ITTO950367A1 - Proteine di prrsv ricombinanti, corredi diagnostici e vaccini contenen ti tali proteine di prrsv ricombinanti. - Google Patents
Proteine di prrsv ricombinanti, corredi diagnostici e vaccini contenen ti tali proteine di prrsv ricombinanti. Download PDFInfo
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Abstract
Proteine ricombinanti del virus causativo della sindrome porcina riproduttiva e respiratoria (PRRS), corrispondente alle ORF da 2 a 7 dell'isolato spagnolo di PRRSV (PRRS - Olot) sono state prodotte in un sistema di espressione di Baculovirus utilizzando colture di cellule SF9 come un ospite permissivo. Queste proteine ricombinanti sono adatte per la formulazione di vaccini capaci di proteggere efficacemente il bestiame porcino da PRRS e per la preparazione di corredi diagnostici adatti per la rivelazione di anticorpi anti - PRRSV, come pure di PRRSV in un campione biologico di maiale. La presente invenzione è di interesse nella medicina veterinaria.
Description
SCOPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce a proteine virali ricombinanti dell'agente causativo della sindrome porcina riproduttiva e re spiratoria (PRRS) prodotta in un sistema di espressione di baculovi rus ricombinanti moltiplicati in una coltura di cellule ospite permissive. L'invenzione si riferisce pure a corredi diagnostici ed a vaccini che comprendono, almeno, una di dette proteine ricombinanti. PRECEDENTI DELL'INVENZIONE
In Spagna, i primi casi di alterazioni respiratorie in maialini sono stati rilevati in un lotto di 300 maialini importati dalla Germania nella metà gennaio 1991 [Plana ed al., "Med. Vet.", 8, 11, (1991)J. Poco dopo, in due branchi di allevamento in due fattorie situate in vicinanza del branco in cui era comparso il problema iniziale, si è individuata una malattia caratteri zzata da un numero anormalmente elevato di aborti durante l'ultima fase della gestazione, come pure una mortalità del 70% nei maialini.
La causa di queste esplosioni epizootiche non era nota, ma la loro sintomatologia era simile ai segni clinici che erano stati descritti per una malattia dei maiali individuata la prima volta in Europa in Germania (1990). e alla malattia denomi rata "Mystery Swine Oisease" individuata negli Stati Uniti e in Canada nel 1987 [Hill. "Proceedngs of tre Misterv Swine Oisease Commi ttee Meeting", 6 ottobre 1990. Denver, USA]. Questa malattia attacca le scrofe gravide provocando in queste anoressia, aborti, feti nati morti, feti mummificati, maialini deboli che muoiono dopo poche ore di vita, e problemi respiratori dopo il parto, tra gli altri. Attualmente, la malattia è nota come "Sindrome porcina riproduttiva e respiratoria" ( PRRS ) , sebbene sia stata precedentemente indicata come "Aborto azzurro di maiali", "Sindrome riproduttiva misteriosa" (MRS ), "Sindrome di infertilità e respiratoria in maiali" (SIARS) e "Sindrome epidemica di aborto e respiratoria porcina" (PEARS ).
Attualmente, è noto che l’agente causativo di questa malattia è un virus denominato virus PRRS ( PRRSV ) . Questo virus è stato isolato per la prima volta in Olanda da un gruppo di ricercatori del CDI/Lelystad , che lo chiamarono virus Lelystad (.LV) [Wesvoort G. e al., " Vet . Quarterly" , 3, 121-130 (.1991)] , Alcuni mesi più tardi, si è ottenuto un altro isolato in Spagna dai Laboratori Sobrino/Cyanamid [Plana ed al. , "Vet. Microbiol . " , 33, 203-211 ( 1992;] che verrà identif icato in questa descrizione come PRRS-Glot. Da questo momento, nuovi isolati del virus sono stati descritti (Richiesta EP n. 0.529.584 A2 , richieste PCT n. WO 93/06211 e WO 93/07898;.
Le ca ra tte ris tic he strutturali del virus PRR£ sono state descritte in due pubblicazioni recenti: a) Meulenberg J.J.M. ed al., "Virus Leìystad, l’agente causativo della sindrome porcina di aborto epidemico e respiratoria (PEARS) si riferisce a LDV e EAV" . "Virology", 192, 62-72 (1993); e
b) Cozelmann K-K. ed al., "Caratterizzazione molecolare di virus della sindrome porcina riproduttiva e respiratoria, un termine del gruppo di Ar terivi rus" . "Virology", 193, 329-339 (1993).
Il virus PRRS ha una dimensione di 50-60 nm, con un inviluppo di approssimativamente 30-35 nm contenuto nel nucleocapside , e una singola molecola di RNA come materiale genomico. In base a questi dati morfologici, PRRSV è stato inizialmente classificato come un Togavirus, sebbene in base alla sua struttura genomica e ai meccanismi di trascrizione e di traslazione esso sia più prossimo alla famiglia dei Coronaviride. Recentemente, in base a differenze e/oppure a similitudini in confronto con i gruppi precedenti, è stata proposta la sua classificazione in una nuova famiglia denominata Ar terivirid&3⁄4 [Cavanagh 0. ed al., "Arch. Virology", (1994)]. Insieme con PRRSV, in questo gruppo sono inclusi i virus della arterite equina (EAV). il virus della de idrogenasi lattica (LDV ) e il virus della febbre emorragica di scimmia <SHFV ).
Recentemente, tutto il genoma del virus Lelystad (LV) (Meulenberg ed al., citato sopra), un segmento genomico dell'isolato del virus PRRS di Tubingen (Germania) (TV) (Cozelmann ed al., citati sopra), e un segmento del virus PRRS-Olot (Rivendicazione di brevetto spagnolo n. ES P9301973) sono stati clonati e sequenziati . In base a tutti i risultati ottenuti, si può stabilire che il genoma PRRSV è formato da una molecola di RNA a filamento singolo che contiene alla estremità 3’ una coda poli-A. La lunghezza del genoma è di approssimativamente 15.000 coppie di basi (bp) e nella sua struttura contiene sette fasi di lettura aperte (ORF) codificanti per le proteine virali. Le ORF sono state denominate come da 0RF1 a 0RF7 e esse presentano piccoli segmenti sovrapposti tra loro. Si è proposto che la sintesi delle proteine virali sia prodotta da un gruppo di trascritti subgenomici di differente lunghezza (mRNA ), ma di simile estremità 3’ poi iadeni lata . e di sequenza leader 5’ originante dalla sequenza terminale 5’ non codificante. Questa forma di espressione di proteina vi rale è stata denominata mRNA annidati ed è stata descritta precedentemente per i coronavìrus [Spaan W.J.M.. Cavanagh D., e Horzineck M.C., <">J. Gen. Virol.<" >, 19 , 293^-2952 (1988)]. In base alla sequenza di nucleotidi di isolato virale di PRRSV di Lelystad (LV ) e di Tubingen (TV) e per omologia con quanto e stato osservato con altri arterivirus, si è proposto che nel genoma virale , 0RF1 (a e b) codifichi per la polimerasi e replicasi virale . Le ORF da 2 a 6 codi f iche rebbe ro per le proteine dell’inviluppo virale, e la 0RF7 codificherebbe per la proteina del nucleocapside . La replicasi e la polimerasi virale sono proteine di grandi dimensioni, 260 e 163 kDa , rispettivamente, ed entrambe contengono tre siti di gl icosilaz ione possibili. Le proteine di inviluppo (ORF da 2 a 6) disposte alla estremità 3’ sono piccole, tra 30 e 19 kDa. Tutte queste contengono più di due siti di glicosi laz ione possibili, specialmente la 0RF3 che contiene 7 siti. Tutte queste proteine contengono sequenze idrofobe .3⁄4lle estremità terminali ammino (N-) e carbossi (C-) che possono funzionare come sequenza leader e ancora della membrana.
Generalmente , esse sono proteine idrofobe, in accordo con la loro posizione associata ad una membrana. Dovrebbe essere messo in evidenza la 0RF6 con tre segmenti idrofobi disposti entro i 90 residui di amminoacidi alla estremità N-terminale. D’altra parte, la proteina codificata da 0RF7, corrispondente possibilmente al nucleocapside virale, è estremamente basica con residui di arginina. lisina e istidina alla estremità N-terminale. Sequenze di amminoacido di polimerasi virali LV e TV, proteine strutturali e nucleocapside presentano una identità tra il 29% e il 67% in confronto con il virus LDV e tra 20% e 36% in confronto con il virus EA V . Ciò fa pensare che l’evoluzione del virus PRRS sia più prossima a LDV che a EAV
La malattia provocata da PRRSV è responsabile per gravi perdite nell’industria dell’allevamento dei maiali. Per questa ragione, sono stati sviluppati vaccini in grado di prevenire l’infezione provocata da PRRSV.
In generale, i vaccini contro il PRRSV noto, descritto nelle rivendicazioni di brevetto WO 92/21375, WO 93/06211, WO 93/07898 e ES P9301973, sono vaccini ottenuti da virus cresciuti su macrofagi e successivamente inattivati. La domanda di brevetto ES P9301Q73 provvede un vaccino in grado di evitare la sindrome riproduttiva crespi ratoria porcina {PRRS ). Si e dimostrato che il vaccino e efficace ne 11 'evi ta re alterazioni della riproduzione in scrofe, quali il parto di feti morti, ma ialini mummificati o viventi ma deboli, ripetizione dell’estro e simili problemi prodotti dal virus causativo della PRRS. Analogamente, si è verificato che il vaccino provoca una immunità cellulare negli animali vaccinati. Detto vaccino contiene una quantità adatta di antigene virale di PRRS, ceppo spagnolo (PRRS-Dlot), inattivato, insieme con un coadiuvante ed un preservativo.
La presente invenzione provvede un vaccino della seconda generazione in cui si è impiegata la tecnologia del DNA ricombinante allo scopo di ottenere nuovi vaccini in grado di proteggere efficacemente contro l’infezione provocata da PRRSV. I vaccini secondo la presente invenzione contengono, almeno, una proteina di PRRSV ricombinante. D’altra parte, la presente invenzione provvede nuovi sistemi o corredi diagnostici del PRRSV che comportano l ’impiego di tecniche di saggio immunologico enzimatico (ELISA) le quali utilizzano proteine di PRRSV ricombinante. Questi vaccini ricombinanti non richiedono una manipolazione del virus completo, ma viceversa di soltanto parte di questo, eliminando il pericolo di un incidente che libererebbe il virus, rappresentando un notevole vantaggio rispetto ai presenti vaccini di PRRSV inattivati. Questi nuovi vaccini ricombinanti non richiedono una manipolazione del virus completo, ma piuttosto di soltanto una parte di questo, eliminando il pericolo di un incidente che libererebbe il virus, il che rappresenta un considerevole vantaggio rispetto ai presenti vaccini di PRRSV inattivati .
La produzione di proteine ricombinanti mediante Ingegneria Genetica e un fatto che è stato descritto precedentemente. Sono noti numerosi sistemi di espressione e di produzione di proteine ricombinanti. Uno dei sistemi più efficaci per la produzione su larga scala di proteine ricombinanti si basa sulla replicazione di baculovirus ricombinanti , derivati dal virus della poliedrosi nucleari di Autographa californica (AcNPV), in cellule d’insetto in coltura. La descrizione della tecnica di espressione del baculovirus viene descritta negli articoli seguenti: a) LuKow, V.A. e Summers M.D., "Tendenze nello sviluppo di vettori di espressione di baculovi rus", "Bio/Technology" , 6, 47-55 (1988): e
b) Bishop D.H.L., "Vettori di espressione di baculovirus" . Seminari in "Vi rology " , ( 1Q92
La presente invenzione provvede proteine ricombinanti di PRRSVj in particolare dell’ isolato PRRS-Olot, prodotte in un sistema di espressione di baculovirus moltiplicati su una coltura permissiva di cellule ospite. I baculovirus ricombinanti in grado di produrre tali proteine ricombinanti, come pure i vettori di trasf erimento utilizzati, costituiscono obiettivi addizionali dell’invenzione. I procedimenti per l’ottenimento di tali baculovirus ricombinanti e proteine è pure uno scopo della presente invenzione.
L’invenzione provvede anche nuovi vaccini per la vaccinazione di maiali per la loro protezione contro infezione provocata da PRRSV, comprendenti , almeno, una proteina ricombinante di quelle provviste dalla presente invenzione e un adeguato veicolo o coadiuvante .
L’invenzione provvede pure un corredo diagnostico per rilevare la presenza di anticorpi che riconoscono specificamente PRRSV in un campione biologico da maiali (ad esempio: sangue, siero, espettorato, saliva o latte). Il corredo comprende almeno una proteina ricombinante di quelle provviste dalia presente invenzione e adeguati metodi di rivelazione.
L'invenzione provvede pure un corredo diagnostico per la rilevazione della presenza di antigene (PPRSVj in un campione biologico da maiali (ad esempio: sangue, siero, espettorato, saliva, latte o tessuto,). Il corredo comprende almeno un anticorpo che riconosce specificamente il PRRSV ottenuto immunizzando animali con, almeno, una proteina ricombinante di quelle provviste dalla presente invenzione e un adeguato mezzo di rivelazione.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
La figura 1 illustra la sequenza consecutiva delle 3383 bp clonate dall’isolato di PRRS-Olot;
la figura 2 illustra la sequenza di amminoacidi co r r i spo nden te alle proteine codificate da OR F 2 (figura 2A), 0RF3 (figura 28), 0RF4 (figura 20), 0RF5 (figura 2D) , GRF6 (figura 2E) e 0RF7 (figura 2F);
la figura 3 illustra la differente estensione dei Cloni pPRRS-8, pPRRS-108, pPRRS-121, pPRRS-132, pPRRS-146, pPRRS - 147 , pPRRS -148, pPRRS-153 e pPRRS-3, in confronto con LV, come pure le ORF contenute in ognuno di questi. In questa figura, si fa riferimento al genoma di PRRSV (a), alla dimensione in Kb (b) e al numero del clone (c);
la figura 4 illustra il clone di pPRRS-3 contenente il gene della proteina codificata da QRF2; la figura 5 illustra il clone pPRRS- 12 l con tenente il gene della proteina codi ficata da GRF3 ;
la figura 6 illustra il clone pPRRS- 14t contenente il gene della proteina codificata da 0RF4;
la figura 7 illustra il clone pPRRS-132 contenente il gene della proteina codificata da 0RF5;
la figura 8 illustra il clone pPRRS-8 contenente i geni delle proteine codificate da DRF6 e 0RF7;
la figura 9 illustra i risultati dalla titolazione di antigene mediante ELISA (assorbanza monitorata a 405 nm ). La figura 9 illustra i risultati della titolazione di antigene mediante ELISA. Nella figura si fa riferimento alla titolazione del 1 ’an tigene (a), ai valori di assorbanza letti a 405 nm (b), e alle diluizioni di antigene (in unità di 1/ (c) ;
la figura 10 illustra i risultati dalla titolazione, mediante ELISA, di un siero di campo di PRRS ottenuto in un animale infetto. La figura fa riferimento alla titolazione del siero (a), ai valori di assorbanza letti a 405 nm (b), e alle diluizioni del siero (in unità di 1/ ) (c);
la figura 11 illustra i risultati ottenuti da un esperimento di campionamento con parecchie dozzine di sieri di campo. La f igura fa riferimento alla titolazione dei sieri (a), ai valori di assorbenza letti a 405 nm (b), e ai sieri (c).
DESCRIZ IONE DELL’INVENZIONE
Il nostro laboratorio ha effettuato una ricerca sull’agente causativo della PRRS negli anni recenti. La conseguenza principale di questft è stato l'isolamento del virus denominato PRRS-CY-JPD-P5-6-91 . Questo è stato depositato presso la ECACC (con numero di accessione V93070108) e è stato sviluppato un vaccino contro il PRRSV contenente il virus inattivato (domanda di brevetto ES P9301973).
Successivamente, i nostri sforzi di ricerca si sono rivolti all'isolamento e alla clonazione del genoma di PRRSV (PRRS-CY- JPD-P5-6-91 ), denominato in questa descrizione PRRS-Olot, allo scopo di permettere lo sviluppo di nuovi vaccini ricombinanti efficaci contro l’infezione provocata dal PRRSV. A tal fine, é stato clonato un segmento di genoma del detto genoma PRRS-Olot. Il frammento clonato corrisponde alla estremità 3’ del genoma virale, e rappresenta una sequenza consecutiva di 3338 pb . Questo segmento contiene le sei fasi di lettura aperte corrispondenti a ORF da 2 a 7 descritte per LV e TV. Queste codificano per le proteine strutturali del virus (nucleo capside e inviluppo) eventualmente coinvolte nella antigenicita immu noge nic ita virale. Le proteine codificate dalle QRF da 2 a 7 del PRR5-0ÌGÌ: sono simili alle corrispondenti proteine dei virus Lv e TV. Le loro caratterìstiche vengono riassunte nella tabella 1, in cui vengono indicati, in relazione con ogni ORF, le porzioni relative dei nucleotidi, il numero di coppie di basi (bp), il numero di amminoacidi (Aac), il peso molecolare di ogni proteina (in KDa) e i siti di glicosilazione.
Tabella 1
Caratteristiche délls ORF del vi rus PRRS-Olot
La figura 1, che accompagna questa descrizione, illustra la sequenza consecutiva completa delle 3383 bp del frammento clonato corrispondente alla estremità 3’ del genoma virale di PRRS-Olot. Questa sequenza di nucleotidi dimostra il 95% di omologia in confronto con le 'corrispondenti sequenze degli isolati di LV e TV. Questi due ultimi isolati dimostrato, tra loro, una omologia del 99%. I cambiamenti nella sequenza di nucleotidi dell’isolato di PRRS-Glot vengono riscontrati lungo tutta la sequenza, ma risultano concentrati specialmente nella estremità 5’. Si dovrebbe mettere in evidenza, in confronto con LV, la delezione di tre nucleotidi nella posizione 1860 di PRRS-Olot.
La figura 2 (da 2A a 2F) di questa descrizione illustra le sequenze di amminoacidi delle proteine codificate dalle ORF da 2 a 7 del virus PRRS-Olot. A livello della proteina, si osserva una omologia del 99% tra la 0RF7 del PRRS-Olot e del LV, come previsto per una proteina virale del nucleocapside e perciò più conservata. La percentuale di omologia per il resto delle proteine varia da 93% per le 0RF3, 4 e 5, raggiungendo valori di 96,5% per le 0RF2 e 6. Tutte queste presentano siti di gl icosi Iasione simili a quelli descritti per LV eccetto per la 0RF4 del virus PRRS-Olot, che ha un sito di gl icosi laz ione extra. Per quanto riguarda i suddetti cambiamenti degli amminoacidi della proteina di PRRS-Olot, il 50% dei cambiamenti sono in amminoacidi chimicamente simili, mentre il resto dei cambiamenti sono in amminoacidi differenti. Come detto per LV, eccettuata la 0RF7, il resto delle proteine presentano un elevato grado di id rof obici ta , eventualmente in accordo con la loro associazione su membrane, poiché esse sono proteine dell’inviluppo virale.
Proteine ricombinanti corrispondenti alla espressione delle ORF da 2 a 7 dì PRSS-Olot possono essere prodotte in un sistema di espressione adatto e, vantaggiosamente, in un sistema di espressione di baculovirus ricombinanti moltiplicati in una coltura di cellule ospite permissive. Il procedimento globale per l’ottenimento di queste proteine ricombinanti comprende fondamentalmente le seguenti fasi generali: X. Preparazione della sequenza di cDNA da inserire in un baculovirus; e
II. Ottenimento di baculovirus ricombinanti che esprimono le proteine ricombinanti.
Queste fasi generali sono a loro volta suddivise in altre sottofasi. In questo modo, la preparazione della sequenza di cDNA da inserire comprende le sottofasi di:
I .a Isolamento e pu rificazione del virus di PRRS-Olot;
I.b Isolamento del RNA virale del virus PRRS-Olot; e I .c Sintesi del cDNA dal RNA genomico di PRRS-Olot.
D’altra parte, l’ottenimento di baculovirus ricombinanti che esprimono le proteine ricomoinanti corrispondenti alle ORF da 2 a 7 di PRP.;-01ot , comprende le sottofasi di:
II.a Preparazione del gene della ORF di PRRS-Olot da inse rire;
II. b Inserimento del detto gene in un vettore di trasferimento di baculovirus:;
II.c Transfezione di cellule ospite permissive con il detto vettore di trasferimento che porta inserito il cor rispondente gene della ORF di PRRS-Olot;
Il.d Selezione dei baculovirus ricombinanti che esprimono la proteina ricombinante corrispondente alla ORF inserita.
Vengono quindi effettuate la caratterizzazione dei baculovirus ricombinanti e l’analisi e la purif icazione delle proteine ricombinanti.
Tutte queste fasi vengono descritte in dettaglio ulteriormente in seguito in questa descrizione.
Il procedimento utilizzato per l’ottenimento delle proteine ricombinanti provviste dalla presente invenzione inizia con l’isolamento a la purificazione del PRRSV,specificamente il PRRS-Olot, in accordo con il protocollo descritto nell’esempio 1. Una volta che il PRRS-Olot è stato isolato e purificato, il RNA virale viene isolato e per tale scopo si utilizza un corredo commerciale ( Pharmacia J , che utilizza un metodo basato sulla selezione e la purificazione del RNA virale contenente una sequenza p o 1 i - ( A j all’estremità 5' (esempio 2). Il RNA ottenuto viene analizzato in gel di agarosio neutri a 0,7% mediante colorazione con bromuro di etidio, e si osserva soltanto una banda di materiale con peso molecolare tra 5000 e 23000 bp .
Successivamente, viene sintetizzato il cDNA co rrispo nden te alla estremità 3’ del RNA virale (esempio 3), con un corredo commerciale (Boehringer), mediante una strategia che sfrutta la presenza di una coda poli(A) e utilizza un oligo d(T) come primer di estensione capace di essere esteso con enzima di transcriptasi inversa e sintetizza molecole di cDNA . Per clonare le regioni del RNA a monte dell’estremità 3’, si utilizza un oligonucleotide riassociato ad una sequenza di genoma virale specifico disposto approssimativamente a 2500 bp dall’estremità 3’. Viene effettuata una seconda sintesi utilizzando un ol igonucleotide di 20 nucleotidi invece dell’oligo d(T)i2 (esempio 3.1). La sintesi di cDNA viene verificata e quantificata mediante conteggio della radioattività incorporata nel materiale sintetizzato e mediante elettroforesi in gel di agarosio alcalini e neu t ri . Dopo ciò , vengono ef f e t tua te la clonaz ione e i l sequenz iamen to de l cDNA t, esempio 3.2 ) . A tal f i ne , la pr ima cosa fatta e una selezione per dimensioni dei frammenti di cDNA sintetizzato tra 1000 e 5000 nt (nucleotidi ). Il cDNA purificato viene clonato in estremità smussate nel vettore pMTL25. L’analisi dei cloni PRRSV-positivi viene effettuata mediante preparazioni di DNA del plasmide e mappatura dei siti di restrizione, in base alla sequenza di LV. Soltanto 9 sui 300 pìasmidi analizzati risultano positivi e contengono inserti tra 800 e 2600 bp . La verifica definitiva della autenticità di questi cloni di cDNA viene effettuata mediante loro sequenziamento diretto, usando il metodo dideossi applicato ai pìasmidi a doppio filamento.
La maggior parte dei cloni di PRRS positivi ottenuti contiene un’estremità poli(A) comune e differenti estremità 5’. I cloni sono stati denominati ppRRS-8, pPRRS-108, PPRRS-12l, pPRRS-132, PRRS-146, pPRRS- 147 , pPRRS-148 e pPRRS-153. Il clone PPRRS-3 viene estratto dalla seconda sintesi. Per ottenere i baculovirus ricombinanti che esprimono i geni delle proteine codificate dalle 0RF da 2 a 7 di pRRSV-Olot, viene seguito in generale e separatamente i l seguente procedimento . Dapprima , viene preparato i l gene da ogni ORF da inserire, eccettuato il gene della GRF3 che non richiede una preparazione preliminare. Per la preparazione di questi geni e a seconda di ogni caso particolare, vengono impiegati i plasmidi pMTL25, ρΓΊΤΙ_24 e pMTL22 prima di essere trasferiti nei vettori di trasferimento di baculovirus. I geni corrispondenti alle ORF da 2 a 7 vengono ottenuti dai cloni che sono stati ottenuti precedentemente . Dopo successive manipolazioni, questi o riginano nuovi plasmidi ricombinanti. I plasmidi ricombinanti, che contengono i geni corrispondenti ad ogni ORF inserita, vengono purificati seguendo la tecnica della lisi alcalina e vengono caratterizzati mediante mappatu ra con endonucleasi di restrizione e sequenziamento delle regioni di inserimento . I nuovi vettori ottenuti vengono denominati pPRRS-ORFN, in cui N rappresenta il numero di ogni ORF (N = da 2 a 7 ) .
Successivamente, ogni gene di ogni ORF viene clonato in un adatto vettore di trasferimento. Il vettore di trasfe ri mento impiegato è pAcYMl [Matsuura ed al . , "J . Gen . Vi rol . " , 68 , 1233-50 J . Dopo successive manipolaz ionim vengono originati nuovi plasmidi ricombinanti, ognuno di questi contenendo il gene di ORF inserita. I plasmidi ricombinanti ottenuti vengono pu rif icati seguendo le tecniche di lisi alcalina e mediante mappatura con endonucleasi di restrizione. Le estremità dell’inserto vengono seque oziate allo scopo di verificar' e la cori'atta sequenza della regione di inserimento. I nuovi vettori di trasferimento ottenuti vengono analizzati per verificare che i geni inseriti abbiano il orientamento per la loro espressione mediante il promotore della poliedrina del virus AcNPV. I vettori di trasferimento ottenuti sono:
Cellule di Spodopte ra_ fruqiperda . clone Sf9, vengono quindi transfettate con miscele di DNA infetto purificato del virus parenterale AcRP23-lacZ e il corrispondente vettore di trasferimento. Dopo che è stata fatta questa t ransf ez ione , i baculovirus ricombinanti vengono identif icati mediante saggio del f enotipo di colore di placca dopo la colorazione del la progenie virale con X-gal, e quindi purificati.
I baculovirus ricombinanti ottenuti vengono depositati presso la "European C-ollection of Animai Celi Culture" (ECACC), Porton Down, Salisbury , Whi ltshi re SP4 OJG (G.B.).
Gli esempi da 4 a 9 descrivono in dettaglio l’ottenimento di baculovirus ricombinanti che esprimono i geni codificati dalle ORF da 2 a 7, rispettivamente .
Le proteine ricombinanti delle ORF da 2 a 7 di PRRS-Olot possono essere impiegate per scopi di diagnosi allo scopo di rilevare la presenza di antìcorpi specifici di PRRSV (esempio 12) e per rilevare la presenza di antigene (PRRSV) mediante anticorpi che identificano specificamente il PRRSV ottenuto mediante immunizzazione di animali con, almeno, una proteina ricombinante corr ispondente ad una delle ORF da 2 a 7 di PRRS-Olot. Inoltre, queste proteine possono anche essere impiegate per immunizzare animali contro il PRRSV. Perciò, dette proteine possono essere impiegate per formulare vaccini ricombinanti capaci di proteggere ef f icacemente i maiali contro infezioni provocate dal PRRSV. Questi vaccini possono essere attivi o passivi. Vaccini attivi possono essere preparati sospendendo almeno una del l e protei ne rìcombinanti provviste dal la presen te invenz ione i n un di luente immunologicamente accettabi le e un coadiuvante . Un vacci no passivo può esse re o t tenu to immunizzando animali con le dette proteine e isolando gli anticorpi policlonali contro dette proteine. Dopo isolamento e purificazione dell anticorpo , questi possono essere impiegati in applicazioni di vaccino. In una realizzazione specifica della presente invenzione, vaccini ricombinanti vengono ottenuti in grado di proteggere efficacemente dalla infezione provocata dal PRRS , comprendenti l’antigene virale (fase antigenica.), insieme con un diluente immunologicamente accettabile e un coadiuvante.
Per la preparazione della fase antigenica, cellule di insetti - preferibilmente cellule di Spodoptera fruqjperda - vengono infettate con i diversi baculovirs ricombinanti capaci di produrre le proteine ricombinanti corrispondenti alle ORF da 2 a 7 di PRRSV e incubate in condizioni adatte per l’espressione delle dette proteine. Immediatamente dopo, le cellule vengono raccolte, lavate, risospese in un tampone adatto e quindi impiegate nella preparazione dei suddetti vaccini ricombinanti.
In una realizzazione specifica, l a base antigenica è composta da un omogenato di cellule di insetti infettate con baculovirus ricombinanti che esprimono una singola proteina di PP.RSV ricombinante, quale, preferibilmente, QRF3, 0RF5 e 0RF7 (.esempio 13). In un’altra reai izza; ione specifica, la fase antigenica e composta da un omogenato di una miscela di cellule di insetti infettate con differenti baculovirus ricombinanti esprimenti, ognuno di questi, una differente proteina di PRRSV ricombinante, quale una miscela di cellule di insetti infettate con i baculovirus ricombinanti esprimenti, per esempio, le proteine corrispondenti a 0RF3, 0RF5 e 0RF7 .
In generale, vengono formulati i vaccini contenenti come fase antigenica una quantità di circa 50xl0c cellule di insetti infettate con baculovirus esprimenti la proteina ricombinante in questione. Quando il vaccino contiene diverse proteine ricombinanti, la fase antigenica è composta da una quantità di circa 5o x10<6 >cellule di insetti infettate con baculovirus per la proteina ricombinante in questione, cioè per una formulazione di un vaccino contenente le proteine corrispondenti alle GRF3, 5 e 7, la fase antigenica è composta da circa 50 x 10^' cellule di insetti infettate con baculovirus che esprimono la proteina ricombinante di 0RF3, 50 x IO6 cellule di insetti infettate con baculcvirus che esprimono la proteina ricombinante di 0P,FS, e 50 x IO6 cellule di insetti infettate con baculcvirus che esprimono la proteina di 0RF7 ricombinante (esempio 13) .
Come diluenti immunologicamente accettabili, è possibile impiegare soluzioni saline tamponate con fosfato (PBS) od altre soluzioni saline simili.
Come coadiuvante, in generale si può impiegare uno qualsiasi dei coadiuvanti abitualmente impiegati per formulare vaccini, sìa acquosi, quali idrossido dì alluminio, sospensione di gel di allumina. Qui1A od altri, sia coadiuvanti oleosi, basati su olii minerali, gliceridi ed altri derivati di etere-acido, In particolare, è stato confermato che un coadiuvante oleoso composto da una miscela di ftacrolR 52, SimusolR 5100 e Ma n ta n id eR 8RB, fornisce ottimi risultati. Il MarcolR 52 è un olio minerale a bassa densità prodotto da Esso Espanda S.A. , SimulsolR 5100 è un polietossi — etere - oleato commercial izzato da SEPIC e MontanideR 888 è un anidromanni toloo t tadece noa to — - etere di elevata purezza commercializzato da SEPIUC.
I vaccini della presente invenzione possono anche contenere sostanze potenziatrici di risposta della cellula fCRP>, cioè sostanze che potenziano le subpopolazioni di cellule heìper T (Th^ e Th^), quali IL-l interleuchina-1 ), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN (gamma-interferone) , fattore di necrosi della cellula e sostanze simili che potrebbero in teoriz\ provocare una immunità della cellula negli animali vaccinati. Queste sostanze CRP potrebbero essere impiegate in formulazioni di vaccino con coadiuvanti acquosi come anche oleosi.
Analogamente, si possono impiegare altri tipi di coadiuvanti che modulano e immunostimolano la cellula, quali MDP (muram il-dipe ptide ), ISCOM (complesso immuno-stimolante) o liposomi.
I vaccini della presente invenzione possono essere ottenuti sospendendo o mescolando una fase antigenica con il diluente i mmunologicamente accettabile e con il coadiuvante. Quando il coadiuvante è oleoso, viene formata una emulsione che - in un caso specifico e preferito - se il coadiuvante è una miscela di Marcol 52, Simulsol 5100 e Montanide 888, il vaccino sarà un’emulsione doppia acqua/olio/ acqua, tipo acqua/olio/acqua.
Nel caso che il vaccino contenga sostanze CRP, queste sostanze possono essere aggiunte sia alla fase antigenica, sia al coadiuvante. In alternativa, se il vaccino non contiene alcuna sostanza CRP. queste possono essere iniettate , se desiderato , simultaneamente in un sito separato differente dal sito di inoculazione.
Inoltre, questi vaccini possono contenere combinazioni di differenti patogeni porcini contenenti, oltre ad una o più proteina di PRRSV ricombinante , uno o piu dei patogeni citati in seguito , permettendo la preparazione di vaccini polivalenti. Tra questi patogeni, senza essere esclusivamente limitati a questi, vi sono Ac tinobacillus pleu rop neumo niae., Haemophilus paras u is , Po rc.ine_ p a rvov i rus , Leptospi ra , Escherichia coli , E rys.ìpeloi_thrix__ rhusiopathiae , Pasteurella multicida , 6o rde tella _ b ronehiseptica , porcine respiiratorv coronavi rus , Rotavi rus, o contro patogeni causativi della malattia di Aujeszky, influenza suina e la gastroenteri te trasmissibile.
Prove di sicurezza ed efficacia con i vaccini secondo la presente invenzione hanno messo in evidenza che detti vaccini sono sicuri e nello stesso tempo eff icaci .
E ’ stato possibile confermare che una dose di 2 mi di una quantità di antigene virale o di fase antigenica uguale o superiore a 50x10° cellule di insetti infette, esprimenti uno. o più delle proteine di PRRSV ricombinante, somministrati mediante una via intramuscolare profonda seguita da una r ìvacci naz ione con una dose di 2 mi di vaccino , può proteggere efficacemente gli animali vaccinati dalle infezioni provocate dal PRRSV. Analogamente, è stato possibile verificare che alcuni dei vaccini oggetto della prova - qui identificati come rPRRS C e rPRRS 0 - sono in grado di indurre una immunità cellulare negli animali vaccinati, in base al fatto che scrofe vaccinate e rivaccinate con detti vaccini non presentano risposta sierologica al momento della prova e , tuttavia , risultano protette (esempio 14, tabelle 4 e 10).
Allo scopo di determinare e valutare l’efficacia dei vaccini ricombinanti preparati nella prevenzione della PRRS in scrofe gravide, è stata progettata una prova che consiste nella vaccinazione di scrofe gravide con i differenti vaccini e sottoporre quindi queste ad una prova di scarica con virus virulento. In base ai risultati ottenuti , è stato possibile valutare l ’efficacia dei vaccini scopo di questa prova. Allo scopo di valutare l’efficacia di questi vaccini , sono stati presi in considerazione (esempio 14) i risultati di riproduzione, il numero sia di maialini vivi che morti a differenti stadi della vita del maialino, come anche l'analisi dei risultati sierologici nelle scrofe e nei maialini (esempio 14).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL1INVENZIONE (ESEMPI! Esempio 1. - Ottenimento e purificazione del virus PRRS-Olot
1.1. Ottenimento di macrofagi alveolari di polmone di maiale.
1.1.1. Animali- Vengono impiegati maiali dell’età di 7-S settimane provenienti da un incrocio tra razze Belgium Landrace e Large White. Gli animali, da nostre proprie fattorie, sono sieronegativi alle seguenti malattie: Aujeszky, parvovirosi porcina, afta epizootica , febbre suina classica, influenza suina (tipi H1N1 ε H3N2) e gastroenterite trasmissibile.
1.1.2. Isolamento di macrofagi. Gli animali vengono anestetizzati iniettando nella vena giugulare 0,1 g di tiopental di sodio per ogni 10 kg di peso corporeo. Quindi, questi vengono uccisi e i polmoni vengono estratti, dopo aver legato la trachea al di sotto della epiglottide e sezionamento al di sopra del legamento. I polmoni estratti vengono lavati esternamente con PBS. Successivi lavaggi interni vengono effettuati (da 4 a 5) con un totale di 500 mi di PBS integrato con antibiotici a 1:500 (soluzione PEG: ÌOOO IU/ml penicillina, 1 mg/ml streptomicina e 0,5 mg/mi gent amici na), allo scopo ai ottenere macrofagi. Questi lavaggi vengono raccolti insieme e centrifugati a 3000 g per 15 minuti. La fase seguente è di lavare le cellule due volte con P&S mediante centrif ugazione/sedimentazione consecutiva, per risospendere infine in mezzo DMEM (DMEM integrato con amminoacidi non essenziali a 100 x, GIBCGj, contenente piruvato di sodio IrnM e antibiotici (1:1000 di PEG). Le cellule vengono contate mediante colorazione con blu tripano in camera di Newbauer. 0,1 mi di sospensione di 10”^ macrofagi vengono aggiunti a 0,4 mi dì DMEM e 0,5 mi di soluzione di blu tripano. Nella maggior parte dei casi il numero di cellule ottenute vana tra 1 e 1,2x10'.
Vengono effettuati controlli di sterilità sulle cellule di macrofago per mezzo di insemenzamenti in mezzi di coltura adatti per la rivelazione di batteri e di funghi. L’assenza di micopiasma viene verificata mediante rivelazione citochimica con DAPI (4’, 6- diamm idin 0~ 2 - feni1indo1o ) che si fissa selettivamente sul DNA e forma complessi fluorescenti DNA-DAPI di elevata specificità.
1.2. Replicazione del virus in macrofagi alveolari di maiale. Vengono utilizzate fiale di coltura di cellule (150 cm ) contenenti 100 mi di una sospensione di macrofagi (3 x 106 cellule/ml) nel mezzo DMEM descritto sopra, eccetto che per l'aggiunta di siero bovino fetale (Ftii al 5%. Le cellule '/erigono infettate con virus -3⁄4RS-01ot, isolate dal Laboratorio Sobrino e denominate PRRS-JPD-P5-6-91 (ECACC, numero dì accessione V9307CI08). L’infezione viene eseguita ad una molteplicità ci infezione di lo’**', e le cellule infette vengono incutete a 37°C per 24 ore. Dopo che e trascorso questo periodo, il mezzo viene estratto e sostituito da DMEM fresco contenente 2% di PCS e antibiotici; l’incubazione viene proseguita a 37,'C-Le colture vengono osservate periodicamente con microscopio per determinare l’effetto citopatico (CPE) prodotto dal virus sui macrofagi, in generale, il CPE ai giorni 3-4 di infezione è 70-80%. Compaiono cellule deformate giganti. Normalmente, il titolo di queste preparazioni è 106·^ TCID5o/ml (dose infettiva di coltura di tessuto 50 per millilitro). I macrofagi infettati a molteplicità di IO-4 producono rese virali di un ordine di grandezza inferiore. La presenza di virus in queste cellule è stata determinata mediante il saggio di immunoperossidasi a monostrato su cellule di macrofago di maiale ottenute come descritto nell’esempio 1 (1.1.2). In breve, ciò viene fatto nel modo seguente: in una piastra per titolazione a 96> pozzetti, 100 JJ1 di macrofagi vengono infettati con 50 1 di virus PRRS-Olot replicato su macrofagi. Le piastre vengono incubate per 48 ore a 37"C. Dopo che e stata completata l ’incubaz ione , il mezzo viene estratto e le piastre vengono lavate due volte con soluzione salina (NaCl 0,1M). Successivamente, queste vengono fissate con formaldeide al 20% dopo incubazioni successive a 37UC, -30“C e formaldeide al 20%. Dopo lavaggio due volte con soluzione salina, si aggiungono 50 μΐ di una diluzione 1:50 di un siero anti-PRRS da un animale esposto a stimolo antigenico. Vengono eseguite incubazioni simultanee con un siero negativo da un animale non infetto. L’incubazione è effettuata per 1 ora a 3,7 * 0. Dopo estrazione della soluzione precedente, queste vengono lavate due volte con soluzione salina. Immediatamente, si aggiungono 0,1 /ug di proteina A (Sigma) in 50 >ul e si incuba a 37eC per 1 ora. Il saggio viene sviluppato con AEC (.3-ammino-9-etil-carbazolo) sciolto in dimetilformammìde in presenza di tampone acetato e di acqua ossigenata. Dopo 15-30 minuti a temperatura ambiente al buio, le piastre vengono osservate al microscopio. Le cellule infette appaiono colorate in rosso scuro, in confronto con le cellule non infette che risultano incolori.
1.3. Purificazione del virus PRRS. Il virus viene purificato da colture di cellule infette con PRRSV. La coltura viene chiarificata mediante centrifugazione (20 minuti, 6500 g). Il supernatante viene concentrato 10x impiegando un sistema di ultrafiltrazione Mi llipore-Mini tan (4,5 pSi. filtro con dimensione dei pori di 300 kDa ). Successivamente, il virus viene sedimentato mediante centrifugazione (5 ore, 20.000 g). Il supernatante viene scartato e il crecipitato viene solubilizzato con PBS contenente fluoruro di fenilmetilsolfonile 1 mrt(PMSF ) (Sigma) a 4 C, per una notte . Il virus viene purificato in gradiente discontinuo di saccarosio (20-50% peso/volume in PBS) mediante centrifugazione a 95.000 g per 3 ore . Completata la centrifugazione, la banda contenente il virus viene estratta dal gradiente , diluita con tampone Tris-EDTA e infine centrifugata per una notte a 26.000 g per la sedimentazione del virus.
Il virus purificato viene analizzato mediante elettro† oresi in gel di poliacrilammide- 5DS al 12% Laemmli , U. K . , "Nature” , 227.., 680 ( 1970)] . La proteina totale viene rilevata mediante colorazione con blu coomassie, e immunoblot [Towbin H. , Staehlin T. , e Gordon J. , "Proc. Nati. Acad . Sci. USA", 76, 4350 - 4354 (1979)]. I blot vengono sviluppati con coniugato perossidasi-proteina A (Sigma) impiegando un siero covalescente antì-PRRSV. Non risulta possibile osservare alcuna banda specifica correlata con PRR5V nei gel colorati con coomassie a causa della contaminazione con proteine dai macrofagi. Tuttavia, mediante immunoblot sono state identificate parecchie proteine virali con pesi molecolari tra 15,5 e 30 KDa. Con tempi di sviluppo piu lunghi, è risultato anche possibile osservare bande con pesi molecolari superiori a fcO KDa, ma poiché queste sono pure state rilevate in macrofagi non infetti, si è concluso che queste non erano proteine correlate con il virus PRRS. Esempio 2. - Isolamento del RNA virale
Si impiega un corredo commerciale della Pharmacia p-L 8iochemical. Il metodo si basa sulla selezione e purificazione del RNA virale contenente una coda poliCA) all’estremità 3’. La rottura del capside virale viene effettuata con purificazione mediante cloruro di guanidinio di TNA-poli(A) con una matrice di oligocellulosa (dT).
In breve, l’isolamento del RNA del virus PRRS-Qlot viene effettuate nel modo seguente. il virus purificato sedimenta mediante centrifugazione per una notte a 40.000 g. Successivamente, il supernatante viene scartato e il precipitato viene solubilizzato con 0,4 mi del tampone di estrazione del corredo. Dopo adsorbimento della matrice di cellulosa-d(T), e successivi lavaggi con i tamponi con concentrazione di sale alta e bassa, il RNA-poli(A) viene eluito con concentrazione elevata di NaCl. Il RNA viene precipitato aggiungendo un volume l:10 di acetato di potassio 2,5 M, 0,25 mg/ml di glicogeno e 2 volumi di etanolo (>2 ore a -20°C). Trascorso questa periodo, il RNA viene ricuperato mediante centrifugazione a 16.000 g per 30 minuti. Dopo lavaggio del precipitato con etanolo al 75%, questo viene risospeso in 20 yul di tampone TE (Tris-HCl 10 mM, pH = 8,0 e EDTA 1 mM).
Il RNA ottenuto viene analizzato in gel di agarosio neutri 0,7% mediante colorazione con bromuro di etidio. Si osserva una singola banda di materiale entro un peso molecolare da 5000 a 23.000 bp . L’assenza di materiale a basso peso molecolare deve essere messa in evidenza e perciò la possibilità di DNA o RNA cellulare. Tuttavia, la quantità di materiale ottenute è bassa - non superiore a 100 ng di RNA/250 mi di coltura di macrofago infettata con il virus. Questa bassa resa è in accordo con la bassa resa di virus purificato, come dimostrato mediante elettrof oresi in gel di poliacrilammide e microscopia elettronica (dati non illustrati).
Esempio 3. Sintesi di cDNA dal RNA genomico del virus PRRS-Olat
3.1. Preparazione del cDNA. Viene isolato il c0NA corrispondente al RNA dell’estremità 3' dell’isolato virale PRRS~01ot. La strategia sfrutta la presenza di una coda poli(A) allo scopo di impiegare l’oligo d(T) come primer di estensione che può essere esteso con transcriptasi inversa e può sintetizzare copie di molecole di DNA. Per clonare le regioni di RNA anteriori alla estremità 3’, si impiega un oligonucleotide con una sequenza specifica del genoma virale disposto ad approssimativamente 2500 bp dalla estremità 3’. La sintesi di cDNA viene eseguita impiegando un corredo commerciale (Boehringer). Il procedimento in breve, è : 0,1 /ug di RNA-poli(A) di PRRS, ottenuto come descritto nell’esempio precedente, viene incubato in presenza di dNTP ognuno 1 mM (dATP, dCTP [5-10 /uCi di 32P-C^-dCTP], dGTP e dTTP), 25 unità di inibitore di RNase, 0,8 /jg di oligo dCTl^ - e 40 unità di transcriptasi inversa in un volume finale di 20 ;ol. La reazione viene incubata a 42°C per 1 ora e quindi viene avviata la sintesi del secondo filamento nella stessa provetta. A tal fine, si aggiungono tampone, TNase, e 25 unità di polimerasi di DNA di E.co 1i. L’incubazione viene effettuata per 1 ora a 22 " C e per 10 minuti 3 e> 5 '* C . Infine, per generare estremiti smussate, si aggiungono 4 unita di DNA polimerasi T4. Dopo 10 minuti a 3e>”C, la reazione viene arrestata mediante aggiunta di EDTA e sarcosile. Viene effettuata una seconda sintesi di cDNA nelle stesse condizioni, eccetto per il fatto che si impiega lJol igonucleotide 5 ’CGGGCTCGAGCCTTTGGCGA3 ’ invece di oligo dtT)^ . In entrambi i casi, la miscela viene estratta con fenolo :cloroformio e il materiale viene precipitato con etanolo, come descritto nell’esempio precedente. La sintesi di cDNA viene verificata e quantificata per mezzo del conteggio della radioattività incorporata nel materiale sintetizzato, e ele in gel di agarosio alcalino e neutro.
3.2 Clonazione e sequenziamento. Dapprima, il cDNA sintetizzato viene selezionato per dimensione allo scopo di evitare la clonazione di segmenti eccessivamente piccoli. Per tale scopo, il materiale dalla sintesi del cDNA viene ricuperato mediante centri† ugazione (30 minuti, 16.000 g). Il precipitato viene essiccato sotto vuoto, sciolto con tampone Tris/EDTA (TE) pH = 8,0, e caricato in 1% di gel di agarosio. I frammenti di cDNA tra 1000 e 5000 bp vengono ricuperati dal gel con DEAE-carta alla cellulosa e da quest’ultimo mediante eluizione con NaCl e successiva precipitazione. Il cONA purificato viene clonato in estremità smussate nel vettore pMTL25 , un vettore derivato dal pUC18. Per tale scope, il vettore viene linearizzato con Smal e trattato con fosfatasi alcalina per ridurre il fondo del vettore. Dopo legamento con DNA ligasi T4, cellule competenti XL-lBlu di i-col.i vengono trasformate con la miscela di legamento in presenza di X-gal (5-bromo-4-cloro-3-i ndolil-^-D-galattopi ranos.ide ) (Boehringer) e IPTG (isopropi 1-jj-D- tiogalattopi ranoside ) (Gold Bioch), che permettono la selezione iniziale di colonie ricombinanti mediante il colore (colonie blu senza inserto in confronto con quelle bianche con inserto).
L’analisi dei cloni di PRRS positivi viene effettuata mediante preparazioni di DNA del plasmide [Birnboim e Doly, “Nucleic Acids Res.",_7' 1513-i523 (.1979)], e mappatura dei siti di restrizione in base a sequenze di LV. Soltanto 9 dei 300 plasmidi analizzati risultano positivi e contengono inserti tra 800 e 2600 bp . La verifica definitiva della autenticità di quseti cloni di cDNA viene effettuata mediante il loro sequenziamento diretto, impiegando il metodo di terminazione della catena di^deossi applicato al DNA a filamento doppio [Sanger F. ed al. , "J. Mol . Bioì." , 9_4, 441-448 ( 1975)] . L ’ òligooucleotide universale ( 5 ' G Γ AAACGACGGCCAG Γ3 ' ) e l ’oligonucleotide inverso ( S ’ A A C AG C T A T G ACLATGJ’ ) vengono impiegati per sequenziare tutti i cloni. La maggior parte dei cloni di PRRS ottenuti contiene una coda comune poli (.A,' e differenti estremità 5 ’. I cloni vengono denominati pPRRS'8 , pPRRS- 108 , pPRRS-121, pPRRS-132, pPRRS-146, pPRRS-147, pPRRS-148 e pPRRS-153. Dalla seconda sintesi del cDNA, si ottiene il clone PRRS-3. La figura 3 illustra la differente estensione di questi cloni in confronto con LV, come pure le ORF contenute in ognuno. D’altra parte, la figura 1 illustra la sequenza consecutiva delle 3383 bp clonate dall'isolato di PRRS-Olot, e la figura 2 (da 2A a 2F ) illustra le sequenze di amminoacidi corrispondenti alle proteine codificate da ogni ORF.
Esempio 4. Ottenimento di baculovirus ricombinanti esprimenti il gene di proteina codificato da 0RF2 4.1. Preparazione del gene di 0RF2
I geni pMTL25, priTL24 e pMTL22, derivati dal vettore pUCIS vengono impiegati per la preparazione delle differenti ORF citate in questa descrizione, prima di essere clonati in vettori di trasferimento di baculovirus. Il vettore impiegato viene indicato per ogni caso particolare. Il gene di 0RF2 ha una dimensione di 747 bp e viene ottenuto dal clone di cDNA pPRRS-3 (figura 4 }. Il DNA viene digerito con Mael , e l'inserto di approssimativamente 900 bp viene purificato in gel di agarosio. Le estremità coesive dell’inserto vengono trasformate in estremità smussate mediante trattamento con il frammento Klenow della polirne rasi di DNA di E.col i.. La clonazione viene eseguita nel pMTL25 trattato con Smal, fosfatasi alcalina e purificato in gel di agarosio all’1% a basso punto di fusione. Dopo legamento con DNA ligasi T4 (Boehringer), cellule XL-lBlu di E .co 1i vengono trasformate con la miscela di legamento e i cloni positivi vengono inizialmente selezionati per colore. I plasmidi ricombinanti contenenti il gene di 0RF2 inserito vengono purificati secondo il metodo della lisi alcalina [Birnboim e Doly, "Nucleic Acids Res" , 7 , 1513-1523 (1979)], e caratterizzati mediante mappatura con endonucleasi di restrizione e sequenziamento delle regioni di inserzione.
Il vettore ora ottenuto viene denominato pPRRS-0RF2. In questo, il codone di iniziazione della 0RF2 (ATG) è disposto approssimativamente a 50 bp dall’inizio dell’inserto e del sito BamHI.
4.2. Inserimento del gene della QRF2 in un vettore di trasferimento a bacuiovirus.
Il vettore di trasferimento a Bacuiovirus utilizzato in tutti gli esperimenti, descritti in questa domanda di brevetto, e il vettore pAcYrii [Matasuura ed al., <">J . Gen. Virol.<">. 68, 1233-50], che ha un singolo sito di inserimento BamHI.
11 vettore è stato donato dal prof. D.H.L. Bishop (I.V.E-M. Oxford, Regno Unito]. Per l’inserimento, il vettore viene accuratamente digerito con la endonucleasi BamHI e quindi trattato con l'enzima di fosfatasi alcalina per evitare un rilegamento del vettore. La 0RF2 codifica per una proteina di 28,4 KDa„ In breve, l’inserimento del gene corrispondente nel vettore pAcYMl impiega plasmide pPRRS-0RF2 come materiale di partenza. In questo plasmide il gene della 0RF2 è fiancheggiato da due siti BamHI. Cosi, pPRRS-0RF2 viene digerito con BamHI e caricato in gel di agarosio all’1% a basso punto di fusione allo scopo di ottenere il frammento di 935 bp. Questo frammento viene inserito nel sito BamHI di pAcYMl secondo il metodo di Struhl [ “Biotecniques", 6, 452-453 (1985)], impiegando il DNA ligasi T4 (Boehringer) per legare l’inserto al vettore. La miscela di legamento viene impiegata per trasformare cellule DH5 di E.co1i. I plasmidi ricombinanti ottenuti contenenti il gene inserito della 0RF2 vengono purificati secondo il metodo della lisi alcalina (Birnboin e Doly, sopra).
caratterizzato da mappatura con endonucleasi di restrizione e sequenziati i bordi inseri ti per confermare la sequenza corretta delle regioni di inserimento. Il vettore di trasf erimento ottenuto a nuovo viene denominato pPRRS-8ac8 e viene dimostrato che ha il gene PRRS nell’orientamento corretto per la sua espressione mediante promotore della poliedrina del baculovirus AcNPV.
4.3. - Transfez ione e selezione di baculovirus Cellule di Spodoptera f lugiperda. clone Sf 9, vengono cotransfettate con una miscela di DNA infettivo purificato del virus parentale AcRP23-lacZ (500 ng) , donato da Or. Rosee (I.V.E.M., Oxford, G.B.) e del vettore di trasferimento di DNA di pPRR5-8ac8 (2 ug). Il DNA del virus parentale viene linearizzato con l’enzima 8su36I entro il gene lacZ [Kitts ed al., "Nuc. Acids Res . " , 18, 5667-72 (1990)] allo scopo di aumentare l’efficienza della ricombinazione. Per la co- transfez ione , si utilizza il metodo della lipofectina (Gibco-BRL) [Felgner ed al., "Proc. Nati. Acad. Sci. USA", 84, 7413-7417 (1987)]. Dopo la cot ransfez ione , le cellule vengono incubate per 5 giorni in mezzo TNMFH completo integrato con 5% di siero bovino fetale (FCS) e antibiotici, sino a che si osserva un effetto citopatico.
Successivamente, il supernatante di transfezione viene ricuperato e i virus ricombinanti vengono identif icati mediante saggio placca . Il virus parentale AcRP23-lacZ presenta placche di lisi blu in presenza di substrato X-gal poiché viene espresso il gene di -galattosidasi . I virus ricombinanti vengono inizialmente identificati dalle placche limpide dopo colorazione della progenie virale mediante X-gal. Parecchie placche di ogni virus vengono prelevate e sottoposte a tre cicli di purificazione, prima di preparare una scorta di virus ad elevato titolo. Il baculovirus ricombinante finalmente ottenuto viene denominato AcNPV, PRRS 2. Questo è stato depositato presso la European Collection of Animai Celi Cultures (ECACC) con il numero di accessione V94021007.
Esempio 5 - Ottenimento di baculovirus ricombinanti esprimenti il gene della proteina codificato dalla QRF3.
5.1. Inserimento del gene della QRF3 in un vettore di trasferimento di baculovirus.
La OR F3 codifica per una proteina con un peso molecolare valutato di 30,8 KDa . Il DNA del plasmide pPRRS-121 viene impiegato come materiale di partenza per l’inserimento del corrispondente gene nel vettore di trasferimento pAcYMl (figura 5). In questo vettore, il codone di iniziazione della 0RF3 è disposto 10 pb dal sito BamHI. Il gene può essere escisso mediante doppia digestione con gli enzimi BamHI e Sau3A, che generano estremità coesive compatibili con BamHI. Dopo digestione, la miscela viene caricata in gel di agarosio all’1% a basso punto di fusione e viene purificato un frammento di 1009 bp. Questo viene isolato e quindi legato al vettore pAcYMl trattato con BamHI e fosfatasi alcalina impiegando l’enzima di DNA ligasi T4. Successivamente, cellule DH5 di E.co1i vengono trasformate e i plasmidi ricombinanti vengono purificati e caratterizzati secondo i procedimenti descritti sopra. Dopo che sono stati verificati la sequenza e l 'orientamento dell’inserto corretti verso il promotore di poliedrica, il nuovo vettore di trasferimento viene denominato pPRRS-Bac2.
5.2- Transfezione e selezione di baculovirus ricombinanti
Il procedimento impiegato per la transfezione e la selezione di baculovirus ricombinanti è simile a quello descritto sopra per la 0RF2 (esempio 4.3). Il baculovirus ricombinante ottenuto viene denominato AcNPV, PRRS 3. Questo è stato depositato presso la ECACC con il numero di accessione V94011325.
Esempio 6. - Ottenimento di baculovirus ricombinanti esprimenti il gene della proteina codificata dalla 0RF4.
6.1 * Preparazione del gene della ORF4
La dimensione del gene della 0RF4 è 549 bp. Questo viene ottenuto dal clone pPRRS-146 (figura 6) digerito con gli enzimi BamHI, Afilli e PstI. 1 primi due enzimi fiancheggiano l'inserto e si impiega PstI per scindere un frammento del DNA del vettore, di dimensione simile al gene della 0RF4 che avrebbe reso difficile l’isolamento del gene. Un frammento di 112 bp viene purificato in gel di agarosio a basso punto dì fusione e clonato in vettore phTL22 digerito con BamHI e Ncol (compatibile con Afilli}. Dopo legamento con DNA ligasi T4 e trasformazione di cellule DH5 di E.col i. i plasmidi ricombinanti vengono purificati secondo il metodo della lisi alcalina (Birmboin e Doly, sopra), e caratterizzati mediante mappatura di endonucleasi di restrizione. Il vettore ottenuto di fresco viene denominato pPRRS-0RF4. Esso contiene il codone ATG di iniziazione della 0RF4 disposto a 5 bp dal sito BamHI.
6.2. Inserimento del gene della QRF4 in un vettore di trasferimento di baculovirus
La 0RF4 codifica per una proteina dì 20,0 KDa. Il corrispondente gene viene ottenuto dal plasmide pPRRS-OR F 4 mediante digestione con BamHi piu BglII . Il frammento di 1112 bp viene purificato in gel di agarosio a basso punto di fusione all’1% e clonato direttamente in pAcYMl-BamHI . I procedimenti per la identificazione e la caratterizzazione dei cloni ricombinanti sono identici a quelli descritti sopra (esempio 4.2). Una volta che sono stati verificati il corretto orientamento e la sequenza di inserto, il plasmide nuovo viene denominato pPRRS-Bac9. Questo plasmide viene impiegato per esperimenti di transfezione successivi e per la preparazione di baculovirus ricombinanti.
6.3 - Transfezione e selezione di baculovirus ricombinanti
Il procedimento seguito per la transfezione e la selezione di baculovirus ricombinanti è simile al procedimento descritto sopra per la 0RF2 (esempio 4.3). Il baculovirus ricombinante viene denominato AcNPV, PRRS4 . Questo è stato depositato presso la ECACC con il numero di accessione V94021008.
Esempio 7. - Ottenimento di baculovirus ricombinanti esprimenti il gene della proteina codificato dalla 0RF5 .
7.1. Preparazione del gene della 0RF5.
La dimensione del la 0RF5 è 600 bp . Questa viene ottenuta dal clone pPRRS-132 (figura 7). Il DNA viene digerito con gli enzimi BstXI e BfrI, e un frammento di 700 bp contenente la 0RF5 viene purificato in gel di agarosio all’1% a basso punto di fusione. Dopo conversione delle estremità del frammento da coesive a smussate mediante trattamento con DNA polimerasi T4, il frammento viene clonato nel vettore pMTL25/SmaI. Il metodo impiegato è simili ai procedimenti descritti nell’esempio 4.1. Il vettore ottenuto o ra viene denominato pPRRS-0RF5. Essa contiene il codone ATG di iniziazione della 0RF5, disposto a 15 bp dall’inizio del gene.
7.7?. Inserimento del gene della 0RF5 in un vettore di trasferimento di baculovirus
La GRF5 codifica per una proteina di 22,4 KDa. Per inserire il corrispondente gene nel vettore di trasferimento , il vettore pPRRS-0RF5 viene digerito con l’enzima BamHI. Il frammento di 706 bp viene purificato in gel di agarosio a basso punto di fusione all’1% e legato direttamente al vettore dì trasferimento pAcYMl-BamHI. I plasmidi ricombinanti vengono caratterizzati come descritto sopra. Il nuovo vettore di trasferimento viene denominato pPRRS-Bac3.
Questo viene impiegato nei successivi esperimenti di transf ezione .
7.3. - Transfezione e selezione di baculovirus ricombinante
Il procedimento seguito per la transfezione e la selezione di baculovirus ricombinanti è simile al procedimento descritto sopra per la 0RF2 (esempio 4.3). Il baculovirus ricombinante ottenuto viene denominato AcNPV, PRRS5 ed è stato depositato presso la ECACC con il numero di accessione V94011326.
Esempio 8 - Ottenimento di baculovirus ricombinanti esprimenti il gene di proteina codificato dalla 0RF6 8.1, - Preparazione del gene della 0RF6 .
La dimensione del gene della 0RF6 è 519 bp . Questo viene preparato dal clone del gene pPRRS-8 (figura 8). Dapprima, il DNA viene digerito con l’enzima Afilli, il che permette la eliminazione di bande che si avvicinano come dimensioni al gene della QRF6. Un frammento di 990 bp di Af1111-Af1111 viene purificato in gel di agarosio a basso punto di fusione all’1% e digerito con Tagl. Il nuovo frammento di 790 bp viene purificato in gel di agarosio a basso punto di fusione e clonato nel vettore pMTL24 trattato con Acci e con fosfatasi alcalina. Successivamente vengono effettuate le fasi descritte nell’esempio 4.1.
Il nuovo vettore viene denominato pPRRS-ORFó. Esso contiene il codone di iniziazione della 0RF6 disposto a 4fa bp dall'inizio del gene.
8.2. Inserimento del gene della 0RF6 in un vettore di trasferimento di baculovirus
La 0RF6 codifica per una proteina di 19,0 KDa. Questa si suppone che sia la proteina di inviluppo, e a causa della sua natura idrofoba, viene considerata essere una proteina che abbraccia la membrana. Per l’inserimento del corrispondente gene nel vettore di trasferimento, il vettore pPRRS-0RF6, contenente il gene della 0RF6 clonato al sito pMTL24 di Acci, viene digerito con l’enzima BamHI. Il frammento di 790 bp viene purificato da gel di agarosio all’1% e legato direttamente al vettore pAcYMl-BamHI . Il nuovo vettore di trasferimento viene denominato pPRRS-Bac5. Questo viene impiegato nei successivi esperimenti di transfezione.
8.3. Transfezione e selezione di baculovirus ricombinanti
I metodo impiegato per la transfezione e la selezione di virus ricombinanti è simile al procedimento descritto sopra per la 0RF2 (esempio 4.3) . Il baculovirus ricombinante ottenuto viene denominato AcNPV, PRRS6. Questo è stato depositato p r ess o l a EC A CC con il numero di accessione
V94011327 .
Esempio 9. - Ottenimento di baculovirus ricombinanti che esprimono il gene della proteina codificata dalla 0RF7-9.1. Preparazione del gene della ORF7.
La dimensione del gene della 0RF7 é 384 bp. Questo viene preparato dal clone del gene pPRRS-8 (figura 8). Il frammento Af1111- Af1I11 descritto nell’esempio 8.1 viene digerito con l’enzima Hpal. Il frammento AflIII-Hpal di 430 bp contenente il gene della 0RF7 viene purificato in gel di agarosio a basso punto di fusione e successivamente clonato nel vettore pPMTL25 digerito con Ncol-Saml. L’analisi e la caratterizzazione delle colonie ricombinanti vengono effettuate come descritto nell’esempio 4.1. Il nuovo vettore viene denominato pPRRS-ORFT. Essa contiene il codone di iniziazione della 0RF7 disposto a 16 bp dall’inizio del gene.
9.2. Inserimento del gene della 0RF7 in un vettore di trasferimento di baculovirus.
La QRF7 codifica per una proteina di 13,8 KDa. Si suppone che questa sia la nucleoproteina virale. Per l’inserimento del gene corrispondente nel vettore di trasferimento, il plasmide pPRRS-0RF7 viene digerito con gli enzimi BglII e BamHI. Il risultante frammento di 430 bp viene isolato da un gel di agarosio a basso punto di fusione e legato direttamente entro il vettore pAcfMl -BamHI . Dopo l’adatta caratterizzazione, si ottiene il nuovo vettore di trasf erimento pPRRS-Bac7. Questo viene impiegato per i successivi esperimenti di transfez ione .
9.3. Transfezione e selezione di baculovirus ricombinanti
Il metodo impiegato per la transfezione e la selezione di baculovirus ricombinanti è simile al procedimento descritto per la 0RF2 (esempio 4.3). Il baculovirus ricombinante ottenuto viene denominato AcNPV, PRRS7. Questo è stato depositato presso la ECACC con il numero di accessione V94011328.
Esempio 10. Analisi di proteine ricombinanti e immuno rivelazione
Cellule Sf9 vengono infettate con differenti baculovirus ricombinanti ad una molteplicità di infezione di 1 PFU/cellula e incubate a 27°C sino a che vengono raccolte le colture. Differenti colture di cellule vengono eseguite in monostrato e in sospensione. In tutti i casi i risultati sono simili. Le colture vengono raccolte a differenti tempi dopo l ’ infezione . Viene determinato per ogni vi rus r icombinante i l tempo di raccol ta ottimo . Questo var ia t ra 48 e' 96 p.i.h. (ore dopo infezione). Le cellule vengono raccolte mediante centrifugazione a 150 0 giri/minuto per 10 minuti, lavate due volte con PBS, pH 7,4 e successivamente risospese e sottoposte a lisi con soluzione di bicarbonato a 25 mM . Queste vengono centrifugate a 10.000 giri/minuto per 10 minuti e la frazione citoplasmica solubile viene separata dai detriti di cellule insolubili residui. Gli estratti di cellule totali, come pure le differenti frazioni vengono analizzati mediante elettroforesi in gel ci poliacr ilammide all’11% e colorati con blu coomassie oppure trasferiti su membrane di nitrocellulosa per la rivelazione immunologica . Si osservano bande mediante colorazione con blu coomassie, aventi pesi molecolari di 28,4, 30,8, 20.0, 22,4 e 19,0 e 13,8 KDa . Queste dimensioni co rrispondono rispettivamente alle dimensioni previste per i geni codificati dalle 0RF2, 3, 4, 5, 6 e 7. Vi è una variazione rilevante nei livelli di espressione dei differenti geni: 0RF 3, 5 e 7 ad un livello considerevole, 0RF2 e 4 ad un livello apprezzabile e 0RF6 ad un livello basso. I geni con livelli di espressione inferiori, cor rispondenti alle 0RF2 e ó, possono essere dovuti alla maggiore distanza, 42 e 39 nucleotidi rispettivamente, tra il codone ATG di inizio della proteina e il promotore del baculovirus di poliedrina. In parecchie occasioni, è stato dimostrato che questa distanza dovrebbe essenzialmente essere mantenuta ad un minimo allo scopo di ottenere una buona espressione. Un altro fattore, responsabile per una bassa espressione, potrebbe essere l’elevata natura idrofoba di queste proteine.
Quando si analizzano separatamente le frazioni solubili ed insolubili delle cellule infette, si è osservato che, eccetto che per la QRF7 , la maggior parte delle proteine PRRS espresse sono insolubili e rimangono associate con i detriti della membrana. Ciò può essere dovuto alla natura idrofoba e glicosilata di queste proteine. La maggior parte di queste proteine contiene zone transmembrana che le ancorano alle membrane. Tali caratteristiche rendono difficile la purificazione di queste proteine da estratti di cellule .
Per la immunorivelazione , le proteine vengono trasferite su membrane di nitrocellulosa, secondo metodi standard [Burnette, "Anal . Biochem.", 112.
195-293 (1981); Towbin ed al., "Proc. Nati. Acad. Sci. USA" , 77, 4350-4354 (1969)]. Il trasferimento delle proteine viene effettuato in un dispositivo semisecco (Bio-Rad) a 22V per 30 minuti. Quindi, le strisce di nitrocellulosa vengono bloccate con 3% di latte scremato in polvere in Tris-HCl 20 mn, pH 7,5, NaCl 500 mM (7BS) per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, le strisce vengono incubate dapprima per 2 ore a temperatura ambiente con un antisiero di maiale anti-PRRS (C-45) diluito 1/100 in TBS-0,05% Tween 20, lavate con TBS-0,05% Tween 20 per 30 minuti a temperatura ambiente e quindi incubate con IgG antimaiale coniugata con fosfatasi alcalina (diluizione 1/1000.) (Sigma) per 1 ora. Le strisce vengono lavate un’altra volta e, infine, sviluppate con un NBT (nitro blu tetrazolio) (Sigma) e in soluzione di BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato) (Sigma) in NaCl 100 mM, MgCl2 5 roti, dietanolammina 100 mM, pH 9,5, sino alla comparsa di bande visibili. La reazione viene arrestata con acqua distillata. In tutti i casi in cui si osservano reazioni mediante immunoblot, si ottengono proteine con peso molecolare equivalente alle dimensioni valutate della QRF. In alcuni casi, specificamente nelle QRF3 e 5, si osserva la presenza di altre bande di dimensioni maggiori, sino a 45 KDa. Queste bande rappresenterebbero differenti forme di glicosilazione delle proteine, in accordo con i siti potenziali previsti.
10.1. Caratterizzazione antigenica delle proteine ricombinanti
La antigenicità corretta delle proteine ricombinanti espresse in baculovirus viene verificata mediante la loro reazione a differenti sieri animali in un saggio dì immunoblott ing . Le proteine ricombinanti espresse e trasferite in nitrocellulosa seconda il precedente metodo, vengono fatte reagire con una raccolta di sieri suini precedentemente caratterizzati contenenti anticorpi anti-PRRSV. I sieri sono stati ottenuti in animali infettati sperimentalmente (n. 1-4) o naturalmente (.n. 5-8).
Le proteine corrispondenti alle ORF 3. 5 e 7 sono state le prime da verificare. I risultati sono illustrati nella tabella 2.
Tabella 2
Reattività di sieri da animali infetti contro proteine ricombinanti di QRF3. 0RF5 e 0RF7
Questo saggio dimostra che le proteine ricombinanti 3, 5 e 7 sono antigenicamente simili alle proteine virali inattive 3, 5 e 7, rispettivamente.
Quando il saggio viene eseguito con proteine ricombinanti 2, 4 e 6, i risultati sono di una maggiore variabilità in quanto si riferisce al riconoscimento da parte di sieri di campo. Le ragioni per questa variabilità possono essere sia il loro basso livello di espressione, sia /oppure la loro elevata idrofoblìi tà.
Questi saggi dimostrano che le proteine ricombinanti PRRSV espresse nel sistema di baculovirus non sono antigenicamente distinguibili dalle proteine virali inattive.
Esempio 11. - Purificazione delle proteine ricombinanti
La strategia ideata per la purificazione delle proteine ricombinanti dovrebbe prendere in considerazione le caratteristiche strutturali delle proteine. Dovrebbero essere messe in evidenza due di queste caratteristiche:
(1) La natura idrofoba che le rende insolubili, e (2) la presenza di un grande numero di regioni transmembrana che impartisce loro una grande affinità per le membrane. Nella maggior parte dei casi, queste caratteristiche non rendono conveniente l’estrazione e la purificazione delle proteine, ad esempio per il loro impiego come vaccino, quando si possono impiegare cellule complete infettate, come descritto da differenti autori [Hall S.L., ed al ., "Vaccine", 9, 659-66 7 (1991): Tordo N., ed al., "Virology", 194 , 5269 (19^3)]. Nonostante ciò, sono stati fatti alcuni tentativi per purificare queste proteine impiegando come modello la proteina della 0RF3.
11.1. Purificazione della proteina derivata dalla 0RF3 Cellule Sf9 vengono infettate con il virus ricombinante AcNPV, PRRS3 secondo il metodo descritto nel precedente esempio. Le cellule infette vengono raccolte mediante centrifugazione a 400 g per 10 minuti, lavate con PBS e risospese a 20 x lo^ cellule/ml in PBS . Le cellule vengono demolite mediante congelamento/scongelamento e la frazione solubile viene separata dalla frazione insolubile mediante centrifugazione. In tutti i casi, la frazione insolubili viene utilizzata per i successivi trattamenti .
In seguito vi è una descrizione di alcuni dei metodi impiegati.
Trattamento con agenti caotropici
La frazione insolubile viene dapprima lavata con NaCl 1M e quindi con cloruro di guanidinio 2M o 4M. Le pastiglie di cellule vengono risospese nei differenti tamponi e mantenute a temperatura ambiente per 1 ora. Quindi, la preparazione viene centrifugata a 15.000 giri/minuto per 5 minuti. La presenza della proteina ricombinante nelle differenti frazioni viene analizzata mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide-SOS al 15% (.dodecilsolfato di sodio).
I risultati ottenuti indicano che il trattamento sequenziale con questi sali fornisce una proteina con una purezza dal 30% al 50%. E’ stato dimostrato che questa proteina purificata è antigenicamente analoga alla proteina naturale, poiché è riconoscibile mediante sieri d’animali infetti, determinati sia mediante immunoblotting, sia mediante ELISA indiretta. Trattamento con detergenti
Vengono impiegati detergenti alle seguenti concentrazioni:
NP40 0,5%
ottilglucoside 2%
SDS 0,5% 1% e 2%
- deossicolato di sodio 0,5%, 1% e 2%.
In tutti i casi la preparazioni di cellule vengono rese analoghe a quella descritta sopra, I detriti di cellule contenenti proteina ricombinante vengono trattati con le suddette concentrazioni di detergente e nelle condizioni descritte. In generale, si può stabilire che in queste condizioni , il trattamento con i differenti detergenti non permette la solubilizzazione di una quantità rilevante di proteina rìcombinante . Soltanto SDS allo 0,5% fornisce proteina con una purezza valutata del 50%, sebbene con una resa molto bassa. Antigenicamente , questa proteina reagisce con sieri di animali infetti mediante ELISA diretta, sebbene l’efficacia sia inferiore di quella che si ottiene con la proteina purificata mediante agenti caotropici.
Riassumendo , queste proteine parzialmente purificate potrebbero essere impiegate in vaccini anti-PRRSV .
Esempio 12. - Impiego diagnostico
Una delle applicazioni principali delle proteine ricombinanti provviste dalla presente invenzione è il loro impiego nella preparazione di corredi per la diagnosi di infezioni in campo da PRRSV .
12.1 - Preparazione di antiqene espresso in Sf9 per applicazioni nella diagnosi
Cellule Sf9 cresciute in monostrato o in sospensione vengono infettate a una molteplicità di infezione da 0,5 a 1 con i rispettivi baculovirus ricombinanti. A seconda di quale virus ricombinante sia impiegato, le colture vengono raccolte tra 48 e 72 ore dopo l’infezione. Queste vengono centrifugate a 400 g a 15°C per 10 minuti e lavate con PBS.
Infine, le pastiglie di cellule contenenti le proteine ricombinanti vengono risospese in PBS con 2% di ottilglucoside (Sigma) e vengono lasciate in riposo su ghiaccio per 1 ora. Queste vengono quindi centrifugate a 1000 g per 10 minuti per eliminare i detriti delle cellule. I supernatanti vengono dializzati a fondo contro PBS per rimuovere il detergente, centrifugati a 10.000 g per 30 minuti per rimuovere i precipitati e conservate a -70°C sino all’impiego successivo.
12.2 ELISA per la diagnosi
Immunopiastre ELISA a 96 pozzetti in polistirene (Polisorb, NUN C) vengono rivestite con differenti diluizioni della miscela di estratti ricombinanti (0RF2 , 0RF3, 0RF4, 0RF5, 0RF6 e 0RF7), preparate in tampone carbonato 50 mM, pH 9,6 (100 μ1/pozze tto ) mediante incubazione di una notte a 4°C . Come illustrato nella figura 9, la diluizione ottima scelta per il rivestimento della piastra è 1/100. Le piastre vengono saturate con tampone bloccante (latte scremato 1% in PBS) per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, si aggiungono diluizioni differenti degli antisieri anti-PRRSV preparati in tampone bloccante. L’incubazione viene proseguita per I ora a 37*0. Dopo lavaggio con PBS contenente 0,5% di Tween 20, si aggiunge proteina A marcata con perossidasi (diluizione 1/5000), incubando a 37°C per 1 ora. Viene effettuato un lavaggio come il precedente e la reazione viene sviluppata a temperatura ambiente per 10 minuti impiegando come substrato ABTS [acido 2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolίη-6-solfonico)]. La reazione viene arrestata con SDS 1% e l’assorbanza viene monitorata a 405 nm. I risultati di titolazioni usuali con ELISA da un siero di campo di animale infetto sono indicati nella figura 10. Le titolazioni su sieri di campo normalmente variano da diluizioni 1/100 a 1/800. I risultati ottenuti in un esperimento di campionamento con parecchie dozzine di sieri di campo sono riportati nella figura 11. Si può vedere che i titoli ottenuti per sieri chiaramente positivi variano da 0,4 a 1,7. I titoli da sieri incerti variano da 0,2 a 0,3. I sieri negativi forniscono titoli inferiori a 0,1. Così, la conclusione cui si arriva è : l’impiego di queste proteine ricombinanti espressfi in baculovirus è un metodo sicuro, affidabile e riproducibile, che permette di differenziare in modo conclusivo animali infetti da animali non infetti. Esempio 13. Formulazione dei vaccini ricombinanti Vengono preparati diversi vaccini contenenti differenti proteine di PRRSV r i comb i na n te , speci f icamente PRRS-Olot (ECACC V93070108) in forma di emulsione, secondo il metodo descritto in seguito.
Cellule di Spodoptera frugiperda. clone Sf9 - in seguito Sf9 - vengono infettate nella quantità di 1x10^ cellule/ml con i baculovirus ricomb inanti :
capaci di produrre, rispettivamente, le proteine ricombinanti corrispondenti alle 0RF3, 0RF5 e 0RF7 del suddetto PRRSV (figure 2, 4 e 6), a un moltiplicità di infezione di 0,1 unità formanti placca ( PFU )/cellu la . Queste vengono incubate a 27°C con agitazione a 100 giri/minuto e 30% di p02 per 72 ore, in un fermentatore Braun-MD da 2 litri. Quindi cellule di insetti infetti vengono raccolte mediante ce nt r i f ugaz i one a 1000 giri/minuto per 10 minuti, lavate con soluzione salina tamponata con fosfato ( PBS ) pH : 7,4 e sospese a 5 x IO7 cellule /mi nello stesso tampone PBS.
I vaccini vengono formulati mescolando un omogenato di cellule Sf9 infette contenenti 50 x 10to cellule Sf9 che esprimono ognuna una delle proteine ricombinanti 0RF3, 0RF5 e 0RF7, con un coadiuvante oleoso, o fase oleosa, compost^ da una miscela di:
Marcol^ 52.,. 790,9 mg Simulsol^ 5100 . 70,0 mg Montanide^ 888 . 80,0 mg.
In queste condizioni, vengono preparati quattro vaccini ricombinanti in dosi di 2 mi, composti da 53% di fase antigenica e 47% della fase oleosa descritta sopra, in cui la relazione fase oleosa/fase antigenica è una relazione di peso/volume. I vaccini preparati presentano le formulazioni seguenti.
1. Vaccino identificato come rPRRS C:
53% in volume di fase antigenica composta da 50 x IO6 cellule Sf9 esprimenti la 0RF3; e
47% in peso della fase oleosa come descritto. sopra .
2. Vaccino identificato come rPRRS D:
53% in volume di una fase antigenica composta da 50 x IO6 cellule Sf9 esprimenti la 0RF5; e
47% in peso della fase oleosa come descritta, sopra .
3. Vaccino identificato come rPRRS E:
53% in volume di fase antigenica composta da 50 :< 10° cellule Sf9 esprimenti la 0RF7: e
47% in peso della fase oleosa quale descritta sopra .
4. Vaccino identificato come rPRRS F:
53% in volume di fase antigenica composta da 50 x IO6 cellule Sf9 esprimenti la 0RF3; 50x10° cellule Sf9 esprimenti la 0RF5 e 50x10° cellule Sf9 esprimenti la 0RF7 (totale 150xl06 cellule Sf9); e
47% in peso della fase oleosa quale descritta sopra.
Esempio 14. - Efficacia in scrofe gravide
Questa prova viene eseguita per valutare l’efficacia dei vaccini ricombinanti preparati come descritto nell’esempio 13. A tal fine, si utilizza un totale di 12 scrofe - un incrocio Landrace X Large White. Gli animali vengono trasferiti in stalle di sicurezza del Centro Ricerche.
Due scrofe vengono scelte a caso (scrofe n.
400398 e 400298) e vengono vaccinate con il vaccino identificato come rPRRS C. Due scrofe (scrofe n.
400118 e 400307) vengono vaccinate con il vaccino identificato come rPRRS D. Con il vaccino identificato come rPRRS E vengono vaccinate tre scrofe (scrofe n.
3 1 40 10 , 313426 e 400059 ) , e co n i l va c c i no identi f icato come rPRRS F vengono vaccinate tre scrof e ( sc rof e n . 313524, 401236 e 401426). Le due scrofe rimanenti (scrofe n. 1 e 20) non vengono vaccinate e vengono impiegate come animali di controllo.
Le scrofe vengono vaccinate tramite una via intramuscolare profonda (IM) nel collo, in vicinanza dell’orecchio, con una dose di 2 mi di vaccino, e rivaccinate 21 giorni dopo con la stessa dose.
Si osservano le reazioni locali e generali, quali: temperatura rettale, assunzione di cibo e segni clinici sia post- vacci naz ione sia post-esposizione a stimolo antigenico. Inoltre, vengono monitorati i risultati riproduttivi post-esposizione a stimolo antigenico per le scrofe, come pure i risultati sierologici sia nelle scrofe che nei porcellini. L’analisi dei risultati viene utilizzata nella valutazione dell’efficienza del vaccino (tabella 1).
L’esposizione a stimolo antigenico viene effettuata nelle stalle di sicurezza del Centro Ricerche. Tutti gli animali vengono infettati nella quantità di 5 mi di PRRSV-218-P6-MO-F22955-29/10/94 , un ceppo isolato e mantenuto in deposito presso il centro di ricerche, con un titolo di TCID^/ml (dose infettiva di coltura di tessu to 50% ) trami te la via intranasale (IN)
Per la valutazione dei risultati riproduttivi delle serofe nel giorno del parto, vengono annotati i dati seguenti (tabella 3):
numero di maialini nati vivi e in buona salute - numero di maialini nati vivi ma deboli - numero di maialini nati morti
- nume ro di maialini con autolisi parziale (edematosa }
numero di maialini mummificati
- maialini vivi dopo la prima settimana di vita,
maialini vivi al tempo di slattamento (25-30 giorni di età)
TABELLA 3
Risultati riproduttivi
Quindi , la risposta sierologica viene analizzataa nelle scrofe (tabella 4) e nei maialini (tabelle 5, 6, 7 , 8 e 9) mediante un saggio a rnonostrato di perossidasi (IPMA) [Saggio monostrato di immunoperossidasi , Wensvoort ed al. , <">Vet. Quarterly" , 13, n. 3, (luglio 1991)] in accordo con il programma seguente :
D 0 (giorno 0): salasso e vaccinazione
D - 14: salasso (14 giorni dopo vaccinazione) D 21: salasso e rivaccinazione (21 giorni dopo vaccinazione)
D 28: salasso (28 giorni dopo vaccinazione) D 35: salasso (35 giorni dopo vaccinazione) 0 I : salasso e esposizione a stimolo antigenico D I 7: salasso (a 7 giorni dopo infezione) I risultati sierologici nelle scrofe (anticorpi anti-PRRSV) sono illustrati nella tabella 4),
TABELLA 4
Risultati sierologici (anticorpi anti-PRRSV)
N.T. : non provato ; i.;Negativo)
TABELLA 5
Risultati sierologici ottenuti in maialini nati ad animali di controllo (non vaccinati)
Scrofa n.: riferimento della scrofa
No: numero di maialini; Ab: anticorpi; negativo Ref riferimento del maialino.
TA8ELLA 6
Risultati sierologici ottenuti in maialini nati da animali vaccinati con rPRRS C (ORF3)
Scrofa n.: riferimento della scrofa
No: numero di maialini; Ab: anticorpi; NT : non provato; - negativo
Ref: riferimento del maialino.
TABELLA 7
Risultati sierologici ottenuti in maialini nati da animali vaccinati con rPRRS D (0RF5)
Scrofa n.: riferimento della scrofa
No: numero di maialini; Ab: anticorpi; NT: non provato; - negativo
Ref : riferimento del maialino.
TABELLA 8
Risultati sierologici ottenuti in maialini nati da animali vaccinati con rPRRS E (0RF7)
Scrofa n.: riferimento della scrofa
No: numero di maialini; Ab: anticorpi; NT . no provato; - negativo
Ref : riferimento del maialino.
TABELLA 9
Risultati sierologici ottenuti in maialini nati da animali vaccinati con rPRRS F (0RF3+5+7)
Scrofa n.: riferimento della scrofa
No: numero di maialini; Ab: anticorpi
Ref: riferimento del maialino.
TABELLA 7 (continua)
Risultati sierologici ottenuti in maialini nati da animali vaccinati con rPRRS F (0RF3+5+7)
Scrofa n.: riferimento della scrofa
No: numero di maialini; Ab: anticorpi
Ref: riferimento del maialino.
Allo scopo di valutare i vaccini oggetto della prova, sono stati valutati i risultati sierologici come anche i risultati di riproduzione. La tabella 3 illustra alcuni dati sierologici, mentre la tabella 9 riassume i dati di riproduzione delle scrof e utilizzate nelle prove, compresa un’informazione sul numero totale di maialini nati, sul numero di maialini vivi dopo la prima settimana, sul numero di maialini slattati e sul numero di maialini con oltre 40 giorni di età.
TABELLA 11
Sommario dei dati riproduttivi
77
TABELLA 10
Sommario dei dati sierologici e riproduttivi
(-: negativo; : positivo)
D O : tempo di vaccinazione
I risultati , nella loro totalità, rendono evidente che, nel caso del vaccino RPRRS C, una scrofa e sieroconvertita ( 400298 ) e l ’altra non lo è (400398); nel caso del vaccino D, nessuna delle scrofe è sieroconvertita; per i vaccini E e F vi e una forte sieroconversione dovuta, essenzialmente, alla proteina codificata per la 0RF7.
Vi è un comportamento favorevole di fronte alla esposizione allo stimolo antigenico, quando gli animali vaccinati vengono confrontati con quelli non vaccinati, permettendo di definire positivamente che i vaccini ricombinanti oggetto di questa prova , costituiscono un mezzo efficace per la prevenzione della PRRS .
Si è verificato che le scrofe vaccinate prive di anticorpi titolati, con la tecnica IPMA sono protette, il che mette in evidenza che detti vaccini (PRRS C e PRRS S_) sono in grado di indurre una immunità cellulare .
L’efficacia del vaccino viene valutata conf rontando:
a) la percentuale di maialini vivi dopo la prima settimana in contrasto con il numero totale di maialini nati,
b.) la percentuale di maialini slattati in contras to con il numero totale di maialini nati, e c) la percentuale di maialini con un’età superiore a 40 giorni in contrasto con il numero totale di maialini nati.
La tabella 12 illustra il dato relativo alla percentuale di maialini vivi dopo la prima settimana, la percentuale di maialini slattati e la percentuale di maialinì con oltre 40 giorni di età in contrasto con il numero totale di maialini nati.
Si è verificato che gli animali privi di anticorpi, valutati con la tecnica I PMA , sono protetti .
TABELLA 12
Percentuale di maialini vivi dopo la prima settimana, slattati e con oltre 40 giorni di età in contrasto con il numero totale di maialini nati
DEPOSITO DI MICROORGANISMI
I baculovirus ricombinanti ottenuti sono stati depositati presso la European Collection of Animai Celi Cultures (ECACC ) , Porton Down, Salisbury , Whilt5hire SPa 03G . Regno Unito. La denominazione e i numeri di accessione dei baculovirus ricombinanti sono :
Denomi naz ione Numero di accessione ECACC
Tutti questi baculovirus sono stati depositati il 14 gennaio 1994, eccettuati AcNPV, PRRS2 (V94021007 ) e AcNPV, PRRS4 (V94021008) che sono stati depositati il 10 febbraio 1994.
LEGENDA DELLE FIGURE
Figura 3:
a ) Genoma di PRRSV
b) Dimensione (Kb)
c ) Numero del clone
Figura 9
a) Titolazione dell’antigene mediante ELISA b) Assorbanza a 405 nm
c) Diluzione di antigene (1/ )
d) Siero a 1/200
Campo
Sperimentale
Negativo
Figura 10
a) Titolazione del siero mediante ELISA bi Assorbanza a 405 nm
c) Diluizione del siero (1/ )
d) Positivo
Negativo
Figura. 11
a) Titolazione di sieri di campo
l> Assorbanza a 405 nm
cÌ Sieri di scrofe.
Claims (3)
- RIVENDICAZIONI 1. - Proteine ricombinanti del virus causativo della sindrome riproduttiva e respiratoria porcina (PRRS ), caratterizzate dal fatto che vengono scelte da una qualsiasi delle proteine codificate dalle QRF da 2 a 7 del virus PRRS-Olot. 2. - Proteine secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto che esse comprendono le sequenze di amminoacidi illustrate nella figura 2. 3. - Proteine secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto che sono ottenibili mediante Ingegneria Genetica in un sistema di espressione di baculovirus ricombinante moltiplicato in una coltura di cellule ospite permissive. 4. - Proteine secondo la rivendicazione 3 , caratterizzate dal fatto che tali baculovirus ricombinanti contengono debitamente inseriti) ed esprimonq, almeno, il gene di una proteina codificata dalle QRF da 2 a 7 del virus PRRS-Olot. 5. - Proteine secondo la rivendicazione 3. caratterizzate dal fatto che tale coltura di cellule ospiti permissive e una coltura di cellule di insetti permissive . 6. - Proteine secondo la rivendi c azione 3. caratterizzate dal fatte che sono ottenibili mediante l’espressione di baculovirus ricombinanti scelti tra: Denomi n azione _ Numero di accessione ECACC 7 . - Procedimento per l’ottenimento di proteine di PRRS-Olot ricombinanti , codificate dei geni contenuti in una qualsiasi delle QRF da 2 a 7 del detto virus, che comprende le fasi di: a ) preparazione della sequenza di cDNA , sintetizzata dal RNA genomico di PP,RS-01ot da inserire in un baculovirus; e b) ottenimento di baculovirus ricombinanti che esprimono le proteine ricombinanti corrispondenti alle QRF inserite. 8. - Procedimento secondo la rivendicaz ione 7, caratterizzato dal fatto che la preparazione della sequenza di cONA da inserire comprende le fasi di: a.l Isolamento e purificazione del virus PRRS-Olot: a.2 Isolamento cel RNA virale di PRRS-Olot: e ó.Z Sintesi di cONA dal RNA genomico di PRRS-Olot·. o. - Procedimento secondo la r i vendi caz i one 8, caratterizzato dal fatto che l’isolamento del virus PRRS-Olot viene effettuato mediante replicazione del detto virus su colture di cellule permissive. 10. - Procedimento secondo la rivendicazione 8. caratterizzato dal fatto che l’isolamento del RNA virale di PRRS-Olot viene effettuato mediante adsorbimento su una oligo d (T )12-ceH |Jiosa . 11. - Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratter izzato dal fatto che la sintesi di cDNA, dal RNA genomico di PRRS-Olot, viene effettuata incubando il detto RNA con i co rrisponden ti dNTP, transcriptasi inversa e sia un oligo d(T)12, sia , in alternativa, un oligonucleotide con la formula 5 ’CGGGCTCGAGCCTTTGGCGA3 ’. 12. - Procedimento secondo la rivendicazione 8. caratterizzato dal fatto che l'ottenimento di baculovirus ricombinanti che esprimono proteine ricombinanti che cor rispondono alle QRF da 2 a 7 di PRRS-Olot, comprendono le fasi di: b.ì Inserimento dei corrispondenti geni della ORF in /etton di trasferimento del baculovirus; b .
- 2 Transfezione di cellule ospiti permissive con i detti vettori di trasferimento che portano inseriti i geni della ORF coi rispondente ; e P.
- 3 Selez ione dei baculovirus r i combinanti che esprimono le cor rispondenti proteine ricombinanti della ORF inserita. 13. - Procedimento secondo la rivendicazione 12. caratterizzato dal fatto che detto vettore di trasferimento del baculovirus è il vettore pAcYMl. 14. - Procedimento secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che la transfezione delle dette cellule ospite permissive per la replicazione di baculovirus ricombinanti viene effettuata con una miscela di DNA del vettore di trasferimento che porta inserito il corrispondente gene della ORF e DNA del baculovirus di tipo selvatico. 15. - Procedimento secondo la rivendicazione 12, caratter izzato dal fatto che le dette cellule ospiti permissive sono una coltura di cellule di insetto. 16. - Procedimento secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che il baculovirus ricombinante ottenuto esprime una singola proteina ricombinante di PRRS-Olot, scelta da una qualsiasi delle proteine codificate dalle ORF da 2 a 7 del detto virus. 17. - Procedimento secondo la rivendicazione 12, caratteri zzato dal fatto che i baruìovirus ricombinanti ottenuti vengono scelti tra: Denominazione .Nume r o. di acce ssione ECACC 18. - Baculovirus ricombinanti, caratterizzati dal fatto che essi esprimono, almeno, una proteina ricombinante corrispondente ad una delle ORF da 2 a 7 di PRRS-Olot. 19. - Baculovirus ricombinanti secondo la rivendicazione 18, caratterizzati dal fatto che essi esprimono una singola proteina ricombinante di PRRS-Olot, scelta fra una qualsiasi delle proteine codificate dalle ORF da 2 a 7 del detto virus. 20. - Baculovirus ricombinanti secondo la rivendicazione 18. caratterizzati dal fatto che essi vengono scelti tra: Denon.inaz ione Numero di accessione. ECACC 21 . Vaccino adatto per la vaccinazione e la protezione di maiali contro la sindrome riproduttiva e respiratoria porcina ( PRRS ) , che comprende, almeno, una proteina ricombinante corrispondente ad una qualsiasi delle proteine codificate dalle ORF da 2 a 7 di PRRS-Olot e un adatto veicolo o coadiuvante. 22. - Vaccino secondo la rivendicazione 21, caratterizzato dal fatto che dette proteine ricombinanti sono ottenibili mediante tecniche di Ingegneria Genetica in un sistema di espressione di baculovirus ricombinanti moltiplicati in coltura di cellule ospiti permissive. 23. - Vaccino secondo la rivendicazione 21 , caratterizzato dal fatto che i baculovirus ricombinanti che esprimono dette proteine ricombinanti sono scel ti tra : De nom ina zione Numero di accessione ECACC 24. - Vaccino secondo la rivendicazione 21 , caratterizzato dal fatto che dette proteine ricombinanti vengono impiegate parzialmente purificate . 25. - Vaccino secondo la rivendicazione 21, caratterizzato dal fatto che detta fase antigenica contiene una singola proteina di PRRSV ricombinante, scelta dal gruppo formato dalle proteine ricombinanti codificate dalle ORF 3, 5 e 7 di PRRS-Olot. 26. - Vaccino secondo la rivendicazione 21, caratterizzato dal fatto che detta fase antigenica e composta da cellule di insetti infettate con lo stesso baculovirus ricombinante che esprime soltanto una celle proteine ricombinanti codificate dalle ORF da 2 di PRRS-Olot. 27. - Vaccino secondo la rivendicazione 21 , caratterizzato dal fatto che detta fase, antigenica e composta da cellule di insetti infettate con cifferenti baculovirus ricombinanti che esprimono, ognuno di questi , soltanto una delle differenti Proteine ricombinanti codificate dalle ORF da 2 a 7 di FcRS-01ot. vaccino secondo la rivendicazione 2 i caratterizzato dal fatto che contiene un coadiuvante cieoso. 29. - Vaccino secondo la rivendicazione 28, caratterizzato dal fatto che detto coadiuvante oleoso è composto da una miscela di Marcol 52, Simulsol 5100 e Montanide 888. 30 . Vaccino secondo la rivendicazione 21, caratterizzato dal fatto che contiene un coadiuvante acquoso . 31. - Vaccino secondo la rive ndicaz io ne 21, caratterizzato dal fatto che contiene inoltre sostanze potenz latrici della risposta della cellula (CRPj quali IL-1, IL-2. IL-4, IL-5 , IL-6. IL-12, g-IFN, fattore di necrosi della cellula e sostanze simili. Vaccino secondo la rivendicazione 21. caratterizzato dal fatto che il coadiuvante e un coadiuvante capace di modulare e ìmmunostimolare la risposta della cellula, quale MDP, I3C0M o liposomi. 33. - Vaccino secondo la rivendicazione 21, caratterizzato dal fatto che è in grado di indurre una immunità cellulare in animali vaccinati. 34 . Vaccino Pi- o multivalente capace di prevenire la sindrome riproduttiva e re porcina e un' altra o altre infezioni porcine, caratterizzato dal fatto che comprende, almeno, una proteina ricombinar, te corrispondente ad una delle proteine codificate da uno qualsiasi dei geni contenuti in una qualsiasi delle ORF da 2 a 7 del PRRS-Olot, insieme con uno o più patogeni porcini e un adatto veicolo o un coadiuvante. 35. - Vaccino secondo la rivendicazione 34 , caratterizzato dal fatto che comprende, almeno, un patogeno porcino scelto tra il gruppo formato da Actinobacillus Pleuropneumoniae. . Haemphilus parasuis. Porcine parvovirus s_ Leptosoira Escherichia coli Ervsipelothrix_ rhusìopathi ae._ Pasteurella. .mul tocida , Bordetella bronchiseptj ca_,. Porcine respirator y corgnavirus, Rotavi rus o contro patogeni causativi di malattia di Aujeszky, influenza suina o gastroenterite trasmissìbi le . 36. - Vaccino passivo adatto per la vaccinazione e la protezione di maiali contro la sindrome riproduttiva e respiratoria porcina (PRRS ), caratterizzato dal fatto che contiene anticorpi ottenuti mediante immunizzazione di animali con, almeno, una proteina ricombinante cor rispondente ad una delle proteine codificate da uno qualsiasi dei geni contenuti in una qualsiasi delle ORF da 2 a 7 di PRRS-Olot e un adatto coadiuvante o veicolo. 37. - Corredo diagnostico per la rivelazione della presenza di anticorpi che identif icano specificamente PRRSV in un campione biologico, quale sangue, siero, espettorato, saliva o latte da maiali comprendente, almeno , una proteina ricombinante corrispondente ad una delle ORF da 2 a 7 di PRRS-Olot. e adatti mezzi di rivelazione. 38 Corredo diagnostico secondo la rivendicazione 37, caratterizzato dal fatto che dette proteine ricombìnanti sono ottenibili mediante Ingegneria Genetica in un sistema di espressione di baculovirus ricombinanti moltiplicato in colture di cellule ospite permissive. 39. - Corredo diagnostico secondo la rivendicazione 38, ca ratte rizzato dal fatto che i baculovirus ricombinanti che esprimono dette proteine ricombinanti sono scelti da: Denominazione Numero di accessione ECACC 40. - Corredo diagnostico per la ri v e I a z i o n e della presenza di PRR3V in un campione b iologico, quale sangue, siero, espettorato, saliva. tessuto o latte , da animali , comprendente anticorpi che identif icano specificamente il PRRSV o ttenuto immunizzando animali con , almeno , una p ro teina ricombinante corrispondente ad una delle QRF da 2 a 7 di PRRS-Qlot e adatti mezzi di rivelazione.
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