DE19517773A1

DE19517773A1 - Rekombinante PRRSV-Proteine, Diagnostik-Kits und solche rekombinanten PRRSV-Proteine enthaltenden Vakzinen

Info

Publication number: DE19517773A1
Application number: DE19517773A
Authority: DE
Inventors: Duran Juan Plana; Alvarez Jose Ignacio Casal; Sanchez Isabel Climent
Original assignee: Cyanamid Iberica SA
Current assignee: Wyeth Farma SA
Priority date: 1994-05-13
Filing date: 1995-05-15
Publication date: 1995-11-16
Also published as: AU2409495A; NL1000365C2; DE69533690T2; DE69533690D1; NL1000365A1; EP0717108A1; IT1277996B1; DK53595A; PT717108E; CA2167080A1; US5888513A; ITTO950367A0; JPH09500544A; CA2167080C; ATE280829T1; FR2719845B1; WO1995031550A1; GB2289279B; TW450977B; FR2719845A1

Description

Umfang der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf virale rekombinante Proteine des Erregers des "porcine reproductive and respiratory syndrome" (PRRS) ("reproduktives und respiratorisches Syndrom bei Schweinen"), in einem Ausdruckssystem rekombinanter Baculoviren, in permis siver Gastzellenkultur vervielfacht, produziert. Die Erfindung bezieht sich auch auf Diagnostik-Kits und Vakzinen, die mindestens eins der genannten rekombi nanten Proteine aufweisen.

Historie der Erfindung

In Spanien wurden die ersten Fälle respiratorischer Veränderungen bei Ferkeln in einer 300-Ferkel-Partie, die aus Deutschland importiert wurde, Mitte Januar 1991 festgestellt, (Plana et al., Med. Vet., Vol. 8, No. 11, 1991). Kurz danach wurde bei zwei Zuchtherden auf zwei landwirtschaftlichen Betrieben, die sich in der Nähe der Herde befanden, in der das anfängliche Problem aufgetre ten war, eine Krankheit festgestellt, die durch eine ab normal hohe Zahl von Abortionen in der letzten Phase der Trächtigkeit sowie 70% Sterblichkeit bei Ferkeln ge kennzeichnet war.

Die Ursache dieser epizootischen Ausbruchereignisse war nicht bekannt, aber ihre Symptomatologie war den klini schen Anzeichen ähnlich, die für eine Schweinekrankheit beschrieben worden war, die zuerst in Europa in Deutschland festgestellt wurde (1990) und mit der Krank heit, die "Mystery Swine Disease" genannt wurde und in den Vereinigten Staaten und Kanada 1987 festgestellt wurde, (Hill, Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, 06. Oktober 1990, Denver, USA). Diese Krankheit beeinträchtigt trächtige Mutterschweine, wobei bei ihnen Appetitlosigkeit, Abortionen, Totgeburten, mu mifizierte Föten, schwächliche Ferkel, die wenige Stunden nach dem Werfen eingingen, und respiratorische Probleme nach dem Werfen, unter anderen, hervorgerufen wurden. Derzeit ist die Krankheit als "Porcine Reproduc tive and Respiratory Syndrome" (PRRS) bekannt, obwohl man sie zuvor bezeichnete als "Blue-eared Pig Disease", "Mysterious Reproductive Syndrome" (MRS), "Swine Infer tility and Respiratory Syndrome" (SIARS) und "Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome" (PEARS).

Derzeit ist bekannt, daß der Erreger dieser Krankheit ein Virus ist, das PRRS-Virus (PRRSV) genannt wird. Dieses Virus wurde erstmals in den Niederlanden durch eine Gruppe von Forschern von CDI/Lelystad isoliert, die es als Lelystad-Virus (LV) bezeichnete, (Wesvoort, G., et al., Vet. Quarterly, Vol. 3, 121-130, 1991). Einige Monate später wurde ein anderes Isolat in Spanien er langt durch Laboratorios Sobrino/Oyanamid, (Plana et al., Vet. Microbiol., 33: 203.211, 1992), das in dieser Beschreibung als PRRS-Olot identifiziert werden wird. Von jenem Zeitpunkt an sind neue Isolate dieses Virus beschrieben worden, (EP Requests No. 0 529 584 A2, PCT Requests No. WO 93/06211 und No. WO 93/07898).

Die strukturellen Charakteristika des PRRS-Virus sind in zwei neueren Publikationen beschrieben worden:

a) Meulenberg, J. J. M., et al., "Lelystad Virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS) is related to LDV and EAV". Virology, 192: 62-72, (1993), und
b) Cozelmann, K.-K., et al., "Molecular charac terization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the Arterivirus group". Virology, 193: 329-339, (1993).

Das PRRS-Virus hat eine Größe von 50-60 nm, mit einer Hülle von ungefähr 30-35 nm, in dem Nucleocapsid enthal ten, und ein einziges RNA-Molekül als genomisches Mate rial. Auf der Grundlage dieser morphologischen Daten wurde das PRRSV zunächst als ein Togavirus klassifi ziert, obwohl es, auf seiner genomischen Struktur und seinen Transkriptions- und Translationsmechanismen ba sierend, näher an der Coronaviridae-Familie war. Kürz lich wurde und auf Differenzen und/oder Ähnlichkeiten beim Vergleich mit den früheren Gruppen basierend, seine Klassifizierung vorgeschlagen innerhalb einer neuen Familie, die mit Arteriviridae bezeichnet wurde, (Cavanagh, D., et al., Arch. Virology, 1994). Zusammen mit dem PRRSV sind in dieser Gruppe eingeschlossen die Arteritisviren bei Pferden (EAV), das Milchdehydroge nasevirus (LDV) und das hemorrhagische Fiebervirus bei Affen (SHFV).

Kürzlich wurden das gesamte Lelystad-Virus-(LV)-Genom (Meulenberg et al., oben aufgeführt), ein genomisches Segment des Tübingen- (Deutschland) -PRRS-Virusisolats (TV) (Cozelmann et al., oben aufgeführt) und ein Segment des PRRS-Olot-Virus (spanischer Patentanspruch No. ES P9301973) geklont und sequenziert. Auf der Grundlage all der Ergebnisse, die erzielt wurden, kann festgestellt werden, daß das PRRSV-Genom aus einem Einzelstrang-RNA- Molekül besteht, das am 3′-Ende einen Poly-A-Schwanz enthält. Die Länge des Genoms ist ungefähr 15000 "base pairs" (bp) (Basispaare), und in seiner Struktur enthält es sieben "Open Reading Frames" (ORFs) (offene Ablese rahmen), die für die viralen Proteine kodieren. Die ORFs sind als ORF1 bis ORF7 bezeichnet worden, und sie zeigen kleine überlappende Segmente zwischen sich. Es ist vor gebracht worden, daß die Synthese der viralen Proteine aus einer Gruppe subgenomischer Transkripte unterschied licher Länge (mRNA) erstellt wird, aber mit ähnlichem 3′ polyadenilierten Ende, und einer 5′-Führersequenz, die aus der nichtkodierenden 5′-Endsequenz herrührt. Diese Form eines viralen Proteinausdrucks wurde als inein andergesetzte mRNAs bezeichnet und ist zuvor für Coraniviren beschrieben worden (Spaan, W. J. M., Cavanagh, D., und Horzineck, M. C., J. Gen. Virol., 69: 2939-2952, 1988). Basierend auf der Lelystad-(LV)- und Tübingen-(TV)-PRRSV-Viralisolat-Nukleotidsequenz und durch Homologie mit dem, was bei anderen Arteriviren beobachtet worden ist, ist vorgebracht worden, daß bei dem viralen Genom, ORF1 (a und b) für virale Polymerase und Replicase kodieren. Die ORFs 2 bis 6 würden für die Viralhüllenproteine kodieren, und ORF7 würde für das Nucleocapsidprotein kodieren. Virale Replicase und Poly merase sind großbemessene Proteine, 260 bzw. 163 kDa, und beide von diesen enthalten drei mögliche Glyko silationsstellen. Die Hüllenproteine (ORFs 2 bis 6), am 3′-Ende angeordnet, sind klein, zwischen 30 und 19 kDa. Alle von diesen enthalten mehr als zwei mögliche Glyko silationsstellen, insbesondere ORF3, der 7 Stellen ent hält. Alle diese Proteine enthalten hydrophobische Se quenzen an den Amino-(N-)- und Carboxy-(C-)-Terminal enden, die als Führersequenz und Membrananker funktio nieren könnten. Allgemein, es sind hydrophobische Pro teine, gemäß ihrer Lokation mit einer Membran assozi iert. ORF6 sollte hervorgehoben werden, mit 3 hydro phobischen Segmenten, innerhalb der 90 Aminosäurereste an dem N-Terminalende angeordnet. Andererseits ist das Protein, durch ORF7 kodiert, möglicherweise dem viralen Nucleocapsid entsprechend, extrem basisch mit Arginin-, Lysin- und Histidinresten an dem N-Terminalende. Die Aminosäuresequenzen der LV- und TV-Viralpolymerase, die strukturellen Proteine und Nucleocapsid zeigen eine Identität von zwischen 29% und 67% im Vergleich mit dem LDV-Virus und zwischen 20% und 36% im Vergleich mit dem EAV-Virus. Dies legt nahe, daß die Evolution des PRRS-Virus enger am LDV als am EAV ist.

Die durch PRRSV hervorgerufene Krankheit ist für erheb liche Verluste in der Schweine-Industrie verantwortlich. Aus diesem Grund sind Vakzinen, welche die durch das PRRSV hervorgerufene Infektion zu verhindern vermögen, entwickelt worden.

Im allgemeinen handelt es sich bei den Vakzinen gegen das bekannte PRRSV, die in den Patentansprüchen WO 92/21375, WO 93/06211, WO 93/07898 und ES P9301973 um Vakzinen, die aus Viren gewonnen wurden, die an Makro phagen wuchsen und anschließend inaktiviert wurden. Die Patentanmeldung ES P9301973 sieht eine Vakzine vor, die fähig ist, das reproduktive und respiratorische Syndrom bei Schweinen (PRRS) zu vermeiden. Es hat sich gezeigt, daß die Vakzine wirksam ist beim Vermeiden reproduktiver Veränderungen bei Mutterschweinen, wie beispielsweise das Werfen totgeborener, mumifizierter oder lebender, aber schwächlicher Ferkel, Wiederholung von Estrus und ähnlicher Probleme, durch den Viruserreger von PRRS her vorgerufen. Ferner wurde verifiziert, daß die Vakzine zellulare Immunität in den vakzinierten Tieren hervor ruft. Die genannte Vakzine enthält eine geeignete Menge von PRRS-Viralantigen, spanische Abstammung (PRRS-Olot), inaktiviert, zusammen mit einem Adjuvans und einem Schutzmittel.

Die vorliegende Erfindung sieht eine Vakzine der zweiten Generation vor, bei welcher die rekombinante DNA-Techno logie angewendet worden ist, mit dem Ziel, neue Vakzinen zu erhalten, die fähig sind, wirkungsvoll vor der durch PRRSV hervorgerufenen Infektion zu schützen. Die Vak zinen dieser Erfindung enthalten mindestens ein rekombi nantes PRRSV-Protein. Andererseits sieht die vorliegende Erfindung neue PRRSV-Diagnostiksysteme oder -Kits vor, welche die Verwendung enzymatischer Immunprüfungstech niken (ELISA) mit sich bringen, die rekombinante PRRSV- Proteine verwenden. Diese neuen rekombinanten Vakzinen erfordern keine Manipulation des kompletten Virus, son dern lediglich nur eines Teils des Virus, wodurch die Gefahr eines Unfalls, der das Virus befreien würde, be seitigt wird, was einen beträchtlichen Vorteil gegenüber den derzeitigen inaktivierten PRRSV-Vakzinen darstellt.

Die Herstellung von rekombinanten Proteinen mittels "Genetic Engineering" ist eine Tatsache, die früher be schrieben worden ist. Zahlreiche Ausdrucks- und Herstel lungssysteme rekombinanter Proteine sind bekannt. Eines der effektivsten Systeme für die Großproduktion rekom binanter Proteine basiert auf der Replikation rekombi nanter Baculoviren, die von dem "Autographa californica nuclear polyhedrosis virus" (AcNPV), in Insektenzellen in einer Kultur, abstammen. Die Beschreibung der Baculo virus-Ausdrucksstechnik ist in den folgenden Artikeln beschrieben:

a) LucKow, V. A., & Summers, M. D., "Trends in the development of baculovirus expression vectors". Bio/Technology, 6: 47-55, (1988), und
b) Bishop, D. H. L., "Baculovirus expression vectors". Seminare in VIROLOGY, 3: 253-264, (1992).

Diese Erfindung sieht rekombinante PRRSV-Proteine vor, insbesondere des PRRS-Olot-Isolats, in einem Ausdrucks system von Baculoviren erzeugt, auf einer permissiven Gastzellenkultur vervielfacht. Die rekombinanten Baculo viren, die fähig sind, solche rekombinanten Proteine zu erzeugen, sowie die Transfer-Vektoren, die verwendet werden, bilden zusätzliche Ziele der Erfindung. Die Ver fahren für den Erhalt solcher rekombinanten Baculoviren und Proteine sind auch ein Ziel dieser Erfindung.

Die Erfindung sieht auch neue Vakzinen vor, zum Impfen von Schweinen, zu ihrem Schutz vor der durch PRRSV her vorgerufenen Infektion, die mindestens ein rekombinan tes Protein von jenen aufweisen, die durch diese Erfin dung vorgesehen werden, und einen adäquaten Träger oder ein adäquates Adjuvans.

Die Erfindung sieht auch ein Diagnostik-Kit vor, um das Vorhandensein von Antikörpern zu ermitteln, die das PRRSV in einer biologischen Probe von Schweinen z. B.: Blut, Serum, Sputum, Speichelflüssigkeit oder Milch) spezifisch erkennen. Das Kit weist mindestens ein rekom binantes Protein von jenen auf, die durch diese Erfin dung vorgesehen werden, und adäquate Feststellungsver fahren.

Die Erfindung sieht auch ein Diagnostik-Kit vor für die Feststellung des Vorhandenseins eines Antigens (PPRSV) in einer biologischen Probe von Schweinen (z. B.: Blut, Serum, Sputum, Speichelflüssigkeit, Milch oder Gewebe). Das Kit weist mindestens einen Antikörper auf, der das PRRSV spezifisch erkennt, durch Immunisieren der Tiere erhalten, mit mindestens einem rekombinanten Protein von jenen, die durch diese Erfindung vorgesehen werden, und adäquate Feststellungsmittel.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die konsekutive Sequenz der 3383 bp, aus dem PRRS-Olot-Isolat geklont.

Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz, die den Proteinen entspricht, die durch ORF2 (Fig. 2A), ORF3 (Fig. 2B), ORF4 (Fig. 2C), ORF5 (Fig. 2D), ORF6 (Fig. 2E) und ORF7 (Fig. 2F) kodiert sind.

Fig. 3 zeigt die verschiedenen Extensionen der Klone pPRRS-8, pPRRS-108, pPRRS-121, pPRRS-132, pPPRS-146, pPPRS-147, pPPRS-148, pPRRS-153 und pPRRS-3, im Vergleich mit LV, sowie die ORFs, die in jedem einzelnen von diesen enthalten sind. In dieser Figur wird Bezug genommen auf das PRRSV-Genom (a), Größe im Kb (b) und Anzahl der Klone (c).

Fig. 4 zeigt den pPRRS-3-Klon, der das Gen des Proteins, durch ORF2 kodiert, enthält.

Fig. 5 zeigt den pPRRS-121-Klon, der das Gen des Proteins, durch ORF3 kodiert, enthält.

Fig. 6 zeigt den pPRRS-146-Klon, der das Gen des Proteins, durch ORF4 kodiert, enthält.

Fig. 7 zeigt den pPRRS-132-Klon, der das Gen des Proteins, durch ORF5 kodiert, enthält.

Fig. 8 zeigt den pPRRS-8-Klon, der die Gene des Proteins, durch ORF6 und ORF7 kodiert, enthält.

Fig. 9 zeigt die Ergebnisse aus einer Antigentitra tion durch ELISA (Absorbanz überwacht bei 405 nm). In der Figur wird Bezug genommen auf die Antigentitration (a), die Absorbanzwerte, bei 405 nm abgelesen (b), und die Antigenverdün nungen [in Einheiten von 1/ ] (c).

Fig. 10 zeigt die Ergebnisse aus der Titration durch ELISA, eines PRRS-Feldserums, in einem infi zierten Tier erzielt. Die Figur bezieht sich auf die Titration des Serums (a), die Absor banzwerte, bei 405 nm abgelesen, (b), und die Serumverdünnungen [in Einheiten von 1/ ] (c).

Fig. 11 zeigt die Ergebnisse, aus einem Probenahme experiment erzielt, mit einigen Dutzend Feld sera. Die Figur bezieht sich auf die Titration der Sera (a), die Absorbanzwerte, bei 405 nm abgelesen, (b) und die Sera (c).

Beschreibung der Erfindung

Unser Labor hat in den letzten Jahren Forschungsarbeiten hinsichtlich des PRRS-Erregers geleistet. Die hauptsäch liche Folge hiervon war die Isolation des Virus, das mit PRRS-CY-JPD-P5-6-91 bezeichnet wurde. Es wurde bei der ECACC (mit der Zugangsnummer V93070108) deponiert, und eine Vakzine wurde gegen das PRRSV entwickelt, die das inaktivierte Virus enthielt (Patentanmeldung ES P9301973).

Seitdem waren unsere Forschungsbemühungen auf die Isola tion und das Klonen des PRRSV-(PRRS-CY-JPD-P5-6-91)- Genoms gerichtet, das in dieser Beschreibung mit PRRS- Olot bezeichnet ist, um die Entwicklung neuer rekombi nanter Vakzinen zu ermöglichen, die gegen die durch das PRRSV hervorgerufene Infektion wirksam sind. Zu diesem Zweck ist ein Genomsegment des genannten PRRS-Olot- Genoms geklont worden. Das geklonte Fragment entspricht dem 3′-Viralgenom und stellt eine konsekutive Sequenz von 3.383 bp dar. Dieses Segment enthält die sechs "Open Reading Frames" (offene Ableserahmen), die den für das LV und das TV beschriebenen ORFs 2 bis 7 ent sprechen. Sie kodieren für die strukturellen Proteine des Virus (Nucleocapsid und Hülle), die möglicherweise mit der viralen Antigenizität und Immunogenizität zusammenhängen. Die Proteine, die durch PRRS-Olot ORFs 2 bis 7 kodiert sind, sind den entsprechenden LV- und TV-Proteinen ähnlich. Ihre Charakteristika sind in Tabelle 1 zusammengefaßt, in der, in Relation zu jedem ORF, die relativen Positionen der Nukleotide, die Anzahl der Basispaare (bp), die Anzahl der Aminosäuren (Aac), das Molekulargewicht jedes Proteins (in KDa) und die Glykosilationsstellen angegeben sind.

Tabelle 1

Charakteristika der PRRS-Olot-Virus-ORFs

Fig. 1, die dieser Beschreibung beigefügt ist, zeigt die vollständige konsekutive Sequenz der 3.383 bp des geklonten Fragments entsprechend dem 3′-Ende des PRRS- Olot-Viralgenoms. Diese Nukleotidsequenz zeigt 95% Homologie im Vergleich mit den entsprechenden Sequenzen der LV- und TV-Isolate. Diese zwei letzten Isolate zei gen, unter sich, 99% Homologie. Die Veränderungen bei der Nukleotidsequenz des PRRS-Olot-Isolats finden sich über die gesamte Sequenz, sind aber besonders im 5′-Ende konzentriert. Im Vergleich mit LV sei auf den Wegfall der drei Nukleotide an Position 1860 des PRRS-Olot beson ders hingewiesen.

Die Fig. 2 (2A-2F) dieser Beschreibung zeigt die Amino säuresequenzen der Proteine, die durch die ORFs 2 bis 7 des PRRS-Olot-Virus kodiert sind. Auf Proteinebene ist 99% Homologie festzustellen zwischen PRRS-Olot und LV ORF7, wie für ein Nucleocapsid-Viralprotein erwartet, und daher das konserviertere. Der Prozentsatz an Homolo gie für den Rest der Proteine beläuft sich zwischen 93% für die ORFs 3, 4 und 5, wobei ein Wert von 96,5% für die ORFs 2 und 6 erreicht wird. Alle von diesen lassen Glykosilationsstellen erkennen ähnlich jenen, die für LV beschrieben wurden, außer für ORF4 des PRRS-Olot-Virus, das eine Extraglykosilationsstelle aufweist. In bezug auf die oben aufgeführten Veränderungen bei den PRRS- Olot-Protein-Aminosäuren sind 50% der Veränderungen zu chemisch ähnlichen Aminosäuren vorhanden, während der Rest der Veränderungen zu unterschiedlichen Aminosäuren vorhanden ist. Wie für LV, ausgenommen ORF7, erwähnt, stellt der Rest der Proteine ein hohes Maß an Hydropho bizität dar, möglicherweise in Übereinstimmung mit ihrer Assoziation zu Membranen, da sie Viralhüllenproteine sind.

Rekombinante Proteine entsprechend dem Ausdruck PRRS- Olot ORFs 2 bis 7 können in einem entsprechenden Aus druckssystem produziert werden und vorteilhaft in einem Ausdruckssystem rekombinanter Baculoviren, in einer per missiven Gastzellenkultur vervielfacht. Das globale Ver fahren für die Erlangung dieser rekombinanten Proteine weist im Grunde die folgenden allgemeinen Stufen auf:

I. Vorbereitung der cDNA-Sequenz, die in ein Baculo virus einzufügen ist, und
II. Erlangung rekombinanter Baculoviren, welche die rekombinanten Proteine ausdrücken.

Diese allgemeinen Stufen sind wiederum in andere Unter stufen unterteilt. In dieser Weise weist die Präparation der cDNA-Sequenz, die einzufügen ist, folgende Unter stufen auf:

I.a Isolation und Purifikation des PRRS-Olot-Virus;
I.b Isolation des viralen RNA des PRRS-Olot-Virus, und
I.c Synthetisieren der cDNA aus der PRRS-Olot-Genom- RNA.

Andererseits weist die Erlangung rekombinanter Baculo viren, welche die rekombinanten Proteine ausdrücken, die den PRRS-Olot-ORFs 2 bis 7 entsprechen, folgende Unterstufen auf:

II.a Präparation des PRRS-Olot-ORF-Gens, das einzufü gen ist.
II.b Einfügen des genannten Gens in einen Baculovirus- Transfer-Vektor.
II.c Transfektion permissiver Gastzellen mit dem genannten Transfer-Vektor, dem das entsprechende PRRS-Olot-ORF-Gen eingefügt wurde.
II.d Selektion der rekombinanten Baculoviren, die das rekombinante Protein ausdrücken, das dem einge setzten ORF entspricht.

Die Charakterisierung der rekombinanten Baculoviren und die Analyse und Purifikation der rekombinanten Proteine wird dann durchgeführt.

Alle diese Stufen werden nachfolgend in dieser Beschrei bung im einzelnen beschrieben.

Das Verfahren, das für die Erlangung der rekombinanten Proteine, die durch diese Erfindung vorgesehen werden, angewendet wird, beginnt mit der Isolation und Purifika tion des PRRSV, spezifisch PRRS-Olot, gemäß dem in Bei spiel 1 beschriebenen Protokoll. Sobald das PRRS-Olot isoliert und purifiziert worden war, wurde die virale RNA isoliert, und zu diesem Zweck wurde ein im Handel erhältliches Kit (Pharmacia) verwendet, das eine Methode anwendet, die auf der Selektion und Purifikation der viralen RNA basiert, die eine Poly(A)-Sequenz am 3′-Ende enthält (Beispiel 2). Die erhaltene RNA wurde in neutra len Agarose-Gels mit 0,7% analysiert, durch Beflecken mit Ethidiumbromid, und nur ein einziges Materialband mit einem Molekulargewicht zwischen 5000 und 23000 bp wurde festgestellt.

Danach wurde die cDNA, die der 3′-End-Viral-RNA ent spricht, synthetisiert (Beispiel 3), mit einem im Handel erhältlichen Kit (Boehringer), durch eine Strategie, die einen Vorteil aus dem Vorhandensein eines Poly(A)- Schwanzes zieht und ein Oligo d(T) als Extensionsprimer verwendet, der fähig ist, mit einem umgekehrten Trans kriptase-Enzym verlängert zu werden, und die cDNA-Mole küle synthetisiert. Um die 3′-stromaufwärts-RNA- Regio nen zu klonen, wurde ein Oligonukleotid an eine spezi fische virale Genomsequenz, die ungefähr bei 2500 bp vom 3′-Ende her angeordnet ist, verwendet. Eine zweite Syn these wurde durchgeführt, unter Verwendung eines Oligo nukleotids von 20 Nukleotiden statt des Oligo d(T)₁₂ (Beispiel 3.1). Eine cDNA-Synthese wurde verifiziert und quantifiziert durch Zählung der Radioaktivität, die in dem synthetisierten Material vorhanden ist, und Elektro phorese in alkalischen und neutralen Agarose-Gels. Da nach wurde das Klonen und Sequenzieren der cDNA durchge führt (Beispiel 3.2). Zu diesem Zweck wurde als erstes eine Größenselektion der synthetisierten cDNA-Fragmente von zwischen 1000 und 5000 nt (Nukleotide) durchgeführt. Die purifizierte cDNA wurde geklont in den stumpfen Enden im Vektor pMTL25. Die Analyse der PRRSV-positiven Klone wurde mittels Plasmid-DNA-Präparationen und Dar stellung bzw. Zuordnung der Restriktionsstellen, auf der Grundlage der LV-Sequenz, vorgenommen. Nur 9 der 300 analysierten Plasmide waren positiv und enthielten Ein fügungen zwischen 800 und 2600 bp. Die definitive Veri fikation der Authentizität dieser cDNA-Klone wurde durch ihr direktes Sequenzieren durchgeführt, unter Verwendung der Dideoxys-Methode, auf doppelsträngige Plasmide ange wendet.

Die Majorität der erhaltenen positiven PRRS-Klone ent hielt ein gemeinsames Poly(A)-Ende und unterschiedliche 5′-Enden. Die Klone wurden bezeichnet mit pPRRS-8, pPRRS-108, pPRRS-121, pPRRS-132, pPRRS-146, pPRRS-147, pPRRS-148 und pPRRS-153.

Der Klon pPRRS-3 wurde aus der zweiten Synthese extra hiert.

Um die rekombinanten Baculoviren zu erhalten, welche die Gene der Proteine ausdrücken, durch PRRSV- Olot ORFs 2 bis 7 kodiert, wurde dem folgenden Verfahren allgemein und separat gefolgt:
Zuerst wurde das Gen aus jedem einzufügenden ORF präpa riert, ausgenommen das ORF3-Gen, das keine vorherige Präparation benötigte. Für die Präparation dieser Gene und abhängig von jedem besonderen Fall wurden die pMTL25-, pMTL24- und pMTL22-Plasmide verwendet, bevor sie in Baculovirus-Transfer-Vektoren transferiert wur den. Die den ORFs 2 bis 7 entsprechenden Gene wurden aus den Klonen erlangt, die vorher erlangt worden waren. Nach sukzessiven Manipulationen ließen sie neue rekombi nante Plasmide entstehen. Die rekombinanten Plasmide, welche die Gene enthielten, jedem eingefügten ORF ent sprechend, wurden purifiziert gemäß der alkalischen Lösungstechnik, und wurden gekennzeichnet durch Dar stellen mit Restriktions-Endonucleasen und Sequenzieren der Einfügungsregionen. Die neuen Vektoren, die erzielt wurden, wurden mit pPRRS-ORFN bezeichnet, wobei N die Anzahl jedes ORF (N = 2 bis 7) bedeutet.

Dann wurde jedes ORF-Gen in einen geeigneten Trans fer-Vektor geklont. Der Transfer-Vektor, der verwendet wurde, war pAcYM1 (Matsuura et al., J. Gen Virol. 68, 1233-50). Nach sukzessiven Manipulationen entstanden neue rekombinante Plasmide, wobei jeweils eins von diesen das eingefügte ORF-Gen enthielt. Die rekom binanten Plasmide, die erzielt wurden, wurden purifi ziert gemäß der alkalischen Lösungstechnik und ge kennzeichnet durch Darstellen mit Restriktions-Endonu cleasen. Die Einfügungsenden wurden sequenziert, um die richtige Einfügungsregionsequenz zu verifizieren. Die neuen Transfer-Vektoren, die erzielt wurden, wurden ana lysiert, um zu verifizieren, daß die eingefügten Gene die richtige Ausrichtung für ihren Ausdruck durch den AcNPV-Virus-Polyhedrin-Promoter hatten. Die Transfer- Vektoren, die erlangt wurden, waren:

Bezeichnung
ORF
pPRRS-Bac8
2
pPRRS-Bac2	3
pPRRS-Bac9	4
pPRRS-Bac3	5
pPRRS-Bac5	6
pPRRS-Bac7	7

Spodoptera-Frugiperda-Zellen, Klon Sf 9, wurden dann transfektiert bzw. transfiziert mit Mischungen purifi zierter, infektiöser DNA des AcRP23-lacZ-Stammvirus und des entsprechenden Transfer-Vektors. Sobald diese Trans fektion durchgeführt worden war, wurden die rekombinanten Baculoviren identifiziert durch Plaque- Farben-Phenotyp-Untersuchung nach dem Beizen der viralen Nachkommenschaft mit X-Gal und dann purifiziert.

Die rekombinanten Baculoviren, die erzielt wurden, wur den in der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, Whiltshire SP4 OJG, (Vereinigtes Königreich), deponiert.

Die Beispiele 4 bis 9 beschreiben im einzelnen die Er langung der rekombinanten Baculoviren, welche die Gene ausdrücken, die entsprechend durch ORFs 2 bis 7 kodiert sind.

Die PRRS-Olot-ORF-2-bis-7-Rekombinant-Proteine können zu Diagnosezwecken verwendet werden, um das Verhandensein spezifischer PRRSV-Antikörper festzustellen (Beispiel 12), und um das Vorhandensein von Antigen (PRRSV) fest zustellen, mittels Antikörpern, die das PRRSV spezifisch identifizieren, durch Immunisierung von Tieren mit min destens einem rekombinanten Protein, entsprechend einem der PRRS-Olot-ORFs 2 bis 7. Darüber hinaus können diese Proteine auch verwendet werden, um Tiere gegen das PRRSV zu immunisieren. Daher können die genannten Proteine verwendet werden, um rekombinante Vakzinen zu formulieren, die fähig sind, Schweine vor durch PRRSV hervorgerufener Infektion wirksam zu schützen. Diese Vakzinen können aktiv oder passiv sein. Aktive Vakzinen können präpariert werden durch Suspendieren von mindestens einem der rekombinanten Proteine, die durch diese Erfindung vorgesehen werden, in einem immunolo gisch akzeptablen Verdünnungsmittel und einem Adjuvans. Eine passive Vakzine kann erlangt werden durch Immu nisieren von Tieren mit den genannten Proteinen und Isolieren der polyklonalen Antikörper gegen die genann ten Proteine. Nach der Antikörperisolation und Purifi kation können sie bei Vakzine-Anwendungen verwendet wer den.

Bei einer spezifischen Realisierung dieser Erfindung werden rekombinante Vakzinen gewonnen, die fähig sind, vor der durch PRRSV hervorgerufenen Infektion wirksam zu schützen, wobei sie das virale Antigen (antigene Phase), zusammen mit einem immunologisch akzeptablen Verdün nungsmittel und einem Adjuvans, aufweisen.

Für die Präparation der antigenen Phase wurden Insek tenzellen - vorzugsweise Zellen der Spodoptera frugi perda - mit den diversen rekombinanten Baculoviren infiziert, die fähig sind, die rekombinanten Proteine, die den PRRSV ORFs 2 bis 7 entsprechen, zu produzieren, und unter Bedingungen, die für den Ausdruck der genann ten Proteine geeignet sind, inkubiert. Unmittelbar da nach wurden die Zellen gesammelt, gewaschen, in einem geeigneten Puffer resuspendiert und dann für die Präpa ration der vorgenannten rekombinanten Vakzinen verwen det.

Bei einer spezifischen Realisierung setzt sich die antigene Phase aus einem Homogenat von Insektenzellen zusammen, die mit rekombinanten Baculoviren infiziert wurden, die ein einzelnes rekombinantes PRRSV-Protein, wie, vorzugsweise, ORF3, ORF5 und ORF7 ausdrücken, (Bei spiel 13). Bei einer anderen spezifischen Realisierung setzt sich die antigene Phase aus einem Homogenat einer Mischung von Insektenzellen zusammen, die mit unter schiedlichen rekombinanten Baculoviren infiziert wurden, wobei jedes von diesen ein unterschiedliches rekombinan tes PRRSV-Protein ausdrückt, wie beispielsweise eine Mischung aus Insektenzellen, die mit den rekombinanten Baculoviren infiziert wurden, die, zum Beispiel, die Proteine ausdrücken, die ORF3, ORF5 und ORF7 ent sprechen.

Im allgemeinen wurden Vakzinen formuliert, die als anti gene Phase einen Betrag von etwa 50×10⁶ Insektenzellen enthalten, die mit Baculoviren infiziert wurden, wodurch das betreffende rekombinante Protein ausgedrückt wurde. Wenn die Vakzine diverse rekombinante Proteine enthält, setzt sich die antigene Phase aus einer Menge von etwa 50×10⁶ Insektenzellen zusammen, die mit Baculoviren ge mäß dem betreffenden rekombinanten Protein infiziert wurden, d. h., für eine Formulierung einer Vakzine, wel che die Proteine enthält, die den ORFs 3, 5 und 7 ent sprechen, setzt sich die antigene Phase zusammen aus etwa 50×10⁶ Insektenzellen, die mit Baculoviren infi ziert wurden, die das ORF3 rekombinante Protein aus drücken, 50×10⁶ Insektenzellen, die mit Baculoviren in fiziert wurden, die das ORF5 rekombinante Protein aus drücken, und 50×10⁶ Insektenzellen, die mit Baculoviren infiziert wurden, die das rekombinante ORF7 Protein ausdrücken, (Beispiel 13).

Phosphatgepufferte Salzlösungen (PBS) oder andere ähn liche Salzlösungen können als immunologisch akzeptable Verdünnungsmittel verwendet werden.

Als Adjuvans können im allgemeinen irgendwelche der Ad juvanzien, die üblicherweise verwendet werden, um Vakzi nen zu formulieren, verwendet werden, entweder wäßrige - wie beispielsweise Aluminiumhydroxid-, Aluminiumoxid- Gel-Suspensionen, QuilA - oder andere, wie ölige Adju vanzien auf der Grundlage von Mineralölen, Glyceriden und ölhaltigen Äthersäurederivaten. Insbesondere ist be stätigt worden, daß ein öliges Adjuvans, das aus einer Mischung von Marcol® 52, Simulsol® 5100 und Montanide® 888 besteht, sehr gute Ergebnisse mit sich bringt. Marcol® 52 ist ein Mineralöl geringer Dichte, das durch ESSO Española S. A. hergestellt wird, Simulsol® 5100 ist ein polyäthoxyoleatäther, durch SEPIC vertrieben, und Montanide® 888 ist ein Anhydromannitoctadecenoatäther hoher Reinheit, durch SEPIC vertrieben. Die Vakzinen dieser Erfindung können auch Zellreaktions-Potentiator- (CRP)-Substanzen enthalten, d. h., Substanzen, die Helfer-T-Zell-Subpopulationen (Th₁ und Th₂) potenzieren, wie beispielsweise IL-1 (interleukin-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN (gamma interferon), Zellnekro sefaktor, und ähnliche Substanzen, die theoretisch Zellimmunität in vakzinierten Tieren hervorrufen könn ten. Diese CRP-Substanzen könnten in Vakzine-Formulie rungen mit wäßrigen wie auch öligen Adjuvanzien ver wendet werden.

Gleichermaßen können andere Arten von Adjuvanzien, wel che die Zellreaktion modulieren und immunostimulieren, verwendet werden, wie beispielsweise MDP (muramyl dipeptide), ISCOM (Immuno Stimulant Complex) oder Liposome.

Die Vakzinen dieser Erfindung können dadurch erzielt werden, daß die antigene Phase mit dem immunologisch akzeptablen Verdünnungsmittel und dem Adjuvans suspen diert oder gemischt wird. Wenn das Adjuvans ölig ist, bildet sich eine Emulsion, die - in einem spezifischen und bevorzugten Fall -, falls das Adjuvans eine Mischung aus Marcol 52, Simulsol 5100 und Montanide 888 ist, die Vakzine eine doppelte Wasser/öl/Wasser-Emulsion, Typ w/o/w, sein wird.

In dem Fall, daß die Vakzine CRP-Substanzen enthalten wird, können diese Substanzen der antigenen Phase wie auch dem Adjuvans beigegeben werden. Alternativ können, falls die Vakzine keine CRP-Substanzen enthält, diese injiziert werden, falls gewünscht, gleichzeitig in eine separate Stelle unterschiedlich von der Einimpfung stelle.

Darüber hinaus können diese Vakzinen Kombinationen von verschiedenen Schweinekrankheitserregern, die, außer einem rekombinanten PRRSV-Protein oder mehr, einen oder mehr der nachfolgend aufgeführten Krankheitserreger auf weisen, wodurch die Präparation von polyvalenten Vak zinen ermöglicht wird. Unter diesen Pathogenen, aber nicht ausschließlich auf diese beschränkt, sind Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, porcine parvovirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopatiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Porcine respiratory corona virus, Rotavirus, oder gegen die Pathogene, welche die Aujeszkysche Krankheit, Schweine-Influenza und die an steckende Gastroenteritis auslösen.

Sicherheits- und Wirksamkeitserprobungen mit den Vakzi nen der vorliegenden Erfindung haben den Beweis er bracht, daß die genannten Vakzinen sicher und gleich zeitig wirksam sind.

Es ist möglich gewesen, zu bestätigen, daß eine Dosis von 2 ml einer Menge des viralen Antigens oder der anti genen Phase, gleich oder höher als 50×10⁶, Insekten zellen infizierte, die ein oder mehrere der rekombinan ten PRRSV-Proteine ausdrückten, über die tiefe intramus kuläre Bahn verabreicht, von einer Nachimpfung mit einer Dosis von 2 ml der Vakzine gefolgt, vakzinierte Tiere vor der durch das PRRSV hervorgerufenen Infektion wirk sam zu schützen vermag.

Gleichermaßen ist es möglich gewesen, zu verifizieren, daß einige der Vakzinen, die Gegenstand der Erprobung waren, - jene, die als rPRRS C und rPRRS D identifiziert sind -, fähig sind, zellulare Immunität in vakzinierten Tieren einzubringen, auf der Grundlage der Tatsache, daß Mutterschweine, mit den genannten Vakzinen geimpft und nachgeimpft, zum Zeitpunkt der Herausforderung keine serologischen Ergebnisse zeigten, und trotzdem waren sie geschützt, (Beispiel 14, Tabellen 4 und 10).

Mit dem Zweck, die Wirksamkeit der präparierten rekombi nanten Vakzinen bei der Verhütung von PRRS bei trächti gen Mutterschweinen festzustellen und zu bewerten, wurde eine Erprobung ausgearbeitet, die aus der Vakzinierung trächtiger Mutterschweine mit den verschiedenen Vakzinen bestand, und danach wurden sie einem Discharge-Test mit einem virulenten Virus unterzogen. Auf der Grundlage der erzielten Ergebnisse ist es möglich gewesen, die Wirk samkeit der Vakzinen, die Gegenstand dieser Erprobung waren, auszuwerten. Um die Wirksamkeit dieser Vakzinen zu bewerten, wurden die reproduktiven Resultate, die Anzahl der Ferkel, lebend und tot, auf den verschiedenen Stufen des Lebenszeitraums der Ferkel, sowie die Analyse der serologischen Ergebnisse bei Mutterschweinen und Ferkeln berücksichtigt, (Beispiel 14).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung (Beispiele) Beispiel 1 - Erlangung und Purifikation des PRRS-Olot- Virus 1.1 - Erlangung alveolärer Makrophagen der Schweinelunge 1.1.1 - Tiere

7 bis 8 Wochen alte Schweine, eine Kreu zung zwischen Belgische Landrasse und Large-White-Züch tungen, wurden verwendet. Die Tiere, von unseren eigenen landwirtschaftlichen Betrieben, waren seronegativ gegen über den folgenden Krankheiten: Aujeszkysche Krankheit, Schweine-Parvovirose, Maul- und Klauenseuche, klassi sches Schweinefieber, Schweine-Influenza (Typen H1N1 und H3N2) und ansteckende Gastroenteritis.

1.1.2 - Isolierung von Makrophagen

Die Tiere wurden anästhesiert durch Injizieren, in die Halsader, von 0,1 g Natriumthiopental für jeweils 10 kg Körpergewicht. Dann wurden sie schmerzlos getötet, und die Lungen wur den extrahiert, nachdem die Trachea unterhalb der Epi glottis abgebunden worden war und über der Abbindung ab geschnitten worden war. Die extrahierte Lunge wurde ex tern mit PBS gewaschen. Sukzessive interne Waschungen wurden vorgenommen (4 bis 5) mit einer Gesamtheit von 500 ml PBS, durch Antibiotika mit 1 : 500 ergänzt (PEG- Lösung: 1000 IU/ml Penicillin, 1 mg/ml Streptomyzin und 0,5 mg/ml Gentamizin), um Makrophagen zu erhalten. Diese Waschungen wurden gemeinsam gesammelt und 15 Minuten lang mit 300 g zentrifugiert. Der folgende Schritt be stand darin, die Zellen zweimal mit PBS zu waschen durch konsekutive Zentrifugierung/Sedimentation, um schließ lich in einem DMEMs-Medium zu resuspendieren (DMEM er gänzt durch nichtessentielle Aminosäuren mit 100x, GIBCO), das Natriumpyruvat 1 mM und Antibiotika (1 : 1000 PEG) enthielt.

Die Zellen wurden gezählt durch Färben mit Trypanblau in einer Newbauer-Kammer. 0,1 ml einer 10^-1 Makrophagen- Suspension wurde 0,4 ml von DMEMs hinzugefügt und 0,5 ml Trypanblau-Lösung. Bei der Mehrheit der Fälle war die Anzahl der Zellen, die erlangt wurden, zwischen 1 bis 1,2×10⁹.

Sterilitätskontrollen wurden durchgeführt an den Makro phagenzellen mittels Keimen in Kulturmedien, die für die Feststellung von Bakterien und Pilzen geeignet sind. Das Nichtvorhandensein von Mykoplasma wurde verifiziert durch zytochemische Ermittlung mit DAPI (4′,6-diamidino- 2-phenylindole), das sich selektiv an die DNA anfügt und DNA-DAPI-Fluoreszenz-Komplexe hoher Spezifizität bildet.

1.2 - Replikation des Virus in alveolären Makrophagen von Schweinen

Zellkultur-Glasschalen (150 cm²) wurden verwendet, die 100 ml einer Makrophagensuspension (3×10⁶ Zellen/ml) in dem oben beschriebenen DMEMs- Medium enthielten, abgesehen von der Hinzufügung föta len Kalbsserums (FCS) bei 5%. Die Zellen wurden mit dem PRRS-Olot-Virus infiziert, durch Laboratorios Sobrino isoliert und bezeichnet mit PRRS-JPD-P5-6-91 (ECACC, Zu gangsnummer V93070108). Eine Infektion wurde durchge führt mit 10^-3 Infektionsmultiplizität, und die infi zierten Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37°C inku biert. Nachdem diese Zeit vergangen war, wurde das Medium entnommen und durch frische DMEMs ersetzt, die 2% FCS und Antibiotika enthielten; die Inkubation wurde bei 37°C fortgesetzt.

Die Kulturen wurden periodisch mit dem Mikroskop beob achtet, um die zytopathische Wirkung [cytopathic effect] (CPE) festzustellen, die durch das Virus an den Makro phagen hervorgerufen wurde. Im allgemeinen war der CPE nach 3-4 Infektionstagen 70-80%. Sehr große deformierte Zellen erschienen. Normalerweise war der Titer dieser Präparationen 10^6,55 TCID₅₀/ml (Gewebekultur-Infektions dosis 50 pro Milliliter). Die mit 10^-4 Multiplizität in fizierten Makrophagen brachten virale Ausbeuten, um eine Größenordnung kleiner, hervor.

Das Vorhandensein des Virus in diesen Zellen wurde durch die Immunoperoxidase in Mono-Schicht-Erprobung an Schweinemakrophagenzellen, die erlangt wurden, wie in Beispiel 1 (1.1.2) beschrieben, ermittelt. Kurz zusam mengefaßt, dies wurde in folgender Weise durchgeführt: In Titrations-Probenträgern mit 96er Raster wurden 100 µl der Makrophagen infiziert mit 50 µl des PRRS-Olot- Virus, an Makrophagen repliziert. Die Probenträger wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Sobald die Inkubation durchgeführt war, wurde das Medium entzogen, und die Probenträger zweimal mit Salzlösung (0,1 M NaCl) gewaschen. Anschließend wurden sie mit 20% Formaldehyd fixiert, nach konsekutiven Inkubationen bei 37°C, -30°C und Formaldehyd bei 20%. Nach zweimaligem Waschen mit Salzlösung 50 µl eines Verdünnungsmittels 1 : 50 eines Anti-PRRS-Serums von einem experimentell infizierten Tier. Gleichzeitige Inkubationen wurden durchgeführt mit einem negativen Serum von einem nichtinfizierten Tier. Die Inkubation dauerte 1 Stunde bei 37°C. Nach Entfernung der vorherigen Lösung wurden sie zweimal mit Salzlösung gewaschen. Sofort wurde 0,1 µg des Proteins A (Sigma) in 50 µl beigegeben und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Erprobung wurde mit AEC (3-amino-9-ethyl-carbazole) entwickelt, in Dimethylformamid gelöst, bei Vorhanden sein eines Acetat-Puffermittels und Wasserstoffsuper oxid. Nach 15-30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunklen wurden die Platten mikroskopisch untersucht. Die infizierten Zellen erschienen dunkelrot gefärbt, ver glichen mit nichtinfizierten Zellen, die farblos waren.

1.3 - PRRS-Virus-Purifikation

Das Virus wurde von PRRSV-infizierten Zellkulturen her purifiziert. Die Kul tur wurde mittels Zentrifugierung geklärt (20 Minuten, 6500 g). Der Überstand wurde 10× konzentriert, unter Verwendung eines Millipore -Minitan -Ultrafiltrationssy stems (4,5 pSi, Filter 300 kDa Porengröße). Dann wurde das Virus sedimentiert mittels Zentrifugation (5 Stun den, 20000 g). Der Überstand wurde entfernt, und das Präzipitat wurde mit PBS, das 1 mM Phenylmetylsulfonyl fluorid (PMSF) (Sigma) enthielt, über Nacht löslich ge macht bei 4°C. Das Virus wurde purifiziert in einem diskontinuierlichen Sucrosegradienten (20-50% w/v in PBS), mittels Zentrifugierung mit 95000 g, 3 Stunden lang. Sobald die Zentrifugierung durchgeführt worden war, wurde das Band, welches das Virus enthielt, aus dem Gradienten extrahiert, mit einem Tris/EDTA-Puffermittel verdünnt und schließlich über Nacht zentrifugiert mit 26000 g, zur Virus-Sedimentation.

Das purifizierte Virus wurde analysiert mittels Elek trophorese in Polyacrilamid-SDS-Gels bei 12% (Laemmli, U. K., Nature, 227: 680, 1970). Das Gesamtprotein wurde ermittelt durch Färben mit "coomassie blue" und Immuno blots (Towbin, H., Staehelin, T., und Gordon, J., 1979. Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354). Die Blots wurden entwickelt mit Peroxidase-Protein-A-(Sigma)-Kon jugat, unter Verwendung eines konvaleszenten Anti-PRRSV- Serums. Es war nicht möglich, irgendein spezifisches Band festzustellen, das mit PRRSV zusammenhing, in coomassiegefärbten Gels, wegen der Verseuchung mit Pro teinen von den Makrophagen her. Jedoch wurden verschie dene virale Proteine mit Molekulargewichten zwischen 15,5 und 30 KDa durch Immunoblot identifiziert. Bei längeren Entwicklungszeiten war es auch möglich, Bänder mit Molekulargewichten über 60 KDa festzustellen, aber da diese auch in nichtinfizierten Makrophagen ermit telt wurden, wurde gefolgert, daß es sich dabei nicht um PRRS-Virus-bezogene Proteine handelte.

Beispiel 2 - Isolierung der viralen RNA

Ein im Handel erhältliches Pharmacia P-L Biochemicals Kit wurde verwendet.

Die Methode basiert auf der Selektion und Purifizierung der viralen RNA, die einen 3′-End-Poly(A)-Schwanz ent hält. Der virale Capsid-Bruch wurde durchgeführt mit einer Guanidiniumchlorid-Purifizierung der RNA-Poly(A) mit einer Oligo-Cellulose-(dT)-Matrix.

Kurz zusammengefaßt, die Isolierung der PRRS-Olot- Virus-RNA wurde in folgender Weise durchgeführt: Das purifizierte Virus wurde durch Übernacht-Zentrifugierung mit 40 000 g sedimentiert. Danach wurde der Überstand entfernt und das Präzipitat mit 4,0 ml des Kit- Extraktions-Puffermittels löslich gemacht. Nach Adsorp tion in die Cellulose-d(T)-Matrix und anschließenden Waschungen mit Puffermitteln niedriger und hoher Salz konzentration wurde die RNA-Poly(A) mit hoher ClNa-Kon zentration eluiert. Die RNA wurde präzipitiert durch Hinzufügen eines 1 : 10-Volumens von 2,5 M Kaliumacetat, 0,25 mg/ml Glykogen und 2 Volumen Äthanol (< 2 Stunden bei -20°C). Sobald diese Zeit verstrichen war, wurde die RNA rückgewonnen durch Zentrifugierung bei 16000 g, 30 Minuten lang. Nach Waschen des Präzipitats mit Äthanol von 75% wurde es in 20 µl eines TE-Puffer mittels (10 mM Tris-ClH, pH = 8,0, und 1 mM EDTA) resuspendiert.

Die erhaltene RNA wurde in 0,7% neutralen Agarose-Gels analysiert durch Färben mit Ethidiumbromid. Ein einzel nes Materialband innerhalb eines Molekulargewichts von 5000 bis 23000 bp wurde festgestellt. Das Nichtvorhan densein von Material mit niedrigem Molekulargewicht muß hervorgehoben werden und daher die Möglichkeit einer zellularen DNA oder RNA. Jedoch war der Betrag des Mate rials, der erzielt wurde, gering, nicht höher als 100 ng RNA/250 ml der mit dem Virus infizierten Makrophagen kultur. Diese geringe Ausbeute stimmt mit der geringen Ausbeute des purifizierten Virus überein, wie durch die Elektrophorese in Polyacrilamid-Gels und Elektronenmi kroskopie bewiesen (Daten nicht dargestellt).

Beispiel 3 - cDNA-Synthese aus der PRRS-Olot-Virus- Genom - RNA 3.1 - Präparation der cDNA

Die cDNA, die dem 3′-End-RNA des PRRS-Olot-Viral-Isolats entspricht, wurde syntheti siert. Die Strategie zieht einen Vorteil aus dem Vorhan densein eines Poly(A)-Schwanzes, um die Oligo-d(T) als Extensionsprimer zu verwenden, der mit umgekehrter Transkriptase verlängert werden kann und DNA Molekül kopien synthetisieren kann. Um die RNA-Regionen vor dem 3′-Ende zu klonen, wurde ein Oligonukleotid mit spezi fischer Sequenz des viralen Genoms, bei ungefähr 2500 bp des 3′-Endes angeordnet, verwendet.

Eine cDNA-Synthese wurde durchgeführt, unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (Boehringer). Kurz zu sammengefaßt, das Verfahren war: 0,1 µg des PRRS-RNA- Poly(A), erlangt, wie in dem vorherigen Beispiel be schrieben, wurde bei Vorhandensein von jeweils 1 mM dNTPs (dATP, dGTP [5-10 µCi des ³²P-α-dCTP] dGTP und dTTP), 25 Einheiten eines RNase-Inhibitors, 0,8 µg Oligo-d(T)₁₂ und 40 Einheiten einer umgekehrten Trans kriptase in 20 µl Endvolumen inkubiert. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 42°C inkubiert, und dann wurde die Synthese des zweiten Stranges in derselben Röhre begonnen. Zu diesem Zweck wurden ein Puffermittel, RNasa, und 25 Einheiten von E.-Coli DNA-Polymerase beigegeben. Es fand 1 Stunde lang bei 22°C und 10 Minuten bei 65°C eine Inkubation statt. Um stumpfe Enden hervorzurufen, wurden schließlich 4 Einheiten der DNA-T4-Polymerase beigegeben. Nach 10 Minuten bei 37°C wurde die Reaktion dadurch gestoppt, daß EDTA und Sarkosyl beigegeben wurden. Eine zweite cDNA-Synthese wurde unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, mit Ausnahme der Tatsache, daß 5′CGGGCTCGAGCCTTTGGCGA3′- Oligonukleotid verwendet wurde statt Oligo-d(T)₁₂. In beiden Fällen wurde die Mischung extrahiert mit Phenol: Chloroform, und das Material wurde mit Äthanol präzi pitiert, wie in dem vorherigen Beispiel beschrieben.

Eine cDNA-Synthese wurde geprüft und quantifiziert mit tels Zählung der Radioaktivität, die in dem syntheti sierten Material eingebracht war, und Elektrophorese in alkalischen und neutralen Agarose-Gels.

3.2 - Klonen und Sequenzieren

Zuerst wurde die synthetisierte cDNA nach der Größe selektiert, um das Klonen übermäßig kleiner Segmente zu vermeiden. Zu diesem Zweck wurde das Material von der cDNA-Synthese her durch Zen trifugierung (30 Minuten, 16000 g) rückgewonnen. Das Präzipitat wurde vakuumgetrocknet, mit Tris-EDTA-Puffer mittel (TE), pH = 8,0, gelöst, und in 1% Agarose-Gel belastet. Die cDNA-Fragmente zwischen 1000 und 5000 bp wurden mit DEAE-Cellulosepapier aus dem Gel und von dem letzteren durch Elution mit ClNa und anschließende Präzipitation rückgewonnen. Die purifizierte cDNA wurde geklont in stumpfen Enden in dem pMTL25-Vektor, ein von dem pUC18 abgeleiteten Vektor. Zu diesem Zweck wurde der Vektor linearisiert mit SmaI und mit alkalischer Phosphatase behandelt, um den Vektor-Hintergrund zu re duzieren. Nach Ligation mit DNA-T4-Ligase wurden E.-Coli-XL-1Blue-Kompetent-Zellen mit der Ligationsmi schung transformiert, bei Vorhandensein von X-gal (5-bromo-4-chloro-3- indolyl β-D-galactopyranoside) (Boehringer) und IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyra noside) (Gold Bioch), was die anfängliche Selektion re kombinanter Kolonien durch Farbe gestattet, (blaue Kolonien ohne Einfügung im Vergleich mit weißen Kolonien mit Einfügung).

Die Analyse der positiven PRRS-Klone wurde durchgeführt mittels Plasmid-DNA-Präparationen (Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523, 1979), und Darstellung der Restriktionsstellen, auf der Grundlage der LV-Se quenz. Nur 9 aus den 300 Plasmiden, die analysiert wur den, waren positiv und enthielten Einfügungen zwischen 800 und 2600 bp. Die definitive Verifikation der Authen tizität dieser cDNA-Klone wurde durch ihr direktes Se quenzieren durchgeführt, unter Verwendung der Dideoxy- Ketten-Terminationsmethode, auf die doppelstrangige DNA angewendet, (Sanger, F., et al., J. Mol. Biol., 94: 441-448, 1975). Die universalen Oligonukleotide (5′GTAAAACGACGGCCAGT3′) und umgekehrten Oligonukleotide (5′AACAGCTATGACCATG3′) wurden verwendet, um all die Klone zu sequenzieren. Die Majorität der erhaltenen PRRS-Klone enthielt einen gemeinsamen Poly(A)-Schwanz und unterschiedliche 5′-Enden. Die Klone wurden bezeich net mit pPRRS-8, pPRRS-108, pPRRS-121, pPRRS-132, pPRRS-146, pPRRS-147, pPRRS-148, und pPRRS-153. Aus der zweiten cDNA-Synthese wurde der Klon PRRS-3 erlangt. Die Fig. 3 zeigt die unterschiedliche Verlängerung dieser Klone im Vergleich mit LV wie auch die ORFs, die in jedem enthalten waren. Andererseits zeigt die Fig. 1 die konsekutive Sequenz der 3.383 bp, die aus dem PRRS- Olot-Isolat geklont wurde, und die Fig. 2 (2A-2F) zeigt die Aminosäure-Sequenzen, die den Proteinen entsprechen, durch jeden ORF kodiert.

Beispiel 4 - Erlangung rekombinanter Baculoviren, die das durch ORF2 kodierte Protein-Gen ausdrücken 4.1 - Präparation des ORF2-Gens

Die Gene pMTL25, pMTL24 und pMTL22, von dem pUC18-Vektor abgeleitet, wurden für die Präparation der verschiedenen ORFs verwendet, die in dieser Beschreibung erwähnt sind, bevor sie in Baculovirus-Transfer-Vektoren geklont wur den. Der Vektor, der verwendet wurde, ist für jeden be sonderen Fall angegeben. Das ORF2-Gen hat eine Größe von 747 bp und wurde von dem cDNA-pPRRS-3-Klon erlangt (Fig. 4). Die DNA wurde mit MaeI verschmolzen, und die Einfügung von ungefähr 900 bp wurde in Agarose-Gel puri fiziert. Die kohäsiven Einfügungsenden wurden in stumpfe Enden transformiert mittels Behandlung mit dem Klenow- Fragment der E.-Coli-DNA-Polymerase. Das Klonen wurde durchgeführt in dem pMTL25, behandelt mit SmaI, alkali sche Phosphatase und purifiziert in 1% niedrigschmel zendem Agarose-Gel. Nach Ligation mit DNA-T4-Ligase (Boehringer) wurden E.-Coli-XL-1Blue-Zellen transfor miert mit der Ligationsmischung und die positiven Klone anfänglich durch Farbe selektiert. Die rekombinanten Plasmide, die das eingefügte ORF2-Gen enthielten, wurden purifiziert gemäß der alkalinen Auflösungsmethode (Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523, 1979), und durch Darstellen mit Restriktions-Endo nucleasen und Sequenzieren der Einfügungsregionen ge kennzeichnet.

Der neu erlangte Vektor wurde mit pPRRS-ORF2 bezeichnet. In ihm ist das ORF2-Initiations-Codon (ATG) angeordnet, ungefähr bei 50 bp von dem Anfang der Einfügung und der BamHI-Stelle an.

4.2 - Einfügung des ORF2-Gens in einen Baculovirus- Tansfer-Vektor

Der Baculovirus-Transfer-Vektor, der bei all den Experi menten verwendet wurde, die in diesem Patentanspruch be schrieben wurden, war der pAcYM1-Vektor (Matsuura et al., J. Gen Virol. 68, 1233-50), der eine einzelne BamHI-Einfügungsstelle hat.

Der Vektor wurde durch Professor D. H. L. Bishop (I. V. E. M., Oxford, Vereinigtes Königreich) gestiftet. Für die Einfügung wurde der Vektor mit der BamHI-Endo nuclease sorgfältig verschmolzen und dann mit dem alkalischen Phosphatase-Enzym behandelt, um Vektor- Religation zu vermeiden. Der ORF2 kodiert für ein 28,4 KDa Protein. Kurz zusammengefaßt, die Einführung des entsprechenden Gens in den pAcYM1-Vektor verwendete das pPRRS-ORF2-Plasmid als Ausgangsmaterial. In diesem Plasmid ist das ORF2-Gen durch 2 BamHI-Stellen flan kiert. Somit wird der pPRRS-ORF2 mit BamHI verschmolzen und in 1% niedrigschmelzendem Agarose-Gel belastet, um das 935-bp-Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wurde in die BamHI-Stelle des pAcYM1 eingesetzt gemäß der Struhlschen Methode (Biotechniques 6, 452-453, 1985), unter Verwendung der DNA-T4-Ligase (Boehringer), um die Einfügung des Vektors zu ligatieren. Die Ligations mischung wurde verwendet, um die E.-Coli-DH5-Zellen zu transformieren. Die erhaltenen rekombinanten Plasmide, die das eingefügte ORF2-Gen enthalten, wurden purifi ziert gemäß der alkalischen Auflösungsmethode (Birnboim & Doly, supra), durch Darstellung mit Restriktions- Endonukleasen gekennzeichnet, und die Einfügungsränder wurden sequenziert, um die richtige Sequenz der Einfü gungsregionen zu bekräftigen. Der neu erhaltene Trans fer-Vektor wurde mit pPRRS-Bac8 bezeichnet, und es wurde bewiesen, daß er das pPRRS-Gen in der richtigen Ausrich tung hat, für seinen Ausdruck durch den AcNPV- Baculo virus-Polyhedrin-Promoter.

4.3 - Transfektion und Selektion von Baculoviren

Spodoptera-frugiperda-Zellen, Sf-9-Klon, wurden mit einer Mischung aus purifizierter, infektiöser DNA des Stammvirus AcRP23-lacZ (500 ng), durch Dr. Posee (I. V. E. M., Oxford, Vereinigtes Königreich) gestiftet, und dem Transfer-Vektor pPRRS-Bac8-DNA (2 µg) kotransfi ziert. Das Stammvirus DNA wurde linearisiert mit dem BSsu36I-Enzym innerhalb des lacZ-Gens (Kitts et al., Nuc. Acids Res. 18, 5667-72. 1990), um die Wirksamkeit der Rekombination zu erhöhen. Zur Kotransfektion wurde die Lipofectin-(Gibco-BRL)-Methode verwendet, (Felgner et al., Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 84, 7413-7417, (1987)). Nach der Kotransfektion wurden die Zellen 5 Tage lang inkubiert in einem vollständigen TNMFH-Medium, durch 5% fötales Kalbsserum (FCS) und Antibiotika er gänzt, bis eine zytopathische Wirkung festgestellt wurde.

Dann wurde der Transfektionsüberstand rückgewonnen, und die rekombinanten Viren wurden durch Probenträger- Untersuchung identifiziert. Das AcRP23-lacZ-Stammvirus zeigt blaue Auflösungsflecken bei Vorhandensein des X-gal-Substrats, weil das β-Galactosidase-Gen ausge drückt wird. Die rekombinanten Viren wurden anfänglich identifiziert durch die deutlichen Flecken, nachdem die viralen Nachkommen mit X-gal gefärbt worden waren. Eine Anzahl Flecken jedes Virus wurden herausgepickt und 3 Purifizierungsrunden unterworfen, bevor ein Virusbestand mit hohem Titer präpariert wurde. Das schließlich er zielte rekombinante Baculovirus wurde mit AcNPV, PRRS 2, bezeichnet. Es wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) deponiert, mit der Zugangsnummer V94021007.

Beispiel 5 - Erlangung rekombinanter Baculoviren, die das durch ORF3 kodierte Protein-Gen ausdrücken 5.1 - Einfügung des ORF3-Gens in einen Baculovirus- Transfer- Vektor

Der ORF3 kodiert für ein Protein mit einem geschätzten Molekulargewicht von 30,8 KDa. Die pPRRS-121-Plasmid-DNA wurde verwendet als Ausgangsmaterial für die Einfügung des entsprechenden Gens in den pAcYM1-Transfer-Vektor (Fig. 5). In diesem Vektor ist das ORF3-Initiations- Codon 10 bp von der BamHI-Stelle angeordnet. Das Gen kann durch Doppelverschmelzung mit den BamHI- und Sau3A-Enzymen herausgeschnitten werden, welches kohäsive Enden hervorbringt, mit BamHI-kompatibel. Nach der Verschmelzung wurde die Mischung in 1% niedrigschmel zendem Agarose-Gel belastet, und ein 1009-bp-Fragment wurde purifiziert. Es wurde isoliert und dann mit dem pAcYM1-Vektor abgebunden, mit BamHI und alkalischer Phosphatase behandelt, unter Verwendung des T4-Ligase- DNA-Enzyms. Anschließend wurden E.-Coli-DH5-Zellen transformiert und die rekombinanten Plasmide purifiziert und gemäß den oben beschriebenen Verfahren gekenn zeichnet. Sobald die richtige Sequenz und Einfügungsaus richtung nach dem Polyhedrin-Promoter hin verifiziert worden war, wurde der neue Transfer-Vektor mit pPRRS- Bac2 bezeichnet.

5.2 - Transfektion und Selektion rekombinanter Baculo viren

Das Verfahren, das für die Transfektion und Selektion rekombinanter Baculoviren verwendet wurde, war dem Ver fahren ähnlich, das für ORF2 oben beschrieben wurde, (Beispiel 4.3). Das rekombinante Baculovirus, das er zielt wurde, wurde mit AcNPV, PRRS 3 bezeichnet. Es wurde bei der ECACC deponiert, mit der Zugangsnummer V94011325.

Beispiel 6 - Erlangung rekombinanter Baculoviren, die das durch ORF4 kodierte Protein-Gen ausdrücken 6.1 - Präparation des ORF4-Gens

Die Größe des ORF4-Gens ist 549 bp. Es wurde erzielt aus dem pPRRS-146-Klon (Fig. 6), mit den BamHI-, Af1III- und PstI-Enzymen verschmolzen. Die ersten zwei Enzyme flankieren die Einfügung, und PstI wurde verwendet, um ein Vektor-DNA-Fragment von ähnlicher Größe wie das ORF4-Gen zu spalten, was eine Gen-Isolation schwierig gemacht hätte. Ein 1112-bp-Fragment wurde in niedrig schmelzendem Agarose-Gel purifiziert und im pMTL22-Vek tor geklont, mit BamHI und NcoI verschmolzen, (mit Af1III kompatibel). Nach Ligation mit der T4-Ligase-DNA und Transformierung der E.-Coli-DH5-Zellen wurden die rekombinanten Plasmide purifiziert gemäß der alkalinen Auflösungsmethode (Birnboim & Doly, supra), und durch Restriktions-Endonuclease-Darstellung gekennzeichnet. Der neu erzielte Vektor wurde pPRRS-ORF4 genannt. Er enthält das ORF4-Initiations-ATG-Codon, das 5 bp von der BamHI- Stelle angeordnet ist.

6.2 - Einfügung des ORF4-Gens in einen Baculovirus- Transfer- Vektor

ORF4 kodiert für ein 20,0 KDa Protein. Das entsprechende Gen wurde aus dem pPRRS-ORF4-Plasmid erzielt, durch Ver schmelzung mit BamHI plus Bg1II. Das 1112-bp-Fragment wurde purifiziert in 1% niedrigschmelzendem Agarose-Gel und direkt geklont in pAcYM1-BamHI. Die Verfahren für die Identifizierung und Charakterisierung der rekombi nanten Klone waren mit jenen identisch, die oben be schrieben wurden, (Beispiel 4.2). Sobald die richtige Ausrichtungs- und Einfügungssequenz verifiziert worden war, wurde das neue Plasmid mit pPRRS-Bac9 bezeichnet. Dieses Plasmid wurde für spätere Transfektions-Experi mente und die Präparation rekombinanter Baculoviren ver wendet.

6.3 - Transfektion und Selektion rekombinanter Baculo viren

Das Verfahren, dem für die Transfektion und Selektion rekombinanter Baculoviren gefolgt wurde, war dem Verfah ren ähnlich, das oben für ORF2 beschrieben ist, (Bei spiel 4.3). Das rekombinante Baculovirus wurde mit AcNPV, PRRS4 bezeichnet. Es wurde beim ECACC deponiert, mit der Zugangsnummer V94021008.

Beispiel 7 - Erlangung rekombinanter Baculoviren, die das durch ORF5 kodierte Protein-Gen ausdrücken 7.1 - Präparation des ORF5-Gens

Die Größe von ORF5 ist 600 bp. Es wurde aus dem Klon pPRRS-132 erzielt, (Fig. 7). Die DNA wurde verschmolzen mit den BstXI- und BfrI-Enzymen, und ein 700-bp-Frag ment, das ORF5 enthält, wurde in 1% niedrigschmelzendem Agarose-Gel purifiziert. Nach Umwandeln der Fragment enden von kohäsiv in stumpf mittels Behandlung mit T4-Polymerase-DNA wurde das Fragment in dem pMTL25/SmaI- Vektor geklont. Die Methode, die verwendet wurde, war den in Beispiel 4.1 beschriebenen Verfahren ähnlich. Der neu erzielte Vektor wurde mit pPRRS-ORF5 bezeichnet. Er enthält das ORF5-Initiation-ATG-Codon, 15 bp von dem Anfang des Gens angeordnet.

7.2 - Einfügung des ORF5-Gens in einen Baculovirus- Transfer-Vektor

ORF5 kodiert für ein 22,4 KDa Protein. Um das ent sprechende Gen in den Transfer-Vektor einzufügen, wurde der pPRRS-ORF5-Vektor mit dem Enzym BamHI verschmolzen. Das 706-bp-Fragment wurde in 1% niedrigschmelzendem Agarose-Gel purifiziert und an dem pAcYm1-BamHI-Trans fer-Vektor direkt abgebunden. Die rekombinanten Plasmide wurden gekennzeichnet, wie oben beschrieben. Der neue Transfer-Vektor wurde mit pPRRS-Bac3 bezeichnet. Er wurde bei anschließenden Transfektions-Experimenten verwendet.

7.3 - Transfektion und Selektion rekombinanter Baculo viren

Das Verfahren, dem für die Transfektion und Selektion rekombinanter Baculoviren gefolgt wurde, war dem Verfah ren ähnlich, das für ORF2 oben beschrieben wurde, (Bei spiel 4.3). Das rekombinante Baculovirus, das erzielt wurde, wurde mit AcNPV, PRRS5 bezeichnet und wurde bei ECACC deponiert, mit der Zugangsnummer V94011326.

Beispiel 8 - Erlangung rekombinanter Baculoviren, die das durch ORF6 kodierte Protein-Gen ausdrücken 8.1 - Präparation des ORF6-Gens

Die Größe des ORF6-Gens ist 519 bp. Es wurde aus dem pPRRS-8-Gen-Klon präpariert, (Fig. 8). Zuerst wurde die DNA mit dem Af1III-Enzym verschmolzen, was die Elimi nierung von Bändern ermöglichte, in der Größe dem ORF6- Gen angenähert. Ein-990-bp-Af1III-Af1III-Fragment wurde in 1% niedrigschmelzendem Agarose-Gel purifiziert und mit TaqI verschmolzen. Das neue 790-bp-Fragment wurde in niedrigschmelzendem Agarose-Gel purifiziert und in dem pMTL24-Vektor geklont, mit AccI und alkalischer Phospha tase behandelt. Anschließend wurden die in Beispiel 4.1 beschriebenen Schritte durchgeführt. Der neue Vektor wurde mit pPRRS-ORF6 bezeichnet. Er enthält das ORF6- Initiations-Codon, das bei 46 bp von dem Anfang des Gens her angeordnet ist.

8.2 - Einfügung des ORF6-Gens in einen Baculovirus- Transfer-Vektor

ORF6 kodiert für ein 19,0 KDa Protein. Hierbei handelt es sich vermutlich um das Hüllenprotein, und im Hinblick auf seine hydrophobe Art wird es als membranspannendes Protein angesehen. Für die Einfügung des entspre chenden Gens in den Transfer-Vektor wurde der pPRRS- ORF6-Vektor, der das ORF6-Gen enthält, das an der pMTL24-AccI-Stelle geklont wurde, mit dem BamHI-Enzym verschmolzen. Das 790-bp-Fragment wurde aus dem 1% Agarose-Gel purifiziert und nach dem Vektor pAcYM1-BamHI hin direkt abgebunden. Der neue Transfer-Vektor wurde mit pPRRS-Bac5 bezeichnet. Er wurde bei anschließenden Transfektions-Experimenten verwendet.

8.3 - Transfektion und Selektion rekombinanter Baculo viren

Die Methode, die für die Transfektion und Selektion re kombinanter Viren verwendet wurde, war dem Verfahren ähnlich, das für ORF2 oben beschrieben wurde, (Beispiel 4.3). Das rekombinante Baculovirus, das erzielt wurde, wurde mit AcNPV, PRRS6 bezeichnet. Es wurde beim ECACC deponiert, mit der Zugangsnummer V94011327.

Beispiel 9 - Erlangung rekombinanter Baculoviren, die das durch ORF7 kodierte Protein-Gen ausdrücken 9.1 - Präperation des ORF7-Gens

Die Größe des ORF7-Gens ist 384 bp. Es wurde aus dem pPRRS-8-Gen-Klon präpariert, (Fig. 8). Das in Beispiel 8.1 beschriebene Fragment Af1III-Af1III wurde mit dem HpaI-Enzym verschmolzen. Das 430-bp-Af1III-HpaI-Frag ment, welches das ORF7-Gen enthielt, wurde in niedrig schmelzendem Agarose-Gel purifiziert und anschließend in dem pPMTL25-Vektor geklont, mit NcoI-SmaI verschmolzen. Die Analyse und Charakterisierung rekombinanter Kolonien wurde durchgeführt, wie in Beispiel 4.1 beschrieben. Der neue Vektor wurde mit pPRRS-ORF7 bezeichnet. Er enthält das ORF7-Initiations-Codon, bei 16 bp von dem Anfang des Gens her angeordnet.

9.2 - Einfügung des ORF7-Gens in einen Baculovirus- Transfer- Vektor

ORF7 kodiert für ein 13,8 KDa-Protein. Hierbei handelt es sich vermutlich um das virale Nucleoprotein. Für die Einfügung des entsprechenden Gens in den Transfer-Vektor wurde das pPRRS-ORF7-Plasmid mit den Bg1II- und BamHI-Enzymen verschmolzen. Das resultierende 430-bp- Fragment wurde aus einem niedrigschmelzenden Agarose-Gel isoliert und innerhalb des pAcYM1-BamHI-Vektors direkt abgebunden. Nach den geeigneten Charakterisierungen wur de der neue pPRRS-Bac7-Transfer-Vektor erzielt. Er wurde bei anschließenden Transfektions-Experimenten verwendet.

9.3 - Transfektion und Selektion rekombinanter Baculo viren

Die Methode, die für die Transfektion und Selektion re kombinanter Baculoviren verwendet wurde, war dem Verfah ren ähnlich, das für ORF2 oben beschrieben wurde, (Bei spiel 4.3). Das rekombinante Baculovirus, das erlangt wurde, wurde mit AcNPV, PRRS7 bezeichnet. Es wurde beim ECACC deponiert, mit der Zugangsnummer V94011328.

Beispiel 10 - Analyse rekombinanter Proteine und Immunodetektion

Sf9-Zellen wurden mit verschiedenen rekombinanten Baculoviren infiziert, mit einer Infektionsmultiplizität von 1 PFU/Zelle, und bei 27°C inkubiert, bis die Kul turen geerntet wurden. Verschiedene Zellkulturen wurden einschichtig und in Suspension ausgeführt. In all den Fällen waren die Resultate ähnlich. Die Kulturen wurden zu verschiedenen Nachinfektionszeiten geerntet. Die op timale Erntezeit für jedes rekombinante Virus wurde er mittelt. Diese reichte von 48 bis 96 p. i. h. (post infection hours/Nachinfektionsstunden). Die Zellen wur den geerntet durch Zentrifugierung mit 1500 UpM 10 Min. lang, zweimal mit PBS, pH: 7,4, gewaschen und anschlie ßend resuspendiert und mit 25 mM Bikarbonatlösung aufgelöst. Sie wurden mit 10000 UpM 10 Minuten zentrifu giert und die lösliche zytoplasmische Fraktion wurde von der verbleibenden unlöslichen Zell-Debris separiert. Die gesamten Zellextrakte sowie die verschiedenen Fraktionen wurden durch Elektrophorese in 11% Polyacrilamid-Gels analysiert und mit "coomassie-blue" eingefärbt oder auf Nitrocellulose-Membranen übertragen, zur immunologischen Feststellung. Bänder wurden beobachtet durch Färben mit "coomassie-blue", mit Molekulargewichten von 28,4, 30,8, 20,0, 22,4, 19,0 und 13,8 KDa. Diese Größen stimmen entsprechend mit den Größen überein, die für die Prote ine erwartet wurden, die durch die ORFs 2, 3, 4, 5, 6 und 7 kodiert wurden. Es gibt eine signifikante Varia tion bei den Ausdrucks-Levels der verschiedenen Gene: die ORFs 3, 5 und 7 auf beträchtlichem Level, die ORFs 2 und 4 auf nennenswertem Level und ORF 6 auf niedrigem Level. Die Gene mit niedrigeren Ausdrucks-Levels, ent sprechend den ORFs 2 und 6, könnten entstanden sein infolge der größeren Distanz, 42 bzw. 39 Nukleotide, zwischen dem Protein-Initiations-ATG-Codon und dem Polyhedrin-Baculo virus-Promoter. Bei verschiedenen Gelegenheiten ist be wiesen worden, daß diese Distanz im wesentlichen auf einem Minimum gehalten werden sollte, um einen guten Ausdruck zu erhalten. Ein anderer Faktor, der für gerin gen Ausdruck verantwortlich ist, könnte die hohe hydro phobische Art dieser Proteine sein.

Wenn die löslichen und unlöslichen Fraktionen der infi zierten Zellen separat analysiert werden, ist festge stellt worden, daß, außer für ORF7, die meisten der aus gedrückten PRRS-Proteine unlöslich sind und mit der Membran-Debris assoziiert bleiben. Dies kann auf die hydrophobe und glykosilierte Natur dieser Proteine zurückzuführen sein. Die Majorität dieser Glykoproteine enthält Transmembranregionen, welche sie an den Membranen verankern. Solche Charakteristika machen die Purifizierung dieser Proteine aus Zellextrakten schwie rig. Zur Immunodetektion wurden die Proteine auf Nitro cellulose-Membranen übertragen, gemäß Standardmethoden (Burnette, Anal. Biochem. 112, 195-203, 1981; Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76, 4350-4354, 1979).

Die Proteinübertragung wurde in einer halbtrockenen Vorrichtung (Bio-Rad) bei 22 V 30 Minuten lang durchge führt. Dann wurden die Nitrocellulose-Streifen blockiert mit 3% Pulver von entrahmter Milch in Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM (TBS), 1 Stunde lang bei Raumtempe ratur. Anschließend wurden die Streifen zuerst für zwei Stunden bei Raumtemperatur mit einem Anti-PRRS-Schweine- Antiserum (C-45), inkubiert, 1/100 in TBS-0,05% Tween 20 verdünnt, mit TBS-0,05% Tween 20, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen und dann mit Anti-Schwein- IgG, mit alkalischer Phosphatase (Verdünnung 1/1000) (Sigma) konjugiert, 1 Stunde lang inkubiert. Die Strei fen wurden noch einmal gewaschen und schließlich mit einem NBT (nitro blue tetrazolium) (Sigma) und BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) (Sigma) Lösung in NaCl 100 mM, MGCL₂ 5 mM, Diethanolamin 100 mM, pH: 9,5, entwickelt, bis zum Erscheinen sichtbarer Bänder. Die Reaktion wurde mit destilliertem Wasser gestoppt. In all den Fällen, in denen spezifische Reaktionen durch Im munoblot sichtbar wurden, wurden Proteine mit einem Molekulargewicht, äquivalent mit den geschätzten ORF- Größen, erzielt. In einigen Fällen, speziell bei den ORFs 3 und 5, wurde das Vorhandensein anderer größer bemessener Bänder, bis 45 KDa, festgestellt. Diese Bänder würden verschiedene Protein-Glykosilationsformen darstellen, in Übereinstimmung mit den vorhergesehenen potentiellen Stellen.

10.1 - Antigenische Charakterisierung der rekombinanten Proteine

Die richtige Antigenizität der rekombinanten Proteine, im Baculovirus ausgedrückt, wurde geprüft durch ihre Reaktion auf verschiedene Tier-Sera in einer Immuno blotting-Untersuchung
Rekombinante Proteine, auf Nitrocellulose gemäß der obigen Methode ausgedrückt und übertragen, wurden dazu gebracht, mit einer Kollektion der zuvor charakteri sierten Schweine-Sera, die Anti-PRRSV-Antikörper ent hielten, zu reagieren. Die Sera waren in Tieren erzielt worden, die experimentell (# 1-4) oder natürlich (# 5-8) infiziert wurden.

Die Proteine, die den ORFs 3, 5 und 7 entsprechen, waren die ersten, die geprüft wurden. Die Resultate sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2

Reaktivität der Sera von infizierten Tieren her gegen rekombinante Proteine ORF3, ORF5 und ORF7

Diese Untersuchung bewies, daß die rekombinanten Pro teine 3, 5 und 7 antigenisch sind ähnlich den ursprüng lichen viralen Proteinen 3, 5 und 7.

Wenn die Untersuchung mit rekombinanten Proteinen 2, 4 und 6 durchgeführt wurde, waren die Resultate von grö ßerer Variabilität, was die Erkennung durch Feldsera an geht. Die Gründe für diese Variabilität können ihr geringer Ausdrucks-Level und/oder ihre hohe Hydrophobi zität sein.

Diese Untersuchungen zeigen, daß die PRRSV-rekombinanten Proteine, im Baculovirus-System ausgedrückt, von den ur sprünglichen viralen Proteinen nicht antigenisch unter scheidbar sind.

Beispiel 11 - Purifikation der rekombinanten Proteine

Die für die Purifikation rekombinanter Proteine entwor fene Strategie sollte die strukturellen Charakteristika der Proteine berücksichtigen. Zwei dieser Charakteri stika sollten hervorgehoben werden:

1) die hydrophobe Art, die sie unlöslich macht, und
2) das Vorhandensein einer großen Zahl von Transmem branregionen, die ihnen eine große Affinität zu Membra nen verleiht. In den meisten Fällen machen diese Charak teristika eine Proteinextraktion und -purifizierung nicht zweckmäßig, z. B.: für ihre Verwendung als Vak zine, wenn komplette infizierte Zellen verwendet werden können, wie durch verschiedene Autoren beschrieben, (Hall, S. L., et al., Vaccine, 9, 659-667, Sept. (1991); Tordo, N., et al., Virology, 194, 5269 (1993)). Trotzdem sind einige Versuche unternommen worden, diese Proteine zu purifizieren, unter Verwendung des ORF3-Proteins als Modell.

11.1 - Purifikation des aus ORF3 abgeleiteten Proteins

Sf9-Zellen wurden mit dem rekombinanten Virus AcNPV, PRRS3 infiziert, gemäß der Methode, die in dem früheren Beispiel beschrieben wurde. Die infizierten Zellen wur den durch Zentrifugierung mit 400 g, 10 Min. lang, ge sammelt, mit PBS gewaschen und resuspendiert bei 20×10⁶ Zellen/ml in PBS. Die Zellen wurden durch Gefrieren/Auftauen zerbrochen, und die lösliche Fraktion wurde durch Zentrifugierung von der unlöslichen Fraktion getrennt. In all den Fällen wurde die unlösliche Frak tion für die anschließenden Behandlungen verwendet.

Nachfolgend eine Beschreibung einiger Methoden, die ver wendet wurden:

Behandlung mit chaotropen Agenten

Die unlösliche Fraktion wurde zuerst mit 1 M NaCl und dann mit 2 M oder 4 M Guanidiniumchlorid gewaschen. Die Zell-Pellets wurden in den verschiedenen Puffermitteln resuspendiert und 1 Stunde lang auf Raumtemperatur ge halten. Dann wurde die Präparation mit 15000 UpM 5 Minu ten lang zentrifugiert. Das Vorhandensein des rekombi nanten Proteins in den verschiedenen Fraktionen wurde durch Elektrophorese in 15% Polyacrylamid-SDS-Gels (Natriumdodecylsulfat) analysiert.

Die erzielten Resultate lassen erkennen, daß die sequen tielle Behandlung mit diesen Salzen ein Protein von 30% bis 50% Reinheit hervorbringt. Dieses purifizierte Protein hat sich als antigenisch analog mit ursprüngli chem Protein herausgestellt, da es durch Sera von infi zierten Tieren her erkennbar ist, entweder durch Immuno blotting oder indirekt ELISA bestimmt.

Behandlung mit Detergenzien

Detergenzien mit den folgenden Konzentrationen wurden verwendet:

NP40\|0,5%
Octylglucosid	2%
SDS	0,5%, 1% und 2%
Natriumdeoxycholat	0,5%, 1% und 2%

In allen Fällen wurden die Zellpräparationen analog der oben beschriebenen Zellpräparation durchgeführt. Zell- Debris, die das rekombinante Protein enthielt, wurde mit den obigen Detergenskonzentrationen und unter den be schriebenen Bedingungen behandelt. Allgemein kann an gegeben werden, daß unter diesen Bedingungen die Behand lung mit den verschiedenen Detergenzien den Aufschluß eines signifikanten Betrages des rekombinanten Proteins nicht ermöglichte. Nur 0,5%iges SDS erzielte Protein mit 50% geschätzter Reinheit, wenn auch mit sehr gerin ger Ausbeute. Antigenisch reagiert dieses Protein mit infizierten Tiersera durch indirekte ELISA, obwohl die Wirksamkeit geringer ist als das, was mit dem Protein, mit chaotropen Agenten purifiziert, erreicht wird.

Zusammengefaßt, diese teilweise purifizierten Proteine könnten in Anti-PRRSV-Vakzinen verwendet werden.

Beispiel 12 - Diagnostische Verwendung

Eine der Hauptanwendungen der rekombinanten Proteine, die durch diese Erfindung vorgesehen werden, ist deren Verwendung bei der Präparation von Kits für die Diagnose von PRRSV-Feldinfektionen.

12.1 - Präparation von Antigen, ausgedrückt in Sf9, zur Anwendung bei der Diagnose

Sf9-Zellen, einschichtig oder in Suspension gezüchtet, wurden mit einer Infektionsmultiplizität von 0,5 bis 1 mit den entsprechenden rekombinanten Baculoviren infi ziert. Abhängig davon, welches rekombinante Virus ver wendet wurde, wurden die Kulturen 48 bis 72 Stunden nach der Infektion geerntet. Sie wurden 10 Minuten lang mit 400 g bei 15°C zentrifugiert und mit PBS gewaschen.

Schließlich wurden die Zell-Pellets, welche die rekom binanten Proteine enthielten, in PBS mit 2% Octyl glucosid (Sigma) resuspendiert und eine Stunde lang auf Eis stehen gelassen. Sie wurden dann 10 Minuten lang mit 1000 g zentrifugiert, um Zell-Debris zu beseitigen. Die Überstände wurden gegen PBS erschöpfend dialysiert, um das Detergens zu entfernen, 30 Minuten lang mit 10000 g zentrifugiert, um Präzpitate zu entfernen, und bei -70°C gelagert, zur späteren Verwendung.

12.2 - ELISA zur Diagnose

Polystyrol-ELISA-Immunoplatten mit 96er Raster (Poli sorp, NUNC) wurden mit verschiedenen Verdünnungen der Mischung der rekombinanten Extrakte (ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 und ORF7) bedeckt, in 50 mM Karbonat- Puffermittel, pH: 9,6 (100 µl/Raster) hergestellt, durch Inkubation bei 4°C über Nacht. Wie in Fig. 9 darge stellt, war die optimale Verdünnung, die für die Plat tenbedeckungen gewählt wurde, 1/100. Die Platten wurden mit einem blockierenden Puffermittel durchtränkt (1% entrahmte Milch in PBS), 30 Minuten lang bei Raumtem peratur. Anschließend wurden verschiedene Verdünnungen der Anti-PRRSV- Antisera, im blockierenden Puffermittel hergestellt, beigegeben. Die Inkubation wurde 1 Stunde lang bei 37°C fortgesetzt. Nach dem Waschen mit PBS, das 0,05% Tween 20 enthielt, wurde peroxidasemarkiertes Protein A (1/5000 Verdünnung) beigegeben, 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Waschen, wie vorher, wurde durchge führt, und die Reaktion wurde 10 Minuten lang bei Raum temperatur entwickelt, unter Verwendung von ABTS [2,2′-azino- bis(3-ethylbenzthiazoline-6 sulfonic acid)] als Substrat. Die Reaktion wurde mit 1% SDS gestoppt, und die Absorbanz wurde bei 405 nm überwacht.

Die üblichen ELISA-Titrationsresultate von einem Feld serum eines infizierten Tieres her sind in Fig. 10 dargestellt. Die Feldsera-Titrationen haben normaler weise Verdünnungen von 1/100 bis 1/800. Die Resultate, die bei einem Stichprobenexperiment mit einigen Dutzend Feldsera erzielt wurden, sind in Fig. 11 dargestellt. Es ist ersichtlich, daß die für eindeutig positive Sera erhaltenen Titer von 0,4 bis 1,7 reichen. Titer von unbestimmten Sera reichen von 0,2 bis 0,3. Negative Sera ergeben Titer unter 0,1. Somit lautet die Schlußfol gerung, die zu ziehen ist: die Verwendung dieser rekom binanten Proteine, in Baculovirus ausgedrückt, ist eine sichere, zuverlässige und reproduzierbare Methode, die es möglich macht, infizierte Tiere von nichtinfizierten Tieren endgültig zu unterscheiden.

Beispiel 13 - Formulierung der rekombinanten Vakzinen

Verschiedene Vakzinen wurden präpariert, die verschie dene rekombinante PRRSV-Proteine enthielten, spezifisch PRRS-Olot [ECACC V93070108] in Emulsionsform, gemäß der nachfolgend beschriebenen Methode.

Spodoptera-frugiperda-Zellen, Klon Sf9 - nachfolgend Sf9 - wurden mit der Rate von 1×10⁶ Zellen/ml mit den rekombinanten Baculoviren infiziert:

AcNPV, PRRS3, [ECACC V94011325];
AcNPV, PRRS5, [ECACC V94011326], und
AcNPV, PRRS7, [ECACC V94011328],

die fähig sind, entsprechend die rekombinanten Proteine zu produzieren, die ORF3, ORF5 und ORF7 des vorgenannten PRRSV entsprechen (Fig. 2, 4 und 6), mit einer Infek tionsmultiplizität von 0,1 "plaque forming units" [flec kenbildende Einheiten] (PFU)/ Zelle. Sie wurden bei 27°C inkubiert, mit Umrühren bei 100 UpM und 30% pO₂, 72 Stunden lang, in einem 2-Liter- Braun-MD-Fermentor. Dann wurden die infizierten Insektenzellen gesammelt durch Zentrifugieren mit 1000 UpM, 10 Minuten lang, mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH: 7,4, gewaschen und mit 5×10⁷ Zellen/ml in dem gleichen PBS-Puffer mittel suspendiert.

Die Vakzinen wurden formuliert durch Mischen eines infi zierten Sf9-Zellhomogenats, das 50×10⁶ Sf9-Zellen ent hielt, die jedes der rekombinanten Proteine ORF3, ORF5 und ORF7 ausdrücken, mit einem öligen Adjuvans, oder einer öligen Phase, die sich zusammensetzt aus einer Mischung von:

Marcol® 52\|790,0 mg
Simulsol® 5100	70,0 mg
Montanide® 888	80,0 mg

Unter diesen Bedingungen wurden 4 rekombinante Vakzinen präpariert, in Dosen von 2 ml, zusammengesetzt aus 53% antigene Phase und 47% ölige Phase, wie oben beschrie ben, bei denen die Relation ölige Phase/antigene Phase eine Gewicht/Volumen-Relation (W/V) ist. Die präparier ten Vakzinen ergaben die folgende Formulierung:

1. Vakzine, identifiziert als rPRRS C:
53%, Volumenprozent, antigene Phase, zusammenge setzt aus 50×10⁶ Sf9-Zellen, Ausdruck ORF3, und
47%, Gewichtsprozent, der öligen Phase, wie oben beschrieben.
2. Vakzine, identifiziert als rPRRS D:
53%, Volumenprozent, antigene Phase, zusammenge setzt aus 50×10⁶ Sf9-Zellen, Ausdruck ORF5, und
47%, Gewichtsprozent, der öligen Phase, wie oben beschrieben.
3. Vakzine, identifiziert als rPRRS E:
53%, Volumenprozent, antigene Phase, zusammenge setzt aus 50×10⁶ Sf9-Zellen, Ausdruck ORF7, und
47%, Gewichtsprozent, der öligen Phase, wie oben beschrieben.
4. Vakzine, identifiziert als rPRRS F:
53%, Volumenprozent, antigene Phase, zusammenge setzt aus 50×10⁶ Sf9-Zellen, Ausdruck ORF3; 50×10⁶ Sf9-Zellen, Ausdruck ORF5, und 50×10⁶ Sf9-Zellen, Ausdruck ORF7, (gesamt 150×10⁶ Sf9- Zellen), und
47%, Gewichtsprozent, der öligen Phase, wie oben beschrieben.

Beispiel 14 - Wirksamkeit bei trächtigen Mutterschweinen

Diese Erprobung wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit der rekombinanten Vakzine zu bewerten, die präpariert wurden, wie in Beispiel 13 beschrieben. Zu diesem Zweck wurden insgesamt 12 Mutterschweine - eine Kreuzung Land rasse X Large White - verwendet. Die Tiere wurden in die Sicherheitsställe des Forschungszentrums gebracht.

Zwei Mutterschweine wurden willkürlich ausgewählt (Mut terschweine No. 400398 und No. 400298) und wurden mit der Vakzine, als rPRRS C identifiziert, vakziniert. Zwei Mutterschweine (Mutterschweine No. 400118 und No. 400307) wurden mit der Vakzine, als rPRRS D identi fiziert, vakziniert. Mit der Vakzine, als rPRRS E iden tifiziert, wurden drei Mutterschweine (Mutterschweine No. 314010, No. 313426 und No. 400059) vakziniert, und mit der Vakzine, als rPRRS F identifiziert, wurden drei Mutterschweine (Mutterschweine No. 313524, No. 401236 und No. 401426) vakziniert. Die zwei verbleibenden Mut terschweine (Mutterschweine No. 1 und No. 20) wurden nicht vakziniert und wurden als Kontrolltiere verwendet.

Die Mutterschweine wurden über die tiefe intramuskuläre Bahn (IM) in den Nacken, nahe dem Ohr, vakziniert, mit einer Dosis von 2 ml Vakzine, und 21 Tage später mit der gleichen Dosis nachgeimpft.

Die lokalen und allgemeinen Reaktionen wurden beobach tet, wie beispielsweise: rektale Temperatur, Futterauf nahme und klinische Anzeichen nach der Vakzinierung und nach der künstlichen Infektion. Darüber hinaus wurden die reproduktiven Resultate nach der künstlichen Infek tion in den Mutterschweinen wie auch die serologischen Resultate bei den Mutterschweinen und auch den Ferkeln überwacht. Die Analyse der Resultate wurde bei der Bewertung der Wirksamkeit der Vakzine verwendet (Tabelle 1).

Die künstliche Infektion wurde in den Sicherheitsställen des Forschungszentrums durchgeführt. Alle Tiere wurden mit der Rate von 5 ml des PRRSV-218-P6-Mø-F22055-29/10/94 infiziert, eine Abstammung isoliert und in dem Depot des Forschungszentrums aufbewahrt, mit einem Titer von 10^6,1 TCID₅₀/ml (Gewebekultur, infektiöse Dosis 50%) über die intranasale Bahn (IN).

Für die Bewertung der reproduktiven Resultate der Mut terschweine am Tage des Werfens wurden die folgenden Daten notiert (Tabelle 3):

- Anzahl der Ferkel, lebend geboren und bei guter Gesundheit
- Anzahl der Ferkel, lebend geboren, aber schwäch lich
- Anzahl der totgeborenen Ferkel
- Anzahl der Ferkel mit teilweiser Autolyse (ödem artig)
- Anzahl der mumifizierten Ferkel
-Ferkel, die nach der 1. Lebenswoche lebten, und
- Ferkel die zum Zeitpunkt der Entwöhnung (25-30 Tage alt) lebten.

Tabelle 3

Reproduktive Ergebnisse

Anzahl der Ferkel

Dann wurde die serologische Reaktion in den Mutterschweinen (Tabelle 4) und Ferkeln (Tabellen 5, 6, 7, 8 und 9) mittels einer "Peroxidase Monolayer Assay" /Immuno-Peroxidase-Monoschicht-Untersuchung/(IPMA) [Immuno Peroxidase Monolayer Assay, Wensvoort et al., Vet. Quarterly, Vol. 13, No. 3, (Juli 1991)] analy siert, gemäß dem folgenden Programm:

D 0 (Tag 0): Blutentnahme und Vakzinierung
D + 14: Blutentnahme [14 Tage nach der Vakzinierung]
D + 21: Blutentnahme und Nachimpfung [21 Tage nach der Vakzinierung]
D + 28 : Blutentnahme [28 Tage nach der Vakzinie rung]
D + 35: Blutentnahme [35 Tage nach der Vakzinierung]
D I: Blutentnahme und Herausforderung
D I + 7: Blutentnahme [7 Tage nach der Infektion].

Die serologischen Resultate bei den Mutterschweinen (Anti-PRRSV-Antikörper) sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4

Serologische Resultate (Anti-PRRSV-Antikörper)

Tabelle 5

Serologische Resultate bei den Ferkeln erhalten, die von den Kontrolltieren geworfen wurden (nicht vakziniert)

Tabelle 6

Serologische Resultate, bei den Ferkeln erhalten, die von mit rPRRS C (ORF3) vakzinierten Tieren geworfen wurden

Tabelle 7

Serologische Resultate, bei den Ferkeln erhalten, die von mit rPRRS D (ORF5) vakzinierten Tieren geworfen wurden

Tabelle 8

Serologische Resultate, bei den Ferkeln erhalten, die von mit rPRRS E (ORF7) vakzinierten Tieren geworfen wurden

Tabelle 9

Serologische Resultate, bei den Ferkeln erhalten, die von mit rPRRS F (ORF3+5+7) vakzinierten Tieren geworfen wurden

Tabelle 9 (Fortsetzung)

Mit dem Ziel, die Vakzinen einzuschätzen, Aufgabe der Erprobung, wurden die serologischen Resultate sowie die reproduktiven Resultate bewertet. Die Tabelle 8 zeigt einige serologische Daten, während die Tabelle 9 die reproduktiven Daten der Mutterschweine, die bei den Erprobungen verwendet wurden, zusammenfaßt, einschließ lich Informationen über die Gesamtzahl der Ferkel, die geworfe 04296 00070 552 001000280000000200012000285910418500040 0002019517773 00004 04177n wurden, die Anzahl der Ferkel, die nach der 1. Woche lebten, die Anzahl der Ferkel, die entwöhnt waren, und die Anzahl der Ferkel, die über 40 Tage alt waren.

Tabelle 10

Zusammenfassung der serologischen und reproduktiven Daten

Tabelle 11

Zusammenfassung der reproduktiven Daten

Die Resultate machen in ihrer Gesamtheit deutlich, daß bei der Vakzine rPRRS G ein Mutterschwein serokonver tierte (400298) und ein Mutterschwein nicht serokonver tierte (400398); bei der Vakzine D serokonvertierte kei nes der Mutterschweine; für die Vakzinen E und F ist eine starke Serokonversion vorhanden, hauptsächlich in folge des Proteins, für ORF 7 kodiert.

Es gibt ein günstiges Verhalten gegenüber der künstlichen Infektion, wenn die vakzinierten Tiere mit jenen verglichen werden, die nicht vakziniert wurden, wodurch es möglich wird, positiv geltend zu machen, daß die rekombinanten Vakzinen, Gegenstand der Erprobung, ein wirksames Mittel zur Verhinderung des PRRS bilden.

Es ist verifiziert worden, daß vakzinierte Mutterschwei ne, ohne Antikörper, mit der IPMA-Technik titriert, ge schützt werden, was beweist, daß die genannten Vakzinen (rPRRS C und rPRRS D) fähig sind, zellulare Immunität zu induzieren.

Die Wirksamkeit der Vakzinen wurde bewertet durch Ver gleichen:

a) des Prozentsatzes der Ferkel, die nach der 1. Woche lebten, gegenüber der Gesamtzahl der Ferkel, die geworfen wurden,
b) des Prozentsatzes der entwöhnten Ferkel, gegen über der Gesamtzahl der Ferkel, die geworfen wurden, und
c) des Prozentsatzes der Ferkel, über 40 Tage alt, gegenüber der Gesamtzahl der Ferkel, die geworfen wur den.

Die Tabelle 12 zeigt die Daten, die sich auf den Pro zentsatz der Ferkel, die nach der 1. Woche lebten, den Prozentsatz der Ferkel, die entwöhnt waren und den Pro zentsatz der Ferkel, die über 40 Tage alt waren, bezie hen, gegenüber der Gesamtzahl der Ferkel, die geworfen wurden.

Es ist verifiziert worden, daß die Tiere ohne Anti körper, mit der IPMA-Technik ausgewertet, geschützt sind.

Tabelle 12

Prozentsatz der Ferkel, die nach der 1. Woche lebten, entwöhnt, und über 40 Tage alt, gegenüber der Gesamtzahl der Ferkel, die geworfen wurden

Depot der Mikroorganismen

Die rekombinanten Baculoviren, die erlangt wurden, wur den bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, Whiltshire SP4 OJG, Vereinigtes Königreich, deponiert. Die Bezeichnung und die Zugangsnummern der rekombinanten Baculoviren sind:

Bezeichnung
ECACC-Zugangsnummer
AcNPV, PRRS2
V94021007
AcNPV, PRRS3	V94011325
AcNPV, PRRS4	V94021008
AcNPV, PRRS5	V94011326
AcNPV, PRRS6	V94011327
AcNPV, PRRS7	V94011328

Alle diese Baculoviren wurden am 14. Januar 1994 depo niert, ausgenommen AcNPV, PRRS2, (V94021007) und AcNPV, PRRS4, (V94021008), die am 10. Februar 1994 deponiert wurden.

Legende Figuren

Fig. 3:

a) PRRSV-Genom
b) Größe (Kb)
c) Klon-Nummer

Fig. 9:

a) Antigen-Titration durch ELISA
b) Absorbanz bei 405 nm
c) Antigen-Verdünnungen (1/ )
d) Serum mit 1/200

- - · - - · - - Feld
- - + - - + - - experimentell
- - _* - - _* - - negativ

Fig. 10:

a) Serum-Titration durch ELISA
b) Absorbanz bei 405 nm
c) Serum-Verdünnungen (1/ )
d) positiv - - · - - · - -
negativ - - + - - + - -

Fig. 11:

a) Feldsera-Titration
b) Absorbanz bei 405 nm
c) Mutterschwein-Sera

Claims

1. Rekombinante Proteine des Erregervirus des "porcine reproductive and respiratory syndrome" (PRRS) ("repro duktives und respiratorisches Syndrom bei Schweinen"), dadurch gekennzeichnet, daß sie aus irgendwelchen der durch ORFs 2 bis 7 kodierten Proteine des Virus PRRS-Olot ausgewählt sind.

2. Proteine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in Fig. 2 dargestellten Aminosäure- Sequenzen aufweisen.

3. Proteine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie erlangbar sind mittels Genetic Engineering in einem rekombinanten Baculovirus-Ausdruckssystem, in einer permissiven Gastzellenkultur multipliziert.

4. Proteine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß solche rekombinanten Baculoviren mindestens das Gen eines Proteins, durch ORFs 2 bis 7 kodiert, des Virus PRRS-Olot enthalten, ordnungsgemäß eingefügt und aus gedrückt.

5. Proteine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß solche permissive Gastzellenkultur eine Kultur per missiver Insektenzellen ist.

6. Proteine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie erlangbar sind mittels des Ausdrucks rekombi nanter Baculoviren, ausgewählt aus Bezeichnung ECACC-Zugangsnummer AcNPV, PRRS2 V94021007 AcNPV, PRRS3 V94011325 AcNPV, PRRS4 V94021008 AcNPV, PRRS5 V94011326 AcNPV, PRRS6 V94011327 AcNPV, PRRS7 V94011328

7. Verfahren zum Erlangen rekombinanter PRRS-Olot-Pro teine, kodiert durch die Gene, die in irgendeinem der ORFs 2 bis 7 des genannten Virus enthalten sind, das die Stufen aufweist:

a) Päparation der cDNA-Sequenz, synthetisiert aus der PRRS-Olot-Genom-RNA, in ein Baculovirus einzuset zen, und
b) Erlangung rekombinanter Baculoviren, welche die re kombinanten Proteine ausdrücken, die den einge setzten ORFs entsprechen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation der einzusetzenden cDNA-Sequenz die Stufen aufweist:

a.1 Isolierung und Purifizierung des Virus PRRS-Olot,
a.2 Isolierung der PRRS-Olot-Viral-RNA, und
a.3 Synthese der cDNA aus der PRRS-Olot-Genom-RNA.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung des Virus PRRS-Olot durchgeführt wird durch Replikation des genannten Virus auf permissiven Zellkulturen.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung des PRRS-Olot-Viral-RNA durchgeführt wird durch Adsorption an eine Oligo-d(T)₁₂-Cellulose.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese von cDNA, aus der PRRS-Olot-Genom-RNA, durchgeführt wird durch Inkubieren der genannten RNA mit den entsprechenden dNTPs, umgekehrte Transkriptase und entweder ein Oligo d(T)₁₂ oder, alternativ, ein Oligo nukleotid mit der Formel 5′CGGGCTCGAGCCTTTGGCGA3′.

12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Erlangung der rekombinanten Baculoviren, die re kombinante Proteine ausdrücken, die den ORFs 2 bis 7 des PRRS-Olot entsprechen, die Stufen aufweist:

b.1 Einfügung der entsprechenden ORF-Gene in Baculovi rus-Transfer-Vektoren,
b.2 Transfektion permissiver Gastzellen mit den genann ten Transfer-Vektoren, welche die entsprechenden ORF-Gene eingefügt haben, und
b.3 Selektion der rekombinanten Baculoviren, welche die entsprechenden eingefügten ORF rekombinanten Pro teine ausdrücken.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Baculovirus-Transfer-Vektor ein Vektor pAcYM1 ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion der genannten permissiven Gastzel len für die Replikation der rekombinanten Baculoviren durchgeführt wird mit einer Mischung der DNA des Trans fer-Vektors, der das entsprechende ORF-Gen und die DNA des Baculovirus, wilder Typ, eingefügt hat.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den genannten permissiven Gastzellen um eine Insektenzellkultur handelt.

16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Baculovirus, das erlangt wird, ein einzelnes rekombinantes Protein des PRRS-Olot ausdrückt, aus irgendeinem der Proteine ausgewählt, durch die ORFs 2 bis 7 des genannten Virus kodiert.

17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinanten Baculoviren, die erlangt werden, ausgewählt werden aus: Bezeichnung ECACC-Zugangsnummer AcNPV, PRRS2 V94021007 AcNPV, PRRS3 V94011325 AcNPV, PRRS4 V94021008 AcNPV, PRRS5 V94011326 AcNPV, PRRS6 V94011327 AcNPV, PRRS7 V94011328

18. Rekombinante Baculoviren, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein rekombinantes Protein ausdrücken, das einem der ORFs 2 bis 7 des PRRS-Olot entspricht.

19. Rekombinante Baculoviren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein einzelnes rekombinates Pro tein des PRRS-Olot ausdrücken, aus irgendeinem der Pro teine gewählt, durch die ORFs 2 bis 7 des genannten Virus kodiert.

20. Rekombinante Baculoviren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt sind aus Bezeichnung ECACC-Zugangsnummer AcNPV, PRRS2 V94021007 AcNPV, PRRS3 V94011325 AcNPV, PRRS4 V94021008 AcNPV, PRRS5 V94011326 AcNPV, PRRS6 V94011327 AcNPV, PRRS7 V94011328

21. Vakzine, für die Vakzinierung und den Schutz von Schweinen vor dem reproduktiven und respiratorischen Syndrom bei Schweinen (PRRS) geeignet, die mindestens ein rekombinantes Protein, das irgendeinem der durch die ORFS 2 bis 7 des PRRS-Olot kodierten Proteine ent spricht, und einen geeigneten Träger oder ein geeignetes Adjuvans aufweist.

22. Vakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten rekombinanten Proteine durch Genetic- Engineering-Techniken erlangbar sind in einem Ausdrucks system rekombinanter Baculoviren, in einer permissiven Gastzellenkultur multipliziert.

23. Vakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinanten Baculoviren, welche die genannten rekombinanten Proteine ausdrücken, ausgewählt sind aus: Bezeichnung ECACC-Zugangsnummer AcNPV, PRRS2 V94021007 AcNPV, PRRS3 V94011325 AcNPV, PRRS4 V94021008 AcNPV, PRRS5 V94011326 AcNPV, PRRS6 V94011327 AcNPV, PRRS7 V94011328

24. Vakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten rekombinanten Proteine teilweise puri fiziert verwendet sind.

25. Vakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte antigene Phase ein einzelnes rekom binantes PRRSV-Protein enthält, aus der Gruppe ausge wählt, die durch die rekombinanten Proteine gebildet wird, die kodiert sind durch die PRRS-Olot-ORFs 3, 5 und 7.

26. Vakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte antigene Phase aus Insektenzellen zu sammengesetzt ist, die mit dem gleichen rekombinanten Baculovirus infiziert sind, das nur eins der rekombinan ten Proteine ausdrückt, die durch die PRRS-Olot-ORFs 2 bis 7 kodiert sind.

27. Vakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte antigene Phase aus Insektenzellen zu sammengesetzt ist, die mit unterschiedlichen rekom binanten Baculoviren infiziert sind, die jeweils nur eins der unterschiedlichen rekombinanten Proteine aus drücken, die durch die PRRS-Olot-ORFs 2 bis 7 kodiert sind.

28. Vakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein öliges Adjuvans enthält.

29. Vakzine nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte ölige Adjuvans aus einer Mischung von Marcol 52, Simulsol 5100 und Montanide 888 besteht.

30. Vakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein wäßriges Adjuvans enthält.

31. Vakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Zell-Reaktions-Potentiator-(CRP)- Substanzen, wie beispielsweise IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL12, g-IFN, Zellnekrosefaktor und ähnliche Sub stanzen enthält.

32. Vakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvans ein Adjuvans ist, das fähig ist, Zell reaktion, wie beispielsweise MDP, ISCOM oder Liposome, zu modulieren und zu immunostimulieren.

33. Vakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie fähig ist, zellulare Immunität in vakzinierten Tieren hervorzurufen.

34. Bi- oder multivalente Vakzine, die fähig ist, das reproduktive und respiratorische Syndrom bei Schweinen, und ein anderes Syndrom, oder andere Schweine-Infektio nen zu verhindern, dadurch gekennzeichnet, daß sie min destens ein rekombinantes Protein, das einem der Pro teine entspricht, das durch irgendeines der Gene kodiert ist, das in irgendeinem der ORFs 2 bis 7 des PRRS-Olot enthalten ist, zusammen mit einem oder mehreren Schwei ne-Pathogenen, und einem geeigneten Träger oder Adjuvans aufweist.

35. Vakzine nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Schweine-Pathogen einschließt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die gebildet wird durch Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, porcine parvovirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopatiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Porcine respiratory coronavirus, Rotavirus, oder gegen die Pathogene, welche die Aujeszkysche Krankheit, Schweine- Influenza oder die ansteckende Gastroenteritis auslösen.

36. Passive Vakzine, für die Vakzinierung und den Schutz von Schweinen vor dem reproduktiven und respiratorischen Syndrom bei Schweinen (PRRS) geeignet, dadurch gekenn zeichnet, daß sie Antikörper, die durch die Immunisie rung von Tieren mit mindestens einem rekombinanten Pro tein erlangt werden, das einem der Proteine entspricht, die durch irgendeines der Gene kodiert sind, das in irgendeinem der ORFs 2 bis 7 des PRRS-Olot enthalten ist, und einen geeigneten Träger oder ein geeignetes Adjuvans enthält.

37. Diagnostik-Kit für die Feststellung des Vorhanden seins von Antikörpern, die das PRRSV in einer biologi schen Probe, wie beispielsweise Blut, Serum, Sputum, Speichelflüssigkeit, oder Milch von Schweinen, spezi fisch identifizieren, wobei mindestens ein rekombinantes Protein vorhanden ist, das einem der ORFs 2 bis 7 des PRRS-Olot entspricht, und geeignete Feststellungsmittel.

38. Diagnostik-Kit nach Anspruch 37, dadurch gekenn zeichnet, daß die genannten rekombinanten Proteine er zielbar sind durch Genetic Engineering in einem Aus druckssystem rekombinanter Baculoviren, in einer permis siven Gastzellenkultur multipliziert.

39. Diagnostik-Kit nach Anspruch 38, dadurch gekenn zeichnet, daß die rekombinanten Baculoviren, welche die genannten rekombinanten Proteine ausdrücken, ausgewählt sind aus: Bezeichnung ECACC-Zugangsnummer AcNPV, PRRS2 V94021007 AcNPV, PRRS3 V94011325 AcNPV, PRRS4 V94021008 AcNPV, PRRS5 V94011326 AcNPV, PRRS6 V94011327 AcNPV, PRRS7 V94011328

40. Diagnostik-Kit für die Feststellung des Vorhanden seins des PRRSV in einer biologischen Probe, wie bei spielsweise Blut, Serum, Sputum, Speichelflüssigkeit, Gewebe oder Milch, von Schweinen, die Antikörper auf weist, die das PRRSV spezifisch identifizieren, die da durch erlangt wurden, daß Tiere mit mindestens einem rekombinaten Protein immunisiert wurden, das einem der ORFs 2 bis 7 des PRRS-Olot entspricht, und geeignete Feststellungsmittel.