JPH07509127A - 偽狂犬病ウイルス変異株を含むアウジェスキー病及び他の動物疾病に対するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

偽狂犬病ウィルス変異株を含むアウジエスキー病及び他の動物疾病に対するワク チン 発明の背景 本発明は、アウジェスキー病ウィルス（Ａ　Ｄ　Ｖ）とも称する偽狂犬病ウィル ス（ＰＲＶ）の条件致死変異株に関する。ＰＲＶは、家畜及び野生動物のアウジ エスキー病を起こす神経向性の大きいヘルペスウィルスである（Ｍｅｔｔｅｎｌ ｅｉｔｅｒ、Ｃｏｍｐ、Ｉｍｍｕｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｎ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉ ｓ、１４，１５１−１６３［１９９１１；Ｗｉ　ｔ　ｔｍａｎｎ及びＲｚｉｈａ 、［Ｇ。 Ｗｉｔｔｍａｎｍ］Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｏｆ　Ｃａｔ ｔｌｅ、Ｈｏｒｓｅｓ　ａｎｄ　Ｐｉｇｓ、　Ｋｌｕｗｅｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、 　２３０−３２５［１９８９コ　；Ｐｅｎ５ａｅｒｔ及びＫｌｕｇｅ、［Ｍ。 Ｂ、Ｐｅｎ５ａｅｒｔ編］Ｖｉｒｕｓ　１ｎｆｅｃｔｉ。 ｎｓ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅｓ、ＥＩｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌ ｉｓｈｅｒｓ　Ｂ、Ｖ、、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、３９−６４　［１９８９］参照 ）。ブタはＰＲＶに対して比較的耐性であるため、該ウィルスの天然宿主とみな される。天然の侵入間は鼻咽頭領域である。該ウィルスは鼻及び咽頭粘膜細胞内 で複製することができ、抹消神経の感染後に中枢神経系に輸送され、若いブタに とってしばしば致死的である脳炎を発生させる。年齢がより高いブタは通常は該 感染で死ぬことはないが、発熱及び肺炎を起こし得る。知覚神経節の感染は通常 、潜伏期を確立させる。 感染した動物の死亡及び発育遅延によって生じる経済的損害を制限するために、 アウジエスキー病の予防接種が実施されている。該接種には、弱毒化生ウィルス 及び不活性化ウィルスをベースとするワクチンが使用可能である。通常は弱毒化 生ウイルスワクチンが好ましい。なぜなら、不活性化ワクチンより製造が簡単で あり、従って廉価だからある。また、弱毒化ウィルスは鼻腔内投与することがで き、これは、弱毒化生ウィルス又は不活性化ウィルスを非経口接種した場合より 防護力が強い。 細胞培養で連続継代後に得られた弱毒化生ウィルスをベースとする初期のワクチ ンは、幾つかの欠点を有していた。 この種のワクチンは均質でなく、未知の毒性及び免疫原住を有するウィルス変異 株が混合物中に含まれていた。また、この種のワクチンには、毒性に戻る危険が あった。その後、ウィルスの構造及び複製が分子レベルでより良く解明され且つ 高度の分子生物学的技術の使用が可能になったため、科学者達は、確率に頼るの ではなく、弱毒化ワクチンを設計することができるようになった。ウィルス遺伝 学及びＤＮＡ分析は、修正（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）がウィルス病原性の弱毒化 に貢献し得るウィルスゲノム内の領域の同定を可能する。組換えＤＮＡ技術は、 このような領域を修正又は欠失させて、所定の安定な変性を有する弱毒化ウィル スの製造を可能にする。この方法は最初、ＰＲＶの弱毒化のためにＫｉｔら（Ａ ｍ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、４６．１３５９−１３６７　［１９８５］　）により 適用されて成功をおさめた。ＰＲＶのチミジン−キナーゼ（Ｔ　Ｋ　）遺伝子の 不活性化は、ブタに対する毒性を著しく低下させた（ＥＰ−Ａ−１４１，４５８ 号）。ＴＫ遺伝子の損傷の他に欠失が、ｇｌ、ｇｌｌＩ及びｇＸのような糖タン パク質遺伝子に導入され（Ｋｉｔら、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、４８゜７８０ −７９３　［１９８７］　；Ｍａｒｃｈｉｏｌ　ｉら、Ａ９８７］　；Ｑｕｉｎ ｔら、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６８゜５２３−５３４　［１９８７］　＋Ｍｏ ｏｒｍａｎｎら、Ｊ。 Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、７１．　１５９１−１５９５　［１９９０］　：ＷＯ−Ａ −９１０２７９５号）、その結果ウィルスの毒性が更に低下し、予防接種した動 物と感染した動物とを血清学的に判別することが可能となった（Ｐ　ｌ　ａ　ｔ 　ｔら。 Ｖｅｔ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１１．２５−４０　［１９８６］　；Ｖａｎ　０ ｉｒｓｃｈｏｔら、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉ　ｒ１９１−２０６　［１９８８］　；Ｅ ｌｏｉ　ｔら、Ｖｅｔ、Ｒｅｃ、１２８．９１−９４　［１９８９］　）。 ワクチン開発への新しいアプローチは、弱毒化生ウィルスワクチン株をキャリヤ ー（ウィルスワクチンベクター）として用いる外来病原体遺伝子の発現である。 生きているベクターウィルスによる抗原の発現は天然感染後の発現と類似してお り、体液性及び細胞性両方の免疫応答を刺激し得る。ワクチンベクターは、適当 なワクチンが現存しないか又は安全もしくは容易に製造できないような病気に対 する免疫感作に使用し得る。 ワクチンベクターの開発は主に、ワクシニアウィルスに絞られてきた（Ｍｏｓｓ 及びＦｌｅｘｎｅｒ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　５．　３０５−３２４ 　［１９８７コ；Ｐｉｃｃｉｎｉ及びＰａｏｌｅｔｔｉ、Ａｄｖ、Ｖｉｒｕｓ　 Ｒｅｓ、３４．４３−６４　［１９８８コ）。ワクシニアウィルスはヒト天然痘 の根絶のために広く使用され、極めて効果的であると共に比較的安全であること が判明した。宿主範囲が広（且つ多量の外来ＤＮＡを収容する能力があるため、 ワクシニアはワクチンベクターとして一般的に好んで試用されるウィルスとなっ た（Ｈｒ　ｕ　ｂ　ｙ、ＣＩｉｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、３，１５３− １７０［１９９０１；Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｃｒ　ｉ　ｔ、Ｒｅｖ。 Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０．１３　［１９９０］　）ｏワクシニアウィルスに代わる ものとして、ラクーンボックス（ｒａｃｏｏｎｐｏｘ）ウィルス、アビボックス （ａｖｉｐｏｐｘ）ウィルス、カブリボックス（ｃａｐｒｉｐｏｘ）ウィルス及 びスイボックス（ｓｕｉｐｏｘ）ウィルスのような別のポックスウィルスがワク チンベクターとして開発されつつある（Ｔａｙｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ　６．５ ０４−５０８　［１９８８］　：　Ｌｏｄｍｅ　］　Ｉら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６ ５．３４００−３４０５　［１９９１］　；Ｌｅｔｅｌｌｉｅワクチンベクター として使用できる別のウィルスとしては、アデノウィルスが挙げられる（Ｂｅｒ ｋｎｅｒ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６．６００３−６０２０　［１９８８ ］）及びヘルペスウィルス（Ｓｈｉｎら、Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８１．５８６７−５８７０　［１９ ８４］　；Ｔｈｏｍｓｅｎら、Ｇｅｎｅ３８９６−３９００　［１９８７］　； Ｃｏ１ｅら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６４．４９３０−４９３８　［１９９０］　；ｖ ａｎＺｉｊｌら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６５．２７６１−２７６５　［１９９１コ　 ；Ｋｉｔ　ら、Ｖａｃｃｉｎｅ　９，５６４−５７２　［１９９１１）。安全で 効果的な生のヘルペスウィルスワクチンを得ることができ且つ多量の外来ＤＮＡ を収容する能力を有するため、これらのウィルスはワクチンベクターの開発のた めに有利に使用し得る可能性がある。 ワクチンベクターとしてのＰＲＶの使用は極めて有望である。ＰＲＶは特性が良 く解明されており、安全で効果的な生ワクチンが標的欠失（前出文献参照）によ って開発されている。該ウィルスは宿主範囲が広いが、ヒトに対しては無害であ る。効果的なキャリヤーワクチンとしてのＰＲＹの適用は、最近ｖａｎ　Ｚｉｊ ｌらによって示された（Ｊ。 Ｖｉｒｏｌ、６５．２７６１−２７６５　［１９９１］　、ＷＯ−Ａ−９１００ ３５２号）。彼らは、ブタコレラウィルスのエンベロープ糖タンパク質Ｅ１を発 現するＰＲＶ組換え体が、偽狂犬病及びブタコレラ（一般的なブタ熱）の両方に 対してブタを防護することを立証した。 ワクチンの最も重要な特性の一つは安全性である。従来の方法で弱毒化した生ワ クチンの表現型を変える正確な分子変化は一般的に未知であるため、これらのワ クチンが毒性に戻る可能性は僅かながら常に存在する。この問題は、所定の安定 な欠失を有する組換えワクチンの使用によって解決し得る。しかしながら、安定 に弱毒化したワクチンの形成は、不可能ではないとしても極めて難しい時がある 。 その場合は、死んだワクチンか又は安全なワクチンベクターの使用に頼らなけれ ばならない。適当に調製し且つ検査した生の弱毒化欠失ワクチン及びワクチンベ クターは通常、免疫適性（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）宿主においては安 全である。しかしながら、免疫を発揮し得ない（１ｍｍｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉ　 ｚｅｄ）宿主では、重大な合併症が生起し得る。生の弱毒化ワクチン及びワクチ ンベクターは複製することができるため、免疫を発揮し得ない宿主にとって危険 であり得る環境に放出され得る。また、標的種において安全に使用できるワクチ ンは、別の種に対して依然として毒性であり得る。 ワクチンベクターに導入するのに適当と思われる遺伝子はしばしば、大きな免疫 原性を有する構造ピリオンタンパク質をコードする。この種のタンパク質として は、ウィルス糖タンパク質、融合タンパク質及び赤血球凝集素ノイラミニダーゼ が挙げられる（Ｈｒｕｂｙ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、３．１５ ３−１７０　［１９９０］　）。この種のタンパク質はしばしば、ウィルスの宿 主向性及び／又は細胞向性を決定するウィルス−細胞相互作用に関与する。従っ て、キャリヤーウィルスによるこのような遺伝子の発現は、理論的には、その生 物学的特性、例えば病原性、組織向性及び宿主特異性を変化させ得る。また、こ れらの変化した生物学的特性は、相同的組換えによって、弱毒化ベクターウィル スから毒性野生型ウィルスに伝えられ得る。 以上の考察は、生ワクチン及び自己制限型（ｓｅｌｆ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ） 即ちワクチンを受けた動物によって広まることのないワクチンベクターの開発を 主張するものである。理想的には、この種のワクチンは非感染性子孫を生み出す ものでなければならず、また対応する野生型ウィルスでの組換え後に感染性ウィ ルスを発生させることができないものでなければならない。我々は本明細書に、 これらの要件を満たす発明を記述する。 発明の概要 本発明は、アランニスキー病の予防接種に使用し得且つ安全なワクチンベクター として使用し得る条件致死偽狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）変異株を提供する。本発 明の株は、前記ウィルスの感染性にとって必須のウィルスエンベロープタンパク 質であるｇｐ５０を発現することができない。 ｇｐ５０遺伝子は、外来オリゴヌクレオチドの挿入、もしくは欠失、又はその両 方（置換）により不活性化した。ｇｐ５０遺伝子は特に、三つの読取り枠総ての 中の翻訳ストップコドンを含む合成オリゴヌクレオチドの挿入、又はｇｐ５０遺 伝子及びｇｐ６３遺伝子両方の一部分を含むＰＲＶゲノムの一部分の欠失により 不活性化した。該変異体ウィルスは、ウィルスｇｐ５０遺伝子を発現する相補細 胞系（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）で増殖する。これら の細胞によって産生された子孫ピリオンは表現型的相補（ｐｈｅｎｏ−ｔｙｐｉ ｃａｌｌｙ　ｃ。 ｍｐ　ｌ　ｅｍｅｎ　ｔ　ｅｄ）である、即ち、前記相補細胞系によって与えら れるｇｐ５０を有する。このような表現量的相補変異体ピリオンは、ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉＶＯの両方で細胞に感染することができ、複製され、直接 的細胞−細胞伝搬によって広まることができる。しかしながら、感染細胞によっ て放出された子孫ピリオンはｇｐ５０を欠くため非感染性である。これらのウィ ルスは新しい感染サイクルを開始することができないため、予防接種した動物か ら予防接種していない動物へと伝搬され得ない。 このような制限は、これらのウィルスをベースとする（キャリヤー）ワクチンを 極めて安全なものとする。 従って本発明は、動物の病気に対するワクチンを製造するための、即ちアランニ スキー病に対するワクチンを製造するための、又は別の対応病原体に由来する抗 原又は抗原の一部分をコードするヌクレオチド配列を偽狂犬病ウィルスｇｐ５０ 変異株に導入することによって他の動物疾病に対するベクターワクチンを製造す るための、偽狂犬病ウィルスｇｐ５０変異株の使用に関する。 本発明は、糖タンパク質ｇｐ５０を含み且つｇｐ５０遺伝子中に突然変異を有す る偽狂犬病ウィルスを含む、動物の病気を抑制するためのワクチンにも関する。 該ワクチンはアウジェスキー病に対する防護のために使用し得、その場合は突然 変異が欠失であり、あるいは他の動物疾病に対する防護のために使用し得、その 場合は突然変異が、前記他の動物疾病を誘発する別の病原体に由来する抗原もし くは抗原の一部分をコードする異種ヌクレオチド配列の挿入からなる。偽狂犬病 ウィルスはゲノム内に、毒性を変えるための、又は別のタンパク質を発現するた めの別の突然変異、例えばｇｐ６３、ｇＩ、ｇｌｌ）、ｇＸ、ＩＩＫ、チミジン キナーゼ（ＴＫ）、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）　、タンパク質キナ ーゼ又は２８に遺伝子、特にｇＩもしくはｇｐ６３遺伝子における欠失及び／又 は挿入を含み得る。 本発明は、株Ｒ１２２、Ｒ３３２、Ｄ５６０及びＤ１２００（第１図参照）に代 表されるＰＲＶ　ｇｐ５０変異株に関する。株Ｒ１２２及びＲ３３２は機能性ｇ ｐ５０を発現することができず、株Ｄ５６０及びＤ１２００は機能性ｇｐ５０又 は機能性ｇｐ６３を発現することができない。 ｇｐ５０はウィルスの侵入に必須のものであるため、これらの変異株はｇｐ５０ を発現する相補細胞系で増殖させる。 総ての株は非相補細胞内で完全複製サイクルを全うすることができるが、この種 の細胞から放出された子孫ピリオンはｇｐ５０を欠き、従って非感染性である。 ｇｐ５０変異株が非相補細胞系でプラークを形成することができるという観察事 実は、該ウィルスが感染細胞から非感染細胞に伝搬され得ることを意味する。 ＥｃｏＲＩ制限部位（ＧＡＡＴＴＣ）と三つの読取り枠縁ての中の翻訳ストップ コドンとを含む配列５’　−ＴＡＧＧＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＣＴＡ−３’ 　（配列番号１）を有する合成オリゴヌクレオチドを、Ｗ　ｉ　ｎ　ｄら（Ｊ、 　Ｖｉ　ｒｏｌ、６４．４６９１−４６９６　［１９９０］　）に記載のように プラスミドｐＮ３ＨＢのｇｐ５０遺伝子内の二つの異なる位置に挿入して（第１ 図参照）、ＰＲＶ株Ｒ１２２及びＲ３３２を得た。プラスミドｐＮ３ＨＢは、プ ラスミドｐＢＲ３２２にクローニングしたＰＲＶのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ７ラグメ ントからなる（ｖａｎ　Ｚｉｊｌら。 Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．６５．２７６１−２７６５　［１９８８］　）。その結果 得られた、オリゴヌクレオチドがｇｐ５０遺伝子のヌクレオチド３６６−３６７ の間及び９９６−９９７の間に挿入されているプラスミドを、それぞれＲ１及び ３２２と命名した。我々は、ＰＲＶ株Ｒｉｃｅのｇｐ５０遺伝子のヌクレオチド 配列番号付けを使用する（Ｐｅｔｒ。 ｖｓｋｉら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５９．２１６−２２３　［１９８６］の第２図） 。但しここで留意すべきこととして、ＰＲＶ株ＮＩＡ−３のｇｐ５０遺伝子のヌ クレオチド配列は位置３６４（ＧからＡ）が株Ｒｉｃｅの配列とは異なり、株Ｎ ＩＡ−３のｇｐ５０遺伝子中にはＢｇｌＩＩ制限部位が存在することになる。 突然変異誘発フラグメント（ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄｆｒａｇｍｅｎｔ）（Ｒ１ もしくは３２２のいずれか）と、互いに一緒になって完全ウィルスゲノムを含む コスミドＣ−１７９、Ｃ−２７及びｃ−４４３に由来する三つの重複（ｏｖｅｒ ｌａｐｐｉｎｇ）サブゲノム野生型ＰＲＶフラグメントとを組合わせて使用して 、オーバーラツプ組換え（ｖａｎ　Ｚｉｊｌら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６５．２７６ １−２７６５　［１９８８］　）により、ウィルスゲノムの再構築を行った。オ ーバーラツプ組換えは、ｇｐ５０を構成的に（ｃｏｎｓｔ、１ｔｕｔｉｖｅｌｙ ）発現する相補細胞系（Ｇ５細胞系）内で実施した（Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｊ、　 Ｖｉｒｏｌ、６６．８９４−９０５　［１９９２］　）ｏ得られてウィルス株を 、それぞれＲ１２２及びＲ３３２と命名した。 株Ｄ５６０を得るために、我々はプラスミド３２２（既述）と、プラスミドｐＮ ３ＨＢの別の誘導体であるプラスミド１４９（ｄｅ　Ｗｉｎｄら、Ｊ、Ｖｉｒｏ ｌ、６４゜４６９１−４６９６　［１９９０］　’Ｉを使用した。プラスミド１ ４９では、オリゴヌクレオチドがヌクレオチド３５２−３５３　（番号付はＰｅ ｔｒｏｖｓｋｉら、Ｊ、Ｖｉｒ。 １．６０，１８５−１９３　［１９８６］の第５図に従う）（第１図参照）の間 でｇｐ６３遺伝子に挿入されている。 プラスミド１４９のＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントをプラスミド３２ ２のＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントで置換して、ｇｐ５０遺伝子の位 置９９６とｇｐ６３遺伝子の位ｆｆ１３５３との間のヌクレオチド配列が配列番 号１の配列（即ち突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列）で置換された新規の プラスミドを得た。該プラスミドを重複野生型フラグメントと一緒に用いて、Ｇ ５細胞内でのオーバーラツプ組換えによりウィルスを再生した。得られたウィル スをＤ５６０と命名した。 株Ｄ１２００を得るために、プラスミド１４９を制限酵素Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ及びＥ ｃｏＲＩで消化し、得られたより大きいフラグメントを、大腸菌（Ｅ、ｃｏ　Ｉ 　１）ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントでの両端の処理後に、Ｔ４ 　ＤＮＡリガーゼで環化した。得られたプラスミドは、ｇｐ５０遺伝子の位ｆｆ １３３６とｇｐ６３遺伝子の位置３５３との間のヌクレオチド配列が、配列ＡＡ ＴＴＣＴＡＧＣＣＴＡ　（配列番号２、即ち突然変異誘発オリゴヌクレオチドの レムナンド）で置換されている。このプラスミドを重複野生型フラグメントと一 緒に用いて、Ｇ５細胞内でのオーバーラツプ組換えによりウィルスを再生した。 得られたウィルスをＤ１２００と命名した。 ｇｐ５０変異株Ｒ１２２及びＲ３３２、並びにｇｐ５０＋ｇｐ６３変異株Ｄ５６ ０及びＤ１２００は、非相補ＳＫ６細胞上でプラークを形成することができる。 株Ｒ１２２及びＲ３３２によりＳＫ６細胞上で形成されたプラークは、野生型親 株ＮＩＡ−３によって形成されるプラークと類似の大きさを有する。株Ｄ５６０ 及びＤ１２００によりＳＫ６細胞上で形成されるプラークは大きさがより小さい 。これは、ＰＲＶの複製サイクルにｇｐ６３が関与していることを意味する。 細胞−細胞伝搬はｇｐ５０とは無関係であるが、ｇｐ５０変異株ウィルスが生き た動物においてかなりの程度まで複製するとは考えられなかった。ウィルスの毒 性は通常、主要感染部位での複製、その後に起こる他の体部分への子孫ピリオン の伝搬、及び複数回の感染を介する高度の増殖の結果として生じる。ｇｐ５０変 異株は主要感染部位で複製することができるだけであるため、我々はこれらの変 異株が非毒性であると予想した。また、これらの変異株が免疫原性であるかどう かも疑わしかった。なぜなら、ｇｐ５０がブタにおいて防護的免疫応答を誘発す ることができる［１９９１　コ　；Ｒｉｖｉｅｒｅ　ら、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　 ６６゜３４２４−３４３４　［１９９２］　）が立証するように、ｇｐ５０自体 は大きな免疫原性を有するからである。従ってｇｐ５０の不活性化は、ｇｐ５０ 及びｇｐ５０＋ｇｐ６３の変異株の免疫原特性を著しく低下させると思われた。 また、変異株ウィルスが中枢神経系に到達できるとも考えられなかった。なぜな ら、そのためにはウィルスが感染組織から抹消神経に伝搬され、次いで中枢神経 系に輸送されなければならないからである。ウィルスのシカブス経由（ｔｒａｎ ｓ−ｓｙｎａｐｔｉｃ）輸送が感染性子孫ピリオンによるシナプス後部（ｐｏｓ ｔ−ｓｙｎａｐｔｉｃ）ニューロンの再感染を伴うとすれば（Ｌｙｃｋｅら、Ｊ 、Ｇｅ）、中枢神経系への変異体ウィルスの輸送はシナプスでブロックされ得る 。これは、ウィルスが中枢神経系に侵入するのを妨害し、従って脳におけるウィ ルスの作用を阻止するであろうと思われる。 ｇｐ５０変異体ウィルスが動物組織内で伝搬できるかどうかを調べるために、ブ タ鼻粘膜の外植片におけるｇｐ５０変異株Ｒ１２２及びＲ３３２並びにｇｐ５０ ＋ｇｐ６３変異株Ｄ５６０及びＤ１２００の複製を免疫組織化学的に検査した。 また、該ウィルスがｉｎ　ｖｉｖｏで複製され伝搬されるかどうかを調べるため に、マウスの皮下又は腹腔内に接種して感染させた。その結果、総ての変異株が ブタ鼻粘膜内で複製できることが判明した。 驚いたことに、ｇｐ５０変異株及びｇｐ５０＋ｇｐ６３変異株は、腹腔内又は皮 下接種後にマウスにとって致死であることが判明した。株Ｒ１２２の毒性（感染 動物が死ぬまでの平均時間で表す）は、野生型株Ｎ　Ｉ　Ａ−３と比べて僅かに 低下しているにすぎなかった。しかしながら株Ｄ５６０及びＤ１２００の毒性は それより遥かに低下していた。 これは、マウスに対する毒性にｇｐ６３が関与していることを意味する。感染動 物の検死の結果、該変異株は脳で複製できることが判明した。腹腔内感染した動 物の器官の免疫組織化学的検査では、ウィルスが抹消神経で優先的に複製される ことが判明した。株Ｒ１２２を非相補細胞上で増殖させると、従ってｇｐ５０が 欠失していると、腹腔内経路では感染しなかった。この発見は、ｇｐ５０が一次 感染に必要であることを意味する。表現型的相補ＰＲ，ＶｇＩ■変異株（やはり 非感染性子孫を産生ずるが、非相補細胞系上でプラークを形成することはできな い）がマウスに対して完全に無害であるという観察事実は、−次感染後は、ウィ ルスの伝搬が成功するか否かが細胞−細胞伝搬に依存することを意味する。ｇｐ ５０又はｇｐ５０＋ｇｐ６３変異株に感染させた動物のいずれからも感染性ウィ ルスを単離できないという発見は、これらの変異株によって生きた動物内で産生 された子孫ピリオンが非感染性であることを立証するものである。 これらの結果を総合すると、ｇｐ５０は一次感染には必要であるが、その後のウ ィルスの複製及び伝搬には必要とされないことが明らかである。これは、直接的 細胞−細胞伝搬がｉｎ　ｖｉｖｏでのウィルス伝搬の主なメカニズムであること を意味する。これらの結果は更に、ウィルスのシナプス経由輸送がｇｐ５０には 依存せず、細胞外ピリオンによるシナプス後部ニューロンの新たな感染の結果生 じるものではないことを示している。ｇｐ５０又はｇｐ５０＋ｇｐ６３変異株に 感染させたいずれの動物からも感染性ウィルスを単離できないという発見は、ｇ ｐ５０変異株によって生きた動物内で産生された子孫ピリオンが非感染性である ことを意味する。従って、該変異株の複製は感染／予防接種動物に限定される。 ｇｐ５０変異株をアウジェスキー病に対するワクチンのベースとして、又は異種 遺伝子の発現のための組換えキャリヤーウィルスとして使用すると、予防接種し た動物内でのみ複製され、別の種を含む別の動物に伝搬しない極めて安全なワク チンが形成される。 また、異種遺伝子をキャリヤーウィルス内のｇｐ５０遺伝子の位置に挿入すると 、野生型ウィルスでの組換えによって必ず非感染性組換え体が形成される。 ｇｐ５０変異株Ｒ１２２を接種したブタは、毒性野生型株ＮＩＡ−３を抗原投与 した後に、アウジエスキー病の臨床的徴候に対して完全に防護された。ｇｐ５０ ＋ｇｐ６３変異株Ｄ５６０及びＤ１２００を接種したブタは、ＮＩＡ−３を抗原 投与した後に短期間の発熱及び発育遅延を示したが、神経系の徴候は示さなかっ た。これらの結果は、細胞−細胞伝搬によってのみ伝搬できるＰＲＶ変異株が依 然として大きな免疫原性を有することを意味する。これらの結果は更に、最も大 きい免疫原性を有するＰＲＶタンパク質（既述）であるｇｐ５０の発現がアウジ エスキー病に対するブタの効果的防護に必要とされないことを初めて明らかにし た。この結果は予想外のものであった。 偽狂犬病ウィルス（アウジエスキー病）感染を防止又は抑制するための本発明の ワクチンは、ウィルスエンベロープ中にｇｐ５０を有し且つ前述のような脱機能 性ｇｐ５０遺伝子を有するＰＲＶを活性成分として含む。該ワクチンは通常の成 分、例えば適当な担体、任意的な安定剤、アジュバント、可溶化剤、乳化剤等も 含む。該ワクチンの投与は、陵内、皮下、筋向、静脈内又は鼻腔内といったよう な種々の方法で実施し得る。好ましいのは鼻腔的投与である。該ワクチンはまた 、多価ワクチンを製造するために、別の病気に関連した別の免疫原も含み得る。 ＰＲＶ　ｇｐ５０変異株は、ウィルスベクターとして使用する場合は、ｇｐ５０ 遺伝子の突然変異以外に、好ましくはｇｐ５０遺伝子への挿入として、別の病原 体、例えばブタコレラ（ブタ熱）ウィルス、パーポウイルス、伝染性胃腸炎ウィ ルス、ブタ流行性流産及び呼吸症候群（Ｐ　ＥＡＲ３もしくはブタミステリー病 （ｍｙｓｔｅｒｙ　５ｗ１ｎｅ　ｄｉｓｅａｓｅＳ　ＭＳＤＳＰＲＲ３又は５Ｉ Ｒ３）、ブタ呼吸コロナウィルス（ＰＲＣＶ）　、ブタ地方店性下痢ウィルス及 びインフルエンザウィルスのようなウィルス、Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌ ｔｏｃｉｄａ、Ｂｏｒｄ子情報を含む。病原体の核酸配列をＰＲＶサブゲノムフ ラグメントにクローニングし次いでこれらをＰＲＶのゲノムに組込む方法は一般 的に知られている。具体例はＶａｎＺｉｊｌら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２．２１９ １−２１９５［１９８８］　に記載されている。 ＰＲＶ　ｇｐ５ｏ変異株は依然として細胞−細胞伝染により伝搬することができ るが、単純ヘルペスウィルス１型（Ｈ３Ｖ−１）及びウシヘルペスウィルス１型 （ＢＨＶ−１）の同種遺伝子における突然変異は、細胞−細胞伝染によって伝搬 できないウィルス変異株を発生させる（Ｌｉｇａｓ及びＪｏｈｎｓｏｎ、Ｊ、Ｖ ｉｒｏｌ、６２．１４８６−１４９４　［１９８８］　：Ｆｅｈｌｅｒら、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、６６．８３１−８３９　［１９９２］）、これは、ＰＲＶのｇｐ５ ０（７）機能、並びｉ、：　ＨＳ　Ｖ　−１ノｇ　Ｄ及びＢＨＶ−１のｇｌＶの 機能に相違が存在することを意味する。 組換えＤＮＡ技術を使用すれば、Ｈ６Ｖ−１、ＢＨＶ−１及び他のヘルペスウィ ルスを、ＰＲＶ　ｇｐ５０変異株の場合と同様に、感染性子孫を発生させずに、 細胞−細胞伝染で伝搬できるように改変することが可能であり得る。その結果、 多くの動物及びヒトの病気の根絶及び抑制に使用し得る安全なヘルペスウィルス （キャリヤー）ワクチンが多量に産生されることになる。 ＰＲＶゲノムの部分の物理地図。矢印は、リンカ−挿入突然変異誘発によって導 入した、プラスミドｐＮ３ＨＢ及び対応するウィルス変異株Ｒ１２２、Ｒ３３２ 、Ｍ２Ｏ３及びＭ２Ｏ３（Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６６゜８９４− ９０５　［１９９２］　；ｄｅ　Ｗｉｎｄら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６４．４６９１ −４６９６　［１９９０］　）のｇｐ５０遺伝子及びｇｐ６３遺伝子遺伝米中ス トップコドンの位置を示す。水平バーは変異株Ｄ５６０及びＤ１２００における 欠失の位置及び範囲を示す。上方の線は、ｇｐ５０を構成的に発現するＧ５細胞 内に存在するＰＲＶのＢｓｔＸＩ−ＳｔｕＩフラグメントを示す（Ｐｅｅｔｅｒ ｓら。 ブタコレラウィルスＥ１遺伝子をヒトサイトメロガルウィルスエンハンサ−／プ ロモーターと共に含むプラスミドｐＥＶｈ　ｉ　ｓ　１３ＨＣＶＥ１゜該プラス ミドは、異種遺伝子を含むＰＲＶ　ｇｐ５ｏ変異株の構築に使用される（実施例 ６参照）。 第３図 欠失ｇｐ５０遺伝子の部位でＰＲＶゲノムの一部分に、ブタコレラウィルスＥ１ 遺伝子とヒトサイトメロガルウィルスエンハンサ−／プロモーターとを含むプラ スミドｐＢＰ５３Ｅ１゜該プラスミドは、異種遺伝子を含むＰＲＶｇｐ５０変異 株の構築に使用される（実施例６参照）。 実施例Ｉ ＰＲＶ株ＮＩＡ−３のｇｐ５０遺伝子のクローニング及びｇｐ５０を発現する細 胞系の構築 組換えＤＮＡ方法は総て標準的技術によって実施した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ 、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ［１９８２］）、プラスミドｐＥＶｈｉｓ１４は、ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩフラグメントをヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）の初期（ｉ ｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）エンハンサ−／プロモーターを含むフラグメン ト（Ｂｅｒｎａｒｄら、ＥＭＢＯＪ、旦、１３３−１３８　［１９８７］　’Ｉ で置換し、次いで三つの読取り枠縁ての中のストップコドンとポリアデニル化部 位とを含む合成オリゴヌクレオチドで置換することにより、ｐＳＶ２ｈ　ｉ　ｓ 　（Ｈａ　ｒ　ｔｍａｎ及びＭｕ　Ｉ　Ｉ　ｉｇａｎ、Ｐｒ。 ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５．８０４７−８０５１　［１９ ８８］　）から誘導した。プラスミドｐＥＶｈｉｓｌＯは、ｈＣＭＶエンハンサ −／プロモーターを含むＢａｍＨＩフラグメントの欠失によりｐＥＶｈ　ｉ　ｓ １４から誘導した。ＰＲＶのｇｐ５０遺伝子を、Ｂｓ　ｔＸｌ−３ｔｕＩフラグ メント（ｇｐ５０プロモーターを欠（）として、ｐＥＶｈｉｓ１４内のｈＣＭＶ プロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、プラスミドｐ ＥＶｈ　ｉ　ｓ　１４ｇｐ５０を得た。重複サブゲノムＰＲＶフラグメントを含 むコスミドＣ１７９、Ｃ２７及びＣ４４３、並びにｐＢＲ３２２誘導体のＨｉｎ ｄｌｌＩ部位のＰＲＶのＨｉｎｄｌｌＩ−Ｂフラグメントを含むプラスミドｐＮ ３ＨＢの構築及び特徴解明は、文献に記述されている（ｖａｎ　Ｚｉｊｌら、Ｊ 、Ｖｉｒｏｌ、６５．２７６１−２７６５　［１９８８］　）。ｐＮ３ＨＢのｇ ｐ５０遺伝子内の二つの異なる位置のリンカ−挿入（挿入体Ｒ１及び３２２）よ るｇｐｓｏ発現の不活性化は、文献に記述されている（　ｄ　ｅ　Ｗ　ｉ　ｎ　 ｄら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６４．４６９１−４６９６　［１９９０］　）。 ５Ｋ−６細胞を電気穿孔法によりプラスミドｐＥＶｈｉｓ１４ｇｐ５０でトラン スフェクションした。５Ｋ−６細胞をトリプシン化によって回収し、リン酸塩緩 衝塩水（ＰＢＳ）で室温で一度洗浄し、２Ｘ１０’細胞／ｍｌで水冷ＰＢＳに再 懸濁させた。１０μｇのプラスミドｐＥＶｈｉＳ１４ｇｐ５０を滅菌使い捨て電 気穿孔キュベツト（内部電極距離０．４ｃｍ；ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）内の０°Ｃに維持したＱ、５ｍｌの細胞に加え、Ｂ１ｏＲａｄ　Ｇｅ ｎｅＰｕｌｓｅｒを用いて２５μＦのキャパシタンス設定で１００ＯＶの放電を 行った。細胞を０℃で１５分間静置し、５０ｍ１の培地を入れた７５ｃｍ２フラ スコに移し、−晩インキユベートした。次いで、トランスフェクションした細胞 をトリプシン化し、２．５ｍＭヒスチジノール含有培地中で、幾つかの希釈率で 、１００ｍｍペトリ皿に再ブレーティングした。培地はコロニーが明らかに見え るようになるまで（７〜１０日間）３〜４日毎に交換した。個々のコロニーを採 取し、微量滴定培養皿で増殖させた。ｇｐ５０の発現をイムノペルオキシダーゼ 単層アッセイと、モノクローナル抗体０５ＯＮ２を用いる放射線免疫沈降（ｒａ ｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）とによって調べ、放射線免疫 沈降で測定して多量のｇｐ５０を発現した細胞系をＧ５と命名した（Ｐｅｅｔｅ ｒｓら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６６．８９４−９０５［１９９２］）。 実施例２ 変異体ウィルスの構築 重複野生型ＰＲＶ配列を含む三つのコスミド（ｖａｎ［１９８８］に記載のｃ− １７９、Ｃ−２７及びＣ−４４３）と、それぞれｇｐ５０遺伝子内のヌクレオチ ド位置３６６−３６７の間及び９９６−９９７の間（第１図）に突然変異誘発オ リゴヌクレオチド５’　−ＴＡＧＧＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＣＴＡ−３°　 （配列番号１）を含むｐＮ３ＨＢ誘導体ＲＩもしくは３２２のＨｉｎｄＴＩＩ− Ｂフラグメント（ｄ　ｅ　Ｗ　ｉ　ｎ　ｄら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６４゜４６９１ −４６９６　［１９９０］　）とを用いて、Ｇ５細胞内でのオーバーラツプ組換 えにより、変異体ウィルスＲ１２及びＲ３３２を構築した。ウィルスＤＮＡフラ グメントはＥｃｏＲＩ消化（コスミド）又はＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ消化（クローン ＲＩ及び３２２）によってプラスミドから放出され、ベクター配列からはそれ以 上分離されなかった。ＢｉｏＲａｄ　ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ及びＣａｐａｃｉｔ ａｎｃｅ　Ｅｘｔｅｎｄｅｒをそれぞれ２５０ｖ及び９６０μＦの設定で使用し て、電気穿孔法によりトランスフェクションを実施した（既述）。細胞を６ウエ ルプレートに接種し、３７℃で３時間インキュベートした後、培地を２％ウシ胎 児血清、１％メチルセルロースを含むイーグル最少必須培地に替えて６、プラー クが現れるまで（２〜３日間）３７℃でインキュベートした。 株Ｄ５６０を得るために、プラスミド１４９のＢｇｌｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメ ント（ｇｐ６３遺伝子のヌクレオチド３５２−３５３の間に突然変異誘発オリゴ ヌクレオチドを含むｐＮ３ＨＢ誘導体（ｄｅＷｉｎｄら、Ｊ、Ｖｉｒｏ　１．６ ４．４６９１−４６９６　［１９９０］　；番号付けはＰｅｔｒｏｖｓｋｉｓら 、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、且、１８５−１９３　［１９８６］の第５図に従う））を、 プラスミド３２２のＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントで置換した（第１ 図参照）。その結果得られた、ｇｐ５０遺伝子の位置９９６とｇｐ６３遺伝子の 位置３５３との間のヌクレオチド配列が配列ＴＡＧＧＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧ ＣＣＴＡ　（配列番号１：突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列）で置換され ているプラスミドを重複野生型フラグメントと一緒に用いて、前述のように、Ｇ ５細胞内でのオーバーラツプ組換えによりウィルスを再生させた。 株Ｄ１２００を得るために、プラスミド１４９を制限酵素Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ及びＥ ｃｏＲＩで消化し、その結果得られたより大きいフラグメントを大腸菌ＤＮＡポ リメラーゼＩのフレノウフラグメントで処理して平滑末端を形成し、次いで自己 連結させた。その結果得られた、ｇｐ５０遺伝子の位置３３６とｇｐ６３の位置 ３５３との間のヌクレオチド配列が配列ＡＡＴＴＣＴＡＧＣＣＴＡ　（配列番号 ２；即ち突然変異誘発オリゴヌクレオチドのレムナンド）で置換されているプラ スミドを重複野生型フラグメントと一緒に用いて、前述のように６５細胞内での オーバーラツプ組換えによりウィルスを再生させた。 実施例３ ブタ鼻粘膜の外植片におけるｇｐ５０及びｇｐ５０＋ｇｐ６３変異株の複製 これらの変異株が動物組織内でも伝搬できるかどうかを確認するために、我々は ブタ鼻粘膜の外植片を使用した。 これらの外植片は上皮細胞と基質線維芽細胞との天然の組合わせを提供するもの であり、このような外植片の感染は鼻粘膜のｉｎ　ｖｉｖｏ感染に極めて類似し ていることが判明している（Ｐｏｌら、Ｒｅｓ、Ｖｅｔ、Ｓｃｉ、５０゜４５− ５３　［１９９１］　）　。外植片ニハ、野生型ＰＲｖ株ＮＩＡ−３、ｇｐ５０ リンカ−挿入変異株Ｒ１２２及びＲ３３２、並びにｇｐ５０＋ｇｐ６３欠失変異 株Ｄ１２００及びＤ５６０を感染させた。 感染から２４時間後にウサギ抗ＰＲＹ血清（Ｐｏｌら。 Ｒｅｓ、Ｖｅｔ、Ｓｃｉ、５０．４５−５３　［１９９１］　）を用いて感染粘 膜外植片の免疫組織化学検査を行ったところ、野生型ウィルスＮＩＡ−３は上皮 細胞の広い領域に伝搬することが判明した。ｇｐ５０変異株Ｒ１２２及びＲ３３ ２並びにｇｐ５０＋ｇｐ６３変異株Ｄ１２００及びＤ５６０についても類似の結 果が得られた。感染から２４時間後には、ウィルスの複製がほぼ全面的に上皮細 胞に限定されていた。しかしながら総ての株は、より長いインキュベーション時 間後に、下の線維芽細胞に感染することができた。ウサギ抗ＰＲＶ血清とモノク ローナル抗体（Ｇ５ＯＮ２、ｇｐ５０に対して特異的）とを用いた免疫付染法で は、ｇｐ５０がｇｐ５０＋ｇｐ６３変異株又はｇｐ５０変異株によって発現され ないことが確認された。これらの観察事項は、ｇｐ５０がブタ鼻粘膜におけるウ ィルスの伝搬にとって必須ではないことを意味する。 実施例４ マウスにおけるｇｐ５０及びｇｐ５０＋ｇｐ６３変異株の毒性 ａ、　ｇｐ５０＋ｇｐ６３ヌル変異株はマウスにとって致命的である。 ｇｐ５０変異株が組織外植片中で複製され伝搬できるという観察事実は、これら の変異株が生きた動物においても複製され伝搬できることを示唆するものである 。検査動物としてマウスを選択した理由は、マウスがヘルペスウィルスに極めて 敏感であり、毒性及びニューロン伝搬を研究するためのモデル系として広く使用 されてきたからである（Ｆ　ｒ　ａ　ｓ　ｅ　ｒ及びＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎ 、Ｊ、Ｃ。 ２７２−２８８　［１９７３］　：Ｆｉｅｌｄ及びＨｉｌｌ。 Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、２３．１４５−１．５７　［１９７４］　；Ｆｉｅｌ ｄ及びＨｉ　ｌ　Ｉ、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉ　ｒｏｌ。 ２３、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ　２６．１４５　１４８［１９７５］　；Ｋｒ１ ｓｔｅｎｓｏｎら、Ｂｒａｉｎ　Ｒ１１２［１９８３］　）。最初の実験では、 リンカ−挿入変異株Ｒ１２２又はＲ３３２の代わりにｇｐ５０＋ｇｐ６３欠失変 異株Ｄ５６０及びＤ１２００を使用して、接種材料中の野生型復帰突然変異体の 存在を排除した。この種の復帰突然変異体は、相補細胞系及びウィルスゲノム中 に存在するウィルス配列の相同的組換えによってリンカ−挿入変異株のストック 中で発生し得る（Ｃａｉら、Ｊ、Ｖｉｒ。 １．６２．２５９６−２６０４　［１９８８］　：Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｊ、Ｖｉ ｒｏｌ、６６．８９４　９０５　［１９９２］　ＨＰｅｅｔｅｒｓら、Ｊ、Ｖｉ ｒｏｌ、６６．３３８８−３８９２　［１９９２コ）。株Ｄ５６０及びＤ１２０ ０のｇｐ５０＋ｇｐ６３欠失の３′側の配列は相補Ｇ５細胞内に同種相対物（ｈ ｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）をもたないため（第１図）、相 補Ｇ５細胞におけるこれらの変異体の複製中に野生型復帰突然変異体が発生する ことは不可能である。 適齢６〜８の５匹のメスＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　７ウス（ＣｈａｒＩｅｓ　Ｒ ｉｖｅｒ、５ｕｌｄｚｆｅｌｄ、ＦＲＧ）の首に、株ＮＩＡ−３、Ｄ５６０、Ｄ １２００及びｇｐ６３変異株Ｍ１０５のプラーク形成単位１０５を皮下接種して 感染させた。株Ｎ　Ｉ　Ａ−３を接種したマウスはアランニスキー病の重大な徴 候、例えば後脚で激しく掻く動作、［顔を洗う」動作、及び麻痺を示し、感染後 約７０時間で死亡した。株Ｍ１０５を感染させた動物はひどい掻痒症を示さなか ったが、背中を丸めて離れて座り、呼吸速度が速（なった。これらの動物は感染 後約９０時間で死亡した。株Ｄ５６０又はＤ１２００を感染させた動物は、株Ｍ １０５に感染した動物と類似の症状を示した。これらの動物は感情を表さな（な り、瀕死状態に入る前に麻痺徴候を示した。瀕死状態は時には４２時間まで続き 、動物は感染後約１３０〜１４０時間で死亡した（表１、実験１）。これらの結 果は、ｇｐ５０＋ｇｐ６３ヌル変異株が依然としてマウスにとって致命的である ことを示している。しかしながらこれらの株の毒性は、野生型ウィルス又はｇ　 ｐ、、　６３変異体ウィルスと比べると大幅に低下している。 ｂ、　ｇｐ５０＋ｇｐ６３ヌル変異体は中枢神経系に到達し、そこで複製するこ とができる。 神経障害の症状は、株ＮＩＡ、３に感染したマウスよりもｇｐ６３又はｇｐ５０ ＋ｇｐ６３変異株に感染したマウスの方が遥かに弱いため、感染動物の脳をウィ ルスの存在について免疫組織化学的に調べた。感染マウスの脳及び器官の冷却断 片（ｃｒｙｏｓｔａｔ　５ｅｃｔｉｏｎ））を固定し、既述のように免疫組織化 学について分析した（Ｐｏ１．　ら、Ｍｉｃｒｏｂ、Ｐａｔｈ、７，３６１−３ ７１［１９８９］）。ｇｐ５０に対するモノクローナル抗体を一次抗体として使 用した時は、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ抗体を二次イ ンキュベーションで使用した（Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６６゜８９ ４−９０５　［１９９２］　）。 驚いたことに、我々は、Ｄ１２００及びＤ５６０に感染したマウスの脳の断片に は多数の感染ニューロンが存在し、Ｎ　Ｉ　Ａ−３又はＭ２Ｏ３に感染したマウ スの脳の断片には感染ニューロンが少数しか存在しないことを発見した。Ｄ１２ ００及びＤ５６０に感染した動物の脳に存在するウィルスは、ウサギ抗ＰＲＶ血 清を用いる免疫分集法（Ｐｏｌら、Ｒｅｓ、Ｖｅｔ、Ｓｃｉ、５０．４５−５３ 　［１９９１］）で調べたところ、ｇｐ５０を発現していなかった。 ウィルスを脳から単離し、５Ｋ−６細胞上で滴定した時は、感染性ウィルスがＮ ＩＡ−３又はＭ２Ｏ３に感染した動物からは容易に回収されたが、Ｄ５６０又は Ｄ１２００に感染した動物からは回収されなかった（表１、実験１）。これらの 結果は、感染性子孫を産生できないｇｐ５０＋ｇｐ６３ヌル変異株が依然として 中枢神経系に到達し、そこで複製できることを示すものである。 ｃ、　ｇｐ５０ヌル変異株は毒性が大きい。 ｇｐ６３はウィルスの増殖にとって必須ではないが（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓら、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６０．１１６６−１１６９　［１９８６］　）、ｇｐ５０＋ｇ ｐ６３変異株によって相補Ｇ５細胞及び非相補５Ｋ−６細胞上に形成されたプラ ークは、ｇｐ５０突然変異体によって形成されたプラークよりかなり小さかった 。また、ｇｐ６３はブタにおける毒性に関与していることが判明した（ｋｉｍｍ ａｎら。 Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、７３，２４３−２５１　［１９９２］）。これらの発 見は、ｇｐ５０変異株がｇｐｓｏ＋ｇｐ６３変異株より大きい毒性を有すること を示唆するが、我々はマウスにおけるｇｐ５０の毒性も調べたいと思った。 しかしながら、ｇｐ５０変異株をマウスの感染に使用するためには、接種材料が 野生型復帰突然変異体（既述）を含んでいないことを絶対的に確信しなければな らなかった。 Ｇ５細胞上にＲ１２２によって形成された単一プラークを５Ｋ−６細胞に感染さ せることによって、野生型復帰突然変異体を実質的に、含んでいない表現量的相 補Ｒ１２２ウィルスのバッチを製造した。ウィルスＤＮＡを感染５Ｋ−６細胞か ら単離し、Ｇ５細胞の単層（ＰＲＶに関するブレーティング効果が著しく低下し ているＨＰｅｅｔｅｒｓら。 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６６、８９４−９０５　［１９９２コ　）　のトランスフェ クションに使用した。トランスフェクション細胞から、５Ｋ−６細胞上での滴定 で測定して２．ｌＸｌ０７のプラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌを含むウィルス バッチを製造した。このバッチを、該ウィルスが表現型的相補であることを示す ために、Ｒ１２２“と命名した。５Ｋ−６細胞に２００μＩ　（４，２Ｘ１０’ ｐｆ　ｕ）の非希釈Ｒ１２２”ストックを感染させることにより、ｇｐ５０を欠 くウィルスバッチを製造した。得られたウィルスバッチは、非相補細胞から誘導 したことを示すためにＲ１２２−と命名した。該バッチは１５０ｐｆｕ／ｍｌを 含んでいた。しかしながら、我々がｇｐ５０に対するモノクローナル抗体（Ｐｅ ｅｔｅｒｓら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６６．８９４−９０５　［１９９２］　）を用 いてイムノペルオキシダーゼ染色を実施した時は、これらのプラークはｇｐ５０ 陰性であることが判明した。この発見は、ウィルスストックが野生型ウィルスは 含んでいないが感染性ウィルス粒子は依然として含んでいることを示すものであ った。これらの粒子が、Ｒ１２２−バッチの製造に使用した接種材料（Ｒ１２２ ′″）に由来している可能性はある。あるいは子孫ピリオンが、感染性Ｒ１２２ ＋ピリオンにより５Ｋ−６細胞の血漿メンプラン中にデポジットされたｇｐ５０ を再度取り込む能力を有し得る。また、ｇｐ５ｏを欠くピリオンがエンドサイト −シスによって取込まれ（Ｃａｍｐａｄｅ　１１ｉ−Ｆ　ｉ　ｕｍｅら、Ｊ、Ｖ ｉｒｏｌ、６２，１５９−１６７　［１９８８］　）　、時折分解を免れ、その 結果産生的感染（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）が生じるという 可能性もある。Ｒ１２２”″及びＲ１２２２ストツクの物理的力価を、ラテック スビーズ（直径９１ｎｍ；５ｅｒｖａ）を内部標準として用いて、電子顕微鏡検 査で測定した。 Ｒ１２２”の毒性の検査に加えて、我々は種々のウィルスの毒性が感染経路に依 存するかどうかをも調べた。マウス５匹のグループに１０’ｐｆｕの株ＮＩＡ− ３、ＭＩＯ５、Ｒ１２２″″及びＤ１２００を皮下注射又は腹腔内注射によって 接種した。株Ｒ１２２“に感染したマウスは、ＮＩＡ−３感染動物に見られる徴 候（既述）と類似のアウジェスキー病徴候を示した。Ｎ　Ｉ　Ａ−３を皮下接種 した動物では、最初の症状が感染から約３４〜４０時間後に現れ、Ｒ１２２＋を 皮下接種した動物では感染の約４２時間後に現れた。動物はそれぞれ感染後約５ ６時間及び６８時間で死亡した（表１、実験２）。これらの結果は、ｇｐ５０変 異株Ｒ１２２＋がマウスに対しては依然として極めて毒性であり、その毒性がｇ ｐ５０＋ｇｐ６３変異株Ｄ１２００又はｇｐ６３変異株Ｍ１０５より遥かに強い ことを示すものであった。株ＮＩＡ−３、Ｒ１２２”及びＭ２Ｏ３を腹腔的注射 した時は、死亡までの平均時間が皮下注射の場合よりも約１０〜１３時間長くな った。株Ｄ１２００の場合は、腹腔内注射後の死亡までの平均時間が皮下注射後 と比べて約２５時間短縮された（表１、実験２）。検査した総ての株について、 症状及び臨床的徴候は感染経路と無関係であった。即ち、感染の時間経過に相違 はあるが、どちらの接種経路も致死的感染を起こす。実験２で使用した総ての動 物の脳の断片で、免疫組織化学によりウィルスが検出された（表１）。この場合 も、ウィルスの複製はＮ　Ｉ　Ａ−３、Ｒ１２２′″又はＭ２Ｏ３に感染した動 物よりもＤ１２００に感染した動物の脳での方が遥かに進んでいた。 ｄ、　感染器官の末梢神経における優先的ウィルス複製器官の断片をウィルス抗 原の存在について免疫組織化学的に検査した時には、腹腔内感染した動物だけか らウィルス抗原が検出された。ウィルスは肝臓、膵臓、腎臓、腸及び副腎で検出 されたが肺では検出されなかった。器官のウィルス感染はほぼ完全に神経繊維に 限定されていた。この発見は、神経組織がＰＲＶの感染及び複製の優先的部位で あることを意味し、既に明らかにされているように（Ｃ。 Ｏｋ及び５ｔｅｖｅｎｓ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、７゜２７２−２８８　［ １９７３］　：Ｆｉｅｌｄ及びＨ４１ｌ。 Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、２３．１４５−１５７　［１９７４］　；Ｆｉｅｌｄ 及びＨｉｌｌ、Ｊ、ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ。 ２６．１４５−１４８　［１９７５］　：ＭｃＣｒａｃｋｅｎら、Ｊ、Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、２０．１７−２８　［１９７３コ　；５ｔｒａｃｋ及びＬｏｗｅｙ 、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１０．２１３９−２１４７　［１９９０］　；Ｃａｒ ｄら。 Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１０．１９７４−１９９４　［１９９０］）、ウィルス が逆行的（ｒｅ　ｔ　ｒａｏｇｒａｄｅ）軸索輸送により器官から中枢神経系に 輸送されることを示唆するものである。ｇｐ５０ヌル変異体が中枢神経系に効率 的に輸送されるという観察事実は、ニューロン輸送がｇｐ５０の存在に依存しな いことを意味する。 感染性ウィルスは、株ＮＩＡ−３及びＭ２Ｏ３を腹腔内感染させた動物の器官抽 出物から回収された。予想した通り、Ｒ１２２“又はＤ１２００感染動物からは 感染性ウィルスは回収されなかった。これも、これらのウィルスの子孫が非感染 性であることを意味する。驚いたことに、株ＮＩＡ−３を皮下感染させた５匹の 動物のうちの３匹が、器官抽出物の滴定後に感染性ウィルスを発生させた（表１ 、実験２）。これは、ウィルスが中枢神経系からこれらの器官への前方（ａｎｔ ｅｒｏｇｒａｄｅ）移動によって輸送されることを意味し得る。株Ｍ１０５を皮 下感染させたマウスの器官に感染性ウィルスが存在しないという事実はおそらく 、該ウィルスの輸送が遅延したことを意味する。 ｅ、　ｇｐ５０はｉｎ　ｖｉｖｏの一次感染に必要とされる。 我々が得たｉｎ　ｖｉｔｒｏ結果、即ちｇｐ５０が侵入には必要であるが細胞− 細胞伝染には必要とされないことを示す結果は（Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｊ、Ｖｉｒ ｏｌ、６６゜８９４−９０５　［１９９２］　）　、ｉｎ　ｖｉｖｏ感染につい ても同じことが言えることを示唆するものであった。ｇｐ５０がｉｎ　ｖｉｖｏ での侵入にとって必須ではないという可能性は極めて疑わしいものであるが、我 々は、この場合もｇｐ５０が一次感染に必要であることを正式に立証しなければ ならなかった。ｇｐ５０の関与を調べるために、非相補５Ｋ−６細胞上で増殖さ せた、従ってｇｐ５０を欠＜Ｒ１２２のバッチ（Ｒ１２２−１既述）を使用した 。１０’ｐｆｕのＲ１２２”は３．３Ｘ１０’の物理的粒子に対応するため、我 々は同数のＲ１２２−粒子を用いてマウスの接種を行った。予想した通り、Ｒ１ ２２＋を腹腔的注射又は皮下注射したマウスは総て死亡した（表１、実験３）。 しかしながら、Ｒ１２２−を感染させたマウスは、腹腔的感染後は総て生き残り 、皮下感染後は５匹の動物のうち１匹が死亡した。これらの結果は、動物の感染 が成功するためには、ウィルスのエンベロープ中にｇｐ５０が存在していなけれ ばならないことを示すものであった。 Ｒ１２２−での感染後に死亡した動物を調べたところ、ウィルスが脳に存在して いた。これは、接種材料中に感染性ウィルスが依然として存在していたことを意 味する。接種材料を非相補５Ｋ−６細胞上で２回滴定した結果、それぞれ９個及 び１６個のプラークが観察された。免疫組織化学による検査では、これらのプラ ークはｇｐ５０変異株によって産生されたものであった。これらの感染性ピリオ ンの由来源として考えられるものは前述の通りである。腹腔内感染後のＰＲＹ株 ＮＩＡ−３のしＤ５ｏは約７Ｑｐｆｕであるため、Ｒ１２２−接種材料中に存在 する感染性ウィルス粒子が死亡した１匹の動物の致死的感染に関与している可能 性はある。 ｆ、　感染性子孫を産生ずることができず、細胞−細胞伝染によって伝搬するこ とができないウィルスは、マウスにとって無毒である。 我々は先に、非相補細胞系内でのＰＲＹのｇＩＩ又はｇＨヌル変異体の複製が、 ｇｐ５０ヌル変異株と同様に、非感染性子孫ピリオンを産生させることを立証し た（Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６６．８９４−９０５　［１９９２コ 　；Ｐｅｅｔｅｒｓ　ら、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６６、３３８８−３８９２　 ［１９９２］　）。しかしながら、ｇｐ５０変異株と異なり、ｇｌＩ及びｇＨ変 異株は非相補細胞上でプラークを形成することができない。この発見は、ｇＩＩ 及びｇＨがウィルスの細胞−細胞伝染に必要であることを意味する。細胞−細胞 伝染がｉｎ　ｖｉｖｏのウィルス伝搬の成功のために前もって必要とされるかど うかを確認するために、我々は表現型的相補ＰＲＶ　ｇＩＩヌル変異株Ｂ１４５ 　（Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６６゜８９４−９０５　［１９９２コ ）をマウスに感染させた。マウスに１０’ｐｆｕのＢ１４５ウイルスを腹腔内注 射又は皮下注射した時は、いずれの動物もアウジエスキー病の徴候を示さなかっ た（表１、実験３）。この結果は、感染性子孫を産生ずることができず、細胞− 細胞伝染によって伝搬することができないウィルスは、マウスにとって無毒であ ることを意味する。 実施例５ ブタにおけるｇｐ５０変異株及びｇｐ５０＋ｇｐ６３変異株の毒性及び免疫原性 変異株の毒性及び免疫原性を調べるために、株Ｒ１２２３、Ｄ５６０及びＤ１２ ００をブタに接種した。野生型株Ｍ２Ｏ９及びｇｐ６３変異株Ｍ１０２（第１図 ）（Ｋｉｍｍａｎら、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、７３．２４３−２５１　［１９ ９２］　）を対照として使用した。免疫感作に次いで、毒性ＰＲＹ株ＮＩＡ−３ を抗原投与した。 適齢４〜６のブタ５匹（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　１ｎｓｔｉｔ ｕｔｅの特定の無病原体群に由来するオランダ・ランドレース・ブタ）のグルー プに、０゜５ｍｌのウィルス懸濁液を吸い込み時に各鼻孔にゆっくり投与するこ とによって、１０ｓｐｆｕのウィルスを鼻腔内感染させた。接種から４週間後、 ブタに１０’ｐｆｕの毒性ＰＲＹ株ＮＩＡ−３を鼻孔から抗原投与した。臨床的 徴候についてブタを一日２回観察し、直腸温度を毎日測定した。動物の体重を一 週間に３回測定した。各ブタ毎に、発育停止、発熱び神経系症状の日数を測定し た。発育停止期間は、抗原投与を行った日の動物の体重を取り戻すのに必要な日 数であると定義した。発熱は、４０℃を超える直腸温度であると定義した。神経 系症状は、痒み、運動失調、麻痺、ふるえ及び痙牽であると定義した。 野生型株Ｍ２Ｏ９を感染させたブタは、アウジェスキー病の典型的症状、例えば 発熱、食欲減退、発育遅延、並びに運動失調及び麻痺のような神経系症状を示し た（表２）。 変異株Ｒ１２２’及びＭ２Ｏ３は、短期間の発熱及び発育遅延を生起させたが、 神経系症状は生起させなかった。変異株Ｄ５６０及びＤ１２００は神経系症状を 全く生起させず、発熱又は発育遅延も生起させなかった。これらの結果は、ｇｐ ５０＋ｇｐ６３変異株Ｄ５６０及びＤ１２００がブタにとって完全に無毒であり 、ｇｐ５０変異株Ｒ１２２“及びｇｐ６３変異株Ｍ１０２が野生型ＰＲＶより遥 かに低い毒性を示すことを意味する。 株Ｒ１２２”及びＭ２Ｏ３を接種したブタは、ＮＩＡ−３での抗原投与後に発熱 又は発育遅延を起こさず、臨床的徴候も示さなかった（表３）。株Ｄ５６０及び Ｄ１２００を接種したブタは短期間の発熱及び発育遅延を起こしたが、数日間倦 怠を示し２匹が嘔吐したものの、神経系症状は示さなかった。予防接種していな い対照グループのブタは重いアウジェスキー病症状を示し、発熱及び発育遅延の 期間が比較的長かった。２匹のブタが死亡した（表３）。これらの結果は、ｇｐ ５０変異株Ｒ１２２＋及びｇｐ６３変異株Ｍ１０２を接種したブタがアウジエス キー病の臨床的徴候に対して完全に防護され、ｇｐ５０＋ｇｐ６３変異株Ｄ５６ ０及びＤ１２００を接種したブタがアウジエスキー病の臨床的症状に対しである 程度防護されていることを意味する。 表２３種々のＰＲＶ株によるブタの免疫感作＄免疫化　発熱゛　発育遅延°　臨 床的徴候に２０９　（ｎ富３）　５−３　◆／−０，６８，３”／−７−３＊＋ Ｍ１０２　（ｎ−１１）’　２．’ｌ　＊７−１．５　２．’ｌ　＋／−２，２ Ｒ１２２°　（ｎ−５１３，８”／−１，６０，８＋／−１，８０５６０（ｎ− ５）　ＯＱ Ｄ１２００　（ｎ−５）　ＯＯ ＄　実験中に死亡したブタはいない。 ＊　平均日数（＋／−標準偏差）を表す。 ＃　１匹のブタが死亡。その原因はおそらく採血後の外傷にある。 ＋十　運動失調、痙看及び麻痺のような神経系症状を表す。 表３．ＮＩＡ−３抗原投与後の免疫感作したブタの防護免疫化　死亡　発熱°　 発育遅延°臨床的徴候−−（ｎ−６１２６，８◆／−０，５１０，３”／’７． １　”◆Ｍ１０２　（ｎ−１ｔ）　ＯＯ０ Ｒ１２２’　（ｎ−５１０００ Ｄ５６０　ｆｎ”５１　’　０　２．６．７−１．３　１．６．７−６．５　＊ ／−Ｄ１２００　（ｎ璽５１　０　３．６◆／−１，１１，４＋／−３，１＋／ −＊は平均日数（＋／−標準偏差）を表す。 十＋は運動失調、痙牽及び麻痺のような神経系症状を表す。 十／−は倦怠（時には嘔吐、本文参照）を表す。 これらの実施例は、ＰＲＶのｇ−ｐ５０が該ウィルスの感染性（侵入）にとって 必須であるが、細胞−細胞伝染には不要であることを示している。表現型相補ｇ ｐ５０変異株及びｇｐ５０＋ｇｐ６３変異株は、感染動物内で複製し伝搬するこ とができる。しかしながら、感染細胞から放出された子孫ウィルスは非感染性で あり、従って感染動物は感染性ウィルスを放つことはできない。この特性は、Ｐ Ｒｖの広い宿主範囲及び多量の外来ＤＮＡを収容する能力と協働して、ＰＲＶ　 ｇｐ５０変異株を、アウジエスキー病及び他の動物疾病に対する安全な（キャリ ヤー）ワクチンの製造に適した理想的な株とする。 実施例６ ブタコレラウィルスのエンベロープ糖タンパク質Ｅ１を発現するｇｐ５０欠失変 異株の構築 ｇｐ５０欠失変異株を異種遺伝子の発現のためのベクターウィルスとして使用で きるかどうかを調べるために、ＰＲＶ株ＮＩＡ−３のｇｐ５０遺伝子を、ｈＣＭ Ｖプロモーターの転写制御下のブタコレラウィルス（ＨＣｈＶ＝一般的なブタ熱 ）のＥ１遺伝子を含むＤＮＡフラグメントで置換した。 ＰＲＶのＵｓ領領域由来する５ｃａｌ−ＤｒａＩフラグメント（ｇＸ遺伝子の位 置３１７−３２２の５ｃａｌ部位、伝子の間の位置１１８１−１１８６のＤｒａ Ｉ部位、ヌクレオチド配列番号付はＰｅｔｒｏｖｓｋｉｓら、Ｊ、Ｖｉｒｏ　１ ．６０，１８５−１９３　［１９８６］に従う）を、プラスミドｐＵｃ１９Ｍ　 （Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）の平滑化Ｍｄｅ１部位にクローニングした。部位特異的ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ　ｋｉｔ、Ｃ１ｏ ｎｔｅｃｈ）、非反復制限酵素認識部位をｇｐ５０遺伝子のすぐ前とｇｐ５０遺 伝子のすぐ後ろとに形成した。突然変異誘発プライマー５’　−ＡＧＧＴＴＣＣ ＣＡＴＡＣＡＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＡＴＧＣ−３゛　（配列番号３ ）及び５’　−ＣＣＣＧＧＴＣＣＧＴＡＧＣＣＴＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＧＧＣＧ ＴＣＧ−３’　（配列番号４）を用いて、制限酵素Ｓｐｅ　Ｉ認識配列（ＡＣＴ ＡＧＴ）及びＡｖｒｌＩ認識配列（ＯＣＴＡＧＧ）をそれぞれ位置−１７〜−１ ２及び１２１０〜１２１５に形成した（ｇｐ５０遺伝子のヌクレオチド配列番号 付はＰｅ　ｔ　ｒ。 ｖｓｋｉｓら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５９．２１６　２２３［１９８６］に従う）ｏ 　ｇｐ５０遺伝子をＳｐｅ　Ｉ及びＡｖｒＩＩでのプラスミドＤＮＡの消化によ って欠失させ、制限酵素ＥｃｏＲＩＳＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を 含む合成５ｐｅＩ−ＡｖｒＩＩ　ＤＮＡフラグメントで置換した（談合成りＮＡ フラグメントは、等モル量の二つの一本鎖オリゴヌクレオチドを配列５’　−Ｃ ＴＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＣ−３°　（配列番号５）及び ５°−ＣＴＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡ−３’　（配列番号 ６）でアニーリングすることにより得た）。次いで、ｇｐ５０欠失を含むＮｃｏ ｌ−Ｐｓｔｌフラグメント（ｇＸ遺伝子の位置８８３−８８８のＮｃｏＩ部位、 ヌクレオチド配列番号付はＲｅａら、Ｊ。 Ｖｉ　ｒｏ　１．５４．２１−２９　［１９８５］に従う；ｇｐ６３遺伝子の位 置４３９−４４４のＰｓｔＩ部位、ヌクレオチド配列番号付はＰｅｔｒｏｖｓｋ ｉｓら、Ｊ、Ｖｉｒｏ　１．６０，１８５−１９３　［１９８６］に従う）を、 ＮｃｏＩ及びＰｓｔｌで消化したプラスミドｐＧＥＭ５Ｚｆ（＋）（Ｐａｒｏｍ ｅｇａ）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＢＰ５３と命名した。 ＨＣｈＶのＥ１遺伝子は、ＨＣｈＶ株Ｂｒｅｓｃｉａ（Ｍｏｏｒｍａｎｎら、Ｖ ｉｒｏｌＯｇＶ　上Ｌユ、１８４−１９８’［１９９０コ）のｃＤＮＡクローン から誘導した。該遺伝子をＤｓ　ａ　Ｉ−ＥｃｏＲＶフラグメント（大腸菌ＤＮ ＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントを充填したＤｓａＩ部位；Ｍｏｏｒｍ ａｎｎら、Ｖｉｒｏｌｏｙ１７７．１８４−１９８　［１９９０コのヌクレオチ ド配列番号付でヌクレオチド２３３７−３８０４）として、プラスミドｐＥＶｈ ｉｓ１３のＥｃｏＲＩ部位（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメン トを充填）とＥｃ。 ＲＶ部位との間にクローニングした。プラスミドｐＥＶｈ１Ｓ１３は、ＡＴＧ開 始コドンの前のｈＣＭＶプロモーターと、複数の非反復制限部位と、三つの読取 り枠縁ての中の翻訳ストップコドン（ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｊ、Ｖｉｒ。 １．６６．８９４−９０５　［１９９２］　；実施例１も参照）とを含むプラス ミドｐＳＶ２ｈ　ｉ　ｓ　（Ｈａ　ｒ　ｔｍａｎ及びＭｕｌ　ｌ　ｉｇａｎ、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５．８０４７−８０５１ 　［１９８８］）の誘導体である。得られたプラスミドは、Ｅ１遺伝子がｐＥＶ ｈｉｓ１３のストップコドンとインフレーム融合されている。このプラスミドを ｐＥＶｈ　ｉ　ｓ　１３ＨＣＶＥ　１と命名シタ（第２図）。ブラスミＦｐＥＶ ｈ　ｉ　ｓ　１３ＨＣＶＥ１をＨｐａＩ及びＰｓｔＩで消化した後、ｈＣＭＶプ ロモーターとＥ１遺伝子と翻訳ストップコドンとを含むフラグメントを単離した 。ＨｐａＩ−ＰｓｔＩフラグメントをＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑 末端を形成し、次いでｐＢＰ５３のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。該フラ グメントが遺伝子Ｅ１の転写方向がｐＢＰ５３のｇＸ及びｇｐ６３遺伝子のそれ と類似するような方位で挿入されているプラスミドを単離し、ｐＢＰ５３Ｅ１と 命名した（第３図）。 Ｅ１遺伝子が正確にクローニングされたかどうかを調べるために、Ｅｌの過渡的 （ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現を６５細胞内で検査した。リポフエクチン（ＧＩＢ ＣＯＢＲＬ）を用いて、細胞をプラスミドｐＢＰ５３Ｅ１又はｐＥＶｈ　ｉ　ｓ 　１３ＨＣＶＥ　１でトランスフェクションした。２８後、単層を固定し、Ｅｌ の発現を、ＨＣｈＶの糖タンパク質Ｅ１に特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ 結合モノクローナル抗体３及び４を用いる免疫染色によって調べた（Ｗｅｎｓｖ ｏｏｒｔ、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、７０゜２６８５−２８６７　［１９８９コ ）。ｐＢＰ５３Ｅ１でトランスフェクションした細胞によるＥｌの発現は明らか に目に見え、染色１；ｊｐＥＶｈ　ｉ　ｓ　１３ＨＣＶＥ１でトランスフェクシ ョンした細胞の場合よりも強かった。これらの結果は、ＥｌがｐＢＰ５３Ｅ１の コンチクストで、即ちＰＲ■配列に囲まれている場合に、効果的に発現されるこ とを示すものであった。 プラスミドｐＢＰ５３Ｅ１をＰｖｕＩＩ及びＰｓｔｌで消化し、リボフエクチン を用いてＧ５細胞内で、ＰＲＶ株ＮＩＡ−３のウィルスＤＮＡと一緒に同時トラ ンスフェクションした。２日後、プラークが明白に見えるようになった時点で単 層を固定し、過渡的発現アッセイについて前述したように免疫染色した。染色プ ラークの存在は、Ｅ１遺伝子が相同的組換えによってウィルスゲノムにトランス ファーされており、Ｅ１遺伝子が組換えウィルスによって発現されていることを 意味した。組換えウィルスを単離するために、トランスフェクション実験を繰り 返し、４００個の個々のプラークを単離した。Ｅｌを発現した組換え体を同定す るために、単離体の一部を、５Ｋ−６細胞が入っている微量滴定プレートにトラ ンスファーした。２日間のインキュベーション後にプラークが目に見えるように なった。 感染単層を固定し、免疫染色によってＥｌの発現を調べた。 最終的に、Ｅｌを発現した組換えウィルスは、５Ｋ−６細胞上で染色プラークを 形成した元の単離体から精製したプラークであった。 ＨＣｈＶのＥｌを発現するＰＲＶの組換えワクチン株は、ＨＣｈＶでの抗原接種 後に、ブタを一般的ブタ熱から防護することが判明した（ｖａｎ　Ｚｉｊｌら、 Ｊ、Ｖｉｒ。 １．６５．２７６１−２７６５　［１９９１１）。これらの発見に基づいて、前 述の非伝染性Ｅ１発現ｇｐ５０欠失変異株は、ブタの体内で、一般的ブタ熱に対 する防護的免疫応答を誘起することもできよう。

【配列表】

配列番号＝１ 配列の長さ＝２０塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数ニー重鎖 起源：合成 配列番号：２ 配列の長さ＝１２塩基 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数ニー重鎖 起源：合成 配列番号；１の部分 配列 ＡＡＴＴＣＴＡＧＣＣＴＡ　１２ 配列番号：３ 配列の長さ：３３ 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数ニー重鎖 起源：合成 配列 ＡＧＧＴＴＣＣＣＡＴＡＣＡＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＡＴＧＣ３３配 列番号＝４ 配列の長さ＝３２ 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数ニー重鎖 起源二合成 配列 ＣＣＣＧＧＴＣＣＧＴＡＧＣＣＴＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＧＧＣＧＴＣＧ　３２配 列番号：５ 配列の長さ＝２４ 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数ニー重鎖 起源二合成 配列 ＣＴＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣ＾＾ＧＣＴＴＣ２４配列番号：６ 配列の長さ：２４ 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数ニー重鎖 起源二合成 配列 ＣＴＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡ　２４七（ 、、、ＰＣＴ／ＭＬ９３１００１４６ −馴−−−一１−１−ｍ−−１・伽−−−−一一一−−閥一一一翻−ｗｔｈｒ− τｌｍ−−１−−テｉｗｅｗｍＩＩｔｗｍＩ＠０−Ｆｘ・ＰＣ１橢Ｐｐ−リ一（ Ｈ鳴鐘ｔ、Ｅｌ）ＰＦｌｉｔ・−Ｔｈ＋＊−−ＰａＩａ１１ｏＩＩＩＩ＃ｉ＋＋ ａｗｍｔ−ｉｒｌｍｍ−―＋ｄｗｄ＋ｗ−−ｂｒ呻−ｍｌ−−２５／１０／９３ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、　ＭＬ、ＭＲ，Ｎ Ｅ、ＳＮ。 ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＢＹ。 ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、Ｒ○、 　ＲＵ。 ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ （７２）発明者　ヒールケンス、アルノルド・レオナルト・ヨセフ オランダ国、エヌ・エル−８２４２・セー・エル・レリスタツド、ブーイニル・ ０４−７６（７２）発明者　モールマン、ロベルトウス・ヤコブス・マリア オランダ国、エヌ・エル−８２５２・ニー・バー・ドロンテン、デ・チルハング ・１２

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト及び動物の疾病に対するワクチンを製造するための、ウイルス誘導細胞 −細胞伝染によってのみ伝搬することができ且つ非感染性子孫ビリオンを産生す るヘルペスウイルス変異株の使用。
2. ２．動物の疾病に対するワクチンを製造するための偽狂犬病ウイルスｇｐ５０変 異株の使用。
3. ３．アウジェスキ−病に対するワクチンを製造するための請求項２に記載の使用 。
4. ４．別の病原体に由来する抗原又は抗原の一部分をコードするヌクレオチド配列 を前記変異株に導入することによりヒト又は動物の疾病に対するベクターワクチ ンを製造するための請求項１に記載の使用。
5. ５．別の病原体に由来する抗原又は抗原の一部分をコードする少なくとも一つの 遺伝子を前記変異株に導入することによりアウジェスキ−病以外の動物の疾病に 対するベクターワクチンを製造するための請求項２に記載の使用。
6. ６．糖タンパク質ｇｐ５０を含みｇｐ５０遺伝子中に突然変異を有する偽狂犬病 ウイルスを含む、動物の疾病を予防及び／又は抑制するためのワクチン。
7. ７．突然変異が欠失である、アウジェスキ−病を予防及び／又は抑制するための 請求項６に記載のワクチン。
8. ８．少なくとも一種類の動物疾病を予防及び／又は抑制するためのワクチンであ って、突然変異が、前記動物疾病に対応する抗原をコードする異種遺伝子を含む 挿入である請求項６に記載のワクチン。
9. ９．偽狂犬病ウイルスが更に一つ以上の突然変異を別の遺伝子の一つ、例えばｇ ｐ６３遺伝子又はｇＩ遺伝子中に有する請求項６から８のいずれか一項に記載の ワクチン。