PL174219B1 - Szczepionka przeciwko chorobie Aujeszky'ego i innym chorobom zwierząt - Google Patents
Szczepionka przeciwko chorobie Aujeszky'ego i innym chorobom zwierzątInfo
- Publication number
- PL174219B1 PL174219B1 PL93307049A PL30704993A PL174219B1 PL 174219 B1 PL174219 B1 PL 174219B1 PL 93307049 A PL93307049 A PL 93307049A PL 30704993 A PL30704993 A PL 30704993A PL 174219 B1 PL174219 B1 PL 174219B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- virus
- gene
- virol
- mutants
- prv
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 122
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 56
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 title claims abstract description 11
- 101000686824 Enterobacteria phage N4 Virion DNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 147
- 101000644628 Escherichia phage Mu Tail fiber assembly protein U Proteins 0.000 claims abstract description 147
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims abstract description 66
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 101001095863 Enterobacteria phage T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 claims description 43
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 22
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 22
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 6
- 101150015940 gL gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 74
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 67
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 49
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 36
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 30
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 13
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 11
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 10
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 10
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 10
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 9
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 9
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 9
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 9
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 9
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 8
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 8
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 8
- 101150118312 gp63 gene Proteins 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 8
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 7
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 6
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 6
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 6
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 description 5
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 4
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 4
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 4
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 description 3
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 3
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241000711493 Porcine respiratory coronavirus Species 0.000 description 2
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 2
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 244000144980 herd Species 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 230000003363 transsynaptic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033033 28K gene Proteins 0.000 description 1
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 101100334117 Caenorhabditis elegans fah-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 101800001466 Envelope glycoprotein E1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 229940124841 Herpesvirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035032 Multiple sulfatase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000032023 Signs and Symptoms Diseases 0.000 description 1
- 101800001475 Spike glycoprotein E1 Proteins 0.000 description 1
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 244000038280 herbivores Species 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003434 inspiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004393 laryngeal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000006033 mucosulfatidosis Diseases 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000011886 postmortem examination Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010015936 pseudorabies virus glycoprotein gH Proteins 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000009844 retrograde axon cargo transport Effects 0.000 description 1
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000012153 swine disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000014599 transmission of virus Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000007919 viral pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007485 viral shedding Effects 0.000 description 1
- 230000021887 virion transport Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16761—Methods of inactivation or attenuation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1. Szczepionka przeciwko chorobie Aujeszky’ego i innym chorobom zwierzat zawie- rajaca wirusa pseudowscieklizny jako skladnik czynny i odpowiedni nosnik oraz ewentualnie standardowe skladniki takie jak stabilizator, bufor, adiuwant, solubilizer, emulgator i podobne w konwencjonalnych ilosciach, znamienna tym, ze zawiera wirusa pseudowscieklizny, który jest mutantem gp50, posiadajacego glikoproteine gp50 i zmutowany gen kodujacy gp50. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciwko chorobie Aujeszky’ego i innym chorobom zwierząt, zawierająca mutanty wirusa pseudowścieklizny (PRV), zwanego również wirusem choroby Aujeszky’ego (ADV). PRV silnie neurotropowym wirusem z rodziny herpes, powodującym chorobę Aujeszky’ego u zwierząt domowych i dzikich (patrz Mattenleiter, Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 14, 151-163 (1991); Wittman i Rziha w (G. Wittman ed.) Herpesvirus Disease of Cattle, Horses and Pigs, Kluwer, Boston, 230-325 (1989); Pensaert i Kluge w (M. B. Pensaert ed.) Virus Infections of Porcines, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam 39-64 (1989)). Świnia domowa jest stosunkowo odporna na zakażenia PRV i stąd uważana jest za naturalnego gospodarza wirusa. Naturalnymi wrotami zakażenia jest okolica nosogardzieli. Wirus jest zdolny do namnażania się w komórkach śluzówki nosa i krtani, a po zakażeniu nerwów obwodowych transportowany jest do ośrodkowego układu nerwowego gdzie wywołuje ciężkie zapalenie mózgu, będące zwykle śmiertelne zwłaszcza dla młodych świń. Starsze świnie zwykle przeżywają zakażenie, ale mogą dostać gorączki i zapalenia płuc. Zakażenie zwojów (jąder) czuciowych prowadzi do ustalenia się latencji.
Szczepienie przeciwko chorobie Aujeszky’ego przeprowadza się by ograniczyć straty gospodarcze powodowane przez śmierć lub opóźnienie wzrostu u zakażonych zwierząt. Dostępne są do tego celu szczepionki oparte bądź na żywym, atenuowanym, bądź na inaktywowanym wirusie. Korzystne są szczepionki oparte na żywym atenuowanym wirusie, ponieważ są łatwiejsze w produkcji i stąd tańsze niż szczepionki inaktywowane. Ponadto, atenuowany wirus może być podawany donosowo, co prowadzi do lepszej ochrony niż szczepienie drogą pozajelitową przy użyciu żywej atenuowanej, bądź inaktywowanej szczepionki.
Pierwsze szczepionki oparte na żywym wirusie wielokrotnie pasażowanym na hodowli komórkowej obciążone były licznymi wadami. Szczepionki takie były niehomogenne i stanowiły mieszaninę wariantów wirusa o nieznanej zakaźności i immunogenności. Ponadto, szczepionki takie niosły ze sobą ryzyko nawrotu wirulencji. Ostatnio, coraz lepsze poznanie, na poziomie molekularnym, struktury i replikacji wirusów, oraz dostępność wyrafinowanych technik biologii molekularnej, pozwoliła naukowcom zaprojektować atenuowaną szczepionkę
174 219 zamiast polegać na przypadku. Genetyka wirusów oraz analiza sekwencji DNA umożliwia identyfikację regionów genomu wirusowego, w których zmiany prowadzą do zmniejszenia patogenności wirusa. Technika rekombinacji DNA umożliwia wprowadzanie zmian lub usuwanie takich regionów, co prowadzi do produkowania atenuowanego wirusa ze zdefiniowanymi i stałymi zmianami. To podejście po raz pierwszy zastosowane było z sukcesem przez Kit i wsp. (Am J. Vet. Res. 46, 1359-1367 (1985)) do atenuacji PRV. Inaktywacja genu kinazy tymidynowej (TK) PRV spowodowała drastyczne zmniejszenie wirulencji dla świń (EP-A-141.458). Dodatkowo wprowadzono delecje do genów kodujących · takie glikoproteiny jak gl, gIII i gX (Kit i wsp. Am J. Vet. Res. 48, 780-793 (1987); Marchioli i in., Am J. Vet. Res. 48, 1557-1583 (1987); Quint i in., J. Gen. Virol. 68,523-534 (1987); Moorman i in., J. Gen. Virol. 71,1591-1595 (1990); W0-A-9102795) co doprowadziło do dalszego zmniejszenia wirulencji i zdolności do serologicznego rozróżnienia zwierząt szczepionych i zakażonych (Platt i in., Vet. Microbiol. 11 25-40 (1986); Van Oirschoti in., J. Gen. Virol., 67,1179-1182 (1986); Van Oirschoti in., J. Virol. Meth., 22,191-206 (1988); Eloit i in., Vet. Rec. 128, 91-94 (1989)).
Nowym podejściem do uzyskania szczepionki jest ekspresja genów obcych patogenów przy użyciu atenuowanych szczepów wirusa jako nośników (wektory szczepionki wirusowej). Ekspresja antygenów przez żywe wektory wirusowe naśladuje ich ekspresję po naturalnym zakażeniu i może pobudzać zarówno odporność humoralnąjak i komórkową. Szczepionki oparte na wektorze mogą być używane do immunizacji przeciw chorobom, dla których nie ma dostępnej odpowiedniej szczepionki lub która to szczepionka nie może być w sposób bezpieczny lub łatwy produkowana.
W opracowaniu szczepionki opartej na wektorze skupiono się przede wszystkim na wirusie krowianki (Moss i Flexner, Ann Rev. Immunol., 5 305-324 (1987); Piccini i Paoletti, Adv. Virus Res., 34, 43-64 (1988)). Wirus krowianki używany był szeroko przy wykrzewieniu ospy prawdziwej u ludzi, gdzie wykazano jego wysoką efektywność i relatywne bezpieczeństwo stosowania. Szeroka rzesza gospodarzy i zdolność do pomieszczenia wielkich ilości obcego DNA kreują wirusa krowianki na wirusa z wyboru do szczepionek opartych na wektorze (Hruby, Clin. Microbiol. Rev., 3, 153-170 (1990); Tartaglia i in., Crit. Rev. Immunol., 10, 13 (1990)). Jako alternatywa dla wirusa krowianki inne poxwirusy takie jak racoonpox, avipox, capripox i suipox stosowane są w szczepionkach opartych na wektorze (Taylor i in., Vaccine 6,504-508 (1988); Lodmell i in., J. Virol. 65,3400-3405 (1991); Letellier i in., Arch Virol., 118,43-56 (1991)).
Inne wirusy, które mogą być zastosowane w tym typie szczepionki obejmują adenowirusy (Berkner, BioTechniques 6,6(03-6020 (1988)) i herpeswirusy (Shih i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81,5867-5870 (1984); Thomsen i in., Gene 57,261-265 (1987); Lowe i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 3896-3900 (1987); Cole i in., J. Virol. 64,4930-4938 (1990); van Zijl i in., J. Virol. 65,2761-2765 (1991); Kit i in., Vaccine 9,564-572 (1991)). Dostępność bezpiecznej i wydajnej żywej szczepionki opartej na herpeswirusie w połączeniu ze zdolnością do pomieszczenia znacznych ilości obcego DNA czyni tego wirusa bardzo atrakcyjnym kandydatem do opracowania szczepionki opartej na wektorze. Użycie PRV j ako wektora szczepionki jest bardzo obiecujące. PRV jest bardzo dobrze scharakteryzowany a bezpieczne i wydajne żywe szczepionki zostały wytworzone poprzez celowane delecje (patrz powyżej). Wirus posiada szeroką rzeszę gospodarzy jest jednakże szkodliwy dla ludzi. Użycie PRV jako wydajnego wektora dla szczepionki zostało ostatnio zademonstrowane przez van Zijl i in., (J. Virol. 65, 2761-2765 (1991), WO-A-9100352), którzy wykazali, że rekombinanty PRV, które ekspresjonują glikoproteinę otoczkową E1 wirusa cholery zabezpieczały świnie przed zarówno pseudowścieklizną, jak i cholerą (klasyczną gorączką świń).
Jedną z najważniejszych własności szczepionek jest ich bezpieczność. Ponieważ zmiany molekularne, powodujące zmieniony fenotyp atenuowanych w sposób tradycyjny żywych szczepionek, nie są dokładnie znane istnieje pewna szansa nawrotu wirulencji. Problem ten może być ominięty przez użycie rekombinowanych szczepionek, niosących określone i stałe delecje. Jednakże, konstruowanie atenuowanych w sposób stabilny szczepionek jest czasami bardzo trudne, jeżeli nie niemożliwe. W takim przypadku należy oprzeć się na zabitej szczepionce lub na użyciu bezpiecznych wektorów do szczepionki. Właściwie wytworzone i zbadane, żywe szczepionki atenuowane przez delecję i wektory szczepionek są na ogół bezpieczne dla
174 219 immunokompetentnych gospodarzy. Jednakże, u gospodarzy z niedoborem odporności nastąpić mogą ciężkie powikłania. Ponieważ żywe atenuowane szczepionki i wektory szczepionek są zdolne do replikacji mogą być uwalniane do otoczenia gdzie stanowić mogą zagrożenie dla gospodarzy z niedoborem odporności. Ponadto, szczepionka będąca bezpieczną dla jednego konkretnego gatunku może być wciąż zakaźna dla innego.
Geny będące kandydatami na włączenie do wektorów szczepionek zwykle kodują białka strukturalne wirionu, które są wysoce immunogenne. Białka te obejmują glikoproteiny wirusowe, białka fuzyjne i hemaglutyniny-neuraminidazy (Hruby, Clin. Microbiol. Rev 3, 153-170, (1990)). Białka te biorą często udział w oddziaływaniu wirus-komórka, które determinuje tropizm wirusa w stosunku do gospodarza i/lub tkanki. Stąd ekspresja tych genów przez wirusa nosiciela może teoretycznie zmienić jego biologiczne własności jak patogenność, tropizm do tkanek oraz specyficzność gatunkową gospodarza. Ponadto, owe zmienione własności biologiczne ulec mogą przeniesieniu, poprzez rekombinację homologiczną, z atenuowanego wirusawektora na zakaźny wirus dziki.
Wyżej wspomniane argumenty przemawiają za opracowaniem żywej szczepionki i wektorów do szczepionki, które byłyby samoograniczające się, a w szczególności, takie które nie byłyby rozprzestrzeniane przez osobniki zaszczepione. Idealnie, owe szczepionki powinny produkować niezdolne do zakażania wirusy potomne i powinny być niezdolne do wytworzenia zakaźnego wirusa po rekombinacji z odpowiednim wirusem dzikim. Szczepionka według wynalazku w pełni odpowiada powyższym wymaganiom.
Szczepionka według wynalazku zawierajako składnik czynny wirusa pseudowścieklizny, który jest mutantem gp50, posiadającego glikoproteinę gp50 i zmutowany gen kodujący gp50 i odpowiedni nośnik oraz ewentualnie standardowe składniki takie jak stabilizator, bufor, adiuwant, solubilizer, emulgator i podobne w konwencjonalnych ilościach.
Szczepy według wynalazku są niezdolne do ekspresji gp50, białka otoczki wirusa, które jest niezbędne dla zakaźności wirusa. Gen kodujący gp50 został inaktywowany, bądź przez wprowadzenie obcego oligonukleotydu bądź przez delecję lub też przez oba wymienione powyżej zabiegi (substytucja). W szczególności, gen gp50 został inaktywowany przez wprowadzenie syntetycznego oligonukleotydu, zawierającego kodony zatrzymujące translację we wszystkich trzech ramkach odczytu, lub przez delecję części genomu PRV obejmującą część genów gp50 i gp63. Zmutowane wirusy namnażano na komplementującej linii komórkowej ekspresjonującej wirusowy gen gp50. Powstające wiriony potomne były fenotypowo komplementowane tzn. posiadały gp50 dostarczoną przez komplementującą linię komórkową. Wiriony takie zdolne są do zakażenia komórki zarówno in vitro jak i in vivo, zdolne są do replikacji i rozprzestrzeniania przez bezpośredni kontakt z komórki do komórki. Jednakże wiriony potomne uwolnione przez zakażone komórki nie są zdolne do zarażenia ponieważ nie posiadają gp50. Ponieważ nie mogą rozpocząć kolejnego cyklu zakażenia, nie mogą się rozprzestrzenić ze zwierzęcia zaszczepionego na zwierzęta nie zaszczepione. Takie ograniczenie czyni szczepionkę opartą na takim wirusie bardzo bezpieczną.
Wirus pseudowścieklizny o zmutowanym gp50 stanowi składnik szczepionki według wynalazku przeciwko chorobie Aujeszky’ego, bądź służy jako wektor dla szczepionek opartych na wektorze, przeciwko innym chorobom zwierząt, w których do wspomnianych mutantów wprowadzone są sekwencje nukleotydów kodujących antygeny lub fragmenty antygenów z innych patogenów.
Gdy szczepionkaj est przeznaczona do ochrony przed chorobą Aujeszky ’ ego, mutacj ę genu gp50 stanowi delecja, natomiast w przypadku gdy jest przeznaczona do zapobiegania i/lub zwalczania przynajmniej jednej choroby zwierząt innej niż choroba Aujeszky’ego, mutację stanowi insercja pochodzącej od innego patogenu obcej sekwencji nukleotydowej kodującej antygen lub jego fragment wywołujący wspomnianą chorobę zwierząt. Wirus pseudowścieklizny może zawierać inne mutacje w swym genomie, zmieniające jego zakaźność lub zmieniające ekspresję innych białek, jak np. delecje i/lub insercje w genach gp63, gl, gili, gX, 11K, kinazy tymidynowej (TK), reduktazy rybonukleotydowej (RR), kinazy białkowej lub genie 28K, zaś w szczególności w genie gl lub gp63.
174 219
Szczepionka według wynalazku zawiera wirusy w odpowiednim nośniku, typowym dla żywych szczepionek wirusowych, którym może być, przykładowo, sterylna woda lub ciekła pożywka, w której namnaża się wirusy. W zależności od typu wirusa, jego charakterystyki oraz osobnika, który ma być szczepiony, szczepionka może ewentualnie dodatkowo zawierać bufor lub stabilizator lub inne konwencjonalne składniki.
Szczepionkę można podawać różnymi drogami, jak np. śródskórnie, podskórnie, domięśniowo, dożylnie czy donosowo. Najkorzystniejszejest podawanie donosowe. Szczepionka może również zawierać inne immunogeny charakterystyczne dla innych chorób i wówczas stanowi szczepionkę poliwalentną.
Jako mutanty PRV gp50, stanowiące składniki szczepionki można wymienić przykładowo szczepy R122, R332, D560 i D1200 (patrz Fig. 1). Szczepy R122 i R332 niezdolne są ani do ekspresji funkcjonalnej gp50, natomiast szczepy D560 i D1200 są niezdolne ani do ekspresji funkcjonalnej gp50 ani gp63. Jako że, gp50 jest niezbędna do fazy penetracji wirusa, mutanty te namnażano na komplementującej linii komórkowej ekspresjonującej gp50. Jakkolwiek wszystkie szczepy zdolne są do ukończenia pełnego cyklu replikacji w komórkach niekomplementujących, wiriony potomne uwolnione z tych komórek nie są zakaźne, ponieważ nie posiadają gp50. Obserwacja, że mutanty gp50 zdolne są do wytwarzania łysinek w liniach komórkowych niekomplementujących wskazuje, że wirus może rozprzestrzeniać się z komórek zakażonych do niezakażonych.
Syntetyczny oligonukleotyd o sekwencji 5'-TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3' (Sekw. Nr. 1), zawierający miejsce restrykcyjne EcoRI (GAATTC) i kodony zatrzymujące translację we wszystkich ramkach odczytu, wprowadzono w dwa różne miejsca w genie gp50 plazmidu pN3HB jak jest to opisane przez de Wind i in. (J. Virol., 64, 4691-4696 (1990)) (patrz Fig. 1), w celu uzyskania szczepu PRV R122 i R332. Plazmid pN3HB składał się z fragmentu HindIII-B PRV wklonowanego do plazmidu pBR322 (van Zijl i in., J. Virol. 65, 2761-2765 (1988)). Powstałe plazmidy, w których wprowadzono oligonukleotyd pomiędzy nukleotydy 366-367 oraz 996-997 genu gp50, oznaczono odpowiednio R1 i 322. Użyto numeracji sekwencji nukleotydów genu gp50 PRV szczepu Rice (Fig. 2 z Petrovskis i in., J. Virol., 59, 216-223 (1986)). Należy wspomnieć, jednakże, że sekwencja nukleotydów genu gp50 PRV szczepu NIA-3 różni się od sekwencji szczepu Rice w pozycji 364 (zamiana G na A), co powoduje powstanie miejsca restrykcyjnego BglU w genie gp50 szczepu NIA-3.
Odtworzenie genomu wirusowego uzyskano przez rekombinację nakładkową (van Zij 1 i in., J. Virol., 65, 2761-2765 (1988)) używając kombinacji mutagenizowanego fragmentu (bądź R1 bądź 322) i trzech nakładających się subgenomowych fragmentów dzikiego PRV uzyskanych z kosmidów c-179, c-27 i c-443, stanowiących razem cały genom wirusowy. Rekombinację nakładkową przeprowadzono w komplementującej linii komórkowej (linia G5) ekspresjonującą konstytutywnie gp50 (Peeters i in., J. Virol., 66, 894-905 (1992)). Powstałe szczepy wirusa oznaczono odpowiednio R122 i R332.
W celu uzyskania szczepu D560, użyto plazmidu 322 (patrz pow.) i innej pochodnej plazmidu pN3HB, oznaczonej 149 (de Wind i in., J. Virol., 64, 4691-4696 (1990)), w której wprowadzono oligonukleotyd do genu gp63 pomiędzy nukleotydy 352 i 353 (numeracja według Fig. 5 z Petrovskis i in., J. Virol., 60, 185-193 (1986)) (patrz Fig. 1). Przez zamianę fragmentu BglII-EcoRI plazmidu 149 przez fragment BglH-EcoRI plazmidu 322 stworzono nowy plazmid, w którym sekwencja nukleotydów pomiędzy nukleotydem 996 genu gp50 a nukleotydem 353 genu gp63 zastąpiona została sekwencją Sekw. Nr. 1 (t.zn. sekwencją mutagenicznego oligonukleotydu). Plazmid ten został użyty wraz z nakładającymi się fragmentami dzikimi do regeneracji wirusa przez rekombinację nakładkową w komórkach G5. Powstały wirus oznaczono D560.
W celu uzyskania szczepu D1200, trawiono plazmid 149 enzymami restrykcyjnymi BgIII i EcoRI, a powstałe duże fragmenty cyrkularyzowano przy użyciu ligazy DNA T4, po uprzednim traktowaniu ich końców fragmentem Klenowa polimerazy I DNA E. coli. W powstałym plazmidzie sekwencja pomiędzy pozycją 336 genu gp50 a 353 genu gp63 zastąpiona została przez sekwencję aAtTCTAGCcTA (Sekw. Nr. 2, będąca fragmentem mutagenicznego oligonukleo6
174 219 tydu). Plazmid ten użyto wraz z nakładającym się fragmentem dzikim w celu odtworzenia wirusa przez rekombinację nakładkową w komórkach G5. Powstały wirus oznaczono D1200.
Mutanty R122 i R332, o zmutowanym gp50 i mutanty D560 i D1200 o zmutowanych gp50 i gp63 zdolne były do wytwarzania łysinek na niekomplementujących komórkach SK6. Łysinki tworzone na komórkach SK6 przez szczepy R122 i R332 są podobne w wielkości do łysinek tworzonych przez dziki szczep rodzicielski NIA-3. Łysinki tworzone na komórkach SK6 przez szczepy D560 i D1800 były mniejszej wielkości, co wskazywało na udział gp63 w cyklu replikacyjnym PRV.
Jakkolwiek, rozprzestrzenianie z komórki do komórki jest niezależne od gp50, wirusy o zmutowanym gp50 nie powinny replikować w znacznym stopniu na zwierzętach. Wirulencja wirusów jest głównie rezultatem replikacji w miejscu pierwotnej infekcji, a następnie rozprzestrzeniania się wirionów potomnych do innych części ciała oraz obfitego namnażania poprzez liczne cykle zakażania. Jako, że wirusy o zmutowanym gp50 są tylko zdolne do replikowania w miejscu pierwotnej infekcji, oczekiwano, że mutanty te nie będą zaraźliwe. Ponadto, wątpliwe było czy mutanty te będą immunogenne ponieważ gp50 sama jest wysoce immunogenna, co wykazano przez odkrycie, że gp50 jest zdolna do wytworzenia odporności u świń (Marchioli i in., J. Virol., 61,3977-3982 (1987); Mukamoto i in., Vet. Microbiol. 29,109-121 (1991); Riviere i in., J. Virol., 66, 3424-3434 (1992)). Stąd, inaktywacja gp50 mogłaby znacznie zmniejszyć własności immunogenne mutantów posiadających mutację gp50 i gp50 wraz z gp63. Tak więc nie oczekiwano, że mutanty będą zdolne osiągnąć ośrodkowy układ nerwowy, ponieważ wymagałoby to przeniesienia wirusa z zakażonej tkanki do nerwów obwodowych, a następnie transportowania doośrodkowego układu nerwowego. Jeżeli przezsynaptyczny transport wirionów wymaga reinfekcji neuronów postsynaptycznych przez zaraźliwe wiriony potomne (Lycke i in., J. Gen. Virol., 65 (1984); Card i in., J. Neurosci. 10, 1974-1994 (1990)), transport zmutowanych wirusów do ośrodkowego układu nerwowego mógłby być zablokowany w synapsach. To mogłoby zapobiec wniknięciu wirusa do ośrodkowego układu nerwowego, zapobiegając jego niszczącemu efektowi w mózgu.
W celu stwierdzenia czy zmutowany w zakresie gp50 wirus jest zdolny do rozprzestrzeniania się w tkankach zwierzęcych, badano replikację szczepów R122 i R332, oraz mutantów D560 i D1200 w wycinkach śluzówki nosa świń metodą immunohistochemi. Na dodatek zakażano myszy podskórnie lub dootrzewnowo w celu stwierdzenia czy wirusy replikują i rozprzestrzeniają się in vivo. Uzyskane wyniki pokazują, że wszystkie mutanty zdolne są do replikacji w śluzówce nosa świń.
Ku zaskoczeniu, mutanty gp50 i gp50+gp63 okazały się być letalne dla myszy po podaniu dootrzewnowym lub podskórnym. Wirulencja (wyrażonajako średnia czasu do śmierci zakażonych zwierząt) szczepu R122 była tylko nieznacznie zmniejszona w porównaniu z wirusem dzikim szczepu NIA-3. Wirulencja szczepów D560 i D1200 była, jednakże, dużo bardziej zmniejszona, co wskazuje na udział gp63 w zjawisku zakaźności u myszy. Badanie sekcyjne zakażonych zwierząt wykazało, że mutanty są zdolne do namnażania w mózgu. Badanie immunohistochemiczne organów zakażonych dootrzewnowo zwierząt pokazało, że wirus namnaża się głównie w nerwach obwodowych. Gdy szczep R122 namnażano na komórkach niekomplementujących, a stąd nie posiadał gp50, nie udawało się zakazić myszy drogą dootrzewnową. Wynik ten wskazuje, że gp50 niezbędna jest do zakażenia pierwotnego. Obserwacja, że uzupełnione fenotypowo mutanty gil PRV (które również dawały początek niezakaźnym wirusom potomnym, ale nie wytwarzały łysinek na komórkach niekomplementujących) są całkowicie nieszkodliwe dla myszy, wskazuje, że po pierwotnym zakażeniu dalszy rozsiew wirusa zależny jest od przeniesienia z komórki na komórkę. Stwierdzenie, że zakaźny wirus nie mógł być wyizolowany od żadnego ze zwierząt zakażonych wirusami o zmutowanym gp50 lub gp50 i gp63, wskazuje, że wirusy potomne tworzone w zwierzętach przez te mutanty były nie zakaźne.
Podsumowując, wyniki ' powyższe wskazują, że gp 50 niezbędna jest do zakażenia pierwotnego ale nie do następowej replikacji i przenoszenia się wirusa, co wskazuje, że bezpośrednie przenoszenie z komórki na komórkę jest głównym mechanizmem szerzenia się wirusa in vivo. Wyniki te wskazują dalej, że transport przez-synaptyczny wirusa jest niezależny od gp50 i nie wynika z zakażenia de novo neuronów postsynaptycznych przez wirusy znajdujące się pozako174 219 mórkowo. Stwierdzenie, że zakaźny wirus nie może być wyizolowany od żadnego ze zwierząt zakażonych wirusami o zmutowanym gp50 lub gp50 i gp63, wskazuje, że wirusy potomne tworzone w zwierzętach przez mutanty gp50 były nie zakaźne. Stąd, replikacja tychże mutantów ograniczona jest do zakażonego czy też zaszczepionego zwierzęcia. Użycie wirusów o zmutowanym gp50 jako podstawy szczepionki przeciwko chorobie Aujeszky’ego, lub jako zrekombinowanych wirusów użytych do ekspresji obcych genów powinno stworzyć bardzo bezpieczną szczepionkę, która replikuje wyłącznie w zwierzęciu zaszczepionym i nie szerzy się na inne zwierzęta, ani inne gatunki. Ponadto, jeżeli heterologiczny gen zostanie wprowadzony w miejsce genu gp50 wirusa-nośnika, rekombinacja z wirusem dzikim zawsze da w wyniku powstanie niezakaźnych rekombinantów.
Świnie zaszczepione R122 o zmutowanej gp50 były całkowicie zabezpieczone przed klinicznymi objawami choroby Aujeszky’ego po ekspozycji na chorobotwórczy szczep dziki NIA-3. Świnie zaszczepione D560 i D1200 o zmutowanych gp50 i gp63, wykazywały krótki okres gorączki i opóźnienia wzrostu, ale nie wykazywały objawów neurologicznych po ekspozycji na NIA-3. Wyniki te wskazują, że mutanty PRV, zdolne jedynie do szerzenia się przez kontakt komórek, są nadal silnie immunogenne. Ponadto, wyniki te wskazują, że ekspresja gp50, będącej jednym z najsilniej immunogennych białek PRV (patrz powyżej), nie jest niezbędna do wydajnego zabezpieczenia świń przed chorobą Aujeszky’ego. Nie oczekiwano takiego wyniku.
Jeżeli PRV o zmutowanej gp50 używany jest jako wektor wirusowy, zawiera dodatkowo do mutacji w genie gp50, korzystnie insercję w obrębie genu kodującego gp50, którą jest informacja genetyczna uzyskana z innego patogenu, będącego np. wirusem cholery trzody (świńskiej gorączki), parwowirusem, wirusem zakaźnego zapalenia żołądka i jelit, epidemicznego zespołu ronienia (PEARS lub tzw. tajemniczej choroby świń MSD, PRRS lub SIRS), świńskim koronawirusem oddechowym (PRCV), wirusem endemicznej biegunki świń oraz wirusem grypy, oraz bakteriami jak np. Pasteurella multocida, Bordetella bronchoseptica, Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Treponema hyodysenteria, Escherichia coli czy Leptospira oraz mykoplazmyjakM. hyopneumoniaeiM. lyorhinis. Sposoby klonowania sekwencji kwasu nukleinowego patogenów do fragmentów genomu PRV oraz następnie integrowania tychże fragmentów z genomem PRV są znane i opisane przykładowo przez Van Zij 1 i in., J. Virol., 62, 2191-2195 (1988).
Podczas gdy PRV o zmutowanej gp50 wciąż są zdolne do rozprzestrzeniania się przez kontakt z komórki do komórki, mutacje w homologicznych genach wirusa herpes simplex typu 1 (HSV-1) i bydlęcego wirusa herpes typu 1 (BHV-1) powodują powstanie mutantów niezdolnych do przeniesienia z komórki na komórkę (Ligas i Johnson, J. Virol., 62,1486-1494 (1988); Fehler i in., J. Virol., 66,831-839 (1992)). Wskazuje to na istnienie różnic w funkcji gp50 u PRV i gD u HSV-1 czy gIV u BHV-1. Przy użyciu technik rekombinacji DNA może być możliwe zmodyfikowanie HSV-1, BHV-1 czy innego wirusa herpes w sposób umożliwiający rozprzestrzenianie się go przez kontakt z komórki na komórkę bez tworzenia zakaźnych wirusów potomnych, w sposób podobny do mutantów PRV. Powinno to umożliwić stworzenie bezpiecznych szczepionek opartych na wirusach herpes jako nośnikach, i które mogłyby być wykorzystane do wykrzewienia i zwalczania wielu chorób ludzi i zwierząt.
Figura 1 - Mapa fizyczna części genomu PRV. Strzałki pokazują pozycje kodonów przedwczesnej terminacji translacji, wprowadzonych przez mutagenezę polegającą na wprowadzeniu łącznika do genu gp50 i gp63 plazmidu pH3HB oraz odpowiednich mutantów R122, R332, M102 i M105 (Peeters i in., J. Virol., 66 894-905 (1992); de Wind i in., J. Virol., 64, 4691-4696 (1990)). Poziome słupki pokazują pozycje i wielkość delecji w mutantach D560 i D1200. Górna linia pokazuje fragment BstXI-StuI PRV, który jest obecny w komórkach G5 i ekspresjonuje w sposób konstytutywny gp50 (Peeters i in., J. Virol., 66, 894-905 (1992)).
Figura 2 - Plazmid pEVhis13HCVE1 zawierający wirusa cholery trzody ze wzmacniaczem/promotorem ludzkiego wirusa cytomegalii, którego użyto do konstrukcji PRV o zmutowanej gp50 zawierającego heterologiczny gen (patrz Przykład VI).
Figura 3 - Plazmid pBP53E1 zawierający gen E1 wirusa cholery trzody ze wzmacniaczem/promotorem ludzkiego wirusa cytomegalii, wraz z częścią genomu PRV w
174 219 miejscu delecji genu gp50, którego użyto do konstrukcji PRV o zmutowanej gp50 zawierającego heterologiczny gen (patrz Przykład VI).
Przykład I.Klonowanie genu gp50 PRV szczepu NIA-3 i konstrukcja linii komórkowej ekspresjonującej gp50.
Wszystkie metody rekombinacji DNA wykonano standartowymi technikami (Maniatis i in., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York (1982)). Plazmid pEVhisl4 uzyskano z pSV2his (Hartman i Mulligan, Proc. Natl. -Acad. Sci. U. S. A. 85, 8047-8051 (1988)) przez podstawienie fragmentu EcoRI-BamHI przez fragment zawierający wczesny wzmacniacz/promotor ludzkiego wirusa cytomegalii (hCMV) (Bernard i in., EMBO J. 6, 133-138 (1987)), po którym następował syntetyczny oligonukleotyd zawierający kodony zatrzymujące translację we wszystkich trzech ramkach odczytu oraz miejsce poliadenylacji. Plazmid pEVhis10 uzyskano z pEVhis14 przez delecję fragmentu BamHI zawierającego wzmacniacz/promotor hCMV. Gen gp50 PRV wklonowano jako fragment BstXI-StuI (z brakującym promoterem gp50) w miejsce EcoRV położone poniżej promotera hCMV w pEVhis14, uzyskując plazmid pEVhis14gp50. Konstrukcja i charakteryzacja kosmidów c179, c27 i c443 zawierających nakładające się fragmenty PRV oraz plazmid pN3HB zawierający fragment HindIII-B PRV w miejscu HindIII pochodnej pBR322 opisano w van Zij 1 i in., J. Virol., 65,2761-2765 (1988). Zakłócenie ekspresji gp50 przez wprowadzenie łącznika w dwóch różnych pozycjach genu gp50 w pN3HB (insercja R1 i 322) opisano w de Wind i in., J. Virol., 64, 4691-4696 (1990).
Komórki SK-6 transfekowano plazmidem pEVhis14gp50 drogą elektroporacji. Komórki SK-6 zbierano po trypsynizacji, przepłukiwano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w temperaturze pokojowej, po czym zawieszano w gęstości 2x107 komórek/ml w lodowatym pBs. Do 0.5 ml komórek dodawano 10 mg plazmidu pEVhis14gp50 w sterylnej kuwecie do elektroporacji (odległość elektrod 0.4 cm, BioRad Laboratories) schłodzonej do 0°C, po czym dostarczano wyładowanie o napięciu 1000V przy nastawionej pojemności 25 mF przy użyciu BioRad GenePulser. Komórki pozostawiano w temp. 0°C przez 15 minut, a następnie przenoszono bo butelki hodowlanej o poj. 75 ml zawierającej 50 ml pożywki i inkubowano przez noc. Następnie trasfekowane komórki trypsynizowano i rozsiewano w rozcieńczeniu w 1 θ0 mm płytkach Petriego w pożywce zawierającej 2.5 M histidinol. Pożywkę zmieniano co 3-4 dni, dopóki kolonie nie były widzialne (7-10 dni). Pojedyncze kolonie pobierano i hodowano w płytkach microtiter. Ekspresję gp50 badano testem z użyciem immunoperoksydazy oraz przez radioimmunoprecypitację z użyciem przeciwciała monoklonalnego G50N2, a linię ekspresjonującą znaczne ilości gp50, stwierdzone metodą radioimmunoprecypitacji, oznaczono G5 (Peeters i in., J. Virol., 66, 894-905 (1992)).
Przykład II. Konstrukcja zmutowanych wirusów.
Zmutowane wirusy R122 i R332 skonstruowano przez rekombinację nakładkową w komórkach G5, przy użyciu trzech kosmidów (c-179, c-27 i c-443 opisanych przez van Zijl i in., J. Virol., 65,2761-2765 (1988)) zawierających nakładające się fragmenty sekwencji dzikiego PRV i fragmenty HindIII-B pochodnej pN3HB R1 lub 322 (de Wind i in., J. Virol., 64,4691 -4696 (1990)) zawierających mutageniczny oligonukleotyd 5'-TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3' (Sekw. Nr. 1.) pomiędzy odpowiednio nukleotydami 366-367 i 996-997 genu gp50 (Fig. 1). Wirusowe fragmenty dNa uwalniano z plazmidu przez trawienie przy użyciu EcoRI (kosmidy) lub HindIII (klony R1 i 322) po czym oddzielano je od sekwencji wektora. Transfekcję przeprowadzano drogą elektroporacji (patrz powyżej) przy użyciu BioRad Gene-Pulser i Capacitance Extender nastawionych na250V i 960mF. Komórki wysiewano na płytki 6-studzienkowe i po inkubacji przez 3 h w temp. 37°C pożywkę zmieniano na MEM Earle’a zawierającą 2% surowicy płodowej cielęcej, 1 % metylocelulozy i inkubowano w temp. 37°C dopóki nie pojawiły się łysinki (2-3 dni).
W celu uzyskania szczepu D560 fragment BglII-EcoRI plazmidu 149 (pochodna pN3HB zawierająca mutageniczny oligonukleotyd pomiędzy nukleotydami 352-353 genu gp63 (de Wind i in., J. Virol., 64,4691-4696 (1990); numeracja według Fig. 5 z Petrovskis i in., J. Virol., 60,185-193 (1986)) zastąpiono fragmentem BgIII-EcoRI plazmidu 322 (patrz Fig. 1). Powstały plazmid, w którym sekwencja nukleotydów pomiędzy pozycją 996 genu gp50 i pozycją 353 genu gp63 zastąpiła sekwencja 5'-TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3' (Sekw. Nr. 1, tj. sekwen174 219 cja mutagenicznego oligonukleotydu), użyto wraz z nakładającą się sekwencją fragmentów dzikich do rekonstrukcji wirusa przez rekombinację nakładkową w komórkach G5, tak jak to opisano powyżej.
W celu uzyskania szczepu D1200, plazmid 149 trawiono enzymami BglII i EcoRI, a powstały większy fragment traktowano fragmentem Klenowa polimerazy I DNA E. coli by utworzyć tępe końce, które poddawano następnie ligacji. Powstały plazmid, w którym sekwencja nukleotydowa pomiędzy pozycją 336 genu gp50 i pozycją 353 genu gp63 zastąpiona została sekwencją AATTCTAGCCTA (Sekw. Nr. 2, tj. fragmentem oligonukleotydu mutagenicznego), użyty został wraz z fragmentami dzikimi do rekombinacji nakładkowej w komórkach G5, tak jak to opisano powyżej.
Przykład III. Replikacja wirusów o zmutowanej gp50 i gp50+gp63 w wycinkach śluzówki nosa świń.
W celu ustalenia czy mutanty te zdolne są do rozprzestrzeniania się w tkankach zwierząt, użyto wycinków śluzówki nosa świń. Wycinki te oferują naturalną kombinację komórek nabłonka i fibroblastów zrębowych, i jak wykazano, zakażenie takich wycinków przypomina zakażenie in vivo śluzówki nosa (Pol i in., Res. Vet. Sci. 50, 45-53 (1991)). Wycinki zakażano dzikim szczepem NIA-3, mutantami R122 i R332 z insercją łącznika do genu gp50 oraz mutantami d5ó0 i D1200 z delecją gp50 i gp63.
Badanie immunohistochemiczne, wykonane 24 h po zakażeniu, przy użyciu króliczej surowicy anty-PRV (Pol i in., Res. Vet. Sci. 50,45-53 (1991)) zakażonych wycinków śluzówki wykazało rozprzestrzenianie się wirusa dzikiego szczepu NIA-3 w znacznych obszarach nabłonka. Podobne wyniki uzyskano z mutantami R122 i R332 oraz mutantami D560 i D1200. Po 24 h od zakażenia, replikacja wirusa ograniczona była prawie wyłącznie do komórek nabłonkowych. Jednakże, wszystkie szczepy były zdolne do zakażenia leżących poniżej nabłonka fibroblastów po dłuższym czasie. Znakowanie różnicowe z użyciem króliczej surowicy anty-PRV i przeciwciała monoklonalnego (G50N2, specyficznego dłagp50) potwierdziło, że gp 50 nie jest ekspresjonowany przez wirusy o zmutowanym gp50 i gp50 oraz gp63. Obserwacja ta pokazała, że gp50 nie jest niezbędny do rozprzestrzeniania się wirusa w śluzówce nosa świni.
Przykład IV. Zdolność do zakażenia myszy przez wirusy o zmutowanej gp50 i gp50+gp63.
a. Mutanty gp50+gp63 null są śmiercionośne dla myszy.
Obserwacja, że mutanty gp50 zdolne są do replikacji i szerzenia się w wycinkach tkanek, sugerowała, że będą one zdolne do replikacji i szerzenia się w żywych zwierzętach. Jako zwierzęta doświadczalne wybrano myszy z racji ich dużej podatności na wirusy herpes oraz ich szerokiego użycia jako modelu do badania zakaźności i szerzenia się w neuronach (Fraz.er i Ramachandran, J. Comp. Path., 79,435-444 (1969); Cook i Stevens, Infect Immun. 7,272-288 (1973); Field i Hill, J. Gen. Virol., 26,145-148 (1975); Kristenson i in., Brain Res., 69,189-201 (1978); Platt i in., Arch Virol., 63,107-114 (1980); Dix i in., Infect Immun., 40,103-112 (1983)). W pierwszym eksperymencie użyto mutantów D560 i D1200 z delecją gp50 i gp63, zamiast mutantów R122 czy R332 z insercją łącznika, w celu wykluczenia obecności wirusów, u których nawrócił genotyp dziki. Wirusy takie mogłyby się pojawić w partii podstawowej mutanta z wstawionym łącznikiem w wyniku rekombinacji homologicznej sekwencji wirusowych obecnych w komplementującej linii komórkowej z genomem wirusa (Cai i in., J. Virol., 62, 2596-2604 (1988); Peeters i in., J. Virol., 66, 894-905 (1992); Peeters i in., J. Virol., 66, 3388-3892 (1992)). Jako, że sekwencje z końca 3' delecji gp50+gp63 szczepów D560 i D1200 nie posiadają odpowiedników homologicznych w komplementującej linii komórkowej G5 (Fig. 1) powstanie wirusów o genotypie dzikim w trakcie replikacji na linii komplementującej było niemożliwe.
Pięć samic myszy BALB/c w wieku 6-8 tygodni (Charles River, Suldzfeld, NRF) zaszczepiono podskórnie w kark 105 jednostek pfu szczepu NIA-3, D560, D1200 oraz M105 o zmutowanym gp63. Myszy zakażone szczepem NIA-3 rozwinęły ciężkie objawy choroby Aujeszky’ego, jak np. energiczne drapanie tylną łapą, czyszczenie pyszczka czy porażenia, i padały po ok. 70 h od zakażenia. Zwierzęta zakażone szczepem M105 nie wykazywały objawów świerzbienia ale siedziały osowiałe ze zwiększoną częstością oddechów. Zwierzęta padały po
174 219 ok. 90 godzinach od zakażenia. Myszy zakażone szczepami D560 i D1200 przejawiały objawy podobne do tych zakażonych szczepem M105. Stały się apatyczne i przejawiały objawy porażeń zanim wchodziły w stan agonalny trwający czasem do 42 godzin. Zwierzęta zwykle padały ok. 130-140 godzin po zakażeniu (Tabela 1, Doświadczenie 1). Wyniki te pokazują, że mutanty gp50+gp63 null wciąż są śmiercionośne dla myszy. Ich zakaźność, jednakże, jest znacznie zmniejszona w porównaniu z wirusem dzikim czy mutantem gp63.
b. Mutanty gp50+gp63 null są zdolne do dotarcia do ośrodkowego układu nerwowego i do replikacji w nim.
Ponieważ objawy neurologiczne były znacznie mniejsze u myszy zakażonych mutantami gp63 i gp50+gp63 w porównaniu z myszami zakażonymi szczepem dzikim NIA-3, mózgi zakażonych zwierząt badane były przy użyciu immunohistochemii na obecność wirusa. Krojone na kriostacie skrawki mózgów i narządów ze zwierząt zakażonych były utrwalane i poddane immunohistochemii jak to opisano wcześniej (Pol i in., Microb. Pathol., 7, 361-371 (1989). Gdy używano przeciwciał monoklonalnych przeciwko gp50 jako przeciwciał pierwotnych, w drugiej inkubacji używano konjugatu peroksydazy i koziego przeciwciała przeciwko mysim IgG (Peeters i in., J. Virol., 66, 894-905 (1992)).
Ku zaskoczeniu, obserwowano znaczną liczbę zakażonych neuronów w skrawkach mózgu myszy zakażonej D1200 i D560, podczas gdy w skrawkach mózgu myszy zakażonej NIA-3 czy M105 jedynie mała liczba neuronów była zakażona. Wirus obecny w mózgach zwierząt zakażonych D1200 i D560 nie ekspresjonował gp50, jak to stwierdzono w badaniu z użyciem króliczej surowicy anty-PRV (Pol i in., Res. Vet. Sci. 50,45-53 (1991)). Kiedy izolowano wirusa z mózgów i miareczkowano komórkami SK-6, odzyskiwano zakaźnego wirusa od zwierząt zakażonych NIA-3 i M105 ale nie od zwierząt zakażonych D560 i D1200 (Tabela 1, Doświadczenie 1). Wyniki te wskazują, że mutanty gp50+gp63 null nie są zdolne do tworzenia zakaźnych wirusów potomnych ale wciąż są zdolne do dotarcia do ośrodkowego układu nerwowego i do replikacji w nim.
c. Mutanty gp50 null są wysoce zakaźne.
Jakkolwiek, gp63 umożliwia wzrost wirusa (Petrovskis i in., J. Virol., 60,166-169 (1986)), łysinki tworzone na komplementującej linii G5 i niekomplementującej linii SK-6 przez mutanty gp50+gp63 były znacznie mniejsze od łysinek tworzonych przez mutanty gp50. Ponadto, gp63, jak to wykazano, związana jest z wirulencją u świń (Kimman i in., J. Gen. Virol., 73, 243-251 (1992)). Ponieważ wyniki te sugerują, że mutanty gp50 są bardziej zakaźne od mutantów gp50+gp63, postanowiono sprawdzić zakaźność mutantów gp50 u myszy. Jednakże, w celu użycia mutantów gp50 na myszach, należało być całkowicie pewnym, że inokulum nie zawiera wirusów z odtworzonym dzikim genotypem (patrz powyżej). Przygotowano znaczną ilość fenotypów komplementowanego wirusa R122, będącego praktycznie wolnym od mutantów z odtworzonym dzikim genotypem, przez zakażenie komórek SK-6 jedną łysinką R122 rosnącego na komórkach G5. Wirusowy DNA wyizolowano z zakażonych komórek SK-6 i użyto do transfekcji komórek G5 (posiadających znacznie zmniejszoną wydajność zasiedlania dla PRV; Peeters i in., J. Virol., 66, 894-905 (1992)). Z transfekowanych komórek przygotowano partię wirusa zawierającą 2· 1x107 pfu/ml, co określono miareczkowaniem na komórkach SK-6. Partię oznaczono R122+ co wskazywało, że wirus był fenotypowo uzupełniany. Partię wirusa z brakującym gp50 przygotowano przez zakażenie komórek SK-6 przy pomocy 200 ml (4-2x106 pfu) nierozcieńczonego roztworu R122+. Powstała partia wirusa, oznaczona R122', co oznaczało, że uzyskano go od komórek niekomplementujących, posiadająca 150 pfu/ml. Jednakże, gdy wykonano barwienie immunoperoksydazy z użyciem przeciwciała monoklonalnego przeciwko gp50 (Peeters i in., J. Virol., 66, 894-905 (1992)), łysinki okazały się być gp50 negatywne. Wskazuje to, że partia wirusa nie zawierała wirusa dzikiego, ale wciąż posiadała nieco wirusów zakaźnych. Możliwe jest, że pochodziły one z inokulum (R122+), które użyte było do przygotowania partii R122'. Możliwe jest również, że wirusy potomne wbudowywały cząsteczki gp50 pozostałe w błonie komórek SK6 po zakażeniu ich przez zakaźne wiriony R122+. Inną możliwością jest, że wiriony pozbawione gp50 pobierane były drogą endocytozy (Campadelli-Fiume i in., J. Virol., 62, 159-167 (1988)) i unikały czasami degradacji co powodowało zakażenie.
174 219
Miano partii R122+ i R122’ oznaczono przy pomocy mikroskopii elektronowej z użyciem kulek lateksowych (średnicy 91 nm; Serva) jako wewnętrznego standartu.
Dodatkowo, w celu zbadania zakaźności R122+, badano czy zakaźność różnych wirusów jest zależna od drogi zakażenia. Grupy po pięć myszy zakażane były 105 pfu szczepów NIA-3, M105, R122+ i D1200, przez podanie podskórne lub dootrzewnowe. Myszy zakażone R122+ rozwinęły objawy choroby Aujeszky'ego przypominające te u zwierząt zakażonych szczepem NIA-3 (patrz powyżej). U zwierząt zakażonych podskórnie NIA-3 pierwsze objawy widoczne były po 34-40 godzinach od zakażenia, zaś u zwierząt zakażonych tą samą drogą przez R122+ po 42 h. Zwierzęta padały w odpowiednio 56 i 68 godzin po zakażeniu (Tabela 1, Doświadczenie 2). Wyniki te pokazują, że mutant gp50 R122+ był wciąż bardzo zakaźny dla myszy i był znacznie bardziej zakaźny niż mutant gp50+gp63 D1200 czy gp63 M105. Dootrzewnowe podanie szczepów NIA-3, R122+ i M105, powodowało wydłużenie średniego czasu do padnięcia o około 10-13 godzin w porównaniu z podaniem podskórnym. Dla szczepu D1200 średni czas do śmierci był o około 25 h krótszy po podaniu dootrzewnowym w porównaniu do podania podskórnego (Tabela 1, Doświadczenie 2). Dla wszystkich szczepów badanych, objawy i oznaki kliniczne były niezależne od drogi zakażenia. Stąd, jakkolwiek występują różnice w przebiegu infekcji, obie drogi zakażenia powodowały śmiertelną infekcję. Wirus znajdowany był metodą immunohistochemii w skrawkach mózgu wszystkich zwierząt użytych w Doświadczeniu 2 (Tabela 1). Tak więc replikacja wirusa była znacznie bardziej nasilona w mózgach zwierząt zakażonych D1200 w porównaniu do zwierząt zakażonych przez NIA-3, R122+ czy M105.
d. Wybiórcza replikacja w nerwach obwodowych zakażonych narządów.
Gdy badano narządy na obecność antygenów wirusowych metodą immunohistochemii, stwierdzano je wyłącznie u zwierząt zakażonych dootrzewnowo. Wirusa stwierdzano w wątrobie, śledzionie, nerkach, jelitach i nadnerczach, ale nie w płucach. Zakażenie było prawie wyłącznie ograniczone do włókien nerwowych. Obserwacja ta wskazuje, że tkanka nerwowa jest wybiórczym miejscem zakażenia i replikacji PRV, i sugeruje, że wirus jest transportowany z narządów do ośrodkowego układu nerwowego poprzez wsteczny transport aksonalny, jak to opisano poprzednio (Cook i Stevens, Infect Immun. 7,272-288 (1973); Field i Hill, J. Gen. Virol., 23, 145-157 (1974); Field i Hill, J. Gen. Virol., 26, 145-148 (1975); McCracken i in., J. Gen Virol., 20, 17-28 (1973); Strack i Loewy, J. Neurosci. 10, 2139-2147 (1990); Card i in., J. Neurosci. 10,1974-1994(1990)). Obserwacja, że mutant gp50nulljest wydajnie transportowany do ośrodkowego układu nerwowego, wskazuje na niezależność transportu neuronalnego od obecności gp50.
Zakaźny wirus odzyskiwany był z wyciągów z narządów zwierząt zakażonych dootrzewnowo szczepami NIA-3 i M105. Jak oczekiwano, nie wyizolowano zakaźnego wirusa od zwierząt zakażonych R122+ i D1200, co ponownie pokazało, że wirusy potomne tych szczepów są niezakaźne. Nieoczekiwanie, u trzech spośród pięciu zwierząt zakażonych podskórnie szczepem NIA-3 możliwe było wykazanie wirusa w wyciągach z narządów (Tabela 1, Doświadczenie 2).
Może to oznaczać, że wirus jest transportowany z ośrodkowego układu nerwowego do tych narządów. Brak wirusa w narządach myszy zakażonych podskórnie szczepem M105 wskazuje prawdopodobnie na to, że u zwierząt tych transport wirusa był opóźniony.
174 219
Tabeli a 1
Średni czas do śmierci i wykrywanie winisa u myszy zakażonych różnymi szczepami PRY
a podskórnie, D nee stwierdzono, dootrzewnowo, α w nerwahh obwodowych.
174 219
e. gp50 jest wymagany do pierwotnego zakażenia in vivo.
Wyniki in vitro, które pokazały, że gp50 jest wymagane do fazy penetracji ale nie do szerzenia się z komórki na komórkę (Peeters i in., J. Virol., 66, 894-905 (1992)), sugerowały, że jest to również prawda podczas zakażenia in vivo. Jakkolwiek możliwość, że gp50 nie jest niezbędna do penetracji in vivo, jest mało prawdopodobna, wymagane było aby sprawdzić czy gp50 niezbędna jest do pierwotnej infekcji. W celu zbadania udziału gp50 użyto partii R122 namnożonego naniekomplementujących komórkach SK-6 i stąd nie posiadającego gp50 (R122’, patrz powyżej). Ponieważ 105 pfu R122+ odpowiada 3-3x106 cząstek, do zakażenia myszy użyto tej samej liczby cząstek R122'. Jak tego oczekiwano wszystkie myszy zaszczepione dootrzewnowo lub podskórnie przy użyciu R122+ padły (Tabela 1, Doświadczenie 3). Jednakże wszystkie myszy zaszczepione przy użyciu R122’ pozostały żywe po zaszczepieniu drogą dootrzewnową, a tylko jedno z pięciu zwierząt zaszczepionych podskórnie padło. Wynik ten wskazuje, że obecność gp50 w otoczce wirusa jest niezbędna do zakażenia zwierząt.
Badanie zwierzęcia padłego po zakażeniu R122‘ pokazało, że wirus obecny był w mózgu, co wskazuje, że w inokulum wciąż były wirusy zakaźne. Gdy miareczkowano inokulum, w powtórzeniach, na niekomplementujących komórkach SK-6, stwierdzono obecność 9 i 16 łysinek. Łysinki te wytworzone zostały przez mutanta gp50, co stwierdzono immunoCistocCemią. Prawdopodobne pochodzenie tych zakaźnych wirionów było dyskutowane powyżej. Ponieważ LD50 PRV szczepu NIA-3 po zakażeniu dootrzewnowym wynosi około 70pfu, możliwe jest, że zakaźne cząstki wirusa w inokulum R122‘ odpowiadają za śmiertelne zakażenie owego zwierzęcia.
f. Wirus niezdolny do tworzenia zakaźnego potomstwa i niezdolny do szerzenia się przez kontakt z komórki do komórki jest niezakaźny dla myszy.
Poprzednio wykazano, że podobnie jak mutanty gp50 null replikacja mutantów gil i gH null PRV na niekomplementujących liniach komórkowych powoduje powstanie niezakaźnych wirusów potomnych (Peeters i in., J. Virol., 66, 894-905 (1992); Peeters i in., J. Virol., 66, 3388-3892 (1992)). Jednakże w przeciwieństwie do mutantów gp50, mutanty gil i gH miały zdolność tworzenia łysinek na komórkach niekoimplementujących. Wynik ten wskazuje, że gil i gH są niezbędne dla szerzenia się wirusa z komórki na komórkę. Aby zbadać czy taki typ szerzenia się wirusa wymagany jest dla pomyślnego szerzenia się in vivo, użyto fenotypowo komplementowanych mutantów PRV gH null - B145 (Peeters i in., J. Virol., 66,894-905 (1992)) do zakażenia myszy. Gdy myszy zakażono dootrzewnowo lub podskórnie przy użyciu 105 pfu wirusa B145, żadne ze zwierząt nie rozwinęło objawów choroby Aujeszky’ego (Tabela 1, Doświadczenie 3). Wynik ten wskazuje, że wirus niezdolny do tworzenia zakaźnego potomstwa oraz niezdolny do szerzenia się przez kontakt komórek jest niezakaźny dla myszy.
Przykład V. Zakaźność i immunogenność mutantów gp50 i gp50 oraz gp63 dla świń.
W celu zbadania zakaźności i immunogenności zmutowanych szczepów, zaszczepiono świnie szczepami R122+, D560 i D1200. Dziki szczep M209 i mutant gp63 M102 (Figura 1) (Kimman i in., J. Gen. Virol., 73, 243-251 (1992)) służyły jako kontrola. Po immunizacji następowała ekspozycja na dziki szczep PRV NIA-3.
Grupy pięciu świń w wieku 4 do 6 tygodni (rasy Dutch landrace wolne od specyficznych patogenów - SPF, ze specjalnego stada Central Veterinary Institute) zakażano donosowo przy użyciu 105pfu w objętości 0.5 ml podawane powoli do każdego z nozdrzy w fazie wdechu. Cztery tygodnie po szczepieniu świnie eksponowano na 105pfu zakaźnego szczepu PRV NIA-3, również donosowo. Świnie badano klinicznie dwa razy dziennie i mierzono temperaturę w odbycie raz dziennie. Zwierzęta ważono trzy razy w tygodniu. Dla każdej świni oznaczono liczbę dni zahamowania wzrostu, gorączki oraz objawów neurologicznych. Okres zahamowania wzrostu zdefiniowano jako liczbę dni potrzebną na odzyskanie wagi z dnia ekspozycji na wirusa. Gorączkę zdefiniowano jako temperaturę mierzoną w odbycie przekraczającą 40°C. Drapanie się, ataksja, porażenie, drżenie i konwulsje, określano jako objawy neurologiczne.
Świnie szczepione dzikim szczepem M209 rozwinęły objawy typowej choroby Aujeszky’ego a więc gorączkę, brak apetytu, opóźnienie wzrostu i objawy neurologiczne jak ataksja i porażenia (Tabela 2). Mutanty R122+ i M102 powodowały krótszy okres gorączki i opóźnienia wzrostu ale nie wywoływały objawów neurologicznych. Mutanty D560 i D1200 nie wywoływały
174 219 żadnych objawów neurologicznych ani nie powodowały gorączki i opóźnienia wzrostu. Wynika z tego, że mutanty gp50+gp63 D560 i D1200 są całkowicie niezakaźne dla świń, podczas gdy mutant gp50 R122+ i mutant gp63 M102 mają znacznie zmniejszoną zakaźność w porównaniu z dzikim wirusem PRV.
Świnie szczepione szczepami R122+ i M102 nie przejawiały ani gorączki ani opóźnienia wzrostu oraz nie rozwinęły żadnych objawów klinicznych po ekspozycji na NIA-3 (Tabela 3). Świnie szczepione szczepem D560 i D1200 przejawiały krótszy okres gorączki i opóźnienia wzrostu ale nie przejawiały objawów neurologicznych, pomimo że niektóre zwierzęta były osowiałe przez kilka dni a dwoje z nich wymiotowało. Świnie nieszczepione z grupy kontrolnej rozwinęły pełne objawy choroby Aujeszky’ego oraz stosunkowo długi czas gorączki i zahamowania wzrostu; dwie świnie padły (Tabela 3). Wyniki te wskazują, że świnie szczepione R122+ - wirusem o zmutowanej gp50 oraz mutantem gp63 - M102, są całkowicie zabezpieczone przed objawami klinicznymi choroby Aujeszky’ego, podczas gdy świnie szczepione mutantami gp50+gp63 D560 i D1200 są częściowo zabezpieczone przed chorobą.
Tabela 2 $
Immunizacja świń różnymi szczepami PRV
| I Immunizacja | Gorączka | Opóźnienie wzrostu* | Objawy kliniczne i |
| M209 | 5.3 ±0.6 | 8.3 ±7.3 | ++ |
| (n=3) M102 | 2.4 ± 1.5 | 2.4 ±2.2 | |
| (n=4)# | |||
| R122+ | 3.8 ±1.6 | 0.8 ±1.8 | ί |
| (n=5) | |||
| D560 | 0 | 0 | - | |
| (n=5) D1200 | 0 | 0 | |
| (n=5) |
$ żadna ze świń nie padła w trakcie doświadczenia * średnia liczba dni (±S. D.) # jedna ze świń padła prawdopodobnie na skutek urazu po pobraniu krwi ++ oznacza objawy neurologiczne jak ataksja, porażenia i konwulsje
Tabela 3
Zabezpieczenie świń przez szczepienie po ekspozycji na NIA-3
| Immunizacja | Śmiertelność | Gorączka* | Opóźnienie wzrostu* | Objawy kliniczne |
| - | 2 | 6.8 ±0.5 | 10.3 ±7.1 | ++ |
| (n=6) M102 | 0 | 0 | 0 | |
| (n=4) | ||||
| R122+ | 0 | 0 | 0 | - |
| (n=5) | ||||
| D560 | 0 | 2.6 ± 1.3 | 4.6 ± 6.5 | +/- |
| (n=5) D1200 | 0 | 3.6 ±1.1 | 1.4 ± 3.1 | +/- |
| (n=5) |
średnia liczba dni (±S. D.) ++ oznacza objawy neurologiczne jak ataksja, porażenia i konwulsje +/- oznacza osowienie (czasem wymioty, patrz tekst)
174 219
Przykłady te pokazują, że gp50 PRV jest niezbędna dla zakaźności wirusa (penetracja) ale nie do rozprzestrzeniania się z komórki na komórkę. Fenotypowo uzupełnione mutanty gp50 i gp50+gp63 są zdolne do replikacji i szerzenia się w zakażonych zwierzętach. Jednakże tworzone wirusy potomne są niezakaźne i stąd nie mogą być rozsiewane przez zakażone zwierzęta. Własność ta wraz z szerokim zakresem gospodarzy PRV i zdolnością do pomieszczenia znacznych ilości obcego DNA, czyni PRV o zmutowanej gp50 idealnym dla przygotowania bezpiecznej szczepionki (nośnika) przeciwko chorobie Aujeszky’ego i innym chorobom zwierząt.
Przykład VI. Konstrukcja mutanta o delecji w obrębie gp50, ekspresjonującego glikoproteinę otoczkową E1 wirusa cholery trzody.
W celu zbadania, czy mutant gp50 będzie mógł być użyty jako wirus nośnikowy służący ekspresji genów heterologicznych, gen gp50 PRV szczepu NIA-3 zastąpiono fragmentem DNA zawierającym gen E1 wirusa cholery trzody (HChV; czyli klasycznej gorączki świń) pod kontrolą promotora transkrypcji hCMV.
Fragment ScaI-DraI (miejsce ScaI w pozycji 317-322 genu gX, numeracja sekwencji według Rea i in., J. Virol. 54,21-29 (1985); miejsce DraI w pozycji 1181-1186 pomiędzy genami gp63 i gI, numeracja sekwencji według Petrovskis i in., J. Virol. 60, 185-193 (1986)) z regionu Us PRV wklonowano w przygotowane miejsce NdeI plazmidu pUC19M (Clontech). Metodą specyficznej miejscowo mutagenezy in vitro (Transformer Kit, Clontech) stworzono unikalne miejsca restrykcyjne tuż na przodzie genu gp50 i zaraz za jego końcem. Przy użyciu primerów 5'-AGGTTCCCATACACTAGTCCGCCAGCGCCATGC-3' (Sekw. Nr. 3) i 5'-CCCGGTCCGTAGCCTAGGCAGTACCGGCGTCG-3' (Sekw. Nr. 4) stworzono sekwencje rozpoznawane przez enzymy SpeI (ACTAGT) i Avrll (CCTAGG) odpowiednio w pozycji -17 do -12 i 1210 do 1215 (numeracja nukleotydów w/g Petrovskis i in., J. Virol. 59, 216-223 (1986)). Gen gp50 usunięto drogą trawienia DNA plazmidowego enzymami SpeI i Avril i zastąpiono syntetycznym oligonukleotydem SpeI-AvrII zawierającym miejsca restrykcyjne EcoRI, EcorV i HindIII (syntetyczny fragment DNA uzyskano przez sparowanie równych molarnie ilości dwóch jednoniciowych oligonukleotydów o sekwencji 5'-CTAGTGAATTCGATATCAAGCTTC-3' (Sekw. Nr. 5) i 5'-CTAGGAAGCTTGATATCGAATTCA-3' (Sekw. Nr. 6). Następnie wklonowano fragment NcoI-PstI (miejsce NcoI w pozycji 883-888 genu gX, numeracja sekwencji według Rea i in., J. Virol. 54, 21-29 (1985); miejsce PstI w pozycji 439-444 genu gp63, numeracja sekwencji według Petrovskis i in., J. Virol. 60, 185-193 (1986)) zawierającego delecję w obrębie gp50, do plazmidu pGEM5Zf(+) (Promega) po trawieniu tego ostatniego NcoI i PstI. Powstały plazmid oznaczono pBP53.
Gen E1 pochodzący z HChV uzyskano z klonu cDNA szczepu Brescia HChV (Moorman i in., J. Virol., Γ77,184-198 (1990)). Gen wklonowanojako fragment DsaI-EcoRV (miejsce DsaI wypełniono przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA E.coli, nukleotydy 2337-3804 numeracja w/g Moorman i in., J. Virol., 177, 18-4-198 (1990)) pomiędzy miejsce EcoRI (wypełnione przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA E.coli) i miejsce EcoRV plazmidu pEVhis 13. Ten ostatni plazmid jest pochodną plazmidu pSV2his (Hartman i Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8047-8051 (1988)) zawierającą promotor hCMV poprzedzający kodon rozpoczynający translację ATG, znaczną liczbę miejsc restrykcyjnych i kodon stopujący translację we wszystkich trzech ramkach odczytu (Peeters i in., J. Virol., 66, 894-905 (1992); patrz również Przykład I). W powstałym plazmidzie gen E1 połączono w jednej ramce odczytu z kodonem startującym pEVhisl3. Plazmid ten oznaczono pEVhisl3HCVE1 (Figura 2). Po trawieniu go przy użyciu HpaI i PstI wyizolowano fragment zawierający promoter hCMV, gen E1 i stopkodony. Fragment HpaI-PstI traktowano polimeraząDNA T4 tworząc tępe końce a następnie wklonowano w miejsce EcoRV plazmidu pBP53. Wyizolowano plazmid, w którym kierunek translacji genu E1 był zgodny z kierunkiem genów gX i gp63 plazmidu pBp53, i oznaczono go pBP53E1 (Figura 3).
W celu zbadania czy gen E1 został sklonowany prawidłowo, badano przejściową ekspresję E1 nakomórkach G5. Komórki transfekowano plazmidem pBp53E1 lub pEVhis 13HCVE1 przy pomocy lipofectin (GIBCO BRL). Po dwóch dniach utrwalano komórki rosnące w postaci pojedynczej warstwy, i badano ekspresję E1 przy pomocy znakowania z użyciem przeciwciała monoklonalnego 3 lub 4 specyficznego dla glikoproteiny E1 HChV (Wensvoort, J. Gen. Virol.,
174 219
70, 2685-2876 (1989)) sprzężonego z peroksydazą chrzanową. Ekspresja E1 przez komórki transfekowane przy pomocy pBp53E1 była wyraźnie widoczna a barwienie nawet intensywniejsze niż w przypadku komórek transfekowanych pEVhis13HCVE1. Wskazuje to na wydajną ekspresję E1w kontekście pBp53E1 czyli w otoczeniu sekwencji pochodzących z PRV.
Plazmid pBp53E1 trawiono PvuII i PstI i kotransfekowano nim wraz z wirusowym DNA szczepu NIA-3 PRV komórki G5 używając lipofectin. Po dwóch dniach, gdy łysinki były wyraźnie widoczne, komórki utrwalano i znakowano przeciwciałami, tak jak to opisano w przypadku badania przejściowej ekspresji. Obecność wybarwionych łysinek wskazywała, że gen E1 wprowadzony został do genomu wirusa poprzez rekombinację homologiczną, oraz że gen E1 ekspresjonowany był przez zrekombinowane wirusy. W celu izolacji zrekombinowanego wirusa powtórzono eksperyment i wyizolowano 400 pojedynczych łysinek. W celu identyfikacji rekombinantów przeniesiono część izolatów na płytkę microtiter zawierającej komórki SK-6. Po dwudniowej inkubacji gdy widoczne były łysinki, zakażone komórki utrwalono i poddano znakowaniu przeciwciałem na ekspresję E1. Rekombinowane wirusy, ekspresjonujące E1 pochodzące z oryginalnych izolatów i dające zabarwienie na komórkach SK-6 wyizolowano i oczyszczono przez pasażowanie.
Wykazano, że rekombinowana szczepionka wirusa PRV ekspresjonująca E1 pochodzący z HChV zabezpiecza świnie przed rozwojem gorączki świń po ekspozycji ich na HChV (van Zijl i in., J. Virol., 65, 2761-2765 (1991)). W oparciu o te wyniki, stwierdzić można, że nie zdolny do szerzenia się mutant z delecją gp50 ekspresjonujący E1 opisany powyżej powodować może odpowiedź odpornościową chroniącą przed klasyczną gorączką świń.
Przykład VII. Wytworzono szczepionki ze szczepów PRV D5 i D57 o zmutowanej gp50. Szczep D5 zawierał delecję genu gp50; a szczep D57 zawierał delecję genu gp50 i dodatkowo delecję gp63.
Komórki Vero transfekowano plazmidem ekspresyjnym zawierającym kopię genu gp50 PRV położoną poniżej promotora gB PRV. Po selekcji kolonii opornych na neomycynę (Geneticin; Life Technologies), wyselekcjonowano i klonowano rozcieńczeniami granicznymi komórki zdolne do komplementacji mutantów gp50. Wyselekcjonowano jeden z takich klonów do dalszego stosowania (określony jako VII/50) i hodowano go w minimalnej zmodyfikowanej pożywce Glasgow, zawierającej 5% płodową surowicę cielęcą i antybiotyki (GMEM), z dodatkiem 900 gg/ml Genetycyny. Szczepy D5 i D57 hodowano na wyselekcjonowanych komórkach w GMEM pozbawionej Genetycyny. Nadsącz (pożywkę GMEM zawierająca wirusa) zebrano i przechowywano w 0,5 ml porcjach w -70°C.
Szczepionki przygotowano w ciągu 30 minut przed szczepieniem. Zamrożone porcje szczepionki (wirus w pożywce, która stanowiła nośnik) gwałtownie rozmrożono w 37°C w łaźni wodnej, do momentu pozostania małego kawałka lodu. Następnie probówki umieszczono na lodzie i zawartość ich połączono w szklanej fiolce o pojemności 50 ml i zamknięto gumowym korkiem. Szczepionkę wirusową utrzymywano na lodzie do momentu na krótko przed szczepieniem.
W doświadczeniu zastosowano sześć owiec i sześć cieląt. Zwierzęta były seronegatywne pod względem PRV. Zwierzęta szczepiono 2 ml szczepionki wirusowej stosując sterylną strzykawkę i igłę 20-Gauge (Terumo). Przed szczepieniem, miejsce wstrzyknięcia przecierano gazikiem z 70% etanolem. Miejsce wstrzyknięcia badano pod kątem odczynu miejscowego. Objawy kliniczne, które są uważane za charakterystyczne dla choroby Aujeszky’ego u roślinożernych obejmują: drapanie, kąsanie, okresy pobudzenia, po których następuje porażenie.
Wyniki pokazują, że żadne ze zwierząt nie rozwinęło żadnego objawu klinicznego charakterystycznego dla choroby Aujeszky’ego. Nie można było wyizolować zakaźnego wirusa z wymazów nosowych w żadnym z dni okresu obserwacji, ani z narządów albo odchodów w 14 dni po szczepieniu.
174 219
ANEKS
Lista sekwencji
Sekw.Nr 1.
Typ sekwencji: nukleotydowa Długość sekwencji: 20 zasad Niciowość: pojedyncza Źródło: syntetyczna
TAGGCTAGAATTCTAGCCTA
Sekw.Nr 2.
Typ sekwencji: nukleotydowa Długość sekwencji: 12 zasad Niciowość: pojedyńcza Źródło: syntetyczna
AATTCTAGCCTA
Sekw.Nr 3.
Typ sekwencji: nukleotydowa Długość sekwencji: 33 zasady Niciowość: pojedyńcza Źródło: syntetyczna
AGGTTCCCATACACTAGTCCGCCAGCGCCATGC
174 219
Sekw.Nr 4.
Typ sekwencji: nukleotydowa Długość sekwencji: 32 zasady Niciowość: pojedyncza Źródło: syntetyczna
CCCGGTCCGTAGCCTAGGCAGTACCGGCGTCG
Sekw.Nr 5.
Typ sekwencji: nukleotydowa Długość sekwencji: 24 zasady Niciowość: pojedyńcza Źródło: syntetyczna
CTAGTGAATTCGATATCAAGCTTC
Sekw.Nr 6.
Typ sekwencji: nukleotydowa Długość sekwencji: 24 zasady Niciowość: pojedyńcza Źródło: syntetyczna
CTAGGAAGCTTGATATCGAATTCA
174 219
174 219
ΙΛ
Ο b
SO s
o
X <Λ v~>
o >
X
CL
B
O
C
V U t>
E o
c
V ClD > CĆ CL.
ca x
g © Φ *H υ ©* u u Φ 43 CO O c
«Η Ϊ c
Ł>
o.
<0
Λ w4 e
N υ
«· tM </>
c £ i «
E Ł· E φ _ w O 5 E H
V5 .Ξ ►>
oj C β c +> a x
Di200deletion mutant
Mutant D1200 z delecją
D560 deletion mutant Mutant D56O -Ł delecją
co
H
I
CP
Ιΐ >
X uo
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4.00 zł
Claims (4)
- Zastrzeżenia patentowe1. Szczepionka przeciwko chorobie Aujeszky’ego i innym chorobom zwierząt zawierająca wirusa pseudowścieklizny jako składnik czynny i odpowiedni nośnik oraz ewentualnie standardowe składniki takie jak stabilizator, bufor, adiuwant, solubilizer, emulgator i podobne w konwencjonalnych ilościach, znamienna tym, że zawiera wirusa pseudowścieklizny, który jest mutantem gp50, posiadającego glikoproteinę gp50 i zmutowany gen kodujący gp50.
- 2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że w przypadku gdy jest przeznaczona do zapobiegania i/lub zwalczania choroby Aujeszky’ego, zawiera wymienionego wirusa, w którym mutacja genu kodującego gp50 polega na delecji.
- 3. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że w przypadku gdy jest przeznaczona do zapobiegania i/lub zwalczania przynajmniej jednej choroby zwierząt innej niż choroba Aujeszky’ego, zawiera wymienionego wirusa, w którym mutacja polega na wprowadzeniu (insercji) heterologicznego genu kodującego antygen odpowiadający danej chorobie zwierząt.
- 4. Szczepionka według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że zawiera wirusa pseudowścieklizny, który dodatkowo ma co najmniej jedną mutację w jednym ze swoich innych genów, w szczególności w genie kodującym gp63 lub w genie gl.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP92202096 | 1992-07-09 | ||
| PCT/NL1993/000146 WO1994001573A1 (en) | 1992-07-09 | 1993-07-08 | Vaccines against aujeszky's disease and other animal diseases containing pseudorabies virus mutants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL307049A1 PL307049A1 (en) | 1995-05-02 |
| PL174219B1 true PL174219B1 (pl) | 1998-06-30 |
Family
ID=8210764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL93307049A PL174219B1 (pl) | 1992-07-09 | 1993-07-08 | Szczepionka przeciwko chorobie Aujeszky'ego i innym chorobom zwierząt |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5674500A (pl) |
| EP (1) | EP0654086B1 (pl) |
| JP (1) | JPH07509127A (pl) |
| KR (1) | KR100341994B1 (pl) |
| CN (1) | CN1124159C (pl) |
| AT (1) | ATE189000T1 (pl) |
| AU (1) | AU684252B2 (pl) |
| CA (1) | CA2139507C (pl) |
| DE (1) | DE69327656T2 (pl) |
| DK (1) | DK0654086T3 (pl) |
| ES (1) | ES2143507T3 (pl) |
| HU (1) | HU220099B (pl) |
| NZ (1) | NZ254267A (pl) |
| PL (1) | PL174219B1 (pl) |
| RU (1) | RU2158308C2 (pl) |
| TW (1) | TW289731B (pl) |
| WO (1) | WO1994001573A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA934882B (pl) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2290906C (en) * | 1991-06-06 | 2003-04-01 | Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut | Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits |
| US6007825A (en) * | 1991-12-23 | 1999-12-28 | American Cyanamid Company | Serpulina hyodysenteriae vaccine comprising a tly gene mutant |
| US7223411B1 (en) | 1992-07-31 | 2007-05-29 | Dana-Farber Cancer Institute | Herpesvirus replication defective mutants |
| US6773908B1 (en) * | 1992-10-30 | 2004-08-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US6592873B1 (en) * | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
| US6380376B1 (en) * | 1992-10-30 | 2002-04-30 | Iowa State University Research Foundation | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US5695766A (en) * | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
| EP0689603A1 (en) * | 1993-03-19 | 1996-01-03 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Defective mutant non-retroviral virus (e.g. hsv) as vaccine |
| EP0659885A1 (en) * | 1993-12-21 | 1995-06-28 | Akzo Nobel N.V. | Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity |
| EP0693551A1 (en) | 1994-07-18 | 1996-01-24 | Akzo Nobel N.V. | gD-negative bovine herpesvirus mutant, capable of direct cell-to-cell transmission |
| EP0839912A1 (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| US20040224327A1 (en) * | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| US6399354B1 (en) | 1998-07-31 | 2002-06-04 | President And Fellows Of Harvard College | Replication-competent virus expressing a detectable fusion protein |
| CA2366072C (en) * | 1999-03-08 | 2007-07-10 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. | Prrsv vaccines |
| CA2650236C (en) * | 1999-04-22 | 2016-01-12 | United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine, based on isolate ja-142 |
| US20050014264A1 (en) * | 2002-12-11 | 2005-01-20 | University Of Massachusetts | Method of introducing siRNA into adipocytes |
| RU2007101725A (ru) * | 2004-06-18 | 2008-07-27 | Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Миннесота (Us) | Идентификация инфицированных вирусом и вакцинированных вирусом организмов |
| US7632636B2 (en) * | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
| SI1904631T1 (sl) | 2005-06-24 | 2012-09-28 | Univ Minnesota | Virusi PRRS, infekciozni kloni, njihovi mutanti in postopki uporabe |
| CN101081298A (zh) * | 2007-06-26 | 2007-12-05 | 陈少莺 | 一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法 |
| WO2010025109A1 (en) * | 2008-08-25 | 2010-03-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedia, Inc. | Vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome (hp prrs) |
| CN101457215B (zh) * | 2008-12-01 | 2010-11-17 | 华中农业大学 | 重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株及应用 |
| TWI627281B (zh) * | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物 |
| JP2014506795A (ja) | 2011-02-17 | 2014-03-20 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Ｐｒｒｓｖの工業規模の製造方法 |
| UA117272C2 (uk) | 2011-02-17 | 2018-07-10 | Бьорінгер Інгельхайм Ветмедіка Гмбх | Новий європейський штам prrsv |
| WO2013017570A1 (en) | 2011-07-29 | 2013-02-07 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Novel prrs virus inducing type i interferon in susceptible cells |
| US9187731B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-11-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells |
| WO2014150822A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use |
| CN104250640A (zh) * | 2014-08-22 | 2014-12-31 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用 |
| CN111560355A (zh) * | 2015-03-20 | 2020-08-21 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2559384B2 (ja) * | 1985-07-29 | 1996-12-04 | ジ・アップジョン・カンパニ− | ウイルスワクチン |
| US5352575A (en) * | 1985-10-04 | 1994-10-04 | The Upjohn Company | Pseudorabies virus protein |
| US4999296A (en) * | 1986-04-29 | 1991-03-12 | Novagene, Inc. | Thymidine kinase negative insertion mutants of pseudorabies virus and methods for the production of same |
| NL8902087A (nl) * | 1989-08-17 | 1991-03-18 | Stichting Tech Wetenschapp | Niet-natuurlijk voorkomend pseudorabiesvirus en vaccins die dit bevatten. |
| WO1992005263A1 (en) * | 1990-09-25 | 1992-04-02 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Viral defective vaccine produced by transcomplementing cell line |
| ATE288483T1 (de) * | 1992-07-30 | 2005-02-15 | Akzo Nobel Nv | Nicht-verbreitendes lebendes herpesvirusvakzin |
-
1993
- 1993-07-02 TW TW82105279A patent/TW289731B/zh active
- 1993-07-07 ZA ZA934882A patent/ZA934882B/xx unknown
- 1993-07-08 DK DK93916297T patent/DK0654086T3/da active
- 1993-07-08 WO PCT/NL1993/000146 patent/WO1994001573A1/en active IP Right Grant
- 1993-07-08 AU AU45898/93A patent/AU684252B2/en not_active Ceased
- 1993-07-08 US US08/373,325 patent/US5674500A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-08 CA CA 2139507 patent/CA2139507C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-08 PL PL93307049A patent/PL174219B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1993-07-08 KR KR1019950700064A patent/KR100341994B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-07-08 AT AT93916297T patent/ATE189000T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-08 NZ NZ254267A patent/NZ254267A/en unknown
- 1993-07-08 HU HU9500039A patent/HU220099B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-07-08 EP EP19930916297 patent/EP0654086B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-08 JP JP6503188A patent/JPH07509127A/ja active Pending
- 1993-07-08 ES ES93916297T patent/ES2143507T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-08 DE DE1993627656 patent/DE69327656T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-08 RU RU95105518A patent/RU2158308C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-07-09 CN CN93108005A patent/CN1124159C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69327656T2 (de) | 2000-08-03 |
| CN1124159C (zh) | 2003-10-15 |
| WO1994001573A1 (en) | 1994-01-20 |
| ES2143507T3 (es) | 2000-05-16 |
| HU220099B (hu) | 2001-10-28 |
| HU9500039D0 (en) | 1995-03-28 |
| AU4589893A (en) | 1994-01-31 |
| EP0654086A1 (en) | 1995-05-24 |
| EP0654086B1 (en) | 2000-01-19 |
| AU684252B2 (en) | 1997-12-11 |
| ZA934882B (en) | 1994-02-03 |
| US5674500A (en) | 1997-10-07 |
| CN1086143A (zh) | 1994-05-04 |
| CA2139507A1 (en) | 1994-01-20 |
| DK0654086T3 (da) | 2000-06-13 |
| ATE189000T1 (de) | 2000-02-15 |
| RU2158308C2 (ru) | 2000-10-27 |
| HUT70986A (en) | 1995-11-28 |
| DE69327656D1 (de) | 2000-02-24 |
| NZ254267A (en) | 1996-08-27 |
| TW289731B (pl) | 1996-11-01 |
| RU95105518A (ru) | 1997-03-27 |
| CA2139507C (en) | 2005-04-19 |
| KR100341994B1 (ko) | 2002-11-30 |
| JPH07509127A (ja) | 1995-10-12 |
| PL307049A1 (en) | 1995-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL174219B1 (pl) | Szczepionka przeciwko chorobie Aujeszky'ego i innym chorobom zwierząt | |
| JP6845266B2 (ja) | 多価組換型鳥ヘルペスウイルス及び鳥類を免疫化するためのワクチン | |
| Morgan et al. | Protection of chickens from Newcastle and Marek's diseases with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing the Newcastle disease virus fusion protein | |
| RU2305559C2 (ru) | Вакцина свиней против респираторных патологий и патологий репродукции свиней | |
| US5187087A (en) | Recominbant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof | |
| JP2738524B2 (ja) | ウイルスに感染した動物とワクチン接種した動物を区別する方法 | |
| Pensiero et al. | Expression of the Hantaan virus M genome segment by using a vaccinia virus recombinant | |
| KR100746524B1 (ko) | 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터 | |
| JP2703538B2 (ja) | 偽狂犬病ウイルス突然変異体、それを含有するワクチン、その生産法およびその使用法 | |
| FI110060B (fi) | Menetelmä rokotekoostumuksen saamiseksi eläinten rokottamiseksi niiden suojaamiseksi BHV-1-virusta vastaan | |
| ITTO950367A1 (it) | Proteine di prrsv ricombinanti, corredi diagnostici e vaccini contenen ti tali proteine di prrsv ricombinanti. | |
| AU656185B2 (en) | Recombinant avipox virus, the culture of cells infected with this virus and vaccines for poultry derived from this virus | |
| Finberg et al. | Host immune response to reovirus: CTL recognize the major neutralization domain of the viral hemagglutinin. | |
| Loudon et al. | Expression of the outer capsid protein VP5 of two bluetongue viruses, and synthesis of chimeric double-shelled virus-like particles using combinations of recombinant baculoviruses | |
| Peeters et al. | Non-transmissible pseudorabies virus gp50 mutants: a new generation of safe live vaccines | |
| JPH08502043A (ja) | ヘルペスウイルスワクチン | |
| US6241989B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
| EP0606452B1 (en) | Vector vaccines of recombinant feline herpesvirus | |
| Yokoyama et al. | Vaccine efficacy of recombinant feline herpesvirus type 1 expressing immunogenic proteins of feline calicivirus in cats | |
| US7087234B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
| AU738684B2 (en) | Recombinant equine herpesvirus type 1 (EHV-1) comprising a dysfunctional gene 71 region and use thereof as a vaccine | |
| Martinez et al. | Recombinant vesicular stomatitis (Indiana) virus expressing New Jersey and Indiana glycoproteins induces neutralizing antibodies to each serotype in swine, a natural host | |
| WO1997020036A1 (es) | Adenovirus recombinantes que expresan antigenos del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (vgpt) y su empleo en la formulacion de vacunas | |
| WO1998004710A9 (en) | Live recombinant bhv/brsv vaccine | |
| Tirabassi | A mutational analysis of the glycoproteins E and I of pseudorabies virus: Domains involved in trafficking, virulence and direct cell-to-cell spread |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20080708 |