CN106929483A - 表达鸡新城疫病毒f基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用 - Google Patents

表达鸡新城疫病毒f基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒被命名为重组火鸡疱疹病毒rHVT‑F株，该病毒株是将含鸡新城疫病毒F基因的表达盒与火鸡疱疹病毒(HVT)结合在一起，即通过将由CMV启动子控制下的F基因插入到HVT基因组中，构建而获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT‑F株，该rHVT‑F株病毒不仅可以对鸡可以诱导产生抗MD和ND的持久保护性免疫。该株病毒作生产毒株制备马立克氏病和鸡新城疫病的二联重组疫苗。

Description

表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其 应用
技术领域
本发明涉及一种表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用，属于动物病毒学领域。本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-F株，其基因组中包含有CMV启动子控制下的鸡新城疫病毒(NDV)F基因。
背景技术
鸡马立克氏病(Marek’s disease，MD)和鸡新城疫病(newcastle disease,ND)给养禽业造成极大的危害。对于MD、ND的防控主要是依靠疫苗的预防接种。
HVT对鸡及其它动物均无致病性，自1970年以来普遍用于MDV的防控。目前，绝大多数国家采用预防接种作为控制新城疫的主要措施。但由于常规疫苗的免疫保护期短，虽然商品鸡群在整个饲养期内多次进行免疫接种，但是仍有可能感染NDV强毒，造成非典型新城疫病毒的流行。此外，常规弱毒疫苗和中等毒力疫苗还可在鸡呼吸道复制，引起温和的病变，增加了继发细菌感染的易感性。为了弥补常规疫苗的不足，国内外许多实验室从20世纪80年代末开始利用重组技术研制新城疫病毒基因工程疫苗。其中基因工程活载体疫苗，是疫苗研制与开发的主要方向之一。火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)作为载体疫苗对鸡及其他动物均无致病性，接种后可刺激机体产生较高水平的抗体并维持终生，接种一次即可获得终生免疫，同时HVT是预防马立克氏病(MDV)的常规疫苗。HVT作为载体具有以下优势：(1)HVT已经广泛的应用于1日龄雏鸡的免疫，已近50年历史，其疫苗生产、储存和接种等都有十分成熟的方法；(2)HVT极为安全，对鸡不具有任何副作用；(3)接种鸡后终身带毒，可以长时间刺激机体产生免疫反应，达到理想的免疫保护效果；(4)HVT在CEF细胞上生长迅速，产生大量有囊膜的病毒，这样制备的冻干疫苗在4℃可以长期保存，使用方便；(5)即使在密度很高的鸡群，HVT也不易发生水平传播，因而减少了重组疫苗散毒的风险。
本发明通过在细胞水平的同源重组，构建成一株能够稳定表达NDV F基因的重组HVT毒株，并制备基因工程疫苗，用于鸡群的免疫接种，同时产生对MD、ND的免疫保护。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用生物技术构建的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-F)，其基因组中包含有CMV启动子控制下的鸡新城疫病毒(NDV)F基因，，其实际上是将含NDV的F基因与火鸡疱疹病毒HVT结合在一起，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-F，该病毒同时也是一种制备马立克氏病和鸡新城疫病二联疫苗的生产毒种，是通过将由CMV启动子控制下的NDV F基因插入到HVT基因组中，rHVT-F不仅可以对鸡MD起到良好的免疫保护作用，而且可以诱导抗NDV的持久保护性免疫。
本发明的技术方案
1.一株表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于该重组火鸡疱疹病毒携带在CMV启动子序列控制下的鸡新城疫病毒的F基因的表达盒，该表达盒的基因序列如Seq ID No:1所示，该病毒被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)rHVT-F株，并已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.13396。
2.如本发明所述一种表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于，重组病毒株该在禽类宿主中诱导抗马立克氏病病毒和鸡新城疫病毒的保护性免疫并作为生产毒株用于制备相应的疫苗。
3.如本发明所述一种表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组病毒rHVT-F株，作为病毒载体构建新的重组病毒株中的应用。
本发明具体实施方式
本发所述的明重组火鸡疱疹病毒的DNA序列模式图如附图1所示，其构建的具体方法如下：
在本发明中，发明人将含有鸡新城疫病毒F基因的表达盒(序列见序列1)插入HVT基因组中，插入的区域为HVT基因组中病毒生长非必需的区域(US10和SORF3之间)，插入序列及位置见图2。
为了达到上述的目的，发明人首先：
1.获得了含NDV F基因的表达盒，具体如下：设计扩增NDV F基因引物NDV-F-F/R(序列2/序列3)。以提取的NDV RNA为模板，经过RT-PCR扩增NDV F基因片段，经过Nhe I、XbaI双酶切后，克隆进真核表达载体pcDNA3.1(赛默飞世尔科技)，获得的阳性质粒，命名为pcDNA3.1/NDV-F。按照Lipofectamine2000(赛默飞世尔科技)转染方法将重组质粒pcDNA3.1/NDV-F转染CEF细胞，以NDV F蛋白的单克隆抗体作为一抗，鉴定重组质粒F蛋白的表达。根据pcDNA3.1载体BGH polyA序列，设计引物BGH-F/R(序列4/序列5)扩增BGH polyA片段，经Xba I、Sph I酶切后克隆进pUC18载体(宝生物工程有限公司)，阳性质粒命名为pUC18/BGH。根据Genebank提供的HVT FC-126株(AF291866)基因序列，设计引物Tongyuan-down-F/R(序列6/序列7)、Tongyuan-up-F/R(序列8/序列9)分别扩增重组位点上下游同源臂。下游同源臂经Sph I、Hind III双酶切，上游同源臂经EcoR I、Xba I双酶切依次克隆进pUC18/BGH质粒，重组质粒命名为pUC18/BGH/Tongyuan。利用引物PNDV-F-F/R(序列10/序列11)扩增cmv启动子以及NDV F基因，经Cla I、Xba I双酶切后克隆进pUC18/BGH/Tongyuan质粒，含有同源臂、NDV F基因表达盒的重组质粒命名为pUC18/NDV-F。
2.重组病毒rHVT(rHVT-F)的构建
利用同源重组的方法构建重组病毒rHVT-F，步骤如下：将长成单层的原代CEF细胞用胰酶消化，以6～8×106细胞接种到35mm的平皿，待细胞长至80％～90％时用于DNA转染。取1μg HVT感染的CEF DNA与2.5μg pUC18/NDV-F质粒DNA共同转染原代CEF。具体操作方法按Lipofectamine2000(赛默飞世尔科技)使用说明书进行。待培养至第4天，出现病毒蚀斑，用0.05％胰酶消化细胞，同时接种到新鲜制备2块35mm的平皿上。取其中一块以NDV F蛋白单克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光法鉴定，如果出现带荧光的病毒蚀斑，另一块经超声破碎后接种到新鲜制备96孔板继续培养，培养3-4d，再孔对孔接种到两块新鲜制备96孔板继续培养，3～4d后取一块固定进行间接免疫荧光法鉴定，另一块作为筛选阳性克隆的储备板。在96孔板中挑选独立的经IFA检测阳性的蚀斑继续用96孔板筛选，如此重复下去直到筛选出表达F蛋白的纯化的重组病毒，命名为HVT-F1。提取纯化病毒的基因组DNA，采用引物(序列12/序列13)进行PCR鉴定。
HVT-F:5'-CATAGGCACG CTCTGATG-3'；18(序列12)
HVT-R:5'-TGGCAAACAG TAAAATTATC C-3')21(序列13)。
3.rHVT-F的体外的稳定性试验
为了验证所获得的重组病毒rHVT-F体内和体外的稳定性，具体操作如下：
将纯化的重组病毒HVT-F1在CEF细胞上连续传代，分别选取第10、20、30代重组病毒进行间接免疫荧光鉴定，检测NDV F基因的表达。提取不同代次病毒DNA，利用PCR扩增重组病毒外源基因的嵌合区，并进行测序验证，利用引物(序列14/序列15)进行扩增，结果表明所发明的rHVT-F在细胞中传30代后仍保持稳定。
qianhe-F:5'-GCACATCTGC TCTCATTACC-3'20(序列14)
qianhe-R:5'-GTTTCAAATT TTCACGATTC C-3')21(序列15)
4.重组病毒rHVT-F应用于SPF鸡中的免疫试验
具体步骤如下：60只1日龄SPF鸡，随机分成3组,第一组接种rHVT-F，免疫剂量为4000PFU/只。第二组为非免疫攻毒组，第三组为空白对照(非免疫非攻毒)组。21日龄进行NDV强毒北京株攻击，观察14d，rHVT-F保护率达到90％。
5.重组病毒rHVT-F制备成疫苗
疫苗的制备方法如下：rHVT-F接种鸡胚成纤维细胞，转瓶接种密度为每1cm2面积接种1000PFU的重组病毒，接种后50小时，有70％以上单层细胞出现典型的细胞病变(CPE)时，倒去培养液，加入适量胰酶消化液，在室温下消化10min左右，细胞单层出现疏松拉网接近脱离瓶壁现象时，立即加入与消化液等量的含10％牛血清的营养液，停止消化。轻轻摇动转瓶，使细胞全部脱离瓶壁，离心收集的细胞用超声波裂解后加入适量SPGA稳定剂，摇匀后分装冻干。
附图说明
图1为rHVT-F重组病毒中的含有新城疫病毒F(NDV-F)基因的表达盒的序列示意图；
图2：NDV-F表达盒插入HVT基因组中的序列及插入位点；大写下划线部分为HVTFC126(AF291866.1)基因组中的US10序列，大写斜体部分为SORF3序列，小写部分为US10和SORF3基因之间的序列。“*”号为F表达盒插入位点；
图3为重组病毒HVT-F1的间接免疫荧光鉴定；A：HVT-F1感染CEF细胞，在荧光显微镜下显示亮绿色荧光；B：HVT感染CEF细胞，荧光显微镜下视野为黑色；C：空白CEF细胞，荧光显微镜下视野为黑色。
本发明涉及生物材料资源信息
本发明构建的重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey)rHVT-F株，该株病毒是将含鸡新城疫病毒的F基因与火鸡疱疹病毒HVT结合在一起，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒；该重组毒株被命名重组火鸡疱疹病毒rHVT-F株，已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.13396；新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)北京株(CVCC AV 1611)，为商品化疫苗效力检验用强毒株来自中国兽医药品监察所，请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p142。
本发明的积极意义
本发明涉及一株表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒被命名为重组火鸡疱疹病毒rHVT-F株，该病毒株是将含鸡新城疫病毒F基因的表达盒与火鸡疱疹病毒(HVT)结合在一起，即通过将由CMV启动子控制下的F基因插入到HVT基因组中，构建而获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-F株，该rHVT-F株病毒不仅可以对鸡可以诱导产生抗MD和ND的持久保护性免疫。该株病毒作为生产毒株用于制备马立克氏病和鸡新城疫病的二联重组疫苗。
实施例
以下实施例是为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。
实施例1
——rHVT-F重组病毒的构建
1.含鸡新城疫病毒的F基因的表达盒(序列见序列1)的制备
设计扩增NDV F基因引物NDV-F-F/R(序列2/序列3)。以提取的NDV RNA为模板，经过RT-PCR扩增NDV F基因片段，经过Nhe I、Xba I双酶切后，克隆进真核表达载体pcDNA3.1，获得的阳性质粒，命名为pcDNA3.1/NDV-F。按照Lipofectamine2000(赛默飞世尔科技)转染方法将重组质粒pcDNA3.1/NDV-F转染CEF细胞，以NDV F蛋白的单克隆抗体作为一抗，鉴定重组质粒F蛋白的表达。
表1构建重组质粒所使用引物。
2.含有同源臂、表达盒重组质粒的构建
根据pcDNA3.1载体BGH polyA序列，设计引物BGH-F/R(序列4/序列5)扩增BGHpolyA片段，经Xba I、Sph I酶切后克隆进pUC18载体，阳性质粒命名为pUC18/BGH。根据Genebank提供的HVT FC-126株(AF291866)基因序列，设计引物Tongyuan-down-F/R(序列6/序列7)、Tongyuan-up-F/R(序列8/序列9)分别扩增重组位点上下游同源臂。下游同源臂经Sph I、Hind III双酶切，上游同源臂经EcoR I、Xba I双酶切依次克隆进pUC18/BGH质粒，重组质粒命名为pUC18/BGH/Tongyuan。利用引物PNDV-F-F/R(序列10/序列11)扩增cmv启动子以及NDV F基因，经Cla I、Xba I双酶切后克隆进pUC18/BGH/Tongyuan质粒，含有同源臂、NDV F基因表达盒的重组质粒命名为pUC18/NDV-F(图3)。
3.rHVT-F重组病毒的筛选与鉴定
将长成单层的原代CEF细胞用胰酶消化，以6～8×106细胞接种到35mm的平皿，待细胞长至80％～90％时用于DNA转染。取1μg HVT感染的CEF DNA与2.5μg pUC18/NDV-F质粒DNA共同转染原代CEF。具体操作方法按Lipofectamine2000(赛默飞世尔科技)使用说明书进行。待培养至第4天，出现病毒蚀斑，用0.05％胰酶消化细胞，同时接种到新鲜制备2块35mm的平皿上。取其中一块以NDV F蛋白单克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光法鉴定，如果出现带荧光的病毒蚀斑，另一块接种到新鲜制备96孔板继续培养，培养3-4d，再孔对孔稀释到两块新鲜制备96孔板继续培养，3-4d后取一块固定进行间接免疫荧光法鉴定，另一块作为筛选阳性克隆的储备板。在96孔板中挑选独立的经IFA检测阳性的蚀斑继续用96孔板筛选，如此重复下去直到筛选出表达F蛋白的纯化的重组病毒，命名为HVT-F1。
提取纯化病毒的基因组DNA，进行PCR鉴定(序列12/序列13)
HVT-F:5'-CATAGGCACG CTCTGATG-3'；18(序列12)
HVT-R:5'-TGGCAAACAG TAAAATTATC C-3'21(序列13)。
以重组病毒HVT-F1DNA为模板，利用重组位点两端的引物进行PCR鉴定，仅能扩增出约2813bp的NDV F基因表达盒的基因片段(包含两端约200bp的HVT基因组片段)，而以HVTDNA为模板仅能扩增出约200bp的HVT基因组片段。
实施例2
——rHVT-F重组病毒在细胞中的稳定性的研究
将纯化的重组病毒HVT-F1在CEF细胞上连续传代，分别选取第10、20、30代重组病毒进行间接免疫荧光鉴定，检测NDV F基因的表达。提取不同代次病毒DNA，利用PCR扩增重组病毒外源基因的嵌合区，并进行测序验证。以不同代次的DNA为模板，均能扩增出长约600bp NDV F基因表达盒嵌合区的特异性片段。结果表明，NDV F基因能够在重组病毒HVT-F1中稳定存在并表达。所用引物为：
qianhe-F:5'-GCACATCTGC TCTCATTAC C-3'21(序列14)
qianhe-R:5'-GTTTCAAATT TTCACGATTC C-3'21(序列15)
实施例3
——重组病毒rHVT-F在SPF鸡中的的免疫免疫效力评价
60只1日龄SPF鸡，随机分成3组,第一组接种rHVT-F，免疫剂量为4000PFU/只。第二组为非免疫攻毒组，第三组为空白对照(非免疫非攻毒)组。21日龄进行NDV强毒北京株攻击，观察14d，rHVT-F保护率达到90％，(见表2)。
表2 rHVT-F对SPF鸡的免疫保护效果
组别 攻毒毒株 死亡数(率) 保护率(％)
rHVT-F疫苗免疫组 NDV(北京株) 2/20(10％) 90
攻毒对照组- NDV(北京株) 20/20(0％) 0
空白对照组- - 0/20(0％) -
实施例4
——重组病毒rHVT-F株疫苗的制备方法
rHVT-F株病毒接种鸡胚成纤维细胞，转瓶接种密度为每1cm2面积接种1000PFU的重组病毒，接种后50小时，有70％以上单层细胞出现典型的细胞病变(CPE)时，倒去培养液，加入适量胰酶消化液，在室温下消化10min左右，细胞单层出现疏松拉网接近脱离瓶壁现象时，立即加入与消化液等量的含10％牛血清的营养液，停止消化。轻轻摇动转瓶，使细胞全部脱离瓶壁，离心收集的细胞用超声波裂解后加入适量SPGA稳定剂，摇匀后分装冻干。
附注：
Lipofectamine2000(赛默飞世尔科技)使用说明书
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板(6孔板)，使其在转染日密度为90％～95％。细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。对于每孔细胞，使用250μl无血清培养基稀释4.0ugDNA，轻轻混匀。使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250μl无血清培养基稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine2000稀释后，在5min内同稀释的DNA混合，室温放置20min。将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2ml无血清配养基。直接将室温放置20min的DNA复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％CO2中保温12小时，12小时后更换成含有血清的培养基。
序列表
　　<110> 北京邦卓生物科技有限公司
　　<120> 表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用
　　<130>
　　<160>
　　<170> Patentin version 3.5
　　<210> 1
　　<211> 2613
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：构建重组火鸡疱疹病毒rHVT-F株的NDV-F基因的表达盒序列
　　<400> 1
CCTGCATCGA TGTACGGGCC AGATATACGC GTTGACATTG ATTATTGACT AGTTATTAAT 060
AGTAATCAAT TACGGGGTCA TTAGTTCATA GCCCATATAT GGAGTTCCGC GTTACATAAC 120
TTACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCTGACCGC CCAACGACCC CCGCCCATTG ACGTCAATAA 180
TGACGTATGT TCCCATAGTA ACGCCAATAG GGACTTTCCA TTGACGTCAA TGGGTGGAGT 240
ATTTACGGTA AACTGCCCAC TTGGCAGTAC ATCAAGTGTA TCATATGCCA AGTACGCCCC 300
CTATTGACGT CAATGACGGT AAATGGCCCG CCTGGCATTA TGCCCAGTAC ATGACCTTAT 360
GGGACTTTCC TACTTGGCAG TACATCTACG TATTAGTCAT CGCTATTACC ATGGTGATGC 420
GGTTTTGGCA GTACATCAAT GGGCGTGGAT AGCGGTTTGA CTCACGGGGA TTTCCAAGTC 480
TCCACCCCAT TGACGTCAAT GGGAGTTTGT TTTGGCACCA AAATCAACGG GACTTTCCAA 540
AATGTCGTAA CAACTCCGCC CCATTGACGC AAATGGGCGG TAGGCGTGTA CGGTGGGAGG 600
TCTATATAAG CAGAGCTCTC TGGCTAACTA GAGAACCCAC TGCTTACTGG CTTATCGAAA 660
TTAATACGAC TCACTATAGG GAGACCCAAG CTGGCTAGCA TGGGCTCCAG ACCTTCTACC 720
AAGAACCCAG CACCTATGAT GCTGACTATC CGGGTTGCGC TGGTACTGAG TTGCATCTGT 780
CCGGCAAACT CCATTGATGG CAGGCCTCTT GCAGCTGCAG GAATTGTGGT TACAGGAGAC 840
AAAGCCGTCA ACATATACAC CTCATCCCAG ACAGGATCAA TCATAGTTAA GCTCCTCCCG 900
AATCTGCCCA AGGATAAGGA GGCATGTGCG AAAGCCCCCT TGGATGCATA CAACAGGACA 960
TTGACCACTT TGCTCACCCC CCTTGGTGAC TCTATCCGTA GGATACAAGA GTCTGTGACT 1020
ACATCTGGAG GGGGGAGACA GGGGCGCCTT ATAGGCGCCA TTATTGGCGG TGTGGCTCTT 1080
GGGGTTGCAA CTGCCGCACA AATAACAGCG GCCGCAGCTC TGATACAAGC CAAACAAAAT 1140
GCTGCCAACA TCCTCCGACT TAAAGAGAGC ATTGCCGCAA CCAATGAGGC TGTGCATGAG 1200
GTCACTGACG GATTATCGCA ACTAGCAGTG GCAGTTGGGA AGATGCAGCA GTTTGTTAAT 1260
GACCAATTTA ATAAAACAGC TCAGGAATTA GACTGCATCA AAATTGCACA GCAAGTTGGT 1320
GTAGAGCTCA ACCTGTACCT AACCGAATTG ACTACAGTAT TCGGACCACA AATCACTTCA 1380
CCTGCTTTAA ACAAGCTGAC TATTCAGGCA CTTTACAATC TAGCTGGTGG AAATATGGAT 1440
TACTTATTGA CTAAGTTAGG TGTAGGGAAC AATCAACTCA GCTCATTAAT CGGTAGCGGC 1500
TTAATCACCG GTAACCCTAT TCTATACGAC TCACAGACTC AACTCTTGGG TATACAGGTA 1560
ACTCTACCTT CAGTCGGGAA CCTAAATAAT ATGCGTGCCA CCTACTTGGA AACCTTATCC 1620
GTAAGCACAA CCAGGGGATT TGCCTCGGCA CTTGTCCCAA AAGTGGTGAC ACAGGTCGGT 1680
TCTGTGATAG AAGAACTTGA CACCTCATAC TGTATAGAAA CTGACTTAGA TTTATATTGT 1740
ACAAGAATAG TAACGTTCCC TATGTCCCCT GGTATTTATT CCTGCTTGAG CGGCAATACG 1800
TCGGCCTGTA TGTACTCAAA GACCGAAGGC GCACTTACTA CTCCATACAT GACTATCAAA 1860
GGTTCAGTCA TTGCCAACTG CAAGATGACA ACATGTAGAT GTGTAAACCC CCCGGGTATC 1920
ATATCGCAAA ATTATGGAGA AGCCGTGTCT TTAAGCGATA ATCAATCAGG CATTGTTTTA 1980
TCTTTGGGCG GGAGTATTGT ACGGTTCAGT GGGGAATTCG ATGTAACTTA TCAGAAGAAT 2040
ATCTCAATAC AAGATTCTCA AGTAATCATA ACATCCAATC CCGATATCTC AACTGAGCTT 2100
GGGAATGTCA ACAACTCGAT CAGTAATGCT TTGAATAAGT TAGAGGAAAG CAACAGAAAA 2160
CTAGACAAAG TCAATGTCAA ACTGACTAGC ACATCTGCTC TCATTACCTA TATCGTTTTG 2220
ACTATCATAT CTCTTGTTTT TGGTATACTT AGCCTGATTC TAGCATGCTA CCTAATGTAC 2280
AAGCAAAAGG CGCAACAAAA GACCTTATTA TGGCTTGGGA ATAATACTCT CGATCAGATG 2340
AGAGCCACTA CAAAAATGTG ATCTAGAGGG CCCGTTTAAA CCCGCTGATC AGCCTCGACT 2400
GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT TGCCCCTCCC CCGTGCCTTC CTTGACCCTG 2460
GAAGGTGCCA CTCCCACTGT CCTTTCCTAA TAAAATGAGG AAATTGCATC GCATTGTCTG 2520
AGTAGGTGTC ATTCTATTCT GGGGGGTGGG GTGGGGCAGG ACAGCAAGGG GGAGGATTGG 2580
GAAGACAATA GCAGGCATGC TGGGGAATGC AGG 2613
　　<210> 2
　　<211> 27
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：上游引物NDV-F-F序列
　　<400> 2
ATAGCTAGCA TGGGCTCCAG ACCTTCT 27
　　<210> 3
　　<211> 27
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：下游引物NDV-F-R序列
　　<400> 3
GCGTCTAGAT CACATTTTTG TAGTGGC 27
　　<210> 4
　　<211> 27
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：上游引物BGH-F序列
　　<400> 4
AATTCTAGAG GGCCCGTTTA AACCCGC 27
　　<210> 5
　　<211> 29
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：下游引物BGH-R序列
　　<400> 5
AGGGCATGCC TGCTATTGTC TTCCCAATC 29
　　<210> 6
　　<211> 29
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：上游引物Tongyuan-down-F序列
　　<400> 6
GGCGCATGCT GGGGAATGCA GGTACAATAC TTTCGACA 38
　　<210> 7
　　<211> 38
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：下游引物Tongyuan-down-R序列
　　<400> 7
GGGGCAAGCT TATGCATTTA TTGTGAGACT GCTTTAAG 38
　　<210> 8
　　<211> 35
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：上游引物Tongyuan-up-F序列
　　<400> 8
GCGGAATTCATGCATCTGTCACCAACGCAAAGTCG
　　<210> 9
　　<211> 29
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：下游引物Tongyuan-down-R序列
　　<400> 9
GCGTCTAGAA TCGATGCAGG GTCTTACATA GAATA 35
　　<210> 10
　　<211> 27
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：上游引物PNDV-F-F序列
　　<400> 10
GCGATCGATG TACGGGCCAG ATATACG 27
　　<210> 11
　　<211> 27
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：下游引物PNDV-F-R序列
　　<400> 11
GCGTCTAGAT CACATTTTTG TAGTGGC 27
　　<210> 12
　　<211> 27
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：上游引物HVT-F序列
　　<400> 12
CATAGGCACG CTCTGATG 18
　　<210> 13
　　<211> 21
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：下游引物HVT-R序列
　　<400> 13
TGGCAAACAG TAAAATTATC C 21
　　<210> 14
　　<211> 20
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：上游引物qianhe-F序列
　　<400> 14
GCACATCTGC TCTCATTACC 20
　　<210> 15
　　<211> 21
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<223> 对人工序列的描述：下游引物qianhe-R序列
　　<400> 15
GTTTCAAATT TTCACGATTC C 21
5

Claims (3)

1.一株表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于该重组火鸡疱疹病毒携带在CMV启动子序列控制下的鸡新城疫病毒的F基因的表达盒，该表达盒的基因序列如Seq ID No:1所示，该病毒被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)rHVT-F株，并已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.13396。
2.如权利要求1所述一种表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于，重组病毒株该在禽类宿主中诱导抗马立克氏病病毒和鸡新城疫病毒的保护性免疫并作为生产毒株用于制备相应的疫苗。
3.如权利要求1所述一种表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组病毒rHVT-F株，作为病毒载体构建新的重组病毒株中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611328A (zh) * 2018-05-04 2018-10-02 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应用
CN110331135A (zh) * 2019-07-18 2019-10-15 扬州大学 表达基因vii型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒候选疫苗株及制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1774264A (zh) * 2002-01-31 2006-05-17 日本瑞翁株式会社 重组火鸡疱疹病毒及其应用
CN102634489A (zh) * 2012-03-22 2012-08-15 肇庆大华农生物药品有限公司 一种重组火鸡疱疹病毒及其应用
CN104159604A (zh) * 2011-11-30 2014-11-19 梅里亚有限公司 表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途
CN104364381A (zh) * 2012-03-30 2015-02-18 法国诗华动物保健公司 多价重组禽疱疹病毒和用于免疫禽类的疫苗

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1774264A (zh) * 2002-01-31 2006-05-17 日本瑞翁株式会社 重组火鸡疱疹病毒及其应用
CN104159604A (zh) * 2011-11-30 2014-11-19 梅里亚有限公司 表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途
CN105920598A (zh) * 2011-11-30 2016-09-07 梅里亚有限公司 表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途
CN102634489A (zh) * 2012-03-22 2012-08-15 肇庆大华农生物药品有限公司 一种重组火鸡疱疹病毒及其应用
CN104364381A (zh) * 2012-03-30 2015-02-18 法国诗华动物保健公司 多价重组禽疱疹病毒和用于免疫禽类的疫苗

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REDDY SK等: "Protective efficacy of a recombinant herpesvirus of turkeys as an in ovo vaccine against Newcastle and Marek"s diseases in specific pathogen-free chickens", 《VACCINE》 *
ROBIN W.MORGAN等: "Protection of Chickens from Newcastle and Marek"s Diseases with a Recombinant Herpesvirus of Turkeys Vaccine Expressing the Newcastle Disease Virus Fusion Protein", 《AVIAN DISEASES》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611328A (zh) * 2018-05-04 2018-10-02 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应用
CN108611328B (zh) * 2018-05-04 2019-05-10 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种表达新城疫病毒f蛋白的传染性喉气管炎重组病毒株及其构建方法和应用
CN110331135A (zh) * 2019-07-18 2019-10-15 扬州大学 表达基因vii型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒候选疫苗株及制备方法

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