TW202233253A - 用於人類基因療法之elovl2構築體 - Google Patents

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Abstract

本文揭示可增加ELOVL2之表現量之治療劑。本文亦描述減少或減緩衰老表型之治療劑。本文亦提供用於治療年齡相關性眼部疾病或病症之方法。本文提供藉由投與一或多種治療劑治療受試者(subject)中年齡相關性眼部疾病或病症之方法。

Description

用於人類基因療法之ELOVL2構築體
本發明係關於生物化學及醫藥領域。更特定言之，本發明係關於適用於ELOVL2基因療法以治療眼部疾病之方法及組合物。
已證實長鏈及超長鏈多不飽和脂肪酸(分別LC-PUFA及VLC-PUFA)在多種生物過程中至關重要。該等長鏈及超長鏈多不飽和脂肪酸被廣泛接受以在多種組織中用作：1)能量來源，2) 結構膜組分，及3)信號轉導途徑中之關鍵介質。
LC-PUFA無法由人類從頭合成及較短鏈脂肪酸前體之膳食來源對LC-PUFA組織生物合成而言係必需的。該等較短鏈脂肪酸在其中藉由各種延長酶作用以逐步方式添加2個碳之過程中經「延長」。已顯示一種此延長酶ELOVL2在二十二碳五烯酸(DPA) (22:5n-3)至DHA (22:6n-3)之轉化中發揮必不可少的作用。
本發明提供修飾、維持或增加受試者組織中ELOVL2酶含量之方法。在一些實施例中，該方法包括對該受試者投與包含增加ELOVL2之組織量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之最佳化密碼子或顯示與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之最佳化密碼子或顯示與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，該聚核苷酸序列進一步包含啟動子、強化子、反向末端重複序列(ITR)、多腺苷酸化信號、訊息序列，或其組合，其可包括(但不限於) SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、11、12及15。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列進一步包含病毒衣殼或套膜或非病毒遞送系統。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列進一步包含病毒衣殼及套膜或非病毒遞送系統兩者。在一些實施例中，該病毒衣殼及套膜係獨立地選自基於腺相關病毒(AAV)、基於腺病毒、基於α病毒、基於疱疹病毒、基於反轉錄病毒、基於慢病毒或基於牛痘病毒。在一些實施例中，該病毒衣殼及套膜可包括(但不限於) SEQ ID NO. 19、20、21及22。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列係於非病毒遞送系統中，於該系統中該最佳化聚核苷酸序列可與合成聚合微粒締合或囊封於合成聚合微粒中。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列係於DNA微環形式中。在一些實施例中，該方法進一步包括投與另外治療劑。在一些實施例中，該另外治療劑係抗補體劑或抗VEGF劑。在一些實施例中，該另外治療劑係皮質類固醇、抗發炎劑、去甲基化劑，或其組合。在一些實施例中，該去甲基化劑係地西他濱(decitabine)。在一些實施例中，該受試者係人類。
本發明進一步提供減少或減緩有需要受試者中衰老表型之方法。在一些實施例中，該方法包括對該受試者投與包含增加組織中ELOVL2酶含量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，該聚核苷酸序列進一步包含啟動子、強化子、反向末端重複序列(ITR)、多腺苷酸化信號、訊息序列，或其組合，其可包括(但不限於) SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、11、12及15。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列進一步包含病毒衣殼或套膜或非病毒遞送系統。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列進一步包含病毒衣殼及套膜或非病毒遞送系統。在一些實施例中，該病毒衣殼及套膜係各獨立地選自基於腺相關病毒(AAV)、基於腺病毒、基於α病毒、基於疱疹病毒、基於反轉錄病毒、基於慢病毒或基於牛痘病毒。在一些實施例中，該病毒衣殼及套膜可包括(但不限於) SEQ ID NO 19、20、21及22。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列係於非病毒遞送系統中，於該系統中該最佳化聚核苷酸序列可與合成聚合微粒締合或囊封於合成聚合微粒中。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列係於DNA微環形式中。
本發明亦提供一種治療、減輕或預防年齡相關性眼部疾病或病症之方法。在一些實施例中，該方法包括對該受試者投與包含增加ELOVL2之組織量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列係於載體中。在一些實施例中，該聚核苷酸序列進一步包含啟動子、強化子、反向末端重複序列(ITR)、多腺苷酸化信號、訊息序列，或其組合，其可包括(但不限於) SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、11、12及15。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列進一步包含病毒衣殼或套膜或非病毒遞送系統。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列進一步包含病毒衣殼及套膜或非病毒遞送系統。在一些實施例中，該病毒衣殼或套膜係各獨立地選自基於腺相關病毒(AAV)、基於腺病毒、基於α病毒、基於疱疹病毒、基於反轉錄病毒、基於慢病毒或基於牛痘病毒。在一些實施例中，該病毒衣殼及套膜可包括(但不限於) SEQ ID NO 19、20、21及22。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列係於非病毒遞送系統中，於該系統中該最佳化聚核苷酸序列可與合成聚合微粒締合或囊封於合成聚合微粒中。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列係於DNA微環形式中。在一些實施例中，該組合物係藉由玻璃體內、視網膜下、結膜下、眼球筋膜下(subtenon)或後鞏膜旁途徑對眼睛投與。在一些實施例中，該年齡相關性眼部疾病係年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病眼病、青光眼、弱視或乾眼症。
本發明亦提供一種包含SEQ ID NO: 2之最佳化聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之序列及載體之組合物。本發明亦提供一種包含SEQ ID NO: 3之最佳化聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之序列及載體之組合物。在一些實施例中，該組合物進一步包含SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO 15中之至少一者。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列係微環形式。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列進一步包含衣殼或套膜，其各獨立地選自腺相關病毒、腺病毒、α病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒、基於慢病毒載體或牛痘病毒。在一些實施例中，該衣殼及套膜係來自腺相關病毒(AAV)。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列進一步包含啟動子、強化子、內含子、反向末端重複序列(ITR)、衣殼、套膜、多腺苷酸化信號、訊息序列，或其組合。在一些實施例中，該組合物進一步包含另外治療劑。在一些實施例中，該另外治療劑係抗補體劑或抗VEGF劑。在一些實施例中，該另外治療劑係地西他濱。在一些實施例中，該組合物係經調配用於玻璃體內投與。
ELOVL脂肪酸延長酶2 (ELOVL2)係編碼參與催化長鏈脂肪酸延長循環之限速步驟之同名跨膜蛋白之基因。ELOVL2沉默(knockdown)小鼠中之研究表明ELOVL2對LC-PUFA及VLC-PUFA體內穩態而言係必不可少的。ELOVL2基因沉默及剔除動物顯示明顯之病理變化，包括生殖不育、眼部異常、代謝功能障礙、認知障礙及增加之細胞衰老。已觀測到在衰老期間，ELOVL2之表現下降。ELOVL2表現之此損失(及隨之發生的ELOVL2酶減少)可為由於ELOVL2基因啟動子中富含CPG片段之甲基化之年齡相關性增加。
因此，本發明之實施例係關於用於增加ELOVL2基因表現已下降之組織中之ELOVL2酶濃度之方法及組合物。在一些實施例中，本發明係關於使用ELOVL2基因療法於眼內增加ELOVL2基因表現之方法。在一些實施例中，該等方法表示經改善之治療策略。在一些實施例中，本文提供使用ELOVL2基因療法治療視力下降及其他衰老相關之功能障礙之方法。在一些實施例中，本文提供最佳化目標組織中之表現之特定遺傳構築體。在一些實施例中，相較於視網膜細胞中野生型基因之表現，該等基因構築體係經最佳化以更高度表現於人類視網膜細胞中。
在下列實施方式中，參考形成其一部分之隨附圖式。在該等圖式中，除非內文另有規定，否則相似符號通常識別相似組分。實施方式、圖式及申請專利範圍中描述之說明性實施例無意限制。可利用其他實施例，且可作出其他變化，而不背離本文呈現之標的之精神或範圍。將容易瞭解，如本文一般描述及圖式中闡述之本發明之態樣可以多種不同之配置進行佈置、替換、組合、分離及設計，其等所有均經本文明確審慎考慮。 定義
除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學術語均具有與如由本發明所屬領域之一般技術者通常瞭解之含義相同之含義。所有專利、申請案、公開申請案及其他公開案均以全文引用之方式併入本文中。在本文術語存在複數種定義之情況下，除非另有規定，否則以此章節中之彼等為準。
本文使用冠詞「一(a/an)」以係指該冠詞之語法對象中之一者或多於一者(例如，至少一者)。以實例說明之，「一元件」意謂一個元件或多於一個元件。
「約」意謂變化多達參考數量、量、值、數值、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度的30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%之數量、量、值、數值、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。
在整個本說明書中，除非內文另有要求，否則將瞭解字組「包含(comprise)」、「包含(comprises)」及「包含(comprising)」暗示包括規定步驟或元件或步驟或元件之組，但不排除任何其他步驟或元件或步驟或元件之組。
「由…構成」意謂包括且僅限於片語「由…構成」後之所有內容。因此，片語「由…構成」指示列舉之元件係必需且強制性的，且不存在其他元件。「基本上由…構成」意謂包括該片語後列舉之任何元件，且僅限於不干擾或有助於本發明中針對該等列舉元件規定之活動或動作之其他元件。因此，片語「基本上由…構成」指示列舉之元件係必需且強制性的，但其他元件係任選的且根據其等是否實質性影響該等列舉元件之活動或動作而可存在或可不存在。
在一些實施例中，組合物中任何給定藥劑(例如，抗體、多肽結合劑)之「純度」可經明確定義。針對實施例，如藉由(例如但絕不限於)高壓液相層析術(HPLC)(一種生物化學及分析化學中常用以分離、識別及定量化合物之管柱層析術之熟知形式)量測，某些組合物可包含至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%純(包括其中之所有小數)之藥劑。
如本文使用，術語「功能」及「功能性」及類似物係指生物、酶促或治療功能。
術語「經分離」意謂大體上或基本上不含於其天然狀態下通常伴隨之組分之材料。例如，如本文使用之「經分離之細胞」或「經分離之細胞群體」包括已自樣本材料(包括其他細胞、碎片或來自其天然生成狀態之外來樣本材料)純化之細胞或細胞群體。或者，如本文使用之「經分離之細胞」或「經分離之細胞群體」及類似物包括細胞或細胞群體自其天然環境之活體外、體外或其他分離及/或純化，及與出現其之樣本或材料之其他組分締合。在一些實施例中，經分離意謂該組分與活體內物質未顯著締合。
如本文使用，「受試者」意謂人類或非人類哺乳動物，例如，狗、貓、小鼠、大鼠、奶牛、綿羊、豬、山羊、非人類靈長類動物或鳥類(例如，雞)，及任何其他脊椎動物或無脊椎動物。
術語「哺乳動物」以其一般之生物意義使用。因此，具體言之，其包括(但不限於)靈長類動物，包括猿猴(黑猩猩、猿、猴)及人類、牛、馬、綿羊、山羊、豬、兔、狗、貓、嚙齒類動物、大鼠、小鼠、豚鼠，或類似物。
如本文使用之「有效量」或「治療有效量」係指在一定程度上有效緩解，或降低疾病或病症之一或多種症狀發作之可能性，且包括治癒疾病或病症之治療劑之量。「治癒」意謂消除疾病或病症之症狀；然而，即使在獲得治癒後，仍可存在某些長期或永久性影響(諸如廣泛之組織損傷)。
如本文使用，「治療(treat)」、「治療(treatment)」或「治療(treating)」係指出於預防及/或治療目的，對受試者投與化合物或醫藥調配物。術語「預防性治療」係指治療尚未顯示疾病或病症之症狀，但易患或否則處於特定疾病或病症之風險下之受試者，藉此該治療降低該病患將發展該疾病或病症之可能性。術語「治療性治療」亦係指對已罹患疾病或病症之受試者投與治療。
如本文使用之「投與(administration)」或「投與(administering)」係指將本文提供之化合物或組合物引入個體(individual)以進行其預期功能之途徑。例如，「投與」意謂玻璃體內注射及經由非玻璃體內途徑注射兩者。非玻璃體內途徑可包括結膜下注射、視網膜下注射、眼球筋膜下注射、眼球後注射及脈絡膜上腔(suprachoroidal)注射。另外實例亦包括有或無遞送裝置之基因療法遞送。其他非玻璃體內途徑包括局部施加至眼睛及於身體之其他部位靜脈內注射及皮下注射之注射。
如本文使用，「共投與」及類似術語均為廣義術語，並為一般技術者提供其等一般及習慣含義(且不限於特殊或指定含義)，及係指(但不限於)對單個病患投與選定治療劑，且旨在包括藉由相同或不同之投與途徑或在相同或不同之時間下投與藥劑之治療方案。在一些實施例中，共投與本文揭示之化合物。
如本文使用之「醫藥調配物」意謂包括最佳化聚核苷酸序列之生物可相容水性或非水性溶液、懸浮液、分散液或其他物理形式，其中該最佳化聚核苷酸序列係以適用於對哺乳動物受試者投與有效量之濃度。
如本文使用，「最佳化」聚核苷酸一般係指針對特定宿主物種藉由置換來自野生型之任何核苷酸已最佳化之核苷酸序列，該置換使得該核苷酸序列在異源環境中表現更佳。在一項實施例中，可製備含有特定原核或真核宿主較佳之密碼子之最佳化聚核苷酸序列(亦參見Murray等人，(1989) Nucl. Acids Res. 17:477-508)，(例如)以相較於自非最佳化序列產生之轉錄本，增加轉譯率或產生具有所需性質(諸如更長之半衰期)之重組RNA轉錄本。 組合物
在一些態樣中，本文描述一種包含最佳化聚核苷酸序列之組合物。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含編碼ELOVL2或其功能活性片段之聚核苷酸。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列係經進一步調配成用於上調ELOVL2表現之組合物。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之最佳化密碼子。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之最佳化密碼子。
在一些實施例中，組合物進一步包含人類ELOVL2強化子序列、CMV啟動子、腺病毒三聯體前導序列、合成內含子、土撥鼠肝炎轉錄後調節元件及人類生長激素polyA序列。在一些實施例中，該組合物包含SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO 15中之至少一者之核苷酸序列。
在一些實施例中，組合物包含與SEQ ID NO: 1具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之最佳化聚核苷酸序列。在一些實施例中，該組合物包含與SEQ ID NO: 2具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之最佳化聚核苷酸序列。在一些實施例中，該組合物包含與SEQ ID NO: 3具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之最佳化聚核苷酸序列。
在一些實施例中，最佳化聚核苷酸序列在無病毒衣殼或套膜(即非病毒遞送系統)之情況下投與。在一些實施例中，該非病毒遞送系統係基於囊封該最佳化聚核苷酸序列之合成聚合物。在一些實施例中，DNA微環形式係用於轉移該最佳化聚核苷酸序列。「微環DNA載體」可稱為「微環載體」或「微環」係小(通常在3至4 kb之範圍內，大約3至4 kb或通常不大於10 kb)環狀、附加型質體衍生物，其中已去除所有原核載體部分(例如，細菌複製起點、與質體之細菌繁殖相關聯之基因)。由於微環載體不含原核DNA序列，因此當其等用作將轉基因轉移至目標哺乳動物細胞內之媒介物時，其等不太可能感知為外來且經破壞。在實施例中，微環DNA載體係攜載轉基因表現匣之微環。在實例中，微環DNA載體係攜載轉基因表現匣且不含無插入物之空載體之微環。在一或多個實施例中，含有該轉基因表現匣之微環之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3。
微環載體係使用兩步程序製備。首先，於(例如)大腸桿菌中產生含有細菌序列及轉基因之全尺寸親代質體。儘管該親代質體仍於該大腸桿菌宿主內部，但位點特異性重組酶之表現係經誘導且原核或細菌骨於重組酶識別位點處經酶切除。位點特異性重組酶之實例包括Tyr-及Ser-重組酶(諸如Cre重組酶、Flp重組酶、ParA分解酶及PhiC31整合酶)。藉由毛細管凝膠電泳回收所得微環載體。合適材料、技術、途徑及方法之一個實例描述於美國專利第8,236,548號中，該案係以全文引用之方式併入本文中。進一步描述可參見Kay等人，A Robust System for Production of Minicircle DNA Vectors, Nature Biotechnology, 2010 28:1287-1289，該案係以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，最佳化聚核苷酸進一步包含衣殼或套膜。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸進一步包含衣殼及套膜兩者。在一些實施例中，該衣殼係基於AAV血清型1 (AAV1)、基於AAV-血清型2 (AAV2)、基於AAV血清型3 (AAV3)、基於AAV血清型4 (AAV4)、基於AAV血清型5 (AAV5)、基於AAV血清型6 (AAV6)、基於AAV血清型7 (AAV7)、基於AAV-血清型8 (AAV8)、基於AAV血清型9 (AAV9)或基於人類化AAV。在一些實施例中，該衣殼及套膜係各獨立地選自基於腺病毒、α病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒或牛痘病毒之衣殼或套膜聚核苷酸序列。
在一些實施例中，載體包含細胞或組織特異性啟動子，諸如可操作地連接至上文描述之聚核苷酸之視紫質激酶。在某些情況下，該細胞或組織特異性啟動子係對受關注之細胞類型具特異性之內源性啟動子。在其他情況下，該細胞或組織特異性啟動子係對受關注之細胞類型具特異性之外源性啟動子。
在一些實施例中，最佳化聚核苷酸序列包含微生物啟動子。在某些情況下，該微生物啟動子係SV40。在其他情況下，該微生物啟動子包含巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子。
在一些實施例中，最佳化聚核苷酸序列包含伸長因子1-α (EF1a)啟動子。
在一些實施例中，最佳化聚核苷酸序列包含強化子、反向末端重複序列(ITR)、衣殼、多腺苷酸化信號、訊息序列，或其組合。
在一些實施例中，最佳化聚核苷酸序列可經進一步修飾以表現於特定有機體中，此取決於該有機體之生物約束。在一些實施例中，聚核苷酸包含經最佳化以於人類細胞中轉譯之密碼子。例如，SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3包含已經最佳化用於上調ELOVL2表現之序列。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列已經最佳化用於在人類細胞中表現。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列可進一步包含導致保守胺基酸取代及或改善mRNA或經編碼之多肽之活性或穩定性之額外突變。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸包括導致改善基因或經編碼之蛋白質在受試者之眼中之穩定性之額外突變。 醫藥調配物
在一些態樣中，最佳化聚核苷酸序列進一步包含醫藥調配物。在一些實施例中，醫藥調配物中之該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3。
在一些實施例中，醫藥調配物(例如，最佳化聚核苷酸)可藉由多種投與途徑，包括(但不限於)玻璃體內、視網膜下、結膜下、眼球筋膜下、後鞏膜旁途徑、靜脈內、皮下、肌內、經口、鼻內、經頰、經直腸或穿皮式投與途徑，投與受試者。在一些實施例中，組合物(例如，醫藥調配物)可經調配用於視網膜下投與。
在一些實施例中，醫藥調配物包括(但不限於)水溶液或液體分散液、自乳化分散液、固溶體、懸浮液、脂質體分散液、噴霧劑、固體劑型、粉末、立即釋放調配物、控制釋放調配物、快速融化調配物、錠劑、膠囊、丸劑、延遲釋放調配物、延長釋放調配物、脈衝釋放調配物、多顆粒調配物(例如，奈米顆粒調配物)，及混合之立即釋放及控制釋放調配物。
在一些實施例中，醫藥調配物包括基於與本文揭示之組合物之相容性，及所需劑型之概況性質選擇之緩衝劑、張力劑、穩定劑、懸浮劑、穩定劑、增溶劑、研磨劑、載劑材料、pH調節劑，及類似物。載劑可包括(但不限於)阿拉伯樹膠、明膠、膠體二氧化矽、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、麥芽糊精、甘油、矽酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、膽固醇、膽固醇酯、脂肪酸、泊洛沙姆、聚葡糖、聚乙二醇、酪蛋白鈉、大豆卵磷脂、牛膽酸、磷脂醯膽鹼、氯化鈉、磷酸三鈣、磷酸二鉀、纖維素及纖維素結合物、糖、硬脂醯乳酸鈉、角叉菜膠、甘油單酯、甘油二酯、預膠化澱粉，及類似物。參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第十九版(Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995), Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975, Liberman, H.A.及Lachman, L.編，Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N. Y., 1980, and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第七版(Lippincott Williams & Wilkinsl999)。
在一些實施例中，醫藥調配物進一步包括pH調節劑或緩衝劑，其等包括酸(諸如乙酸、硼酸、檸檬酸、乳酸、磷酸及鹽酸)、鹼(諸如氫氧化鈉、磷酸鈉、硼酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉及三羥甲基胺基甲烷)，及緩衝劑(諸如檸檬酸鹽/右旋糖、碳酸氫鈉及氯化銨)。以將組合物pH維持在可接受範圍內所需之量包括此等酸、鹼及緩衝劑。
在一些實施例中，醫藥調配物包括使組合物之滲透壓於可接受範圍內所需之量之一或多種鹽。此等鹽包括彼等具有鈉、鉀或銨陽離子及氯離子、檸檬酸根、抗壞血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氫根、硫酸根、硫代硫酸根或亞硫酸氫根陰離子者，合適之鹽包括氯化鈉、氯化鉀、硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉及硫酸銨。
在一些實施例中，醫藥調配物包括(但不限於)糖(諸如海藻糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、葡萄糖)，或鹽(諸如磷酸鉀、檸檬酸鈉、硫酸銨)及/或其他藥劑以增加溶解度及活體內穩定性。在一些實施例中，該等醫藥調配物進一步包括稀釋劑。溶解於緩衝溶液中之鹽(其亦可提供pH控制或維持)在此項技術中用作稀釋劑，包括(但不限於)磷酸鹽緩衝鹽水溶液。 使用方法
在一些態樣中，本文揭示修飾、維持或增加有需要受試者組織中ELOVL2酶含量之方法。在一些實施例中，本發明係關於用於增加眼內ELOVL2基因表現之方法。在一些實施例中，本發明係關於用於維持眼內ELOVL2基因表現之方法。在一些實施例中，本發明係關於修飾眼內ELOVL2基因表現。在一些實施例中，該方法包括對該受試者投與包含增加組織中ELOVL2酶含量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2或顯示與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3或顯示與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包括遞送載體。在一些實施例中，該載體包含腺相關病毒載體、基於腺病毒載體、基於α病毒載體、基於疱疹病毒載體、基於反轉錄病毒載體、基於慢病毒載體或基於牛痘病毒載體。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列可於微環形式中。在一些實施例中，該組合物進一步包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 15中之至少一者之核苷酸序列。
在一些實施例中，修飾、維持或增加組織中ELOVL2酶含量之方法進一步包括投與另外治療劑。在一些實施例中，該另外治療劑可為C18-C28多不飽和脂肪酸。在一些實施例中，該另外治療劑可為抗發炎劑。在一些實施例中，該另外治療劑可為類固醇。在一些實施例中，該類固醇可為皮質類固醇。在一些實施例中，該另外治療劑可為去甲基化劑。在一些實施例中，該去甲基化劑可為地西他濱。在一些實施例中，該另外治療劑可為地西他濱-PLGA。在一些實施例中，該另外治療劑可選自貝伐單抗(bevacizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、阿柏西普(afibercept)、雷珠單抗(lucentis)、艾力雅(eylea)、貝奧武(beovu)、布羅珠單抗(brolucizumab)、哌加他尼(macugen)、蘭尼單抗、維速達爾(visudyne)、阿帕西普(aflibercept)、維替泊芬(vertecporfin)、哌加他尼(pegaptanib)，或其組合。
在一些實施例中，修飾、維持或增加ELOVL2酶之組織水量之方法可藉由視網膜下注射投與。在一些實施例中，修飾、維持或增加組織中ELOVL2酶含量之方法可藉由玻璃體內投與而投與。在一些實施例中，可使用脈絡膜上腔投與。在一些實施例中，修飾、維持或增加組織中ELOVL2酶含量之方法可藉由靜脈內投與而投與。在一些實施例中，投與可經由用於遞送組合物之窄規格針頭或套管型裝置。
在一些態樣中，本文描述一種減少或減緩有需要受試者中衰老表型之方法。在一些實施例中，該方法包括對該受試者投與包含增加ELOVL2之組織量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。在某些情況下，該衰老表型包含眼中光感受器減少、視網膜功能、氧化應激、年齡相關性黃斑變性、糖尿病眼病或乾眼症。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，該聚核苷酸序列進一步包含啟動子、強化子、反向末端重複序列(ITR)、多腺苷酸化信號、訊息序列，或其組合，其可包括(但不限於) SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、11、12及15。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列進一步包含病毒衣殼或套膜或非病毒遞送系統。在一些實施例中，該病毒衣殼及套膜可獨立地選自基於腺相關病毒(AAV)、基於腺病毒、基於α病毒、基於疱疹病毒、基於反轉錄病毒、基於慢病毒或基於牛痘病毒。在一些實施例中，該病毒衣殼可包括(但不限於) SEQ ID NO 19、20、21及22。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列可為於非病毒遞送系統中，於該系統中該最佳化聚核苷酸序列可與合成聚合微粒締合或囊封於合成聚合微粒中。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列可於DNA微環形式中。
在一些實施例中，衰老相關疾病或病症可為年齡相關性黃斑變性(AMD)。年齡相關性黃斑變性(亦稱為黃斑變性、AMD或ARMD)係一種視力惡化，其導致視野中心之視力模糊或無視力。在一些實施例中，氧化應激、脂質分子積累及發炎促成AMD之發展。在某些情況下，包含上文描述之載體之組合物治療AMD。在其他情況下，包含上文描述之載體之組合物減少及/或減緩AMD之進展。在一些實施例中，該衰老相關疾病或病症可為白內障。在一些實施例中，該衰老相關疾病或病症可為青光眼。在一些實施例中，該衰老相關疾病或病症可為乾眼症症候群。在一些實施例中，該衰老相關疾病或病症可為弱視。
在一些實施例中，衰老相關疾病或適應症可為代謝疾病或病症。在一些實施例中，年齡相關性疾病或適應症可為阿茲海默症(Alzheimer’s disease)。在一些實施例中，該年齡相關性疾病或適應症可為非酒精性脂肪肝疾病。在一些實施例中，該年齡相關性疾病或適應症可為癌症。在一些實施例中，該年齡相關性疾病或適應症可為色素性視網膜炎。在一些實施例中，該年齡相關性疾病或適應症可為角膜病。在此等實施例中，該代謝疾病或病症可為糖尿病(糖尿病，DM)。在某些情況下，糖尿病係1型糖尿病、2型糖尿病、3型糖尿病、4型糖尿病、雙重糖尿病、潛在自體免疫糖尿病(LAD)、妊娠糖尿病、新生兒糖尿病(NDM)、年輕人之成年型糖尿病(MODY)、沃爾夫拉姆症候群(Wolfram syndrome)、阿爾斯特羅姆症候群(Alstrom syndrome)、糖尿病前期或尿崩症。2型糖尿病(亦稱為非胰島素依賴型糖尿病)係最常見之糖尿病類型，其佔所有糖尿病病例之95%。在某些情況下，2型糖尿病係由因素之組合引起，包括由於胰臟β細胞功能障礙引起之胰島素抵抗，其進一步導致高血糖量。在某些情況下，胰高血糖素量增加刺激肝產生異常量非所需之葡萄糖，此促成高血糖量。
在一些實施例中，最佳化聚核苷酸序列可調配成用於上調一或多種另外基因之表現之組合物。在此等實施例中，該方法包括治療有需要受試者，其包括對該受試者投與包括包含編碼一或多種另外基因或其功能活性片段之聚核苷酸之載體的組合物。在一些實施例中，治療劑可調配成用於上調ELOVL2與選自以下之另外基因中之一或多者之組合之表現之組合物：Slc6a4、Sst、Hdac4、Nefm、Calbl、I14U、Grin2c、Chga、Grm2、Neurodl、Ardbl、Dio3、Ghsr、Avprla、Cadps2、Gria2、Irs2、Smad2、Htr7、Sypl2、Madlll、Vgf，或其組合。
在一些態樣中，本文描述一種治療、減輕或預防年齡相關性眼部疾病或病症之方法。在一些實施例中，該方法包括對該受試者投與包含增加ELOVL2之組織量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，該聚核苷酸序列進一步包含啟動子、強化子、反向末端重複序列(ITR)、多腺苷酸化信號、訊息序列，或其組合，其可包括(但不限於) SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、11、12及15。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列進一步包含病毒衣殼或套膜或非病毒遞送系統。在一些實施例中，該病毒衣殼及套膜可選自基於腺相關病毒(AAV)、基於腺病毒、基於α病毒、基於疱疹病毒、基於反轉錄病毒、基於慢病毒或基於牛痘病毒。在一些實施例中，該病毒衣殼可包括(但不限於) SEQ ID NO 19、20、21及22。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列可為於非病毒遞送系統中，於該系統中該最佳化聚核苷酸序列可與合成聚合微粒締合或囊封於合成聚合微粒中。在一些實施例中，該最佳化聚核苷酸序列可於DNA微環形式中。在一些實施例中，該組合物可使用靜脈內途徑全身投與。在一些實施例中，利用局部投與。針對眼部投與，可利用玻璃體內、視網膜下、結膜下、眼球筋膜下或後鞏膜旁途徑。在一些實施例中，該年齡相關性眼部疾病可為年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病眼病、青光眼、弱視或乾眼症。 治療方案
本發明提供用以治療受試者之醫藥調配物及套組。在一些實施例中，該受試者係哺乳動物。在一些實施例中，該受試者係人類。在一些實施例中，該等調配物為需治療眼部疾病之受試者提供治療益處。
在一些態樣中，對受試者提供如本文描述之調配物以治療、預防或減輕與視力下降相關聯之疾病或病症。在一些實施例中，該視力下降可由視網膜疾患引起。在一些實施例中，該視網膜疾患可為年齡相關性黃斑變性。在一些實施例中，該調配物進一步包含醫藥上可接受之水性或非水性介質。在一些實施例中，該投與可為視網膜下注射。
在一些態樣中，如本文描述之調配物導致受試者眼中ELOVL2酶之量增加。在一些實施例中，該調配物進一步包含醫藥上可接受之水性或非水性介質。在一些實施例中，該投與可為視網膜下注射。在一些實施例中，該調配物可以約10 µL至約200 µL之體積投與。在一些實施例中，該體積係約50 µL。在一些實施例中，如本文描述之組合物係對眼睛視網膜下投與。在一些實施例中，如本文描述之組合物之單一投與係足以治療性治療。在一些實施例中，治療性治療需重複投與。儘管非意欲限制，但在一些實施例中，本文描述之治療劑係以3個月、6個月、12個月、18個月、24個月、30個月、36個月、42個月、48個月、54個月、60個月、66個月、72個月或其組合之間隔投與。在一些實施例中，本文描述之組合物係在投與皮質類固醇後投與。在一些實施例中，對受試者投與皮質類固醇，接著投與如本文描述之組合物，接著投與皮質類固醇。
在一些實施例中，此等治療方案之毒性及治療效用係藉由標準醫藥程序於細胞培養物或實驗動物中測定，包括(但不限於)測定LD50 (對50%群體致死之劑量)及ED50 (於50%群體中治療有效之劑量)。毒性與治療效應之間的劑量比係治療指數且其表示為LD50與ED50之間的比率。顯示高治療指數之治療較佳。獲自細胞培養分析及動物研究之資料用以調配適用於人類之劑量範圍。該劑量根據採用之劑型及利用之投與途徑於此範圍內變化。 實例
下列實例意欲闡述本發明之細節，而不藉此以任何方式對其進行限制。 實例 1
ELOVL2野生型序列係使用加州大學聖克魯斯分校(UCSC)基因體瀏覽器(RefSeq_NM017770)獲得。一系列密碼子最佳化變體係使用密碼子最佳化產生。ELOVL2密碼子變體係使用MUSCLE (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)多重比對程式比對且僅接受彼此顯著不同之序列。將ELOVL2野生型(WT)及一組五個密碼子變體選殖至質體pAAV-EF1a內。
質體pAAV-EF1a含有人類EF1a啟動子、最佳化Kozak、將ELOVL2連接至GFP報導基因之P2A序列、wpre元件及人類生長激素polyA尾。質體pAAV-CMV含有人類巨細胞病毒啟動子、最佳化Kozak、將ELOVL2連接至GFP報導基因之P2A序列、wpre元件及人類生長激素polyA尾。質體pAAV-CMVT含有人類巨細胞病毒啟動子、腺病毒三聯體前導序列、最佳化Kozak、將ELOVL2連接至GFP報導基因之P2A序列、wpre元件及人類生長激素polyA尾。質體pAAV-CMVT-HR含有人類ELOVL2強化子元件、人類巨細胞病毒啟動子、腺病毒三聯體前導序列、最佳化Kozak、將ELOVL2連接至GFP報導基因之P2A序列、wpre元件及人類生長激素polyA尾。微環CMVT-CV4-GFP含有人類巨細胞病毒啟動子、腺病毒三聯體前導序列、最佳化Kozak、將ELOVL2連接至GFP報導基因之P2A序列、wpre元件及具有很少細菌質體骨架之人類生長激素polyA尾。AAV載體AAV8-CMVT-CV4-GFP含有AAV2 ITR、人類巨細胞病毒啟動子、腺病毒三聯體前導序列、最佳化Kozak、將ELOVL2連接至GFP報導基因之P2A序列、wpre元件及人類生長激素polyA尾於AAV8衣殼中。
將視網膜色素上皮細胞(來自ATCC之ARPE19)以每孔3x10 5個細胞接種於6孔盤內。第二天，使用2.5 µg各質體(ELOVL2 WT及密碼子變體)及Lipofectamine3000以250 µl總體積藉由逐滴方式轉染各孔。在37℃及5% CO 2下培養八小時後更換培養基。然後容許該等細胞在37℃及5% CO 2下靜置另外48小時。轉染後48小時，將細胞胰蛋白酶化，於1X PBS中清洗，固定30 min並重懸浮於流量500 µl緩衝液中。第二天，該等細胞藉由流式細胞術於LSRII儀器(BD Biosciences)上分析。量測GFP表現百分比及平均螢光強度(MFI)並將其用以確定相對表現量。 實例 2
在此實驗中，如圖1中顯示，用ELOVL2表現構築體、野生型、密碼子變體1 (CV1)作為微環及質體，及密碼子變體4 (CV4)轉染ARPE19細胞。此等構築體均使用人類EF1a啟動子來驅動表現。觀測到改變密碼子以最佳化於視網膜中之表現可顯示不同之活體外表現量。微環中之CV1 (SEQ ID NO: 2)變體的表現為野生型之1.61X。CV1質體的表現為野生型之1.33X。質體中之CV4 (SEQ ID NO: 3)變體的表現為野生型之1.82X。此實驗證實密碼子最佳化導致比野生型更好之表現。
圖2顯示其中將經使用EF1a啟動子的ELOVL2表現構築體轉染之ARPE19細胞與使用CMV啟動子之構築體進行比較之另一實驗的結果。此實驗證實在轉染後48小時，具有CMV啟動子之構築體具有增加之表現。具體言之，EF1a-CV1的表現為野生型之2.09X，EF1a-CV4的表現為野生型之2.39X及CMV-CV1的表現為野生型之3.10X。
圖3顯示在經上文提及之ELOVL2表現構築體轉染之ARPE19細胞中發現之一組GFP表現之顯微鏡影像。相較於彼等使用EF1a啟動子者，CMV-CV1構築體中GFP表現最高。如圖3中顯示，明顯可偵測到表現CMV啟動子構築體之細胞產生高得多的表現。此在如圖4中顯示之ELOVL2西方墨點法中經進一步證明。
圖4係闡述經ELOVL2表現構築體轉染之ARPE19細胞之西方墨點法。該等表現構築體包括ELOVL2野生型(ARPE19-WT)、ELOVL2剔除(ELOVL2-KO)、EF1a啟動子之ELOVL2野生型(EF1a-WT)、結合至EF1a啟動子之ELOVL2密碼子變體1 (SEQ ID NO: 2) (EF1a-CV1)、結合至EF1a啟動子之ELOVL2密碼子變體4 (SEQ ID NO: 3) (EF1a-CV4)、結合至CMV啟動子之ELOVL2密碼子變體1 (SEQ ID NO: 2) (CMV-CV1)、結合至CMV啟動子之ELOVL2密碼子變體4 (SEQ ID NO: 3) (CMV-CV4)及結合至具有三聯體前導序列之CMV啟動子之ELOVL2密碼子變體4 (SEQ ID NO: 3) (CMV-T-CV4)。如顯示，CMV構築體之表現高於使用EF1a啟動子。在該等CMV構築體中，對應於結合至具有三聯體前導序列之CMV啟動子之ELOVL2密碼子變體4 (CMV-T-CV4)的泳道8似乎具有最高表現。
圖5係闡述經AAV8-CMVT-CV4載體轉導之ARPE19細胞中ELOVL2表現之劑量反應的條形圖。該等細胞係經1x10 9、1x10 10或1x10 11個病毒基因體轉導。如顯示，1x10 9之劑量導致4750 MFI。1x10 10之劑量導致12469 MFI及1x1011之劑量導致25159 MFI。
圖6係闡述經ELOVL2表現構築體轉染之ARPE19細胞中ELOVL2蛋白之表現的條形圖。第一表現構築體係添加腺病毒三聯體前導序列(CMVT-CV4)。第二構築體係添加人類因子IX內含子(CMVTX-CV4)，第三構築體係具有腺病毒三聯體前導序列及人類ELOVL2強化子序列(CMVT-HR-CV4)兩者及第四構築體係CMV強化子、雞β-肌動蛋白啟動子及兔β-球蛋白迷你內含子(CAG-CV4)。
圖7係闡述當相較於野生型ARPE19細胞(WT-6E3)時，ELOVL2剔除細胞系(δ3)具有顯著生長缺陷之線圖。第3天，相較於生長率為2之δ3剔除細胞系，該等WT-6E3細胞係以4.2之相對生長率生長。 實例 3
在此實例中，表現ELOVL2/GFP之AAV及微環載體作為視網膜下注射劑投與。將治療投與時12個月齡之C57BL/6JRj雄性小鼠(Janvier, France)圈養在個別通風之籠子中，及籠子中具有白楊墊料、築巢材料(歐洲山楊(Populus tremula)，Tapvei® Estonia OÜ, Estonia)及聚碳酸酯冰屋(Datesand group, USA)作為富集物，在恆溫(22 ± 1℃)，相對濕度(50±10%)下及於光控環境(自7 am至7 pm開燈)中，及可隨意獲取食物(大鼠/小鼠維持V1535-000，ssniff Spezialdiäten GmbH, Germany)及自來水。在動物飼養所中進行至少一週隔離及馴化後開始實驗。
所有動物均根據關於在眼科及視力研究中使用動物之ARVO聲明、歐洲議會及理事會關於保護用於科學目的之動物之EC指令2010/63/EU及使用芬蘭動物實驗委員會批准及監測之協議(實驗有限公司(Experimentica Ltd.)動物許可證編號ESAVI-10750-2020)進行治療。
針對所有程序，皮下注射含有氯胺酮(30 mg/Kg) (Ketaminol Vet 50 mg/mL. Intervet, Germany)及美托咪定(0.4 mg/kg) (Cepetor Vet 1 mg/mL. Vetmedic, Finland)之混合物以麻醉動物。由美托咪定之α2-拮抗劑(2.5 mg/kg) (Revertor Vet 5 mg/mL；Vetmedic)逆轉麻醉。
如圖8中顯示，組1及2給藥AAV/ELOVL2/GFP構築體作為視網膜下注射劑，而組3及4分別給藥微環/ELOVL2/GFP構築體作為視網膜下及玻璃體內注射劑。針對各組，該組中一半動物係經雙側投與測試載體，而另一半於OD眼中接受該測試載體且該OS眼係用具有GFP之對照載體治療。
為進行注射，將經麻醉之動物放置於立體鏡(Leica Microsystems)下，並在角膜上施加一滴碘且容許其均勻分佈(微量聚維酮碘5%，Bausch & Lomb, Canada)。在結膜/鞏膜之顳側用30G針頭形成一個小切口以曝露脈絡膜。使用相同針頭以於該脈絡膜之顳側中產生一個小開口。將該角膜刺破以降低眼內壓。對微量注射器(Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Switzerland)填充AAV/微環之1 µl溶液並通過曝露之脈絡膜將病毒載體引入視網膜下空間內。
將溶液注入視網膜下空間內，歷時10秒。針頭在移除前於原位保持另外30秒。使用活體內SD-OCT成像(Bioptigen Envisu R2210. Bioptigen Inc./Leica Microsystems, Morrisville, NC, USA)確認成功注射。注射後施加氯黴素軟膏(Oftan Chlora, Santen Oy, Finland)。針對各治療組，一半動物係經雙側投與測試載體，而另一半於OD眼中接受測試化合物且該OS係用對照GFP載體治療，如圖8中顯示。
使用OE、FAF在第0、1、3、7、14、21及28天，及用SD-OCT在第0、3及28天監測眼睛。
對如上文描述經麻醉之小鼠進行宏觀眼科檢查，且其等接受一滴0.5%托品醯胺(Oftan Tropicamid, Santen Oy, Finland)以擴張瞳孔。將該等小鼠放置於裂隙燈(SL9900 Elite 5X-D. CSO srl, Italy)上，並檢查該等動物之雙眼。
使用Heidelberg Spectralis HRA2系統(Heidelberg Engineering, Germany)檢查GFP AAV/微環-載體對視網膜之轉導。簡而言之，在經麻醉之小鼠之角膜上投與一滴0.5%托品醯胺(Oftan Tropicamid. Santen Oy)以擴張瞳孔，並將該小鼠放置於小鼠支架上。在視網膜水平對準視神經頭後，使用紅外反射相機，將拍攝螢光影像，顯示該視網膜水平下之所有轉導區域。
藉由麻醉過量殺死小鼠，並經心臟灌注0.9% NaCl溶液(120S/DV手動控制變速泵，Watson-Marlow Pumps, UK)。摘除眼睛並製備視網膜平鋪片(flat-mount)。
使用螢光顯微鏡(MST69. Leica Microsystems, Germany)取得新鮮切除之全眼平鋪片影像。
圖9中可見此研究之代表性結果，圖9顯示相較於接受包含與GFP連接之ELOVL2基因之AAV或微環載體給藥之小鼠中的高螢光度，對照動物(PBS)中很少或無螢光。由於GFP及ELOVL2基因轉錄於微環及AAV載體中直接連接，因此由GFP表現產生之螢光係ELOVL2表現之直接替代物。 實例 4
在此實例中，探討該表現ELOVL2蛋白(AAV8-HRCMVT-CV4)之AAV載體基因療法在作為黃斑變性模型顯示隨年齡增長而逐漸減弱之眼部活動之衰老小鼠中之效用。在此研究中，以含在緩衝劑中之AAV8-HRCMVT-CV4載體進行單劑視網膜下注射，依下列低、中或高劑量投藥至12個月齡之C57BL/6JRj小鼠(Janvier, France)之右眼：低劑量(5 X 10E 7vg/眼)、中劑量(2 X 10E 8vg/眼)及高劑量(8 X 10E 8vg/眼)。另外，作為對照，用媒介物治療各小鼠之左眼。在投與後2週及12週，進行光譜域光學同調斷層掃描SD-OCT，以評估視網膜結構(變性)，連同閃光視網膜電圖(fERG)一起評估視網膜功能。
針對此研究，在治療投與時為12個月齡之C57BL/6JRj雄性小鼠係圈養在個別通風之籠子中，及籠子中具有白楊木墊料、巢套材料及聚碳酸酯保冰桶，在恆溫(22 ± 1℃)，相對濕度(50±10%)下及於光控環境(自7 am至7 pm開燈)中，且可隨意獲取食物及自來水。在動物飼養所中進行至少一週隔離及馴化後開始實驗。
將經麻醉之動物放置於立體顯微鏡下，並在角膜上施加一滴碘且容許其均勻分佈。在結膜/鞏膜之顳側用30G針頭形成一個小切口以曝露脈絡膜。使用相同針頭以於該脈絡膜之顳側中產生一個小開口。將該角膜刺破以降低眼內壓。
對微量注射器填充1 µl PBS或含有AAV8-HRCVMT-CV4之PBS並通過曝露之脈絡膜引入視網膜下空間內。將治療劑注入該視網膜下空間內，歷時10秒，且該針頭在移除前原位保持另外30秒。使用活體內SD-OCT成像確認成功注射。注射後施加氯黴素軟膏。右眼(OD)中投與於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之AAV8-HRCMVT-CV4，而左眼(OS)僅注射PBS (媒介物)。
光譜域光學同調斷層掃描 (SD-OCT) 。使用Envisu R2200 SD-OCT系統(Bioptigen Inc./Leica Microsystems)經由視網膜掃描評估經麻醉之小鼠。掃描區域覆蓋以視神經為中心的1.4 x 1.4 mm 2視網膜。各掃描由100個B掃描組成，各B掃描由1000個A掃描組成。
閃光視網膜電圖 (fERG) 。使用閃光視網膜電圖(fERG)雙側定量視網膜功能。針對暗視fERG量測，使動物過夜適應黑暗。ERG之所有準備均在昏暗之紅光下進行。如上文描述將小鼠麻醉並固定於Celeris ERG系統(Diagnosys LLC)之加熱墊表面上。藉由施加一滴0.5%托品醯胺(Oftan Tropicamid. Santen Oy)歷時3 min，接著一滴10%脫羥腎上腺素鹽酸鹽(Oftan Metaoksedrin. Santen Oy)歷時另外3 min，使瞳孔完全擴張。在fERG記錄期間，使用生理鹽水潤滑眼睛。用鹽水潤滑亦確保角膜與光導電極之間的電接觸。
在1.0 cd.s/m2光強度下測試fERG。將反應連續記錄六次並平均化且用以識別a波及b波兩者之振幅(以µV計)及延遲(以ms計)。
圖10A闡述12週fERG a波之振幅及圖10B闡述多種治療組的作為第2週反應之百分比之a波延遲期。相較於媒介物，高劑量及中劑量組兩者中a波之振幅均存在降低。相比之下，相較於其他治療組(包括媒介物)，低劑量AAV8-HRCMVT-CV4維持fERG a波之較大振幅。在治療組中，a波延遲無有意義之變化。由於fERG之a波反映光感受器之功能，因此此等結果表明用低劑量表現ELOVL2之AAV8-HRCMVT-CV4治療改善光感受器功能。圖10A及圖10B資料呈現為自基線之變化，該變化為來自中劑量之11隻眼、來自高劑量之12隻小鼠、來自低劑量之14隻小鼠，及來自媒介物組之37隻眼之平均值± SEM。
圖11A闡述12週fERG b波之振幅及圖11B闡述作為第2週反應之百分比之b波延遲。類似於針對a波觀測到之反應，相較於高劑量及中劑量組兩者之媒介物，b波之振幅降低。然而，類似於針對a波觀測到者，相對於媒介物，低劑量組之b波之振幅增加。另外，低劑量組(圖B)之b波反應延遲亦縮短(改善)。反應延遲縮短及振幅增加證實低劑量AAV8-HRCMVT-CV4改善視網膜功能。圖11A及圖11B資料呈現為絕對值，該絕對值為來自中劑量之11隻眼、來自高劑量之12隻小鼠、來自低劑量之14隻小鼠，及來自媒介物組之37隻眼之平均值± SEM。
圖12闡述如藉由SD-OCT量測在12週研究期內多種治療組之內(圖A)及外(圖B)視網膜層之厚度及總厚度(圖C)之變化。針對所有治療組均觀測到內及外視網膜層及全視網膜兩者變薄，可能由於衰老相關之細胞損失。然而，在低劑量治療組中針對內及外層及全視網膜兩者觀測到最少量之變薄。SD-OCT非常適合評估視網膜結構及疾病相關之退化。此等資料證實用低劑量AAV8-HRCMVT-CV4治療防止年齡相關性視網膜組織損失。圖12資料呈現為來自中劑量之11隻眼、來自高劑量之12隻小鼠、來自低劑量之14隻小鼠，及來自媒介物組之37隻眼之平均值± SD。 序列表 SEQ ID NO: 1 ：ELOVL2野生型(RefSeq_NM017770) ATGGAACATCTAAAGGCCTTTGATGATGAAATCAATGCTTTTTTGGACAATATGTTTGGACCGCGAGATTCTCGAGTCAGAGGGTGGTTCATGTTGGACTCTTACCTTCCTACCTTTTTTCTTACTGTCATGTATCTGCTCTCAATATGGCTGGGTAACAAGTATATGAAGAACAGACCTGCTCTTTCTCTCAGGGGTATCCTCACCTTGTATAATCTTGGAATCACACTTCTCTCCGCGTACATGCTGGCAGAGCTCATTCTCTCCACTTGGGAAGGAGGCTACAACTTACAGTGTCAAGATCTTACCAGCGCAGGGGAAGCTGACATCCGGGTAGCCAAGGTGCTTTGGTGGTACTATTTCTCCAAATCAGTAGAGTTCCTGGACACAATTTTCTTCGTTTTGCGGAAAAAAACGAGTCAGATTACTTTTCTTCATGTATATCATCATGCTTCTATGTTTAACATCTGGTGGTGTGTCTTGAACTGGATACCTTGTGGACAAAGTTTCTTTGGACCAACACTGAACAGTTTTATCCACATTCTTATGTACTCCTACTATGGACTTTCTGTGTTTCCATCTATGCACAAGTATCTTTGGTGGAAGAAATATCTCACACAGGCTCAGCTGGTGCAGTTCGTGCTCACCATCACGCACACCATGAGCGCCGTCGTGAAACCGTGTGGCTTCCCCTTCGGTTGTCTCATCTTCCAGTCATCTTATATGCTAACGTTAGTCATCCTCTTCTTAAATTTTTACGTTCAGACATACCGAAAAAAGCCAATGAAGAAAGATATGCAAGAGCCACCTGCAGGGAAAGAAGTGAAGAATGGTTTTTCCAAAGCCTACTTCACTGCAGCAAATGGAGTGATGAACAAGAAAGCACAA SEQ ID NO: 2 ：密碼子變體1 (CV1) ATGGAACACCTGAAGGCCTTCGACGACGAGATCAACGCCTTTCTGGACAACATGTTCGGCCCCAGAGATTCTAGAGTGCGGGGCTGGTTCATGCTGGATAGCTACCTGCCTACATTCTTCCTGACCGTGATGTACCTGCTGAGCATCTGGCTGGGCAACAAGTACATGAAAAACAGACCTGCCCTGAGCCTGAGAGGCATCCTGACCCTGTACAACCTGGGAATTACACTGCTGAGCGCCTACATGCTGGCCGAGCTGATCCTGTCAACATGGGAGGGCGGCTACAACCTGCAGTGCCAGGACCTGACCTCCGCCGGCGAGGCCGACATCAGAGTGGCCAAGGTGCTGTGGTGGTACTACTTCAGCAAAAGCGTGGAATTCCTGGACACCATCTTCTTCGTGCTGCGGAAGAAGACCAGCCAGATCACCTTCCTGCACGTGTACCACCACGCCAGCATGTTCAACATCTGGTGGTGCGTGCTGAATTGGATCCCCTGCGGCCAGTCTTTTTTTGGACCTACCCTTAATAGCTTCATCCACATCCTGATGTACTCTTATTACGGCCTGTCTGTTTTCCCATCTATGCACAAGTACCTGTGGTGGAAGAAATACCTGACACAGGCCCAGCTGGTCCAGTTCGTGCTCACAATCACCCACACCATGAGCGCCGTGGTGAAGCCTTGTGGCTTTCCATTCGGTTGTCTGATCTTTCAGAGCAGCTACATGCTGACACTGGTGATCCTGTTCCTGAACTTCTACGTGCAGACCTACAGAAAGAAGCCCATGAAAAAGGACATGCAGGAGCCTCCTGCTGGCAAGGAAGTGAAGAACGGCTTCAGCAAGGCTTATTTCACCGCCGCCAACGGAGTGATGAACAAGAAGGCACAG SEQ ID NO: 3 ：密碼子變體4 (CV4) ATGGAACACCTGAAGGCATTCGACGACGAGATCAACGCCTTCCTGGATAACATGTTCGGACCTAGAGATAGCAGAGTGCGGGGCTGGTTCATGCTGGACAGCTACCTGCCTACCTTCTTCCTGACAGTGATGTACCTGCTGTCTATCTGGCTGGGCAACAAGTACATGAAAAATAGACCTGCCCTGAGCCTGCGGGGCATCCTCACACTGTACAACCTGGGAATCACCCTGCTGAGCGCCTACATGCTGGCCGAGCTGATCCTGTCAACATGGGAGGGCGGCTACAACCTGCAGTGCCAGGACCTGACCTCTGCCGGCGAGGCCGACATCAGAGTGGCCAAGGTGCTGTGGTGGTACTACTTTTCTAAGAGCGTGGAATTCCTGGACACCATCTTCTTCGTGCTGAGAAAGAAGACCAGCCAGATCACATTCCTGCACGTGTACCACCACGCCAGCATGTTCAACATCTGGTGGTGCGTGCTGAACTGGATCCCCTGCGGCCAGAGCTTTTTCGGCCCTACACTGAACAGCTTCATCCACATCCTGATGTACAGCTATTACGGCCTGAGCGTGTTCCCCAGCATGCACAAGTACCTGTGGTGGAAGAAATACCTGACACAGGCCCAGCTGGTGCAATTTGTGCTGACCATCACCCACACCATGAGCGCCGTGGTGAAACCTTGTGGATTTCCATTCGGCTGCCTGATTTTCCAGTCTAGCTACATGCTGACCCTGGTCATCCTGTTCCTCAACTTCTACGTGCAGACCTACCGGAAGAAGCCCATGAAGAAGGACATGCAGGAGCCTCCTGCTGGCAAGGAAGTGAAGAACGGCTTCAGCAAGGCTTATTTCACCGCCGCTAATGGCGTGATGAACAAGAAAGCCCAG SEQ ID NO: 4 ：巨細胞病毒啟動子(CMV) CTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAAT SEQ ID NO: 5 ：腺病毒三聯體前導序列(ATL) ACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAG SEQ ID NO: 6 ：合成內含子 GTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAG SEQ ID NO: 7 ：人類ELOVL2強化子 TTGTTTTACTTTTGTTTCTGCCCTTCTTCCACTGTGACTAAATTTTTGCAATATAGAAATAATACGGGCTTTGTGACCTTTAGCGTTTTCTTAGCTCTACAAATGTTGGAAAATGGATTTTGAACCTTAGCAAACAAGCTGAAACAGTTTAAACATTTGTTTGTGGGTGCAGCAATGGAAGAAAGACTTCATTGGCATTTGTTATGATGGTGAGTACATTTGTGAGATTAACATTCTTTGCTCAAGACTGAGAGGCCTCTGGTCAGCCGCCCCCATTCTAAAGCAACACAGATCATATTCTGTCACACTGAGATCTCAGGTAACTGACCTTTCTCACATCG SEQ ID NO: 8 ：人類伸長因子1啟動子(EF1) ATCGATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTGT SEQ ID NO: 9 ：P2A CGCGCGAAGCGATCAGGCAGCGGGGCGACAAATTTCAGCCTTCTGAAACAAGCAGGCGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCA SEQ ID NO: 10 ：GFP ATGGTGTCCAAGGGCGAGGAACTGTTCACCGGCGTGGTGCCAATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGATGTGAATGGCCACAAGTTTTCTGTGTCTGGCGAAGGCGAGGGAGATGCCACATACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACAGGAAAGTTGCCTGTGCCCTGGCCTACCCTGGTGACCACCCTCACCTACGGCGTTCAGTGCTTCAGCAGATACCCCGATCACATGAAACAGCACGACTTTTTCAAGTCCGCCATGCCTGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCATCTTCTTCAAAGACGACGGCAACTACAAGACAAGAGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTTGTGAACAGAATCGAGCTGAAAGGCATCGACTTCAAGGAAGATGGAAATATCCTGGGCCACAAGCTGGAATACAACTACAACAGCCACAACGTGTACATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCAGACACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTGGCCGATCACTACCAGCAGAACACCCCTATCGGCGACGGCCCTGTGCTGCTGCCTGACAACCACTACCTGAGCACACAGAGCGCCCTGTCTAAGGACCCCAACGAGAAGAGAGATCACATGGTCCTGCTGGAATTCGTGACAGCCGCTGGCATAACACTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAGCGGCCTGAGAAGCCGGGCCCAGGCCAGCAACAGCGCCGTGGACGGTACAGCCGGCCCCGGCTCTACCGGCAGCAGATAG SEQ ID NO: 11 ：WPRE TCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTC SEQ ID NO: 12 ：人類生長激素polyA CTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCCCAAGTTGGGAAGAAACCTGTAGGGCCTGCG SEQ ID NO: 13 ：AAV8-CMVT-CV4-GFP GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACGGATCTTTACAAATTCAAGCCAGGTGATTTCAACAAATTTTGCTGACGATTTAGGCGCACTATCCCCTAAACTACAAATTAGAAAATAGCGTTCCTTGACACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATAAGCTTTCTCAGGGGAGATCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGTTTAAACGCCGCCACCATGGAACACCTGAAGGCATTCGACGACGAGATCAACGCCTTCCTGGATAACATGTTCGGACCTAGAGATAGCAGAGTGCGGGGCTGGTTCATGCTGGACAGCTACCTGCCTACCTTCTTCCTGACAGTGATGTACCTGCTGTCTATCTGGCTGGGCAACAAGTACATGAAAAATAGACCTGCCCTGAGCCTGCGGGGCATCCTCACACTGTACAACCTGGGAATCACCCTGCTGAGCGCCTACATGCTGGCCGAGCTGATCCTGTCAACATGGGAGGGCGGCTACAACCTGCAGTGCCAGGACCTGACCTCTGCCGGCGAGGCCGACATCAGAGTGGCCAAGGTGCTGTGGTGGTACTACTTTTCTAAGAGCGTGGAATTCCTGGACACCATCTTCTTCGTGCTGAGAAAGAAGACCAGCCAGATCACATTCCTGCACGTGTACCACCACGCCAGCATGTTCAACATCTGGTGGTGCGTGCTGAACTGGATCCCCTGCGGCCAGAGCTTTTTCGGCCCTACACTGAACAGCTTCATCCACATCCTGATGTACAGCTATTACGGCCTGAGCGTGTTCCCCAGCATGCACAAGTACCTGTGGTGGAAGAAATACCTGACACAGGCCCAGCTGGTGCAATTTGTGCTGACCATCACCCACACCATGAGCGCCGTGGTGAAACCTTGTGGATTTCCATTCGGCTGCCTGATTTTCCAGTCTAGCTACATGCTGACCCTGGTCATCCTGTTCCTCAACTTCTACGTGCAGACCTACCGGAAGAAGCCCATGAAGAAGGACATGCAGGAGCCTCCTGCTGGCAAGGAAGTGAAGAACGGCTTCAGCAAGGCTTATTTCACCGCCGCTAATGGCGTGATGAACAAGAAAGCCCAGCGCGCGAAGCGATCAGGCAGCGGGGCGACAAATTTCAGCCTTCTGAAACAAGCAGGCGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCAATGGTGTCCAAGGGCGAGGAACTGTTCACCGGCGTGGTGCCAATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGATGTGAATGGCCACAAGTTTTCTGTGTCTGGCGAAGGCGAGGGAGATGCCACATACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACAGGAAAGTTGCCTGTGCCCTGGCCTACCCTGGTGACCACCCTCACCTACGGCGTTCAGTGCTTCAGCAGATACCCCGATCACATGAAACAGCACGACTTTTTCAAGTCCGCCATGCCTGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCATCTTCTTCAAAGACGACGGCAACTACAAGACAAGAGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTTGTGAACAGAATCGAGCTGAAAGGCATCGACTTCAAGGAAGATGGAAATATCCTGGGCCACAAGCTGGAATACAACTACAACAGCCACAACGTGTACATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCAGACACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTGGCCGATCACTACCAGCAGAACACCCCTATCGGCGACGGCCCTGTGCTGCTGCCTGACAACCACTACCTGAGCACACAGAGCGCCCTGTCTAAGGACCCCAACGAGAAGAGAGATCACATGGTCCTGCTGGAATTCGTGACAGCCGCTGGCATAACACTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAGCGGCCTGAGAAGCCGGGCCCAGGCCAGCAACAGCGCCGTGGACGGTACAGCCGGCCCCGGCTCTACCGGCAGCAGATAGTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCCCAAGTTGGGAAGAAACCTGTAGGGCCTGCGAGCGCTGGCTAGAATTACCTACCGGCCTCCACCATACCTTCGATATTCGCGCCCACTCTCCCATTAATCCGCACAAGTGGATGTGATGCGATTGCCCGCTAAGATAGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC SEQ ID NO: 14 ：微環CMVT-CV4-GFP 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MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRFLTRNL 序列ID 22 AAV8-Y447F+Y733F衣殼 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYFLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRFLTRNL
除本文描述之特徵外，另外特徵及變化將容易自下列圖式及例示性實施例之描述顯而易見。應瞭解此等圖式繪示典型實施例，且無意限制範圍。
圖1係藉由量測平均螢光強度(MFI)闡述構築體中與綠色螢光蛋白(GFP)連接之ELOVL2蛋白(「ELOVL2/GFP」)於ARPE19細胞中之表現的條形圖。用不同之ELOVL2/GFP表現構築體轉染細胞，不同之ELOVL2/GFP表現構築體包括野生型(wt) -SEQ ID NO. 1、密碼子變體1質體(CV1) - SEQ ID NO. 2、密碼子變體1微環(CV1MC)，及密碼子變體4 (CV4) - SEQ ID NO. 3。此等構築體均使用人類EF1a啟動子來表現ELOVL2基因。
圖2係闡述經使用EF1a啟動子與CMV啟動子(CMV-CV1)相比的ELOVL2/GFP表現構築體轉染之ARPE19細胞中轉染後48小時ELOVL2/GFP蛋白之表現的條形圖。
圖3係闡述與圖2中相同之經ELOVL2/GFP表現構築體轉染之ARPE19細胞之影像。相較於使用EF1a啟動子的構築體，CMV-CV1構築體中ELOVL2/GFP表現最高。
圖4係闡述經ELOVL2表現構築體轉染之ARPE19細胞之西方墨點法。該等表現構築體包括ELOVL2野生型(ARPE19-WT)、ELOVL2剔除(knock-out)(ELOVL2-KO)、EF1a啟動子之ELOVL2野生型(EF1a-WT)、結合至EF1a啟動子之ELOVL2密碼子變體1 (SEQ ID NO: 2) (EF1a-CV1)、結合至EF1a啟動子之ELOVL2密碼子變體4 (SEQ ID NO: 3) (EF1a-CV4)、結合至CMV啟動子之ELOVL2密碼子變體1 (SEQ ID NO: 2) (CMV-CV1)、結合至CMV啟動子之ELOVL2密碼子變體4 (SEQ ID NO: 3) (CMV-CV4)，及結合至CMV啟動子之ELOVL2密碼子變體4 (SEQ ID NO: 3) (CMVT-CV4)及結合至具有三聯體前導序列之CMV啟動子之ELOVL2密碼子變體4 (SEQ ID NO: 3)。
圖5係闡述經AAV8-CMVT-CV4載體轉導之ARPE19細胞中ELOVL2表現之劑量反應之條形圖。該等細胞用1x10 9、1x10 10或1x10 11個病毒基因體轉導。
圖6係闡述經ELOVL2表現構築體轉染之ARPE19細胞中ELOVL2蛋白之表現之條形圖。第一表現構築體係添加腺病毒三聯體前導序列(CMVT-CV4)。第二構築體係添加人類因子IX內含子(CMVTX-CV4)，第三構築體係具有腺病毒三聯體前導序列及人類ELOVL2強化子序列(CMVT-HR-CV4)兩者及第四構築體係CMV強化子、雞β-肌動蛋白啟動子及兔β-球蛋白迷你內含子(CAG-CV4)。
圖7係闡述當相較於野生型ARPE19細胞(WT-6E3)時，ELOVL2剔除細胞系(δ3)具有顯著生長缺陷之線圖。
圖8係顯示根據一項實施例注射表現ELOVL2/GFP之AAV或微環載體之四組小鼠之投與時間表的示意圖。
圖9係闡述對12個月齡C57BL/6JRj小鼠投與AAV8-CMVT-CV4-GFP (劑量：2E10 vg/眼，視網膜下)、微環CMVT-CV4-GFP (劑量：2 µl 1 µg/µl，玻璃體內)及注射對照之影像。在投與後第14天，使用Heidelberg Spectralis HRA2系統(Heidelberg Engineering, Germany)進行之眼底自體螢光成像顯示相較於接受對照注射之小鼠，經治療之小鼠中具有顯著螢光。發現螢光強度與GPF/ELOVL2基因表現呈正比例。
圖10A係闡述藉由fERG以相對於基線水準的cd.s/m 2亮度a波振幅分析之視網膜功能之條形圖。
圖10B係闡述藉由fERG以相對於基線水準的cd.s/m 2亮度a波延遲分析之視網膜功能之條形圖。
圖11A係闡述藉由fERG以相對於基線水準的cd.s/m 2亮度b波振幅分析之視網膜功能之條形圖。
圖11B係闡述藉由fERG以相對於基線水準的cd.s/m 2亮度b波延遲分析之視網膜功能之條形圖。
圖12係闡述A)內、B)外及C)全視網膜之視網膜厚度之線圖。
 

          <![CDATA[<110> 美商維斯基因股份有限公司(VISGENX, INC.)]]>
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          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 腺病毒]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          ttgttttact tttgtttctg cccttcttcc actgtgacta aatttttgca atatagaaat 60
          aatacgggct ttgtgacctt tagcgttttc ttagctctac aaatgttgga aaatggattt 120
          tgaaccttag caaacaagct gaaacagttt aaacatttgt ttgtgggtgc agcaatggaa 180
          gaaagacttc attggcattt gttatgatgg tgagtacatt tgtgagatta acattctttg 240
          ctcaagactg agaggcctct ggtcagccgc ccccattcta aagcaacaca gatcatattc 300
          tgtcacactg agatctcagg taactgacct ttctcacatc g                     341
          <![CDATA[<210> 8]]>
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          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 腺病毒]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          atcgattggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa 60
          gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg 120
          ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat 180
          aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacaggt 240
          gt                                                                242
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          <![CDATA[<213> 腺病毒]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          cgcgcgaagc gatcaggcag cggggcgaca aatttcagcc ttctgaaaca agcaggcgac 60
          gtggaagaaa accccggtcc a                                           81
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          <![CDATA[<213> 腺病毒]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          atggtgtcca agggcgagga actgttcacc ggcgtggtgc caatcctggt cgagctggac 60
          ggcgatgtga atggccacaa gttttctgtg tctggcgaag gcgagggaga tgccacatac 120
          ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc acaggaaagt tgcctgtgcc ctggcctacc 180
          ctggtgacca ccctcaccta cggcgttcag tgcttcagca gataccccga tcacatgaaa 240
          cagcacgact ttttcaagtc cgccatgcct gagggctacg tgcaggagcg gaccatcttc 300
          ttcaaagacg acggcaacta caagacaaga gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctt 360
          gtgaacagaa tcgagctgaa aggcatcgac ttcaaggaag atggaaatat cctgggccac 420
          aagctggaat acaactacaa cagccacaac gtgtacatca tggccgacaa gcagaagaac 480
          ggcatcaagg tgaacttcaa gatcagacac aacatcgagg acggcagcgt gcagctggcc 540
          gatcactacc agcagaacac ccctatcggc gacggccctg tgctgctgcc tgacaaccac 600
          tacctgagca cacagagcgc cctgtctaag gaccccaacg agaagagaga tcacatggtc 660
          ctgctggaat tcgtgacagc cgctggcata acactcggca tggacgagct gtacaagagc 720
          ggcctgagaa gccgggccca ggccagcaac agcgccgtgg acggtacagc cggccccggc 780
          tctaccggca gcagatag                                               798
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          <![CDATA[<400> 11]]>
          tcctgttaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactgata ttcttaacta 60
          tgttgctcct tttacgctgt gtggatatgc tgctttaatg cctctgtatc atgctattgc 120
          ttcccgtacg gctttcgttt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga 180
          ggagttgtgg cccgttgtcc gtcaacgtgg cgtggtgtgc tctgtgtttg ctgacgcaac 240
          ccccactggc tggggcattg ccaccacctg tcaactcctt tctgggactt tcgctttccc 300
          cctccctatc gccacggcag aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc 360
          taggttgctg ggcactgata attccgtggt gttgtcgggg aagctgacgt c          411
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          ctgcccgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc 60
          actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag 120
          gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcccaagttg 180
          ggaagaaacc tgtagggcct gcg                                         203
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          <![CDATA[<400> 13]]>
          gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
          tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
          gggttccttg tagttaatga ttaacggatc tttacaaatt caagccaggt gatttcaaca 180
          aattttgctg acgatttagg cgcactatcc cctaaactac aaattagaaa atagcgttcc 240
          ttgacactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 300
          agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 360
          gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 420
          gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 480
          atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 540
          cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 600
          ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 660
          cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 720
          atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 780
          ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctctctg gctaactaga gaacccactg 840
          cttactggct tatcgaaata agctttctca ggggagatct cgtttagtga accgtcagat 900
          cctcactctc ttccgcatcg ctgtctgcga gggccagctg ttgggctcgc ggttgaggac 960
          aaactcttcg cggtctttcc agtactcttg gatcggaaac ccgtcggcct ccgaacggta 1020
          ctccgccacc gagggacctg agcgagtccg catcgaccgg atcggaaaac ctctcgagaa 1080
          aggcgtctaa ccagtcacag tcgcaaggta ggctgagcac cgtggcgggc ggcagcgggt 1140
          ggcggtcggg gttgtttctg gcggaggtgc tgctgatgat gtaattaaag taggcggtct 1200
          tgagacggcg gatggtcgag gtgaggtgtg gcaggcttga gatccagctg ttggggtgag 1260
          tactccctct caaaagcggg cattacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag 1320
          gaggatttga tattcacctg gcccgatctg gccatacact tgagtgacaa tgacatccac 1380
          tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc caggtccaag tttaaacgcc gccaccatgg 1440
          aacacctgaa ggcattcgac gacgagatca acgccttcct ggataacatg ttcggaccta 1500
          gagatagcag agtgcggggc tggttcatgc tggacagcta cctgcctacc ttcttcctga 1560
          cagtgatgta cctgctgtct atctggctgg gcaacaagta catgaaaaat agacctgccc 1620
          tgagcctgcg gggcatcctc acactgtaca acctgggaat caccctgctg agcgcctaca 1680
          tgctggccga gctgatcctg tcaacatggg agggcggcta caacctgcag tgccaggacc 1740
          tgacctctgc cggcgaggcc gacatcagag tggccaaggt gctgtggtgg tactactttt 1800
          ctaagagcgt ggaattcctg gacaccatct tcttcgtgct gagaaagaag accagccaga 1860
          tcacattcct gcacgtgtac caccacgcca gcatgttcaa catctggtgg tgcgtgctga 1920
          actggatccc ctgcggccag agctttttcg gccctacact gaacagcttc atccacatcc 1980
          tgatgtacag ctattacggc ctgagcgtgt tccccagcat gcacaagtac ctgtggtgga 2040
          agaaatacct gacacaggcc cagctggtgc aatttgtgct gaccatcacc cacaccatga 2100
          gcgccgtggt gaaaccttgt ggatttccat tcggctgcct gattttccag tctagctaca 2160
          tgctgaccct ggtcatcctg ttcctcaact tctacgtgca gacctaccgg aagaagccca 2220
          tgaagaagga catgcaggag cctcctgctg gcaaggaagt gaagaacggc ttcagcaagg 2280
          cttatttcac cgccgctaat ggcgtgatga acaagaaagc ccagcgcgcg aagcgatcag 2340
          gcagcggggc gacaaatttc agccttctga aacaagcagg cgacgtggaa gaaaaccccg 2400
          gtccaatggt gtccaagggc gaggaactgt tcaccggcgt ggtgccaatc ctggtcgagc 2460
          tggacggcga tgtgaatggc cacaagtttt ctgtgtctgg cgaaggcgag ggagatgcca 2520
          catacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccacagg aaagttgcct gtgccctggc 2580
          ctaccctggt gaccaccctc acctacggcg ttcagtgctt cagcagatac cccgatcaca 2640
          tgaaacagca cgactttttc aagtccgcca tgcctgaggg ctacgtgcag gagcggacca 2700
          tcttcttcaa agacgacggc aactacaaga caagagccga ggtgaagttc gagggcgaca 2760
          cccttgtgaa cagaatcgag ctgaaaggca tcgacttcaa ggaagatgga aatatcctgg 2820
          gccacaagct ggaatacaac tacaacagcc acaacgtgta catcatggcc gacaagcaga 2880
          agaacggcat caaggtgaac ttcaagatca gacacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 2940
          tggccgatca ctaccagcag aacaccccta tcggcgacgg ccctgtgctg ctgcctgaca 3000
          accactacct gagcacacag agcgccctgt ctaaggaccc caacgagaag agagatcaca 3060
          tggtcctgct ggaattcgtg acagccgctg gcataacact cggcatggac gagctgtaca 3120
          agagcggcct gagaagccgg gcccaggcca gcaacagcgc cgtggacggt acagccggcc 3180
          ccggctctac cggcagcaga tagtcctgtt aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa 3240
          agattgactg atattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta 3300
          atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa 3360
          tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tccgtcaacg tggcgtggtg 3420
          tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc 3480
          ctttctggga ctttcgcttt ccccctccct atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc 3540
          cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg ctgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg 3600
          gggaagctga cgtcctgccc gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg 3660
          ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca 3720
          ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca 3780
          aggggcccaa gttgggaaga aacctgtagg gcctgcgagc gctggctaga attacctacc 3840
          ggcctccacc ataccttcga tattcgcgcc cactctccca ttaatccgca caagtggatg 3900
          tgatgcgatt gcccgctaag atagttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag 3960
          ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 4020
          cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgc              4068
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 3571]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 腺病毒]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 60
          gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 120
          tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 180
          aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 240
          caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 300
          acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 360
          ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 420
          gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 480
          gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 540
          tacggtggga ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact 600
          ggcttatcga aataagcttt ctcaggggag atctcgttta gtgaaccgtc agatcctcac 660
          tctcttccgc atcgctgtct gcgagggcca gctgttgggc tcgcggttga ggacaaactc 720
          ttcgcggtct ttccagtact cttggatcgg aaacccgtcg gcctccgaac ggtactccgc 780
          caccgaggga cctgagcgag tccgcatcga ccggatcgga aaacctctcg agaaaggcgt 840
          ctaaccagtc acagtcgcaa ggtaggctga gcaccgtggc gggcggcagc gggtggcggt 900
          cggggttgtt tctggcggag gtgctgctga tgatgtaatt aaagtaggcg gtcttgagac 960
          ggcggatggt cgaggtgagg tgtggcaggc ttgagatcca gctgttgggg tgagtactcc 1020
          ctctcaaaag cgggcattac ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat 1080
          ttgatattca cctggcccga tctggccata cacttgagtg acaatgacat ccactttgcc 1140
          tttctctcca caggtgtcca ctcccaggtc caagtttaaa cgccgccacc atggaacacc 1200
          tgaaggcatt cgacgacgag atcaacgcct tcctggataa catgttcgga cctagagata 1260
          gcagagtgcg gggctggttc atgctggaca gctacctgcc taccttcttc ctgacagtga 1320
          tgtacctgct gtctatctgg ctgggcaaca agtacatgaa aaatagacct gccctgagcc 1380
          tgcggggcat cctcacactg tacaacctgg gaatcaccct gctgagcgcc tacatgctgg 1440
          ccgagctgat cctgtcaaca tgggagggcg gctacaacct gcagtgccag gacctgacct 1500
          ctgccggcga ggccgacatc agagtggcca aggtgctgtg gtggtactac ttttctaaga 1560
          gcgtggaatt cctggacacc atcttcttcg tgctgagaaa gaagaccagc cagatcacat 1620
          tcctgcacgt gtaccaccac gccagcatgt tcaacatctg gtggtgcgtg ctgaactgga 1680
          tcccctgcgg ccagagcttt ttcggcccta cactgaacag cttcatccac atcctgatgt 1740
          acagctatta cggcctgagc gtgttcccca gcatgcacaa gtacctgtgg tggaagaaat 1800
          acctgacaca ggcccagctg gtgcaatttg tgctgaccat cacccacacc atgagcgccg 1860
          tggtgaaacc ttgtggattt ccattcggct gcctgatttt ccagtctagc tacatgctga 1920
          ccctggtcat cctgttcctc aacttctacg tgcagaccta ccggaagaag cccatgaaga 1980
          aggacatgca ggagcctcct gctggcaagg aagtgaagaa cggcttcagc aaggcttatt 2040
          tcaccgccgc taatggcgtg atgaacaaga aagcccagcg cgcgaagcga tcaggcagcg 2100
          gggcgacaaa tttcagcctt ctgaaacaag caggcgacgt ggaagaaaac cccggtccaa 2160
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          gcgatgtgaa tggccacaag ttttctgtgt ctggcgaagg cgagggagat gccacatacg 2280
          gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca caggaaagtt gcctgtgccc tggcctaccc 2340
          tggtgaccac cctcacctac ggcgttcagt gcttcagcag ataccccgat cacatgaaac 2400
          agcacgactt tttcaagtcc gccatgcctg agggctacgt gcaggagcgg accatcttct 2460
          tcaaagacga cggcaactac aagacaagag ccgaggtgaa gttcgagggc gacacccttg 2520
          tgaacagaat cgagctgaaa ggcatcgact tcaaggaaga tggaaatatc ctgggccaca 2580
          agctggaata caactacaac agccacaacg tgtacatcat ggccgacaag cagaagaacg 2640
          gcatcaaggt gaacttcaag atcagacaca acatcgagga cggcagcgtg cagctggccg 2700
          atcactacca gcagaacacc cctatcggcg acggccctgt gctgctgcct gacaaccact 2760
          acctgagcac acagagcgcc ctgtctaagg accccaacga gaagagagat cacatggtcc 2820
          tgctggaatt cgtgacagcc gctggcataa cactcggcat ggacgagctg tacaagagcg 2880
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          ctaccggcag cagatagtcc tgttaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg 3000
          actgatattc ttaactatgt tgctcctttt acgctgtgtg gatatgctgc tttaatgcct 3060
          ctgtatcatg ctattgcttc ccgtacggct ttcgttttct cctccttgta taaatcctgg 3120
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          ctgactaggt gtccttctat aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc 3540
          ccaagttggg aagaaacctg tagggcctgc g                                3571
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          gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60
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          <![CDATA[<400> 16]]>
          gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
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          accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg 3180
          c                                                                 3181
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 738]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 腺病毒]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
           1               5                  10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
              50                  55                  60                  
          Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
          65                  70                  75                  80  
          Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
                          165                 170                 175     
          Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
                      180                 185                 190         
          Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly
                  195                 200                 205             
          Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
              210                 215                 220                 
          Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
          225                 230                 235                 240 
          Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
                          245                 250                 255     
          Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp
                      260                 265                 270         
          Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
                  275                 280                 285             
          Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
              290                 295                 300                 
          Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
          305                 310                 315                 320 
          Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
                          325                 330                 335     
          Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
                  355                 360                 365             
          Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
          385                 390                 395                 400 
          Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr
                          405                 410                 415     
          Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
                      420                 425                 430         
          Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
                  435                 440                 445             
          Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly
              450                 455                 460                 
          Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp
          465                 470                 475                 480 
          Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly
                          485                 490                 495     
          Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His
                      500                 505                 510         
          Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr
                  515                 520                 525             
          His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile
              530                 535                 540                 
          Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val
          545                 550                 555                 560 
          Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
                          565                 570                 575     
          Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala
                      580                 585                 590         
          Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
                  595                 600                 605             
          Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
              610                 615                 620                 
          Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
          625                 630                 635                 640 
          Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
                          645                 650                 655     
          Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe
                      660                 665                 670         
          Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
                  675                 680                 685             
          Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
              690                 695                 700                 
          Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
          705                 710                 715                 720 
          Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
                          725                 730                 735     
          Asn Leu
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 738]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 腺病毒]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
           1               5                  10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
              50                  55                  60                  
          Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
          65                  70                  75                  80  
          Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
                          165                 170                 175     
          Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
                      180                 185                 190         
          Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly
                  195                 200                 205             
          Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
              210                 215                 220                 
          Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
          225                 230                 235                 240 
          Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
                          245                 250                 255     
          Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp
                      260                 265                 270         
          Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
                  275                 280                 285             
          Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
              290                 295                 300                 
          Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
          305                 310                 315                 320 
          Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
                          325                 330                 335     
          Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
                  355                 360                 365             
          Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
          385                 390                 395                 400 
          Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr
                          405                 410                 415     
          Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
                      420                 425                 430         
          Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Phe Leu
                  435                 440                 445             
          Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly
              450                 455                 460                 
          Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp
          465                 470                 475                 480 
          Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly
                          485                 490                 495     
          Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His
                      500                 505                 510         
          Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr
                  515                 520                 525             
          His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile
              530                 535                 540                 
          Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val
          545                 550                 555                 560 
          Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
                          565                 570                 575     
          Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala
                      580                 585                 590         
          Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
                  595                 600                 605             
          Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
              610                 615                 620                 
          Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
          625                 630                 635                 640 
          Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
                          645                 650                 655     
          Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe
                      660                 665                 670         
          Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
                  675                 680                 685             
          Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
              690                 695                 700                 
          Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
          705                 710                 715                 720 
          Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
                          725                 730                 735     
          Asn Leu
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 738]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 腺病毒]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
           1               5                  10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
              50                  55                  60                  
          Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
          65                  70                  75                  80  
          Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
                          165                 170                 175     
          Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
                      180                 185                 190         
          Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly
                  195                 200                 205             
          Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
              210                 215                 220                 
          Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
          225                 230                 235                 240 
          Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
                          245                 250                 255     
          Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp
                      260                 265                 270         
          Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
                  275                 280                 285             
          Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
              290                 295                 300                 
          Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
          305                 310                 315                 320 
          Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
                          325                 330                 335     
          Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
                  355                 360                 365             
          Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
          385                 390                 395                 400 
          Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr
                          405                 410                 415     
          Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
                      420                 425                 430         
          Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
                  435                 440                 445             
          Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly
              450                 455                 460                 
          Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp
          465                 470                 475                 480 
          Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly
                          485                 490                 495     
          Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His
                      500                 505                 510         
          Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr
                  515                 520                 525             
          His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile
              530                 535                 540                 
          Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val
          545                 550                 555                 560 
          Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
                          565                 570                 575     
          Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala
                      580                 585                 590         
          Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
                  595                 600                 605             
          Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
              610                 615                 620                 
          Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
          625                 630                 635                 640 
          Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
                          645                 650                 655     
          Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe
                      660                 665                 670         
          Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
                  675                 680                 685             
          Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
              690                 695                 700                 
          Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
          705                 710                 715                 720 
          Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Phe Leu Thr Arg
                          725                 730                 735     
          Asn Leu
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 738]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 腺病毒]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
           1               5                  10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
              50                  55                  60                  
          Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
          65                  70                  75                  80  
          Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
                          165                 170                 175     
          Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
                      180                 185                 190         
          Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly
                  195                 200                 205             
          Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
              210                 215                 220                 
          Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
          225                 230                 235                 240 
          Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
                          245                 250                 255     
          Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp
                      260                 265                 270         
          Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
                  275                 280                 285             
          Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
              290                 295                 300                 
          Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
          305                 310                 315                 320 
          Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
                          325                 330                 335     
          Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
                  355                 360                 365             
          Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
          385                 390                 395                 400 
          Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr
                          405                 410                 415     
          Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
                      420                 425                 430         
          Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Phe Leu
                  435                 440                 445             
          Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly
              450                 455                 460                 
          Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp
          465                 470                 475                 480 
          Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly
                          485                 490                 495     
          Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His
                      500                 505                 510         
          Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr
                  515                 520                 525             
          His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile
              530                 535                 540                 
          Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val
          545                 550                 555                 560 
          Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
                          565                 570                 575     
          Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala
                      580                 585                 590         
          Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
                  595                 600                 605             
          Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
              610                 615                 620                 
          Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
          625                 630                 635                 640 
          Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
                          645                 650                 655     
          Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe
                      660                 665                 670         
          Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
                  675                 680                 685             
          Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
              690                 695                 700                 
          Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
          705                 710                 715                 720 
          Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Phe Leu Thr Arg
                          725                 730                 735     
          Asn Leu
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
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Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
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Claims (61)

  1. 一種增加有需要受試者組織中ELOVL2酶含量之方法，其包括： 對該受試者投與包含會增加組織中ELOVL2酶含量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。
  2. 如請求項1之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之最佳化密碼子或顯示與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之序列。
  3. 如請求項1之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之最佳化密碼子或顯示與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之序列。
  4. 如請求項1至3之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列進一步包含啟動子、強化子、反向末端重複序列(ITR)、多腺苷酸化信號、訊息序列，或其組合。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列包括病毒衣殼或病毒套膜。
  6. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列包括病毒衣殼及病毒套膜兩者。
  7. 如請求項5或6之方法，其中該病毒衣殼或套膜係選自腺相關病毒、腺病毒、α病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒或牛痘病毒衣殼或套膜。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列係於非病毒遞送系統中投與。
  9. 如請求項1至7之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列係於DNA微環中。
  10. 如請求項5或6之方法，其中該衣殼係腺相關病毒衣殼及該套膜係腺相關病毒套膜。
  11. 如請求項1至9中任一項之方法，其進一步包括投與另外治療劑。
  12. 如請求項10之方法，其中該另外治療劑係選自抗補體療法、皮質類固醇、抗發炎劑、去甲基化劑，或其組合。
  13. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該受試者係人類。
  14. 一種減少或減緩有需要受試者中衰老表型之方法，其包括： 對該受試者投與包含增加組織中ELOVL2酶含量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。
  15. 如請求項14之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之最佳化密碼子或顯示與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之序列。
  16. 如請求項14之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之最佳化密碼子或顯示與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之序列。
  17. 如請求項14至16中任一項之方法，其中該衰老表型係選自眼中光感受器減少、視網膜功能下降、氧化應激、年齡相關性黃斑變性、糖尿病眼病、阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、非酒精性脂肪肝疾病或乾眼症。
  18. 如請求項17之方法，其中該非酒精性脂肪肝疾病係非酒精性脂肪性肝炎。
  19. 如請求項14至17中任一項之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列係於病毒衣殼或套膜或非病毒載體中。
  20. 如請求項19之方法，其中該病毒衣殼或套膜係選自腺相關病毒、腺病毒、α病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒或牛痘病毒衣殼或套膜。
  21. 如請求項19中任一項之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列係於微環形式中。
  22. 一種治療、減輕或預防年齡相關性眼部疾病或病症之方法，其包括： 對該受試者投與包含增加組織中ELOVL2酶含量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。
  23. 如請求項22之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之最佳化密碼子或顯示與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之序列。
  24. 如請求項22之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之最佳化密碼子或顯示與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之序列。
  25. 如請求項22至24中任一項之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列係於病毒衣殼或套膜中。
  26. 如請求項25之方法，其中該病毒衣殼或套膜係選自腺相關病毒、腺病毒、α病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒或牛痘病毒衣殼或套膜。
  27. 如請求項22至27中任一項之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列係於非病毒遞送系統中遞送。
  28. 如請求項27之方法，其中該非病毒遞送系統係DNA微環。
  29. 如請求項22至27中任一項之方法，其中該組合物係藉由玻璃體內、視網膜下、結膜下、眼球筋膜下(subtenon)、脈絡膜上腔(suprachoroidal)或後鞏膜旁途徑對眼睛投與。
  30. 如請求項22至29中任一項之方法，其中該年齡相關性眼部疾病係年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病眼病、青光眼、弱視或乾眼症。
  31. 一種組合物，其包含SEQ ID NO: 2之最佳化聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之序列。
  32. 一種組合物，其包含SEQ ID NO: 3之最佳化聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之序列。
  33. 如請求項31至32之組合物，其中該最佳化聚核苷酸序列進一步包含啟動子、強化子、反向末端重複序列(ITR)、衣殼、多腺苷酸化信號、訊息序列，或其組合。
  34. 如請求項31至33之組合物，其進一步包含SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 15中之至少一者。
  35. 如請求項31至34中任一項之組合物，其進一步包含病毒衣殼或套膜。
  36. 如請求項35中任一項之組合物，其中該病毒衣殼或套膜係選自腺相關病毒、腺病毒、α病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒或牛痘病毒衣殼或套膜。
  37. 如請求項36之組合物，其中該病毒衣殼係基於腺相關病毒(AAV)。
  38. 如請求項37之組合物，其進一步包含SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ IN NO: 22中之至少一者。
  39. 如請求項31至37中任一項之組合物，其進一步包含另外治療劑。
  40. 如請求項31至39中任一項之組合物，其中該組合物係經調配用於玻璃體內投與。
  41. 一種維持有需要受試者組織中ELOVL2酶含量之方法，其包括： 對該受試者投與包含維持組織中ELOVL2酶含量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。
  42. 一種修飾有需要受試者組織中ELOVL2酶含量之方法，其包括： 對該受試者投與包含修飾組織中ELOVL2酶含量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。
  43. 如請求項41或42之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之序列。
  44. 如請求項41至43之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之聚核苷酸序列或顯示與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之序列。
  45. 如請求項41至44之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列進一步包含啟動子、強化子、反向末端重複序列(ITR)、衣殼、多腺苷酸化信號、訊息序列，或其組合。
  46. 如請求項41至45中任一項之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列進一步包含病毒衣殼或套膜。
  47. 如請求項46之方法，其中該病毒衣殼或套膜係選自腺相關病毒、腺病毒、α病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒或牛痘病毒衣殼或套膜。
  48. 如請求項41至45中任一項之方法，其中該最佳化聚核苷酸序列係於非病毒遞送系統中。
  49. 如請求項48之方法，其中該非病毒遞送系統係DNA微環。
  50. 如請求項41至49中任一項之方法，其中該組合物係藉由玻璃體內、視網膜下、結膜下、眼球筋膜下、脈絡膜上腔或後鞏膜旁途徑對眼睛投與。
  51. 一種改善有需要受試者中光感受器功能之方法，該方法包括： 對該受試者投與包含增加降低組織中ELOVL2酶含量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。
  52. 如請求項51之方法，其中該組合物係以約5x10 7vg/眼至約9x10 9vg/眼之劑量投與。
  53. 如請求項51之方法，其中該組合物係以在約1x10 7至9x10 7vg/眼之範圍內之劑量投與。
  54. 如請求項51之方法，其中該組合物係以在約1x10 8vg/眼至9x10 8vg/眼之範圍內之劑量投與。
  55. 如請求項51之方法，其中該組合物係以在約1x10 9vg/眼至9x10 9vg/眼之範圍內之劑量投與。
  56. 如請求項51之方法，其中該組合物係以在約1x10 10vg/眼至9x10 10vg/眼之範圍內之劑量投與。
  57. 如請求項51之方法，其中該組合物係以在約1x10 11vg/眼至9x10 11vg/眼之範圍內之劑量投與。
  58. 一種改善有需要受試者中視網膜功能之方法，該方法包括： 對該受試者投與包含增加組織中ELOVL2酶含量之最佳化聚核苷酸序列之組合物。
  59. 一種防止年齡相關性視網膜組織損失之方法，該方法包括： 對該受試者投與包含增加組織中ELOVL2酶含量之最佳化聚核苷酸序列之組合物，其中該視網膜組織厚度損失係小於10 µm。
  60. 如請求項59之方法，其中該視網膜組織外視網膜厚度損失係小於10 µm。
  61. 如請求項59或60之方法，其中該組合物之劑量係約5x10 7vg/眼。
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