用于转染。

此外，对Cos7细胞中的内源性基因组位点SOD1进行RT-qPCR用于测试，以研究指示Cas13f突变体的切割活性的SOD1 mRNA敲低。根据标准细胞培养方法，使Cos7细胞在6孔组织培养板中生长至合适的密度，然后使用PEI转染试剂用编码Cas13f突变体和SOD1靶向指导RNA(SEQ ID NO:18)的表达质粒中的每一个转染细胞。72小时后，通过流式分选对前30％的量的mCherry阳性细胞进行分选，从阳性细胞中提取总RNA，并且通过RT-qPCR测量SOD1mRNA水平，并将其相对于管家基因GAPDH归一化。

每个测试的Cas13f突变体的切割活性与EGFP MFI呈负相关。EGFP MFI越低，切割活性就越高。因此，Cas13f突变体相对于参考F40S23的切割活性显示为Cas13f突变体的EGFP MFI相对于F40S23的EGFP MFI的倒数。

相对于F40S23的切割活性＝1/(Cas13f突变体的EGFP MFI/F40S23的EGFP MFI)。

每个测试的Cas13f突变体的旁切活性与mCherry MFI呈负相关。mCherry MFI越高，旁切活性就越低。因此，Cas13f突变体相对于参考F40S23的旁切活性显示为Cas13f突变体的mCherry MFI相对于F40S23的mCherry MFI的倒数。

相对于F40S23的旁切活性＝1/(Cas13f突变体的mCherry MFI/F40S23的mCherryMFI)。

此外，对于RT-qPCR测试，每个测试的Cas13f突变体的切割活性与SOD1 mRNA水平呈负相关。SOD1 mRNA水平越低，切割活性就越高。因此，Cas13f突变体相对于参考F40S23的切割活性显示为Cas13f突变体的SOD1 mRNA水平相对于F40S23的SOD1 mRNA水平的倒数。

相对于F40S23的切割活性＝1/(Cas13f突变体的SOD1 mRNA水平/F40S23的SOD1mRNA水平)。

结果：

注意到，表6中列出的Cas13f突变体不仅具有比F40S23更高的切割活性，而且还具有比F40S23更低的旁切活性。

表6.如通过MFI呈现的列出的Cas13f突变体的平均切割和旁切活性，其中gRNA靶向ATXN2 RNA转录物(n＝3)

此外，下表7中的RT-qPCR结果显示，与F40S23相比，所有列出的Cas13f突变体的SOD1 mRNA敲低效率都有所提高。

表7.对于所列出的Cas13f突变体，通过RT-qPCR在Cos7细胞中的平均SOD1mRNA水平(n＝3)

上述结果表明，向F40S23中另外引入表5中所列的单点突变，增强了切割活性，同时保持或者甚至降低了F40S23的旁切活性。

基于上述结果和同一实验程序，随后将单一突变成对组合以引入F40S23中，以进一步评估所得突变体的切割和旁切活性，如下表8中所示。

表8.如通过MFI呈现的列出的Cas13f突变体的平均切割和旁切活性，其中gRNA靶向RHO RNA转录物(n＝3)

表8中的结果显示，与F40S23相比，所列出的Cas13f突变体的旁切活性降低，并且所列出的Cas13f突变体具有F40S23的至少75％的切割活性(例如，F40S23+L631A和L641A)，F40S23的至少95％的切割活性(例如，F40S23+H638A和L641A)，或者与F40S23相比，所列出的Cas13f突变体的切割活性增加。

特别地，突变体F40S23+D160A和D642A(Cas13f-D160A+D642A+Y666A+Y677A，其全长氨基酸序列在SEQ ID NO:4中示出，命名为“hfCas13f”)实现了最高的切割活性和最低的旁切活性两者。

进行另外评估以验证表9-11中特定突变体的切割和旁切活性。

表9.如通过MFI呈现的Cas13f突变体的平均切割和旁切活性，其中gRNA靶向EGFPRNA转录物(SEQ ID NO:15中所示的gRNA)(n＝3)

表9中的结果显示，与F40S23相比，对于EGFP靶标，突变体具有显著提高的切割活性，同时保持了旁切活性。

表10.如通过MFI呈现的Cas13f突变体的平均切割和旁切活性，其中gRNA靶向ATXN2 RNA转录物(SEQ ID NO:16中所示的gRNA)(n＝3)

表10中的结果显示，与F40S23相比，对于ATXN2靶标，突变体具有显著提高的切割活性和显著降低的旁切活性。

表11.对于Cas13f突变体，通过RT-qPCR的Cos7细胞中平均SOD1 mRNA水平(SEQ IDNO:18中所示的gRNA)(n＝3)

表11中的结果显示，与突变体F40S23相比，对于SOD1靶标，突变体具有显著提高的切割活性。

实施例3针对增加的切割活性对hfCas13f的工程化

本实施例证明，通过将特定氨基酸突变引入hfCas13f，可以进一步显著增加切割活性。

设计和构建：

为了获得切割活性增加的Cas13f突变体，将hfCas13f中除HEPN1和HEPN2结构域中的非碱性氨基酸外的一种非碱性氨基酸突变为精氨酸(R，常见的带正电荷的碱性氨基酸)，以构建Cas13f突变体(图5)。

构建了包含突变体编码质粒和gRNA编码质粒的两质粒哺乳动物荧光报告系统(图6)，用于检测基于hfCas13f进一步工程化的Cas13f突变体的切割活性。

突变体编码质粒包含(1)在SV40启动子和poly A序列的调控下的mCherry红色荧光报告基因(其RNA转录物作为Cas13f突变体的切割活性的RNA靶标)，(2)在Cbh启动子和poly A序列的调控下侧接5'和3’SV40 NLS(SEQ ID NO:5)编码序列两者的Cas13f突变体编码序列，以及(3)在CMV启动子和poly A序列的调控下的BFP荧光报告基因。来自BFP的蓝色荧光将指示突变体编码质粒在宿主细胞中的成功转染和表达。

gRNA编码质粒包含在U6启动子的调控下编码由5'-DR序列(SEQ ID NO:2)-mCherry靶向间隔序列(SEQ ID NO:13)-DR序列(SEQ ID NO:2)-3'组成的mCherry靶向gRNA(SEQ ID NO:19)的序列。

转染和检测：

根据标准方法将HEK293T细胞在24孔组织培养板中培养12小时，然后使用标准聚乙烯亚胺(PEI)转染将两个质粒共转染到细胞中。然后将经转染的细胞在37℃在5％的CO₂下培养约48小时。然后通过流式细胞术分析BFP阳性培养的细胞。

作为阴性对照(“NT”)，将编码hfCas13f的突变体编码质粒和编码非靶向间隔序列(SEQ ID NO:14)而不是mCherry靶向间隔序列(SEQ ID NO:13)的gRNA编码质粒一起用于转染。Cas13f突变体的所有mCherry(RFP)MFI结果(平均值±SD)均相对于阴性对照归一化。

作为阳性对照(“PT”或“hfCas13f”)，将编码hfCas13f的突变体编码质粒和编码mCherry靶向间隔序列(SEQ ID NO:13)的gRNA编码质粒一起用于转染。

每个测试的Cas13f突变体的切割活性与mCherry MFI呈负相关。mCherry MFI越低，切割活性就越高。因此，Cas13f突变体相对于参考hfCas13f的切割活性显示为Cas13f突变体的mCherry MFI相对于hfCas13f的mCherry MFI的倒数。

相对于hfCas13f的切割活性＝1/(Cas13f突变体的mCherry MFI/hfCas13f的mCherry MFI)。

结果：

将Cas13f突变体与作为阳性对照的hfCas13f分四批进行测试，由此排除转染效率对切割活性的影响。流式细胞术结果显示每个具有单个氨基酸取代为R的Cas13f突变体的mCherry MFI。其中，每个Cas13f突变体在位置183、189、200、202、204、205、213、214、222、233、239、240、241、258、259、276、282、283、298、299、300、314、320、329、338、339、345、353、361、383、410、433、451、455、497、508、509、518、520、526、574、595、598、599或601(以灰色突出显示)处都具有单个氨基酸取代为R，与hfCas13f相比，Cas13f突变体在一个或多个批次中的mCherry MFI更弱，表明切割活性增加(表12-15)。

表12.Cas13f突变体的平均mCherry MFI(n＝2)

表13.Cas13f突变体的平均mCherry MFI(n＝2或1)

表14.Cas13f突变体的平均mCherry MFI(n＝2)

表15.Cas13f突变体的平均mCherry MFI(n＝2或1)

***

在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法、药物组合物和试剂盒的各种修改和变化对本领域的技术人员将是显而易见的。尽管本发明已经结合特定的实施方式进行了说明，但是应当理解能够进行进一步的修改，并且要求保护的本发明不应该不当地受限于此类特定的实施方式。实际上，对于该领域的技术人员显而易见的、用于执行本发明的所描述的方式的各种修改旨在落入本发明的范围内。本申请意在涵盖任何一般而言依循本发明的原理的变化、用途或改编，且包括这样的偏离本公开的内容：其在本发明所属领域的已知或惯常操作内、且可适用于此前所示的基本特征。

Claims

1.一种工程化Cas13f多肽，其中所述工程化Cas13f多肽：

(2)包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸序列的双突变Y666A和Y677A的双突变；并且

2.如权利要求1所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有至少约70％(例如，至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％)的间隔序列特异性切割活性。

3.如权利要求1或2所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有最多约120％(例如，最多约120％、115％、110％、105％、100％、95％、90％、85％、80％、75％或70％)的间隔序列非依赖性旁切活性。

4.如权利要求1-3中任一项所述的工程化Cas13f多肽，(1)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有至少约75％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有最多约90％的间隔序列非依赖性旁切活性。

5.如权利要求1-3中任一项所述的工程化Cas13f多肽，(1)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有至少约100％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有最多约90％的间隔序列非依赖性旁切活性。

6.如权利要求1-3中任一项所述的工程化Cas13f多肽，(1)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有至少约130％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有最多约110％的间隔序列非依赖性旁切活性。

7.如权利要求1-3中任一项所述的工程化Cas13f多肽，(1)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有至少约130％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有最多约100％的间隔序列非依赖性旁切活性。

8.如权利要求1-3中任一项所述的工程化Cas13f多肽，(1)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有至少约130％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有最多约90％的间隔序列非依赖性旁切活性。

9.如权利要求1-8中任一项所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的以下位置的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代：160、161、183、189、200、202、204、205、213、214、222、233、239、240、241、258、259、276、282、283、298、299、300、314、320、329、338、339、345、353、361、383、410、433、451、455、497、508、509、518、520、526、574、595、598、599、601、631、634、638、641、642、647、667、670、762、763及其组合。

10.如权利要求9所述的工程化Cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用非极性氨基酸残基(如甘氨酸(Gly/G)、丙氨酸(Ala/A)、缬氨酸(Val/V)、半胱氨酸(Cys/C)、脯氨酸(Pro/P)、亮氨酸(Leu/L)、异亮氨酸(Ile/I)、蛋氨酸(Met/M)、色氨酸(Trp/W)、苯丙氨酸(Phe/F)，或带正电荷的氨基酸残基(如赖氨酸(Lys/K)、精氨酸(Arg/R)、组氨酸(His/H))进行的取代。

11.如权利要求10所述的工程化Cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用精氨酸(Arg/R)残基取代非精氨酸(Arg/R)残基。

12.如权利要求10所述的工程化Cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用丙氨酸(Ala/A)残基取代非丙氨酸(Ala/A)残基。

13.如权利要求10所述的工程化Cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用缬氨酸(Val/V)残基取代丙氨酸(Ala/A)残基。

14.如权利要求1-13中任一项所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的以下位置的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代：160、161、631、634、638、641、642、647、667、670、762、763及其组合。

15.如权利要求14所述的工程化Cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用丙氨酸(Ala/A)残基取代非丙氨酸(Ala/A)残基或用缬氨酸(Val/V)残基取代丙氨酸(Ala/A)残基。

16.如权利要求14或15所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置D160、H638、D642及其组合的位置的一个或多个位置处用丙氨酸(Ala/A)残基进行的氨基酸取代。

17.如权利要求16所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于SEQID NO:3的氨基酸序列的以下位置的一个或多个位置处用丙氨酸(Ala/A)残基进行的氨基酸取代：

(a)位置D160、

(b)位置H638、

(c)位置D642、

(d)位置D160和H638、

(e)位置D160和D642、

(f)位置H638和D642、或

(g)位置D160和L631。

18.如权利要求17所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的位置D160、D642、Y666和Y677的位置处用丙氨酸(Ala/A)残基进行的四重氨基酸取代。

19.如权利要求18所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。

20.如权利要求1-19中任一项所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的以下位置的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代：183、189、200、202、204、205、213、214、222、233、239、240、241、258、259、276、282、283、298、299、300、314、320、329、338、339、345、353、361、383、410、433、451、455、497、508、509、518、520、526、574、595、598、599、601及其组合。

21.如权利要求20所述的工程化Cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用精氨酸(Arg/R)残基取代非精氨酸(Arg/R)残基。

22.如权利要求21所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比具有增加的间隔序列特异性切割活性。

23.如权利要求22所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比具有至少约105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％的间隔序列特异性切割活性。

24.如权利要求20-23中任一项所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置G282、F314、Y338、E410、Q520、L526、F598及其组合的位置的一个或多个位置处用精氨酸(Arg/R)残基进行的氨基酸取代。

25.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-24中任一项所述的工程化Cas13f多肽；任选地，所述多核苷酸经密码子优化以在真核生物、哺乳动物如非人哺乳动物、非人灵长类动物、人、植物、昆虫、鸟、爬行动物、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)、鱼、线虫或酵母中表达。

26.一种CRISPR-Cas13f系统，所述CRISPR-Cas13f系统包含：

a)权利要求1-24中任一项所述的工程化Cas13f多肽或编码所述工程化Cas13f多肽的多核苷酸(例如，DNA、RNA)；以及

ii.能够与靶RNA杂交，由此将所述复合物引导至所述靶RNA的间隔序列；

任选地，其中所述DR序列具有与SEQ ID NO:2的DR序列的二级结构基本上相同的二级结构；并且

任选地，其中所述间隔序列的长度为至少约15个核苷酸，任选地为约30个核苷酸。

27.一种载体，所述载体包含权利要求25所述的多核苷酸；

任选地，其中所述多核苷酸与启动子和任选的增强子可操作地连接；

任选地，其中所述启动子是组成型启动子，诱导型启动子，广谱启动子，或细胞、组织或器官特异性启动子；

任选地，其中所述载体是质粒；

任选地，其中所述载体是逆转录病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、AAV载体或慢病毒载体；

任选地，其中所述AAV载体为包含衣壳的重组AAV颗粒，所述衣壳的血清型为AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAV.PHP.eB、AAV1-AAV13中的任一者所属的进化枝的成员、或其功能变体(例如，功能截短物)；和/或

任选地，其中所述AAV载体是包封RNA的AAV颗粒。

28.一种递送系统，所述递送系统包含(1)递送媒介物，和(2)权利要求1-24中任一项所述的工程化Cas13f多肽、权利要求25所述的多核苷酸、权利要求26所述的CRISPR-Cas13f系统、或权利要求27所述的载体；

任选地，其中所述递送媒介物是纳米颗粒(例如，LNP)、脂质体、外泌体、微泡或基因枪。

29.一种修饰靶RNA的方法，所述方法包括使所述靶RNA与权利要求26所述的CRISPR-Cas13f系统、权利要求27所述的载体、或权利要求28所述的递送系统接触，由此修饰所述靶RNA。

30.一种在有需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求26所述的CRISPR-Cas13f系统，其中所述疾病与靶RNA关联，其中所述CRISPR-Cas13f系统修饰所述靶RNA，并且其中对所述靶RNA的修饰治疗所述疾病。

31.如权利要求29或30所述的方法，其中所述靶RNA是mRNA、tRNA、核糖体RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、非编码RNA、长非编码(lnc)RNA、核RNA、干扰RNA(iRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核酶、核糖开关、卫星RNA、微开关、微酶或病毒RNA；

任选地，其中所述靶RNA由真核DNA编码；和/或

任选地，其中所述真核DNA是哺乳动物DNA，如非人哺乳动物DNA、非人灵长类动物DNA、人DNA、植物DNA、昆虫DNA、鸟DNA、爬行动物DNA、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)DNA、鱼DNA、线虫DNA、或酵母DNA。

32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述疾病选自青光眼，与年龄相关的RGC丧失，视神经损伤，视网膜缺血，莱伯遗传性视神经病变，与RGC神经元退化相关的神经病症，与有需要的受试者的纹状体中功能性神经元退化相关的神经病症，帕金森病，阿尔茨海默病，亨廷顿病，精神分裂症，抑郁症，药物成瘾，运动障碍如舞蹈病、舞蹈徐动症和动作障碍，双相障碍，自闭症谱系障碍(ASD)，功能失调，MECP2重复综合征(MDS)，天使综合征，年龄相关性黄斑变性(AMD)和肌萎缩侧索硬化(ALS)。