JP2022552260A - 眼治療のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

マトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）の発現のための組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の単位用量が提供される。さらに、組換えＭＭＰ－３の単位用量が提供される。また、例えば、対象の角膜内皮の形質導入、対象の眼の眼圧の低減、対象の眼圧上昇の治療および／または予防、ならびに対象の緑内障の治療および／または予防における、その使用方法も提供される。対象には霊長類が含まれる。【選択図】図１

Description

本開示は、治療遺伝子の送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用を含む、眼治療に関する。

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年１０月８日に出願された米国仮特許出願第６２／９１２，４２７号の優先権を主張するものであり、その開示は、すべての目的に対しその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の組み込み
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眼圧（ＩＯＰ）は、毛様体突起による房水（ＡＨ）の産生と、線維柱帯網（ＴＭ）およびシュレム管（ＳＣ）を含む従来の流出経路を通した房水の流出に対する流体力学的抵抗との間のバランスの結果として維持される。ＩＯＰ上昇は、ＡＨ流出に対する耐性の増加によって引き起こされる可能性があり、開放隅角緑内障の主要なリスク因子である。マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリクスをリモデリングする能力において従来の房水流出の恒常性維持に寄与し、これは房水流出抵抗およびＩＯＰに直接影響を与える。ヒト緑内障性ＡＨでは、同年齢の正常圧の対照ＡＨと比較して、ＭＭＰ－３活性の低下が観察された。緑内障性ＡＨでの治療は、対照ＡＨと比較した場合、または外因性ＭＭＰ－３で治療を補充した場合、ＳＣ内皮およびＴＭ細胞単層の経内皮抵抗を有意に増加させ、単層の透過性を減少させた。

ＩＯＰ上昇のための遺伝子療法または組換えタンパク質ベースの治療についての改善された組成物および方法に対する満たされていない必要性が、依然として存在する。本開示は、この必要性に対処し、解決するための新規の組成物および方法を提供する。

一態様では、眼治療のための組成物および方法が提供される。一態様では、組成物は、特定の眼疾患を治療するために使用することができる。一部の態様では、組成物は、ＭＭＰ－３の核酸配列およびタンパク質配列を含む。

一部の態様では、本開示は、複数の血清型９の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）粒子を含む単位用量を提供し、ここで、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が非複製であり、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、（ａ）５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）をコードする配列、（ｂ）プロモーターをコードする配列、（ｃ）ヒトマトリクスメタロプロテイナーゼ３（ｈＭＭＰ－３）をコードする配列；（ｄ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列、および（ｅ）３’ＩＴＲをコードする配列、を５’から３’に向かって含むポリヌクレオチドを含み、単位用量が、ｒＡＡＶ９粒子の１×１０^１０ベクターゲノム（ｖｇ）～５×１０^１２ｖｇ（終点を含む）を含む。

一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）無菌であり、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９は、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９は、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターを含み、ＣＭＶプロモーターをコードする配列は、配列番号６、配列番号７、もしくは配列番号１９の配列、または、それに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を任意選択的に有するその機能的変異体を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、ヒトＭＭＰ－３をコードする配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号１０、もしくは配列番号２２のＭＭＰ－３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または、それに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を任意選択的に有するその機能的変異体を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、野生型ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３をコードする配列は、配列番号９、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列を含むかもしくはそれからなる、またはそれに対する少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の配列同一性を共有する。一部の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲ配列から誘導される。一部の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲの配列と同一の配列を含む。一部の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、配列番号５、配列番号１４、または配列番号１５のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲ配列から誘導される。一部の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲの配列と同一の配列を含む。一部の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、配列番号１２、または配列番号１６～１８のうちのいずれか一つのヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｈＧＨポリＡシグナルをコードする配列は、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コザック配列をさらに含む。一部の実施形態では、コザック配列は、ＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ（配列番号２１）のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、（配列番号：ベクター（ＶＥＣＴＯＲ））の配列を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ９粒子は、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）Ｃａｐタンパク質から単離または誘導されたウイルスＣａｐタンパク質を含む。一部の態様では、本開示は、組換えマトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）タンパク質を含む単位用量を提供し、単位用量は、１ミリリットル当たり１ミリグラム（ｍｇ／ｍＬ）～５００ｍｇ／ｍＬ（終点を含む）の組換えＭＭＰ－３タンパク質、または０．１ナノグラム（ｎｇ）～１０ｎｇ（終点を含む）の組換えＭＭＰ－３タンパク質を含む。一部の実施形態では、単位用量は、約１０ｎｇ／ｍＬの組換えＭＭＰ－３タンパク質を含む。一部の実施形態では、組換えＭＭＰ－３タンパク質は、ヒトＭＭＰ－３タンパク質である。一部の実施形態では、組換えＭＭＰ－３タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号１０、もしくは配列番号２２の配列を含むかもしくはそれからなるポリペプチド配列、または、それに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を任意選択的に有するその機能的変異体もしくは機能的断片を有する。

一部の態様では、本開示は、対象の角膜内皮を形質導入する方法であって、本明細書に記載の単位用量の有効量を投与することを含み、対象は霊長類である、方法を提供する。一部の実施形態では、単位用量の有効量を投与することが、０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）、０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）、または０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）の測定濃度の、対象の眼の房水におけるＭＭＰ－３の発現をもたらす。一部の実施形態では、測定濃度は、１ｎｇ／ｍＬ以上である。一部の実施形態では、測定濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ以下である。一部の実施形態では、測定濃度は、１～１０ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）である。一部の実施形態では、測定濃度は、少なくとも１～３ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）である。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３の発現は、少なくとも２１日間、４２日間、５６日間、または６６日間維持される。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３の発現は、少なくとも９０日間維持される。一部の実施形態では、房水中におけるＭＭＰ－３の発現は、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって測定される。一部の実施形態では、本方法は、房水流出能を少なくとも２５％、または少なくとも３０％増加させる。一部の実施形態では、房水流出能の増加は、投与工程の約６６日以内に生じる。一部の実施形態では、角膜厚は、投与工程前の対象における角膜厚と比べて、および／または対照単位用量を投与された対象における角膜厚と比べて変化しないままである。一部の実施形態では、本方法は、炎症反応を引き起こさない。一部の実施形態では、本方法は、対象の血清中のＭＭＰ－３のベースラインレベルを超えて上昇しないＭＭＰ－３の血清レベルをもたらす。一部の実施形態では、投与工程は、対象の少なくとも一方の眼への単位用量の前房内注射を含む。

一部の態様では、本開示は、対象の少なくとも一方の眼の眼圧（ＩＯＰ）を低減する方法であって、本明細書に記載の単位用量の有効量を投与することを含み、対象は霊長類である、方法を提供する。一部の実施形態では、単位用量の有効量を投与することが、０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）の測定濃度の、対象の眼の房水におけるＭＭＰ－３の発現をもたらす。一部の実施形態では、測定濃度は、１ｎｇ／ｍＬ以上である。一部の実施形態では、測定濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ以下である。一部の実施形態では、測定濃度は、１～１０ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）である。一部の実施形態では、測定濃度は、少なくとも１～３ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）である。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３の発現は、少なくとも２１日間、４２日間、５６日間、または６６日間維持される。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３の発現は、少なくとも９０日間維持される。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３の発現は、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって測定される。一部の実施形態では、本方法は、房水流出能を少なくとも２５％、または少なくとも３０％増加させる。一部の実施形態では、本方法は、眼圧（ＩＯＰ）を低減する。一部の実施形態では、角膜厚は、投与工程前の対象における角膜厚と比べて、および／または対照単位用量を投与された対象における角膜厚と比べて変化しないままである。一部の実施形態では、本方法は、炎症反応を引き起こさない。一部の実施形態では、本方法は、対象の血清中のＭＭＰ－３のベースラインレベルを超えて上昇しないＭＭＰ－３の血清レベルをもたらす。一部の実施形態では、投与工程は、対象の少なくとも一方の眼の角膜への単位用量の注射を含む。一部の実施形態では、投与工程は、対象の少なくとも一方の眼の側頭角膜（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｏｒｎｅａ）への単位用量の注射を含む。一部の実施形態では、投与工程は、対象の少なくとも一方の眼への単位用量の前房内注射を含む。

一部の態様では、本開示は、対象におけるＩＯＰ上昇および／または緑内障を治療および／または予防する方法であって、本明細書に記載の単位用量の有効量を投与することを含み、対象は霊長類である、方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、対象の角膜内皮を形質導入する方法であって、複数の血清型９の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）粒子を含む単位用量の有効量を対象に投与することを含み、対象は霊長類であり、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が非複製であり、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）であり、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、（ａ）５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）をコードする配列、（ｂ）プロモーターをコードする配列、（ｃ）マトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）をコードする配列、（ｄ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列、および（ｅ）３’ＩＴＲをコードする配列、を５’から３’に向かって含むポリヌクレオチドを含み、単位用量は、（ｉ）１×１０^１０のベクターゲノム（ｖｇ）～５×１０^１２ｖｇと（終点を含む）のｒＡＡＶ９粒子、または（ｉｉ）１ミリリットル（ｍＬ）当たり約１×１０^１１のベクターゲノム（ｖｇ）～１×１０^１４ｖｇ／ｍＬのｒＡＡＶ９粒子、を含み；単位用量の有効量を投与することが、０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）の測定濃度の、対象の眼の房水におけるＭＭＰ－３の発現をもたらす、方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３をコードする配列は、配列番号９、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列を含むかもしくはそれからなる、またはそれに対する少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の配列同一性を共有する。

一部の態様では、本開示は、対象の角膜内皮を形質導入する方法であって、複数の血清型９の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）粒子を含む単位用量の有効量を対象に投与することを含み、ここで対象は霊長類であり、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が非複製であり、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）であり、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、（ａ）５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）をコードする配列、（ｂ）プロモーターをコードする配列、（ｃ）導入遺伝子をコードする配列；（ｄ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列、（ｅ）３’ＩＴＲをコードする配列、を５’から３’に向かって含むポリヌクレオチドを含む、方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、任意選択的にプロモーターに作動可能に連結された、ヒトマトリクスメタロプロテイナーゼ３（ｈＭＭＰ－３）またはその機能的変異体をコードする導入遺伝子を含む発現カセットを含む遺伝子療法ベクターであって、導入遺伝子が、ヒト宿主細胞における発現のために最適化されている、遺伝子療法ベクターを提供する。一部の実施形態では、ヒト宿主細胞はヒト角膜内皮細胞である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２３～２７から選択される配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、を共有する。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２３～２７から選択される配列を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２３と少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２３と同一である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２４と少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２４と同一である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２５と同一である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２６と少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２６と同一である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２７と少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２７と同一である。一部の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ９ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターである。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを含む医薬組成物を提供する。

一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるＩＯＰ上昇および／または緑内障を治療および／または予防する方法であって、有効量の記載の遺伝子療法ベクター、または記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、対象は霊長類である、方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、ヒトマトリクスメタロプロテイナーゼ３（ｈＭＭＰ－３）またはその機能的変異体をコードする導入遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、導入遺伝子が、ヒト宿主細胞における発現のために最適化されている、ポリヌクレオチドを提供する。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。一部の実施形態では、ヒト宿主細胞はヒト角膜内皮細胞である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２３～２７から選択される配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、を共有する。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２３～２７から選択される配列を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２３と少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２３と同一である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、導入遺伝子に隣接するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端リピート（ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは単離ポリヌクレオチドである。

一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２４と少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２４と同一である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２５と同一である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２６と少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２６と同一である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２７と少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２７と同一である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、導入遺伝子に隣接するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端リピート（ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは単離ポリヌクレオチドである。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む単離細胞を提供する。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。

本発明のさらなる態様および実施形態は、以下の詳細な説明によって提供される。

図１は、ｒｈＭＭＰ３の眼内注入後のサルの房水中の組換えヒトマトリクスメタロプロテイナーゼ３（ｒｈＭＭＰ３）の箱ひげ図を示す。

図２Ａは、１７の霊長類対象（１～１７と標識する）における、処置された眼と対側の眼との間の、房水流出能の相対的差異のプロットを示す。図２Ｂは、霊長類対象の房水（ＡＨ）中の測定されたｒｈＭＭＰ３濃度に対する、処置された眼と対側の眼との間の房水流出能の相対的差異のプロットを示す。

図３Ａは、自己相補的ＡＡＶ血清型９（ｓｃＡＡＶ９－ＥＧＦＰ）の前房内注射で処置された霊長類対象の角膜の蛍光顕微鏡写真を示す。図３Ｂは、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ９－ＥＧＦＰ）の前房内注射で処置された霊長類対象の角膜の蛍光顕微鏡写真を示す。図３Ｃは、前房内一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ９－ＥＧＦＰ）で処置された霊長類対象の角膜の蛍光顕微鏡写真のＺ－スタック再構築を示す。

図４は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＭＭＰ３またはＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｅＧＦＰを前房内に注射された霊長類対象の眼の房水中のＭＭＰ－３の平均濃度のプロットを示す。

図５Ａは、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＭＭＰ３または生理食塩水対照を前房内に注射された霊長類対象の眼における経時的（日）なミリメートル水銀（ｍｍＨｇ）での眼圧（ＩＯＰ）のプロットを示す。図５Ｂは、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＭＭＰ３を前房内に注射された霊長類対象の眼における、その眼で観察された房水中のＭＭＰ－３の発現レベル（ｎｇ／ｍＬ）に対するミリメートル水銀（ｍｍＨｇ）での眼圧の変化（ΔＩＯＰ）のプロットを示す。

図６Ａは、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＭＭＰ３または生理食塩水対照を前房内に注射された霊長類対象の眼における経時的（日）なパキメトリーによって測定された平均角膜厚（μｍ）のプロットを示す。図６Ｂは、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＭＭＰ３または生理食塩水対照を前房内に注射された霊長類対象の眼における経時的（日）なスペキュラーマイクロスコピーによって測定された平均角膜厚（μｍ）のプロットを示す。

図７は、処置された（下段線）対象およびビヒクル対照（上段線）対象において、ＥＬＩＳＡにより判定されたＭＭＰ－３の血清レベルのグラフを示す。

図８Ａは、ＭＭＰ－３またはＧＦＰ対照を誘導的に発現するアデノ随伴ベクターを前房内に注射された、デキサメタゾン処理された［ＤＥＸ（＋）］動物における経時的（週）な眼圧（ＩＯＰ）のチャートを示す。図８Ｂは、ＭＭＰ－３またはＧＦＰ対照を誘導的に発現するアデノ随伴ベクターを前房内に注射された、対照［ＤＥＸ（－）］動物における経時的（週）な眼圧（ＩＯＰ）のチャートを示す。

図９Ａ～９Ｂは、ＤＥＸ処理された （ＤＥＸ （＋）、図９Ａ）、およびシクロデキストリン対照群（ＤＥＸ （－）、図９Ｂ）の両方において、ＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３処置した眼（左）と対側のＡＡＶ－ｉＧＦＰ対照（右）の、ベースライン（注射前）から最終測定（ＤＥＸ ４週目）までのＩＯＰの変化のドット箱ひげ図を示す。ＭＭＰ－３は、高圧モデル（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｍｏｄｅｌ）のみでのＩＯＰを有意に低減する。図９Ｃ～９Ｄは、ＤＥＸ処理された （ＤＥＸ （＋）、図９Ｃ）、およびシクロデキストリン対照群（ＤＥＸ （－）、図９Ｄ）の両方において、ＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３処置した眼（左）と対側のＡＡＶ－ｉＧＦＰ対照（右）の、４週目のＩＯＰの箱ひげ図を示す。

図１０Ａは、房水流出能の、ＤＥＸ処置コホートにおけるＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３処置した眼とＡＡＶ－ｉＧＦＰ処置した眼との間のペア分析を示すチェロプロット（ｃｅｌｌｏ ｐｌｏｔ）を示す。平均能力差のパーセンテージは白線で示され、濃い青色の影は平均値の９５％ ＣＩである。個々のデータポイントは、独自の９５％ ＣＩと共にプロットされる。図１０Ｂは、房水流出能の、シクロデキストリン対照群におけるＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３処置した眼とＡＡＶ－ｉＧＦＰ処置した眼との間のペア分析を示すチェロプロットを示す。平均能力差のパーセンテージは白線で示され、濃い青色の影は平均値の９５％ ＣＩである。個々のデータポイントは、独自の９５％ ＣＩと共にプロットされる。

図１１は、処置された（ＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３）眼およびベクター対照（ＡＡＶ－ｉＧＦＰ）眼における光学的空隙の割合（％）のプロットを示す。

図１２Ａは、ヒトミオシリンＹ４３７ＨのトランスジェニックマウスにおけるＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３（青色）処置した眼およびＡＡＶ－ｉＧＦＰ（赤色）処置した眼のＩＯＰを示す。図１２Ｂは、野生型マウスにおけるＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３（青色）処置した眼およびＡＡＶ－ｉＧＦＰ（赤色）処置した眼のＩＯＰを示す。

図１３Ａ～３Ｂは、トランスジェニックモデル （ＭＹＯＣ（＋）、図１３Ａ）、および対照群（ＭＹＯＣ（－）、図１３Ｂ）の両方において、ＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３処置した眼（左）と対側のＡＡＶ－ｉＧＦＰ対照（右）の、ベースライン（注射前）から最終測定までのＩＯＰの変化のドット箱ひげ図を示す。ＭＭＰ－３は、ＭＹＯＣ（＋）モデルのみでのＩＯＰを有意に低減する。図１３Ｃ～１３Ｄは、トランスジェニックモデル （ＭＹＯＣ（＋）、図１３Ｃ）、および対照群（ＭＹＯＣ（－）、図１３Ｄ）の両方において、ＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３処置した眼（左）と対側のＡＡＶ－ｉＧＦＰ対照（右）の最終ＩＯＰのドット箱ひげ図を示す。

図１４Ａは、房水流出能の、ＭＹＯＣ（＋）動物におけるＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３処置した眼とＡＡＶ－ｉＧＦＰ処置した眼との間のペア分析を示すチェロプロットを示す。図１４Ｂは、房水流出能の、ＭＹＯＣ（－）動物におけるＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３処置した眼とＡＡＶ－ｉＧＦＰ処置した眼との間のペア分析を示すチェロプロットを示す。

図１５は、天然およびコドン最適化されたＭＭＰ－３配列でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞によって産生された組換えＭＭＰ－３の量を示す棒グラフを示す。

図１６は、天然およびコドン最適化されたＭＭＰ－３配列でトランスフェクトされたＨＣＥＣ細胞によって産生された組換えＭＭＰ－３の量を示す棒グラフを示す。

図１７は、天然またはコドン最適化されたＭＭＰ－３配列をコードするＡＡＶ９ウイルスベクターによって形質導入されたＨＣＥＣ細胞で産生された組換えＭＭＰ－３の量を示す棒グラフを示す。

図１８は、天然またはコドン最適化されたＭＭＰ－３配列をコードするＡＡＶ９ウイルスベクターによって形質導入された、ＨＣＥＣ細胞で産生された組換えＭＭＰ－３の正規化された量を示す棒グラフを示す。

図１９は、天然またはコドン最適化されたＭＭＰ－３配列をコードするＡＡＶ９ウイルスベクターによって形質導入された、ＨＣＥＣ細胞で産生された組換えｐｒｏＭＭＰ－３および活性ＭＭＰ－３の量を示す免疫ブロットを示す。

図２０は、天然またはコドン最適化されたＭＭＰ－３配列をコードするＡＡＶ９ウイルスベクターによって形質導入されたＨＣＥＣ細胞の培地におけるＭＭＰ－３プロテアーゼ活性の量を示す棒グラフを示す。

図２１Ａは、ビヒクル、および５ｎｇ／ｍｌのＭＭＰ－３を前房内に注入した１時間後のＭＭＰ－３処置されたヒトの眼の、房水流出能（ｎｌ／分／ｍｍＨｇ）値を示すチェロプロットを示す。図２１Ｂは、ビヒクルと実験用のヒトの眼の対との間の差異の割合を示すチェロプロットを示す。

図２２Ａ～２２Ｃは、一実施形態による、ＭＭＰ－３をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列の配列アライメントを示す。 同上。 同上。

配列リスト
配列番号： 説明
１ 完全長ヒトＭＭＰ－３アミノ酸配列
２ 組換えヒトＭＭＰ－３アミノ酸配列（プロペプチドドメインの欠如）
３ 完全長ベクター（骨格を含まない）
４ 発現カセット（ＩＴＲを含まない）
５ ＡＡＶ２ ＩＴＲ １－１３０ １３０ｂｐ
６ ＣＭＶエンハンサー２１０－５１３ ３０４ｂｐ
７ ＣＭＶプロモーター５１４－７１６ ２０３ｂｐ
８ ヒトベータグロビンイントロン ８０９－１３０１ ４９３ｂｐ
９ ヒトＭＭＰ３ １３３２－２７６５ １４３４ｂｐ（ヌクレオチド）
１０ ヒトＭＭＰ３ １３３２－２７６５ １４３４ｂｐ（アミノ酸）
１１ ｈＧＨポリ（Ａ）シグナル ２８４７－３３２３ ４７７ｂｐ
１２ ＡＡＶ２ ＩＴＲ（逆位） ３３６３－３５０３ １４１ｂｐ
１３ ＡＡＶ９キャプシド配列
１４ ５’ＩＴＲ
１５ ５’ＩＴＲ
１６ ３’ＩＴＲ
１７ ３’ＩＴＲ
１８ ３’ＩＴＲ
１９ ＣＭＶエンハンサー／プロモーター
２０ ｈＧＨポリＡ
２１ コザック
２２ 完全長ヒトＭＭＰ－３アミノ酸配列（シグナル配列なし）
２３ ＭＭＰ３ Ｏｐｔ １
２４ ＭＭＰ３ Ｏｐｔ ２
２５ ＭＭＰ３ Ｏｐｔ ３
２６ 天然ＭＭＰ３ ＣｐＧ枯渇
２７ ＭＭＰ３ Ｏｐｔ３ ＣｐＧ枯渇

詳細な説明
本開示は、概して、霊長類対象（例えば、サル、類人猿およびヒト）における眼病態の治療での、組換えタンパク質および遺伝子療法ベクター、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの治療使用、ならびに、眼への、ＡＡＶベクターを使用することによる、または組換えタンパク質、例えば、組換えヒトＭＭＰ－３（ｒｈＭＭＰ－３）の注射を指向させることによる、プロテイナーゼ、および限定はしないが、マトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）などの、マトリクスメタロプロテイナーゼを含む遺伝子の治療送達に関する。本明細書では、対象の眼の房水流出能を増加しながら、および／または対象の眼の眼圧を低減しながら、対象の角膜内皮を含む眼の前房に構造を効果的に形質導入する、ＡＡＶベクターが開示される。ＡＡＶベクターの単位用量が、対象における眼圧上昇の低減および／または予防に効果的であると判定される濃度でさらに本明細書に開示される。ｒｈＭＭＰ－３の単位用量が、対象における眼圧上昇の低減および／または予防に効果的であると判定される濃度でさらに本明細書に開示される。一部の実施形態では、対象は霊長類である。

野生型マウスへのＣＭＶ駆動型マウスＭＭＰ－３遺伝子（ＡＡＶ－ｍｕＭＭＰ－３）を含有するＡＡＶ－２／９の前房内接種は、角膜内皮の効率的な形質導入と、ｍｕＭＭＰ－３の水性濃度および活性の増加をもたらした。Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２６：１２３０－１２４６（２０１７）。しかしながら、霊長類に対する効果的な投与戦略の決定は、マウスと霊長類との間のＭＭＰ－３配列の差異、マウスと霊長類との間のサイズ差、および角膜内皮の生理学と細胞生物学との差異により妨げられる。霊長類の角膜上皮を形質導入する過去の努力は、導入遺伝子発現が７０日以内に消失し、炎症が起こることを示してきた。Ｂｕｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５１：２３６－４８（２０１０）。過去の努力は、組換えタンパク質（ｒｈＭＭＰ－３）またはｈＭＭＰ－３遺伝子をコードする遺伝子療法ベクターのいずれかとして、ヒトＭＭＰ－３（本明細書ではｈＭＭＰ－３または代替的にｈｕＭＭＰ－３と呼称される）の前房内送達（すなわち、目の前房への送達）を特徴付けなかった。

単位用量
複数の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の単位用量および組換えヒトマトリクスメタロプロテイナーゼ３（ｒｈＭＭＰ－３）タンパク質の単位用量が本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、単回投与で対象に投与される治療用組成物の量を指す。単回投与は、１回の注射、または、例えば、１時間、２時間、１２時間、もしくは２４時間などの所定の時間内の複数回の注射で投与され得る。

単位用量は、治療用組成物（例えば、ＡＡＶ粒子または組み換えタンパク質）の量、濃度、および／または体積によって定義され得る。ＡＡＶについては、ゲノム粒子（ｇｐ）、ＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）、またはベクターゲノム（ｖｇ）の観点から量が表され得る。本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、参照標準に対する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）滴定によって決定される粒子の数を指す。ＤＮＡｓｅを用いてキャプシド形成されていないＤＮＡを除去し、次いで、インキュベーションプロテイナーゼＫによってウイルスタンパク質を分解する。サンプルは希釈され、２Ｘ ＴＡＱＭＡＮ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ウイルス粒子のポリヌクレオチド（例えば、ＭＭＰ－３をコードするポリヌクレオチド）を標的化する２０Ｘ ＴＡＱＭＡＮ遺伝子発現アッセイプローブ、およびＲＮａｓｅフリー水を含むマスターミックスを使用して四重で実施される。サンプルは、既知の濃度の標準曲線および参照標準と比較される。ｑＰＣＲ反応は、事前の１０分間のポリメラーゼ活性化工程で、ＳＴＥＰＯＮＥＰＬＵＳ（アプライドバイオシステムズ（登録商標））機器上で４０サイクルの変性およびアニーリングで実施される。データは機器上で分析される。ウイルスゲノムの一部またはすべてを含有するプラスミドＤＮＡを、参照標準として使用してもよい。例えば、ＥＧＦＰをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子の参照標準として、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰを使用してもよい。ＭＭＰ－３をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子については、ＡＡＶ粒子を生成するために使用されるプラスミドを、ｑＰＣＲによってＡＡＶ粒子の力価を決定するための参照標準として使用してもよい。ｑＰＣＲ用のプライマーは、参照標準およびウイルスゲノムの両方を増幅するように選択される。

ＡＡＶ粒子の濃度を力価として表してもよく、それは、体積で割った量、例えば、１ミリリットル当たりのベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）、ｇｐ／ｍＬ、およびＤＲＰ／ｍＬである。一部の実施形態では、単位用量は、１ミリリットル当たり１×１０^９ベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）～５×１０^１３ｖｇ／ｍＬ（終点を含む）のｒＡＡＶ９粒子の濃度を含む。一部の実施形態では、単位用量は、１×１０^９ｖｇ／ｍＬ～２．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ、２．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ～５×１０^９ｖｇ／ｍＬ、５×１０^９ｖｇ／ｍＬ～７．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ、７．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ～１×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１０ｖｇ／ｍＬ～２．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、２．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ～５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ～７．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、７．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ～１×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１１ｖｇ／ｍＬ～２．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、２．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ～５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ～７．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、７．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ～１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ～２．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、２．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ～５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ～７．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、７．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ～１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ～２．５×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、または２．５×１０^１３ｖｇ／ｍＬ～５×１０^１３ｖｇ／ｍＬの、ｒＡＡＶ９粒子の濃度を含む。

一部の実施形態では、単位用量は、約１×１０^９ｖｇ／ｍＬ、約２．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ、約５×１０^９ｖｇ／ｍＬ、約７．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ、約１×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、約２．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、約５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、約７．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、約１×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、約２．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、約５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、約７．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、約１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約２．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約７．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、約２．５×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、または約５×１０^１３ｖｇ／ｍＬの、ｒＡＡＶ９粒子の濃度を含む。

一部の実施形態では、単位用量は、１×１０^７ベクターゲノム（ｖｇ）～５×１０^１２ｖｇ（終点を含む）のｒＡＡＶ９粒子を含む。一部の実施形態では、単位用量は、１×１０^７ｖｇ～２．５×１０^７ｖｇ、２．５×１０^７ｖｇ～５×１０^７ｖｇ、５×１０^７ｖｇ～７．５×１０^７ｖｇ、７．５×１０^７ｖｇ～１×１０^８ｖｇ、１×１０^８ｖｇ～２．５×１０^８ｖｇ、２．５×１０^８ｖｇ～５×１０^８ｖｇ、５×１０^８ｖｇ～７．５×１０^８ｖｇ、７．５×１０^８ｖｇ～１×１０^９ｖｇ、１×１０^９ｖｇ～２．５×１０^９ｖｇ、２．５×１０^９ｖｇ～５×１０^９ｖｇ、５×１０^９ｖｇ～７．５×１０^９ｖｇ、７．５×１０^９ｖｇ～１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ～２．５×１０^１０ｖｇ、２．５×１０^１０ｖｇ～５×１０^１０ｖｇ、５×１０^１０ｖｇ～７．５×１０^１０ｖｇ、７．５×１０^１０ｖｇ～１×１０^１１ｖｇ、１×１０^１１ｖｇ～２．５×１０^１１ｖｇ、２．５×１０^１１ｖｇ～５×１０^１１ｖｇ、５×１０^１１ｖｇ～７．５×１０^１１ｖｇ、７．５×１０^１１ｖｇ～１×１０^１２ｖｇ、１×１０^１２ｖｇ～２．５×１０^１２ｖｇ、または２．５×１０^１２ｖｇ～５×１０^１２ｖｇ、のｒＡＡＶ９粒子を含む。

一部の実施形態では、単位用量は、約１×１０^７ｖｇ、約２．５×１０^７ｖｇ、約５×１０^７ｖｇ、約７．５×１０^７ｖｇ、約１×１０^８ｖｇ、約２．５×１０^８ｖｇ、約５×１０^８ｖｇ、約７．５×１０^８ｖｇ、約１×１０^９ｖｇ、約２．５×１０^９ｖｇ、約５×１０^９ｖｇ、約７．５×１０^９ｖｇ、約１×１０^１０ｖｇ、約２．５×１０^１０ｖｇ、約５×１０^１０ｖｇ、約７．５×１０^１０ｖｇ、約１×１０^１１ｖｇ、約２．５×１０^１１ｖｇ、約５×１０^１１ｖｇ、約７．５×１０^１１ｖｇ、約１×１０^１２ｖｇ、約２．５×１０^１２ｖｇ、または約５×１０^１２ｖｇ、のｒＡＡＶ９粒子を含む。

一部の実施形態では、単位用量は、１ミリリットル当たり１×１０^９ベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）～５×１０^１３ｖｇ／ｍＬ（終点を含む）のｒＡＡＶ粒子の濃度を含む。一部の実施形態では、単位用量は、１×１０^９ｖｇ／ｍＬ～２．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ、２．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ～５×１０^９ｖｇ／ｍＬ、５×１０^９ｖｇ／ｍＬ～７．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ、７．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ～１×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１０ｖｇ／ｍＬ～２．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、２．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ～５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ～７．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、７．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ～１×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１１ｖｇ／ｍＬ～２．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、２．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ～５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ～７．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、７．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ～１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ～２．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、２．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ～５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ～７．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、７．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ～１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ～２．５×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、または２．５×１０^１３ｖｇ／ｍＬ～５×１０^１３ｖｇ／ｍＬの、ｒＡＡＶ粒子の濃度を含む。

一部の実施形態では、単位用量は、約１×１０^９ｖｇ／ｍＬ、約２．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ、約５×１０^９ｖｇ／ｍＬ、約７．５×１０^９ｖｇ／ｍＬ、約１×１０^１０ｖｇ／ｍ、約２．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、約５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、約７．５×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、約１×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、約２．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、約５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、約７．５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、約１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約２．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約７．５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、約２．５×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、または約５×１０^１３ｖｇ／ｍＬの、ｒＡＡＶ粒子の濃度を含む。

一部の実施形態では、単位用量は、１×１０^７ベクターゲノム（ｖｇ）～５×１０^１２ｖｇ（終点を含む）のｒＡＡＶ粒子を含む。一部の実施形態では、単位用量は、１×１０^７ｖｇ～２．５×１０^７ｖｇ、２．５×１０^７ｖｇ～５×１０^７ｖｇ、５×１０^７ｖｇ～７．５×１０^７ｖｇ、７．５×１０^７ｖｇ～１×１０^８ｖｇ、１×１０^８ｖｇ～２．５×１０^８ｖｇ、２．５×１０^８ｖｇ～５×１０^８ｖｇ、５×１０^８ｖｇ～７．５×１０^８ｖｇ、７．５×１０^８ｖｇ～１×１０^９ｖｇ、１×１０^９ｖｇ～２．５×１０^９ｖｇ、２．５×１０^９ｖｇ～５×１０^９ｖｇ、５×１０^９ｖｇ～７．５×１０^９ｖｇ、７．５×１０^９ｖｇ～１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ～２．５×１０^１０ｖｇ、２．５×１０^１０ｖｇ～５×１０^１０ｖｇ、５×１０^１０ｖｇ～７．５×１０^１０ｖｇ、７．５×１０^１０ｖｇ～１×１０^１１ｖｇ、１×１０^１１ｖｇ～２．５×１０^１１ｖｇ、２．５×１０^１１ｖｇ～５×１０^１１ｖｇ、５×１０^１１ｖｇ～７．５×１０^１１ｖｇ、７．５×１０^１１ｖｇ～１×１０^１２ｖｇ、１×１０^１２ｖｇ～２．５×１０^１２ｖｇ、または２．５×１０^１２ｖｇ～５×１０^１２ｖｇ、のｒＡＡＶ粒子を含む。

一部の実施形態では、単位用量は、約１×１０^７ｖｇ、約２．５×１０^７ｖｇ、約５×１０^７ｖｇ、約７．５×１０^７ｖｇ、約１×１０^８ｖｇ、約２．５×１０^８ｖｇ、約５×１０^８ｖｇ、約７．５×１０^８ｖｇ、約１×１０^９ｖｇ、約２．５×１０^９ｖｇ、約５×１０^９ｖｇ、約７．５×１０^９ｖｇ、約１×１０^１０ｖｇ、約２．５×１０^１０ｖｇ、約５×１０^１０ｖｇ、約７．５×１０^１０ｖｇ、約１×１０^１１ｖｇ、約２．５×１０^１１ｖｇ、約５×１０^１１ｖｇ、約７．５×１０^１１ｖｇ、約１×１０^１２ｖｇ、約２．５×１０^１２ｖｇ、または約５×１０^１２ｖｇ、のｒＡＡＶ粒子を含む。

一部の実施形態では、単位用量は、１０μｌ～２００μｌ、または２０μｌ～１００μｌの体積を含む。一部の実施形態では、単位用量は、約５０μｌ、約６０μｌ、約７０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、または約１００μｌである。

ベクターおよびＡＡＶ
用語「ベクター」は、その最も一般的な意味において本明細書で使用され、任意の核酸の媒介ビヒクルを含み、この媒介ビヒクルは、例えば、当該核酸を原核細胞および／または真核細胞に導入すること、ならびに適切な場合には、ゲノム内に統合することを可能にする。ベクターは、細胞内で複製および／または発現されてもよい。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、およびウイルスゲノムを含む。

ＡＡＶに適用されるように、「ベクター」とは、ウイルスＤＮＡゲノムをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドと、ウイルスＤＮＡゲノムをキャプシドおよび他の補助タンパク質を含む組換えＡＡＶ粒子にパッキングすることによって産生されるウイルス粒子との両方を指す。

本明細書で使用される場合、用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスまたはその組換えベクターの略語である。アデノ随伴ウイルスは、共感染ヘルパーウイルスによって特定の機能が提供される細胞でのみ増殖する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶの一般的な情報およびレビューは、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，１：１６９－２２８（１９８９）、およびＢｅｒｎｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７４３－１７６４（１９９０）に見出され得る。

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ末端リピート配列（ＩＴＲ）に隣接する一つ以上の対象のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含む組換えベクターを指す。かかるＡＡＶベクターは、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子産物をコードする、および発現するベクターでトランスフェクトされている宿主細胞中に存在するとき、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも一つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびカプセル封入ポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。本明細書で使用される場合、粒子が、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、通常、これは、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ＡＡＶベクター粒子の産生は、ＡＡＶベクター粒子内に含有されるベクターゲノムを有するＡＡＶベクターの産生を必然的に含む。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは約４．７ｋｂの長さであり、二つの１４５ヌクレオチド逆位末端リピート（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の既知の変異体があり、抗原エピトープによって分類されると血清型と呼ばれることもある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が既知である。例えばＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００２０７７に提供され、ＡＡＶ－２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１４０１、およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）に提供され、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿１８２９に提供され、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１８２９に提供され、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０８５７１６に提供され、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００ １８６２に提供され、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供され、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供され、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供され、およびＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供される。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４３４，９２８号に提供されている。ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５およびそれらの誘導体を含む祖先ＡＡＶの配列は、ＷＯ２０１５０５４６５３Ａ２、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｃｈｉｅｖｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｙｅ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．１２（８）：ｅ０１８２４７３（２０１７）に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製、キャプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組込みを指示するｃｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。三つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的マップ位置についてｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名）は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする二つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。二つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ９）は、（ヌクレオチド２１０７および２２２７で）単一ＡＡＶイントロンの差次的スプライシングと組み合わさり、ｒｅｐ遺伝子から四つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製の原因となる複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現し、三つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、三つの関連するキャプシドタンパク質の産生の原因となる。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９ （１９９２）で概説されている。

ＡＡＶは、例えば遺伝子療法において、外来性ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な、独自の特徴を有している。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染はサイレントであり無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染し、多くの異なる組織をインビボで標的化する可能性を許容する。さらに、ＡＡＶは分裂細胞と非分裂細胞とをゆっくりと形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）として、これらの細胞の寿命の間、本質的に持続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド内にクローン化ＤＮＡとして挿入され、これにより組換えゲノムの構築が実行可能となる。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムのキャプシド形成を指示するシグナルは、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製および構造キャプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部またはすべては、外来性ＤＮＡで置換されてもよい。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質をトランスで提供してもよい。ＡＡＶの別の重要な特徴は、ＡＡＶが極めて安定し、強力なウイルスであることである。アデノウイルスを不活化するのに使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶはさらに、凍結乾燥されてもよい。最後に、ＡＡＶ感染細胞は重複感染に耐性でない。

一部の事例では、本開示のＡＡＶベクターおよび粒子は、ポリヌクレオチド配列を霊長類の角膜内皮に送達するために使用される。本開示のＡＡＶベクターおよび粒子を使用して送達され得るポリヌクレオチド配列には、タンパク質コード遺伝子およびＲＮＡコード遺伝子が含まれる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターのポリヌクレオチドは、遺伝子編集系の一つ以上の（またはすべての）構成要素をコードする。本開示はさらに、マルチベクター系を提供する。一部の実施形態では、ベクター系は、約４．５ｋＢより大きい遺伝子が、細胞内相同組換えにより結合されて単一のコードポリヌクレオチドを形成する二つのベクターに提供される、分割ベクター系である。本開示は、マトリクスメタロプロテイナーゼの送達のためのみの発明に限定されるものとして読み取られるべきではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。

ＡＡＶ９
本明細書で使用される場合、血清型９の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）粒子は、野生型ＡＡＶ９のキャプシドタンパク質に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を共有し、ＡＡＶ９の一つ以上の機能的特性を保持するキャプシドタンパク質を有する遺伝子操作ＡＡＶ粒子を指す。例示的なＡＡＶ９キャプシド配列は、ＵＳ７，９０６，１１１およびＵＳ９，７３７，６１８に提供されている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ９粒子は、配列番号１３のアミノ酸１～７３６、１３８～７３６、または２０３～７３６に対する少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む。

一部の事例では、ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＬＫ０３、Ａｎｃ８０Ｌ６５のベクターである。Ａｎｃ８０Ｌ６５は、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＡＡＶ ２／６，２／８ ａｎｄ ２／９ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｎｅａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（８）：ｅ０１８２４７３ （２０１７）に記載されている。ＬＫ０３は、Ｌｉｓｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ＡＡＶ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｌｉｖｅｒ ｍｏｄｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１４ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０； ５０６（７４８８）：３８２－３８６に記載されている。

シュードタイプ化したｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ２００１／０８３６９２に開示されている。キャプシド変異を有するｒＡＡＶなどの他の種類のｒＡＡＶ変異体もまた、企図されている。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２２（１１）：１９００－１９０９ （２０１４）を参照されたい。一部の事例では、ｒＡＡＶベクターは血清型ＡＡＶ９のベクターである。一部の実施形態では、当該ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ９のベクターであり、一本鎖ゲノムを含む。かかるＡＡＶは、「一本鎖ＡＡＶ」または「ｓｓＡＡＶ」と称される。一部の実施形態では、当該ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ９のベクターであり、自己相補的ゲノムを含む。かかるＡＡＶは、「自己相補的ＡＡＶ」または「ｓｃＡＡＶ」と称される。本発明者らは、一部の事例では、ｓｓＡＡＶが、ｓｃＡＡＶより高い効率で、霊長類の角膜内皮を形質導入することを、予期せず判定した。

一部の実施形態では、各ｒＡＡＶ９粒子は、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）Ｃａｐタンパク質から単離または誘導されたウイルスＣａｐタンパク質を含む。

ポリヌクレオチド
本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも一つのポリヌクレオチドまたは正確に一つのポリヌクレオチドを含む。本開示のポリヌクレオチドは、（ａ）５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）をコードする配列、（ｂ）プロモーターをコードする配列、（ｃ）導入遺伝子をコードする配列、（ｄ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列、（ｅ）３’ＩＴＲをコードする配列、を５’から３’に向かって含む。

逆位末端リピート
本明細書で使用される場合、「逆末端リピート配列」または「ＩＴＲ」は、ＡＡＶゲノムの末端における類似の自己アニーリングセグメントを指す。プラスミドの観点では、ＩＴＲは、転写されてＡＡＶゲノムを形成するＤＮＡセグメントに隣接する。本開示のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ、またはＡＡＶベクターのＩＴＲとして機能する合成配列を含む、任意のＡＡＶ ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２のＩＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ２ゲノムを含み、その結果、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ－２／９ベクター、ＡＡＶ－２／６ベクター、またはＡＡＶ－２／８ベクターである。ゲノムと血清型との他の組み合わせは、本開示によって企図され、これには、限定されるものではないが、Ｓｈａｒｍ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＡＡＶ ２／６，２／８ ａｎｄ ２／９ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｎｅａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ．８１：２７３－７８ （２０１０）に記載されたものが含まれる。

一部の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲ配列から誘導される。一部の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲの配列と同一の配列を含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＩＴＲとして機能する異種または合成ＩＴＲである。一部の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、配列番号５、配列番号１４、または配列番号１５のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。

一部の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲ配列から誘導される。一部の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲの配列と同一の配列を含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＩＴＲとして機能する異種または合成ＩＴＲである。一部の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、配列番号１２、または配列番号１６～１８のうちのいずれか一つのヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。

プロモーター
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子のポリヌクレオチドは、プロモーター、すなわち、少なくとも一つのプロモーターを含んでもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは二つのプロモーターを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは一つのプロモーターを含む。一部の実施形態では、各プロモーターは独立して、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３プロモーター、およびＭＮＤプロモーターからなる群から選択される。ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー、ならびにニワトリベータアクチンプロモーターおよびウサギベータグロビン遺伝子の部分からなるプロモーター配列である。ＳＶ４０／ＣＤ４３プロモーターは、ＳＶ４０プロモーターおよびＣＤ４３プロモーターの部分を含むプロモーター配列である。ＭＮＤプロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する改変ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーターである。他のプロモーター配列は、本開示のＡＡＶ粒子と適合性がある。一部の実施形態では、プロモーターはユビキタスプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、内皮細胞（ＥＣ）特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターである。

一部の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列は、薬剤の添加もしくは蓄積に応答して、または薬剤の除去、分解、もしくは希釈に応答して、ポリヌクレオチド配列を転写的に発現させるか、または転写的に発現させないように構成されてもよい。薬剤は薬物（ｄｒｕｇ）であってもよい。薬剤は、テトラサイクリンまたはその誘導体の一つであってもよく、これには限定されないが、ドキシサイクリンが含まれる。一部の事例では、誘導性プロモーターは、ｔｅｔ－ｏｎプロモーター、ｔｅｔ－ｏｆｆプロモーター、化学的に調節されたプロモーター、物理的に調節されたプロモーター（すなわち、光の存在または不在、若しくは低温または高温に応答するプロモーター）である。この誘導性プロモーターのリストは非限定的である。

一部の実施形態では、プロモーターはＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含む。一部の実施形態では、ＣＭＶプロモーターをコードする配列は、配列番号１９の配列またはそれに対する８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を任意選択的に有するその機能的変異体を含むかまたはそれからなる。

一部の実施形態では、プロモーターはＣＭＶエンハンサーを含む。一部の実施形態では、ＣＭＶプロモーターはＣＭＶエンハンサーを含む。一部の実施形態では、ＣＭＶエンハンサーをコードする配列は、配列番号６の配列またはそれに対する８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を任意選択的に有するその機能的変異体を含むかまたはそれからなる。

一部の実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターを含む。一部の実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、配列番号７の配列またはそれに対する８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を任意選択的に有するその機能的変異体を含むかまたはそれからなる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはプロモーターを欠く。一部の実施形態では、ウイルスゲノムからのＲＮＡの発現は、５’ＩＴＲによって駆動されてもよい。一部の実施形態では、ウイルスゲノムからのタンパク質の発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって駆動されてもよい。

導入遺伝子
本明細書で使用される場合、用語「導入遺伝子」は、プロモーターに作動可能に連結された任意の遺伝要素を指す。導入遺伝子には、タンパク質コード配列、ＲＮＡコード配列（例えば、マイクロＲＮＡ、ｇＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）、および遺伝子編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系など）が含まれる。一部の実施形態では、導入遺伝子は、表１に列挙されたプロテイナーゼのいずれかをコードする配列を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、表１に列挙されたプロテイナーゼのいずれかをコードする配列、もしくはその機能的変異体、またはそれに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する機能的変異体を含むかまたはそれからなる。
（表１）

一部の実施形態では、導入遺伝子は、マトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）をコードする配列を含む。

一部の実施形態では、本開示は、複数の血清型９の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）粒子を含む単位用量を提供し、ここで、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が非複製であり、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、（ａ）５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）をコードする配列、（ｂ）プロモーターをコードする配列、（ｃ）マトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）をコードする配列；（ｄ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列、および（ｅ）３’ＩＴＲをコードする配列、を５’から３’に向かって含むポリヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、ＭＭＰ－３をコードする配列は、配列番号１もしくは配列番号２２のＭＭＰ－３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または、それに対する８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を任意選択的に有するその機能的変異体もしくは機能的断片を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、野生型ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３をコードする配列は、配列番号９のヌクレオチド配列またはそれに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。

一部の実施形態では、ＭＭＰ－３をコードする配列はコドン最適化されている。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３をコードする配列は、配列番号２３のヌクレオチド配列またはそれに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３をコードする配列は、配列番号２４のヌクレオチド配列またはそれに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３をコードする配列は、配列番号２５のヌクレオチド配列またはそれに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。

一部の実施形態では、ＭＭＰ－３をコードする配列は、ＣｐＧ枯渇している。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３をコードする配列は、配列番号２６のヌクレオチド配列またはそれに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３をコードする配列は、配列番号２７のヌクレオチド配列またはそれに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。

その他のベクター要素
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列を含む。一部の実施形態では、ポリＡシグナルは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｈＧＨポリＡ配列は、配列番号１１もしくは配列番号２０、またはそれに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ポリＡシグナルは、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナルまたはウサギβ－グロビンポリＡシグナルを含む。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、イントロン、例えば、配列番号８またはそれに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列などのヒトβ－グロビンイントロンを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コザック配列、例えば配列番号２１を含む。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３もしくは配列番号４の配列、またはそれに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。

医薬組成物
一部の実施形態では、単位用量は無菌である。一部の実施形態では、薬学的に許容可能な担体を含む。適切な担体としては、限定されないが、生理食塩水、１００～２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む生理食塩水、１５０塩化ナトリウムを含む生理食塩水、ポリオールを含有する生理食塩水（５％スクロースなど）、およびこれに類するものが挙げられる。一部の実施形態では、担体はポロクサマー１８８またはプルロニックＦ－６８を含むがこれに限定されないポロクサマーを含む。ポロクサマーの適切な濃度は、０．０００１％～０．０１％、またはおよそ０．００１％を含む。

注射の目的のために、無菌水溶液など、様々な溶液を用いることができる。かかる水溶液は、所望により緩衝されてもよく、液体希釈剤は、生理食塩水またはグルコースで最初に等張にされる。遊離酸としてのｒＡＡＶの溶液（ＤＮＡは酸性リン酸基を含有する）または薬理学的に許容可能な塩は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水中で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物、ならびに油中で調製されてもよい。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有する。この関連で、用いられる無菌水性媒体はすべて、当業者に既知の標準技術によって容易に取得可能である。

注射可能な使用に適した医薬品形態には、無菌水溶液または分散液、および無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。すべての場合において、形態は、滅菌されなければならず、容易な注射針通過能力（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動的でなければならない。製造および保管の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。

無菌注射溶液は、上記で列挙された様々な他の成分とともに、適切な溶媒中に必要な量のｒＡＡＶを組み込み、必要に応じて、その後に濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、滅菌された活性成分を、塩基性分散媒体および上記で列挙されたものから必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末と任意の追加の所望の成分とを、以前に滅菌濾過されたそれの溶液からもたらす、真空乾燥および凍結乾燥技術である。

組換えタンパク質
別の態様では、本開示は、組換えマトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）タンパク質を含む単位用量を提供する。一部の実施形態では、単位用量は、０．１ナノグラム（ｎｇ）～１０ｎｇ、または０．５ｎｇ～５ｎｇ、１ｎｇ～２ｎｇ、３ｎｇ～４ｎｇ、５ｎｇ～６ｎｇ、７ｎｇ～８ｎｇ、または９ｎｇ～１０ｎｇ（終点を含む）を含む。一部の実施形態では、単位用量は、０．１ｎｇ以上、１ｎｇ以上、または１０ｎｇ以上である。別の態様では、単位用量は、１０～２００μｌの体積、または２０～１００μｌの体積で提供される。

一部の実施形態では、医薬用量は、１ミリリットル当たり１ミリグラム（ｍｇ／ｍｌ）～５００ｍｇ／ｍＬ、例えば５ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍｌ、または２０ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍｌの組換えＭＭＰ－３タンパク質の濃度を含む。

一部の実施形態では、単位用量は、１ミリリットル当たり１ミリグラム（ｍｇ／ｍＬ）～１００ｍｇ／ｍＬ（終点を含む）の組換えＭＭＰ－３タンパク質を含む。一部の実施形態では、単位用量は、１ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ～３５ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ～４０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ～４５ｍｇ／ｍＬ、または４５ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬを含む。一部の実施形態では、単位用量は、５０ｍｇ／ｍＬ～５５ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ～７０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ～７５ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ～８５ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ～９５ｍｇ／ｍＬ、または９５ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬを含む。

一部の実施形態では、単位用量は、約１ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、または約４５ｍｇ／ｍＬを含む。一部の実施形態では、単位用量は、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬを含む。一部の実施形態では、単位用量は、約１０ｍｇ／ｍＬの組換えＭＭＰ－３タンパク質を含む。

一部の実施形態では、組換えＭＭＰ－３タンパク質は、ヒトＭＭＰ－３タンパク質である。一部の実施形態では、組換えＭＭＰ－３タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号１０、もしくは配列番号２２の配列を含むかもしくはそれからなるポリペプチド配列、または、それに対する８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を任意選択的に有するその機能的変異体もしくは機能的断片を有する。

方法
別の態様では、本開示は、対象の角膜内皮を形質導入する方法を提供する。方法は、本明細書に記載の単位用量の有効量を投与することを含む。一部の実施形態では、対象は霊長類（例えば、サル、類人猿、またはヒト）である。対象は、オスまたはメスであってもよい。対象は、若年または成体であってもよい。一部の実施形態では、対象は、ＩＯＰ上昇に罹患するか、またはそのリスクがある。一部の実施形態では、対象は、原発先天緑内障、若年性原発性開放隅角緑内障、ＭＹＯＣ緑内障などの先天性障害のために、ＩＯＰ上昇に罹患するか、またはそのリスクがある。一部の実施形態では、対象は、高齢のためにＩＯＰ上昇に罹患するか、またはそのリスクがある。一部の実施形態では、対象は、緑内障にまだ進行していないＩＯＰ上昇を有する。一部の事例では、対象はＩＯＰ上昇および緑内障を有する。一部の事例では、対象はＩＯＰ上昇を伴わない緑内障を有する。

組成物の有効用量の投与は、限定されるものではないが、前房内接種、硝子体内接種、網膜下接種、脈絡膜上腔接種、カナロプラスティ、または強膜上静脈を介する送達を含む、当技術分野で標準である経路による場合がある。一実施形態では、有効用量は、前房内に送達される。

本明細書で使用される場合、用語「必要とする患者」または「必要とする対象」は、マトリクスメタロプロテイナーゼをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ、または本明細書に提供されるこのようなｒＡＡＶを含む組成物を用いた治療または改善に適している疾患、障害、または状態の、リスクがある、またはそれに罹患している患者または対象を指す。必要とする患者または対象は、例えば、高眼圧症および／または緑内障などのマトリクスメタロプロテイナーゼの機能不全に関連する疾患と診断された患者または対象であってもよい。対象は、マトリクスメタロプロテイナーゼ遺伝子またはタンパク質に突然変異または機能不全を有し得る。本明細書では、「対象」と「患者」とが互換的に使用される。

本明細書に記載される方法によって治療される対象は、哺乳動物であってもよい。一部の事例では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、またはラットである。対象は、ヒトのメスまたはヒトのオスであってもよい。対象は、若年発症型緑内障、早期発症型成人緑内障、または加齢性緑内障を含む年齢の範囲であり得る。したがって、本開示は、若年発症型緑内障を患う対象、早期発症型成人緑内障を患う対象、または加齢性緑内障を患う対象に、ｒＡＡＶベクター開示のいずれかを投与することを企図する。

併用療法もまた、本発明によって企図される。本明細書で使用される場合、併用とは、同時治療または連続治療を含む。本発明の方法の、標準的な医学的治療（例えば、コルチコステロイドまたは局所的減圧薬）との併用が、新規の療法との併用と同様に、具体的に企図される。一部の事例では、対象は、本明細書に記載されるｒＡＡＶの投与に対する免疫反応を防止または低減するためにステロイドで治療され得る。特定の事例では、対象は、本明細書に記載のｒＡＡＶの投与の前、最中、または後に、プロスタグランジン類似体、ベータブロッカー、および／またはＲＯＣＫ阻害剤などの、局所的減圧薬を受けてもよい。特定の事例では、対象は、眼の瞳孔を拡張させることができる薬剤（例えば、トロピカミドおよび／またはフェニレフリン）を投与されてもよい。特定の事例では、対象は、角膜脱水を防ぐために、回復中に保湿ゲルを受けてもよい。一部の実施形態では、プロスタグランジン類似体は、ラタナプロストまたはビマトプロストである。一部の実施形態では、ベータブロッカーはチモロールである。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はＲｈｏｐｒｅｓｓａである。

一部の実施形態では、角膜内皮の形質導入は、角膜内皮細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％の形質導入をもたらす。言い換えれば、形質導入効率は、場合により、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、またはそれ以上であり得る。本明細書で使用される場合、「形質導入効率」は、ポリヌクレオチドを細胞（例えば、角膜内皮細胞）内に送達するベクター（例えば、ＡＡＶベクターまたはＡＡＶ粒子）の能力を指す。形質導入効率は、蛍光マーカー（例えば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰ）をコードするＡＡＶ粒子を使用するなど、インビボで判定され得る。形質導入効率は、同組織の免疫組織化学分析によっても判定され得る。例えば、治療された対象からの角膜サンプルの切片は、抗ＭＭＰ３抗体を使用して染色されてもよい。形質導入効率は、概して、標的ポリヌクレオチドを受ける標的細胞の分数またはパーセンテージとして記載される。角膜内皮の場合、標的細胞は形態学的に識別され得る。角膜内皮細胞の形態学的識別は、顕微鏡を使用して行われてもよい。

形質導入効率は、限定されるものではないが、カラーおよび蛍光前眼部撮影、光干渉断層撮影、および免疫組織化学検査を含む、当技術分野で既知の様々な方法を使用して、インビボで評価され得る。カラーおよび蛍光前眼部撮影は、例えば、キヤノン６Ｄデジタル撮像ハードウェアおよびＦＵＮＤＵＳ ＰＨＯＴＯ ＮＥＷ ＶＩＳＩＯＮ眼科撮像ソフトウェアを備えたＴｏｐｃｏｎ ＴＲＣ５０ＥＸ網膜カメラを使用して実施され得る。カラー写真の例示的な設定には、１／２５秒のシャッター速度（Ｔｖ）、４００のＩＳＯ、およびフラッシュ１８が含まれる。エキサイタおよびバリアフィルタが係合された単色およびカラー蛍光画像の例示的設定は、４８０ｎｍエキサイタ、５２５ｎｍバリアフィルタ、フラッシュ設定２００、Ｔｖ １／５秒、ＩＳＯ ３２００およびＦｌａｓｈ３００である。

前眼部ＯＣＴは、アイトラッキングおよびＨＥＹＥＸ画像取り込み解析ソフトウェアを備えた Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＯＣＴ ＨＲＡまたはＯＣＴ Ｐｌｕｓを使用して実施され得る。ＳＰＥＣＴＲＡＬＩＳの自己蛍光機能を使用して、前房におけるＧＦＰ発現の画像を取得してもよい。

免疫組織化学検査は、様々な既知の方法を使用して実施されてもよい。トランスフェクション効率は、共焦点顕微鏡下でマーカータンパク質（例えば、ＧＦＰ）または治療用タンパク質（例えば、ＭＭＰ－３）に対して陽性である細胞を計数することによって判定され得る。

形質導入効率はまた、ＭＭＰ－３などの分泌タンパク質の濃度を測定することによってインビボで評価されてもよい。まず、房水および／または硝子体液などの眼液は、対象から回収され、評価まで凍結などの適切な条件下で保存される。次に、眼液は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウェスタンブロットを使用して、存在する分泌タンパク質の量を測定するためにアッセイされる。存在する分泌タンパク質の量は、ＥＬＩＳＡアッセイで得られたシグナルを、既知のタンパク質標準のシグナルを測定する標準曲線と比較することによって定量化される。

一部の実施形態では、本開示の方法は、ｒＡＡＶ９粒子を含む単位用量を投与することを含み、単位用量中の複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９は、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である。

一部の実施形態では、１０μｌ～２００μｌの体積が、眼の前房内に注入される。一部の実施形態では、これは、２０μｌ～１００μｌの体積である。より具体的には、注入する体積は、約５０μｌ、約６０μｌ、約７０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、または約１００μｌとすることができる。一部の実施形態では、注射針を使用して注入する前に、ある体積の房水を最初に対象の眼から除去する。水性の除去は、水性タップ（ａｑｕｅｏｕｓ ｔａｐ）または穿刺と呼ばれることがある。

一部の実施形態では、本開示は、対象の角膜内皮を形質導入する方法であって、複数の血清型９の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）粒子を含む単位用量の有効量を投与することを含み、ここで対象は霊長類であり、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が非複製であり、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）であり、複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、（ａ）５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）をコードする配列、（ｂ）プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）をコードする配列、（ｃ）マトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）をコードする配列；（ｄ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列、（ｅ）３’ＩＴＲをコードする配列、を５’から３’に向かって含むポリヌクレオチドを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）１×１０^７ベクターゲノム（ｖｇ）～５×１０^１２ｖｇ（終点を含む）のｒＡＡＶ９粒子、または（ｉｉ）１ミリリットル（ｍＬ）当たり約１×１０^９ベクターゲノム（ｖｇ）～５×１０^１３ｖｇ／ｍＬのｒＡＡＶ９粒子、を含む。

あるいは、または形質導入のアッセイの他の方法に加えて、角膜内皮の形質導入は、発現される外因性タンパク質の濃度を測定することによって評価されてもよい。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）の測定濃度の、対象の眼の房水（ＡＨ）におけるＭＭＰ－３の発現を生じる。

一部の実施形態では、ＡＨ中のＭＭＰ－３の濃度は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約４ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ～約６ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ～約８ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬであるか、またはそれを超える。

一部の実施形態では、ＡＨ中のＭＭＰ－３の濃度は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬ以上である。一部の実施形態では、ＡＨ中のＭＭＰ－３の濃度は、１ｎｇ／ｍＬよりも大きい。一部の実施形態では、濃度は、１ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬの範囲内である。

ＡＨ中のＭＭＰ－３（または別の外因性タンパク質）の濃度を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはウェスタンブロットによって測定してもよい。ＡＨ中の濃度を測定するのに有用なＭＭＰ－３に対する抗体には、ＰＲＯＴＥＩＮＴＥＣＨ（１７８７３－１－ＡＰ）、ＡＢＣＡＭ（ａｂ５３０１５）、およびＲ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ（ＤＭＰ３００）から入手可能なものが含まれる。

一部の実施形態では、ＡＨ中のＭＭＰ－３の測定濃度は、１ｎｇ／ｍＬ以上である。一部の実施形態では、ＡＨ中のＭＭＰ－３の測定濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ以下である。一部の実施形態では、ＡＨ中のＭＭＰ－３の測定濃度は、１～１０ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）である。一部の実施形態では、ＡＨ中のＭＭＰ－３の測定濃度は、少なくとも１～３ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）である。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３の濃度は、放射標識されたＭＭＰ－３を使用して測定される。

一部の実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子および方法は、ＭＭＰ－３（または別の導入遺伝子）の持続される発現または長期の発現をもたらした。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３の発現は、少なくとも２１日間、４２日間、５６日間、または６６日間維持される。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３の発現の発現は、少なくとも９０日間維持される。一部の実施形態では、導入遺伝子および／または外因性タンパク質の発現は、少なくとも２１日間、４２日間、５６日間、または６６日間維持される。一部の実施形態では、導入遺伝子および／または外因性タンパク質の発現は、少なくとも９０日間維持される。

本開示はさらに、インビトロアッセイ系における遺伝子療法ベクターの有効性と安全性の評価に関する。本開示は、マトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。このｒＡＡＶベクターまたは他の治療用タンパク質に導入遺伝子を送達するベクターを使用して、眼にｒＡＡＶを投与することによって、緑内障などの視覚状態を治療することができる。一部の事例では、治療は眼圧を低下させることを目指し、より低い眼圧を達成する一手段は、ＭＭＰ－３などの治療用タンパク質によって細胞外マトリクスをリモデリングまたは分解することによる。効果は、眼の線維柱帯網の細胞外マトリクスの浸透性を測定することによって、またはインビボアッセイでｒＡＡＶの効果を測定することによって評価することができる。本発明により開示される適切なインビトロアッセイには、ヒト緑内障、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）、または房水（ＡＨ）中で培養された対照（白内障）のいずれかに由来するヒトシュレム管（ＳＣ）内皮細胞（ＳＣＥＣ）単層の使用が含まれる。次いで、蛍光結合染料に対する経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）および浸透性を、比較のためにｒＡＡＶベクターで形質導入された細胞、または形質導入されていない細胞で測定することができる。他のアッセイでは、ＥＣＭタンパク質を染色し、免疫蛍光法によって観察することができる。これらおよび他のインビトロアッセイは、以下のようにより詳細に記述される。

ｒＡＡＶベクターをヒト線維柱帯網（ＨＴＭ）単層に接触させることにより、かかる単層を介したトレーサー分子流束の速度を、当該ｒＡＡＶと接触しないＨＴＭ単層を介したトレーサー分子流束に対して約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１５％超増加させ得る。本明細書で使用される場合、用語「トレーサー分子流束」または「トレーサー流束」は、例えば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｃｅｒ ｆｌｕｘ ｒａｔｉｏｓ：ａ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．３１：３５１－５８（１９９７）に記載されるような、上皮膜にわたるトレーサー分子の流れを指す。任意選択で、トレーサーは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ－デキストラン）にコンジュゲートされたデキストランであってもよい。事例によっては、当該ｒＡＡＶベクターをヒト線維柱帯網（ＨＴＭ）単層に接触させることにより、当該単層の経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）が、当該ｒＡＡＶに接触されない単層のＴＥＥＲよりも、１ｃｍ^２当たり約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５オーム超、１ｃｍ^２当たり約１５オーム超、または１ｃｍ^２当たり約２０オーム超減少する。ＴＥＥＲを判定する方法は、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．ＴＥＥＲ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂａｒｒｉｅｒ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ Ｌａｂ Ａｕｔｏｍ．２０：１０７－２６（２０１５）に記載されている。

対象の眼において、インビボで、ｒＡＡＶを眼に投与することは、一部の事例では、線維柱帯網の細胞外マトリクスの浸透性を増加させ、当該眼の流出抵抗を減少させ、および／または眼圧（ＩＯＰ）を低減させ得る。眼の流出抵抗および眼圧の測定は、この詳細な説明に続く実施例、および例えば、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ａｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｕｔｆｌｏｗ Ｆａｃｉｌｉｔｙ Ｕｓｉｎｇ ｉＰｅｒｆｕｓｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１１，ｅ０１５０６９４に記載されている。本開示の方法は、一部の事例では、処置された眼の房水流出能を少なくとも２５％または少なくとも３０％増加させる。

本明細書で使用される場合、「房水流出能」は、関連する圧力に対する流出速度の比率を指し、流体力学的抵抗の逆数である。房水流出能を測定するために一般的に使用されるアプローチは、以下に従う、インビボ灌流中に眼に出入りする流れの質量保存に基づく：

これは、修正されたゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎｎ）方程式として知られている。Ｑ_ｉｎはＡＨ分泌の速度であり、Ｑは灌流装置から眼内への流量であり、Ｑ_０は圧力非依存性流出である。Ｐは眼圧であり、Ｐ_ｅは上強膜血管（その中へＡＨが排出する）の圧力である。この形態では、Ｃは、通例の流出と、非通例の流出およびＡＨ分泌の任意の圧力依存性構成要素との両方を含む、総房水流出能である（仮性房水流出率（ｐｓｅｕｄｏｆａｃｉｌｉｔｙ））。本明細書では、簡略化のため、Ｃを示すために「能」という用語を使用する。能を計算するために、Ｑ_０およびＱ_ｉｎ、Ｐ_ｅおよびＣ自体は、多くの場合、圧力非依存であるとみなされる（それによって、暗黙のうちに、線形のＱ－Ｐ関係を仮定する）。

これらの仮定の下で、ＰおよびＱの二つの測定値は、ゆえに、２ステップの灌流プロトコルに従って能を推定するのに十分である：

式中、下付き文字ＩおよびＩＩは、二つの異なる圧力における測定値を示し、Ｃ_ｌｉｎは、線形Ｑ－Ｐ応答の仮定に基づく、圧力非依存性能である。あるいは、除核された眼の場合、Ｑ_ｉｎおよびＰ_ｅはゼロであり、それゆえ、Ｅｑ １は、下記のようになる：

より堅牢な方法を提供するために、複数の（２～１０）点を測定し、べき乗則モデルをＱ－Ｐ関係に適合させて、房水流出能の圧力依存性を捕捉することが可能である。

式中、Ｐ_ｒは、除核マウス眼において８ｍｍＨｇであると定義される基準圧力であり、ここでＣ_ｒは能である。べき指数βは、流れと圧力との関係の非線形性を特徴づけ、流出経路を通る流れと圧力との関係に影響を及ぼす非線形性の組合わされたソースの指標として解釈することができる。霊長類のインビボ灌流のさらなる精密化には、時間および圧力依存性応答を考慮するために、各サイクルの前および後に自発的ＩＯＰ読取りを伴う三つのステッピングサイクルの導入が含まれる。

組成物が投与される対象または哺乳動物の眼圧（ＩＯＰ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｍＨｇ超減少し得る。流出速度は、０．１～０．５μＬ／分／ｍｍＨｇ増加し得る。流出速度は、０．１、０．２、０．３、０．４、または０．５μＬ／分／ｍｍＨｇ超増加し得る。流出速度は、１、２、３、４、５、１０、または１５μＬ／分／ｍｍＨｇ超、または２０％、３０％、４０％、または５０％超増加し得る。対象または哺乳動物の線維柱帯網における光学的空隙の長さは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％超増加し得る。一般に、ｒＡＡＶベクターは、それらが接触する細胞の形質導入を引き起こす。形質導入細胞は、角膜内皮の細胞、ならびに他の眼細胞であってもよい。投与後、房水中におけるＭＭＰ－３濃度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、または０．６ｎｇ／ｍｌ、または例えば特に約１ｎｇ／ｍｌ以上の増加など、その間の任意の値だけ増加し得る。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３濃度は、約０．１～約１０ｎｇ／ｍｌであってもよい。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３濃度は、約１～約１０ｎｇ／ｍｌであってもよい。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３濃度は、約１～約５ｎｇ／ｍｌであってもよい。一部の実施形態では、ＭＭＰ－３濃度は、約１～約２ｎｇ／ｍｌであってもよい。一部の実施形態では、前述の眼の房水中のＭＭＰ－３活性は、約１、２、３、４、５、または６、ｍＵ以上、または例えば特に約５．３４ｍＵ以上など、その間の任意の値だけ増加する。治療後、前述の哺乳動物の角膜厚に変化がないことがさらに開示される。一部の実施形態では、ＩＯＰの低減および／または房水流出能の増加は、投与工程の約３０日、約４０日、約５０日、約６０日、約７０日、または約８０日以内に起こる。一部の実施形態では、ＩＯＰの低減および／または房水流出能の増加は、投与工程の約６６日以内に起こる。

一部の実施形態では、角膜厚は、投与工程前の対象における角膜厚と比べて、および／または対照単位用量を投与された対象における角膜厚と比べて変化しないままである。本明細書で使用される場合、「角膜厚」は、角膜上皮の外側境界と角膜内皮との間の距離を指す。角膜厚は、角膜パキメトリーによって判定され得る。角膜パキメトリーは、例えば、ＡＣＣＵＴＯＭＥ ＡＣＣＵＰＡＣＨ ５超音波パキメーターまたは同等のものを使用して実施され得る。平均パキメトリー値は、通常、各眼における一連の連続する四つ以上の測定から、ミクロン単位で、得られる。

あるいは、またはパキメトリーに加えて、角膜厚は、スペキュラーマイクロスコピーによって評価されてもよい。スペキュラーマイクロスコピーは、例えば、ＴＯＭＥＹ ＥＭ－３０００スペキュラーマイクロスコープ等を用いて実施されてもよい。また角膜内皮の完全性を評価するために、スペキュラーマイクロスコピーを使用してもよい。

一部の実施形態では、本開示の方法は、炎症反応を引き起こさないか、または臨床的に有意でない炎症反応を引き起こす。角膜の炎症を評価する方法は、スリットランプ検査を含む。前房細胞、房水フレア、および他の眼所見は、判定されたスコアの個々の構成要素の総和から導出された、改変ハケット－マクドナルドスコアリングシステムおよび複合臨床スコアを使用して等級分けされてもよい。ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｔ．Ｏ．、およびＳｈａｄｄｕｃｋ，Ｊ．Ａ．Ｅｙｅ ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．１３９－１９１（１９７７）。Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｒ．Ｂ．、およびＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｔ．Ｏ．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｏｃｕｌａｒ ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．５ｔｈ ｅｄ．５５７－５６７（１９９６）を参照されたい。スリットランプ検査および眼底検査は、試験経過中（すなわち、少なくとも９０日間）、眼内炎症の証拠を示さない。

一部の実施形態では、本方法は、対象の血清中のＭＭＰ－３のベースラインレベルを超えて上昇しないＭＭＰ－３の血清レベルをもたらす。血清ＭＭＰ３が上昇しないことは、眼から出て循環に入る非結合型ＭＭＰ３がないことを実証する。これは、オフターゲット効果の可能性を低減すると考えられる。

別の態様では、本開示は、対象の少なくとも一方の眼の眼圧（ＩＯＰ）を低減する方法であって、任意の本開示の単位用量の有効量を投与することを含む。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、対象は霊長類である。

別の態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるＩＯＰ上昇および／または緑内障を治療および／または予防する方法であって、任意の本開示の単位用量の有効量を投与することを含む。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。他の実施形態では、対象は霊長類である。

本開示の方法のいずれかにおいて、改善、減少、増加、および／または予防は、治療を受けない対照である対象を参照して、または対照である眼を参照して、判定され得る。例えば、治療は一方の眼に行われ、および反対側の眼は対照として使用されてもよい。あるいは、または追加的に、改善、減少、増加、および／または他の変化は、ベースライン測定値に関連して判定され得る。本明細書で使用される場合、「ベースライン」は、単位用量の投与前に測定された測定値、またはいくつかの測定値の平均を指す。

これらの実施形態および他の実施形態は、以下の実施例を参照してさらに理解され得る。

実施例１：組換えヒトＭＭＰ－３
本実施例は、アフリカミドリザルの、房水流出に対する組換えヒトＭＭＰ３（ｒｈＭＭＰ３）の前房内送達の効果、および線維柱帯網とシュレム管の形態学を特徴解析する。実施例は、ＭＭＰ－３を使用した霊長類における増加する房水流出能を示す。平均増加は約３０％であり、一部の対象は、少なくとも５０％、８０％、１００％、１５０％、２００％、またはそれ以上の流出の増加を呈した。実施例はさらに、ｒｈＭＭＰ３が、房水流出動態および眼圧に対する用量依存性効果を有することを実証する。

プロペプチドドメイン（配列番号２）を欠く組換えヒトＭＭＰ－３（ｒｈＭＭＰ３）を、細菌細胞内に発現させ、標準的な方法を使用して精製した。原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）におけるＩＯＰ上昇の主な原因は、流出抵抗の増加であると考えられる。Ｒｏｃｈａ－Ｓｏｕｓａ ｅｔ ａｌ．ＩＳＲＮ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３：２６１３８６ （２０１３）。さらに、ラタノプロストおよびｒｈｏｐｒｅｓｓａの降圧薬は、流出を増加させ、ＩＯＰを減少させることが知られている。顕著なことに、眼圧（ＩＯＰ）上昇の低減または防止と相関することが知られている房水流出能の増加が、眼の房水中のＭＭＰ－３の濃度が１ミリリットル当たり約１ナノグラム（ｎｇ／ｍＬ）を超えると達成されることを、本実施例は確立している。これは、ＩＯＰ上昇および／または緑内障を治療または予防するよう設計された任意の治療の治療有効性に対する重要な相関を確立する。

各サル（ｎ＝１７）は、１０ｎｇ／ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で製剤化された０．２ｍＬ～２ｍＬのｒｈＭＭＰ３の濃度で、前房内注入を受けた。ｒｈＭＭＰ３は、能力測定前、１時間の「プレコンディショニング」のために、自然発生的（または安静時の）ＩＯＰより５ｍｍＨｇ高い圧力で、眼に注入された。対側対照にビヒクルを注入し、この１時間のプレコンディショニング段階の後に房水流出能を判定した。

指定された時点（１時間のプレコンディショニングの前および後）で、３ゲージ針を有する０．３ｍｌシリンジを使用して、両方の眼から１００μｌの房水を無菌的に収集し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による分析まで－７０℃で保存した。サンプルを、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ Ｈｕｍａｎ Ｔｏｔａｌ ＭＭＰ－３ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔの標準プロトコルに従って、二重に実施した。

図１に示すように、組換えヒトＭＭＰ３を、インビボで霊長類の前房内に注入した。自然眼圧より５ｍｍＨｇ高い圧力での１時間の注入は、房水中０～４ｎｇ／ｍｌ（またはより具体的には、０．５～３．９ｎｇ／ｍｌ）の濃度の範囲をもたらした。

房水流出能は、インビボで霊長類の眼における流出測定を可能にする、改変ｉＰｅｒｆｕｓｉｏｎシステム（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｕｔｆｌｏｗ Ｆａｃｉｌｉｔｙ Ｕｓｉｎｇ ｉＰｅｒｆｕｓｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、１１、ｅ０１５０６９４）を使用して、測定された。

図２Ａに示すように、対照および処置の各対の間の能力差異を、ｒｈＭＭＰ３の送達用量にマッピングした。ｒｈＭＭＰ３は、霊長類においてインビボで、房水流出能を３０％増加させる（Ｐ＝０．０１７、Ｎ＝１７）。データ点は、対照眼と処置された対側眼との間の能力の差異のパーセンテージを表す。暗い影になった領域は、白色平均線の９５％信頼区間範囲を表す。エラーバーは、９５％信頼区間および２標準偏差を表す。

図２Ｂは、送達されたｒｈＭＭＰ３の量が、眼の間の房水流出能の差と相関していたことを示す。平均して、処置された眼は０．１３μｌ／分／ｍｍＨｇの増加を示し、これはｒｈＭＭＰ３濃度によって変化する。房水中のＭＭＰ－３の濃度は、処置された眼および対照眼についての房水流出能の相対的差異に対してプロットされ、用量反応曲線がもたらされた。観察された用量反応は統計的に有意であった（Ｒ^２＝０．５１；ｐ＝０．００７５）。平均して、処置された眼は０．１３μｌ／分／ｍｍＨｇの増加を示し、これはｒｈＭＭＰ３の濃度に従って変化する。

実施例２：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
本実施例は、ＣＭＶプロモーター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ）から強化緑色蛍光タンパク質を発現するＡＡＶ９ベクターを使用した、霊長類の角膜内皮の形質導入を示す。実施例は、角膜内皮の形質導入が、５×１０^１１ｖｇと同じ低さのＡＡＶ用量で達成され得ることを示す。実施例はさらに、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ９－ＥＧＦＰ）と比較して、一本鎖ＡＡＶベクター（ｓｓＡＡＶ９－ＥＧＦＰ）を使用した、霊長類の角膜内皮の予想外に優れた形質導入を実証する。

各試験ベクター（ｓｃＡＡＶ９－ＥＧＦＰまたはｓｓＡＡＶ９－ＥＧＦＰ）から生成されたＡＡＶ粒子、ならびに対照ベクターを含む単位用量を、それぞれ、１ミリリットル当たり３．３×１０^１３ベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）および１×１０^１３ｖｇ／ｍＬで調製した。ＤＮａｓｅおよびプロテイナーゼＫとのインキュベーション後、ｑＰＣＲを使用して力価を測定した。サンプルは希釈され、２Ｘ ＴＡＱＭＡＮ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＧＦＰまたはＭＭＰ－３遺伝子を標的とする２０Ｘ ＴＡＱＭＡＮ 遺伝子発現アッセイプローブ、およびＲＮａｓｅフリー水を含むマスターミックスを使用して四重で実行される。サンプルは、既知の濃度の標準曲線および参照標準と比較される。ｑＰＣＲ反応は、事前の１０分間のポリメラーゼ活性化工程と共に、ＳＴＥＰＯＮＥＰＬＵＳ（アプライドバイオシステムズ（登録商標））機器上での４０サイクルの変性およびアニーリングで実施される。データはｑＰＣＲ機器上で分析される。対照には０．９％の生理食塩水ビヒクルが含まれた。

正常スリットランプ検査および眼底検査、カラー眼底写真（ＣＦＰ）、および光干渉断層撮影（ＯＣＴ）を有するアフリカミドリサルを試験に選択した。麻酔下、すべての手技：ケタミン（８ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１．６ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内投与、ならびに１０％フェニルエプリン（ｐｈｅｎｙｌｅｐｒｈｉｎｅ）の局所投与を伴う瞳孔拡張を実施した。各対象は両眼に処置を受けた（ＯＤ＝右眼、ＯＳ＝左眼）。５０μＬの体積を、前房内注射により投与し、各対象のＯＤにおいて、５×１０^１０ １．６５×１０^１２ベクターゲノム（ｖｇ）のｓｃＡＡＶ９、および各対象のＯＳにおいて、５×１０^１１ｖｇのｓｓＡＡＶ９の送達用量を得た。注射を容易にするために眼に開眼器を配置し、続いてプロパラカイン塩酸塩０．５％、次いで５％のベタジン溶液を滴加し、滅菌生理食塩水ですすいだ。両眼（ＯＵ）に、前房内注射を行った。注射は、０．３ｍＬシリンジに接続された３１ゲージの０．５インチ長針を使用して行った。針は、眼内構造物を乱すことなく、角膜縁からおよそ２ｍｍ前方の側頭角膜を通して導入された。両方の前房内注射に続いて、局所用三重抗生物質ネオマイシン、ポリミキシン、バシトラシン眼軟膏（または同等のもの）が投与された。

図３Ａ～３Ｃは、ＡＡＶ９による霊長類角膜形質導入の結果を示す。図３Ａに示すように、自己相補的ＡＡＶ９（ｓｃＡＡＶ９－ＥＧＦＰ）の前房内注射により処置された霊長類の角膜内皮における蛍光ｅＧＦＰマーカーの発現は、このアッセイの感受性レベルで陰性対照と区別できなかった。図３Ｂに示すように、一本鎖ＡＡＶ９（ｓｓＡＡＶ９－ＥＧＦＰ）を前房内注射した対象からの角膜内皮は、レポーター遺伝子ｅＧＦＰの発現を示した。発現は角膜内皮に限定された。図３Ｃは、ｓｓＡＡＶ９－ｅＧＦＰを注射した眼からのＺスタックの３Ｄレンダリングを示す（図３Ｂのように）。このレンダリングは、角膜内皮層における大部分の細胞におけるＧＦＰの核周囲発現を示す。

角膜内皮における蛍光レポーターの発現は、少なくとも９０日間継続した。単位用量の前房内注射後９０日超経過した試験の終了時に、対象霊長類の眼の前房切片の免疫組織化学検査によってＧＦＰシグナルが観察された。

実施例３：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
実施例１は、マトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）の臨床的に有効な発現のための標的範囲を確立した。範囲は、１ミリリットル当たり少なくとも約少なくとも約１ナノグラム（ｎｇ／ｍＬ）、または約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、または約１ｎｇ／ｍＬ～約３ｎｇ／ｍＬである。実施例２の結果により、一本鎖ＡＡＶを選択した。

Ａ．房水中の標的濃度範囲でのＭＭＰ－３の発現
パートＡは、ＡＡＶ９ベクターを使用した霊長類の角膜内皮の形質導入が、マトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）の発現、およびこのような治療に関連するレベル、すなわち、少なくとも１ミリリットル当たり約１ナノグラム（ｎｇ／ｍＬ）、をもたらすことを示す。ＣＭＶプロモーター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＭＭＰ３）からのＭＭＰ－３を発現する一本鎖ＡＡＶ９ベクターを、ＧＦＰ対照（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ）と比較した。処置の割り当てを表４に示す。

（表４）処置の割り当て

撮像：カラーおよび蛍光前眼部撮影は、キヤノン６Ｄデジタル撮像ハードウェアおよびＮｅｗ Ｖｉｓｉｏｎ 眼底画像解析システムソフトウェアを備えたＴｏｐｃｏｎ ＴＲＣ－５０ＥＸ網膜カメラを使用して実施され得る。カラー写真には、シャッター速度（Ｔｖ）１／２５秒、ＩＳＯ ４００およびＦｌａｓｈ １８を使用した。単色およびカラー蛍光画像は、係合されたエキサイタおよびバリアフィルタ（４８０ｎｍエキサイタ／５２５ｎｍバリアフィルタ）、フラッシュ設定２００、Ｔｖ １／５秒、ＩＳＯ ３２００およびＦｌａｓｈ３００で取得された。蛍光画像が収集され、ＧＦＰベクターを受ける陰性対照眼としての役目を果たした。

光干渉断層撮影：前眼部ＯＣＴは、アイトラッキングおよびＨＥＹＥＸ画像取り込み分析ソフトウェアを備えた Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ＳＰＥＣＴＲＡＬＩＳ ＯＣＴ ＨＲＡまたはＯＣＴ Ｐｌｕｓを使用してOUで実施された。ＯＣＴ測定時に、ＳＰＥＣＴＲＡＬＩＳの自己蛍光機能を使用して、前房におけるＧＦＰ発現の画像を得た。

Ｂ．ＭＭＰ－３を用いたＡＡＶベースの遺伝子療法後の霊長類におけるＭＭＰ－３の発現
パートＢは、＞１ｎｇ／ｍＬでのＭＭＰ－３の発現を示し、これは少なくとも６６日間維持される。図４に示すように、ＭＭＰ３を発現するＡＡＶ９（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＭＭＰ３）での前房内注射は、選択された時点にわたって、ＥＬＩＳＡにより判定された約１ｎｇ／ｍｌ～２ｎｇ／ｍｌの範囲の眼の房水中濃度をもたらした（上段線）。一つの対象は、３～４ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度を有した。ＭＭＰ－３の濃度を評価した時点は、注射後２１、４２、５６、および６６日目であった。時点は、３週間、７週間、８週間、または９～１０週間目、または１か月または２か月目に相当する。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射した眼の房水中におけるＭＭＰ－３の発現は増加しなかった（下段線）。

ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＭＭＰ３で処置された対象におけるＭＭＰ－３の発現は、最終時点で平均１．６ｎｇ／ｍｌであった。これは、各時点で＜１ｎｇ／ｍｌの濃度のままであったビヒクル対照（ＡＡＶ９－ｅＧＦＰ）と比較して、有意な増加であった。個々の対象は、最終時点で３～４ｎｇ／ｍｌのＭＭＰ－３の発現を達成した。

Ｃ．ＭＭＰ－３を用いたＡＡＶベースの遺伝子療法を使用した霊長類におけるＩＯＰの低減
パートＣは、ＭＭＰ－３を用いたＡＡＶベースの遺伝子療法を使用した霊長類におけるＩＯＰの低減を示す。パートＣはさらに、ＡＡＶベースの遺伝子療法によって引き起こされるＭＭＰ－３の発現と眼圧（ＩＯＰ）への影響との間の用量反応関係を示す。

指定された時点で、サルを仰臥位に置いた後、鎮静後１０分以内に眼圧（ＩＯＰ）をＯＵで測定した。ＩＯＰ測定は、イヌ（ｄ）キャリブレーション設定に設定されたＴＯＮＯＶＥＴ眼圧計を用いて実施された。各検査時点で各眼から三つの測定値が取られ、平均ＩＯＰが定義された。

図５Ａ～５Ｂは、眼圧（ＩＯＰ）に対するＡＡＶ－ＭＭＰ３の治療効果を示す。図５Ａは、ｍｍＨｇとして測定された平均ＩＯＰ±ＳＥＭ（平均の標準誤差）を示す。測定は、２１、４２、５６、６６、９１、１２２、１５０、および１７８日目（第３、６、８、９～１０、１３、１７～１８、２１～２２、および２５～２６週目に相当し、１、２、３、４、５、および６ヵ月目に相当する）に行われた。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＭＭＰ３で処置したサルのＩＯＰ測定は、投与後即時の低減を超えて安定しており、約５６日目から約１５０日目までＩＯＰの低減が観察された。図５Ｂは、処置の投与後６６日目に測定された房水中のＭＭＰ３レベルの増加を伴うＩＯＰの低減を示す。

図５Ａに示すように、投与直後に予想される低減とは別に、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＭＭＰ３で処置した眼において、評価された時点でＩＯＰは安定したままであった。平均して、処置された眼は、ＡＡＶ－ＭＭＰ３の注射後の実験の全過程で、一貫してＩＯＰの低減を示す。図５Ｂに示すように、房水中のＭＭＰ３レベルと、ベースラインからのＩＯＰの変化との比較により、ＭＭＰ３レベルの増加を伴うＩＯＰの低減が明らかになった。

Ｄ．ＭＭＰ－３を用いたＡＡＶベースの遺伝子療法は角膜厚に影響を与えない
パートＤは、ＭＭＰ－３を用いたＡＡＶベースの治療が角膜厚に影響を与えないことを実証する。角膜厚は、安全性試験の過程全体を通じて、パキメトリーおよびスペキュラーマイクロスコピーにより測定された。角膜厚の測定値は安定しており、正常範囲内であり、明らかにＡＡＶ－ＭＭＰ３に関連した変化はなかった。

スペキュラーマイクロスコピー：指定された時点で、角膜内皮の完全性を評価するために、ＴＯＭＥＹ ＥＭ－３０００スペキュラーマイクロスコープを用いてスペキュラーマイクロスコピーを実施した。分析した内皮細胞の数、細胞密度、平均、標準偏差、変動係数（ＣＶ）および細胞寸法の範囲を定量化した。

パキメトリー：角膜パキメトリーは、ＡＣＣＵＴＯＭＥ ＡＣＣＵＰＡＣＨ ５超音波パキメーターを使用して、指定された時点で実施された。平均パキメトリー値は、各眼における一連の連続する四つの測定から、ミクロン単位で、得られた。

図６Ａ～６Ｂは、角膜厚の測定値がＡＡＶ－ＭＭＰ３に応答して変化しなかったことを示す。図６Ａに示すように、ＡＡＶ－ＭＭＰ３に応答して選択された時点での、霊長類に対するパキメトリーによる角膜厚の平均測定値の代表値は、経時的な有意な変化を示さなかった。図６Ｂに示すように、スペキュラーマイクロスコピーで測定される平均角膜厚の代表値もまた、試験の全過程で安定した値を示し、ＡＡＶ－ＭＭＰ３に関連する厚さの差異は観察されない。

Ｅ．ＭＭＰ－３を用いたＡＡＶベースの遺伝子療法は炎症を引き起こさない
パートＥは、ＭＭＰ－３を用いたＡＡＶベースの治療が炎症反応をもたらさない、または炎症反応が最小限であることを実証する。指定された時点で、スリットランプ検査を両眼（ＯＵ）で行った。前房細胞、房水フレア、および他の眼所見は、判定されたスコアの個々の構成要素の総和から導出された、改変ハケット－マクドナルドスコアリングシステムおよび複合臨床スコアを使用して等級分けされた。スリットランプ検査および眼底検査は、試験経過中（すなわち、少なくとも９０日間）、眼内炎症の証拠を示さない。一部の動物では、最小限の炎症反応が観察された。

Ｆ．ＡＡＶベースの遺伝子療法はＭＭＰ－３の血清濃度を上昇させない
パートＦは、ＭＭＰ－３を用いたＡＡＶベースの治療がベースラインに対してＭＭＰ－３の血清レベルの増加を引き起こさないことを示す。血液（５ｍＬ）を、前房内注射後の指定された放血時点（ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｙ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ）で、遠心分離管（血餅活性化剤（ｃｌｏｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を含まない）中で室温で１時間インキュベーションすることによる血清調製のために収集し、凝固させ、その後４℃で３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。総ＭＭＰ３濃度を測定するためにＥＬＩＳＡを実施した。ＡＡＶ－ＭＭＰ３を注射された霊長類において、いずれの時点でも、注射前のベースラインと比較して有意な上昇は認められなかった。図７に示すように、ＥＬＩＳＡによって判定された血清中のＭＭＰ３レベル（ｎｇ／ｍＬ）は、ベースラインに対して有意に上昇しなかった（下段線）。また、レベルは、ビヒクル対照で観察されたものよりも大きくはなかった（上段線）。

実施例４：ステロイド緑内障のマウスモデルにおいて、ＡＡＶ９発現ＭＭＰ３は、ＩＯＰを低減させ、房水流出能を増加させる
ＡＡＶ９発現ＭＭＰ３は、高眼圧症のグルココルチコイドモデルにおいてＩＯＰを低減させる
野生型マウスに、ＭＭＰ３をコードするテトラサイクリン誘導性ＡＡＶ（ＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３）、または対照として、ＧＦＰをコードするテトラサイクリン誘導性ＡＡＶ（ＡＡＶ－ｉＧＦＰ）を前房内注射した。ＡＡＶ注射の２週間後、マウスに、グルココルチコイドデキサメタゾンを充填した浸透圧ミニポンプを皮下移植した。マウスの対照サブセットに、ビヒクル対照であるシクロデキストリンを分泌するポンプを移植した。デキサメタゾン処置された動物では、図８Ａに見られるように、移植後４週間にわたり高圧を発症した。眼圧は、シクロデキストリン対照処置動物において安定であった（図８Ｂ）。

移植の２週間後、ドキシサイクリン（テトラサイクリン類似体）を眼に１日２回局所適用し、ＡＡＶの転写を誘導した。ドキシサイクリンの添加時点以後（ＤＥＸ第２週）、ＡＡＶ－ＭＭＰ３処置した眼のＩＯＰは、高圧の動物では安定的であるようである（図８Ａ、下段線）、しかしＡＡＶ－ｉＧＦＰ動物では、上昇が続いた（図８Ａ、上段線）。

ベースラインから最終時点までのＩＯＰの変化を比較する場合、ＡＡＶ－ｉＭＭＰ３処置した眼は、ＡＡＶ－ｉＧＦＰ対照と比較して、ＩＯＰが有意に低減した（合計６週間、図９Ａ）。また、対側の眼の間でのみ最終時点を比較した場合でも、高圧の動物におけるＡＡＶ－ｉＭＭＰ３処置した眼でＩＯＰは有意に低減する（図９Ｃ）。正常圧の対照マウスでは有意な変化は観察されない、図９Ｂおよび図９Ｄ）。統計は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。デキサメタゾン処置マウスについてＮ＝１４。シクロデキストリン処置マウスについてはＮ＝１０。

ＡＡＶ９発現ＭＭＰ３は、高眼圧症のグルココルチコイドモデルにおいて房水流出能を増加させる
デキサメタゾン誘発性高眼圧のマウス（図１０Ａ）、および正常圧のマウス（図１０Ｂ）の両方において、房水流出能は、対側対照と比較して、ＡＡＶ－ＭＭＰ３処置した眼でおよそ５０％増加する。高圧動物では、房水流出能の平均増加は４５％［１８、７８］（平均パーセンテージ、［下側の信頼区間、上側の信頼区間］）、Ｐ＝０．００４９、Ｎ＝８であった。正常圧の動物対照では、房水流出能の平均増加は５９％［２６、１００］、Ｐ＝０．００２、Ｎ＝８であった。

ＡＡＶ－ＭＭＰ３は、グルココルチコイド誘発性高眼圧症のマウスモデルにおいて、従来の流出組織で細胞外分解を誘導する。
シュレム管の内皮下領域について、電子顕微鏡法を用いて処置された眼と対照眼の両方での細胞外マトリクス（ＥＣＭ）物質の不在を定量化した（図１１）。処置された眼は、眼の全周のこの領域において、視覚的空隙を有意により多量に有した。

実施例５：先天性緑内障のマウスモデルにおいて、ＡＡＶ９発現ＭＭＰ３は、ＩＯＰを低減させ、房水流出能を増加させる
ＡＡＶ９発現ＭＭＰ３は、緑内障の遺伝モデルにおいてＩＯＰを低下させる
野生型マウス（図中ＭＹＯＣ（－））およびヒト突然変異ミオシリンＹ４３７Ｈ導入遺伝子（図中ＭＹＯＣ（＋））陽性マウスに、一方の眼にＡＡＶ－ｉＭＭＰ３を注射し、対側対照としてＡＡＶ－ｉＧＦＰを注射した。２週間後、発現は、ドキシサイクリン点眼薬の１日２回投与を介して誘発された。図１２Ａは、高圧ＭＹＯＣ（＋）動物において、ＡＡＶ－ｉＭＭＰ３処置した眼が、試験過程にわたってＩＯＰの低減を呈することを示す。実験の過程にわたりＡＡＶ－ｉＭＭＰ－３およびＡＡＶ－ｉＧＦＰで対側性に処置された眼のＩＯＰの中央値の変化は、ＭＹＯＣ（＋）群（図１３Ａ）およびＭＹＯＣ（－）群（図１３Ｂ）についてドット箱ひげ図で表される。最終ＩＯＰの測定値が、それぞれＭＹＯＣ（＋）群およびＭＹＯＣ（－）群に対応して、（図１３Ｃ）および（図１３Ｄ）に表される。対側性眼の間の最終ＩＯＰ測定値の差は、ＭＹＯＣ（＋）動物（１．７±０．１ｍｍＨｇ、ｐ＝０．０００３、ｎ＝１６、図６Ｃ）では有意であったが、ＭＹＯＣ（－）動物では有意ではなかった（０．１±０．２ｍｍＨｇ、ｐ＝０．４８、ｎ＝１２、図６Ｄ）。

緑内障の遺伝モデルにおいて、ＡＡＶ９発現ＭＭＰ３は房水流出能を増加させる
ＭＹＯＣ^{Ｙ４３７Ｈ}マウス（図１４Ａ）では、房水流出能は、平均４９％増加する、Ｐ＝０．０１１５、Ｎ＝９。正常圧の同腹仔対照では（図１４Ｂ）、房水流出能の平均増加は８８％、Ｐ＝０．０００１、Ｎ＝８であった。

実施例６：コドン最適化ＭＭＰ３配列の開発および特徴解析
コドン最適化配列の開発
ＭＭＰ３配列（配列番号９）のコドン最適化を、ヒトコドン使用のための配列を最適化するためのアルゴリズムを使用して実施した。天然ＭＭＰ３配列およびコドン最適化配列の一つであるＭＭＰ Ｏｐｔ ３も、ＣｐＧ枯渇のために改変した（表５および表６）。表５は、天然ＭＭＰ３配列に対する各最適化配列の配列類似性を示す。コドン最適化配列のパーセント同一性およびＧＣ含量は両方とも、天然ＭＭＰ３配列と有意に異なっていた。図２２Ａ～２２Ｃは、天然配列および最適化配列のアライメントを示す。本明細書に記載される実施例に提供される方法および分析を使用して、任意の最適化配列を試験し、特徴解析する。
（表５）コドン最適化ＭＭＰ３配列と天然配列との比較。

表６のコドン最適化配列の対比較は、最適化配列間の配列類似性を示す。パーセント同一性は、コドン最適化配列が有意差を有することを示す。
（表６）コドン最適化ＭＭＰ３配列の対比較。

インビトロでのコドン最適化配列の発現
特徴解析のために、ＭＭＰ３ Ｏｐｔ １（配列番号２３）、ＭＭＰ３ Ｏｐｔ ２（配列番号２４）、およびＭＭＰ３ Ｏｐｔ ３（配列番号２５）の三つの最適化配列を選択した。コドン最適化配列を作製し、ＡＡＶ発現カセット内にサブクローニングした。コドン最適化配列を含有するプラスミドを、トランスフェクトしやすく広く使用されているヒト細胞株の代表例であるＨＥＫ２９３細胞に、および、意図された標的細胞型の代表例であるＨＣＥＣ（ヒト角膜内皮細胞）に、トランスフェクトした。どちらの場合も、リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬を使用して細胞を４８時間トランスフェクトした。次いで、タンパク質を、培養培地上清から、および細胞溶解物から採取した。ヒトＭＭＰ３（Ｒ＆Ｄシステム、ＤＭＰ３００）用のＥＬＩＳＡを実施して、各サンプルのＭＭＰ３濃度を判定した。ＢＣＡアッセイを実施して、総タンパク質濃度を判定した。ＥＬＩＳＡデータをＢＣＡデータに正規化し、総タンパク質１μｇ当たりのｎｇでＭＭＰ３の量を生成した。

コドン最適化ＭＭＰ３配列の発現を、ＨＥＫ細胞株およびＨＣＥＣ細胞株で特徴解析した。ＨＥＫ細胞にトランスフェクトされた最適化構築物は、この細胞型に対する培地および細胞溶解物の両方で、ＭＭＰ３発現にほとんど変化を示さなかった（図１５）。対照的に、ＨＣＥＣ細胞におけるＭＭＰ３発現は、ＭＭＰ３をコードする異なる配列間の発現に明確な差異を示した（図１６）。ＨＣＥＣ細胞にトランスフェクトされた最適化構築物の分析は、天然ＭＭＰ３コード配列と比較して、細胞溶解物および培地上清の両方におけるＭＭＰ３タンパク質産生の有意な増加を示す。最適化配列間のタンパク質産生の差異は、ＭＭＰ３ Ｏｐｔ ３配列が最高レベルのタンパク質産生をもたらし、ＭＭＰ３ Ｏｐｔ ２およびＭＭＰ３ Ｏｐｔ １が後に続くことを示している（図１６）。これらの結果は、関連する細胞型において、コドン最適化配列が、天然配列と比較して、より大きなＭＭＰ３タンパク質産生をもたらすことを示唆している。

ＨＥＫ２９３細胞およびＨＣＥＣ細胞において、ＭＭＰ３をコードする天然配列およびコドン最適化配列について観察された発現傾向の比較は、ヒト細胞株間で発現が予測できないことを示す。ＨＥＫ２９３細胞では、天然配列とコドン最適化配列の間、およびコドン最適化配列間の発現のばらつきは非常に少なかった。予想外のことに、コドン最適化配列はすべて、天然配列よりも高いレベルで発現され、ＨＣＥＣ細胞のコドン最適化配列間では発現に差異があった。この結果は、改善された発現は、ＭＭＰ３コード配列のコドン最適化の明白な結果ではない、ということを示す。

コドン最適化ＭＭＰ３配列のＡＡＶ９ウイルスベクター送達
最も効率的なコドン最適化配列、ＭＭＰ３ Ｏｐｔ ３、または天然ＭＭＰ３配列のいずれかを含有するＡＡＶ９ウイルスベクターを作製した。ベクターを、１×１０^５のＭＯＩ（感染多重度）でＨＣＥＣ細胞に形質導入した。培地上清を、トランスフェクションの４８時間後に採取した。ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、およびＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）活性アッセイをこれらのサンプルに対して実施し、タンパク質発現およびプロテアーゼ活性を特徴解析した。

ＡＡＶ９ウイルスベクターにより送達されるコドン最適化ＭＭＰ３配列の発現
ＭＭＰ３発現を、ＡＡＶ９ベクターで形質導入されたＨＣＥＣ細胞で評価した。ＭＭＰ３発現は、ＭＭＰ３ Ｏｐｔ ３構築物を使用した場合、対照および天然ＭＭＰ３配列を含有する構築物と比較して、培地において有意に増加した（Ｐ＝＜０．０００１、Ｎ＝１６ ＭＭＰ３ Ｏｐｔ ３、Ｎ＝１５天然、対でないｔ検定）（図１７）。さらに、利用可能な場合、ＭＭＰ３レベルをさらに、総タンパク質濃度に対して正規化正規化した。（Ｐ＝＜０．０００１、Ｎ＝８）（図１８）。ウェスタンブロット分析を使用して、ＡＡＶ９ベクターによって形質導入されたＨＣＥＣ細胞中のコドン最適化配列および天然配列から培地中に分泌されたＭＭＰ３を測定した。天然または最適化されたＭＭＰ３を発現するＡＡＶ９で処理されたＨＣＥＣ細胞培養物からの培地を、ＭＭＰ３（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ５２９１５）に対して免疫ブロットした（図１９）。結果は、最適化構築物で処理された細胞を含有するレーンにおいて、ｐｒｏ－ＭＭＰ３バンドと活性ＭＭＰ３バンドの両方の強度がより強いことを示す。ポンソーはローディングコントロールとして提示される。

ＡＡＶ９ウイルスベクターによって送達されるコドン最適化ＭＭＰ３配列のプロテアーゼ活性
ＡＡ９ベクターによって形質導入された細胞から採取された培地におけるＭＭＰ３プロテアーゼ活性。（図２０）。発現されたＭＭＰ３のプロテアーゼ活性を、ＭＭＰ３活性アッセイＦＲＥＴキット（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１１８９７２）を使用して評価した。ＭＭＰ３活性は、最適化構築物を使用して有意に増加した。（Ｐ＜０．０００１、Ｎ＝８）。活性は、ｍＵ／ｍｌで定量化され、ここで、製造業者のプロトコルに従って、室温で１分当たり１．０μｍｏｌのクエンチされていないＭｃａを生成する酵素の量として、１ユニットが定義される。

実施例７：ヒトの眼における房水流出能に対するＭＭＰ３の効果
マウスおよび非ヒト霊長類データを拡張するために、ヒトの眼に対する組換えヒトＭＭＰ３の有効性を判定した。死後、眼は二等分され、前房はｉＰｅｒｆｕｓｉｏｎシステムに取り付けられた。ＭＭＰ３は、安定した流量が達成された後、数日間にわたって濃度を増加して、眼内に灌流された。対側眼にビヒクルを使用し、ペア観察を可能にした。５ｎｇ／ｍｌの濃度を分析のために選択した。この濃度では、５ｎｇ／ｍｌの灌流液を交換を介して前房に導入した１時間後、ＭＭＰ３は、対照と比較して平均で５６％、房水流出能を増加させた、Ｐ＝０．１３９９、Ｎ＝３ペア（図２１Ａ～２１Ｂ）。これらの結果は、特に１～１０ｎｇ／ｍｌの用量を達成するように組換えタンパク質または遺伝子療法ベクターの用量が選択される場合に、緑内障患者の眼における組換えＭＭＰ３への曝露が、房水流出能を増加させ、眼圧を低減させ得ることを示唆する。

本明細書に記載されるすべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示したかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書の任意の定義を含む本出願が優先する。しかしながら、本明細書に引用される任意の参照、記事、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、有効な先行技術を構成する、または世界の任意の国で共通の一般知識の部分を形成するという承認やいかなる形態の提案ではなく、そのようにとらえられるべきではない。

本明細書の記載では、別段の示唆がない限り、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比範囲、または整数範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合にはその分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。用語「約」は、数字または数詞の直前にあるとき、当該数字または数詞がプラスまたはマイナス１０％の範囲であることを意味する。本明細書で使用されるとき、用語「ａ」および「ａｎ」は、別段の示唆がない限り、列挙された構成要素のうちの「一つ以上」を指すことが理解されるべきである。選択肢の使用（例えば、「または」）は、選択肢の一方、両方、または任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。用語「および／または」は、選択肢の一方または両方を意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は同義で使用される。

本明細書で使用される節の見出しは、組織化のみを目的としており、記載される主題を制限するものとして解釈されるべきではない。

例示的実施形態が図示および説明されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されよう。

Claims (90)

1. 複数の血清型９の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）粒子を含む単位用量であって、
   前記複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、非複製であり、
   前記複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、
   （ａ）５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）をコードする配列、
   （ｂ）プロモーターをコードする配列、
   （ｃ）ヒトマトリクスメタロプロテイナーゼ３（ｈＭＭＰ－３）をコードする配列、
   （ｄ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列、および
   （ｅ）３’ＩＴＲをコードする配列
   を５’から３’に向かって含むポリヌクレオチドを含み、
   前記単位用量が、１×１０^１０ベクターゲノム（ｖｇ）～５×１０^１２ｖｇ（終点を含む）のｒＡＡＶ９粒子を含む、
   単位用量。
2. （ｉ）無菌であり、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、請求項１に記載の単位用量。
3. 前記複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターである、請求項１または請求項２に記載の単位用量。
4. 前記複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、請求項１または請求項２に記載の単位用量。
5. 前記プロモーターがＣＭＶプロモーターを含み、前記ＣＭＶプロモーターをコードする前記配列が、
   配列番号６、配列番号７、もしくは配列番号１９の配列、または
   それに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を任意選択的に有する、その機能的変異体
   を含むかまたはそれからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の単位用量。
6. 前記ヒトＭＭＰ－３をコードする配列が、
   配列番号１、配列番号２、配列番号１０、もしくは配列番号２２のＭＭＰ－３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または
   それに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を任意選択的に有するその機能的変異体
   を含むかまたはそれからなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の単位用量。
7. 前記ＭＭＰ－３アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が、野生型ヌクレオチド配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単位用量。
8. 前記ＭＭＰ－３をコードする配列が、
   配列番号９、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列を含むかもしくはそれからなる、または
   それに対する少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の配列同一性を共有する、
   請求項７に記載の単位用量。
9. 前記５’ＩＴＲをコードする配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲ配列から誘導される、請求項１～８のいずれか一項に記載の単位用量。
10. 前記５’ＩＴＲをコードする配列が、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲの配列と同一である配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の単位用量。
11. 前記５’ＩＴＲをコードする配列が、配列番号５、配列番号１４、または配列番号１５のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単位用量。
12. 前記３’ＩＴＲをコードする配列が、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲ配列から誘導される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単位用量。
13. 前記３’ＩＴＲをコードする配列が、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲの配列と同一である配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単位用量。
14. 前記３’ＩＴＲをコードする配列が、配列番号１２、または配列番号１６～１８のいずれか一つのヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単位用量。
15. 前記ポリＡシグナルをコードする配列が、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡ配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単位用量。
16. 前記ｈＧＨ ポリＡシグナルをコードする配列が、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の単位用量。
17. 前記ポリヌクレオチドが、コザック配列をさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単位用量。
18. 前記コザック配列が、ＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ（配列番号２１）のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、請求項１７に記載の単位用量。
19. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号３、または配列番号４の配列を含むかまたはそれからなる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単位用量。
20. 前記ｒＡＡＶ９粒子の各々が、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）キャップタンパク質から単離または誘導されたウイルスＣａｐタンパク質を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の単位用量。
21. 組換えマトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）タンパク質を含む単位用量であって、
    １ミリリットル当たり１ミリグラム（ｍｇ／ｍＬ）～５００ｍｇ／ｍＬ（終点を含む）の前記組換えＭＭＰ－３タンパク質、または、０．１ナノグラム（ｎｇ）～１０ｎｇ（終点を含む）の前記組換えＭＭＰ－３タンパク質
    を含む、前記単位用量。
22. 約０．０１～約１０ｎｇ／ｍＬの前記組換えＭＭＰ－３タンパク質を含む、請求項２１に記載の単位用量。
23. 前記組換えＭＭＰ－３タンパク質がヒトＭＭＰ－３タンパク質である、請求項２１または請求項２２に記載の単位用量。
24. 前記組換えＭＭＰ－３タンパク質が、
    配列番号１、配列番２、配列番号１０、もしくは配列番号２２の配列を含むかもしくはそれからなるポリペプチド配列、または
    それに対する８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を任意選択的に有するその機能的変異体もしくは機能的断片
    を有する、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の単位用量。
25. 対象の角膜内皮を形質導入する方法であって、請求項１～２４のいずれか一項に記載の単位用量の有効量を投与することを含み、前記対象が霊長類である、前記方法。
26. 前記単位用量中の前記複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記単位用量の前記有効量を投与することが、０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）、０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）、または０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）の測定濃度の、前記対象の眼の房水におけるＭＭＰ－３の発現をもたらす、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
28. 前記測定濃度が、１ｎｇ／ｍＬ以上である、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記測定濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記測定濃度が、１～１０ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記測定濃度が、少なくとも１～３ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）である、請求項２８に記載の方法。
32. 前記ＭＭＰ－３の発現が、少なくとも２１日間、４２日間、５６日間、または６６日間維持される、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記ＭＭＰ－３の発現が、少なくとも９０日間維持される、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。
34. 房水中の前記ＭＭＰ－３の発現が、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって測定される、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。
35. 房水流出能を少なくとも２５％または少なくとも３０％増加させる、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記房水流出能の増加が、前記投与工程の約６６日以内に発生する、請求項３５に記載の方法。
37. 角膜厚が、前記投与工程前の前記対象における角膜厚と比べて、および／または対照単位用量を投与された対象における角膜厚と比べて、変化しないままである、請求項２５～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 炎症反応を引き起こさない、請求項２５～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記対象の血清中のＭＭＰ－３のベースラインレベルを超えて上昇しないＭＭＰ－３の血清レベルをもたらす、請求項２５～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記投与工程が、前記対象の少なくとも一方の眼への前記単位用量の前房内注射を含む、請求項２５～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 対象の少なくとも一方の眼の眼圧（ＩＯＰ）を低減する方法であって、請求項１～２４のいずれか一項に記載の単位用量の有効量を投与することを含み、前記対象が霊長類である、前記方法。
42. 前記単位用量の前記有効量を投与することが、０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）の測定濃度の、前記対象の眼の房水におけるＭＭＰ－３の発現をもたらす、請求項４１に記載の方法。
43. 前記測定濃度が、１ｎｇ／ｍＬ以上である、請求項４２に記載の方法。
44. 前記測定濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
45. 前記測定濃度が、１～１０ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）である、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記測定濃度が、少なくとも１～３ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）である、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記ＭＭＰ－３の発現が、少なくとも２１日間、４２日間、５６日間、または６６日間維持される、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 前記ＭＭＰ－３の発現が、少なくとも９０日間維持される、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記ＭＭＰ－３の発現が、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって測定される、請求項４２～４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 房水流出能を少なくとも２５％または少なくとも３０％増加させる、請求項４２～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 眼圧（ＩＯＰ）を低減させる、請求項４２～５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 角膜厚が、前記投与工程前の前記対象における角膜厚と比べて、および／または対照単位用量を投与された対象における角膜厚と比べて、変化しないままである、請求項４２～５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 炎症反応を引き起こさない、請求項４２～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記対象の血清中のＭＭＰ－３のベースラインレベルを超えて上昇しないＭＭＰ－３の血清レベルをもたらす、請求項４２～５３のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記投与工程が、前記対象の少なくとも一方の眼の角膜への前記単位用量の注射を含む、請求項４２～５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記投与工程が、前記対象の少なくとも一方の眼の側頭角膜への前記単位用量の注射を含む、請求項４２～５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記投与工程が、前記対象の少なくとも一方の眼への前記単位用量の前房内注射を含む、請求項４２～５６のいずれか一項に記載の方法。
58. それを必要とする対象におけるＩＯＰ上昇および／または緑内障を治療および／または予防する方法であって、前記対象に請求項１～２４のいずれか一項に記載の単位用量の有効量を投与することを含み、前記対象が霊長類である、前記方法。
59. 対象の角膜内皮を形質導入する方法であって、複数の血清型９の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）粒子を含む単位用量の有効量を前記対象に投与することを含み、
    前記対象が霊長類であり、
    前記複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、非複製であり、
    前記複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）であり、
    前記複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、
    （ａ）５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）をコードする配列、
    （ｂ）プロモーターをコードする配列、
    （ｃ）マトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ－３）をコードする配列、
    （ｄ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列、および
    （ｅ）３’ＩＴＲをコードする配列
    を５’から３’に向かって含むポリヌクレオチドを含み、
    前記単位用量が、
    （ｉ）１×１０^１０ベクターゲノム（ｖｇ）～５×１０^１２ｖｇ（終点を含む）のｒＡＡＶ９粒子、または
    （ｉｉ）１ミリリットル（ｍＬ）当たり約１×１０^１１ベクターゲノム（ｖｇ）～１×１０^１４ｖｇ／ｍＬ のｒＡＡＶ９粒子
    を含み、ならびに
    前記単位用量の前記有効量を投与することが、０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ（終点を含む）の測定濃度の、前記対象の眼の房水におけるＭＭＰ－３の発現をもたらす、
    前記方法。
60. 前記ＭＭＰ－３をコードする配列が、
    配列番号９、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列を含むかもしくはそれからなる、または
    それに対する少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の配列同一性を共有する、
    請求項５９に記載の方法。
61. 対象の角膜内皮を形質導入する方法であって、複数の血清型９の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ９）粒子を含む単位用量の有効量を前記対象に投与することを含み、
    前記対象が霊長類であり、
    前記複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、非複製であり、
    前記複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）であり、
    前記複数のｒＡＡＶ９粒子の各ｒＡＡＶ９が、
    （ａ）５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）をコードする配列、
    （ｂ）プロモーターをコードする配列、
    （ｃ）導入遺伝子をコードする配列、
    （ｄ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列、
    （ｅ）３’ＩＴＲをコードする配列
    を５’から３’に向かって含むポリヌクレオチドを含む、
    前記方法。
62. 任意選択的にプロモーターに作動可能に連結された、ヒトマトリクスメタロプロテイナーゼ３（ｈＭＭＰ－３）またはその機能的変異体をコードする導入遺伝子を含む発現カセットを含む遺伝子療法ベクターであって、前記導入遺伝子が、ヒト宿主細胞における発現のために最適化されている、遺伝子療法ベクター。
63. 前記ヒト宿主細胞が、ヒト角膜内皮細胞である、請求項６２に記載の遺伝子療法ベクター。
64. 前記導入遺伝子が、配列番号２３～２７から選択される配列に対する少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を共有する、請求項６２または請求項６３に記載の遺伝子療法ベクター。
65. 前記導入遺伝子が、配列番号２３～２７から選択される配列を含む、請求項６４に記載の遺伝子療法ベクター。
66. 前記導入遺伝子が、配列番号２３に対する少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２３と同一である、請求項６５に記載の遺伝子療法ベクター。
67. 前記導入遺伝子が、配列番号２４に対する少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２４と同一である、請求項６５に記載の遺伝子療法ベクター。
68. 前記導入遺伝子が、配列番号２５に対する少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２５と同一である、請求項６５に記載の遺伝子療法ベクター。
69. 前記導入遺伝子が、配列番号２６に対する少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２６と同一である、請求項６５に記載の遺伝子療法ベクター。
70. 前記導入遺伝子が、配列番号２７に対する少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２７と同一である、請求項６５に記載の遺伝子療法ベクター。
71. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項６３～７０のいずれか一項に記載の遺伝子療法ベクター。
72. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ９ベクターである、請求項７１に記載の遺伝子療法ベクター。
73. 前記ＡＡＶベクターが一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターである、請求項７１または請求項７２に記載の遺伝子療法ベクター。
74. 前記ＡＡＶベクターが、自己相補的ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターである、請求項７１または請求項７２に記載の遺伝子療法ベクター。
75. 請求項６２～７４のいずれか一項に記載の遺伝子療法ベクターを含む、医薬組成物。
76. それを必要とする対象におけるＩＯＰ上昇および／または緑内障を治療および／または予防する方法であって、前記対象に、請求項６２～７４のいずれか一項に記載の遺伝子療法ベクター、または請求項７５に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含み、
    前記対象が霊長類である、
    前記方法。
77. ヒトマトリクスメタロプロテイナーゼ３（ｈＭＭＰ－３）またはその機能的変異体をコードする導入遺伝子を含む、ポリヌクレオチドであって、前記導入遺伝子が、ヒト宿主細胞における発現のために最適化されている、ポリヌクレオチド。
78. 前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項７７に記載のポリヌクレオチド。
79. 前記ヒト宿主細胞が、ヒト角膜内皮細胞である、請求項７７または請求項７８に記載のポリヌクレオチド。
80. 前記導入遺伝子が、配列番号２３～２７から選択される配列に対する少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を共有する、請求項７７～７９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
81. 前記導入遺伝子が、配列番号２３～２７から選択される配列を含む、請求項８０に記載のポリヌクレオチド。
82. 前記導入遺伝子が、配列番号２３に対する少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２３と同一である、請求項８１に記載のポリヌクレオチド。
83. 前記導入遺伝子が、配列番号２４に対する少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２４と同一である、請求項８１に記載のポリヌクレオチド。
84. 前記導入遺伝子が、配列番号２５に対する少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２５と同一である、請求項８１に記載のポリヌクレオチド。
85. 前記導入遺伝子が、配列番号２６に対する少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２６と同一である、請求項８１に記載のポリヌクレオチド。
86. 前記導入遺伝子が、配列番号２７に対する少なくとも９５％の同一性を共有するか、または配列番号２７と同一である、請求項８１に記載のポリヌクレオチド。
87. 前記導入遺伝子に隣接するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端リピート（ＩＴＲ）を含む、請求項７７～８６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
88. 単離ポリヌクレオチドである、請求項７７～８７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
89. 請求項７７～８８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、単離細胞。
90. 請求項７７～８８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。

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