JP2023550381A - 真核生物遺伝子編集のためのベクター、システムおよび方法 - Google Patents

Abstract

真核細胞のゲノムを編集するための組成物および方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列は、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａタンパク質をコードする。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＡＢＥ７．１０またはＡＢＥ８である。一部の実施形態では、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群より選択されるＡＢＰによって特異的に結合されるアプタマー配列をコードする。

Description

先行関連出願
本出願は、２０２０年１１月１９日に出願された米国仮出願第６３／１１５，９３２号の利益を主張し、これは、その全体が、これにより参照により本明細書に組み込まれる。

分野
本開示は、真核生物遺伝子編集のための組成物およびそれを使用する方法を記載する。

ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してテキストファイルとして提出された配列表に対する言及
配列表の正式な写しは、０９５１９９－１２７５９５４＿ｓｅｑｌｉｓｔというファイル名で、２０２１年１１月１５日に作成され、７９．０ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマット文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

背景
アデニンデアミナーゼとヌクレアーゼ欠損ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連９）の融合は、二本鎖ＤＮＡ切断なしでゲノムＤＮＡを編集することができるアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）を作出する。塩基編集は、二本鎖切断を生じることなく、ゲノムＤＮＡにおいて正確な点変異を生じる。さらに、アデニン塩基編集は、ＤＮＡドナー鋳型を必要とせず、細胞相同指向性修復に依拠しない。そのため、これは、疾患を引き起こす点変異の６１％を占める対変異によって引き起こされる遺伝性疾患のための遺伝子治療として大きな可能性を有している。アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）は、多くのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ研究において使用されているが、ＡＢＥは、安全性の懸念を生じ、その潜在的な臨床適用を妨げる、顕著なガイド非依存性ＲＮＡオフターゲット活性を示す。そのため、ＡＢＥのＲＮＡオフターゲット活性を低減するための組成物および方法が必要である。

概要
非ウイルス核酸配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドであって、非ウイルス核酸配列が、（ｉ）アデノシン塩基対エディター（ＡＢＥ）をコードする核酸配列であって、ＡＢＥが、アデノシンデアミナーゼおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質である、核酸配列、ならびに（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列を含む、哺乳動物発現プラスミドが本明細書に提供される。

一部の実施形態では、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列は、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａタンパク質をコードする。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＡＢＥ７．１０またはＡＢＥ８である。一部の実施形態では、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群より選択されるＡＢＰによって特異的に結合されるアプタマー配列をコードする。一部の実施形態では、アプタマーは、ＭＳ２アプタマー配列またはｃｏｍアプタマー配列である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡコード配列は、ｓｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのアプタマーを含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡコード配列は、ｇＲＮＡコード配列のＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのｃｏｍアプタマーを含む。

（ａ）Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含むパッケージングプラスミドであって、Ｇａｇヌクレオチド配列が、ヌクレオカプシド（ＮＣ）コード配列およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）コード配列を含み、ＮＣコード配列またはＭＡコード配列の一方または両方が、少なくとも１つの非ウイルスアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含み、パッケージングプラスミドが、機能的インテグラーゼタンパク質をコードしない、パッケージングプラスミド、（ｂ）本明細書に提供される少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミド、ならびに（ｃ）エンベロープ糖タンパク質コード配列を含むエンベローププラスミドを含む、レンチウイルスパッケージングシステムも提供される。

一部の実施形態では、パッケージングプラスミドは、Ｒｅｖヌクレオチド配列およびＴａｔヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、システムは、Ｒｅｖヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングプラスミドをさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列は、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチド、またはＣｏｍタンパク質をコードする。

（ａ）ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質またはマトリックス（ＭＡ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、ＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質が、少なくとも１つの非ウイルスアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質、ならびに（ｂ）（ｉ）アデニン塩基エディターおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドであるアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、および（ｉｉ）ｇＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体を含むレンチウイルス様粒子であって、機能的インテグラーゼタンパク質を含まない、レンチウイルス様粒子がさらに提供される。一部のレンチウイルス様粒子では、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、触媒的に損なわれたＣａｓ９タンパク質、触媒的に損なわれたＣｐｆ１タンパク質、またはいずれかの誘導体である。一部のレンチウイルス様粒子では、アデニン塩基エディターは、ＡＢＥ７．１０またはＡＢＥ８である。

レンチウイルス様粒子を産生する方法であって、（ａ）複数の真核細胞を、本明細書に記載されるシステムのいずれかのパッケージングプラスミド、少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミド、およびエンベローププラスミドでトランスフェクトすること、ならびに（ｂ）トランスフェクトされた真核細胞を、レンチウイルス様粒子が産生されるのに十分な時間、培養することを含む、方法も提供される。一部の実施形態では、産生されるレンチウイルス様粒子は、（ｉ）アデノシンデアミナーゼおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドであるアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、ならびに（ｉｉ）ガイドＲＮＡを含むＲＮＰを含む。一部の実施形態では、複数の真核細胞は、哺乳動物細胞である。

細胞においてゲノム標的配列を改変する方法であって、複数の真核細胞を、本明細書に記載される複数のウイルス粒子で形質導入することを含み、ＲＮＰが、細胞のゲノムＤＮＡにおけるゲノム標的配列に結合し、ＡＢＥが、ゲノム標的配列におけるアデニンを脱アミノ化し、それによって、ゲノム標的配列を改変する、方法がさらに提供される。一部の方法では、複数の真核細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、複数の真核細胞は、対象中に存在する細胞である。一部の実施形態では、対象は、ヒト対象である。一部の実施形態では、対象は、複数のウイルス粒子を注射される。

本明細書に記載されるプラスミド、レンチウイルスパッケージングシステムまたはレンチウイルス様粒子のいずれかを含む細胞も提供される。本明細書に提供される方法のいずれかによって改変された細胞も提供される。

対象における疾患を処置するための方法であって、（ａ）対象から細胞を得ること、および（ｂ）対象の細胞を、本明細書に記載されるゲノム編集方法のいずれかを使用して改変すること、および改変された細胞を対象に投与することを含む、方法がさらに提供される。一部の実施形態では、疾患は、がんである。一部の実施形態では、疾患は、鎌状赤血球貧血である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。

図の説明
本出願は、以下の図を含む。図は、ある特定の実施形態ならびに／または組成物および方法の特色を説明し、組成物および方法の任意の記載を補足することを意図する。図は、明細書が明確にそうであることを示さない限り、組成物および方法の範囲を限定するものではない。

図１Ａは、本開示の態様による、ヒトＵＳＰ３８ ｍＲＮＡにおける予測されるＡＢＥオフターゲットホットスポットを示す図である。予測されるホットスポット（赤色）およびＰＣＲ増幅のために使用されたプライマーを示す。

図１Ｂは、本開示の態様による、ＡＢＥ ＤＮＡトランスフェクション後にＵＳＰ３８ ｍＲＮＡ領域の４４０ｎｔ領域における高レベルのＡからＧへの変化が検出された、ＲＴ－ＰＣＲの結果および標的化ＮＧＳを示す。Ｘ軸の上のピークは、ＡＢＥおよびｓｇＲＮＡ（ＡＢＥ部位１を標的化する）を発現するプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた細胞において観察された。ピーク（非常に低い、陰性エリア中）は、対照細胞（ＡＢＥ部位１を標的化するＣａｓ９ニッカーゼでトランスフェクトされた）において観察された。予測されるホットスポット（ＣＵＡＣＧＡＡ）に対応する最も高いピークを示す。

図１Ｃは、本開示の態様による、ＡＢＥ部位１を標的化するＡＢＥを発現するプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた細胞からの最も頻繁なＮＧＳリード（配列番号１０８～１１７）の配列を示す。予測されるＲＮＡオフターゲットホットスポットに下線を付ける（最も高いピーク）。ＡからＧへの変化を示す。破線のボックスによってマークされたＴＡジヌクレオチドは、図１Ｂにおいてマークされた２番目のピークに対応する。３つの影付きの対立遺伝子は、ホットスポットにおいてＡからＧへの変化を有さないが、２番目のピークにおいてＡからＧへの変化を有する。ＤＮＡ試料を、処理４８時間後に収集した。

図１Ｄは、本開示の態様による、ＡＢＥ部位１でのオンターゲット塩基編集の次世代配列（ＮＧＳ）分析の結果を示す。配列番号１１８は、参照配列として示される。リードの９６．３０％が配列番号１１８に対応し、配列番号１１９および１２０は、それぞれ、リードの２．２２％および０．２５％を表す。２０μｇのＡＢＥ ＲＮＰで処理され、ＮＧＳのために電気穿孔２４時間後に収集された細胞（２×１０^５個）からのデータを示す。

図２Ａは、本開示の態様による、ＡＢＥ ＲＮＰパッケージングのためのｓｇＲＮＡスキャフォールドに対する例示的な改変である（配列番号１２１）。テトラループ（ＧＡＡＡ）およびＳＴ２ループは、破線ボックスによって示される。コアアプタマー配列に下線を付け、追加のリンカーには下線を付けていない。縦線は相補的塩基対を示し、ドットは非標準塩基対を示す。図３Ａに示されるように、テトラループおよびＳＴ２ループは、ＭＳ２アプタマー配列（配列番号１２２）と置き換えることができる。別の例では、テトラループまたはＳＴ２ループは、ｃｏｍアプタマー配列（配列番号１２３）と置き換えることができる。

図２Ｂは、本開示の態様による、ＡＢＥ部位１におけるＡＢＥ－ｇ１ ＲＮＰ活性を検出するｑＰＣＲの結果を示す。合計で２００ｎｇのさまざまなＬＶカプシドのｐ２４を使用して、２．５×１０^４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入した。ｇＤＮＡを、プライマーがマッチする編集された配列によるｑＰＣＲのために使用した。＊＊＊は、ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）後のチューキー多重比較検定を示す。エラーバーは、３反復のｓ．ｅ．ｍを示す。

図２Ｃは、本開示の態様による、ＡＢＥ部位５におけるＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰ活性を検出するｑＰＣＲの結果を示す。＊ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意でない；ＡＮＯＶＡ後のチューキー多重比較検定。

図２Ｄは、本開示の態様による、ＡＢＥ部位５でのカプシドＲＮＰ媒介塩基編集のＮＧＳ分析を示す。カプシドＲＮＰ（１０８ｎｇのｐ２４）を使用して、２．５×１０^４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入した。配列番号１２４は、参照配列である。＞０．２％の塩基編集頻度を有する対立遺伝子を、列挙し（配列番号１２５～１３３）、異なる位置でのＡ＞Ｇ変化の頻度を下部に示す。

図３は、本開示の態様による、ＡＢＥ部位１でのカプシドＲＮＰ媒介塩基編集のＮＧＳ分析を示す。２００ｎｇのｐ２４の量のカプシドＲＮＰを使用して、２．５×１０^４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入した。配列番号１３４は、参照配列である。＞０．１％の塩基編集頻度を有する対立遺伝子を、列挙し（配列番号１３４～１３９）、異なる位置でのＡ＞Ｇ変化の頻度を下部に示す。

図４Ａは、アプタマー／アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）相互作用が、本開示の態様による、レンチウイルスカプシドにおける機能的ＡＢＥパッケージングのために必要であることを示す。４０ｎｇのｐ２４（ＥＬＩＳＡ）ＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰカプシドおよびＡＢＥ－ｇ５^{ＳＴ２－ｃｏｍ} ＲＮＰカプシドを、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ１００ありまたはなしで処理し、ｐ２４およびＡＢＥを、ウエスタンブロッティングによって検出した。ｐ２４の画像は、無関係レーンを除去した同じブロットからである。アスタリスクは全長タンパク質を示す。

図４Ｂは、本開示の態様による、ＬＶカプシドにおけるＡＢＥタンパク質の量の推定を示す。

図４Ｃは、本開示の態様による、ＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰカプシドおよびＡＢＥ－ｇ５^{ＳＴ２－ｃｏｍ} ＲＮＰカプシドの塩基編集活性のｑＰＣＲ検出の結果を示す。２．５×１０^４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２００ｎｇのカプシドＲＮＰのｐ２４で処理した。４８時間後、ｇＤＮＡを、抽出し、ｐＰＣＲによって分析して、部位５での塩基編集を検出した。ＡＢＥ－ｇ１^{ＳＴ２－ｃｏｍ} ＲＮＰカプシドで処理された細胞からのＤＮＡ（図３Ｂから）を、部位特異性を示すための対照として使用した。

図４Ｄは、本開示の態様による、ＰＣＲ検出におけるｃｏｍ添加の効果を調べるための公知の濃度のプラスミドＤＮＡを使用するｑＰＣＲの結果を示す。

図４Ｅは、本開示の態様による、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００ありおよびなしで処理されたＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰおよびＡＢＥ－ｇ５^{ＳＴ２－ｃｏｍ} ＲＮＰカプシドにおけるｓｇＲＮＡレベルのＲＴ－ｑＰＣＲ比較を示す。＊＊＊は、ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ事後検定におけるｐ＜０．０００１を示す。

図５Ａは、本開示の態様による、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入した後のＡＢＥレベルのウエスタンブロットである。ＡＢＥおよびβ－アクチンのゲル画像を示す。矢印は、全長ＡＢＥバンドの位置を示す。β－アクチンの画像は、すべての試料が、溶解物インプットを有することを実証する。ＲＮＰ量は細胞増殖と無関係であったので、正規化は試みなかった。

図５Ｂは、本開示の態様による、タンパク質分解のデンシトメトリー分析である。全長ＡＢＥバンドのみを定量化した。半減期を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０の２相減衰モデルを使用して推定した。

図６は、本開示の態様による、ＵＳＰ３８ ｍＲＮＡにおけるホットスポットでのカプシド－ＲＮＰ処理細胞におけるＲＮＡオフターゲットのＮＧＳ分析である。カプシド－ＲＮＰ（ＡＢＥ部位１を標的化）処理細胞（Ｘ軸の上のピーク）、およびニッカーゼで処理された陰性対照細胞（Ｘ軸の下のピーク）における置換率は、相違を示さなかった。両方のピークでのＡからＧへの変化率は、バックグラウンドレベルのものであった。予測されるホットスポットの位置を示す。２つの実験の１つの代表的な写真を示す。

定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が他を明確に示さない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。

「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語、およびそれらの変形形態の本明細書での使用は、その後に列挙される要素およびその等価物、ならびに追加の要素を包含することを意味する。ある特定の要素を「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」として列挙される実施形態はまた、これらのある特定の要素「から本質的になる」および「からなる」として企図される。本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能な組合せ、ならびに選択肢（「または」）において解釈される組合せの欠如を指し、それを包含する。

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という移行句（および文法的変形形態）は、特許請求された発明の列挙された材料またはステップ「ならびに基本的なおよび新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないもの」を包含するとして解釈されるべきである。In re Herz、537 F.2d 549、551-52、190 U.S.P.Q.461、463(CCPA 1976)（原文において強調）を参照されたく、またMPEP §2111.03も参照されたい。そのため、「から本質的になる」という用語は、本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であるとして解釈されるべきではない。

「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、および一本鎖または二本鎖形態のいずれかのそのポリマーを指す。ＲＮＡが記載される場合、ウリジンがチミジンとして表されるその対応するＤＮＡも記載されることが理解される。同様に、ＤＮＡが記載される場合、チミジンがウリジンによって表されるその対応するＲＮＡも記載される。具体的に限定されない限り、用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知アナログを含有する核酸を包含する。他に指示されない限り、特定の核酸配列は、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補配列、ならびに明確に示された配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。本発明のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステムおよびループ構造などを含む配列のすべての形態も包含する。

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生またはコードに関与するＤＮＡのセグメントを指し得る。これは、コーディング領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。あるいは、「遺伝子」という用語は、非翻訳ＲＮＡ、例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはマイクロＲＮＡの産生またはコードに関与するＤＮＡのセグメントを指し得る。

「処置すること」は、任意の客観的または主観的パラメーター、例えば、緩和；寛解；症状の減少、もしくは疾患状態を患者により耐えられるようにすること；変性もしくは減退の速度を減速すること；または変性の最終点をあまり衰弱しないようにすることを含む、疾患、状態または障害の処置または回復または防止の任意の成功の兆候を指す。症状の処置または回復は、客観的または主観的パラメーターに基づき得、医師による検査の結果を含む。したがって、「処置すること」という用語は、本明細書に記載される疾患、状態または障害に関連する症状または状態の発生を防止もしくは遅延するための、軽減するための、または停止もしくは阻害するための本開示の化合物、レンチウイルス様粒子または薬剤の投与を含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状または疾患の副作用の低減、排除または防止を指す。本開示の方法を使用する「処置すること」または「処置」は、本明細書に記載される疾患、状態または障害に関連する疾患または障害の増加したリスクがあり得るが、まだ症状を経験していないもしくは示していない対象において、症状の開始を防止すること、疾患または障害の症状を阻害すること（その発生を減速することまたは停止すること）、疾患の症状または副作用からの解放を提供すること（待期療法を含む）、および疾患の症状を緩和すること（退縮を引き起こすこと）を含む。処置は、疾患もしくは状態の予防的な（疾患の開始を防止するもしくは遅延させるため、またはその臨床的もしくは無症候性症状の顕在化を防止するため）、または疾患もしくは状態の顕在化後の症状の治療的な抑制もしくは軽減であり得る。「処置」という用語は、本明細書で使用される場合、防止（例えば、予防）処置、治癒処置または待期療法を含む。

「プロモーター」は、核酸の転写を指示する１つまたは複数の核酸制御配列として定義される。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写の開始部位に近い必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合では、ＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターは、必要に応じて、転写の開始部位から数千塩基対程度に位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書で互換的に使用される。３つの用語はすべて、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用される場合、用語は、全長タンパク質、トランケートされたタンパク質およびその断片、ならびにアミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結されているアミノ酸鎖を包含する。全体を通して使用される場合、「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」という用語は、２つまたはそれよりも多くのタンパク質またはその断片を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、約３～１０アミノ酸を含むリンカーは、発現の際にタンパク質の適正なフォールディングを容易にするのを助けるように、任意の２つのタンパク質またはその断片間に位置し得る。

「同一性」または「実質的同一性」という用語は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈で使用される場合、参照配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を指す。あるいは、同一性パーセントは、６０％～１００％の任意の整数であり得る。例示的な実施形態は、本明細書に記載されるプログラム、好ましくは、下に記載される標準的なパラメーターを使用するＢＬＡＳＴを使用して参照配列と比較した場合に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。本明細書に示される任意のヌクレオチドまたはポリペプチド配列、例えば、配列番号１～４８のいずれか１つに対する６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を、本明細書に提供される組成物および方法で使用することができることが理解される。核酸配列が、本明細書に記載される任意の核酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり得ることが理解される。同様に、ポリペプチドは、本明細書に記載される任意のポリペプチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり得る。配列比較のために、典型的には、ある配列は、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピュータに入力され、必要により部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用することができ、または代替パラメーターを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列についての配列同一性パーセントを算出する。

「比較ウインドウ」は、本明細書で使用される場合、２つの配列が最適に整列された後で、配列を、同じ数の連続する位置の参照配列と比較し得る、２０～６００、約２０～５０、約２０～１００、約５０～約２００または約１００～約１５０からなる群より選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する言及を含む。比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野において周知である。比較のための最適な配列のアライメントは、Smith and Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって、または手作業のアライメントおよび目視検査によって実施され得る。

配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトにより公表されている。アルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴとマッチするかまたはそれを満たすのいずれかで、クエリ配列中の短いワード長Ｗを特定することによって、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に特定することを含む。Ｔを、隣接ワードスコア閾値（Altschul et al、上記）と称する。これらの初期の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして働く。次いで、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限りは、各配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（マッチする残基の対についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して算出する。累積アライメントスコアが、到達したその最大値から量Ｘだけ低下した場合；１つもしくは複数の負のスコアリング残基のアライメントの蓄積に起因して、累積スコアがゼロもしくはそれより下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合、各方向のワードヒットの伸長を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、２８のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待（Ｅ）、Ｍ＝１、Ｎ＝－２、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じる確率の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸の参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．０１未満、より好ましくは、約１０^－５未満、最も好ましくは、約１０^－２０未満である場合、核酸は参照配列と類似すると考えられる。

全体を通して使用される場合、対象とは、個体を意味する。例えば、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、より具体的には、ヒトである。非ヒト霊長類は、同様に、対象である。対象という用語は、飼育動物、例えば、ネコ、イヌなど、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、および実験動物（例えば、フェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモットなど）を含む。そのため、獣医学的使用および医学的使用、ならびに製剤が本明細書で企図される。用語は、特定の年齢または性別を示さない。そのため、成体および新生児対象は、雄または雌にかかわらず、網羅されることが意図される。本明細書で使用される場合、患者または対象は、互換的に使用されてもよく、疾患または障害に罹患する対象を指し得る。

「発現カセット」は、宿主細胞における特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の指定の核酸エレメントを用いて、組換え的にまたは合成的に作製された核酸構築物である。発現カセットは、プラスミド、ウイルスゲノム、または核酸断片の一部であってもよい。典型的には、発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結した転写されるポリヌクレオチドと、それに続く転写終結シグナル配列を含む。発現カセットは、特異的調節配列、例えば、ヒトグロビン遺伝子由来の５’または３’非翻訳領域を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。

「レポーター遺伝子」は、それらの生化学的特徴、例えば、酵素活性または化学蛍光特色に起因して容易に検出可能であるタンパク質をコードする。これらのレポータータンパク質は、選択可能なマーカーとして使用することができる。そのようなレポーターの１つの具体例は、緑色蛍光タンパク質である。このタンパク質から生じる蛍光は、さまざまな市販の蛍光検出システムを用いて検出することができる。他のレポーターは、染色によって検出することができる。レポーターはまた、適切な基質と接触したら、検出可能なシグナルを生じる酵素であり得る。レポーターは、検出可能な産物の形成を触媒する酵素であり得る。好適な酵素として、限定されるものではないが、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼおよびヒドロラーゼが挙げられる。レポーターは、基質が真核細胞膜に対して実質的に不透過性であり、そのため、シグナル形成をしっかりと制御することを可能にする酵素をコードし得る。酵素をコードする好適なレポーター遺伝子の具体例としては、限定されるものではないが、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；Alton and Vapnek (1979) Nature 282: 864-869）；ルシフェラーゼ（ｌｕｘ）；β－ガラクトシダーゼ；ＬａｃＺ；β－グルクロニダーゼ；およびアルカリホスファターゼ（Toh, et al. (1980) Eur. J. Biochem. 182: 231-238；およびHall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101）が挙げられ、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。他の好適なレポーターとしては、エピトープを特異的に認識する標識抗体を用いて検出することができる特定のエピトープをコードするものが挙げられる。

本明細書に提供される組成物および方法では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、触媒的に損なわれたヌクレアーゼである。全体を通して使用される場合、「触媒的に損なわれた」は、ＤＮＡの一方または両方の鎖を切断するための減少したＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ酵素活性を指す。触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの例としては、限定されるものではないが、触媒的に損なわれたＣａｓ９、触媒的に損なわれたＣｐｆ１、および触媒的に損なわれたＣ２ｃ２が挙げられる。一部の例では、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、触媒的に損なわれたＣａｓ９、例えば、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａであり、これは、ＤＮＡの一本の鎖のみを切断するか、またはそれにニックを入れる 一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼであり得、ここで、エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖を切断することができない、すなわち、二本鎖切断を行うことができない。改変としては、限定されるものではないが、１つまたは複数のアミノ酸を変更して、ヌクレアーゼ活性またはヌクレアーゼドメインを不活性化することが挙げられる。例えば、限定されないが、Ｄ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９中で作製されて、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を低減または不活性化し得る。他の改変としては、ヌクレアーゼ活性を示す配列がＣａｓ９から存在しなくなるように、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインのすべてまたは一部分を除去することが挙げられる。したがって、触媒的に損なわれたＣａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を低減するように改変されたポリペプチド配列、またはヌクレアーゼ活性を低減するためのポリペプチド配列（単数または複数）の除去を含み得る。触媒的に損なわれたＣａｓ９は、ヌクレアーゼ活性が不活性化されたとしても、ＤＮＡに結合する能力を保持している。したがって、触媒的に損なわれたＣａｓ９は、ＤＮＡ結合に必要なポリペプチド配列（単数または複数）を含むが、改変されたヌクレアーゼ配列を含むか、またはヌクレアーゼ活性の原因となるヌクレアーゼ配列を欠く。類似の改変を行って、他の部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃｐｆ１またはＣ２ｃ２のヌクレアーゼ活性を低減することができることが理解される。一部の例では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよび／またはＨＮＨヌクレアーゼドメインのポリペプチド配列を欠き、ＤＮＡ結合機能を保持している、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の全長Ｃａｓ９配列である。他の例では、Ｃａｓ９タンパク質配列は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよび／またはＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠き、ＤＮＡ結合機能を保持するＣａｓ９ポリペプチド配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する。

触媒的に損なわれ得るＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの例としては、限定されるものではないが、ＩＩ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする任意の細菌種に存在するヌクレアーゼが挙げられる。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系は、外来核酸に対する防御のための細菌系の広範なクラスを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、広範囲の真正細菌および古細菌生物において見られる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型サブタイプを含む。Makarova, et al. (Nat Rev Microbiol. 2015 Nov; 13(11):722-36)に記載されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の分類は、共有される特徴および進化的類似性に基づいて５つのタイプおよび１６のサブタイプを定義する。これらは、ゲノムＤＮＡを切断するエフェクター複合体の構造に基づいて２つの大きなクラスにグループ分けされる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノム工学のために最初に使用されたものであり、２０１５年にＶ型が続いた。野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ガイドＲＮＡとの複合体においてＲＮＡ媒介ヌクレアーゼＣａｓタンパク質またはホモログ（本明細書で「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」と称される）を利用して、外来核酸を認識および切断する。Ｃａｓ９タンパク質は、活性化ＲＮＡ（トランス活性化ＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡとも称される）も使用する。それらとともに使用されるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの種類に応じて、ガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡおよび活性化ＲＮＡの両方のいずれかの活性を有するガイドＲＮＡも、当技術分野において公知である。一部の例では、そのような二重活性ガイドＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と称される。活性化ＲＮＡ配列を含有しない合成ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡとも称され得る。本開示では、ｓｇＲＮＡおよびｇＲＮＡという用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと複合体化し、リボヌクレオタンパク質複合体を標的ＤＮＡ配列に局在化させるＲＮＡ分子を指すために互換的に使用される。

例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチド（ＩＩ型）またはＣｐｆ１ポリペプチド（Ｖ型）であり得る。例えば、Abudayyeh et al., Science 2016 August 5; 353(6299):aaf5573；Fonfara et al. Nature 532: 517-521 (2016)、およびZetsche et al., Cell 163(3): p. 759-771, 22 October 2015を参照されたい。全体を通して使用される場合、「Ｃａｓ９ポリペプチド」という用語は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする任意の細菌種において特定されたＣａｓ９タンパク質またはその断片もしくは誘導体を意味する。例えば、補足情報を含んで、その全体が、これにより参照により本明細書に組み込まれるMakarova et al. Nature Reviews, Microbiology, 9: 467-477 (2011)を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９およびＣａｓ９ホモログは、限定されるものではないが、以下の分類学的群の細菌：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ－Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ－Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｃｈｌｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｅを含む多種多様な真正細菌において見られる。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）である。別の例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質（ＳａＣａｓ９）である。追加のＣａｓ９タンパク質およびそのホモログは、例えば、Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5): 726-737；Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6): 467-477；Hou, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Sep 24;110(39):15644-9；Sampson et al., Nature. 2013 May 9;497(7448):254-7；およびJinek, et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21に記載されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインは、宿主細胞における有効な活性または増強された安定性のために最適化され得る。他のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとしては、Ｃｐｆ１（例えば、Zetsche et al., Cell, Volume 163, Issue 3, p. 759-771, 22 October 2015を参照されたい）およびそのホモログが挙げられる。

全長Ｃａｓ９は、ＤＮＡ配列中に二本鎖切断を作出する認識ドメインおよび２つのヌクレアーゼドメイン（それぞれ、ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）を含むエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９のアミノ酸配列では、ＨＮＨは、直線的に連続しているが、ＲｕｖＣは、３つの領域、認識ドメインの左側の１つ、およびＨＮＨドメインに隣接している認識ドメインの右側の他の２つに分かれている。Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと相互作用することによって、細胞におけるゲノム部位に標的化される。これは、細胞のゲノムＤＮＡにおける二本鎖切断をもたらす。一部の例では、ガイドＲＮＡによって標的化される領域のすぐ３’にＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とするＣａｓ９ヌクレアーゼを利用することができる。別の例として、直交性ＰＡＭモチーフ要件を有するＣａｓ９タンパク質を利用して、隣接ＮＧＧ ＰＡＭ配列を有さない配列を標的化することができる。直交性ＰＡＭ配列特異性を有する例示的なＣａｓ９タンパク質としては、限定されるものではないが、Esvelt et al., Nature Methods 10: 1116-1121 (2013)に記載されているものが挙げられる。さまざまなＣａｓ９ヌクレアーゼを、本明細書に記載される方法で利用することができる。例えば、ガイドＲＮＡによって標的化される領域のすぐ３’にＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とするＣａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、ＳｐＣａｓ９を利用することができる。そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＮＧＧ配列を含有するゲノムの任意の領域に標的化され得る。別の例として、ガイドＲＮＡによって標的化される領域のすぐ３’にＮＮＧＲＲＴ（配列番号７９）またはＮＮＧＲＲ（Ｎ）（配列番号８０）ＰＡＭを必要とするＣａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、ＳａＣａｓ９を利用することができる。別の例として、直交性ＰＡＭモチーフ要件を有するＣａｓ９タンパク質を利用して、隣接ＮＧＧ ＰＡＭ配列を有さない配列を標的化することができる。直交性ＰＡＭ配列特異性を有する例示的なＣａｓ９タンパク質としては、限定されるものではないが、Esvelt, K.M., et al., Nature Methods 10(11): 1116-1121 (2013)に記載されているもの、およびZetsche et al., Cell, Volume 163, Issue 3, p. 759-771, 22 October 2015に記載されているものが挙げられる。

一部の場合では、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａである。一部の例では、ＡＢＥ中のＣａｓ９ １０Ａは、配列番号２９によってコードされる。一部の例では、Ｃａｓ９ １０Ａは、配列番号３０を含み、通常、Ｃａｓ９ニッカーゼが、ガイドＲＮＡとの複合体の一部として標的核酸に結合している場合に、一本鎖切断またはニックが標的核酸に導入される。構造的に異なるガイドＲＮＡにそれぞれ結合した一対のＣａｓ９ニッカーゼは、標的ゲノム領域の２つの近位部位に標的化され得る。例示的なＣａｓ９ニッカーゼとしては、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ変異を有するＣａｓ９ヌクレアーゼが挙げられる。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、触媒的に損なわれたＣｐｆ１ポリペプチドである。Ｃｐｆ１タンパク質は、クラスＩＩのＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９など）よりも小さく単純なエンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインと類似しているが、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有さない、ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有する。Ｃｐｆ１のＮ末端ドメインはまた、Ｃａｓ９タンパク質のようなアルファへリックス認識ローブを有さない。ＤＮＡを切断する場合、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドオーバーハングを有する付着末端様ＤＮＡ二本鎖切断を導入する。Ｃｐｆ１タンパク質は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、むしろ、Ｃｐｆ１タンパク質は、ｃｒＲＮＡのみにより機能する。本開示の文脈では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣｐｆ１タンパク質である場合、ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒ配列を含まない。Ｃｐｆ１タンパク質とともに使用されるｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列（定常領域）のみを含み得る。一部の例では、ガイドＲＮＡによって標的化される領域のすぐ５’にＴＴＴＮまたはＴＴＮ ＰＡＭ（「Ｎ」が核酸塩基である種に応じる）を必要とするＣｐｆ１タンパク質を利用することができる。公知のＣｐｆ１タンパク質およびその誘導体は、本開示の文脈で使用されてもよい。例えば、一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＦｎＣｐｆ１ｐであり、ＰＡＭは、５’ＴＴＮ（ここで、Ｎは、Ａ／Ｃ／ＧまたはＴである）である。一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＰａＣｐｆ１ｐであり、ＰＡＭは、５’ＴＴＴＶ（ここで、Ｖは、Ａ／ＣまたはＧである）である。ある特定の例では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＦｎＣｐｆ１ｐであり、ＰＡＭは、５’ＴＴＮ（ここで、Ｎは、Ａ／Ｃ／ＧまたはＴである）であり、ＰＡＭは、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する。ある特定の例では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＦｎＣｐｆ１ｐであり、ＰＡＭは、５’ＣＴＡであり、プロトスペーサーの５’末端の上流または標的遺伝子座に位置する。一例では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＡｓＣｐｆ１ｐであり、ＰＡＭは、５’ＴＴＴＮである。

本明細書で使用される場合、ｓｇＲＮＡ活性、またはＲＮＰ活性、すなわち、（１）ｇＲＮＡならびに（２）ＡＢＥおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質を含む複合体のＲＮＰ活性の文脈における「活性」は、ｓｇＲＮＡの標的遺伝子エレメントに結合する能力を指す。典型的には、活性は、ＡＢＥ ＲＮＰ（すなわち、ＡＢＥと複合体化したｓｇＲＮＡ）の塩基対を編集する、すなわち、ＤＮＡの一方の鎖においてＡからＧへの変化を行う能力も指す。

本明細書で使用される場合、細胞のゲノムの編集の文脈における「編集」という語句は、標的ゲノム領域でゲノムの配列に構造変化を誘導すること、例えば、ＡＢＥによって行われる編集を指す。例えば、編集は、標的ゲノム領域でのＤＮＡの一方の鎖におけるＡからＧへの変化（またはＤＮＡの対向する鎖におけるＴからＣへの変化）の形態をとることができる。ヌクレオチド配列は、ポリペプチドまたはその断片をコードし得る。例えば、Gaudelli et al., "Programmable base editing of A-T to G-C in genomic DNA without DNA cleavage," Nature 551: 464-471 (2017)を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「アデニン塩基エディター」または「ＡＢＥ」は、アデノシンデアミナーゼおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質を指す。一部の例では、アデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡの一本鎖上でアデニンを脱アミノ化して、イノシンを形成するｔａｄＡ酵素である。Gaudelli et al, (2017)を参照されたい。一部の例では、ＡＢＥは、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、およびアデノシンデアミナーゼの１つまたは複数のコピー、例えば、２つ、３つ、４つのコピーなどを含む融合タンパク質である。一部の例では、ＡＢＥは、配列番号２７を含む核酸配列によってコードされる融合タンパク質を含む。一部の例では、ＡＢＥは、配列番号２８を含む。

本明細書で使用される場合、「リボヌクレオタンパク質複合体」、「ＲＮＰ」という用語などは、（１）ＡＢＥおよびｃｒＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡ）、（２）ＡＢＥおよびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、（３）ＡＢＥ、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、およびガイドＲＮＡ、または（４）それらの組合せの間の複合体（例えば、ＡＢＥおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ならびにｃｒＲＮＡガイドを含有する複合体）を指す。

本明細書で使用される場合、「細胞」は、任意の真核細胞、例えば、ヒトＴ細胞、またはＴ細胞に分化することができる細胞、例えば、ＴＣＲ受容体分子を発現するＴ細胞であり得る。これらとしては、造血幹細胞、および造血幹細胞に由来する細胞が挙げられる。本明細書に提供されるゲノム編集方法のいずれかによって作製された細胞の集団、例えば、ウイルス粒子を含む細胞または遺伝子改変細胞の集団も提供される。

本明細書で使用される場合、「造血幹細胞」という語句は、血液細胞を生じさせ得る幹細胞の種類を指す。造血幹細胞は、骨髄系列もしくはリンパ系列、またはそれらの組合せの細胞を生じさせ得る。造血幹細胞は、主に骨髄において見られるが、それらは、末梢血またはその画分から単離することができる。さまざまな細胞表面マーカーを使用して、造血幹細胞を特定、選別または精製することができる。一部の場合では、造血幹細胞は、ｃ－ｋｉｔ^＋およびｌｉｎ^－として特定される。一部の場合では、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４^＋、ＣＤ５９^＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０^＋、ＣＤ３８^ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７^＋、ｌｉｎ^－として特定される。一部の場合では、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４^－、ＣＤ５９^＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０^＋、ＣＤ３８^ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７^＋、ｌｉｎ^－として特定される。一部の場合では、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ１３３^＋、ＣＤ５９^＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０^＋、ＣＤ３８^ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７^＋、ｌｉｎ^－として特定される。一部の場合では、マウス造血幹細胞は、ＣＤ３４^ｌｏ／－、ＳＣＡ－１^＋、Ｔｈｙ１^＋／ｌｏ、ＣＤ３８^＋、Ｃ－ｋｉｔ^＋、ｌｉｎ^－として特定される。一部の場合では、造血幹細胞は、ＣＤ１５０^＋ＣＤ４８^－ＣＤ２４４^－である。

本明細書で使用される場合、「造血細胞」という語句は、造血幹細胞に由来する細胞を指す。造血細胞は、生物、系、器官または組織（例えば、血液またはその画分）からの単離によって得られるか、または提供され得る。あるいは、造血幹細胞は、単離され得、造血細胞は、幹細胞を分化することによって、得られるか、または提供され得る。造血細胞は、さらなる細胞型に分化するための制限された可能性を有する細胞を含む。そのような造血細胞としては、限定されるものではないが、多能性前駆細胞、系列制限前駆細胞、骨髄系共通前駆細胞、顆粒球－マクロファージ前駆細胞、または巨核球－赤血球前駆細胞が挙げられる。造血細胞としては、リンパ系列および骨髄系列の細胞、例えば、リンパ球、赤血球、顆粒球、単球、および血小板が挙げられる。一部の実施形態では、造血細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または樹状細胞である。一部の実施形態では、細胞は、自然免疫細胞である。

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」という語句は、Ｔ細胞受容体分子を発現するリンパ球系細胞を指す。Ｔ細胞としては、ヒトアルファベータ（αβ）Ｔ細胞およびヒトガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞が挙げられる。Ｔ細胞としては、限定されるものではないが、ナイーブＴ細胞、刺激されたＴ細胞、初代Ｔ細胞（例えば、培養されていない）、培養Ｔ細胞、不死化Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、それらの組合せ、またはそれらの下位集団が挙げられる。Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、またはＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋であり得る。Ｔ細胞はまた、ＣＤ４^－、ＣＤ８^－、またはＣＤ４^－およびＣＤ８^－であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパー細胞、例えば、Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２、Ｔ_Ｈ３、Ｔ_Ｈ９、Ｔ_Ｈ１７、またはＴ_ＦＨ型のヘルパー細胞であり得る。Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞であり得る。調節性Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３^＋またはＦＯＸＰ３^－であり得る。Ｔ細胞は、アルファ／ベータＴ細胞またはガンマ／デルタＴ細胞であり得る。一部の場合では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉＣＤ１２７^ｌｏ調節性Ｔ細胞である。一部の場合では、Ｔ細胞は、１型調節性（Ｔｒ１）、Ｔ_Ｈ３、ＣＤ８＋ＣＤ２８－、Ｔｒｅｇ１７、およびＱａ－１制限Ｔ細胞、またはそれらの組合せもしくは下位集団からなる群より選択される調節性Ｔ細胞である。一部の場合では、Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞である。一部の場合では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｌｏＣＤ１２７^ｈｉエフェクターＴ細胞である。一部の場合では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｌｏＣＤ１２７^ｈｉＣＤ４５ＲＡ^ｈｉＣＤ４５ＲＯ^－ナイーブＴ細胞である。Ｔ細胞は、遺伝子操作された組換えＴ細胞であり得る。

本明細書で使用される場合、初代細胞の文脈における「初代」という語句は、形質転換も不死化もされていない細胞である。そのような初代細胞は、培養、二次培養、または限定された回数継代することができる（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回培養）。一部の場合では、初代細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件に適合される。一部の場合では、初代細胞は、生物、系、器官、または組織から単離され、必要に応じて選別され、培養または二次培養することなく直接利用される。一部の場合では、初代細胞は、刺激され、活性化され、または分化される。例えば、初代Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ２８アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、またはそれらの組合せとの接触（例えば、それらの存在下で培養する）によって活性化することができる。

詳細な説明
以下の説明は、本組成物および方法のさまざまな態様および実施形態を列挙する。特定の実施形態は、組成物および方法の範囲を定義することを意図するものではない。むしろ、実施形態は、開示される組成物および方法の範囲内に少なくとも含まれるさまざまな組成物および方法の非限定的な例を単に提供する。説明は、当業者の観点から読むべきであり、したがって、当業者に周知の情報は、必ずしも含まれていない。

ウイルス粒子を使用するアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）の真核細胞への効率的な送達のための組成物、システム、製造方法および方法が本明細書に提供される。本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ｓｇＲＮＡと無関係のＲＮＡオフターゲット効果を最小限にしながら、ＡＢＥを、真核細胞に効率的に送達することができる。例えば、レンチウイルス様粒子を介した、（１）アデノシンデアミナーゼおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質であるアデノシン塩基対エディター（ＡＢＥ）、ならびに（２）ｓｇＲＮＡを含むＲＮＰの細胞への効率的な送達のための構成要素、システム、製造方法および方法が提供される。本明細書に記載されるＲＮＰは、制限された半減期を有し、このようにして、ＲＮＡおよびＤＮＡオフターゲット媒介変異誘発のリスクを低減する。ＲＮＰの真核細胞への送達は、オフターゲット効果を低減しながら、例えば、トランスフェクトすることが困難である細胞、例えば、初代細胞における効率的な送達を可能にする。

哺乳動物発現プラスミド
ＣＲＩＳＰＲ構成要素コード配列、すなわち、ｓｇＲＮＡおよびＡＢＥを、使用される哺乳動物細胞に送達して、本開示のレンチウイルス様粒子を生じさせるために使用される哺乳動物発現プラスミドが本明細書に提供される。例えば、非ウイルス核酸配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドであって、非ウイルス核酸配列が、（ｉ）アデノシン塩基対エディター（ＡＢＥ）をコードする核酸配列であって、ＡＢＥが、アデノシンデアミナーゼおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質である、核酸配列、ならびに（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列を含む、哺乳動物発現プラスミドが本明細書に提供される。

本明細書に記載される哺乳動物発現プラスミドでは、ＡＢＥの１つまたは複数のコピーが、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼに融合または連結され得る。必要に応じて、部位特異的ヌクレアーゼは、ペプチドリンカーを介してアデニン塩基エディターに連結される。リンカーは、約２～約２５アミノ酸長であり得る。一部の例では、アデニン塩基エディターは、ＡＢＥ７（例えば、ＡＢＥ７．１０（Gaudelli et al. (2017)、ＡＢＥ６．３、ＡＢＥ７．８またはＡＢＥ７．９）、またはＡＢＥ８アデニン塩基エディター（Gaudelli et al., "Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application," Nature Biotechnology 38: 892-900 (2020)）であり得る。

本明細書に提供される哺乳動物発現プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ構成要素コード配列、例えば、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡについてのコード配列を含む。一部の例では、ｇＲＮＡコード配列は、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む。一部の例では、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ｇＲＮＡの５’末端または３’末端に位置し得る。一部の例では、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ｇＲＮＡ内の内部位置、例えば、フォールディングされたｇＲＮＡにおいて形成されるループの１つまたは複数などに挿入され得る。例えば、ｇＲＮＡがＣａｓ９タンパク質のためである場合、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ｇＲＮＡのテトラループ、ステムループ２（ＳＴ２）、または３’末端に位置し得る。一部の例では、１～３０ヌクレオチドのスペーサーは、ｇＲＮＡの少なくとも１つのアプタマーコード配列間に、または少なくとも１つのアプタマーコード配列に隣接して位置し得る。

一部の例では、哺乳動物発現ベクターは、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）によって特異的に結合されるアプタマー配列をコードする少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む。本開示の文脈では、アプタマー配列は、ＡＢＰによって特異的に結合される三次ループ構造を形成するＲＮＡ配列である。ＡＢＰは、ＲＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ結合タンパク質ドメインである。好適なアプタマーコード配列としては、公知のバクテリオファージアプタマー配列をコードするポリヌクレオチド配列が挙げられる。例示的なアプタマーコード配列としては、上記の表１に提供されるアプタマー配列をコードするものが挙げられる。一部の例では、アプタマーは、ＡＢＰの二量体によって結合される。これらのアプタマー配列は、バクテリオファージタンパク質によって特異的に結合されることが公知のＲＮＡ配列である。一部の状況では、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群より選択されるＡＢＰによって特異的に結合されるアプタマー配列をコードする。
表1. アプタマー結合タンパク質および対応するアプタマー配列

一部の例では、哺乳動物発現ベクターは、その下流に１つのアプタマーコード配列を含むｓｇＲＮＡを含む。他の例では、ｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のアプタマーコード配列を含み得る。例えば、一部の例では、ｇＲＮＡは、２つのアプタマーコード配列をタンデムで含み得る。

全体を通して使用される場合、ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ部位特異的ヌクレアーゼ）と相互作用し、細胞のゲノム内の標的核酸（ゲノム標的配列）に特異的に結合するか、またはハイブリダイズし、その結果、ｓｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが細胞のゲノム中の標的核酸に共局在化する、単一ガイドＲＮＡ配列である。各ｓｇＲＮＡは、ゲノム中の標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するか、またはハイブリダイズする約１０～５０ヌクレオチド長のＤＮＡ標的化配列またはプロトスペーサー配列を含む。例えば、ＤＮＡ標的化配列は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド長であり得る。例えば、ＤＮＡ標的化配列は、約１５～３０ヌクレオチド、約１５～２５ヌクレオチド、約１０～２５ヌクレオチド、または約１８～２３ヌクレオチドであり得る。一例では、ＤＮＡ標的化配列は、約２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない。

一般に、ＤＮＡ標的化配列は、標的ＤＮＡ配列に対して補完する（例えば、完全に補完する）か、または実質的に補完する（例えば、１～４つのミスマッチを有する）ように設計される。一部の場合では、ＤＮＡ標的化配列は、複数の遺伝子エレメントを結合するために、ウォッブル塩基または縮重塩基を組み込むことができる。一部の場合では、結合領域の３’または５’末端の１９ヌクレオチドは、標的遺伝子エレメント（単数または複数）に対して完全に相補的である。一部の場合では、結合領域は、安定性を増加させるために、変更することができる。例えば、非天然ヌクレオチドは、分解に対するＲＮＡ耐性を増加させるために、組み込むことができる。一部の場合では、結合領域は、結合領域における二次構造形成を回避するまたは低減するために、変更または設計することができる。一部の場合では、結合領域は、Ｇ－Ｃ含量を最適化するように設計することができる。一部の場合では、Ｇ－Ｃ含量は、好ましくは、約４０％～約６０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％）である。一部の場合では、結合領域は、ｓｇＲＮＡの効率的な転写を容易にする配列で開始するように選択することができる。例えば、結合領域は、Ｇヌクレオチドを有する５’末端で開始し得る。一部の場合では、結合領域は、改変されたヌクレオチド、例えば、限定されないが、メチル化ヌクレオチドまたはリン酸化ヌクレオチドを含有し得る。

本明細書で使用される場合、「相補的」または「相補性」という用語は、ヌクレオチドまたは核酸間の塩基対形成、例えば、限定されるものではないが、ｓｇＲＮＡと標的配列との間の塩基対形成を指す。相補的ヌクレオチドは、一般に、ＡとＴ（またはＡとＵ）、およびＧとＣである。本明細書に記載されるガイドＲＮＡは、ゲノム配列に対して完全に相補的または実質的に相補的である（例えば、１～４つのミスマッチを有する）配列、例えば、ＤＮＡ標的化配列を含み得る。

ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと相互作用するか、またはそれに結合するｓｇＲＮＡ定常領域を含む。本明細書に提供される構築物では、ｓｇＲＮＡの定常領域は、約７５～２５０ヌクレオチド長であり得る。一部の例では、定常領域は、ステム、ステムループ、ヘアピン、ヘアピン間の領域、および／または定常領域のネクサス中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くのヌクレオチド置換を含む改変された定常領域である。一部の例では、改変された定常領域が由来する天然または野生型ｓｇＲＮＡ定常領域の活性と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の活性を有する改変された定常領域が、本明細書に記載される構築物において使用され得る。特に、改変は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと直接相互作用するヌクレオチドでも、定常領域の二次構造に重要であるヌクレオチドでも行われるべきではない。

哺乳動物発現プラスミドは、非ウイルス核酸配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含む。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列に作動可能に連結されており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ｇＲＮＡコード配列に作動可能に連結されている。

ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列は、哺乳動物種から選択される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列は、哺乳動物種から選択される。例えば、これらのプロモーター配列は、２～３例を挙げると、ヒト、ウシ、ヒツジ、バッファロー、ブタ、またはマウスから選択され得る。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＦＥ１α、またはＳＶ４０配列である。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列は、Ｕ６またはＨ１配列である。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列は、改変されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列である。例えば、任意の哺乳動物種由来の野生型ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列を、本明細書に提供される構築物において使用することができる。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ配列は、改変されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ配列である。例えば、任意の哺乳動物種由来の野生型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ配列を、本明細書に提供される構築物において使用することができる。当業者であれば、どのようにして２つのポリペプチドまたは核酸の同一性を決定するかを容易に理解する。例えば、同一性は、同一性がその最高のレベルであるように、２つの配列を整列させた後に算出することができる。同一性を算出する別の仕方は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。例えば、比較のための配列の最適アライメントは、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48(3): 443-453 (1970)のアルゴリズムを使用して実施することができる。一部の例では、真核生物プロモーターは、誘導性プロモーターまたは調節可能プロモーターである。

ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターから転写されたコード配列は、コード配列の下流にポリ（Ａ）シグナルおよび転写ターミネーター配列を含む。一般に使用される哺乳動物ターミネーター（ＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＧＨ、およびｒｂＧｌｏｂ）は、ポリアデニル化および終結の両方を促進する配列モチーフＡＡＵＡＡＡ（配列番号８１）を含む。ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターから転写されたコード配列は、ターミネーター配列としてコード配列の下流に単純な一続き（ｓｉｍｐｌｅ ｒｕｎ）のＴ残基を含む。配列に基づくエレメントであるターミネーターの役割は、転写単位（遺伝子など）の末端を定義し、転写機構から新たに合成されたＲＮＡを放出するプロセスを開始することである。ターミネーターは、転写される遺伝子の下流で見られ、典型的には、ポリアデニル化またはポリ（Ａ）シグナルなどの任意の３’調節エレメントの直後に存在する。

一部の例では、哺乳動物発現プラスミドはまた、ＣＲＩＳＰＲ構成要素コード配列の下流、またはＣＲＩＳＰＲ構成要素コード配列の下流に位置する場合はアプタマーコード配列の下流に位置するＲＮＡ安定化配列をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み得る。ＲＮＡ安定化配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系構成要素コード配列の下流で転写され、転写されたＲＮＡ配列の寿命を安定化する。一例では、ＲＮＡ安定化配列をコードするポリヌクレオチド配列は、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列の下流に位置する。別の例では、ＲＮＡ安定化配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ｇＲＮＡコード配列の下流に位置する。例示的なＲＮＡ安定化配列は、配列番号１７（ＤＮＡ）および配列番号１８（ＲＮＡ）に示されるヒトベータグロビン遺伝子の３’ＵＴＲの配列である。ＲＮＡ安定化配列の別の例は、配列番号１７の２つのコピーを含む配列番号３４である。他のＲＮＡ安定化配列は、Hayashi, T. et al., Developmental Dynamics 239(7):2034-2040 (2010)およびNewbury, S. et al., Cell 48(2):297-310 (1987)に記載されている。一部の例では、１～３０ヌクレオチドのスペーサーが、ＣＲＩＳＰＲ構成要素コード配列と、ＲＮＡ安定化配列をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列との間に位置していてもよい。

一部の例では、哺乳動物発現プラスミドは、１つまたは複数の発現カセットを含んでいてもよい。一部の例では、哺乳動物発現プラスミドは、ＡＢＥをコードする第１の発現カセット、および少なくとも１つのアプタマーを含むｇＲＮＡをコードする第２の発現カセットを含む。一部の例では、哺乳動物発現プラスミドはまた、レポーター遺伝子を含んでいてもよい。

システム
本開示の別の態様は、レンチウイルスパッケージングシステムである。そのようなシステムは、本開示に記載される哺乳動物発現プラスミドを含む。これらのシステムは、本開示に記載されるレンチウイルス様粒子を作製するための哺乳動物細胞への導入のための構成要素の提供において有用である。

一部の例では、システムは、ウイルス配列、例えば、Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含むレンチウイルスパッケージングプラスミドであって、Ｇａｇヌクレオチド配列が、ヌクレオカプシド（ＮＣ）コード配列およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）コード配列を含み、ＮＣコード配列またはＭＡコード配列の一方または両方が、少なくとも１つの非ウイルスアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含み、パッケージングプラスミドが、機能的インテグラーゼタンパク質をコードしない、レンチウイルスパッケージングプラスミドを含む。

例えば、（ａ）Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含むパッケージングプラスミドであって、Ｇａｇヌクレオチド配列が、ヌクレオカプシド（ＮＣ）コード配列およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）コード配列を含み、ＮＣコード配列またはＭＡコード配列の一方または両方が、少なくとも１つの非ウイルスアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含み、パッケージングプラスミドが、機能的インテグラーゼタンパク質をコードしない、パッケージングプラスミド、（ｂ）（ｉ）アデノシン塩基対エディター（ＡＢＥ）をコードする核酸配列であって、ＡＢＥが、アデノシンデアミナーゼおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質である、核酸配列、ならびに（ｉｉ）本明細書に記載されるｇＲＮＡを含む少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミド、ならびに（ｃ）エンベロープ糖タンパク質コード配列を含むエンベローププラスミドを含む、レンチウイルスパッケージングシステムが本明細書に提供される。

システムは、第２世代パッケージングプラスミドもしくは第３世代パッケージングプラスミド、またはそれらの改変されたバージョンを含んでいてもよい。一部の例では、パッケージングプラスミドは、上に記載されたＧａｇヌクレオチド配列を含み、Ｒｅｖヌクレオチド配列およびＴａｔヌクレオチド配列をさらに含む。他の例では、システムは、上に記載されたＧａｇヌクレオチド配列を含む第１のパッケージングプラスミド、およびＲｅｖヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングプラスミドを含む。パッケージングプラスミドのそれぞれでは、ウイルスタンパク質コード配列は、真核生物プロモーター、例えば、複数のタンパク質コード配列のためのそれぞれ個々のまたは１つのプロモーターに作動可能に連結される。システムは、第２世代パッケージングプラスミドもしくは第３世代パッケージングプラスミド、またはそれらの改変されたバージョンを含んでいてもよい。

一部の例では、ＡＢＰコード配列は、ウイルスタンパク質コード配列の５’末端または３’末端、すなわち、ＮＣコード配列またはＭＡコード配列の５’末端または３’末端にある。一部の例では、ＡＢＰコード配列は、コードされるＡＢＰがウイルスタンパク質に融合されるように、ウイルスタンパク質コード配列に挿入され得る。ＡＢＰコード配列は、ウイルスタンパク質コード配列内の内部位置にインフレームで挿入されてもよい。ウイルスタンパク質コード配列の５’または３’末端の近くの内部位置にインフレームで位置する場合、ＡＢＰコード配列は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるTritch, R.J. et al., J. Virol. 65(2):922-30 (1991)およびScarlata, S. and Carter, C., Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes 1614(1):62-72 (2003)に記載されているものなどのプロセシング配列を破壊しないように位置する。例えば、Ｇａｇヌクレオチド配列は、とりわけ、ＮＣコード配列およびＭＡコード配列をコードし、Ｇａｇ前駆体タンパク質は、タンパク質切断によって別々の成熟ウイルスタンパク質にプロセシングされる。ＡＢＰコード配列のインフレーム挿入は、タンパク質切断のためのプロセシング配列をコードするヌクレオチドを破壊しないであろう。一部の例では、ウイルスタンパク質コード配列中のヌクレオチドは、ＡＢＰタンパク質コード配列と置き換えられ得る。一部の例では、３～６アミノ酸をコードするリンカー配列は、発現の際にタンパク質ドメインの適正なフォールディングを容易するのに役立つように、ウイルスタンパク質コード配列とＡＢＰコード配列との間に、またはＡＢＰコード配列に隣接して位置し得る。

一例では、改変されたウイルスタンパク質は、ＮＣであり、ＡＢＰコード配列は、ＮＣコード配列の５’末端または３’末端に挿入される。別の例では、改変されたウイルスタンパク質は、ＮＣであり、ＡＢＰコード配列は、ジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインの１つの前または後に挿入される。例えば、ＡＢＰコード配列は、第２のＺＦ（ＺＦ２）ドメインの最後のコドンの後に挿入され得る。別の例では、ＡＢＰコード配列は、ＺＦ２ドメインの最初のコドンの前に挿入され得る。別の例では、ＡＢＰコード配列は、第１のＺＦ（ＺＦ１）ドメインの最初のコドンの前に挿入され得る。別の例では、ＡＢＰコード配列は、第１のＺＦ（ＺＦ１）ドメインの最後のコドンの後に挿入され得る。一部の例では、ＡＢＰコード配列は、ＮＣタンパク質中のアミノ酸の高度に陽性（positive）のストレッチを破壊しない様式でＮＣコード配列に挿入される。

別の例では、改変されたウイルスタンパク質は、ＭＡであり、ＡＢＰコード配列は、ＭＡコード配列の５’末端または３’末端に挿入される。別の例では、ＡＢＰコード配列は、ＭＡコード配列内の内部位置にインフレームで挿入される。一部の例では、ＭＡコード配列中のヌクレオチドは、ＡＢＰタンパク質コード配列と置き換えられ得る。例えば、ＭＡタンパク質のアミノ酸４４～１３２をコードするヌクレオチドは、ＡＢＰコード配列と置き換えられ得る。別の例では、ＡＢＰコード配列は、ＭＡタンパク質のアミノ酸４４をコードするコドンの前に挿入される。別の例では、ＡＢＰコード配列は、ＭＡタンパク質のアミノ酸１３２をコードするコドンの後に挿入される。

一部の例では、システムは、ＮＥＦコード配列またはＶＰＲコード配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含むパッケージングプラスミドであって、ＮＥＦコード配列またはＶＰＲコード配列が、少なくとも１つの非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列を含む、パッケージングプラスミドを含む。システムは、第２世代パッケージングプラスミドもしくは第３世代パッケージングプラスミド、またはそれらの改変されたバージョンを含んでいてもよい。一部の例では、パッケージングプラスミドは、Ｇａｇヌクレオチド配列、Ｒｅｖヌクレオチド配列、およびＴａｔヌクレオチド配列を含む。他の例では、システムは、Ｇａｇヌクレオチド配列を含む第１のパッケージングプラスミド、およびＲｅｖヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングプラスミドを含む。

一部の例では、改変されたウイルスタンパク質は、ＶＰＲであり、ＡＢＰコード配列は、ＶＰＲコード配列の５’末端または３’末端に挿入される。一例では、ＡＢＰコード配列は、ＶＰＲコード配列の５’末端に挿入される。

他の例では、改変されたウイルスタンパク質は、ＮＥＦであり、ＡＢＰコード配列は、ＮＥＦコード配列の５’末端または３’末端に挿入される。一例では、ＡＢＰコード配列は、ＮＥＦコード配列の３’末端に挿入される。

一部の例では、ウイルスタンパク質のコード配列は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２５の１つであり得る。一部の例では、ウイルスタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、または配列番号２６の１つであり得る。一部の例では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、真核生物プロモーターに作動可能に連結した、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、または配列番号２６の少なくとも１つをコードする配列を含む。一部の例では、ウイルスタンパク質がＮＥＦである場合、ポリペプチドは、ウイルスカプシドにおけるパッケージングを増強する３つの変異、例えば、以下の置換変異：Ｇ３Ｃ、Ｖ１５３Ｌ、およびＥ１７７Ｇなどを含み得る。

一部の例では、プラスミドは、それに融合された２つまたはそれよりも多くのアプタマー結合タンパク質を含む１つまたは複数のウイルスタンパク質をコードし得る。ある特定の例では、レンチウイルスパッケージングプラスミドのＧａｇヌクレオチド配列は、ＮＣコード配列およびＭＡコード配列を含み得、ＮＣコード配列またはＭＡコード配列の一方または両方は、第１の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列を含む。第１の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列は両方とも、同じＡＢＰをコードし得る。あるいは、第１の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列は、異なるＡＢＰをコードする。一部の例では、レンチウイルスパッケージングプラスミドのＧａｇヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列を含むＮＣコード配列、および少なくとも１つの第２の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列を含むＭＡコード配列を含み得る。少なくとも１つの第１の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列および少なくとも１つの第２の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列は両方とも、同じＡＢＰをコードし得る。あるいは、少なくとも１つの第１の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列および少なくとも１つの第２の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列は、異なるＡＢＰをコードする。

ある特定の例では、パッケージングプラスミドは、ＶＰＲコード配列またはＮＥＦコード配列をコードし得、ＶＰＲコード配列またはＮＥＦコード配列は、第１の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列を含む。第１の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列は両方とも、同じＡＢＰをコードし得る。あるいは、第１の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列は、異なるＡＢＰをコードする。

非ウイルスアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列は、ＲＮＡアプタマー配列に結合するポリペプチド配列をコードする。いくつかの非ウイルスＡＢＰは、本開示における使用に好適である。特に、好適なＡＢＰとしては、ＲＮＡアプタマー配列と称されるステム－ループ構造を形成するＲＮＡ配列に特異的に結合するバクテリオファージＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。例示的な非ウイルスアプタマー結合タンパク質としては、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドおよびＣｏｍ（ｍｏｍの制御（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｏｍ））タンパク質が挙げられる。ラムダＮペプチドは、タンパク質のＲＮＡ結合ドメインであるラムダＮタンパク質のアミノ酸１～２２であり得る。一部の例では、ＡＢＰは、二量体としてそれらのアプタマーに結合する。これらのＡＢＰおよびそれらが結合するアプタマー配列についての情報を、表１に提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のいずれかに示される配列を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、少なくとも１つの非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５のいずれかを含む。

本明細書に提供されるレンチウイルスパッケージングプラスミドの特色は、それらが機能的インテグラーゼタンパク質をコードすることができないことである。パッケージングプラスミドが機能的インテグラーゼタンパク質をコードせず、それらが、本明細書に記載されるシステムおよび方法において使用される場合、これらのパッケージングプラスミドを使用して産生されたレンチウイルス様粒子によって運ばれる核酸分子が、形質導入された真核細胞のゲノムに組み込まれるリスクが実質的に低減される。一部の例では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、その中にインテグラーゼ不活性化変異を有するインテグラーゼコード配列を含む。例えば、インテグラーゼ不活性化変異は、インテグラーゼコード配列によってコードされるインテグラーゼタンパク質のアミノ酸６４位でのアスパラギン酸からバリンへの変異（Ｄ６４Ｖ）であり得る。一部の例では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、インテグラーゼコード配列のすべてまたは一部分の欠失を含む。

一部の実施形態では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含む。一部の実施形態では、哺乳動物発現プラスミドは、ＶＰＲコード配列またはＮＥＦコード配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含む。一部の例では、真核生物プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列は、哺乳動物種から選択される。例えば、プロモーター配列は、２～３例を挙げると、ヒト、ウシ、ヒツジ、バッファロー、ブタ、またはマウスから選択され得る。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＦＥ１α、またはＳＶ４０配列である。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列は、改変されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列である。例えば、任意の哺乳動物種由来の野生型ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列を、本明細書に提供される構築物において使用することができる。当業者であれば、どのようにして２つのポリペプチドまたは核酸の同一性を決定するかを容易に理解する。例えば、同一性は、同一性がその最高のレベルであるように、２つの配列を整列させた後に算出することができる。同一性を算出する別の仕方は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。例えば、比較のための配列の最適アライメントは、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)のアルゴリズムを使用して実施することができる。一部の例では、真核生物プロモーターは、誘導性プロモーターである。

ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターから転写されたコード配列は、コード配列の下流にポリ（Ａ）シグナルおよび転写ターミネーター配列を含む。一般に使用される哺乳動物ターミネーター（例えば、ＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＧＨ、およびｒｂＧｌｏｂ）は、ポリアデニル化および終結の両方を促進する配列モチーフＡＡＵＡＡＡを含む。配列に基づくエレメントであるターミネーターの役割は、転写単位（遺伝子など）の末端を規定し、転写機構から新たに合成されたＲＮＡを放出するプロセスを開始することである。ターミネーターは、転写される遺伝子の下流で見られ、典型的には、ポリアデニル化またはポリ（Ａ）シグナルなどの任意の３’調節エレメントの直後に存在する。

一部の例では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、１つまたは複数の発現カセットを含んでいてもよい。

システムは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードするエンベロープコード配列を有するエンベローププラスミドを含むこともできる。例えば、Ｅｎｖヌクレオチド配列は、ＶＳＶ－Ｇをコードし得る。エンベロープコード配列は、真核生物プロモーターに作動可能に連結されている。適切な真核生物プロモーターは、上に記載している。一部の例では、真核生物プロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターである。

システムは、本明細書に記載される、パッケージングプラスミド、エンベローププラスミド、および哺乳動物発現プラスミド、すなわち、（ｉ）ＡＢＥをコードする核酸配列、および（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーを含むｇＲＮＡを含む哺乳動物発現プラスミドのいずれかを含み得る。本明細書に記載されるパッケージングプラスミド、哺乳動物発現プラスミド、およびエンベローププラスミドのいずれかが、システムとして真核細胞に送達される場合、哺乳動物発現プラスミドによって発現されるｇＲＮＡは、哺乳動物発現プラスミドによって発現される触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと複合体を形成して、ｇＲＮＡと融合または連結したアプタマーとパッケージングプラスミドによって発現されるウイルスタンパク質に連結したＡＢＰとの間の相互作用を介して、真核細胞によって産生されるウイルス粒子によってパッケージングされるＲＮＰを形成する。

また、本開示に記載されるシステムの構成要素を含むキットも本明細書に提供される。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されるプラスミドの１つまたは複数を含む。

レンチウイルス様粒子
別の態様では、レンチウイルス様粒子、例えば、本明細書に記載される方法のいずれかによって作製されたレンチウイルス様粒子が提供される。本明細書で使用される場合、レンチウイルス様粒子は、真正のネイティブウイルスの組織化およびコンフォメーションを模倣するが、ウイルスゲノムを欠く、多タンパク質構造である。複数のレンチウイルス様粒子も提供される。レンチウイルス様粒子は、少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質が１つまたは複数のウイルスタンパク質に融合している融合タンパク質である改変されたレンチウイルスタンパク質を含有する。本開示の文脈では、改変されたウイルスタンパク質は、構造性または非構造性であり得る。例示的な構造タンパク質は、レンチウイルスヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質およびマトリックス（ＭＡ）タンパク質である。例示的な非構造タンパク質は、ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）および陰性調節因子（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）（ＮＥＦ）である。一部の例では、粒子は、ＮＣタンパク質およびＭＡタンパク質を含む融合タンパク質を含有し、その一方または両方は、少なくとも１つの非ウイルスアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）と融合している。粒子のＮＣタンパク質は、２つの機能的ジンクフィンガータンパク質ドメインを有し得る。特に、第２のＮＣジンクフィンガードメインの保持は、ウイルスの集合および出芽の効率を保ち得る。一部の例では、粒子は、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質を含む融合タンパク質を含有し、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質は、少なくとも１つの非ウイルスＡＢＰと融合している。粒子はまた、（ｉ）アデノシンデアミナーゼおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質であるアデノシン塩基対エディター（ＡＢＥ）、ならびに（ｉｉ）ｇＲＮＡを含むＲＮＰも含有する。非ウイルス核酸配列を含み、少なくとも１つのアプタマーが、ｇＲＮＡ配列に付着しているまたは挿入されている、本明細書に記載される哺乳動物発現プラスミドのいずれかを使用して、ＲＮＰを含有するレンチウイルス様粒子を作製することができる。一部の例では、レンチウイルス様粒子は、機能的インテグラーゼタンパク質を含有しない。これらのウイルス様粒子は、目的の真核細胞に形質導入するのに有用である。

粒子は、１つまたは複数のＡＢＰを含むウイルス融合タンパク質を含み得る。一部の例では、粒子は、ＮＣタンパク質、ＭＡタンパク質、またはその両方を含有し、ＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質の一方または両方は、１つまたは複数の非ウイルスＡＢＰと融合している。一部の例では、レンチウイルス様粒子は、少なくとも１つの非ウイルスＡＢＰと融合したＮＣタンパク質を含む。一部の例では、レンチウイルス様粒子は、少なくとも１つの非ウイルスＡＢＰと融合したＭＡタンパク質を含む。一部の例では、レンチウイルス様粒子は、ＮＣタンパク質およびＭＡタンパク質を含み得、ＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質の一方または両方は、２つの非ウイルスＡＢＰタンパク質、第１の非ウイルスＡＢＰ、および第１の非ウイルスＡＢＰのＣ’末端に融合した第２の非ウイルスＡＢＰと（すなわち、タンデムで）融合され得る。ある特定の例では、粒子は、第１の非ウイルスＡＢＰおよび第２の非ウイルスＡＢＰと融合したＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質の一方または両方を含有し得る。

一部の例では、レンチウイルス様粒子は、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質を含有し、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質は、１つまたは複数の非ウイルスＡＢＰに融合している。一部の例では、レンチウイルス様粒子は、２つの非ウイルスＡＢＰ、第１の非ウイルスＡＢＰ、および第１の非ウイルスＡＢＰのＣ’末端に融合した第２の非ウイルスＡＢＰに（すなわち、タンデムで）融合したＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質を含有する。一部の例では、レンチウイルス様粒子は、第１の非ウイルスＡＢＰおよび第２の非ウイルスＡＢＰに融合したＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質を含有する。第１の非ウイルスＡＢＰおよび第２の非ウイルスＡＢＰは両方とも、同じＡＢＰであり得る。あるいは、第１の非ウイルスＡＢＰおよび第２の非ウイルスＡＢＰは、異なるＡＢＰであり得る。一部の例では、レンチウイルス様粒子は、そのＣ’末端に融合した少なくとも１つの第２の非ウイルスＡＢＰを有するＭＡタンパク質に融合した少なくとも１つの第１の非ウイルスＡＢＰを有するＮＣタンパク質を含み得る。少なくとも１つの第１の非ウイルスＡＢＰおよび少なくとも１つの第２の非ウイルスＡＢＰは両方とも、同じＡＢＰである。あるいは、少なくとも１つの第１の非ウイルスＡＢＰタンパク質および少なくとも１つの第２の非ウイルスＡＢＰは、異なるＡＢＰであり得る。第１の非ウイルスＡＢＰおよび第２の非ウイルスＡＢＰは両方とも、同じＡＢＰであり得る。あるいは、第１の非ウイルスＡＢＰおよび第２の非ウイルスＡＢＰは、異なるＡＢＰであり得る。

非ウイルスＡＢＰは、ＲＮＡアプタマー配列に結合するポリペプチド配列である。いくつかの非ウイルスＡＢＰは、本開示における使用に好適である。特に、好適なＡＢＰとしては、ステム－ループ構造を形成するＲＮＡ配列である公知のＲＮＡアプタマー配列に特異的に結合するバクテリオファージＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。例示的な非ウイルスアプタマー結合タンパク質としては、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドおよびＣｏｍ（ｍｏｍの制御）タンパク質が挙げられる。ラムダＮペプチドは、タンパク質のＲＮＡ結合ドメインであるラムダＮタンパク質のアミノ酸１～２２であり得る。これらのＡＢＰおよびそれらが結合するアプタマー配列についての情報を、上記の表１に提供する。

レンチウイルス様粒子は、さまざまなレンチウイルスタンパク質を含み得る。しかしながら、一部の例では、レンチウイルス様粒子は、ネイティブレンチウイルスで見られるタンパク質または核酸の種類のすべてを含んでいない。一部の例では、粒子は、ＮＣ、ＭＡ、ＣＡ、ＳＰ１、ＳＰ２、Ｐ６、ＰＯＬ、ＥＮＶ、ＴＡＴ、ＲＥＶ、ＶＩＦ、ＶＰＵ、ＶＰＲ、および／もしくはＮＥＦタンパク質、またはそれらのいずれかの誘導体、組合せもしくは部分を含有し得る。一部の例では、粒子は、ＮＣ、ＭＡ、ＣＡ、ＳＰ１、ＳＰ２、Ｐ６、およびＰＯＬを含有し得る。一部の例では、レンチウイルス様粒子は、ウイルスシェル（カプシド）を形成するタンパク質のみを含み得る。一部の例では、１つまたは複数のレンチウイルスタンパク質は、レンチウイルス様粒子から全部または一部が除外され得る。例えば、一部の例では、レンチウイルス様粒子は、ＰＯＬタンパク質を含有しなくてもよく、またはＰＯＬタンパク質の非機能的バージョン、例えば、不活性化点変異もしくは不活性化トランケーションを有するＰＯＬタンパク質などを含んでいてもよい。別の例では、レンチウイルス様粒子は、インテグラーゼタンパク質を含有しなくてもよく、またはインテグラーゼタンパク質の非機能的バージョン、例えば、不活性化点変異もしくは不活性化トランケーションを有するインテグラーゼタンパク質などを含んでいてもよい。例えば、レンチウイルス様粒子は、アミノ酸６４位でのアスパラギン酸からバリンへの変異（Ｄ６４Ｖ）を含む非機能的インテグラーゼタンパク質を含有し得る。別の例では、レンチウイルス様粒子は、逆転写酵素タンパク質を含有しなくてもよく、または逆転写酵素タンパク質の非機能的バージョン、例えば、不活性化点変異もしくは不活性化トランケーションを有する逆転写酵素タンパク質などを含んでいてもよい。

上に示されるように、ｇＲＮＡは、一般に、ＤＮＡ標的化配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと相互作用する定常領域を含む。一部の例では、ｇＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質または誘導体と併せて使用されるｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。他の例では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない。例えば、ｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質または誘導体と併せて使用されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでいなくてもよい。

一部の例では、ｇＲＮＡは、少なくとも１つのアプタマー配列を含む。一部の例では、少なくとも１つのアプタマー配列は、ｇＲＮＡの５’末端または３’末端に位置し得る。一部の例では、少なくとも１つのアプタマー配列は、ｇＲＮＡ内の内部位置、例えば、フォールディングされたｇＲＮＡにおいて形成されるループの１つまたは複数などに挿入され得る。例えば、ｇＲＮＡがＣａｓ９タンパク質のためである場合、少なくとも１つのアプタマー配列は、ｇＲＮＡのテトラループ、ステムループ２（ＳＴ２）、または３’末端に位置し得る。一部の例では、１～３０リボヌクレオチドのスペーサーは、ｇＲＮＡと少なくとも１つのアプタマー配列との間に、または少なくとも１つのアプタマー配列に隣接して位置し得る。ある特定の例では、少なくとも１つのアプタマー配列は、真核細胞のレンチウイルス様粒子形質導入を妨げない。例えば、ＮＣタンパク質、ＭＡタンパク質、ＶＰＲタンパク質、またはＮＥＦタンパク質の１つまたは複数に融合した少なくとも１つの非ウイルスＡＢＰは、真核細胞のレンチウイルス様粒子形質導入を妨げることができない。

遺伝子編集方法
真核細胞のゲノムにおいて、ＤＮＡ標的、例えば、遺伝子を編集するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において本開示に提供されるプラスミドおよびシステムを使用する方法が本明細書に記載される。

本明細書に提供される方法では、改変される目的の標的ゲノム配列を含む真核細胞は、少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）に融合したウイルスタンパク質を含むウイルス融合タンパク質、ならびに（１）ｇＲＮＡ、および（２）アデノシンデアミナーゼおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質であるアデノシン塩基対エディター（ＡＢＥ）を含むＲＮＰを含有するレンチウイルス様粒子を用いて形質導入される。

提供される方法の利点は、ＡＢＥに関連するガイド非依存性ＲＮＡオフターゲット遺伝子編集事象の低減である。例えば、本明細書に提供される方法では、ガイド非依存性ＲＮＡオフターゲット活性は、ＲＮＰが非レンチウイルス送達を使用して送達される場合のＲＮＡオフターゲット活性と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、９５％、９９％、またはそれより高く低減され得る。一部の例では、ガイド非依存性ＤＮＡオフターゲット遺伝子編集事象も低減される。例えば、本明細書に提供される方法では、ガイド依存性ＤＮＡオフターゲット活性は、ＲＮＰが非レンチウイルス送達を使用して送達される場合の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、９５％、９９％、またはそれより高く低減され得る。また、インテグラーゼ活性を欠くレンチウイルス様粒子が方法において使用される場合、粒子によって運ばれる核酸のいずれかの細胞ゲノムへの組込みのリスクの低減がある。一部の例では、使用されるレンチウイルス粒子は、ウイルス複製に必須であるレンチウイルスゲノム配列の部分を欠き、そのようなものとして、継続した粒子産生のリスクを低減する。提供される構成要素の別の利点は、ウイルス融合タンパク質が、ＲＮＰのレンチウイルス様粒子へのパッケージングを増加させ得、次に、ゲノム編集効率を増加させるということである。

一部の例では、形質導入された真核細胞は、哺乳動物細胞である。一部の例では、真核細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養された細胞であり得る。一部の例では、真核細胞は、対象から得られたｅｘ ｖｉｖｏ細胞であり得る。他の例では、真核細胞は、対象中に存在する。全体を通して使用される場合、対象とは、個体を意味する。例えば、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、より具体的には、ヒトである。非ヒト霊長類は、同様に、対象である。対象という用語は、飼育動物、例えば、ネコ、イヌなど、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、および実験動物（例えば、フェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモットなど）を含む。そのため、獣医学的使用および医学的使用、ならびに製剤が本明細書で企図される。用語は、特定の年齢または性別を示さない。そのため、成体および新生児対象は、雄または雌にかかわらず、網羅されることが意図される。本明細書で使用される場合、患者または対象は、互換的に使用されてもよく、疾患または障害に罹患する対象を指し得る。本明細書に提供されるレンチウイルス様粒子は、対象に投与され得る、例えば、公知の、日常的な方法に従って、対象に注射され得る。例示的な投与の方式としては、経口、直腸、経粘膜、局所、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介する）、頬側（例えば、舌下）、経膣、髄腔内、眼内、経皮、皮内、胸膜内、大脳内、および関節内、局所など、ならびに直接的な組織または器官の注射が挙げられる。投与はまた、腫瘍に対してであり得る。任意の所与の場合における最も好適な経路は、処置されている状態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のレンチウイルス様粒子の性質に依存する。一部の例では、レンチウイルス様粒子は、静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、筋肉内、または特定の器官もしくは組織に注射される。一部の実施形態では、２回以上の投与（例えば、２回、３回、４回またはそれよりも多くの投与）が、さまざまな間隔の期間にわたって、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年など、所望の遺伝子編集のレベルを達成するために用いられ得る。

本明細書に記載される組換えレンチウイルス様粒子のいずれかの有効量は、実験および／または臨床試験を通して、当業者によって、変更され、決定され得る。例えば、有効用量は、約１０^６～約１０^１５個のレンチウイルス様粒子、例えば、約１０^６～約１０^１４個、約１０^６～約１０^１３個、約１０^６～約１０^１２個のレンチウイルス様粒子、約１０^６～約１０^１２個、約１０^６～約１０^１１個、または約１０^６～約１０^１１個のレンチウイルス様粒子であり得る。他の有効投薬量は、用量応答曲線を確立する日常的な試験を通して、当業者によって容易に確立され得る。例えば、Mangeot et al. "Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins," Nat Commun 10, 45 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-018-07845-zを参照されたい。

一部の例では、提供される方法は、目的の標的遺伝子座を改変するためのものであって、複数の真核細胞を複数のウイルス粒子で形質導入することを含み、複数のウイルス粒子は、（ｉ）ウイルスタンパク質、例えば、ＮＣ、ＭＡ、ＶＲＰ、またはＮＥＦを含む融合タンパク質であって、ウイルスタンパク質が、少なくとも１つの非ウイルスアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）（１）ｇＲＮＡおよび（２）ＡＢＥを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体であって、ＲＮＰが、ｇＲＮＡを介して、細胞のゲノムＤＮＡ中のゲノム標的配列に結合する（例えば、優先的に結合する）ことができ、ＡＢＥが、細胞のゲノムＤＮＡを変更する、ＲＮＰ複合体を含む。上に記載されたように、ＲＮＰは、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと複合体を形成するｇＲＮＡ配列に付着したまたは挿入されたアプタマー配列の相互作用を介して、ウイルス粒子にパッケージングされる。

記載される方法は、機能のためにｓｇＲＮＡの定常領域を必要とする任意の触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとともに使用することができる。これらとしては、限定されるものではないが、ＲＮＡガイド部位特異的ヌクレアーゼが挙げられる。例としては、ＩＩまたはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする任意の細菌種に存在するヌクレアーゼが挙げられる。好適なＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、本開示全体を通して記載される。例えば、限定されるものではないが、部位特異的ヌクレアーゼは、触媒的に損なわれたＣａｓ９ポリペプチド、触媒的に損なわれたＣｐｆ１ポリペプチド、触媒的に損なわれたＣａｓ９ニッカーゼ、またはそれらのいずれかの誘導体であり得る。

一般に、ｓｇＲＮＡは、遺伝子またはその近くの特異的領域に標的化される。一部の例では、ｓｇＲＮＡは、単一塩基変化が、例えば、鎌状赤血球貧血を引き起こすヒトベータ－グロビン遺伝子中の単一塩基変異を修正するために必要である領域に標的化され得る。ｓｇＲＮＡは、本明細書に記載されるＲＮＰを、細胞のゲノム配列中の特異的部位に許容する。ＲＮＰがゲノム配列中の特異的部位に結合したら、アデニン塩基エディターは、一方の鎖におけるアデノシン（Ａ）からイノシンの形成を触媒するが、触媒的に損なわれたエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａは、対向する鎖、すなわち、編集されていない鎖にニックを入れる。イノシンは、ポリメラーゼ酵素によってグアノシンとして読み取られるので、ＤＮＡ修復および複製メカニズムは、標的部位で、元のＡ－Ｔ塩基対をＧ－Ｃ塩基対に置き換える。Gaudelli et al. (2017)を参照されたい。

一部の例では、本開示に記載されるシステム構成要素に対する改変は、真核細胞への形質導入後にシステム構成要素が機能する方法を損なわない。むしろ、構成要素は、真核細胞への形質導入の際に、未改変構成要素と同様にまたはより良好に機能し得る。例えば、レンチウイルス様粒子中のウイルス融合タンパク質は、真核細胞のレンチウイルス様粒子形質導入を妨げることができない。同様に、レンチウイルス様粒子にパッケージングされたＲＮＰが少なくとも１つのアプタマー配列を含む場合、少なくとも１つのアプタマー配列は、真核細胞のレンチウイルス様粒子形質導入を妨げることができない。一部の例では、ウイルス融合タンパク質を含有するレンチウイルス様タンパク質は、真核細胞への形質導入の際に、ウイルス融合タンパク質を含まないレンチウイルス様粒子と比べて、より多くの遺伝子編集をもたらし得る。一例では、ウイルス融合タンパク質は、ＮＣ－ＡＢＰ融合タンパク質、例えば、ＮＣ－ＭＳ２融合タンパク質またはＮＣ－ＰＰ７融合タンパク質であり得る。一例では、ＮＣ融合タンパク質は、１つまたは２つのＡＢＰ、例えば、１つもしくは２つのＭＳ２タンパク質、１つもしくは２つのＰＰ７タンパク質、または１つのＭＳ２タンパク質および１つのＰＰ７タンパク質に融合される。

真核細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであり得る。一部の実施形態では、細胞は、（対象から単離された）初代細胞である。本明細書で使用される場合、初代細胞は、形質転換されていないまたは不死化されていない細胞である。そのような初代細胞は、培養、二次培養、または限定された回数継代することができる（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回培養）。一部の場合では、初代細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件に適合される。一部の場合では、初代細胞は、生物、系、器官、または組織から単離され、必要に応じて選別され、培養または二次培養することなく直接利用される。一部の場合では、初代細胞は、刺激され、活性化され、または分化される。一部の実施形態では、細胞は、改変された細胞の集団を拡大増殖するのに有効な条件下で培養される。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法のいずれかによって改変された細胞は精製される。一部の場合では、細胞は、対象から取り出され、本明細書に記載される方法のいずれかを使用して改変され、患者に再投与される。

一部の例では、細胞が上に記載されるウイルス粒子で形質導入されたら、細胞は、遺伝子編集が生じるのを可能にする十分な時間量の間培養され、その結果、検出可能な表現型を発現する細胞のプールを、複数の形質導入された細胞から選択することができる。表現型は、例えば、細胞の成長、生存または増殖であり得る。一部の例では、表現型は、薬剤、例えば、細胞傷害剤、癌遺伝子、腫瘍抑制因子、転写因子、キナーゼ（例えば、受容体チロシンキナーゼ）、プロモーター（例えば、異種プロモーター）の制御下の遺伝子（例えば、外因性遺伝子）、チェックポイント遺伝子または細胞周期調節因子、増殖因子、ホルモン、ＤＮＡ損傷剤、薬物、または化学療法薬の存在下での、細胞の成長、生存または増殖である。表現型はまた、タンパク質発現、ＲＮＡ発現、タンパク質活性、または細胞運動性、遊走もしくは侵襲性であり得る。一部の例では、表現型に基づいて細胞を選択することは、蛍光標識細胞分取、細胞の親和性精製、または細胞運動性に基づく選択を含む。

一部の例では、細胞を選択することは、例えば、増幅、シークエンシング、ＳＮＰ分析などによる細胞のゲノムＤＮＡの分析を含む。シークエンシング方法としては、限定されるものではないが、ショットガンシークエンシング、ブリッジＰＣＲ、サンガーシークエンシング（マイクロ流体サンガーシークエンシングを含む）、パイロシークエンシング、大規模並列シグネチャーシークエンシング、ナノポアＤＮＡシークエンシング、単一分子リアルタイムシークエンシング（ＳＭＲＴ）（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）、イオン半導体シークエンシング、ライゲーションシークエンシング、合成によるシークエンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ）、Ｐｏｌｏｎｙシークエンシング、４５４シークエンシング、固相シークエンシング、ＤＮＡナノボールシークエンシング、ヘリスコープ単一分子シークエンシング、質量分析シークエンシング、パイロシークエンシング、Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｏｌｉｇｏ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）シークエンシング、ＤＮＡマイクロアレイシークエンシング、ＲＮＡＰシークエンシング、トンネル電流ＤＮＡシークエンシング、および将来特定される任意の他のＤＮＡシークエンシング方法が挙げられる。本明細書に記載されるシークエンシング方法の１つまたは複数を、ハイスループットシークエンシング方法において使用することができる。本明細書で使用される場合、「ハイスループットシークエンシング」という用語は、２つ以上の核酸配列が所与の時間で配列決定される、核酸を配列決定することに関するすべての方法を指す。

処置の方法
本明細書に記載される方法および組成物のいずれかを使用して、対象における疾患（例えば、がん、血液障害（例えば、鎌状赤血球貧血またはベータサラセミア）、感染性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、または他の炎症性障害）を処置することができる。

一部の方法では、処置されるがんは、Ｂ細胞起源のがん、乳がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺がん、結腸がん、慢性骨髄性がん、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ））、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、腎臓がん、卵巣がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、横紋筋肉腫、およびホジキンリンパ腫から選択される。一部の実施形態では、Ｂ細胞起源のがんは、Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される。

一部の方法では、対象の細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで改変される。一部の方法では、対象における疾患を処置する方法は、ａ）対象から細胞を得ること、ｂ）細胞を、本明細書に提供される方法のいずれかを使用して改変すること、およびｃ）改変された細胞を対象に投与することを含む。例えば、Milone and O'Doherty "Clinical sue of lentiviral vectors," Leukemia 32, 1529-1541 (2018)を参照されたい。必要に応じて、疾患は、対象におけるがん、血液障害（例えば、鎌状赤血球貧血またはベータサラセミア）、感染性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、または他の炎症性障害からなる群より選択される。がんを処置するための一部の方法では、対象から得られた細胞は、腫瘍特異的抗原を発現するように改変される。全体を通して使用される場合、「腫瘍特異的抗原」という語句は、がん細胞に対して固有である抗原、または非がん性細胞においてよりもがん細胞においてより多く発現される抗原を意味する。必要に応じて、対象から得られた細胞は、Ｔ細胞である。必要に応じて、改変された細胞は、対象への投与の前に拡大増殖される。

本明細書に記載されるレンチウイルス様粒子または細胞は、医薬組成物として製剤化され得る。したがって、本明細書に記載されるレンチウイルス様粒子のいずれかを含む医薬組成物が本明細書に提供される。本明細書に記載される改変された細胞のいずれかを含む医薬組成物も提供される。必要に応じて、医薬組成物は、担体をさらに含むことができる。担体という用語は、レンチウイルス様粒子または細胞と組み合わせた場合に、その意図される使用または目的のために、レンチウイルス様粒子または細胞の調製、保管、投与、送達、有効性、選択性、または任意の他の特色を補助するまたは容易にする、化合物、組成物、物質、または構造体を意味する。例えば、担体は、活性成分の任意の分解を最小限にするように、および対象における任意の有害な副作用を最小限にするように、選択され得る。そのような薬学的に許容される担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝食塩水、人工脳脊髄液、デキストロース、および水を含む、無菌の生体適合性医薬担体が挙げられる。薬学的に許容されるとは、生物学的にもその他の点で望ましくないものでもない材料を意味し、これは、許容されない生物学的効果を生じることも、それを含有する医薬組成物の他の構成要素と有害な様式で相互作用することもなく、選択された薬剤と一緒に個体に投与することができる。

本開示で議論されるすべての特許、特許公開、特許出願、論文記事、書籍、技術参考文献などは、すべての目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示の図および説明は、本開示の明確な理解に関連する要素を説明するために簡略化されていることが理解されるべきである。図は、組立図としてではなく、説明の目的で提示されていることが認識されるべきである。省略された詳細および改変または代替実施形態は、当業者の範囲内である。

本開示のある特定の態様では、要素もしくは構造を提供するため、または所与の機能（単数または複数）を行うために、単一の構成要素を複数の構成要素によって置き換えることができ、複数の構成要素を単一の構成要素によって置き換えることができることが認識され得る。そのような置換が、本開示のある特定の実施形態を実行するために作動しない場合を除き、そのような置換は本開示の範囲内と考えられる。

本明細書に提示される実施例は、本開示の潜在的なおよび具体的なインプリメンテーションを説明することを意図する。実施例は、主に、当業者のための本開示の説明の目的を意図することが認識され得る。本開示の精神から逸脱することなく、本明細書に記載されるこれらの図または操作に対する変形形態が存在し得る。例えば、ある特定の場合では、方法のステップまたは操作は、異なる順序で行われるまたは実施されてもよく、あるいは操作は、付加、欠失または改変されてもよい。

値の範囲が提供される場合、文脈が明確に他を指示しない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の最小分数までそれぞれ介在する値も具体的に開示されていることが理解される。述べられた範囲内の任意の述べられた値または述べられていない介在する値と、その述べられた範囲内の任意の他の述べられた値または介在する値との間の任意のより狭い範囲が包含される。それらのより小さな範囲の上限および下限は、独立してその範囲に含まれるか、またはその範囲で除外されてもよく、より小さな範囲に限定のいずれかが含まれる、どちらも含まれない、または両方が含まれる各範囲も、述べられた範囲内の任意の具体的に除外された限定に付される技術内に包含される。述べられた範囲が、限定の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限定のいずれかまたは両方を除外する範囲も含まれる。

図面に表されるか、または上に記載される構成要素、ならびに示されても、記載されてもいない構成要素およびステップの異なる配置が可能である。同様に、一部の特色および下位組合せが有用であり、他の特色および下位組合せに言及することなく用いられ得る。本開示の実施形態は、制限的な目的ではなく、例証のために説明してきたが、代替実施形態は、本特許の読者には明らかになろう。したがって、本開示は、上に記載された実施形態にも、図面に表される実施形態にも限定されず、下記の特許請求の範囲から逸脱することなく、さまざまな実施形態および改変を行うことができる。

本明細書に引用された刊行物、およびそれらが引用する材料は、それらの全体が、ここに参照により具体的に組み込まれる。

プラスミド
ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ 番号１２２５９）、ｐＣＭＶ＿ＡＢＥｍａｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ 番号１１２０９５）（Koblanet al. Nat Biotechnol 2018, 36(9): 843-846）、およびｐｓＰＡＸ２－Ｄ６４Ｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ 番号６３５８６）（Certo et al. Nat Methods 2011, 8(8): 671-6）を、Ａｄｄｇｅｎｅから購入した。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＡＢＥ７．１０を発現するためのプラスミドは以前に記載されている（Kim et al., Nat Biotechnol 2019, 37 (4), 430-435）。他のプラスミドを、表２に示すように、作製した。遺伝子合成は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．によって行った。作製されたすべての構築物を、サンガーシークエンシングによって確認した。プライマーおよびオリゴヌクレオチドについての配列情報を、表３に列挙する。ＡＢＥ標的配列およびｓｇＲＮＡ発現構築物を作製するために使用したオリゴを、表４に列挙する。表２に列挙したプラスミドの構成要素についての配列を、核酸リンカー、例えば、約２～１００塩基のリンカーによって分離することができることが理解される。必要に応じて、本明細書に記載される構築物のいずれかは、例えば、プロモーター配列とポリペプチド配列（例えば、ＡＢＥ）をコードする核酸との間に１つまたは複数のイントロンを含んで、構築物中の１つまたは複数のポリペプチド配列の発現を容易にすることができる。
表2. プラスミド
表3. プライマー
表4. 標的配列およびsgRNA発現ベクターへのクローニングガイドのためのオリゴ

ＡＢＥ７．１０発現および精製
Ｎ末端Ｈｉｓタグに連結したコドン最適化ＡＢＥ７．１０をコードするＳＮＵ－ＡＢＥプラスミドを、最初に、ＢＬ２１－ｓｔａｒ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、次いで、これを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するルリア－ベルターニ（ＬＢ）寒天プレートに蒔いた。３７℃での終夜のインキュベーション後、単一コロニーを選択し、ＡＢＥ触媒活性を維持するために、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１０μＭのＺｎＣｌ_２を含有するＬＢブロス中、３７℃で終夜成長させた（事前培養）。この事前培養後、接種物の一部を、大規模培養のために（最高で６Ｌ）、１Ｌのフラスコ中のいくつかの４００ｍｌのＬＢ培地に移し、得られた培養物を、吸光度Ａ６００＝約０．５～０．７０まで、２５０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃でインキュベートした。次に、培養物を、約１時間、氷上に置いた。ＡＢＥタンパク質発現を誘導するために、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＧｏｌｄＢｉｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加し、培養物を、２５０ｒｐｍで振とうしながら、１８℃で１４～１６時間インキュベートした。

精製手順の後のステップはすべて、０～４℃で行った。細胞溶解前に、細胞を、５，０００ｇで１０分間の遠心分離によって回収し、その後、それらを、４００ｍｌの接種物あたり８ｍｌの溶解緩衝液［５０ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、５００ｍＭの１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０％のグリセロール、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍｇ／ｍｌのニワトリ卵白由来リゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μＭのＺｎＣｌ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ８．０］に再懸濁させた。溶解のために、合計で３回、細胞を、液体窒素中で凍結し、３７℃で解凍した。さらなる溶解のために、細胞を超音波処理（合計で３分、５秒オン、１０秒オフ）し、その後、それらを、１３，０００ｒｐｍで遠心分離して、溶解物を清澄化した。上清を、１０ｍｌのＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）と混合し、樹脂－溶解物混合物を、１時間穏やかに回転させ、次いで、カラムにロードした。カラムを、５０ｍｌのニッケル洗浄緩衝液［５０ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、３５ｍＭのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭのＤＴＴ（ＧｏｌｄＢｉｏ）、１０μＭのＺｎＣｌ２ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ ８．０］でそれぞれ３回洗浄し、次いで、タンパク質を、２０ｍｌのニッケル溶出緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、２０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、１０μＭのＺｎＣｌ２、ｐＨ８．０）で溶出させた。溶出したタンパク質を、別のカラムにおいて、５ｍｌのヘパリンセファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製した。カラムを、５０ｍｌのヘパリン洗浄緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１０μＭのＺｎＣｌ２、ｐＨ８．０）で３回洗浄し、タンパク質を、２０ｍｌのヘパリン溶出緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、７５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、１０μＭのＺｎＣｌ２、ｐＨ８．０）で溶出させた。最後に、溶出したタンパク質を、濃縮し、１００，０００ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）による６，０００ｘｇでの遠心分離によって、ＡＢＥ保管緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＤＴＴ、４０％のグリセロール、ＰＨ７．５）に緩衝液交換した。

増幅された標的部位のＡＢＥおよびＥｎｄｏ Ｖ－媒介ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化
ＡＢＥ部位１（Ｈｅｋ２）に及ぶ領域を、プライマーＨＥＫ２－ＦおよびＨＥＫ２－Ｒによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ｃｈｒ５：＋８７９４４４８０－８７９４４８０２）を使用して増幅した。次いで、２μｇの得られたアンプリコンを、２００μｌのＡＢＥ反応緩衝液［５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｍＭのＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２．５ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭのＤＴＴ（ＧｏｌｄＢｉｏ）、１０ｍＭのＺｎＣｌ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０％のグリセロール］中の４μｇのＡＢＥ７．１０タンパク質および３μｇのｓｇＲＮＡ（ＡＢＥ部位１を標的化する）とともに、３７℃で１～２時間、インキュベートした。反応後、ＡＢＥタンパク質およびｓｇＲＮＡを、それぞれ、８０μｇのプロテイナーゼＫおよび４００μｇのＲＮａｓｅ Ａ（両方ともＱｉａｇｅｎ製）との１０分間のインキュベーションによって、除去した。アンプリコンを、ＰＣＲ精製キット（ＭＧｍｅｄ）を使用して精製した。１μｇの精製されたアンプリコンを、１０単位のＥｎｄｏ Ｖ酵素（ＮＥＢ）とともに１時間インキュベートした。次に、混合物を、８０μｇのプロテイナーゼＫとともにインキュベートし、再び、ＰＣＲ精製キット（ＭＧｍｅｄ）を用いて精製した。最後に、ＤＮＡ断片を、２％のアガロースゲル上での電気泳動後に画像化した。
ＲＮＰ電気穿孔
ＡＢＥ部位１のためのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｒＧｒＡｒＡｒＣｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｒＧｒＣｒＡｒＵｒＡｒＧｒＡｒＣｒＵｒＧｒＣｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵｒＧｒＣｒＵ）（配列番号７４）を、ＩＤＴ Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成した。Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９陰性対照ｃｒＲＮＡ、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃａｓ９電気穿孔エンハンサー、およびＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｄｕｐｌｅｘ緩衝液を、ＩＤＴ Ｉｎｃ．から購入した。ＲＮＰ再構成および電気穿孔を、ＩＤＴ Ｉｎｃ．の指示に従って行った。合計で２×１０^５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、各電気穿孔のために使用した。細胞を、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キットＶ（カタログ番号ＶＣＡ－１００３、Ｌｏｎｚａ）からの１００μｌのヌクレオフェクション緩衝液に再懸濁させ、電気穿孔キュベットに入れた。次いで、１μｌのＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃａｓ９電気穿孔エンハンサーおよび５μｌの再構成したＡＢＥ ＲＮＰを、キュベット中の細胞に添加した。最後に、細胞に、プロトコールＱ－００１で、電気ショックを与えた。細胞を、キュベットから取り出し、分析前に、成長培地中で２４時間培養した。

レンチウイルスカプシド－ＲＮＰ産生
ＡＢＥ ＲＮＰでパッケージングされたレンチウイルスカプシドを、３つのプラスミドトランスフェクション手順によって産生した。簡潔には、１３００万個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭを有する１５ｃｍディッシュ中で培養した。１６μｇのＡＢＰ－改変パッケージングプラスミドｐｓｐＡＸ２－Ｄ６４Ｖ－ＮＣ－ＡＢＰ（ＡＢＰはＭＣＰ（ＭＳ２コートタンパク質、ＲＮＡアプタマーＭＳ２に結合）（Peabody et al., Nucleic Acids Res 1992, 20 (7): 1649-55）またはＣｏｍ（ＲＮＡアプタマーｃｏｍに結合）であり得る）（Hattmanet al., P Natl Acad Sci USA 1991, 88 (22):10027-10031）、６μｇのエンベローププラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ）、および１６μｇのＡＢＥを共発現するプラスミドＤＮＡ、ならびに対応するアプタマー－改変ｓｇＲＮＡを、１ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で混合した。７６ｕｌの１ｍｇ／ｍｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）を、１ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）低減血清培地中で混合した。次いで、ＤＮＡ混合物およびＰＥＩ混合物を、混合し、室温で１５分間、インキュベートした。次いで、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地中の細胞に添加した。トランスフェクション２４時間後、培地を、１５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地に交換し、ＡＢＥ ＲＮＰ負荷ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、トランスフェクション４８時間後および７２時間後に収集した。上清を、５００ｇで１０分間回転させて、細胞デブリを除去した。清澄化した上清は、直接使用する、または下に記載されるようにさらに濃縮することができる。トランスフェクションはまた、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、１０ｃｍディッシュまたは６ウェルプレート中で行うこともできる。ＤＮＡ量は、容器の表面積に基づいて、比例的に調整した。

ＡＢＥ ＲＮＰ負荷ＶＬＰの濃縮
ＡＢＥ ＲＮＰ負荷ＶＬＰを含有する上清を、ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２ｉ（ＫＲ２ｉ）タンジェンシャルフロー濾過システム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂ、カタログ番号ＳＹＲ２－Ｕ２０）を用いて、濃縮－透析濾過－濃縮方式を使用して、濃縮した。簡潔には、１５０～３００ｍｌの上清を、最初に、約５０ｍｌに濃縮し、５００ｍｌ～１０００ｍｌのＰＢＳを用いて透析濾過し、最後に、約８ｍｌに濃縮した。中空繊維フィルターモジュールを、５００ｋＤａの分子量カットオフの改変ポリエーテルスルホンから作製した。流量および圧力制限は、フィルターモジュールＤ０２－Ｅ５００－０５－Ｎについて、８０ｍｌ／分および８ｐｓｉ、フィルターモジュールＣ０２－Ｅ５００－０５－Ｎについて、１０ｍｌ／分および５ｐｓｉであった。カプシド－ＲＮＰも、以前に記載されたようにして、超遠心分離法によって濃縮した（Lu et al., Nucleic Acids Res 2019, 47 (8): e44.）。

ＶＬＰ定量化
ＶＬＰの濃度を、ｐ２４（レンチウイルスカプシドタンパク質ＣＡ）ベースのＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｔｉｔｅｒキットカタログ番号ＶＰＫ－１０７、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって決定した。未濃縮試料をアッセイする場合、可溶性ｐ２４タンパク質が検出されないように、ＶＬＰを、製造者の指示に従って沈殿させた。

ＡＢＥ ＲＮＰ ＶＬＰ中のカプシドおよびＣａｓ９タンパク質のウエスタンブロッティング分析
２００ｎｇのＶＬＰのｐ２４を、公開された手順（Wiegers et al., J Virol 1998, 72 (4): 2846-54）に従って、０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００を用いて一過的に処理した。簡潔には、ＶＬＰを、Ｓｏｒｖａｌｌ Ｔ－８９０ローター（１２０，０００ｇで２時間）を用いて、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００ありまたはなしのＳＴＥ［１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ］中の１０％のスクロースの１ｍｌ層、およびＳＴＥ溶液中の２ｍｌの２０％のスクロースのクッションを含有するステップ勾配により遠心分離した。ペレット化したＶＬＰ粒子を、ウエスタンブロッティングのため、またはＲＴ－ｑＰＣＲ分析のためのＲＮＡを精製するために、１００μｌの１×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に直接溶解した。

各試料中のタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、ウエスタンブロッティングによって分析した。使用した抗体は、マウスモノクローナル抗ＳｐＣａｓ９抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９モノクローナル抗体７Ａ９－３Ａ３、カタログ番号ＭＡ１－２０１、１：１０００）、およびカプシドタンパク質のためのｐ２４マウスモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号３１０８１０、１：１０００）を含む。ＨＲＰコンジュゲート化抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、カタログ番号３１４３０、１：５０００）およびＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３１４６０、１：５０００）二次抗体を、ウエスタンブロッティングにおいて使用した。ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰ標準は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ製のＧｅｎＣｒｉｓｐｒ ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳヌクレアーゼ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、カタログ番号Ｚ０３３８９Ｓ）であった。化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）を使用して、ＬＡＳ－３０００システム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）においてタンパク質シグナルを可視化した。デンシトメトリー（ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェア）を使用して、タンパク質の量を定量化した。

ＲＮＡ単離およびＲＴ－ｑＰＣＲ分析
ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号２１７００４）を使用して、濃縮したカプシドまたは細胞からＲＮＡを単離した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ＲＮＡからｃＤＮＡに逆転写した。ｓｇＲＮＡ逆転写のために、キットにおいて提供された０．６μｌのランダムプライマー、および０．４μｌのｓｇＲＮＡ特異的プライマー（Ｓｐ－ｓｇＲＮＡ－Ｒ１、ｇｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇｔｇｃｃａｃｔｔ（配列番号８２）、２０μＭ）を、逆転写のために使用した。次いで、ガイド特異的フォワードプライマーＡＢＥ－ｇ５－Ｆ（表２）を、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎベースのＲＴ－ｑＰＣＲ中のＳｐ－ｓｇＲＮＡ－Ｒ１と一緒に使用して、ｓｇＲＮＡを検出した。定量的ＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）３機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）またはＡＢＩ ７５００機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）において実行した。

ＶＬＰ形質導入
約１０～３００ｎｇのｐ２４タンパク質の量のＶＬＰを、８μｇ／ｍｌのポリブレンを用いて、２４ウェルプレート中で成長した２．５×１０^４個細胞に添加した。ＶＬＰの未濃縮上清を、形質導入細胞に対して１：１の比で、新鮮な培地で希釈した。細胞を、ＶＬＰ含有培地とともに１２～２４時間インキュベートし、その後、培地を、通常の培地と置き換えた。

細胞におけるＡＢＥタンパク質分解の調査
２×１０^４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、アプタマーありまたはなしで、１００ｎｇのＡＢＥ ＲＮＰを含有するＶＬＰのｐ２４で形質導入した。形質導入１２時間後、細胞を、０．５％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中で維持して、細胞分裂を制限した。新鮮な培地を、４８時間ごとに交換した。細胞を、形質導入後１２時間ごとに収集して、抗ＳｐＣａｓ９（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＭＡ１－２０１）および抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ、Ａ５４４１、１：５０００）抗体を使用して、ウエスタンブロッティングによって、ＡＢＥタンパク質の存在を検出した。ＡＢＥの相対発現を、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．４９）を用いて、デンシトメトリーによって定量化した。デンシトメトリーデータを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の２相減衰法を使用して、タンパク質の半減期を決定した。

次世代シークエンシングおよびデータ分析
次世代シークエンシングのための標的ＤＮＡを増幅するために使用した領域およびプライマーを表４に列挙する。ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）製のプルーフリーディングＨｏｔＳｔａｒｔ（登録商標）ＲｅａｄｙＭｉｘをＰＣＲのために使用した。アンプリコンを、ＧｅｎｅＷｉｚ’ｓ Ａｍｐｌｉｃｏｎ－ＥＺサービスによって配列決定した。通常、５０，０００リード／アンプリコンを得た。塩基編集を、オンラインソフトウェアＢＥ ａｎａｌｙｚｅｒ（Hwang et al., BMC Bioinformatics 2018, 19 (1): 542）およびＣＲＩＳＰＲＥＳＳＯ２（Clement et al., Nat Biotechnol 2019, 37 (3): 224-22）で分析し、これらは、類似の結果を与えた。

統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０）を、統計分析のために使用した。Ｔ検定を使用して、２群の平均を比較した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）、それに続いてチューキー事後検定を行って、２つよりも多くの群からのデータを分析した。２因子の場合に、ボンフェローニ事後検定を、ＡＮＯＶＡ後に行った。ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。

結果
ＡＢＥ ＲＮＡオフターゲット活性を検出するためのＲＮＡホットスポット
この研究の主要なゴールは、短い活性持続期間および最小限のＲＮＡオフターゲット活性を伴うＡＢＥ送達方法を見出すことであり、そのために、高感度のＲＮＡオフターゲット検出方法が有用である。現在、高深度ＲＮＡシークエンシングが、ＡＢＥ ＲＮＡオフターゲットを検出するために使用されており（Grunewald et al., Nature 2019, 569 (7756): 433-437）、これは、時間がかかり、高価である。最近、ＲＮＡモチーフＣＵＡＣＧＡＡ（配列番号７５）が最も効率的なＡＢＥ ＲＮＡオフターゲットであったことが見出された（Grunewald et al., Nat Biotechnol 2019, 37 (9): 1041-1048）。ヒト配列データベースを分析し、ヒトＵＳＰ３８遺伝子が、そのコード領域のエクソン９中にＣＴＡＣＧＡＡ（配列番号７６）配列を含有することを見出した（図２Ｃ）。ＲＴ－ＰＣＲは、この遺伝子がＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されたことを確認した。ＵＳＰ３８ ｍＲＮＡの「ＣＵＡＣＧＡＡ」（配列番号７５）配列が、ＡＢＥ ＲＮＡオフターゲットホットスポットであるかどうかを分析した。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｃａｓ９ニッカーゼを発現するプラスミドＤＮＡ（陰性対照）またはＡＢＥおよびｓｇＲＮＡ（ＡＢＥ部位１を標的化する）を発現するプラスミドＤＮＡ（Gaudelli et al., Nature 2017, 551 (7681): 464-471）でトランスフェクトした。予測されるホットスポット（図２ＡにおけるプライマーＦ１およびＲ１）に及ぶ４４４ｂｐのＵＳＰ３８ ｃＤＮＡを、標的化次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のために増幅した。ＡＢＥを発現するＤＮＡでトランスフェクトされた細胞において、予測されたホットスポットＣＵＡＣＧＡＡ（配列番号７５）で「Ａ」から「Ｇ」への変化の最も高いピーク（下線付きＡの約１５％がＧに変化した）が、分析領域全体にわたって＜５％の複数のより低いピークとともに、観察された（図２Ｂ）。類似のピークは、Ｃａｓ９ニッカーゼによる対照細胞中に存在しなかった（図２Ｂ）。

ＡＢＥおよびＡＢＥ部位１ ｓｇＲＮＡでトランスフェクトされた細胞のゲノムＤＮＡから増幅された対応するＤＮＡのＮＧＳ分析が、対立遺伝子の０．０２％未満のＡからＧへの変化を明らかにしたので、これらの「Ａ」から「Ｇ」への変化は、ｍＲＮＡにおける変化の結果であるはずである。ＵＳＰ３８ ｃＤＮＡで観察された変化は、アデノシン（Ａ）から、逆転写およびシークエンシングにおいてグアニン（Ｇ）として認識されたイノシン（Ｉ）への非特異的ＲＮＡ編集の結果である可能性が最も高かった。最も頻繁に観察されたＡからＧへの変化はすべて、以前の観察（Grunewald et al. 2019 Nature; Grunewald et al., 2019 Nat. Biotech.）と一致して、ＵＡモチーフにおいて起こった（図２Ｃ）。

「ＣＵＡＣＧＡＡ」（配列番号７５）モチーフにおけるＡからＧへの変化に焦点を合わせると、これらの変化は、ＡＢＥを発現するＤＮＡでトランスフェクトされた細胞のｃＤＮＡから最高で１６．７％のリードで観察されたが、ニッカーゼでトランスフェクトされた細胞のｃＤＮＡから０％のリードで観察された（表５）。重要なことには、ＡＢＥでトランスフェクトされた細胞のｇＤＮＡを分析した場合に、ＡからＧへの変化を有する３２０２５リードのうち３つのみが観察された。これらのデータは、ＵＳＰ３８ ｍＲＮＡにおける「ＣＵＡＣＧＡＡ」（配列番号７５）配列が、実際に、ＡＢＥ ＲＮＡオフターゲットのホットスポットであることを示し、このホットスポットにおけるＲＮＡオフターゲットを分析することで、本発明者らが、異なる送達方法から得られたＡＢＥ ＲＮＡオフターゲット活性を比較することを可能にすることを示唆する。
表5. NGSによるUSP38 cDNAおよびgDNAにおけるCU/(T)ACGAA (配列番号77)からCU/(T)GCGAA (配列番号78)への変化の分析
^a CU(/T)ACGAAからCU(/T)GCGAAへの変化を有するリードのみをカウントした。
^b すべてのリードは、1つのNGS試料由来であった。

電気穿孔によって送達されたＡＢＥ ＲＮＰは、送達２４時間後に、検出不能なＲＮＡオフターゲット活性を示した
ＡＢＥ ＲＮＡオフターゲットホットスポットが確認されたら、電気穿孔によってＡＢＥ ＲＮＰを送達することが、ＤＮＡトランスフェクションと比較して低減されたＲＮＡオフターゲット活性を示すか否かどうかを研究した。組換えＡＢＥ ＲＮＰを、以前に記載されたようにして（Kim et al., Nat Biotechnol 2019, 37 (4), 430-435）調製し、それらの活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて確認した。２０、１０、５、２．５、１．２５、および０．６２５μｇのＡＢＥ ＲＮＰ（ＡＢＥ部位１を標的化する）を、電気穿孔によって、２×１０^５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に送達した。塩基編集によるＤＮＡに特異的なプライマーを設計し、このアプローチを検証するために、このｑＰＣＲアッセイが、ニッカーゼでトランスフェクトされた細胞 対 ＡＢＥでトランスフェクトされた細胞からのＤＮＡを比較した場合に、約６異なるサイクル閾値（Ｃｔ）の値を生じるかどうかを検証した。処理２４時間後、ｑＰＣＲは、オンターゲット塩基編集を、２０および１０μｇのＡＢＥ ＲＮＰで処理された細胞において検出したが、より低い量のＡＢＥ ＲＮＰで処理された細胞において検出しなかった。ＮＧＳを行って、２０および１０μｇのＡＢＥ ＲＮＰで処理された細胞におけるオンターゲット塩基編集を調べ、それぞれ、２．１０％±０．２２％（Ｎ＝３）および１．９３％±０．５３％（Ｎ＝３）のオンターゲット塩基編集が観察された（図１Ｄ）。ランダムｓｇＲＮＡによるＡＢＥ ＲＮＰの電気穿孔が、試料の０．０１％のみにおいて、ＡＢＥ部位１でＡからＧへの変化を示したので、これらは標的特異的塩基編集の発生であった。Lyu et al. "Adenine Base Editor Ribnucleoproteins Delivered by Lentivirus-Like Particles Show High On-Target Base Editing and Undetectable RNA Off-Target Activities," The CRISPR Journal 4(1): 69-81 (2021)も参照されたい。

ＲＮＡオフターゲット活性を、ＵＳＰ３８ホットスポットで調べた。オフターゲットＲＮＡ編集は、６つの試料のいずれにおいてもＵＳＰ３８ホットスポットで観察されず、これは、ＡＢＥプラスミドＤＮＡトランスフェクションによる高レベル（＞１５％）のＲＮＡオフターゲット編集とは全く対照的であった（図１Ｃ、表４）。データは、ＡＢＥ ＲＮＰが、送達２４時間後に、検出可能なオンターゲットＤＮＡ編集を示したが、オフターゲットＲＮＡ編集が検出不能であったことを示す。

電気穿孔によってＡＢＥ ＲＮＰを送達することは、ＲＮＡオフターゲット活性を大いに低減したが、比較的低いオンターゲット塩基編集（＜５％）が、ＡＢＥの比較的大きなタンパク質サイズ（約１８００アミノ酸残基）に恐らく起因して、２０μｇ（約１００ｐｍｏｌ）のＡＢＥ ＲＮＰの電気穿孔後に起こった。単に投薬量を増加することによって、オンターゲット塩基編集効率を顕著に改善することは困難であろう。そのため、より効率的なＡＢＥ ＲＮＰ送達方法が必要である。

レンチウイルスカプシドにおけるＡＢＥ ＲＮＰのパッケージングを介したＡＢＥ ＲＮＰ負荷ＶＬＰの開発
アプタマー／ＡＢＰ相互作用を使用して、効率的なゲノム編集のために、Ｃａｓ９ ＲＮＰをレンチウイルスカプシドにパッケージングすることができる（Lyu et al., Nucleic Acids Res 2019, 47 (17): e99）。問題のタンパク質の異なるサイズ（ＡＢＥについて約１８００ＡＡ 対 ＳａＣａｓ９について１１１４ＡＡ）、およびＣａｓ９タンパク質が異なる種に由来し（ＡＢＥについてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ 対 ＳａＣａｓ９についてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、異なるｓｇＲＮＡスキャフォールドを有していたことを考慮して、３つの方法のｓｇＲＮＡスキャフォールド改変を使用した：１）ＭＳ２アプタマーをテトラループおよびＳＴ２ループの両方と置き換えた（図２Ａ）、２）ｃｏｍアプタマーの１つのコピーを使用して、テトラループのループを置き換えた、ならびに３）ｃｏｍアプタマーの１つのコピーを使用して、ＳＴ２ループを置き換えた。アプタマーｃｏｍが、ＬＶカプシドへのＳａＣａｓ９ ＲＮＰパッケージングを媒介するのに最も効率的なアプタマーであったので、これを選択した。２つ以上のコピーが、ＲＮＡ安定性を大いに減少させるので、アプタマーの１つのコピーを試験した。

ＡＢＥ－ＲＮＰを、最近記載されたように、３つのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトすることによって、ＬＶカプシドにパッケージングした：ＶＳＶ－Ｇタンパク質を発現するエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ、ＡＢＥおよびさまざまな標的特異的アプタマー改変ｓｇＲＮＡを共発現する標的プラスミド、ならびに対応するＡＢＰ（ＭＳ２改変ｓｇＲＮＡについてｐｓｐＡＸ２－Ｄ６４Ｖ－ＮＣ－ＭＳ２、およびｃｏｍ改変ｓｇＲＮＡについてｐｓｐＡＸ２－Ｄ６４Ｖ－ＮＣ－ｃｏｍ）によって改変されたパッケージングプラスミド。カプシド／ＡＢＥ ＲＮＰを含有する上清を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入した。次いで、ｑＰＣＲによる塩基編集活性を比較した。

単一ガイドＲＮＡ ｓｇＲＮＡ ｇ１およびｇ５を使用して、それぞれ、ＡＢＥ部位１および５を標的化した。これらは、対応するＡＢＥを発現するプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした後に成功裏に編集されたことが以前に示された２つの部位であった（Gaudelli et al.）。ｑＰＣＲを使用して、それぞれ、２ｘＭＳ２、Ｔｅｔｒａ－ｃｏｍ、およびＳＴ２－ｃｏｍを含有するｓｇＲＮＡでパッケージングされたカプシド／ＡＢＥ ＲＮＰの塩基編集活性を検出した。２０～１６０倍多い編集された産物を、ＡＢＥ部位１および５で、陰性対照細胞（ＡＢＥ－ｇ１ ＲＮＰ処理細胞のための対照としてＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰ処理細胞、およびその逆も同様）よりもカプシド／ＡＢＥ ＲＮＰ処理細胞において検出した。３種類のＡＢＥ ＲＮＰすべてが機能的であった（図２Ｂ、図２Ｃ）。

ＡＢＥ部位１および５について、２ｘＭＳ２改変は、最も低い塩基編集活性を示した。ＡＢＥ部位５について、単一コピー－ｃｏｍ改変ｓｇＲＮＡの活性は、テトラループおよびＳＴ２ループの場所で、類似の活性を示した。しかしながら、ＡＢＥ部位１について、ＳＴ２－ｃｏｍ改変ＲＮＰは、Ｔｅｔｒａ－ｃｏｍ改変ＲＮＰよりも大幅に良好に機能した（Ｐ＜０．０００１）。ｓｇＲＮＡのＳＴ２－ｃｏｍ改変をさらなる実験のために使用した。アプタマー／ＡＢＰ戦略は、機能的ＡＢＥ ＲＮＰをヒト細胞にパッケージングおよび送達することが可能であった。

ＡＢＥ ＲＮＰ ＶＬＰの塩基編集活性をＮＧＳによって調べた。２．５×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＡＢＥ部位１を標的化する場合、２００ｎｇのカプシド－ＡＢＥ ＲＮＰのｐ２４は、対立遺伝子の３１．８５％においてＡからＧへの編集を生じた（図３）。２．５×１０^４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＡＢＥ部位５を標的化する場合、１０８ｎｇのカプシド－ＡＢＥ ＲＮＰのｐ２４（非濃縮上清）は、すべての対立遺伝子の８７．５％においてＡからＧへの編集を生じた（図２Ｄ）。ＡＢＥ部位５を標的化するＶＬＰで処理された細胞では、ＡからＧへの変化は、ＡＢＥ部位１で対立遺伝子の０．０２％において観察されたが、ＡＢＥ部位１を標的化するＶＬＰで処理された細胞では、ＡからＧへの変化は、対立遺伝子の０．０１％において、ＡＢＥ部位５で観察された。これらのデータは、ＶＬＰが高レベルの部位特異的塩基編集を生じさせたことを示す。

ＡＢＥ ＲＮＰ負荷ＶＬＰのアプタマー依存性集合
アプタマー／ＡＢＰ相互作用が、ＲＮＰが設計されたようにカプシド内部にパッケージングされるために必要であったかどうかを分析した。ＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰ（未改変ｇ５ ｓｇＲＮＡ）およびＡＢＥ－ｇ５ＳＴ２－ｃｏｍ ＲＮＰ（ＳＴ２－ｃｏｍ改変ｇ５ ｓｇＲＮＡ）を有するカプシド中のＡＢＥタンパク質含量を比較した。小胞または粒子膜と会合した可能性のあるＡＢＥタンパク質を排除するために、本発明者らは、０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００緩衝液で粒子を一過性に処理した。この手順は、１００％を超えて、カプシドタンパク質ｐ２４を低減した（図４Ａ）。

次いで、ＡＢＥタンパク質を、ＳｐＣａｓ９抗体を用いるウエスタンブロッティングによって調べた。ＡＢＥは、ＡＢＥ－ｇ５ＳＴ２－ｃｏｍ ＲＮＰを有するカプシドにおいてのみ検出されたが、ＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰを有するカプシドにおいて検出されなかった（図４Ａ）。加えて、一過性の０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００処理は、ＡＢＥの量を３０～５０％減少させた。公知濃度のＳｐＣａｓ９タンパク質と比較して、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）処理されたカプシドにおけるＡＢＥの量は、約１００ｐｇのＡＢＥ／ｎｇ ｐ２４であった（図４Ｂ、アスタリスクを伴う全長ＡＢＥのみを考慮）。１ｎｇのｐ２４あたり１．２５×１０^７個カプシドと仮定すると、カプシド１個あたりのＡＢＥ分子の数は、カプシド１個あたり３０分子と推定された。

ＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰカプシドにおけるＡＢＥタンパク質の欠如と一致して、ｑＰＣＲは、ＡＢＥ－ｇ５（ｓｔ２－ｃｏｍなし）ＲＮＰでパッケージングされたカプシドで処理された細胞における塩基編集活性を検出できなかった（図４Ｃ）。データは、ＡＢＥのカプシドとの会合、および塩基編集活性がアプタマー依存性であったことを示した。

ＲＴ－ｑＰＣＲによるＶＬＰにおけるｓｇＲＮＡレベル。ｑＰＣＲを、公知濃度のそれぞれのプラスミドＤＮＡ（ｓｇＲＮＡ中にｃｏｍありまたはなし）を使用して行って、ｃｏｍアプタマーがｑＰＣＲ検出に影響を及ぼさなかったことを確認した（図４Ｄ）。等量（３００ｎｇのｐ２４）のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）ありおよびなしで処理されたＶＬＰでは、ｇ５ＳＴ２－ｃｏｍ ｓｇＲＮＡ（ｃｏｍあり）のレベルは、それぞれ、ｇ５ ｓｇＲＮＡ（ｃｏｍなし）のものの３５．０±４．８（Ｎ＝４）および７４．２±４．８（Ｎ＝４）倍であった（図４Ｅ）。ｓｇＲＮＡ ｑＰＣＲデータは、ｓｇＲＮＡのｃｏｍ改変が、カプシドにおけるＡＢＥレベルを増加させ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００処理がそれを減少させたことを示す本発明者らのウエスタンブロッティングデータと一致する。一緒に、データは、カプシドにおけるＡＢＥタンパク質およびｓｇＲＮＡのパッケージングならびにＶＬＰの塩基編集活性がすべて、ｓｇＲＮＡのｃｏｍ改変に依存したことを示し、ＡＢＥ ＲＮＰのパッケージングにおけるＡＢＰ／アプタマー相互作用の役割を確認した。

ＶＬＰは、ヒト細胞におけるＡＢＥ ＲＮＰの一過性発現を可能にする
ヒト細胞におけるＡＢＥ ＲＮＰの発現持続期間を決定するために、形質導入されたＡＢＥ－ｇ５ＳＴ２－ｃｏｍ ＲＮＰ負荷ＶＬＰおよびＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰ負荷ＶＬＰ（それぞれ１００ｎｇのｐ２４／ウェル）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質導入し、ＡＢＥタンパク質レベルを、１２時間ごとに測定した。対照細胞では検出されなかったがＲＮＰで処理された細胞では、ウエスタンブロッティングは、１５０～２５０ｋＤａのバンドを検出し（図５Ａ）、ＡＢＥの予想サイズ（２０４．７ｋＤａ）と一致した。ＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰカプシドで形質導入された細胞では、本発明者らは、低いＡＢＥレベル（すべての時点で最も高いＡＢＥ－ｇ５ＳＴ２－ｃｏｍ ＲＮＰレベルの＜２５％）のランダムな変動を観察した。ＡＢＥ－ｇ５ＳＴ２－ｃｏｍ ＲＮＰカプシドで形質導入された細胞では、ＡＢＥレベルは、形質導入後最初の２４時間の期間で最も高く、形質導入後２４～４８時間でわずかに低減した。形質導入後４８～７２時間で、ＡＢＥレベルは、ＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰで処理された細胞におけるレベルと類似して、形質導入後１２時間でのレベルの約２５％に低下した。形質導入後約６０時間で、ＡＢＥレベルは、形質導入後１２時間でのレベルの半分であった（図５Ａ、５Ｂ）。

ＶＬＰにおいてＡＢＥを調べる実験では（図５Ａ）、ＡＢＥは、ＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰ ＶＬＰにおいて検出されなかった。その実験では、ＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰ ＶＬＰを、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００なしの緩衝液中での超遠心分離法に供し、細胞を形質導入するために使用したＶＬＰは、遠心分離しなかった。ＡＢＥ－ｇ５ ＲＮＰ ＶＬＰで形質導入された細胞における低バックグラウンドＡＢＥは、カプシド調製物におけるＡＢＥであった可能性が高い。これは、タンジェンシャル低濾過システムによって濃縮されたが、カプシドにパッケージされず、そのため、超遠心分離法によって除去できた。データは、ＶＬＰによって送達されたＡＢＥ ＲＮＰの短期発現を確認した。

ＡＢＥ ＲＮＰ負荷ＶＬＰは、検出不能なガイド非依存性ＲＮＡオフターゲット活性を示した
ＬＶカプシドによって送達されたＡＢＥ ＲＮＰが検出可能なＲＮＡオフターゲットを生じたかどうかを調べた。ＡＢＥ部位１を、ＡＢＥ ＲＮＰ負荷ＶＬＰおよびプラスミドＤＮＡトランスフェクションによって標的化した。２つの送達方法についての条件を決定し、類似のオンターゲット塩基編集効率を得た。ＶＬＰ処理後に最も高いＡＢＥレベルの時点であったので、オンターゲット活性およびオフターゲット活性を処理２４時間後に調べた。処理２４時間後のｇＤＮＡのｑＰＣＲ分析は、２５０ｎｇのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションが、１００ｎｇのカプシド－ＲＮＰのｐ２４を形質導入するのと類似の遺伝子編集活性をＡＢＥ部位１において示したことを明らかにした。ＮＧＳを、ＡＢＥ部位１のゲノムＤＮＡおよびＵＳＰ３８ ｃＤＮＡ（図１ＡにおいてＦ３およびＲ１で増幅した）において行った。ＡＢＥ部位１ ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（９．２％、表６）よりも、カプシド－ＲＮＰ形質導入細胞においてわずかに高いオンターゲットのＡからＧへの塩基編集率（１４．５％）を有していた。

表6. ホットスポットでのオンターゲット塩基編集およびRNAオフターゲット
*カプシド-RNP処理細胞の値およびDNAでトランスフェクトされた細胞の値をt検定によって比較した場合に、P<0.05。

ＵＳＰ３８ホットスポットの周辺のＲＮＡオフターゲットを分析した。２番目のピークが、以前の実験で予測されたホットスポットの近くで観察されたので（図１Ｂにおけるピーク２）、両方のピークでのＡからＧへの変化のパーセンテージを調べた。ＶＬＰ処理細胞では、ＡからＧへの変化率は、陰性対照細胞と類似して、両方のピークで観察されたが、プラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた細胞では、わずかに高いＡからＧへの変化率が、ＶＬＰ処理細胞と比較して、両方のピークで生じた（表５）。この実験では、ＤＮＡトランスフェクションは、以前のＤＮＡトランスフェクション実験の約２０分の１のＲＮＡオフターゲット率をもたらした（ホットスポットについて、０．６６７％ 対 約１５％）。この実験におけるＲＮＡオフターゲットのより低いレベルは、２つの非排他的なメカニズムによって引き起こされた可能性がある：１）より少ないＤＮＡがトランスフェクトされた（２５０ｎｇ 対 ５００ｎｇ）、および２）ＲＮＡオフターゲット活性を、トランスフェクションの４８時間後ではなく２４時間後に検出した。それにもかかわらず、オンターゲットＤＮＡ塩基編集レベルが、ＤＮＡトランスフェクションにより処理された細胞よりも５６％高かったものの、ＬＶカプシドによってＡＢＥ ＲＮＰを送達することは、検出可能なＲＮＡオフターゲットをもたらさなかった。

ＲＮＰオフターゲット活性は、ＡＢＥ ＲＮＰ発現持続期間データが、ＡＢＥ ＲＮＰが形質導入２４時間後に最高であったことを示したので、ＶＬＰ送達２４時間後に調べた（図５Ａ）。ＲＮＡオフターゲットも、ＶＬＰ送達４８時間後に調べ、ＲＮＡオフターゲット活性は、ホットスポットで観察されなかった（図６）。ＡＢＥタンパク質レベルは、この時点の後に素早く減少したので、さらなるＲＮＡオフターゲット活性が、その後に検出され得る可能性は低い。そのため、ＬＶカプシドによって送達されたＡＢＥ ＲＮＰについてのＲＮＡオフターゲット活性は、アッセイの検出限界を下回った。

この研究は、短い活性持続期間、高い塩基編集効率、および最小限のＲＮＡオフターゲット活性を伴うＡＢＥ送達方法を見出すことを試みた。上に記載された観察のうちの２つは、特にｉｎ ｖｉｖｏ適用に対して、ＡＢＥのＲＮＡオフターゲット活性によって引き起こされる安全性の懸念を解消するのを助け得る：１）ＡＢＥ ＲＮＰを送達することは、検出不能なＲＮＡオフターゲット活性を有する検出可能なオンターゲットＤＮＡ塩基編集を生じた、ならびに２）高いオンターゲットＤＮＡ塩基編集効率および検出不能なＲＮＡオフターゲット活性を有する新規のＡＢＥ ＲＮＰ負荷ＶＬＰを開発した。

ＲＮＰは、改善された特異性で、ゲノム編集およびシトシン塩基編集において使用されている（Kim et al., Genome Res 2014, 24 (6): 1012-9）。しかしながら、ＲＮＰを使用するＡＢＥの送達は、行われていない。上に示したように、ＡＢＥ ＲＮＰの送達は、電気穿孔によって行われ、Ｃａｓ９ ＲＮＰ電気穿孔プロトコールに共通しているＡＢＥ ＲＮＰの量を使用した場合に、比較的低い塩基編集活性（＜５％）が観察された。電気穿孔においてより多くのＡＢＥ ＲＮＰを使用することで、塩基編集活性が改善され得る可能性がある。ＡＢＥ ＲＮＰ負荷ＶＬＰが、開発され、パッケージングされた（各カプシド粒子に約３０個のＡＢＥ ＲＮＰ分子）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＡＢＥ部位１を標的化する場合、ＡＢＥ ＲＮＰ電気穿孔は、５ｐｇ／細胞（２×１０５個細胞について１０μｇのＲＮＰ）で＜５％の塩基編集効率をもたらしたが、ＡＢＥ ＲＮＰ ＶＬＰ形質導入は、０．８ｐｇ／細胞（２．５×１０４個細胞について約２０ｎｇのＲＮＰ）で＞３０％の塩基編集効率をもたらした。ＡＢＥ ｇ５部位を標的化する場合、＞８５％の塩基編集効率が、０．４３ｐｇ／細胞の用量で得られた。そのため、ＡＢＥ ＲＮＰ負荷ＶＬＰは、はるかに少ないＡＢＥタンパク質を使用したが、はるかに効率の良い塩基編集をもたらした。この新規のＡＢＥ ＲＮＰ負荷ＶＬＰは、高い塩基編集活性および低いＲＮＡオフターゲット活性を実証する最初のＡＢＥ ＲＮＰ送達ビヒクルである。

高いカプシド集合効率および塩基編集効率（未濃縮ＶＬＰで＞８０％の編集効率）に加えて、ＲＮＡオフターゲット活性は、ＶＬＰ送達２４時間後に観察されなかった。検出前のＲＮＡオフターゲット生成は、除外することができなかった。しかしながら、典型的には、ＶＬＰを送達した後に遺伝子編集活性を観察する最も早い時間は、形質導入後約１６時間である。エンドソーム系からの逃避は、ＶＬＰがレシピエント細胞に侵入するのと類似のプロセスであるので、同等の時間が、送達後にＡＢＥ ＲＮＰが機能的になるのに必要とされるはずである。ＲＮＡオフターゲットは、もしあれば、ＲＮＰ送達１６～２４時間後に生じる可能性がある。この短い時間枠は、細胞に有害である誤ったタンパク質を十分に生じる機会を大いに低減し得る。ＡＢＥ ｍＲＮＡを送達することにより、ＲＮＡオフターゲット活性は低減したが、依然として検出可能であり（Gaudelli et al., Nat Biotechnol 2020 38 (7), 892-900）、そのため、ＶＬＰによってＡＢＥ ＲＮＰを送達することは、検出不能なＲＮＡオフターゲット活性に起因してより安全である。

本明細書に提供されるデータは、ＶＬＰが、低減されたＲＮＡオフターゲット活性を有するＡＢＥ変異体を使用する必要のない、最小限のＲＮＡオフターゲット活性で効率的なＡＢＥ ＲＮＰ送達ビヒクルであることを示す。ＡＢＥは、検出可能なガイド非依存性ＤＮＡオフターゲット活性を示さない。この開発は、ＡＢＥのガイド非依存性ＲＮＡオフターゲット活性によって引き起こされる安全性のリスクを大いに低減し、効率的で安全なＡＢＥ ＲＮＰの送達を可能にする。

ＶＬＰ媒介ＡＢＥ ＲＮＰ送達方法は、現在の典型的なＲＮＰ電気穿孔プロトコールと比較して、各細胞へのわずか１／１０のＲＮＰを送達する。ＶＬＰによって送達された一過性に発現したＡＢＥ ＲＮＰのこの低い量は、低減されたガイド依存性ＤＮＡオフターゲット活性も達成するはずである。

要約すると、ＡＢＥ ＲＮＰは、ガイド依存性ＤＮＡ塩基編集を示すが、ガイド非依存性ＲＮＡオフターゲット活性は検出不能である。ＡＢＥ ＲＮＰは、レンチウイルスカプシドに、効率的および機能的にパッケージングされ得る。ＶＬＰで送達されたＡＢＥ ＲＮＰは、高いオンターゲットＤＮＡ塩基編集活性、および検出不能なＲＮＡオフターゲット活性を示す。

例示的実施形態
実施形態１．非ウイルス核酸配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドであって、非ウイルス核酸配列が、（ｉ）アデノシン塩基対エディター（ＡＢＥ）をコードする核酸配列であって、ＡＢＥが、アデノシンデアミナーゼおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質である、核酸配列、ならびに（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列を含む、哺乳動物発現プラスミド。

実施形態２．触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列が、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａタンパク質をコードする、実施形態１に記載の哺乳動物発現プラスミド。

実施形態３．アデニン塩基エディターが、ＡＢＥ７．１０またはＡＢＥ８である、実施形態１または２に記載の哺乳動物発現プラスミド。

実施形態４．少なくとも１つのアプタマーコード配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群より選択されるＡＢＰによって特異的に結合されるアプタマー配列をコードする、実施形態１～３のいずれか１つに記載の哺乳動物発現プラスミド。

実施形態５．アプタマーが、ＭＳ２アプタマー配列またはｃｏｍアプタマー配列である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の哺乳動物発現プラスミド。

実施形態６．ｓｇＲＮＡコード配列が、ｓｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのアプタマーを含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の哺乳動物発現プラスミド。

実施形態７．ｓｇＲＮＡコード配列が、ｇＲＮＡコード配列のＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのｃｏｍアプタマーを含む、実施形態６に記載の哺乳動物発現プラスミド。

実施形態８．ａ）Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含むパッケージングプラスミドであって、Ｇａｇヌクレオチド配列が、ヌクレオカプシド（ＮＣ）コード配列およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）コード配列を含み、ＮＣコード配列またはＭＡコード配列の一方または両方が、少なくとも１つの非ウイルスアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含み、パッケージングプラスミドが、機能的インテグラーゼタンパク質をコードしない、パッケージングプラスミド、
ｂ）請求項１～７のいずれか１つに記載の少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミド、ならびに
ｃ）エンベロープ糖タンパク質コード配列を含むエンベローププラスミド
を含む、レンチウイルスパッケージングシステム。

実施形態９．パッケージングプラスミドが、Ｒｅｖヌクレオチド配列およびＴａｔヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態８に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。

実施形態１０．Ｒｅｖヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングプラスミドをさらに含む、実施形態８または９に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。

実施形態１１．少なくとも１つの非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチド、またはＣｏｍタンパク質をコードする、実施形態８～１０のいずれか１つに記載のレンチウイルスパッケージングシステム。

実施形態１２．ａ）ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質またはマトリックス（ＭＡ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、ＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質が、少なくとも１つの非ウイルスアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質、ならびにｂ）（ｉ）アデニン塩基エディターおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドであるアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、および（ｉｉ）ｇＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体を含むレンチウイルス様粒子であって、
機能的インテグラーゼタンパク質を含まない、
レンチウイルス様粒子。

実施形態１３．触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、触媒的に損なわれたＣａｓ９タンパク質、触媒的に損なわれたＣｐｆ１タンパク質、またはいずれかの誘導体である、実施形態１２に記載のレンチウイルス様粒子。

実施形態１４．アデニン塩基エディターが、ＡＢＥ７．１０またはＡＢＥ８である、実施形態１２または１３に記載のレンチウイルス様粒子。

実施形態１５．レンチウイルス様粒子を産生する方法であって、ａ）複数の真核細胞を、請求項８～１１のいずれか１つに記載のシステムのパッケージングプラスミド、少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミド、およびエンベローププラスミドでトランスフェクトすること、ならびにｂ）トランスフェクトされた真核細胞を、レンチウイルス様粒子が産生されるのに十分な時間、培養することを含む、方法。

実施形態１６．レンチウイルス様粒子が、（ｉ）アデノシンデアミナーゼおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドであるアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、ならびに（ｉｉ）ガイドＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、実施形態１５に記載の方法。

実施形態１７．複数の真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１６に記載の方法。

実施形態１８．実施形態１５～１７のいずれか１つに記載の方法によって作製されたレンチウイルス様粒子。

実施形態１９．細胞においてゲノム標的配列を改変する方法であって、複数の真核細胞を、複数のウイルス粒子で形質導入することを含み、複数のウイルス粒子が、実施形態１２に記載のレンチウイルス様粒子を含み、ＲＮＰが、細胞のゲノムＤＮＡにおけるゲノム標的配列に結合し、ＡＢＥが、ゲノム標的配列におけるアデニンを脱アミノ化し、それによって、ゲノム標的配列を改変する、方法。

実施形態２０．複数の真核細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１９に記載の方法。

実施形態２１．複数の真核細胞が、対象中に存在する細胞である、実施形態１９または２０のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２２．対象が、ヒト対象である、実施形態２１に記載の方法。

実施形態２３．対象が、複数のウイルス粒子を注射される、実施形態２２に記載の方法。

実施形態２４．実施形態１～７のいずれか１つに記載のプラスミドを含有する細胞。

実施形態２５．実施形態８～１１のいずれか１つに記載のレンチウイルスパッケージングシステムを含有する細胞。

実施形態２６．実施形態１２～１４のいずれか１つに記載のレンチウイルス様粒子を含有する細胞。

実施形態２７．実施形態１９～２３のいずれか１つに記載の方法を使用して改変された細胞。

実施形態２８．対象における疾患を処置するための方法であって、ａ）対象から細胞を得ること、ｂ）対象の細胞を、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載の方法を使用して改変すること、およびｃ）改変された細胞を対象に投与することを含む、方法。

実施形態２９．疾患が、がんである、実施形態２８に記載の方法。

実施形態３０．疾患が、鎌状赤血球貧血である、実施形態２９に記載の方法。

実施形態３１．細胞が、Ｔ細胞である、実施形態２８～３０のいずれか１つに記載の方法。
配列

Claims (31)

1. 非ウイルス核酸配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドであって、前記非ウイルス核酸配列が、
   （ｉ）アデノシン塩基対エディター（ＡＢＥ）をコードする核酸配列であって、前記ＡＢＥが、アデノシンデアミナーゼおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質である、核酸配列、ならびに
   （ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列
   を含む、哺乳動物発現プラスミド。
2. 前記触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列が、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａタンパク質をコードする、請求項１に記載の哺乳動物発現プラスミド。
3. 前記アデニン塩基エディターが、ＡＢＥ７．１０またはＡＢＥ８である、請求項１に記載の哺乳動物発現プラスミド。
4. 前記少なくとも１つのアプタマーコード配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群より選択されるＡＢＰによって特異的に結合されるアプタマー配列をコードする、請求項１に記載の哺乳動物発現プラスミド。
5. 前記アプタマーが、ＭＳ２アプタマー配列またはｃｏｍアプタマー配列である、請求項１に記載の哺乳動物発現プラスミド。
6. 前記ｓｇＲＮＡコード配列が、前記ｓｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのアプタマーを含む、請求項１に記載の哺乳動物発現プラスミド。
7. 前記ｓｇＲＮＡコード配列が、前記ｇＲＮＡコード配列の前記ＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのｃｏｍアプタマーを含む、請求項６に記載の哺乳動物発現プラスミド。
8. ａ）Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核生物プロモーターを含むパッケージングプラスミドであって、前記Ｇａｇヌクレオチド配列が、ヌクレオカプシド（ＮＣ）コード配列およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）コード配列を含み、前記ＮＣコード配列または前記ＭＡコード配列の一方または両方が、少なくとも１つの非ウイルスアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含み、前記パッケージングプラスミドが、機能的インテグラーゼタンパク質をコードしない、パッケージングプラスミド、
   ｂ）請求項１～７のいずれか一項に記載の少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミド、ならびに
   ｃ）エンベロープ糖タンパク質コード配列を含むエンベローププラスミド
   を含む、レンチウイルスパッケージングシステム。
9. 前記パッケージングプラスミドが、Ｒｅｖヌクレオチド配列およびＴａｔヌクレオチド配列をさらに含む、請求項８に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
10. Ｒｅｖヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングプラスミドをさらに含む、請求項８に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
11. 前記少なくとも１つの非ウイルスＡＢＰヌクレオチド配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチド、またはＣｏｍタンパク質をコードする、請求項８に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
12. ａ）ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質またはマトリックス（ＭＡ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記ＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質が、少なくとも１つの非ウイルスアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質、ならびに
    ｂ）（ｉ）アデニン塩基エディターおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドであるアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、および（ｉｉ）ｇＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体
    を含む、レンチウイルス様粒子であって、
    機能的インテグラーゼタンパク質を含まない、
    レンチウイルス様粒子。
13. 前記触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、触媒的に損なわれたＣａｓ９タンパク質、触媒的に損なわれたＣｐｆ１タンパク質、またはいずれかの誘導体である、請求項１２に記載のレンチウイルス様粒子。
14. 前記アデニン塩基エディターが、ＡＢＥ７．１０またはＡＢＥ８である、請求項１２に記載のレンチウイルス様粒子。
15. レンチウイルス様粒子を産生する方法であって、
    ａ）複数の真核細胞を、請求項８～１１のいずれか一項に記載のシステムのパッケージングプラスミド、少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミド、およびエンベローププラスミドでトランスフェクトすること、ならびに
    ｂ）トランスフェクトされた前記真核細胞を、レンチウイルス様粒子が産生されるのに十分な時間、培養すること
    を含む、方法。
16. 前記レンチウイルス様粒子が、（ｉ）アデノシンデアミナーゼおよび触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドであるアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、ならびに（ｉｉ）ガイドＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記複数の真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１５に記載の方法によって作製されたレンチウイルス様粒子。
19. 細胞においてゲノム標的配列を改変する方法であって、複数の真核細胞を、複数のウイルス粒子で形質導入することを含み、前記複数のウイルス粒子が、請求項１２に記載のレンチウイルス様粒子を含み、ＲＮＰが、前記細胞のゲノムＤＮＡにおける前記ゲノム標的配列に結合し、ＡＢＥが、前記ゲノム標的配列におけるアデニンを脱アミノ化し、それによって、前記ゲノム標的配列を改変する、方法。
20. 前記複数の真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記複数の真核細胞が、対象中に存在する細胞である、請求項１９に記載の方法。
22. 前記対象が、ヒト対象である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記対象が、前記複数のウイルス粒子を注射される、請求項２２に記載の方法。
24. 請求項１に記載のプラスミドを含有する細胞。
25. 請求項８に記載のレンチウイルスパッケージングシステムを含有する細胞。
26. 請求項１２に記載のレンチウイルス様粒子を含有する細胞。
27. 請求項１９に記載の方法を使用して改変された細胞。
28. 対象における疾患を処置するための方法であって、
    ａ）前記対象から細胞を得ること、
    ｂ）前記対象の前記細胞を、請求項１９に記載の方法を使用して改変すること、
    および
    ｃ）改変された前記細胞を前記対象に投与すること
    を含む、方法。
29. 前記疾患が、がんである、請求項２８に記載の方法。
30. 前記疾患が、鎌状赤血球貧血である、請求項２９に記載の方法。
31. 前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項２８に記載の方法。