CN102329784A - 一种日本乙型脑炎病毒样颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本乙型脑炎病毒样颗粒（Virus Likeparticles,VLPs）及其制备方法和应用。该病毒样颗粒是由日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)的PrM/E基因和核苷酸序列如SEQIDNO:1的JEVRNA复制子组装而成。该病毒样颗粒的制备方法是将RT-PCR扩增的JEVPrM/E基因连接到Tet-onadvance表达系统的质粒pTRE-Tight中，形成重组载体，Xfect法转染HelaTet-onadvanced细胞，经HygB筛选鉴定后，有限稀释法获得可调控的稳定表达PrM/E基因的Hela细胞系，诱导可表达PrM/E蛋白，可包装出常规的病毒样颗粒；用JEV复制子RNA载体转染该Hela细胞系，可包装出具有“一过性感染”能力的病毒样颗粒。本发明的日本乙型脑炎病毒样颗粒可以用于制备疫苗或作为检测试剂，具有良好的免疫原性和反应性，安全可靠。

Description

一种日本乙型脑炎病毒样颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种日本乙型脑炎病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

日本乙型脑炎，又称流行性乙型脑炎（简称乙脑），是由日本乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV）引起的。流行广泛，主要通过蚊子传播，是严重威胁人畜健康的一种急性传染病，也是我国及亚洲地区夏秋季流行的主要传染病之一。

JEV是单股正链RNA，长约11kb，分子量约4.2×10⁶D，在CsCl中的浮密度为1.24~1.25g/ml。病毒由脂质双层包裹核衣壳，基因组5’端的帽子结构m7GpppAmp，对感染性和稳定性无影响，其后是保守的AG序列。3’末端为CU_OH，不含polyA尾。病毒RNA只有一个开放阅读框架（ORF），在ORF两侧5’端大约95bp，3’端有大约582 bp的非编码区，顺序为NH₂-C-PrM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-COOH。根据已明确的黄病毒相关区域蛋白功能特点分析，与免疫研究有关的基因主要集中与PrM、E及NS1蛋白编码基因上。

JEV的结构蛋白包括C蛋白、M蛋白和E蛋白。C蛋白（核衣壳蛋白）分子量13.9kDa，由120个氨基酸组成，其39~54位氨基酸序列在黄病毒属中具有保护性。C端疏水性氨基酸将其固定在宿主细胞的粗面内质网膜上，以便装配成包裹基因组的核衣壳，使之免受核酸酶的破坏。M蛋白（膜蛋白）分子量8.3 kDa，由75个氨基酸残基组成，前体蛋白PrM对E蛋白的正确折叠、定位于膜上和最后的装配至关重要。在病毒粒子释放同时或释放之前一瞬间，PrM切割形成M蛋白。PrM切割不完全就成为中和抗体的靶子。利用表达JEV的PrM及E蛋白的质粒载体转染COS-1细胞，在培养液中检测到类病毒颗粒，用质粒作基因疫苗免疫老鼠表达中和抗体活性。PrM是病毒诱发保护性免疫的协同成分，M蛋白能诱发轻度中和抗体。E蛋白是主要结构蛋白，影响病毒毒力，病毒入侵和病毒的免疫原性。分子量53 kDa，含500个氨基酸残基，甘氨酸和丙氨酸含量最高。E蛋白中高甘露糖侧链的存在对病毒蛋白的抗原性有重要影响。E蛋白是主要的囊膜蛋白和毒粒表面最中药的成分，它与病毒粒子的吸附、穿入、致病等密切相关。E蛋白也是体外中和作用的主要靶位点、FEV特异性抗体的作用位点；具有血凝活性和中和活性，能和血凝抑制抗体结合，能刺激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒攻击。目前针对黄病毒的疫苗大多包含E蛋白中的抗原表位。

病毒样颗粒（Virus-Like Particles, VLPs）是含有某种病毒的一个或者多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸（DNA/RNA），不能自主复制，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力。近年来发现多数病毒的衣壳蛋白基因在真核表达系统以及少数病毒的衣壳蛋白基因在原核表达系统中都能够有效地实现自我组装，这为病毒的基础研究（基因治疗、药物治疗等）及疫苗的开发提供了便利条件。由于VLPs没有感染性，作为免疫原，它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应，而宿主、病毒和疫苗因素共同决定VLPs产生的机体防护水平。

国内外目前虽然已经有日本乙型脑炎病毒样颗粒报道，但因公认的黄病毒5’端的蛋白的不稳定性或毒性原因，存在一定的问题。现在的研究热点主要集中在结构蛋白的长度选取、表达的载体系统、表达的哺乳动物细胞、转染复制子载体的结构等方面。本研究中所采用的Tet-on advance表达系统是改进型表达系统（具有更高的灵敏性，更低的本底表达和诱导后极高的表达，诱导水平可以增加100倍，表达量比常规的CMV启动子要高很多），该系统具有严密性、特异性、高效性等优点，被认为是目前最理想的真核基因表达调控系统之一，在没有四环素的情况下表达水平为零，非常适用于不稳定或毒性基因的研究。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种日本乙型脑炎病毒样颗粒。

本发明的另一目的是提供上述日本乙型脑炎病毒样颗粒的制备方法。

本发明的又一目的是提供上述日本乙型脑炎病毒样颗粒的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种日本乙型脑炎病毒样颗粒，是由日本乙型脑炎病毒PrM/E基因或日本乙型脑炎病毒PrM/E基因和有复制缺陷的日本乙型脑炎病毒复制子RNA组装而成，所述复制子RNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述有复制缺陷的日本乙型脑炎病毒RNA复制子是将RNA病毒基因组中的结构基因删除，而保留其非结构基因和非编码区的顺式作用元件，复制子利用正链RNA 病毒的自主复制特性，能够在细胞中表达病毒的非结构蛋白和外源蛋白。

一种上述日本乙型脑炎病毒样颗粒的制备方法，步骤为：扩增日本乙型脑炎病毒PrM/E基因，将扩增产物连接到Tet-on advance表达系统的质粒pTRE-Tight中，形成重组载体，Xfect法转染Hela Tet-on advanced 细胞，经HygB筛选鉴定后，有限稀释法获得可调控的稳定表达PrM/E基因的Hela细胞系，强力霉素诱导表达PrM/E蛋白，可包装出常规的病毒样颗粒；用包含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示RNA复制子的载体转染可调控的稳定表达PrM/E蛋白的Hela细胞系，可包装出具有“一过性感染”能力的病毒样颗粒。

所述扩增日本乙型脑炎病毒疫苗株的PrM/E基因是以日本乙型脑炎病毒疫苗的总RNA为模板，用RT-PCR方法得到日本乙型脑炎病毒疫苗株cDNA，设计引物序列如SEQ ID NO:2~3，扩增得到PrM/E基因。

转染Hela Tet-on advanced 细胞的重组载体的浓度为500ng/μl。优选每6×10⁶个Hela Tet-on advanced 细胞转染7.5μg前述浓度的重组载体。

优选添加HygB的浓度最低为200μg/mL，强力霉素的浓度为1μg/mL。

上述制备方法中，RNA复制子载体的构建方法参见申请号为201110135709.9的专利“一种基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统及其构建方法和应用”。

上述日本乙型脑炎病毒样颗粒在疫苗制备或诊断试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

具有“一过感染性”

利用本发明构建的稳定表达JEV PrM/E蛋白的Hela细胞系，借助RNA复制子载体系统，可以利用Hela细胞系提供的结构蛋白将RNA复制子包装出“一过感染性”的病毒样颗粒，滴度为6×10⁶UI/mL（如图1）。将病毒样颗粒感染BHK-21细胞后，仅第一轮能够检测到非结构蛋白的表达（如图2），因为RNA复制子是有复制缺陷的，病毒样颗粒感染细胞后，仅具有“一过感染性”，作为疫苗具有安全性。

本发明的病毒样颗粒包裹乙脑病毒RNA复制子，类似于假病毒，可以进行一过感染性复制，有效刺激机体产生体液和细胞免疫，同时保留了病毒的空间构象和表位，具有更好的免疫原性和反应性。

2.良好的稳定性和可调控性

本发明构建的表达系统是可以调控表达的系统，即Tet-on advance表达系统是改进型表达系统（具有更高的灵敏性，更低的本底表达和诱导后极高的表达，诱导水平可以增加100倍，表达量比常规的CMV启动子要高很多），该系统具有严密性、特异性、高效性等优点，被认为是目前最理想的真核基因表达调控系统之一，在没有四环素的情况下表达水平为零，非常适用于不稳定或毒性基因的研究。可以克服PrM-E蛋白对细胞的毒性而无法建立细胞系的问题，本发明选用hela细胞，可以高效包装出具有活性的病毒样颗粒。

良好的免疫原性

本发明的病毒样颗粒作为疫苗，可以有效刺激机体产生免疫反应，不但能够刺激体液免疫，还可以进入感染细胞，通过MHCⅠ类途径进行递呈，实现CD8⁺细胞介导的保护性免疫反应。用滴度为6×10⁶UI/mL免疫小鼠后，ELISA抗体水平、中和抗体水平均与商品化弱毒苗SA-14-14-2株相当，攻毒保护率为85%（6/7），显示良好的免疫原性。

4.良好的反应性

本发明的病毒样颗粒保留了天然病毒的空间构象和诱导中和抗体的表位，在结构，功能方面与真实的病毒粒子非常相似，我们将其作为非感染的诊断试剂包被ELISA板，与全病毒包被的商品化试剂盒具有90%以上的相符性，具有很好的反应性。

附图说明

图1. IFA法测定病毒样颗粒的滴度，其中A为病毒样颗粒10^-2稀释的IFA结果（×100）；B为病毒样颗粒10^-3稀释的IFA结果（×200）；C为病毒样颗粒10^-4稀释的IFA结果（×200）；其中绿色荧光部分即为细胞。

图2. NS基因RT-PCR产物电泳图，M为DNA marker DL2,000，1为第一轮感染的细胞RT-PCR产物，2为第二轮感染的细胞RT-PCR产物。

图3. PrM/E基因cDNA PCR产物，1为DL 2,000 Marker，2为PrM/E基因PCR产物，3. DL15,000 Marker。

图4. 重组质粒pTRE-Tight-JME的酶切鉴定电泳图，1为DL2,000DNA Marker；2为pTRE-Tight-JME的酶切结果；3为λ-EcoT14 I digest Marker。

图5. pTRE-Tight-JME转染细胞后的间接免疫荧光检测图，A为pTRE-Tight-JME转染后经1μg/mL Dox诱导的Hela细胞(×200)；B为pTRE-Tight-JME转染后未加Dox的Hela细胞(×200)；其中绿色荧光部分为细胞。

图6. 不同剂量的pTRE-Tight-EGFP转染细胞48h结果，A.剂量为7.5μg重组质粒转染的Hela细胞(×200)，B.剂量为5μg重组质粒转染的Hela细胞(×200)，C.剂量为2.5μg重组质粒转染的Hela细胞(×200)；其中绿色荧光部分为细胞。

图7. 不同浓度的HygB杀伤Hela细胞10天的结果，A浓度为100 μg/mL的HygB杀伤细胞10天观察结果(×200)，B浓度为150 μg/mL的HygB杀伤细胞10天观察结果(×200)，C浓度为200 μg/mL的HygB杀伤细胞10天观察结果(×200)，D浓度为250 μg/mL的HygB杀伤细胞10天观察结果(×200)。

图8. 筛选出稳定表达PrM/E蛋白的Hela细胞IFA鉴定结果，其中绿色荧光部分显示能稳定表达PrM/E蛋白的Hela细胞。

图9. 透射电镜观察常规病毒样颗粒形态(30000×)。

图10. 透射电镜观察“一过性感染”病毒样颗粒形态(20000×)。

图11. 免疫小鼠血清的ELISA抗体水平检测。

具体实施方式

以下结合实施例进一步解释本发明，但实施例不对发明构成任何形式的限制。实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规实验试剂和步骤。

实施例1重组质粒pTRE-Tight-JME和pTRE-Tight-EGFP的构建

提取日本乙型脑炎病毒(JEV)疫苗株（中牧实业股份有限公司产品，生产批号为1101001-1）的总RNA，反转录合成cDNA，并以此为模板，SEQ ID NO:2~3所示的序列为引物扩增JEV疫苗株的PrM/E基因（如图3）。酶切鉴定及测序正确的序列用限制性内切酶BamH                                                

和EcoR

进行双酶切，把该基因插入到同样经过双酶切的Tet-on advance系统（Clontech公司产品）的表达质粒pTRE-Tight中，重组质粒进行酶切鉴定（如图4），鉴定结果正确的质粒命名为pTRE-Tight-JME。

质粒pTRE-Tight-JME用Xfect法（Clontech公司Xfect试剂protocol，按说明书进行）瞬时转染Hela Tet-on advanced细胞，经四环素诱导后，间接免疫荧光（IFA）鉴定Tet-on系统可以用来调控PrM/E基因表达。如图5，图5A表示pTRE-Tight-JME转染后经1μg/mL 强力霉素(Dox)诱导的Hela细胞(×200)，图5B表示pTRE-Tight-JME转染后未加Dox的Hela细胞(×200)。表明Dox诱导Hela细胞表达PrM/E基因。

研究Hela细胞对质粒量的耐受性及转染效率，发现转染7.5μg质粒（浓度为500ng/μl，转染Hela细胞数量为约6×10⁶个）效果最优（如图6，7.5μg组转染Hela细胞效率最高），用不同浓度的HygB去筛选细胞，做细胞杀伤曲线，确定HygB最低有效浓度为200μg/mL（如图7）。用pTRE-Tight-JME质粒与HygB selective marker按照最佳摩尔比共转染Hela细胞，48h后加最低有效浓度的HygB筛选细胞20天，挑取细胞克隆进行IFA鉴定，选取阳性率高的细胞克隆进行纯化及鉴定，最终获得稳定表达JEV PrM/E的Hela细胞系（如图8）。

将Hela细胞系加入1μg/mL的Dox进行诱导表达JEV结构蛋白，电镜下可以观察到直径为30nm的常规病毒样颗粒（如图9）。将Hela细胞系转染复制子载体pJEV-REP-GFP（SEQ ID NO:4），经电镜（如图10）和间接免疫荧光鉴定后，可以包装出滴度为6×10⁶UI/mL“一过性感染”的病毒样颗粒（如图1）。将滴度为6×10⁶UI/mL的“一过性感染”VLPs和常规VLPs免疫小鼠后，用间接ELISA方法可以检测到特异性抗体，与商品化弱毒疫苗SA14-14-2株兽用（为中牧实业股份有限公司产品，生产批号为1101001-1）的抗体水平相当（如图11），二免后血清中和抗体滴度为1:128。免疫28天后用100TCID₅₀的乙脑病毒BJB株进行攻毒保护试验，免疫“一过性感染”VLPs和常规VLPs组小鼠均有85%（6/7）的保护率，商品化弱毒疫苗的保护率为100%（7/7）（如表1）。实验结果表明JEV病毒样颗粒良好的免疫原性。作为诊断抗原包被ELISA板，检测临床猪血清样品，与全病毒包被的商品化试剂盒平行检测，具有90%以上的符合率，证明JEV病毒样颗粒良好的反应性。

表1免疫小鼠攻毒保护结果

组别	病毒剂量	攻毒方式	存活率（存活数/实验数）
				对照组	30μL	脑内注射	0%（0/7）
“一过性感染”的VLPs	30μL	脑内注射	85%（6/7）
				常规VLPs	30μL	脑内注射	85%（6/7）
JEV弱毒疫苗	30μL	脑内注射	100%（7/7）

注：表1中对照组为注射生理盐水，“一过性感染”的VLPs组为注射本实施例制备的JEV病毒样颗粒，常规VLPs组是指没有转染RNA复制子的细胞表达的PrM/E蛋白形成的病毒样颗粒，JEV弱毒疫苗组为注射商品化弱毒疫苗SA14-14-2株（兽用）。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  一种日本乙型脑炎病毒样颗粒及其制备方法和应用

 

<130> 

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  10971

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

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atttgcaccc tggttcaggg aaaaccagga aaattctgcc acaaataatt aaggacgcta   4920

 

tccagcagcg cctaagaaca gctgtgttgg caccgacgcg ggtggtagca gcagaaatgg   4980

 

cagaagtttt gagagggctc ccagtacgat atcaaacttc agcagtgcag agagagcacc   5040

 

aagggaatga aatagtggat gtgatgtgcc acgccactct gacccataga ctgatgtcac   5100

 

cgaacagagt gcccaactac aacctatttg tcatggatga agctcatttc accgacccag   5160

 

ccagtatagc cgcacgagga tacattgcta ccaaggtgga attaggggag gcagcagcca   5220

 

tctttatgac agcgaccccg cctggaacca cggatccttt tcctgactca aatgccccaa   5280

 

tccatgattt gcaagatgag ataccagaca gggcatggag cagtggatac gaatggatca   5340

 

cagaatatgc gggtaaaacc gtgtggtttg tggcgagcgt aaaaatgggg aatgagattg   5400

 

caatgtgcct ccaaagagcg gggaaaaagg tcatccaact caaccgcaag tcctatgaca   5460

 

cagaataccc aaaatgtaag aatggagact gggattttgt cattaccacc gacatctctg   5520

 

aaatgggggc caacttcggt gcgagcaggg tcatcgactg tagaaagagc gtgaaaccca   5580

 

ccatcttaga agagggagaa ggcagagtca tcctcggaaa cccatctccc ataaccagtg   5640

 

caagcgcagc tcaacggagg ggcagagtag gcagaaaccc caatcaagtt ggagatgaat   5700

 

accactatgg gggggctacc agtgaagatg acagtaacct agcccattgg acagaggcaa   5760

 

agatcatgtt agataacata cacatgccca atggactggt ggcccagctc tatggaccag   5820

 

agagggaaaa ggctttcaca atggatggcg aataccgtct cagaggtgaa gaaaagaaaa   5880

 

acttcttaga gctgcttagg acggctgacc tcccggtgtg gctggcctac aaggtggcgt   5940

 

ccaatggcat tcagtacacc gacagaaagt ggtgttttga tgggccgcgt acgaatgcca   6000

 

tactggagga caacaccgag gtagagatag tcacccggat gggtgagagg aaaatcctca   6060

 

agccgagatg gcttgatgca agagtttatg cagatcacca ggccctcaag tggttcaaag   6120

 

actttgcagc agggaagaga tcagccgtta gcttcataga ggtgctcggt cgcatgcctg   6180

 

agcatttcat gggaaagacg cgggaagctt tagacaccat gtacttggtt gcaacggctg   6240

 

agaaaggtgg gaaagcacac cgaatggctc tcgaagagct gccagatgca ctggaaacca   6300

 

tcacacttat tgtcgccatt actgtgatga caggaggatt cttcctacta atgatgcagc   6360

 

gaaagggtat agggaagatg ggtcttggag ctctagtgct cacactagct accttcttcc   6420

 

tgtgggcggc agaggttcct ggaaccaaaa tagcagggac cctgctgatc gccctgctgc   6480

 

tgatggtggt tctcatccca gaaccggaaa aacagaggtc acagacagat aaccaactgg   6540

 

cggtgtttct catctgtgtc ttgaccgtgg ttggagtggt ggcagcaaac gagtacggga   6600

 

tgctagaaaa aaccaaagcg gatctcaaga gcatgtttgg cggaaagacg caggcatcag   6660

 

gactgactgg attgccaagc atggcactgg acctgcgtcc agccacagcc tgggcactgt   6720

 

atggggggag cacagtcgtg ctaacccctc ttctgaagca cctgatcacg tcggaatacg   6780

 

tcaccacatc gctagcttca attaactcac aagctggctc attattcgtc ttgccacgag   6840

 

gcgtgccttt taccgaccta gacttgactg ttggcctcgt cttccttggc tgttggggtc   6900

 

aagtcaccct cacaacgttt ctgacagcca tggttctggc gacacttcac tatgggtaca   6960

 

tgctccctgg atggcaagca gaagcactca gggctgccca gagaaggaca gcggctggaa   7020

 

taatgaagaa tgccgttgtt gacggaatgg tcgccactga tgtgcctgaa ctggaaagga   7080

 

ctactcctct gatgcaaaag aaagtcggac aggtgctcct cataggggta agcgtggcag   7140

 

cgttcctcgt caaccctaat gtcaccactg tgagagaagc aggggtgttg gtgacggcgg   7200

 

ctacgcttac tttgtgggac aatggagcca gtgccgtttg gaattccacc acagccacgg   7260

 

gactctgcca tgtcatgcga ggtagctacc tggctggagg ctccattgct tggactctca   7320

 

tcaagaacgc tgataagccc tccttgaaaa ggggaaggcc tgggggcagg acgctagggg   7380

 

agcagtggaa ggaaaaacta aatgccatga gtagagaaga gttttttaaa taccggagag   7440

 

aggccataat cgaggtggac cgcactgaag cacgcagggc cagacgtgaa aataacatag   7500

 

tgggaggaca tccggtttcg cgaggctcag caaaactccg ttggctcgtg gagaaaggat   7560

 

ttgtctcgcc aataggaaaa gtcattgatc tagggtgtgg gcgtggagga tggagctact   7620

 

acgcagcaac cctgaagaag gtccaggaag tcagaggata cacgaaaggt ggggcgggac   7680

 

atgaagaacc gatgctcatg cagagctacg gctggaacct ggtctccctg aagagtggag   7740

 

tggacgtgtt ttacaaacct tcagagccca gtgataccct gttctgtgac ataggggaat   7800

 

cctccccaag tccagaagta gaagaacaac gcacactacg cgtcctagag atgacatctg   7860

 

actggttgca ccgaggacct agagagttct gcattaaagt tctctgccct tacatgccca   7920

 

aggttataga aaaaatggaa gttctgcagc gtcgcttcgg aggtgggcta gtgcgtctcc   7980

 

ccctgtcccg aaactccaat cacgagatgt attgggttag tggagccgct ggcaatgtgg   8040

 

tgcacgctgt gaacatgacc agccaggtat tactggggcg aatggatcgc acagtgtgga   8100

 

gagggccaaa gtatgaggaa gatgtcaacc tagggagcgg aacaagagcc gtgggaaagg   8160

 

gagaagtcca tagcaatcag gagaaaatca agaagagaat ccagaagctt aaagaagaat   8220

 

tcgccacaac gtggcacaaa gaccctgagc atccataccg cacttggaca taccacggaa   8280

 

gctatgaagt gaaggctact ggctcagcca gctctctcgt caacggagtg gtgaagctca   8340

 

tgagcaaacc ttgggacgcc attgccaacg tcaccaccat ggccatgact gacaccaccc   8400

 

cttttggaca gcaaagagtt ttcaaggaga aagttgacac gaaggctcct gagccaccag   8460

 

ctggagccaa ggaagtgctc aacgagacca ccaactggct gtgggcctac ttgtcacggg   8520

 

aaaaaagacc ccgcttgtgc accaaggaag aattcattaa gaaagttaac agcaacgcgg   8580

 

ctcttggagc agtgttcgct gaacagaatc aatggagcac ggcgcgtgag gctgtggatg   8640

 

acccgcggtt ttgggagatg gttgatgaag agagggaaaa ccatctgcga ggagagtgtc   8700

 

acacatgtat ctacaacatg atgggaaaaa gagagaagaa gcctggagag tttggaaaag   8760

 

ctaaaggaag cagggccatt tggttcatgt ggcttggagc acggtatcta gagtttgaag   8820

 

ctttggggtt cctgaatgaa gaccattggc tgagccgaga gaattcagga ggtggagtgg   8880

 

aaggctcagg cgtccaaaag ctgggataca tcctccgtga catagcagga aagcaaggag   8940

 

ggaaaatgta cgctgatgat accgccgggt gggacactag aattaccaga actgatttag   9000

 

aaaatgaagc taaggtactg gagctcctag acggtgaaca ccgcatgctc gcccgagcca   9060

 

taattgaact gacttacagg cacaaagtgg tcaaggtcat gagacctgca gcagaaggaa   9120

 

agaccgtgat ggacgtgata tcaagagaag atcaaagggg gagtggacag gtggtcactt   9180

 

atgctcttaa cactttcacg aacatcgctg tccagctcgt caggctgatg gaggctgagg   9240

 

gggtcattgg accacaacac ttggaacatc tacctaggaa aaacaagata gctgtcagga   9300

 

cctggctctt tgagaatgga gaggagagag tgaccaggat ggcgatcagc ggagacgact   9360

 

gtgccgtcaa accgctggac gacagattcg ccacagccct ccacttcctc aacgcaatgt   9420

 

caaaggtcag aaaagacatc caggaatgga agccttcgca tggctggcac gattggcagc   9480

 

aagttccctt ctgttctaac cattttcagg agattgtgat gaaagatgga aggagtatag   9540

 

ttgtcccgtg cagaggacag gatgagctga taggcagggc tcgcatctct ccaggagctg   9600

 

gatggaatgt gaaggacaca gcttgcctgg ccaaagcata tgcacagatg tggctactcc   9660

 

tatacttcca tcgcagggac ttgcgtctca tggcaaatgc gatttgctca gcagtgccag   9720

 

tagattgggt gcccacaggc aggacatcct ggtcaataca ctcgaaagga gagtggatga   9780

 

ccacggaaga catgctgcag gtctggaaca gagtttggat tgaagaaaat gaatggatga   9840

 

tggacaagac tccaatcaca agctggacag acgttccgta tgtgggaaag cgcgaggaca   9900

 

tctggtgtgg cagcctcatc ggaacgcgat ccagagcaac ctgggctgag aacatctatg   9960

 

cggcgataaa ccaggttaga gctgtcattg ggaaagaaaa ttatgttgac tacatgacct  10020

 

cactcaggag atacgaagac gtcttgatcc aggaagacag ggtcatctag tgtgatttaa  10080

 

ggtagaaaag tagactatgt aaacaatgta aatgagaaaa tgcatgcata tggagtcagg  10140

 

ccagcaaaag ctgccaccgg atactgggta gacggtgctg cctgcgtctc agtcccagga  10200

 

ggactgggtt aacaaatctg acaacagaaa gtgagaaagc cctcagaacc gtctcggaag  10260

 

taggtccctg ctcactggaa gttgaaagac caacgtcagg ccacaaattt gtgccactcc  10320

 

gctagggagt gcggcctgcg cagccccagg aggactgggt taccaaagcc gttgaggccc  10380

 

ccacggccca agcctcgtct aggatgcaat agacgaggtg taaggactag aggttagagg  10440

 

agaccccgtg gaaacaacaa catgcggccc aagccccctc gaagctgtag aggaggtgga  10500

 

aggactagag gttagaggag accccgcatt tgcatcaaac agcatattga cacctgggaa  10560

 

tagactggga gatcttctgc tctatctcaa catcagctac taggcacaga gcgccgaagt  10620

 

atgtagctgg tggtgaggaa gaacacagga tctggccggc atggtcccag cctcctcgct  10680

 

ggcgctggct gggcaacatt ccgaggggac cgtcccctcg gtaatggcga atgggacctc  10740

 

gagcagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa  10800

 

aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct  10860

 

gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggaga  10920

 

tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtaggtac c           10971

 

 

<210>  2

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

aacgaattca ccatgggagg aaatgaaggc tcaatc                               36

 

 

<210>  3

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ttcggatcct taagcatgca cattggtcgc taagaac                              37

 

 

<210>  4

<211>  12130

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccaccac tgatttgagc gtcagatttc gtgatgcttg     60

 

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacggc tttggcggcc gctagttatt aatagtaatc    120

 

aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt    180

 

aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta    240

 

tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg    300

 

gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga    360

 

cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt    420

 

tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg    480

 

gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc    540

 

cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg    600

 

taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat    660

 

aagcagagct ggtttagtga accgagaagt ttatctgtgt gaacttcttg gcttagtatc    720

 

gtagagaaga atcgagagat tagtgcagtt taaacagttt tttagaacgg aagataacca    780

 

tgactaaaaa accaggaggg cccggtaaaa accgggctat caatatgctg aaacgcggcc    840

 

taccccgcac tagtatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc    900

 

tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg    960

 

gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg   1020

 

tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc   1080

 

ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg   1140

 

agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg   1200

 

agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca   1260

 

acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg   1320

 

acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca   1380

 

gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc   1440

 

tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc   1500

 

gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg   1560

 

agctgtacaa ggtcgaccga gaccgatcaa ttgctttggc cttcttagcc acaggaggtg   1620

 

tgctcgtgtt cttagcgacc aatgtgcatg ctgacactgg atgtgccatt gacatcacaa   1680

 

gaaaagagat gagatgtgga agtggcatct tcgtgcacaa cgacgtggaa gcctgggtgg   1740

 

ataggtataa atatttgcca gaaacgccca gatccctagc gaagatcgtc cacaaagcgc   1800

 

acaaggaagg cgtgtgcgga gtcagatctg tcactagact ggagcaccaa atgtgggaag   1860

 

ccgtaaggga cgaattgaac gtcctgctca aagagaatgc agtggacctc agtgtggttg   1920

 

tgaacaagcc cgtgggaaga tatcgctcag cccctaaacg cctatccatg acgcaagaga   1980

 

agtttgaaat gggctggaaa gcatggggaa aaagcatcct ctttgccccg gaattggcta   2040

 

actccacatt tgtcgtagat ggacctgaga caaaggaatg ccctgatgag cacagagctt   2100

 

ggaacagcat gcaaatcgaa gacttcggct ttggcatcac atcaacccgt gtgtggctga   2160

 

aaattagaga ggagagcact gacgagtgtg atggagcgat cataggcacg gctgtcaaag   2220

 

gacatgtggc agtccatagt gacttgtcgt actggattga gagtcgctac aacgacacat   2280

 

ggaaacttga gagggcagtc tttggagagg tcaaatcttg cacttggcca gagacacaca   2340

 

ccctttgggg agatgatgtt gaggaaagtg aactcatcat tccgcacacc atagccggac   2400

 

caaaaagcaa gcacaatcgg agggaagggt ataagacaca aaaccaggga ccttgggatg   2460

 

agaatggcat agtcttggac tttgattatt gcccagggac aaaagtcacc attacagagg   2520

 

attgtagcaa gagaggccct tcggtcagaa ccactactga cagtggaaag ttgatcactg   2580

 

actggtgctg tcgcagttgc tcccttccgc ccctacgatt ccggacagaa aatggctgct   2640

 

ggtacggaat ggaaatcaga cctgttatgc atgatgaaac aacactcgtc agatcacagg   2700

 

ttcatgcttt caaaggtgaa atggttgacc cttttcagct gggccttctg gtgatgtttc   2760

 

tggccaccca ggaagtcctt cgcaagaggt ggacggccag attgaccatt cctgcggttt   2820

 

tgggggtcct acttgtgctg atgcttgggg gtatcactta cactgatttg gcgaggtatg   2880

 

tggtgctagt cgctgctgct ttcgcagagg ccaacagtgg aggagacgtc ctgcaccttg   2940

 

ctttgattgc tgtttttaag atccaaccag catttttagt gatgaacatg cttagcacga   3000

 

gatggacgaa ccaagaaaac gtggttctgg tcctaggggc tgcctttttc caattggcct   3060

 

cagtagatct gcaaatagga gtccacggaa tcctgaatgc cgccgctata gcatggatga   3120

 

ttgtccgagc gatcaccttc cccacaacct cctccgtcac catgccagtc ttagcgcttc   3180

 

taactccggg gatgagggct ctatacctag acacttacag aatcatcctc ctcgtcatag   3240

 

ggatttgctc cctgctgcac gagaggaaaa agaccatggc gaaaaagaaa ggagctgtac   3300

 

tcttgggctt agcgctcaca tccactggat ggttctcgcc caccactata gctgccggac   3360

 

taatggtctg caacccaaac aagaagagag ggtggccagc tactgagttt ttgtcggcag   3420

 

ttggattgat gtttgccatc gtaggtggtt tggccgagtt ggatattgaa tccatgtcaa   3480

 

tacccttcat gctggcaggt ctcatggcag tgtcctacgt ggtgtcagga aaagcaacag   3540

 

atatgtggct tgaacgggcc gccgacatca gctgggatat gggtgctgca atcacaggaa   3600

 

gcagtcggag gctggatgtg aaactggatg atgacggaga ttttcacttg attgatgatc   3660

 

ccggtgttcc atggaaggtc tgggtcctgc gcatgtcttg cattggctta gccgccctca   3720

 

cgccttgggc catcgttccc gccgctttcg gttattggct cactttaaaa acaacaaaaa   3780

 

gagggggcgt gttttgggac acgccatccc caaaaccttg ctcaaaagga gacaccacta   3840

 

caggagtcta ccgaattatg gctagaggga ttcttggcac ttaccaggcc ggcgtcggag   3900

 

tcatgtacga gaatgttttc cacacactat ggcacacaac tagaggagca gccattgtga   3960

 

gtggagaagg aaaattgacg ccatactggg gtagtgtgaa agaagaccgc atagcttacg   4020

 

gaggcccatg gaggtttgac cgaaaatgga atggaacaga tgacgtgcaa gtgatcgtgg   4080

 

tagaaccggg gaagggcgca gtaaacatcc agacaaaacc aggagtgttt cggactccct   4140

 

tcggggaggt tggggctgtt agtctggatt acccgcgagg aacatccggc tcacccattc   4200

 

tggattccaa tggagacatt ataggcctat acggcaatgg agttgagctt ggcgatggct   4260

 

catacgtcag cgccatcgtg cagggtgacc gtcaggagga accagtccca gaagcttaca   4320

 

ccccaaacat gttgagaaag agacagatga ctgtgctaga tttgcaccct ggttcaggga   4380

 

aaaccaggaa aattctgcca caaataatta aggacgctat ccagcagcgc ctaagaacag   4440

 

ctgtgttggc accgacgcgg gtggtagcag cagaaatggc agaagttttg agagggctcc   4500

 

cagtacgata tcaaacttca gcagtgcaga gagagcacca agggaatgaa atagtggatg   4560

 

tgatgtgcca cgccactctg acccatagac tgatgtcacc gaacagagtg cccaactaca   4620

 

acctatttgt catggatgaa gctcatttca ccgacccagc cagtatagcc gcacgaggat   4680

 

acattgctac caaggtggaa ttaggggagg cagcagccat ctttatgaca gcgaccccgc   4740

 

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taccagacag ggcatggagc agtggatacg aatggatcac agaatatgcg ggtaaaaccg   4860

 

tgtggtttgt ggcgagcgta aaaatgggga atgagattgc aatgtgcctc caaagagcgg   4920

 

ggaaaaaggt catccaactc aaccgcaagt cctatgacac agaataccca aaatgtaaga   4980

 

atggagactg ggattttgtc attaccaccg acatctctga aatgggggcc aacttcggtg   5040

 

cgagcagggt catcgactgt agaaagagcg tgaaacccac catcttagaa gagggagaag   5100

 

gcagagtcat cctcggaaac ccatctccca taaccagtgc aagcgcagct caacggaggg   5160

 

gcagagtagg cagaaacccc aatcaagttg gagatgaata ccactatggg ggggctacca   5220

 

gtgaagatga cagtaaccta gcccattgga cagaggcaaa gatcatgtta gataacatac   5280

 

acatgcccaa tggactggtg gcccagctct atggaccaga gagggaaaag gctttcacaa   5340

 

tggatggcga ataccgtctc agaggtgaag aaaagaaaaa cttcttagag ctgcttagga   5400

 

cggctgacct cccggtgtgg ctggcctaca aggtggcgtc caatggcatt cagtacaccg   5460

 

acagaaagtg gtgttttgat gggccgcgta cgaatgccat actggaggac aacaccgagg   5520

 

tagagatagt cacccggatg ggtgagagga aaatcctcaa gccgagatgg cttgatgcaa   5580

 

gagtttatgc agatcaccag gccctcaagt ggttcaaaga ctttgcagca gggaagagat   5640

 

cagccgttag cttcatagag gtgctcggtc gcatgcctga gcatttcatg ggaaagacgc   5700

 

gggaagcttt agacaccatg tacttggttg caacggctga gaaaggtggg aaagcacacc   5760

 

gaatggctct cgaagagctg ccagatgcac tggaaaccat cacacttatt gtcgccatta   5820

 

ctgtgatgac aggaggattc ttcctactaa tgatgcagcg aaagggtata gggaagatgg   5880

 

gtcttggagc tctagtgctc acactagcta ccttcttcct gtgggcggca gaggttcctg   5940

 

gaaccaaaat agcagggacc ctgctgatcg ccctgctgct gatggtggtt ctcatcccag   6000

 

aaccggaaaa acagaggtca cagacagata accaactggc ggtgtttctc atctgtgtct   6060

 

tgaccgtggt tggagtggtg gcagcaaacg agtacgggat gctagaaaaa accaaagcgg   6120

 

atctcaagag catgtttggc ggaaagacgc aggcatcagg actgactgga ttgccaagca   6180

 

tggcactgga cctgcgtcca gccacagcct gggcactgta tggggggagc acagtcgtgc   6240

 

taacccctct tctgaagcac ctgatcacgt cggaatacgt caccacatcg ctagcttcaa   6300

 

ttaactcaca agctggctca ttattcgtct tgccacgagg cgtgcctttt accgacctag   6360

 

acttgactgt tggcctcgtc ttccttggct gttggggtca agtcaccctc acaacgtttc   6420

 

tgacagccat ggttctggcg acacttcact atgggtacat gctccctgga tggcaagcag   6480

 

aagcactcag ggctgcccag agaaggacag cggctggaat aatgaagaat gccgttgttg   6540

 

acggaatggt cgccactgat gtgcctgaac tggaaaggac tactcctctg atgcaaaaga   6600

 

aagtcggaca ggtgctcctc ataggggtaa gcgtggcagc gttcctcgtc aaccctaatg   6660

 

tcaccactgt gagagaagca ggggtgttgg tgacggcggc tacgcttact ttgtgggaca   6720

 

atggagccag tgccgtttgg aattccacca cagccacggg actctgccat gtcatgcgag   6780

 

gtagctacct ggctggaggc tccattgctt ggactctcat caagaacgct gataagccct   6840

 

ccttgaaaag gggaaggcct gggggcagga cgctagggga gcagtggaag gaaaaactaa   6900

 

atgccatgag tagagaagag ttttttaaat accggagaga ggccataatc gaggtggacc   6960

 

gcactgaagc acgcagggcc agacgtgaaa ataacatagt gggaggacat ccggtttcgc   7020

 

gaggctcagc aaaactccgt tggctcgtgg agaaaggatt tgtctcgcca ataggaaaag   7080

 

tcattgatct agggtgtggg cgtggaggat ggagctacta cgcagcaacc ctgaagaagg   7140

 

tccaggaagt cagaggatac acgaaaggtg gggcgggaca tgaagaaccg atgctcatgc   7200

 

agagctacgg ctggaacctg gtctccctga agagtggagt ggacgtgttt tacaaacctt   7260

 

cagagcccag tgataccctg ttctgtgaca taggggaatc ctccccaagt ccagaagtag   7320

 

aagaacaacg cacactacgc gtcctagaga tgacatctga ctggttgcac cgaggaccta   7380

 

gagagttctg cattaaagtt ctctgccctt acatgcccaa ggttatagaa aaaatggaag   7440

 

ttctgcagcg tcgcttcgga ggtgggctag tgcgtctccc cctgtcccga aactccaatc   7500

 

acgagatgta ttgggttagt ggagccgctg gcaatgtggt gcacgctgtg aacatgacca   7560

 

gccaggtatt actggggcga atggatcgca cagtgtggag agggccaaag tatgaggaag   7620

 

atgtcaacct agggagcgga acaagagccg tgggaaaggg agaagtccat agcaatcagg   7680

 

agaaaatcaa gaagagaatc cagaagctta aagaagaatt cgccacaacg tggcacaaag   7740

 

accctgagca tccataccgc acttggacat accacggaag ctatgaagtg aaggctactg   7800

 

gctcagccag ctctctcgtc aacggagtgg tgaagctcat gagcaaacct tgggacgcca   7860

 

ttgccaacgt caccaccatg gccatgactg acaccacccc ttttggacag caaagagttt   7920

 

tcaaggagaa agttgacacg aaggctcctg agccaccagc tggagccaag gaagtgctca   7980

 

acgagaccac caactggctg tgggcctact tgtcacggga aaaaagaccc cgcttgtgca   8040

 

ccaaggaaga attcattaag aaagttaaca gcaacgcggc tcttggagca gtgttcgctg   8100

 

aacagaatca atggagcacg gcgcgtgagg ctgtggatga cccgcggttt tgggagatgg   8160

 

ttgatgaaga gagggaaaac catctgcgag gagagtgtca cacatgtatc tacaacatga   8220

 

tgggaaaaag agagaagaag cctggagagt ttggaaaagc taaaggaagc agggccattt   8280

 

ggttcatgtg gcttggagca cggtatctag agtttgaagc tttggggttc ctgaatgaag   8340

 

accattggct gagccgagag aattcaggag gtggagtgga aggctcaggc gtccaaaagc   8400

 

tgggatacat cctccgtgac atagcaggaa agcaaggagg gaaaatgtac gctgatgata   8460

 

ccgccgggtg ggacactaga attaccagaa ctgatttaga aaatgaagct aaggtactgg   8520

 

agctcctaga cggtgaacac cgcatgctcg cccgagccat aattgaactg acttacaggc   8580

 

acaaagtggt caaggtcatg agacctgcag cagaaggaaa gaccgtgatg gacgtgatat   8640

 

caagagaaga tcaaaggggg agtggacagg tggtcactta tgctcttaac actttcacga   8700

 

acatcgctgt ccagctcgtc aggctgatgg aggctgaggg ggtcattgga ccacaacact   8760

 

tggaacatct acctaggaaa aacaagatag ctgtcaggac ctggctcttt gagaatggag   8820

 

aggagagagt gaccaggatg gcgatcagcg gagacgactg tgccgtcaaa ccgctggacg   8880

 

acagattcgc cacagccctc cacttcctca acgcaatgtc aaaggtcaga aaagacatcc   8940

 

aggaatggaa gccttcgcat ggctggcacg attggcagca agttcccttc tgttctaacc   9000

 

attttcagga gattgtgatg aaagatggaa ggagtatagt tgtcccgtgc agaggacagg   9060

 

atgagctgat aggcagggct cgcatctctc caggagctgg atggaatgtg aaggacacag   9120

 

cttgcctggc caaagcatat gcacagatgt ggctactcct atacttccat cgcagggact   9180

 

tgcgtctcat ggcaaatgcg atttgctcag cagtgccagt agattgggtg cccacaggca   9240

 

ggacatcctg gtcaatacac tcgaaaggag agtggatgac cacggaagac atgctgcagg   9300

 

tctggaacag agtttggatt gaagaaaatg aatggatgat ggacaagact ccaatcacaa   9360

 

gctggacaga cgttccgtat gtgggaaagc gcgaggacat ctggtgtggc agcctcatcg   9420

 

gaacgcgatc cagagcaacc tgggctgaga acatctatgc ggcgataaac caggttagag   9480

 

ctgtcattgg gaaagaaaat tatgttgact acatgacctc actcaggaga tacgaagacg   9540

 

tcttgatcca ggaagacagg gtcatctagt gtgatttaag gtagaaaagt agactatgta   9600

 

aacaatgtaa atgagaaaat gcatgcatat ggagtcaggc cagcaaaagc tgccaccgga   9660

 

tactgggtag acggtgctgc ctgcgtctca gtcccaggag gactgggtta acaaatctga   9720

 

caacagaaag tgagaaagcc ctcagaaccg tctcggaagt aggtccctgc tcactggaag   9780

 

ttgaaagacc aacgtcaggc cacaaatttg tgccactccg ctagggagtg cggcctgcgc   9840

 

agccccagga ggactgggtt accaaagccg ttgaggcccc cacggcccaa gcctcgtcta   9900

 

ggatgcaata gacgaggtgt aaggactaga ggttagagga gaccccgtgg aaacaacaac   9960

 

atgcggccca agccccctcg aagctgtaga ggaggtggaa ggactagagg ttagaggaga  10020

 

ccccgcattt gcatcaaaca gcatattgac acctgggaat agactgggag atcttctgct  10080

 

ctatctcaac atcagctact aggcacagag cgccgaagta tgtagctggt ggtgaggaag  10140

 

aacacaggat ctggccggca tggtcccagc ctcctcgctg gcgctggctg ggcaacattc  10200

 

cgaggggacc gtcccctcgg taatggcgaa tgggacctcg agcagacatg ataagataca  10260

 

ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa  10320

 

tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca  10380

 

acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt ttttaaagca  10440

 

agtaaaacct ctacaaatgt ggtaggtacc tcgatcccca attcgcccta tagtgagtcg  10500

 

tattacaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc  10560

 

caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc  10620

 

cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatgagc ttgcgccgtc  10680

 

ccgtcaagtc agcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa  10740

 

aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata  10800

 

tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat  10860

 

ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa  10920

 

tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc  10980

 

cggtgagaat ggcaaaaggt tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt  11040

 

acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg  11100

 

agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa  11160

 

ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc  11220

 

taatacctgg aatgctgttt tcccagggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg  11280

 

agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct  11340

 

gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc  11400

 

tggcgcatcg ggcttcccat acaatcaata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc  11460

 

gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga  11520

 

cgagcaagac gtttcccgtt gaatatggct cataacaccc cttgtattac tgtttatgta  11580

 

agcagacagt tttattgttc atgatgatat atttttatct tgtgcaatgt aacatcagag  11640

 

attttgagac actcgacaag atgatcttct tgagatcgtt ttggtctgcg cgtaatctct  11700

 

tgctctgaaa acgaaaaaac cgccttgcag ggcggttttt cgaaggttct ctgagctacc  11760

 

aactctttga accgaggtaa ctggcttgga ggagcgcagt caccaaaact tgtcctttca  11820

 

gtttagcctt aaccggcgca tgacttcaag actaactcct ctaaatcaat taccagtggc  11880

 

tgctgccagt ggtgcttttg catgtctttc cgggttggac tcaagacgat agttaccgga  11940

 

taaggcgcag cggtcggact gaacgggggg ttcgtgcata cagtccagct tggagcgaac  12000

 

tgcctacccg gaactgagtg tcaggcgtgg aatgagacaa acgcggccat aacagcggaa  12060

 

tgacaccggt aaaccgaaag gcaggaacag gagagcgcac gagggagccg ccaggggaaa  12120

 

cgcctggtat                                                         12130

 

 

<210>  5

<211>  12724

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccaccac tgatttgagc gtcagatttc gtgatgcttg     60

 

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacggc tttggcggcc gctagttatt aatagtaatc    120

 

aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt    180

 

aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta    240

 

tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg    300

 

gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga    360

 

cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt    420

 

tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg    480

 

gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc    540

 

cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg    600

 

taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat    660

 

aagcagagct ggtttagtga accgagaagt ttatctgtgt gaacttcttg gcttagtatc    720

 

gtagagaaga atcgagagat tagtgcagtt taaacagttt tttagaacgg aagataacca    780

 

tgactaaaaa accaggaggg cccggtaaaa accgggctat caatatgctg aaacgcggcc    840

 

taccccgcac tagtatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc    900

 

tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg    960

 

gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg   1020

 

tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc   1080

 

ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg   1140

 

agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg   1200

 

agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca   1260

 

acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg   1320

 

acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca   1380

 

gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc   1440

 

tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc   1500

 

gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg   1560

 

agctgtacaa gtaacgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct   1620

 

tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgtgattttc caccatattg ccgtcttttg   1680

 

gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt   1740

 

cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg   1800

 

aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac   1860

 

ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg   1920

 

cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct   1980

 

caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg   2040

 

atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag   2100

 

gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa gcttgccaca   2160

 

acatggtcga ccgagaccga tcaattgctt tggccttctt agccacagga ggtgtgctcg   2220

 

tgttcttagc gaccaatgtg catgctgaca ctggatgtgc cattgacatc acaagaaaag   2280

 

agatgagatg tggaagtggc atcttcgtgc acaacgacgt ggaagcctgg gtggataggt   2340

 

ataaatattt gccagaaacg cccagatccc tagcgaagat cgtccacaaa gcgcacaagg   2400

 

aaggcgtgtg cggagtcaga tctgtcacta gactggagca ccaaatgtgg gaagccgtaa   2460

 

gggacgaatt gaacgtcctg ctcaaagaga atgcagtgga cctcagtgtg gttgtgaaca   2520

 

agcccgtggg aagatatcgc tcagccccta aacgcctatc catgacgcaa gagaagtttg   2580

 

aaatgggctg gaaagcatgg ggaaaaagca tcctctttgc cccggaattg gctaactcca   2640

 

catttgtcgt agatggacct gagacaaagg aatgccctga tgagcacaga gcttggaaca   2700

 

gcatgcaaat cgaagacttc ggctttggca tcacatcaac ccgtgtgtgg ctgaaaatta   2760

 

gagaggagag cactgacgag tgtgatggag cgatcatagg cacggctgtc aaaggacatg   2820

 

tggcagtcca tagtgacttg tcgtactgga ttgagagtcg ctacaacgac acatggaaac   2880

 

ttgagagggc agtctttgga gaggtcaaat cttgcacttg gccagagaca cacacccttt   2940

 

ggggagatga tgttgaggaa agtgaactca tcattccgca caccatagcc ggaccaaaaa   3000

 

gcaagcacaa tcggagggaa gggtataaga cacaaaacca gggaccttgg gatgagaatg   3060

 

gcatagtctt ggactttgat tattgcccag ggacaaaagt caccattaca gaggattgta   3120

 

gcaagagagg cccttcggtc agaaccacta ctgacagtgg aaagttgatc actgactggt   3180

 

gctgtcgcag ttgctccctt ccgcccctac gattccggac agaaaatggc tgctggtacg   3240

 

gaatggaaat cagacctgtt atgcatgatg aaacaacact cgtcagatca caggttcatg   3300

 

ctttcaaagg tgaaatggtt gacccttttc agctgggcct tctggtgatg tttctggcca   3360

 

cccaggaagt ccttcgcaag aggtggacgg ccagattgac cattcctgcg gttttggggg   3420

 

tcctacttgt gctgatgctt gggggtatca cttacactga tttggcgagg tatgtggtgc   3480

 

tagtcgctgc tgctttcgca gaggccaaca gtggaggaga cgtcctgcac cttgctttga   3540

 

ttgctgtttt taagatccaa ccagcatttt tagtgatgaa catgcttagc acgagatgga   3600

 

cgaaccaaga aaacgtggtt ctggtcctag gggctgcctt tttccaattg gcctcagtag   3660

 

atctgcaaat aggagtccac ggaatcctga atgccgccgc tatagcatgg atgattgtcc   3720

 

gagcgatcac cttccccaca acctcctccg tcaccatgcc agtcttagcg cttctaactc   3780

 

cggggatgag ggctctatac ctagacactt acagaatcat cctcctcgtc atagggattt   3840

 

gctccctgct gcacgagagg aaaaagacca tggcgaaaaa gaaaggagct gtactcttgg   3900

 

gcttagcgct cacatccact ggatggttct cgcccaccac tatagctgcc ggactaatgg   3960

 

tctgcaaccc aaacaagaag agagggtggc cagctactga gtttttgtcg gcagttggat   4020

 

tgatgtttgc catcgtaggt ggtttggccg agttggatat tgaatccatg tcaataccct   4080

 

tcatgctggc aggtctcatg gcagtgtcct acgtggtgtc aggaaaagca acagatatgt   4140

 

ggcttgaacg ggccgccgac atcagctggg atatgggtgc tgcaatcaca ggaagcagtc   4200

 

ggaggctgga tgtgaaactg gatgatgacg gagattttca cttgattgat gatcccggtg   4260

 

ttccatggaa ggtctgggtc ctgcgcatgt cttgcattgg cttagccgcc ctcacgcctt   4320

 

gggccatcgt tcccgccgct ttcggttatt ggctcacttt aaaaacaaca aaaagagggg   4380

 

gcgtgttttg ggacacgcca tccccaaaac cttgctcaaa aggagacacc actacaggag   4440

 

tctaccgaat tatggctaga gggattcttg gcacttacca ggccggcgtc ggagtcatgt   4500

 

acgagaatgt tttccacaca ctatggcaca caactagagg agcagccatt gtgagtggag   4560

 

aaggaaaatt gacgccatac tggggtagtg tgaaagaaga ccgcatagct tacggaggcc   4620

 

catggaggtt tgaccgaaaa tggaatggaa cagatgacgt gcaagtgatc gtggtagaac   4680

 

cggggaaggg cgcagtaaac atccagacaa aaccaggagt gtttcggact cccttcgggg   4740

 

aggttggggc tgttagtctg gattacccgc gaggaacatc cggctcaccc attctggatt   4800

 

ccaatggaga cattataggc ctatacggca atggagttga gcttggcgat ggctcatacg   4860

 

tcagcgccat cgtgcagggt gaccgtcagg aggaaccagt cccagaagct tacaccccaa   4920

 

acatgttgag aaagagacag atgactgtgc tagatttgca ccctggttca gggaaaacca   4980

 

ggaaaattct gccacaaata attaaggacg ctatccagca gcgcctaaga acagctgtgt   5040

 

tggcaccgac gcgggtggta gcagcagaaa tggcagaagt tttgagaggg ctcccagtac   5100

 

gatatcaaac ttcagcagtg cagagagagc accaagggaa tgaaatagtg gatgtgatgt   5160

 

gccacgccac tctgacccat agactgatgt caccgaacag agtgcccaac tacaacctat   5220

 

ttgtcatgga tgaagctcat ttcaccgacc cagccagtat agccgcacga ggatacattg   5280

 

ctaccaaggt ggaattaggg gaggcagcag ccatctttat gacagcgacc ccgcctggaa   5340

 

ccacggatcc ttttcctgac tcaaatgccc caatccatga tttgcaagat gagataccag   5400

 

acagggcatg gagcagtgga tacgaatgga tcacagaata tgcgggtaaa accgtgtggt   5460

 

ttgtggcgag cgtaaaaatg gggaatgaga ttgcaatgtg cctccaaaga gcggggaaaa   5520

 

aggtcatcca actcaaccgc aagtcctatg acacagaata cccaaaatgt aagaatggag   5580

 

actgggattt tgtcattacc accgacatct ctgaaatggg ggccaacttc ggtgcgagca   5640

 

gggtcatcga ctgtagaaag agcgtgaaac ccaccatctt agaagaggga gaaggcagag   5700

 

tcatcctcgg aaacccatct cccataacca gtgcaagcgc agctcaacgg aggggcagag   5760

 

taggcagaaa ccccaatcaa gttggagatg aataccacta tgggggggct accagtgaag   5820

 

atgacagtaa cctagcccat tggacagagg caaagatcat gttagataac atacacatgc   5880

 

ccaatggact ggtggcccag ctctatggac cagagaggga aaaggctttc acaatggatg   5940

 

gcgaataccg tctcagaggt gaagaaaaga aaaacttctt agagctgctt aggacggctg   6000

 

acctcccggt gtggctggcc tacaaggtgg cgtccaatgg cattcagtac accgacagaa   6060

 

agtggtgttt tgatgggccg cgtacgaatg ccatactgga ggacaacacc gaggtagaga   6120

 

tagtcacccg gatgggtgag aggaaaatcc tcaagccgag atggcttgat gcaagagttt   6180

 

atgcagatca ccaggccctc aagtggttca aagactttgc agcagggaag agatcagccg   6240

 

ttagcttcat agaggtgctc ggtcgcatgc ctgagcattt catgggaaag acgcgggaag   6300

 

ctttagacac catgtacttg gttgcaacgg ctgagaaagg tgggaaagca caccgaatgg   6360

 

ctctcgaaga gctgccagat gcactggaaa ccatcacact tattgtcgcc attactgtga   6420

 

tgacaggagg attcttccta ctaatgatgc agcgaaaggg tatagggaag atgggtcttg   6480

 

gagctctagt gctcacacta gctaccttct tcctgtgggc ggcagaggtt cctggaacca   6540

 

aaatagcagg gaccctgctg atcgccctgc tgctgatggt ggttctcatc ccagaaccgg   6600

 

aaaaacagag gtcacagaca gataaccaac tggcggtgtt tctcatctgt gtcttgaccg   6660

 

tggttggagt ggtggcagca aacgagtacg ggatgctaga aaaaaccaaa gcggatctca   6720

 

agagcatgtt tggcggaaag acgcaggcat caggactgac tggattgcca agcatggcac   6780

 

tggacctgcg tccagccaca gcctgggcac tgtatggggg gagcacagtc gtgctaaccc   6840

 

ctcttctgaa gcacctgatc acgtcggaat acgtcaccac atcgctagct tcaattaact   6900

 

cacaagctgg ctcattattc gtcttgccac gaggcgtgcc ttttaccgac ctagacttga   6960

 

ctgttggcct cgtcttcctt ggctgttggg gtcaagtcac cctcacaacg tttctgacag   7020

 

ccatggttct ggcgacactt cactatgggt acatgctccc tggatggcaa gcagaagcac   7080

 

tcagggctgc ccagagaagg acagcggctg gaataatgaa gaatgccgtt gttgacggaa   7140

 

tggtcgccac tgatgtgcct gaactggaaa ggactactcc tctgatgcaa aagaaagtcg   7200

 

gacaggtgct cctcataggg gtaagcgtgg cagcgttcct cgtcaaccct aatgtcacca   7260

 

ctgtgagaga agcaggggtg ttggtgacgg cggctacgct tactttgtgg gacaatggag   7320

 

ccagtgccgt ttggaattcc accacagcca cgggactctg ccatgtcatg cgaggtagct   7380

 

acctggctgg aggctccatt gcttggactc tcatcaagaa cgctgataag ccctccttga   7440

 

aaaggggaag gcctgggggc aggacgctag gggagcagtg gaaggaaaaa ctaaatgcca   7500

 

tgagtagaga agagtttttt aaataccgga gagaggccat aatcgaggtg gaccgcactg   7560

 

aagcacgcag ggccagacgt gaaaataaca tagtgggagg acatccggtt tcgcgaggct   7620

 

cagcaaaact ccgttggctc gtggagaaag gatttgtctc gccaatagga aaagtcattg   7680

 

atctagggtg tgggcgtgga ggatggagct actacgcagc aaccctgaag aaggtccagg   7740

 

aagtcagagg atacacgaaa ggtggggcgg gacatgaaga accgatgctc atgcagagct   7800

 

acggctggaa cctggtctcc ctgaagagtg gagtggacgt gttttacaaa ccttcagagc   7860

 

ccagtgatac cctgttctgt gacatagggg aatcctcccc aagtccagaa gtagaagaac   7920

 

aacgcacact acgcgtccta gagatgacat ctgactggtt gcaccgagga cctagagagt   7980

 

tctgcattaa agttctctgc ccttacatgc ccaaggttat agaaaaaatg gaagttctgc   8040

 

agcgtcgctt cggaggtggg ctagtgcgtc tccccctgtc ccgaaactcc aatcacgaga   8100

 

tgtattgggt tagtggagcc gctggcaatg tggtgcacgc tgtgaacatg accagccagg   8160

 

tattactggg gcgaatggat cgcacagtgt ggagagggcc aaagtatgag gaagatgtca   8220

 

acctagggag cggaacaaga gccgtgggaa agggagaagt ccatagcaat caggagaaaa   8280

 

tcaagaagag aatccagaag cttaaagaag aattcgccac aacgtggcac aaagaccctg   8340

 

agcatccata ccgcacttgg acataccacg gaagctatga agtgaaggct actggctcag   8400

 

ccagctctct cgtcaacgga gtggtgaagc tcatgagcaa accttgggac gccattgcca   8460

 

acgtcaccac catggccatg actgacacca ccccttttgg acagcaaaga gttttcaagg   8520

 

agaaagttga cacgaaggct cctgagccac cagctggagc caaggaagtg ctcaacgaga   8580

 

ccaccaactg gctgtgggcc tacttgtcac gggaaaaaag accccgcttg tgcaccaagg   8640

 

aagaattcat taagaaagtt aacagcaacg cggctcttgg agcagtgttc gctgaacaga   8700

 

atcaatggag cacggcgcgt gaggctgtgg atgacccgcg gttttgggag atggttgatg   8760

 

aagagaggga aaaccatctg cgaggagagt gtcacacatg tatctacaac atgatgggaa   8820

 

aaagagagaa gaagcctgga gagtttggaa aagctaaagg aagcagggcc atttggttca   8880

 

tgtggcttgg agcacggtat ctagagtttg aagctttggg gttcctgaat gaagaccatt   8940

 

ggctgagccg agagaattca ggaggtggag tggaaggctc aggcgtccaa aagctgggat   9000

 

acatcctccg tgacatagca ggaaagcaag gagggaaaat gtacgctgat gataccgccg   9060

 

ggtgggacac tagaattacc agaactgatt tagaaaatga agctaaggta ctggagctcc   9120

 

tagacggtga acaccgcatg ctcgcccgag ccataattga actgacttac aggcacaaag   9180

 

tggtcaaggt catgagacct gcagcagaag gaaagaccgt gatggacgtg atatcaagag   9240

 

aagatcaaag ggggagtgga caggtggtca cttatgctct taacactttc acgaacatcg   9300

 

ctgtccagct cgtcaggctg atggaggctg agggggtcat tggaccacaa cacttggaac   9360

 

atctacctag gaaaaacaag atagctgtca ggacctggct ctttgagaat ggagaggaga   9420

 

gagtgaccag gatggcgatc agcggagacg actgtgccgt caaaccgctg gacgacagat   9480

 

tcgccacagc cctccacttc ctcaacgcaa tgtcaaaggt cagaaaagac atccaggaat   9540

 

ggaagccttc gcatggctgg cacgattggc agcaagttcc cttctgttct aaccattttc   9600

 

aggagattgt gatgaaagat ggaaggagta tagttgtccc gtgcagagga caggatgagc   9660

 

tgataggcag ggctcgcatc tctccaggag ctggatggaa tgtgaaggac acagcttgcc   9720

 

tggccaaagc atatgcacag atgtggctac tcctatactt ccatcgcagg gacttgcgtc   9780

 

tcatggcaaa tgcgatttgc tcagcagtgc cagtagattg ggtgcccaca ggcaggacat   9840

 

cctggtcaat acactcgaaa ggagagtgga tgaccacgga agacatgctg caggtctgga   9900

 

acagagtttg gattgaagaa aatgaatgga tgatggacaa gactccaatc acaagctgga   9960

 

cagacgttcc gtatgtggga aagcgcgagg acatctggtg tggcagcctc atcggaacgc  10020

 

gatccagagc aacctgggct gagaacatct atgcggcgat aaaccaggtt agagctgtca  10080

 

ttgggaaaga aaattatgtt gactacatga cctcactcag gagatacgaa gacgtcttga  10140

 

tccaggaaga cagggtcatc tagtgtgatt taaggtagaa aagtagacta tgtaaacaat  10200

 

gtaaatgaga aaatgcatgc atatggagtc aggccagcaa aagctgccac cggatactgg  10260

 

gtagacggtg ctgcctgcgt ctcagtccca ggaggactgg gttaacaaat ctgacaacag  10320

 

aaagtgagaa agccctcaga accgtctcgg aagtaggtcc ctgctcactg gaagttgaaa  10380

 

gaccaacgtc aggccacaaa tttgtgccac tccgctaggg agtgcggcct gcgcagcccc  10440

 

aggaggactg ggttaccaaa gccgttgagg cccccacggc ccaagcctcg tctaggatgc  10500

 

aatagacgag gtgtaaggac tagaggttag aggagacccc gtggaaacaa caacatgcgg  10560

 

cccaagcccc ctcgaagctg tagaggaggt ggaaggacta gaggttagag gagaccccgc  10620

 

atttgcatca aacagcatat tgacacctgg gaatagactg ggagatcttc tgctctatct  10680

 

caacatcagc tactaggcac agagcgccga agtatgtagc tggtggtgag gaagaacaca  10740

 

ggatctggcc ggcatggtcc cagcctcctc gctggcgctg gctgggcaac attccgaggg  10800

 

gaccgtcccc tcggtaatgg cgaatgggac ctcgagcaga catgataaga tacattgatg  10860

 

agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg  10920

 

atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt  10980

 

gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg agatgtggga ggttttttaa agcaagtaaa  11040

 

acctctacaa atgtggtagg tacctcgatc cccaattcgc cctatagtga gtcgtattac  11100

 

aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt  11160

 

aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc  11220

 

gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gagcttgcgc cgtcccgtca  11280

 

agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc  11340

 

atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac catatttttg  11400

 

aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag  11460

 

atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc  11520

 

ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga  11580

 

gaatggcaaa aggttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc cattacgctc  11640

 

gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag  11700

 

acgaaatacg cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg  11760

 

caggaacact gccagcgcat caacaatatt ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac  11820

 

ctggaatgct gttttcccag ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg  11880

 

gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat aaattccgtc agccagttta gtctgaccat  11940

 

ctcatctgta acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc  12000

 

atcgggcttc ccatacaatc aatagattgt cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc  12060

 

ccatttatac ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc tcgacgagca  12120

 

agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga  12180

 

cagttttatt gttcatgatg atatattttt atcttgtgca atgtaacatc agagattttg  12240

 

agacactcga caagatgatc ttcttgagat cgttttggtc tgcgcgtaat ctcttgctct  12300

 

gaaaacgaaa aaaccgcctt gcagggcggt ttttcgaagg ttctctgagc taccaactct  12360

 

ttgaaccgag gtaactggct tggaggagcg cagtcaccaa aacttgtcct ttcagtttag  12420

 

ccttaaccgg cgcatgactt caagactaac tcctctaaat caattaccag tggctgctgc  12480

 

cagtggtgct tttgcatgtc tttccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc  12540

 

gcagcggtcg gactgaacgg ggggttcgtg catacagtcc agcttggagc gaactgccta  12600

 

cccggaactg agtgtcaggc gtggaatgag acaaacgcgg ccataacagc ggaatgacac  12660

 

cggtaaaccg aaaggcagga acaggagagc gcacgaggga gccgccaggg gaaacgcctg  12720

 

gtat                                                               12724

 

 

Claims (8)

1.一种日本乙型脑炎病毒样颗粒，其特征在于是由日本乙型脑炎病毒PrM/E蛋白或日本乙型脑炎病毒PrM/E蛋白和日本乙型脑炎病毒RNA复制子包装而成，所述RNA复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述日本乙型脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于步骤为：扩增日本乙型脑炎病毒PrM/E基因，将扩增产物连接到Tet-on advance表达系统的质粒pTRE-Tight中，形成重组载体，Xfect法转染Hela Tet-on advanced 细胞，经HygB筛选鉴定后，有限稀释法获得可调控的稳定表达PrM/E基因的Hela细胞系，强力霉素诱导表达PrM/E蛋白，可包装出常规的病毒样颗粒；用包含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示RNA复制子的载体转染可调控的稳定表达PrM/E蛋白的Hela细胞系，可包装出具有“一过性感染”能力的病毒样颗粒。

3.根据权利要求2所述日本乙型脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于所述扩增日本乙型脑炎病毒PrM/E基因是以日本乙型脑炎病毒疫苗株总RNA为模板，用RT-PCR方法得到日本乙型脑炎病毒疫苗株cDNA，设计引物序列如SEQ ID NO:2~3，扩增得到PrM/E基因。

4.根据权利要求2所述日本乙型脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于转染Hela Tet-on advanced 细胞的重组载体的浓度为500ng/μl。

5.根据权利要求2所述日本乙型脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于所述HygB的最低有效浓度为200μg/mL。

6.根据权利要求2所述日本乙型脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于强力霉素的浓度为1μg/mL。

7.根据权利要求3所述日本乙型脑炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于所述包含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的RNA复制子的载体，具体序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。

8.权利要求1所述日本乙型脑炎病毒样颗粒在疫苗制备或诊断试剂中的应用。

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