FR2719845A1 - Protéines PRRSV recombinantes, kits de diagnostic et vaccins contenant ces protéines PRRSV recombinantes. - Google Patents

Protéines PRRSV recombinantes, kits de diagnostic et vaccins contenant ces protéines PRRSV recombinantes. Download PDF

Info

Publication number
FR2719845A1
FR2719845A1 FR9505716A FR9505716A FR2719845A1 FR 2719845 A1 FR2719845 A1 FR 2719845A1 FR 9505716 A FR9505716 A FR 9505716A FR 9505716 A FR9505716 A FR 9505716A FR 2719845 A1 FR2719845 A1 FR 2719845A1
Authority
FR
France
Prior art keywords
recombinant
prrs
acnpv
olot
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
FR9505716A
Other languages
English (en)
Other versions
FR2719845B1 (fr
Inventor
Duran Juan Plana
Sanchez Isabel Climent
Alvarez Jose Ignacio Casal
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wyeth Farma SA
Original Assignee
Cyanamid Iberica SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from ES09401027A external-priority patent/ES2078187B1/es
Application filed by Cyanamid Iberica SA filed Critical Cyanamid Iberica SA
Publication of FR2719845A1 publication Critical patent/FR2719845A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of FR2719845B1 publication Critical patent/FR2719845B1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/815—Viral vaccine for porcine species, e.g. swine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Des protéines recombinantes du virus responsable du syndrome de reproduction et respiratoire porcin (PRRS), correspondant aux ORF 2 à 7 de l'isolat espagnol du PRRSV (PRRS-Olot), ont été produites dans un système d'expression de baculovirus, en utilisant des cultures de cellules Sf9 en tant qu'hôte permissif. Ces protéines recombinantes sont appropriées pour la préparation de vaccins capables de protéger de manière efficace un élevage porcin vis-à-vis du PRRS et pour la préparation de kits de diagnostic destinés à la détection d'anticorps anti-PRRSV ainsi que du PRRSV dans un échantillon biologique porcin. La présente invention présente de l'intérêt en Médecine Vétérinaire.

Description

PROTÉINES PRRSV RECOMBINANTES, KITS DE DIAGNOSTIC ET VACCINS CONTENANT
CES PROTÉINES PRRSV RECOMBINANTES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention a pour objet des protéines recombinantes virales de l'agent responsable du syndrome respiratoire et de reproduction porcin (PRRS) produites dans un système d'expression de baculovirus recombinant proliférant dans une culture de cellule hôtes permissives. L'invention a également pour objet des kits de diagnostic et des vaccins qui comprennent au moins l'une des
dites protéines recombinantes.
HISTORIQUE DE L'INVENTION
En Espagne, les premiers cas de troubles respiratoires chez les porcelets
ont été détectés sur un lot de 300 porcelets importés d'Allemagne, à la mi-
janvier de l'année 1991 (Plana et al., Med. Vet., Vol. 8, N 11, 1991). Peu de temps après, dans deux élevages de porcs de deux fermes situées près de l'élevage o le problème initial est apparu, on a détecté une maladie caractérisée par un nombre anormalement élevé d'avortements pendant la dernière phase de la gestation, ainsi que par un taux de mortalité de 70 %
chez les porcelets.
La cause de cette explosion épizootique n'était pas connue, mais la symptomatologie était similaire aux signes cliniques qui ont été décrits pour une maladie porcine détectée, pour la première fois en Europe, en Allemagne (1990) et pour la maladie appelée Maladie Mystérieuse Porcine détectée au Etats-Unis et au Canada en 1987 (Hill, Proceedings of the Mystery Swine Disease Comittee Meeting, 6 Octobre 1990, Denver, USA). Cette maladie affecte des truies pleines, provoquant chez elles une anorexie, des avortements, des mort-nés, des foetus momifiés, des porcelets faibles qui meurent quelques heures après leur naissance et des problèmes respiratoires après l'accouchement, parmi d'autres. Actuellement, cette maladie est connue sous le nom de "Syndrome respiratoire et de reproduction porcin (PRRS)", bien qu'il ait été appelé antérieurement "Maladie porcine aux oreilles bleues", "Syndrome de reproduction mystérieux" (MRS), "Syndrome respiratoire et d'infertilité porcin (SIARS) et "Syndrome respiratoire et d'avortement
épidémique porcin" (PEARS).
Actuellement, on sait que l'agent responsable de cette maladie est un virus appelé virus PRRS (PRRSV). Ce virus a été isolé pour la première fois au Pays-Bas par un groupe de chercheurs de CDI/Lelystad, qui l'ont appelé virus
Lelystad (LV) (Wesvoort, G. et al., Vet. Quarterly, Vol. 3, 121-130, 1991).
Quelque mois plus tard, un autre isolat a été obtenu en Espagne par les Laboratoires Sobrino/Cyanamid (Plana et al., Vet., Microbiol., 33:203. 211,
1992) qui va être appelé dans cette description PRRS-Olot. Depuis ce temps,
de nouveaux isolats de ce virus ont été décrits (EP Requests N 0 529 584 A2, PCT Requests N WO 93/06211 et WO 93/07898). Les caractéristiques structurelles du virus PRRS ont été décrites dans deux publications récentes: a) Meulenberg, J.J.M. et ai., "Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV", Virology, 192: 62-72, (1993); et b) Cozelmann, K-K., et ai., "Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the Arterivirus
group". Virology, 193:329-339, (1993).
Le virus PRRS présente une taille de 50-60 nm, avec une enveloppe d'environ 30-35 nm contenue dans le nucléocapside, et une molécule d'ARN simple comme matériau génomique. En se basant sur ces données morphologiques, le PRRSV a été initialement classé comme Togavirus, alors que si l'on se base sur sa structure génomique et ses mécanismes de
transcription et de traduction, il est plus proche de la famille des Coronavirus.
Récemment, en se basant sur des différences et/ou des similitudes avec les groupes précédents, on a proposé de le placer dans une nouvelle famille appelée Artérivirus (Cavanagh D., et al., Arch. Virology, 1994). Conjointement avec le PRRSV, on a classé dans ce groupe les virus de l'artérite équine (EAV), le virus déshydrogénase lactique (LDV) et le virus de la fièvre hémorragique
simienne (SHFV).
Récemment, le génome entier du virus Lelystad (LV) (Meulenberg et al., cité plus haut), un segment génomique de l'isolat de virus PRRS T bingen (Allemagne) (TV) (Cozelmann et al., cité plus haut) et un segment du virus PRRS-Olot (revendication du brevet espagnol N ES P9301973) ont été clonés et séquencés. En se basant sur l'ensemble des résultats obtenus, on peut affirmer que le génome du PRRSV est constitué d'une molécule d'ARN simple brin qui contient, à l'extrémité 3', une queue poly-A. La longueur du génome est d'environ 15000 paires de bases (pb), et dans sa structure, il contient sept cadres ouverts de lecture (ORF) codant pour les protéines virales. Les ORF ont été appelés ORF1 à ORF7 et ils présentent de petits segments se chevauchant entre eux. On a supposé que la synthèse des protéines virales est produite à partir d'un groupe de transcripts subgénomiques de différentes longueurs (ARNm), mais d'extrémités 3' polyadénylés similaires, et d'une séquence de tête 5' provenant de la séquence de l'extrémité 5' non codante. Cette forme d'expression de protéine virale a été appelée ARNm nichés et elle a été décrite antérieurement pour des coronavirus (Spaan, W.J.M., Cavanagh, D., et Horzineck, M.C., J. Gen., Virol., 69: 2939-2952, 1988). En se basant sur la séquence nucléotidique d'isolat viral des PRRSV Lelystad (LV) et T bingen (TV) et par homologie avec ce que l'on a observé chez d'autres artérivirus, il a été proposé que dans le génome viral, ORF1 (a et b) code pour la polymérase et la réplicase virales. Les ORF 2 à 6 pourraient coder pour les protéines
d'enveloppe virale, et ORF7 pourrait coder pour la protéine du nucléocapside.
La réplicase et la polymérase virales sont des protéines de grande taille, de 260 et 163 kDa respectivement, et les deux contiennent trois sites de glycosylation possibles. Les protéines d'enveloppe (ORF 2 à 6) situées à I'extrémité 3' sont petites, leur taille étant comprise entre 30 et 19 kDa. Toutes contiennent plus de deux sites de glycosylation possibles, en particulier ORF3, qui contient 7 sites. Toutes ces protéines contiennent des séquences hydrophobes aux extrémités amino(N)-terminale et carboxy(C)-terminale, qui
peuvent fonctionner comme séquences de tête et ancre de membrane.
Généralement, ce sont des protéines hydrophobes, conformément à leur position associée à une membrane. Il faut noter que ORF6 présente 3 segments hydrophobes placés à l'intérieur de 90 résidus d'acides aminés à l'extrémité N-terminale. D'autre part, la protéine codée par ORF7, correspondant éventuellement au nucléocapside viral, est extrêmement basique, avec des résidus arginine, lysine et histidine à l'extrémité N terminale. Les séquences d'acides aminés de la polymérase virale de LV et TV, des protéines de structure et du nucléocapside présentent une identité de 29 % à 67 % avec le virus LDV, et entre 20 % et 36 % avec le virus EAV. Ce phénomène suggère que
l'évolution du virus PRRSV est plus proche du LDV que du EAV.
La maladie provoquée par le PRRSV est responsable de pertes sévères dans l'industrie porcine. En conséquence, des vaccins capables d'éviter
l'infection provoquée par le PRRSV ont été développés.
Généralement, les vaccins dirigés contre des PRRSV connus, décrits dans
les revendications de brevets WO 92/21375, WO 93/06211, WO 93/077898 et
ES P9301973, sont des vaccins obtenus à partir de virus cultivés sur des macrophages et inactives ensuite. La demande de brevet ES P9301973 fournit un vaccin capable d'éviter le syndrome respiratoire et de reproduction porcin (PRRS). On a démontré que le vaccin est efficace pour éviter des troubles de reproduction chez les truies, tels que la naissance de porcelets mort-nés, momifiés ou vivants mais faibles, la répétition de l'oestrus et des problèmes similaires provoqués par le virus responsable du PRRS. De même, on a vérifié
que le vaccin provoque une immunité cellulaire chez les animaux vaccinés.
Ledit vaccin contient une quantité appropriée d'antigène viral PRRS, la souche espagnole (PRRS-Olot), inactivée, conjointement avec un adjuvant et un
conservateur.
La présente invention fournit un vaccin de la seconde génération, dans lequel la technologie de l'ADN recombinant a été utilisée avec l'objectif d'obtenir de nouveaux vaccins capables de conférer une protection efficace contre l'infection provoquée par le PRRSV. Les vaccins de la présente invention contiennent au moins une protéine recombinante de PRRSV. D'un autre coté, la présente invention fournit de nouveaux systèmes ou kits de
diagnostic du PRRSV, qui impliquent l'utilisation de techniques enzymo-
immunologiques (ELISA) utilisant des protéines recombinantes de PRRSV. Ces vaccins recombinants n'exigent pas la manipulation du virus complet, mais plutôt seulement d'une partie de celui-ci, éliminant ainsi le risque d'un accident qui pourrait libérer le virus, ce qui représente un avantage considérable par
rapport aux vaccins inactivés actuels contre le PRRSV.
La production de protéines recombinantes par des techniques de génie génétique est un fait qui a été décrit antérieurement. De nombreux systèmes d'expression et de production de protéines recombinantes sont connues. Un des systèmes les plus efficaces pour une production à grande échelle de protéines recombinantes est basée sur la réplication de baculovirus recombinants dérivant du Autographa californica nuclear polyhedrosis virus
(AcNPV), dans la culture de cellules d'insectes. La description de la technique
d'expression de baculovirus est présentée dans les articles suivants: a) LucKow, V.A. & Summers, M.D., "Trends in the development of baculovirus expression vectors". Bio/Technology, 6: 47-55, (1988); et b) Bishop, D.H.L., "Baculovirus expression vectors". Seminars in
VIROLOGY, 3: 253-264 (1992).
La présente invention fournit des protéines recombinantes de PRRSV, en particulier de l'isolat PRRS-Olot, produit dans un système d'expression de baculovirus proliférant dans une culture de cellules hôtes permissives. Les baculovirus recombinants capables de produire de telles protéines recombinantes, ainsi que les vecteurs de transfert utilisés, constituent des objectifs supplémentaires de l'invention. Les procédés d'obtention de ces baculovirus et protéines recombinants sont également des objectifs de la
présente invention.
L'invention fournit également de nouveaux vaccins pour la vaccination de porcs afin de les protéger de l'infection provoquée par le PRRSV, comprenant au moins une protéine recombinante parmi celles fournies par la présente
invention, et un véhicule ou adjuvant approprié.
L'invention fournit également un kit de diagnostic pour détecter la présence d'anticorps qui reconnaissent spécifiquement le PRRSV dans un échantillon biologique prélevé chez les porcs (par exemple: sang, sérum, crachat, salive ou lait). Le kit comprend au moins une protéine recombinante parmi celles fournies par la présente invention, et des procédés de détection appropriés. L'invention fournit également un kit de diagnostic pour la détection de la présence d'antigènes (PPRSV) dans un échantillon biologique prélevé chez des porcs (par exemple: sang, sérum, crachat, salive, lait ou tissu). Le kit comprend au moins un anticorps qui reconnaît spécifiquement le PRRSV obtenu par immunisation d'animaux avec au moins une protéine recombinante choisie parmi celles fournies par la présente invention, et des moyens de
détection appropriés.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 représente la séquence des 3383 pb clonés à partir de l'isolat PRRS-Olot. La figure 2 représente la séquence d'acides aminés correspondant aux protéines codées par ORF2 (Figure 2A), ORF3 (Figure 2B), ORF4 (Figure 2C),
ORF5 (Figure 2D), ORF6 (Figure 2E) et ORF7 (Figure 2F).
La figure 3 représente l'extension différente de clones pPRRS-8, pPRRS-
108, pPRRS-121, pPRRS-132, pPRRS-146, pPRRS-147, pPRRS-148, pPRRS-
153 et pPRRS-3, en comparaison avec LV, ainsi que les ORF contenus dans chacune d'eux. Sur cette figure, on se réfère au génome de PRRSV (a), la taille
étant indiquée en Kb (b) et le nombre de clones (c).
La figure 4 représente le clone pPRRS-3 contenant le gène de la protéine
codée par ORF2.
La figure 5 représente le clone pPRRS-121 contenant le gène de la
protéine codée par ORF3.
La figure 6 représente le clone pPRRS-146 contenant le gène de la
protéine codée par ORF4.
La Figure 7 représente le clone pPRRS-132 contenant le gène de la
protéine codée par ORF5.
La figure 8 représente le clone pPRRS-8 contenant les gènes des
protéines codées par ORF6 et ORF7.
La figure 9 représente les résultats du dosage antigénique par ELISA (absorbance conduite à 405 nm). La figure 9 représente les résultats du dosage antigénique par ELISA. Sur la figure, on se réfère au dosage antigénique (a), aux valeurs de l'absorbance lues à 405 nm (b) et aux dilutions
antigéniques [en unités de 1/] (c).
La figure 10 représente les résultats du dosage ELISA d'un sérum de PRRS obtenu chez un animal infecté. La figure représente le dosage du sérum (a), les valeurs de l'absorbance lues à 405 nm (b) et les dilutions sériques [en
unités de 1/] (c).
La figure 11 représente les résultats obtenus lors d'une expérience d'échantillonnage avec plusieurs douzaines de sérum prélevés sur le site. La figure représente le dosage des sérums (a), les valeurs d'absorbance lues à
405 nm (b) et les sérums (c).
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Notre laboratoire a effectué des recherches concernant l'agent responsable du PRRS au cours de ces dernières années. La principale conséquence en est l'isolement du virus appelé PRRS-CY-JPD-P5-6-91. Il a été déposé à l'ECACC (sous le numéro d'enregistrement V93070108) et un vaccin contre le PRRSV a été développé, contenant le virus inactivé (demande
de brevet ES P9301973).
Depuis, nos recherches se sont concentrées sur l'isolement et le clonage du génome de PRRSV (PRRS-CY-JPD-P5-6-91), appelé PRRS-Olot dans la
présente description, afin de permettre le développement de nouveaux vaccins
recombinants qui sont efficaces contre l'infection provoquée par le PRRSV. A cet effet, on a cloné un segment génomique dudit génome de PRRS- Olot. Le fragment cloné correspond au génome viral 3 et représente une séquence consécutive de 3338 pb. Ce segment contient les six cadres de lecture ouverts correspondant aux ORF 2 à 7 décrits pour LV et TV. Ils codent pour les protéines de structure du virus (nucléocapside et enveloppe) éventuellement impliquées dans l'antigénie et l'immunogénie virales. Les protéines codées par les ORF 2 à 7 de PRRS-Olot sont similaires aux protéines correspondantes de LV et TV. Leurs caractéristiques sont résumées dans le tableau 1, o l'on a indiqué, en relation avec chaque ORF, les positions relatives des nucléotides, le nombre de paires de base (pb), le nombre d'acides aminés (Aac), la masse
moléculaire de chaque protéine (en kDa) et les sites de glycosilation.
Tableau 1
Caractéristiques des ORF du virus PRRS-Olot ORF Nucléotides pb Aac (N ) Protéines Glycosylation (sites) (kDa)
2 68-811 747 249 28,4 2
3 673-1467 795 265 30,8 7
4 1215-1763 549 183 20,0 5
1763-2362 600 200 22,4 2
6 2353-2871 519 173 19,0 2
7 2864-3247 384 128 13,8 1
La figure 1, qui accompagne la présente description, montre la séquence
consécutive complète des 3383 pb du fragment clone correspondant à l'extrémité 3' du génome viral PRRS-Olot. Cette séquence nucléotidique présente 95 % d'homologie avec les séquences correspondantes des isolats LV et TV. Ces deux derniers isolats présentent entre eux une homologie de 99 %. Les modifications de la séquence nucléotidique de l'isolat PRRSOlot se trouvent le long de la séquence entière, mais elles sont compensées en particulier à l'extrémité 5'. Il faut noter, en comparaison avec LV, la délétion des
trois nucléotides à la position 1860 de PRRS-Olot.
La figure 2 (2A-2F) de la présente description indique les séquences
d'acides aminés des protéines codées par les ORF 2 à 7 du virus PRRSOlot.
Au niveau de la protéine, on observe une homologie de 99 % entre PRRSOlot et LV ORF7, comme on pouvait s'y attendre pour une protéine virale de nucléocapside et en conséquence, la mieux conservée. Le pourcentage d'homologie pour le reste des protéines est compris entre 93 % pour les ORF 3, 4 et 5, atteignant une valeur de 96,5 % pour les ORF 2 et 6. Tous présentent des pics de glycosylation similaires à ceux décrits pour LV, sauf ORF4 du virus PRRS-Olot, qui présente un site de glycosylation supplémentaire. Concernant les modifications mentionnées ci-dessus dans les acides aminés de la protéine de PRRS-Olot, 50 % des modifications se trouvent dans des acides aminés chimiquement similaires, tandis que le reste des modifications se trouvent dans des acides aminés différents. Comme mentionné pour LV, excepté ORF7, le reste des protéines présentent un degré d'hydrophobie élevé, éventuellement en accord avec leur association à des membranes, dans la mesure o ce sont
des protéines d'enveloppe virales.
Des protéines recombinantes correspondant à l'expression des ORF 2 à 7 de PRRS-Olot peuvent être produites dans un système d'expression approprié et avantageusement, dans un système d'expression de baculovirus recombinant proliférant dans une culture de cellules hôtes permissives. Le procédé global d'obtention de ces protéines recombinantes comprend essentiellement les étapes générales suivantes: Préparation de la séquence d'ADNc qui doit être insérée dans un baculovirus; et Il. Obtention de baculovirus recombinants exprimant les protéines recombinantes. Ces étapes générales sont divisées à leur tour en d'autres étapes partielles. De cette façon, la préparation de la séquence d'ADNc à insérer comprend les étapes partielles suivantes: I.a Isolement et purification du virus PRRS-Olot I.b Isolement de l'ARN viral du virus PRRS-Olot et
I.c Synthèse de l'ADNc à partir de l'ARN génomique de PRRS-Olot.
D'un autre côté, I'obtention des baculovirus recombinants exprimant les protéines recombinantes correspondant aux ORF 2 à 7 de PRRS-Olot comprend les étapes partielles suivantes: lI.a Préparation du gène d'ORF de PRRS-Olot à insérer; II.b Insertion dudit gène dans un vecteur de transfert de baculovirus; II.c Transcription de cellules hôtes permissives à l'aide dudit vecteur de
transfert qui présente un gène ORF de PRRS-Olot inséré.
Il.d Sélection du baculovirus recombinant exprimant la protéine
recombinante correspondant à l'ORF inséré.
La caractérisation des baculovirus recombinants et l'analyse et la purification des protéines recombinantes sont ensuite effectuées. Toutes ces
étapes sont décrites en détail dans la description ci-après.
Le procédé utilisé pour l'obtention des protéines recombinantes fournies par la présente invention commence avec l'isolement et la purification du PRRSV, en particulier le PRRS-Olot, conformément au protocole décrit dans l'exemple 1. Une fois que le PRRS-Olot a été isolé et purifié, I'ARN viral est isolé et à cet effet, on utilise un kit commercial (Pharmacia) qui met en oeuvre une méthode basée sur la sélection et la purification de l'ARN viral contenant une séquence poly(A) à l"extrémité 3' (exemple 2). L'ARN obtenu est analysé sur des géloses neutres à 0,7 % par coloration au bromure d'éthidium, et on observe uniquement une bande de substance ayant une masse moléculaire
comprise entre 5000 et 23000 pb.
Ensuite, I'ADNc correspondant à l'ARN viral de l'extrémité 3' est synthétisé (Exemple 3) à l'aide d'un kit commercial (Boehringer), à l'aide d'une stratégie qui profite de la présence d'une queue poly(A) et utilise un oligo d(T) en tant qu'amorce d'extension capable d'être prolongée à l'aide de l'enzyme transcriptase réverse et de synthétiser des molécules d'ADNc. Pour cloner les régions d'ARN en amont de 3', on utilise un oligonucléotide acollé à une séquence génomique virale spécifique positionnée à environ 2500 pb de Il I'extrémité 3'. Une seconde synthèse est réalisée en utilisant un
oligonucléotide de 20 nucléotides à la place de l'oligo d(T)12 (Exemple 3.1).
La synthèse d'ADNc est vérifiée et quantifiée par détermination de la radioactivité incorporée dans la substance synthétisée et électrophorèse sur des géloses alcalines et neutres. Après cela, le clonage et le séquençage de l'ADNc sont effectués (Exemple 3.2). A cet effet, la première étape consiste à sélectionner par la taille les fragments d'ADNc synthétisés, compris entre 1000 et 5000 nt (nucléotides). L'ADNc purifié est cloné dans des extrémités franches
du vecteur pMTL25.
L'analyse des clones PRRSV-positifs est effectuée à l'aide de préparation d'ADN plasmidique et cartographie des sites de restriction, basés sur la séquence LV. Parmi les 300 plasmides analysés, seulement 9 sont positifs et contiennent des inserts compris entre 800 et 2600 pb. La vérification définitive de l'authenticité de ces clones d'ADNc est effectuée par leur séquençage direct, en utilisant la méthode didésoxy appliquée à des plasmides doubles brins. La majorité des clones PRRS- positifs obtenus contient une extrémité poly(A) commune et des extrémités 5' différentes. Les clones sont appelés pPRRS-8, pPRRS-108, pPRRS-121, pPRRS-132, pPRRS-146, pPRRS-147, pPRRS-148 et pPRRS-153. Le clone pPRRS-3 est extrait de la seconde synthèse. Pour obtenir les baculovirus recombinants exprimant les gènes des protéines codées par les ORF 2 à 7 de PRRSV-Olot, on suit généralement et séparément le mode opératoire suivant: Premièrement, on prépare le gène de chaque ORF à insérer, sauf le gène d'ORF3 qui n'exige pas de préparation préalable. Pour la préparation de ces gènes et en fonction de chaque cas particulier, on utilise les plasmides pMTL25, pMTL24 et pMTL22 avant de les transférer dans les vecteurs de transfert de baculovirus. Les gènes correspondant aux ORF 2 à 7 sont obtenus à partir des clones qui ont été obtenus préalablement. Après les manipulations successives, on obtient de nouveaux plasmides recombinants. Les plasmides recombinants, qui contiennent les gènes correspondant à chaque ORF inséré, sont purifiés selon une technique de lyse alcaline et sont caractérisés par cartographie avec des endonucléases de restriction et séquençage des régions d'insertion. Les nouveaux vecteurs obtenus sont appelés pPRRS- ORFN, o N
représente le numéro de chaque ORF (N = 2 à 7).
Ensuite, chaque gène d'ORF est cloné dans un vecteur de transfert approprié. Le vecteur de transfert utilisé est pAcYM1 (Matsuura et al., J. Gen. Virol. 68, 1233-50). Après des manipulations successives, on obtient de nouveaux plasmides recombinants, chacun d'eux contenant le gène d'ORF inséré. Les plasmides recombinants obtenus sont purifiés par une technique de lyse alcaline et caractérisés par cartographie avec des endonucléases de restriction. Les extrémités insérées sont séquencées afin de vérifier la séquence correcte des régions insérées. Les nouveaux vecteurs de transfert obtenus sont analysés pour vérifier que les gènes insérés ont une orientation
correcte pour leur expression par le promoteur polyhédrine du virus AcNPV.
Les vecteurs de transfert obtenus sont les suivants Dénomination ORF pPRRS-Bac8 2 pPRRS-Bac2 3 pPRRS-Bac9 4 pPRRS-Bac3 5 pPRRS-Bac5 6 pPRRS-Bac7 7 Ensuite, des cellules de Spodoptera frugiperda, clone Sf9, sont transfectés avec des mélanges d'ADN infectieux purifiés du virus parentéral AcRP23-lacZ, et le vecteur de transfert correspondant. Une fois cette transfection réalisée, les baculovirus recombinants sont identifiés par coloration sur plaque de phénotypes après la coloration de la progénie viral avec X-gal, et
ensuite purifiés.
Les baculovirus recombinants obtenus sont déposés à la Collection Européenne de Culture de Cellules Animales (ECACC), Porton Down,
Salisbury, Whiltshire SP4 OJG (R.U.).
Les exemples 4 à 9 décrivent en détail l'obtention des baculovirus
recombinants exprimant les gènes codés respectivement par les ORF 2 à 7.
Les protéines recombinantes ORF 2 à 7 de PRRS-Olot peuvent être utilisées à des fins de diagnostic pour détecter la présence d'anticorps dirigés spécifiquement contre le PRRSV (Exemple 12) et pour détecter la présence d'antigènes (PRRSV) à l'aide d'anticorps qui identifient spécifiquement le PRRSV obtenu par immunisation d'animaux avec au moins une protéine recombinante correspondant à l'un des ORF 2 à 7 de PRRS- Olot. De plus, ces protéines peuvent être également utilisées pour immuniser des animaux contre le PRRSV. En conséquence, lesdites protéines peuvent être utilisées pour formuler des vaccins recombinants capables de protéger de manière efficace les porcs contre l'infection provoquée par le PRRSV. Ces vaccins peuvent être actifs ou passifs. Des vaccins actifs peuvent être préparés par mise en suspension d'au moins une des protéines recombinantes fournies par la présente invention dans un diluant et un adjuvant immunologiquement acceptables. Un vaccin passif peut être obtenu par immunisation des animaux avec lesdites protéines et isolement des anticorps polyclonaux dirigés contre lesdites protéines. Après l'isolement et la purification des anticorps, on peut les
utiliser dans des applications de vaccin.
Dans un mode de réalisation spécifique de la présente invention, on obtient des vaccins recombinants qui sont capables de protéger de manière efficace des animaux contre l'infection provoquée par le PRRSV, comprenant l'antigène viral (phase antigénique) conjointement avec un diluant et un
adjuvant immunologiquement acceptables.
Pour la préparation de la phase antigénique, on infecte des cellules d'insectes - de préférence des cellules de Spodoptera fruaiperda - avec les divers baculovirus recombinants capables de produire les protéines recombinantes correspondant aux ORF 2 à 7 de PRRSV, et on effectue l'incubation dans des conditions appropriées pour l'expression desdites protéines. Immédiatement après, on recueille les cellules, on les lave et les remet en suspension dans un tampon approprié et ensuite, on les utilise pour la
préparation des vaccins recombinants mentionnés précédemment.
Dans un mode de réalisation spécifique, la phase antigénique est composée d'un homogénat de cellules d'insectes infectées avec des baculovirus recombinants exprimant une seule protéine recombinante de PRRSV, telle que de préférence ORF3, ORF5 et ORF7 (Exemple 13). Dans un autre mode de réalisation spécifique, la phase antigénique est constituée d'un homogénat d'un mélange de cellules d'insectes infectées avec différents baculovirus recombinants exprimant, chacun d'entre eux, une protéine recombinante PRRSV différente, tel qu'un mélange de cellules d'insectes infectées avec les baculovirus recombinants exprimant par exemple les protéines correspondant à ORF3, ORF5 et ORF7. D'une manière générale, les vaccins sont formulés de façon à contenir, en tant que phase antigénique, une quantité d'environ 50x106 cellules d'insectes infectées avec desbaculovirus exprimant la protéine recombinante en question. Lorsque le vaccin contient diverses protéines recombinantes, la phase antigénique est constituée d'une quantité d'environ 50x106 cellules d'insectes infectées avec des baculovirus pour la protéine recombinante en question, c'est-à-dire pour la formulation d'un vaccin contenant les protéines correspondant à ORF3, 5 et 7, la phase antigénique est constituée d'environ 50x106 cellules d'insectes infectées avec des baculovirus exprimant la protéine recombinante d'ORF3, 50x106 cellules infectées avec des baculovirus exprimant la protéine recombinante d'ORF5 et x106 cellules d'insectes infectées avec des baculovirus exprimant la protéine
recombinante d'ORF7 (Exemple 13).
On peut utiliser des solutions salines tamponnées au phosphate (PBS) ou d'autres solutions salines similaires en tant que diluants immunologiquement
acceptables.
En tant qu'adjuvant, on peut utiliser généralement l'un quelconque des adjuvants habituels utilisés pour formuler des vaccins, soit des adjuvants aqueux - tels que l'hydroxyde d'aluminium, des suspensions de gel d'alumine, QuilA - ou autres, tels que des adjuvants huileux, à base d'huile minérale, de glycérides et d'autres dérivés éther-acide oléique. En particulier, il est confirmé qu'un adjuvant huileux, constitué d'un mélange de Marcol 52, Simusol 5100 et Montanide 888, donne de très bon résultats. Le Marcol 52 est une huile minérale de faible densité fabriquée par ESSO Espanola S.A., le Simulsol 5100 est un polyéthoxy oléate-éther commercialisé par SEPIC, et le Montanide 888 est un octadécénoate d'anhydromannitol-éther de grande
pureté, commercialisé par SEPIC.
Les vaccins de la présente invention peuvent également contenir des substances potentiateurs de réponse cellulaire (CRP) c'est-à-dire des substances qui renforcent les sous-populations de cellules auxiliaires T (Thl et Th2) telles que IL-1 (interleukine-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN (interféron gamma), le facteur de nécrose cellulaire et des substances similaires qui peuvent théoriquement provoquer une immunité cellulaire chez les animaux vaccinés. Ces substances CRP peuvent être utilisées dans des formulations de
vaccin avec des adjuvants aqueux ou huileux.
De même, on peut utiliser d'autres types d'adjuvants pour la modulation et l'immunostimulation de la réponse cellulaire, tels que le MDP (muramyle
dipeptide), I'ISCCM (Complex immunostimulant) ou des liposomes.
Les vaccins de la présente invention peuvent être obtenus par mise en suspension de la phase antigénique dans, ou mélange avec le diluant et l'adjuvant immunologiquement acceptables. Lorsque l'adjuvant est huileux, il se forme un émulsion qui - dans un cas spécifique et préféré, lorsque l'adjuvant est un mélange de Marcol 52, de Simulsol 5100 et de Montanide 888 - est une émulsion double eau/huile/eau, de type e/h/e. Dans le cas o le vaccin doit contenir des substances CRP, ces substances peuvent être ajoutées aussi bien à la phase antigénique qu'à l'adjuvant. Selon une variante, lorsque le vaccin ne contient pas de substances CRP, ces dernières peuvent être injectées, si on le souhaite, simultanément, au niveau d'un site séparé, différent du site de l'inoculation. De plus, ces vaccins peuvent contenir des combinaisons de différents agents pathogènes porcins contenant, en plus d'une ou plusieurs protéines
recombinantes PRRSV, un ou plusieurs des agents pathogènes mentionnés ci-
après, permettant la préparation de vaccins polyvalents. Parmi ces agents pathogènes, on peut mentionner, mais sans y être limité, Actinobacillus pleuropneumoniae. Haemophilus parasuis, Porcine parvovirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Porcine respiratory coronavirus, Rotavirus. Les vaccins peuvent être également dirigés contre l'agent pathogène responsable de la maladie
d'Aujeszky, de la grippe porcine et de la gastro-entérite transmissible.
Des essais de sécurité ou d'efficacité effectués avec les vaccins de la présente invention ont mis en évidence que lesdits vaccins sont sûrs et en même temps efficaces. Il a été possible de confirmer qu'une dose de 2 ml d'une quantité d'antigène viral ou de phase antigénique est égale à 50x106 cellules d'insectes infectées exprimant une ou plusieurs des protéines recombinantes de PRRSV, administrée par voie intramusculaire profonde, suivie d'une vaccination de rappel avec une dose de 2 ml de vaccin, peut protéger d'une manière efficace
des animaux vaccinés vis-à-vis de l'infection provoquée par le PRRSV.
De même, on a pu vérifier que certains des vaccins faisant l'objet de l'essai - ceux identifiés par rPRRS C et rPRRS D - sont capables de provoquer l'immunité cellulaire chez des animaux vaccinés par le fait que les truies vaccinées et ayant subies un vaccin de rappel avec lesdits vaccins ne présentent pas de signes sérologiques au moment de la provocation et
néanmoins, elles sont protégées (Exemple 14, tableaux 4 et 10).
Afin de déterminer et d'évaluer l'efficacité des vaccins recombinants préparés pour la prévention du PRRS chez des truies pleines, on a conçu un essai consistant à vacciner des truies pleines avec différents vaccins et à les soumettre ensuite à un test de décharge avec des virus virulents. En se basant sur les résultats obtenus, on a pu évaluer l'efficacité des vaccins faisant l'objet du test. Afin d'évaluer l'efficacité de ces vaccins, la reproductivité des résultats, le nombre de porcelets vivants et le nombre de porcelets morts à différentes étapes de la période de vie des porcelets, ainsi que l'analyse des résultats sérologiques chez les truies et les porcelets, ont été pris en compte
(Exemple 14).
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION (EXEMPLES)
Exemple 1: Obtention et purification du virus PRRS-Olot.
1.1 - Obtention de macrophages alvéolaires de poumons porcins 1.1.1 Animaux. On utilise des porcelets âgés de 7 à 8 semaines, obtenus par croisement entre les races Belgium Landrace et Large White. Les animaux provenant de notre propre ferme sont séronégatifs pour les maladies suivantes: la maladie d'Aujeszky, la parvovirose porcine, la fièvre aphteuse, la
fièvre porcine classique, la grippe porcine (type H1 N1 et H3N2) et la gastro-
entérite transmissible.
1.1.2 - Isolement de macrophages. Les animaux sont anesthésiés par injection dans la veine jugulaire de 0,1 g de thiopental de sodium par 10 kg de poids corporel. Ensuite, ils sont tués et les poumons sont extraits, après ligature de la trachée en dessous de l'épiglotte et sectionnement au-dessus de la ligature. Le poumon extrait est lavé de façon externe au PBS. Ensuite, on effectue des lavages internes successifs (4 à 5) avec, au total, 500 ml de PBS additionné d'antibiotiques à raison de 1:800 (solution de PEG: 1000 UI/ml de pénicilline, 1 mg/ml de streptomycine et 0,8 mg/ml de gentamicine), afin d'obtenir des macrophages. Les liquides de lavage sont réunis et centrifugés à 300 g pendant 15 minutes. Dans les étapes suivantes, on lave les cellules deux fois avec du PBS par centrifugation/sédimentation successives, pour enfin remettre en suspension dans un milieu DMEMs (DMEM additionné d'acides aminés non essentiel à 100x, GIBCO), contenant du pyruvate de sodium 1 mM
et des antibiotiques (1:1000 de PEG).
On effectue le comptage des cellules par coloration au bleu de trypan dans une chambre de Newbauer. On ajoute 0,1 ml d'une suspension de -1 macrophage à 0,4 ml de DMEMs et 0,5 ml d'une solution de bleu de trypan. Dans la majorité des cas, le nombre de cellules obtenues se trouve
entre 1 et 1,2 xl 09.
On effectue des contrôles de stérilité sur les cellules de macrophage par ensemencement dans des milieux de culture appropriés pour la détection de bactéries et de champignons. L'absence de mycoplasme est vérifiée par détection cytochimique avec du DAPI (4',6-diamidino-2- phénylindole) qui se fixe sélectivement à l'ADN et forme des complexes fluorescents ADN-DAPI
hautement spécifiques.
1.2 - Réplication du virus dans des macrophaaes alvéolaires porcins. On utilise des flacons pour culture cellulaire (150 cm2), contenant 100 ml d'une solution de macrophage (3x106 cellules/ml) dans le milieu DMEMs décrit ci-dessus, excepté l'addition de sérum de veau foetal (FCS) à 5 %. On infecte les cellules
avec le virus PRRS-Olot, isolé par les Laboratoires Sobrino et appelé PRRS-
JPD-P5-6-91 (ECACC, numéro d'enregistrement V93070108). L'infection est effectuée à une multiplicité d'infections de 10-3 et les cellules infectées sont incubées à 37 C pendant 24 heures. Après cette période, on retire le milieu et on le remplace par du DMEMs frais contenant 2 % de FCS et des
antibiotiques; I'incubation est poursuivie à 37 C.
On observe les cultures périodiquement au microscope pour déterminer
I'effet cytopathogène (CPE) produit par le virus sur les macrophages.
Généralement, le CPE est de 70-80 % pour 3-4 jours d'infection. Des cellules déformées géantes apparaissent. Normalement, le titre de ces préparations est
de 106,55 TCID50/ml (dose infectieuse de culture tissulaire: 50 par millilitre).
Les macrophages infectés à une multiplicité de 10-4 produisent des
rendements viraux d'un ordre de grandeur plus petit.
La présence de virus dans ces cellules est déterminée par le test d'immunoperoxydase en monocouche sur les cellules de macrophages porcins, comme décrit dans l'exemple 1 (1.1.2). En bref, on a effectué l'opération de la façon suivante: sur des plaques de titration à 96 puits, on infecte 100 gl de macrophages avec 50 pIl de virus PRRS-Olot répliqué sur les macrophages. Les plaques sont incubées pendant 48 heures à 37 C. Une fois l'incubation terminée, on retire le milieu et on lave les plaques deux fois avec une solution saline (NaCI 0,1 M) Ensuite, on les fixe avec du formaldéhyde à % après des incubations successives à 37 C, -30 C et avec du formaldéhyde à 20 %. Après deux lavages avec une solution saline, on ajoute jll d'une dilution à 1: 50 d'un sérum anti-PRRS prélevé chez un animal provoqué. On effectue des incubations simultanées avec un sérum négatif prélevé chez un animal non-infecté. L'incubation dure 1 heure à 37 C. Après que l'on ait retiré la solution précédente, on lave deux fois avec la solution saline. Immédiatement, on ajoute 0,1.g de protéine A (Sigma) dans 50 Ri et
l'on incube à 37 C pendant 1 heure. On développe le test avec AEC (3amino-
9-éthyl-carbazole) dissous dans du diméthylformamide en présence d'un tampon acétate et d'eau oxygénée. Après 15-30 minutes à la température ambiante à l'abri de la lumière, on observe les plaques au microscope. Les cellules apparaissent colorées en rouge foncé, comparées aux cellules non
infectées qui restent incolores.
1.3 - Purification du virus PRRS. Le virus est purifié à partir des cultures cellulaires infectées au PRRSV. La culture est clarifiée par centrifugation (20 minutes, 6500 g). Le surnageant est concentré 10x en utilisant un système d'ultrafiltration Millipore-Minitan (4,5 psi, filtre ayant une taille de pore de 300 kDa). Ensuite, le virus est sédimenté par centrifugation (5 heures, 20000 g). Le surnageant est rejeté et le précipité est solubilisé avec du PBS contenant 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) (Sigma) à 4 C jusqu'au lendemain. Le virus est purifié dans un gradient de saccharose discontinu (20-50 % p/v dans PBS) par centrifugation à 95000 g pendant 3 heures. Une fois la centrifugation terminée, on extrait du gradient la bande contenant le virus, on dilue avec un tampon Tris/EDTA et enfin on centrifuge
jusqu'au lendemain à 26000 g pour la sédimentation du virus.
Le virus purifié est analysé par électrophorèse sur gel polyacrylamide-
SDS à 12 % (Laemmli, R.U., Nature, 227:680, 1970). La teneur totale en
protéine est détectée par coloration au bleu de coomassie, et immuno-
empreintes (Towbin, H., Staehelin, T., et Gordon, J., 1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354). Les empreintes sont développées avec le conjugué peroxydase-Protein A (Sigma) en utilisant un sérum anti- PRRSV covalescent. Il n'est pas possible d'observer une bande spécifique liée au PRRSV sur les gels colorés au bleu de coomassie, en raison d'une contamination avec les protéines des macrophages. Toutefois, on identifie plusieurs protéines virales
ayant une masse moléculaire comprise entre 15,5 et 30 kDa par immuno-
empreintes. Avec de plus longues périodes de développement, il est également possible d'observer des bandes ayant une masse moléculaire de 60 kDa, mais étant donné que celles-ci sont également détectées chez des macrophages non infectés, on en conclut que ce ne sont pas des protéines apparentées au
virus PRRS.
Exemple 2. - Isolement de l'ARN viral
On utilise un kit commercial Pharmacia P-L Biochemicals.
La méthode est basée sur la sélection et la purification de l'ARN viral contenant une queue poly(A) à l'extrémité 3'. La rupture du capside viral est effectuée par purification au chlorure de guanidium de l'ARN- poly(A) avec une
matrice d'oligo-cellulose (dT).
En bref, I'isolement de l'ARN viral PRRS-Olot est effectué de la manière suivante: le virus purifié est sédimenté par centrifugation jusqu'au lendemain à 40 000 g. Ensuite, le surnageant est rejeté et le précipité est solubilisé avec 0,4 ml du tampon d'extraction du kit. Après adsorption sur une matrice de cellulose-d(T), et lavages successifs avec des tampons salins respectivement de faible concentration et de concentration élevée, I'ARN-poly(A) est élué avec une concentration élevée en CINa. I'ARN est précipité par addition de i:10 volume d'acétate de potassium 2,5 M, 0,25 mg/ml de glycogène et 2 volumes d'éthanol (>2 h à -20 C). Après la fin de cette période, on récupère l'ARN par centrifugation à 16 000 g pendant 30 minutes. Après lavage du précipité avec de l'éthanol à 75 %, on le remet en suspension dans 1 1l de
tampon TE (10 mM de Tris-CIH, pH 8,0 et 1 mM d'EDTA).
On analyse l'ARN obtenu sur gélose neutre à 0,7 % par coloration au bromure d'éthidium. On observe une seule bande de substance ayant une masse moléculaire comprise entre 5000 et 23000 pb. L'absence de substances de faible masse moléculaire doit être noté et en conséquence, la possibilité d'ADN ou d'ARN cellulaire. Toutefois, la quantité de substance obtenue est faible - elle n'est pas supérieure à 100 ng d'ARN/250 ml de culture de macrophage infecté avec le virus. Ce faible rendement concorde avec le faible rendement du virus purifié, comme indiqué par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et microscopie électronique (données non
représentées).
Exemple 3. - Synthèse d'ADNc à partir de l'ARN génomique du virus PRRS-
Olot 3.1 - Préparation de l'ADNc. L'ADNc correspondant à l'extrémité 3' de I'ARN de l'isolat viral PRRS-Olot est synthétisé. La stratégie profite de la présence de la queue poly(A) afin d'utiliser l'oligo-d(T) en tant qu'amorce d'extension qui peut être prolongée à l'aide de la transcriptase réverse et permet de synthétiser des copies de molécules d'ADN. Pour cloner les régions d'ARN avant l'extrémité 3', on utilise un oligo-nucléotide avec une séquence spécifique du génome viral située à environ 2500 pb de l'extrémité 3'. La synthèse d'ADNc est effectuée à I'aide d'un kit commercial (Boehringer). Succinctement, le mode opératoire est le suivant: 0,1 gg d'ARN-poly(A) de PRRS, obtenu comme décrit dans l'exemple précédent, est incubé en présence de 1 mM de chaque dNTP (dATP, dCTP [5-10 gCi de 32P-x-dCTP], dGTP et dTTP), 25 unités d'inhibiteur d'ARNase, 0,8 9g d'oligo d(T)12, et 40 unités de transcriptase réverse dans 20 l1 de volume final. On incube le mélange réactionnel à 42 C pendant
1 heure et ensuite, on démarre la synthèse du second brin dans le même tube.
A cet effet, on ajoute du tampon, de l'ARNase et 25 unités d'ADN polymérase d'E. coli. L'incubation est réalisée pendant 1 heure à 22 C et pendant minutes à 65 C. Enfin, afin de générer des extrémités franches, on ajoute 4 unités d'ADN T4 polymérase. Après 10 minutes à 37 C, on arrête la réaction par addition d'EDTA et de sarkosyle. On effectue une seconde synthèse d'ADNc dans les mêmes conditions, sauf que l'on utilise l'oligo-nucléotide 'CGGGCTCGAGCCTTTGGCGA3' à la place de l'oligo d(T)12. Dans les deux cas, on extrait le mélange avec du phénol: chloroforme et on précipite la
substance avec de l'éthanol comme décrit dans l'exemple précédent.
La synthèse d'ADNc est quantifiée en déterminant la radioactivité incorporée dans la substance synthétisée et électrophorèse sur gélose alcaline
et neutre.
3.2 - Clonage et séquençaae. Tout d'abord, on sélectionne par tailles l'ADNc synthétisé pour éviter le clonage de segments excessivement petits. A cet effet, on récupère la substance de la synthèse d'ADNc par centrifugation (30 minutes, 16000 g). On sèche le précipité sous vide, on dissout avec du tampon Tris/EDTA (TE) pH = 8,0 et on charge sur une gélose à 1 %. Les fragments d'ADNc compris entre 1000 et 5000 pb sont récupérés à partir du gel avec du papier DEAE-cellulose et à partir de ce dernier, par élution avec CINa et précipitation subséquente. L'ADNc purifié est cloné en extrémités franches dans le vecteur pMTL25, un vecteur dérivé de pUC18. A cet effet, le vecteur est linéarisé avec Smai et traité avec la phosphatase alcaline pour réduire le bruit de fond dû au vecteur. Après ligature avec l'ADN T4 ligase, les cellules compétentes de E. coli XL-1 Blue sont transformées à l'aide du mélange de
ligature, en présence de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl P-D-
galactopyranoside) (Boehringer) et IPTG (Isopropyl-,-D-thiogalactopyranoside) 1 0 (Gold Bioch.), ce qui permet la sélection initiale de colonies recombinantes en
comparaison avec celles à insérer).
L'analyse des clones PRRS positifs est effectuée au moyen de
préparations d'ADN plasmidique (Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513-
1523, 1979), et cartographie des sites de restriction basée sur la séquence LV.
i 5 Parmi les 300 plasmides analysés, 9 seulement sont positifs et contiennent des inserts compris entre 800 et 2600 pb. La vérification définitive de l'authenticité de ces clones d'ADNc est effectuée par leur séquençage direct, en utilisant la méthode didésoxy de terminaison de chaîne appliquée à l'ADN double brin (Sanger, F., et al., J. Mol. Biol., 94:441-448, 1975). On utilise les oligonucléotides (5'GTAAAACGACGGCCAGT3') et les oligonucléotides réverses (5'AACAGCTATGACCATG3') universels pour séquencer tous les clones. La majorité des clones PRRS obtenus contient une queue poly(A) commune et des extrémités 5' différentes. Les clones sont appelés pPRRS-8, pPRRS- 108, pPRRS-121, pPRRS-132, pPRRS-146, pPRRS-147, pPRRS-148 et
2 5 pPRRS-153. A partir de la seconde synthèse d'ADN, on obtient le clone PRRS-3.
La figure 3 représente l'extension différente de ces clones, comparée à LV, ainsi qu'aux ORF contenus dans chacun d'entre eux. D'autre part, la figure 1 représente la séquence consécutive des 3383 pb clonées à partir de l'isolat PRRS-Olot, et la figure 2 (2A-2F) représente les séquences d'acides aminés
3 0 correspondant aux protéines codées par chaque ORF.
Exemple 4. - Obtention de baculovirus recombinants exprimant le gène protéique codé par ORF2 4.1 - Préparation du gène d'ORF2 Les gènes pMTL25, pMTL24 et pMTL22, dérivés du vecteur pUC18, sont utilisés pour la préparation des différents ORF mentionnés dans la présente
description, avant d'être clonés dans les vecteurs de transfert de baculovirus. Le
vecteur utilisé est indiqué pour chaque cas particulier. Le gène d'ORF2 présente une taille de 747 pb, et il est obtenu à partir du clone d'ADNc PRRS-3 (figure 4). L'ADN est digéré avec Mael, et l'insert d'environ 900 pb est purifié 1 0 sur gélose. Les extrémités cohésives de l'insert sont transformées en extrémités franches par traitement avec le fragment de Klenow de 1' ADN polymérase d'E. coli.. Le clonage est effectué dans le pMTL25 traité avec Smal, la phosphatase alcaline et purifié sur gélose à bas point de fusion à 1 %. Après ligature avec l'ADN T4 ligase (Boehringer), les cellules de E. coli XL-1Blue 1 5 sont transformées à l'aide du mélange de ligature, et les clones positifs sont sélectionnés initialement par la couleur. Les plasmides recombinants contenant le gène d'ORF2 inséré sont purifiés selon la méthode de lyse alcaline (Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523, 1979), et caractérisés par cartographie
avec les endonucléases de restriction et séquençage des régions d'insertion.
2 0 Le vecteur nouvellement obtenu est appelé pPRRS-ORF2. Dans ce vecteur, le codon d'initiation d'ORF2 (ATG) se situe à environ 50 pb à partir du
début de l'insert et du site BamHI.
4.2 - Insertion du gène d'ORF2 dans un vecteur de transfert de baculovirus Le vecteur de transfert de baculovirus utilisé dans tous les essais, décrit dans cette revendication de brevet, est le vecteur pAcYM1 (Matsuura et al.,
J. Gen. Virol. 68, 1233-50), qui présente un site d'insertion BamHI unique.
Le vecteur a été donné par le Professeur D.H.L. Bishop (I.V.E.M., Oxford, Royaume Uni). Pour l'insertion, le vecteur est digéré complètement avec l'endonucléase BamHI. et ensuite, traité avec l'enzyme phosphatase alcaline
3 0 afin d'éviter la religature du vecteur. ORF2 code pour une protéine de 28,4 KDa.
En bref, I'insertion du gène correspondant dans la vecteur pAcYM1 utilise le plasmide pPRRS-ORF2 comme matériau de départ. Dans ce plasmide, le gène d'ORF2 est adjacent à deux sites BamHI.. Ainsi, pPRRS- ORF2 est digéré par BamHI. et chargé dans une gélose à bas point de fusion à 1 %, afin d'obtenir le fragment de 935 pb. Ce fragment est inséré au niveau du site BamHI de pAcYM1 selon la méthode de Struhl (Biotechniques 6, 452-453, 1985), en utilisant l'ADN T4 ligase (Boehringer) pour ligaturer l'insert au vecteur. Le mélange de ligature est utilisé pour transformer les cellules de E. coli DH5. Les plasmides recombinants obtenus contenant le gène d'ORF2 inséré sont purifiés selon la méthode de lyse alcaline (Birnboim & Doly, cité plus haut), caractérisés 1 0 par cartographie avec des endonucléases de restriction et séquences pour
insérer des bords afin de corroborer la séquence correcte des régions insérées.
Le vecteur de transfert nouvellement obtenu est appelé pPRRS-Bac8 et on a pu montrer qu'il présente le gène PRRS dans l'orientation correcte pour son
expression par le promoteur polyhédrine du baculovirus AcNPV.
1 5 4.3 - Transfection et sélection de baculovirus Des cellules de Spodoptera frugiperda, clone Sf 9, sont co-transfectées aec un mélange d'ADN infectieux purifié du virus parental AcRP23-lacZ (500 ng), fourni par le Dr. Posee (I.V.E.M., Oxford, Royaume Uni) et du vecteur de transfert pPRRS-Bac8 ADN (2 gg). L'ADN viral parental est linéarisé avec
I'enzyme Bsu361 dans le gène lacZ (Kitts et al., Nuc. Acids Res. 18, 5667-
72.1990) afin d'augmenter l'efficacité de la recombinaison. Pour la cotransfection, on utilise la méthode à la lipofectine (Gibco-BRL) (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, (1987)). Après la co-transfection, on incube les cellules pendant 5 jours dans le milieu complet TNMFH supplémenté avec 5 % de sérum de veau foetal (FCS) et des antibiotiques, jusqu'à ce que
l'on observe un effet cytopathe.
Ensuite, on récupère le surnageant de transfection et on identifie les virus recombinants par essai sur plaque. Le virus parental AcRP23 lacZ présente des plaques de lyse bleues en présence de substrat X-gal, car le gène de la 3 0 f3-galactosidase est exprimé. Les virus recombinants sont initialement identifiés
par des plaques transparentes après coloration de la progénie virale avec X-gal.
On prélève un certain nombre de plaques de chaque virus et on les soumet à
trois purifications successives, avant de préparer un stock de virus de titre élevé.
Le baculovirus recombinant finalement obtenu est appelé AcNPV, PRRS 2. Il est déposé à la Collection Européenne de Culture de Cellules Animales (ECACC)
sous le numéro d'enregistrement V94021007.
Exemple 5. - Obtention de baculovirus recombinants exprimant le gène protéique codé par ORF3 5.1 - Insertion du gène d'ORF3 dans un vecteur de transfert de baculovirus ORF3 code pour une protéine ayant une masse moléculaire estimée à ,8 KDa. L'ADN plasmidique pPRRS-121 est utilisé comme substance de départ pour l'insertion du gène correspondant dans le vecteur de transfert 1 0 pAcYM1 (figure 5). Dans ce vecteur, le codon d'initiation d'ORF3 est situé à pb du site BamHI. Le gène peut être excisé par double digestion avec les enzymes BamHI et Sau3A, ce qui produit des extrémités cohésives compatibles avec BamHI. Après la digestion, on charge le mélange sur une gélose à bas point de fusion à 1 %, et on purifie un fragment de 1009 pb. Ensuite, on l'isole i 5 puis on le ligature au vecteur pAcYM1 traité avec BamHI et la phosphatase alcaline, en utilisant l'enzyme ADN T4 ligase. Ensuite, on transforme des cellules de E. coli DH5 et on purifie les plasmides recombinants et on les caractérise selon les modes opératoires décrits plus haut. Une fois que l'on a vérifié la séquence correcte et l'orientation de l'insert vers le promoteur
polyhédrine, on appele le nouveau vecteur de transfert pPRRS-Bac-2.
* 5.2 - Transfection et sélection de baculovirus recombinants Le mode opératoire utilisé pour la transfection et la sélection de baculovirus recombinants est similaire à celui décrit ci-dessus pour ORF2
(Exemple 4.3). Le baculovirus recombinant obtenu est appelé AcNPV, PRRS 3.
Il est déposé à I'ECACC sous le numéro d'enregistrement V94011325.
Exemple 6. - Obtention de baculovirus recombinants exprimant la protéine codée par le gène ORF4 6.1 - Préparation du gène ORF4 La taille du gène ORF4 est de 549 pb. Il est obtenu à partir du clone pPRRS-146 (figure 6) digéré avec les enzymes BamHI, Af1111et Pstl. Les deux premières enzymes sont adjacentes à l'insert et Pstl est utilisée pour couper un fragment d'ADN vectoriel, de taille similaire à celle du gène ORF4 qui pourrait rendre l'isolement du gène difficile. Un fragment de 1112 pb est purifié sur gélose à bas point de fusion et cloné dans le vecteur pMTL22 digéré avec BamHI et Ncol (compatible avec Af1i1). Après ligature avec l'ADN T4 ligase et transformation des cellules de E. coli DH5, les plasmides recombinants sont purifiés par la méthode de lyse alcaline (Birboim & Doly, cité plus haut), et caractérisés par cartographie avec endonucléases de restriction. Le nouveau vecteur obtenu est appelé pPRRS-ORF4. Il contient le codon d'initiation ATG
1 0 d'ORF4 situé à 5 pb du site BamHI.
6.2 - Insertion du gène ORF4 dans un vecteur de transfert de baculovirus ORF4 code pour une protéine de 20,0 KDa. Le gène correspondant est obtenu à partir du plasmide pPRRS-ORF4 par digestion avec BamHI et BgIIL. Le fragment de 1112 pb est purifié dans une gélose à bas point de fusion à 1 % et 1 5 cloné directement dans pAcYMI-BamHI. Les modes opératoires utilisés pour l'identification et la caractérisation des clones recombinants sont identiques à ceux décrits ci-dessus (Exemple 4. 2). Une fois que l'orientation correcte et la séquence d'insertion ont étévérifiées, le nouveau plasmide a été nommé pPRRS-Bac9. Ce plasmide est utilisé pour des essais de transfection ultérieurs
et pour la préparation de baculovirus recombinants.
6.3 - Transfection et sélection de baculovirus recombinants Le mode opératoire suivi pour la transfection et la sélection de baculovirus recombinants est similaire à celui décrit ci-dessus pour ORF2 (Exemple 4. 3). Le baculovirus recombinant est appelé AcNPV, PRRS4. Il est déposé à l'ECACC
sous le numéro d'enregistrement V94021008.
Exemple 7. - Obtention de baculovirus recombinants exprimant la protéine codée par le gène ORF5 7.1 - Préparation du gène ORF5 La taille du gène ORF5 est de 600 pb. Il est obtenu à partir du clone 3 0 pPRRS-132 (figure 7). L'ADN est digéré avec les enzymes BstXI et Bfrl, et un fragment de 700 pb contenant ORF5 est purifié sur gélose à bas point de fusion à 1%. Après transformation des extrémités du fragment de cohésives en franches, par traitement avec l'ADN T4 polymérase, on clone le fragment dans le vecteur pMTL25/Smal. Le mode opératoire utilisé est similaire à celui utilisé dans l'exemple 4.1. Le nouveau vecteur obtenu est appelé pPRRS-ORF5. Il contient le codon d'initiation ATG de l'ORF5, situé à 15 pb du début du gène. 7.2 - Insertion du gène ORF5 dans un vecteur de transfert de baculovirus ORF5 code pour une protéine de 22,4 KDa. Pour insérer le gène correspondant dans le vecteur de transfert, le vecteur pPRRS-ORF5 est digéré avec l'enzyme BamHI. Le fragment de 706 pb est purifié sur gélose à bas point
1 0 de fusion à 1 % et ligaturé directement au vecteur de transfert pAcYmI-BamHI.
Les plasmides recombinants sont caractérisés comme décrit ci-dessus. Le nouveau vecteur de transfert est nommé pPRRS-Bac3. Il est utilisé pour des
essais de transfection ultérieurs.
7.3 - Transfection et sélection de baculovirus recombinants 1 5 Le mode opératoire suivi pour la transfection et la sélection de baculovirus recombinants est similaire à celui décrit ci-dessus pour ORF2 (Exemple 4.3). Le baculovirus recombinant est appelé AcNPV, PRRS5 et il est déposé à l'ECACC
sous le numéro d'enregistrement V94011326.
Exemple 8. - Obtention de baculovirus recombinants exprimant la protéine codée par le gène ORF6 8.1 - Préparation du gène ORF6 La taille du gène ORF6 est de 519 pb. Il est obtenu à partir du clone génique pPRRS-8 (figure 8). D'abord, I'ADN est digéré avec l'enzyme Afill, qui
permet l'élimination de bandes ayant une taille proche de celle du gène ORF6.
Un fragment d'Aflli-Afilil de 990 pb est purifié sur gélose à bas point de fusion à 1 % et digéré avce Taql. Le nouveau fragment de 790 pb est purifié sur gélose à bas point de fusion et cloné dans le vecteur pMTL24 traité avec Accl et la phosphatase alcaline. On effectue ensuite les étapes décrites dans l'Exemple 4.1. Le nouveau vecteur est appelé pPRRSORF6. Il contient le codon
3 0 d'initiation d'ORF situé à 46 pb du début du gène.
8.2 - Insertion du gène ORF6 dans un vecteur de transfert de baculovirus ORF6 code pour une protéine de 19,0 KDa. Cette dernière est supposée être une protéine de l'enveloppe, et en raison de sa nature hydrophobe, elle est considérée comme étant une protéine franchissant la membrane. Pour l'insertion du gène correspondant dans le vecteur de transfert, le vecteur pPRRS-ORF6, contenant le gène ORF6 cloné au niveau du site pMTL24 Accl, est digéré par l'enzyme BamHI. Le fragment de 790 pb est purifié sur gélose à 1 % et ligaturé directement au vecteur pAcYM1-BamHI. Le nouveau vecteur de transfert est
appelé pPRRS-Bac5. Il est utilisé pour des essais de transfection ultérieurs.
1 0 8.3 - Transfection et sélection de baculovirus recombinants Le mode opératoire suivi pour la transfection et la sélection de baculovirus recombinants est similaire à celui décrit ci-dessus pour ORF2 (Exemple 4. 3). Le baculovirus recombinant est appelé AcNPV, PRRS6. Il est déposé à l'ECACC
sous le numéro d'enregistrement V94011327.
1 5 Exemple 9. - Obtention de baculovirus recombinants exprimant la protéine codée par le gène ORF7 9.1 - Préparation du gène ORF7 La taille du gène ORF7 est de 384 pb. Il est obtenu à partir du clone génique pPRRS-8 (figure 8). Le fragment Afili-AfiliI décrit dans l'exemple 8.1 est digéré avec l'enzyme Hpal. Le fragment AflI-Hpal. de 430 pb contenant le gène ORF7 est purifié sur gélose à bas point de fusion et ensuite cloné dans le vecteur pPMTL25 digéré par NcoI-Smal.. L'analyse et la caractérisation des colonies recombinantes sont effectuées comme décrit dans l'Exemple 4.1. Le nouveau vecteur est appelé pPRRS-ORF7. Il contient le codon d'initiation
2 5 d'ORF7 situé à 16 pb du début du gène.
9.2 - Insertion du gène ORF7 dans un vecteur de transfert de baculovirus ORF7 code pour une protéine de 13,8 KDa. Cette dernière est supposée être la nucléoprotéine virale. Pour l'insertion du gène correspondant dans le vecteur de transfert, le plasmide pPRRS-ORF7 est digéré par les enzymes BgIll 3 0 et BamHi. Le fragment de 430 pb est isolé sur gélose à bas point de fusion et ligaturé directement au vecteur pAcYM1-BamHI. Après les caractérisations appropriées, le nouveau vecteur de transfert pPRRS-Bac7 est obtenu. Il est
utilisé pour des essais de transfection ultérieurs.
9.3 - Transfection et sélection de baculovirus recombinants Le mode opératoire suivi pour la transfection et la sélection de baculovirus recombinants est similaire à celui décrit ci-dessus pour ORF2 (Exemple 4.3). Le baculovirus recombinant obtenu est appelé AcNPV, PRRS7. Il est déposé à
l'ECACC sous le numéro d'enregistrement V94011328.
Exemple 10. - Analyse de protéines recombinantes et immunodétection 1 0 On infecte des cellules Sf9 avec différents baculovirus recombinants à une multiplicité d'infections de 1 PFU/cellule et on incube à 27 C jusqu'à ce qu'on recueille les cultures. Différentes cultures de cellules sont effectuées en
monocouche et en suspension. Dans tous les cas, les résultats sont similaires.
Les cultures sont recueillies après différents laps de temps postinfection. La 1 5 période de recueil optimale est déterminée pour chaque virus recombinant. Elle se situe entre 48 et 96 h.i.p. (heures post-infection). Les cellules sont recueillies par centrifugation à 1500t/min, lavées deux fois avec PBS pH 7,4, et ensuite, remises en suspension et lysées avec une solution de bicarbonate de sodium mM. Elles sont centrifugées à 10 000 t/min pendant 10 minutes et la fraction cytoplasmique soluble est séparée des débris cellulaires insolubles restants. L'extrait cellulaire total ainsi que les différentes fractions sont analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 11% et colorés avec du bleu de coomassie ou transférés sur des membranes en nitrocellulose pour la détection immunologique. Par coloration au bleu de coomassie, on observe des bandes correspondant à des masses moléculaires de 28,4, 30,8, 20,0, 22,4, 19,0 et 13,8 KDa. Ces tailles correspondent respectivement aux tailles prévues pour les protéines codées par les ORF 2, 3, 4, 5, 6 et 7. Il existe une variation importante des niveaux d'expression des différents gènes: les ORF 3, 5 et 7 à des niveaux considérables, les ORF 2 et 4 à des iveaux appréciables et l'ORF6 à un faible 3 0 niveau. Les niveaux d'expression inférieurs des gènes, correspondant aux ORF 2 et 6, peuvent être dus aux distances plus élevées, 42 et 39 nucléotides respectivement, entre le codon d'initiation ATG de la protéine et le promoteur de baculovirus polyhédrine. A plusieurs occasions, on a démontré que cette distance doit être essentiellement maintenue à un niveau minimum afin d'obtenir une bonne expression. Un autre facteur, responsable du faible niveau
d'expression, pourrait être la nature fortement hydrophobe de ces protéines.
Lorsqu'on analyse séparément les fractions soluble et insoluble des cellules infectées, on observe que, sauf pour ORF7, la plupart des protéines PRRS exprimées sont insolubles et restent associées aux débris de la membrane. Ce phénomère peut être dû à la nature hydrophobe et glycosylée de ces protéines. La majorité de ces glycoprotéines contient des régions transmembranaires qui les fixent aux membranes. Des caractéristiques de ce 1 0 type rendent la purification par élimination des extraits cellulaires de ces
protéines difficile.
Pour l'immunodétection, les protéines sont transférées sur des membranes en nitrocellulose, suivant des procédés usuels (Burnette, Anal. Biochem. 112, 195-203, 1981; Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354, 1979). Le transfert de protéine est effectuée dans un dispositif semi-sec (Bio-Rad) à 22V pendant 30 minutes. Ensuite, les bandes de nitrocellulose sont bloquées avec du lait écrémé en poudre à 3 % dans Tris-HCI mM, pH 7,5, NaCI 500 mM (TBS) pendant 1 heure à la température ambiante. Ensuite, on incube les bandes d'abord pendant deux heures à la température ambiante avec un sérum porcin anti-PRRS (C-45) dilué à 1/100 dans du TBS-0,05 % Tween 20 pendant 30 minutes à la température ambiante, et ensuite, on les incube avec de l'lgG anti-porc conjuguée à la phosphatase alcaline (dilution 1/1000) (Sigma) pendant 1 heure. Les bandes sont lavées encore une fois, enfin elles sont développées avec un NBT
(nitrobleu de tétrazolium) (Sigma) et une solution de BCIP (5-bromo-4chloro-3-
indolyl-phosphate) (Sigma) dans du NaCI 100 mM, MgCI2 5 mM, de la diéthanolamine 100 mM, pH 9,5, jusqu'à l'apparition de bandes visibles. On arrête la réaction avec de l'eau distillée. Dans tous les cas o l'on constate des réactions spécifiques par immunoempreinte, on obtient des protéines dont la 3 0 masse moléculaire est équivalente à la taille estimée des ORF. Dans certains cas, en particulier pour les ORF 3 et 5, on observe la présence d'autres bandes de grande taille, jusqu'à 45 KDa. Ces bandes pourraient représenter différentes
formes de glycosylation de protéines, en accord avec les sites potentiels prévus.
10.1 Caractérisation antigénique des protéines recombinantes Le pouvoir antigénique correct des protéines recombinantes exprimées dans un baculovirus est vérifiée par leur réaction vis-à-vis de différents sérums
d'origine animale dans un dosage immunologique.
On fait réagir les protéines recombinantes, exprimées et transférées sur la nitrocellulose suivant le procédé décrit ci-dessus, avec l'ensembles des sérums porcins caractérisés précédemment, contenant des anticorps anti-PRRSV. Les sérums ont été prélevés chez des animaux infectés par voie expérimentale
(É1-4) ou naturelle (É5-8).
1 0 Les protéines correspondant aux ORF 3, 5 et 7 sont vérifiées en premier.
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 2.
Tableau 2
Réactivité de sérums d'animaux infectés vis-à-vis des Drotéines recombinantes ORF3. ORF5 et ORF7 Sérum n ORF3 ORF5 ORF7
1 + +
2 + +
3 + + +
4 ND + +
ND + +
6 + + +
7 ND +
8 ND + +
+ positif -: négatif ND: non déterminé 3 2 Ce test démontre que les protéines recombinantes 3, 5 et 7 sont similaires, quant à leur pouvoir antigénique, aux protéines virales naturelles
respectives 3, 5 et 7.
Lorsque le test est réalisé avec les protéines recombinantes 2, 4 et 6, les résultats sont beaucoup plus variables du point de vue de la reconnaissance par les sérums du terrain. Les raisons de cette variabilité pourraient être leur faible
niveau d'expression et/ou leur hydrophobie élevée.
Ces tests démontrent que les protéines recombinantes de PRRSV, exprimées dans un système de baculovirus, ne peuvent être distinguées du
1 0 point de leur pouvoir antigénique des protéines virales naturelles.
Exemple 11. Purification des protéines recombinantes La stratégie prévue pour la purification des protéines recombinantes doit tenir compte des caractéristiques de structure des protéines. Il faut mentionner en particulier deux de ces caractéristiques: 1 5 (1) la nature hydrophobe qui les rend insolubles, et (2) la présence d'un grand nombre de régions transmembranaires qui leur confère une grande affinité pour les membranes. Dans la plupart des cas, ces caractéristiques rendent peu commode l'extraction et la purification des protéines, par exemple pour leur utilisation comme vaccins, lorsque des cellules infectées complètes peuvent être
utilisées, comme décrit par différents auteurs (Hall S.L. et ai., Vaccine, 9, 659-
667, sept. (1991); Tordo N., et ai., Virology, 194, 5269 (1993)). Malgré cela, quelques tentatives ont été faites pour purifier ces protéines en utilisant la
protéine ORF3 comme modèle.
11.1 - Purification de la protéine dérivée de ORF3 2 5 Des cellules Sf9 sont infectées avec le virus recombinant AcNPV, PRRS3, suivant le procédé décrit dans l'exemple précédent. Les cellules infectées sont recueillies par centrifugation à 400 g pendant 10 minutes, lavées avec du PBS et remises en suspension à raison de 20x106 cellules/ml dans du PBS. Les cellules sont rompues par congélation/décongélation et la fraction soluble est 3 0 séparée de la fraction insoluble par centrifugation. Dans tous les cas, la fraction
insoluble est utilisée pour les traitements subséquents.
Ce qui suit est une description des certains des procédés utilisés:
Traitement avec des agents chaotropes La fraction insoluble est d'abord lavée avec NaCI 1 M et ensuite, avec du chlorure de guanidinium 2M ou 4M. Les culots cellulaires sont remis en suspension dans différents tampons et maintenus à la température ambiante pendant 1 heure. Ensuite, la préparation est centrifugée à 15 000 t/min pendant 5 minutes. La présence de la protéine recombinante dans les différentes fractions est déterminée par électrophorèse sur des gels à 15 % de
polyacrylamide-SDS (dodécylsulfate de sodium).
1 0 Les résultats obtenus indiquent que le traitement séquentiel avec ces sels produit une protéine d'une pureté de 30 % à 50 %. Cette protéine purifiée se révèle présenter un pouvoir antigénique analogue à celui de la protéine naturelle, comme l'indiquent les sérums d'animaux infectés, la détermination
étant réalisée soit par immunoempreinte soit par ELISA indirecte.
1 5 Traitement avec des détergents On utilise des détergents aux concentrations suivantes
NP40 0,5 %
Octylglucoside 2 % SDS 0,5%, 1% et 2% Désoxycholate de sodium 0, 5 %, 1 % et 2 %
Dans tous les cas, les préparations cellulaires sont obtenues comme ci-
dessus. Les débris cellulaires contenant la protéine recombinante sont traités avec les concentrations de détergents indiquées ci-dessus et dans les conditions décrites. D'une manière générale, on peut affirmer que dans ces conditions, le traitement avec différents détergents ne permet pas la solubilisation d'une quantité significative de protéine recombinante. Seulement 0,5 % de SDS fournit une protéine ayant une puretée estimée à 50 %, et avec un très faible rendement. Au point de vue du pouvoir antigénique, cette protéine réagit par Et.SA indirect aux sérums des animaux infectés, bien que l'efficacité 3 0 soit plus faible que celle obtenue avec la protéine purifiée avec des agents chaotropes. En résumé, ces protéines partiellement purifiées peuvent être utilisées
dans des vaccins anti-PRRSV.
Exemple 12. Utilisation dans le diagnostic Une des principales applications des protéines recombinantes fournies par la présente invention est leur utilisation dans la préparation de kits pour
diagnostiquer les infections au PRRSV sur le terrain.
12.1 - Préparation d'antigène exprimée dans Sf9 pour l'application dans le diagnostic Des cellules Sf9 cultivées en monocouche ou en suspension sont 1 0 infectées à une multiplicité d'infections de 0,5 à 1 avec les baculovirus recombinants respectifs. En fonction du virus recombinant utilisé, les cultures sont recueillies après un laps de temps postinfection de 48 à 72 heures. Elles
sont centrifugées à 400 g à 15 C pendant 10 minutes et lavées avec du PBS.
Finalement, les culots cellulaires contenant les protéines recombinantes 1 5 sont remis en suspension dans du PBS avec 2 % d'octylglucoside (Sigma) et laissés au repos sur de la glace pendant 1 heure. Ensuite, ils sont centrifugés à 1000 g pendant 10 minutes pour éliminer les débris cellulaires. Les surnageants sont soumis à une dialyse approfondie contre du PBS pour éliminer le détergent, centrifugés à 10 000 g pendant 30 minutes pour éliminer les
précipités et conservés à -70 C jusqu'à l'utilisation ultérieure.
12.2 - ELISA pour le diagnostic Des plaques de dosage immunologique ELISA à 96 puits en polystyrène (Polisorp, NUNC) sont revêtues avec différentes dilutions de mélanges d'extraits recombinants (ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7), préparées dans un tampon carbonate 50 mM, pH 9,6 (100 jal/puits) par incubation jusqu'au lendemain à 4 C. Comme représenté à la figure 9, la dilution optimale choisie pour le revêtement des plaques est de 1/100. On sature les plaques avec du tampon de blocage (lait écrémé à 1 % dans du PBS) pendant 30 minutes à la température ambiante. Ensuite, on ajoute différentes dilutions des antisérums 3 0 anti-PRRSV préparées dans du tampon de blocage. On continue l'incubation pendant 1 heure à 37 C. Après lavage avec du PBS contenant 0,05 % de Tween 20, on ajoute de la protéine A marquée à la peroxydase (dilution à 1/5000) et on incube à 37 C pendant 1 heure. On effectue un lavage comme précédemment et on développe la réaction à la température ambiante pendant
minutes en utilisant de l'ABTS [acide 2,2'-azino-bis(3éthylbenzothiazoline-
6-sulfonique)] comme substrat. On arrête la réaction avec du SDS à 1 % et on
suit l'absorbance à 405 nm.
Les résultats du dosage ELISA usuel d'un sérum de terrain provenant d'un animal infecté sont représentés à la figure 10. Les dosages des sérums de terrain sont généralement effectués à des dilutions de 1/100 à 1/800. Les 1 0 résultats obtenus dans un essai d'échantillonnage avec plusieurs douzaines de sérums de terrain sont représentés à la figure 11. On peut voir que les titres obtenus pour des sérums clairement positifs vont de 0,4 à 1,7. Les titres d'une gamme incertaine vont de 0,2 à 0,3. Les sérums négatifs donnent des titres inférieurs à 0,1. La conclusion est donc la suivante: I'utilisation de ces protéines 1 5 recombinantes exprimées dans un baculovirus est un procédé sûr, fiable et reproductible, qui permet de différencier de façon décisive les animaux infectés
des animaux non infectés.
Exemple 13. Formulations de vaccins recombinants On prépare divers vaccins contenant différentes protéines PRRSV, en particulier PRRS- Olot (ECACC V93070108) sous forme d'émulsion, selon le
procédé décrit ci-après.
Des cellules du clone Sf9 de Spodoptera frugiperda - ci-après Sf9 - sont infectées à raison de 1x106cellules/ml avec les baculovirus recombinants suivants: AcNPV, PRRS3, [ECACC V94011325] AcNPV, PRRS5, [ECACC V94011326] AcNPV, PRRS7, [ECACC V94011328] capables de produire respectivement les protéines recombinantes correspondant à ORF3, ORF5 et ORF7 des PRRSV mentionnés (figures 2, 4 et 6), à une multiplicité d'infections de 0,1 unité formant plaque (PFU)/cellule. Les cellules sont incubées à 27 C, sous agitation à 100 t/min et 30 % de PO2, pendant 72 heures, dans un fermenteur Braun-MD de 2 litres. Ensuite, on recueille les cellules d'insecte infectées, par centrifugation à 1000 t/min pendant minutes, on les lave avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et on les remet en suspension à raison de 5x107 cellules/ml dans le même tampon PBS. La formulation des vaccins est effectuée en mélangeant un homogénat de cellules Sf9 infectées, contenant 5x106 cellules Sf9 exprimant chacune des protéines recombinantes ORF3, ORF5 et ORF7, avec un adjuvant huileux, ou une phase huileuse, composée d'un mélange de: 1 0 Marcol 52...........
............................. 790,0 mg Simulsol 5100..................... DTD: ............... 70,0 mg Montanide 888.................................... DTD: 80,0 mg Dans ces conditions, on prépare quatre vaccins recombinants, en doses de 2 ml, composés de 53 % de phase antigénique et de 47 % de la phase 1 5 huileuse décrite ci-dessus, dans laquelle le rapport phase huileuse/phase antigénique est un rapport en poids/volume (P/V). Les vaccins préparés ont les compositions suivantes: 1. Vaccin identifié sous le nom de rPRRS C 53 % en volume de phase antigénique constituée de 50x106 cellules Sf9 exprimant ORF3; et..DTD: 47 % en poids d'une phase huileuse telle que décrite ci-dessus.
2. Vaccin identifié sous le nom de rPRRS D: 53 % en volume de phase antigénique constituée de x106 cellules Sf9 exprimant ORF5; et
47 % en poids d'une phase huileuse telle que décrite ci-dessus.
3. Vaccin identifié sous le nom de rPRRS E: 53 % en volume de phase antigénique constituée de x106 cellules Sf9 exprimant ORF7; et
47 % en poids d'une phase huileuse telle que décrite ci-dessus.
3 0 4. Vaccin identifié sous le nom de rPRRS F: 53 % en volume de phase antigénique constituée de x106 cellules Sf9 exprimant ORF3; 50x106 cellules Sf9 exprimant ORF5 et 50x106 cellules Sf9 exprimant ORF7 (au total, x106 cellules Sf9); et 47 % en poids d'une phase huileuse telle que décrite ci-dessus. Exemple 14. Efficacité chez des truies pleines Cet essai est conduit afin d'évaluer l'efficacité des vaccins recombinants préparés comme décrit dans l'exemple 13. A cet effet, on utilise au total 1 0 12 truies - un croisement Landrace X- Large White. Les animaux sont transférés
dans les porcheries, offrant toute sécurité, du centre de recherche.
On choisit deux truies au hasard (les truies n 400398 et 400298) et on les vaccine avec le vaccin identifié par rPRRS C. Deux truies (n 400118 et 400307) sont vaccinées avec le vaccin identifié sous le nom de rPRRS D. Avec 1 5 le vaccin rPRRS E, on vaccine trois truies (les truies n 314010, 313426 et 400059) et avec le vaccin rPRRS F, on vaccine trois truies (les truies n 313524, 401236 et 401426). Les deux truies restantes (les truies n 1 et 20)
ne sont pas vaccinées et sont utilisées comme animaux témoins.
Les truies sont vaccinées par voie intramusculaire profonde (IM) dans le 2 0 cou, près de l'oreille, avec une dose de 2 ml de vaccin, et revaccinées 21 jours
plus tard, avec la même dose.
On observe les réactions locales et générales, telles que: température
rectale, alimentation et signes cliniques, après vaccination et après provocation.
De plus, on suit chez les truies les résultats de reproduction après la provocation, ainsi que les résultats sérologiques à la fois chez les truies et les porcelets. L'analyse des résultats est utilisée pour l'évaluation de l'efficacité du
vaccin (Tableau 1).
La provocation est réalisée dans les porcheries sûres du centre de
recherche. Tous les animaux sont infectés à raison de 5 ml de PRRSV-218P6-
MO-F22055-29/10/94, une souche isolée et maintenue au dépôt du centre de recherche, avec un titre de 106,1TCID50/ml (dose infectieuse de culture tissulaire
%) par voie intranasale (IN).
Pour l'évaluation des résultats de reproduction des truies, on note, le jour o elles mettent bas, les données suivantes (Tableau 3): nombre de porcelets nés vivants et en bonne santé nombre de porcelets nés vivants mais faibles nombre de porcelets mort-nés nombre de porcelets avec autolyse partielle (oedémateux) nombre de porcelets momifiés 1 0 porcelets vivants après la 1 ère semaine de leur vie, et
porcelets vivants au moment du sevrage (25-30 jours d'âge).
Tableau 3
Résultats de reproduction n de la Vaccin Nombre de porcelets truie Total Nés Nés Mort- Auto- Momi- Vivants Sevrés vivants vivants nés lyse fiés après la e n faibles partielle 1 ère
bonne se-
santé maine
1 témoin 1 7 - 4 9 4 - -
témoin 1 4 9 - 2 3 - 7 4 400398 rPRS C 8 8 - - - - 7 6 400298 rPRRS C 1 1 0 1 - - - 8 7
400118 PRRS C 1 2 6 1 2 3 - 5 4
400307 rPRRS C 1 0 9 - 1 - - 9 7 314010 rPFRRS C 1 2 - 1 0 1 1 - 3 2 313426 rPS C 6 3 - - 1 2 3 3 400059 rPRRS C 1 2 6 2 2 2 - 1 0
313524 PRRS C 11 10 - 1 - - 10 8
401236 rPRRS C 2 - - - - - 2 2
401426 RPRRS C 1 5 1 2 3 - - - 1 0 1 0
1 5 Ensuite, on analyse la réponse sérologique chez les truies (Tableau 4) et les porcelets (Tableaux 5, 6, 7, 8 et 9) à l'aide d'un test en monocouche à la
peroxydase (IPMA) [Immuno Peroxidase Monolayer Assay, Wensvoort et al., Vet.
Quarterly, vol. 13, n 3 (juillet 1991)], conformément au protocole suivant: D O (jour O) prise de sang et vaccination D-14 prise de sang (le 14ème jour post-vaccination) D-21 prise de sang et revaccination (21 jours post-vaccination) D-28 prise de sang (28 jours post-vaccination) D-35 prise de sang (35 jours post-vaccination) D I prise de sang et provocation D 1+7 prise de sang (7 jours post- infection) Les résultats sérologiques chez les truies (anticorps anti- PRRSV) sont
représentés au Tableau 4.
Tableau 4 Résultats sérologiques (anticorps anti-PRRSV) Vaccin Trie Do 0 +14 D+21 0+238 Y D r D r7 rPRBS C 400298 - 30 320 N oO 320 >640 rPRRS C 400398 - - - Nr - - >640 rPRS D 400307 - -- - - - - >640 rPS D 400113 - - -- >640 rPRS E 314010 - >640 >640 >640 >640 160 320-640 rPRS E 313426 >640 >640 >640 '640 320 >640 rPRS E 400059 - >640 32i Nr >640 >640 >640 rPRS F 31352i4 - 320-640 320 >640 >640 320-640 >640 rP{S F 401236 -. 64QO)446)_644 a4 >640 320 rPS F 401426 - 320 Nr Nr 32 160 >640 2 Temodn I - Nr Nr NT Nr - 160 T0rein 20 - Nr Ni Ni h - 80 (NT): non testé; --: négatif
Tableau 5
Résultats sérologiques obtenus avec des Dorcelets nés d'animaux témoins (non vaccinés) Truie Avant sevrage ISevrage Après sevrage IAge '.c k AeT i I jour 1 Ijours Ijour
l 2 | >640 | | 0 -
]40 s0.2 4361;' 4 33 3 39 152 0 4137;0 037;2a io
= 442 |>ia |_ -
438 320 438];0-440
439 >_640
2-0 441 {320-640 41 '4
_ _ _ _._ _, 442 f{>_d40 _ __} 3 0 Truie n : référence de la truie No. nombre de porcelets; Ac: anticorps; N.T. non testé; -: négatif Réf. référence du porcelet
Tableau 6
Résultats séroloaiaues obtenus avec des porcelets nés d'animaux vaccinés avec rPRRS C (ORF3) s Truie Avant sevrage Sevrage I Après sevrage no Age ED AC o' Age M A ijours jur jour Jur 1 0. I jours 4003398 s -- _ NS 7 _ _.:
2 I 160 482 -
1 5!83 I16!0 483
I- i 5i
24 0 640 484.E.
4002?8I 7 7
À86 >_640 486
2 0
287I 320 487 -
488 80
489 6j 60 Truie n référence de la truie 3 0 No. nombre de porcelets; Ac: anticorps; N.T. non testé; -: négatif Réf.: référence du porcelet
Tableau 7
Résultats sérologiques obtenus avec des Dorcelets nés d'animaux vaccinés avec rPRRS D (ORF5) Truie Avant sevrage Sevrage Après sevrage Age '.i Age I. Age RE Ac jour jours jours
4'15 >640
416
4!7:20 47,
400113 S 418 30-160 4 3
!19 160 {9 -
4.4;1. 3 l.424 -
)640 425 -
426 >640 426
2 0
- 427 N.T.
400307 y 4 7 25 7 _
4.a Io 428.
49 30-640o 429 50a-160 2 5 4 |.id
| >640 432 -
3 0 Truie n : référence de la truie No. nonmbre de porcelets; Ac: anticorps; N.T. non testé; -: négatif Réf.: référence du porcelet
Tableau 8
Résultats sérologiques obtenus avec des porcelets nés d'animaux vaccinés avec rPRRS E (QRF7)
-
Tuie Avant evrage Sevrage Après savrage Ige P l Ac, Age ai 4 R Ac jour sotms jours ___ __!j __- 1
30 I
314010 z 10 1 >1 I 45 412][0 412 la
421 >640 421
42 >640 422
313426 3 Z _ 3 3 3;
423 >640 - 423 16 _
2 Y
Truie n référence de la truie No. nombre de porcelets; Ac: anticorps; N. T. non testé; -: négatif Réf.: référence du porcelet
Tableau 9
Résultats sérologiques obtenus avec des porcelets nés d'animaux vaccinés avec rPRRS F (ORF3+5+7) Truie Avant sevrage Sevrage Après sevrage J; Age i.. n Age n; Age R AC jaours jours jours 7o313524M!0 'i >74 0 M 8 45 401 >640 1 0
- > 402 >640
-Q3 30-z0
404 >640 404 >640
405 >640 405 >640
406 >_4i 406 >640
!07 >640 407 120
2 0 408 >640 406 >640
t 09 >640 409 >640
:0 >440
401236 2 7,3 >640 2 27 2 42 413 80
2 5 14 >64i0 414 30 Truie n référence de la truie 3 0 No. nombre de porcelets; Ac: anticorps; N.T. non testé; -: négatif Réf.: référence du porcelet Tableau 9 (suite) Résultats sérologiques obtenus avec des porcelets nés d'animaux vaccinés avec rPRRS F (ORF3+5+7> Tie Avant sevage Sevrage A près sevrage X; Age.F'.'.c aAge il Age i. Ae c joas jors joeurs 401426' i 3 >640;.0:2.3 3A 44 1 0
44 - a#4 -
445 >640 445! 60
44 6>640 4;6 160
'7 >" 80
À,.>640 '.I 8
449 >_640 49 160
450 320 450 -
451 16 5 0
_____ - - 452 045J
Truie n référence de la truie 2 5 No.: nombre de porcelets; Ac: anticorps; N.T.: non testé; -: négatif Réf.: référence du porcelet Afin d'évaluer les vaccins faisant l'objet des essais, on étudie les résultats sérologiques ainsi que les résultats de reproduction. Le Tableau 10 présente certaines données sérologiques, tandis que le Tableau 11 rassemble les 3 0 données concernant la reproduction pour les truies utilisées dans les essais, y compris l'information sur le nombre total de porcelets nés, le nombre de porcelets vivants après la 1 ère semaine, le nomre de porcelets sevrés et le
nombre de porcelets d'âge supérieur à 40 jours.
Tableau 10
Résumé des données sérologioues et des données de reproduction
TRUIE SEROCONVERSION [IPMA]
VACCIN NO D 0 POST POST
VAC. INFECTION
(7 jours) rPRRS C 400398 - + rPRRS C 400398 - + + rPRRS C 400298 -++ rPRRS D 400118 - - + rPRRS D 400307 - - +
rPRRS E 314010 -
rPRRS E 313426 -
rPRRS E 400059 - + rPRRS F 313524 - + + rPRRS F 401236 - + + rPRRS F 401426 - + +
TEMDIN 1 - -
TEMDIN 20 - -
[-: négatif; +: positif] D 0: jour de la vaccination
Tableau 1 1
Résumé des données de reproduction VACIN f TRUIE NOMBRE DE PORCELETS l
A CI N!-___ , _
Nés lère Sevrage >40 semaine jours Il
T1 ' 17 O O
TEMOIN
I 20 14 7 4 3
TOTAL 31 7 4 3
rPRRS C 400398 8 7 6 6
ORF3 400298 7
400298 11 8 7 6
I!
TOTAL 19 15 13 12
rPRRS D 400118 12 5 4 3
1 2 54
____ 400307 10 19 7 7
TOTAL 22 14 i 11 10 f
O313426 6 3 3 3
l 400059 1 12 1 1 1 o o
TOTAL 30 7 5 I4
rPRRS F 313524 1 10 8 8 ORF t
401236 2 2 2 2
3+5+7
*401426 15 10 10 9
TOTAL 28 22 20 19
L'ensemble des résultats obtenus indique clairement que dans le cas du vaccin rPRRS C, une des truies a présenté une séroconversion (400298) et une non (400398); dans le cas du vaccin D, aucune des truies n'a présenté de séroconversion; pour les vaccins E et F, on constate une forte séroconversion, qui est due principalement à la protéine codée par ORF7. Il y a un comportement favorable vis-à-vis de la provocation, lorsqu'on compare les animaux vaccinés aux animaux non vaccinés, permettant d'affirmer positivement que les vaccins recombinants faisant l'objet des essais constituent
un moyen efficace pour la prévention du PRRS.
l 0 On a vérifié que les truies vaccinées dépourvues d'anticorps dosés par la technique IPMA sont protégées, ce qui indique clairement que lesdits vaccins
(rPRRS C et rPRRS D) sont capables d'induire une immunité cellulaire.
L'efficacité du vaccin est évalué en comparant: a) le pourcentage de porcelets vivants après la 1ère semaine, avec le 1 5 nombre total de porcelets nés, b) le pourcentage de porcelets sevrés, avec le nombre total de porcelets nés; et c) le pourcentage de porcelets de plus de 40 jours d'âge, avec le nombre
total de porcelets nés.
Le Tableau 12 présente les données concernant le pourcentage de porcelets vivants après la 1ère semaine, le pourcentage de porcelets sevrés, et le pourcentage de porcelets de plus de 40 jours d'âge, en comparaison avec le
nombre total de porcelets nés.
On a vérifié que les animaux dépourvus d'anticorps, évalués avec la
technique IPMA, sont protégés.
Tableau 12
Pourcentage de porcelets vivants après la 1 ère semaine. sevrés. et de plus de iours d'âge. en comparaison avec le nombre total de porcelets nés Il % nIE FC = I, 1 I LA 1èe SWAIE I >40OJnS Il lrPRRS C- ORF 3 79% I 68,5% i 63% l rPRRS D - ORF 5 63 6% 50% 45,5% Il g rPRRS E - ORF 7 | 23% 16,6% 13,3% | | rPRRS F - ORF 3+5+7 78,6%! 71,4% | 67,8%
| TEM0IN | 22,5% | 12,9% 9,6%
1 5 DÉPOT DE MICROORGANISMES
Les baculovirus recombinants obtenus ont été déposés à la Collection Européenne de Cultures de Cellules Animales (ECACC), Porton Down, Salisbury, Whiltshire SP4 OJG, Royaume Uni. Les dénominations et les numéros d'enregistrement des baculovirus recombinants sont les suivants: Dénomination Numéro d'enregistrement ECACC AcNPV, PRRS2 V94021007 AcNPV, PRRS3 V94011325 AcNPV, PRRS4 V94021008 AcNPV, PRRS5 V94011326 AcNPV,PRRS6 V94011327 AcNPV, PRRS7 V94011328 Tous ces baculovirus ont été déposés le 14 janvier 1994, sauf AcNPV, PRRS2 (V94021007) et AcNPV, PRRS4 (V94021008) qui ont été déposés le
février 1994.
Légendes des figures: Fiagure 3: a) Génome de PRRSV b) Taille (Kb) c) Nombre de clones Figure 9: 1 0 a) Dosage d'antigène par ELISA b) Absorbance à 405 nm c) Dilutions d'antigène (1/...) d) Sérum à 1/200 _ terrain 1 5 ±-±- expérimental --*--*-- négatif Figure 10: a) Dosage de sérum par ELISA b) Absorbance à 405 nm c) Dilutions de sérum (1/...) positif
négatif --±-±-
Figure 1: a) Dosage de sérum du terrain b) Absorbance à 405 nm c) Sérum de truie 1

Claims (40)

REVENDICATIONS
1. Protéines recombinantes du virus responsable du syndrome de reproduction et respiratoire porcin (PRRS), caractérisées par le fait qu'elles sont choisies parmi l'une quelconque des protéines codées par les ORF 2 à 7 du virus PRRS-Olot.
2. Protéines selon la revendication 1, caractérisées par le fait qu'elles
comprennent les séquences d'acides aminés représentées à la figure 2.
3. Protéines selon la revendication 1, caractérisées par le fait qu'elles peuvent être obtenues par génie génétique dans un système d'expression de 1 0 baculovirus recombinant, se multipliant dans une culture cellulaire d'un hôte permissif.
4. Protéines selon la revendication 3, caractérisées par le fait que ces baculovirus recombinants contiennent, inséré comme il se doit, et expriment au
moins le gène d'une protéine codée par les ORF 2 à 7 du virus PRRS-Olot.
i1 5
5. Protéines selon la revendication 3, caractérisées par le fait qu'une telle
culture cellulaire d'hôte permissif est une culture de cellules d'insecte permissif.
6. Protéines selon la revendication 3, caractérisées par le fait qu'elles peuvent être obtenues par l'expression de baculovirus recombinants choisis parmi: Dénomination Numéro d'enregistrement ECACC AcNPV, PRRS2 V94021007 AcNPV, PRRS3 V94011325 AcNPV, PRRS4 V94021008 AcNPV, PRRS5 V94011326 AcNPV, PRRS6 V94011327 AcNPV, PRRS7 V94011328
7. Procédé d'obtention de protéines recombinantes PRRS-Olot, codées par les gènes contenus dans l'un quelconque des ORF 2 à 7 dudit virus, le procédé comprenant les étapes consistant à: a) préparer la séquence d'ADNc, synthétisée à partir de l'ARN génomique de PRRS-Olot, destinée à être insérée dans un baculovirus; et b) obtenir des baculovirus recombinants qui expriment les protéines
recombinantes correspondant aux ORF insérés.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que la préparation de la séquence d'ADNc à insérer comprend les étapes consistant à a.1 isoler et purifier le virus PRRS-Olot a.2 isoler l'ARN viral de PRRS-Olot; et
a.3 synthétiser l'ADNc à partir de l'ARN génomique de PRRS-Olot.
1 0
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'isolement du virus PRRS-Olot est effectué par réplication dudit virus sur des cultures de
cellules permissives.
10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'isolement
de IARN du virus PRRS-Olot est effectué par adsorption sur une oligo d(T)12-
1 5 cellulose.
11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que la synthèse de l'ADNc, à partir de l'ARN génomique de PRRS-Olot, est effectuée par incubation dudit ARN avec les dNTP correspondants, la transcriptase réverse et soit oligo d(T)1 2, soit un oligonucléotide de formule
5'CGGGCTCGAGCCTTTGGCGA3'.
12. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'obtention de baculovirus recombinants, exprimant des protéines recombinantes qui correspondent aux ORF 2 à7 de PRRS-Olot, comprend les étapes consistant à: b.1 insérer les gènes d'ORF correspondants dans des vecteurs de transfert de 2 5 baculovirus; b.2 transfecter des cellules d'hôte permissif avec lesdits vecteurs de transfert dans lesquels ont été insérés les gènes d'ORF correspondants; et b.3 sélectionner des baculovirus recombinants qui expriment les protéines
recombinantes ORF insérées correspondantes.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que ledit vecteur
de transfert de baculovirus est le vecteur pAcYM1.
14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que la transfection desdites cellules d'hôte permissif pour la réplication de baculovirus recombinants est effectuée avec un mélange de l'ADN du vecteur de transfert dans lequel est inséré le gène ORF correspondant et de l'ADN du baculovirus de
type sauvage.
1 0
15. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que lesdites
cellules d'hôte permissif sont une culture de cellules d'insecte.
16. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que le baculovirus recombinant obtenu exprime une seule protéine recombinante de PRRS-Olot, choisie parmi l'une quelconque des protéines codées par les ORF 2
1 5 à 7 dudit virus.
17. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que les baculovirus recombinants obtenus sont choisis parmi les suivants: Dénomination Numéro d'enregistrement ECACC AcNPV, PRRS2 V94021007 AcNPV, PRRS3 V94011325 AcNPV, PRRS4 V94021008 AcNPV, PRRS5 V94011326 AcNPV, PRRS6 V94011327 AcNPV, PRRS7 V94011328
18. Baculovirus recombinants, caractérisés par le fait qu'ils expriment au
moins une protéine recombinante correspondant à l'un des ORF 2 à 7 de PRRS-
Olot.
19. Baculovirus recombinants selon la revendication 18, caractérisés par le fait qu'ils expriment une seule protéine recombinante de PRRS-Olot, choisie
parmi l'une quelconque des protéines codées par les ORF 2 à 7 dudit virus.
20. Baculovirus recombinants selon la revendication 18, caractérisés par le fait qu'ils sont choisis parmi les suivants: Dénomination Numéro d'enregistrement ECACC AcNPV, PRRS2 V94021007 AcNPV, PRRS3 V94011325 AcNPV, PRRS4 V94021008 AcNPV,PRRS5 V94011326 AcNPV, PRRS6 V94011327 AcNPV, PRRS7 V94011328
21. Vaccin appropré pour la vaccination et la protection de porcs face au syndrome de reproduction et respiratoire porcin (PRRS), qui comprend au moins i 5 une protéine recombinante correspondant à l'une quelconque des protéines
codées par les ORF 2 à 7 de PRRS-Olot, et un véhicule ou adjuvant approprié.
22. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé par le fait que lesdites protéines recombinantes peuvent être obtenues par des techniques de génie génétique dans un système d'expression de baculovirus recombinants se
2 0 multipliant dans une culture des cellules d'un hôte permissif.
23. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé par le fait que les baculovirus recombinants qui expriment lesdites protéines recombinantes sont choisis parmi les suivants Dénomination Numéro d'enregistrement ECACC AcNPV,PRRS2 V94021007 AcNPV, PRRS3 V94011325 AcNPV, PRRS4 V94021008 AcNPV, PRRS5 V94011326 AcNPV, PRRS6 V94011327 AcNPV,PRRS7 V94011328
24. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé par le fait que lesdites
protéines recombinantes sont utilisées à l'état partiellement purifié.
25. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé par le fait que ladite phase antigénique contient une seule protéine recombinante PRRSV, choisie dans le groupe formé par les protéines recombinantes codées par les ORF 3, 5 et 7 de PRRS-Olot.
26. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé par le fait que ladite phase antigénique est constituée de cellules d'insectes infectées avec le même baculovirus recombinant exprimant une seule des protéines recombinantes
1 0 codées par les ORF 2 à 7 de PRRS-Olot.
27. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé par le fait que ladite phase antigénique est constituée de cellules d'insectes infectées avec différents baculovirus recombinants exprimant, chacun, seulement une des différentes
protéines recombinantes codées par les ORF 2 à 7 de PRRS-Olot.
1 5
28. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé par le fait qu'il contient un
adjuvant huileux.
29. Vaccin selon la revendication 28, caractérisé par le fait que ledit adjuvant huileux est constitué d'un mélange de Marcol 52, de Simulsol 5100 et de
Montanide 888.
30. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé par le fait qu'il contient un
adjuvant aqueux.
31. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé par le fait qu'il contient en outre des substances potentiatrices de la réponse cellulaire (CRP) telles que IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN, le facteur de nécrose cellulaire et des
2 5 substances similaires.
32. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé par le fait que l'adjuvant est un adjuvant capable de moduler et d'immunostimuler la réponse cellulaire,
comme le MDP, I'ISCOM ou des liposomes.
33. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé par le fait qu'il est capable
d'induire l'immunité cellulaire chez des animaux vaccinés.
34. Vaccin bi- ou plurivalent, capable d'empêcher le syndrome de reproduction et respiratoire porcin et une ou plusieurs autres infections porcines, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins une protéine recombinante correspondant à l'une quelconque des protéines codées par l'un quelconque des gènes contenus dans l'un quelconque des ORF 2 à 7 de PRRS-Olot, conjointement avec ou ou plusieurs agents pathogènes porcins et un véhicule
ou adjuvant approprié.
1 0
35. Vaccin selon la revendication 34, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins un agent pathogène porcin choisi dans le groupe formé par Actinobacillus Dleuropneumoniae. Haemophilus parasuis, Porcine parvovirus, Leptosoira, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Porcine respiratory coronavirus, Rotavirus ou les agents 1 5 pathogènes responsables de la maladie d'Aujeszky, de la grippe porcine et de
la gastro-entérite transmissible.
36. Vaccin passif approprié pour la vaccination et la protection de porcs vis-à-
vis du syndrome de reproduction et respiratoire porcin (PRRS), caractérisé par le fait qu'il contient des anticorps obtenus par immunisation d'animaux avec au moins une protéine recombinante correspondant à l'une quelconque des protéines codées par l'un quelconque des gènes contenus dans l'un quelconque des ORF 2 à 7 de PRRS- Olot, conjointement avec un ou ou
plusieurs agents pathogènes porcins et un véhicule ou adjuvant approprié.
37. Kit de diagnostic pour la détection de la présence d'anticorps qui identifient spécifiquement le PRRSV dans un échantillon biologique, tel que le sang, le sérum, le crachat, la salive ou le lait de porcs, comprenant au moins une protéine recombinante correspondant à l'un des ORF 2 à 7 de PRRS-Olot, et des
moyens de diagnostic appropriés.
38. Kit de diagnostic selon la revendication 37, caractérisé par le fait que 3 0 lesdites protéines recombinantes peuvent être obtenues par des techniques de génie génétique dans un système d'expression de baculovirus recombinants se
multipliant dans une culture cellulaire d'un hôte permissif.
39. Kit de diagnostic selon la revendication 38, caractérisé par le fait que les baculovirus recombinants exprimant lesdites protéines recombinantes sont choisies parmi les suivants Dénomination Numéro d'enregistrement ECACC AcNPV, PRRS2 V94021007 AcNPV, PRRS3 V94011325 AcNPV, PRRS4 V94021008 AcNPV, PRRS5 V94011326 AcNPV, PRRS6 V94011327 1 0 AcNPV,PRRS7 V94011328
40. Kit de diagnostic pour la détection de la présence de PRRSV dans un échantillon biologique, tel que le sang, le sérum, le crachat, la salive ou le lait de porcs, comprenant des anticorps qui identifient spéfiquement le PRRSV obtenu par immunisation d'animaux avec au moins une protéine recombinante 1 5 correspondant à l'un des ORF 2 à 7 de PRRS-Olot, et un moyen de détection approprié.
FR9505716A 1994-05-13 1995-05-15 Protéines PRRSV recombinantes, kits de diagnostic et vaccins contenant ces protéines PRRSV recombinantes. Expired - Lifetime FR2719845B1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES09401027A ES2078187B1 (es) 1994-05-13 1994-05-13 Proteinas recombinantes de prrs, kits de diagnostico y vacunas que contienen dichas proteinas recombinantes.
ES09500815A ES2085837B1 (es) 1994-05-13 1995-04-27 Proteinas recombinantes de prrsv, kits de diagnostico y vacunas que contienen dichas proteinas recombinantes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FR2719845A1 true FR2719845A1 (fr) 1995-11-17
FR2719845B1 FR2719845B1 (fr) 1997-05-23

Family

ID=26154789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FR9505716A Expired - Lifetime FR2719845B1 (fr) 1994-05-13 1995-05-15 Protéines PRRSV recombinantes, kits de diagnostic et vaccins contenant ces protéines PRRSV recombinantes.

Country Status (16)

Country Link
US (1) US5888513A (fr)
EP (1) EP0717108B1 (fr)
JP (1) JPH09500544A (fr)
AT (1) ATE280829T1 (fr)
AU (1) AU699385B2 (fr)
CA (1) CA2167080C (fr)
DE (2) DE69533690T2 (fr)
DK (2) DK53595A (fr)
FR (1) FR2719845B1 (fr)
GB (1) GB2289279B (fr)
HK (1) HK1014546A1 (fr)
IT (1) IT1277996B1 (fr)
NL (1) NL1000365C2 (fr)
PT (1) PT717108E (fr)
TW (1) TW450977B (fr)
WO (1) WO1995031550A1 (fr)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0587780T4 (da) 1991-06-06 2008-10-13 Boehringer Ingelheim Vetmed Smitstof, som forårsager Mystery Swine Disease,vaccinepræparater og diagnostiske sæt
US6592873B1 (en) 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US6773908B1 (en) * 1992-10-30 2004-08-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US5695766A (en) * 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
US6380376B1 (en) 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US20040224327A1 (en) * 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
EP0839912A1 (fr) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Clones infectieux de virus à ARN, vaccins et essais diagnostiques
ES2122921B1 (es) * 1996-12-30 1999-09-16 Inmunologia & Genetica Aplic Proteinas recombinantes de fusion del virus reproductivo y respiratorio porcino (prrsv) y su empleo en diagnostico.
ID23399A (id) * 1997-05-06 2000-04-20 Stichting Dienst Landbouwkundi Situs antigenik prrsv untuk mengidentifikasi urutan peptida dari virus prrs yang digunakan untuk vaksin atau pengujian diagnostik
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
ZA991641B (en) * 1998-03-02 2000-09-01 Lilly Co Eli Treatment of viral disease in swine.
AU769539B2 (en) 1999-01-29 2004-01-29 Zoetis Services Llc Adjuvants for use in vaccines
EP1157121B1 (fr) 1999-03-08 2013-04-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Réplicon du virus du syndrome dysgenesique respiratoire porcin (srdp)
DK2251419T3 (da) 1999-04-22 2012-07-02 Us Agriculture Porcint reproduktions- og respirations-syndrom-vaccine baseret på isolat JA-142
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
MXPA02011545A (es) * 2000-05-24 2003-06-06 Merial Sas Virus del sindrome respiratorio y reproductor porcino (peesv), vacuna recombinante para el virus de la viruela.
EP1372722A1 (fr) * 2001-02-23 2004-01-02 The Board of Regents of the University of Nebraska Methode de prevention et de traitement du syndrome dysgenesique respiratoire porcin
JP2005075752A (ja) * 2003-08-29 2005-03-24 Nippon Inst For Biological Science 豚繁殖・呼吸障害症候群用ワクチン製剤
US20080268426A1 (en) * 2004-06-18 2008-10-30 Regents Of The University Of Minnesota Identifying virally infected and vaccinated organisms
BRPI0510928A (pt) 2004-06-18 2007-11-13 Univ Minnesota identificação de organismos viralmente infectados e vacinados
US7632636B2 (en) 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
MX2007015849A (es) 2005-06-24 2008-02-22 Univ Minnesota Virus del sindrome respiratorio y reproductivo porcino, clones infecciosos, mutantes de los mismos, y metodos de uso.
US7241582B2 (en) * 2005-07-05 2007-07-10 Mj Biologics, Inc. Diagnostic test kits
EP1792996A1 (fr) * 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Acides nucléiques encodant des vaccins contre le virus du syndrome reproductif et respiratoire porcin (PRRSV)
BRPI0917887A2 (pt) * 2008-08-25 2019-09-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc vacina contra síndrome reprodutiva e respiratória suína altamente patogênica (hp pprs)
AR078253A1 (es) 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad
DK2488872T3 (da) * 2009-10-13 2014-06-02 Fraunhofer Ges Forschung Fremgangsmåde til prrsv detektering
CN101899421B (zh) * 2010-03-01 2012-09-19 中国农业科学院上海兽医研究所 重组杆状病毒及其构建方法和应用
CN101792740B (zh) * 2010-04-07 2012-05-30 西北农林科技大学 表达prrsv免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用
TWI417385B (zh) * 2010-05-04 2013-12-01 Univ Nat Taiwan 以植物生產之豬生殖與呼吸道綜合症口服疫苗及其用途
CA2827337C (fr) 2011-02-17 2019-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Procede de production de prrsv a l'echelon commercial
DK2959916T3 (en) 2011-02-17 2018-10-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh New European PRRSV strain.
MX351695B (es) 2011-05-07 2017-10-24 Laboratorio Avi Mex S A De C V Vacuna recombinante contra el síndrome reproductivo y respiratorio porcino en vector viral.
EP2737059A1 (fr) 2011-07-29 2014-06-04 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Nouveau virus srrp induisant un interféron de type i dans des cellules susceptibles
US9187731B2 (en) 2011-07-29 2015-11-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells
US9579373B2 (en) 2013-03-15 2017-02-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use
MX2016003855A (es) 2013-09-25 2016-08-04 Zoetis Services Llc Composicion de vacuna de circovirus porcino tipo 2b divergente y procedimientos de uso.
HUE061768T2 (hu) 2013-12-20 2023-08-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus variáns, európai PRRS virus cDNS klón, és alkalmazásuk
US10279031B2 (en) 2016-05-11 2019-05-07 Phibro Animal Health Corporation Composition comprising antigens and a mucosal adjuvant and a method for using
WO2020138761A1 (fr) * 2018-12-27 2020-07-02 주식회사 바이오포아 Virus chimère du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin, et vaccin l'utilisant
CN111996213A (zh) * 2020-02-06 2020-11-27 广西大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992021375A1 (fr) * 1991-06-06 1992-12-10 Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut Agent provocateur du syndrome respiratoire et reproductif du porc, compositions de vaccins et kits de diagnostic
EP0595436A2 (fr) * 1992-10-30 1994-05-04 Solvay Animal Health, Inc. Virus du syndrôme disgènésique respiratoire et de reproduction porcin, vaccins et ADN virol

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX9204885A (es) * 1991-08-26 1994-05-31 Boehringer Animal Health Inc Composicion de vacuna que comprende virus del sindrome de infertilidad y respiratorio de los cerdos.
ATE144144T1 (de) * 1991-08-26 1996-11-15 James Edward Collins Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas)
DE69206631T2 (de) * 1991-10-14 1996-05-15 Akzo Nobel Nv Impfstoff gegen das Fortpflanzungs- und Atmungssyndrom bei Schweinen (PRRS) und Diagnose.
FR2682966B1 (fr) * 1991-10-29 1994-12-02 Rhone Merieux Preparation d'antigenes et de vaccins du virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie.
FR2686097B1 (fr) * 1992-01-14 1994-12-30 Rhone Merieux Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie.
ES2074950B1 (es) * 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992021375A1 (fr) * 1991-06-06 1992-12-10 Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut Agent provocateur du syndrome respiratoire et reproductif du porc, compositions de vaccins et kits de diagnostic
EP0595436A2 (fr) * 1992-10-30 1994-05-04 Solvay Animal Health, Inc. Virus du syndrôme disgènésique respiratoire et de reproduction porcin, vaccins et ADN virol

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOAN PLANA ET AL.: "Porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease). Isolation in Spain of the causative agent and experimental reproduction of the disease", VETERINARY MICROBIOLOGY, vol. 33, pages 203 - 211, XP002007562 *
KARL-KLAUS CONZELMANN ET AL.: "Molecular characterizytion of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, a member of the Arterivirus group", VIROLOGY, vol. 193, no. 1, pages 329 - 339, XP002007561 *

Also Published As

Publication number Publication date
GB2289279A (en) 1995-11-15
HK1014546A1 (en) 1999-11-05
US5888513A (en) 1999-03-30
WO1995031550A1 (fr) 1995-11-23
EP0717108A1 (fr) 1996-06-19
GB9509392D0 (en) 1995-06-28
ITTO950367A1 (it) 1996-11-10
ATE280829T1 (de) 2004-11-15
PT717108E (pt) 2005-01-31
TW450977B (en) 2001-08-21
DE19517773A1 (de) 1995-11-16
JPH09500544A (ja) 1997-01-21
DE69533690T2 (de) 2006-03-09
DK0717108T3 (da) 2005-01-31
ITTO950367A0 (it) 1995-05-10
IT1277996B1 (it) 1997-11-12
DK53595A (da) 1995-11-14
NL1000365C2 (nl) 1996-10-02
AU699385B2 (en) 1998-12-03
AU2409495A (en) 1995-12-05
DE69533690D1 (de) 2004-12-02
GB2289279B (en) 1998-09-16
CA2167080A1 (fr) 1995-11-23
EP0717108B1 (fr) 2004-10-27
FR2719845B1 (fr) 1997-05-23
NL1000365A1 (nl) 1995-11-13
CA2167080C (fr) 2006-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FR2719845A1 (fr) Protéines PRRSV recombinantes, kits de diagnostic et vaccins contenant ces protéines PRRSV recombinantes.
Urniza et al. Baculovirus expression of proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain Olot/91. Involvement of ORF3 and ORF5 proteins in protection
JP4152462B2 (ja) ブタ生殖および呼吸症候群ウィルス（ｐｒｒｓｖ）のヨーロッパワクチン株
JP4149008B2 (ja) 同じ細胞中でのブタ再生性呼吸系症候群ウイルスポリペプチド類の発現
EP0676467B1 (fr) Souches vaccinales Européennes du virus du syndrome respiratoire réproducteur porcin (PRRSV)
GB2282811A (en) Viral vaccine for the prevention of porcine reproductive and respiratory syndrome
JP2003533989A (ja) ブタ生殖・呼吸症候群ウィルス（ｐｒｒｓｖ）の組換えポックスウィルスワクチン
WO1998003658A1 (fr) Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs
JP2000514314A (ja) Ｒｎａウイルス感染性クローンおよびそれから誘導されるワクチンと診断アッセイ法
WO2000047756A1 (fr) Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines
AU2009285843A1 (en) Vaccine against Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (HP PRRS)
FR2776928A1 (fr) Vaccins adn adjuves
DE69534242T2 (de) Hämorrhagie-Virus
WO2003013598A2 (fr) Nouvelles compositions de vaccins et procedes de preparation de vaccins pour des maladies veterinaires et humaines
EP0627936A1 (fr) Vaccin contre la peritonite infectieuse feline et procede de preparation
JP6986078B2 (ja) ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスｃＤＮＡクローンおよびその用途
EP0817799A1 (fr) Vaccin plasmidique contre le virus pseudorabique
EP1469076A2 (fr) Protéines recombinantes PRRS, kits de diagnostic et vaccins contenant lesdites protéines recombinantes
CA2410694A1 (fr) Vaccins adn contre le virus du syndrome dysgenesique respiratoire porcin (sdrp)
EP1248648A2 (fr) Vaccination contre l'herpesvirose canine et vaccins
CA2240779A1 (fr) Vaccins adn contre le virus du syndrome dysgenesique respiratoire porcin (sdrp)
MXPA97007780A (en) European strains of vaccines of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv)
MXPA97010149A (en) Live pathogenicity live virus vaccines and methods of preparation of mis