CN115003820A - 用于眼部治疗的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于表达基质金属蛋白酶3(MMP‑3)的重组腺相关病毒(AAV)颗粒的单位剂量。还提供了重组MMP‑3的单位剂量。还提供了所述单位剂量的使用方法，例如，用于转导受试者的角膜内皮；降低受试者眼部的眼压；治疗和/或预防受试者的眼压升高；以及治疗和/或预防受试者的青光眼的使用方法。受试者包括灵长类。

Description

用于眼部治疗的组合物和方法

技术领域

本公开涉及眼部治疗，包括使用腺相关病毒(AAV)载体递送治疗基因。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年10月8日提交的美国临时专利申请第62/912,427号的优先权，该临时专利申请的公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。

序列表的并入

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背景技术

由于睫状突的房水(AH)产生与房水流出通过包含小梁网(TM)和Schlemm管(SC)的常规流出路径的流体动力学阻力之间平衡，眼压得以维持(IOP)。可因AH流出阻力增加而引起的IOP升高是开角型青光眼的主要风险因素。基质金属蛋白酶(MMP)在其重塑细胞外基质的能力方面促成常规的房水流出稳态，这对房水流出阻力和IOP具有直接影响。与年龄匹配的正常眼压对照AH相比，已在人青光眼AH中观察到MMP-3活性降低。与对照AH或外源MMP-3补充治疗相比时，青光眼AH的治疗引起SC内皮和TM细胞单层的跨内皮阻力显著增加和单层渗透性降低。

对于用于IOP升高的基因治疗或基于重组蛋白的治疗的改良组合物和方法的需求仍未满足。本公开提供了此类新型组合物和方法来处理和解决这种需求。

发明内容

在一个方面，提供了用于眼部治疗的组合物和方法。在一个方面，组合物可用于治疗某些眼部疾病。在一些方面，组合物包括MMP-3的核酸和蛋白质序列。

在一些方面，本公开提供了一种单位剂量，所述单位剂量包含多个重组腺相关病毒血清型9(rAAV9)颗粒，其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是非复制型的，并且其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9包含多核苷酸，所述多核苷酸从5′到3′包含：(a)编码5′反向末端重复序列(ITR)的序列；(b)编码启动子的序列；(c)编码人基质金属蛋白酶3(hMMP-3)的序列；(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；以及(e)编码3′ITR的序列；并且其中所述单位剂量包含1×10¹⁰个载体基因组(vg)至5×10¹²vg的rAAV9颗粒，包括端值在内。

在一些实施方案中，所述单位剂量是(i)无菌的并且(ii)包含药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是单链AAV(ssAAV)载体。在一些实施方案中，所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是自我互补AAV(scAAV)载体。在一些实施方案中，所述启动子包含CMV启动子，并且其中编码所述CMV启动子的所述序列包含下述序列或由下述序列组成：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:19的序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的其功能变体。在一些实施方案中，编码人MMP-3的所述序列包含下述核苷酸序列或由下述核苷酸序列组成，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:22的MMP-3氨基酸序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的其功能变体。在一些实施方案中，编码所述MMP-3氨基酸序列的所述核苷酸序列包含野生型核苷酸序列。在一些实施方案中，编码MMP-3的所述序列包含以下各项或由以下各项组成：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的核苷酸序列，或与其共有至少80％、90％、95％、97％、99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码所述5′ITR的所述序列源自AAV血清型2(AAV2)的5′ITR序列。在一些实施方案中，编码所述5′ITR的所述序列包含与AAV2的5′ITR的序列相同的序列。在一些实施方案中，编码5′ITR的所述序列包含以下各项或由以下各项组成：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码3′ITR的所述序列源自AAV2的3′ITR序列。在一些实施方案中，编码3′ITR的所述序列包含与AAV2的3′ITR的序列相同的序列。在一些实施方案中，编码3′ITR的所述序列包含以下各项或由以下各项组成：SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16-18中任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码polyA信号的序列包含人生长激素(hGH)polyA序列。在一些实施方案中，编码hGH polyA信号的序列包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，所述Kozak序列包含CGCCACCATG(SEQ ID NO:21)的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含(SEQ ID NO：载体)的序列或由所述序列组成。在一些实施方案中，所述rAAV9颗粒包含分离自或源自AAV血清型9(AAV9)Cap蛋白的病毒Cap蛋白。在一些方面，本公开提供一种单位剂量，所述单位剂量包含重组基质金属蛋白酶3(MMP-3)蛋白，其中所述单位剂量包含1毫克/毫升(mg/mL)至500mg/mL的重组MMP-3蛋白，包括端值在内；或0.1纳克(ng)至10ng的重组MMP-3蛋白，包括端值在内。在一些实施方案中，单位剂量包含约10ng/mL的重组MMP-3蛋白。在一些实施方案中，所述重组MMP-3蛋白是人MMP-3蛋白。在一些实施方案中，所述重组MMP-3蛋白具有包含下述序列或由下述序列组成的多肽序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:22的序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的其功能变体或功能片段。

在一些方面，本公开提供了一种转导受试者的角膜内皮的方法，所述方法包括施用有效量的本文所述的单位剂量，其中所述受试者是灵长类。在一些实施方案中，以0.01ng/mL至约10ng/mL(包括端值在内)、0.01ng/mL至约500ng/mL(包括端值在内)或0.01ng/mL至约1000ng/mL且包括端值在内的测量浓度，施用有效量的所述单位剂量引起所述受试者的眼房水中的MMP-3表达。在一些实施方案中，所述测量浓度大于或等于1ng/mL。在一些实施方案中，所述测量浓度小于或等于10ng/mL。在一些实施方案中，所述测量浓度为1-10ng/mL，包括端值在内。在一些实施方案中，所述测量浓度为至少1-3ng/mL，包括端值在内。在一些实施方案中，所述MMP-3表达维持至少21天、42天、56天或66天。在一些实施方案中，所述MMP-3表达维持至少90天。在一些实施方案中，房水中的MMP-3表达通过蛋白质印迹(Western Blot)或ELISA测量。在一些实施方案中，所述方法使房水流畅度增加至少25％或至少30％。在一些实施方案中，所述房水流畅度的增加发生在所述施用步骤约66天内。在一些实施方案中，其中角膜厚度相对于在所述施用步骤之前所述受试者的角膜厚度和/或相对于施用对照单位剂量的受试者的角膜厚度保持不变。在一些实施方案中，所述方法不引起炎性反应。在一些实施方案中，所述方法未引起在所述受试者的血清中MMP-3的血清水平升高超过MMP-3的基线水平。在一些实施方案中，所述施用步骤包括将所述单位剂量经前房内注射到所述受试者的至少一只眼中。

在一些方面，本公开提供了一种降低受试者至少一只眼的眼压(IOP)的方法，所述方法包括施用有效量的本文所述的单位剂量，其中所述受试者是灵长类。在一些实施方案中，以0.01ng/mL至约10ng/mL且包括端值在内的测量浓度，施用有效量的所述单位剂量引起所述受试者的眼房水中的MMP-3表达。在一些实施方案中，所述测量浓度大于或等于1ng/mL。在一些实施方案中，所述测量浓度小于或等于10ng/mL。在一些实施方案中，所述测量浓度为1-10ng/mL，包括端值在内。在一些实施方案中，所述测量浓度为至少1-3ng/mL，包括端值在内。在一些实施方案中，所述MMP-3表达维持至少21天、42天、56天或66天。在一些实施方案中，所述MMP-3表达维持至少90天。在一些实施方案中，所述MMP-3表达通过蛋白质印迹或ELISA测量。在一些实施方案中，所述方法使房水流畅度增加至少25％或至少30％。在一些实施方案中，所述方法降低眼压(IOP)。在一些实施方案中，角膜厚度相对于在所述施用步骤之前所述受试者的角膜厚度和/或相对于施用对照单位剂量的受试者的角膜厚度保持不变。在一些实施方案中，所述方法不引起炎性反应。在一些实施方案中，所述方法未引起在所述受试者的血清中MMP-3的血清水平升高超过MMP-3的基线水平。在一些实施方案中，所述施用步骤包括将所述单位剂量注射到所述受试者的至少一只眼的角膜中。在一些实施方案中，所述施用步骤包括将所述单位剂量注射到所述受试者的至少一只眼的颞侧角膜中。在一些实施方案中，所述施用步骤包括将所述单位剂量经前房内注射到所述受试者的至少一只眼中。

在一些方面，本公开提供了一种治疗和/或预防有需要的受试者的IOP升高和/或青光眼的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的单位剂量，其中所述受试者是灵长类。

在一些方面，本公开提供了一种转导受试者的角膜内皮的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的单位剂量，所述单位剂量包含多个重组腺相关病毒血清型9(rAAV9)颗粒，其中所述受试者是灵长类；其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是非复制型的；其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是单链AAV(ssAAV)；其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9包含多核苷酸，所述多核苷酸从5′到3′包含：(a)编码5′反向末端重复序列(ITR)的序列；(b)编码启动子的序列；(c)编码基质金属蛋白酶3(MMP-3)的序列；(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；以及(e)编码3′ITR的序列；并且其中所述单位剂量包含(i)1×10¹⁰个载体基因组(vg)至5×10¹²vg的rAAV9颗粒，包括端值在内；或(ii)约1×10¹¹个载体基因组(vg)/毫升(mL)至1×10¹⁴vg/mL的rAAV9颗粒；并且其中以0.01ng/mL至约10ng/mL且包括端值在内的测量浓度，施用有效量的所述单位剂量引起所述受试者的眼房水中的MMP-3表达。在一些实施方案中，编码MMP-3的所述序列包含以下各项或由以下各项组成：SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的核苷酸序列，或与其共有至少80％、90％、95％、97％、99％的序列同一性。

在一些方面，本公开提供了一种转导受试者的角膜内皮的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的单位剂量，所述单位剂量包含多个重组腺相关病毒血清型9(rAAV9)颗粒，其中所述受试者是灵长类；其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是非复制型的；其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是单链AAV(ssAAV)；其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9包含多核苷酸，所述多核苷酸从5′到3′包含：(a)编码5′反向末端重复序列(ITR)的序列；(b)编码启动子的序列；(c)编码转基因的序列；(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；(e)编码3′ITR的序列。

在一些方面，本公开提供了一种基因治疗载体，所述基因治疗载体包含表达盒，所述表达盒包含任选地与启动子可操作地连接的编码人基质金属蛋白酶3(hMMP-3)的转基因或其功能变体，其中所述转基因经优化用于在人宿主细胞中表达。在一些实施方案中，人宿主细胞是人角膜内皮细胞。在一些实施方案中，所述转基因与选自SEQ ID NO:23-27的序列共有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，所述转基因包含选自SEQ ID NO:23-27的序列。在一些实施方案中，所述转基因与SEQ ID NO:23共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:23是相同的。在一些实施方案中，所述转基因与SEQ ID NO:24共有至少95％同一性或与SEQ IDNO:24是相同的。在一些实施方案中，所述转基因与SEQ ID NO:25共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:25是相同的。在一些实施方案中，所述转基因与SEQ ID NO:26共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:26是相同的。在一些实施方案中，所述转基因与SEQ ID NO:27共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:27是相同的。在一些实施方案中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，AAV载体是AAV9载体。在一些实施方案中，AAV载体是单链AAV(ssAAV)载体。在一些实施方案中，AAV载体是自我互补AAV(ssAAV)载体。

在一些方面，本公开提供了包含本文所述的基因治疗载体的药物组合物。

在一些方面，本公开提供了一种治疗和/或预防有需要的受试者的IOP升高和/或青光眼的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所描述的基因治疗载体或所描述的药物组合物，其中所述受试者是灵长类。

在一些方面，本公开提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码人基质金属蛋白酶3(hMMP-3)的转基因或其功能变体，其中所述转基因经优化用于在人宿主细胞中表达。

在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与转基因可操纵地连接的启动子。在一些实施方案中，人宿主细胞是人角膜内皮细胞。在一些实施方案中，所述转基因与选自SEQ IDNO:23-27的序列共有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，所述转基因包含选自SEQ IDNO:23-27的序列。在一些实施方案中，所述转基因与SEQ ID NO:23共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:23是相同的。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含侧接转基因的腺相关病毒(AAV)末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，所述多核苷酸是分离的多核苷酸。

在一些实施方案中，所述转基因与SEQ ID NO:24共有至少95％同一性或与SEQ IDNO:24是相同的。在一些实施方案中，所述转基因与SEQ ID NO:25共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:25是相同的。在一些实施方案中，所述转基因与SEQ ID NO:26共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:26是相同的。在一些实施方案中，所述转基因与SEQ ID NO:27共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:27是相同的。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含侧接转基因的腺相关病毒(AAV)末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，所述多核苷酸是分离的多核苷酸。

在一些方面，本公开提供了一种分离的细胞，所述分离的细胞包含本文所述的多核苷酸。

在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的多核苷酸。

本发明的其他方面和实施方案由下文的具体实施方式提供。

附图说明

图1示出了在眼内输注rhMMP3后猴的房水中的重组人基质金属蛋白酶3(rhMMP3)的箱须图。

图2A示出了17只灵长类(标记1-17)中经治疗的眼与对侧眼之间房水流畅度的相对差异图。

图2B示出了灵长类受试者经治疗的眼与对侧眼之间房水流畅度的相对差异相对于房水(AH)中测得的rhMMP3浓度的图。

图3A示出了经前房内注射自我互补AAV血清型9(scAAV9-EGFP)治疗的灵长类受试者角膜的荧光显微照片。

图3B示出了经前房内注射单链AAV(ssAAV9-EGFP)治疗的灵长类受试者角膜的荧光显微照片。

图3C示出了经前房内注射单链AAV(ssAAV9-EGFP)治疗的灵长类受试者角膜的荧光显微照片的Z堆叠重建(Z-stack reconstruction)。

图4示出了前房内注射AAV9-CMV-MMP3或AAV9-CMV-eGFP的灵长类受试者眼房水中的MMP-3平均浓度图。

图5A示出了前房内注射AAV9-CMV-MMP3或盐水对照的灵长类受试者的眼部中随时间(天)推移以毫米汞柱(mmHg)计的眼压(IOP)图。

图5B示出了前房内注射AAV9-CMV-MMP3的灵长类受试者的眼部中，以毫米汞柱(mmHg)计的眼压变化(ΔIOP)相对于在该眼中观测到的房水中的MMP-3表达水平(以ng/mL计)的图。

图6A示出了前房内注射AAV9-CMV-MMP3或盐水对照的灵长类受试者的眼部中随时间(天)推移通过厚度测量法测得的平均角膜厚度(μm)图。

图6B示出了前房内注射AAV9-CMV-MMP3或盐水对照的灵长类受试者的眼部中随时间(天)推移通过角膜内皮显微镜检查测得的平均角膜厚度(μm)图。

图7示出了通过ELISA在经治疗的受试者(下部线条)和媒介物对照受试者(上部线条)中测定的MMP-3血清水平的曲线图。

图8A示出了前房内注射可诱导性地表达MMP-3或GFP对照的腺相关载体的经地塞米松治疗的[DEX(+)]动物中随时间(周)推移的眼压(IOP)图表。

图8B示出了前房内注射可诱导性地表达MMP-3或GFP对照的腺相关载体的对照[DEX(-)]动物中随时间(周)推移的眼压(IOP)图表。

图9A-图9B示出了在DEX治疗组(DEX(+)，图9A)和环糊精对照组(DEX(-)，图9B)中经AAV-iMMP-3治疗的眼(左)和对侧AAV-iGFP对照(右)，IOP从基线(注射前)到最终测量(DEX第4周)的变化的点箱图。MMP-3仅在高血压模型中显著降低IOP。

图9C-图9D示出了在DEX治疗组(DEX(+)，图9C)和环糊精对照组(DEX(-)，图9D)中经AAV-iMMP-3治疗的眼(左)和对侧AAV-iGFP对照(右)在第4周时的IOP的点箱图。

图10A示出了描绘房水流畅的DEX治疗队列中经AAV-iMMP-3治疗的眼与经AAV-iGFP治疗的眼之间的配对分析的大提琴图。平均百分比流畅度差用白线表示，深蓝阴影为平均值的95％CI。绘制单个数据点及其自身的95％CI。

图10B示出了描绘房水流畅的环糊精对照组中经AAV-iMMP-3治疗的眼与经AAV-iGFP治疗的眼之间的配对分析的大提琴图。平均百分比流畅度差用白线表示，深蓝阴影为平均值的95％CI。绘制单个数据点及其自身的95％CI。

图11示出了经治疗(AAV-iMMP-3)的眼和载体对照(AAV-iGFP)眼中光学空白空间百分比(％)的图

图12A示出了针对人肌纤蛋白(myocilin)Y437H转基因的小鼠中经AAV-iMMP-3治疗的眼(蓝色)和经AAV-iGFP治疗的眼(红色)的IOP。

图12B示出了野生型小鼠中经AAV-iMMP-3治疗的眼(蓝色)和经AAV-iGFP治疗的眼(红色)的IOP。

图13A-图3B示出了在转基因模型(MYOC(+)，图13A)和对照组(MYOC(-)，图13B)中经AAV-iMMP-3治疗的眼(左)和对侧AAV-iGFP对照(右)，IOP从基线(注射前)到最终测量的变化的点箱图。MMP-3仅在MYOC(+)模型中显著降低IOP。

图13C-图13D示出了在转基因模型(MYOC(+)，图13C)和对照组(MYOC(-)，图13D)中经AAV-iMMP-3治疗的眼(左)和对侧AAV-iGFP对照(右)的最终IOP的点箱图。

图14A示出了描绘房水流畅的MYOC(+)动物中经AAV-iMMP-3治疗的眼与经AAV-iGFP治疗的眼之间的配对分析的大提琴图。

图14B示出了描绘房水流畅的MYOC(-)动物中经AAV-iMMP-3治疗的眼与经AAV-iGFP治疗的眼之间的配对分析的大提琴图。

图15示出了描绘用天然的和密码子优化的MMP-3序列转染的HEK293细胞产生的重组MMP-3的量的条形图。

图16示出了描绘用天然的和密码子优化的MMP-3序列转染的HCEC细胞产生的重组MMP-3的量的条形图。

图17示出了描绘在用编码天然的或密码子优化的MMP-3序列的AAV9病毒载体转导的HCEC细胞中产生的重组MMP-3的量的条形图。

图18示出了描绘在用编码天然的或密码子优化的MMP-3序列的AAV9病毒载体转导的HCEC细胞中产生的重组MMP-3的归一化量的条形图。

图19示出了显示用编码天然的或密码子优化的MMP-3序列的AAV9病毒载体转导的HCEC细胞中产生的重组前MMP-3和活性MMP-3的量的免疫印迹。

图20示出了描绘在用编码天然的或密码子优化的MMP-3序列的AAV9病毒载体转导的HCEC细胞培养基中的MMP-3蛋白酶活性的量的条形图。

图21A示出了描绘了在将5ng/ml MMP-3输注到前房中一小时后，经媒介物和经MMMP-3治疗的人眼的房水流畅度(nl/min/mmHg)值的大提琴图。图21B示出了描绘人眼的媒介物和实验对之间的百分比差的大提琴图。

图22A-图22C示出了根据一个实施方案，编码MMP-3的优化多核苷酸序列的序列比对。

序列表

SEQ ID NO: 描述

1 全长人MMP-3氨基酸序列

2 重组人MMP-3氨基酸序列(缺乏前肽结构域)

3 全长载体(不包括骨架)

4 表达盒(不包括ITR)

5 AAV2 ITR 1-130 130bp

6 CMV增强子210-513 304bp

7 CMV启动子514-716 203bp

8 人β-珠蛋白内含子809-1301 493bp

9 人MMP3 1332-2765 1434bp(核苷酸)

10 人MMP3 1332-2765 1434bp(氨基酸)

11 hGH poly(A)信号2847-3323 477bp

12 AAV2 ITR(反向)3363-3503 141bp

13 AAV9衣壳序列

14 5′ITR

15 5′ITR

16 3′ITR

17 3′ITR

18 3′ITR

19 CMV增强子/启动子

20 hGH polyA

21 Kozak

22 全长人MMP-3氨基酸序列(无信号序列)

23 MMP3 Opt 1

24 MMP3 Opt 2

25 MMP3 Opt 3

26 天然MMP3 CpG耗尽

27 MMP3 Opt 3CpG耗尽

具体实施方式

本公开总体上涉及重组蛋白和基因治疗载体，特别是腺相关病毒(AAV)载体，在治疗灵长类受试者(例如，猴、猿和人)的眼部病状中的治疗用途；并且涉及通过使用AAV载体或通过引导注射重组蛋白(例如重组人MMP-3(rhMMP-3))将基因(包括蛋白酶而不限于基质金属蛋白酶，诸如基质金属蛋白酶3(MMP-3))向眼部的治疗性递送。本文公开了AAV载体，所述载体有效地转导眼部前房中的结构，包括受试者的角膜内皮，从而增加受试者眼部中的房水流畅度，和/或降低受试者眼部中的眼压。本文还公开了在确定有效降低和/或预防受试者的眼压升高的浓度下的AAV载体的单位剂量。本文还公开了在确定有效降低和/或预防受试者的眼压升高的浓度下的rhMMP-3的单位剂量。在一些实施方案中，该受试者是灵长类。

将含有CMV驱动的鼠类MMP-3基因(AAV-muMMP-3)的AAV-2/9经前房内接种到野生型小鼠中引起角膜内皮的高效转导以及muMMP-3的房水浓度和活性增加。O’Callaghan等人Hum.Mol.Genet.26:1230-1246(2017)。然而，小鼠与灵长类之间的MMP-3序列差异、小鼠与灵长类之间的大小差异以及角膜内皮的生理学和细胞生物学差异阻碍了针对灵长类的有效给药策略的确定。先前转导灵长类角膜上皮的努力已证实转基因表达在70天内消失并且出现炎症。Buie等人Investigative Ophthalmology&Visual Science 51:236-48(2010)。先前的努力尚未表征呈重组蛋白(rhMMP-3)或编码hMMP-3基因的基因治疗载体形式的人MMP-3(在本文中称为hMMP-3或可替代地huMMP-3)的前房内递送(即，递送至眼前房)。

单位剂量

本文提供了多个重组腺相关病毒(AAV)颗粒的单位剂量和重组人基质金属蛋白酶3(rhMMP-3)蛋白的单位剂量。如本文所用，“单位剂量”是指以单剂量施用于受试者的治疗组合物的量。单剂量可以在预定时间段内，例如1小时、2小时、12小时或24小时内以一次注射或多次注射施用。

单位剂量可以按治疗组合物(例如AAV颗粒或重组蛋白)的量、浓度和/或体积来定义。对于AAV，该量可以用基因组颗粒(gp)、DNA酶抗性颗粒(DRP)或载体基因组(vg)来表示。如本文所用，“载体基因组”是指相对于参考标准品通过定量聚合酶链反应(qPCR)滴定来测定的颗粒数目。使用DNA酶去除未衣壳化的DNA，然后通过温育蛋白酶K降解病毒蛋白。使用含有2X TAQMAN通用主混合物、靶向病毒颗粒的多核苷酸(例如，编码MMP-3的多核苷酸)的20X TAQMAN基因表达测定探针和无RNA酶的水的主混合物，稀释样品并一式四份地运行。将样品与已知浓度和参考标准品的标准曲线进行比较。qPCR反应在STEPONEPLUS(Applied

)仪器上进行40个周期的变性和退火，有先前10分钟的聚合酶活化步骤。在该仪器上分析数据。含有部分或整个病毒基因组的质粒DNA可以用作参考标准品。例如，pcDNA3-EGFP可以用作包含含有编码EGFP的序列的多核苷酸的AAV颗粒的参考标准品。对于包含含有编码MMP-3的序列的多核苷酸的AAV颗粒，用于生成AAV颗粒的质粒可用作通过qPCR测定AAV颗粒的滴度的参考标准品。选择用于qPCR的引物以扩增参考标准品和病毒基因组两者。

AAV颗粒的浓度可以表示为滴度，滴度是量除以体积，例如载体基因组/毫升(vg/mL)、gp/mL和DRP/mL。在一些实施方案中，单位剂量包含浓度为1×10⁹个载体基因组/毫升(vg/mL)至5×10¹³vg/mL的rAAV9颗粒，包括端值在内。在一些实施方案中，该单位剂量包含浓度为1×10⁹vg/mL至2.5×10⁹vg/mL、2.5×10⁹vg/mL至5×10⁹vg/mL、5×10⁹vg/mL至7.5×10⁹vg/mL、7.5×10⁹vg/mL至1×10¹⁰vg/mL、1×10¹⁰vg/mL至2.5×10¹⁰vg/mL、2.5×10¹⁰vg/mL至5×10¹⁰vg/mL、5×10¹⁰vg/mL至7.5×10¹⁰vg/mL、7.5×10¹⁰vg/mL至1×10¹¹vg/mL、1×10¹¹vg/mL至2.5×10¹¹vg/mL、2.5×10¹¹vg/mL至5×10¹¹vg/mL、5×10¹¹vg/mL至7.5×10¹¹vg/mL、7.5×10¹¹vg/mL至1×10¹²vg/mL、1×10¹²vg/mL至2.5×10¹²vg/mL、2.5×10¹²vg/mL至5×10¹²vg/mL、5×10¹²vg/mL至7.5×10¹²vg/mL、7.5×10¹²vg/mL至1×10¹³vg/mL、1×10¹³vg/mL至2.5×10¹³vg/mL或2.5×10¹³vg/mL至5×10¹³vg/mL的rAAV9颗粒。

在一些实施方案中，该单位剂量包含浓度为约1×10⁹vg/mL、约2.5×10⁹vg/mL、约5×10⁹vg/mL、约7.5×10⁹vg/mL、约1×10¹⁰vg/m、约2.5×10¹⁰vg/mL、约5×10¹⁰vg/mL、约7.5×10¹⁰vg/mL、约1×10¹¹vg/mL、约2.5×10¹¹vg/mL、约5×10¹¹vg/mL、约7.5×10¹¹vg/mL、约1×10¹²vg/mL、约2.5×10¹²vg/mL、约5×10¹²vg/mL、约7.5×10¹²vg/mL、约1×10¹³vg/mL、约2.5×10¹³vg/mL或约5×10¹³vg/mL的rAAV9颗粒。

在一些实施方案中，该单位剂量包含1×10⁷个载体基因组(vg)至5×10¹²vg的rAAV9颗粒，包括端值在内。在一些实施方案中，该单位剂量包含1×10⁷vg至2.5×10⁷vg、2.5×10⁷vg至5×10⁷vg、5×10⁷vg至7.5×10⁷vg、7.5×10⁷vg至1×10⁸vg、1×10⁸vg至2.5×10⁸vg、2.5×10⁸vg至5×10⁸vg、5×10⁸vg至7.5×10⁸vg、7.5×10⁸vg至1×10⁹vg、1×10⁹vg至2.5×10⁹vg、2.5×10⁹vg至5×10⁹vg、5×10⁹vg至7.5×10⁹vg、7.5×10⁹vg至1×10¹⁰vg、1×10¹⁰vg至2.5×10¹⁰vg、2.5×10¹⁰vg至5×10¹⁰vg、5×10¹⁰vg至7.5×10¹⁰vg、7.5×10¹⁰vg至1×10¹¹vg、1×10¹¹vg至2.5×10¹¹vg、2.5×10¹¹vg至5×10¹¹vg、5×10¹¹vg至7.5×10¹¹vg、7.5×10¹¹vg至1×10¹²vg、1×10¹²vg至2.5×10¹²vg或2.5×10¹²vg至5×10¹²vg的rAAV9颗粒。

在一些实施方案中，该单位剂量包含约1×10⁷vg、约2.5×10⁷vg、约5×10⁷vg、约7.5×10⁷vg、约1×10⁸vg、约2.5×10⁸vg、约5×10⁸vg、约7.5×10⁸vg、约1×10⁹vg、约2.5×10⁹vg、约5×10⁹vg、约7.5×10⁹vg、约1×10¹⁰vg、约2.5×10¹⁰vg、约5×10¹⁰vg、约7.5×10¹⁰vg、约1×10¹¹vg、约2.5×10¹¹vg、约5×10¹¹vg、约7.5×10¹¹vg、约1×10¹²vg、约2.5×10¹²vg或约5×10¹²vg的rAAV9颗粒。

在一些实施方案中，单位剂量包含浓度为1×10⁹个载体基因组/毫升(vg/mL)至5×10¹³vg/mL的rAAV颗粒，包括端值在内。在一些实施方案中，该单位剂量包含浓度为1×10⁹vg/mL至2.5×10⁹vg/mL、2.5×10⁹vg/mL至5×10⁹vg/mL、5×10⁹vg/mL至7.5×10⁹vg/mL、7.5×10⁹vg/mL至1×10¹⁰vg/mL、1×10¹⁰vg/mL至2.5×10¹⁰vg/mL、2.5×10¹⁰vg/mL至5×10¹⁰vg/mL、5×10¹⁰vg/mL至7.5×10¹⁰vg/mL、7.5×10¹⁰vg/mL至1×10¹¹vg/mL、1×10¹¹vg/mL至2.5×10¹¹vg/mL、2.5×10¹¹vg/mL至5×10¹¹vg/mL、5×10¹¹vg/mL至7.5×10¹¹vg/mL、7.5×10¹¹vg/mL至1×10¹²vg/mL、1×10¹²vg/mL至2.5×10¹²vg/mL、2.5×10¹²vg/mL至5×10¹²vg/mL、5×10¹²vg/mL至7.5×10¹²vg/mL、7.5×10¹²vg/mL至1×10¹³vg/mL、1×10¹³vg/mL至2.5×10¹³vg/mL或2.5×10¹³vg/mL至5×10¹³vg/mL的rAAV颗粒。

在一些实施方案中，该单位剂量包含浓度为约1×10⁹vg/mL、约2.5×10⁹vg/mL、约5×10⁹vg/mL、约7.5×10⁹vg/mL、约1×10¹⁰vg/m、约2.5×10¹⁰vg/mL、约5×10¹⁰vg/mL、约7.5×10¹⁰vg/mL、约1×10¹¹vg/mL、约2.5×10¹¹vg/mL、约5×10¹¹vg/mL、约7.5×10¹¹vg/mL、约1×10¹²vg/mL、约2.5×10¹²vg/mL、约5×10¹²vg/mL、约7.5×10¹²vg/mL、约1×10¹³vg/mL、约2.5×10¹³vg/mL或约5×10¹³vg/mL的rAAV颗粒。

在一些实施方案中，该单位剂量包含1×10⁷个载体基因组(vg)至5×10¹²vg的rAAV颗粒，包括端值在内。在一些实施方案中，该单位剂量包含1×10⁷vg至2.5×10⁷vg、2.5×10⁷vg至5×10⁷vg、5×10⁷vg至7.5×10⁷vg、7.5×10⁷vg至1×10⁸vg、1×10⁸vg至2.5×10⁸vg、2.5×10⁸vg至5×10⁸vg、5×10⁸vg至7.5×10⁸vg、7.5×10⁸vg至1×10⁹vg、1×10⁹vg至2.5×10⁹vg、2.5×10⁹vg至5×10⁹vg、5×10⁹vg至7.5×10⁹vg、7.5×10⁹vg至1×10¹⁰vg、1×10¹⁰vg至2.5×10¹⁰vg、2.5×10¹⁰vg至5×10¹⁰vg、5×10¹⁰vg至7.5×10¹⁰vg、7.5×10¹⁰vg至1×10¹¹vg、1×10¹¹vg至2.5×10¹¹vg、2.5×10¹¹vg至5×10¹¹vg、5×10¹¹vg至7.5×10¹¹vg、7.5×10¹¹vg至1×10¹²vg、1×10¹²vg至2.5×10¹²vg或2.5×10¹²vg至5×10¹²vg的rAAV颗粒。

在一些实施方案中，该单位剂量包含约1×10⁷vg、约2.5×10⁷vg、约5×10⁷vg、约7.5×10⁷vg、约1×10⁸vg、约2.5×10⁸vg、约5×10⁸vg、约7.5×10⁸vg、约1×10⁹vg、约2.5×10⁹vg、约5×10⁹vg、约7.5×10⁹vg、约1×10¹⁰vg、约2.5×10¹⁰vg、约5×10¹⁰vg、约7.5×10¹⁰vg、约1×10¹¹vg、约2.5×10¹¹vg、约5×10¹¹vg、约7.5×10¹¹vg、约1×10¹²vg、约2.5×10¹²vg或约5×10¹²vg的rAAV颗粒。

在一些实施方案中，该单位剂量包含10μl至200μl，或20μl至100μl的体积。在一些实施方案中，该单位剂量为约50μl、约60μl、约70μl、约80μl、约90μl或约100μl。

载体和AAV

术语“载体”在这里以其最一般的含义使用并且包含核酸的任何中间媒介物，其使得所述核酸例如能够引入原核细胞和/或真核细胞中，并且在适当的情况下整合到基因组中。载体可以在细胞中复制和/或表达。载体包含质粒、噬菌粒、噬菌体和病毒基因组。

在应用于AAV时，“载体”是指包含编码病毒DNA基因组的多核苷酸的质粒，并且是指通过将病毒DNA基因组包装到包括衣壳和其他附属蛋白的重组AAV颗粒中而产生的病毒颗粒。

如本文所用，术语“AAV”是腺相关病毒或其重组载体的缩写。腺相关病毒是单链DNA细小病毒，其仅在其中某些功能由共感染辅助病毒提供的细胞中生长。AAV的一般信息和综述可见于例如Carter,Handbook of Parvoviruses,1:169-228(1989)和Berns,Virology,1743-1764(1990)中。

如本文所用，“AAV载体”或“rAAV载体”是指重组载体，其包含侧接AAV末端重复序列(ITR)的一个或多个所关注多核苷酸(或转基因)。此类AAV载体在存在于已经用编码和表达Rep和Cap基因产物的载体转染的宿主细胞中时可以复制并包装到感染性病毒颗粒中。

如本文所用，“AAV病毒颗粒”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和包封的多核苷酸AAV载体构成的病毒颗粒。如本文所用，如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组之外的多核苷酸，诸如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，在AAV载体颗粒内含有载体基因组。

腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度为约4.7kb，包括两个145个核苷酸反向末端重复序列(ITR)。存在多种已知AAV变体，当通过抗原表位分类时有时也称为血清型。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。举例来说，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人,J.Virol.,45:555-564(1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_001862中提供；AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人,J.Virol.,78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在Mol.Ther.,13(1):67-76(2006)中提供；并且AAV-11基因组在Virology,330(2):375-383(2004)中提供。AAV rh.74基因组的序列在以引用的方式并入本文的美国专利9,434,928中提供。包括AAV.Anc80、AAV.Anc80L65和其衍生物的祖先AAV的序列描述于WO2015054653A2和Wang等人Single stranded adeno-associated virus achievesefficient gene transfer to anterior segment in the mouse eye.PLoS One.12(8):e0182473(2017)中。引导病毒DNA复制、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在AAV ITR内。三个AAV启动子(对于其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p9)与单一AAV内含子(在核苷酸2107和2227处)的差异剪接相结合，导致由rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有多重酶促特性，其最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且其编码三个衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代剪接和非一致翻译起始位点负责三个相关衣壳蛋白的产生。单个共有聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95处。在Muzyczka等人,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:97-129(1992)中综述了AAV的生命周期和遗传学。

AAV具有独特的特征，其使其作为例如在基因治疗中将外来DNA递送至细胞的载体具有吸引力。培养中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人和其他动物的天然感染是沉默的和无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而允许在体内靶向许多不同组织的可能性。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂的细胞，并且可以基本上作为转录活性核附加体(染色体外元件)在这些细胞的寿命期间持续存在。AAV病毒前基因组作为克隆DNA插入质粒中，这使得重组基因组的构建成为可行的。此外，由于导引AAV复制和基因组衣壳化的信号包含在AAV基因组的ITR内，因此基因组的内部大约4.3kb的一些或全部(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以被外源DNA替换。为了产生AAV载体，可以反式形式提供rep和cap蛋白。AAV的另一显著特征是其是极其稳定且强大的病毒。其容易承受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃，持续数小时)，使得AAV的冷藏不太重要。甚至可以冻干AAV。最后，AAV感染的细胞对双重感染不具有抗性。

在一些情况下，使用本公开的AAV载体和颗粒将多核苷酸序列递送到灵长类的角膜内皮。可以使用本公开的AAV载体和颗粒递送的多核苷酸序列包括蛋白质编码基因和RNA编码基因。在一些实施方案中，AAV载体的多核苷酸编码基因编辑系统的一个或多个(或所有)组分。本公开还提供了多载体系统。在一些实施方案中，所述载体系统是分裂载体系统，其中大于约4.5kB的基因在通过细胞内同源重组连接的两个载体中提供以形成单个编码多核苷酸。本公开不应理解为仅将本发明限于基质金属蛋白酶的递送。本发明仅受权利要求书的限制。

AAV9

如本文所用，重组腺相关病毒血清型9(rAAV9)颗粒是指具有衣壳蛋白的基因工程AAV颗粒，所述衣壳蛋白与野生型AAV9的衣壳蛋白共有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性并且保留AAV9的一种或多种功能特性。说明性AAV9衣壳序列提供于US7,906,111和US9,737,618中。在一些实施方案中，rAAV9颗粒包含的衣壳蛋白与SEQ ID NO:13的氨基酸1至736、138至736或203至736共有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在一些情况下，rAAV载体是血清型AAV1、AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或LK03、Anc80L65。Anc80L65描述于Sharma等人Transduction efficiency of AAV 2/6,2/8and 2/9vectors for delivering genes inhuman corneal fibroblasts.PLoS ONE 12(8):e0182473(2017)中。LK03描述于Lisowski等人，Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in axenograft liver model,Nature.2014年2月20日；506(7488):382-386中。

假型rAAV的产生公开于例如WO 2001/083692中。还考虑了其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如，Marsic等人，Mol.Ther.,22(11):1900-1909(2014)。在一些情况下，rAAV载体具有血清型AAV9。在一些实施方案中，所述rAAV载体具有血清型AAV9，并且包含单链基因组。此类AAV称为“单链AAV”或“ssAAV”。在一些实施方案中，所述rAAV载体具有血清型AAV9，并且包含自互补基因组。此类AAV称为“自我互补AAV”或“scAAV”。本发明人已出乎意料地确定，在一些情况下，ssAAV以比scAAV更高的效率转导灵长类的角膜内皮。

在一些实施方案中，所述rAAV9颗粒中的每个颗粒包含分离自或源自AAV血清型9(AAV9)Cap蛋白的病毒Cap蛋白。

多核苷酸

本公开的AAV颗粒包含至少一种多核苷酸或确切地一种多核苷酸。本公开的多核苷酸从5′到3′包含：(a)编码5′反向末端重复序列(ITR)的序列；(b)编码启动子的序列；(c)编码转基因的序列；(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；(e)编码3′ITR的序列。

反向末端重复序列

如本文所用，“反向末端重复序列”或“ITR”是指在AAV基因组的末端处的类似自我退火区段。在质粒的背景下，ITR侧接转录形成AAV基因组的DNA区段。本公开的ITR包括任何AAV ITR，包括野生型AAV ITR或起AAV载体的ITR作用的合成序列。在一些实施方案中，rAAV载体包含AAV2的ITR序列。在一些实施方案中，rAAV载体包含AAV2基因组，使得rAAV载体是AAV-2/9载体、AAV-2/6载体或AAV-2/8载体。本公开涵盖基因组和血清型的其他组合，包括但不限于Sharm等人Transduction efficiency of AAV 2/6,2/8and 2/9vectors fordelivering genes in human corneal fibroblasts.Brain Res Bull.81:273-78(2010)中所描述的那些。

在一些实施方案中，编码所述5′ITR的所述序列源自AAV血清型2(AAV2)的5′ITR序列。在一些实施方案中，编码所述5′ITR的所述序列包含与AAV2的5′ITR的序列相同的序列。在一些实施方案中，ITR是起ITR作用的异源或合成ITR。在一些实施方案中，编码5′ITR的所述序列包含以下各项或由以下各项组成：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码所述3′ITR的所述序列源自AAV2的3′ITR序列。在一些实施方案中，编码所述3′ITR的所述序列包含与AAV2的3′ITR的序列相同的序列。在一些实施方案中，ITR是起ITR作用的异源或合成ITR。在一些实施方案中，编码3′ITR的所述序列包含以下各项或由以下各项组成：SEQ ID NO:12或SEQ ID NOS:16-18中任一者的核苷酸序列。

启动子

在一些实施方案中，AAV颗粒的多核苷酸可以包含启动子，即至少一个启动子。在一些实施方案中，多核苷酸包含两个启动子。在一些实施方案中，多核苷酸包含一个启动子。在一些实施方案中，每个启动子独立地选自由巨细胞病毒(CMV)启动子、CAG启动子、SV40启动子、SV40/CD43启动子和MND启动子组成的组。CAG启动子是由CMV增强子与鸡β-肌动蛋白启动子的一部分和兔β-珠蛋白基因的一部分组成的启动子序列。SV40/CD43启动子是包含SV40启动子的一部分和CD43启动子的一部分的启动子序列。MND启动子是含有经修饰的MoMuLV LTR的U3区与骨髓增生性肉瘤病毒增强子的合成启动子。其他启动子序列与本公开的AAV颗粒相容。在一些实施方案中，启动子是遍在启动子。在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子，诸如内皮细胞(EC)特异性启动子。

在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。可操作地连接至诱导型启动子的多核苷酸序列可以被配置成响应于药剂的添加或累积或响应于药剂的去除、降解或稀释而使多核苷酸序列转录表达或不转录表达。药剂可以是药物。药剂可以是四环素(tetracycline)或其衍生物中的一种，包括但不限于强力霉素(doxycycline)。在一些情况下，诱导型启动子是tet-on启动子、tet-off启动子、化学调节的启动子、物理调节的启动子(即，对光的存在或不存在或对低温或高温作出反应的启动子)。此诱导型启动子列表是非限制性的。

在一些实施方案中，启动子包含CMV增强子/启动子。在一些实施方案中，编码CMV启动子的序列包含下述序列或由下述序列组成：SEQ ID NO:19的序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的其功能变体。

在一些实施方案中，启动子包含CMV增强子。在一些实施方案中，CMV启动子包含CMV增强子。在一些实施方案中，编码CMV启动子的序列包含下述序列或由下述序列组成：SEQ ID NO:6的序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的其功能变体。

在一些实施方案中，启动子包含CMV启动子。在一些实施方案中，CMV启动子包含下述序列或由下述序列组成：SEQ ID NO:7的序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的其功能变体。

在一些实施方案中，多核苷酸缺乏启动子。在一些实施方案中，RNA从病毒基因组的表达可以由5′ITR驱动。在一些实施方案中，蛋白质从病毒基因组的表达可以由内部核糖体进入位点(IRES)驱动。

转基因

如本文所用，术语“转基因”是指可操作地连接至启动子的任何遗传元件。转基因包括蛋白质编码序列、RNA编码序列(例如，微RNA、gRNA或sgRNA)和基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统等)。在一些实施方案中，转基因包含编码表1中列出的任何蛋白酶的序列。在一些实施方案中，转基因包含下述序列或由下述序列组成：编码表1中列出的任何蛋白酶的序列，或与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的其功能变体。

表1

在一些实施方案中，转基因包含编码基质金属蛋白酶3(MMP-3)的序列。

在一些实施方案中，本公开提供了一种单位剂量，所述单位剂量包含多个重组腺相关病毒血清型9(rAAV9)颗粒，其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是非复制型的，并且其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9包含多核苷酸，所述多核苷酸从5′到3′包含：(a)编码5′反向末端重复序列(ITR)的序列；(b)编码启动子的序列；(c)编码基质金属蛋白酶3(MMP-3)的序列；(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；以及(e)编码3′ITR的序列。

在一些实施方案中，编码MMP-3的序列包含以下各项或由以下各项组成：编码SEQID NO:1或SEQ ID NO:22的MMP-3氨基酸序列的核苷酸序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的其功能变体或功能片段。在一些实施方案中，编码所述MMP-3氨基酸序列的所述核苷酸序列包含野生型核苷酸序列。在一些实施方案中，编码MMP-3的序列包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列或由所述核苷酸序列组成。

在一些实施方案中，编码MMP-3的序列经密码子优化。在一些实施方案中，编码MMP-3的序列包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列或由所述核苷酸序列组成。在一些实施方案中，编码MMP-3的序列包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列或由所述核苷酸序列组成。在一些实施方案中，编码MMP-3的序列包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列或由所述核苷酸序列组成。

在一些实施方案中，编码MMP-3的序列是CpG耗尽的。在一些实施方案中，编码MMP-3的序列包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列或由所述核苷酸序列组成。在一些实施方案中，编码MMP-3的序列包含SEQID NO:27的核苷酸序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列或由所述核苷酸序列组成。

其他载体元件

在一些实施方案中，多核苷酸包含编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列。在一些实施方案中，polyA信号包含人生长激素(hGH)polyA序列。在一些实施方案中，hGH polyA序列包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:20，或与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列。在一些实施方案中，polyA信号包含牛生长激素(bGH)polyA信号或兔β-珠蛋白polyA信号。

在一些实施方案中，多核苷酸包含内含子，例如人β-珠蛋白内含子，诸如SEQ IDNO:8，或与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含Kozak序列，例如SEQ ID NO:21。

在一些实施方案中，多核苷酸包含下述序列或由下述序列组成：SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列，或与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列。

药物组合物

在一些实施方案中，单位剂量是无菌的。在一些实施方案中，包含药学上可接受的载剂。合适的载剂包括但不限于生理盐水、含100-200mM氯化钠的盐水、含150氯化钠的盐水、含有多元醇(诸如5％蔗糖)的盐水等。在一些实施方案中，载剂包含泊洛沙姆(poloxamer)，包括但不限于泊洛沙姆188或普朗尼克F-68。合适的泊洛沙姆浓度包括0.0001％-0.01％或大约0.001％。

出于注射目的，可以采用各种溶液，诸如无菌水溶液。如果需要，可以缓冲此类水溶液，并且首先使液体稀释剂与盐水或葡萄糖等渗。rAAV作为游离酸的溶液(DNA含有酸性磷酸酯基团)或药理学可接受的盐可以在水中与诸如羟丙基纤维素的表面活性剂适当地混合制备。rAAV的分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物以及在油中制备。在通常的存储和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。在这一点上，所采用的无菌水性介质均可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。

适合可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须无菌且必须是达到易于注射的程度的流体。其必须在制造和存储条件下稳定，并且必须防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用诸如卵磷脂的涂层、通过在分散液的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等来实现。在许多情况下，优选的是包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)引起可注射组合物的延长吸收。

通过根据需要将所需量的rAAV与上文列举的各种其他成分一起并入适当的溶剂中，然后进行过滤器灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将灭菌的活性成分并入含有碱性分散介质和来自上文列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何额外所需成分的粉末。

重组蛋白

在另一个方面，本公开提供了包含重组基质金属蛋白酶3(MMP-3)蛋白的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量包含0.1纳克(ng)至10ng，或0.5ng至5ng、1ng至2ng、3ng至4ng、5ng至6ng、7ng至8ng或9ng至10ng，包括端值在内。在一些实施方案中，单位剂量为0.1ng或更高、1ng或更高、或10ng或更高。在另一方面，单位剂量以10至200μl或20-100μl的体积提供。

在一些实施方案中，药物剂量包含浓度为1毫克/毫升(mg/ml)至500mg/ml，例如5mg/mL至200mg/ml、10mg/mL至100mg/ml、或20mg/mL至80mg/ml的重组MMP-3蛋白。

在一些实施方案中，单位剂量包含1毫克/毫升(mg/mL)至100mg/mL的重组MMP-3蛋白，包括端值在内。在一些实施方案中，单位剂量包含1mg/mL至5mg/mL、5mg/mL至10mg/mL、15mg/mL至20mg/mL、20mg/mL至25mg/mL、25mg/mL至30mg/mL、30mg/mL至35mg/mL、35mg/mL至40mg/mL、40mg/mL至45mg/mL或45mg/mL至50mg/mL。在一些实施方案中，单位剂量包含50mg/mL至55mg/mL、55mg/mL至60mg/mL、65mg/mL至70mg/mL、70mg/mL至75mg/mL、75mg/mL至80mg/mL、80mg/mL至85mg/mL、85mg/mL至90mg/mL、90mg/mL至95mg/mL，或95mg/mL至100mg/mL。

在一些实施方案中，单位剂量包含约1mg/mL、约5mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL或约45mg/mL。在一些实施方案中，单位剂量包含约50mg/mL、约55mg/mL、约65mg/mL、约70mg/mL、约75mg/mL、约80mg/mL、约85mg/mL、约90mg/mL、约95mg/mL或约100mg/mL。在一些实施方案中，单位剂量包含约10mg/mL的重组MMP-3蛋白。

在一些实施方案中，所述重组MMP-3蛋白是人MMP-3蛋白。在一些实施方案中，所述重组MMP-3蛋白具有包含下述序列或由下述序列组成的多肽序列：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:22的序列，或任选地与其具有80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的其功能变体或功能片段。

方法

在另一方面，本公开提供了转导受试者的角膜内皮的方法。所述方法包括施用有效量的如本文所述的单位剂量。在一些实施方案中，受试者是灵长类(例如，猴、猿或人)。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是青少年或成人。在一些实施方案中，受试者罹患眼压(IOP)升高或处于眼压(IOP)升高的风险中。在一些实施方案中，受试者罹患由于先天性病症，诸如原发性先天性青光眼、青少年原发性开角型青光眼、MYOC青光眼等引起的IOP升高，或处于IOP升高的风险中。在一些实施方案中，受试者罹患由于高龄引起的IOP升高，或处于IOP升高的风险中。在一些实施方案中，受试者患有尚未进展为青光眼的IOP升高。在一些情况下，受试者患有IOP升高和青光眼。在一些情况下，受试者患有青光眼而没有IOP升高。

组合物的有效剂量的施用可通过本领域中标准的途径进行，包括但不限于房内接种、玻璃体内接种、视网膜下接种、脉络膜上接种、腺体成形术或巩膜上静脉介导的递送。在一个实施方案中，有效剂量在前房内递送。

如本文所用，术语“有需要的患者”或“有需要的受试者”是指处于可以用包含编码基质金属蛋白酶的核酸序列的rAAV或包含本文提供的此类rAAV的组合物进行治疗或改善的疾病、病症或病状的风险中或罹患所述疾病、病症或病状的患者或受试者。有需要的患者或受试者可以是例如被诊断患有与基质金属蛋白酶的功能障碍相关的疾病，诸如高眼压症和/或青光眼的患者或受试者。受试者可以具有基质金属蛋白酶基因或蛋白质的突变或功能障碍。“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。

通过本文所描述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物。在一些情况下，受试者是人、非人灵长类、猪、马、牛、狗、猫、兔、小鼠或大鼠。受试者可以是人类女性或人类男性。受试者可以在一定年龄范围内，包括青少年发作性青光眼、早发性成人青光眼或年龄相关性青光眼。因此，本公开考虑向罹患青少年发作性青光眼的受试者，向罹患早发性成人青光眼的受试者或向罹患年龄相关性青光眼的受试者施用本公开的任何rAAV载体。

本发明也考虑了组合疗法。如本文所用的组合包括同时治疗或依序治疗。特别考虑本发明的方法与标准医学治疗(例如，皮质类固醇或局部减压药物)的组合，相同考虑与新型疗法的组合。在一些情况下，受试者可以用类固醇治疗以防止或减少对施用本文所述的rAAV的免疫反应。在某些情况下，受试者可以在施用本文所述的rAAV之前、期间或之后接受局部减压药物，诸如前列腺素类似物、β阻滞剂和/或ROCK抑制剂。在某些情况下，受试者可以接受能够使眼睛瞳孔扩张的药物(例如，托吡卡胺(tropicamide)和/或苯肾上腺素)。在某些情况下，受试者可以在恢复期间接受滋润凝胶以防止角膜脱水。在一些实施方案中，前列腺素类似物是拉坦前列素(latanaprost)或比马前列素(bimatoprost)。在一些实施方案中，β阻滞剂是噻吗洛尔(timolol)。在一些实施方案中，ROCK抑制剂是罗普雷萨(Rhopressa)。

在一些实施方案中，转导角膜内皮引起至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的角膜内皮细胞的转导。换句话说，在一些情况下，转导效率可为15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更高。如本文所用，“转导效率”是指载体(例如AAV载体或AAV颗粒)将多核苷酸递送至细胞(例如角膜内皮细胞)中的能力。转导效率可在体内测定，诸如使用编码荧光标志物(例如GFP或eGFP)的AAV颗粒。转导效率也可以通过对相同组织的免疫组织化学分析来测定。例如，可以使用抗MMP3抗体对来自经治疗的受试者的角膜样品的切片进行染色。通常将转导效率描述为接受靶多核苷酸的靶细胞的分数或百分比。在角膜内皮的情况下，可以在形态上鉴定靶细胞。可以使用显微镜检查进行角膜内皮细胞的形态鉴定。

可以使用本领域已知的各种方法在体内评定转导效率，所述方法包括但不限于彩色和荧光前段摄影、光学相干断层扫描和免疫组织化学。可以例如使用带Canon 6D数字成像硬件和FUNDUS PHOTO NEW VISION眼科成像软件的Topcon TRC50EX视网膜照相机进行彩色和荧光前段摄影。彩色照片的说明性设置包括1/25秒的快门速度(Tv)、400的ISO和闪光18。接合有激发器和屏障滤光片的单色和彩色荧光图像的说明性设置是480nm激发器、525nm屏障滤光片、200的闪光设置、Tv 1/5秒、ISO 3200和闪光300。

可以使用带有眼追踪和HEYEX图像捕获和分析软件的Heidelberg SpectralisOCT HRA或OCT Plus来进行前段OCT。SPECTRALIS的自体荧光功能可用于获得前房中GFP表达的图像。

可以使用各种已知方法进行免疫组织化学。转染效率可以通过在共聚焦显微镜下对标志物蛋白(例如GFP)或治疗性蛋白(例如MMP-3)阳性的细胞计数来测定。

也可以在体内通过测量分泌蛋白(诸如MMP-3)的浓度评定转导效率。首先，将眼部流体，诸如房水和/或玻璃体液从受试者中抽出并储存在适当的条件，诸如冷冻条件下直到进行评估。接下来，例如使用ELISA测定或蛋白质印迹测定眼部流体以测量存在的分泌蛋白的量。通过将ELISA测定中获得的信号与测量已知蛋白质标准品的信号的标准曲线进行比较来定量存在的分泌蛋白的量。

在一些实施方案中，本公开的方法包括施用包含rAAV9颗粒的单位剂量，其中该单位剂量中的多个rAAV9中的每个rAAV9是单链AAV(ssAAV)。

在一些实施方案中，将10μl至200μl体积注射到眼前房中。在一些实施方案中，这是20μl至100μl的体积。更具体地，注射体积可为约50μl、约60μl、约70μl、约80μl、约90μl或约100μl。在一些实施方案中，在注射之前先使用针头从受试者的眼部中取出一定体积的房水。房水的取出有时称为房水穿刺(aqueous tap)或穿刺术(paracentesis)。

在一些实施方案中，本公开提供了一种转导受试者的角膜内皮的方法，所述方法包括施用有效量的单位剂量，所述单位剂量包含多个重组腺相关病毒血清型9(rAAV9)颗粒，其中所述受试者是灵长类；其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是非复制型的；其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是单链AAV(ssAAV)；其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9包含多核苷酸，所述多核苷酸从5′到3′包含：(a)编码5′反向末端重复序列(ITR)的序列；(b)编码启动子(例如，CMV启动子)的序列；(c)编码基质金属蛋白酶3(MMP-3)的序列；(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；(e)编码3′ITR的序列。在一些实施方案中，单位剂量包含(i)1×10⁷个载体基因组(vg)至5×10¹²vg的rAAV9颗粒，包括端值在内；或(ii)约1×10⁹个载体基因组(vg)/毫升(mL)至5×10¹³vg/mL的rAAV9颗粒。

可替代地或除了用于转导的其他测定方法以外，还可以通过测量表达的外源蛋白的浓度来评定角膜内皮的转导。例如，在一些实施方案中，本文所述的方法引起在0.01ng/mL至约10ng/mL且包括端值在内的测量浓度下，受试者的眼房水(AH)中的MMP-3表达。

在一些实施方案中，AH中MMP-3的浓度为约0.01ng/mL至约0.1ng/mL，约0.1ng/mL至约1ng/mL，约1ng/mL至约2ng/mL，约2ng/mL至约4ng/mL，约4ng/mL至约6ng/mL，约6ng/mL至约8ng/mL，约6ng/mL至约10ng/mL，或约10ng/mL至约50ng/mL。

在一些实施方案中，AH中MMP-3的浓度为约0.01ng/mL、约0.1ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约4ng/mL、约6ng/mL、约6ng/mL、约10ng/mL或约50ng/mL或更高。在一些实施方案中，AH中MMP-3的浓度大于1ng/mL。在一些实施方案中，浓度在1ng/mL至10ng/mL的范围内。

AH中MMP-3(或另一种外源蛋白)的浓度可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白质印迹来测量。可用于测量AH中的浓度的针对MMP-3的抗体包括可从PROTEINTECH(17873-1-AP)、ABCAM(ab53015)和R&D SYSTEMS(DMP300)获得的抗体。

在一些实施方案中，AH中测得的MMP-3浓度大于或等于1ng/mL。在一些实施方案中，AH中测得的MMP-3浓度小于或等于10ng/mL。在一些实施方案中，AH中测得的MMP-3浓度为1-10ng/mL，包括端值在内。在一些实施方案中，AH中测得的MMP-3浓度为至少1-3ng/mL，包括端值在内。在一些实施方案中，使用放射性标记的MMP-3测量MMP-3的浓度。

在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒和方法引起MMP-3(或另一转基因)的持续表达或长期表达。在一些实施方案中，所述MMP-3表达维持至少21天、42天、56天或66天。在一些实施方案中，所述MMP-3表达维持至少90天。在一些实施方案中，转基因和/或外源蛋白的表达维持至少21天、42天、56天或66天。在一些实施方案中，转基因和/或外源蛋白的表达维持至少90天。

本公开还涉及评定基因治疗载体在体外测定系统中的功效和安全性。本公开提供了一种重组AAV(rAAV)载体，其包含编码基质金属蛋白酶3(MMP-3)的多核苷酸序列。使用这种rAAV载体或递送其他治疗蛋白的转基因的载体，可以通过将rAAV施用于眼部来治疗视力病状，诸如青光眼。在一些情况下，治疗旨在降低眼压，并且达到较低眼压的一种手段是通过治疗蛋白诸如MMP-3等重塑或降解细胞外基质。可以通过测量眼部小梁网的细胞外基质的渗透性或通过在体内测定中测量rAAV的效果来评定效果。本发明公开的合适的体外测定包括使用在房水(AH)中培养的源自人青光眼原发性开角型青光眼(POAG)或对照(白内障)的人Schlemm管(SC)内皮细胞(SCEC)单层。然后，可以在用rAAV载体转导的细胞或未转导用于比较的细胞中测量跨内皮电阻(TEER)和对荧光连接染料的渗透性。在其他测定中，ECM蛋白可以染色并通过免疫荧光法进行观察。这些和其他体外测定如下更详细地描述。

使rAAV载体与人小梁网(HTM)单层接触可以使通过此类单层的示踪分子通量与通过未与所述rAAV接触的HTM单层的示踪分子通量相比增加约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％或15％。如本文所用，术语“示踪分子通量”或“示踪剂通量”是指穿过上皮膜示踪分子流量，例如Dawson等人Tracer flux ratios:a phenomenological approach.JMembr Biol.31:351-58(1997)中所述。任选地，示踪剂可以是与异硫氰酸荧光素缀合的葡聚糖(FITC-葡聚糖)。在多种情况下，使所述rAAV载体与人小梁网(HTM)单层接触使所述单层的跨内皮电阻(TEER)与未接触所述rVAA的单层的TEER相比降低超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15欧姆/cm²，超过约15欧姆/cm²，或超过约20欧姆/cm²。测定TEER的方法描述于Srinivasan等人TEER measurement techniques for in vitro barriermodel systems.J Lab Autom.20:107-26(2015)中。

在受试者的眼部中，向眼部体内施用rAAV在一些情况下可增加小梁网的细胞外基质的渗透性，降低所述眼的流出阻力和/或降低眼压(IOP)。眼的流出阻力和眼压的测量在该具体实施方案后面的实施例中，并且在例如Sherwood等人(2016)Measurement ofOutflow Facility Using iPerfusion.PLoS One,11,e0150694中有描述。在一些情况下，本公开的方法使受治疗的眼的房水流畅度增加至少25％或至少30％。

如本文所用，“房水流畅度”是指流出速率与相关压力的比率，并且是流体动力学阻力的倒数。测量房水流畅度的常用方法基于在体内灌注期间进入和离开眼部的液流的质量守恒，根据：

Q_in+Q＝C(P-P_e)+Q₀

称为修正Goldmann方程。Q_in是AH分泌速率，Q是从灌注装置流入眼部的流速，且Q₀是与压力无关的流出量。P是眼压且P_e是巩膜外脉管(AH排出到巩膜外脉管中)中的压力。在该形式中，C是总房水流畅度，包含常规流出与非常规流出和AH分泌(假性)的任何与压力有关的分量两者。在本文中为简单起见，我们使用术语“流畅度”指示C。为了计算流畅度，常常假设Q₀和Q_in、P_e和C本身是与压力无关的(由此默认假设线性Q-P关系)。

在这些假设下，P和Q两个测量值因而足以根据两步灌注方案估计流畅度：

其中基于线性Q-P反应的假设，下标I和II表示在两个不同压力下的测量值，并且C_lin是与压力无关的流畅度。可替代地，对于摘出的眼，Q_in和P_e为零，因此方程式1降低到：

Q＝C_linP+Q₀ 方程式2

为了提供更稳健的方法，可以测量多个(2至10个)点，并将幂律模型拟合为Q-P关系，以捕获房水流畅度的压力依赖性

其中P_r是摘出的眼中定义为8mmHg的参考压力，其中C_r是流畅度。幂指数β表征流量-压力关系的非线性，并且可以解释为影响通过流出路径的流量-压力关系的组合非线性源的指数。灵长类体内灌注的其他改进包括引入三个步进周期，在每个周期之前和之后进行自发IOP读数，以考虑时间和压力相关的反应。

向其施用组合物的受试者或哺乳动物的眼压(IOP)可以降低超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mmHg。流出速率可以增加0.1-0.5μL/min/mmHg。流出速率可以增加超过0.1、0.2、0.3、0.4或0.5μL/min/mmHg。流出速率可以增加超过1、2、3、4、5、10或15μL/min/mmHg，或超过20％、30％、40％或50％。受试者或哺乳动物的小梁网中的光学空白长度可以增加超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。通常，rAAV载体引起它们与其接触的细胞的转导。转导的细胞可以是角膜内皮的细胞，以及其他眼细胞。在施用后，房水中的MMP-3浓度可以增加约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或0.6ng/ml，或介于之间的任何值，诸如尤其是增加约1ng/ml或更大。在一些实施方案中，MMP-3浓度可以为约0.1至约10ng/ml。在一些实施方案中，MMP-3浓度可以为约1至约10ng/ml。在一些实施方案中，MMP-3浓度可以为约1至约5ng/ml。在一些实施方案中，MMP-3浓度可以为约1至约2ng/ml。在一些实施方案中，所述眼的房水中的MMP-3活性增加约1、2、3、4、5或6mU或更大，或介于之间的任何值，诸如尤其增加约5.34mU或更大。还公开所述哺乳动物的角膜厚度在治疗后不变。在一些实施方案中，IOP的降低和/或房水流畅度的增加发生在施用步骤约30天、约40天、约50天、约60天、约70天或约80天内。在一些实施方案中，IOP的降低和/或房水流畅度的增加发生在施用步骤约66天内。

在一些实施方案中，角膜厚度相对于在所述施用步骤之前所述受试者的角膜厚度和/或相对于施用对照单位剂量的受试者的角膜厚度保持不变。如本文所用，“角膜厚度”是指角膜上皮的外边界与角膜内皮之间的距离。角膜厚度可通过角膜厚度测量法测定。角膜厚度测量法可以例如使用ACCUTOME ACCUPACH 5超声波测厚仪或等效装置进行。以微米计的平均厚度测量量度通常是从每只眼一系列连续四次或更多次量度获得的。

可替代地或除了厚度测量法以外，还可以通过角膜内皮显微镜检查来评定角膜厚度。角膜内皮显微镜检查可以例如用TOMEY EM-3000角膜内皮显微镜等进行。角膜内皮显微镜检查也可用于评估角膜内皮的完整性。

在一些实施方案中，本公开的方法不引起炎症反应或引起临床不显著的炎症反应。评定角膜炎症的方法包括裂隙灯生物显微镜检查。可使用修正的Hackett-McDonald评分系统对前房细胞、房水闪辉和其他眼部发现进行分级并确定从得分的单个分量的总和得出的综合临床得分。参见McDonald,T.O.和Shadduck,J.A.Eye irritation.Advances inModern Toxicology.139–191(1977).Hackett,R.B.和McDonald,T.O.Assessing ocularirritation.Dermatotoxicology.第5版557-567(1996)。裂隙灯生物显微镜检查和眼底检查未显示出研究过程中(即，在至少90天内)有眼内炎症的迹象。

在一些实施方案中，所述方法未引起在所述受试者的血清中MMP-3的血清水平升高超过MMP-3的基线水平。血清MMP3没有升高证明没有未结合的MMP3离开眼睛并进入循环。认为这降低了脱靶效应的潜力。

在另一方面，本公开提供了降低受试者至少一只眼的眼压(IOP)的方法，所述方法包括施用有效量的本公开的任何单位剂量。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，受试者是灵长类。

在另一方面，本公开提供了治疗和/或预防有需要的受试者的IOP升高和/或青光眼的方法，所述方法包括施用有效量的本公开的任何单位剂量。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其他实施方案中，受试者是灵长类。

在本公开的任何方法中，可以参考未接受治疗的对照受试者或参考对照眼来确定改善、减少、增加和/或预防。例如，可以对一只眼进行治疗而对侧眼用作对照。可替代地或另外，可以参考基线测量来确定改善、减少、增加和/或其他变化。如本文所用，“基线”是指在单位剂量施用之前进行的测量或若干测量的平均值。

这些实施方案和其他实施方案可以参考以下实施例进一步理解。

实施例

实施例1：重组人MMP-3

本实施例表征了前房内递送重组人MMP3(rhMMP3)对非洲绿猴小梁网和Schlemm管的房水流出和形态的影响。该实施例展示在使用MMP-3的灵长类中增加了房水流畅度。平均增加量为约30％，一些受试者表现出至少50％、80％、100％、150％、200％或更大的流出量增加。该实施例进一步证明rhMMP3对房水流出动力学和眼压具有剂量依赖性影响。

使缺乏前肽结构域(SEQ ID NO:2)的重组人MMP-3(rhMMP3)在细菌细胞中表达，并使用标准方法纯化。在原发性开角型青光眼(POAG)中IOP升高的主要原因被认为是流出阻力增加。Rocha-Sousa等人ISRN Ophthalmol 2013:261386(2013)。此外，已知降压药物拉坦前列素和罗普雷萨会增加流出量并降低IOP。显著地，该实施例确定，当眼房水中MMP-3的浓度超过约1纳克/毫升(ng/mL)时，实现已知与降低或预防升高的眼压(IOP)相关的房水流畅度增加。这确定了设计用于治疗或预防IOP升高和/或青光眼的任何治疗的治疗功效的关键相关性。

每只猴(n＝17)接受在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制的浓度为10ng/mL的0.2mL至2mL rhMMP3的前房内输注。在测量流畅度之前，允许rhMMP3在高于自发(或静息)IOP的5mmHg压力下输注到眼睛内进行一小时“预处理”。对侧对照输注媒介物并且在这种一小时预处理阶段之后测定房水流畅度。

在指定的时间点(在一小时预处理前和在一小时预处理后)，使用带3号针头的0.3ml注射器从双眼中无菌收集100μl房水并储存在-70℃下，直到通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行分析。根据&D SYSTEMS Human Total MMP-3Quantikine ELISA试剂盒的标准方案，一式两份地运行样品。

如图1中所示，将重组人MMP3体内输注到灵长类的前房中。在高于自发眼压的5mmHg下输注1小时，在房水中产生0-4ng/ml(或更具体地，0.5-3.9ng/ml)的浓度范围。

使用修正的iPerfusion系统(Sherwood等人(2016)Measurement of OutflowFacility Using iPerfusion.PLoS One,11,e0150694)测量房水流畅度，以允许在灵长类眼中进行体内流出测量。

如图2A中所示，将每个对照与治疗对之间的流畅度差映射到rhMMP3的递送剂量。RhMMP3使灵长类体内房水流畅度增加30％(P＝0.017，N＝17)。数据点表示对照与受治疗的对侧眼之间的流畅度百分比差异。深色阴影区表示白色平均线的95％置信区间边界。误差条表示95％置信区间和2个标准偏差。

图2B显示递送的rhMMP3的量与眼部之间的房水流畅度差异相关。平均而言，受治疗的眼表现出0.13μl/min/mmHg的增加；这随rhMMP3浓度而变化。针对受治疗的眼和对照眼的房水流畅度的相对差异对房水中MMP-3的浓度作图，产生剂量-反应曲线。观察到的剂量反应是统计学显著的(R²＝0.51；p＝0.0075)。平均而言，受治疗的眼表现出0.13μl/min/mmHg的增加；这根据rhMMP3浓度而变化。

实施例2：腺相关病毒(AAV)

本实施例展示了使用从CMV启动子(AAV9-CMV-eGFP)表达增强型绿色荧光蛋白的AAV9载体转导灵长类的角膜内皮。该实施例证明角膜内皮的转导可以在低至5x 10¹¹vg的AAV剂量下实现。该实施例进一步证明，与自我互补AAV载体(scAAV9-EGFP)相比，使用单链AAV载体(ssAAV9-EGFP)对灵长类的角膜内皮的转导出人意料地优良。

分别以3.3×10¹³个载体基因组/毫升(vg/mL)和1×10¹³vg/mL制备包含从每种试验载体(scAAV9-EGFP或ssAAV9-EGFP)以及对照载体生成的AAV颗粒的单位剂量。在与DNA酶和蛋白酶K一起温育之后，使用qPCR测量滴度。使用含有2X TAQMAN通用主混合物、靶向GFP或MMP-3基因的20X TAQMAN基因表达测定探针和无RNA酶的水的主混合物，稀释样品并一式四份地运行。将样品与已知浓度和参考标准品的标准曲线进行比较。qPCR反应在STEPONEPLUS(Applied

)仪器上进行40个周期的变性和退火，有先前10分钟的聚合酶活化步骤。在qPCR仪器上分析数据。对照包括0.9％盐水媒介物。

选择裂隙灯检查和眼底检查、彩色眼底照片(CFP)和光学相干断层扫描(OCT)正常的非洲绿色猴进行研究。所有程序都在麻醉下进行：肌内注射氯胺酮(8mg/kg)和甲苯噻嗪(1.6mg/kg)，以及用局部的10％去氧肾上腺素进行瞳孔放大。每个受试者接受双眼治疗(OD＝右眼；OS＝左眼)。通过前房内注射施用50μL的体积，在每个受试者的OD中产生5×10¹⁰-1.65×10¹²个载体基因组(vg)的scAAV9递送剂量且在每个受试者的OS中产生5×10¹¹vgssAAV9的递送剂量。将开睑器置于眼中以利于注射，接着滴0.5％的盐酸丙美卡因，然后滴5％的必妥碘(Betadine)溶液，并进行无菌盐水冲洗。在双眼(OU)中进行前房内注射。使用连接到0.3-mL注射器的31号0.5英寸长的针头进行注射。将针头通过颞侧角膜引入边缘前大约2mm处，而不干扰眼内结构。在两次前房内注射后，施用局部三重抗生素即新霉素、多粘菌素、杆菌肽眼膏(或等效物)。

图3A-3C示出了用AAV9进行灵长类角膜转导的结果。如图3A中所示，通过前房内注射自我互补AAV9(scAAV9-EGFP)治疗的灵长类角膜内皮中的荧光eGFP标志物的表达在该测定的灵敏度水平下不能与阴性对照区分开。如图3B中所示，来自前房内注射单链AAV9(ssAAV9-EGFP)的受试者的角膜内皮展示出报告基因eGFP的表达。表达限于角膜内皮。图3C示出了来自注射ssAAV9-eGFP的眼的Z堆叠的3D渲染(如同图3B中一样)。这种渲染证明了GFP在角膜内皮层中的很大百分比的细胞中的核周表达。

荧光报告因子在角膜内皮中的表达持续至少90天。在前房内注射单位剂量后超过90天终止研究时，通过来自灵长类受试者的眼前房切片的免疫组织化学分析来观察GFP信号。

实施例3：腺相关病毒(AAV)

实施例1确定了基质金属蛋白酶3(MMP-3)临床有效表达的目标范围。该范围为至少约1纳克/毫升(ng/mL)，或约1ng/mL至约10ng/mL，或约1ng/mL至约3ng/mL。由于实施例2的结果，选择单链AAV。

A.房水中在目标浓度范围的MMP-3表达

部分A证明，使用AAV9载体转导灵长类的角膜内皮引起基质金属蛋白酶3(MMP-3)的表达和此类治疗相关水平-即，至少约1纳克/毫升(ng/mL)。将从CMV启动子(AAV9-CMV-MMP3)表达MMP-3的单链AAV9载体与GFP对照(AAV9-CMV-eGFP)进行比较。治疗分配如表4所示。

表4：治疗分配

成像：使用带Canon 6D数字成像硬件和New Vision眼底图像分析系统软件的Topcon TRC-50EX视网膜照相机进行彩色和荧光前段摄影。对于彩色照片，使用1/25秒的快门速度(Tv)、ISO 400和闪光18。用激发器和屏障滤光片(480nm激发器/525nm屏障滤光片)、200的闪光设置、Tv1/5秒、ISO 3200和闪光300获取单色和彩色荧光图像。收集荧光图像以充当阴性对照即接受GFP载体的眼。

光学相干断层扫描：使用带有眼追踪和HEYEX图像捕获和分析软件的HeidelbergSPECTRALIS OCT HRA或OCT Plus来进行前段OCT。在OCT测量时，使用SPECTRALIS的自体荧光功能来获得前房中GFP表达的图像。

B.在灵长类中在用MMP-3的基于AAV的基因治疗之后MMP-3的表达

B部分展示>1ng/mL的MMP-3表达，维持至少66天。如图4中所示，在选定时间点内，前房内注射表达MMP3的AAV9(AAV9-CMV-MMP3)导致通过ELISA测定的眼房水中的浓度在约1ng/ml至2ng/ml的范围内(上部线条)。一名受试者具有在3-4ng/ml范围内的浓度。评定MMP-3浓度的时间点是注射后第21、42、56和66天。时间点对应于3周、7周、8周或9-10周；或对应于1个月或2个月。注射AAV9-CMV-EGFP的眼房水中的MMP-3的表达未增加(下部线条)。

在用AAV9-CMV-MMP3治疗的受试者中，MMP-3的表达在最终时间点平均为1.6ng/ml。这与每个时间点保持浓度<1ng/ml的媒介物对照(AAV9-eGFP)相比，是显著增加。在最终时间点，个体受试者达到3-4ng/ml的MMP-3表达。

C.在灵长类中使用用MMP-3的基于AAV的基因治疗降低IOP

C部分展示在灵长类中使用基于AAV的基因治疗与MMP-3降低IOP。C部分进一步展示了由基于AAV的基因治疗引起的MMP-3的表达与对眼压(IOP)的影响之间的剂量反应关系。

在指定时间点，在将猴置于仰卧位后，在镇静10分钟内测量双眼(OU)眼压(IOP)。用设为狗(d)校准设置的TONOVET眼压计进行IOP量度。在每个检查时间点从每只眼取三个量度值，并且定义平均IOP。

图5A-5B示出了AAV-MMP3对眼压(IOP)的治疗效果。图5A示出了按照mmHg测量的平均IOP±SEM(平均标准误差)。在第21、42、56、66、91、122、150和178天(对应于第3、6、8、9-10、13、17-18、21-22和25-26周；并且对应于第1、2、3、4、5和6个月)进行测量。在用AAV9-CMV-MMP3治疗的猴中，IOP量度保持稳定，而不是给药后立即降低，从约第56天至约第150天观察到IOP降低。图5B显示在施用治疗后66天测得IOP随着房水中MMP3水平的增加而降低。

如图5A中所示，给药后没有立即出现预期的降低，在用AAV9-CMV-MMP3治疗的眼中，IOP在评估的时间点保持稳定。平均而言，在实验过程中在注射AAV-MMP3后，受治疗的眼展示出持续降低的IOP。如图5B中所示，比较房水中的MMP3水平与IOP从基线的变化揭示IOP随着MMP3水平的增加而降低。

D.用MMP-3的基于AAV的基因治疗不影响角膜厚度

D部分证明用MMP-3的基于AAV的治疗不影响角膜厚度。在整个安全性研究过程中，通过厚度测量法和角膜内皮显微镜检查测量角膜厚度。角膜厚度量度值保持稳定并且在正常限值范围内，并且没有明显的AAV-MMP3相关变化。

角膜内皮显微镜检查：在指定时间点，用TOMEY EM-3000角膜内皮显微镜进行角膜内皮显微镜检查，以评定角膜内皮的完整性。定量分析的内皮细胞的数目、细胞密度、平均值、标准偏差、变异系数(CV)和细胞尺寸范围。

厚度测量法：在指定时间点使用ACCUTOME ACCUPACH 5超声波测厚仪进行角膜厚度测量。以微米计的平均厚度测量量度通常是从每只眼一系列连续四次量度获得的。

图6A-6B显示，响应于AAV-MMP3，角膜厚度测量保持不变。如图6A中所示，响应于AAV-MMP3在选定时间点，通过对灵长类的厚度测量获得的平均角膜厚度测量值的代表，显示随时间推移没有显著变化。如图6B中所示，正如通过角膜内皮显微镜检查测得的平均角膜厚度的代表也展示出在研究过程中稳定的值，未观察到与AAV-MMP3相关的厚度差异。

D.用MMP-3的基于AAVE基因治疗不引起炎症

E部分证明用MMP-3的基于AAV的治疗不引起炎症反应或引起最小炎症反应。在指定时间点，在双眼(OU)中进行裂隙灯生物显微镜检查。使用修正的Hackett-McDonald评分系统对前房细胞、房水闪辉和其他眼部发现进行分级并确定从得分的单个分量的总和得出的综合临床得分。裂隙灯生物显微镜检查和眼底检查未显示出研究过程中(即，在至少90天内)有眼内炎症的迹象。在一些动物中，观察到最小炎症反应。

F.基于AAV的基因治疗不升高MMP-3的血清浓度

F部分证明用MMP-3的基于AAV的治疗未引起MMP-3的血清水平相对于基线增加。在前房内注射后在指定放血时间点收集血液(5mL)，用于通过在离心管(不含凝块活化剂)中在室温下温育1小时，以允许凝结，接着在4℃下以3000rpm离心10分钟进行血清制备。进行ELISA以测量总MMP3浓度。与注射前的基线相比，在注射AAV-MMP3的灵长类中在任何时间点均未发现显著升高。如图7中所示，正如通过ELISA测定的血清中的MMP3水平(ng/mL)相对于基线没有显著升高(下部线条)。水平也不高于在媒介物对照中观察到的水平(上部线条)。

实施例4：AAV9表达的MMP3降低类固醇诱导的青光眼鼠类模型中的IOP并增加房水流畅度

在高眼压症的糖皮质激素模型中AAV9表达的MMP3降低IOP

野生型小鼠前房内注射编码MMP3的四环素诱导型AAV(AAV-iMMP-3)或前房内注射编码GFP的四环素诱导型AAV(AAV-iGFP)作为对照。在AAV注射后两周，小鼠皮下植入装满糖皮质激素地塞米松的渗透微型泵。对照子集的小鼠植入分泌媒介物对照环糊精的泵。在经地塞米松治疗的动物中，在植入后四周内发展高眼压症，如图8A中所见。在经环糊精对照治疗的动物中，眼压稳定(图8B)。

植入后两周，每天两次向眼部局部施加强力霉素(四环素类似物)，以诱导AAV的转录。从添加强力霉素时开始(DEX第2周)，在高眼压动物中，经AAV-MMP3治疗的眼中的IOP看起来稳定(图8A，下部线条)，但在AAV-iGFP动物中继续增加(图8A，上部线条)。

当比较从基线至最终时间点的IOP变化时(总共6周，图9A)，与AAV-iGFP对照相比，经AAV-iMMP3治疗的眼具有显著降低的IOP。当仅在对侧眼之间比较最终时间点时，高眼压动物中经AAV-iMMP3治疗的眼中的IOP也显著降低(图9C)。在正常眼压的对照小鼠中未观察到显著变化(图9B和图9D)。使用学生t检验进行统计。对于地塞米松治疗的小鼠，N＝14。对于环糊精治疗的小鼠，N＝10。

在高眼压症的糖皮质激素模型中AAV9表达的MMP3增加房水流畅度

在地塞米松诱导的高眼压小鼠(图10A)和正常眼压小鼠(图10B)中，与对侧对照相比，在AAV-MMP3治疗的眼中房水流畅度增加大约50％。在高眼压动物中，房水流畅度的平均增加量为45％[18,78](平均百分比，[下置信区间，上置信区间])，P＝0.0049，N＝8。在正常眼压动物对照中，房水流畅度的平均增加量为59％[26,100]，P＝0.002，N＝8。

AAV-MMP3在糖皮质激素诱导的高眼压症小鼠模型中诱导常规流出组织的细胞外降解。

使用电子显微镜检查量化受治疗的眼和对照眼两者中Schlemm管内皮下区域细胞外基质(ECM)材料的缺乏(图11)。受治疗的眼在围绕眼部整个周缘的这一区域具有显著更大量的视觉空白空间。

实施例5：AAV9表达的MMP3在先天性青光眼鼠类模型中降低IOP并增加房水流畅度

在青光眼遗传模型中AAV9表达的MMP3降低IOP

野生型小鼠(图中的MYOC(-))和人突变型肌纤蛋白Y437H转基因呈阳性的小鼠(图中的MYOC(+))一只眼注射AAV-iMMP3且注射AAV-iGFP作为对侧对照。两周后，经由每天施用两次强力霉素滴眼液来诱导表达。图12A显示，在高眼压MYOC(+)动物中，在整个研究过程中，经AAV-iMMP3治疗的眼表现出IOP降低。对于MYOC(+)组(图13A)和MYOC(-)组(图13B)，在实验过程中经AAV-iMMP-3和AAV-iGFP对侧治疗的眼的IOP中值变化在点箱图中呈现。最终IOP读数呈现于分别对应于MYOC(+)和MYOC(-)组的(图13C)和(图13D)中。对侧眼之间的最终IOP读数差异在MYOC(+)动物中显著(1.7±0.1mmHg，p＝0.0003，n＝16，图6C)，但在MYOC(-)动物中不显著(0.1±0.2mmHg，p＝0.48，n＝12，图6D)。

在青光眼遗传模型中AAV9表达的MMP3增加房水流畅度

在MYOC^Y437H小鼠中(图14A)，房水流畅度平均增加49％，P＝0.0115，N＝9。在正常眼压同窝对照中(图14B)，房水流畅度平均增加88％，P＝0.0001，N＝8。

实施例6：密码子优化的MMP3序列的开发和表征

密码子优化序列的开发

使用算法进行MMP3序列(SEQ ID NO:9)的密码子优化，以优化该序列供人类密码子使用。天然MMP3序列和密码子优化序列之一MMP Opt3也针对CpG耗尽进行修饰(表5和表6)。表5示出了每个优化序列与天然MMP3序列的序列相似性。密码子优化序列的百分比同一性和GC含量均与天然MMP3序列显著不同。图22A-图22C示出了天然序列和优化序列的比对。任何优化序列均使用本文所述实施例中提供的方法和分析来测试和表征。

表5.密码子优化的MMP3序列与天然序列的比较。

表6中的密码子优化序列的成对比较示出了优化序列之间的序列相似性。百分比同一性显示密码子优化序列具有显著差异。

表6.密码子优化的MMP3序列的成对比较。

密码子优化序列的体外表达

选择三个优化序列用于表征，MMP3 Opt 1(SEQ ID NO:23)、MMP3 Opt 2(SEQ IDNO:24)和MMP3 Opt 3(SEQ ID NO:25)。产生密码子优化序列并亚克隆到AAV表达盒中。将含有密码子优化序列的质粒转染到代表易于转染和广泛使用的人类细胞系的HEK293细胞，以及代表预期靶细胞类型的HCEC(人角膜内皮细胞)中。在两种情况下，使用lipofectamine3000转染试剂转染细胞48小时。然后从培养基上清液以及还有细胞裂解产物中获取蛋白质。进行人MMP3(R&D systems，DMP300)的ELISA以测定每个样品的MMP3浓度。进行BCA测定以测定总蛋白浓度。将ELISA数据归一化为BCA数据，以生成以ng/μg总蛋白计的MMP3的量。

表征HEK和HCEC细胞系中密码子优化的MMP3序列的表达。转染到HEK细胞中的优化构建体在这种细胞类型的培养基和细胞裂解产物两者中均显示出很小的MMP3表达变化(图15)。相比之下，在HCEC细胞中的MMP3表达显示编码MMP3的不同序列之间表达有明显差异(图16)。与天然MMP3编码序列相比，对转染到HCEC细胞中的优化构建体的分析显示细胞裂解产物和培养基上清液两者中的MMP3蛋白产生有显著增加。优化序列之间蛋白质产生的差异显示，MMP3 Opt 3序列引起最高水平的蛋白质产生，接着是MMP3 Opt 2和MMP3 Opt 1(图16)。这些结果表明在相关细胞类型中，与天然序列相比，密码子优化序列引起更高的MMP3蛋白产生。

对于HEK293细胞和HCEC细胞中编码MMP3的天然序列和密码子优化序列所观察到的表达趋势的比较显示，在人类细胞系之间表达无法预测。在HEK293细胞中，天然序列和密码子优化序列之间以及密码子优化序列之间的表达存在非常小的可变性。出乎意料的是，每个密码子优化序列以高于天然序列的水平表达，并且在HCEC细胞中密码子优化序列之间存在差异性表达。该结果证明改善的表达不是MMP3编码序列密码子优化的显然结果。

密码子优化的MMP3序列的AAV9病毒载体递送

产生含有最有效的密码子优化序列MMP3 Opt 3或天然MMP3序列的AAV9病毒载体。将载体以1×10⁵的MOI(感染复数)转导到HCEC细胞中。在转染后48小时收获培养基上清液。对这些样品进行ELISA、蛋白质印迹和FRET(荧光共振能量转移)活性测定以表征蛋白质表达和蛋白酶活性。

由AAV9病毒载体递送的密码子优化的MMP3序列的表达

评定用AAV9载体转导的HCEC细胞中的MMP3表达。当使用MMP3Opt 3构建体时，与对照和含有天然MMP3序列的构建体相比，培养基中的MMP3表达显著增加(P＝<0.0001，N＝16个MMP3 Opt 3，N＝15个天然序列，未配对t检验)(图17)。此外，在可用的情况下，将MMP3水平进一步归一化为总蛋白浓度。(P＝<0.0001，N＝8)(图18)。使用蛋白质印迹分析测量在用AAV9载体转导的HCEC细胞中从密码子优化序列和天然序列分泌到培养基中的MMP3。将来自于用表达天然或优化MMP3的AAV9处理的HCEC细胞培养物的培养基进行免疫印迹以测量MMP3(Abcam，#ab52915)(图19)。结果显示在含有优化构建体处理的细胞的泳道中前MMP3和活性MMP3条带两者的强度更强。丽春红(ponceau)作为上样对照呈现。

由AAV9病毒载体递送的密码子优化的MMP3序列的蛋白酶活性

从由AA9载体转导的细胞中收获的培养基中的MMP3蛋白酶活性。(图20)。使用MMP3活性测定FRET试剂盒(Abcam，#ab118972)评定表达的MMP3的蛋白酶活性。使用优化构建体显著增加MMP3活性。(P<0.0001，N＝8)。根据制造商的方案，活性以mU/ml定量，其中一个单位定义为在室温下每分钟将会生成1.0μmol未淬灭的Mca的酶的量。

实施例7：MMP3对人眼房水流畅度的影响

为了对小鼠和非人灵长类数据进行扩展，测定了重组人MMP3对人眼的功效。将死后的眼二等分，并且将前房固定到iPerfusion系统。在达到稳定流速后，在数天内以递增浓度将MMP3灌注到眼中。在对侧眼中使用媒介物，允许配对观察。选择5ng/ml浓度用于分析。在该浓度下，MMP3在与对照相比时，在经由交换将5ng/ml灌注液引入前房后一小时，使房水流畅度平均增加56％，P＝0.1399，N＝3对(图21A-图21B)。这些结果表明，在青光眼患者的眼中暴露于重组MMP3可以增加房水流畅度并降低眼压，特别是在选择重组蛋白或基因治疗载体的剂量以达到1-10ng/ml的剂量时。

****

本文提及的所有出版物和专利在此以引用的方式整体并入，如同每个个别出版物或专利被具体且个别地指示以引用的方式并入一般。在发生冲突的情况下，以本申请(包括本文的任何定义)为准。但是，提及本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请并不且不应被视为承认或任何形式的建议，即其构成有效的现有技术或构成世界上任何国家的公知常知的部分。

在本描述中，除非另外指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所叙述范围内的任何整数的值，且适当时包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。当紧接在数量或数字之前时，术语“约”意指数量或数字范围加减10％。应理解，除非另外指示，否则如本文所用，术语“一(a)”和“一(an)”是指所列举的组分中的“一个或多个”。替代物(例如，“或”)的使用应理解为意指替代物中的一个、两个或其任何组合。术语“和/或”应理解为意指替代物中的一个或两个。如本文所用，术语“包括(include)”和“包括/包含(comprise)”是同义使用的。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应解释为限制所描述的主题。

虽然已示出和描述了说明性实施方案，但应了解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可在其中进行各种改变。

序列表

<110> 爱科霍拉有限公司(Exhaura, Ltd.)

都柏林三一学院(THE PROVOST, FELLOWS, FOUNDATION SCHOLARS, AND THE OTHER

MEMBERS OF BOARD, OF THE COLLEGE OF THE HOLY AND UNDIVIDED

TRINITY OF QUEEN ELIZABETH, NEAR DUBLIN)

<120> 用于眼部治疗的组合物和方法

<130> EXHA-004/01WO 333159-2010

<150> US 62/912,427

<151> 2019-10-08

<160> 27

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 477

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Lys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Leu Cys Val Ala Val Cys Ser

1 5 10 15

Ala Tyr Pro Leu Asp Gly Ala Ala Arg Gly Glu Asp Thr Ser Met Asn

20 25 30

Leu Val Gln Lys Tyr Leu Glu Asn Tyr Tyr Asp Leu Lys Lys Asp Val

35 40 45

Lys Gln Phe Val Arg Arg Lys Asp Ser Gly Pro Val Val Lys Lys Ile

50 55 60

Arg Glu Met Gln Lys Phe Leu Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp

65 70 75 80

Ser Asp Thr Leu Glu Val Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp

85 90 95

Val Gly His Phe Arg Thr Phe Pro Gly Ile Pro Lys Trp Arg Lys Thr

100 105 110

His Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Lys Asp

115 120 125

Ala Val Asp Ser Ala Val Glu Lys Ala Leu Lys Val Trp Glu Glu Val

130 135 140

Thr Pro Leu Thr Phe Ser Arg Leu Tyr Glu Gly Glu Ala Asp Ile Met

145 150 155 160

Ile Ser Phe Ala Val Arg Glu His Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly

165 170 175

Pro Gly Asn Val Leu Ala His Ala Tyr Ala Pro Gly Pro Gly Ile Asn

180 185 190

Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Gln Trp Thr Lys Asp Thr Thr

195 200 205

Gly Thr Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Ile Gly His Ser Leu

210 215 220

Gly Leu Phe His Ser Ala Asn Thr Glu Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr

225 230 235 240

His Ser Leu Thr Asp Leu Thr Arg Phe Arg Leu Ser Gln Asp Asp Ile

245 250 255

Asn Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Pro Pro Asp Ser Pro Glu Thr

260 265 270

Pro Leu Val Pro Thr Glu Pro Val Pro Pro Glu Pro Gly Thr Pro Ala

275 280 285

Asn Cys Asp Pro Ala Leu Ser Phe Asp Ala Val Ser Thr Leu Arg Gly

290 295 300

Glu Ile Leu Ile Phe Lys Asp Arg His Phe Trp Arg Lys Ser Leu Arg

305 310 315 320

Lys Leu Glu Pro Glu Leu His Leu Ile Ser Ser Phe Trp Pro Ser Leu

325 330 335

Pro Ser Gly Val Asp Ala Ala Tyr Glu Val Thr Ser Lys Asp Leu Val

340 345 350

Phe Ile Phe Lys Gly Asn Gln Phe Trp Ala Ile Arg Gly Asn Glu Val

355 360 365

Arg Ala Gly Tyr Pro Arg Gly Ile His Thr Leu Gly Phe Pro Pro Thr

370 375 380

Val Arg Lys Ile Asp Ala Ala Ile Ser Asp Lys Glu Lys Asn Lys Thr

385 390 395 400

Tyr Phe Phe Val Glu Asp Lys Tyr Trp Arg Phe Asp Glu Lys Arg Asn

405 410 415

Ser Met Glu Pro Gly Phe Pro Lys Gln Ile Ala Glu Asp Phe Pro Gly

420 425 430

Ile Asp Ser Lys Ile Asp Ala Val Phe Glu Glu Phe Gly Phe Phe Tyr

435 440 445

Phe Phe Thr Gly Ser Ser Gln Leu Glu Phe Asp Pro Asn Ala Lys Lys

450 455 460

Val Thr His Thr Leu Lys Ser Asn Ser Trp Leu Asn Cys

465 470 475

<210> 2

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组人MMP-3氨基酸序列（缺乏前肽结构域）

<400> 2

Arg Thr Phe Pro Gly Ile Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu Thr Tyr

1 5 10 15

Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Lys Asp Ala Val Asp Ser

20 25 30

Ala Val Glu Lys Ala Leu Lys Val Trp Glu Glu Val Thr Pro Leu Thr

35 40 45

Phe Ser Arg Leu Tyr Glu Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe Ala

50 55 60

Val Arg Glu His Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Gly Asn Val

65 70 75 80

Leu Ala His Ala Tyr Ala Pro Gly Pro Gly Ile Asn Gly Asp Ala His

85 90 95

Phe Asp Asp Asp Glu Gln Trp Thr Lys Asp Thr Thr Gly Thr Asn Leu

100 105 110

Phe Leu Val Ala Ala His Glu Ile Gly His Ser Leu Gly Leu Phe His

115 120 125

Ser Ala Asn Thr Glu Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr His Ser Leu Thr

130 135 140

Asp Leu Thr Arg Phe Arg Leu Ser Gln Asp Asp Ile Asn Gly Ile Gln

145 150 155 160

Ser Leu Tyr Gly Pro Pro Pro Asp Ser Pro Glu Thr Pro Leu Val Pro

165 170 175

Thr Glu Pro Val Pro Pro Glu Pro Gly Thr Pro Ala Asn Cys Asp Pro

180 185 190

Ala Leu Ser Phe Asp Ala Val Ser Thr Leu Arg Gly Glu Ile Leu Ile

195 200 205

Phe Lys Asp Arg His Phe Trp Arg Lys Ser Leu Arg Lys Leu Glu Pro

210 215 220

Glu Leu His Leu Ile Ser Ser Phe Trp Pro Ser Leu Pro Ser Gly Val

225 230 235 240

Asp Ala Ala Tyr Glu Val Thr Ser Lys Asp Leu Val Phe Ile Phe Lys

245 250 255

Gly Asn Gln Phe Trp Ala Ile Arg Gly Asn Glu Val Arg Ala Gly Tyr

260 265 270

Pro Arg Gly Ile His Thr Leu Gly Phe Pro Pro Thr Val Arg Lys Ile

275 280 285

Asp Ala Ala Ile Ser Asp Lys Glu Lys Asn Lys Thr Tyr Phe Phe Val

290 295 300

Glu Asp Lys Tyr Trp Arg Phe Asp Glu Lys Arg Asn Ser Met Glu Pro

305 310 315 320

Gly Phe Pro Lys Gln Ile Ala Glu Asp Phe Pro Gly Ile Asp Ser Lys

325 330 335

Ile Asp Ala Val Phe Glu Glu Phe Gly Phe Phe Tyr Phe Phe Thr Gly

340 345 350

Ser Ser Gln Leu Glu Phe Asp Pro Asn Ala Lys Lys Val Thr His Thr

355 360 365

Leu Lys Ser Asn Ser Trp Leu Asn Cys

370 375

<210> 3

<211> 3503

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 全长载体（不包括骨架）

<400> 3

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggccgcac gcgtggagct agttattaat agtaatcaat tacggggtca 180

ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 240

ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 300

acgtcaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 360

ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 420

aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 480

tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat 540

gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 600

gggagtttgt tttgcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc 660

cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt 720

tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac 780

accgggaccg atccagcctc cgcggattcg aatcccggcc gggaacggtg cattggaacg 840

cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gagtctatag gcccacaaaa 900

aatgctttct tcttttaata tacttttttg tttatcttat ttctaatact ttccctaatc 960

tctttctttc agggcaataa tgatacaatg tatcatgcct ctttgcacca ttctaaagaa 1020

taacagtgat aatttctggg ttaaggcaat agcaatattt ctgcatataa atatttctgc 1080

atataaattg taactgatgt aagaggtttc atattgctaa tagcagctac aatccagcta 1140

ccattctgct tttattttat ggttgggata aggctggatt attctgagtc caagctaggc 1200

ccttttgcta atcatgttca tacctcttat cttcctccca cagctcctgg gcaacgtgct 1260

ggtctgtgtg ctggcccatc actttggcaa agaattggga ttcgaacatc gattgaattc 1320

cccggggatc catgaagagt cttccaatcc tactgttgct gtgcgtggca gtttgctcag 1380

cctatccatt ggatggagct gcaaggggtg aggacaccag catgaacctt gttcagaaat 1440

atctagaaaa ctactacgac ctcaaaaaag atgtgaaaca gtttgttagg agaaaggaca 1500

gtggtcctgt tgttaaaaaa atccgagaaa tgcagaagtt ccttggattg gaggtgacgg 1560

ggaagctgga ctccgacact ctggaggtga tgcgcaagcc caggtgtgga gttcctgatg 1620

ttggtcactt cagaaccttt cctggcatcc cgaagtggag gaaaacccac cttacataca 1680

ggattgtgaa ttatacacca gatttgccaa aagatgctgt tgattctgct gttgagaaag 1740

ctctgaaagt ctgggaagag gtgactccac tcacattctc caggctgtat gaaggagagg 1800

ctgatataat gatctctttt gcagttagag aacatggaga cttttaccct tttgatggac 1860

ctggaaatgt tttggcccat gcctatgccc ctgggccagg gattaatgga gatgcccact 1920

ttgatgatga tgaacaatgg acaaaggata caacagggac caatttattt ctcgttgctg 1980

ctcatgaaat tggccactcc ctgggtctct ttcactcagc caacactgaa gctttgatgt 2040

acccactcta tcactcactc acagacctga ctcggttccg cctgtctcaa gatgatataa 2100

atggcattca gtccctctat ggacctcccc ctgactcccc tgagaccccc ctggtaccca 2160

cggaacctgt ccctccagaa cctgggacgc cagccaactg tgatcctgct ttgtcctttg 2220

atgctgtcag cactctgagg ggagaaatcc tgatctttaa agacaggcac ttttggcgca 2280

aatccctcag gaagcttgaa cctgaattgc atttgatctc ttcattttgg ccatctcttc 2340

cttcaggcgt ggatgccgca tatgaagtta ctagcaagga cctcgttttc atttttaaag 2400

gaaatcaatt ctgggctatc agaggaaatg aggtacgagc tggataccca agaggcatcc 2460

acaccctagg tttccctcca accgtgagga aaatcgatgc agccatttct gataaggaaa 2520

agaacaaaac atatttcttt gtagaggaca aatactggag atttgatgag aagagaaatt 2580

ccatggagcc aggctttccc aagcaaatag ctgaagactt tccagggatt gactcaaaga 2640

ttgatgctgt ttttgaagaa tttgggttct tttatttctt tactggatct tcacagttgg 2700

agtttgaccc aaatgcaaag aaagtgacac acactttgaa gagtaacagc tggcttaatt 2760

gttgataccc atacgatgtt ccagattacg ctgacccaca tattgaagag caatagctgg 2820

tttaattgtt aactcgagag atctacgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc 2880

tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt 2940

gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat 3000

ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg cggggtctat tgggaaccaa 3060

gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc cgcctcctgg gttcaagcga 3120

ttctcctgcc tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc atgcatgacc aggctcagct 3180

aatttttgtt tttttggtag agacggggtt tcaccatatt ggccaggctg gtctccaact 3240

cctaatctca ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt gctgggatta caggcgtgaa 3300

ccactgctcc cttccctgtc cttctgattt tgtaggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc 3360

gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga 3420

ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga 3480

gcgagcgcgc agctgcctgc agg 3503

<210> 4

<211> 3232

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 表达盒（不包括ITR）

<400> 4

gcggccgcac gcgtggagct agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgtcaatag 180

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480

tttgcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca 540

aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg 600

tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg 660

atccagcctc cgcggattcg aatcccggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc 720

gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gagtctatag gcccacaaaa aatgctttct 780

tcttttaata tacttttttg tttatcttat ttctaatact ttccctaatc tctttctttc 840

agggcaataa tgatacaatg tatcatgcct ctttgcacca ttctaaagaa taacagtgat 900

aatttctggg ttaaggcaat agcaatattt ctgcatataa atatttctgc atataaattg 960

taactgatgt aagaggtttc atattgctaa tagcagctac aatccagcta ccattctgct 1020

tttattttat ggttgggata aggctggatt attctgagtc caagctaggc ccttttgcta 1080

atcatgttca tacctcttat cttcctccca cagctcctgg gcaacgtgct ggtctgtgtg 1140

ctggcccatc actttggcaa agaattggga ttcgaacatc gattgaattc cccggggatc 1200

catgaagagt cttccaatcc tactgttgct gtgcgtggca gtttgctcag cctatccatt 1260

ggatggagct gcaaggggtg aggacaccag catgaacctt gttcagaaat atctagaaaa 1320

ctactacgac ctcaaaaaag atgtgaaaca gtttgttagg agaaaggaca gtggtcctgt 1380

tgttaaaaaa atccgagaaa tgcagaagtt ccttggattg gaggtgacgg ggaagctgga 1440

ctccgacact ctggaggtga tgcgcaagcc caggtgtgga gttcctgatg ttggtcactt 1500

cagaaccttt cctggcatcc cgaagtggag gaaaacccac cttacataca ggattgtgaa 1560

ttatacacca gatttgccaa aagatgctgt tgattctgct gttgagaaag ctctgaaagt 1620

ctgggaagag gtgactccac tcacattctc caggctgtat gaaggagagg ctgatataat 1680

gatctctttt gcagttagag aacatggaga cttttaccct tttgatggac ctggaaatgt 1740

tttggcccat gcctatgccc ctgggccagg gattaatgga gatgcccact ttgatgatga 1800

tgaacaatgg acaaaggata caacagggac caatttattt ctcgttgctg ctcatgaaat 1860

tggccactcc ctgggtctct ttcactcagc caacactgaa gctttgatgt acccactcta 1920

tcactcactc acagacctga ctcggttccg cctgtctcaa gatgatataa atggcattca 1980

gtccctctat ggacctcccc ctgactcccc tgagaccccc ctggtaccca cggaacctgt 2040

ccctccagaa cctgggacgc cagccaactg tgatcctgct ttgtcctttg atgctgtcag 2100

cactctgagg ggagaaatcc tgatctttaa agacaggcac ttttggcgca aatccctcag 2160

gaagcttgaa cctgaattgc atttgatctc ttcattttgg ccatctcttc cttcaggcgt 2220

ggatgccgca tatgaagtta ctagcaagga cctcgttttc atttttaaag gaaatcaatt 2280

ctgggctatc agaggaaatg aggtacgagc tggataccca agaggcatcc acaccctagg 2340

tttccctcca accgtgagga aaatcgatgc agccatttct gataaggaaa agaacaaaac 2400

atatttcttt gtagaggaca aatactggag atttgatgag aagagaaatt ccatggagcc 2460

aggctttccc aagcaaatag ctgaagactt tccagggatt gactcaaaga ttgatgctgt 2520

ttttgaagaa tttgggttct tttatttctt tactggatct tcacagttgg agtttgaccc 2580

aaatgcaaag aaagtgacac acactttgaa gagtaacagc tggcttaatt gttgataccc 2640

atacgatgtt ccagattacg ctgacccaca tattgaagag caatagctgg tttaattgtt 2700

aactcgagag atctacgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct 2760

ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt 2820

gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg 2880

gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg cggggtctat tgggaaccaa gctggagtgc 2940

agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc 3000

tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc atgcatgacc aggctcagct aatttttgtt 3060

tttttggtag agacggggtt tcaccatatt ggccaggctg gtctccaact cctaatctca 3120

ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt gctgggatta caggcgtgaa ccactgctcc 3180

cttccctgtc cttctgattt tgtaggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc gc 3232

<210> 5

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AAV2 ITR 1-130 130bp

<400> 5

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct 130

<210> 6

<211> 304

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CMV增强子210-513 304bp

<400> 6

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca 120

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300

catg 304

<210> 7

<211> 203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CMV启动子514-716 203bp

<400> 7

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt gcaccaaaat caacgggact 120

ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 180

gggaggtcta tataagcaga gct 203

<210> 8

<211> 493

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人β-珠蛋白内含子809-1301 493bp

<400> 8

cgaatcccgg ccgggaacgg tgcattggaa cgcggattcc ccgtgccaag agtgacgtaa 60

gtaccgccta tagagtctat aggcccacaa aaaatgcttt cttcttttaa tatacttttt 120

tgtttatctt atttctaata ctttccctaa tctctttctt tcagggcaat aatgatacaa 180

tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg ataatttctg ggttaaggca 240

atagcaatat ttctgcatat aaatatttct gcatataaat tgtaactgat gtaagaggtt 300

tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg cttttatttt atggttggga 360

taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc taatcatgtt catacctctt 420

atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc 480

aaagaattgg gat 493

<210> 9

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人MMP3 1332-2765 1434bp

<400> 9

atgaagagtc ttccaatcct actgttgctg tgcgtggcag tttgctcagc ctatccattg 60

gatggagctg caaggggtga ggacaccagc atgaaccttg ttcagaaata tctagaaaac 120

tactacgacc tcaaaaaaga tgtgaaacag tttgttagga gaaaggacag tggtcctgtt 180

gttaaaaaaa tccgagaaat gcagaagttc cttggattgg aggtgacggg gaagctggac 240

tccgacactc tggaggtgat gcgcaagccc aggtgtggag ttcctgatgt tggtcacttc 300

agaacctttc ctggcatccc gaagtggagg aaaacccacc ttacatacag gattgtgaat 360

tatacaccag atttgccaaa agatgctgtt gattctgctg ttgagaaagc tctgaaagtc 420

tgggaagagg tgactccact cacattctcc aggctgtatg aaggagaggc tgatataatg 480

atctcttttg cagttagaga acatggagac ttttaccctt ttgatggacc tggaaatgtt 540

ttggcccatg cctatgcccc tgggccaggg attaatggag atgcccactt tgatgatgat 600

gaacaatgga caaaggatac aacagggacc aatttatttc tcgttgctgc tcatgaaatt 660

ggccactccc tgggtctctt tcactcagcc aacactgaag ctttgatgta cccactctat 720

cactcactca cagacctgac tcggttccgc ctgtctcaag atgatataaa tggcattcag 780

tccctctatg gacctccccc tgactcccct gagacccccc tggtacccac ggaacctgtc 840

cctccagaac ctgggacgcc agccaactgt gatcctgctt tgtcctttga tgctgtcagc 900

actctgaggg gagaaatcct gatctttaaa gacaggcact tttggcgcaa atccctcagg 960

aagcttgaac ctgaattgca tttgatctct tcattttggc catctcttcc ttcaggcgtg 1020

gatgccgcat atgaagttac tagcaaggac ctcgttttca tttttaaagg aaatcaattc 1080

tgggctatca gaggaaatga ggtacgagct ggatacccaa gaggcatcca caccctaggt 1140

ttccctccaa ccgtgaggaa aatcgatgca gccatttctg ataaggaaaa gaacaaaaca 1200

tatttctttg tagaggacaa atactggaga tttgatgaga agagaaattc catggagcca 1260

ggctttccca agcaaatagc tgaagacttt ccagggattg actcaaagat tgatgctgtt 1320

tttgaagaat ttgggttctt ttatttcttt actggatctt cacagttgga gtttgaccca 1380

aatgcaaaga aagtgacaca cactttgaag agtaacagct ggcttaattg ttga 1434

<210> 10

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人MMP3 1332-2765 1434bp （氨基酸）

<400> 10

Met Lys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Leu Cys Val Ala Val Cys Ser

1 5 10 15

Ala Tyr Pro Leu Asp Gly Ala Ala Arg Gly Glu Asp Thr Ser Met Asn

20 25 30

Leu Val Gln Lys Tyr Leu Glu Asn Tyr Tyr Asp Leu Lys Lys Asp Val

35 40 45

Lys Gln Phe Val Arg Arg Lys Asp Ser Gly Pro Val Val Lys Lys Ile

50 55 60

Arg Glu Met Gln Lys Phe Leu Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp

65 70 75 80

Ser Asp Thr Leu Glu Val Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp

85 90 95

Val Gly His Phe Arg Thr Phe Pro Gly Ile Pro Lys Trp Arg Lys Thr

100 105 110

His Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Lys Asp

115 120 125

Ala Val Asp Ser Ala Val Glu Lys Ala Leu Lys Val Trp Glu Glu Val

130 135 140

Thr Pro Leu Thr Phe Ser Arg Leu Tyr Glu Gly Glu Ala Asp Ile Met

145 150 155 160

Ile Ser Phe Ala Val Arg Glu His Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly

165 170 175

Pro Gly Asn Val Leu Ala His Ala Tyr Ala Pro Gly Pro Gly Ile Asn

180 185 190

Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Gln Trp Thr Lys Asp Thr Thr

195 200 205

Gly Thr Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Ile Gly His Ser Leu

210 215 220

Gly Leu Phe His Ser Ala Asn Thr Glu Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr

225 230 235 240

His Ser Leu Thr Asp Leu Thr Arg Phe Arg Leu Ser Gln Asp Asp Ile

245 250 255

Asn Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Pro Pro Asp Ser Pro Glu Thr

260 265 270

Pro Leu Val Pro Thr Glu Pro Val Pro Pro Glu Pro Gly Thr Pro Ala

275 280 285

Asn Cys Asp Pro Ala Leu Ser Phe Asp Ala Val Ser Thr Leu Arg Gly

290 295 300

Glu Ile Leu Ile Phe Lys Asp Arg His Phe Trp Arg Lys Ser Leu Arg

305 310 315 320

Lys Leu Glu Pro Glu Leu His Leu Ile Ser Ser Phe Trp Pro Ser Leu

325 330 335

Pro Ser Gly Val Asp Ala Ala Tyr Glu Val Thr Ser Lys Asp Leu Val

340 345 350

Phe Ile Phe Lys Gly Asn Gln Phe Trp Ala Ile Arg Gly Asn Glu Val

355 360 365

Arg Ala Gly Tyr Pro Arg Gly Ile His Thr Leu Gly Phe Pro Pro Thr

370 375 380

Val Arg Lys Ile Asp Ala Ala Ile Ser Asp Lys Glu Lys Asn Lys Thr

385 390 395 400

Tyr Phe Phe Val Glu Asp Lys Tyr Trp Arg Phe Asp Glu Lys Arg Asn

405 410 415

Ser Met Glu Pro Gly Phe Pro Lys Gln Ile Ala Glu Asp Phe Pro Gly

420 425 430

Ile Asp Ser Lys Ile Asp Ala Val Phe Glu Glu Phe Gly Phe Phe Tyr

435 440 445

Phe Phe Thr Gly Ser Ser Gln Leu Glu Phe Asp Pro Asn Ala Lys Lys

450 455 460

Val Thr His Thr Leu Lys Ser Asn Ser Trp Leu Asn Cys

465 470 475

<210> 11

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hGH poly（A）信号2847-3323 477bp

<400> 11

gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60

gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 120

ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 180

acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg 240

ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg 300

ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg 360

ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct 420

tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtcctt 477

<210> 12

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AAV2 ITR （反向） 3363-3503 141bp

<400> 12

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

<210> 13

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AAV9衣壳序列

<400> 13

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln

580 585 590

Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 14

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5' ITR

<400> 14

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc 60

ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcct 119

<210> 15

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 5' ITR

<400> 15

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60

tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120

gggttccttg tagttaatga ttaac 145

<210> 16

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3' ITR

<400> 16

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag 130

<210> 17

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3' ITR

<400> 17

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145

<210> 18

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3' ITR

<400> 18

gttaatcatt aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 60

tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 120

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 145

<210> 19

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CMV增强子/启动子

<400> 19

acgcgtggag ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 60

atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 120

ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgtcaat agggactttc 180

cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 240

tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 300

tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 360

atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt 420

gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttgcacc 480

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 540

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 600

cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc 660

tcc 663

<210> 20

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hGH polyA

<400> 20

gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60

gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 120

ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 180

acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg 240

ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg 300

ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg 360

ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct 420

tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg 480

<210> 21

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Kozak

<400> 21

cgccaccatg 10

<210> 22

<211> 453

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 22

Arg Gly Glu Asp Thr Ser Met Asn Leu Val Gln Lys Tyr Leu Glu Asn

1 5 10 15

Tyr Tyr Asp Leu Lys Lys Asp Val Lys Gln Phe Val Arg Arg Lys Asp

20 25 30

Ser Gly Pro Val Val Lys Lys Ile Arg Glu Met Gln Lys Phe Leu Gly

35 40 45

Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Ser Asp Thr Leu Glu Val Met Arg

50 55 60

Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly His Phe Arg Thr Phe Pro

65 70 75 80

Gly Ile Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn

85 90 95

Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Lys Asp Ala Val Asp Ser Ala Val Glu Lys

100 105 110

Ala Leu Lys Val Trp Glu Glu Val Thr Pro Leu Thr Phe Ser Arg Leu

115 120 125

Tyr Glu Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe Ala Val Arg Glu His

130 135 140

Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Gly Asn Val Leu Ala His Ala

145 150 155 160

Tyr Ala Pro Gly Pro Gly Ile Asn Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp

165 170 175

Glu Gln Trp Thr Lys Asp Thr Thr Gly Thr Asn Leu Phe Leu Val Ala

180 185 190

Ala His Glu Ile Gly His Ser Leu Gly Leu Phe His Ser Ala Asn Thr

195 200 205

Glu Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr His Ser Leu Thr Asp Leu Thr Arg

210 215 220

Phe Arg Leu Ser Gln Asp Asp Ile Asn Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Pro Pro Pro Asp Ser Pro Glu Thr Pro Leu Val Pro Thr Glu Pro Val

245 250 255

Pro Pro Glu Pro Gly Thr Pro Ala Asn Cys Asp Pro Ala Leu Ser Phe

260 265 270

Asp Ala Val Ser Thr Leu Arg Gly Glu Ile Leu Ile Phe Lys Asp Arg

275 280 285

His Phe Trp Arg Lys Ser Leu Arg Lys Leu Glu Pro Glu Leu His Leu

290 295 300

Ile Ser Ser Phe Trp Pro Ser Leu Pro Ser Gly Val Asp Ala Ala Tyr

305 310 315 320

Glu Val Thr Ser Lys Asp Leu Val Phe Ile Phe Lys Gly Asn Gln Phe

325 330 335

Trp Ala Ile Arg Gly Asn Glu Val Arg Ala Gly Tyr Pro Arg Gly Ile

340 345 350

His Thr Leu Gly Phe Pro Pro Thr Val Arg Lys Ile Asp Ala Ala Ile

355 360 365

Ser Asp Lys Glu Lys Asn Lys Thr Tyr Phe Phe Val Glu Asp Lys Tyr

370 375 380

Trp Arg Phe Asp Glu Lys Arg Asn Ser Met Glu Pro Gly Phe Pro Lys

385 390 395 400

Gln Ile Ala Glu Asp Phe Pro Gly Ile Asp Ser Lys Ile Asp Ala Val

405 410 415

Phe Glu Glu Phe Gly Phe Phe Tyr Phe Phe Thr Gly Ser Ser Gln Leu

420 425 430

Glu Phe Asp Pro Asn Ala Lys Lys Val Thr His Thr Leu Lys Ser Asn

435 440 445

Ser Trp Leu Asn Cys

450

<210> 23

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 优化的MMP3 CDNA 1

<400> 23

atgaagtcgc tgccgattct cctgctgctg tgcgtggccg tgtgcagcgc ctacccgctg 60

gacggcgccg cccggggaga ggacacctcc atgaacctcg tgcagaagta cctggaaaac 120

tactacgatc tcaaaaagga cgtgaagcag tttgtgcggc ggaaggactc cggtcctgtg 180

gtcaagaaga ttcgggagat gcagaagttc ctgggccttg aagtgaccgg aaagctcgat 240

agcgataccc tcgaagtcat gcggaagccc cgctgcggag tccctgacgt gggacatttc 300

aggacttttc ctggcatccc taagtggaga aagacccacc tcacgtaccg catcgtgaac 360

tatacccccg atctgcctaa ggacgcagtg gactccgccg tggaaaaggc actgaaagtc 420

tgggaagaag tcacaccact gaccttctcc cgcctgtatg aaggggaagc cgacattatg 480

atctcgttcg ctgtgcggga gcacggggat ttctacccat ttgacgggcc cggaaacgtg 540

ctggcgcatg cctacgcgcc cggcccggga atcaacggcg atgcacattt cgacgacgac 600

gagcagtgga ccaaggacac cactggtacc aatctgttcc tggtggccgc ccacgagatt 660

ggtcattcac tgggcctgtt tcactccgcc aacactgaag ctctgatgta cccgctgtac 720

cactcactga ctgacctgac cagattccgc ttgagccaag acgacatcaa cggaatccag 780

tcactgtacg gtcccccgcc cgactcgcct gaaaccccct tggtgcccac cgagcccgtg 840

cccccggagc cgggaactcc ggccaactgc gacccagccc tgtccttcga cgctgtctcg 900

actcttcgcg gagagatcct gattttcaag gatcggcact tctggcgaaa gtcgcttagg 960

aaactcgagc cagagctcca cctgatctcc tccttctggc cgagcttgcc ctccggcgtg 1020

gatgccgctt acgaagtgac ctcgaaagat cttgtgttca tattcaaggg aaaccagttc 1080

tgggcgatca ggggaaacga agtcagagcg ggctacccta gagggatcca cactctgggg 1140

ttccctccaa ccgtgcggaa gattgatgcc gcgattagcg ataaggaaaa gaacaagact 1200

tacttcttcg tggaggacaa gtactggcgc ttcgacgaaa agcgcaactc catggaaccg 1260

ggatttccga agcaaatcgc cgaggatttc ccgggtatcg actccaagat cgacgccgtg 1320

ttcgaagagt tcggcttctt ctacttcttc accggctcct cccaactcga gtttgaccct 1380

aacgccaaga aggtcaccca cacgctcaag tccaactctt ggctgaattg ttga 1434

<210> 24

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 优化的MMP3 CDNA 2

<400> 24

atgaagtccc tcccgatcct cctgcttctg tgcgtggcag tgtgcagcgc ctacccgctg 60

gatggggctg ccaggggcga agatacttcg atgaatctgg tgcagaagta cctggagaac 120

tactatgact tgaagaaaga cgtgaagcag ttcgtgcgga gaaaggactc cgggccagtg 180

gtcaagaaga ttcgcgaaat gcagaagttc ctgggcctcg aagtgaccgg aaaactggac 240

tccgatactc tggaagtcat gcgcaagcct agatgcggcg tgcccgacgt gggccacttc 300

cggacattcc ctggaatccc gaagtggaga aagacccact tgacctaccg gatcgtgaac 360

tacactcccg atctgcctaa ggacgccgtg gactccgccg tggaaaaggc cctcaaagtc 420

tgggaagaag tgaccccgct gacctttagc cgcctgtacg agggcgaagc ggacatcatg 480

atttccttcg ccgtgcggga gcacggggat ttctaccctt tcgacggacc gggaaacgtg 540

ctggcccacg cttacgcgcc cggtcccggc attaacggcg atgctcactt cgacgacgat 600

gagcagtgga ccaaggatac cactggaacc aacctgttcc ttgtggccgc ccatgaaatt 660

gggcactcac tgggactgtt tcattccgcc aacaccgagg ccctgatgta cccgctgtac 720

cactccctca ccgacttgac tagattccgc ctgtcacaag acgacattaa cgggatccag 780

tccctctacg gtcccccgcc ggactcgccg gaaaccccgc ttgtgcctac cgaaccagtg 840

ccgcccgagc ctggcactcc cgccaactgc gaccctgccc tgagcttcga cgcagtcagc 900

accctgcgcg gagagatcct gatctttaag gaccgacact tctggcggaa atcactgcgc 960

aagctcgaac cagagctcca tctcatctcg tccttctggc cctccctgcc gtctggagtg 1020

gacgcagcct acgaggtcac gtccaaggat ctggtgttca tattcaaggg aaaccagttc 1080

tgggcgatca ggggcaacga agtcagagcg ggataccccc ggggcattca cactttggga 1140

tttcctccta ccgtgcggaa gattgacgcc gcgatctcgg acaaggaaaa gaacaagact 1200

tacttcttcg tcgaggacaa gtattggcgg ttcgatgaaa agcgcaactc catggaaccc 1260

ggtttcccaa agcaaattgc tgaggacttc cccggcatcg actcaaagat cgatgccgtg 1320

ttcgaggagt ttgggttctt ctacttcttc accggttcga gccagctcga gttcgatcca 1380

aacgccaaga aagtcactca caccctgaag tccaacagct ggctgaattg ttaa 1434

<210> 25

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 优化的MMP3 CDNA 3

<400> 25

atgaagtcac tgccgatcct gttgctgctg tgcgtggccg tgtgctcggc ttaccccctg 60

gatggcgccg cgcgcggaga ggacacctcc atgaaccttg tgcaaaagta cctcgagaac 120

tactacgacc tgaagaagga tgtgaagcag ttcgtgcgcc gcaaggattc gggacctgtg 180

gtcaaaaaga tccgcgagat gcagaaattc cttggactcg aagtgaccgg aaagctcgac 240

tccgacactc ttgaagtcat gagaaagccg cgctgcggag tcccggacgt gggccatttc 300

cggaccttcc ccggtattcc gaagtggaga aagactcacc tgacataccg catcgtgaac 360

tacactcccg acctcccgaa ggacgcagtg gactcggccg tggaaaaggc cttgaaagtc 420

tgggaggaag tgacccctct gaccttttcg agactgtacg aaggggaagc cgatatcatg 480

atctccttcg ccgtgcggga acacggggac ttttatcctt ttgatggccc tgggaacgtc 540

ctggcgcatg cttacgcccc tggacccggg atcaacggag atgcccactt cgacgatgat 600

gagcagtgga ccaaggacac caccggtact aacctgttcc tggtggccgc ccacgaaatc 660

ggtcattccc tgggactctt ccattccgcg aacactgaag ccctgatgta cccgttgtac 720

cactccctga ccgacctcac tcggttccgg ctgagccagg acgatatcaa cggcattcag 780

agcctctatg gacccccgcc tgattccccc gaaaccccgc tggtgccgac cgagccagtg 840

ccaccagagc cgggaactcc cgcgaactgc gaccccgctc tgagctttga cgctgtgtca 900

accctgaggg gcgaaattct gattttcaag gacagacact tctggcgcaa gagcctccgg 960

aagctcgagc ctgagctgca cctcatttcc tcgttctggc caagccttcc gtccggagtg 1020

gacgccgcat acgaagtcac gtccaaagac ctggtgttca tctttaaggg caatcagttc 1080

tgggcgattc ggggcaacga agtcagggcc ggctaccctc ggggcatcca caccctgggg 1140

tttcccccca ctgtgcggaa gatcgatgca gccatcagcg acaaggaaaa gaacaagacc 1200

tacttcttcg tggaggacaa gtactggcgg ttcgatgaga agcgaaatag catggaaccc 1260

ggcttcccga agcaaattgc cgaggacttc ccgggtatcg actccaagat cgacgccgtg 1320

ttcgaggagt tcggtttctt ctacttcttc accgggtcat ctcagctgga attcgacccc 1380

aacgcgaaga aagtcactca caccctcaag tccaactcct ggctcaactg ttga 1434

<210> 26

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 天然MMP3 CpG耗尽

<400> 26

atgaagagtc ttccaatcct actgttgctg tgtgtggcag tttgctcagc ctatccattg 60

gatggagctg caaggggtga ggacaccagc atgaaccttg ttcagaaata tctagaaaac 120

tactatgacc tcaaaaaaga tgtgaaacag tttgttagga gaaaggacag tggtcctgtt 180

gttaaaaaaa tcagagaaat gcagaagttc cttggattgg aggtgacagg gaagctggac 240

tctgacactc tggaggtgat gagaaagccc aggtgtggag ttcctgatgt tggtcacttc 300

agaacctttc ctggcatccc caagtggagg aaaacccacc ttacatacag gattgtgaat 360

tatacaccag atttgccaaa agatgctgtt gattctgctg ttgagaaagc tctgaaagtc 420

tgggaagagg tgactccact cacattctcc aggctgtatg aaggagaggc tgatataatg 480

atctcttttg cagttagaga acatggagac ttttaccctt ttgatggacc tggaaatgtt 540

ttggcccatg cctatgcccc tgggccaggg attaatggag atgcccactt tgatgatgat 600

gaacaatgga caaaggatac aacagggacc aatttatttc tggttgctgc tcatgaaatt 660

ggccactccc tgggtctctt tcactcagcc aacactgaag ctttgatgta cccactctat 720

cactcactca cagacctgac tagattcaga ctgtctcaag atgatataaa tggcattcag 780

tccctctatg gacctccccc tgactcccct gagacccccc tggtacccac agaacctgtc 840

cctccagaac ctgggacccc agccaactgt gatcctgctt tgtcctttga tgctgtcagc 900

actctgaggg gagaaatcct gatctttaaa gacaggcact tttggagaaa atccctcagg 960

aagcttgaac ctgaattgca tttgatctct tcattttggc catctcttcc ttcaggggtg 1020

gatgctgcat atgaagttac tagcaaggac ctggttttca tttttaaagg aaatcaattc 1080

tgggctatca gaggaaatga ggtaagagct ggatacccaa gaggcatcca caccctaggt 1140

ttccctccaa cagtgaggaa aattgatgca gccatttctg ataaggaaaa gaacaaaaca 1200

tatttctttg tagaggacaa atactggaga tttgatgaga agagaaattc catggagcca 1260

ggctttccca agcaaatagc tgaagacttt ccagggattg actcaaagat tgatgctgtt 1320

tttgaagaat ttgggttctt ttatttcttt actggatctt cacagttgga gtttgaccca 1380

aatgcaaaga aagtgacaca cactttgaag agtaacagct ggcttaattg ttga 1434

<210> 27

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MMP3 Opt 3 CpG耗尽

<400> 27

atgaagtcac tgcctatcct gttgctgctg tgtgtggctg tgtgctctgc ttaccccctg 60

gatggagctg ctagaggtga ggacacctcc atgaaccttg tgcaaaagta cctggagaac 120

tactatgacc tgaagaagga tgtgaagcag tttgtgagaa ggaaggattc tggacctgtg 180

gtcaaaaaga tcagggagat gcagaaattc cttggactgg aagtgacagg aaagctggac 240

tctgacactc ttgaagtcat gagaaagcct agatgtggag tccctgatgt gggccatttc 300

agaaccttcc ctggtattcc taagtggaga aagactcacc tgacatacag gattgtgaac 360

tacactccag acctccctaa ggatgcagtg gacagtgcag tggaaaaggc cttgaaagtc 420

tgggaggaag tgacccctct gacctttagt agactgtatg aaggtgaagc tgatatcatg 480

atctcctttg ctgtgagaga acatggggac ttttatcctt ttgatggccc tgggaatgtc 540

ctggctcatg cttatgcccc tggacctggg atcaatggag atgcccactt tgatgatgat 600

gagcagtgga ccaaggacac cacaggtact aacctgttcc tggtggcagc ccatgagatt 660

ggtcattccc tgggactctt ccattctgct aacactgaag ccctgatgta ccctctgtac 720

cactccctga cagacctcac tagattcagg ctgagccagg atgatatcaa tggcattcag 780

agcctctatg gacccccacc tgattcccca gaaaccccac tggtgcctac agagccagtg 840

ccaccagagc ctggaactcc agctaactgt gaccctgctc tgagctttga tgctgtgtca 900

accctgaggg gagaaattct gattttcaag gacagacact tctggaggaa gagcctcaga 960

aagctggagc ctgagctgca cctcatttcc agtttctggc caagccttcc atctggagtg 1020

gatgctgcat atgaagtcac atccaaagac ctggtgttca tctttaaggg caatcagttc 1080

tgggctatta gaggcaatga agtcagggct ggctacccta gaggcatcca caccctgggg 1140

tttcccccca ctgtgagaaa gattgatgca gccatcagtg acaaggaaaa gaacaagacc 1200

tacttctttg tggaggacaa gtactggaga tttgatgaga agaggaatag catggaacct 1260

ggcttcccta agcaaattgc tgaggacttc ccaggtattg actccaagat tgatgcagtg 1320

tttgaggagt ttggtttctt ctacttcttc acagggtcat ctcagctgga atttgacccc 1380

aatgctaaga aagtcactca caccctcaag tccaactcct ggctcaactg ttga 1434

Claims (90)

1.一种单位剂量，所述单位剂量包含多个重组腺相关病毒血清型9(rAAV9)颗粒，

其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是非复制型的，并且

其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9包含多核苷酸，所述多核苷酸从5′到3′包含：

(a)编码5′反向末端重复序列(ITR)的序列；

(b)编码启动子的序列；

(c)编码人基质金属蛋白酶3(hMMP-3)的序列；

(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；以及

(e)编码3′ITR的序列；并且

其中所述单位剂量包含1×10¹⁰个载体基因组(vg)至5×10¹²vg的rAAV9颗粒，包括端值在内。

2.如权利要求1所述的单位剂量，其中所述单位剂量是(i)无菌的并且(ii)包含药学上可接受的载剂。

3.如权利要求1或权利要求2所述的单位剂量，其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是单链AAV(ssAAV)载体。

4.如权利要求1或权利要求2所述的单位剂量，其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是自我互补AAV(scAAV)载体。

5.如权利要求1-4中任一项所述的单位剂量，其中所述启动子包含CMV启动子，并且其中编码所述CMV启动子的所述序列包含下述序列或由下述序列组成：SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:19的序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的其功能变体。

6.如权利要求1-5中任一项所述的单位剂量，其中编码人MMP-3的所述序列包含下述核苷酸序列或由下述核苷酸序列组成，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:10或SEQ ID NO:22的MMP-3氨基酸序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的其功能变体。

7.如权利要求1-5中任一项所述的单位剂量，其中编码所述MMP-3氨基酸序列的所述核苷酸序列包含野生型核苷酸序列。

8.如权利要求7所述的单位剂量，其中编码MMP-3的所述序列包含以下各项或由以下各项组成：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQID NO:27的核苷酸序列，或与其共有至少80％、90％、95％、97％、99％的序列同一性。

9.如权利要求1-8中任一项所述的单位剂量，其中编码所述5′ITR的所述序列源自AAV血清型2(AAV2)的5′ITR序列。

10.如权利要求1-9中任一项所述的单位剂量，其中编码所述5′ITR的所述序列包含与AAV2的5′ITR的序列相同的序列。

11.如权利要求1-10中任一项所述的单位剂量，其中编码所述5′ITR的所述序列包含以下各项或由以下各项组成：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的核苷酸序列。

12.如权利要求1-11中任一项所述的单位剂量，其中编码所述3′ITR的所述序列源自AAV2的3′ITR序列。

13.如权利要求1-12中任一项所述的单位剂量，其中编码所述3′ITR的所述序列包含与AAV2的3′ITR的序列相同的序列。

14.如权利要求1-13中任一项所述的单位剂量，其中编码所述3′ITR的所述序列包含以下各项或由以下各项组成：SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16-18中任一者的核苷酸序列。

15.如权利要求1-14中任一项所述的单位剂量，其中编码所述polyA信号的所述序列包含人生长激素(hGH)polyA序列。

16.如权利要求15所述的单位剂量，其中编码所述hGH polyA信号的所述序列包含SEQID NO:11的核苷酸序列。

17.如权利要求1-16中任一项所述的单位剂量，其中所述多核苷酸还包含Kozak序列。

18.如权利要求17所述的单位剂量，其中所述Kozak序列包含CGCCACCATG(SEQ ID NO:21)的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成。

19.如权利要求1-18中任一项所述的单位剂量，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列或由所述序列组成。

20.如权利要求1-19中任一项所述的单位剂量，其中所述rAAV9颗粒中的每个颗粒包含分离自或源自AAV血清型9(AAV9)Cap蛋白的病毒Cap蛋白。

21.一种单位剂量，所述单位剂量包含重组基质金属蛋白酶3(MMP-3)蛋白，其中所述单位剂量包含1毫克/毫升(mg/mL)至500mg/mL的重组MMP-3蛋白，包括端值在内；或0.1纳克(ng)至10ng的重组MMP-3蛋白，包括端值在内。

22.如权利要求21所述的单位剂量，其中所述单位剂量包含约0.01ng/mL至约10ng/mL的重组MMP-3蛋白。

23.如权利要求21或权利要求22所述的单位剂量，其中所述重组MMP-3蛋白是人MMP-3蛋白。

24.如权利要求21-23中任一项所述的单位剂量，其中所述重组MMP-3蛋白具有包含下述序列或由下述序列组成的多肽序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:22的序列，或任选地与其具有80％、90％、95％或99％的序列同一性的其功能变体或功能片段。

25.一种转导受试者的角膜内皮的方法，所述方法包括施用有效量的如权利要求1-24中任一项所述的单位剂量，

其中所述受试者是灵长类。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述单位剂量中的所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是单链AAV(ssAAV)。

27.如权利要求25或权利要求26所述的方法，其中以0.01ng/mL至约10ng/mL(包括端值在内)、0.01ng/mL至约500ng/mL(包括端值在内)或0.01ng/mL至约1000ng/mL且包括端值在内的测量浓度，施用有效量的所述单位剂量引起所述受试者的眼房水中的MMP-3表达。

28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述测量浓度大于或等于1ng/mL。

29.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中所述测量浓度小于或等于10ng/mL。

30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中所述测量浓度为1-10ng/mL，包括端值在内。

31.如权利要求28所述的方法，其中所述测量浓度为至少1-3ng/mL，包括端值在内。

32.如权利要求25-31中任一项所述的方法，其中所述MMP-3表达维持至少21天、42天、56天或66天。

33.如权利要求25-31中任一项所述的方法，其中所述MMP-3表达维持至少90天。

34.如权利要求25-31中任一项所述的方法，其中房水中的所述MMP-3表达通过蛋白质印迹或ELISA测量。

35.如权利要求25-34中任一项所述的方法，其中所述方法使房水流畅度增加至少25％或至少30％。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述房水流畅度的增加发生在所述施用步骤约66天内。

37.如权利要求25-36中任一项所述的方法，其中角膜厚度相对于在所述施用步骤之前所述受试者的角膜厚度和/或相对于施用对照单位剂量的受试者的角膜厚度保持不变。

38.如权利要求25-37中任一项所述的方法，其中所述方法不引起炎症反应。

39.如权利要求25-38中任一项所述的方法，其中所述方法未引起在所述受试者的血清中MMP-3的血清水平升高超过MMP-3的基线水平。

40.如权利要求25-39中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括将所述单位剂量经前房内注射到所述受试者的至少一只眼中。

41.一种降低受试者的至少一只眼的眼压(IOP)的方法，所述方法包括施用有效量的如权利要求1-24中任一项所述的单位剂量

其中所述受试者是灵长类。

42.如权利要求41所述的方法，其中以0.01ng/mL至约10ng/mL且包括端值在内的测量浓度，施用有效量的所述单位剂量引起所述受试者的眼房水中的MMP-3表达。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述测量浓度大于或等于1ng/mL。

44.如权利要求42或权利要求43所述的方法，其中所述测量浓度小于或等于10ng/mL。

45.如权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述测量浓度为1-10ng/mL，包括端值在内。

46.如权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述测量浓度为至少1-3ng/mL，包括端值在内。

47.如权利要求42-46中任一项所述的方法，其中所述MMP-3表达维持至少21天、42天、56天或66天。

48.如权利要求42-47中任一项所述的方法，其中所述MMP-3表达维持至少90天。

49.如权利要求42-48中任一项所述的方法，其中所述MMP-3表达通过蛋白质印迹或ELISA测量。

50.如权利要求42-49中任一项所述的方法，其中所述方法使房水流畅度增加至少25％或至少30％。

51.如权利要求42-50中任一项所述的方法，其中所述方法降低眼压(IOP)。

52.如权利要求42-51中任一项所述的方法，其中角膜厚度相对于在所述施用步骤之前所述受试者的角膜厚度和/或相对于施用对照单位剂量的受试者的角膜厚度保持不变。

53.如权利要求42-52中任一项所述的方法，其中所述方法不引起炎症反应。

54.如权利要求42-53中任一项所述的方法，其中所述方法未引起在所述受试者的血清中MMP-3的血清水平升高超过MMP-3的基线水平。

55.如权利要求42-54中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括将所述单位剂量注射到所述受试者的至少一只眼的角膜中。

56.如权利要求42-55中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括将所述单位剂量注射到所述受试者的至少一只眼的颞侧角膜中。

57.如权利要求42-56中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括将所述单位剂量经前房内注射到所述受试者的至少一只眼中。

58.一种治疗和/或预防有需要的受试者的IOP升高和/或青光眼的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-24中任一项所述的单位剂量，

其中所述受试者是灵长类。

59.一种转导受试者的角膜内皮的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的单位剂量，所述单位剂量包含多个重组腺相关病毒血清型9(rAAV9)颗粒，

其中所述受试者是灵长类；

其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是非复制型的；

其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是单链AAV(ssAAV)；

其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9包含多核苷酸，所述多核苷酸从5′到3′包含：

(a)编码5′反向末端重复序列(ITR)的序列；

(b)编码启动子的序列；

(c)编码基质金属蛋白酶3(MMP-3)的序列；

(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；以及

(e)编码3′ITR的序列；并且

其中所述单位剂量包含

(i)1×10¹⁰个载体基因组(vg)至5×10¹²vg的rAAV9颗粒，包括端值在内；或

(ii)约1×10¹¹个载体基因组(vg)/毫升(mL)至1×10¹⁴vg/mL的rAAV9颗粒；并且

其中以0.01ng/mL至约10ng/mL且包括端值在内的测量浓度，施用有效量的所述单位剂量引起所述受试者的眼房水中的MMP-3表达。

60.如权利要求59所述的方法，其中编码MMP-3的所述序列包含以下各项或由以下各项组成：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27的核苷酸序列，或与其共有至少80％、90％、95％、97％、99％的序列同一性。

61.一种转导受试者的角膜内皮的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的单位剂量，所述单位剂量包含多个重组腺相关病毒血清型9(rAAV9)颗粒，

其中所述受试者是灵长类；

其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是非复制型的；

其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9是单链AAV(ssAAV)；

其中所述多个rAAV9颗粒中的每个rAAV9包含多核苷酸，所述多核苷酸从5′到3′包含：

(a)编码5′反向末端重复序列(ITR)的序列；

(b)编码启动子的序列；

(c)编码转基因的序列；

(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；

(e)编码3′ITR的序列。

62.一种基因治疗载体，所述基因治疗载体包含表达盒，所述表达盒包含任选地与启动子可操作地连接的编码人基质金属蛋白酶3(hMMP-3)的转基因或其功能变体，其中所述转基因经优化用于在人宿主细胞中表达。

63.如权利要求62所述的基因治疗载体，其中所述人宿主细胞是人角膜内皮细胞。

64.如权利要求62或权利要求63所述的基因治疗载体，其中所述转基因与选自SEQ IDNO:23-27的序列共有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性。

65.如权利要求64所述的基因治疗载体，其中所述转基因包含选自SEQ ID NO:23-27的序列。

66.如权利要求65所述的基因治疗载体，其中所述转基因与SEQ ID NO:23共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:23是相同的。

67.如权利要求65所述的基因治疗载体，其中所述转基因与SEQ ID NO:24共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:24是相同的。

68.如权利要求65所述的基因治疗载体，其中所述转基因与SEQ ID NO:25共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:25是相同的。

69.如权利要求65所述的基因治疗载体，其中所述转基因与SEQ ID NO:26共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:26是相同的。

70.如权利要求65所述的基因治疗载体，其中所述转基因与SEQ ID NO:27共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:27是相同的。

71.如权利要求63-70中任一项所述的基因治疗载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。

72.如权利要求71所述的基因治疗载体，其中所述AAV载体是AAV9载体。

73.如权利要求71或权利要求72所述的基因治疗载体，其中所述AAV载体是单链AAV(ssAAV)载体。

74.如权利要求71或权利要求72所述的基因治疗载体，其中所述AAV载体是自我互补AAV(ssAAV)载体。

75.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求62至74中任一项所述的基因治疗载体。

76.一种治疗和/或预防有需要的受试者的IOP升高和/或青光眼的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求62-74中任一项所述的基因治疗载体或如权利要求75所述的药物组合物，

其中所述受试者是灵长类。

77.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码人基质金属蛋白酶3(hMMP-3)的转基因或其功能变体，其中所述转基因经优化用于在人宿主细胞中表达。

78.如权利要求77所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与所述转基因可操作地连接的启动子。

79.如权利要求77或权利要求78所述的多核苷酸，其中所述人宿主细胞是人角膜内皮细胞。

80.如权利要求77-79中任一项所述的多核苷酸，其中所述转基因与选自SEQ ID NO:23-27的序列共有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性。

81.如权利要求80所述的多核苷酸，其中所述转基因包含选自SEQ ID NO:23-27的序列。

82.如权利要求81所述的多核苷酸，其中所述转基因与SEQ ID NO:23共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:23是相同的。

83.如权利要求81所述的多核苷酸，其中所述转基因与SEQ ID NO:24共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:24是相同的。

84.如权利要求81所述的多核苷酸，其中所述转基因与SEQ ID NO:25共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:25是相同的。

85.如权利要求81所述的多核苷酸，其中所述转基因与SEQ ID NO:26共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:26是相同的。

86.如权利要求81所述的多核苷酸，其中所述转基因与SEQ ID NO:27共有至少95％同一性或与SEQ ID NO:27是相同的。

87.如权利要求77-86中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含侧接所述转基因的腺相关病毒(AAV)末端重复序列(ITR)。

88.如权利要求77-87中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是分离的多核苷酸。

89.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含如权利要求77-88中任一项所述的多核苷酸。

90.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求77-88中任一项所述的多核苷酸。

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