CN114958920A

CN114958920A - 一种新型CRISPR-Cas9系统载体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114958920A
Application number: CN202110212578.3A
Authority: CN
Inventors: 刘旭; 陈邵宏; 史天永; 郝丹丹
Original assignee: Beijing Chinagene Tech Co ltd
Current assignee: Beijing Chinagene Tech Co ltd
Priority date: 2021-02-25
Filing date: 2021-02-25
Publication date: 2022-08-30

Abstract

本发明实施例涉及一种新型CRISPR‑Cas9系统载体及其制备方法和应用。所述载体上按照5’‑3’的方向依次包括下述功能元件：第一组成型启动子、编码Cas9蛋白的DNA序列、转录终止元件、第二组成型启动子、编码第一sgRNA序列的DNA序列、可诱导启动子、编码第二sgRNA序列的DNA序列；其中，第一sgRNA序列靶向目标基因，第二sgRNA序列靶向所述Cas9基因序列。本发明提供的载体，可以实现CRISPR‑Cas9系统的自清除；可避免CRISPR‑Cas9系统过度剪切细胞基因组或引起免疫反应。

Description

一种新型CRISPR-Cas9系统载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新型CRISPR-Cas9系统载体及其制备方法和应用。

背景技术

CRISPR-Cas9(规律成簇间隔短回文重复系统)技术是一种新型基因编辑方法，可用于基因的定点敲除，在基因治疗领域广受关注。Cas9核酸内切酶在向导核糖核酸(guideRNA，sgRNA)引导下切割双链DNA，造成基因组双链断裂，利用细胞基因组修复的不稳定性产生非特异重组来产生修复错误(插入或者缺失)。

目前有很多研究者使用CRISPR-Cas9体系敲除致病基因或者敲入有益基因进行疾病预防或者治疗，但是没有考虑基因敲除或者敲入后，CRISPR-Cas9体系可能对细胞的潜在危险：首先，Cas9蛋白作为外源蛋白，可能引起机体内的免疫反应；其次，sgRNA在细胞内作为外源核酸也有可能引起免疫反应；再次，Cas9蛋白和sgRNA同时存在，还有可能造成对细胞基因组的过度剪切。

虽然现在有案例使用RNA转染技术，直接将sgRNA和Cas9 mRNA共同转染到需要改造的细胞中，进行瞬时表达，但是这些技术较多用于体外实验，不适用于体内实验或者体内基因编辑治疗。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种新型CRISPR-Cas9系统载体及其制备方法和应用。本发明提供的载体，在CRISPR-Cas9系统后依次设置可诱导启动子和靶向Cas蛋白DNA序列的sgRNA2序列，在CRISPR-Cas9系统完成基因敲除或者基因敲入功能后，对可诱导启动子进行诱导，启动sgRNA2的表达，而sgRNA2可以引导Cas蛋白敲除Cas蛋白序列，从而实现CRISPR-Cas9系统的自清除；可避免CRISPR-Cas9系统过度剪切细胞基因组或引起免疫反应。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种载体，所述载体上按照5’-3’的方向依次包括下述功能元件：第一组成型启动子、编码Cas9蛋白的DNA序列、转录终止元件、第二组成型启动子、编码第一sgRNA序列的DNA序列、可诱导启动子、编码第二sgRNA序列的DNA序列；其中，第一sgRNA序列靶向目标基因，第二sgRNA序列靶向所述Cas9基因序列。各功能元件之间可包括0-数百bp的间隔序列。

上述载体在一种可能的实现方式中，第一组成型启动子或第二组成型启动子相互独立地选自CMV启动子、MSCV启动子或U6启动子。

上述载体在一种可能的实现方式中，Cas9蛋白选自saCas9蛋白或spCas9蛋白。

上述载体在一种可能的实现方式中，可诱导启动子包括Mx1启动子、TRE启动子、ISG15启动子、ER启动子或光敏感启动子。

上述载体在一种可能的实现方式中，第一sgRNA序列的靶向序列选自SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.15。

上述载体在一种可能的实现方式中，第二sgRNA序列的靶向序列选自SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.23。

上述载体在一种可能的实现方式中，所述载体为质粒。

上述载体在一种可能的实现方式中，所述载体包括病毒载体；可选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

上述载体在一种可能的实现方式中，所述载体包括慢病毒穿梭质粒；可选地，所述慢病毒穿梭质粒包括pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP或FG12。

本发明实施例还提供了包含所述载体的细胞。

上述细胞在一种可能的实现方式中，所述细胞为293T细胞。

上述细胞在一种可能的实现方式中，所述细胞敲除了p53基因或Rhodopsin(RHO)基因的视网膜细胞。

本发明实施例还提供了一种药物组合物，其包括所述的载体，和药学上可接受的辅料。

本发明实施例还提供了上述载体、包含所述载体的细胞、上述药物组合物在制备修饰基因或调节基因表达试剂盒或药物中的应用。

上述应用在一种可能的实现方式中，所述修饰为敲除。

本发明实施例还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：上述载体，和/或上述组合物，和/或上述细胞。

有益效果

本发明提供的载体，在CRISPR-Cas9系统后依次设置可诱导启动子和靶向Cas蛋白DNA序列的特定sgRNA2序列，在CRISPR-Cas9系统完成基因敲除或者基因敲入功能后，对可诱导启动子进行诱导，启动sgRNA2的表达，而sgRNA2可以引导Cas蛋白敲除Cas蛋白序列，从而实现CRISPR-Cas9系统的自清除；可避免CRISPR-Cas9系统过度剪切细胞基因组或引起免疫反应。

本发明提供了缺失了p53基因或Rhodopsin(RHO)基因的细胞，

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是本发明实施例1中功能元件的结构示意图。

图2是本发明实施例1中转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞和对照293T细胞中p53基因的检测电泳图，其中：mock表示对照293T细胞组，+virus表示转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞组。

图3是本发明实施例1中转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞中加入IFN-β和不加IFN-β后，检测cas9敲除效果的电泳图，其中：-IFN表示未加IFN-β的对照组，+IFN表示加入IFN-β的293T细胞组。

图4是本发明实施例2中小鼠注入或未注入慢病毒的眼球视网膜细胞cDNA PCR结果，mock表示未注射病毒组，可见Rhodopsin cDNA扩增产物105bp；+virus组为慢病毒注射组，无相应条带。

图5是本发明实施例2中注入或未注入慢病毒的眼球视网膜细胞总蛋白western结果，mock表示未注射病毒组，可见Rho蛋白；+virus组为慢病毒注射组，无相应条带。

图6是本发明实施例2中注入或未注入慢病毒的眼球又注入或未注入IFN-β后的眼球视网膜细胞cDNA PCR结果，小鼠B进行眼底视网膜注射100IU IFN-β，诱导sgRNA2表达；小鼠C不注射IFN-β，作为对照；-virus表示未注入慢病毒，+virus表示注入了慢病毒。

图7是本发明实施例2中注入或未注入慢病毒的眼球又注入或未注入IFN-β后的眼球视网膜细胞总蛋白western结果，小鼠B进行眼底视网膜注射100IU IFN-β，诱导sgRNA2表达；小鼠C不注射IFN-β，作为对照；-virus表示未注入慢病毒，+virus表示注入了慢病毒。

图8是本发明实施例3中转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞和对照293T细胞中p53基因的检测电泳图，其中：mock表示对照293T细胞组，sg1表示转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞组。

图9是本发明实施例3中转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞和对照293T细胞均分别加终浓度1ug/ml或不加Doxyclcline(Dox)诱导sgRNA2后，基因组PCR检测PCR产物中Cas9的检测电泳图，其中：mock表示对照293T细胞组，sg1表示转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞组，Dox+表示加入Dox诱导，Dox-表示未加入Dox诱导。

图10是本发明实施例4中转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞和对照293T细胞中p53基因的检测电泳图，其中：mock表示对照293T细胞组，sg1表示转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞组。

图11是本发明实施例4中转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞分别加l或不加IFN-β诱导sgRNA2后，基因组PCR检测PCR产物中Cas9的检测电泳图，其中：+IFN表示加入IFN诱导，-IFN表示未加入IFN诱导。

图12是本发明实施例5中转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞和对照293T细胞中p53基因的检测电泳图，其中：mock表示对照293T细胞组，sg1-1表示转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞组。

图13是本发明实施例5中转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞分别加或不加IFN-β诱导sgRNA2后，基因组PCR检测PCR产物中Cas9的检测电泳图，其中：+IFN表示加入IFN诱导，-IFN表示未加入IFN诱导。

图14是本发明实施例6中转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞和对照293T细胞中p53基因的检测电泳图，其中：mock表示对照293T细胞组，sg1-1表示转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞组。

图15是本发明实施例6中转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞分别加或不加IFN-β诱导sgRNA2后，基因组PCR检测PCR产物中Cas9的检测电泳图，其中：+IFN表示加入IFN诱导，-IFN表示未加入IFN诱导。

图16是本发明实施例7中转染有FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞和对照293T细胞中p53基因的检测电泳图，其中：mock表示对照293T细胞组，sg1-1表示转染有FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞组。

图17是本发明实施例7中转染有FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞分别加或不加IFN-β诱导sgRNA2后，基因组PCR检测PCR产物中Cas9的检测电泳图，其中：+IFN表示加入IFN诱导，-IFN表示未加入IFN诱导。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

本发明实施例中的分子克隆部分，如酶切、连接、PCR、凝胶电泳、胶回收、转化、转染等实验步骤，均可参照《分子克隆实验指南(第四版)》(科学出版社，J.萨姆布鲁克、M.R.格林)相关章节进行。

实施例1

1、一种载体，在本发明实施中被称为pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2，其为：在慢病毒穿梭质粒(型号为pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP)的多克隆位点插入有如下功能元件的载体，所述功能元件从5’-3’包括：

CMV启动子、saCas9蛋白、bGH polyA序列、U6启动子、sgRNA1序列、Mx1启动子、sgRNA2序列，其结构示意图如图1所示；

所述CMV启动子序列如SEQ ID NO.1所示；

所述saCas9蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，所述saCas9 mRNA序列如SEQ ID NO.3所示；

所述bGH polyA序列如SEQ ID NO.4所示；

所述U6启动子序列如SEQ ID NO.5所示；

所述sgRNA1序列为sgRNA1-1，其靶向p53基因的序列如SEQ ID NO.6所示；

所述Mx1启动子序列如SEQ ID NO.7所示；

所述sgRNA2序列为sgRNA2-1，其靶向saCas9基因的序列如SEQ ID NO.8所示。

所述慢病毒穿梭质粒pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2的构建方法包括如下步骤：

1)采用限制性内切酶AgeI和KpnI酶切pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP，得到线性化质粒。

2)设计含有CMV启动子-saCas9-bGH polyA-U6启动子-sgRNA1元件的Px601载体(实验所用PX601骨架载体为商业化载体，购自XYbscience)，使用如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示引物序列从Px601载体中PCR扩增得到CMV启动子-saCas9-bGH polyA-U6启动子-sgRNA1元件。

3)利用同源重组的方法将CMV启动子-saCas9-bGH polyA-U6启动子-sgRNA1元件连入线性化的pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP，得到pCDH-MSCV-CMV-saCas9-bGH polyA-U6-sgRNA1载体。

4)采用限制性内切酶NotI酶切pCDH-MSCV-CMV-saCas9-bGH polyA-U6-sgRNA1载体的sgRNA1 scaffold位点，酶切后得到线性化质粒。

5)利用同源重组的方法将人工合成的MX1-sgRNA2元件连入线性化的pCDH-MSCV-CMV-saCas9-bGH polyA-U6-sgRNA1载体，得到pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体。

2、转染敲除

将步骤1构建好的慢病毒穿梭质粒pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2转染到293T细胞中。

具体步骤如下：

1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的DMEM培养基(购自gibco)调整细胞密度为1.2×10⁷细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养。培养24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。

2)向一灭菌离心管中加入2μg pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体，与100μl的Opti-MEM培养基(购自gibco)混合均匀。

3)将Lipofectamine 2000(购自Invitrogen)试剂轻柔摇匀，取6μlLipofectamine 2000试剂在另一管中与100ul Opti-MEM培养基混合，在室温下温育5分钟。

4)把步骤2)所得稀释后的载体与步骤3中所得稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。

5)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。

6)将步骤5)中的DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

7)培养8h后将未转染的293T(对照)和转染的293T各自平均分至三个35mm培养皿，换10％血清的细胞培养基2ml，于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养48小时。

3、检测p53基因的敲除效果

使用PCR方法检测p53基因在293T细胞基因组中的拷贝数，检测步骤：

1)各取一个35mm培养皿放置转染有质粒的293T细胞和对照293T细胞，提取基因组；

2)使用检测引物检测p53在基因组中的拷贝数；

所用检测引物为：

F1：SEQ ID NO.11；R1：SEQ ID NO.12。

检测结果如图2所示，从图2可以看出，对照293T细胞组(图2中以“mock”表示)可见野生型p53(717bp)的基因产物；而转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2的293T细胞组(图2中以“+virus”表示)对应位置无特异性条带，说明sgRNA1-1发挥了基因敲除功能，p53基因被成功敲除。

4、检测Cas9敲除效果

检测到p53基因敲除后，使用IFN-β诱导sgRNA2表达；

1)在一个35mm培养皿放置的转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2的293T细胞中加入500IU的重组IFN-β。另一个35mm培养皿放置的转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2的293T细胞作为对照组，其不加IFN-β。

2)72h后，提取两盘293T细胞的基因组；

3)使用检测引物检测293T细胞中Cas9拷贝数：

所用的特异性PCR引物为：

F2：SEQ ID NO.13；

R2：SEQ ID NO.14；

检测结果如图3所示，由图3可以看出，对照组(未加IFN-β组，图中以“-IFN”表示)可见saCas9(910bp)的PCR产物；而加IFN-β组(图中以“+IFN”表示)的对应位置无特异性条带，说明加IFN-β诱导后，saCas9被成功敲除。即加IFN-β诱导后，sgRNA2发挥了基因敲除功能，成功敲除了Cas9基因。

实施例2

1、一种载体，其结构与实施例1所得pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的差别仅在于sgRNA1序列不同。

本实施例中所用sgRNA1序列为sgRNA1-2，其靶向Rhodopsin(RHO)基因的序列为：SEQ ID NO.15；

其构建步骤同实施例1，差别在于PCR扩增得到CMV启动子-saCas9-bGH polyA-U6启动子-sgRNA1元件使用的引物序列：

Oligo1-2F：SEQ ID NO.16；

Oligo1-2R：SEQ ID NO.17。

得到慢病毒穿梭质粒pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2。

2、包装慢病毒

使用步骤1构建完成的慢病毒穿梭质粒pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2包装慢病毒；将获得的慢病毒对小鼠进行眼底视网膜注射；

具体步骤如下：

(1)细胞转染

2)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体20μg，pHelper1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg)，加入Opti-MEM培养基(购自gibco)至总体积为2.5ml后混合均匀，在室温下温育5分钟。

3)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM培养基混合，在室温下温育5分钟。

4)把步骤2获得的稀释后的DNA溶液与步骤3中稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。

6)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

7)培养8h后除去培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。

8)每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25ml，于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养48小时。

(2)病毒的收获及浓缩

1)收集转染后48小时(转染即可为0小时计起)的293T细胞上清液。

2)于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。

3)以0.45μm滤器过滤上清液，得病毒粗提液样品。

4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。

5)组合好后，做好平衡，放在转头上。

6)在4000×g离心，使过滤杯中的样品体积至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。

7)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。

8)将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心。离心力不超过1000g，时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。

9)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80℃长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定，通过ELISA p24定量表征病毒滴度。

3、小鼠眼底注射病毒

取三只小鼠作为实验组，分别编号小鼠A，B，C，每只小鼠一侧眼球作为对照不注射病毒，另一侧注射病毒。

视网膜下腔注射方法包括下述步骤：

1)准备好相应实验物品后，将小鼠用1％阿托品散瞳，后按80mg/kg氯胺酮+8mg/kg甲苯噻嗪安腹腔内注射麻醉。

2)麻醉后再次散瞳，然后将小鼠置于眼外科手术显微镜的动物实验平台前方，在小鼠眼球上滴加0.5％丙美卡因局麻。

3)以100：1的浓度在400ng p24病毒里(病毒浓度400ng/uL)加入荧光素钠原液，用移液枪吸混，注意不要有气泡。

4)用胰岛素针在小鼠眼球睫状体平坦部预扎一个小孔，用微量注射器的针头穿过该小孔后进入小鼠眼球玻璃体腔，这时在小鼠眼球上滴加适量2％羟甲基纤维素使在镜下能清晰见到小鼠眼底，再继续将针头避开晶状体插入对侧周边的视网膜下，缓慢推入带有荧光素钠的病毒，每只眼睛注射量为1ul，以荧光素钠为指示剂判断是否注射入视网膜下腔。

5)术后观察小鼠有无异常，用生理盐水清洗眼球表面，置于笼子里等麻醉苏醒，根据小鼠情况可以给予新霉素眼膏预防感染。

4、检测Rhodopsin基因表达量

2周后，取小鼠A检测视网膜细胞中Rhodopsin蛋白表达；具体步骤如下：

1)取小鼠双眼眼球，分别分离视网膜细胞，每只眼球样品的视网膜细胞分成两份，一份样本提取总蛋白质，一份样本提取RNA；

2)RNA反转录得到cDNA，使用RT-PCR方法检测Rhodopsin基因表达量；

所用检测引物为：

F3：SEQ ID NO.18；R3：SEQ ID NO.19；

检测结果如图4所示，由图4可以看出，未注射病毒组(图4中以“mock”表示)可见Rhodopsin(105bp)的cDNA扩增产物，而注射病毒组(图4中以“+virus”表示)无相应条带。

3)对提取的小鼠视网膜细胞总蛋白使用Western Blot方法，检测Rhodopsin蛋白表达水平；分别使用Rhodopsin的内源抗体α-RHO和cas9的标签抗体anti-HA显色；以β-actin(肌动蛋白)作内参；

检测结果如图5所示，由图5可知，未注射病毒组(图5中以“mock”表示)可见Rhodopsin蛋白(简写为RHO)正常表达，而注射病毒组(图5中以“+virus”表示)未见Rhodopsin蛋白的表达。

图4和图5说明，sgRNA1-2在小鼠眼球内发挥了基因敲除功能，Rhodopsin基因被成功敲除。

5、检测Cas9和Rhodopsin基因表达量

检测到Rhodopsin基因敲除后，对小鼠B进行眼底视网膜注射100IU IFN-β，诱导sgRNA2表达；小鼠C不注射IFN-β，作为对照。

1)取小鼠B和小鼠C的眼球，分离视网膜细胞，分成两份，一份样本提取总蛋白质，一份样本提取RNA；

2)RNA反转录得到cDNA，使用RT-PCR方法检测saCAS9和Rhodopsin基因表达量；

所用的检测cas9的引物为：

F2’：SEQ ID NO 26；

R2’：SEQ ID NO 27；

所用的检测Rhodopsin的引物为：

F3：SEQ ID NO.18；

R3：SEQ ID NO.19；

检测结果如图6所示，由图6可以看出，未注射病毒组(图6中以“-virus”表示)加或不加IFN-β诱导，均可见Rhodopsin的cDNA扩增产物(105bp)，并且均没有cas9(910bp)的PCR产物。

而注射病毒组(图6中以“+virus”表示)，加或不加IFN-β诱导，均没有Rhodopsin的cDNA扩增产物，即sgRNA1-2发挥了基因敲除功能，Rhodopsin基因被成功敲除；不加IFN-β诱导时，可见cas9(910bp)的PCR产物；加了IFN诱导后，无cas9的PCR产物，即IFN诱导后，sgRNA2发挥了基因敲除功能，成功敲除了cas9基因。

3)对提取的小鼠视网膜细胞总蛋白使用Western Blot方法，检测cas9和Rhodopsin蛋白表达水平。分别使用Rhodopsin的内源抗体α-RHO和cas9的标签抗体anti-HA显色；以α-actin(肌动蛋白)作内参；

检测结果如图7所示，由图7可知，未注射病毒组(图7中以“-virus”表示)加或不加IFN-β诱导，均可见Rhodopsin蛋白正常表达，并且均没有cas9蛋白的表达。

而注射病毒组(图7中以“+virus”表示)，加或不加IFN-β诱导，均可见Rhodopsin的表达显著减弱，即sgRNA1-2发挥了基因敲除功能，Rhodopsin基因被成功敲除；不加IFN-β诱导时，可见cas9蛋白的表达；加了IFN诱导后，未见cas9蛋白的表达，即IFN诱导后，sgRNA2发挥了基因敲除功能，成功将cas9基因完全敲除。

图6和图7说明，在小鼠眼球内，IFN诱导后，sgRNA2发挥基因敲除功能，成功将cas9完全清除，可避免CRISPR-Cas9系统过度剪切细胞基因组或引起免疫反应。

实施例3

1、一种载体，所述载体为慢病毒穿梭质粒pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2，其结构同实施例1，差别仅在于诱导型启动子不同。

本实施例中，所用的诱导型启动子为TRE启动子，其序列如SEQ ID NO.20所示。

其构建步骤参照实施例1，差别在于步骤5)利用同源重组的方法将人工合成的TRE-sgRNA2元件连入线性化的pCDH-MSCV-CMV-saCas9-bGH polyA-U6-sgRNA1载体，即得到pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体。

将本实施例所得pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体转染293T细胞，检测p53的敲除效果，实验步骤同实施例1，结果如图8所示。图8中将未转染pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的对照293T和转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞提取基因组，使用实施例1中的检测引物检测p53在基因组中的拷贝数。mock表示对照293T细胞组，sg1表示转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞组，对照组可见野生型p53的基因产物717bp，转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞对应位置无特异性条带。说明p53基因被敲除。

检测到p53基因被敲除后，对未转染pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的对照293T和转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞各准备两盘，分别加终浓度1ug/ml或不加Doxyclcline(Dox)诱导sgRNA2表达，72h后提取基因组；使用PCR引物F2和R2检测Cas9的拷贝数，结果如图9所示。由图9可以看出，未转染pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的对照293T无论是否加入Doxyclcline，都无Cas9的PCR产物；转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞未加Dox进行诱导时，具有PCR产物，加入Dox组的对应位置无Cas9的PCR产物特异性条带，说明加Dox诱导后，sgRNA2发挥了基因敲除功能，成功敲除了cas9基因。

实施例4

本实施例中，所用的诱导型启动子为重组IFN-β诱导的ISG15启动子，其序列如SEQID NO.21所示。

其构建步骤参照实施例1，差别在于步骤6)利用同源重组的方法将基因合成的ISG15-sg2元件连入线性化的pCDH-MSCV-CMV-saCas9-bGH polyA-U6-sgRNA1，即得到pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体。

将本实施例所得pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体转染293T细胞，检测p53的敲除效果，实验步骤同实施例1，结果如图10所示。图10中将未转染pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的对照293T和转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞提取基因组，使用实施例1中的检测引物检测p53在基因组中的拷贝数。mock表示对照293T细胞组，sg1表示转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞组，对照组可见野生型p53的基因产物717bp，转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞对应位置无特异性条带。说明p53基因被敲除。

检测到p53基因被敲除后，对转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞准备两盘，分别加或不加500IU的重组IFN-β诱导sgRNA2表达，72h后提取基因组；使用PCR引物F2和R2检测Cas9的拷贝数，结果如图11所示。由图11可以看出，转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞未加IFN-β进行诱导时，具有PCR产物，加入IFN-β组的对应位置无Cas9的PCR产物特异性条带，说明加IFN-β诱导后，sgRNA2发挥了基因敲除功能，成功敲除了cas9基因。

实施例5

1、一种载体，所述载体为慢病毒穿梭质粒pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2，其结构同实施例1，差别仅在于sgRNA2序列不同。

本实施例中，所用sgRNA2的靶向序列如SEQ ID NO.22所示。

其构建步骤参照实施例1，差别在于步骤5)中人工合成的MX1-sgRNA2元件的序列不同。

将本实施例所得pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体转染293T细胞，检测p53的敲除效果，实验步骤同实施例1，结果如图12所示。图12中将未转染pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的对照293T和转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞提取基因组，使用实施例1中的检测引物检测p53在基因组中的拷贝数。mock表示对照293T细胞组，sg1-1表示转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞组，对照组可见野生型p53的基因产物717bp，转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞对应位置无特异性条带。说明p53基因被敲除。

检测到p53基因被敲除后，对转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞准备两盘，分别加或不加500IU的重组IFN-β诱导sgRNA2表达，72h后提取基因组；使用PCR引物F2和R2检测Cas9的拷贝数，结果如图13所示。由图13可以看出，转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞未加IFN-β进行诱导时，具有PCR产物，加入IFN-β组的对应位置无Cas9的PCR产物特异性条带，说明加IFN-β诱导后，sgRNA2发挥了基因敲除功能，成功敲除了cas9基因。

实施例6

本实施例中，所用sgRNA2序列的靶向序列如SEQ ID NO.23所示。

其构建步骤参照实施例1，差别在于步骤5)基因合成的MX1-sgRNA2元件的序列不同。

将本实施例所得pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体转染293T细胞，检测p53的敲除效果，实验步骤同实施例1，结果如图14所示。图14中将未转染pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的对照293T和转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞提取基因组，使用实施例1中的检测引物检测p53在基因组中的拷贝数。mock表示对照293T细胞组，sg1-1表示转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞组，对照组可见野生型p53的基因产物717bp，转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞对应位置无特异性条带。说明p53基因被敲除。

检测到p53基因被敲除后，对转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞准备两盘，分别加或不加500IU的重组IFN-β诱导sgRNA2表达，72h后提取基因组；使用PCR引物F2和R2检测Cas9的拷贝数，结果如图15所示。由图15可以看出，转染有pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞未加IFN-β进行诱导时，具有PCR产物，加入IFN-β组的对应位置无Cas9的PCR产物特异性条带，说明加IFN-β诱导后，sgRNA2发挥了基因敲除功能，成功敲除了cas9基因。

实施例7

1、一种载体，在本发明实施中被称为FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2，其为：在慢病毒穿梭质粒(型号为FG12,Addgene#14884)的多克隆位点插入有如下功能元件的载体，所述功能元件从5’-3’包括：

CMV启动子、saCas9蛋白、bGH polyA序列、U6启动子、sgRNA1序列、Mx1启动子、sgRNA2序列，该功能元件中各部分的序列如实施例1。

所述慢病毒穿梭质粒FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2的构建方法包括如下步骤：

所述慢病毒穿梭质粒FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2的构建在FG12(Addgene#14884)和pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2的基础上完成。构建方法包括如下步骤：

1)采用限制性内切酶XhoI和BsrGI酶切FG12，得到线性化质粒。

2)CMV启动子-saCas9-bGH polyA-U6启动子-sgRNA1-MX1-sgRNA2元件从pCDH-MSCV-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒中PCR得到，所用PCR引物为：

FG12-Cas9-F：SEQ ID NO.24；

FG12-sgRNA2-R：SEQ ID NO.25。

3)利用同源重组的方法将PCR扩增得到的CMV启动子-saCas9-bGH polyA-U6启动子-sgRNA1-MX1-sgRNA2元件连入线性化的FG12，得到FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2。

将本实施例所得FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2载体转染293T细胞，检测p53的敲除效果，实验步骤同实施例1，结果如图16所示。图16中将未转染FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的对照293T和转染有FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞提取基因组，使用实施例1中的检测引物检测p53在基因组中的拷贝数。mock表示对照293T细胞组，sg1-1表示转染有FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2质粒的293T细胞组，对照组可见野生型p53的基因产物717bp，转染有FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞对应位置无特异性条带。说明p53基因被敲除。

检测到p53基因被敲除后，对转染有FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞准备两盘，分别加或不加500IU的重组IFN-β诱导sgRNA2表达，72h后提取基因组；使用PCR引物F2和R2检测Cas9的拷贝数，结果如图17所示。由图17可以看出，转染有FG12-sa-sgRNA1-sgRNA2载体的293T细胞未加IFN-β进行诱导时，具有PCR产物，加入IFN-β组的对应位置无Cas9的PCR产物特异性条带，说明加IFN-β诱导后，sgRNA2发挥了基因敲除功能，成功敲除了cas9基因。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京中因科技有限公司

<120> 一种新型CRISPR-Cas9系统载体及其制备方法和应用

<130> 1053-190301F

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 588

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc 60

atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact 120

gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat 180

gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact 240

tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac 300

atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac 360

gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac 420

tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga 480

gctctctggc taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac 540

tatagggaga cccaagctgg ctagcgttta aacttaagct tggtaccg 588

<210> 2

<211> 1085

<212> PRT

<213> saCAS9

<400> 2

Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala

1 5 10 15

Ala Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val

20 25 30

Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly

35 40 45

Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg

50 55 60

Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile

65 70 75 80

Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His

85 90 95

Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu

100 105 110

Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu

115 120 125

Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr

130 135 140

Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala

145 150 155 160

Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys

165 170 175

Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr

180 185 190

Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln

195 200 205

Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg

210 215 220

Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys

225 230 235 240

Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe

245 250 255

Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr

260 265 270

Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn

275 280 285

Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe

290 295 300

Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu

305 310 315 320

Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys

325 330 335

Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr

340 345 350

Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala

355 360 365

Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu

370 375 380

Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser

385 390 395 400

Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile

405 410 415

Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala

420 425 430

Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln

435 440 445

Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro

450 455 460

Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile

465 470 475 480

Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg

485 490 495

Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys

500 505 510

Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr

515 520 525

Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp

530 535 540

Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu

545 550 555 560

Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro

565 570 575

Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys

580 585 590

Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu

595 600 605

Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile

610 615 620

Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu

625 630 635 640

Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp

645 650 655

Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu

660 665 670

Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys

675 680 685

Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp

690 695 700

Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp

705 710 715 720

Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys

725 730 735

Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys

740 745 750

Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu

755 760 765

Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp

770 775 780

Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile

785 790 795 800

Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu

805 810 815

Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu

820 825 830

Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His

835 840 845

Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly

850 855 860

Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr

865 870 875 880

Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile

885 890 895

Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp

900 905 910

Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr

915 920 925

Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val

930 935 940

Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser

945 950 955 960

Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala

965 970 975

Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly

980 985 990

Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile

995 1000 1005

Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn

1010 1015 1020

Met Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser

1025 1030 1035

Lys Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn

1040 1045 1050

Leu Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys

1055 1060 1065

Gly Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys

1070 1075 1080

Lys Lys

1085

<210> 3

<211> 3255

<212> RNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

auggccccaa agaagaagcg gaaggucggu auccacggag ucccagcagc caagcggaac 60

uacauccugg gccuggacau cggcaucacc agcgugggcu acggcaucau cgacuacgag 120

acacgggacg ugaucgaugc cggcgugcgg cuguucaaag aggccaacgu ggaaaacaac 180

gagggcaggc ggagcaagag aggcgccaga aggcugaagc ggcggaggcg gcauagaauc 240

cagagaguga agaagcugcu guucgacuac aaccugcuga ccgaccacag cgagcugagc 300

ggcaucaacc ccuacgaggc cagagugaag ggccugagcc agaagcugag cgaggaagag 360

uucucugccg cccugcugca ccuggccaag agaagaggcg ugcacaacgu gaacgaggug 420

gaagaggaca ccggcaacga gcuguccacc aaagagcaga ucagccggaa cagcaaggcc 480

cuggaagaga aauacguggc cgaacugcag cuggaacggc ugaagaaaga cggcgaagug 540

cggggcagca ucaacagauu caagaccagc gacuacguga aagaagccaa acagcugcug 600

aaggugcaga aggccuacca ccagcuggac cagagcuuca ucgacaccua caucgaccug 660

cuggaaaccc ggcggaccua cuaugaggga ccuggcgagg gcagccccuu cggcuggaag 720

gacaucaaag aaugguacga gaugcugaug ggccacugca ccuacuuccc cgaggaacug 780

cggagcguga aguacgccua caacgccgac cuguacaacg cccugaacga ccugaacaau 840

cucgugauca ccagggacga gaacgagaag cuggaauauu acgagaaguu ccagaucauc 900

gagaacgugu ucaagcagaa gaagaagccc acccugaagc agaucgccaa agaaauccuc 960

gugaacgaag aggauauuaa gggcuacaga gugaccagca ccggcaagcc cgaguucacc 1020

aaccugaagg uguaccacga caucaaggac auuaccgccc ggaaagagau uauugagaac 1080

gccgagcugc uggaucagau ugccaagauc cugaccaucu accagagcag cgaggacauc 1140

caggaagaac ugaccaaucu gaacuccgag cugacccagg aagagaucga gcagaucucu 1200

aaucugaagg gcuauaccgg cacccacaac cugagccuga aggccaucaa ccugauccug 1260

gacgagcugu ggcacaccaa cgacaaccag aucgcuaucu ucaaccggcu gaagcuggug 1320

cccaagaagg uggaccuguc ccagcagaaa gagaucccca ccacccuggu ggacgacuuc 1380

auccugagcc ccgucgugaa gagaagcuuc auccagagca ucaaagugau caacgccauc 1440

aucaagaagu acggccugcc caacgacauc auuaucgagc uggcccgcga gaagaacucc 1500

aaggacgccc agaaaaugau caacgagaug cagaagcgga accggcagac caacgagcgg 1560

aucgaggaaa ucauccggac caccggcaaa gagaacgcca aguaccugau cgagaagauc 1620

aagcugcacg acaugcagga aggcaagugc cuguacagcc uggaagccau cccucuggaa 1680

gaucugcuga acaaccccuu caacuaugag guggaccaca ucauccccag aagcgugucc 1740

uucgacaaca gcuucaacaa caaggugcuc gugaagcagg aagaaaacag caagaagggc 1800

aaccggaccc cauuccagua ccugagcagc agcgacagca agaucagcua cgaaaccuuc 1860

aagaagcaca uccugaaucu ggccaagggc aagggcagaa ucagcaagac caagaaagag 1920

uaucugcugg aagaacggga caucaacagg uucuccgugc agaaagacuu caucaaccgg 1980

aaccuggugg auaccagaua cgccaccaga ggccugauga accugcugcg gagcuacuuc 2040

agagugaaca accuggacgu gaaagugaag uccaucaaug gcggcuucac cagcuuucug 2100

cggcggaagu ggaaguuuaa gaaagagcgg aacaaggggu acaagcacca cgccgaggac 2160

gcccugauca uugccaacgc cgauuucauc uucaaagagu ggaagaaacu ggacaaggcc 2220

aaaaaaguga uggaaaacca gauguucgag gaaaagcagg ccgagagcau gcccgagauc 2280

gaaaccgagc aggaguacaa agagaucuuc aucacccccc accagaucaa gcacauuaag 2340

gacuucaagg acuacaagua cagccaccgg guggacaaga agccuaauag agagcugauu 2400

aacgacaccc uguacuccac ccggaaggac gacaagggca acacccugau cgugaacaau 2460

cugaacggcc uguacgacaa ggacaaugac aagcugaaaa agcugaucaa caagagcccc 2520

gaaaagcugc ugauguacca ccacgacccc cagaccuacc agaaacugaa gcugauuaug 2580

gaacaguacg gcgacgagaa gaauccccug uacaaguacu acgaggaaac cgggaacuac 2640

cugaccaagu acuccaaaaa ggacaacggc cccgugauca agaagauuaa guauuacggc 2700

aacaaacuga acgcccaucu ggacaucacc gacgacuacc ccaacagcag aaacaagguc 2760

gugaagcugu cccugaagcc cuacagauuc gacguguacc uggacaaugg cguguacaag 2820

uucgugaccg ugaagaaucu ggaugugauc aaaaaagaaa acuacuacga agugaauagc 2880

aagugcuaug aggaagcuaa gaagcugaag aagaucagca accaggccga guuuaucgcc 2940

uccuucuaca acaacgaucu gaucaagauc aacggcgagc uguauagagu gaucggcgug 3000

aacaacgacc ugcugaaccg gaucgaagug aacaugaucg acaucaccua ccgcgaguac 3060

cuggaaaaca ugaacgacaa gaggcccccc aggaucauua agacaaucgc cuccaagacc 3120

cagagcauua agaaguacag cacagacauu cugggcaacc uguaugaagu gaaaucuaag 3180

aagcacccuc agaucaucaa aaagggcaaa aggccggcgg ccacgaaaaa ggccggccag 3240

gcaaaaaaga aaaag 3255

<210> 4

<211> 208

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagagaa tagcaggcat gctgggga 208

<210> 5

<211> 241

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

c 241

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 6

agcaaagttt tattgtaaaa t 21

<210> 7

<211> 1704

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

cctggatggg taagcagcca tgcaagggtt ccttgataat tgctggagaa gcctgtgttc 60

tcccattaga ctccagcaga gggccccata gaacatgcca gacttcaggc cagggagctg 120

ctctgtgtgg cctcctcccc ttcttttggg tgccaccaca ttgaaattgg ttccatccaa 180

gttttcccga tgtggctgaa gaatgtcacc agccatatca gtagacaaaa gaaattgcag 240

ccatcacgcc agcagccact gcattttttg acctgtgact gtacgtcctt caggggttca 300

ggatgaggaa aagcaggatg ctggccctag acagccaagg tgcacatcaa aggaataatt 360

tcaaggagcc cagactcttg catcttccca tgcatagaat aagtgctgaa ttcatgaact 420

tgggatgtct ggtttttctt taagtaacaa taactttgtt aatattttca ctacctggat 480

tttgttgcaa aaactcctat atgttctggc tcctctctga cctgtttgct gccgtcccta 540

agagcaatct gagaggctgt cttccagggt aagtcctcag caagtccacc aagtaaaata 600

taattctcaa tttttttagg tgtgtagttt ttttttttta aagtcaacat tgtagcccag 660

cacttggaaa aggggcagtt ctgggtcttt gtgtaggggg caggtgaccc tctataacca 720

caggagtctt tgtggggagg atacttgttg tccaggcttc ttagctgagc caaggaggat 780

ggaggtgggc tttccaaaat gaaattttac tcctcatccc caaagccctc cgggagggct 840

catctttggg tctatttgac cttggtcccc cactttctac tcatttccat cctgaagaaa 900

tcaaatgagc taaacttcag ggagggcttg ggacttccct ggtggtccag ggaacctttt 960

gcttccgatt cagggggcac aggtccgatc cctggtcaag aaaccaagat ctcacacgac 1020

atgcagagtg gtcaagagat ttaaaggtgg gtggaggggg cggtgcttga agaggataag 1080

gaaaattgag aaaggagcct gatgtaggtc tgggtgagga gggggctaag ggggtagctc 1140

cctagcatgc ttgagaatcc ctacgggcgc tggaatgttc ccagtgaacc tacagcagaa 1200

gtttgatacc caattatcaa tgcatctgtt caaacaacca aaggttaagg ttagccaggt 1260

tccaagctac cttcggcttt ggatgactcg gggctgcttg agcagaggtt ctcaaactgc 1320

cagaaacttc agaagggccg gataaagctc gggtagctgg gtcctactcc cgagtttctg 1380

gggcagcagg tctgggtgcg ggccgagaat ttgcatttcc cgcaagctcc tagggatgcc 1440

gttggtgcgg ggcgcaccta gagtgcttct gggaggatac agctgagggt gctgggcgca 1500

gcgacctcgg gaggcgccgg tgcgcaagtg cgctacccgt tcgatttggg tttcggtttc 1560

ctttccgatt cagcagccct gaaaactcta cgagtttcgt ttcccagagg ctgggtggga 1620

gatgacggac ggggaggcgg gggcagcgag ctgggggcgg cgctagcgct gcataaagcc 1680

gaggagggcc agcgccggga gccc 1704

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 8

gaacagcagc ttcttcactc t 21

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

tcttgaaagg agtgggaatt ctcgaggcgt tgacattgat tattgactag t 51

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

taagtcattg gtcttaaagc ggccgcaaaa atctcgccaa caagttgac 49

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

ggcccacctc ttaccgattt 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

caggagccat tgtctttgag g 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

ggcggcatag aatccagaga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

tcctcgctgc tctggtagat 20

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> human

<400> 15

gtagccatgg agtgatgtgt agagggt 27

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

caccggtagc catggagtga tgtgtagagg gt 32

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

aaacaccctc tacacatcac tccatggcta cc 32

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

ccaccaccct ctacacatca c 21

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

accacagggc gatttcacc 19

<210> 20

<211> 247

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

tccctatcag tgatagagaa cgatgtcgag tttactccct atcagtgata gagaacgtat 60

gtcgagttta ctccctatca gtgatagaga acgtatgtcg agtttactcc ctatcagtga 120

tagagaacgt atgtcgagtt tatccctatc agtgatagag aacgtatgtc gagtttactc 180

cctatcagtg atagagaacg tatgtcgagg taggcgtgta cggtgggagg cctatataag 240

cagagct 247

<210> 21

<211> 2000

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

cccactcccc ctccctggcc cccggtaacg gggtcggctt cctgtgctgc ggctctacca 60

gttccggtcg tttcccctgc ggtgaatgga accaacactc tgcggccttc gtgtctggct 120

ctttccactt agcataacgt tttcaaggtt ctttcacatg aatcagtgcc tcagtccttt 180

tcatggctgc ataatattcc gttgtgtgga cattccacac tttgtgtgtc catccatcac 240

tgatggacat gtgctccgtt cctgctactt gtttattgta aactgtgctg ccatggacat 300

ttgtatgcaa gtatttgaac acctattttc aattcttttg gacacatgcc tagaagtgga 360

actgctgggt tcccaataat tctgttgaac gttttgagca tcgcggcggc cgcactgttt 420

tacattctca acagcaatgc atgtaccagg attccagttc ctctatgtat tccccagtgc 480

ttgttactgc ctttatgttt attttatatt attttttgag actgtcttgc tctgctgccc 540

aggctggagt gcattggtgc aatcttggct caccacaatc tctgcctcct gggttcaagg 600

gattctcccg cctcagcctc ccaagtagct gggattacag gcgtgcacca ccacgcccag 660

ctaatttttg tatttttagt agagatgggg tttctactaa aaatgttggc caggctggtc 720

tcaaactcct gaccttaggt gatccgcccg cctcagcctc ccaaagtgtt gggattgcag 780

gcgtgagcca ccgcacccgg cctggccttt atttttatta ttacagtcat accagcagga 840

aatagcatct cactggggtt ttgatttgca tttccccaat taataatgat gttgaacatc 900

actttacagc cgtttctatg tcattggaga aatgtctatt gaagtctttt ggccatttga 960

aaattgagtt gccttttttt tttattttta ttttttattg agttgtaaga gttctctata 1020

tgtcctggat gctatgccct catcagatag ataatttgca aatatttctt cccattctat 1080

ggattgtctt ttcactttct caatagtgtc ccagagttca tttttgtaga aaataaaaga 1140

taggtctctt ttattaaaaa acaatctgag gctccgggtg cagtggctca cgcctgtaat 1200

cccagcagtt tcagaggccg aggcaggtgg atcacttgag cccaggagtt cgagatcagc 1260

ctgggcgaca tggcgagacc cccatctcta ctaaaaatac aaaaaattag ccgggcctgg 1320

tggtgcaccc ctgtggtccc agctacgtgg gaggctgagg tgagaggatc gctttagcct 1380

ggcaggcgga ggttgcaatg agatgagatc gtgcctctgc actccagcct gggcgacaga 1440

gtgagagacc ctgtctcaaa aacacaaaaa caacaacaaa aaaacaccaa tctgagcaaa 1500

tactgcccta aaccgagtgt tgttatctct gggtagtttg gagttcttgt ttctcaatta 1560

accatgggga tgttttccaa gtttactaat tttgcaagtt ggtaaatgga aaatgaaacc 1620

attagtccat gtgatgacag ctttagtgca tcctgtgaag gatctggaat gcgcgatatt 1680

taggtgtttc cagggtgttg ggtgggggtg gggatgccgt ccgctgtccg gagtccccgc 1740

cacttttgct tttccctgtc tttcggtcat tcggttttgt ttcttccgct cactctgggg 1800

catgcctcgg gaaagggaaa ccgaaactga agccaaattt ggccaccagc gcaggctcgg 1860

cggcacgccc cctgacgtgt gtgcctcagg cttataatag ggccggtgct gcctgccgaa 1920

gccggcggct gagaggcagc gaactcatct ttgccagtac aggagcttgt gccgtggccc 1980

acagcccaca gcccacagcc 2000

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> human

<400> 22

aagcggaagg tcggtatcca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> human

<400> 23

gagccagaag ctgagcgagg 20

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

agttaacatc tcgaggcgtt gacattgatt attgactagt 40

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

ggactagagt cgcggccgct tctcgccaac aagttgacga 40

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

aagagcagat cagccggaac 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

aagcttctct tcacgacggg 20

Claims

1.一种载体，其特征在于：所述载体上按照5’-3’的方向依次包括下述功能元件：第一组成型启动子、编码Cas9蛋白的DNA序列、转录终止元件、第二组成型启动子、编码第一sgRNA序列的DNA序列、可诱导启动子、编码第二sgRNA序列的DNA序列；其中，第一sgRNA序列靶向目标基因，第二sgRNA序列靶向所述Cas9基因序列。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：第一组成型启动子或第二组成型启动子相互独立地选自CMV启动子、MSCV启动子或U6启动子；

和/或，Cas9蛋白包括saCas9蛋白或spCas9蛋白基因序列；

和/或，可诱导启动子包括Mx1启动子、TRE启动子、ISG15启动子、ER启动子或光敏感启动子；

和/或，第一sgRNA序列的靶向序列选自SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.15；

和/或，第二sgRNA序列的靶向序列选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.23。

3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述载体包括质粒。

4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述载体包括病毒载体；可选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

5.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述载体包括慢病毒穿梭质粒；可选地，所述慢病毒穿梭质粒包括pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP或FG12。

6.一种包含权利要求1-5之一所述载体的细胞。

7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于：所述细胞为293T细胞。

8.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于：所述细胞为敲除了p53基因或Rhodopsin(RHO)基因的视网膜细胞。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1-5之一所述载体，和药学上可接受的辅料。

10.一种权利要求1-5之一所述的载体、权利要求6所述的细胞、权利要求9所述的药物组合物在制备修饰基因或调节基因表达试剂盒或药物中的应用。