JP2024504608A

JP2024504608A - 遺伝子操作ｒｎａを使用した内因性ａｄａｒの活用による標的化ｒｎａの編集

Info

Publication number: JP2024504608A
Application number: JP2023542592A
Authority: JP
Inventors: 文▲勝▼ 魏; 宗裔伊; 良 ▲チゥ▼
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2021-01-12
Filing date: 2021-01-12
Publication date: 2024-02-01
Also published as: WO2022150974A1; EP4277990A1; CN117015605A

Abstract

本願は、デアミナーゼリクルートＲＮＡを宿主細胞に導入して標的ＲＮＡ中のアデノシンを脱アミノ化することによりＲＮＡを編集する方法を提供する。本願は、前記ＲＮＡ編集方法に使用されるデアミナーゼリクルートＲＮＡ、それを含む組成物、及びキットをさらに提供する。【選択図】なし

Description

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルで提出された以下の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：ＦＥ００３３０ＰＣＴＲ－ｐｒｊ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２１年１月１２日、サイズ：１８ＫＢ）。

本開示は、一般的に、アデノシンデアミナーゼをリクルートして標的ＲＮＡ中の１種又は複数種のアデノシンを脱アミノ化することができる遺伝子操作ＲＮＡを使用してＲＮＡを編集するための方法及び組成物に関する。

ゲノム編集は、生物医学の研究や病気の治療法の開発のための有力なツールである。（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓタンパク質など）の操作されたヌクレアーゼを用いた編集技術は、無数の生体のゲノム操作に応用されている。最近では、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）などのデアミナーゼタンパク質を用いて、ＲＮＡ編集用の新しいツールが開発されている。哺乳動物細胞には、Ａｄａｒ１（ｐ１１０とｐ１５０の２種類のアイソフォーム）、Ａｄａｒ２、Ａｄａｒ３（触媒活性なし）の３種類のＡＤＡＲタンパク質がある。ＡＤＡＲタンパク質の触媒基質は二本鎖ＲＮＡであり、ＡＤＡＲはアデノシン（Ａ）核酸塩基から－ＮＨ２基を除去し、Ａをイノシン（Ｉ）に変えることができる。（Ｉ）はグアノシン（Ｇ）として認識され、その後の細胞転写および翻訳の間にシチジン（Ｃ）と対になる。標的ＲＮＡ編集を実現するために、ＡＤＡＲタンパク質又はその触媒ドメインをλ Ｎペプチド、ＳＮＡＰ－タグ又はＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ１３ｂ）と融合させ、そしてガイドＲＮＡを設計してキメラＡＤＡＲタンパク質を標的部位にリクルートする。代わりに、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２タンパク質をＲ／Ｇモチーフを持つガイドＲＮＡとともに過剰発現させると、標的化ＲＮＡ編集が可能になることも報告されている。

ただし、現在利用可能なＡＤＡＲ媒介ＲＮＡ編集技術には一定の限界がある。例えば、遺伝子治療のための最も効果的なインビボ送達はウイルスベクターを介するが、非常に望ましいアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターがカーゴサイズ（約４．５ｋｂ）に制限されており、タンパク質とガイドＲＮＡの両方を保持するのが困難である。さらに、ＡＤＡＲ１の過剰発現は、ＲＮＡ上の異常なハイパー編集により多発性骨髄腫に発がん性を与え、大幅なグローバルなオフターゲット編集を生成することが最近報告されている。さらに、非ヒト由来のタンパク質またはそのドメインの異所性発現は、免疫原性を引き起こす潜在的なリスクを有する。さらに、既存の適応性免疫およびｐ５３媒介ＤＮＡ損傷応答は、治療タンパク質（Ｃａｓ９など）の有効性を損なう可能性がある。

本願は、ＡＤＡＲリクルートＲＮＡ（「ｄＲＮＡ」又は「ａｒＲＮＡ」）を使用してＲＮＡを編集するための方法を提供し、これらのＡＤＡＲリクルートＲＮＡは、ＲＮＡに作用する内因性アデノシンデアミナーゼ（「ＡＤＡＲ」）タンパク質を利用してＲＮＡ編集を行うことができる。本明細書では、これらの方法に用いられる遺伝子操作ｄＲＮＡ又は遺伝子操作ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物、並びに、これらを含む組成物及びキットも提供される。本明細書では、個体の疾患又は障害を治療又は予防するための方法であって、個体の細胞において疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む方法も提供される。

一態様では、本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含み、
（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、
（２）ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルート可能であり、及び
（３）ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能な線状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列は、互いに少なくとも部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列の長さは、約２０～約７５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼによって環状化される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼはＲＮＡリガーゼＲｔｃＢである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢは、宿主細胞内で内因的に発現される。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである。

いくつかの実施形態では、該方法は、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列と、ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、３’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、５’ツイスター配列はツイスターＰ１である。いくつかの実施形態では、５’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、３’ツイスター配列はツイスターＰ１である。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは環状ＲＮＡであり、該方法は、インビトロで線状ＲＮＡを使用して環状ＲＮＡを形成することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、線状ＲＮＡを使用して、５’触媒グループＩイントロンフラグメント及び３’触媒グループＩイントロンフラグメントを含むグループＩイントロンの自己触媒によってインビトロで形成される環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列の５’末端に隣接する３’触媒グループＩイントロンフラグメントと、５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列の３’末端に隣接する５’触媒グループＩイントロンフラグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、３’触媒グループＩイントロンフラグメントの５’末端に隣接する５’相同配列と、５’触媒グループＩイントロンフラグメントの３’末端に隣接する３’相同配列と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記環状ＲＮＡの形成は、（ａ）５’触媒グループＩイントロンフラグメント及び３’触媒グループＩイントロンフラグメントの自己触媒を活性化する条件を線状ＲＮＡに曝して環状化ＲＮＡ産物を提供することと、（ｂ）環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、環状ＲＮＡを提供することと、を含む。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、リガーゼによってインビトロで線状ＲＮＡを使用して形成される環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、リガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４Ｄｎｌ）、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１（Ｔ４Ｒｎｌ１）、及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｔ４Ｒｎｌ２）から選択される。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、環状ＲＮＡをコードする核酸配列の５’末端に５’ライゲーション配列を含み、環状ＲＮＡをコードする核酸配列の３’末端に３’ライゲーション配列を含み、５’ライゲーション配列及び３’ライゲーション配列は、リガーゼによって互いに連結されてもよい。いくつかの実施形態では、前記環状ＲＮＡの形成は、（ａ）線状ＲＮＡを一本鎖アダプター核酸と接触させることであって、一本鎖アダプター核酸は、５’末端から３’末端まで、３’ライゲーション配列に相補的な第１配列と５’ライゲーション配列に相補的な第２配列とを含み、５’ライゲーション配列及び３’ライゲーション配列は一本鎖アダプター核酸とハイブリダイズして、５’ライゲーション配列の３’末端と３’ライゲーション配列の５’末端との間の一本鎖切断を含む二本鎖核酸中間体を提供する、ことと、（ｂ）５’ライゲーション配列と３’ライゲーション配列のライゲーションを可能にする条件下で、中間体をＲＮＡリガーゼと接触させて、環状化ＲＮＡ産物を提供することと、（ｃ）環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、環状ＲＮＡを提供することと、を含む。いくつかの実施形態では、前記環状ＲＮＡの形成は、（ａ）５’ライゲーション配列と３’ライゲーション配列のライゲーションを可能にする条件下で、線状ＲＮＡをＲＮＡリガーゼと接触させて、環状化ＲＮＡ産物を提供することと、（ｂ）環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、環状ＲＮＡを提供することと、を含む。

いくつかの実施形態では、該方法は、インビトロで線状ＲＮＡを使用して環状ＲＮＡを形成することを含み、該方法は、線状ＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸構築物をインビトロで転写することによって線状ＲＮＡを得ることをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、環状ＲＮＡを精製することをさらに含む。

別の態様では、本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含み、ｄＲＮＡは、
（１）標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列、及び
（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列を含み、
ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートすることができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、少なくとも約７０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、５’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列はＣ／ＤＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｈ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、複合Ｃ／ＤＢｏｘとＨ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、オーファンｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、該方法は、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）である。いくつかの実施形態では、構築物は、ウイルスベクター又はプラスミドである。いくつかの実施形態では、構築物は、ＡＡＶベクターである。

別の態様では、本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含み、
（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、
（２）ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートすることができ、及び
（３）構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ｐｏｌＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３の核酸配列からなる。

以下の実施形態は上記の３つの態様のいずれにも適用できる。いくつかの実施形態では、構築物は、ウイルスベクター又はプラスミドである。いくつかの実施形態では、構築物はＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは宿主細胞に内因的に発現される。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列の長さは５０ヌクレオチドを超える。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列の長さは約１００～約１８０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列の長さは約１００～約１５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンに直接対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンに直接対向するシチジンミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、シチジンミスマッチは、標的化ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れる位置、及び標的化ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド離れる位置にある。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、それぞれが標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する１つ又は複数のグアノシンを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続したミスマッチヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの５’最近傍は、Ｕ、Ｃ、Ａ、及びＧから選択されるヌクレオチドであり、好ましくはＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの３’最近傍は、Ｇ、Ｃ、Ａ、及びＵから選択されるヌクレオチドであり、好ましくはＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。いくつかの実施形態では、標的アデノシンは、標的ＲＮＡ中のＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵから選択される３塩基モチーフ内にある。いくつかの実施形態では、３塩基モチーフはＵＡＧであり、標的化ＲＮＡは、３塩基モチーフ内のウリジンに直接対向するＡ、標的アデノシンに直接対向するシチジン、及び３塩基モチーフ内のグアノシンに直接対向するシチジン、グアノシン又はウリジンを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡから選択されるＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡである。

いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ３阻害剤を宿主細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、インターフェロン刺激剤を宿主細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、それぞれが異なる標的ＲＮＡを標的化する複数のｄＲＮＡ又は構築物を導入することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ（例えば、外因性ＡＤＡＲ）を宿主細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの編集効率が少なくとも４０％である。いくつかの実施形態では、構築物又はｄＲＮＡ免疫応答を誘導しない。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲはＥ１００８変異を含むＡＤＡＲ１である。

いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化は、標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常スプライシング若しくは選択的スプライシング、又は標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常スプライシング若しくは選択的スプライシングの逆転を生じさせる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化は、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質的点変異、トゥランケイション、伸長及び／又はミスフォールディング、あるいは標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常スプライシング若しくは選択的スプライシングの逆転による機能的な、完全長の、正しくフォールディングされた及び／又は野生型タンパク質を生じさせる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はヒト又はマウス細胞である。本明細書は、上記の３つの態様によるいずれかの方法によって産生される編集ＲＮＡ又は編集ＲＮＡを有する宿主細胞をさらに提供する。

別の態様では、本明細書は、個体の疾患又は障害を治療又は予防するための方法であって、上記で提供される方法のいずれかによって個体の細胞内で疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、遺伝性の遺伝性疾患又は１種又は複数種の後天的遺伝子変異に関連する疾患又は障害である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＧからＡへの変異を持つ。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、単一遺伝子疾患又は障害である。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、多遺伝子性の疾患又は障害である。

いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはＴＰ５３であり、疾患又は障害は癌である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはＩＤＵＡであり、疾患又は障害はムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはＣＯＬ３Ａ１であり、疾患又は障害はエーラス・ダンロス症候群である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはＢＭＰＲ２であり、疾患又は障害はジュベール症候群である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはＦＡＮＣＣであり、疾患又は障害はファンコニ貧血である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはＭＹＢＰＣ３であり、疾患又は障害は、原発性家族性肥大型心筋症である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはＩＬ２ＲＧであり、疾患又は障害は、Ｘ連鎖重度複合免疫不全症である。

別の態様では、本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートすることができ、ｄＲＮＡは、環状であるか、又は宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡを形成可能である線状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列は、互いに少なくとも部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列の長さは約２０～約７５ヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、インビトロで線状ＲＮＡにより形成される環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である線状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、５’触媒グループＩイントロンフラグメント及び３’触媒グループＩイントロンフラグメントを含むグループＩイントロンの自己触媒によって線状ＲＮＡを環状化することにより形成される環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列の５’末端に隣接する３’触媒グループＩイントロンフラグメントと、５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列の３’末端に隣接する５’触媒グループＩイントロンフラグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、３’触媒グループＩイントロンフラグメントの５’末端に隣接する５’相同配列と、５’触媒グループＩイントロンフラグメントの３’末端に隣接する３’相同配列と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡはリガーゼによって環状化される。いくつかの実施形態では、リガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４Ｄｎｌ）、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１（Ｔ４Ｒｎｌ１）、及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｔ４Ｒｎｌ２）から選択される。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、環状ｄＲＮＡをコードする核酸配列の５’末端に５’ライゲーション配列を含み、環状ｄＲＮＡをコードする核酸配列の３’末端に３’ライゲーション配列を含み、５’ライゲーション配列及び３’ライゲーション配列は、ＲＮＡリガーゼによって互いに連結されてもよい。

いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡから選択されるＲＮＡである。

本態様に記載の環状ｄＲＮＡを形成可能である線状ＲＮＡも提供される。本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのキットであって、本態様に記載の線状ｄＲＮＡを含む、キットをさらに提供する。

本明細書は、本態様に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物をさらに提供する。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列と、ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、３’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、５’ツイスター配列はツイスターＰ１である。いくつかの実施形態では、５’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、３’ツイスター配列はツイスターＰ１である。本明細書は、本態様に記載の構築物又はｄＲＮＡを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのキットであって、本態様に記載の構築物又はｄＲＮＡを含む、キットをさらに提供する。

別の態様では、本明細書は、標的ＲＮＡを編集するためのデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、
（１）標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列、及び
（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端にある核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列を含み、
ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートすることができる、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をさらに提供する。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、少なくとも約７０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｈ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、複合Ｃ／ＤＢｏｘとＨ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、オーファンｓｎｏＲＮＡ配列である。本明細書は、本態様に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物をさらに提供する。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡから選択されるＲＮＡである。本明細書は、本態様に記載の構築物又はｄＲＮＡを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのキットであって、本態様に記載の構築物又はｄＲＮＡを含む、キットをさらに提供する。

別の態様では、本明細書は、宿主細胞に入るデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築物であって、
（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、
（２）ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルート可能であり、
（３）構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、構築物を提供する。

いくつかの実施形態では、ｐｏｌＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＣＭＶプロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：３の核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、構築物は、ウイルスベクター又はプラスミドである。いくつかの実施形態では、構築物は、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡから選択されるＲＮＡである。本明細書は、本態様に記載の構築物を含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのキットであって、本態様に記載の構築物を含む、キットをさらに提供する。

なお、本明細書に記載される各実施形態の特性の１つ、いくつか又はすべては組み合わせられて本明細書の他の実施形態としてもよい。以下の詳細な説明により本明細書のこれら及び他の実施形態がさらに説明される。

ｐｏｌＩＩプロモーター（ＣＭＶ）によって駆動されるａｒＲＮＡを発現するプラスミド、及びＰｏｌＩＩＩプロモーター（Ｕ６）によって駆動されるａｒＲＮＡを発現するプラスミドのトランスフェクション４８時間後のＦＡＣＳ分析を示す。ＥＧＦＰ陽性パーセンテージはトランスフェクション効率で正規化され、トランスフェクション効率はｍＣｈｅｒｒｙ陽性率で決定される。データは平均値± ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。ｓｎｏＲＮＡ末端に隣接するＳｎｏ－ａｒＲＮＡ_１５１が媒介するレポーターｍＲＮＡ上の標的化ＲＮＡの編集を示す。図２Ａは、ａｒＲＮＡ発現プラスミドの概略図を示す。蛍光レポーター－１を標的化する１５１－ｎｔａｒＲＮＡは、ヒトＵ６プロモーターの下で発現される。ｓｎｏＲＮＡ末端に隣接するＳｎｏ－ａｒＲＮＡ_１５１が媒介するレポーターｍＲＮＡ上の標的化ＲＮＡの編集を示す。図２Ｂは、ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ又はａｒＲＮＡのトランスフェクション結果のＦＡＣＳ結果を示す。ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ_１５１、ａｒＲＮＡ_１５１、ｓｎｏ－ＣｔｒｌＲＮＡ_１５１又はＣｔｒｌＲＮＡ_１５１を、レポーターを発現するプラスミドとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションする。ｓｎｏＲＮＡ末端に隣接するＳｎｏ－ａｒＲＮＡ_１５１が媒介するレポーターｍＲＮＡ上の標的化ＲＮＡの編集を示す。図２Ｃは、図２ＢにおけるＦＡＣＳ結果の定量を示す。ＣＭＶプロモーターで発現されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡ及びｈＵ６プロモーターで発現されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡの編集効率を示す。図３Ａは、ｈＵ６由来のｓｎｏ－ａｒＲＮＡ又はａｒＲＮＡの各時間点での定量的ＦＡＣＳ結果を示す。ＣＭＶプロモーターで発現されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡ及びｈＵ６プロモーターで発現されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡの編集効率を示す。図３Ｂは、ＣＭＶ又はｈＵ６由来のａｒＲＮＡの各時間点での定量的ＦＡＣＳ結果を示す。ＣＭＶプロモーターで発現されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡ及びｈＵ６プロモーターで発現されたｓｎｏ－ａｒＲＮＡの編集効率を示す。図３Ｃは、ＣＭＶ又はｈＵ６由来のｓｎｏ－ａｒＲＮＡの各時間点での定量的ＦＡＣＳ結果を示す。ＬＥＡＰＥＲ系に環状ａｒＲＮＡを使用するときの編集効率を示す。図４Ａは、環状ａｒＲＮＡ発現の概略図を示す。環状ａｒＲＮＡ転写物には、それぞれが自己切断を受ける５’－ツイスターＰ３Ｕ２Ａ及び３’－ツイスターＰ１リボザイムが隣接している５’及び３’ライゲーション配列が隣接している。ＲｔｃＢ認識によって得られたＲＮＡ末端はライゲーションに用いられる。ＬＥＡＰＥＲ系に環状ａｒＲＮＡを使用するときの編集効率を示す。図４Ｂは、レポーター－１及びレポーター－３の概略図を示す。ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子及びＥＧＦＰ遺伝子は、３×（レポーター－１の場合）又は１×（レポーター－３の場合）ＧＧＧＧＳ－コード領域とインフレームＵＡＧ停止コドンを含む配列によって連結される。レポーター発現細胞はｍＣｈｅｒｒｙタンパク質のみを産生したが、レポーター転写物のＵＡＧ停止コドンを標的化する編集によりＵＡＧがＵＩＧに変換され、下流のＥＧＦＰ発現が可能になる。ＬＥＡＰＥＲ系に環状ａｒＲＮＡを使用するときの編集効率を示す。図４Ｃは、環状ａｒＲＮＡ_７１、環状ａｒＲＮＡ_{２５－７１－２５}、環状ａｒＲＮＡ_{５０－７１－５０}、環状ａｒＲＮＡ_１１１、環状ａｒＲＮＡ_{２５－１１１－２５}、環状ａｒＲＮＡ_{５０－１１１－５０}、環状ＣｔｒｌＲＮＡ_１２３（非標的配列）、ａｒＲＮＡ_７１、ＣｔｒｌＲＮＡ_７１、ａｒＲＮＡ_１１１、ＣｔｒｌＲＮＡ_１１１発現プラスミド１μｇを用いて、１２ウェルプレート（３×１０^５細胞／ウェル）に接種した、レポーター－１を安定的に発現させるＨＥＫ２９３Ｔ細胞をそれぞれトランスフェクションする実験の結果を示す。トランスフェクション２日後及び７日後にＦＡＣＳ分析を行う。ＥＧＦＰ＋細胞の比率はトランスフェクション効率で正規化される。ＬＥＡＰＥＲ系に環状ａｒＲＮＡを使用するときの編集効率を示す。図４Ｄは、ＣｔｒｌＲＮＡ_１５１（環状）、３１－ｎｔ、５１－ｎｔ、７１－ｎｔ、９１－ｎｔ、１１１－ｎｔ、１３１－ｎｔ、１５１－ｎｔ環状ａｒＲＮＡ発現プラスミド１μｇを用いて、１２ウェルプレート（３×１０^５細胞／ウェル）に接種した、レポーター－３を安定的に発現させるＨＥＫ２９３Ｔ細胞をそれぞれトランスフェクションする実験の結果を示す。トランスフェクション２日後にＦＡＣＳ分析を行う。ＥＧＦＰ＋細胞の比率は、トランスフェクション効率で正規化される。ＬＥＡＰＥＲ系に環状ａｒＲＮＡを使用するときの編集効率を示す。図４Ｅは、レポーター－１発現プラスミド０．５μｇ及び環状ａｒＲＮＡ_１１１発現プラスミド０．５μｇを用いて、１２ウェルプレート（２×１０^５細胞／ウェル）に接種したＨｅＬａ及びＡ５４９細胞をそれぞれ同時トランスフェクションする実験の結果を示す。トランスフェクション２日後にＦＡＣＳ分析を行う。ＥＧＦＰ＋細胞の比率はトランスフェクション効率で正規化される。様々な環状ａｒＲＮＡの同時トランスフェクション４８時間及び９６時間後のＦＡＣＳ分析を示し、ＥＧＦＰ陽性パーセンテージはトランスフェクション効率で正規化され、トランスフェクション効率はｍＣｈｅｒｒｙ陽性で決定される。データは平均値± ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。様々な環状ａｒＲＮＡのＨＥＫ２９３Ｔ細胞における同時トランスフェクション４８時間及び９６時間後のＦＡＣＳ分析を示す。ＥＧＦＰ陽性パーセンテージはトランスフェクション効率で正規化され、トランスフェクション効率はｍＣｈｅｒｒｙ陽性で測定される。データは平均値± ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。様々な環状ａｒＲＮＡのＨＥＫ２９３Ｔ細胞における同時トランスフェクション４８時間及び９６時間後のＦＡＣＳ分析を示す。ＥＧＦＰ陽性パーセンテージはトランスフェクション効率で正規化され、トランスフェクション効率はｍＣｈｅｒｒｙ陽性で測定される。データは平均値± ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量を示す。レポーター－１を安定的に発現させる細胞を、ＴｏｒｎａｄｏＣｔｒｌＲＮＡ１１１ウイルスや長さの異なる標的化Ｔｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡウイルスを含み各種のＴｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡレンチウイルスで感染させ、感染２日後にＦＡＣＳを行う。データは平均値± ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝２）である。Ｔ４ＲＮＡリガーゼによる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）アダプターに結合した線状インビトロＲＮＡ転写物のライゲーションを介した環状ｄＲＮＡ（ａｒＲＮＡとも呼ばれる）のインビトロ生成を示す概略図である。ｓｓＤＮＡアダプターを使用せずに、Ｔ４ＲＮＡリガーゼによる線状インビトロＲＮＡ転写物のライゲーションを介した環状ｄＲＮＡ（ａｒＲＮＡとも呼ばれる）のインビトロ生成を示す概略図である。グループＩ触媒イントロンのスプライシングを介した環状ＤＮＡ（ａｒＲＮＡとも呼ばれる）のインビトロ生成を示す概略図である。細胞内のＥＧＦＰレポーターを標的化するように設計された、線状前駆体ＲＮＡ（図９Ａ）、Ｔ４Ｒｎｌ１－処理ＲＮＡ（図９Ｂ）及びＴ４－Ｒｎｌ２処理ＲＮＡ（図９Ｃ）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。細胞内のＥＧＦＰレポーターを標的化するように設計された、線状前駆体ＲＮＡ（図９Ａ）、Ｔ４Ｒｎｌ１－処理ＲＮＡ（図９Ｂ）及びＴ４－Ｒｎｌ２処理ＲＮＡ（図９Ｃ）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。細胞内のＥＧＦＰレポーターを標的化するように設計された、線状前駆体ＲＮＡ（図９Ａ）、Ｔ４Ｒｎｌ１－処理ＲＮＡ（図９Ｂ）及びＴ４－Ｒｎｌ２処理ＲＮＡ（図９Ｃ）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＥＧＦＰレポーターを標的化する線状前駆体ＲＮＡ、Ｔ４Ｒｎｌ１処理ＲＮＡ、及びＴ４Ｒｎｌ２処理ＲＮＡを１日、３日、及び７日トランスフェクションした後の細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。ＥＧＦＰレポーターを標的化する線状前駆体ＲＮＡ（上図）、Ｔ４Ｒｎｌ１処理ＲＮＡ（中間図）、及びＴ４Ｒｎｌ２処理ＲＮＡ（下図）を４８時間トランスフェクションした細胞における標的部位のＳａｎｇｅｒシーケンシングの結果を示す。ＥＧＦＰレポーターを標的化する線状前駆体ＲＮＡ（上図）、Ｔ４Ｒｎｌ１処理ＲＮＡ（中間図）、及びＴ４Ｒｎｌ２処理ＲＮＡ（下図）を４８時間トランスフェクションした細胞における標的部位のディープシーケンシングの結果である。対照（ｃｉｒｃ－ＣｔｒｌＲＮＡ_１５１）、ｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＢ、又はＵ６－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＢ構築物を４８時間トランスフェクションした細胞における内因性ＰＰＩＢ標的部位のディープシーケンシング結果を示す。Ｕ６－ａｒＲＮＡ_１５１－ＰＰＩＢ構築物は、同じＰＰＩＢ標的部位を標的化するｄＲＮＡを発現するＵ６プロモーター駆動プラスミドを示す。対照（ｃｉｒｃ－ＣｔｒｌＲＮＡ_１５１）、又はｃｉｒｃ－ａｒＲＮＡ_１５１－ＩＤＵＡを４８時間トランスフェクションした細胞における内因性ＩＤＵＡ標的部位のディープシーケンシングの結果を示す。

本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための、ＲＮＡ編集方法（本明細書では、「改良型ＬＥＡＰＥＲ」方法と呼ばれる）、及びデアミナーゼリクルートＲＮＡ（「ｄＲＮＡ」）又はＡＤＡＲリクルートＲＮＡ（「ａｒＲＮＡ」）と呼び特に設計されたＲＮＡ、又はこれらのｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を提供する。

「ＬＥＡＰＥＲ」（内因性ＡＤＡＲを利用してＲＮＡをプログラム可能に編集）は、本願発明者らによって以前に開発されており、内因性ＡＤＡＲを利用して、ｄＲＮＡ（「ａｒＲＮＡ」とも呼ばれる）を利用することにより標的ＲＮＡを編集する。ＬＥＡＰＥＲ方法は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１０１０５号及びＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１０１２４８号に記載されており、これらの全内容は引用により本明細書に組み込まれている。具体的には、標的転写物に部分に相補的な標的化ＲＮＡは、天然ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２をリクルートし、標的ＲＮＡ中の特定部位でアデノシンをイノシンに変化させることに用いられる。したがって、ＲＮＡ編集は、宿主細胞におけるＡＤＡＲタンパク質の異所性または過剰発現なしに、特定のシステムで達成できる。

本願は、例えば標的細胞におけるｄＲＮＡのレベルを増加させることによってＲＮＡ編集の効率を高めることを可能にする改良型ＬＥＡＰＥＲ方法を提供した。一態様では、改良型ＬＥＡＰＥＲ方法は、環状ｄＲＮＡ（例えば、インビトロで線状ＲＮＡから形成される環状ｄＲＮＡ）、または標的宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能であるｄＲＮＡの使用に関する。別の態様では、改良型ＬＥＡＰＥＲ方法は、標的化ＲＮＡ配列の３’または５’に連結された１つまたは複数の核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）を含むｄＲＮＡの使用に関する。別の態様では、改良型ＬＥＡＰＥＲ方法は、ポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）の制御下に置かれたｄＲＮＡに関する。我々は、ＬＥＡＰＥＲ方法と比較して、改良型ＬＥＡＰＥＲ方法によりｄＲＮＡの編集効率が大幅に向上することを実証した。理論に束縛されるものではないが、改良型ＬＥＡＰＥＲ方法で使用されるｄＲＮＡの安定性または量の増加が、ＲＮＡ編集効率のそのような改善に寄与したと考えられる。

したがって、本明細書の一態様は、１種又は複数種の改良型ＬＥＡＰＥＲ方法によって標的ＲＮＡを編集する方法を提供する。

別の態様では、改良型ＬＥＡＰＥＲ方法のためのｄＲＮＡ及び構築物を提供する。

本明細書は、ＲＮＡ編集方法によって個体の疾患又は障害を治療又は予防する方法、及び組成物をさらに提供する。

Ｉ．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているすべての特許、出願、公開出願及びその他の出版物は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれている。本項に記載された定義が、参照によって本明細書に組み込まれた特許、出願、または他の出版物に記載された定義と相反するか、または矛盾する場合、本項に記載された定義は、参照によって本明細書に組み込まれた定義よりも優先される。

なお、明確にするために、個別の実施例の文脈で説明された本開示のいくつかの特徴も、単一の実施形態で組み合わせて提供することができることが理解されるべきである。対照的に、単一の実施形態の文脈で説明された本開示の様々な特徴は、簡潔さのために、単独で、または任意の適切なサブ組合せで提供されてもよい。特定の方法ステップ、試薬、または条件に関連する実施形態のすべての組合せは、本開示で具体的にカバーされ、個別の組合せおよび各種の組合せが個別かつ明示的に開示されているように、本明細書で開示されている。

本明細書及び特許請求の範囲で使用されているように、単数形「１つ（ａ）」、「１種（ａｎ）」及び「該（ｔｈｅ）」は、文脈に別段の明示的な規定がない限り、複数の表示を含む。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように作成することができることにも留意すべきである。したがって、この記載は、特許請求の範囲の要素の説明に関連して、「単独で」、「のみ」のような排他的な用語を使用するため、または「否定的な」制限を使用するための前駆的基礎として使用されることを意図している。

「デアミナーゼリクルートＲＮＡ」、「ｄＲＮＡ」、「ＡＤＡＲリクルートＲＮＡ」および「ａｒＲＮＡ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するためにＡＤＡＲをリクルート可能である遺伝子操作ＲＮＡを意味する。

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」および「核酸」という用語は、交換して使用することができる。これらは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその類似体であってもよい、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。

本明細書で使用される「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」および「ヒポキサンチン」という用語は、核酸塩基そのものを指す。「アデノシン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」および「イノシン」という用語は、リボースまたはデオキシリボースの糖部分に結合した核酸塩基を指す。「ヌクレオシド」という用語は、リボースまたはデオキシリボースに結合した核酸塩基を指す。「ヌクレオチド」という用語は、それぞれの核酸塩基－リボシル－リン酸または核酸塩基－デオキシリボシル－リン酸を指す。アデノシンとアデニン（略語「Ａ」）、グアノシンとグアニン（略語「Ｇ」）、シトシンとシチジン（略語「Ｃ」）、ウラシルとウリジン（略語「Ｕ」）、チミンとチミジン（略語「Ｔ」）、イノシンおよびヒポキサンチン（略語「Ｉ」）という用語は、対応する核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを指すために互換的に使用され得る。文脈上明らかに異なる必要がない限り、核酸塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドという用語は、互換的に使用され得る。

本明細書で使用される用語「導入（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ／ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」は、ｄＲＮＡまたは１つまたは複数の構築物（本明細書に記載のベクターを含む）のような１つまたは複数のポリヌクレオチド、およびその１つまたは複数の転写物を宿主細胞に送達することを意味する。本発明は、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、および低分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなど）のようなＲＮＡを標的化して編集することができる基本的なプラットフォームとして使用される。本明細書の方法は、本明細書に記載されたｄＲＮＡまたは構築物の宿主細胞への導入を実現するために、ウイルス、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびコンジュゲーションを含むがこれらに限定されない多くの送達系を採用することができる。哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入するために、従来のウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を使用することができる。このような方法は、本明細書のｄＲＮＡをコードする核酸を培養物中の細胞または宿主生体に投与するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載の構築物の転写物）、裸の核酸、および送達ベクター（例えば、リポソーム）と複合化された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、遊離型または統合型ゲノムを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含み、宿主細胞に送達される。

本明細書の文脈において、「標的ＲＮＡ」とは、デアミナーゼリクルートＲＮＡ配列が、当該ＲＮＡ配列と完全または実質的に相補性を有するように設計され、標的配列とｄＲＮＡとのハイブリダイゼーションが、標的アデノシンを脱アミノ化するＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートする標的アデノシン含有二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を形成するＲＮＡ配列をいう。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは真核細胞（例えば、ヒト細胞のような哺乳動物細胞）のような宿主細胞に天然に存在する。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは宿主細胞に導入される。

本明細書で使用されるように、「相補性」とは、従来のワトソン－クリック塩基対合によって核酸が他の核酸と水素結合を形成する能力を意味する。相補性パーセンテージは、第２の核酸と水素結合を形成（すなわち、ワトソン－クリック塩基対合）可能である核酸分子内の残基のパーセンテージを表す（例えば、それぞれ約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％相補的である約５、６、７、８、９、１０／１０）。「完全に相補的」とは、核酸配列の連続するすべての残基が、第２の核酸配列の連続する残基と同数の水素結合を形成することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補性」とは、約４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上のヌクレオチドの領域における少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかの相補性の程度、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を意味する。

本明細書で使用されるように、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に相補的な核酸が主に標的配列とハイブリダイズし、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は通常、配列依存性であり、多くの要因に応じて変化する。一般に、配列が長いほど、配列が標的配列と特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例はＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、『生化学と分子生物学実験室技術－核酸プローブハイブリダイゼーション（ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓＩｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＷｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ）』第１部、第２章『核酸プローブハイブリダイゼーションの原理とアッセイの戦略の概要（Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｒｏｂｅａｓｓａｙ）』、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ，Ｙに詳細に記載されている。

「ハイブリダイゼーション」とは、これらのポリヌクレオチドの１つまたは複数が反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により結合して安定化された複合体を形成する反応をいう。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグシュタイン結合、または他の任意の配列特異的な方法によって起こり得る。所定の配列とハイブリダイズすることができる配列は、所定の配列の「相補配列」と呼ばれる。

本明細書で使用されるように、「含む」、「含有する」、および「包含する」という用語は、そのオープンで非限定的な意味で使用される。本明細書に記載された本願の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなる」および／または「本質的にからなる」ことを含み得ることも理解される。

「約」という用語が明示的に使用されるか否かにかかわらず、本明細書で与えられるあらゆる量は、実際の所定の値を指すことを意味し、また、そのような所定の値の実験条件および／または測定条件による等価物および近似値を含む、当業者に基づいて合理的に推測されるそのような所定の値の近似値を指すことも意図されることが理解される。

本明細書で使用されるように、「担体」には、使用される量および濃度で曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤が含まれる。一般的に、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の非限定的な例としては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化物質；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールやソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

本明細書で使用されるように、物質の「有効量」または「治療有効量」という用語は、特定の障害を改善または予防するために測定可能な少なくとも必要な最小濃度である。本明細書における有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個人において所望の反応を引き起こす物質の能力などの要因に応じて変化することができる。有効量はまた、治療の有益な効果が治療の毒性または有害な効果を上回る量でもある。癌に関しては、有効量には、腫瘍の縮小を引き起こし、および／または腫瘍の増殖速度を低下させる（例えば、腫瘍の増殖を阻害する）か、または癌における他の不要な細胞増殖を予防または遅延させるのに十分な量が含まれる。いくつかの実施形態では、有効量は、癌の進行を遅らせるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、再発を防止または遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、個体の再発率を減少させるのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与で投与することができる。薬物又は組成物の有効量は、（ｉ）がん細胞の数を減少させることができること、（ｉｉ）腫瘍の大きさを減少させること、（ｉｉｉ）末梢臓器への癌細胞の浸潤を阻害、遅らせ、ある程度遅くし、できれば止めること、（ｉｖ）腫瘍の転移を抑制する（すなわち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させる）こと、（ｖ）腫瘍の増殖を抑制すること、（ｖｉ）腫瘍の発生及び／又は再発を予防し又は遅らせること、（ｖｉｉ）腫瘍の再発率を低下させること、および／または（ｖｉｉｉ）がんに関連する１つ又は複数の症状をある程度緩和することができる。有効量は、１回または複数回の投与で投与することができる。本開示の目的のために、薬物、化合物または医薬組成物の有効量は、予防的または治療的処置を直接的または間接的に達成するのに十分な量である。臨床的文脈において理解されるように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、他の薬物、化合物、または医薬組成物と組み合わせて、または組み合わせなくても達成することができる。したがって、１種又は複数種の治療剤を投与する場合には「有効量」を考慮することができ、１種又は複数種の他の薬剤と組み合わせて所望の結果が得られるかまたは達成される場合には、１つの薬剤を有効量で投与することを考慮することができる。

本明細書に記載された「宿主細胞」とは、本明細書に記載されたように修飾可能であることを条件として、宿主細胞として使用可能な任意の細胞型を意味する。例えば、宿主細胞は、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）が内因的に発現されている宿主細胞であってもよいし、当該分野において公知の方法によりＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）が導入されている宿主細胞であってもよい。宿主細胞は、例えば、原核細胞、真核細胞、または植物細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞株または非ヒト細胞株を含む哺乳動物細胞株のような、予め確立された細胞株から誘導される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ヒト個体のような個体に由来する。

「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」とは、１つ又は複数の異種配列（すなわち、ＡＡＶ由来でない核酸配列）を含み、少なくとも１つの異種配列が隣接し、実施形態では２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接するポリヌクレオチドベクターをいう。このｒＡＡＶベクターは、適切なヘルパーウイルスで感染し（または適切なヘルパー機能を発現した）、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶｒｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現した宿主細胞内に存在する場合、複製して感染性ウイルス粒子にパッケージングすることができる。ｒＡＡＶベクターは、より大きなポリヌクレオチド（例えば、染色体中またはクローンまたはトランスフェクションのためのプラスミドのような他のベクター）に組み込まれた場合、ＡＡＶパッケージング機能および適切な補助機能の存在下で複製およびカプシド化することによって「救済」され得る「プレベクター」と呼ばれてもよい。ｒＡＡＶベクターは、プラスミド、線状人工染色体、脂質と複合化され、リポソームに封入され、ウイルス粒子（特にＡＡＶ粒子）に封入されていることを含むが、これらに限定されない、多くの形態のいずれかであってもよい。ｒＡＡＶベクターは、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成するために、ＡＡＶウイルスキャプシドにパッケージングされることができる。

「ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）」配列は当業者の公知の用語であり、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に存在する約１４５個のヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの最も外側にある１２５個のヌクレオチドは、２つの交互方向のいずれかに存在し、異なるＡＡＶゲノム間および単一のＡＡＶゲノムの両端間に異質性をもたらすことができる。最も外側にある１２５個のヌクレオチドはまた、いくつかの短い自己相補性領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と命名される）を含み、ＩＴＲのその部分内での鎖内塩基対合を可能にする。

「添付文書」とは、薬物の市販パッケージに慣例的に含まれる指示書を指し、適応症、用法、用量、投与、禁忌、包装された製品と組み合わせる他の薬物、および／またはそのような薬物の使用に関する警告などに関する情報を含む、薬物の市販パッケージに慣例的に含まれる適応症に関する情報を含む。

「被験者」、「患者」または「個人」は、ヒトまたは他の動物のような哺乳動物を含み、一般にヒトである。いくつかの実施形態では、治療剤および組成物が投与される被験者（例えば、患者）は、哺乳動物、一般的にはヒトのような霊長類である。いくつかの実施形態では、霊長類はサルまたは類人猿である。被験者は、男性または女性であってもよく、乳児、少年、青少年、成人および高齢者を含む任意の適切な年齢であってもよい。いくつかの実施形態では、被験者は非霊長類哺乳動物、例えば齧歯類、犬、猫、牛または馬などの農場動物などである。

本明細書で使用されるように、「治療」という用語は、臨床病理学的過程の間に、治療される個人または細胞の自然過程に有益で望ましい作用を有するように設計された臨床介入を意味する。本開示の目的のために、所望の治療効果は、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および予後の緩和または改善を含むがこれに限定されない。例えば、癌に関連する１つ又は複数の症状が緩和または除去された場合、個体は、癌細胞の増殖を減少させる（または癌細胞を破壊する）こと、癌細胞の殺傷を増加させること、疾患に起因する症状を減少させること、疾患の伝播を防止すること、疾患の再発を防止すること、疾患に罹患している人々の生活の質を増加させること、疾患の治療に必要な他の薬物の投与量を減少させること、疾患の進行を遅延させること、および／または個体の生存を延長することを含むが、これらに限定されない「治療」に成功する。

「グループＩイントロン」および「グループＩ触媒イントロン」という用語は、交換的に使用可能であり、ＲＮＡ前駆体からの自身の切除を触媒できる自己スプライシングリボザイムを指す。グループＩイントロンは、５’触媒グループＩイントロンフラグメントと３’触媒グループＩイントロンフラグメントの２つのフラグメントと、を含み、これらはフォールディング機能と触媒機能（つまり、自己スプライシング活性）を保持している。自然環境では、５’触媒グループＩイントロンフラグメントは、５’末端には５’エクソンが隣接しており、５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識される５’エクソン配列を含み、３’触媒グループＩイントロンフラグメントは、３’末端に３’エクソンが隣接しており、３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識される３’エクソン配列を含む。本明細書で使用される用語「５’エクソン配列」および「３’エクソン配列」は、例えば図８Ｃに示すように、自然環境におけるグループＩイントロンに対するエクソンの順序に従って標識される。

ＩＩ．ＲＮＡ編集方法
本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞（例えば、真核細胞）に導入することを含み、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、（２）ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートすることができる、方法を提供する。

環状ｄＲＮＡ
一態様では、本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞（例えば、真核細胞）に導入することを含み、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、（２）ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートすることができ、かつ（３）ｄＲＮＡは環状ＲＮＡであるか、又は宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含み、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、（２）ｄＲＮＡは、宿主細胞内で内因性的に発現するＡＤＡＲをリクルートして、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、かつ（３）ｄＲＮＡは環状ＲＮＡであるか、又は宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、タンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、又はＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含むいずれのタンパク質又は構築物を宿主細胞に導入することを含まない。

いくつかの実施形態では、本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含み、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、（２）ｄＲＮＡは、宿主細胞内で因性的に発現するＡＤＡＲをリクルートして、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、かつ（３）ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである、方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、タンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、又はＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含むいずれのタンパク質又は構築物を宿主細胞に導入することを含まない。

いくつかの実施形態では、本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含み、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、（２）ｄＲＮＡは、宿主細胞内で因性的に発現するＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、かつ（３）ｄＲＮＡは、宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である線状ＲＮＡである、方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、タンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、又はＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含むいずれのタンパク質又は構築物を宿主細胞に導入することを含まない。

いくつかの実施形態では、本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することと、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することと、を含み、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、（２）ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン（「Ａ」）残基を脱アミノ化することができ、かつ（３）ｄＲＮＡは環状ＲＮＡであるか、又は宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞で内因的にコードされるＡＤＡＲであり、ＡＤＡＲの導入は宿主細胞でＡＤＡＲを過剰発現することを含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞に対して外因性である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物は、ベクター、例えばプラスミド、又はウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクター）である。

一態様では、本明細書は、宿主細胞内で複数種の標的ＲＮＡ（例えば、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１０００又はそれ以上）をコードするための方法であって、複数種のｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする１種又は複数種の構築物を宿主細胞に導入する、方法を提供する。

一態様では、ｄＲＮＡは、宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成することができる線状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｌｉｔｋｅ，Ｊ．Ｌ．及びＪａｆｆｒｅｙ，Ｓ．Ｒ．『自己触媒転写体を用いた細胞内での環状ＲＮＡアプタマーの高効率発現（Highly efficient expression of circular RNA aptamers in cells using autocatalytic transcripts）』『ネイチャーバイオテクノロジー（Nat Biotechnol）』３７，６６７－６７５（２０１９）」に記載されているように、Ｔｏｒｎａｄｏ発現系（「持続的な過剰発現のためのツイスター最適化ＲＮＡ」）を用いて循環を行い、その全文を引用により本明細書に組み込んだ。簡単に言えば、Ｔｏｒｎａｄｏが発現する転写体には、そのツイスターリボザイムが隣接した目的のＲＮＡが含まれている。ツイスターリボザイムは、自己切断可能な任意の触媒ＲＮＡ配列である。リボザイムは、ＲＮＡリガーゼによって連結された末端を残して自己触媒切断を迅速に行う。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡはｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物によって導入される。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列と、ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、３’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、５’ツイスター配列はツイスターＰ１である。いくつかの実施形態では、５’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、３’ツイスター配列はツイスターＰ１である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは自己触媒切断を受ける。いくつかの実施形態では、触媒されたｄＲＮＡ産物は、３’末端に５’－ヒドロキシ及び２’，３’－環状リン酸エステルを含む。いくつかの実施形態では、触媒されたｄＲＮＡ産物は、遍在する内因性ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢ）によって連結される。いくつかの実施形態では、構築物はプラスミド、又はウイルスベクターである。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ転写物は、５’及び／又は３’ライゲーション配列にも隣接し、次に、それぞれ５’－ツイスターリボザイム及び／又は３’－ツイスターリボザイムに隣接する。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、５’ライゲーション配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列は、互いに少なくとも部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列は、互いに少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％相補的である。いくつかの実施形態では、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列は、互いに完全に相補的である。

いくつかの実施形態では、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列の長さは、独立に、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、又は少なくとも約１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列の長さは、独立に、約２０～３０ヌクレオチド、約３０～４０ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約５０～６０ヌクレオチド、約６０～７０ヌクレオチド、約７０～８０ヌクレオチド、約８０～９０ヌクレオチド、約９０～１００ヌクレオチド、約１００～１２５ヌクレオチド、約１２５～１５０ヌクレオチド、約２０～５０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、又は約１００～１５０ヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼによって環状化される。ＲＮＡリガーゼの非限定的な例としては、ＲｔｃＢ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２、Ｒｎｌ３、及びＴｒｌ１が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼは、宿主細胞内で内因的に発現される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼはＲＮＡリガーゼＲｔｃＢである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＲｔｃＢ）を宿主細胞に導入することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、宿主細胞に導入される前に環状化される。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、インビトロで線状ＲＮＡにより形成される環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは化学合成される。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、インビトロ酵素によるライゲーション（例えば、ＲＮＡ若しくはＤＮＡリガーゼを使用するか、又はイントロンフラグメントのスプライシングを介して）又は化学ライゲーション（例えば、臭化シアン又は類似の縮合剤を使用して）を通じて環状化される。

１つ又は２つのｓｎｏＲＮＡ末端を有するｄＲＮＡ
別の態様では、本明細書は、宿主細胞（例えば、真核細胞）内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列及び（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列を含み、ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルート可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書は、宿主細胞（例えば、真核細胞）内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列、及び（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列を含み、ｄＲＮＡは、宿主細胞内で因性的に発現するＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートして、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、タンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、又はＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含むいずれのタンパク質又は構築物を宿主細胞に導入することを含まない。

いくつかの実施形態では、本明細書は、宿主細胞（例えば、真核細胞）内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、（ａ）デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物と、（ｂ）ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物とを宿主細胞に導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列、及び（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞の内因的にコードされるＡＤＡＲであり、ＡＤＡＲの導入は、宿主細胞内でＡＤＡＲを過剰発現することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞に対して外因的である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物は、ベクター、例えばプラスミド、又はウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクター）である。

一態様では、本願は、宿主細胞内で複数種の標的ＲＮＡ（例えば、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１０００又はそれ以上）をコードするための方法であって、複数種のｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする１種又は複数種の構築物を宿主細胞に導入する、方法を提供する。

核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）は、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡなどの他のＲＮＡの化学修飾をガイドすることが知られている小さな非コードＲＮＡ分子である。ｓｎｏＲＮＡには、その特定の二次構造の特徴に応じて、ｂｏｘＣ／ＤとｂｏｘＨ／ＡＣＡの２つの主要なグループがある。ｓｎｏＲＮＡの両方の構造的特徴により、ｓｎｏＲＮＡはアクセサリータンパク質とともに対応するＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）に結合し、機能的な核小体低分子リボ核タンパク質（ｓｎｏＲＮＰ）複合体を形成可能である。Ｃ／ＤｓｎｏＲＮＡはメチル化に関連していると考えられているが、Ｈ／ＡＣＡｂｏｘｓｎｏＲＮＡはシュードウリジル化に関連していると考えられている。ｓｎｏＲＮＡの他のファミリーには、たとえば、複合Ｈ／ＡＣＡおよびＣ／ＤｂｏｘｓｎｏＲＮＡおよびオーファンｓｎｏＲＮＡが含まれる。本明細書に記載されるｓｎｏＲＮＡ配列は、天然に存在するｓｎｏＲＮＡ、その一部、またはその変異体を含むことができる。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）と、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１１０ヌクレオチド、少なくとも約１２０ヌクレオチド、少なくとも約１３０ヌクレオチド、少なくとも約１４０ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１６０ヌクレオチド、少なくとも約１７０ヌクレオチド、少なくとも約１８０ヌクレオチド、少なくとも約１９０ヌクレオチド、又は少なくとも約２００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、約５０～７５ヌクレオチド、約７５～１００ヌクレオチド、約１００～１２５ヌクレオチド、約１２５～１５０ヌクレオチド、約１５０～１７５ヌクレオチド、約１７５～２００ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、約１００～１５０ヌクレオチド、約１５０～２００ヌクレオチド、約１２５～１７５ヌクレオチド、又は約１００～２００ヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、３’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（５’－ＡＡＧＡＴＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＴＣＣＴＴＧＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＣＴＡＴＡＣＣＧＴＣＡＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＡＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＴＴＡＣＴＣＣＡＡＣＡＧ－３’）の核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、５’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２（５’－ＧＡＧＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＧＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＣＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧＣＴＡＡ－３’）の核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｈ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、複合Ｃ／ＤＢｏｘとＨ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、オーファンｓｎｏＲＮＡ配列である。

線状ＲＮＡからインビトロで形成される環状ｄＲＮＡ
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、イントロンフラグメント（例えばグループＩ触媒性イントロンフラグメント）のインビトロスプライシングによって形成される。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡをコードする核酸配列の５’末端に隣接する３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列と、ｄＲＮＡをコードする核酸配列の３’末端に隣接する５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列と、を含む、ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４の核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５５の核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、３’エクソン配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４の核酸配列からなり、５’エクソン配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５５の核酸配列からなる。
ＳＥＱＩＤＮＯ：５４（３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列）
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCAC
ＳＥＱＩＤＮＯ：５５（５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列）
GAGACGCUACGGACUU

いくつかの実施形態では、Ｔ４ファージＴｄ遺伝子のグループＩ触媒性イントロンは、リボザイムのフォールディングに重要な構造要素を保存するような方法で二分される。次に、エクソンフラグメント２をエクソンフラグメント１の上流に連結し、ｄＲＮＡをコードする核酸配列をエクソン－エクソン接合部の間に挿入する。

いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡのインビトロライゲーションによって形成され、線状ＲＮＡは、線状ＲＮＡの５’末端に５’ライゲーション配列、及び線状ＲＮＡの３’末端に３’ライゲーション配列を含み、５’ライゲーション配列及び３’ライゲーション配列は、リガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ）を介して互いに連結される。

本願は、本明細書の前記環状ｄＲＮＡを製造するための核酸構築物（例えば、線状ＲＮＡ及びベクターなど）、及び、例えば、線状ＲＮＡの化学ライゲーション、酵素的ライゲーション又はリボザイム自己触媒によって環状ｄＲＮＡを製造するための方法をさらに提供する。線状ＲＮＡは、本明細書では、「線状ＲＮＡ前駆体」とも呼ばれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、環状ｄＲＮＡをインビトロで形成する方法のいずれか１つ又は複数のステップ、例えば、インビトロライゲーション又はスプライシング、線状ＲＮＡ前駆体のインビトロ転写及び環状ｄＲＮＡの単離や精製のステップを含む。これらのステップ及び成分については、以下のセクションａ）～ｅ）でさらに詳細に説明する。

ａ）インビトロスプライシングによって環状化される線状ＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本願は、本明細書の前記のいずれかの実施例に記載の環状ｄＲＮＡを形成する線状ＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、臭化シアン又は類似の縮合剤を使用する化学的環状化方法によって環状化されてもよい。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、５’触媒グループＩイントロンフラグメントと３’触媒グループＩイントロンフラグメントを含むグループＩイントロンの自己触媒によって環状化されてもよい。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、リガーゼによって環状化されてもよい。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼによって環状化されてもよい。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、ＤＮＡリガーゼによって環状化されてもよい。適切なリガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４Ｄｎｌ）、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１（Ｔ４Ｒｎｌ１）、及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｔ４Ｒｎｌ２）を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本願は、本明細書の前記いずれかの実施例の環状ｄＲＮＡを形成可能である線状ＲＮＡを提供し、線状ＲＮＡは、グループＩイントロンの自己触媒によって環状化されてもよい。いくつかの実施形態では、グループＩイントロンは、５’触媒グループＩイントロンフラグメント及び３’触媒グループＩイントロンフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、３’触媒グループＩイントロンフラグメント（例えばＳＥＱＩＤＮＯ：５６で示される配列）及び５’触媒グループＩイントロンフラグメント（例えばＳＥＱＩＤＮＯ：５７で示される配列）を含み、３’触媒グループＩイントロンフラグメントは、３’触媒グループＩイントロンフラグメント（例えばＳＥＱＩＤＮＯ：５４で示される配列）によって認識可能な３’エクソン配列の５’末端に隣接し、５’触媒グループＩイントロンフラグメントは、５’触媒グループＩイントロンフラグメント（例えばＳＥＱＩＤＮＯ：５５で示される配列）によって認識可能な５’エクソン配列の３’末端に隣接する。
ＳＥＱＩＤＮＯ：５６（３’触媒グループＩイントロンフラグメント）
AACAAUAGAUGACUUACAACUAAUCGGAAGGUGCAGAGACUCGACGGGAGCUACCCUAACGUCAAGACGAGGGUAAAGAGAGAGUCCAAUUCUCAAAGCCAAUAGGCAGUAGCGAAAGCUGCAAGAGAAUG
ＳＥＱＩＤＮＯ：５７（５’触媒グループＩイントロンフラグメント）
AAAUAAUUGAGCCUUAAAGAAGAAAUUCUUUAAGUGGAUGCUCUCAAACUCAGGGAAACCUAAAUCUAGUUAUAGACAAGGCAAUCCUGAGCCAAGCCGAAGUAGUAAUUAGUAAG

いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、３’触媒グループＩイントロンフラグメントの５’末端に隣接する５’相同配列と、５’触媒グループＩイントロンフラグメントの３’末端に隣接する３’相同配列と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、５’から３’末端まで、５’ホモロジーアーム－３’触媒グループＩイントロンフラグメント－３’エクソン配列－ｄＲＮＡ－５’エクソン配列－５’触媒グループＩイントロンフラグメント－３’ホモロジーアーム配列を含む。いくつかの実施形態では、相同配列の長さは、１～１００、５～８０、５～６０、１０～５０、又は１２～５０ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、相同配列の長さは、約２０～３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、５’相同配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８の核酸配列を含み、３’相同配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ホモロジーアームは、ＲＮＡ環状化効率を約０～２０％、２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上向上させる。
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８（例示的な５’相同配列）
GGGAGACCCUCGACCGUCGAUUGUCCACUGGUC
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９（例示的な３’相同配列）
ACCAGUGGACAAUCGACGGAUAACAGCAUAUCUAG

いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸構築物を提供する。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーターは、線状ＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：６０で示される配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーターはインビトロ転写を駆動可能である。
ＳＥＱＩＤＮＯ：６０（Ｔ７プロモーター）
UAAUACGACUCACUAUAGG

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、リボザイム自己触媒又は触媒性イントロンのインビトロスプライシングによって線状ＲＮＡを環状化することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）グループＩイントロン（又はその５’及び３’触媒グループＩイントロンフラグメント）の自己触媒を活性化する条件を本明細書の前記線状ＲＮＡに曝さして環状化ＲＮＡ産物を提供することと、（ｂ）環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、環状ｄＲＮＡを提供することと、を含む。

いくつかの実施形態では、該方法は、まず、線状化ＲＮＡをコードする配列をプラスミドベクターにクローニングし、次に、組換えプラスミドを線状化することにより、線状ＲＮＡを得るステップを含む。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、制限酵素消化によって線状化される。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、ＰＣＲ増幅によって線状化される。いくつかの実施形態では、該方法は、線状化されたプラスミドテンプレートを用いてインビトロ転写を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態では、インビトロ転写は、Ｔ７プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、該方法は、線状ＲＮＡ転写物を精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡはゲル精製によって精製される。

いくつかの実施形態では、本明細書は、グループＩイントロンのリボザイム自己触媒によって線状ＲＮＡ（例えば、精製された線状ＲＮＡ）を環状化する方法を提供する。スプライシング中、グアノシンヌクレオチドの３’ヒドロキシは、５’スプライシング部位でエステル交換反応に関与する。５’イントロンの半分が切除され、中間体の末端にある遊離ヒドロキシが３′スプライシング部位で２回目のエステル交換を起こし、介在領域が環状化して３’イントロンが切除される。いくつかの実施形態では、グループＩイントロン又は５’及び３’触媒グループＩイントロンフラグメントの自己触媒を活性化する条件は、ＧＴＰ及びＭｇ^２＋の添加である。いくつかの実施形態では、５５℃でＧＴＰ及びＭｇ^２＋を添加し１５分間保持することによって線状ＲＮＡを環状化するステップを提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、反応混合物をＲＮａｓｅＲで処理して線状ＲＮＡ転写物を消化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、環状ｄＲＮＡを単離することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、環状化は、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少なくとも４４％、少なくとも４６％、少なくとも４８％、又は少なくとも５０％の効率を有する。いくつかの実施形態では、環状化は、約４０％～約５０％、又は５０％を超える効率を有する。

ｂ）ライゲーションにより環状化された線状ＲＮＡ
いくつかの実施形態では、環状ＲＮＡは、リガーゼ（例えばＲＮＡリガーゼ）を使用した線状ＲＮＡのインビトロライゲーションによって形成される。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼによって環状化されてもよい。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、環状ｄＲＮＡをコードする核酸配列の５’末端に５’ライゲーション配列を含み、環状ｄＲＮＡをコードする核酸配列の３’末端に３’ライゲーション配列を含み、５’ライゲーション配列及び３’ライゲーション配列は、ＲＮＡリガーゼによって互いにライゲーションしてもよい。非限定的な例において、線状ＲＮＡは、リガーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４Ｄｎｌ）、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１（Ｔ４Ｒｎｌ１）、及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｔ４Ｒｎｌ２））によって環状化されてもよい。線状ＲＮＡは、一本鎖核酸アダプター（例えば、スプリントＤＮＡ）の存在の有無に関わらず環状化されてもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、線状ＲＮＡをインビトロで環状化することを含み、線状ＲＮＡをインビトロで環状化することは、（ａ）環状ｄＲＮＡをコードする核酸配列の５’末端に５’ライゲーション配列を含み、上記環状ｄＲＮＡをコードする核酸配列の３’末端に３’ライゲーション配列を含む線状ＲＮＡのいずれかを、一本鎖アダプター核酸と接触させ、一本鎖アダプター核酸は、５’末端から３’末端まで３’ライゲーション配列に相補的な第１配列及び５’ライゲーション配列に相補的な第２配列を含み、５’ライゲーション配列及び３’ライゲーション配列は一本鎖アダプター核酸とハイブリダイズして、５’ライゲーション配列の３’末端と３’ライゲーション配列の５’末端との間の一本鎖切断を含む二本鎖核酸中間体を提供することと、（ｂ）５’ライゲーション配列と３’ライゲーション配列のライゲーションを可能にする条件下で、中間体をＲＮＡリガーゼと接触させて、環状化ＲＮＡ産物を提供することと、（ｃ）環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、環状ｄＲＮＡを提供することと、を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、線状ＲＮＡをインビトロで環状化することを含み、線状ＲＮＡをインビトロで環状化することは、（ａ）環状ｄＲＮＡをコードする核酸配列の５’末端に５’ライゲーション配列を含み、上記環状ｄＲＮＡをコードする核酸配列の３’末端に３’ライゲーション配列を含む線状ＲＮＡのいずれかを、５’ライゲーション配列と３’ライゲーション配列のライゲーションを可能にする条件下で、ＲＮＡリガーゼと接触させて、環状化ＲＮＡ産物を提供することと、（ｂ）環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、環状ｄＲＮＡを提供することと、を含む。

いくつかの実施形態では、該方法は、反応混合物をＲＮａｓｅＲで処理して、線状ＲＮＡ転写物を消化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、環状ｄＲＮＡを単離することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを使用して５’－リン酸化された核酸分子（例えば、線状ＲＮＡ）を核酸（例えば、線状核酸）の３’－ヒドロキシに酵素的に連結して、新しいホスホジエステル結合を形成してもよい。例示的な反応では、製造業者のプロトコルに従って、線状環状ＲＮＡを１～１０単位のＴ４ＲＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ、マサチューセッツ州イプスウィッチ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ））とともに３７℃で１時間インキュベートする。ライゲーション反応は、酵素的ライゲーション反応を補助するために、５’領域と３’領域の両方と並列して塩基対形成できる線状核酸の存在下で起こり得る。いくつかの実施形態では、ライゲーションはスプリントライゲーションである。例えば、スプリントリガーゼ、例えばＳＰＬＩＮＴＲ（登録商標）リガーゼは、スプリントライゲーションに使用できる。スプリントライゲーションの場合、一本鎖多ヌクレオチド（スプリント）、例えば一本鎖ＲＮＡは、線状ポリリボヌクレオチドの両方の末端とハイブリダイズするように設計されてもよく、その結果、一本鎖スプリントとのハイブリダイゼーションの際に２つの末端が並置され得る。したがって、線状ポリリボヌクレオチドの並置された２つの末端のライゲーションを触媒し、環状ポリリボヌクレオチドを生成することができる。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ＲＮＡの合成に有用である。非限定的な例としては、リガーゼは、サークルリガーゼまたは環状リガーゼであってもよい。

ｃ）化学ライゲーションにより環状化された線状ＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、線状ＲＮＡをインビトロで環状化することを含み、線状ＲＮＡをインビトロで環状化することは、（ａ）環状ｄＲＮＡをコードする核酸配列を含む線状ＲＮＡの５’末端と３’末端を化学的に連結することと、（ｂ）環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、環状ｄＲＮＡを提供することと、を含む。

いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡを環状化するステップは、臭化シアン又は類似の縮合剤を使用した化学的環状化方法を含む。

いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡ前駆体は、化学的方法によって環状化されてもよい。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）の５’－末端及び３’－末端は、化学反応性基を含み、この化学反応性基が互いに接近すると、分子の５’－末端と３’－末端との間に新しい共有結合を形成し得る。５’－末端にはＮＨＳエステル反応性基が含まれ、３’－末端には３’－アミノ末端ヌクレオチドが含まれてもよく、これにより、有機溶媒中では、線状ＲＮＡ分子の３’－末端にある３’－アミノ末端ヌクレオチドが５’－ＮＨＳ－エステル部分に対して求核攻撃を受け、新しい５’－／３’－アミド結合が形成される。

いくつかの実施形態では、本明細書による環状化方法の環状化効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は１００％である。いくつかの実施形態では、本明細書による環状化方法の環状化効率は、少なくとも約４０％である。

ｄ）プラスミド
いくつかの実施形態では、本願は、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含むプラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、プラスミドは、線状ＲＮＡをコードする配列をプラスミドベクターにクローニングすることによって得られる。プラスミドは、Ｇｉｂｓｏｎクローニングまたは制限酵素を使用するクローニングなどの当技術分野で知られている技術によって生成することができる。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、プラスミドを発現する細菌の抗生物質選択を可能にする抗生物質発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、提供されるプラスミドは細菌から精製され、環状ＲＮＡの産生に使用され得る。線状ＲＮＡのインビトロ転写に適した任意のプラスミドベクターを使用することができる。

いくつかの実施形態では、プラスミドは、線状ＲＮＡのインビトロ転写前に線状化される。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、制限酵素消化によって線状化される。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドはＰＣＲ増幅によって線状化される。いくつかの実施形態では、該方法は、線状化されたプラスミドテンプレートを用いてインビトロ転写を実施することをさらに含む。いくつかの実施形態では、インビトロ転写は、Ｔ７プロモーターによって駆動される。

ｅ）環状ｄＲＮＡの精製
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、環状ＲＮＡ産物を単離および／または精製するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、環状ｄＲＮＡをゲルにより精製することを含む。いくつかの実施形態では、アガロースゲル電気泳動により、線状前駆体分子、ニックを入れた環、スプライシング中間体、および除去されたイントロンからの環状スプライシング産物の簡単かつ効果的な分離が可能になる。いくつかの実施形態では、該方法は、クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）によって環状ｄＲＮＡを精製することを含む。いくつかの実施形態では、精製した環状ｄＲＮＡは、－８０℃で保存してもよい。

ＰｏｌＩＩプロモーターを有する構築物
別の態様では、本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含み、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、（２）ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルート可能であり、（３）構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築物を宿主細胞に導入することを含み、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、（２）ｄＲＮＡは、宿主細胞内で因性的に発現するＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートして、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、（３）構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、タンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲ、又はＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）をコードする核酸を含むいずれのタンパク質又は構築物を宿主細胞に導入することを含まない。

いくつかの実施形態では、本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、（ａ）デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築物と、（ｂ）ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物と、を宿主細胞に導入することを含み、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、（２）ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートして、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、（３）構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞の内因的にコードされるＡＤＡＲであり、ＡＤＡＲの導入は、宿主細胞内でＡＤＡＲを過剰発現することを含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞に対して外因的である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物は、ベクター、例えばプラスミド、又はウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクター）である。

一態様では、本明細書は、宿主細胞内で複数種の標的ＲＮＡ（例えば、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１０００又はそれ以上）をコードするための方法であって、複数種のｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする１種又は複数種の構築物を宿主細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つＰｏｌＩＩプロモーター（例えば、ＣＭＶ）は、２つ以上のｄＲＮＡの発現を駆動する。

ＰｏｌＩＩプロモーターの非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１α、ＣＡＧ、及びＲＳＶを含む。いくつかの実施形態では、ＰｏｌＩＩプロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３（5’-CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT-3’）の核酸配列を含む。

本明細書に記載の方法のいずれかによるいくつかの実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はねずみ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、植物細胞又は真菌細胞である。

本明細書に記載の方法又は使用のいずれかによるいくつかの実施形態では、宿主細胞は、細胞系、例えばＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＴ２９、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＲＤ、ＳＦ２６８、ＳＷ１３、及びＨｅＬａ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は線維芽細胞、上皮細胞、または免疫細胞などの初代細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は有糸分裂後細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、脳細胞、例えば、小脳細胞などの中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞である。

本明細書に記載の方法のいずれかによるいくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは宿主細胞に対して内因的である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）は、宿主細胞内に天然または内因的に存在し、例えば、真核細胞内に天然または内因的に存在する。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは宿主細胞によって内因的に発現される。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは宿主細胞に外因的に導入される。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲはＡＤＡＲ１および／またはＡＤＡＲ２である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡＲ１、およびＡＤＡＲ２からなる群から選択される１つまたは複数のＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１、例えば、ＡＤＡＲ１のｐ１１０アイソフォーム（「ＡＤＡＲ１^ｐ１１０」）および／またはＡＤＡＲ１のｐ１５０アイソフォーム（「ＡＤＡＲ１^ｐ１５０」）である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲはＡＤＡＲ２である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞によって発現されるＡＤＡＲ２、例えば、小脳細胞によって発現されるＡＤＡＲ２である。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞に対して外因的なＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、天然に存在するＡＤＡＲの過剰活性変異体である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、Ｅ１００８Ｑ変異を含むＡＤＡＲ１である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、結合ドメインを含む融合タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、遺伝子操作二本鎖核酸結合ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、ｄＲＮＡ中の相補的ＲＮＡ配列に融合されるＭＳ２ヘアピンに結合するＭＣＰドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲはＤＳＢを含まない。

本明細書に記載の方法のいずれかによるいくつかの実施形態では、宿主細胞は、高いＡＤＡＲ１（ＡＤＡＲ１^ｐ１１０および／またはＡＤＡＲ１^ｐ１５０など）の発現レベル、例えば、βチューブリンのタンパク質発現レベルと比較して約１０％、２０％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍、またはそれ以上の少なくともいずれか１つを有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、βチューブリンのタンパク質発現レベルと比較して、高いＡＤＡＲ２発現レベル、例えば、約１０％、２０％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍、またはそれ以上の少なくともいずれか１つを有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＡＤＡＲ３の発現レベルが低く、例えば、βチューブリンのタンパク質発現レベルと比較して約５倍、３倍、２倍、１００％、５０％、２０％またはそれ以下のいずれか１つ以下である。

本明細書に記載の方法のいずれかによる特定の実施形態では、ｄＲＮＡは、少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０ヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む。本明細書に記載の方法のいずれか１つによる特定の実施形態では、ｄＲＮＡは、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０ヌクレオチド以下のうちのいずれか１つを含む。特定の実施形態では、ｄＲＮＡの長さは、約４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１７５、１１０～１５０又は１０５～１４０ヌクレオチドのうちのいずれか１つである。

本明細書に記載の方法又は使用のいずれかによるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡはＡＤＡＲリクルートドメインを含まない。「ＡＤＡＲリクルートドメイン」は、ＡＤＡＲに高親和性で結合するヌクレオチド配列もしくは構造、または遺伝子操作ＡＤＡＲ構築物中のＡＤＡＲに融合された結合パートナーに結合するヌクレオチド配列であってもよい。例示的なＡＤＡＲリクルートドメインとしては、ＧｌｕＲ－２、ＧｌｕＲ－Ｂ（Ｒ／Ｇ）、ＧｌｕＲ－Ｂ（Ｑ／Ｒ）、ＧｌｕＲ－６（Ｒ／Ｇ）、５ＨＴ２Ｃ、およびＦｌｎＡ（Ｑ／Ｒ）ドメインが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｗａｈｌｓｔｅｄｔ、Ｈｅｌｅｎｅ、およびＭａｒｉｅら、『サイト選択型ｖｓ無差別的なＡ－ｔｏ－Ｉ編集（Site-selective vs promiscuous A-to-I editing)』(Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA)』2.6(2011): 761-771を参照する。これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは二本鎖部分を含まない。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＭＳ２ステムループなどのヘアピンを含まない。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは一本鎖である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡはＤＳＢ結合ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、相補的ＲＮＡ配列からなる（または本質的に相補的ＲＮＡ配列からなる）。

本明細書に記載の方法のいずれかによるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは化学修飾を含まない。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドまたはホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドなどの化学的に修飾されたヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、最初の３残基と最後の３残基のみに２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ではない。

本明細書に記載のｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含む。本明細書に記載の方法のいずれかによる特定の実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列は、少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０ヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む。本明細書に記載の方法のいずれかによる特定の実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列は、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０ヌクレオチド以下のうちのいずれか１つを含む。特定の実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは、約４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１６０、１１０～１７５、１１０～１５０、１４０～１６０、１０５～１４０又は１０５～１５５ヌクレオチドのうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは、約７１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡの長さは、約１１１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡの長さは、約１５１ヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基に直接対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基に直接対向するシチジンミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、シチジンミスマッチは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド、例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又はそれ以上のヌクレオチド離れる位置にある。いくつかの実施形態では、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド、例えば、少なくとも２５、３０、３５又はそれ以上のヌクレオチドから離れる位置にある。いくつかの実施形態では、シチジンミスマッチは、標的化ＲＮＡ配列の３’末端から２０（例えば、１５、１０、５又はそれ以下）ヌクレオチド離れる位置にある。いくつかの実施形態では、シチジンミスマッチは、標的化ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド（例えば、少なくとも２５、３０、３５又はそれ以上のヌクレオチド）離れる位置、及び標的化ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又はそれ以上のヌクレオチド）離れる位置にある。いくつかの実施形態では、シチジンミスマッチは、標的化ＲＮＡ配列の中心にある。いくつかの実施形態では、シチジンミスマッチは、ｄＲＮＡ中の標的化配列の中心にある２０ヌクレオチド（例えば、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチド）内にある。

本明細書に記載の方法のいずれかによるいくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、１つ又は複数のグアノシン、例えば、１、２、３、４、５、６又はそれ以上のＧを含み、それぞれは、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに直接対向する。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続したミスマッチヌクレオチド（例えば、２、３、４、５個又はそれ以上のミスマッチヌクレオチド）を含む。

いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、約２０個以下の非標的Ａを含み、例えば約１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個の非標的Ａのいずれか１つ以下を含む。非標的Ａに対向するＧ及び連続したミスマッチヌクレオチドは、ＡＤＡＲによるオフターゲット編集効果を低減することができる。

本明細書に記載の方法のいずれかによる特定の実施形態では、標的アデノシン残基の５’最近傍は、Ｕ、Ｃ、Ａ、及びＧから選択されるヌクレオチドであり、好ましくはＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、標的アデノシン残基の３’最近傍は、Ｇ、Ｃ、Ａ、及びＵから選択されるヌクレオチドであり、好ましくはＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。特定の実施形態では、標的アデノシン残基は、標的ＲＮＡ中のＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵから選択される３塩基モチーフ内にある。特定の実施形態では、３塩基モチーフはＵＡＧであり、ｄＲＮＡは３塩基モチーフ内のＵに直接対向するＡ、標的Ａに直接対向するＣ、及び３塩基モチーフ内のＧに直接対向するＣ、Ｇ又はＵを含む。いくつかの実施形態では、３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中のＵＡＧであり、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ的ＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧ又はＡＣＵを含む。特定の実施形態では、３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中のＵＡＧであり、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ的ＵＡＧに対向するＡＣＣを含む。

本明細書に記載の方法のいずれかによるいくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）からなる群から選択されるいずれか１種である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡである。

本明細書に記載の方法のいずれかによる特定の実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ３阻害剤を宿主細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲ３阻害剤は、ＡＤＡＲ３に対するＲＮＡｉ、例えばＡＤＡＲ３に対するｓｈＲＮＡ、又はＡＤＡＲ３に対するｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、該方法は、インターフェロン刺激剤を宿主細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、インターフェロンによって誘導されてもよく、例えば、ＡＤＡＲはＡＤＡＲ^ｐ１５０である。いくつかの実施形態では、インターフェロン刺激剤はＩＦＮβである。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲ３阻害剤及び／又はインターフェロン刺激剤は、ｄＲＮＡをコードする相同構築物（例えば、ベクター）によってコードされる。

本明細書に記載の方法のいずれかによる特定の実施形態では、標的ＲＮＡの編集効率は、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又はそれ以上のいずれか１種である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの編集効率は、少なくとも約４０％である。いくつかの実施形態では、編集効率は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって決定される。いくつかの実施形態では、編集効率は、新世代のシーケンシングによって決定される。いくつかの実施形態では、編集効率は、レポーター（例えば蛍光レポーター、例えば、ＥＧＦＰ）の発現を評価することによって決定される。

本明細書に記載の方法のいずれかによる特定の実施形態では、該方法は、低いオフターゲット編集率を有する。いくつかの実施形態では、該方法は、標的ＲＮＡ中の非標的Ａに対しては、約１％未満（例えば、約０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％以下、又はそれ以下のいずれか１つ）の編集効率がある。いくつかの実施形態では、該方法は、標的ＲＮＡ中の非標的Ａを編集しない。いくつかの実施形態では、該方法は、非標的ＲＮＡ中のＡに対して、約０．１％未満（例えば、約０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００１％以下、又はそれ以下のいずれかの１つ）の編集効率がある。

本明細書に記載の方法のいずれかによる特定の実施形態では、該方法は、免疫応答、例えば自然免疫応答を誘導しない。いくつかの実施形態では、該方法は、宿主細胞内のインターフェロン及び／又はインターロイキンの発現を誘導しない。いくつかの実施形態では、該方法は、宿主細胞内のＩＦＮ－β及び／又はＩＬ－６の発現を誘導しない。

本明細書に記載の方法のいずれか１つによって産生された編集ＲＮＡまたは編集ＲＮＡを有する宿主細胞も提供される。いくつかの実施形態では、編集ＲＮＡはイノシンを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ミスセンス変異、早期終止コドン、選択的スプライシング部位、または異常スプライシング部位を有するＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、変異タンパク質、切断タンパク質（truncated protein）、またはミスフォールドタンパク質を含む。

核酸の非ウイルス送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質、核酸コンジュゲート、エレクトロポレーション、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞または遺伝子銃、裸のＤＮＡおよび人工ビリオンが含まれる。
核酸の送達にＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムを使用すると、ウイルスを特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを細胞核に輸送する際に高い効率が得られる。

本明細書に記載の方法のいずれかによる特定の実施形態では、該方法は、ｄＲＮＡをコードするウイルスベクター（例えばＡＡＶ又はレンチウイルスベクター）を宿主細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、構築物は、１つ又は複数のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接する。いくつかの実施形態では、構築物は２つのＡＡＶＩＴＲに隣接する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、又はマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶ２ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ベクターは、スタッファー核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、スタッファー核酸は、ｄＲＮＡをコードする核酸の上流又は下流にある。いくつかの実施形態では、ベクターは、自己相補的ｒＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｄＲＮＡをコードする第１核酸配列と、ｄＲＮＡをコードする相補的配列の第２核酸配列と、を含み、第１核酸配列は、その長さの大部分又は全部に沿って第２核酸配列と鎖内塩基対を形成可能である。いくつかの実施形態では、第１核酸配列及び第２核酸配列は、変異ＡＡＶＩＴＲによって連結されており、変異ＡＡＶＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端分解配列（terminal resolution sequence）の変異を含む。いくつかの実施形態では、ベクターはｒＡＡＶ粒子内にキャプシド化されている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶ２Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２Ｖ７０８Ｋ、ＡＡＶ２－ＨＢＫＯ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶＢＲ１、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１７、ヤギＡＡＶ、キメラＡＡＶ１／ＡＡＶ２、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、又はｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。

いくつかの実施形態では、該方法は、ｄＲＮＡをコードするプラスミドを宿主細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、宿主細胞へのｄＲＮＡ（例えば、合成ｄＲＮＡ）のエレクトロポレーションを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、宿主細胞へのｄＲＮＡのトランスフェクションを含む。

脱アミノ化後、標的ＲＮＡおよび／または標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の修飾は、標的ＲＮＡ内の標的アデノシンの位置に応じて異なる方法を使用して決定できる。例えば、標的ＲＮＡにおいて「Ａ」が「Ｉ」に編集されたか否かを決定するために、当技術分野で知られているＲＮＡシーケンシング法を使用してＲＮＡ配列の修飾を検出することができる。標的アデノシンがｍＲＮＡのコード領域に位置する場合、ＲＮＡ編集により、ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列が変化し得る。例えば、点突然変異がｍＲＮＡに導入され、「Ａ」から「Ｉ」への変換により、ｍＲＮＡにおける先天的または後天的な点突然変異が逆転して野生型遺伝子産物が得られ得る。当該技術分野で公知の方法によるアミノ酸シーケンシングを使用して、コードされたタンパク質内のアミノ酸残基のあらゆる変化を見つけることができる。終止コドンの修飾は、機能的、伸長型、切断型、全長および／または野生型タンパク質の存在を評価することによって決定され得る。例えば、標的アデノシンがＵＧＡ、ＵＡＧ、またはＵＡＡ終止コドンに位置する場合、標的アデノシン残基（ＵＧＡまたはＵＡＧ）またはＡｓ（ＵＡＡ）の修飾により、リードスルー変異および／または伸長タンパク質が生じる可能性があり、または標的ＲＮＡによってコードされる切断タンパク質が逆転して、機能的な完全長タンパク質および／または野生型タンパク質が作製され得る。標的ＲＮＡの編集により、標的ＲＮＡに異常なスライシング部位および／または選択的スライシング部位が生成され、その結果、伸長、トゥランケイション、またはミスフォールディングされたタンパク質が生じたり、標的ＲＮＡにコードされている異常なスプライシング部位または選択的スプライシング部位が逆転して、機能的で正しくフォールディングされた完全長および／または野生型タンパク質が作成され得る。いくつかの実施形態では、本願は、先天的および後天的遺伝子変化の両方、例えば、ミスセンス変異、早期終止コドン、異常スプライシングまたは標的ＲＮＡによってコードされる選択的スプライシング部位の編集を企図する。既知の方法を使用して、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の機能を評価すると、ＲＮＡ編集が望ましい効果を達成するか否かを知ることができる。アデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への脱アミノ化は、タンパク質をコードする変異体ＲＮＡの標的位置の変異Ａを修正し得るため、イノシンへの脱アミノ化の同定により、機能性タンパク質が存在するか否か、または変異アデノシンの存在によって引き起こされる疾患または薬剤耐性に関連するＲＮＡが元に戻るか部分的に元に戻るか否かの評価が得られ得る。同様に、アデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への脱アミノ化は、得られるタンパク質に点突然変異を導入する可能性があるため、イノシンへの脱アミノ化の同定は、疾患の原因または疾患の関連因子を特定するための機能的指標を提供し得る。

標的アデノシンの存在が異常なスプライシングを引き起こす場合、リードアウトは、異常なスプライシングの発生および頻度の評価であり得る。一方、スプライス部位を導入するために標的アデノシンの脱アミノ化が望ましい場合、類似のアプローチを使用して、必要なタイプのスプライシングが発生しているか否かを確認できる。当業者に周知の方法を使用して標的アデノシンの脱アミノ化後にイノシンの存在を同定するための例示的な適切な方法は、ＲＴ－ＰＣＲおよびシーケンシングである。

標的アデノシンの脱アミノ化の作用には、例えば、得られるタンパク質の点突然変異、早期終止コドン、異常なスプライス部位、選択的スプライス部位、およびミスフォールディングが含まれる。これらの作用は、遺伝子遺伝するか後天的な遺伝子変異によって引き起こされるかにかかわらず、疾患に関連するＲＮＡおよび／またはタンパク質の構造的および機能的変化を誘発し得る。あるいは、薬剤耐性の発生に関連するＲＮＡおよび／またはタンパク質の構造的および機能的変化を誘発し得る。したがって、本願のｄＲＮＡ、ｄＲＮＡをコードする構築物、およびＲＮＡ編集方法は、疾患関連ＲＮＡおよび／またはタンパク質の構造および／または機能を変化させることによって、遺伝性の遺伝性疾患または障害、あるいは後天的な遺伝子変異に関連する疾患または障害の予防または治療に使用することができる。

いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは制御性ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、編集される標的ＲＮＡは、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、または低分子ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、またはｓｃａＲＮＡ）である。標的アデノシンの脱アミノ化の作用には、例えば、標的ＲＮＡの三次元構造の変化および／または機能の喪失もしくは機能の獲得を含む、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡまたは低分子ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）の構造的および機能的変化が含まれる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ中の標的Ａｓの脱アミノ化により、標的ＲＮＡの１つまたは複数の下流分子（例えば、タンパク質、ＲＮＡおよび／または代謝産物）の発現レベルが変化する。下流分子の発現レベルの変化は、発現レベルの増加または減少であり得る。

本願のいくつかの実施形態は、宿主細胞における標的ＲＮＡの多重編集を含み、これは、宿主細胞における標的遺伝子または異なる遺伝子の異なる変異体をスクリーニングするのに有用である。いくつかの実施形態では、該方法は、複数のｄＲＮＡを宿主細胞に導入することを含み、複数のｄＲＮＡのうちの少なくとも２つのｄＲＮＡは異なる配列を有し、および／または異なる標的ＲＮＡを有する。いくつかの実施形態では、各ｄＲＮＡは、異なる配列および／または異なる標的ＲＮＡを有する。いくつかの実施形態では、該方法は、宿主細胞内の単一の標的ＲＮＡにおいて複数（例えば、少なくとも２、３、５、１０、５０、１００、１０００またはそれ以上）の修飾を生成する。いくつかの実施形態では、該方法は、宿主細胞内の複数（例えば、少なくとも２、３、５、１０、５０、１００、１０００またはそれ以上）の標的ＲＮＡに修飾を生じさせる。いくつかの実施形態では、該方法は、複数の宿主細胞集団における複数の標的ＲＮＡを編集することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞の各集団は、宿主細胞の他の集団とは異なるｄＲＮＡ、または異なる標的ＲＮＡを有するｄＲＮＡを受け取る。

ＩＩＩ．デアミナーゼリクルートＲＮＡ、構築物、及びライブラリー
本明細書は、本明細書に記載のいずれかの方法のためのデアミナーゼリクルートＲＮＡ又は構築物をさらに提供する。このセクションに記載されるｄＲＮＡまたは構築物のいずれか１つが、本明細書に記載されるＲＮＡ編集および治療の方法に使用され得る。ｄＲＮＡまたは構築物について本明細書に記載される特徴およびパラメータのいずれも、あたかもすべての組み合わせが個別に記載されているかのように、互いに組み合わせることができることが意図されている。本明細書に記載されるｄＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系で使用されるｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡを含まない。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含む、ＡＤＡＲをリクルートすることによって標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するためのデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）が提供される。

一態様では、本発明は、本明細書に記載のデアミナーゼリクルートＲＮＡのいずれか１つを含む構築物を提供する。特定の実施形態では、構築物はウイルスベクター（レンチウイルスベクターなど）またはプラスミドである。いくつかの実施形態では、構築物は単一のｄＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、構築物は複数（例えば、約１、２、３、４、５、１０、２０またはそれ以上のいずれか１つ）のｄＲＮＡをコードする。
一態様では、本願は、本明細書に記載の複数のデアミナーゼリクルートＲＮＡまたは複数の構築物を含むライブラリーを提供する。

一態様では、本願は、本明細書に記載のデアミナーゼリクルートＲＮＡまたは構築物を含む組成物または宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞は原核細胞または真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はヒト細胞である。

環状ｄＲＮＡ及び構築物
一態様では、本明細書は、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルート可能であり、ｄＲＮＡは、環状であるか、又は宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）を提供する。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である線状ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、Ｔｏｒｎａｄｏ方法によって環状化される。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ転写物は、５’及び／又は３’ライゲーション配列にも隣接し、次に、それぞれ５’－ツイスターリボザイム及び／又は３’－ツイスターリボザイムに隣接する。いくつかの実施形態では、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列は、互いに少なくとも部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列は、互いに少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％相補的である。いくつかの実施形態では、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列は、互いに完全に相補的である。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼによって環状化される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼは、宿主細胞内で内因的に発現される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼは、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢは、宿主細胞内で内因的に発現される。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、インビトロで酵素によるライゲーション（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡリガーゼ又はスプライシングを使用して）又は化学ライゲーション（例えば、臭化シアン又は類似の縮合剤を使用して）によって環状化される。

本明細書は、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物をさらに提供する。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物によってｄＲＮＡを導入する。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列と、ｄＲＮＡをコードする核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、３’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、５’ツイスター配列はツイスターＰ１である。いくつかの実施形態では、５’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、３’ツイスター配列はツイスターＰ１である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは自己触媒切断を受ける。いくつかの実施形態では、触媒のｄＲＮＡ産物は、３’末端に５’－ヒドロキシ及び２’，３’－環状リン酸エステルを含む。いくつかの実施形態では、触媒的ｄＲＮＡ産物は、遍在する内因性ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢ）によって連結される。いくつかの実施形態では、構築物は、プラスミド、又はウイルスベクターである。

１つ又は２つのｓｎｏＲＮＡ末端を有するｄＲＮＡ、及び構築物
別の態様では、本明細書は、標的ＲＮＡを編集するためのデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、（１）標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端にある核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルート可能である、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）を提供する。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１１０ヌクレオチド、少なくとも約１２０ヌクレオチド、少なくとも約１３０ヌクレオチド、少なくとも約１４０ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１６０ヌクレオチド、少なくとも約１７０ヌクレオチド、少なくとも約１８０ヌクレオチド、少なくとも約１９０ヌクレオチド、又は少なくとも約２００ヌクレオチド。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは約５０～７５ヌクレオチド、約７５～１００ヌクレオチド、約１００～１２５ヌクレオチド、約１２５～１５０ヌクレオチド、約１５０～１７５ヌクレオチド、約１７５～２００ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、約１００～１５０ヌクレオチド、約１５０～２００ヌクレオチド、約１２５～１７５ヌクレオチド、又は約１００～２００ヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、３’ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、５’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｈ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、複合Ｃ／ＤＢｏｘとＨ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、オーファンｓｎｏＲＮＡ配列である。

ＰｏｌＩＩプロモーターを有する構築物
別の態様では、本明細書は、宿主細胞に入るデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築物であって、（１）ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、（２）ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルート可能であり、（３）構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、構築物を提供する。

いくつかの実施形態では、ＰｏｌＩＩプロモーターは、プロモーターがコードヌクレオチド配列の転写または発現を制御するように、コードヌクレオチド配列に作動可能に連結される。ＰｏｌＩＩプロモーターは、その制御下でコードヌクレオチド配列の５’（上流）に位置し得る。ＰｏｌＩＩプロモーターとコード配列との間の距離は、そのプロモーターと、そのプロモーターが由来する遺伝子においてそのプロモーターが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。いくつかの実施形態では、構築物は、コードヌクレオチド配列の転写または発現を調節する５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＰｏｌＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３の核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、１つのＰｏｌＩＩプロモーター（例えば、ＣＭＶ）が、２つ以上のｄＲＮＡの発現を駆動している。

本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築物、ライブラリー又は組成物のいずれかによるいくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の編集される標的アデノシンに直接対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含む。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、１つ又は複数のグアノシンをさらに含み、それぞれは標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに直接対向する。特定の実施形態では、標的アデノシン残基の５’最近傍は、Ｕ、Ｃ、Ａ及びＧから選択されるヌクレオチドであり、好ましくはＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、標的アデノシン残基の３’最近傍は、Ｇ、Ｃ、Ａ及びＵから選択されるヌクレオチドであり、好ましくはＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。いくつかの実施形態では、標的アデノシン残基の５’最近傍はＵである。いくつかの実施形態では、標的アデノシン残基の５’最近傍はＣ又はＡである。いくつかの実施形態では、標的アデノシン残基の３’最近傍はＧである。いくつかの実施形態では、標的アデノシン残基の３’最近傍はＣである。

本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築物、ライブラリー又は組成物のいずれかによるいくつかの実施形態では、標的アデノシン残基は、標的ＲＮＡ中のＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵから選択される３塩基モチーフ内にある。いくつかの実施形態では、３塩基モチーフはＵＡＧであり、ｄＲＮＡは、３塩基モチーフ内のＵに直接対向するＡ、標的Ａに直接対向するＣ、及び３塩基モチーフ内のＧに直接対向するＣ、Ｇ又はＵを含む。特定の実施形態では、３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中のＵＡＧであり、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ的ＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧ又はＡＣＵを含む。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基に直接対向するシチジンミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の中心に近い位置、例えば相補的ＲＮＡ配列の中心から２０、１５、１０、５、４、３、２又は１ヌクレオチド離れる位置にある。いくつかの実施形態では、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の５’末端少なくとも５ヌクレオチドから離れる。いくつかの実施形態では、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れる。

本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築物、ライブラリー又は組成物のいずれかによるいくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０個を超えるヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む。特定の実施形態では、ｄＲＮＡの長さは、約４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～１５０又は１０５～１４０ヌクレオチドのうちのいずれか１つである。

本願のｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含む。標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡに対して完全に相補的であるか、または実質的に相補的であり、標的化ＲＮＡ配列の標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションを可能にする。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと１００％の配列相補性を有する。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の少なくとも約２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、またはそれ以上のヌクレオチドの任意の１つの連続ストレッチにわたって、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ以上相補的である。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列と標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡは、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）の非ワトソン・クリック塩基対（すなわち、ミスマッチ）を有する。

ＡＤＡＲ、たとえば、ヒトＡＤＡＲ酵素は、多くの要因に応じて、さまざまな特異性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）構造を編集する。重要な要素の１つは、ｄｓＲＮＡ配列を構成する２本の鎖の相補性の程度である。ｄＲＮＡと標的ＲＮＡ間の完全な相補性により、通常、ＡＤＡＲの触媒ドメインが無差別にアデノシンを脱アミノ化する。ＡＤＡＲの特異性と効率は、ｄｓＲＮＡ領域にミスマッチを導入することによって修飾され得る。例えば、編集されるアデノシンの脱アミノ化の特異性と効率を高めるには、Ａ－Ｃミスマッチが推奨されることが好ましい。逆に、標的アデノシン残基以外の他のＡ（アデノシン）位置（すなわち、「非標的Ａ」）では、Ｇ－Ａミスマッチによりオフターゲット編集が減少し得る。ｄＲＮＡとその標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションおよびｄｓＲＮＡの形成に実質的な相補性があれば、ｄＲＮＡとその標的ＲＮＡとの間のｄｓＲＮＡ形成に完全な相補性は必ずしも必要ではない。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ配列またはその一本鎖ＲＮＡ領域は、最適にアラインメントされた場合、標的ＲＮＡに対して約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相補性のうちの少なくとも１つを有する。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、スミス・ウォーターマンアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、ニードルマン・ウィムシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、バロウズ・ウィーラー変換（Ｂｕｒｒｏｗｓ－ＷｈｅｅｌｅｒＴｒａｎｓｆｏｒｍ）に基づくアルゴリズム（例えば、バロウズ・ウィーラー・アライナー）が挙げられる。

標的アデノシンに隣接するヌクレオチドも、脱アミノ化の特異性と効率に影響を与える。例えば、アデノシンの脱アミノ化の特異性と効率の観点から、標的ＲＮＡ配列内で編集される標的アデノシンの５’最近傍は好ましくはＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、標的ＲＮＡ配列内で編集される標的アデノシンの３’最近傍は好ましくはＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。いくつかの実施形態では、標的アデノシンが、標的ＲＮＡ中のＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡおよびＧＡＵからなる群から選択される３塩基モチーフにあり得る場合、アデノシンの脱アミノ化の特異性および効率は、他の３塩基モチーフにおけるアデノシンよりも高い。いくつかの実施形態では、編集される標的アデノシンが３塩基モチーフＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＡＡＧ、ＡＡＣまたはＡＡＡ内にある場合、アデノシンの脱アミノ化の効率は、他のモチーフ内のアデノシンよりもはるかに高い。同じ３塩基モチーフでも、ｄＲＮＡの設計が異なると脱アミノ効率も異なる場合がある。３塩基モチーフＵＡＧを例に挙げると、いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、編集される標的アデノシンに直接対向するシチジン（Ｃ）、ウリジンに直接対向するアデノシン（Ａ）、およびグアノシンに直接対向するシチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）を含む場合、標的アデノシンの脱アミノ化の効率は、他のｄＲＮＡ配列を使用する場合よりも高い。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧ、またはＡＣＵを含む場合、標的ＲＮＡのＵＡＧにおけるＡの編集効率は、約２５％～９０％（例えば、約２５％～８０％、２５％～７０％、２５％～６０％、２５％～５０％、２５％～４０％、または２５％～３０％）に達し得る。

標的アデノシンの他に、編集することが望ましくない１つまたは複数のアデノシンが標的ＲＮＡに存在する可能性がある。これらのアデノシンについては、編集効率を極力下げることが好ましい。本開示により、グアノシンが標的ＲＮＡにおけるアデノシンに直接対向する場合、脱アミノ化効率が著しく低下することが判明した。したがって、オフターゲットの脱アミノ化を減少させるために、標的ＲＮＡで編集される標的アデノシン以外の１つまたは複数のアデノシンに直接対向する１つまたは複数のグアノシンを含むようにｄＲＮＡを設計できる。

標的ＲＮＡ配列の編集に必要な特異性のレベルおよび効率は、さまざまな用途に応じて異なる。本特許出願の説明に従って、当業者は、必要に応じて標的ＲＮＡ配列に対して相補的または実質的に相補的な配列を有するｄＲＮＡを設計することができ、多少の試行錯誤を経て、所望の結果を得ることができる。本明細書で使用されるように、「ミスマッチ」という用語は、ワトソン・クリック塩基対規則に従って完全な塩基対を形成しない二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）内の対向するヌクレオチドを指す。ミスマッチ塩基対には、例えば、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｃ、Ｕ－Ｕ塩基対が含まれる。Ａ－Ｃマッチを例に挙げると、標的ＲＮＡ内の標的アデノシン残基が編集される場合、編集されるＡの反対側にＣを含むようにｄＲＮＡが設計され、標的ＲＮＡとｄＲＮＡの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡにＡ－Ｃミスマッチが生成される。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡは、ミスマッチを含まない。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡは、１つまたは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７つまたはそれ以上のミスマッチ（例えば、同じタイプまたは異なるタイプのミスマッチ）を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡは、１つまたは複数のミスマッチ、例えば、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－ＣおよびＵ－Ｕから選択される１、２、３、４、５、６、７種類のミスマッチを含む。

ｄＲＮＡと標的ＲＮＡの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡ内のミスマッチヌクレオチドはバルジを形成する可能性があり、これにより標的ＲＮＡの編集効率が向上する。ミスマッチによって形成されるバルジは１つ（標的アデノシンでのみ形成される）または複数存在する可能性がある。追加のバルジ誘発ミスマッチは、標的アデノシンの上流および／または下流にあり得る。バルジは、単一ミスマッチバルジ（１つのミスマッチ塩基対によって引き起こされる）またはマルチミスマッチバルジ（２つ以上の連続したミスマッチ塩基対、例えば、２つまたは３つの連続したミスマッチ塩基対によって引き起こされる）であり得る。

ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列は一本鎖である。ｄＲＮＡは、完全に一本鎖であってもよく、又は１つ又は複数の（例えば、１、２、３又はそれ以上）の二本鎖領域及び／又は１つ又は複数のステムループを含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的化ＲＮＡ配列は、少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又はそれ以上のヌクレオチドのうちのいずれか１つである。特定の実施形態では、標的化ＲＮＡ配列の長さは、約４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１６０、１１０～１７５、１１０～１５０、１４０～１６０、１０５～１４０又は１０５～１５５ヌクレオチドのうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡ中の標的化ＲＮＡ配列の長さは、約７１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡの長さは、約１１１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡの長さは、約１５１ヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、標的化ＲＮＡ配列とは別に、ｄＲＮＡを安定化するための領域、例えば、１つまたは複数の二本鎖領域および／またはステムループ領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡの二本鎖領域またはステムループ領域は、約２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、１０以下の塩基対のいずれか１つ以下を含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡはステムループまたは二本鎖領域を含まない。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲリクルートドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲリクルートドメインを含まない。

ｄＲＮＡは、１つ又は複数の修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、核酸塩基修飾および／または主鎖修飾を含む、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを有する。ＲＮＡに対する例示的な修飾には、ホスホロチオエート主鎖修飾、リボースの２’－置換（２’－Ｏ－メチルおよび２’－フルオロ置換など）、ＬＮＡ、およびＬ－ＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、核酸塩基または主鎖に修飾を有していない。

本願はまた、本明細書に記載のｄＲＮＡを含む構築物を企図しており、これには、上記のセクションに記載の構築物のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「構築物」という用語は、ＲＮＡに転写され得る、またはタンパク質に発現され得るコードヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、構築物は、ＲＮＡまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された１つまたは複数の調節エレメントを含む。構築物が宿主細胞に導入されると、適切な条件下で、構築物中のコードヌクレオチド配列が転写または発現され得る。

いくつかの実施形態では、構築物は、プロモーターがコードヌクレオチド配列の転写または発現を制御するように、コードヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、その制御下でコードヌクレオチド配列の５’（上流）に位置し得る。プロモーターとコード配列との間の距離は、そのプロモーターと、そのプロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。いくつかの実施形態では、構築物は、コードヌクレオチド配列の転写または発現を調節する５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターはＵ６プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、上記のセクションで説明したように、ＰｏｌｙＩＩプロモーターである。

いくつかの実施形態では、構築物は、本願に開示されるｄＲＮＡのいずれか１つをコードするベクターである。「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターには、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖の核酸分子；１つまたは複数の自由末端を含み、自由末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；および当技術分野で知られている他の種類のポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術などによって追加のＤＮＡセグメントを挿入できる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されているコードヌクレオチド配列の転写または発現を指示することができる。このようなベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。

組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の転写または発現に適した形態で本願の核酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、組換え発現ベクターは、転写または発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る、転写または発現される核酸配列に作動可能に連結される、１つまたは複数の調節エレメントを含む。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にするように（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入されるときの宿主細胞において）調節エレメントに連結されていることを意味することを意図する。

いくつかの実施形態では、ベクターはｒＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型由来のベクターで、ＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、又はマウスＡＡＶキャプシド血清型などを含んでもよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、又はマウスＡＡＶキャプシド血清型などのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ中の核酸はさらに本明細書に記載のｄＲＮＡをコードする。任意のＡＡＶ血清型の使用は、本開示の範囲内であるとみなされる。いくつかの実施形態では、ベクターはｒＡＡＶ粒子内にキャプシド化される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶ２Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２Ｖ７０８Ｋ、ＡＡＶ２－ＨＢＫＯ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶＢＲ１、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１７、ヤギＡＡＶ、キメラＡＡＶ１／ＡＡＶ２、牛ＡＡＶ、マウスＡＡＶ、又はｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。

いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む構築物（例えば、ベクター、例えばウイルスベクター）を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む構築物（例えば、ベクター、例えばウイルスベクター）を提供する。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡをコードする第１ヌクレオチド配列及びＡＤＡＲをコードする第２ヌクレオチド配列を含む構築物を提供する。いくつかの実施形態では、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列は、同一プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列は、異なるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導型のものである。いくつかの実施形態では、構築物はＡＤＡＲをコードしない。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＤＡＲ３阻害剤（例えば、ＡＤＡＲ３ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）及び／又はインターフェロン刺激剤（例えば、ＩＦＮ－α）をコードする核酸配列をさらに含む。

ＩＶ．治療方法
本明細書に記載のＲＮＡ編集方法および組成物は、遺伝性遺伝子疾患および薬剤耐性を含むがこれらに限定されない個体の疾患または状態を治療または予防するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、個体（例えば、ヒト個体）の細胞内で標的ＲＮＡをエクスビボで編集する方法であって、本明細書に記載されるＲＮＡ編集方法のいずれか１つにより標的ＲＮＡを編集することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体（例えば、ヒト個体）の細胞内で標的ＲＮＡをエクスビボで編集する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の細胞に導入することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体（例えば、ヒト個体）の細胞内で標的ＲＮＡをエクスビボで編集する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の細胞に導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体（例えば、ヒト個体）の細胞内で標的ＲＮＡをエクスビボで編集する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の細胞に導入することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは内因的に発現される。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を細胞に導入することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは個体の疾患又は障害に関連している。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、遺伝性の遺伝子疾患、又は１種又は複数種の後天的遺伝子変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患又は障害である。いくつかの実施形態では、該方法は、個体から細胞を得ることをさらに含む。

いくつかの実施形態では、個体（例えば、ヒト個体）の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法によって個体の細胞内で疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体（例えば、ヒト個体）の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の単離細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体（例えば、ヒト個体）の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体（例えば、ヒト個体）の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、単離細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を単離細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、編集ＲＮＡを持つ細胞を培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、個体へ編集ＲＮＡを持つ細胞を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、遺伝性の遺伝子疾患、又は１種又は複数種の後天的遺伝子変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患又は障害である。

いくつかの実施形態では、個体（例えば、ヒト個体）の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体（例えば、ヒト個体）の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体（例えば、ヒト個体）の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、個体の細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、遺伝性の遺伝子疾患、又は１種又は複数種の後天的遺伝子変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患又は障害である。

本願の方法を用いて治療するのに適している疾患及び障害には、変異に関連する疾患、例えばＧからＡへの変異、例えば、ＲＮＡ転写物中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常スプライシング若しくは選択的スプライシングを生じさせるＧからＡへの変異が含まれる。本願の方法で回復させ得る疾患関連変異の例としては、癌に関連するＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ（例えば、１５８Ｇ＞Ａ）、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）に関連するＩＤＵＡ^{Ｗ４０２Ｘ}（例えば、エクソン９中のＴＧＧ＞ＴＡＧ変異）、エーラス・ダンロス症候群に関連するＣＯＬ３Ａ１^{Ｗ１２７８Ｘ}（例えば、３８３３Ｇ＞Ａ変異）、原発性肺高血圧症に関連するＢＭＰＲ２^{Ｗ２９８Ｘ}（例えば、８９３Ｇ＞Ａ）、ジュベール症候群に関連するＡＨＩ１^{Ｗ７２５Ｘ}（例えば、２１７４Ｇ＞Ａ）、ファンコニ貧血に関連するＦＡＮＣＣ^{Ｗ５０６Ｘ}（例えば、１５１７Ｇ＞Ａ）、原発性家族性肥大型心筋症に関連するＭＹＢＰＣ３^{Ｗ１０９８Ｘ}（例えば、３２９３Ｇ＞Ａ）、Ｘ連鎖重度複合免疫不全症に関連するＩＬ２ＲＧ^{Ｗ２３７Ｘ}（例えば、７１０Ｇ＞Ａ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、癌である。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、単一遺伝子疾患である。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、多遺伝子性の疾患である。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連する癌を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の単離細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連する癌を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連する癌を治療する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、単離細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を単離細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ（例えば、１５８Ｇ＞Ａ）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４（５’－ＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＵＣＵＧＧＣＡＵＵＣＵＧＧＧＡＧＣＵＵＣＡＵＣＵＧＧＡＣＣＵＧＧＧＵＣＵＵＣＡＧＵＧＡＡＣＣＡＵＵＧＵＵＣＡＡＵＡＵＣＧＵＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＡＵＣＡＡＡＵＣＡＵＣＣＡＵＵＧＣＵＵＧＧＧＡＣＧＧＣＡＡ－３’）の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いて癌を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いて癌を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いて癌を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、個体の細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ（例えば、１５８Ｇ＞Ａ）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連するＭＰＳＩ（例えば、Ｈｕｒｌｅｒ症候群又はＳｃｈｅｉｅ症候群）を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の単離細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連するＭＰＳＩ（例えば、Ｈｕｒｌｅｒ症候群又はＳｃｈｅｉｅ症候群）を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連するＭＰＳＩ（例えば、Ｈｕｒｌｅｒ症候群又はＳｃｈｅｉｅ症候群）を治療する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、単離細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を単離細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＩＤＵＡ^{Ｗ４０２Ｘ}（例えば、エクソン９中のＴＧＧ＞ＴＡＧ変異）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：５（5’-GACGCCCACCGUGUGGUUGCUGUCCAGGACGGUCCCGGCCUGCGACACUUCGGCCCAGAGCUGCUCCUCAUCUGCGGGGCGGGGGGGGGCCGUCGCCGCGUGGGGUCGUUG-3’）の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてＭＰＳＩ（例えば、Ｈｕｒｌｅｒ症候群又はＳｃｈｅｉｅ症候群）を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてＭＰＳＩ（例えば、Ｈｕｒｌｅｒ症候群又はＳｃｈｅｉｅ症候群）を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてＭＰＳＩ（例えば、Ｈｕｒｌｅｒ症候群又はＳｃｈｅｉｅ症候群）を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、個体の細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＩＤＵＡ^{Ｗ４０２Ｘ}（例えば、エクソン９中のＴＧＧ＞ＴＡＧ変異）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：５の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連する疾患又は障害であるエーラス・ダンロス症候群を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の単離細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連する疾患又は障害であるエーラス・ダンロス症候群を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連する疾患又は障害であるエーラス・ダンロス症候群を治療する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、単離細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を単離細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＣＯＬ３Ａ１^{Ｗ１２７８Ｘ}（例えば、３８３３Ｇ＞Ａ変異）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６（5’-CAUAUUACAGAAUACCUUGAUAGCAUCCAAUUUGCAUCCUUGGUUAGGGUCAACCCAGUAUUCUCCACUCUUGAGUUCAGGAUGGCAGAAUUUCAGGUCUCUGCAGUUUCU-3’）の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてエーラス・ダンロス症候群を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてエーラス・ダンロス症候群を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてエーラス・ダンロス症候群を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、個体の細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＣＯＬ３Ａ１^{Ｗ１２７８Ｘ}（例えば、３８３３Ｇ＞Ａ変異）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連する原発性肺高血圧症を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の単離細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連する原発性肺高血圧症を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連する原発性肺高血圧症を治療する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、単離細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を単離細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＢＭＰＲ２^{Ｗ２９８Ｘ}（例えば、８９３Ｇ＞Ａ）。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：７（5’-GUGAAGAUAAGCCAGUCCUCUAGUAACAGAAUGAGCAAGACGGCAAGAGCUUACCCAGUCACUUGUGUGGAGACUUAAAUACUUGCAUAAAGAUCCAUUGGGAUAGUACUC-3’）の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いて原発性肺高血圧症を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いて原発性肺高血圧症を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いて原発性肺高血圧症を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡの有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、個体の細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＢＭＰＲ２^{Ｗ２９８Ｘ}（例えば、８９３Ｇ＞Ａ）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：７の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連するジュベール症候群を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の単離細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連するジュベール症候群を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連するジュベール症候群を治療する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、単離細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を単離細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＡＨＩ１^{Ｗ７２５Ｘ}（例えば、２１７４Ｇ＞Ａ）。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：８（5’-GUGAACGUCAAACUGUCGGACCAAUAUGGCAGAAUCUUCUCUCAUCUCAACUUUCCAUAUCCGUAUCAUGGAAUCAUAGCAUCCUGUAACUACUAGCUCUCUUACAGCUGG-3’）の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてジュベール症候群を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてジュベール症候群を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてジュベール症候群を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、個体の細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはＡＨＩ１^{Ｗ７２５Ｘ}（例えば、２１７４Ｇ＞Ａ）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：８の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連するファンコニ貧血を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の単離細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連するファンコニ貧血を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連するファンコニ貧血を治療する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、単離細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を単離細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはＦＡＮＣＣ^{Ｗ５０６Ｘ}（例えば、１５１７Ｇ＞Ａ）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：９（5’-GCCAAUGAUCUCGUGAGUUAUCUCAGCAGUGUGAGCCAUCAGGGUGAUGACAUCCCAGGCGAUCGUGUGGCCUCCAGGAGCCCAGAGCAGGAAGUUGAGGAGAAGGUGCCU-3’）の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてファンコニ貧血を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてファンコニ貧血を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてファンコニ貧血を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、個体の細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＦＡＮＣＣ^{Ｗ５０６Ｘ}（例えば、１５１７Ｇ＞Ａ）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：９の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連する原発性家族性肥大型心筋症を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の単離細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連する原発性家族性肥大型心筋症を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連する原発性家族性肥大型心筋症を治療する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、単離細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を単離細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＭＹＢＰＣ３^{Ｗ１０９８Ｘ}（例えば、３２９３Ｇ＞Ａ）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０（5’-CAAGACGGUGAACCACUCCAUGGUCUUCUUGUCGGCUUUCUGCACUGUGUACCCCCAGAGCUCCGUGUUGCCGACAUCCUGGGGUGGCUUCCACUCCAGAGCCACAUUAAG-3’）の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いて原発性家族性肥大型心筋症を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いて原発性家族性肥大型心筋症を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いて原発性家族性肥大型心筋症を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、個体の細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＭＹＢＰＣ３^{Ｗ１０９８Ｘ}（例えば、３２９３Ｇ＞Ａ）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連するＸ連鎖重度複合免疫不全症を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の単離細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連するＸ連鎖重度複合免疫不全症を治療する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡに関連するＸ連鎖重度複合免疫不全症を治療する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を個体の単離細胞にエクスビボで導入することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、単離細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を単離細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＩＬ２ＲＧ^{Ｗ２３７Ｘ}（例えば、７１０Ｇ＞Ａ）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１（5’-AGGAUUCUCUUUUGAAGUAUUGCUCCCCCAGUGGAUUGGGUGGCUCCAUUCACUCCAAUGCUGAGCACUUCCACAGAGUGGGUUAAAGCGGCUCCGAACACGAAACGUGUA-3’）の核酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてＸ連鎖重度複合免疫不全症を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は個体の細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてＸ連鎖重度複合免疫不全症を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、個体において変異（例えば、Ｇ＞Ａ変異）を持つ標的ＲＮＡを用いてＸ連鎖重度複合免疫不全症を治療又は予防する方法であって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物の有効量を個体に投与することを含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、個体の細胞内で内因的に発現されるＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＩＬ２ＲＧ^{Ｗ２３７Ｘ}（例えば、７１０Ｇ＞Ａ）である。いくつかの実施形態では、ｄＲＮＡは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１の核酸配列からなる。

一般に、組成物（例えば、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物）の投与量、スケジュール、および投与経路は、個体のサイズおよび状態に従って、および標準的な薬務（薬学的実務）に従って決定され得る。例示的な投与経路には、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、膀胱内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、くも膜下腔内、または経皮が含まれる。

本願のＲＮＡ編集方法は、動物細胞、例えば哺乳動物細胞において使用できるだけでなく、植物または真菌、例えば内因的に発現したＡＤＡＲを有する植物または真菌のＲＮＡの修飾にも使用することができる。本明細書に記載の方法を使用して、特性が改善された遺伝子操作植物および真菌を生成することができる。

本明細書に記載の治療方法は、線状ＲＮＡ前駆体から環状ｄＲＮＡをインビトロで調製する１つ又は複数のステップをさらに含んでもよい。さらに、本明細書に記載の治療方法のいずれか１つにおいて使用するための、本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築物、編集ＲＮＡを有する細胞、および組成物のいずれか１つ、ならびに疾患または症状を治療するための薬剤の製造における本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築物、編集された細胞、および組成物のいずれか１つの使用が提供される。

Ｖ．組成物、キット、及び製品
本明細書では、本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築物、ライブラリー、または編集ＲＮＡを有する宿主細胞のいずれか１つを含む組成物（薬学的組成物など）も提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築物のいずれか１つと、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤とを含む医薬組成物が提供される（『レミントン薬学』（Remington's Pharmaceutical Sciences)第16版,Osol, A.編集(1980)）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度ではレシピエントに対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸やメチオニンなどの抗酸化物質；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥製剤が提供される。インビボ投与に使用される医薬組成物は無菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。

本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築物、組成物、ライブラリー又は編集宿主細胞のいずれかを含む、本明細書に記載のいずれかのＲＮＡ編集方法又は治療方法に用いられるキットも提供される。

いくつかの実施形態では、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのキットであって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、ｄＲＮＡは環状ＲＮＡであるか、又は宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、キットを提供する。

いくつかの実施形態では、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのキットであって、ｄＲＮＡ又はｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を含み、ｄＲＮＡは、（１）標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列と、（２）標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、キットを提供する。

いくつかの実施形態では、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのキットであって、環状ｄＲＮＡをインビトロで製造するための線状ＲＮＡ又はその構築物を含み、ｄＲＮＡは、疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして宿主細胞内の標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができる、キットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、環状ｄＲＮＡを例えばスプライシング又はライゲーションによりインビトロ製造するためのプロトコールをさらに提供する。いくつかの実施形態では、キットは、リガーゼ（例えば、Ｔ４Ｒｎｌ１又はＴ４Ｒｎｌ２）をさらに含む。

いくつかの実施形態では、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのキットであって、ｄＲＮＡをコードする核酸を含有する構築物を含み、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする標的化ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的アデノシン残基を脱アミノ化することができ、構築物は、ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、キットを提供する。

いくつかの実施形態では、キットは、ＡＤＡＲ又はＡＤＡＲをコードする核酸を含む構築物をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＡＤＡＲ３阻害剤又はその構築物をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、インターフェロン刺激剤又はその構築物をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法又は治療方法のいずれか１つを行うためのプロトコールをさらに含む。

本願のキットは、適切な包装に入っている。適切な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟な包装（例えば、密封されたマイラーまたはビニール袋）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは、トランスフェクションまたは形質導入試薬、細胞培養培地、緩衝液、および解釈情報などの追加のコンポーネントを必要に応じて提供する場合がある。

したがって、本願は製品も提供する。製品は、容器と、容器上の、または容器に付随するラベルまたは添付文書とを備えることができる。適切な容器には、バイアル（密封バイアルなど）、ボトル、ジャー、柔軟な包装などが含まれる。いくつかの実施形態では、容器は医薬組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。医薬組成物を収容する容器は、再構成された製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする複数回使用できるバイアルであってもよい。添付文書とは、治療用製品の市販パッケージに慣例的に含まれる取扱書を指し、そのような製品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、禁忌および／または警告に関する情報が含まれている。また、製品は、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、およびブドウ糖溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２容器をさらに含んでもよい。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器など、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料を含んでもよい。

キットまたは製品は、薬局、例えば病院薬局および調剤薬局での保管および使用に十分な量で包装された、複数の単位用量の医薬組成物および使用説明書を含んでもよい。

以下の例示的な実施形態および実施例は、本願の例示的なものであることを意図しており、したがって、いかなる形でも本発明を限定するものとみなすべきではない。以下の例示的な実施形態、実施例および詳細な説明は、例示として提供されるものであり、限定として提供されるものではない。

例示的な実施形態
本願は、以下の実施形態を提供する。
１．宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又は前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を前記宿主細胞に導入することを含み、
（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートすることができ、
（３）前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は前記宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成可能である、方法。
２．前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
３．前記３’ライゲーション配列及び前記５’ライゲーション配列は、互いに少なくとも部分的に相補的である、実施形態２に記載の方法。
４．前記３’ライゲーション配列及び前記５’ライゲーション配列の長さは約２０～約７５ヌクレオチドである、実施形態２又は実施形態３に記載の方法。
５．前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢによって環状化される、実施形態１～４のいずれか１項に記載の方法。
６．前記ＲＮＡリガーゼＲｔｃＢは、前記宿主細胞内で内因的に発現される、実施形態４に記載の方法。
７．前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）である、実施形態１～６のいずれか１項に記載の方法。
８．前記ｄＲＮＡは、宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成できる線状ＲＮＡである、実施形態１～６のいずれか１項に記載の方法。
９．前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を前記宿主細胞に導入することを含む、実施形態１～６のいずれか１項に記載の方法。
１０．前記構築物は、前記ｄＲＮＡをコードする前記核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列、及び前記ｄＲＮＡをコードする前記核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列を含む、実施形態９に記載の方法。
１１．前記３’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、かつ前記５’ツイスター配列はツイスターＰ１である、実施形態１０に記載の方法。
１２．前記５’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、かつ前記３’ツイスター配列はツイスターＰ１である、実施形態１０に記載の方法。
１３．線状ＲＮＡをインビトロで使用して環状ＲＮＡを形成することを含む、実施形態７に記載の方法。
１４．前記線状ＲＮＡは、５’触媒グループＩイントロンフラグメントと３’触媒グループＩイントロンフラグメントを含むグループＩイントロンの自己触媒によって環状化される、実施形態１３に記載の方法。
１５．宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又は前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を前記宿主細胞に導入することを含み、
（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルート可能であり、
（３）前記ｄＲＮＡは、線状ＲＮＡを使用して５’触媒グループＩイントロンフラグメント及び３’触媒グループＩイントロンフラグメント的グループＩイントロンの自己触媒によってインビトロで形成される環状ＲＮＡである、方法。
１６．前記線状ＲＮＡは、前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントと前記５’触媒グループＩイントロンフラグメントを含み、前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントは、前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列の５’末端に隣接し、前記５’触媒グループＩイントロンフラグメントは、前記５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列の３’末端に隣接する、実施形態１４又は１５に記載の方法。
１７．前記線状ＲＮＡは、前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントの５’末端に隣接する５’相同配列と、前記５’触媒グループＩイントロンフラグメントの３’末端に隣接する３’相同配列と、を含む、実施形態１６に記載の方法。
１８．前記環状ＲＮＡの形成は、
（ａ）前記５’触媒グループＩイントロンフラグメント及び前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントの自己触媒を活性化する条件を前記線状ＲＮＡに曝さして環状化ＲＮＡ産物を提供することと、
（ｂ）前記環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、前記環状ＲＮＡを提供することと、を含む、実施形態１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
１９．前記線状ＲＮＡはリガーゼによって環状化される、実施形態１３に記載の方法。
２０．前記リガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４Ｄｎｌ）、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１（Ｔ４Ｒｎｌ１）、及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｔ４Ｒｎｌ２）から選択される、実施形態１９に記載の方法。
２１．前記線状ＲＮＡは、前記環状ＲＮＡをコードする前記核酸配列の５’末端に５’ライゲーション配列を含み、前記環状ＲＮＡをコードする核酸配列の３’末端に３’ライゲーション配列を含み、前記５’ライゲーション配列と前記３’ライゲーション配列は前記リガーゼを介して互いに連結可能である、実施形態１９又は２０に記載の方法。
２２．前記環状ＲＮＡの形成は、
（ａ）前記線状ＲＮＡを一本鎖アダプター核酸と接触させることであって、前記一本鎖アダプター核酸は、前記５’末端から前記３’末端まで、前記３’ライゲーション配列に相補的な第１配列と、前記５’ライゲーション配列に相補的な第２配列と、を含み、前記５’ライゲーション配列及び前記３’ライゲーション配列は、前記一本鎖アダプター核酸とハイブリダイズして、前記５’ライゲーション配列の前記３’末端と前記３’ライゲーション配列の前記５’末端との間の一本鎖切断を含む二本鎖核酸中間体を提供することと、
（ｂ）前記５’ライゲーション配列と前記３’ライゲーション配列とのライゲーションを可能にする条件下で、前記中間体をＲＮＡリガーゼと接触させて、環状化ＲＮＡ産物を提供することと、
（ｃ）前記環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、前記環状ＲＮＡを提供することと、を含む、実施形態２１に記載の方法。
２３．前記環状ＲＮＡの形成は、
（ａ）前記５’ライゲーション配列と前記３’ライゲーション配列とのライゲーションを可能にする条件下で、前記線状ＲＮＡをＲＮＡリガーゼと接触させて、環状化ＲＮＡ産物を提供することと、
（ｂ）前記環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、前記環状ＲＮＡを提供することと、を含む、実施形態２１に記載の方法。
２４．前記線状ＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸構築物をインビトロで転写することによって前記線状ＲＮＡを得る、及び／又は前記環状ＲＮＡを精製することをさらに含む、実施形態１３～２３のいずれか１項に記載の方法。
２５．宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又は前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を前記宿主細胞に導入することを含み、前記ｄＲＮＡは、
（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列と、
（２）前記標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端に連結された核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートすることができる、方法。
２６．前記ｄＲＮＡは、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む、実施形態２５に記載の方法。
２７．前記ｄＲＮＡは、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む、実施形態２５又は２６に記載の方法。
２８．前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、少なくとも約７０ヌクレオチドである、実施形態２５～２７のいずれか１項に記載の方法。
２９．前記３’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の核酸配列からなる、実施形態２５～２８のいずれか１項に記載の方法。
３０．前記５’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の核酸配列からなる、実施形態２５～２９のいずれか１項に記載の方法。
３１．前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態２５～３０のいずれか１項に記載の方法。
３２．前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｈ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態２５～３０のいずれか１項に記載の方法。
３３．前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、複合Ｃ／ＤＢｏｘとＨ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態２５～３０のいずれか１項に記載の方法。
３４．前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、オーファンｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態２５～３０のいずれか１項に記載の方法。
３５．前記方法は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を前記宿主細胞に導入することを含む、実施形態２５～３４のいずれか１項に記載の方法。
３６．前記構築物は、前記ｄＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、実施形態９～１２、及び２５のいずれか１項に記載の方法。
３７．前記プロモーターはポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）である、実施形態３６に記載の方法。
３８．宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築物を前記宿主細胞に導入することを含み、
（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルート可能であり、
（３）前記構築物は、前記ｄＲＮＡをコードする前記核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、方法。
３９．前記ＰｏｌＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである、実施形態３７又は３８に記載の方法。
４０．前記ＣＭＶプロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：３の核酸配列からなる、実施形態３９に記載の方法。
４１．前記構築物は、ウイルスベクター又はプラスミドである、実施形態９～１２、及び２５～４０のいずれか１項に記載の方法。
４２．前記構築物は、ＡＡＶベクターである、実施形態４１に記載の方法。
４３．前記ＡＤＡＲは、前記宿主細胞によって内因的に発現される、実施形態１～４２のいずれか１項に記載の方法。
４４．前記宿主細胞はＴ細胞である、実施形態４３に記載の方法。
４５．前記標的化ＲＮＡ配列の長さは、５０ヌクレオチドを超える、実施形態１～４４のいずれか１項に記載の方法。
４６．前記標的化ＲＮＡ配列の長さは、約１００～約１５０ヌクレオチドである、実施形態４５に記載の方法。
４７．前記標的化ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンに直接対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含む、実施形態１～４６のいずれか１項に記載の方法。
４８．前記標的化ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンに直接対向するシチジンミスマッチを含む、実施形態４７に記載の方法。
４９．前記シチジンミスマッチは、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れる位置、及び前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド離れる位置にある、実施形態４８に記載の方法。
５０．前記標的化ＲＮＡ配列は、１つ又は複数のグアノシンをさらに含み、前記グアノシンは、それぞれ前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する、実施形態１～４９のいずれか１項に記載の方法。
５１．前記標的化ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続したミスマッチヌクレオチドを含む、実施形態１～５０のいずれか１項に記載の方法。
５２．前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの５’最近傍は、Ｕ、Ｃ、Ａ及びＧから選択されるヌクレオチドであり、好ましくはＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの３’最近傍は、Ｇ、Ｃ、Ａ及びＵから選択されるヌクレオチドであり、好ましくはＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである、実施形態１～５１のいずれか１項に記載の方法。
５３．前記標的アデノシンは、前記標的ＲＮＡ中のＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵから選択される３塩基モチーフ内にある、実施形態１～５２のいずれか１項に記載の方法。
５４．前記３塩基モチーフはＵＡＧであり、前記標的化ＲＮＡは、前記３塩基モチーフ内のウリジンに直接対向するＡ、前記標的アデノシンに直接対向するシチジン、及び前記３塩基モチーフ内のグアノシンに直接対向するシチジン、グアノシン又はウリジンを含む、実施形態５３に記載の方法。
５５．前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡから選択されるＲＮＡである、実施形態１～５４のいずれか１項に記載の方法。
５６．前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡである、実施形態５５に記載の方法。
５７．ＡＤＡＲ３阻害剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態１～５６のいずれか１項に記載の方法。
５８．インターフェロン刺激剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態１～５７のいずれか１項に記載の方法。
５９．それぞれが異なる標的ＲＮＡを標的化する複数のｄＲＮＡ又は構築物を導入することを含む、実施形態１～５８のいずれか１項に記載の方法。
６０．前記標的ＲＮＡの編集効率は少なくとも４０％である、実施形態１～５９のいずれか１項に記載の方法。
６１．前記構築物又は前記ｄＲＮＡ免疫応答を誘導しない、実施形態１～６０のいずれか１項に記載の方法。
６２．ＡＤＡＲ（例えば、外因性ＡＤＡＲ）を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態１～６１のいずれか１項に記載の方法。
６３．前記ＡＤＡＲは、Ｅ１００８変異を含むＡＤＡＲ１である、実施形態６２に記載の方法。
６４．前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常スプライシング若しくは選択的スプライシング、又は前記標的ＲＮＡ中ミスセンス変異、早期終止コドン、異常スプライシング若しくは選択的スプライシングの逆転を生じさせる、実施形態１～６３のいずれか１項に記載の方法。
６５．前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質的点変異、トゥランケイション、伸長及び／又はミスフォールディング、あるいは前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常スプライシング若しくは選択的スプライシングの逆転による機能的な、完全長の、正しくフォールディングされた及び／又は野生型タンパク質を生じさせる、実施形態６４に記載の方法。
６６．前記宿主細胞は真核細胞である、実施形態１～６５のいずれか１項に記載の方法。
６７．前記宿主細胞は哺乳動物細胞である、実施形態６６に記載の方法。
６８．前記宿主細胞はヒト又はマウス細胞である、実施形態６７に記載の方法。
６９．実施形態１～６８のいずれか１項に記載の方法によって産生される編集ＲＮＡ又は編集ＲＮＡを有する宿主細胞。
７０．個体の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、実施形態１～６９のいずれか１項に記載の方法によって前記個体の細胞内で前記疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、方法。
７１．前記疾患又は障害は、遺伝性の遺伝子疾患又は１種又は複数種の後天的遺伝子変異に関連する疾患又は障害である、実施形態７０に記載の方法。
７２．前記標的ＲＮＡは、ＧからＡへの変異を持つ、実施形態７０又は７１に記載の方法。
７３．疾患又は障害は、単一遺伝子疾患又は障害である、実施形態７０～７２のいずれか１項に記載の方法。
７４．前記疾患又は障害は、多遺伝子性の疾患又は障害である、実施形態７０～７３のいずれか１項に記載の方法。
７５．（ｉ）前記標的ＲＮＡはＴＰ５３であり、前記疾患又は障害は癌であり、
（ｉｉ）前記標のＲＮＡはＩＤＵＡであり、前記疾患又は障害はムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）であり、
（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡはＣＯＬ３Ａ１であり、前記疾患又は障害は、エーラス・ダンロス症候群であり、
（ｉｖ）前記標的ＲＮＡはＢＭＰＲ２であり、前記疾患又は障害はジュベール症候群であり、
（ｖ）前記標的ＲＮＡはＦＡＮＣＣであり、前記疾患又は障害はファンコニ貧血であり、
（ｖｉ）前記標的ＲＮＡはＭＹＢＰＣ３であり、前記疾患又は障害は原発性家族性肥大型心筋症であり、又は
（ｖｉｉ）前記標的ＲＮＡはＩＬ２ＲＧであり、前記疾患又は障害は、Ｘ連鎖重度複合免疫不全症である、実施形態７０～７４のいずれか１項に記載の方法。
７６．宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルート可能であり、前記ｄＲＮＡは、環状であるか、又は前記宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成することができる、ｄＲＮＡ。
７７．前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列及び５’ライゲーション配列をさらに含む、実施形態７６に記載のｄＲＮＡ。
７８．前記３’ライゲーション配列及び前記５’ライゲーション配列は、互いに少なくとも部分的に相補的である、実施形態７７に記載のｄＲＮＡ。
７９．前記３’ライゲーション配列及び前記５’ライゲーション配列の長さは約２０～約７５ヌクレオチドである、実施形態７７又は７８に記載のｄＲＮＡ。
８０．前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである、実施形態７６に記載のｄＲＮＡ。
８１．前記ｄＲＮＡは、インビトロで線状ＲＮＡにより形成される環状ＲＮＡである、実施形態８０に記載のｄＲＮＡ。
８２．前記ｄＲＮＡは、前記宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成できる線状ＲＮＡである、実施形態７６～７９のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
８３．前記線状ＲＮＡは、５’触媒グループＩイントロンフラグメントと３’触媒グループＩイントロンフラグメントを含むグループＩイントロンの自己触媒によって環状化される、実施形態８１に記載のｄＲＮＡ。
８４．前記線状ＲＮＡは、前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントと前記５’触媒グループＩイントロンフラグメントを含み、前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントは、前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列の５’末端に隣接し、前記５’触媒グループＩイントロンフラグメントは、前記５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列の３’末端に隣接する、実施形態８３に記載のｄＲＮＡ。
８５．前記線状ＲＮＡは、前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントの５’末端に隣接する５’相同配列と、前記５’触媒グループＩイントロンフラグメントの３’末端に隣接する３’相同配列と、をさらに含む、実施形態８４に記載のｄＲＮＡ。
８６．前記線状ＲＮＡはリガーゼによって環状化される、実施形態８２に記載のｄＲＮＡ。
８７．前記リガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４Ｄｎｌ）、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１（Ｔ４Ｒｎｌ１）、及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｔ４Ｒｎｌ２）から選択される、実施形態８６に記載のｄＲＮＡ。
８８．前記線状ＲＮＡは、前記環状ｄＲＮＡをコードする前記核酸配列の５’末端に５’ライゲーション配列を含み、前記環状ｄＲＮＡをコードする前記核酸配列の３’末端に３’ライゲーション配列を含み、前記５’ライゲーション配列及び前記３’ライゲーション配列は、ＲＮＡリガーゼによって互いに連結されてもよい、実施形態８７に記載のｄＲＮＡ。
８９．実施形態８３～８８のいずれか１項に記載の環状ｄＲＮＡを形成可能である線状ＲＮＡ。
９０．実施形態７６～８８のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ又は実施形態８９に記載の線状ＲＮＡをコードする核酸を含む構築物。
９１．前記ｄＲＮＡをコードする前記核酸の３’末端に連結された３’ツイスターリボザイム配列と、前記ｄＲＮＡをコードする前記核酸の５’末端に連結された５’ツイスターリボザイム配列と、をさらに含む、実施形態９０に記載の構築物。
９２．前記３’ツイスター配列はツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記５’ツイスター配列はツイスターＰ１である、実施形態９１に記載の構築物。
９３．前記５’ツイスター配列は、ツイスターＰ３Ｕ２Ａであり、前記３’ツイスター配列はツイスターＰ１である、実施形態９２に記載の構築物。
９４．標的ＲＮＡを編集するためのデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、
（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列と、
（２）前記標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端にある核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、
前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルート可能である、ｄＲＮＡ。
９５．前記ｄＲＮＡは、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む、実施形態９４に記載のｄＲＮＡ。
９６．前記ｄＲＮＡは、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含む、実施形態９５に記載のｄＲＮＡ。
９７．前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、少なくとも約７０ヌクレオチドである、実施形態９４～９６のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
９８．前記３’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の核酸配列からなる、実施形態９６～９７のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
９９．前記５’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の核酸配列からなる、実施形態９５～９８のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
１００．前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態９４～９９のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
１０１．前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｈ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態９４～９９のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
１０２．前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、複合Ｃ／ＤＢｏｘとＨ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態９４～９９のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
１０３．前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、オーファンｓｎｏＲＮＡ配列である、実施形態９４～９９のいずれか１項に記載のｄＲＮＡ。
１０４．実施形態９４～１０３のいずれか１項に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物。
１０５．前記構築物は、前記ｄＲＮＡをコードする前記核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、実施形態９０～９３及び１０４のいずれか１項に記載の構築物。
１０６．前記プロモーターは、ポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）である、実施形態１０５に記載の構築物。
１０７．前記宿主細胞に入るデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築物であって、
（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルート可能であり、
（３）前記構築物は、前記ｄＲＮＡをコードする前記核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、構築物。
１０８．前記ＰｏｌＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである、実施形態１０６又は１０７に記載の構築物。
１０９．前記ＣＭＶプロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３の核酸配列からなる、実施形態１０８に記載の構築物。
１１０．ウイルスベクター又はプラスミドである、実施形態９０～９３、及び１０４～１０９のいずれか１項に記載の構築物。
１１１．ＡＡＶベクターである、実施形態１１０に記載の構築物。
１１２．、前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡから選択されるＲＮＡである、実施形態７６～８８、及び９０～１１１のいずれか１項に記載の構築物又はｄＲＮＡ。
１１３．実施形態７６～８８、及び９０～１１１のいずれか１項に記載の構築物又はｄＲＮＡを含む宿主細胞。
１１４．宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのキットであって、実施形態７６～１１１のいずれか１項に記載の構築物、線状ＲＮＡ又はｄＲＮＡを含む、キット。

材料および方法
プラスミド構築
ｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰ（ＥＧＦＰの第１コドンＡＴＧ欠損）コードＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ中にプライマーを介して３×ＧＳリンカーおよび標的ＤＮＡ配列を付加し、二重蛍光レポーターをクローニングした。その後、ＩＩ型制限酵素ＢｓｍＢ１（米サーモ社（Ｔｈｅｒｍｏ））とＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）で切断してＰＣＲ産物を連結し、次に、ｐＬｅｎｔｉ主鎖（ｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＳＶ－Ｂｓｄ、スタンフォード大学スタンレー・コーエン研究室（ＳｔａｎｌｅｙＣｏｈｅｎＬａｂ，ＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））に挿入した。

Ｌｂｕプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８３４８５）からＰＣＲによりｄＬｂｕＣａｓ１３ＤＮＡを増幅した。ＡＤＡＲ１ＤＤとＡＤＡＲ２ＤＤはＡｄａｒ１（ｐ１５０）ｃＤＮＡとＡｄａｒ２ｃＤＮＡから増幅され、両者は厦門大学（ＸｉａｍｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の韓の実験室（Ｈａｎ’ｓｌａｂ）から得られた。オーバーラップＰＣＲによりＡＤＡＲ１ＤＤあるいはＡＤＡＲ２ＤＤとｄＬｂｕＣａｓ１３ＤＮＡを融合し、融合したＰＣＲ産物をｐＬｅｎｔｉ主鎖に挿入した。

哺乳動物細胞におけるｄＲＮＡの発現では、ｄＲＮＡ配列を直接合成し（短いｄＲＮＡの場合）、オーバーラップｓｓＤＮＡを合成することによってアニーリングしまたはＰＣＲ増幅し、生成物をゴールデンゲートクローニングによってＵ６発現下で対応するベクターにクローニングした。

全長Ａｄａｒ１（ｐ１１０）およびＡｄａｒ１（ｐ１５０）はＡｄａｒ１（ｐ１５０）ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、全長Ａｄａｒ２はＡｄａｒ２ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、それぞれｐＬｅｎｔｉ主鎖にクローニングした。

二重蛍光レポーターの２つのバージョン（レポーター－１および－３）については、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰ（ＥＧＦＰの開始コドンＡＴＧ欠損）コード配列をＰＣＲ増幅し、ＢｓｍＢＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＥＲ０４５２）を使用して消化し、続いてＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｌ）を介してＧＧＧＧＳリンカーとライゲーションを行った。その後、ライゲーション産物をｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＰＵＲＯ主鎖に挿入した。

ｄＬｂｕＣａｓ１３－ＡＤＡＲ_ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）発現構築物の場合、ＡＤＡＲ１_ＤＤ遺伝子をＡＤＡＲ１^ｐ１５０構築物（厦門大学のＪｉａｈｕａｉＨａｎの研究室（Jiahuai Han’s lab, Xiamen University）からの寄贈）から増幅した。ｄＬｂｕＣａｓ１３遺伝子を、Ｌｂｕ＿Ｃ２ｃ２＿Ｒ４７２Ａ＿Ｈ４７７Ａ＿Ｒ１０４８Ａ＿Ｈ１０５３Ａプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８３４８５）からＰＣＲによって増幅した。ＡＤＡＲ１_ＤＤ（過剰活性Ｅ１００８Ｑ変異体）をオーバーラップＰＣＲによって生成し、ｄＬｂｕＣａｓ１３に融合した。ライゲーション産物をｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＢＳＤ主鎖に挿入した。

ａｒＲＮＡ発現構築物については、ａｒＲＮＡの配列を合成し、ｐＬｅｎｔｉ－ｓｇＲＮＡ－ｌｉｂ２．０（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８９６３８）主鎖にゴールデンゲートをクローニングし、ｈＵ６プロモーターによってａｒＲＮＡの転写を駆動した。ＡＤＡＲ発現構築物については、全長ＡＤＡＲ１^ｐ１１０およびＡＤＡＲ１^ｐ１５０をＡＤＡＲ１^ｐ１５０構築物からＰＣＲ増幅し、全長ＡＤＡＲ２をＡＤＡＲ２構築物からＰＣＲ増幅した（厦門大学のＪｉａｈｕａｉＨａｎの研究室からの寄贈）。次に、増幅産物をｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＢＳＤ主鎖にクローニングした。

病原性変異を持つ遺伝子を発現する構築物については、ＴＰ５３（ヴィジェビオ社（Ｖｉｇｅｎｅｂｉｏから注文））および他の６つの疾患関連遺伝子（ＣＯＬ３Ａ１、ＢＭＰＲ２、ＡＨＩ１、ＦＡＮＣＣ、ＭＹＢＰＣ３及びＩＬ２ＲＧ、中国医学アカデミー病原体生物学研究所のＪｉａｎｗｅｉＷａｎｇの研究室（Jianwei Wang’s lab, Institute of pathogen biology, Chinese Academy of Medical Sciences）から寄贈）の完全長コード配列を、変異誘発ＰＣＲによりＧ＞Ａ変異を導入した対応する遺伝子をコードする構築物から増幅した。増幅産物をＧｉｂｓｏｎクローニング法によりｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ主鎖にクローニングした。

哺乳動物細胞株および細胞培養方法
１０％ウシ胎児血清（中国蘭州市の蘭州百嶺生物技術有限公司（ＬａｎｚｈｏｕＢａｉｌｉｎｇＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．））を添加し、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（１０－０１３－ＣＶ、米国マサチューセッツ州テュークスベリー、コーニング社（Corning, Tewksbury, MA, USA））を用いて、５％ＣＯ_２、３７℃で哺乳動物細胞株を培養した。Ａｄａｒ１－ＫＯ細胞株は中国エディジーン社（ＥｄｉＧｅｎｅＣｈｉｎａ）から購入し、遺伝子型解析の結果も中国エディジーン社から提供された。

ＨｅＬａ細胞株とＢ１６細胞株はＺ．Ｊｉａｎｇの研究室（北京大学）からのものであった。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株はＣ．Ｚｈａｎｇの研究室（北京大学）からのものであった。ＲＤ細胞株は、ＪＷａｎｇの研究室（北京協和病院および中国医学アカデミー病原体生物学研究所（Institute of Pathogen Biology, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences））からのものであった。ＳＦ２６８細胞株は、中国医学院基礎医学研究所細胞センターから入手したものであった。Ａ５４９およびＳＷ１３細胞株はＥｄｉＧｅｎｅＩｎｃ．から入手した。ＨｅｐＧ２、ＨＴ２９、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＭＥＦ細胞株は北京大学の研究室で維持された。これらの哺乳動物細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＣｅｌｌＭａｘ、ＳＡ２０１．０２）を含み、さらに１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、１０－０１３－ＣＶ）中で、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。特に記載がない限り、メーカーの取扱書に従って、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＨＰＤＮＡトランスフェクション試薬（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、０６３６６５４６００１）を使用して細胞をトランスフェクトした。

ヒト初代肺線維芽細胞（＃３３００）およびヒト初代気管支上皮細胞（＃３２１０）はＳｃｉｅｎＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入し、それぞれ線維芽細胞培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、＃２３０１）および気管支上皮細胞培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、＃３２１１）で培養した。両方の培地には１５％ウシ胎児血清（ＢＩ）と１％ペニシリン－ストレプトマイシンが添加された。初代ＧＭ０６２１４およびＧＭ０１３２３細胞は、ＣｏｒｉｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈから購入され、１５％ウシ胎児血清（ＢＩ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、１０－０１３－ＣＶ）で培養された。すべての細胞は、５％ＣＯ_２、３７℃で培養された。

レポーターシステムトランスフェクション、ＦＡＣＳ解析、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング
二重蛍光レポーター編集実験では、２９３Ｔ－ＷＴ細胞または２９３Ｔ－Ａｄａｒ１－ＫＯ細胞を６ウェルプレートに播種し（６×１０^５細胞／ウェル）、２４時間後、レポータープラスミド１．５μｇとｄＲＮＡプラスミド１．５μｇをＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＨＰＤＮＡトランスフェクション試薬（０６３６６５４６００１；Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）で、サプライヤーのプロトコルに従って共トランスフェクションした。４８～７２時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。レポーターｍＲＮＡ編集をさらに確認するために、ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してレポーターおよびｄＲＮＡプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ－ＷＴ細胞からＥＧＦＰ陽性細胞を選別し、続いて全ＲＮＡを単離した（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ４３０）。次に、ＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＫＲ１０３－０４）によってｃＤＮＡに逆転写し、標的遺伝子座を対応するプライマーペアでＰＣＲ増幅し（２３ＰＣＲサイクル）、ＰＣＲ産物をＳａｎｇｅｒシーケンシングのために精製した。

Ａｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２レスキューおよび過剰発現実験のために、２９３Ｔ－ＷＴ細胞または２９３Ｔ－Ａｄａｒ１－ＫＯ細胞を１２ウェルプレートに播種し（２．５×１０^５細胞／ウェル）、２４時間後、レポータープラスミド０．５μｇ、ｄＲＮＡプラスミド０．５μｇおよびＡｄａｒ１／２プラスミド０．５μｇ（コントロールとしてのｐＬｅｎｔｉ主鎖）を、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＨＰＤＮＡトランスフェクション試薬（０６３６６５４６００１、Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）を使用して、共トランスフェクションした。４８～７２時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。

内在性ｍＲＮＡ実験のために、２９３Ｔ－ＷＴ細胞を６ウェルプレートに播種し（６×１０^５細胞／ウェル）、約７０％コンフルエントになったら、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＨＰＤＮＡトランスフェクション試薬（０６３６６５４６００１、Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）を使用してｄＲＮＡプラスミド３μｇをトランスフェクションした。７２時間後、細胞を収集し、次のＲＮＡ単離のためにＦＡＣＳによってＧＦＰ陽性細胞またはＢＦＰ陽性細胞を（対応する蛍光メーカーに従って）選別した。

ヒト初代Ｔ細胞の単離および培養
健康なドナーからの白血球除去産物から初代ヒトＴ細胞を単離した。簡単に説明すると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ遠心分離（Ｄａｋｅｗｅｉ、ＡＳ１１１４５４６）によって単離し、Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、１７９５１）を使用した磁気ネガティブセレクションによってＰＢＭＣから単離した。単離後、Ｔ細胞をＸ－ｖｉｖｏ１５培地、１０％ＦＢＳおよびＩＬ２（１０００Ｕ／ｍｌ）で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ＤｙｎａＢｅａｄｓ（サーモフィッシャー社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１１１３１Ｄ）で２日間刺激した。健康なドナーからの白血球除去製品は、ＡｌｌＣｅｌｌｓＬＬＣＣｈｉｎａから入手した。すべての健康なドナーはインフォームドコンセントを提供した。

慢性ウイルスパッケージングおよびレポーター細胞株の構築
発現プラスミドを、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＨＰＤＮＡトランスフェクション試薬を用いて、２つのウイルスパッケージングプラスミドであるｐＲ８．７４およびｐＶＳＶＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ）とともにＨＥＫ２９３Ｔ－ＷＴ細胞に同時トランスフェクションした。７２時間後、上清ウイルスを回収し、－８０℃で保存した。ＨＥＫ２９３Ｔ－ＷＴ細胞をレンチウイルスに感染させ、７２時間後にｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別し、培養して、限界希釈法によりＥＧＦＰバックグラウンドが非常に低い二重蛍光レポーターシステムを安定して発現する単一クローン細胞株を選択した。

安定したレポーター細胞株の場合、レポーター構築物（ｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＰＵＲＯ主鎖）を２つのウイルスパッケージングプラスミドであるｐＲ８．７４およびｐＶＳＶＧとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスミッションした。７２時間後、上清ウイルスを回収し、－８０℃で保存した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をレンチウイルスに感染させ、次にｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別し、培養して、検出可能なＥＧＦＰバックグラウンドのないが二重蛍光レポーターシステムを安定に発現する単一クローン細胞株を選択した。以前に報告された方法^６０に従って、ＨＥＫ２９３ＴＡＤＡＲ１^－／－及びＴＰ５３^－／－細胞株を生成した。ＡＤＡＲ１を標的化するｓｇＲＮＡと、ＣＭＶ駆動ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＰＣＲ増幅されたドナーＤＮＡとをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションした。次に、トランスフェクションの７日後に細胞をピューロマイシンで処理した。ピューロマイシン耐性細胞から単一クローンを単離し、続いてシーケンシングおよびウェスタンブロットによる検証を行った。

内因性または外因性に発現された転写物のＲＮＡ編集
二重蛍光レポーターでのＲＮＡ編集を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３ＴＡＤＡＲ１ ^－／－細胞を６ウェルプレートに播種した（６×１０^５細胞／ウェル）。２４時間後、細胞をレポータープラスミド１．５μｇおよびａｒＲＮＡプラスミド１．５μｇで同時トランスミッションした。ＡＤＡＲ１^ｐ１１０、ＡＤＡＲ１^ｐ１５０、またはＡＤＡＲ２タンパク質発現の影響を調べるために、編集効率をＥＧＦＰ陽性比率とディープシークエンシングによってアッセイした。

ＨＥＫ２９３ＴＡＤＡＲ１ ^－／－細胞を１２ウェルプレートに播種した（２．５×１０^５細胞／ウェル）。２４時間後、細胞をレポータープラスミド０．５μｇ、ａｒＲＮＡプラスミド０．５μｇ、およびＡＤＡＲ１／２プラスミド０．５μｇ（コントロールとしてのｐＬｅｎｔｉ主鎖）で同時トランスミッションした。ＥＧＦＰ陽性比率とディープシークエンシングによって編集効率を評価した。

内因性ｍＲＮＡ転写物に対するＲＮＡ編集を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種した（６×１０^５細胞／ウェル）。２４時間後、細胞を３μｇのａｒＲＮＡプラスミドでトランスミッションした。ディープシークエンシングによって編集効率を評価した。

複数の細胞株におけるＲＮＡ編集効率を評価するために、８～９×１０^４（ＲＤ、ＳＦ２６８、ＨｅＬａ）または１．５×１０^５（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞を１２ウェルプレートに播種した。ＨＴ２９、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＳＷ１３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＥＦおよびＢ１６などのトランスフェクションが難しい細胞の場合、２～２．５×１０^５細胞を６ウェルプレートに播種した。２４時間後、レポーターとａｒＲＮＡプラスミドをこれらの細胞に同時トランスミッションした。ＥＧＦＰ陽性比率によって編集効率を評価した。

ＥＧＦＰ陽性比率を評価するために、トランスフェクションの４８～７２時間後に、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によって細胞を選別および収集した。ｍＣｈｅｒｒｙシグナルは、レポーター／ａｒＲＮＡ発現細胞の蛍光選択マーカーとして機能し、ＥＧＦＰ^＋／ｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞の割合が編集効率の読み取り値として算出された。

ＡからＩへの編集率のＮＧＳ定量化のために、トランスフェクション４８～７２時間後に、ＦＡＣＳアッセイによって細胞を選別して収集し、その後ＲＮＡ単離（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ４２０）に供した。次に、全ＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＫＲ１０３－０４）を介してｃＤＮＡに逆転写し、標的遺伝子座を次の表に列挙した対応するプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。

ＰＣＲ産物は、精製されて、ＳａｎｇｅｒシーケンシングまたはＮＧＳ（ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＸＴｅｎ）に供した。

複数の細胞株でのテスト
ＨＥＫ２９３Ｔ（陽性対照）およびＨＥＫ２９３ＴＡＤＡＲ１^－／－（陰性対照）細胞に加えて、１つのマウス細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）および異なる組織および器官に由来する７つのヒト細胞株（ＲＤ、ＲＤ、ＨｅＬａ、ＳＦ２６８、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＨＴ－２９、ＳＷ１３）を選択して実験を実施した。より高いトランスフェクション効率を有する細胞株については、約８～９×１０^４細胞（ＲＤ、ＨｅＬａ、ＳＦ２６８）または１．５×１０^５細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を１２ウェルプレートの各ウェルに播種した。トランスフェクションが難しい細胞株（Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＨＴ－２９、ＳＷ１３、ＮＩＨ３Ｔ３）については、２～２．５×１０^５細胞を６ウェルプレートに播種した。そして、これらすべての細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＣｅｌｌＭａｘ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中で、５％ＣＯ_２、３７℃で維持された。２４時間後、ＣＧ２レポーターと７１ｎｔｄＲＮＡ（３５－Ｃ－３５）プラスミドを、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＨＰＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用してさまざまな種類の細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をトリプシンで処理し、ＦＡＣＳ（ＢＤ）によって分析した。トランスフェクション効率の低い細胞ではｍＣｈｅｒｒｙおよびＢＦＰ陽性細胞がかなり少ないため、６ウェルプレートにプレーティングされた細胞のＦＡＣＳ分析の総細胞数を１×１０^５に増やした。

実施例１．ＣＭＶプロモーターを用いてａｒＲＮＡ発現を駆動することによるＬＥＡＰＥＲの最適化
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）が編集効率を向上させることができるか否かをテストするために、ＰｏｌＩＩプロモーター（ＣＭＶ）によって駆動されるａｒＲＮＡを発現するプラスミドを構築した。ＥＧＦＰ発現に基づくレポーターシステム（レポーター１、図４Ｂ）を使用して、ＣＭＶおよびＵ６プロモーターによって駆動されるａｒＲＮＡ間のＲＮＡ編集効率を比較した（ａｒＲＮＡ５１）。未処理の細胞を模擬対照（モック）として使用した。非標的化ＲＮＡでトランスミッションされた細胞もコントロール（ＣｔｒｌＲＮＡ）として使用された。ＣＭＶ－ａｒＲＮＡは、ＲＮＡ編集においてＵ６－ａｒＲＮＡよりも優れていることが見出された（図１）。

実施例２．ｓｎｏ－ａｒＲＮＡを介したＲＮＡ編集
ａｒＲＮＡを安定化し、その核局在化を強化するために、ｓｎｏＲＮＡ末端を持つようにａｒＲＮＡを操作した。蛍光レポーター１を標的化する１５１－ｎｔａｒＲＮＡは、ｓｎｏＲＮＡ末端に隣接した（図２Ａ）。
５’末端：
GAGTGAGATCTTGGACCAATGATGACTTCCATACATGCATTCCTTGGAAAGCTGAACAAAATGAGTGGGAACTCTGTACTATCATCTTAGTTGAACTGAGGTCCACCGGGGGCTAA(SEQ ID NO:19)
３’末端：
AAGATTGTGTGTGGATCGATGATGACTTCCATATATACATTCCTTGGAAAGCTGAACAAAATGAGTGAAAACTCTATACCGTCATTCTCGTCGAACTGAGGTCCAGCACATTACTCCAACAG(SEQ ID NO:20)
ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ１５１と命名した。

二重蛍光レポーター－１は、ｍＣｈｅｒｒｙの配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）と、３×ＧＳリンカーおよび標的Ａを含む配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）と、ｅＧＦＰの配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）とを含む。

次に、ヒトＵ６駆動ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ１５１、ａｒＲＮＡ１５１、ｓｎｏ－ＣｔｒｌＲＮＡ１５１、またはＣｔｒｌＲＮＡ１５１をレポーター発現プラスミドとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＦＡＣＳ分析によってＥＧＦＰ陽性比率を定量化した。ＦＡＣＳの結果は、ｓｎｏＲＮＡ末端に隣接するｓｎｏ－ａｒＲＮＡ１５１が、線状ａｒＲＮＡよりも低いほぼ３８％のＥＧＦＰ陽性比率でレポーターｍＲＮＡ上の標的ＲＮＡ編集を媒介できることを示した（図２Ｂ～２Ｃ）。

ｓｎｏＲＮＡ末端がａｒＲＮＡを安定化するか否かをテストするために、ＥＧＰＦ陽性率をさまざまな時点で測定した。ヒトＵ６プロモーター下のｓｎｏ－ａｒＲＮＡ_１５１、ａｒＲＮＡ_１５１、ｓｎｏ－ＣｔｒｌＲＮＡ_１５１、またはＣｔｒｌＲＮＡ_１５１をＨＥＫ２９３Ｔ－レポーター細胞にトランスミッションした。ＥＧＦＰ陽性比率は、トランスフェクション後３日、６日、１２日の３時点で測定した。結果は、ｓｎｏ－ａｒＲＮＡが長期間にわたってａｒＲＮＡよりも高い編集効率を示すことを示し、ｓｎｏＲＮＡ末端がａｒＲＮＡを分解から保護し、ｓｎｏ－ａｒＲＮＡの存在量を高めることができることを示した（図３Ａ）。

ａｒＲＮＡの発現レベルをさらに高めるために、ウイルスベースの強力なプロモーターＣＭＶを使用してａｒＲＮＡまたはｓｎｏ－ａｒＲＮＡを発現させた。結果は、ＣＭＶプロモーター発現ａｒＲＮＡ（ＣＭＶ＿ａｒＲＮＡ）が、Ｕ６プロモーター発現ａｒＲＮＡ（Ｕ６＿ａｒＲＮＡ）よりもはるかに高い編集効率を有することを示した。また、Ｕ６＿ａｒＲＮＡグループのＥＧＦＰ陽性比率は時間の経過とともに減少したが、ＣＭＶ＿ａｒＲＮＡグループのＥＧＦＰ陽性率はトランスフェクション後６日目でも依然として増加した。同様に、ＣＭＶプロモーター発現ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ（ＣＭＶ＿ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ）は、Ｕ６プロモーター発現ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ（Ｕ６＿ｓｎｏ－ａｒＲＮＡ）よりもはるかに高い編集効率を達成した（図３Ｂおよび図３Ｃ）。

上記の結果に基づいて、ｓｎｏＲＮＡ末端はａｒＲＮＡを安定化することができ、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるａｒＲＮＡまたはｓｎｏ－ａｒＲＮＡはその発現レベルを増加させることができることが証明された。これら２つの戦略は両方とも、ａｒＲＮＡの編集効率を大幅に高めることができる。

実施例３．環状ａｒＲＮＡを介したＲＮＡ編集
ｍＣｈｅｒｒｙとＥＧＦＰとの間のインフレーム終止コドンを含むレポーター１を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図４Ｂ）を、両方ともレポーター１を標的化する環状ａｒＲＮＡ_７１および環状ａｒＲＮＡ_１１１を発現するプラスミドでトランスミッションした。ＥＧＦＰ蛍光は、ＲＮＡに対するターゲット編集の効率を示した。最も効率的なａｒＲＮＡ構造を試験するために、環状ａｒＲＮＡを、両端ライゲーション配列に接続する２５ｎｔまたは５０ｎｔのリンカーで隣接させた（図４Ａ）。比較のために、線状（非環状）ａｒＲＮＡ_７１およびａｒＲＮＡ_１１１も同時トランスミッションした。その結果、環状ａｒＲＮＡは、線状ａｒＲＮＡと比較して、ＥＧＦＰ^＋細胞の比率およびＥＧＦＰ強度の両方を強く改善するが（図４Ｃ）、２５ｎｔまたは５０ｎｔのリンカーを有する環状ａｒＲＮＡは、効率の改善を弱めることが判明した（図４Ｃ）。

レポーター－３を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ（図４Ｂ）において、編集効率に対する長さの影響をさらに試験した。レポーターＥＧＦＰ比率に基づいて、環状ａｒＲＮＡの長さは編集効率と正の相関があり、１１１～１５１ｎｔでピークに達し（図４Ｄ）、７１ｎｔが環状ａｒＲＮＡ活性に必要な最小長であった（図４Ｄ）。

二重蛍光レポーター－３は、ｍＣｈｅｒｒｙの配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）と、１×ＧＳリンカー（斜体および太字で示す）および標的Ａを含む配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）と、ｅＧＦＰの配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）とを含む。

環状ａｒＲＮＡは、ＡＤＡＲ１の発現レベルが低いかＡＤＡＲ３の発現が高いために、テストした複数の細胞株の中でＬＥＡＰＥＲ効率が比較的低いＨｅＬａおよびＡ５４９細胞で使用された。その結果、ＥＧＦＰレポーターアッセイに基づいて、環状ａｒＲＮＡが両方の細胞株において編集効率を大幅に高めることが判明した（図４Ｅ）。

実施例４．環状ａｒＲＮＡを有するＬＥＡＰＥＲ系を使用した中途終止コドンの修正
多くの疾患は、中途終止コドン（ＰＴＣ）によって引き起こされる。ＰＴＣ関連疾患の治療におけるＬＥＡＰＥＲ－環状ａｒＲＮＡの可能性を調べるために、インフレームＵＡＡ終止コドンレポーターを構築した。環状ａｒＲＮＡの３つのバージョン（Ｔｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮ_{Ａ１１１－Ａ１}、Ｔｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮ_{Ａ１１１－Ａ２}及びＴｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮ_{Ａ１１１－２Ａ}）は、このレポーターのＵＡＡ部位を標的化するように設計され、３つの異なるａｒＲＮＡのＥＧＦＰ陽性パーセンテージを比較した。その結果、ＴＡＡコドンの２番目のアデノシンを標的化するＴｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡ_{１１１－Ａ２}がより効率的であることが判明した（図５）。

実施例５．環状ａｒＲＮＡを有するＬＥＡＰＥＲ系を使用したｍＲＮＡスプライシングの調節
ｍＲＮＡスプライシングを操作して新しいスプライシング産物を生成することは、疾患（デュシェーヌ型筋ジストロフィーなど）を治療する戦略のひとつである。ＲＧ６スプライシングレポーターを使用して、ＬＥＡＰＥＲ－環状ａｒＲＮＡがスプライシングアクセプター部位を変更できるか否かをテストした。Ｔｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡ_７１（７１－ｎｔ）、Ｔｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡ_７１（１１１－ｎｔ）、及びＴｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡ_{７１＋ＢＰ}（１１１－ｎｔがアクセプター部位と分岐点の両方を標的化する）を含む、環状ａｒＲＮＡの３つのバージョンが、ＲＧ６スプライシングアクセプター部位を標的化するように設計された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、スプライシングパターンがＬＥＡＰＥＲ－Ｔｏｒｎａｄｏによって変化した場合、ＲＧ６レポーターは、ＥＧＦＰタンパク質よりも多くのｄｓＲＮＡタンパク質を発現した（図６Ａ）。我々は、ＬＥＡＰＥＲ－環状ａｒＲＮＡが細胞スプライシング機構を効率的に標的化できることを発見した（図６Ｂ）。

実施例６．環状ａｒＲＮＡを有するＬＥＡＰＥＲ系によるレンチウイルス送達
治療用ＲＮＡを継続的に投与することは、その有効性にとって重要である。環状ａｒＲＮＡを伴うＬＥＡＰＥＲによるレンチウイルス送達がＲＮＡ編集を達成できるか否かをテストした。研究したところ、環状ａｒＲＮＡを有するＬＥＡＰＥＲはレンチウイルス送達を通じて機能し、それによって様々なＴｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡがゲノムに組み込まれ、安定して発現できることが判明した。Ｔｏｒｎａｄｏ－ａｒＲＮＡの長さは編集効率と正の相関を示した（図７）。

実施例７．インビトロで産生された環状ａｒＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集
Ｔｏｒｎａｄｏ系を使用したインビボでの環状ａｒＲＮＡの発現に加えて、ａｒＲＮＡをインビトロで環状化することもできる。
図８Ａ～８Ｂに示すように、ＤＮＡスプリント（すなわち、一本鎖ＤＮＡアダプター）の有無にかかわらず、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを使用して、ａｒＲＮＡをインビトロで生成した。簡単に言うと、ａｒＲＮＡに対応するインビトロＲＮＡ転写物は、ＤＮＡテンプレートのインビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して得られた。次いで、ＩＶＴ産物を、ＤＮＡスプリントに結合したＴ４ＲＮＡリガーゼ（Ｔ４Ｒｎｌ１またはＴ４Ｒｎｌ２）（図８Ａ）、またはＤＮＡスプリントなしで直接（図８Ｂ）に連結した。Ｔ４Ｒｎｌ１とＴ４Ｒｎｌ２はどちらも、インビトロで線状ｓｓＲＮＡを効率的に環状化できた。

図８Ｃは、グループＩ触媒イントロンに基づいてインビトロで環状ａｒＲＮＡを生成する方法を示す。典型的なグループＩ触媒イントロンは、５’末端から３’末端まで、５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列の５’エクソン（エクソン１）、５’触媒グループＩイントロンフラグメント、３’触媒グループＩイントロンフラグメント、および３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列の３’エクソン（エクソン２）を含む。ａｒＲＮＡ配列を含む線状ＲＮＡ構築物は、ａｒＲＮＡ配列の両端を結合し、グループＩイントロンによる自己スプライシング後に環状ａｒＲＮＡを得るために、グループＩイントロンフラグメントの自己触媒作用を可能にするように作成できる。線状構築物は、５’から３’まで、３’触媒グループＩイントロンフラグメント、３’エクソン（エクソン２）、ａｒＲＮＡ配列、５’エクソン（エクソン１）および５’グループＩイントロンを含む。線状ＲＮＡ構築物は、ＩＶＴを使用して取得された。精製したＩＶＴ産物にＧＴＰとＭｇ^２＋を加えて環状化し、５５℃で１５分間インキュベートした。線状ＲＮＡ前駆体を除去するために、反応混合物をＲＮａｓｅＲで処理するか、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製した。ＲＮａｓｅＲ処理および／またはＨＰＬＣの後、精製されたＲＮＡをアルカリホスファターゼで処理して、必要に応じてリン酸基を除去した。

上記のインビトロ法を使用して、実施例２に記載したように、レポーター１を標的化する環状ａｒＲＮＡを生成した。図９Ａ～９Ｃに示すように、Ｔ４Ｒｎｌ１はａｒＲＮＡを効率的に環状化した。環状化効率は、ＨＰＬＣ分析により測定した結果、約６０％であった。精製した環状ａｒＲＮＡをレポーター－１安定細胞株にトランスミッションした。ａｒＲＮＡは、環状ａｒＲＮＡのトランスフェクション２４時間後にＥＧＦＰ発現を効率的にオンにした（図１０）。環状ａｒＲＮＡ_１５１処理グループでは、ほぼすべての細胞がＥＧＦＰの発現を示した。Ｓａｎｇｅｒシーケンシングの結果（図１１）に基づいて、４８時間のトランスフェクション後の編集効率が約６０％であると決定した。この編集効率は、ディープシークエンシングの結果と一致している（図１２）。環状ａｒＲＮＡによる影響の持続時間をテストするために、細胞を半月培養し続けた。図１０に示すように、環状ａｒＲＮＡでトランスミッションされた細胞の大部分は、トランスフェクション後少なくとも１週間はＥＧＦＰを発現し続けた。

次に、インビトロ法を使用して、内因性転写物を標的化する環状ａｒＲＮＡを生成した。ａｒＲＮＡの長さは１５１ｎｔであった。Ｔ４ＲｎｌベースおよびグループＩ触媒イントロンベースの方法を利用して、内因性転写物を標的化する環状ａｒＲＮＡをインビトロで生成することに成功した。精製した環状ａｒＲＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔおよびマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をトランスフェクトした。

ＨＥＫ２９３ＴのＰＰＩＢ転写産物にあるＵＡＧモチーフを標的化した。ＰＰＩＢ転写産物の標的アデノシン部位は、それに対応する環状ａｒＲＮＡによって編集された。次に、編集効率が用量依存性であるか否かをテストした。図１３Ａのデータは、編集効率が用量依存性であり、高用量の環状ａｒＲＮＡがより高い編集率をもたらす傾向があることを示した。

単遺伝子性疾患であるＨｕｒｌｅｒ症候群の治療に環状ａｒＲＮＡを使用する可能性を検討した。Ｈｕｒｌｅｒ症候群は、ムコ多糖の分解に関与するリソソーム代謝酵素であるＩＤＵＡの欠損によるムＩ型ムコ多糖症（ＭＰＳＩ）の最も重篤なサブタイプである。もともとＨｕｒｌｅｒ症候群のマウスモデルから単離されたＭＥＦ細胞を選択した。これらのＭＥＦ細胞は、ＩＤＵＡ遺伝子のエクソン９にホモ接合性のＴＧＧからＴＡＧへの変異を含んでいた。ＩＤＵＡ転写物を標的化する環状ａｒＲＮＡをＭＥＦにトランスミッションし、編集効率を測定した。図１３Ｂのディープシーケンシングの結果は、ＩＤＵＡ転写物の編集効率が約２７％であったことを示している。

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14 Wong, S. K., Sato, S.及びLazinski, D. W.『ADAR1 および ADAR2 による基質認識（Substrate recognition by ADAR1 and ADAR2）』『RNA』7,846－858（2001）。
15 Montiel-Gonzalez, M. F., Vallecillo-Viejo, I., Yudowski, G. A.及びRosenthal, J. J.『部位特異的RNA編集による嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節因子内の変異の修正（Correction of mutations within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by site-directedRNAediting）』『米国国立科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci U S A）』110,18285－18290（2013）。
16 Sinnamon, J. R.ら『ニューロンにおける内在性 Mecp2RNA の部位特異的 RNA 修復（Site-directedRNArepair of endogenous Mecp2RNAin neurons）』『米国国立科学アカデミー紀要』114,E9395－E9402（2017）。
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19 Schneider, M. F., Wettengel, J., Hoffmann, P. C.及びStafforst, T.『hADAR1 および hADAR2 のデアミナーゼ活性をトランスでリダイレクトするための最適なガイド RNA（Optimal guideRNAs for re-directing deaminase activity of hADAR1 and hADAR2 in trans）』『核酸研究』42,e87（2014）。
20 Vogel, P., Hanswillemenke, A.及びStafforst, T.『光の制御下での部位特異的RNA編集によるタンパク質局在の切り替え（Switching Protein Localization by Site-DirectedRNAEditing under Control of Light）』『ACS合成生物学（ACS synthetic biology）』6,1642－1649（2017）。
21 Vogel, P., Schneider, M. F., Wettengel, J.及びStafforst, T.『ガイド RNA の化学修飾による in vitro および細胞培養における部位特異的 RNA 編集の改善（Improving site-directedRNAediting in vitro and in cell culture by chemical modification of the guideRNA）』『応用化学（Angewandte Chemie）』53,6267－6271（2014）。
22 Vogel, P.ら『SNAPタグ付きADARによる内在性転写産物の効率的かつ正確な編集（Efficient and precise editing of endogenous transcripts with SNAP-tagged ADARs）』『ネイチャー方法』15,535-538（2018）。
23 Cox, D. B. T.ら『CRISPR-Cas13 による RNA 編集（RNA editing with CRISPR-Cas13）』『サイエンス』358,1019-1027（2017）。
24 Fukuda, M.ら『細胞内A-to-IのRNA編集を利用した部位特異的RNA変異誘発用ガイドRNAの構築（Construction of a guide-RNA for site-directedRNAmutagenesis utilising intracellular A-to-I RNA editing）』『サイエンティフィック・リポーツ（Scientific reports）』7,41478（2017）。
25 Wettengel, J., Reautschnig, P., Geisler, S., Kahle, P. J.及びStafforst, T.『ヒト ADAR2 を RNA 修復に利用する - PINK1 変異の再コードによりマイトファジーが救出される（Harnessing human ADAR2 forRNArepair-Recoding a PINK1 mutation rescues mitophagy）』『核酸研究』45,2797－2808（2017）。
26 Heep, M., Mach, P., Reautschnig, P., Wettengel, J.及びStafforst, T.『部位特異的RNA編集-G/C置換にヒトADAR1p110およびADAR1p150を適用すると、ガイドRNAが編集に対して安定化される（Applying Human ADAR1p110 and ADAR1p150 for Site-DirectedRNAEditing-G/C Substitution Stabilizes GuideRNAs against Editing）』『遺伝子（バーゼル）（Genes(Basel)）』8（2017）。
27 Katrekar, D.ら『RNA誘導性アデノシンデアミナーゼによる点変異のin vivo RNA編集（In vivoRNAediting of point mutations viaRNA-guided adenosine deaminases）』『ネイチャー方法』16,239-242（2019）。
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29 Platt, R. J.ら『ゲノム編集およびがんモデリング用の CRISPR-Cas9 ノックインマウス（CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling）』『細胞』159,440-455（2014）。
30 Chew, W. L.ら『多機能 AAV-CRISPR-Cas9 とその宿主応答（A multifunctional AAV-CRISPR-Cas9 and its host response）』『ネイチャー方法』13,868-874（2016）。
31 Teoh, P. J.ら『ADAR1による骨髄腫トランスクリプトームの異常な過剰編集は発がん性をもたらし、予後不良のマーカーとなる（Aberrant hyperediting of the myeloma transcriptome by ADAR1 confers oncogenicity and is a marker of poor prognosis）』『血液（Blood）』132,1304－1317（2018）。
32 Vallecillo-Viejo, I. C., Liscovitch-Brauer, N., Montiel-Gonzalez, M. F., Eisenberg, E.及びRosenthal, J. J. C.『部位特異的RNA編集による豊富なオフターゲット編集は、編集酵素の核局在化によって削減可能（Abundant off-target edits from site-directedRNAediting can be reduced by nuclear localization of the editing enzyme）』『RNA生物学（RNA biology）』15,104－114（2018）。
33 Mays, L. E.及びWilson, J. M.『AAV ベクターにコードされた導入遺伝子産物に対する T 細胞活性化の複雑かつ進化するストーリー（The complex and evolving story of T cell activation to AAV vector-encoded transgene products）』『分子治療（Mol Ther）』19,16－27（2011）。
34 Wagner, D. L.ら『成人集団における化膿レンサ球菌 Cas9 反応性 T 細胞の高い有病率（High prevalence of Streptococcus pyogenes Cas9-reactive T cells within the adult human population）』『ネイチャー医学（Nat Med）』25,242－248（2019）。
35 Simhadri, V. L.ら『米国人口におけるCRISPR関連ヌクレアーゼCas9に対する既存抗体の蔓延（Prevalence of Pre-existing Antibodies to CRISPR-Associated Nuclease Cas9 in the USA Population）』『分子治療方法及び臨床発展（Mol Ther Methods Clin Dev）』10,105－112（2018）。
36 Charlesworth, C. T.ら『ヒトにおける Cas9 タンパク質に対する既存の適応免疫の同定（Identification of preexisting adaptive immunity to Cas9 proteins in humans）』『自然医学』25,249-254（2019）。
37 Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B.及びTaipale, J.『CRISPR-Cas9 ゲノム編集は p53 媒介 DNA 損傷応答を誘発する（CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response）』『自然医学』24,927-930（2018）。
38 Ihry, R. J.ら『p53はヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9遺伝子操作を阻害する（p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells）』『自然医学』24,939-946（2018）。

Claims

宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するための方法であって、
デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）又は前記ｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物を前記宿主細胞に導入することを含み、
（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートすることができ、かつ
（３）前記ｄＲＮＡは、環状ＲＮＡであるか、又は前記宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成することができる、方法。
前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列と５’ライゲーション配列をさらに含み、任意選択に、
（ｉ）前記３’ライゲーション配列及び前記５’ライゲーション配列は、互いに少なくとも部分的に相補的であり、及び／又は
（ｉｉ）前記３’ライゲーション配列及び前記５’ライゲーション配列の長さは、約２０～約７５ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである、請求項１又は２に記載のｄＲＮＡ。
前記ｄＲＮＡは、前記宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成できる線状ＲＮＡである、請求項１又は２に記載のｄＲＮＡ。
インビトロで線状ＲＮＡを使用して前記環状ＲＮＡを形成することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
前記線状ＲＮＡは、５’触媒グループＩイントロンフラグメントと３’触媒グループＩイントロンフラグメントを含むグループＩイントロンの自己触媒によって環状化される、請求項５に記載の方法。
前記線状ＲＮＡは、前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントと前記５’触媒グループＩイントロンフラグメントを含み、前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントは前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な３’エクソン配列の５’末端に隣接し、前記５’触媒グループＩイントロンフラグメントは前記５’触媒グループＩイントロンフラグメントによって認識可能な５’エクソン配列の３’末端に隣接する、請求項６に記載の方法。
前記線状ＲＮＡは、前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントの５’末端に隣接する５’相同配列と、前記５’触媒グループＩイントロンフラグメントの３’末端に隣接する３’相同配列と、をさらに含む、請求項７に記載の方法。
前記環状ＲＮＡの形成は、
（ａ）前記５’触媒グループＩイントロンフラグメント及び前記３’触媒グループＩイントロンフラグメントの自己触媒を活性化する条件を前記線状ＲＮＡに曝さして環状化ＲＮＡ産物を提供することと、（ｂ）前記環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、前記環状ＲＮＡを提供することと、を含む、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
前記線状ＲＮＡはリガーゼによって環状化される、請求項５に記載の方法。
前記リガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４Ｄｎｌ）、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１（Ｔ４Ｒｎｌ１）、及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｔ４Ｒｎｌ２）から選択される、請求項１０に記載の方法。
前記線状ＲＮＡは、前記環状ＲＮＡをコードする核酸配列の５’末端に５’ライゲーション配列を含み、前記環状ＲＮＡをコードする前記核酸配列の３’末端に３’ライゲーション配列を含み、前記５’ライゲーション配列と前記３’ライゲーション配列は前記リガーゼを介して互いに連結可能である、請求項１０又は１１に記載の方法。
前記環状ＲＮＡの形成は、
（ａ）前記線状ＲＮＡを一本鎖アダプター核酸と接触させることであって、前記一本鎖アダプター核酸は、５’末端から３’末端まで、前記３’ライゲーション配列に相補的な第１配列と前記５’ライゲーション配列に相補的な第２配列とを含み、前記５’ライゲーション配列及び前記３’ライゲーション配列は前記一本鎖アダプター核酸とハイブリダイズして、前記５’ライゲーション配列の３’末端と前記３’ライゲーション配列の５’末端との間の一本鎖切断を含む二本鎖核酸中間体を提供する、ことと、
（ｂ）前記５’ライゲーション配列と前記３’ライゲーション配列とのライゲーションを可能にする条件下で、前記中間体をＲＮＡリガーゼと接触させて、環状化ＲＮＡ産物を提供することと、
（ｃ）前記環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、前記環状ＲＮＡを提供することと、を含む、請求項１２に記載の方法。
前記環状ＲＮＡの形成は、
（ａ）前記５’ライゲーション配列と前記３’ライゲーション配列とのライゲーションを可能にする条件下で、前記線状ＲＮＡをＲＮＡリガーゼと接触させて、環状化ＲＮＡ産物を提供することと、
（ｂ）前記環状化ＲＮＡ産物を単離することにより、前記環状ＲＮＡを提供することと、を含む、請求項１２に記載の方法。
前記線状ＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸構築物をインビトロ転写することによって前記線状ＲＮＡを得ることをさらに含む、請求項５～１４のいずれか１項に記載の方法。
（ｉ）前記標的化ＲＮＡ配列の長さは５０ヌクレオチドを超え、任意選択に、前記標的化ＲＮＡ配列の長さは約１００～約１５０ヌクレオチドであり、
（ｉｉ）前記標的化ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンに直接対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含み、任意選択に、前記標的化ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンに直接対向するシチジンミスマッチを含み、例えば、前記シチジンミスマッチは、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れた位置、及び前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド離れた位置にあり、
（ｉｉｉ）前記標的化ＲＮＡ配列は、それぞれ前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する１つ又は複数のグアノシンをさらに含み、
（ｉｖ）前記標的化ＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続したミスマッチヌクレオチドを含み、
（ｖ）前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの５’最近傍は、Ｕ、Ｃ、Ａ及びＧから選択されるヌクレオチドであり、好ましくはＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの３’最近傍は、Ｇ、Ｃ、Ａ及びＵから選択されるヌクレオチドであり、好ましくはＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕであり、
（ｖｉ）前記標的アデノシンは、前記標的ＲＮＡ中のＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵから選択される３塩基モチーフ内にあり、任意選択に、前記３塩基モチーフはＵＡＧであり、前記標的化ＲＮＡは、前記３塩基モチーフ内のウリジンに直接対向するＡ、前記標的アデノシンに直接対向するシチジン、及び前記３塩基モチーフ内のグアノシンに直接対向するシチジン、グアノシン又はウリジンを含み、及び／又は
（ｖｉｉ）前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡから選択されるＲＮＡであり、任意選択に、前記標的ＲＮＡはプレメッセンジャーＲＮＡである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
ＡＤＡＲ３阻害剤及び／又はインターフェロン刺激剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
それぞれが異なる標的ＲＮＡを標的化する複数のｄＲＮＡ又は構築物を導入することを含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
前記標的ＲＮＡの編集効率が少なくとも４０％である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
前記構築物又は前記ｄＲＮＡは免疫応答を誘導しない、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
ＡＤＡＲを前記宿主細胞に導入することをさらに含み、任意選択に、前記ＡＤＡＲは、Ｅ１００８変異を含むＡＤＡＲ１である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシン的脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常スプライシング若しくは選択的スプライシング、又は前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常スプライシング若しくは選択的スプライシングの逆転を生じさせ、任意選択に、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの脱アミノ化は、前記標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の点変異、トゥランケイション、伸長及び／又はミスフォールディング、あるいは前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常スプライシング若しくは選択的スプライシングの逆転による機能的な、完全長の、正しくフォールディングされた及び／又は野生型タンパク質を生じさせる、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
前記宿主細胞は真核細胞であり、任意選択に、前記宿主細胞は哺乳動物細胞であり、例えば、前記宿主細胞はヒト又はマウス細胞である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法によって産生される編集ＲＮＡ又は編集ＲＮＡを有する宿主細胞。
個体の疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、
請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法によって前記個体の細胞内で前記疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、方法。
（ｉ）前記疾患又は障害は、遺伝性の遺伝性疾患、又は１種又は複数種の後天的遺伝子変異に関連する疾患又は障害であり、
（ｉｉ）前記標的ＲＮＡはＧからＡへの変異を有し、及び／又は
（ｉｉｉ）前記疾患又は障害は、単一遺伝子又は多遺伝子性の疾患又は障害である、請求項２５に記載の方法。
（ｉ）前記標的ＲＮＡはＴＰ５３であり、前記疾患又は障害は癌であり、
（ｉｉ）前記標的ＲＮＡはＩＤＵＡであり、前記疾患又は障害はムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）であり、
（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡはＣＯＬ３Ａ１であり、前記疾患又は障害はエーラス・ダンロス症候群であり、
（ｉｖ）前記標的ＲＮＡはＢＭＰＲ２であり、前記疾患又は障害はジュベール症候群であり、
（ｖ）前記標的ＲＮＡはＦＡＮＣＣであり、前記疾患又は障害はファンコニ貧血であり、
（ｖｉ）前記標的ＲＮＡはＭＹＢＰＣ３であり、前記疾患又は障害は原発性家族性肥大型心筋症であり、又は
（ｖｉｉ）前記標的ＲＮＡはＩＬ２ＲＧであり、前記疾患又は障害はＸ連鎖重度複合免疫不全症である、請求項２５又は２６に記載の方法。
宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、
前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートすることができ、前記ｄＲＮＡは、環状であるか、又は前記宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成することができる、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）。
前記ｄＲＮＡは、３’ライゲーション配列と５’ライゲーション配列をさらに含み、任意選択に、
（ｉ）前記３’ライゲーション配列及び前記５’ライゲーション配列は、互いに少なくとも部分的に相補的であり、及び／又は
（ｉｉ）前記３’ライゲーション配列及び前記５’ライゲーション配列の長さは約２０～約７５ヌクレオチドである、請求項２８に記載のｄＲＮＡ。
前記ｄＲＮＡは環状ＲＮＡである、請求項２８又は２９に記載のｄＲＮＡ。
前記ｄＲＮＡは、宿主細胞内で環状ＲＮＡを形成できる線状ＲＮＡである、請求項２８又は２９に記載のｄＲＮＡ。
前記ｄＲＮＡは、インビトロで線状ＲＮＡにより形成される環状ＲＮＡである、請求項３０に記載のｄＲＮＡ。
請求項２８～３２のいずれか１項に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含む構築物。
標的ＲＮＡを編集するためのデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）であって、
（１）前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列と、
（２）前記標的化ＲＮＡ配列の３’及び／又は５’末端にある核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列と、を含み、
前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートすることができる、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）。
（ｉ）前記ｄＲＮＡは、前記標的化ＲＮＡ配列の５’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「５’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含み、
（ｉｉ）前記ｄＲＮＡは、前記標的化ＲＮＡ配列の３’末端に連結されたｓｎｏＲＮＡ配列（「３’ ｓｎｏＲＮＡ配列」）を含み、
（ｉｉｉ）前記ｓｎｏＲＮＡ配列の長さは、少なくとも約７０ヌクレオチドであり、
（ｉｖ）前記３’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の核酸配列からなり、
（ｖ）前記５’ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の核酸配列からなり、及び／又は
（ｖｉ）前記ｓｎｏＲＮＡ配列は、Ｃ／ＤＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列、Ｈ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列、複合Ｃ／ＤＢｏｘとＨ／ＡＣＡＢｏｘｓｎｏＲＮＡ配列、又はオーファンｓｎｏＲＮＡ配列である、請求項３４に記載のｄＲＮＡ。
請求項３４又は３５に記載のｄＲＮＡをコードする核酸を含む、構築物。
前記構築物は、前記ｄＲＮＡをコードする前記核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、前記プロモーターはポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）である、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の構築物。
前記宿主細胞に入ったデアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築物であって、
（１）前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な標的化ＲＮＡ配列を含み、
（２）前記ｄＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）をリクルートすることができ、
（３）前記構築物は、前記ｄＲＮＡをコードする前記核酸に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーター（「ＰｏｌＩＩプロモーター」）を含む、構築物。
前記ＰｏｌＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、任意選択に、前記ＣＭＶプロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：３の核酸配列からなる、請求項３７又は３８に記載の構築物。
前記構築物はウイルスベクター又はプラスミドであり、任意選択に、前記構築物はＡＡＶベクターである、請求項３２～３９のいずれか１項に記載の構築物。
前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、及び低分子ＲＮＡから選択されるＲＮＡである、請求項２８～４０のいずれか１項に記載の構築物又はｄＲＮＡ。
請求項２８～４０のいずれか１項に記載の構築物又はｄＲＮＡを含む宿主細胞。
請求項２８～４０のいずれか１項に記載の構築物又はｄＲＮＡを含む、宿主細胞内で標的ＲＮＡを編集するためのキット。