KR20220072758A - 트랜스-스플라이싱 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하는 프라임에디팅용 조성물 - Google Patents

트랜스-스플라이싱 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하는 프라임에디팅용 조성물 Download PDF

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Abstract

트랜스-스플라이싱 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하는 프라임에디팅용 조성물에 관한 것이다. 일 양상에 따른 조성물을 사용하면 운반 크기(cargo size)가 큰 프라임에디터를 세포에 전달할 수 있어 유전체 편집 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 표적 서열에 특이적으로 작용하며 높은 정확도로 유전체 교정이 가능하여 유전체 편집 분야에서 다양한 유전병 치료 용도로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

트랜스-스플라이싱 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하는 프라임에디팅용 조성물{A composition for prime editing comprising trans-splicing adeno-associated virus vector}
트랜스-스플라이싱 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하는 프라임에디팅용 조성물에 관한 것이다.
프라임에디팅(Prime Editing)은 도너(donor) DNA 또는 이중가닥 절단(double-strand breaks: DSBs) 없이, 거의 모든 크기의 유전자 변화를 도입할 수 있는 혁신적인 신규 게놈 편집 방법이다(Anzalone, A.V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157 (2019)). 이러한 변화에는 삽입, 결실 및 모든 가능한 12가지 점 돌연변이뿐만 아니라 이러한 변화들의 조합을 포함한다.
프라임에디팅(Prime editing)은 기본적으로 단일 가닥만 절단하는 닉카아제 Cas9(nickase Cas9)과 역전사 효소(reverse transcriptase: RT)가 융합된 프라임에디터(Prime editor: PE) 단백질 및 프라임에디팅 가이드 RNA(prime editing guide RNA: pegRNA)가 복합체를 형성하여 일어나게 된다. 그동안 4가지 유형의 프라임에디터가 개발되었다: PE1, PE2, PE3, 및 PE3b. PE1 및 PE2는 Cas9-역전사 효소 융합 단백질(fusion protein)과 pegRNA로 구성되며, PE3 및 PE3b는 PE2와 하나의 추가 단일가닥 가이드 RNA(single guide RNA: sgRNA)로 구성된다.
한편, 유전체 편집이 실제로 치료 효과를 발휘하기 위해서는 유전자 가위가 표적 조직이나 세포에 안전하고, 효과적으로 전달되어야 한다. 유전자 가위를 체내에 전달하는 방법은 크게 바이러스성 전달체를 이용하는 방법과 비-바이러스성 전달체를 이용하는 방법으로 구분할 수 있으며, 유전자 가위의 크기, 전달하고자 하는 세포의 위치 및 안정성을 고려하여 구체적인 전달체를 선택할 수 있다. 그러나, CRISPR/Cas 시스템과 같은 잘 확립된 유전자 가위의 경우 이러한 연구가 활발하게 진행된 것에 반해, 프라임에디터에 대해서는 연구된 바가 거의 없다.
이에, 본 발명자들은 크기가 큰 프라임에디터를 효과적으로 체내로 전달하기 위한 방법을 연구하던 중, 트랜스-스플라이싱 아데노-연관 바이러스 벡터를 사용하는 경우 프라임에디터를 체내의 표적 부위에 정확하고 안정적으로 전달할 수 있고, 생체 내(in vivo)에서 높은 유전자 편집 효율을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 N-말단 닉카아제 Cas9을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 1단편을 발현하는 재조합 벡터;
C-말단 닉카아제 Cas9에 융합된 역전사효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 2단편을 발현하는 재조합 벡터; 및
프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA) 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 유전체 편집용 조성물로서,
상기 프라임에디터 단백질은 닉카아제 Cas9 단백질의 C-말단에 역전사 효소가 융합된 형태인 것인 유전체 편집용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 유전체 편집용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 N-말단 닉카아제 Cas9을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 1단편을 발현하는 재조합 벡터;
C-말단 닉카아제 Cas9에 융합된 역전사효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 2단편을 발현하는 재조합 벡터; 및
프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA) 서열을 포함하는 재조합 벡터를 각각 분리된 진핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 유기체에 도입하는 단계를 포함하고,
상기 프라임에디터 단백질은 닉카아제 Cas9 단백질의 C-말단에 역전사 효소가 융합된 형태인 것인 유전체를 편집하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 망막질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상은 N-말단 닉카아제 Cas9을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 1단편을 발현하는 재조합 벡터;
C-말단 닉카아제 Cas9에 융합된 역전사효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 2단편을 발현하는 재조합 벡터; 및
프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA) 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 유전체 편집용 조성물로서,
상기 프라임에디터 단백질은 닉카아제 Cas9 단백질의 C-말단에 역전사 효소가 융합된 형태인 것인 유전체 편집용 조성물을 제공한다.
"유전체 편집(genome editing)"은 특별한 언급이 없는 한, 표적 유전자의 표적 부위에서의 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자(예컨대, 1 - 100,000 bp, 1 - 10,000 bp, 1 - 1,000 bp, 1 - 100 bp, 1 - 70 bp, 1 - 50 bp, 1 - 30 bp, 1 - 20 bp, 또는 1 - 10 bp)의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 유전자 기능을 상실, 변경, 및/또는 회복(수정)시키는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 상기 유전체 편집은 프라임에디팅을 의미하는 것일 수 있다.
"프라임에디팅(Prime editing)"은 4세대 유전자 가위에 의한, DNA 이중가닥 절단 없이 한 가닥의 DNA만 절단하여 유전자 변화를 도입할 수 있는 게놈 편집 방법이다.
프라임에디팅은 "프라임에디터(Prime editor: PE)"에 의해 수행된다. 프라임에디터의 종류로는 PE1, PE2, PE3, 및 PE3b 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 프라임에디터는 프라임에디터2(PE2) 또는 프라임에디터3(PE3)일 수 있다.
프라임에디터는 닉카아제 Cas9 단백질(nickase Cas9, nCas9)과 역전사 효소(reverse transcriptase: RT)가 융합된 프라임에디터(Prime editor: PE) 단백질 및 프라임에디팅 가이드 RNA(prime editing guide RNA: pegRNA)를 포함한다. 본 명세서에서 프라임에디터는 좁게는 닉카아제 Cas9 단백질과 역전사 효소가 융합된 프라임에디터 단백질을 의미하고, 넓게는 상기 프라임에디터 단백질과 프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA) 단일, RNA(pegRNA) 및/또는 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA)와 복합체를 형성한 형태의 프라임에디터 복합체(prime editor complex)를 의미하는 것일 수 있다.
상기 "Cas9 단백질"은 한 가닥의 DNA를 절단(nick)하도록 변형된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 Cas9 단백질은 단일 가닥만 절단할 수 있는 돌연변이인 nCas9일 수 있으나, pegRNA와 함께 표적 부위로 전달되어 표적 특이적으로 단일 가닥만 절단할 수 있도록 변형된 Cas9 단백질이라면 제한 없이 사용할 수 있다.
프라임에디팅은 상기 프라임에디터 단백질과 프라임에디팅 가이드 RNA가 복합체를 형성하여 일어나게 된다. 상기 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA)는 프라임에디팅 효율을 극대화하기 위해 추가로 도입될 수 있으며, 프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA)가 결합하는 표적 유전자 부위와 조금 떨어진 위치에서 프라임에디터 단백질과 함께 절단(nick)을 형성할 수 있다.
상기 프라임에디터는 유전자 사이즈가 크기 때문에, 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 등의 바이러스 벡터)를 이용하여 프라임에디터를 세포 내 또는 유기체 내로 전달하는 경우 효율이 떨어지는 문제가 있을 수 있고, 이는 프라임에디팅 기술 적용에 한계로 작용할 수 있다. 특히, AAV 벡터와 같은 바이러스 벡터의 경우, 벡터의 패키징(packaging) 한계 때문에 패키징 한계를 넘는 유전자가 클로닝 된 경우 바이러스 생산 효율 및 세포 내 전달 효율이 떨어지는 현상이 보편적으로 잘 알려져 있다.
이에, 본 명세서에서 사용되는 프라임에디터 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 서열은 적어도 하나 이상의 임의의 위치에서 절단되어 생성된 두 개 이상의 절단 단편들 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 두 개 이상의 절단되어 생성된 단편들은 하나의 벡터에 함께 포함되거나 두 개 이상의 벡터에 각각 포함되어 세포 또는 유기체에 전달될 수 있고, 바람직하게는 두 개 이상의 벡터에 각각 포함되어 세포 또는 유기체에 전달될 수 있다. 상기 두 개 이상의 절단되어 생성된 단편들은 전장 프라임에디터 단백질을 중복 없이 커버(cover)하는 것일 수 있다. 상기 전장 프라임에디터 단백질은 닉카아제 Cas9 단백질의 C-말단에 역전사 효소가 융합된 단백질일 수 있고, 바람직하게는 닉카아제 Cas9 단백질의 C-말단과 역전사 효소가 링커로 연결됨으로써 융합된 단백질일 수 있다.
"제1 단편"은 N-말단 프라임에디터 단백질로서 닉카아제 Cas9 단백질의 N-말단을 포함하는 부분을 의미하며, "제2 단편"은 C-말단 프라임에디터 단백질로서 닉카아제 Cas9 단백질의 C-말단에 융합된 역전사효소를 포함하는 부분을 의미한다. 상기 제1 단편 및 제2 단편은 세포 내에서 각각 발현 및 융합하여 프라임에디터 단백질 전체를 형성할 수 있다.
상기 프라임에디터 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 서열의 절단 지점은 프라임에디터 단백질의 3차 구조상 외부 노출 부위 또는 소정의 기능을 갖는 도메인 이외의 부위 (예를 들어, 도메인 간 링커(domain-domain linker), 또는 상기 외부 노출 부위 또는 도메인 이외의 부위를 암호화하는 핵산 서열 내에 위치할 수 있다.
상기 제1 단편 및/또는 제2 단편을 포함하는 재조합 벡터는 스플라이싱 도너(SD) 또는 스플라이싱 어셉터(SA)를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 재조합 벡터는 우드척 간염바이러스 전사후 조절요소(WPRE)를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
상기 SD/SA 서열은 RNA 전사체의 인트론을 제거하는 스플라이싱 반응에 있어서 잘려나가는 인트론의 시작부분과 끝나는 부분에 해당하는 서열을 의미하고, WPRE는 DNA 상에 발현을 촉진하는 3차 구조를 유도하여 유전자의 발현을 증가시키는 서열을 의미한다. 상기 SD/SA는 전사 시작(transcription initiation)과 RNA 폴리머라제 ±의 프로세싱(processing) 및 mRNA의 핵에서 세포질로의 이동(nucleocytoplasmic export)을 증가시키며, WPRE는 mRNA의 프로세싱과 핵에서 세포질로의 이동을 증가시킴으로써 각각 pre-mRNA 수준을 증가시킬 수 있다.
상기와 같은 구성을 통하여 세포 내에서 프라임에디터 단백질의 RNA 수준이 현저히 증가되고, 전사체 양이 증가함으로써, 표적 세포 또는 조직에서 프라임에디터의 발현이 특이적으로 이루어지도록 함으로써 원하는 위치에서의 정확한 유전체 편집이 가능하도록 할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제1 단편을 암호화하는 핵산 서열은 C-말단에 스플라이싱 도너(splicing donor: SD)가 연결된 것이고, 상기 제2 단편을 암호화하는 핵산 서열은 N-말단에 스플라이싱 어셉터(splicing acceptor: SA)가 연결된 것일 수 있다.
상기 프라임에디터 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 프라임에디터 단백질은, 예를 들어 서열번호 2의 핵산 서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 프라임에디터 단백질의 제1 단편은 서열번호 1의 1번째 아미노산 잔기부터 1035번째 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열(서열번호 1에서, N 말단으로부터 1 내지 1035번째 아미노산)로 이루어진 단백질 단편을 포함하고,
상기 프라임에디터 단백질의 제2 단편은 서열번호 1의 1036번째 아미노산 잔기부터 1368번째 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열(서열번호 1에서, N 말단으로부터 1036 내지 1368번째 아미노산)로 이루어진 단백질 단편을 포함하고, 상기 단백질 단편은 C-말단에 역전사효소(reverse transcriptase)가 융합된 것일 수 있다.
"역전사 효소(reverse transcriptase: RT)"는 RNA를 주형으로 하고, 이에 상보적인 새로운 DNA를 합성하는 효소를 의미한다. 상기 역전사 효소는 닉카아제 Cas9 단백질의 C-말단에 융합될 수 있고, 벡터 내에서 닉카아제 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 링커(linker)로 연결된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 역전사 효소는 마우스 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus)에서 유래한 MMLV 역전사 효소일 수 있다.
상기 각 단백질 단편을 암호화하는 핵산 서열은 별개의 재조합 벡터에 각각 포함될 수 있고, 프라임에디터 단백질 내 절단 위치에 따라 트랜스-스플라이싱(trans-splicing) 효율이 달라질 수 있다.
본 명세서에서, 프라임에디터는 Cas9 닉카아제 -RT 융합 단백질만을 포함하는 것을 의미할 수도 있고, Cas9 닉카아제 -RT 융합 단백질과 pegRNA를 함께 포함하는 것을 의미할 수도 있다. 예를 들어, 세포 내에 pegRNA를 별도로 도입한 경우, 여기에 프라임에디터를 도입하였다는 것은 Cas9 닉카아제 -RT 융합 단백질만을 도입한 것을 의미할 수 있다. 즉, pegRNA가 이미 도입되어 있는 경우 프라임에디터의 도입은 Cas9 닉카아제 -RT 융합 단백질만을 도입한 것을 의미할 수 있다.
"pegRNA(prime editing guide RNA)"는 표적 서열을 인식하는 가이드 서열(guide sequence), tracrRNA 스캐폴드 서열, 역전사 개시에 필요한 프라이머 결합 부위(primer binding site: PBS) 및 원하는 유전적 변화를 포함하는 RT 주형(RT template)을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 pegRNA는 서열번호 3, 서열번호 28 및/또는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서는 확인한 pegRNA 157은 서열번호 28로 이루어진 뉴클레오티드 서열이며, pegRNA 198은 서열번호 29로 이루어진 뉴클레오티드 서열이다.
서열 (5'-3') 서열번호
gTGCCTTTCAGTTTCTGGGTgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgggaccgagtcggtccAGTACCACCCAtCCAGAAACTGAAAG 3
gGAGCCCTGGCCCACATCAGgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcgcagtctcctccgatgtgggcc 28
gGAGCCCTGGCCCACATCAGgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcggcagtctcctccgatgtgggcc 29
"표적 서열(target sequence)"은 pegRNA가 목적하는 표적 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 표적 서열은 pegRNA가 표적으로 할 것으로 예상되는 서열일 수 있고, 예를 들어 당업계에 공지된 게놈 서열 중 일부 서열 또는 당업자가 분석하고자 하는 서열을 임의로 설계한 서열일 수 있다.
"벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다.
"작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 의미한다.
상기 벡터는 프라임에디터 단백질, 프라임에디터 가이드RNA(pegRNA)를 세포 내에 전달할 수 있도록 하는 매개체를 의미할 수 있다. 상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터일 수 있고, 상기 AAV 벡터는 특정 혈청형(serotype)에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 혈청형 2 또는 혈청형 8 유래일 수 있다.
상기 벡터는 개체의 세포 내에 존재하는 경우 삽입물, 즉 암호화된 핵산서열이 발현될 수 있도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포 등 목적하는 세포에서 작용할 수 있도록 하는 한, 특별히 한정되지 않는다. 벡터는 프로모터, 개시코돈, 및 종결코돈 터미네이터를 포함할 수 있다. 그 외에 시그널 펩타이드를 암호화하는 DNA, 및/또는 인핸서 서열, 및/또는 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 및/또는 선택마커 영역, 및/또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다.
"프로모터(promoter)"는 전사조절인자들이 결합하는 DNA 염기서열 부위를 의미하며, 본 발명의 목적상 유전자 발현율을 높이기 위하여 강력하고 안정적인 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 사용할 수 있다.
상기 벡터는 벡터의 전달 효율을 향상시키기 위하여, 핵 국재화 서열(nuclear localization sequence: NLS)을 더 포함할 수 있다.
"핵 국재화 서열"은 세포 내로 벡터가 도입된 후 세포질 내에 존재하는 전사인자가 결합하여 벡터의 핵 내로의 이동을 보조하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 전사인자의 핵 내로의 유입은 다양한 외부 및 내부 자극뿐만 아니라 발생 신호에 반응하여 일어나는 과정이다. 그러므로, 벡터 내에 삽입된 NLS는 세포 내로 도입된 벡터가 핵 내로 유입될 수 있도록 이동을 촉진한다.
일 구체예에서, 상기 프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA) 서열을 포함하는 재조합 벡터는 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA)를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 "sgRNA"는 에디팅 부위에서 조금 떨어진 위치에 또 다른 DNA 절단(nick)을 만들어 낼 수 있도록 추가로 도입한 가이드 RNA를 의미하며, 이 경우 프라임에디터는 프라임에디터3(PE3)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 sgRNA는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
서열 (5'-3') 서열번호
GATGAGTACGTCCATGTTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc 4
일 구체예에서, 재조합 벡터는 트랜스-스플라이싱 아데노-연관 바이러스 벡터일 수 있고, 5'에서 3'방향으로, (i) ITR 서열, CMV 프로모터, NLS 서열, 프라임에디터 단백질의 제1 단편을 암호화하는 제1 핵산 서열, SD 서열 및 ITR 서열을 포함하거나(TS-PE2-N, 서열번호 26); 또는 (ii) ITR 서열, SA 서열, 프라임에디터 단백질의 제2 단편을 암호화하는 제2 핵산 서열, NLS 서열, WPRE 서열, poly(A) 및 ITR 서열(TS-PE2-C-WPRE, 서열번호 27)을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 재조합 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터일 수 있고, 5'에서 3'방향으로 ITR 서열, U6 프로모터, pegRNA를 암호화하는 핵산 서열, H1 프로모터, sgRNA를 암호화하는 핵산 서열, CMV 프로모터, mCherry 유전자 서열 및 ITR 서열을 포함하는 것일 수 있다(U6-pegRNA-H1-nick sgRNA-mCherry).
상기 벡터를 세포에 전달하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 예컨대, 국소 주입법, 미세주사법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection) 방법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 바이러스 벡터를 이용하는 경우, 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물, 즉 벡터를 세포 내로 전달시킬 수 있다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입된 벡터는 세포 내에서 벡터 자체로 존재하거나, 염색체 내에 통합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 진핵 세포 또는 진핵 유기체의 유전체 편집에 사용할 수 있다. 상기 진핵 유기체는 진핵 세포(예를 들어, 효모 등의 균류, 진핵 동물 및/또는 진핵 식물 유래 세포(예를 들어, 배아세포, 줄기세포, 체세포, 생식세포 등) 등), 진핵 동물(예를 들어, 척추동물 또는 무척추동물, 보다 구체적으로, 인간, 원숭이 등의 영장류, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 마우스, 래트 등을 포함하는 포유류 등) 및 진핵 식물(예를 들어, 녹조류 등의 조류, 옥수수, 콩, 밀, 벼 등의 단자엽 또는 쌍자엽 식물 등)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 진핵 세포 또는 진핵 유기체의 프라임에디팅 용도로 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "프라임에디팅 효율"은 프라임에디터에 의한 유전자 편집 효율을 의미한다. 프라임에디팅 효율은 프라임에디팅을 수행하였을 때, 표적 서열 내에서 의도하지 않은 돌연변이 없이 프라임에디터 및 pegRNA에 의해 유도된 편집이 발생하는 비율로 계산될 수 있다. 상기 프라임에디팅 효율은 백분율로 표시될 수 있다.
구체적으로, 상기 프라임에디팅 효율에 대한 데이터는 상기 유전체 편집용 조성물을 세포 또는 조직에 도입하는 단계; 상기 조성물이 도입된 세포 또는 조직으로부터 수득한 DNA를 이용하여 딥 시퀀싱(Deep sequencing)을 수행하는 단계; 및 상기 딥 시퀀싱으로 수득한 데이터로부터 프라임에디팅 효율을 분석하는 단계를 포함하는 방법을 수행하여 수득된 것일 수 있다.
상기 프라임에디터가 도입된 세포 또는 조직으로부터 DNA를 수득하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 DNA 분리 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 각각의 세포 또는 조직은 도입된 표적 서열에서 유전자 편집이 발생한 것으로 예상되므로, 표적 서열을 서열 분석하여 유전자 편집 효율을 검출할 수 있다. 상기 서열 분석 방법은 프라임에디팅 효율 데이터를 얻을 수 있다면 특정 방법에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 딥 시퀀싱을 이용할 수 있다.
상기 딥시퀀싱으로 수득한 데이터로부터 프라임에디팅 효율을 분석하는 단계는 프라임에디팅 효율을 계산하는 단계를 포함할 수 있다. 프라임에디팅 효율은 pegRNA 서열 및 표적 서열의 종류 및/또는 길이에 따라 다르게 나타날 수 있다. 상기 프라임에디팅 효율에 대한 데이터는 데이터 세트로 제공될 수 있다.
일 양상에 따른 조성물을 사용하면, 운반 크기(cargo size)가 큰 프라임에디터를 세포에 전달할 수 있어 유전체 편집 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있다. 일 구체예에서는, Atp7b 를 표적으로 하는 pegRNA 및 sgRNA를 암호화하는 AAV 벡터와 함께, (i) PE2의 N-말단 절반을 암호화하는 제 1 tsAAV 벡터; 및 (ii) PE2의 C-말단 절반을 암호화하는 제2 tsAAV 벡터를 마우스 망막색소상피 및 망막에 투여하고, 그 결과 일 양상에 따른 조성물은 표적 서열에 특이적으로 작용하며 높은 정확도로 유전체 교정이 가능함을 확인하였다.
또한 일 양상에 따른 조성물을 사용하면, 운반 크기(cargo size)가 큰 프라임에디터를 세포에 전달할 수 있어 RPE65를 표적으로 하는 pegRNA를 암호화하는 AAV 벡터와 함께 (i) PE2의 N-말단 절반을 암호화하는 제 1 tsAAV 벡터; 및 (ii) PE2의 C-말단 절반을 암호화하는 제2 tsAAV 벡터를 마우스 망막색소상피에 투여하고, 그 결과 일 양상에 따른 조성물은 표적 서열에 특이적으로 작용하며 높은 정확도로 유전체 교정이 가능함을 확인하였다.
따라서, 일 양상에 따른 조성물은 유전체 편집 분야에서 다양한 유전병 치료 용도로의 활용이 가능하다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 유전체 편집용 키트를 제공한다.
상기 키트는 재조합 벡터의 발현이 이루어지거나 촉진될 수 있도록 하는 물질 또는 세포를 유지할 수 있도록 하는 배지용 조성물 뿐 아니라 재조합 벡터의 제작 또는 세포 내로의 도입 등을 용이하게 할 수 있는 조성물, 재조합 벡터의 제작 또는 세포 내로의 도입을 위한 설명서 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 N-말단 닉카아제 Cas9을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 1단편을 발현하는 재조합 벡터; C-말단 닉카아제 Cas9에 융합된 역전사효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 2단편을 발현하는 재조합 벡터; 및 프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA) 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 망막질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 망막질환은 예를 들면 망막색소변성증, 원뿔세포이상증, 황반변성, 스타가르트병(Stargardt disease), 레베르선천성흑내장(Leber congenital amaurosis: LCA), 유전성 망막디스트로피, 맥락막결손, 유전성 유리체망막병증, 녹내장, 어셔 증후군, 바뎃-비들 증후군, 베스트병, 맥락망막 위축, 망막 황반성 퇴화증, 망막층간 분리, 말라티아 레벤티네스(Malattia Leventinese: ML), 오구치병(Oguchi disease) 및 레프섬병(Refsum disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 유전성 망막질환으로서 망막색소변성증, 원뿔세포이상증, 황반변성, 스타가르트병(Stargardt disease), 레베르선천성흑내장, 유전성 망막디스트로피, 맥락막결손 및 유전성 유리체망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "예방"은 망막질환의 병인을 제거하거나 조기 발견하여 해당 질환을 막는 모든 행위를 의미한다.
용어 "치료"는 망막질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 망막질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 재조합 벡터 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및/또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 안약 또는 흡입제로 제제화하는 것이 바람직하다.
일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 망막내, 유리체강내(intravitreal), 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로서 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 일 양상에 따른 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 일 양상에 따른 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때 예를 들어 약 1,000~10,000 세포/회, 1,000~100,000세포/회, 1,000~1000,000 세포/회, 1,000~10,000,000, 1,000~100,000,000 세포/회, 1,000~1,000,000,000 세포/회, 1,000~10,000,000,000 세포/회로, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있고, 일정 시간 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.
'개체'란 유전질환, 구체적으로 망막 질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 마우스(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또 다른 양상은 N-말단 닉카아제 Cas9을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 1단편을 발현하는 재조합 벡터;
C-말단 닉카아제 Cas9에 융합된 역전사효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 2단편을 발현하는 재조합 벡터; 및
프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA) 서열을 포함하는 재조합 벡터를 각각 분리된 진핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 유기체에 도입하는 단계를 포함하고,
상기 프라임에디터 단백질은 닉카아제 Cas9 단백질의 C-말단에 역전사 효소가 융합된 형태인 것인 유전체를 편집하는 방법을 제공한다.
상기 프라임에디터 단백질의 제1 단편 및 제2 단편은 세포 내에서 각각 발현 및 융합하여 프라임에디터 단백질을 형성하는 것일 수 있다.
상기 제1 단편을 암호화하는 핵산 서열은 C-말단에 스플라이싱 도너(splicing donor: SD)가 연결된 것이고, 상기 제2 단편을 암호화하는 핵산 서열은 N-말단에 스플라이싱 어셉터(splicing acceptor: SA)가 연결된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 프라임에디터 단백질의 제1 단편은 서열번호 1의 1번째 아미노산 잔기부터 1035번째 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열(서열번호 1에서, N 말단으로부터 1 내지 1035번째 아미노산)로 이루어진 단백질 단편을 포함하고,
상기 프라임에디터 단백질의 제2 단편은 서열번호 1의 1036번째 아미노산 잔기부터 1368번째 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열(서열번호 1에서, N 말단으로부터 1036 내지 1368번째 아미노산)로 이루어진 단백질 단편을 포함하고, 상기 단백질 단편은 C-말단에 역전사효소(reverse transcriptase)가 융합된 것일 수 있다.
상기 프라임에디터 단백질의 제1 단편 및 제2 단편은 세포 내에서 각각 발현 및 융합하여 프라임에디터 단백질을 형성할 수 있다.
상기 프라임에디터 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 프라임에디터 단백질은, 예를 들어 서열번호 2의 핵산 서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 프라임에디터 단백질은 핵 국재화 서열을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라임에디터 가이드 RNA 서열을 포함하는 재조합 벡터는 단일가닥 가이드 RNA 서열을 더 포함할 수 있다.
상기 재조합 벡터를 도입하는 단계는 국소 주입법, 미세주사법(microinjection), 전기천공법(electroporation) 및 리포펙션(lipofection) 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 수행될 수 있다.
상기 방법은 진핵 세포 또는 진핵 유기체의 유전체 편집에 사용할 수 있다. 상기 진핵 유기체는 진핵 세포(예를 들어, 효모 등의 균류, 진핵 동물 및/또는 진핵 식물 유래 세포(예를 들어, 배아세포, 줄기세포, 체세포, 생식세포 등) 등), 진핵 동물(예를 들어, 척추동물 또는 무척추동물, 보다 구체적으로, 인간, 원숭이 등의 영장류, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 마우스, 래트 등을 포함하는 포유류 등) 및 진핵 식물(예를 들어, 녹조류 등의 조류, 옥수수, 콩, 밀, 벼 등의 단자엽 또는 쌍자엽 식물 등)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 유전체를 편집하는 방법에서 수행되는 모든 단계는 세포 내 또는 세포 외, 또는 생체 내 또는 생체 외에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 유전체를 편집하는 방법은 프라임에디팅에 의해 수행되는 것일 수 있다.
상기 유전체를 편집하는 방법에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
일 양상에 따른 조성물을 사용하면 운반 크기(cargo size)가 큰 프라임에디터를 세포에 전달할 수 있어 유전체 편집 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 표적 서열에 특이적으로 작용하며 높은 정확도로 유전체 교정이 가능하여 유전체 편집 분야에서 다양한 유전병 치료 용도로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 야생형 마우스 망막 및 망막색소상피에서의 프라임에디팅에 관한 개요로서, 실험에 사용한 AAV 벡터맵을 나타낸 도이다. 각 벡터에서, 두 ITR(Inverted terminal repeats) 사이의 서열 길이를 괄호 안에 표시하였다. 2개의 트랜스-스플라이싱 PE2-발현 AAV 벡터(TS-PE2-N, TS-PE2-C-WPRE)를 pegRNA 및 sgRNA를 발현하는 AAV 벡터(U6-pegRNA-H1-nick sgRNA-mCherry)와 함께 망막 및 망막색소상피로 주사하였다. 6주 후, 딥 시퀀싱을 위해 망막 및 망막색소상피 세포를 수집하였다. SD: 스플라이싱 도너(splicing donor); SA: 스플라이싱 어셉터(splicing acceptor); NLS: (nuclear localization sequence, 핵 국소화 서열); ITR: (Inverted terminal repeats, 역위 말단 반복); MMLV-RT: Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, MMLV 역전사 효소); WPRE: Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element, 우드척 간염바이러스 전사후 조절요소).
도 2는 마우스 Atp7b 유전자좌(locus)의 표적 서열을 나타낸 도이다. 프라임에디팅을 통해 G(빨간색)를 A로 바꾸고자 하였다. 밑줄 부분은 RT 서열을 의미하며, 프라이머 결합 부위(primer binding site: PBS)는 소문자로 표시하였다. 표적 서열의 프로토스페이서(protospacer) 및 PAM은 각각 녹색 선, 파란색 선으로 표시하였다.
도 3의 a는 마우스 Atp7b 유전자의 엑손 8 상에 위치한 표적 서열 및 pegRNA, sgRNA에 의해 절단되는 부위를 나타낸 도이다. pegRNA, sgRNA 스페이서(spacer)는 녹색 선으로 표시하였다. pegRNA, sgRNA 표적 서열의 PAM은 각각 파란색 선, 주황색 선으로 표시하였다. 도 3의 b는 N2A 세포에서 측정한 6개 pegRNA의 편집 효율(efficiency, %)을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 PE3 처리된 마우스의 망막색소상피(왼쪽 그래프), 망막(오른쪽 그래프)에서의 의도된, 의도되지 않은 편집 빈도를 나타낸 도이다. PCR 증폭 및 시퀀싱으로부터 발생하는 오류들을 제외하기 위하여, 실험군의 상기 편집 빈도에서 대조군의 상기 편집 빈도 평균을 빼서 정규화하였다. 표적 뉴클레오티드 주위의 치환은 표적 지점을 중심으로 40bp 범위에서 평가하였다. 인델(indel)은 pegRNA 닉킹 부위를 중심으로 136bp 범위에서 측정하였다. 빨간색 가로선은 정규화된 빈도가 0인 위치를 나타낸다. 데이터는 평균 ± s.d로 나타내었으며, 마우스의 수는 3마리로 하였다.
도 5는 PE3 처리된 마우스의 망막색소상피에서, 표적 서열 내 각 위치에서의 치환 빈도(substitution frequencies)를 나타낸 도이다. 치환 빈도는 PE3로 처리되지 않은 대조군의 배경 프라임에디팅 빈도를 빼서 정규화하였다. 빨간색 가로선은 정규화된 빈도가 0인 위치를 나타낸다. 표적 위치는 +2이다. 데이터는 평균 ± s.d로 나타내었으며, 마우스의 수는 3마리로 하였다.
도 6은 PE3 처리된 야생형 마우스의 망막, 망막색소상피에서의 시퀀싱 결과를 나타낸 도이다. 대조군으로는 PE3을 주사하지 않은(non-injection) 야생형 마우스의 망막, 망막색소상피세포를 사용하였다. 빨간색 뉴클레오티드는 프라임에디팅 표적 염기를 나타낸다.
도 7은 PE3 처리된 마우스의 망막에서, 표적 서열 내 각 위치에서의 치환 빈도(substitution frequencies)를 나타낸 도이다. 치환 빈도는 PE3로 처리되지 않은 대조군의 배경 프라임에디팅 빈도를 빼서 정규화하였다. 빨간색 가로선은 정규화된 빈도가 0인 위치를 나타낸다. 표적 위치는 +2이다. 데이터는 평균 ± s.d로 나타내었으며, 마우스의 수는 3마리로 하였다.
도 8은 rd12 마우스의 RPE65 유전자 (p.R44X) 의 엑손 3의 130번째 위치에 C가 T로 치환되어 발생한 넌센스 돌연변이를 보여주는 도이다.
도 9는 rd12 마우스에서 레베르선천성흑내장(LCA)를 유도하는 넌센스 돌연변이를 편집하기 위한 pegRNA 후보군 NG-PE2 타겟 시퀀스를 확인한 도(도 9A)로서, 프로토스페이서(protospacer)는 초록색으로, 각 타겟 시퀀스의 PAM 서열은 빨간색으로 나타내었고, 각 선 옆의 숫자는 타겟 id를 나타낸다. 또한 pegRNA 및 타겟 시퀀스 쌍의 올리고 라이브러리의 모식도를 도 9B에 나타냈다. 각 pegRNA는 프로토스페이서, PAM 및 이웃 시퀀스(neighboring sequences)를 포함하는 타겟 시퀀스를 포함하는 넓은 타겟 시퀀스와 연결되었고, pegRNA 발현은 인간 U6 프로모터(hU6)에 의하여 유도되었으며, 라이브러리는 5 내지 5개의 상이한 길이(7, 9, 11, 13, 15 또는 17nt)의 PBS를 포함하는 pegRNA와 9 내지 16개의 상이한 길이의 RT 템플릿을 포함하는 총 561개의 pegRNA-타겟 페어를 포함한다. 스페이서(Spacer) : pegRNA의 가이드 시퀀스; RT : 역전사 효소(reverse transcriptase); PBS : 프라이머 바인딩 사이트
도 10은 pegRNA에 따른 프라임에디팅 효율을 확인한 도로서, 구체적으로 NG-PE2 인코딩 플라스미드로 독립적으로 형질감염된 복제물에서 프라임에디팅 효율간의 상관관계를 나타낸 도이다. 빨간색과 검은색 점은 각각 NGG 및 NGH PAM가 있는 해당 표적 서열을 포함한 pegRNA를 나타낸다. 파란색 화살표는 이후 실험을 위해 선택된 pegRNA이며, Spearman(R) 및 Pearson(r) 상관 계수 및 추세선이 표시됩니다. n = 309 pegRNA-표적 서열 쌍
도 11은 rd12 마우스에서의 프라임에디팅에 관한 개요로서, 실험에 사용한 AAV 벡터맵을 나타낸 도이다. 각 벡터에서, 두 ITR(Inverted terminal repeats) 사이의 서열 길이를 괄호 안에 표시하였다. 2개의 트랜스-스플라이싱 PE2-발현 AAV 벡터(TS-PE2-N, TS-PE2-C-WPRE)를 pegRNA를 발현하는 AAV 벡터(U6-pegRNA-mCherry)와 함께 망막하에(subretinal) 주사하였다. 6주 후, 딥 시퀀싱을 위해 망막색소상피세포를 수집하였다. SD: 스플라이싱 도너(splicing donor); SA: 스플라이싱 어셉터(splicing acceptor); NLS: (nuclear localization sequence, 핵 국소화 서열); ITR: (Inverted terminal repeats, 역위 말단 반복); MMLV-RT: Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, MMLV 역전사 효소); WPRE: Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element, 우드척 간염바이러스 전사후 조절요소).
도 12는 AAV-PE2와 mCherry형광을 대리표지마커로 사용하여 AAV-PE2 시스템의 전달 효율을 확인하기 위한 실험의 결과를 확인한 도로서, 형광을 상대적으로 낮은 배율로 확인한 결과(도 12A)로 스케일 바는 500 μm이며, 외족은 미처리된 대조군 rd12 마우스의 망막색소상피를 확인한 것이다. 형광을 높은 배율로 확인한 결과를 도 12B에 확인했고, 스케일 바는 10 μm이다. mCherry-양성 면적을 정량화한 분석 결과 (도 12C)에 나타냈으며, 모든 데이터는 평균 ± sd이고, 마우스 수 n = 4이며, 표시된 p-값은 student's t-검정을 기반으로 하였다.
도 13은 AAV-PE2 처리 rd12 마우스의 RPE에서 의도된 편집 및 의도하지 않은 편집의 빈도를 나타낸 도이다. PCR 증폭 및 시퀀싱으로부터 발생하는 오류들을 제외하기 위하여, 실험군의 상기 편집 빈도에서 대조군의 상기 편집 빈도 평균을 빼서 정규화하였다. 표적 뉴클레오티드 주위의 치환은 표적 지점을 중심으로 40bp 범위에서 평가하였다. 인델(indel)은 pegRNA 닉킹부위를 중심으로 60bp 범위에서 측정하였다. 빨간색 가로선은 정규화된 빈도가 0인 위치를 나타낸다. 데이터는 평균 ± s.d로 나타내었으며, 마우스의 수는 5마리로 하였다.
도 14는 PE2 처리된 rd12 마우스의 RPE에서 표적 서열 내 -20 bp에서 +20 bp 범위의 위치에서의 치환 빈도(substitution frequencies)를 나타낸 도이다. 치환 빈도는 PE2 로 처리되지 않은 rd12 마우스의 RPE의 프라임에디팅 빈도를 빼서 정규화하였다. 빨간색 가로선은 정규화된 빈도가 0인 위치를 나타낸다(로그 스케일 값을 표시하기 위해 y축의 모든 값에 0.5%가 추가된다). 위치는 pegRNA 닉킹 위치에서 번호가 매겨졌다. 표적 위치는 +2이다. 데이터는 평균 ± s.d로 나타내었으며, 마우스의 수는 5마리로 하였다.
도 15는 AAV-PE2 처리된 rd12 마우스의 망막색소상피에서의 의도된 편집 및 의도하지 않은 편집의 빈도를 확인한 결과를 도 15A에 나타내었다. PCR 증폭 및 시퀀싱으로부터 발생하는 오류들을 제외하기 위하여, 실험군의 상기 편집 빈도에서 대조군의 상기 편집 빈도 평균을 빼서 정규화하였다. 표적 뉴클레오티드 주위의 치환은 표적 지점을 중심으로 40bp 범위에서 평가하였다. 인델(indel)은 pegRNA 닉킹부위를 중심으로 60bp 범위에서 측정하였다. 빨간색 가로선은 정규화된 빈도가 0인 위치를 나타낸다. 데이터는 평균 ± s.d로 나타내었으며, 마우스의 수는 5마리로 하였다. 또한 AAV-PE2 처리된 rd12 마우스 망막색소상피에서의 표적 서열 내 표적 서열 내 -20 bp에서 +20 bp 범위의 위치에서의 치환 빈도(substitution frequencies)를 확인한 결과를 도 15B에 나타내었다. 치환 빈도는 PE2 로 처리되지 않은 rd12 마우스의 RPE의 프라임에디팅 빈도를 빼서 정규화하였다. 빨간색 가로선은 정규화된 빈도가 0인 위치를 나타낸다(. 위치는 pegRNA 닉킹 위치에서 번호가 매겨졌다. 표적 위치는 +2이다. 데이터는 평균 ± s.d로 나타내었으며, 마우스의 수는 5마리로 하였다.
도 16은 pegRNA ID 157을 포함한 AAV-PE2에 의한 망막전위도검사를 수행한 결과로 야생형(C57BL/6), 주사되지 않은 대조군(rd12) 및 PE2 발현 AAV(rd12-AAV-PE2)가 주입된 rd12 마우스의 0dB에서의 암적응 ERG 반응의 대표적인 파형을 나타낸 도이다. 스케일 바, 30ms(x축) 및 50μV(y축)
도 17은 pegRNA ID 157을 포함한 AAV-PE2에 의한 망막전위도검사를 수행한 결과로 C57BL/6 및 rd12 마우스의 ERG 반응의 a-파(왼쪽) 및 b-파(오른쪽)의 진폭을 확인한 도이다. 데이터는 평균 ± sd이다. 마우스 수는 n = 5이다. 사후 Tukey 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석의 P-값을 표시했다.
도 18은 Optomotor 반응검사의 결과를 나타낸 도이다. 데이터는 평균 ± sd이며, 마우스 수는 n = 5이다. 사후 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석의 P-값을 표시했다.
이하 일 양상을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 일 양상을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 일 양상의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니며, 일 양상의 실시예 및 실험예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 일 양상을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
실험방법
1. 트랜스-스플라이싱 AAV 벡터의 제조
트랜스-스플라이싱(trans-splicing) PE2 플라스미드를 제조하기 위해, PE2 N 말단(PE2-N term)(Addgene #132775) 및 스플라이싱 도너(splicing donor: SD)(Addgene#112734) 코딩 서열을 하기 [표 3]에 기재한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시키고 NEBuilder HiFi DNA assembly kit(NEB)를 사용하여 px601 플라스미드에 클로닝하였다.
목적 서열 (5'-3') 서열번호
TS-PE2-N cloning 정방향 GCAGAGCTCTCTGGCTAACTACCGGTGCCACCATGAAACGGACAG 5
역방향 GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAG 6
CTGTCTTGTAACCTTGATACTTACGTACTTGGCGGTAGCCTT 7
CATCACTAGGGGTTCCTGCG 8
TS-PE2-C-WPRE cloning 정방향 TCACTAGGGGTTCCTGCGGCCTCTAGACTTGTCGAGACAGAGAAGAC 9
CTTTGCCTTTCTCTCCACAGTTCTTCTACAGCAACATCATGAAC 10
AATCAACCTCTGGATTACAAAAT 11
TTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGTGCCTTCTAGTTGCCAG 12
역방향 CTGTGGAGAGAAAGGCAAAG 13
ATTTTGTAATCCAGAGGTTGATTTGGTGATGATGACCGGTTAGAC 14
GCGGGGAGGCGGCCCAAA 15
CTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCCCATAGAGCCCACCGCAT 16
유사하게, 스플라이싱 어셉터(splicing acceptor: SA)(Addgene#112876), PE2 C 말단 코딩 서열(PE2-C term)(Addgene #132775) 및 WPRE 서열(Addgene #52962)을 PCR 증폭시키고 NEBuilder HiFi DNA assembly kit를 사용하여 pX601 플라스미드에 클로닝하였다.U6-pegRNA-H1-nick sgRNA-mCherry를 제조하기 위하여, pegRNA 코딩 서열, sgRNA 코딩 서열 및 H1 프로모터 서열(Addgene#61089)을 합성 또는 PCR 증폭시키고 NEBuilder HiFi DNA assembly kit를 사용하여 px552-U6-CAG-mCherry 플라스미드에 클로닝하였다. 그런 다음, VectorBuilder Inc(Chicago, Illinois, USA)를 통해 상기 AAV 벡터로부터 생체 내(in vivo) 연구에 필요한 high-grade 아데노-연관 바이러스(Adeno-Associated Virus: AAV) 벡터(혈청형 8)를 수득하였다.
Rd12 마우스 관련 실험에는 TS-PE2-N 플라스미드, TS-PE2-C-WPRE 플라스미드 또는 U6-Rpe65 pegRNA-CAG-mCherry 플라스미드는 AAV2-캡시드 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 HEK 293T 세포에 공동 형질감염시켰다. 3일 후, 세포를 용해시키고, 그런 다음 iodixanol(Optiprep, Sigma; D1556) 구배 초정제를 통해 고급 AAV를 수득하였다. 마지막으로 Centricon tube(Vivaspin 20, Sartorius)를 사용하여 고급 AAV를 얻기 위해 인산염 완충 식염수에 바이러스를 농축하였다.
2. 트랜스-스플라이싱 AAV 벡터의 전달
마우스 눈 관련 연구는 서울대학교 및 서울대학교병원 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 수행하였다. C57BL/6 마우스(Central Laboratory Animal)를 12시간 명암주기(dark/light cycle)로 조절하고, AAV 주사 전 틸레타민(tiletamine)/졸라제팜(zolazepam)(Zoletil 50, Virbac; 30 mg/kg) 및 자일라진(xylazine)(Rompun, Bayer; 10 mg/kg)을 사용하여 마취를 유도하였다. 다음으로, PBS에서 AAV8-TS-PE2-N term 4.9 x 1010vg, AAV8-TS-PE2-C term 4.9 x 1010 vg 및 2.4 x 1010 AAV8-Atp7b pegRNA-sgRNA을 혼합한 총 1.5μl를 마우스 유리체강내(vitreous cavity)로 주사하였다.
3. 딥 시퀀싱(Deep sequencing)
DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen)를 사용하여 마우스 조직(망막, 망막색소상피(Retinal Pigment Epithelium: RPE))으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 표적 서열들은 2X Taq PCR Smart mix(SolGent)를 사용하여 PCR 증폭하였다. 실험에 사용한 PCR 프라이머들은 상기 표 3에 나타내었다.
내인성 부위(endogenous sites)에서 프라임에디팅 효율을 평가하기 위해, 마우스 망막과 망막색소상피 시료에 대한 DNA 주형 500ng을 포함하는 반응액 부피(reaction volume) 50μL에서 표적 서열의 첫번째 PCR 증폭을 수행하였다. Illumina 바코드 서열을 부착시키기 위한 두번째 PCR은 첫번째 PCR로부터 수득한 정제 산물 50ng을 사용하여 반응액 부피 30μL에서 수행하였다. 생성된 앰플리콘들은 겔 정제 후 MiniSeq(Illumina, San Diego, CA)를 사용하여 시퀀싱하였다. 한편, 딥 시퀀싱에 사용된 데이터는 accession No. SRR12778000 하에 NCBI Sequence Read Archive에서 제공된다.
4. 망막전위검사(Electroretinography)
ERG 이전에는 마우스를 밤새 어두운 곳에 두었다. 심부 마취를 유도하고 페닐에프린 염산염(5 mg ml-1)과 트로피카미드(5 mg ml-1)를 함유한 Tropherin 안과 용액을 국소 투여하여 동공을 확장시켰다. 전체 필드 ERG에는 범용 테스트 및 전기 생리학 시스템 2000(UTAS E-2000, LKC)이 사용되었다. 0dB 크세논 플래시에 대한 빛 유도 응답은 60Hz에서 노치 필터를 사용하여 2k gain으로 기록되었다. 반응을 0.1에서 1,500Hz 사이에서 대역통과 필터링하였다. Prism 8(GraphPad)을 사용하여 그래프를 그리고 진폭을 추정하였다. a-파 진폭은 기준선에서 가장 낮은 음으로 가는 전압까지 측정하여 결정되었고 b-파 진폭은 a-파 골에서 양의 b-파의 가장 높은 피크까지 측정되었다.
5. 광운동 반응(Optomotor response)
가상 현실 광운동 시스템(OptoMotry HD, CerebralMechanics)을 시스템에 대한 제조업체의 지침 및 원본 간행물에 따라 격자 시력 시각적 임계값을 측정하였다. 마우스는 인클로저를 둘러싼 모니터에서 가상 회전 실린더의 보기에 노출되는 플랫폼에 배치되었다. 그런 다음 마우스의 머리 움직임으로 격자를 추적하였다. 시각적 임계값은 마우스가 회전 자극에 반응하지 않는 최대 공간 주파수(주기/도)를 생성하기 위해 계단 절차로 결정되었다.
6. 프라임에디팅의 효율 분석
내인성 부위에서 프라임에디팅 빈도를 정량화하기 위하여, Cas-analyzer를 사용하여 앰플리콘 서열들을 참조 서열에 정렬하였다. 치환(substitutions) 및 인델(indel)을 포함하는 의도된, 의도되지 않은 편집 빈도를 (편집된 리드 수/총 리드 수)의 비율로 계산하였다. PCR 증폭 및 시퀀싱으로부터 발생하는 오류들을 제외하기 위하여, 실험군의 상기 편집 빈도에서 대조군의 상기 편집 빈도 평균을 빼서 정규화하였다.
실험결과
실시예 1. 트랜스-스플라이싱 AAV 벡터의 제조
트랜스-스플라이싱 아데노-연관 바이러스(trans-splicing Adeno-Associated Virus:tsAAV) 벡터(혈청형 8)를 사용하여 프라임에디터 도입용 벡터를 제조하였다(도 1). 편집하고자 하는 유전자로는 망막 세포의 생존 또는 기능에 영향을 미치지 않을 것으로 예상되는 Atp7b 유전자를 선택하였다.
Atp7b 유전자의 엑손 8에서 G에서 A로의 치환(G>A)을 유도하는 4개의 pegRNA를 설계하고, neuro2A(N2A) 세포에서 가장 높은 활성을 나타낸 pegRNA를 선택하였다(도 2). 구체적으로, 프라이머 결합 부위와 RT 주형의 길이는 서로 다르되, 동일한 표적 서열을 갖도록 하여 6개의 pegRNA(PBS13nt-RT16nt, PBS13nt-RT15nt, PBS13nt-RT14nt, PBS13nt-RT13nt, PBS11nt-RT14nt 및 PBS11nt-RT13nt)를 설계하였다. 그 결과, 프라이머 결합 부위가 13nt이고 RT 주형 길이가 13nt인 PBS13nt-RT13nt를 포함하는 pegRNA(서열번호 3)의 생체 내 프라임에디터 전달 효율이 가장 높음을 확인하고, 이를 선택하여 실험에 사용하였다(도 3).
sgRNA는 pegRNA의 DNA 결합 부위로부터 다운스트림(downstream) 100bp 서열 내에서 설계 가능한 모든 sgRNA에 대하여 DeepSpCas9(Kim HK et al. (2019) Sci Adv 5, eaax9249.)을 이용하여 Atp7b 유전자에 대한 편집 활성을 분석하였다. 그 중, pegRNA가 결합하는 DNA 가닥에 상보적인 가닥에 결합하는 sgRNA만이 PE3 시스템에 적용이 가능하므로 그것들만 따로 분류하였다(표 4). 그 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 guide sequence(ID 2)를 포함하고, 절단 부위가 +55인 sgRNA(서열번호 4)의 편집 활성이 가장 높음을 확인하고, 이를 선택하여 실험에 사용하였다.
ID 서열(5'-3') DeepSpCas9
score		 서열번호
1 Input
sequence		 AAGCCTACAAATCGCTGAGACACAGGTCCG 22.433 17
Target
sequence		 CGGACCTGTGTCTCAGCGATTTGTAGGCTT 18
Guidesequence CCTGTGTCTCAGCGATTTGT 19
2 Input
sequence		 GGTCCGCCAACATGGACGTACTCATCGTGC 60.005 20
Target
sequence		 GCACGATGAGTACGTCCATGTTGGCGGACC 21
Guidesequence GATGAGTACGTCCATGTTGG 22
3 Input
sequence		 CCGCCAACATGGACGTACTCATCGTGCTCG 55.018 23
Target
sequence		 CGAGCACGATGAGTACGTCCATGTTGGCGG 24
Guidesequence CACGATGAGTACGTCCATGT 25
(상기 표에서, Atp7b 유전자의 엑손 8 상에서 각 sgRNA에 의해 유도된 절단 위치는 다음과 같다. 절단 위치(sgRNA-induced nicking position)는 pegRNA-유도된 절단 부위를 기준으로 다음과 같다: ID 1, +31; ID 2, +55; ID 3, +58) Atp7b 를 표적으로 하는 pegRNA 및 sgRNA를 암호화하는 AAV 벡터와 함께, 다음 2개의 tsAAV 벡터를 제조하여 이후 실험에서 사용하였다: (i) PE2의 N-말단 절반을 암호화하는 제 1 tsAAV 벡터, (ii) PE2의 C-말단 절반을 암호화하는 제2 tsAAV 벡터.
실시예 2. 딥 시퀀싱을 통한 유전체 편집 빈도 분석
상기 실시예 1에서 제조한 벡터들을 마우스 망막색소상피(retinal pigment epithelium: RPE) 및 망막(retina)에 유리체강내(intravitreal) 주사하였다. 6주 후, 마우스들을 안락사시키고 망막색소상피 및 망막을 수득하여 딥 시퀀싱 분석을 수행하였다.
그 결과, 평균 편집 효율은 망막색소상피 및 망막에서 각각 1.82%, 1.87%로 나타났으며, 표적 뉴클레오티드 주변에서 인델(indel) 또는 의도하지 않은 치환은 관찰되지 않음을 확인하였다(도 4 내지 7).
상기 결과를 통해, AAV-매개된 PE3 운반은 망막색소상피 및 망막에서 정교한 유전체 편집을 유도할 수 있음을 확인하였다. 또한, 선행 연구(Jo DH et al. (2019) Science Advances. Vol. 5, no. 10, eaax1210.)에 따르면 인간의 유전적 안구 질환 마우스 모델에서 단지 1.17%의 유전체 편집 빈도만으로도 현저한 망막 기능의 향상을 달성할 수 있음을 고려할 때, 상기 결과는 일 양상에 따른 조성물이 유전체 편집 분야에서 다양한 유전병 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
실시예 3. 유전성 안질환 모델에서 트랜스-스플라이싱 AAV-프라임에디터를 통한 유전자 편집능의 확인
3.1 유전성 안질환 모델에서 생체 내 프라임에디팅을 위한 pegRNA 서열 선별
다른 유전성 안질환 모델에서도 상기 실시예에서 확인한 프라임에디팅이 가능한지 확인하기 위하여 레베르선천성흑내장(Leber congenital amaurosis :LCA) 질환 모델에서 실험을 수행하였다. 편집하고자 하는 유전자는 시각주기에 필수적인 11-cis 레티날을 생산하는 아이소머히드롤라아제(isomerohydrolase)를 인코딩하는 대표적인 유전자인 RPE65 이다. 도 8에 나타난 바와 같이, RPE65 유전자 (p.R44X)의 엑손 3의 130번째 위치에 C가 T로 치환되어 발생한 넌센스 돌연변이를 갖는 rd12 안질환 마우스 모델로 실험을 진행하였다.
상기 넌센스 돌연변이를 프라임에디팅하기 위한 효율적인 pegRNA 서열을 찾아내기 위하여, 돌연변이 부위에서 -52bp ~ +59bp 범위의 위치에 존재하는 NGN PAM을 갖는 표적 서열을 확인한 결과를 도 9A에 나타내었다. 결과에 나타낸 10개의 표적 서열 중 6개는 NGG PAM을 갖고 4개는 NGH PAM을 가진다. 10개의 표적 서열에 대해 5~6개의 다른 길이(7, 9, 11, 13, 15 또는 17 nt)의 PBS와 9~17개의 다른 길이(6~62 nt)의 RT 템플릿을 포함하는 총 561개의 pegRNA를 설계하여 올리고 라이브러리를 구성하였으며, 상기 설계된 올리고 라이브러리의 모식도를 도 9B에 나타내었다.
pegRNA의 효율성을 평가하기 위해 설계된 올리고 라이브러리 풀로부터 렌티바이러스 라이브러리를 제작하였고, HEK 293T 세포에 렌티바이러스 라이브러리를 형질도입하였다. 이후, 세포에 NG-PE2를 코딩하는 플라스미드를 형질주입하여 5일 후에 세포의 핵산을 추출하여 딥 시퀀싱을 수행하였다. 총 2번의 반복실험을 진행하였으며 이 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서 pegRNA 후보군 중 가장 높은 평균 15%의 프라임에디팅 효율은 pegRNA ID 157 (서열번호 28)에서 나타났고 두번째로 높은 평균 14%의 프라임 에티딩 효율은 pegRNA ID 198 (서열번호 29)에서 나타났다. 상기 두개의 pegRNA는 같은 표적서열을 갖지만 pegRNA ID 157은 RT 템플릿 길이가 13nt이고, pegRNA ID 198은 14nt인 점에서 차이가 나타났으며, 이후 실시예에서 pegRNA ID 198과 pegRNA ID 157을 순차적으로 실험에 사용하였다. 또한 일반적으로 NGG PAM이 있는 표적 서열에서 SpCas9가 SpCas9-NG보다 더 높은 활성을 갖고 NGG PAM이 있는 표적에서 PE2가 NG-PE2보다 더 높은 활성을 갖기 때문에 이후 마우스 모델 실험에서 NG-PE2 대신 PE2를 사용하였다.
3.2 LCA 질환 마우스 모델에서 프라임에디팅의 유전자 교정 효율 확인
상기 선별된 pegRNA(pegRNA ID 198)를 통하여 실제적인 rd12 마우스에서 프라임에디팅을 통한 망막 질환의 치료효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 혈청형 2를 갖는 AAV 시스템을 사용하여 상기 실시예 1에서 사용한 PE2와 선택된 pegRNA를 발현시켰다. AAV-PE2 시스템을 3주령의 rd12 마우스의 망막하에 주사하였고 6주 후 마우스들을 안락사시키고 망막색소상피를 수득하여 딥 시퀀싱 분석을 수행하였다. AAV-PE2를 미처리한 Rd12 마우스의 망막색소상피를 대조군으로 사용하였다. 본 실험에서 사용한 PE2를 인코딩하는 AAV 벡터, 질환치료용 pegRNA 및 mCherry를 인코딩하는 AAV 벡터와 전반적인 실험과정을 모식화하여 도 11에 나타내었다.
주사 6주 후에 AAV-PE2 시스템의 생체 내 전달 효율을 확인하기 위하여 마우스의 망막색소상피에서 AAV-PE2의 대리표지 마커인 mCherry 형광을 확인하였고 상대적으로 낮은 배율로 확인한 결과를 도 12A에, 높은 배율로 확인한 결과를 도 12B에 나타내었으며 mCherry-양성 면적을 정량화한 분석결과를 도 12C에 나타내었다. 도 12A 및 12B에서 확인한 바와 같이, 대조군 대비 AAV-PE2 시스템을 투여한 경우 마우스의 망막색소상피에서 형광이 우수하게 발현하는 것으로 보아 상기 유전자 편집 시스템은 높은 효율로 타겟에 전달될 수 있음을 확인할 수 있었다. 도 12C에서 확인한 바와 같이, mCherry-양성 면적을 정량 분석한 결과 대조군 대비 AAV-PE2 시스템은 평균적으로 평균 23%(17% ~ 30%의 범위)의 전달 효율이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
또한 주사 6주 후에 마우스의 망막색소상피세포의 DNA를 분석하여 실제로 의도된 유전자 편집의 빈도와 의도되지 않은 유전자 편집의 빈도를 확인하였으며, 이 결과를 도 13 에 나타내었다. 도 13에서 확인한 바와 같이, 망막색소상피세포에서 분리한 DNA에 대한 딥 시퀀싱을 통해 표적 뉴클레오티드에 4.1% ~ 7.4% (평균 6.4%)의 프라임에디팅 효율이 나타나는 것을 확인하였다.
AAV-PE2가 처리된 마우스의 망막색소상피세포에서 표적 서열 내 -20bp 내지 +20bp 위치에서의 염기 치환빈도를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 확인한 바와 같이, 표적 뉴클레오티드 주변에서 인델(indel) 또는 의도하지 않은 염기 치환은 관찰되지 않았다.
실험을 통해 확인한 망막색소상피세포에 대한 AAV-PE2의 전달효율이 23% 라는 점을 고려할 때, 마우스 질병 모델에 대한 프라임에디팅 효율은 약 28%인 것으로 계산할 수 있다. 또한 선행 연구(Jo DH et al. (2019) Science Advances. Vol. 5, no. 10, eaax1210.)를 통해 확인한 동일한 마우스 모델에서의 CRISPR 뉴클레아제 매개 HDR 방식으로 확인한 편집 효율은 17% ± 8%의 삽입결실 빈도가 나타나면서 1.2% ± 0.3%로 나타나는 것임을 확인하였을 때, 일 양상에 따른 유전자 편집 조성물은 유전자 편집 분야에서 다양한 유전병 치료 용도로 유용하게 사용할 수 있음을 다시 한번 확인할 수 있었다.
3.3 LCA 질환 마우스 모델에서 고효율의 pegRNA를 통한 실제적 유전자 교정 효과의 확인
상기 실시예 3.1에서 확인한 가장 유전자 편집 효율이 높은 pegRNA(pegRNA ID 157)를 사용하여 rd12 마우스에서의 프라임에디팅을 통한 망막 질환의 치료효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 실험 조건은 상기 실시예 3.2와 pegRNA 시퀀스를 제외하고 동일하게 하였다. AAV-PE2 주사 6주 후에 망막색소상피세포의 DNA에 대한 딥시퀀싱 실험을 수행하였고, 의도된 편집 및 의도하지 않은 편집의 빈도를 분석한 결과를 도 15A에 나타냈다. AAV-PE2 처리된 마우스의 망막색소상피세포에서 표적 서열 내 -20 bp에서 +20 bp 범위의 위치에서의 염기 치환 빈도(substitution frequencies)를 확인한 결과를 도 15B에 나타내었다.
도 15A에 나타낸 바와 같이, pegRNA ID 157번을 사용하면, 4.7% 내지 16% (평균 7.7%)의 프라임에디팅 효율을 보임을 확인하였다. 도 15B에 나타낸 바와 같이, 표적 뉴클레오티드 주변에서 인델(indel) 또는 의도하지 않은 염기 치환은 관찰되지 않음을 확인하였다.
pegRNA ID 157을 포함한 AAV-PE2에 의해 유발된 망막 기능 개선 수준을 확인하기 위하여 망막전위도검사(electroretinography :ERG) 및 Optomotor 반응 테스트를 수행하였다. 야생형(C57BL/6), 주사되지 않은 대조군(rd12) 및 PE2-발현 AAV(rd12-AAV-PE2)가 주입된 rd12 마우스를 나누어 실험을 수행하였다.
암-순응 ERG 반응의 대표적인 파형을 확인한 결과를 도 16에 나타내었고, ERG 반응의 a-파(왼쪽) 및 b-파(오른쪽)의 진폭을 확인한 결과를 도 17에 나타내었고, Optomotor 반응 테스트를 확인한 결과를 도 18에 나타내었다.
도 16에서 확인한 바와 같이, pegRNA ID 157가 포함된 PE2-발현 AAV(rd12-AAV-PE2)가 주입된 rd12 마우스에서만 암-순응 ERG 반응으로부터 구출할 수 있음을 확인하였다. 도 17에서 확인한 바와 같이, AAV-PE2로 처리된 rd12 마우스의 암순응 a-파 및 b-파 진폭은 각각 평균 34%(범위, 25%~49%) 및 36%(범위, 32%~41%)인 것을 확인하였고, C57BL/6 마우스와 대비한 경우 AAV-PE2처리 군은 유의할 정도의 진폭의 차이가 나타나는 것을 확인하였다. 도 18에서 확인한 바와 같이, 가상 회전 자극에 대한 공간 역치(spatial thresholds) 도 AAV-PE2 처리 rd12 마우스에서 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 결과를 통하여 AAV-PE2-매개의 프라임에디팅이 LCA 질환 마우스 모델의 유전자형 및 표현형을 정밀하게 교정할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 트랜스-스플라이싱 AAV 벡터를 사용하면 운반 크기(cargo size)가 큰 프라임에디터를 세포에 전달하여 유전체를 매우 정교하게 편집할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물은 표적 서열에 특이적으로 작용하며 높은 정확도로 유전체 교정이 가능하여, 유전체 편집 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> A composition for prime editing comprising trans-splicing adeno-associated virus vector <130> PN141628KR <150> KR 10-2020-0160446 <151> 2020-11-25 <160> 29 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2091 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> prime editor(nCas9-linker-RT) <400> 1 Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly 1 5 10 15 Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys 20 25 30 Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly 35 40 45 Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys 50 55 60 Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe 85 90 95 Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His 100 105 110 Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His 115 120 125 Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu 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Claims (19)

  1. N-말단 닉카아제 Cas9을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 1단편을 발현하는 재조합 벡터;
    C-말단 닉카아제 Cas9에 융합된 역전사효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 2단편을 발현하는 재조합 벡터; 및
    프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA) 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 유전체 편집용 조성물로서,
    상기 프라임에디터 단백질은 닉카아제 Cas9 단백질의 C-말단에 역전사 효소가 융합된 형태인 것인 유전체 편집용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 단편을 암호화하는 핵산 서열은 C-말단에 스플라이싱 도너(splicing donor: SD)가 연결된 것이고,
    상기 제2 단편을 암호화하는 핵산 서열은 N-말단에 스플라이싱 어셉터(splicing acceptor: SA)가 연결된 것인, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 프라임에디터 단백질의 제1 단편은 서열번호 1의 1번째 아미노산 잔기부터 1035번째 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편을 포함하고,
    상기 프라임에디터 단백질의 제2 단편은 서열번호 1의 1036번째 아미노산 잔기부터 1368번째 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편을 포함하고, C-말단에 역전사효소(reverse transcriptase)가 융합된 것인, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터로서 혈청형 8 또는 혈청형 2 유래인 것인, 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 프라임에디터 단백질은 닉카아제 Cas9 단백질의 C-말단과 역전사 효소 사이에 링커를 더 포함하는 것인, 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 프라임에디터 단백질은 핵 국재화 서열(nuclear localization sequence: NLS)을 더 포함하는 것인, 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA) 서열을 포함하는 재조합 벡터는 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA) 서열을 더 포함하는 것인, 조성물.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 진핵 세포 또는 진핵 유기체의 유전체 편집에 사용하기 위한 것인, 조성물.
  9. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 유전체 편집용 키트.
  10. N-말단 닉카아제 Cas9을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 1단편을 발현하는 재조합 벡터;
    C-말단 닉카아제 Cas9에 융합된 역전사효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 2단편을 발현하는 재조합 벡터; 및
    프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA) 서열을 포함하는 재조합 벡터를 각각 분리된 진핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 유기체에 도입하는 단계를 포함하고,
    상기 프라임에디터 단백질은 닉카아제 Cas9 단백질의 C-말단에 역전사 효소가 융합된 형태인 것인 유전체를 편집하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 제1 단편을 암호화하는 핵산 서열은 C-말단에 스플라이싱 도너(splicing donor: SD)가 연결된 것이고,
    상기 제2 단편을 암호화하는 핵산 서열은 N-말단에 스플라이싱 어셉터(splicing acceptor: SA)가 연결된 것인, 방법.
  12. 청구항 10에 있어서,
    상기 프라임에디터 단백질의 제1 단편은 서열번호 1의 1번째 아미노산 잔기부터 1035번째 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편을 포함하고,
    상기 프라임에디터 단백질의 제2 단편은 서열번호 1의 1036번째 아미노산 잔기부터 1368번째 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편을 포함하고, C-말단에 역전사효소(reverse transcriptase)가 융합된 것인, 방법.
  13. 청구항 10에 있어서,
    상기 프라임에디터 단백질의 제1 단편 및 제2 단편은 세포 내에서 각각 발현 및 융합하여 프라임에디터 단백질을 형성하는 것인, 방법.
  14. 청구항 10에 있어서,
    상기 프라임에디터 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것인, 방법.
  15. 청구항 10에 있어서,
    상기 프라임에디터 단백질은 핵 국재화 서열(nuclear localization sequence: NLS)을 더 포함하는 것인, 방법.
  16. 청구항 10에 있어서,
    상기 프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA) 서열을 포함하는 재조합 벡터는 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA) 서열을 더 포함하는 것인, 방법.
  17. 청구항 10에 있어서,
    상기 재조합 벡터의 도입은 국소 주입법, 미세주사법(microinjection), 전기천공법(electroporation) 및 리포펙션(lipofection) 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 수행되는 것인, 방법.
  18. 청구항 10에 있어서,
    상기 유전체를 편집하는 방법은 프라임에디팅에 의해 수행되는 것인, 방법.
  19. N-말단 닉카아제 Cas9을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 1단편을 발현하는 재조합 벡터;
    C-말단 닉카아제 Cas9에 융합된 역전사효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 프라임에디터 단백질의 제 2단편을 발현하는 재조합 벡터; 및
    프라임에디팅 가이드 RNA(pegRNA) 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 망막질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 조성물로서,
    상기 프라임에디터 단백질은 닉카아제 Cas9 단백질의 C-말단에 역전사 효소가 융합된 형태인 것인 망막질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.

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